CN115778986A - 普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病 - Google Patents

普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病 Download PDF

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Abstract

本发明涉及普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病。本发明主要涉及药物。更具体地，本发明涉及协同性益生菌作为用于健康的干预的用途。具体地，本发明提供了普氏粪杆菌的菌株和具有一种或多种以下特征的细菌菌株：(i)生产乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体的能力，其用于治疗或预防与丁酸水平降低相关的疾病，或与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量相关疾病。

Description

普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病
本申请是申请日为2016年10月28的中国专利申请201680063240.3“普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病”的分案申请。
技术领域
本发明主要涉及药物。更具体地，本发明涉及协同性的益生菌作为用于健康的干预的用途。本发明公开了支持普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)物种的菌株在人类中的生长和定殖的方法。
背景技术
在健康成人的体内，估计微生物细胞的数量以10：1的比例多于人细胞。然而，这些群落在很大程度上仍未得到研究，其对人类发育、生理、免疫、营养和健康的影响仍是几乎完全未知的。
传统的微生物学关注于作为分离单位的单独物种的研究。然而，很多(如果不是大多数)物种从未被作为用于分析的存活样本而成功地分离，可能是因为其生长依赖于尚未通过实验复制的特定微环境。在已经被分离的这些物种中，分析基因构成、基因表达模式和代谢生理学很少被延伸到物种间相互作用或微生物-宿主相互作用。DNA测序技术中的进展已经产生了被称作宏基因组学的新研究领域，允许综合检查微生物群落，甚至是包含不可培养的微生物的那些。代替检查已经在实验室中培养的单独细菌菌株的基因组，宏基因组学方法允许分析源自从天然环境收集的完整微生物群落的遗传材料。例如，肠道微生物组(microbiome)为我们本身基因组补充了代谢的功能，其影响人类代谢，并且因此在健康和疾病中发挥重要作用。
认为肠中这些细菌的变化在很多慢性和退行性疾病中发挥作用。有越来越多的身体证据证明并且澄清了什么是所谓的“生态失调理论”。
术语“生态失调”最初是由诺贝尔获奖者Eli Metchnikoff提出，用于描述肠道内改变的致病菌。生态失调已经在一定程度上被定义为“肠菌群、其代谢活性及其局部分布中的量变和质变”。因此，生态失调是一种经常与微生物多样性降低相关的状态，其中微生物群(microbiota)通过例如以下产生有害的作用：
-肠菌群本身的量变和质变；
-其代谢活性的变化；和
-其局部分布的变化。
生态失调假说认为，现代饮食和生活方式，并且还有抗生素和各种抗微生物剂在环境中的使用，已经导致正常肠微生物群的破坏。这些因素导致细菌代谢的改变，以及潜在致病性微生物的过度生长。现在认为改变的微生物群在多种疾病状况中发挥作用，包括病症如肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱和各种代谢疾病，包括肥胖症和2型糖尿病。
2型糖尿病(T2D)是一种代谢病症，其特征在于高血糖以及胰岛素分泌和作用中的缺陷。T2D在全世界增加，并且估计至2030年将影响3.5亿人。这种慢性病与多种代谢和心血管合并症，以及增加的心血管并发症死亡率相关。同样令人担忧的是以下事实，即在具有T2D的所有患者中，大约一半是新诊断的，并且其中很多在诊断时具有心血管并发症。在发展出糖尿病之前很久，可能出现葡萄糖耐受性受损(IGT)和其他代谢缺陷。由于药理学和生活方式干预可以减少或延迟糖尿病，特别是在具有IGT的对象中，所以对处于T2D风险的个体的早期检测对于预防以及降低医疗护理成本是非常重要的。
T2D是复杂的基因-环境相互作用的结果，并且已经鉴定了多种风险因素，包括年龄、家族史、饮食、久坐的生活方式和肥胖症。新增加的因素与微生物群组成相关，包括特定细菌属和种在人的胃肠道中的存在，所述因素可以单独地或与其他测量(例如身体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、腰围(WC)和特定标记物)组合使用，以更好地预测个体是否处于发展2型糖尿病的风险中。进一步地，可以使用涉及微生物群组成的特定变化的信息，以使用某些的益生菌产品配制干预选项，从而纠正特定的生态失调。
肠道微生物群已经被作为影响身体代谢和胰岛素敏感性的环境因素提出，并且已经发现其在肥胖症中改变。然而，肠道微生物群和T2D之间的关系直到最近才在大型人类群组中得到研究，例如在Karlsson等人的研究中(Nature，2013年6月6日)。此外，最近已经将一些肠道微生物标记物与T2D关联，例如在Qin等人公开的中国糖尿病患者的宏基因组研究中(Nature，2012年9月26日)。
在妊娠(通常大约第24周)期间，很多妇女发生妊娠期糖尿病(GDM)。已知此前的妊娠期糖尿病史是随后发生2型糖尿病的风险状况。在妊娠期间或分娩后的高血糖水平是妇女发生糖尿病的强预测指标。相对高血糖通常指示一定程度的胰岛素抗性和β-细胞功能障碍，这可以在这些妇女中观察到，即使她们具有正常的体重和葡萄糖耐受性。
鉴别和治疗具有GDM的妇女对于使母亲和新生儿发病率，先兆子痫和高出生体重问题最小化，也是重要的。在正常妊娠期间发生的很多免疫和代谢变化类似于也在代谢综合征中描述的那些。如上所述，肠道微生物群可以在于代谢综合征相关的多种疾病中发挥作用。Koren等人的研究(Cell，2012年8月3日)显示，肠微生物群从第一(T1)至第三(T3)孕期(trimester)剧烈变化。
炎性肠病(IBD)涉及全部或部分消化道的慢性炎症。IBD主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。二者通常涉及严重腹泻、疼痛、疲劳和体重减轻。大量数据归罪于IBD开始和扩增阶段中的肠细菌。
痛风通常表征为具有发红、易痛、发热和肿胀关节的炎性关节炎的反复发作。这与通常快速发作的大量疼痛相关。潜在的机制涉及血液中尿酸的水平升高，并且可以通过看到在关节液中的结晶或痛风石而确认诊断。痛风的病因是饮食和遗传因素的组合。在近几十年，痛风已经变得更为普遍，并且痛风发作和复发的增加很可能反映出人口统计因素的变化。在这些因素中，值得注意的是人群中增加的与长寿和年龄相关的心血管、代谢和肾脏疾病；作为治疗这些慢性病症的非计划结果，改变尿酸盐平衡的药物的应用；以及促成肥胖症和糖尿病发展的食品和食品添加剂的增加的饮食摄取。
贮袋炎是在溃疡性结肠炎和某些其他疾病的治疗中手术产生的小袋的衬里(lining)的炎症。所述小袋在内部连接到紧临***之上的区域，以在消除前保持废物。贮袋炎是回肠袋-***吻合术(IPAA)的最常见的长期并发症。症状可以包括腹泻、腹痛和关节痛、痉挛、发烧、排便次数增多、夜间粪便渗漏、大便失禁，以及需要排便的强烈感觉。大多数的急性贮袋炎患者响应使用抗生素的初始疗法，但大约六成患者具有至少一次复发。
慢性肾病，有时也称作慢性肾衰竭，其特征在于逐步丧失肾功能并且进一步定义为肾损伤(通常作为≥30mg/天的尿白蛋白***，或等同物而测定)，或肾功能降低(定义为60mL/min/1.73m2的估计肾小球滤过率[eGFR])存在三个或更多月，无论病因如何。当慢性肾病达到晚期，体内会聚集危险水平的流体、电解质和废物。慢性肾病的可用治疗集中在减慢肾损伤的进展。慢性肾病可用进展至终末期肾衰竭，其在没有人工过滤(透析)或肾移植的情况下是致命。
银屑病是常见的慢性皮肤病，其特征在于异常皮肤的斑块。这些斑块可以是发红、发痒并且有皮屑的。银屑病通常被视为被环境因素激发的遗传疾病。对于该疾病没有可得的疗法，但有多种治疗可以帮助控制和平衡症状。
虚弱是常见的老年综合征，其表现为在老年人中，健康和功能的灾难性下降的风险提高。诊断虚弱没有金标准，然而虚弱的患者常显示症状和医疗复杂性的负担增加，以及对医疗干预的耐受性降低。
逐渐认识到肠道微生物群和能量体内稳态以及炎症之间的关联，及其在肥胖症的发病机制中的作用。动物模型以及人类数据通过多种机制将改变的微生物群组成与宿主中肥胖症的发生关联。
细菌物种普氏粪杆菌是人类肠道生态***中丰度最高的细菌之一，并且是肠上皮的各种代谢物的重要供给者。已经将低或枯竭数量的粪杆菌与例如IBD、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱以及T2D和GDM相关联。一些人已经提出使用促进有益细菌生长的某些底物来源，例如碳，即所谓益生元(包括菊粉)，作为提高例如粪杆菌的生物量的途径。这种方法的一个潜在问题在于首先特定的粪杆菌菌株必须存在于胃肠道中，其次益生元必须达到靶向的粪杆菌菌株所定位的位置，并且重要的是，益生元也可以“供养”其他细菌，这些细菌可能是非常不想要的，特别是在需要靶向干预时。
干预的优选方法可以是给予包含需要的菌株的益生菌产品，并且还优选以这样的方式以促进其活性并提高其在胃肠道中的适当位置的生物量。然而，例如粪杆菌的细菌在递送至人肠后非常难以定殖。在分离并培养用于开发新的潜在益生菌的肠道微生物群的代表物时的另一个障碍是肠道环境在不同生态位和栖息地方面的复杂性。此外，多种肠道微生物从其他微生物交叉供养，并且可能还需要来自宿主的一些生长因子。本发明旨在解决这个问题。
定义
本说明书中使用的所有术语都旨在具有本领域通常赋予其的含义。为了清楚期间，一些术语定义如下。
在全文中，术语“2型糖尿病”(T2D)用于指以高血糖、胰岛素抗性和胰岛素分泌相对受损为特征的代谢病症。
术语“宏基因组学”是指现代基因组学技术直接在其天然环境中研究微生物体的群落的应用，绕过了分离和实验室培养单个物种的需要。
“益生菌”是活的微生物，其在以足够的量施用时，赋予宿主健康益处。
“协同作用”是两种或更多种药剂(例如两种或更多种不同的微生物)、实体、因子或物质的相互作用，从而其组合的作用，“协同作用”大于其单独作用的总和。
“共生关系”是不同物种的两种或更多种不同生物之间的亲密、长期关联，其可以但不一定对每个成员都有益。
发明内容
本发明在此涉及基于特定厌氧菌的，用于哺乳动物中的益生菌干预的方法和产品。
本发明的主要目的是通过利用细菌物种普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌(Desulfovibrio piger)(或如本文他处定义的替代菌株)之间的独特电子串扰和共生关系，支持物种普氏粪杆菌的菌株在人类中的生长和定殖。所述共生关系可以导致比单独的普氏粪杆菌更多的丁酸生产，以及导致普氏粪杆菌在胃肠道中的生物量或数量增加的协同作用。因此，本发明提供了提高普氏粪杆菌细菌的生长和定殖(例如，在胃肠道，优选在人类中)的方法。
本发明的另一主要目标是使用共生菌株用于与丁酸生产减少相关的疾病，或与普氏粪杆菌的降低或低水平相关的疾病的治疗和/或预防。因此，在一个实施方式中，本发明提供了普氏粪杆菌(F.prausnitzii)的菌株和/或惰性脱硫弧菌(D.piger)的菌株，其用于疗法中，例如作为益生菌使用。
本发明的另一个目的是使用惰性脱硫弧菌的菌株(或如本文描述的替代菌株)，用于与丁酸生产减少相关的疾病，或与普氏粪杆菌的降低或低水平相关的疾病的治疗和/或预防。惰性脱硫弧菌将强化内源的普氏粪杆菌。
普氏粪杆菌的任何适合菌株都可以用在本发明中。普氏粪杆菌是一种厌氧菌，并且具体地，普氏粪杆菌的适合菌株将具有(i)产生丁酸的能力。此外，普氏粪杆菌的适合菌株将具有(ii)消耗乙酸，(iii)产生细胞外电子，和(iv)产生乳酸的能力中的一种或多种(例如，1或2种)，优选所有的能力。在一些实施方式中，使用具有特征(i)、(ii)和(iv)的菌株。具有生产乳酸(特别是高或显著水平的乳酸)的能力的菌株是特别优选的。典型地，这些普氏粪杆菌菌株以葡萄糖发酵，其导致例如葡萄糖至乳酸和丁酸的转化。
即便普氏粪杆菌的任何适合菌株都可以用在本发明中，本发明人在比较不同的普氏粪杆菌菌株时，已经鉴定出一些独特的功能。具有存在的酶L-乳酸脱氢酶的菌株(或包含L-乳酸脱氢酶基因，其进而导致活性酶的产生或表达的菌株)，向细菌提供了更好的性质，以生产乳酸，并且是优选的，因为这对于在其协同关系中的惰性脱硫弧菌菌株是更有益的。示例性的L-乳酸脱氢酶基因或酶定义为EC 1.1.1.27基因/酶。
用于本发明中的普氏粪杆菌的特别优选的菌株在本文中表示为普氏粪杆菌菌株FBT-22，并且已根据布达佩斯条约于2015年10月20日保藏在DSMZ(莱布尼茨学院DSMZ-德国微生物保藏中心，Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany)，并且被给予保藏号DSM32186，分类命名为FBT-22。这个具体菌株具有L-乳酸脱氢酶，并且与普氏粪杆菌的其它菌株相比，显示了更高的乳酸生产。在生产期间的更多乳酸为惰性脱硫弧菌提供了更多的底物，并且因此支持其相互作用。
这个菌株(例如所述分离的菌株)及其在疗法中的用途(例如作为益生菌，例如用于如本文他处所述的疾病的治疗)，提供了本发明的又进一步的方面。
用于本发明的另一个普氏粪杆菌的优选菌株是表示为A2-165的菌株，其可得自于DSMZ(莱布尼茨学院DSMZ-德国微生物保藏中心，Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany)，并且具有登录号DSM17677。
类似地，对于惰性脱硫弧菌菌株成分，预期可以使用惰性脱硫弧菌的任何适合菌株。惰性脱硫弧菌一种厌氧菌，并且具体地，适合的惰性脱硫弧菌菌株将具有(i)产生乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体(例如，将更多的硫酸还原成硫化物)的能力的特征中的一种或多种(例如，1或2种)，优选所有的特征。在一些实施方式中，使用具有特征(i)和(ii)的菌株。这样的菌株一般能够将乳酸转化成乙酸。由于惰性脱硫弧菌细菌的这些具体特征对于与普氏粪杆菌细菌的共生关系是重要的，所以预期具有这些特征的任何其他细菌物种(即，替代菌株)也可以用在本发明中。用于本发明中的惰性脱硫弧菌的特别优选菌株在本文中表示为惰性脱硫弧菌，并且已根据布达佩斯条约于2015年10月20日保藏在DSMZ(莱布尼茨学院DSMZ-德国微生物保藏中心，Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany)，并且被给予保藏号DSM 32187，分类命名为FBT-23。
这个菌株(例如所述分离的菌株)及其在疗法中的用途(例如作为益生菌，例如用于如本文他处所述的疾病的治疗)，提供了本发明的又进一步的方面。
优选地，普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌(或替代物)菌株一起作为组合疗法使用。
优选地，用在本发明中的菌株是分离的菌株，例如从人类或动物体分离的菌株。因此，这样的菌株与来自分离出它们的人类或动物体的其它微生物菌株或其它杂质相分离，例如为纯培养物，除了在将两种或更多种分离的菌株混合或组合在一起用于本发明中时。
当两种菌株相互作用(例如，如上文所述的普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌菌株)，例如共培养(共同培养)或一起施用，或者以其它方式接触到彼此时，与通过单独的普氏粪杆菌菌株的丁酸生产相比，两种菌株都存在时的丁酸生产增加。优选地，增加丁酸生产的作用是协同作用。在必要的情况下，可以选择本发明中使用的两种菌株之间发生相互作用或接触的条件或环境，以支持丁酸生产。
因此，在本发明的又进一步的实施方式中，提供了一种组合物或产品，其包含单独的或组合的，如本文所定义的普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌(或替代物)菌株。优选的细菌组合是当菌株彼此接触时，引起对丁酸生产的协同作用的那些。
如上文所述，本文所述的菌株及其组合具有治疗效用，并且可以用于治疗或预防将获益于提高的丁酸生产任何疾病，或将获益于普氏粪杆菌细菌的数量或定殖增加的任何疾病。因此，适合的疾病包括与降低的丁酸水平相关的任何疾病，例如由于例如产生丁酸的微生物减少或耗尽而导致丁酸生产减少(或丁酸耗尽或缺少丁酸)，例如与减少或低数量或耗尽量的普氏粪杆菌细菌相关的疾病，或由于例如产生丁酸的微生物的丁酸生产减少导致的。可替代地，本文所述的菌株及其组合可用于治疗或预防与生产丁酸的微生物的减少或耗尽相关的任何疾病，例如与减少或低数量或耗尽量的普氏粪杆菌细菌相关的疾病。这些疾病通常是胃肠(GI)道的疾病。
技术人员将容易地理解并确定所提及的降低的水平、减少的生产，或耗尽或低水平，或低数量等，例如，通过与在适合的对照中(例如在健康患者中)所见的水平进行比较。因此，这些水平或数量等可被视为低于正常，或亚正常，或异常，或者以其它方式小于正常丰度。优选地，这种降低(并且实际上是如本文他处所提及的其它降低或减少或不良作用)是可测量的降低，更优选地，它们是显著的降低，优选临床显著或统计学显著的降低，例如当与适合的对照水平或值比较时，具有≤0.05的概率值。
实际上，在本文中描述显著变化的情况下，优选这种变化是统计学显著的变化，例如当与适合的对照水平或值比较时，具有≤0.05的概率值。
本文他处描述了示例性的疾病，并且包括T2D、GDM、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、IBD、IBS、与IBS相关的腹痛，以及便秘(或与便秘相关的疾病)。待治疗的优选疾病为T2D或GDM。待治疗的另一优选疾病或病况是生态失调。
因此，从另一方面来看，本发明提供了用于治疗或预防T2D、GDM、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、IBD、IBS、与IBS相关的腹痛，以及便秘(或与便秘相关的疾病)，或如本文所述的其他疾病或病况(例如，生态失调)，或用于治疗或预防代谢疾病的治疗方法，其包括施用如本文所述的益生菌菌株。
在本文所述的所有实施方式中，术语“与……相关的疾病”也可以是指“以……为特征的疾病”。
两种菌株对彼此的共生且优选协同作用导致丁酸生产增加，并且导致普氏粪杆菌细菌在胃肠道中的生长和定殖增加，从而缓解并治疗疾病。优选地，选择所述菌株，以使通过两种菌株在一起存在时(例如，在共培养中或在一起施用时)的总丁酸生产大于使用单独的普氏粪杆菌细菌观察到的丁酸生产，并且优选是协同的，即通过两种菌株的总丁酸生产大于(增加的)，优选显著大于(增加的)，单独的丁酸生产水平的总和。
因此，本发明进一步提供了如本文所述的普氏粪杆菌菌株和如本文所述的惰性脱硫弧菌菌株(或替代菌株)，其通过组合、顺次或单独的施用而用于疗法中。
进一步提供了包含如本文所述的普氏粪杆菌菌株和惰性脱硫弧菌菌株(或替代菌株)的产品或组合物，其作为组合的制剂在如本文他处所定义的疾病的治疗或预防中单独、同时或顺次使用。
因此，本发明提供了如本文所述的普氏粪杆菌(F.prausnitzii)菌株和惰性脱硫弧菌(D.piger)菌株(或替代菌株)，其用于治疗本文所述的疾病，例如与胃肠道中的丁酸水平或生产减少相关的疾病(例如，由于生产丁酸的微生物减少或耗尽，例如与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量或耗尽量相关的疾病，或生产丁酸的微生物的丁酸生产减少)，或如本文他处所述的其他疾病。
从另一方面来看，本发明提供了如本文所述的普氏粪杆菌(F.prausnitzii)菌株和惰性脱硫弧菌(D.piger)菌株(或替代菌株)，其用于制备治疗如本文所述的疾病的药物或组合物，例如与胃肠道中的丁酸水平或生产减少相关的疾病(例如，由于生产丁酸的微生物减少或耗尽，例如与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量或耗尽量相关的疾病，或生产丁酸的微生物的丁酸生产减少)，或如本文他处所述的其他疾病。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的产品、菌株或组合物在制备药物或组合物中的用途，所述药物或组合物用于治疗或预防如本文所述的疾病。
从另一方面来看，本发明提供了治疗患者中如本文所述的疾病的方法，例如与胃肠道中的丁酸水平或生产减少相关的疾病(例如，由于生产丁酸的微生物减少或耗尽，例如与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量或耗尽量相关的疾病，或生产丁酸的微生物的丁酸生产减少)，或如本文他处所述的其他疾病，所述方法包括向所述患者施用有效量的如本文所述的普氏粪杆菌(F.prausnitzii)菌株和惰性脱硫弧菌(D.piger)菌株(或替代菌株)。
本发明的治疗方法和用途中(或如本文所述的任何其他治疗方法或治疗用途中)，以药学上或生理学有效的量向需要治疗的对象进行益生菌菌株的施用。因此，所述方法和用途可以涉及鉴定需要治疗的对象的额外步骤。
在本文所述的所有实施方式中，待治疗的优选疾病是T2D或GDM。用于如本文所述的疾病(并且特别是T2D或GDM)的疗法或治疗中的优选菌株是普氏粪杆菌菌株DSM 32186或惰性脱硫弧菌菌株DSM 32187，其也可以组合使用。另一个优选的普氏粪杆菌菌株是A2-165(DSM 17677)。
如上文所述，本发明的又另一个方面提供了惰性脱硫弧菌菌株(或如本文所述的替代菌株)，其用于治疗或预防与降低的丁酸水平相关的疾病，或与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量相关的疾病。
因此，本发明还提供了惰性脱硫弧菌菌株(或如本文所述的替代菌株)，其用于制备用于治疗如本文所述的疾病的药物或组合物。
本发明还提供了治疗患者中如本文所述的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的惰性脱硫弧菌菌株(或如本文所述的替代菌株)。
对于所述方法和用途，例如惰性脱硫弧菌的优选菌株(或替代菌株)和优选疾病的优选实施方式如本文他处所述。在这样的实施方式中，惰性脱硫弧菌的施用将强化或增加所述患者或对象，例如在所述患者或对象的胃肠道中的内源普氏粪杆菌(例如，增加其生物量或数量，或者增加其生长或定殖，如本文他处所述)。
本发明的其他目标或优点对读者将是显而易见的，并且预期这些目标和优点在本发明的范围之内。
附图说明
图1显示了在人类肠道中，肠道微生物群采取的主要发酵途径。
图2显示了普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌之间的共生关系。
图3显示了在生理上相关的生长培养基(脑心浸液(LYBHI))中，普氏粪杆菌FBT-22和模式株A2-165的对比SCFA概况，y轴以mM计。
图4显示了在LYBHI生长培养基中，普氏粪杆菌模式株A2-165单培养物和与惰性脱硫弧菌的共培养物的代谢概况，y轴以mM计。
图5显示了在LYBHI生长培养基中，普氏粪杆菌分离物FBT-22单培养物和与惰性脱硫弧菌的共培养物的代谢概况，y轴以mM计。
具体实施方式
如上文所述，本发明涉及基于特定厌氧菌的，用于哺乳动物中的益生菌干预的方法和产品。
可见，在本发明的优选实施方式中，施用益生菌的组合或混合物(组合疗法)。益生菌的这种混合物或组合可以在单个(相同)组合物中一起施用，或单独地施用(例如，在不同的产品或组合物中)。如果单独地施用，则这种施用可以是顺次的或同时的。然而，单独施用形成相同治疗方案或方法的一部分。
在其中两种菌株的施用是单独或顺次的实施方式中，优选在彼此合理的时间框内进行所述施用。例如，单独的使用优选在彼此数小时(例如一小时)或数分钟(例如15或30分钟内)之内进行，最优选在尽可能短的时间框(包括同时或有效地同时施用)之内进行。优选地，两种益生菌细菌菌株在单个组合物中共施用。
在其中多于一种的益生菌细菌菌株在混合物中用于单个组合物中，或其中使用多于一钟的益生菌细菌菌株但它们单独施用的实施方式中，可以使用所述细菌的任何合适的比例，前提是保留所述菌株的益生菌功能(例如提高的丁酸生产，并且优选对丁酸生产的协同作用)至有用的程度。这样的比例可以由本领域的技术人员容易地测定。例如，这样的两种菌株的组合(例如，普氏粪杆菌：惰性脱硫弧菌(或替代菌株))可以以1:10、1:5、1:1、5:1或10:1，或这些极值之间的任何位置的比例使用，例如1:1。这样的比例也可以用在如本文他处所述的本发明的产品、试剂盒、组合物等中。
因此，本发明提供了使用至少两种益生菌细菌菌株的组合疗法，优选地其中所述菌株对彼此具有共生且更优选协同作用，特别是在增加丁酸生产的方面。
这样的协同作用(或实际上增加的作用)可以容易地在体外测量，以选择适合的细菌组合，例如，通过任何适合的测定法测量来自每个单独菌株的丁酸生产水平，并且随后评估所述菌株组合(例如，在共培养或以其他方式可以彼此相互作用时)的丁酸生产是否大于，并且优选显著大于单独菌株的丁酸生产水平的总和。丁酸生产的简单增加(优选显著增加)也可以通过这种方式测量。可以在厌氧条件下进行适合的测定。适合的示例方法描述在实施例中。
在本文所述的治疗方法和用途中，以适合的剂量、制剂等施用所述菌株，从而增加哺乳动物的胃肠道中的丁酸生产。此外，优选普氏粪杆菌细菌的数量增加(例如，普氏粪杆菌的生物量增加)，或者胃肠道内的普氏粪杆菌的生长和定殖得到改进。
优选地，这样的增加(和实际上如本文他处提及的其他增加、改进或积极作用)是可测量的增加等(在适合的情况下)，更优选其为显著的增加，优选临床显著或统计学显著的增加，例如当与适合的对照水平或值比较时(例如，与未经治疗或安慰剂治疗的对象相比，或与健康或正常对象，或治疗前的相同对象相比)，具有≤0.05的概率值。
本发明的方法和用途适合于预防疾病以及治疗疾病。因此，本发明也涵盖了预防性治疗。出于这个原因，在本发明的方法和用途中，治疗在适当的情况下也包括预防和防护。
可以在任何哺乳动物(患者或对象)上进行本发明的方法和用途，例如人或任何牲畜、家养或实验室动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、犬、绵羊、兔、牛和猴。然而，优选地，所述哺乳动物是人。
在本发明的进一步方面，提供了试剂盒或药包。因此，本发明提供了试剂盒或药包，其包含(或由以下组成)：
(i)如本文定义的普氏粪杆菌的菌株，和
(ii)如本文定义的惰性脱硫弧菌的菌株(或替代菌株)；
或试剂盒或药包，其包含(或由以下组成)：
如本文定义的惰性脱硫弧菌的菌株(或替代菌株)，例如用于增强如本文他处所述的内源普氏粪杆菌的生长。
如本文他处所述，形成所述试剂盒的单独组分的两种菌株可以作为单独组分施用，或者可以在施用前组合在一起。在所述试剂盒的替代实施方式中，可以将两种菌株作为单个试剂盒或包组分在一起提供。优选地，这样的试剂盒或包用于本发明的方法和用途中，例如用于治疗如本文定义的疾病。所述试剂盒或包任选地还包含施用所述组分的说明，或使用所述试剂盒或包的说明。
早先的研究指出，在2型糖尿病(T2D)中观察到的细菌改变不影响微生物群的整体组成，而是影响有限数量的物种的丰度。具体地，存在生产短链脂肪酸丁酸的细菌的减少，并且丁酸生产细菌的耗尽还降低了次级胆汁酸的水平。在妊娠期糖尿病(GDM)疾病和其他代谢相关疾病中，看起来也是如此。已报道，作为具有抗炎作用的丁酸生产菌，也在炎性肠病中耗尽的普氏粪杆菌在具有GDM的妊娠妇女的第三孕期(T3)时的平均丰度降低。
基于我们自己在健康人和病人中使用宏基因组学分析的研究，我们从人粪便分离了普氏粪杆菌的多个菌株，并且选择了最有前景的几个，作为潜在的益生菌菌株用于进一步的开发。基于这些研究，本文他处描述了用于在本发明中使用的普氏粪杆菌的合适菌株。优选的菌株是FBT-22(DSM 32186)。这个具体菌株具有L-乳酸脱氢酶基因，并且与普氏粪杆菌的其他菌株相比，显示更高的乳酸生产。实际上，如本文他处所提及的，具有生产乳酸(特别是高或显著水平的乳酸)的能力的菌株是特别优选的。用于本发明的菌株的乳酸生产的示例性适合水平是足以具有生物作用，例如在共培养时对惰性脱硫弧菌的生产具有积极作用的那些。示例性的水平是例如当所述菌株培养在适合的生长培养基，例如，如在实施例中描述的PGM或LYBHI中时，至少10mM、20mM、30mM、40mM、50mM或60mM的水平。乳酸生产的示例性高水平是例如当所述菌株培养在适合的生长培养基，例如，如在实施例中描述的PGM或LYBHI中时，至少35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM的水平。包含L-乳酸脱氢酶基因(或表达活性L-乳酸脱氢酶的酶)菌株是特别优选的。
如本文他处所提及的，具有生产丁酸的能力的普氏粪杆菌菌株是特别优选的。用于本发明的菌株的乳酸生产的示例性适合水平是足以具有生物作用，例如对T2D或如本文所述的其他疾病的积极作用的那些。示例性的水平是例如当所述菌株培养在适合的生长培养基，例如，如在实施例中描述的PGM或LYBHI中时，至少3mM、5mM、7mM、10mM或15mM，或高至10mM或15mM的水平。优选地，根据本发明，与单独的普氏粪杆菌的丁酸生产相比，当普氏粪杆菌的菌株与惰性脱硫弧菌的菌株(或替代菌株)组合存在时，丁酸生产水平增加，优选显著增加。优选地，观察到协同性增加。增加的示例性水平是至少1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍或3.5倍。
普氏粪杆菌是健康成年人的人肠微生物群中丰度最高的细菌，占细菌总数的高达5％以上。在过去5年中，越来越多数量的研究已经清楚地描述了这个具有高度代谢活性的共生细菌作为健康人微生物群的组分的重要性。已经将普氏粪杆菌的丰度变化与多种人类病症相关联。
普氏粪杆菌是对氧极端敏感的(EOS)细菌，并且甚至在厌氧条件下都难以培养。普氏粪杆菌菌株的葡萄糖发酵的主要终产物是甲酸、乳酸和大量的丁酸(在体外>10mM丁酸)。
一些观察结果提供了普氏粪杆菌在肠道屏障的宿主-微生物相互作用中的关键洞察。所述菌株是：
-生产丁酸；
-进行葡萄糖发酵；
-消耗乙酸；
-能够产生细胞外电子，例如能够通过核黄素散发电子到细胞外电子受体；
-使用葡萄糖作为电子供体并以黄素作为介体。
考虑到普氏粪杆菌在健康肠道中的丰度和生长，我们的假设是在附近必然存在能够以共生方式起作用并且支持普氏粪杆菌的生长的其他细菌。因此，通过鉴定的特征，我们寻找了消耗乳酸、生产乙酸并且还能够充当电子受体的细菌。基于这些特征，可以选择出与普氏粪杆菌一起以共生方式发挥作用的菌株。在惰性脱硫弧菌(并且惰性脱硫弧菌的特别优选的菌株是FBT-23(DSM 32187))中发现了一个可能的候选。然而，也可以使用具有这些性质的任何其他菌株(即替代菌株)。
脱硫弧菌是硫还原菌中首先被描述的属之一，并且可能是最深入研究的一个属。它们是还原硫的、非发酵的、厌氧的、革兰氏阴性杆菌，其特征在于存在色素脱硫绿胺霉素，其在长波长UV光下，于碱性pH发出红色荧光，且在酸性pH发出蓝绿色荧光。惰性脱硫弧菌从未从人体之外分离到，并且可以被认为是硫酸盐大量存在的肠道的天然栖息者。
所述菌株的一些特征如下：
-将微生物的还原发酵代谢物乳酸转化，或消耗乳酸，成为还原性较低的产物乙酸。
-乳酸至乙酸的转化释放电子，其将硫酸盐还原成硫化物。
-脱硫弧菌细胞色素可以充当来自周围的还原环境或细菌的电子受体，并且被用于将硫酸盐还原成硫化物。
令我们感到意外的是，当普氏粪杆菌细菌细胞在惰性脱硫弧菌细菌细胞的附近时，在普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌之间存在独特的电子串流和共生关系。本发明在此，通过制备基于所选的两种物种菌株的组合的产品，以支持普氏粪杆菌的菌株在人体中的生长和定殖，而利用了这一新发现。另一个可能的产品可以是使用单独的惰性脱硫弧菌，以施用给例如人类，以支持内源普氏粪杆菌的生长。
两种物种之间的共生关系可以部分地通过以下描述，参见图2：
-普氏粪杆菌将葡萄糖转化成乳酸和丁酸，消耗乙酸并产生细胞外电子；
-惰性脱硫弧菌将乳酸转化成乙酸并接受电子以将更多的硫酸盐还原成硫化物；
-净结果是两种生物的生长更好，并且丁酸生产更多，显示了协同作用。
这种相互作用已经通过普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌的共培养物中更高的丁酸积累而得到证实(参见实施例4)。
共生关系导致普氏粪杆菌的需要的生长和加倍的生产(参见实施例4)，根据本发明，其可用于人体中的益生菌干预，所述人处于其肠微生物群生态失调(例如胃肠道微生物群生态失调)的风险中或具有所述生态失调，其中丁酸生产菌减少(例如在T2D或GDM中)。
用于本发明中的适合的益生菌菌株可以从任何哺乳动物获得或分离，所述哺乳动物能够患上或易感于胃肠道微生物群生态失调，特别是T2D、GDM、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、IBD、IBS、与IBS相关的腹痛和便秘疾病，或本文描述的其他疾病。人类是优选的来源。从其获得适合益生菌细菌的适合样品类型是本领域的技术人员熟知的。然而，优选粪便样品。适合的培养条件是厌氧条件。适合的培养基可以由本领域的技术人员选择，例如PGM培养基或LYBHI或在实施例中描述的其他培养基。
本发明进一步的目标是提供用于所述共生关系的方法、试剂盒、***、组合物和产品。
因此，如本文所述的菌株(或其组合)可以采取复合(试剂)或组合物的形式，例如药物复合物或组合物或营养复合物或组合物。
因此，本发明还提供了组合物或制剂，其包含如本文所述的普氏粪杆菌菌株和如本文所述的惰性脱硫弧菌菌株或替代细菌菌株，例如其具有一种或多种以下特征：(i)生产乙酸，(ii)消耗乳酸；和(iii)具有作为电子受体的能力；和选自以下的至少一种额外组分：载体、稀释剂或赋形剂(例如，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)、食物或食品补充剂，或进一步的治疗或营养剂。因此，所述组合物可以作为药物组合物或营养组合物，例如食品产品配制。
还提供了如本文定义的本发明的菌株、组合物和制剂的治疗用途。
根据疾病的位点选择所述菌株、组合物、制剂等的适合的施用模式和剂型。优选的施用模式是口服或直肠，然而，静脉内或肌肉内注射同样是合适的。
如本文定义的本发明的菌株、组合物和制剂的适合剂量可以由技术人员根据待治疗的病症、所涉及的施用模式和剂型，而容易地选择或确定。例如，选择剂量或施用方案，从而根据本发明施用给对象的益生菌细菌(或细菌的组合)可以产生治疗或健康益处(例如，胃肠道中丁酸水平增加，或胃肠道中普氏粪杆菌细菌生长增加，或疾病的治疗)。因此，在其中施用两种不同的细菌菌株的实施方式中，可以选择每种细菌的适合剂量，从而在两种菌株都存在时观察到治疗或健康益处。例如，可以使用104至1012，例如105至1010，或106至108，或108至1010总CFU的细菌的一种或每种细菌的每日剂量。一种或每种细菌的优选每日剂量是大约108或109总CFU，例如107至1010或108至1010或108至109。
因此，提供了包含如本文定义的菌株的产品或组合物或制剂或试剂盒。优选的产品或组合物包含冷冻的、冷冻干燥的、冻干的或干燥的细菌，并且优选以单位-剂量的形式，例如胶囊或片剂或凝胶。优选的产品或组合物将包含普氏粪杆菌菌株和惰性脱硫弧菌(或替代的)菌株。用于此类产品中的适合的比例和剂量(例如，细菌数量或CFU的形式)等，描述于本文他处以及实施例中。其他组分也可以包括在此类产品中，例如防护剂(例如甘油)、稳定剂、凝胶剂和/或防冻剂。在一些实施方式中，此类额外组分是非天然的试剂。
如图1中所示，在使用葡萄糖作为电子供体时，理论上高乙酸、高甲酸和乳酸生产是在电子处置方面最有能量效率的途径。高丁酸合成(Homobutyrogenesis)对每摩尔葡萄糖产生4摩尔的过量电子，而乳酸至乙酸的转化对每摩尔的乙酸生产，产生4摩尔的电子。从葡萄糖生产丙酸产生过量的10摩尔电子。在发酵中，这种电子失衡通过混合的酸发酵和气体产生而平衡。一些微生物将电子散发到细胞外电子受体，例如硝酸、硫酸或不溶性金属络合物。此外，氧可以充当间接电子受体，因为一些肠道微生物能够消耗少量的氧。微生物活动的净结果在人或动物肠道中产生富含电子的还原环境，其保持负的净氧化还原电位。这种缺氧的还原环境支持严格厌氧菌在肠道腔中的生长。尽管存在通过食物摄取以及从肠道粘膜扩散的连续氧流入的事实，但肠道的净氧化还原电位保持为负的，大约-300mV。
如本文定义的本发明的治疗用途包括减少、预防或缓解相关的病症或病症的症状(例如可以导致疾病症状的调节)。这样的相关病症描述于本文他处，例如与丁酸生产的缺少或耗尽相关的那些，或与普氏粪杆菌的减少或低数量相关的那些，如例如在T2D、GDM、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、IBD、IBS、与IBS相关的腹痛，以及便秘疾病中。可以通过任何合适的测定，测量病症或其症状的减少、预防或缓解。优选地，病症或症状的减少或缓解是临床和/或统计学显著的，优选具有<0.05的概率值。病症或症状的这种减少、预防或缓解通常是相对于适合的对照对象或群体而测定的，例如健康对象或未治疗或安慰剂治疗的对象，或个体对象在治疗前的基线水平。
根据治疗，选择治疗剂的适合的施用模式和剂型。用于益生菌细菌或其他补充剂的优选施用模式是口服或直肠。
共生的组合，或实际上如本文所述的益生菌细菌的任何组合，可以使用冻干材料，在基于油的液体(例如，中链甘油三酯)中制备。
每种菌株在原料中优选生存力范围从106CFU/g至1010CFU/g。
可以通过任何递送模式实现向对象的施用，包括肠溶胶囊、延迟或控释胶囊、软胶囊(例如，可咀嚼胶囊)、肠溶包衣胶囊或胶囊内的胶囊。
可以通过具有干燥剂包衣的基于ALU-ALU的密封袋剂型实现施用。
可以根据具体的试剂、患者的年龄、体重和病况、涉及的施用模式和制剂，通过标准方法选择如本文定义的治疗剂的适合剂量。
如本文所述的本发明的治疗和预防方法可以在任何类型的对象或哺乳动物上实施，所述对象或哺乳动物能够患上生态失调，例如胃肠道微生物群生态失调，特别是T2D、GDM、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、IBD、IBS、与IBS相关的腹痛，以及便秘疾病。所述方法通常在人类上实施。
以下是本发明的一些实施例，其不旨在限定本文的发明的用途，而是用于显示可以如何使用本发明的实际实施例的细节。
实施例1
普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌作为共培养物的分离
意外地，通过微生物纯培养技术，在Coy培养箱中采用的严格厌氧条件下(5％H2,15％CO2和80％N2)，从健康志愿者的粪便分离出普氏粪杆菌FBT-22(DSM 32186)和惰性脱硫弧菌菌株FBT-23(DSM 32187)。采用Postgate培养基(PGM)作为用于分离和培养的常规培养基。PGM包含(g/L)：磷酸氢二钾：0.5g；氯化铵：1；乳酸钠：3.5；酵母提取物：1；抗坏血酸：0.1；半胱氨酸：0.5；氯化钠：1；蛋白胨：10；硫酸钠：1；脱水氯化钙：1；硫酸镁：2；七水合硫酸亚铁：0.5。将硫酸钠、七水合硫酸镁、脱水氯化钙单独地高压灭菌，同时，将七水合硫酸亚铁经0.22μm滤器过滤灭菌，并在所有组分高压灭菌和混合后添加。使用1N NaOH或1N HCl，将培养基的最终pH调整至7.2±0.2。
将培养基在100kPa，121℃高压灭菌15分钟。
这种培养基缺少作为普氏粪杆菌生长主要要求的葡萄糖，但包含相对高量的乳酸。重复的传代培养导致惰性脱硫弧菌和普氏粪杆菌的分离。
实施例2
普氏粪杆菌菌株的替代分离
通过微生物纯培养技术，在Coy培养箱中采用的严格厌氧条件下(5％H2,15％CO2和80％N2)，从健康志愿者的粪便分离出普氏粪杆菌菌株。用于分离的常规培养基包含以下(g/L)：酵母提取物：2.5；酪蛋白：10；葡萄糖：4.5；氯化钠：0.9；磷酸氢二钾：0.45；磷酸二氢钾：0.45；硫酸铵：1.32；碳酸氢钠：4g；半胱氨酸：1；刃天青：0.001；氯化血红素(hemin)：0.01。维生素混合物包含：10μg生物素，10μg钴铵素，30μg对氨基苯甲酸、50μg叶酸和150μg吡哆胺。培养基中的短链脂肪酸(SCFA)的终浓度是33mM乙酸，9mM丙酸，和各1mM的异丁酸，异戊酸和戊酸。所有组分在无菌条件下添加，同时使用CO2冲洗管。热不稳定的维生素使用0.22μm滤器过滤灭菌，并在培养基高压灭菌后添加，以给出0.05μg硫铵素/ml和0.05μg核黄素/ml的最终浓度。使用1NNaOH或1NHCl，将培养基的最终pH调整至7.2±0.2。将培养基在100kPa，121℃高压灭菌15分钟。
实施例3
惰性脱硫弧菌菌株的替代分离
通过微生物纯培养技术，在Coy培养箱中采用的严格厌氧条件下(5％H2,15％CO2和80％N2)，从健康志愿者的粪便分离出惰性脱硫弧菌菌株。采用Postgate培养基(PGM)作为用于分离和培养的常规培养基。PGM培养基包含(g/L)：磷酸氢二钾：0.5g；氯化铵：1；乳酸钠：3.5；酵母提取物：1；抗坏血酸：0.1；半胱氨酸：0.5；氯化钠：1；蛋白胨：10；硫酸钠：1；脱水氯化钙：1；硫酸镁：2；七水合硫酸亚铁：0.5。将硫酸钠、七水合硫酸镁、脱水氯化钙单独地高压灭菌，同时，将七水合硫酸亚铁经0.22μm滤器过滤灭菌，并在所有组分高压灭菌和混合后添加。使用1NNaOH或1NHCl，将培养基的最终pH调整至7.2±0.2。
将培养基在100kPa，121℃高压灭菌15分钟。
实施例4
普氏粪杆菌DSM 32186的基因组测序
这个研究的目的是对候选益生菌普氏粪杆菌DSM 32186的基因组进行测序，以鉴定对于普氏粪杆菌DSM 32186和惰性脱硫弧菌DSM32187之间的代谢相互作用重要的因子。
实验方法和结果
测序和组装
收获普氏粪杆菌菌株DSM 32186的培养物，并分离DNA。在瑞典乌普萨拉SciLifeLab，在Pacific Biosciences RS仪器上对分离的DNA测序。使测序产生73,071个读数，具有17,241个碱基对(bp)的N50读数长度。使用PacBioSMRTPortal和HGA版本3组装协议(Chin等人，2013)，组装序列读数。使用默认参数，除了将估计的基因组大小设定为3Mbp。组装产生了2,915,013bp的单个重叠群，具有197的平均覆盖率。将组装物环化，使用AMOS软件包(Treangen等人，2002)修整重复的尾端，并且将染色体的起始设置为DnaA基因起始密码子。为了改进组装物和环化融合末端，将生成的环化染色体作为参照用于SMRTPortalResequence版本1协议中，其将PacBio的读数映射回这个参照，并生成共有序列。将这个共有序列用于进一步的分析。
通过NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(Angiuoli等人，2008)的初步基因识别和注释指出，组装包含异常高数量的移码基因(总共2,767个基因中的489个)。组装的手动检查指出，移码发生在具有约6bp的长度的G或c的均聚物区段中。为了减轻均聚物的问题，将相同的DNA样品送出，在GATCBiotech使用Illumina技术进行测序。
使用Illumina Hiseq仪器产生了总计7,624,279个配对的末端读数，具有126bp的读数长度。使用Trimmomatic 0.36(Bolger等人2014)，用于读数质量控制和接头序列的过滤。在下游分析中使用了总计6,424,651个高质量配对末端读数。使用bowtie2 2.2.9(Langmead和Salzberg,2012)，将高质量读数与PacBio生成的共有序列比对，其中使用默认参数，除了允许600bp(-X600)的***物大小长度。在高质量读数对中，90.2％与基因组一致地比对，并且整体比对率为99.75％。将比对提供至Pilon(Walker等人，2014)1.18(https://github.com/broadinstitute/pilon/releases)，用于组装的校正。Pilon对组装进行了1074处校正，绝大多数为G或C的单个***。
普氏粪杆菌DSM 32186基因组的最终组装包含2,905,188个碱基对，并且提交至NCBI，并接受到登录号CP015751。
基因组注释
使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline对基因组序列进行注释，并且在基因组上找到总计2,737个基因，其中2,608个是蛋白编码基因，86个RNA基因和43个假基因。基因组包含6个完整的5S、16S和23S核糖体基因和64个tRNA基因。
与其他测序的普氏粪杆菌基因组的相比的独特遗传潜力
通过使用Subsystem技术的快速注释(the Rapid Annotation using SubsystemTechnology,RAST)服务器(http://rast.nmpdr.org/)，对普氏粪杆菌DSM32186的基因组进行注释。在经测序的基因组中的基因注释的比较，普氏粪杆菌A2-165、SL3/3、KLE1255、L2-6和M212对比普氏粪杆菌DSM32186鉴定的以下独特功能列出在表1中。
特别感兴趣的是在任何其他测序的普氏粪杆菌菌株中都没有发现的L-乳酸脱氢酶。DSM32186中的这个蛋白A8C61_00370在其他测序的普氏粪杆菌基因组中没有接近的同源物，并且使用BLAST对NCBInr数据库的序列比对检索鉴定出来自真杆菌(Eubacterium)、Oribacterium和罗斯氏菌(Roseburia)的L-乳酸脱氢酶作为密切相关的序列。A8C61_00370L-乳酸脱氢酶很可能通过水平基因转移被转入普氏粪杆菌DSM32186中，因为它直接靠近由IslandViewer 3(Dhillon等人2015)在线工具(http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/)鉴定的基因组岛。实验数据显示DSM32186菌株在生产期间产生更多的乳酸，其是惰性脱硫弧菌的底物，并且因此支持其相互作用。
表1：与以下测序的普氏粪杆菌基因组相比，普氏粪杆菌DSM 32186中的独特基因注释。粗体的菌株名称注明了DSM32186与其相比具有独特功能的菌株。
Figure BDA0004039426000000191
Figure BDA0004039426000000201
Figure BDA0004039426000000211
Figure BDA0004039426000000221
Figure BDA0004039426000000231
Figure BDA0004039426000000241
实施例5
协同作用的评估
为了评估协同作用，使用了来自实施例1的共培养物。作为替代，将来自实施例2的普氏粪杆菌菌株FBT-22(DSM 32186)与来自实施例3的惰性脱硫弧菌菌株FBT-23(DSM32187)在Postgate培养基中，在严格厌氧条件下共培养。
Postgate培养基包含以下(g/L)：磷酸氢二钾：0.5g；氯化铵：1；乳酸钠：3.5；酵母提取物：1；抗坏血酸：0.1；半胱氨酸：0.5；氯化钠：1；蛋白胨：10；硫酸钠：1；脱水氯化钙：1；硫酸镁：2；七水合硫酸亚铁：0.5。将硫酸钠、七水合硫酸镁、脱水氯化钙单独地高压灭菌，同时，将七水合硫酸亚铁经0.22μm滤器过滤灭菌，并在所有组分高压灭菌和混合后添加。使用1N NaOH或1N HCl，将培养基的最终pH调整至7.2±0.2。
将培养基在100kPa，121℃高压灭菌15分钟。
这产生了以下数据(表2)，说明了所述菌株对丁酸生产的协同作用。
表2：脂肪酸概况中的倍数变化
Figure BDA0004039426000000251
实施例6
包含两种菌株的产品的制备
在本研究中，我们使普氏粪杆菌菌株FBT-22(DSM 32186)和惰性脱硫弧菌菌株FBT-23(DSM 32187)在PGM中，在严格厌氧条件下单独地生长。
PGM培养基包含(g/L)：磷酸氢二钾：0.5g；氯化铵：1；乳酸钠：3.5；酵母提取物：1；抗坏血酸：0.1；半胱氨酸：0.5；氯化钠：1；蛋白胨：10；硫酸钠：1；脱水氯化钙：1；硫酸镁：2；七水合硫酸亚铁：0.5。将硫酸钠、七水合硫酸镁、脱水氯化钙单独地高压灭菌，同时，将七水合硫酸亚铁经0.22μm滤器过滤灭菌，并在所有组分高压灭菌和混合后添加。使用1N NaOH或1N HCl，将培养基的最终pH调整至7.2±0.2。
将培养基在100kPa，121℃高压灭菌15分钟。
在细菌生长至静止期后，将细胞在蒸馏水中洗涤并且随后使用用于敏感材料的离心机浓缩。在包含1E+9CFU的等分试样中测量所得的每种菌株的浆料，并且随后，以1:1的比例彼此混合。随后，将产物保存在20％甘油中，并保持在-80℃。
实施例7
普氏粪杆菌模式株A2-165(DSM 17677)和普氏粪杆菌FBT-22(DSM 32186)在生理 相关培养基LYBHI中的代谢概况普氏粪杆菌菌株的详细代谢概况描述在图1和图2中。在上述附图中，明显可见，经葡萄糖发酵，普氏粪杆菌可以产生作为主要SCFA的丁酸，并且消耗乙酸。此外，这些细菌还产生乳酸、甲酸和乙酸。
普氏粪杆菌模式株A2-165(DSM 17677)和普氏粪杆菌FBT-22(DSM 32186)在生理相关培养基LYBHI中的比较代谢概况揭示，这两种细菌在代谢上是不同的(SCFA的倍数变化显示在表3中)。比较的葡萄糖消耗和丁酸生产最为相似，然而，两种菌株在乳酸生产中不同(图3)。
生理上相关的生长培养基LYBHI的组成：
LYBHI培养基(补充0.5％酵母提取物的脑心浸液培养基)(Oxoid,UK)，其补充了1mg/ml纤维二糖(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,Switzerland)、1mg/ml麦芽糖(Sigma-Aldrich)，和0.5mg/ml半胱氨酸(Sigma-Aldrich)。
表4中呈现了完整的碳和电子平衡。
实施例8
普氏粪杆菌模式株A2-165(DSM 17677)和惰性脱硫弧菌FBT-23(DSM 32187)在 LYBHI培养基中单独培养和共培养的代谢概况
在LYBHI培养基(组成如实施例7中所述)中，评估普氏粪杆菌模式株A2-165和惰性脱硫弧菌菌株FBT-23的协同作用。
如图2中所示，普氏粪杆菌生产的乳酸用作惰性脱硫弧菌的电子供体，并且反之，惰性脱硫弧菌生成的乙酸可以被普氏粪杆菌用于丁酸生产。
在LYBHI培养基中，在共培养条件下，丁酸生产提高1.5倍，且乳酸生产降低2.3倍(图4，表3)。这表明了共培养/交叉供养的有益效果，即增加的丁酸生产。
表4中呈现了完整的碳和电子平衡。
实施例9
普氏粪杆菌FBT-22(DSM 32186)和惰性脱硫弧菌FBT-23(DSM 32187)在LYBHI培养 基中单独培养和共培养的代谢概况在LYBHI培养基(组成如实施例7中所述)中，评估普氏粪杆菌FBT-22和惰性脱硫弧菌菌株FBT-23的协同作用。
在LYBHI培养基中，在共培养条件下，丁酸生产提高2.1倍，且乳酸累积减少2倍(图5，表3)。这显示了存在交叉供养和协同作用。
表4中呈现了完整的碳和电子平衡。
表3：在生理上相关的生长培养基脑心浸液(LYBHI)中，普氏粪杆菌分离物和模式株A2-165的SCFA倍数变化。数据说明不同菌株对丁酸生产的协同作用。
丁酸 乙酸 乳酸
空白LYBHI培养基 1.0 1.0 1.0
惰性脱硫弧菌FBT-23(D·p) 1.0 3.5 0.4
普氏粪杆菌FBT-22(F·p) 4.2 0.0 14.1
F.p+D.p 7.5 1.8 7.1
普氏粪杆菌模式株(F.p A2165) 5.0 0.0 8.8
F.p A2-165+D.p 6.8 0.0 3.8
表4：普氏粪杆菌FBT-22(DSM 32186)、普氏粪杆菌A2-165(DSM 17677)和惰性脱硫弧菌菌株FBT-23(DSM 32187)的单独培养和共培养的碳和电子平衡
Figure BDA0004039426000000271

Claims (19)

1.包含普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的菌株和惰性脱硫弧菌(Desulfovibriopiger)的菌株的组合物在在制备药物中的用途，其中所述惰性脱硫弧菌的菌株具有一种或多种以下特征：(i)产生乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体的能力，所述药物用于治疗或预防与丁酸水平降低相关的疾病，或与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量相关的疾病，其中所述组合物能够增加普氏粪杆菌的生长和丁酸产生，并且其中对普氏粪杆菌的生长和丁酸产生增加的作用在所述菌株之间是协同作用。
2.权利要求1的用途，其中所述菌株组合在一起施用，或顺次地，或单独地施用。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述惰性脱硫弧菌的菌株具有(i)至(iii)的所有特征。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述普氏粪杆菌的菌株具有(i)产生丁酸的能力，和任选地以下一种或多种：(ii)消耗乙酸的能力，(iii)产生细胞外电子的能力，和(iv)产生乳酸的能力。
5.权利要求4的用途，其中所述普氏粪杆菌的菌株具有(i)至(iv)的所有特征和/或所述惰性脱硫弧菌的菌株具有(i)至(iii)的所有特征。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述普氏粪杆菌的菌株包含L-乳酸脱氢酶基因。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中与单独的普氏粪杆菌菌株的丁酸产生相比，当两种菌株都存在时，丁酸产生增加。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述普氏粪杆菌的菌株是DSM32186或DSM17677和/或所述惰性脱硫弧菌的菌株是DSM32187。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述用途导致普氏粪杆菌细菌在胃肠道中的生长和定殖增加，并且其中所述用途导致胃肠道中的丁酸产生增加。
10.权利要求1-9任一项的用途，其中所述疾病选自生态失调、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、肥胖症、痛风、贮袋炎、慢性肾病、银屑病、虚弱、炎性肠病、肠易激综合征、与肠易激综合征相关的腹痛、便秘，以及与便秘相关的疾病。
11.权利要求10的用途，其中所述疾病是2型糖尿病或妊娠期糖尿病。
12.惰性脱硫弧菌的菌株在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与普氏粪杆菌细菌的丁酸水平降低相关的疾病，或与普氏粪杆菌细菌的减少或低数量相关的疾病。
13.权利要求12的用途，其中所述惰性脱硫弧菌的菌株是DSM32187，和/或其中所述用途如权利要求9-11中的任一项所定义。
14.一种组合物，其包含普氏粪杆菌菌株和具有一种或多种以下特征的惰性脱硫弧菌的菌株：(i)产生乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体的能力。
15.权利要求14的组合物，其中所述菌株如权利要求3-8中任一项中所定义。
16.一种试剂盒，其包含：
(i)普氏粪杆菌的菌株；和
(ii)具有一种或多种以下特征的惰性脱硫弧菌的菌株：(i)产生乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体的能力。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述菌株如权利要求3-8中任一项中所定义。
18.普氏粪杆菌菌株DSM32186，其中所述菌株(i)产生丁酸的能力，(ii)消耗乙酸的能力，(iii)产生细胞外电子的能力，和(iv)产生乳酸的能力，并且所述菌株的生长和丁酸产生在惰性脱硫弧菌菌株DSM32187的存在下增加。
19.惰性脱硫弧菌菌株DSM32187，其中所述菌株具有以下特征：(i)产生乙酸，(ii)消耗乳酸，和(iii)具有成为电子受体的能力，并且其中所述菌株能够增加普氏粪杆菌DSM32186的生长和丁酸产生。
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