EP3479122A1 - Schnelltest für den erreger- und zellnachweis und verfahren - Google Patents

Schnelltest für den erreger- und zellnachweis und verfahren

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Publication number
EP3479122A1
EP3479122A1 EP17737240.6A EP17737240A EP3479122A1 EP 3479122 A1 EP3479122 A1 EP 3479122A1 EP 17737240 A EP17737240 A EP 17737240A EP 3479122 A1 EP3479122 A1 EP 3479122A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pathogens
immobilization
enrichment
localization
sample
Prior art date
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Pending
Application number
EP17737240.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Guido BÖSE
Markus Ganter
Taleieh Rajabi
Andreas Guber
Ralf Ahrens
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zendia GmbH
Original Assignee
Zendia GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Zendia GmbH filed Critical Zendia GmbH
Publication of EP3479122A1 publication Critical patent/EP3479122A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • G01N2333/445—Plasmodium

Definitions

  • the present invention relates to a test system for the diagnosis of diseases according to the independent claim 1 and a test method for the diagnosis of diseases according to the independent claim 8 and a use of a test system and / or test method for the diagnosis of diseases according to the independent claim 15.
  • Test systems for the diagnosis of Diseases are known in the art. For example, a variety of analytical methods and methods are used to elicit antibody reactions, so-called immune reactions, which are used for the determination of (bio) markers and many other substances / analytes. Furthermore, microscopy-based methods in the field of diagnostics are described.
  • PoC testing procedures are diagnostic examinations that can not be performed directly and individually on a patient / subject within a short time on-site.
  • PoC test systems such as Immunochromatographic test strips which detect a soluble biomolecule, eg a hormone or a protein in blood, urine or saliva, by means of a color reaction via antibody binding
  • Known PoC test strips are for example pregnancy tests, blood coagulation tests, offered with or without a measuring device Rapid test methods such as the lateral flow test (LFT), flow-through test (FTT), agglutination test (AT) or solid-phase test (SPT) are all known for rapid detection of analytes suitable for visual evaluation in the PoC range
  • LFT lateral flow test
  • FTT flow-through test
  • AT agglutination test
  • SPT solid-phase test
  • a small amount of blood is taken, of which a smear or preparation is prepared as a so-called thick drop and stained with Giemsa dye.
  • Giemsa dye After fixation and drying of the preparation of the parasite can be detected under the microscope in the red blood cells (erythrocytes) and differentiated by the expert.
  • This method requires not only a trained practitioner, but also a laboratory environment and an expensive microscope. In most malaria areas, such a laboratory is not available anyway. Existing molecular biology tests are also expensive and also require deeper user knowledge. Also known are lateral flow rapid tests (supra), which can detect parasite-specific antigens, but not the parasites as such or affected cells and therefore do not allow pathogen or cell diagnostics.
  • a robust and rapid diagnosis for the rapid detection of pathogens at the site of the sample name is needed to determine the source of infection, to initiate appropriate therapy of sick patients and to prevent further infection of humans.
  • Immune detection of the pathogens in rapid tests such as the lateral flow test (LFT), flow-through test (FTT), agglutination test (AT) or solid-phase test (SPT). Therefore, those systems of particular interest are those which have surface antigen-independent analysis of the agents and cells and can be used as POC and / or rapid tests. Detection method via DNA or RNA analysis e.g. By PCR or cultivation of the pathogens are complex in terms of apparatus and time and costly. Thus, there is a great need to develop a test system with a surface antigen-independent analysis as POC and / or rapid tests, which allows complex diagnostics. The complex diagnostics should in particular enable a pathogen and cell diagnostics from body fluids or food and / or drinking water.
  • LFT lateral flow test
  • FTT flow-through test
  • AT agglutination test
  • SPT solid-phase test
  • test system and a test method and a use of the test system and / or test method which at least partially remedy the aforementioned disadvantages.
  • object of the present invention to detect inexpensive and in a very short time a variety of pathogens and / or cells, in particular independent of a laboratory equipment.
  • a test system for the diagnosis of diseases with the technical features of claim 1 and a test method for the diagnosis of diseases with the features of claim 8 and a use of the test system and / or test method with the features of claim 15 is proposed, the following particular importance.
  • the test system comprises at least one means for permeabilization and / or lysis of at least one pathogen and / or at least one cell and / or a means for binding and / or marking of parts of the pathogens and / or cells and / or a means for localization, Immobilization and / or enrichment of at least one component of a pathogen and / or a cell and / or a means for image processing, whereby an optical reading of at least one means for localization, immobilization and / or enrichment is feasible.
  • the readout can take place via an arranged optical magnification unit.
  • the reading can take place via a mobile computer unit.
  • structures for means for binding and / or labeling can preferably be made available to a fluorescent label, which without these means would not be accessible by compartmentalizing structures such as a lipid membrane or cell wall.
  • immobilization and / or enrichment parts of the pathogens and / or cells can be arranged from a liquid sample.
  • the marking can be optically read with the aid of a means for image processing, and a sufficient intensity and contrast effect can be obtained for one or more images and / or images which can be read out via the optical magnification unit and image processing device in the mobile computer unit, so that effective image processing can be done and thus the desired pathogens and Cells can be detected by imaging.
  • a specific immunostaining and / or specific DNA staining infected cells appear in contrast as colored and / or fluorescent dots and / or areas in front of a less colored and / or weaker fluorescent background, while uninfected cells may be invisible and / or only weak can remain visible.
  • an optical magnification unit may constitute a unit which may include at least one objective and / or may include an array of one or more objectives and / or lenses, similar to a microscope, which may have sufficient magnification. Such an enlargement can be achieved, for example, via a connection with a microscope. If such a microscope is used, image data can alternatively be transmitted directly to the computer unit.
  • powers of the optical magnification unit in the presence of the image processing device are preferably conceivable with magnifications of approximately 2.5 times to approximately 5 times, preferably approximately 10 times to approximately 1000 times.
  • the resolution can be about 5 ⁇ , preferably about 0.1 ⁇ to about 2 ⁇ , in particular of about less than 0.5 ⁇ .
  • the magnification factor can be fixed or variable.
  • a variable lens such as a liquid lens, for example, the company Optotune Switzerland AG or Vario Optics AG can be used.
  • the optical magnification unit or image processing device may preferably have one or more arbitrary light sources, such as a white light and / or fluorescence illumination.
  • the fluorescence illumination can be used as excitation light for fluorescent dyes.
  • an image processing device according to the invention can be arranged to the mobile computer unit, in particular in the form of a camera.
  • the image processing device may be used to acquire image data from an optical magnification unit.
  • a mobile computer unit can represent a unit that is made available, for example, by a mobile telephone with computer function (smartphone) and / or by a laptop and / or tablet computer (tablet, tablet computer).
  • the mobile computer unit can essentially comprise a central unit and / or a processor which can execute the arithmetic and process steps required for image processing.
  • the image processing may further comprise an analysis mode, wherein summary gray levels, color values and / or color contrasts, preferably fluorescence signals, can be detected in an image detail.
  • the detection can be qualitative and / or quantitative.
  • This critical value is determined empirically for the test system and serves, for example, to distinguish it from the background signal of the marker ligand of specifically bound labeling ligand still present in the solution in an immunofluorescence.
  • the quality of the image processing can be increased by successively examining individual image sections of a larger field. This can be done by a mere selection in image processing. Alternatively or additionally, the quality of the image processing can also be done by an optical magnification of each image section, for example, a delineated object with an intensity above a critical value can be defined as a pathogen.
  • a quality analysis in the context of the image analysis.
  • the standard deviation of the results can be calculated in several sections. Alternatively or additionally, it can also be determined how close a calculated value is to a critical value. A close proximity of the calculated value to the critical value or to a large standard deviation can be concluded from the poor quality of the measurement.
  • a program can thus likewise be carried out on a computer unit, for example as an app on a smartphone, which has at least one of the following basic functions: reading of image data, image processing, quantitative and / or qualitative output of an image processing and / or analysis result.
  • the program may include a quality analysis related to the quality of the analysis of a sample.
  • the link with further information comes into consideration, in particular internal or external databases on clinical pictures, addresses of medical services, transmission of the pathogen images to healthcare professionals and the like.
  • the test system comprises means for localization, immobilization and / or enrichment elements for receiving a sample fluid.
  • the sample fluid originates from a body fluid and / or a food sample and / or drinking water.
  • a body fluid may preferably be blood, whole blood, urine, saliva, synovial fluid, cerebrospinal fluid, plasma and / or serum and / or tear fluid, sweat, lymph fluid and / or intercellular fluid.
  • Including conventional adjuvants and additives such as anticoagulants, protease inhibitors, stabilizers and / or enzyme inhibitors are treated.
  • Patients are each subject, regardless of a Symptomatikund / or disease and that human and animal, especially mammal.
  • Such body fluids contain analytes, particularly cells that may contain infected cells and / or pathogens as such.
  • pathogens are bacteria, fungi, viruses and / or parasites.
  • a sample fluid of a food sample may comprise any dilution, solution, extract and / or smear of a foodstuff.
  • a sample fluid of drinking water may further comprise an unchanged and / or concentrated and / or diluted sample and / or a liquid uptake of a filtration residue.
  • test system has means for permeabilization, wherein advantageously access for ligands to at least one biomolecule and / or to at least one structure of a pathogen and / or to at least one cell can be achieved.
  • structure and / or the cell it is conceivable for the structure and / or the cell to have at least one opening with a size between approximately 1 nm and approximately 12 ⁇ m can have. Complete lysis of the cell can also be produced.
  • a permeabilization and / or lysis of pathogens and / or cells may be a process for generating a temporary and / or permanent permeability of outer and / or inner cell membranes, cell walls, murein envelopes, virus envelope and / or lipid membranes and / or other compartmentalizing structures, to allow accessibility of antibodies, labeled antibodies, ligands and / or ligand-loaded magnetic particles to internal structures, antigens and / or biomolecules of the pathogens and / or cells.
  • a means for permeabilizing and / or lysing pathogens and / or cells may comprise a moiety and / or substance that provides accessibility to biomolecules and / or structures of the pathogens and / or cells that are typically present, for example, in living pathogens and / or or cells are separated by a lipid membrane, cell wall, virus envelope and / or other Zellumhüllenden layer and are not accessible for example for immunoanalysis.
  • Such agent may provide pores in a membrane by pore proteins and / or destabilize the membrane by cholesterol withdrawal and create openings in the membrane and / or by osmotic effects such as swelling and bursting of the cells lead to openings in the cell membrane and / or by electrical and / or generate mechanical pulses openings.
  • An agent may further comprise any other agents which provide one or more openings in the cell membrane, cell wall, viral envelope, lipid membranes and / or penetration of these, for example by similar means of transfection applied agents such as fused and / or imported vesicles, magnetic particles and / or allow penetrating nanoparticles.
  • These agents can be substances for permeabilization and / or lysis, such as saponins, for example for the lysis of erythrocytes, bacteria, fungal cells and / or other eukaryotic cells, digitonin for the temporary permeabilization of, for example, eukaryotic cells, porins, for example for the permeabilization of lipid membranes, streptolysin O.
  • ammonium chloride eg for the lysis of erythrocytes
  • detergents such as deoxycholates, Triton X100, NP-40 and / or other substances such as acetone and / or ethanol for destabilization of the cell membrane, ethylenediaminetetraacetic acid for permeabilization of the outer membrane of gram-negative bacteria, lysozyme and / or Autolysins eg for lysis of the peptidoglycanic wall of gram-positive bacteria, lactoferrin, defensins and cathelicidins of gram-negative bacteria and other substances, but also an electric field which, like an electroporation, can make the cell membrane temporarily and / or permanently permeable and / or a mechanical and / or other action which leads to permeabilization and / or lysis and provides extended accessibility of biomolecules of the pathogens and / or cells for ligands.
  • These agents can be combined with fixing substances such as paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, methanol, ethanol.
  • the sizes of the apertures produced can range from about 1 nm to about 12 ⁇ , and can result in temporary permeabilization for a few milliseconds until permanent lysis of the cells.
  • means may be conceivable which can serve to accommodate ligands and / or magnetic particles without the formation of openings, such as means which can also be used in a transfection, such as vesicles, magnetic particles, penetrating nanoparticles, import-triggering substances.
  • they may be agents which lead to a release of biological structures and / or molecules and / or other parts of the pathogens and / or cells, which would remain without these agents inside the cells and / or pathogens and thus before a Detection by the immune system would be shielded.
  • This may include lysis and / or other destruction of the pathogens and / or cells and / or the induced release and / or release of biological structures and / or molecules by export and / or through pores and / or openings.
  • means for the localization, immobilization and / or enrichment of at least one component of pathogens and / or cells can be used for the test system.
  • at least one component of pathogens and / or cells can be enriched.
  • the means for localization, immobilization and / or enrichment may be a reaction vessel such as an Eppendorf reaction vessel and / or a filtration column.
  • a sample and / or means for permeabilization and / or means for binding and / or means for labeling may be miscible with each other and may for example be immobilized via a magnet and detected via a means for image processing such as a fluorescence spectrometer and / or a fluorescence imaging microscope become.
  • the means for localization, immobilization and / or enrichment may have a microfluidic structure for dissolving and / or mixing substances.
  • Such means for localization, immobilization and / or enrichment may preferably be a test strip having a microfluidic structure.
  • Such a test strip is preferably made of one or more transparent material and / or materials, such as a planar plastic and / or glass, that may be capable of receiving a body fluid and / or other fluid sample.
  • a sample can pass through the test strip, in particular by means of at least one incorporated and / or applied channel and / or microchannel, in particular with a rectangular, trapezoidal and / or arcuate cross section.
  • the channel may be a capillary and / or permit laminar and / or non-laminar flow by gravity and / or capillary force and / or pumping forces and / or other forces.
  • the test strip may preferably be used to carry out the detection method of pathogens and / or cells consisting of a sample uptake, addition and mixing with one or more permeabilization agents, addition and mixing with one or more binding and / or marking structures of the Pathogens, cells and / or their components, an incubation of the sample, a subsequent localization, immobilization and / or enrichment of the pathogens and / or cells and / or their components in a detection range include.
  • the test strip may also preferably provide a flow maintenance device, for larger volumes up to several liters, to external pumping systems.
  • the sample receptacle can have a reservoir into which a defined volume, in particular of a few microliters of a sample, for example with a micropipette, can be added. For volumes of several liters, these can be given up via a connection from an external system.
  • the sample can be provided with (dried) chemicals such as EDTA, heparin for anticoagulation and / or dyes for histological cell staining, which can be solved by the discontinued sample.
  • the uptake can preferably take place by means of a capillary with a defined volume and a filling indication.
  • the whole blood can preferably be sucked in until full filling and thus provide a defined volume.
  • the capillary is located, for example, in a lid that fits the test strip, then the defined blood volume can then be applied to the test strip by attaching the lid to the test strip.
  • the lid may preferably include structures that irreversibly engage when attached to the test strip.
  • Another embodiment may have a microfluidic structure with defined Volume belong to the test strip include, in which the whole blood is sucked in and can get in contact with the other microfluidic system, for example, by moving the capillary and / or microvalves and / or other devices after the volume definition, so that the whole blood are applied in this can.
  • the application of the agent for permeabilization and / or lysis and the means for binding and / or for marking specific structures can be carried out via a solution of lyophilized substances by the passing sample.
  • the anterior volume in the test strip may comprise more solute than the posterior volume.
  • the test strip may preferably have at least one mixer structure which can mix the dissolved substances with the sample. In the case of a microfluidic structure, this may be a mixing chamber with and / or without external mechanical action, a zigzag structure and / or another device for mixing.
  • a further embodiment may comprise a splitting of the microfluidic sample flow into at least two channels, it being possible for the lyophilized substances to be added to a sample part in a first channel and for a sample part to be conducted past the latter in the second channel. Subsequently, the channels can be at least partially brought together again and mixed in a mixer structure, the two sample parts together.
  • the flow rates may preferably be determined by the channel dimensions. With such an embodiment it can be achieved that the rear sample volume from the second channel can also be mixed with sample volume containing substances from the first channel. In this case, an immunofluorescence staining with a labeling ligand can take place simultaneously.
  • test strip may preferably provide a flow maintenance device for small volumes of a few microliters, for larger volumes up to several liters connections to external pumping systems.
  • the device for maintaining the microfluidic flow can preferably comprise a capillary pump following the detection region, which can be activated by capillary forces Draws liquid into a waste compartment subdivided with microstructures.
  • a material which exerts a suction force such as a filter fleece and / or absorbent fleece, may be integrated into the test strip such that it can at least temporarily make contact with the microfluidic channel and preferentially draw liquid through the test strip.
  • a micropump can be integrated into the test strip, which can control the flow. This can be a stamp which presses liquid from a blister into the microfluidic channel, a suction device which sucks liquid from the channel via negative pressure and / or another device such as, for example, the micropump mp6 from Bartels Mikrotechnik GmbH.
  • a barcode can be printed on a test strip and / or an RFID element can be incorporated, which may contain usual information about the test strip, eg the type of test (eg diagnostics for malarial pathogens, Legionella and / or sepsis) and / or Expiration date of the test strip, among others
  • the test system may comprise means for localization, immobilization and / or enrichment, which on the one hand can have a microfluidic structure for incubating a sample fluid with capture and / or label ligand and at least one detection region.
  • at least one constituent of at least one labeled pathogen and / or at least one labeled cell can be accommodated on the means for localization, immobilization and / or enrichment.
  • the staining may preferably be a simple histological staining of the cell plasma, a lipid membrane, cell wall and / or the DNA and / or an immunochemical stain such as a fluorescent stain.
  • the background signal of the specific marking by the dyeing solution remaining in the channel may not be relevant in the measurement since the dyeing solution may preferably be low concentrated.
  • the dyeing liquid spreads in the channel, and / or has flowed through it, one or more unbound label ligands may be distributed in the channel which may bind to permeabilizable markers of the pathogens and / or cells.
  • the concentration of labeling ligands in the dyeing liquid is preferably selected so that label ligands can be enriched in the infected cells, pathogens and / or their components against the free label ligands present in the liquid.
  • pathogens, cells, infected cells and / or components thereof may preferably appear in contrast as lighter colored / fluorescent dots and / or areas in front of a colored / fluorescent background, while other liquid components such as uninfected cells may remain invisible and / or only weakly visible .
  • Incubation of the sample can be achieved, for example, by an embodiment of the test strip which may contain an incubation structure. This can be, for example, a zigzag structure, which can be flowed through in periods of a few seconds to several minutes and can both mix the sample and allow incubation.
  • substances for permeabilization and / or lysis of the pathogens and / or cells can be presented in a lyophilized form and, as described, dissolved through part of the sample volume, mixed into the sample and incubated. If the pathogens and / or cells are subsequently nonspecifically or specifically retained, immobilized and / or trapped in the microfluidic structure, sequential addition of the labeling ligand to the marking of the structures sought can also take place. In one embodiment, a wash and / or a scavenger ligand and / or a label ligand can be added externally.
  • the test strip may comprise a fluid-filled blister which may be opened by the user and / or a device such as a mechanical punch in the means for receiving the test tire such as an optical reader.
  • the liquid can enter the microfluidic channel and can either already contain the ligands and / or be dissolved in the channel from an initially presented, lyophilized form and subsequently surround the pathogens and cells.
  • Such a test strip may preferably have a detection region of the microfluidic channel system in which preferably fluorescently labeled pathogens, cells and / or their components are immobilized and preferably can be enriched by holding them while the remaining liquid can continue to flow to a collection reservoir ,
  • the detection area can be arbitrarily large and arbitrarily designed configured.
  • test strip may contain a means for localization, immobilization and / or enrichment of at least one microfluidic structure made of PET, in which an aqueous liquid preferably passively flows through the material properties of the PET without further coating.
  • This microfluidic structure can be completely and / or partially closed with a film instead of a rigid lid.
  • the structure can be subdivided into one or more areas, which are first closed, thus forming a dead end, as a result of which the liquid does not flow further through it and which liquid can flow through the liquid after opening, such as, for example, piercing a film over the ventilation opening located behind it.
  • This can in particular form a subdivision into a sample receiving area, a mixing area and a detection area. In the sample receiving area, a defined sample volume of a liquid, such as whole blood from the fingertip, may be picked up due to capillary forces.
  • a mixing area can be arranged, behind which a second ventilation hole can be arranged, which is initially closed. If the film is opened over this and pierced, for example, the sample flows into the mixing area in which the sample is preferably with lyophilized substances such as an anticoagulant and / or a capture ligand with or without Magnetbeads and / or one or more labeling ligands and / or Stabilizers and / or a means for lysis and / or permeabilization can be mixed.
  • lyophilized substances such as an anticoagulant and / or a capture ligand with or without Magnetbeads and / or one or more labeling ligands and / or Stabilizers and / or a means for lysis and / or permeabilization can be mixed.
  • the sample receiving area and the mixing area can also be overlapping or be identical.
  • a detection area can be arranged, which provides a viewing window for an imaging microscopic measurement. If another ventilation hole located behind the detection area, for example, closed with foil, is opened, the sample flows into the detection area.
  • the pathogens can be localized and / or enriched and / or, preferably by an external magnetic field, immobilized and imaged.
  • the test system may also comprise means for binding at least one capture ligand and / or at least one labeling ligand for labeling, in particular staining.
  • an aptamer and / or a ligand can be included and / or a micro-particle, nanoparticles, magnetic nanoparticles can be included, which can be coupled with an antibody, aptamer, ligands.
  • an at least magnetic nanoparticle preferably a turbobead and / or a metal core, may be bindable to at least one constituent of pathogens and / or cells via a coupled ligand.
  • Binders and / or markers may comprise one or more capture ligands and / or label ligands which may preferentially bind to antigens and / or biomolecules of whole or part of cells and / or agents.
  • Ligands may preferably be antibodies, aptamers, peptides, protein ligands, micro-particles, nano-particles, magnetic beads, reactive substances, but also other ligands and / or a combination of the abovementioned, which bind to so-called markers such as antigens, biomolecules and / or other structures of the pathogens and / or cells and / or their constituents can specifically bind.
  • ligands can first be prepared by a means for permeabilization with markers such as biomolecules, structures and / or antigens of the pathogens and / or cells of which they are without the means for permeabilization by a cell envelope, cell membrane, cell wall, virus envelope, lipid membrane and / or other compartmentalized structure would come into contact.
  • Capture ligands may serve to immobilize the pathogens, cells and / or their constituents in order to preferably achieve an enrichment over a detection range.
  • magnetic particles such as preferably magnetic microparticles, in particular Dynabeads or magnetic nanoparticles (MNP), in particular turbobeads, but also other non-fluorescent and / or fluorescent MNP, with or without tethered Antibodies, aptamers and / or ligands
  • MNP magnetic nanoparticles
  • this may mean the immobilization of bound pathogens, cells and / or their constituents, preferably on the bottom and / or the ceiling of a microchannel, over a detection area by means of a magnet.
  • label ligands can be used which can preferentially bind to a second, independent binding site of pathogens, cells and / or their constituents.
  • ligands may preferably be coupled with a fluorescent dye, fluorescent nanoparticles such as quantum dots and / or dye, magnetic particles and / or gold particles, so that their binding to the cell surface produces a sufficient signal, preferably a fluorescence signal, and preferably by means of an optical signal Magnification can be made visible against the background, so that individual visual color values, grayscale and / or contrasts can arise. Therefore, the invention may also relate to a test system, wherein the analyte bound to the test strip, cells, pathogens are labeled by means of a labeling ligand, which is coupled to a dye preferably a fluorescent dye, dye, nanoparticles, magnetic particles and / or gold particles, and preferably an image analysis can be made accessible.
  • a labeling ligand which is coupled to a dye preferably a fluorescent dye, dye, nanoparticles, magnetic particles and / or gold particles, and preferably an image analysis can be made accessible.
  • a double detection in the sandwich system on the one hand for example by a capture ligand of specific antibody to magnetic particles and on the other hand by a labeling ligand such as a fluorescently labeled antibody take place.
  • a capture ligand of specific antibody to magnetic particles and on the other hand by a labeling ligand such as a fluorescently labeled antibody take place.
  • a labeling ligand such as a fluorescently labeled antibody
  • the method can be the enrichment and clear visual recognition of cell types such as malaria-infected erythrocytes, CD4 + cells and / or also infected cells in HIV diagnostics, also the detection and typing of bacteria in the diagnosis of eg sepsis, Legionella, cholera, Allow tuberculosis etc.
  • a labeling ligand also coupled enzymes can be used for an enzymatic detection reaction, so that a color reaction and / or electrochemical reaction can be detected, which is detectable.
  • a filtration device for example consisting of a filter material such as For example, a "Vivid" plasma separation membrane from Pall Corp., a microporous and / or nanoporous membrane with subcellular pore diameters, and / or other structures having a sifting function may permit passage of the fluid, but nonspecific pathogens and / or cells This may be integrated at one end of the channel and / or laterally in a channel wall.
  • the accumulated pathogens, cells, infected cells and / or their constituents may be specifically marked by one or more labeling ligands
  • labeling ligands such as fluorescently labeled antibodies, aptamers and / or other ligands may be a specific coloration of the sought structures of the pathogens, cells and / or their constituents.
  • the test strip may contain a filter for nonspecific damming all Cells and / or pathogens while the labeling of the desired pathogens can preferably
  • fluorescence staining of the DNA can also take place.
  • parallel membrane staining can be carried out to detect all cell outlines by means of white light and / or via spectrally separated fluorescence detection.
  • magnetic particles can preferably be coupled to the ligands which can specifically bind to the cellular structures, thus enabling their magnetic capture and accumulation by application of an external magnetic field.
  • the magnetic force may preferably lead to immobilization of the magnetic particles in the test strip, such as on the floor and / or on the ceiling of a microfluidic channel.
  • Commercial magnetic particles which can usually be used for catching cells via surface antigens by means of antibodies, aptamers and / or ligands, may in particular have a diameter of approximately 1 nm to approximately 12 ⁇ m.
  • Thermo Fisher Scientific offers, for example, Dynabeads 1 ⁇ m micron microparticles or 2.8 ⁇ m Dynebeads with various surface groups such as streptavidin, biotin and / or chemical coupling groups such as azide and / or Amino groups for attachment of biomolecules, antibodies, aptamers and / or ligands.
  • microparticles may be too large to be able to penetrate through the openings produced into permeabilized pathogens and / or cells and / or be absorbed by other techniques. This can for example take place only when the pathogens and / or cells are lysed and fragmented, so that structures from the inside can be accessible to the microparticles.
  • the pathogens and / or cells may be permeabilized but maintained in their form by the cytoskeleton and thus remain physiologically recognizable.
  • Magnetic nanoparticles (MNP) may have a diameter of about 5 nm to about 500 nm, and thus penetrate through openings in permeabilized pathogens and / or cells.
  • non-fluorescent MNPs with coupled antibodies, aptamers and / or ligands can be used in order to be able to specifically bind to antigens and / or structures after permeabilization of the desired pathogens and / or cells.
  • the MNPs with the bound pathogens, cells and / or their components can be immobilized in the detection area, for example at the channel ceiling and / or the channel bottom.
  • a labeling ligand a specific, detectable signal can be generated on the desired pathogens, cells and / or their constituents.
  • immunofluorescence can be produced in the sandwich structure.
  • the DNA can be stained by plasmodia using a fluorescent and / or non-fluorescent DNA dye.
  • the Magvigen particles from Nvigen Inc. have diameters of, for example, 200 nm to 500 nm and are available on their surface with coupling groups and / or proteins.
  • a chemical coupling can be possible as well as existing on the MNP proteins such as avidin and / or a second antibody.
  • Turbobeads Llc. also offers magnetic nanoparticles, called turbobeads, with various surface groups such as streptavidin, biotin and / or chemical coupling groups such as azide and / or amino groups for attachment of biomolecules, antibodies, aptamers and / or ligands.
  • Turbobeads can have a diameter of about 30 nm, but preferably about three times stronger magnetic properties by using a metallic core instead of the usual MNP ferrite core. The magnetic separation can thus be significantly faster and more efficient than with conventional MNPs.
  • Magnetic nanoparticles which are fluorescent at the same time, can bind the target structures via coupled antibodies, aptamers and / or ligands and can be used both for magnetic capture and for fluorescence labeling.
  • the magnetic and fluorescent MyQuVigen particles from Nvigen Inc. and also the NanoScreenMag MNP from Chemicell GmbH are also offered with different surface groups, eg for antibody coupling. This combination may have the advantage of a simple method of simultaneously immobilizing the labeled pathogens over a magnet and the fluorescent label.
  • a fluorescence background can arise from single, unbound particles, which must be reliably differentiated from pathogen-bound MNPs.
  • the immobilization of the pathogens, cells and / or their components can be separated from the label, that is, separate capture ligands and labeling ligands can be used.
  • the test method for diagnosing diseases comprises at least one of the following steps: applying a sample fluid, in particular a liquid, to the means for localization, immobilization and / or enrichment.
  • a sample fluid in particular a liquid
  • this may allow application at the point-of-care, for example, simply by sucking a drop of capillary blood from the fingertip by an untrained person and automated processing of the sample in a sealed means for localization, immobilization and / or enrichment without further intervention by the user and / or laboratory equipment, for example, for the precise addition of substances, pathogen culture, centrifugation, etc. is necessary.
  • a means for permeabilization to the means for localization, immobilization and / or enrichment can be carried out, whereby access of ligands to structures of at least one exciter contained in the sample fluid and / or at least one cell is achieved becomes.
  • This can preferably be done by dissolving a substance lyophilised in the means for localization, immobilization and / or enrichment and / or by opening a blister with the substance presented without user intervention.
  • the means for localization, immobilization and / or enrichment may provide the necessary mixing and incubation of the sample with the means for permeabilization. This can lead to permeabilization and / or lysis of compartmentalizing components of the pathogens and / or cells such as a lipid membrane and / or cell wall.
  • a labeling ligand in particular a fluorescent dye to at least one antibody and / or a DNA dye and / or applying and / or releasing a capture ligand to the means for localization, immobilization and / or enrichment be performed.
  • a labeling ligand in particular a fluorescent dye to at least one antibody and / or a DNA dye and / or applying and / or releasing a capture ligand to the means for localization, immobilization and / or enrichment be performed.
  • This may preferably be done without user intervention by dissolving a substance lyophilised in the means for localization, immobilization and / or enrichment and / or by opening a blister with the substance presented.
  • the means for localization, immobilization and / or enrichment can thereby provide the necessary mixing and incubation of the sample with the means for binding and the means for labeling.
  • marking at least one component of at least one pathogen and / or at least one cell is conceivable.
  • a means for binding and / or labeling can gain access to structures of the pathogen and / or cells, for example inside the cell, so that specific binding of, for example, antibodies to antigens can take place.
  • fluorescently labeled antibodies this can produce a specific immunostaining.
  • the enrichment of at least one component of an exciter and / or a cell in particular by means of damming and / or magnetic separation in a means for localization, immobilization and / or enrichment is conceivable.
  • magnetic nanoparticles When using, for example, magnetic nanoparticles as a binding agent, they can For example, bind via a specific antibody to structures of the pathogen and / or the cell, whereby they can be enriched by means of magnetic separation.
  • damming eg by filtration of the sample liquid, can lead to the accumulation of components of pathogens and / or cells.
  • an imaging detection of an exciter and / or a cell can be provided by microscopic magnification and / or image acquisition, in particular by means of a camera, image processing and / or evaluation in a means for image processing and / or a mobile computer unit.
  • a fluorescent signal can be recorded by means of an illumination unit by means of image processing, preferably comprising a magnification unit and a camera, so that fluorescent structures of the pathogen and / or cell can be visualized in the microscopic image.
  • the image processing means and / or the mobile computer unit can, without user intervention, an object recognition of these fluorescent structures and a further evaluation such. an automatic estimation of the exciter numbers per sample volume.
  • the results can also be transmitted to medical professionals by means of the mobile computer unit, which can create a diagnosis and initiate appropriate therapy.
  • the test method can be used as a detection of diseases.
  • diseases are conceivable: infectious diseases, diseases caused by fungi, viruses and / or bacteria, and / or pathogens and / or pathogens.
  • pathogens are also conceivable as pathogens: adenoviruses, amylostomas, ascaris, babesia, bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Borrelia recurrentis, Brucella sp., Campylobacter sp., Cestoda, Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, human pathogenic Cryptosporidium sp., Ebolavirus, Echinococcus multilocularis, Echinococcus granulosus, Escherichia coli, Enterohe
  • test method is preferably a detection of malaria pathogens conceivable, which occur in particular in a blood sample.
  • test method means for localization, immobilization and / or enrichment for the detection of malaria pathogens can be used in a blood sample. It is possible that at least one structure may be available in infected erythrocytes.
  • the test method may contain a means for permeabilization, in particular saponin and / or ammonium chloride, and for at least one capture ligand, in particular at least one antibody against plasmodial proteins, which preferably can be coupled to at least one magnetic particle, in particular a turbobead, and / or one Labeling ligands, preferably at least one fluorescently labeled antibody against plasmodial proteins and / or at least one DNA dye against plasmodial DNA.
  • a means for permeabilization in particular saponin and / or ammonium chloride
  • at least one capture ligand in particular at least one antibody against plasmodial proteins
  • at least one magnetic particle in particular a turbobead
  • Labeling ligands preferably at least one fluorescently labeled antibody against plasmodial proteins and / or at least one DNA dye against plasmodial DNA.
  • At least one structure of plasmodia and / or the at least one infected erythrocyte in a sandwich structure can be detected and / or at least one infected erythrocyte and / or at least one structure of plasmodia can be detected by means of Damming and / or magnetic separation are caught in a means for localization, immobilization and / or enrichment.
  • the test method can be equipped with a means for localization, immobilization and / or enrichment, which contains at least one microcuvette also in combination with a microfluididic structure into which a sample liquid, preferably a defined amount of whole blood from the fingertip, is taken up.
  • the sample liquid may preferably be provided with lyophilized substances such as an anticoagulant and / or a capture ligand with or without magnetic beads and / or one or more labeling and / or stabilizing agents and / or lysing agents and / or permeabilization are mixed.
  • the mixture can be amplified, for example, by applying a switchable external magnetic field through which the magnetic particles contained can be passed through the solution, herringbone patterns in the channel, vibrations, sound or other mixing methods. Subsequently, the exciters or exciter components bound to the means for immobilization, such as magnetic micro- or nanoparticles, can be immobilized on a viewing window and detected microscopically.
  • the test method may comprise a means for localization, immobilization and / or enrichment with at least one microfluidic structure in combination with a filter structure, such as preferably a sucking filter pad such as present in lateral flow tests.
  • a sample liquid such as a defined amount of whole blood from the fingertip is given.
  • the sample fluid may preferably be mixed with lyophilized substances such as an anticoagulant and / or one or more labeling agents such as antibodies with a fluorescent label or gold particles and / or stabilizers and / or a lysing and / or permeabilizing agent.
  • the liquid can be brought into contact with the filter structure, for example by opening a ventilation opening and / or for example by displacement and / or by buckling of the chip and / or by overcoming a Flußbarriere.
  • the filter structure subsequently sucks up the liquid from the capillary.
  • a capture ligand such as a specific antibody against pathogen antigens can be immobilized on the filter structure.
  • the low Pore size of the filter structure such as a suction pad and the suction of the liquid come the exciters or the components in contact with the capture ligand and are immobilized. Similar to a lateral flow test, this produces a band which, unlike lateral flow tests, does not consist of a protein with bound antibodies but rather of labeled pathogens and / or cells and / or their constituents. Depending on the concentration and labeling method, for example with dye, fluorescent dye, gold particles, beads, this band can be analyzed microscopically and / or photographically and / or by eye.
  • membranes for example, at least one of the following can be used: BA83, BA85, CF1, CF3, CF4, CF5, CF6, CF7, LF1, MF1, VF2, Fusion 5, GF / DVA, AE, FF120HPFFHP.
  • a use for the diagnosis of diseases by means of a test system and / or a test method is conceivable.
  • the use according to the invention brings with it the same advantages as have already been described in detail with respect to the test system according to the invention and the test method according to the invention.
  • diagnostics at the point of care can also be carried out by an untrained person, so that the desired pathogens and / or cells can be detected locally and in real time instead of complex laboratory procedures by the test system.
  • FIG. 1 a shows a schematic representation of a target cell before permeabilization
  • FIG. 1 b schematic representation of a target cell after permeabilization
  • FIG. 2a schematic representation of a reaction vessel as a means for localization, immobilization and / or enrichment
  • FIG. 2b shows a schematic representation of a microchannel as a means for localization
  • FIG. 2c shows a schematic representation of a microchannel with accumulation device
  • FIG. 3 schematic representation of an image acquisition and processing according to FIG.
  • FIG. 1a shows a pathogen and / or an infected cell 10 with specific internal target structures 40, 50, such as an antigen, a protein, a lipid, a glycosaccharide chain, a nucleic acid chain, a peptide or other biomolecules.
  • This may be a pathogen 10 such as a bacterium having a compartmentalizing structure 30, such as a cell membrane and / or a cell wall, which substantially separates the cell interior from the cell exterior.
  • target structures 40, 50 for these bacterial species for example, on one or more internal structures 20 such as a thylakoid, ribosome, plasmid, chlorosome, flagellum scaffold, nucleoid, cytoplasmic side of the cell membrane and / or other constituents on which target structures such as antigens can be found.
  • internal structures 20 such as a thylakoid, ribosome, plasmid, chlorosome, flagellum scaffold, nucleoid, cytoplasmic side of the cell membrane and / or other constituents on which target structures such as antigens can be found.
  • a capture ligand 60 added to and / or dissolved in the outer solution, such as a specific antibody, for example with a coupled magnetic nanoparticle 70 such as a turbobead and / or a label ligand 80 such as a labeled-coupled specific antibody 90 such as, for example a fluorophore, quantum dot, enzyme, gold particles and / or other labeling can not penetrate into the interior of the bacterium due to the compartmentalizing structure 30 such as a cell wall and / or lipid membrane and / or other structure.
  • the cell 10 may also be an erythrocyte 10 infected with a malaria pathogen 20 (Plasmodium spec.).
  • the target structures 40, 50 can also be Plasmodium-specific structures that are arranged in the interior of the erythrocyte.
  • the erythrocyte is enveloped by a cell membrane which, as a compartmentalizing structure, essentially separates the cell interior from the cell exterior. It contains specific target structures 40, 50 for these plasmodium species, for example on one or more internal structures 20, such as plasmodial proteins on the cytoskeleton and / or on an inner membrane.
  • Figure 1 b illustrates a cell 10 after addition of a permeabilization agent 10, e.g. Saponin, pore-forming agents, lysing agents, import-triggering agents, hypotonic or hypertonic solutions, and / or other substances.
  • a permeabilization agent e.g. Saponin
  • pore-forming agents e.g. pore-forming agents
  • lysing agents e.g., import-triggering agents
  • hypotonic or hypertonic solutions e.g. Saponin
  • openings 31 as cracks, pores, holes, destabilized membrane areas, e.g. without cholesterol, and / or a receiving process 31 such as transport mechanisms in the compartmentalizing structure 30 arise.
  • scavenger ligand (s) 60 coupled with magnetic nanoparticle 70 and / or labeled ligand 80 added to the outer solution can penetrate into the cell and / or the pathogen and there specifically to the respective target structure 40 and 40 / or 50 bind.
  • Capturer ligand 60 and labeling ligand 80 preferably have no cross-reactivity, i. they bind to different target structures 40, 50, so that preferably a sandwich structure can arise.
  • the label ligand 80 such as a fluorescently labeled antibody
  • a target structure 40 such as a pathogen-typed antigen
  • Figure 2a is a schematic representation of a reaction vessel 121 as a means for localization, immobilization and / or enrichment with contained sample with cells 10, 1 1.
  • the cells 10 may represent target cells and cells 11 thereby non-target cell.
  • the reaction vessel 121 may be, for example, a microreaction vessel such as an Eppendorf reaction vessel and / or a chromatographic column.
  • An associated magnet 130 such as a high gradient magnet and / or a permanent magnet and / or an electromagnet and / or other magnet may generate a magnetic attraction 131 in the reaction vessel 121.
  • this attractive force 131 can act on the magnetic nanoparticles 70, as a result of which these and the target structure 50 bound via the scavenger ligand are attracted and, insofar as possible in the reaction vessel 10, can be enriched and immobilized in the spatial vicinity of the magnet.
  • the bound target structure 50 may be associated with constituents and / or the majority of the cell and / or the exciter 10 so that the bound target structure 50 with attached further constituents is in close proximity to the magnet, such as at the magnet facing Wall of the reaction vessel is enriched.
  • Non-target cells such as uninfected erythrocytes can not be bound by capture ligands and can not be enriched.
  • a labeling ligand such as a fluorescently labeled antibody and / or a fluorescent DNA dye, labeling of structures of the target cell can take place.
  • FIG. 2b shows a schematic representation of a microfluidic structure 140 as a means for localization, immobilization and / or enrichment with contained sample using a capture ligand with magnetic nanoparticle.
  • a microfluidic structure consists of a component with contained capillaries and / or microstructures and / or one or more microchannels.
  • the sample liquid with contained cells 10, 1 1 can flow through the microfluidic structure 140 in the flow direction 141.
  • An associated magnet 130 may generate a magnetic force 131 in a region of the microfluidic structure.
  • This force may act attractively on the magnetic nanoparticle 70, as shown in Figure 2a, and thus act on the coupled capture ligand 60 and a bound target structure 50 and / or preferably a tethered majority of the structure 20 and / or 10.
  • This can lead to an enrichment of the target structure and preferably of the cells 10 and / or the components of the microfluidic structure 140, in particular on the ceiling, the side walls and / or the floor.
  • Cells such as uninfected erythrocytes can not be bound and enriched by capture ligands 60.
  • a targeting of target structure (s) 40 of the target cell 10 can be carried out.
  • FIG. 2 c is a schematic representation of a microfluidic structure 140 as a means for localization, immobilization and / or enrichment with a contained sample and a backflow device in the microfluidic channel.
  • the sample liquid with contained cells 10, 1 1 can flow through the microfluidic structure 140 in the flow direction 141.
  • a backfill device in a region of the microfluidic structure may retain contained cells 10, 11 (target cells and non-target cells) and / or target pathogens 10, while the residual liquid may flow partially into / through the backflow device.
  • labeling of structures of the cell 10 can take place via binding of a labeling ligand 80, such as a fluorescently labeled antibody and / or a fluorescent DNA dye. Marked cells 10 (target cells) among the pent-up cells 10, 11 (target cells and non-target cells) can be detected by means of image processing apparatus.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of image acquisition and processing after permeabilization, labeling and / or enrichment in the case of fluorescence labeling and imaging detection.
  • the sample with the contained cells 10 can be irradiated with an excitation light 151, for example light of a wavelength in the range of 300 nm to 950 nm of an excitation illumination 150, such as an LED and / or a laser and / or an illumination source.
  • This excitation illumination may be tuned to stimulate the marker 90 to emit fluorescent light 152, such as light of a wavelength in the range of 300 nm to 1000 nm.
  • Fluorescent light 152 may then be captured by image processing means 160.
  • This image processing means 160 may be associated with a magnification unit 161 and a camera 162.
  • Image data of the camera can be processed and transmitted by means of data transmission 164, preferably wirelessly to a mobile computer unit 163, such as a smartphone.
  • the mobile computing unit 163 may evaluate this image data and also perform user guidance and control of the image processing means.
  • contained cells and / or pathogens can be located and displayed on the images.
  • a diagnosis can be made eg by transmission of the Exciter images to a computer unit 164 as another mobile smartphone by medical professionals done by this.
  • Figure 4 shows a schematic representation of a microfluidic structure 200, e.g. contains a capillary and / or a microchannel and / or other microfluidic structure.
  • a sample receptacle 210 into which a volume of liquid samples is added.
  • This can be, for example, a capillary with a defined volume.
  • the sample receptacle 210 may contain lyophilized substances such as e.g. contain an anticoagulant. The sample can then flow through the microfluidic structure 200, for example due to capillary forces.
  • the sample can be divided there, for example, by means of a branch of a microchannel, so that a first part of the sample can flow through a deposit for a solid substance 220 which has been put there, where it is e.g. lyophilized ligands can dissolve.
  • a mixer / incubation structure the first sample portion may be mixed and incubated with this substance (s).
  • the first sample portion may be merged with the second sample portion and mixed and incubated in a mixer / incubation structure 240.
  • the image processing means may detect the target cells / target agents in the detection area.
  • the flow vorgana may preferably be maintained by a suction device 250 such as a wicking mat and / or a micropump, but may also be by an external device such as a pump.
  • the solution may then be collected in a waste reservoir 260.
  • a microfluidic structure as a test strip may further contain a coding such as a barcode and / or an RFID component for identifying the sample.
  • plasmodia in the ring stage are found predominantly in infected red blood cells (iRBC).
  • the plasmodia contain DNA in contrast to the uninfected red blood cells (RBC).
  • RBC uninfected red blood cells
  • PfEMP-1 protein On the surface of iRBC, various parasitic antigens such as the PfEMP-1 protein are found.
  • PfEMP-1 protein On the surface of iRBC, various parasitic antigens such as the PfEMP-1 protein are found.
  • PfEMP-1 protein On the surface of iRBC, various parasitic antigens such as the PfEMP-1 protein are found.
  • PfEMP-1 protein On the surface of iRBC, various parasitic antigens such as the PfEMP-1 protein are found.
  • PfEMP-1 protein On the surface of iRBC, various parasitic antigens such as the PfEMP-1 protein are found.
  • only one of a pool of many variable, genetically encoded subtypes can be found
  • a parasitic antigen is the ring-infected erythrocyte surface antigen (RESA), which contrary to its name is not found on the surface of the iRBC but on the inside of the membrane of infected erythrocytes on components of the iRBC cytoskeleton, on the parasitophoric membrane and after permeabilization of the Plasmodium membrane also in the cytoplasm
  • RESA ring-infected erythrocyte surface antigen
  • the parasitic DNA can be labeled via a fluorescent DNA dye such as Hoechst 33342.
  • a filter now holds back all cells and cell components.
  • the fluorescent label can be visualized with the magnification unit with image processing unit serving as a fluorescence microscope.
  • a magnetic nanoparticle such as a turbobead PEG streptavidin, to which a biotinylated antibody, such as the monoclonal mouse IgM antibody against Pias.
  • the MNP diffuses into the erythrocytes and binds specifically to structures of the infected RBC.
  • a fluorescent DNA dye and / or a fluorescence-labeled antibody is added, which generates an immunofluorescence of the iRBC and / or plasmodia.
  • the iRBC are immobilized and enriched by means of a magnet and can be detected by fluorescence microscopy be detected by imaging.
  • nanoparticles such as the NanoScreenMag particles of Chemicell GmbH and / or the MyQuVigen nanoparticles of Nvigen Inc. are added as a means of binding and labeling to the permeabilized iRBC.
  • these can be immobilized by means of a magnet and detected by fluorescence microscopy by the optical magnification unit.
  • the image data with the fluorescently labeled iRBC may each be subjected to a first processing by the image processing apparatus such as background correction and / or compression.
  • objects can be searched in the images by means of an object recognition app, whose intensity is above a critical value and which can have a certain size and / or number of pixels and which are thus defined as a pathogen.
  • This evaluation can be done in the image processing device and / or in the mobile computer unit.
  • the object detection can be further secured by appropriate controls such as cell detection with white light illumination and / or fluorescence detection after membrane staining. From the detection of pathogens can be concluded on a diagnosis of the patient.
  • Another possibility as an application example for the detection of malaria pathogens is the addition of saponin as a means for lysis and permeabilization to plasmodium-infected erythrocytes in a whole blood sample.
  • saponin By the action of saponin, the outer erythrocyte membrane is lysed and the parasite can be released from it, while the parasitophorous vacuole is retained.
  • At least one structure such as parasitophoric antigens such as the proteins RAP1 or EXP2 are present on this parasitophoric membrane. These are stored for example in Rhoptrien, Micronemen or Dense Granules and are therefore already present in early trophozoites.
  • At least one catcher ligand 60 in particular at least one antibody to plasmodial proteins such as RAP1 or EXP2, such as the monoclonal antibody anti-RAP-1, clone 2.29 or the monoclonal antibody anti-EXP-2, clone 2.2 can bind to these.
  • RAP1 or EXP2 such as the monoclonal antibody anti-RAP-1, clone 2.29 or the monoclonal antibody anti-EXP-2, clone 2.2 can bind to these.
  • This antibody is preferably attached to at least one magnetic micro- or nanoparticle 70, in particular a Dynabead or Dynabead muon and / or at least one or more labeling ligands 80, preferably at least one or more labeled antibodies such as the monoclonal antibody anti-RAP-1, clone 2.29 or the monoclonal antibody anti-EXP-2, clone 2.2 bound against plasmodial proteins such as RAP1 or EXP2.
  • These Antibodies may preferably be labeled with a spectrally distinguishable fluorescent dye such as DY-396XL from Dyomics GmbH or Quantum dots such as Qdots from Thermo Fisher Scientific or Candots from Candots GmbH.
  • At least one (preferably fluorescent) DNA dye can be used against plasmodial DNA in order to detect and / or at least one structure 40, 50, 20 of plasmodia 20 and / or erythrocytes 10 infected with at least one or more plasmodia at least one infected erythrocyte 10 and / or at least one structure 40, 50, 20 of plasmodia by damming and / or magnetic separation in a means for localization, immobilization and / or enrichment 120 such as a microtiter plate with at least 96, in particular 1536 wells, a microcuvette to trap a filter structure without or coated with capture ligands or a fluidic structure.
  • a means for localization, immobilization and / or enrichment 120 such as a microtiter plate with at least 96, in particular 1536 wells, a microcuvette to trap a filter structure without or coated with capture ligands or a fluidic structure.
  • sepsis occurs annually in approximately 18 million patients and has a lethality of approximately 50%. More than 25 different pathogens such as bacteria (meningococci, streptococci, etc.) and / or fungal infections may be responsible for sepsis.
  • pathogens such as bacteria (meningococci, streptococci, etc.) and / or fungal infections
  • bacteria meningococci, streptococci, etc.
  • fungal infections may be responsible for sepsis.
  • streptococci already exist commercial rapid tests. However, these usually consist of several steps, since by means of several reagents first the antigen has to be dissolved out of the cell wall and subsequently detected in an indicator reaction. The high specificity of 95 to 100% is well documented. However, the sensitivity of the tests is, for example, only 70 to 90%; in 10 to 30% the result is false negative.
  • infectious bacteria there is usually a regional and temporal change of surface antigens.
  • a rapid assay according to the invention can be carried out by binding and labeling other antigens which are not accessible to ligands without permeabilization of the cells.
  • other antigens which are not accessible to ligands without permeabilization of the cells.
  • there are various embodiments here such as A) damming of all cells and immunofluorescence detection by means of a fluorescently labeled antibody against an internal, more conserved antigen, B) magnetic capture and parallel fluorescence labeling by means of a fluorescent MNP a specific antibody is coupled and / or C) magnetic capture by means of an MNP, preferably Turbobead, with specific antibody and fluorescent labeling using a second fluorescently labeled antibody and / or a DNA dye.
  • Example of an application of the invention for the analysis of food and / or drinking water detection of Legionella in drinking water
  • Legionella are mobile rod bacteria with an average length of 2 to 5 ⁇ and a diameter of 0.5 to 0.8 ⁇ . They are found in numerous species and serogroups worldwide in surface waters and also in drinking water pipes. Infection with Legionella pneumophila occurs through atomized, atomised water and can lead to the so-called legionnaire's disease, a severe pneumonia, which is fatal in 10-15% of cases. Commercial rapid tests usually include a sampling device, which is sent to a laboratory and analyzed there by means of a bacterial culture on agar plates in about 10 days.
  • one embodiment of the invention may include a test strip designed to filter a volume of drinking water in the range of milliliters to several liters and / or cubic meters such that all contained cells, bacteria and pathogens are retained and placed within the detection range.
  • a test strip designed to filter a volume of drinking water in the range of milliliters to several liters and / or cubic meters such that all contained cells, bacteria and pathogens are retained and placed within the detection range.
  • a microporous filtration membrane having a pore size of 0.45 ⁇ m.
  • a means for permeabilizing the pathogens for example, is introduced from a blister contained in the test strip, so that the filtration membrane is incubated with this.
  • a fluorescently labeled antibody and / or fluorescent nanoparticles is added with antibody that binds specifically to antigens and / or cellular structures of Legionella, which would not be accessible without means for permeabilization and have a locally and temporally largely constant structure.
  • the pathogens can be detected by immunofluorescence by the magnification unit with image processing device imaging.
  • a volume of drinking water in the range of milliliters to several liters and / or cubic meters is first mixed in a mixing chamber with a permeabilization agent and magnetic microparticles such as Dynabeads or nanoparticles such as Turbobeads, to which a specific antibody against Legionella antigens is coupled.
  • Fluorescent staining may be by a labeling ligand such as a fluorescent DNA dye and / or a fluorescently labeled antibody and / or a bound antibody fluorescent nanoparticle.
  • the detection can in turn be done by means of imaging immunofluorescence.
  • a sample in particular a body fluid such as urine and / or stool and / or a food sample and / or drinking water can be used, which can be mixed for dissolution with a buffer. Solid constituents can then be separated off, for example, by filtration, sedimentation and / or centrifugation.
  • Pathogens such as Legionella and / or eggs of the pathogens such as the worms Ascaris, Trichiuris, Amylostoma, Taenia can be lysed and / or permabilized with a means for lysis and / or permeabilization.
  • the pathogens, eggs of the pathogens and / or their constituents can then be labeled with a labeling ligand 80 and / or enriched via a means for localization, immobilization and / or enrichment 120 such as a filter structure and / or magnetic particles and / or by means of imaging Microscopy be detected.
  • a labeling ligand 80 and / or enriched via a means for localization, immobilization and / or enrichment 120 such as a filter structure and / or magnetic particles and / or by means of imaging Microscopy be detected.
  • Microfluidic structure 210 sample intake

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testsystem umfassend zumindest eines der folgenden Mittel: - Mittel zur Permeabilisierung (110) und/oder Lyse von zumindest einem Erreger (10) und/oder zumindest einer Zelle (10), - Mittel zum Fangen (80) und/oder Markierung (90) von Teilen (20 und/oder 40 und/oder 50) der Erreger (10) und/oder Zellen (10), - Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) eines Erregers (10) und/oder einer Zelle (10), - Mittel zur Bildverarbeitung (160) vorzugsweise umfassend eine optische Vergrößerungseinheit (161), wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) durchführbar ist.

Description

Schnelltest für den Erreger- und Zellnachweis und Verfahren
B e s c h r e i b u n g
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 1 sowie ein Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 8 sowie eine Verwendung eines Testsystems und/oder Testverfahrens zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 15. Testsysteme zur Diagnose von Erkrankungen sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise werden eine Vielzahl von analytischen Verfahren und Methoden eingesetzt, um Antikörperreaktionen, sogenannte Immunreaktionen, hervorzurufen, welche für die Bestimmung von (Bio)Markern und vielen weiteren Substanzen/Analyten eingesetzt werden. Weiterhin sind mikroskopiegestützte Verfahren auf dem Gebiet der Diagnostik beschrieben. Patientennahe oder „Point-of-Care" (PoC) Testverfahren sind diagnostische Untersuchungen, die nicht in einem Zentrallabor, sondern innerhalb kurzer Zeit vor Ort direkt und individuell am Patienten/Probanden durchgeführt werden können. Es gibt für einige wenige Parameter PoC-Testsysteme wie immunchromatographische Teststreifen, die über eine Antikörperbindung ein lösliches Biomolekül z.B. ein Hormon oder ein Protein in Blut, Urin oder Speichel mit Hilfe einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Bekannte PoC-Teststreifen sind beispielsweise Schwangerschaftstests, Blutgerinnungstests, die mit oder ohne Messgerät angeboten werden. Ferner sind zugehörige Schnelltestverfahren bekannt, wie der Lateral-Flow-Test (LFT), Flow-Through-Test (FTT), Agglutinations-Test (AT) oder Solid-Phase-Test (SPT). Alle diese Verfahren dienen zum schnellen Nachweis von Analyten und sind zur visuellen Auswertung im PoC-Bereich geeignet. Im PoC-Bereich ist eine robuste und schnelle Diagnostik erforderlich, die den besonderen Bedürfnissen z.B. der Notfallmedizin nachkommen ohne eine hohe Mobilität und/oder Konnektivität zu medizinisch behandelndem Fachpersonal erfordern.
Nachteiligerweise sind jedoch keine PoC-Tests für eine große Zahl der zum Teil lebensbedrohlichen Erkrankungen bekannt, die Gegenstand einer Erreger- oder Zelldiagnostik sind. Hierzu gehören schwere bakterielle Infektionen, die zu einer Sepsis führen können, Viruserkrankungen wie Influenza oder Diarrhö-Erregern, Erkrankungen wie Malaria, Cholera und Tuberkulose oder zur Quantifizierung bestimmter Blutzellen, z.B. von Lymphozyten, eines Krebspatienten. Für die Erreger- und Zelluntersuchungen ist eine apparativ und personell aufwändige Untersuchung im diagnostischen Labor unumgänglich, die entsprechend zeit- und kostenintensiv ist und zudem einen verzögerten Beginn einer individuell abgestimmten Behandlung oder Therapie verursacht. Insbesondere bei einer Malaria-Erkrankung basiert die Standardmethode zur Diagnose im Stand der Technik auf der Mikroskopie. Es wird eine kleine Menge Blut abgenommen, wovon ein Ausstrich oder ein Präparat als so genannter dicker Tropfen angefertigt und mit Giemsa-Farbstoff gefärbt wird. Nach Fixierung und Trocknung des Präparats kann der Parasit unter dem Mikroskop in den roten Blutkörperchen (Erythrozyten) erkannt und vom Fachmann differenziert werden. Diese Methode setzt nicht nur einen geschulten Durchführenden, sondern auch ein Laborumfeld und ein teures Mikroskop voraus. In den meisten Malaria-Gebieten ist ein derart ausgestattetes Labor ohnehin nicht vorhanden. Vorhandene molekularbiologische Tests sind zudem teuer und erfordern ebenfalls tiefergehende Anwenderkenntnisse. Ebenfalls bekannt sind Lateral-Flow-Schnelltests (supra), die zwar parasitenspezifische Antigene, nicht jedoch den Parasiten als solchen oder befallene Zellen nachweisen können und von daher keine Erreger- oder Zelldiagnostik erlauben. Auch im Bereich der Lebensmittel- und Trinkwasser- Analytik wird eine robuste und schnelle Diagnostik für den schnellen Nachweis von Erregern am Ort der Probenname benötigt, um die Infektionsquelle festzustellen, eine entsprechende Therapie von erkrankten Patienten einzuleiten und eine weitere Infektion von Menschen zu verhindern.
Für eine große Zahl der Erreger existieren jedoch keine Schnelltests am Analyseort, so dass aufwändige Laboruntersuchungen notwendig sind. Hierzu gehören z.B. Salmonellen, Legionellen, Enterohämorrhagische E.coli (EHEC), Campylobacter coli und Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis oder Influenzaviren. Insbesondere die Variabilität der Oberflächenantigene stellt ein Problem für jeden analytischen Nachweis dar, der auf der Erkennung von Erregern über ihre Oberflächenantigene beruht. Dazu gehören z.B. Immunnachweise der Erreger in Schnelltests wie der Lateral-Flow-Test (LFT), Flow-Through-Test (FTT), Agglutinations-Test (AT) oder Solid-Phase-Test (SPT). Von daher sind solche System von speziellem Interesse, die eine von Oberflächenantigen unabhängige Analyse der Erreger und Zellen aufweisen und als POC- und/oder Schnelltests genutzt werden können. Nachweisverfahren über eine DNA- oder RNA -Analytik z.B. mittels PCR oder eine Kultivierung der Erreger sind apparativ und zeitlich aufwendig und kostspielig. Damit besteht ein hohes Bedürfnis, ein Testsystem mit einer von Oberflächenantigenen unabhängigen Analyse als POC- und/oder Schnelltests zu entwickeln, das eine komplexe Diagnostik erlaubt. Die komplexe Diagnostik soll insbesondere eine Erreger- und Zelldiagnostik aus Körperflüssigkeiten oder Nahrungsmitteln und/oder Trinkwasser ermöglichen.
Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Patentanmeldung ein Testsystem sowie ein Testverfahren und eine Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens bereitzustellen, die die vorgenannten Nachteile zumindest teilweise beheben. Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kostengünstig und in kürzester Zeit verschiedenste Erreger und/oder Zellen nachzuweisen, insbesondere unabhängig von einer Laborausstattung. Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen mit den technischen Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie ein Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen mit den Merkmalen des Patentanspruchs 8 sowie eine Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens mit den Merkmalen des Patentanspruchs 15 vorgeschlagen, denen nachfolgend besondere Bedeutung zukommt. Dabei gelten alle technischen Merkmale, die für das erfindungsgemäße Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen offenbart werden auch für das erfindungsgemäße Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen sowie zur Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens und umgekehrt, sodass diesbezüglich jeweils wechselseitig Bezug genommen wird und/oder werden kann. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Unteransprüchen aufgeführt.
Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen. Dabei umfasst das Testsystem zumindest ein Mittel zur Permeabilisierung und/oder Lyse von zumindest einem Erreger und/oder zumindest einer Zelle und/oder ein Mittel zur Bindung und/oder Markierung von Teilen der Erreger und/oder Zellen und/oder ein Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung von zumindest einem Bestandteil eines Erregers und/oder einer Zelle und/oder ein Mittel zur Bildverarbeitung, wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchführbar ist. Vorzugsweise kann die Auslesung über eine angeordnete optische Vergrößerungseinheit erfolgen. Alternativ und/oder zusätzlich ist es denkbar, dass die Auslesung über eine mobile Rechnereinheit erfolgen kann. Durch die erfindungsgemäße Permeabilisierung und/oder Lyse eines Erregers und/oder einer Zelle können Strukturen für Mittel zur Bindung und/oder Markierung vorzugsweise einer Fluoreszenzmarkierung zugänglich gemacht werden, welche ohne diese Mittel durch kompartimentierende Strukturen wie eine Lipidmembran oder Zellwand nicht zugänglich wären. In Kombination mit einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung können Teile der Erreger und/oder Zellen aus einer flüssigen Probe so angeordnet werden. Dadurch kann mit Hilfe eines Mittels zur Bildverarbeitung die Markierung optisch ausgelesen und eine hinreichende Intensität und Kontrastwirkung für ein oder mehrere Bild und/oder Bilder erhalten werden, welche über die optische Vergrößerungseinheit und Bildverarbeitungsvorrichtung in der mobilen Rechnereinheit ausgelesen werden können, so dass eine effektive Bildverarbeitung erfolgen kann und somit die gesuchten Erreger und Zellen bildgebend detektiert werden können. Bei einer spezifischen Immunfärbung und/oder spezifischen DNA-Färbung erscheinen infizierte Zellen im Kontrast als gefärbte und/oder fluoreszierende Punkte und/oder Flächen vor einem schwächer gefärbten und/oder schwächer fluoreszierenden Hintergrund, während nicht infizierte Zellen unsichtbar sein können und/oder nur schwach sichtbar bleiben können. In Gegenwart einer Beleuchtung, insbesondere einer Anregungsbeleuchtung, kann die Bildauswertung der Farbkontraste von gefärbten und/oder fluoreszierenden Zellen vor einem weniger gefärbten und/oder fluoreszierenden Hintergrund erfolgen. Durch die Bestimmung hellerer Punkte und/oder Flächen können die Zahl der infizierten Zellen pro Volumen Probe durch Zählen und Berechnung ermittelt werden. Im Rahmen dieser Erfindung kann eine optische Vergrößerungseinheit eine Einheit darstellen, die mindestens ein Objektiv enthalten und/oder eine Anordnung von einem oder mehreren Objektiven und/oder Linsen enthalten kann, ähnlich einem Mikroskop, die eine hinreichende Vergrößerung besitzen können. Eine derartige Vergrößerung kann beispielsweise über eine Verbindung mit einem Mikroskop erreicht werden. Wenn ein solches Mikroskop zum Einsatz kommt, können alternativ auch Bilddaten direkt an die Rechnereinheit übermittelt werden.
Im Rahmen der Erfindung sind bevorzugt Leistungen der optischen Vergrößerungseinheit in Gegenwart der Bildverarbeitungsvorrichtung mit Vergrößerungen von ungefähr 2,5-fach bis ungefähr 5-fach, vorzugsweise ungefähr 10-fach bis ungefähr 1000-fach denkbar. Die Auflösung kann dabei bei ungefähr 5 μηη, vorzugsweise bei ungefähr 0,1 μηη bis ungefähr 2 μηη, insbesondere von ungefähr kleiner als 0,5 μηη liegen. Damit kann eine hinreichende Vergrößerung von Zellen und/oder Erregern erreicht werden. Der Vergrößerungsfaktor kann fest oder variabel sein. Zur Einstellung der Schärfeebene und/oder der Vergrößerung kann eine variable Linse wie einer Flüssiglinse beispielsweise der Firmen Optotune Switzerland AG oder Vario-Optics AG eingesetzt werden. Die optische Vergrößerungseinheit oder Bildverarbeitungsvorrichtung kann vorzugsweise eine oder mehrere beliebige Lichtquellen aufweisen, wie z.B. eine Weisslicht- und/oder Fluoreszenzbeleuchtung. Die Fluoreszenzbeleuchtung kann dabei als Anregungslicht für Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden. Ferner kann eine Bildverarbeitungsvorrichtung erfindungsgemäß zur mobilen Rechnereinheit angeordnet sein, insbesondere in Form einer Kamera. Die Bildverarbeitungsvorrichtung kann dazu verwendet werden, Bilddaten von einer optischen Vergrößerungseinheit zu erfassen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine mobile Rechnereinheit eine Einheit darstellen, die beispielsweise durch ein Mobiltelefon mit Rechnerfunktion (Smartphone) und/oder durch einen Laptop- und/oder Tablettrechner (Tablet, Tablet Computer) zur Verfügung gestellt werden. Die mobile Rechnereinheit kann im Wesentlichen eine Zentraleinheit und/oder einen Prozessor aufweisen, die zur Bildverarbeitung erforderlichen Rechen- und Prozessschritte ausführen kann.
Die Bildverarbeitung kann ferner einen Analysemodus umfassen, wobei summarische Graustufen, Farbwerte und/oder Farbkontraste, vorzugsweise Fluoreszenzsignale, in einem Bildausschnitt erfasst werden können. Die Erfassung kann dabei qualitativ und/oder quantitativ sein. Im Rahmen einer einfachen quantitativen Auswertung kann beispielsweise ausgesagt werden, ob ein festgelegter kritischer Wert einer Intensität in Bereichen überschritten wird. Dieser kritische Wert wird für das Testsystem empirisch festgelegt und dient beispielsweise der Unterscheidung vom Hintergrundsignal des in der Lösung noch vorhandenen Markierungs-Liganden von spezifisch gebundenem Markierungs-Liganden in einer Immunfluoreszenz. Die Qualität der Bildverarbeitung kann erhöht werden, indem nacheinander einzelne Bildausschnitte eines größeren Feldes untersucht werden. Dies kann durch eine reine Auswahl in der Bildverarbeitung geschehen. Alternativ oder zusätzlich kann die Qualität der Bildverarbeitung ebenfalls durch eine optische Vergrößerung jeweils eines Bildausschnittes geschehen, wobei beispielsweise ein abgegrenztes Objekt mit einer Intensität über einem kritischen Wert als ein Erreger definiert werden kann.
Ferner ist es denkbar im Rahmen der Bildauswertung eine Qualitätsanalyse durchzuführen. Dabei kann die Standardabweichung der Ergebnisse in mehreren Bildausschnitten errechnet werden. Alternativ oder zusätzlich kann ebenfalls ermittelt werden, wie nahe ein berechneter Wert an einem kritischen Wert liegt. Eine große Nähe des berechneten Wertes an dem kritischen Wert oder bei großer Standardabweichung kann auf die schlechte Qualität der Messung geschlossen werden. Darüber hinaus kann auch zu einem neuen Test aufgefordert werden. Zur Nutzung der vorliegenden Erfindung kann somit ebenfalls ein Programm auf einer Rechnereinheit, beispielsweise als App auf einem Smartphone durchgeführt werden, welches zumindest eine der folgenden Grundfunktionen aufweist: Einlesen von Bilddaten, Bildverarbeitung, quantitative und/oder qualitative Ausgabe eines Bildverarbeitungsund/oder Analyseergebnisses. Zusätzlich kann das Programm eine Qualitätsanalyse bezogen auf die Qualität der Analyse einer Probe umfassen. Ferner kommt die Verknüpfung mit weiterführenden Informationen in Betracht, insbesondere internen oder externen Datenbanken zu Krankheitsbildern, Adressen von medizinischen Diensten, Senden der Erreger-Bilder an medizinisches Fachpersonal und dergleichen.
Es ist ebenfalls denkbar, dass das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung Elemente zur Aufnahme eines Probefluids aufweist. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das Probefluid von einer Körperflüssigkeit und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser stammt. Bei einer Körperflüssigkeit kann es sich vorzugsweise um Blut, Vollblut, Urin, Speichel, Synovialflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis, Plasma und/oder Serum und/oder Tränenflüssigkeit, Schweiß, Lymphflüssigkeit und/oder Interzellularflüssigkeit handeln. Dabei kann beispielsweise eine Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten mit beliebigen Chemikalien, Reagenzien, insbesondere Färbemittel und Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, ggfs. samt üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen wie Gerinnungshemmern, Proteaseinhibitoren, Stabilisatoren und/oder Enzymhemmstoffen behandelt werden. Patienten sind dabei jeder Proband, unabhängig von einer Symptomatikund/oder Krankheit und zwar Mensch und Tier, insbesondere Säugetier. Derartige Körperflüssigkeiten enthalten Analyten, insbesondere Zellen, die infizierte Zellen und/oder Erreger als solche enthalten können. Erreger sind dabei insbesondere Bakterien, Pilze, Viren und/oder Parasiten. Dabei kann ein Probefluid einer Nahrungsmittelprobe eine beliebige Verdünnung, Lösung, ein Extraktund/oder Abstrich eines Nahrungsmittels umfassen. Ein Probefluid von Trinkwasser kann ferner eine unveränderte und/oder konzentrierte und/oder verdünnte Probe und/oder eine flüssige Aufnahme eines Filtrationsrückstandes umfassen.
Weiterhin kann es von Vorteil sein, wenn das Testsystem Mittel zur Permeabilisierung aufweist, wobei vorteilhafterweise ein Zugang für Liganden zu zumindest einem Biomolekül und/oder zu zumindest einer Struktur eines Erregers und/oder zu zumindest einer Zelle erzielbar sein kann. Insbesondere ist es denkbar, dass die Struktur und/oder die Zelle zumindest eine Öffnung mit einer Größe zwischen ungefähr 1 nm und ungefähr 12 μηη aufweisen kann. Auch eine vollständige Lyse der Zelle kann erzeugbar sein. Eine Permeabilisierung und/oder Lyse von Erregern und/oder Zellen kann dabei ein Vorgang zur Erzeugung einer temporären und/oder dauerhaften Durchlässigkeit von äußeren und/oder inneren Zellmembranen, Zellwänden, Mureinhüllen, Virushülle und/oder Lipidmembranen und/oder sonstigen kompartimentierenden Strukturen darstellen, um eine Zugänglichkeit von Antikörpern, markierten Antikörpern, Liganden und/oder mit Liganden beladenen magnetischen Partikeln zu inneren Strukturen, Antigenen und/oder Biomolekülen der Erreger und/oder Zellen zu ermöglichen. Ein Mittel zur Permeabilisierung und/oder Lyse von Erregern und/oder Zellen kann eine Einheit und/oder Substanz umfassen, die eine Zugänglichkeit zu Biomolekülen und/oder Strukturen der Erreger und/oder Zellen bereitstellt, die in der Regel z.B. bei lebenden Erregern und/oder Zellen durch eine Lipidmembran, Zellwand, Virushülle und/oder sonstigen Zellumhüllenden Schicht abgetrennt sind und so z.B. für eine Immunanalytik nicht zugänglich sind. Ein derartiges Mittel kann beispielsweise durch Porenproteine Poren in einer Membran bereitstellen und/oder durch Cholesterinentzug die Membran destabilisieren und Öffnungen in der Membran erzeugen und/oder durch osmotische Effekte wie ein Anschwellen und Platzen der Zellen zu Öffnungen in der Zellmembran führen und/oder durch elektrische und/oder mechanische Impulse Öffnungen erzeugen. Ein Mittel kann ferner auch alle sonstigen Mittel umfassen, welche eine oder mehrere Öffnungen in Zellmembran, Zellwand, Virushülle, Lipidmembranen bereitstellen und/oder ein Durchdringen dieser z.B. durch ähnlich einer Transfektion angewandten Mitteln wie fusionierten und/oder importierten Vesikeln, magnetischen Partikeln und/oder eindringende Nanopartikel ermöglichen können. Diese Mittel können Substanzen für die Permeabilisierung und/oder Lyse sein, wie Saponine z.B. zur Lyse von Erythrozyten, Bakterien, Pilzzellen und/oder anderen eukaryonten Zellen, Digitonin für die temporäre Permeabilisierung z.B. von eukaryontischen Zellen, Porine z.B. zur Permeabilisierung von Lipidmembranen, Streptolysin O und Equinatoxin II, Ammoniumchlorid z.B. zur Lyse von Erythrozyten, Detergenzien wie Deoxycholate, Triton X100, NP-40 und/oder sonstigen Substanzen wie Aceton und/oder Ethanol zur Destabilisierung der Zellmembran, Ethylendiamintetraessigsäure zur Permeabilisierung der Außenmembran von gramnegativen Bakterien, Lysozym und/oder Autolysine z.B. zur Lyse der Peptidoglykanzellwand grampositiver Bakterien, Lactoferrin, Defensine und Cathelicidine gram-negativer Bakterien und andere Substanzen sein, aber auch ein elektrisches Feld, welches ähnlich einer Elektroporation die Zellmembran temporär und/oder dauerhaft durchlässig machen kann und/oder eine mechanische und/oder sonstige Einwirkung, die zu einer Permeabilisierung und/oder Lyse führt und eine erweiterte Zugänglichkeit von Biomolekülen der Erreger und/oder Zellen für Liganden bereitstellen. Diese Mittel können mit fixierenden Substanzen wie Paraformaldehyd, Glutaraldehyd, Aceton, Methanol, Ethanol kombiniert werden. Die Größen der erzeugten Öffnungen können im Bereich von ungefähr 1 nm bis ungefähr 12 μηη betragen und zu einer temporären Permeabilisierung für wenige Millisekunden bis zur dauerhaften Lyse der Zellen führen. Ebenfalls können Mittel denkbar sein, die einer Aufnahme von Liganden und/oder Magnetpartikeln ohne eine Ausbildung von Öffnungen dienen können, wie z.B. Mittel, die auch bei einer Tranfektion eingesetzt werden können, wie Vesikel, magnetische Partikel, eindringende Nanopartikel, Import-auslösende Substanzen. Ferner kann es sich um Mittel handeln, die zu einer Freisetzung von biologischen Strukturen und/oder Molekülen und/oder sonstigen Teilen der Erreger und/oder Zellen führen, welche ohne diese Mittel im Inneren der Zellen und/oder Erreger verbleiben würden und somit vor einer Erkennung durch das Immunsystem abgeschirmt wären. Dies kann eine Lyse und/oder sonstige Zerstörung der Erreger und/oder Zellen und/oder die induzierte Abgabe und/oder Freisetzung von biologischen Strukturen und/oder Molekülen durch Export und/oder durch Poren und/oder Öffnungen umfassen.
Im Rahmen der Erfindung kann es ebenfalls vorteilhaft sein, wenn für das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung von zumindest einem Bestandteil von Erregern und/oder Zellen einsetzbar sind. Dabei kann zumindest ein Bestandteil von Erregern und/oder Zellen anreicherbar sein. In einer Ausführungsform kann das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung ein Reaktionsgefäß wie ein Eppendorf- Reaktionsgefäß und/oder eine Filtrationssäule sein. In dieser können eine Probe und/oder Mittel zur Permeabilisierung und/oder Mittel zur Bindung und/oder Mittel zur Markierung in miteinander mischbar sein und können beispielsweise über einen Magneten immobilisiert und über ein Mittel zur Bildverarbeitung wie ein Fluoreszenzspektrometer und/oder ein bildgebendes Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Zusätzlich oder alternativ ist es ebenfalls denkbar, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung eine mikrofluidische Struktur zur Auflösung und/oder Mischung von Substanzen aufweisen kann. Ein solches Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann vorzugsweise ein Teststreifen mit einer mikrofluidischen Struktur sein. Ein solcher Teststreifen besteht vorzugsweise aus einem oder mehreren transparenten Material und/oder Materialien, wie einem planaren Kunststoff und/oder Glas, der in der Lage sein kann eine Körperflüssigkeit und/oder eine andere flüssige Probe aufzunehmen. Eine Probe kann in einer bevorzugten Ausführungsform den Teststreifen durchlaufen, insbesondere mittels mindestens eines eingearbeiteten und/oder aufgebrachten Kanals und/oder Mikrokanals, insbesondere mit einem rechteckigen, trapezförmigen und/oder bogenförmigen Querschnitt. Der Kanal kann eine Kapillare sein und/oder einen lamianren und/oder nichtlaminaren Fluss durch Schwerkrafteinwirkung und/oder Kapillarkraft und/oder Pumpkräfte und/oder sonstige Kräfte erlauben. Der Teststreifen kann vorzugsweise die Durchführung des Nachweisverfahrens von Erregern und/oder Zellen bestehend aus einer Probenaufnahme, einer Zugabe und Mischung mit einem oder mehreren Mitteln zur Permeabilisierung, einer Zugabe und Mischung mit einem oder mehreren Mitteln zur Bindung und/oder der Markierung von Strukturen der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile, eine Inkubation der Probe, eine anschließende Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung der Erreger und/oder Zellen und/oder deren Bestandteilen in einem Detektionsbereich umfassen. Für kleine Volumina von wenigen Mikrolitern kann der Teststreifen vorzugsweise außerdem eine Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des Flusses bereitstellen, für größere Volumina bis zu mehreren Litern Anschlüsse an externe Pumpsysteme. Die Probenaufnahme kann im einfachsten Fall ein Reservoir aufweisen, in das ein definiertes Volumen, insbesondere von wenigen Mikrolitern einer Probe z.B. mit einer Mikropipette gegeben werden kann. Bei Volumina von mehreren Litern können diese über einen Anschluss von einem externen System aufgegeben werden. Die Probenaufnahme kann mit (eingetrockneten) Chemikalien z.B. EDTA, Heparin zur Gerinnungshemmung und/oder Farbstoffen zur histologischen Zellfärbung versehen werden, die durch die aufgegebene Probe gelöst werden können. Im Fall von kapillarem Vollblut aus der Fingerbeere kann die Aufnahme vorzugsweise mittels einer Kapillare mit definiertem Volumen und einer Füllungsanzeige erfolgen. In diese kann das Vollblut vorzugsweise bis zur vollständigen Füllung eingesogen werden und somit ein definiertes Volumen bereitstellen. Befindet sich die Kapillare z.B. in einem zum Teststreifen passenden Deckel, so kann das definierte Blutvolumen anschließend durch Aufstecken des Deckels auf den Teststreifen in diesen appliziert werden. In dieser Ausführungsform kann der Deckel vorzugsweise Strukturen, die beim Aufstecken auf den Teststreifen irreversibel einrasten umfassen. Eine weitere Ausführungsform kann eine mikrofluidische Struktur mit definiertem Volumen zugehörig dem Teststreifen umfassen, in die das Vollblut eingesogen wird und die beispielsweise über ein Verschieben der Kapillare und/oder über Mikroventile und/oder sonstige Vorrichtungen nach der Volumendefinition mit dem weiteren mikrofluidischen System Kontakt bekommen kann, so dass das Vollblut in dieses appliziert werden kann. Die Applikation des Mittels zur Permeabilisierung und/oder Lyse und des Mittels zur Bindung und/oder zur Markierung von spezifischen Strukturen kann über eine Lösung von lyophilisierten Substanzen durch die vorbeifließende Probe erfolgen. Hierbei ist zwischen dem vorderen Volumen der Probe hinter der Lauffront und dem nachfolgenden Volumen der Probe zu unterscheiden. Bei diesem Vorgehen kann das vordere Volumen im Teststreifen mehr gelöste Substanz umfassen als das hintere Volumen. Aus diesem Grund kann der Teststreifen vorzugsweise zumindest eine Mischerstruktur aufweisen, welche die gelösten Substanzen mit der Probe mischen kann. Im Falle einer mikrofluidischen Struktur kann dies eine Mischkammer mit und/oder ohne externe mechanische Einwirkung, eine Zickzackstruktur und/oder eine andere Vorrichtung zur Mischung sein. Eine weitere Ausführungsform kann eine Aufspaltung des mikrofluidischen Probenflusses in mindestens zwei Kanäle umfassen, wobei in einem ersten Kanal die lyophilisierten Substanzen einem Probenteil zugemischt werden können und im zweiten Kanal ein Probenteil an diesem vorbeigeleitet werden kann. Anschließend können die Kanäle zumindest teilweise wieder zusammengeführt und in einer Mischerstruktur die beiden Probenteile miteinander gemischt werden. Die Fließraten können vorzugsweise durch die Kanaldimensionen bestimmt werden. Mit einer derartigen Ausführungsform kann erreicht werden, dass auch das hintere Probenvolumen aus dem zweiten Kanal noch mit Substanzen enthaltendem Probenvolumen aus dem ersten Kanal gemischt werden kann. Hierbei kann gleichzeitig eine Imunfluoreszenzfärbung mit einem Markierungs-Liganden erfolgen. Es kann die Färbung der infizierten Zellen und/oder Erreger durch Zugabe eines Markierungs-Liganden in den inzwischen entleerten Proben-Port erfolgen, durch Lösung lyophilisierter Substanzen und/oder aus einem Blister-Depot, dass durch mechanische Einwirkung geöffnet werden kann und dessen Inhalt teilweise oder vollständig in den Teststreifen entlassen werden kann. Der Teststreifen kann vorzugsweise für kleine Volumina von wenigen Mikrolitern eine Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des Flusses bereitstellen, für größere Volumina bis zu mehreren Litern Anschlüsse an externe Pumpsysteme. In einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des mikrofluidischen Flusses vorzugsweise eine dem Detektionsbereich nachfolgender Kapillarpumpe umfassen, die durch kapillare Kräfte Flüssigkeit in ein mit Mikrostrukturen unterteiltes Abfallkompartiment zieht. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Material, welches eine Saugkraft ausübt wie beispielsweise ein Filtervlies und/oder Saugvlies, so in den Teststreifen integriert werden, dass es zumindest temporär Kontakt mit dem mikrofluidischen Kanal erhalten kann und vorzugsweise Flüssigkeit durch den Teststreifen ziehen kann. In einer weiteren Ausführungsform kann vorzugsweise eine Mikropumpe in den Teststreifen integriert werden, welche den Fluss steuern kann. Dies kann ein Stempel sein, der Flüssigkeit aus einem Blister in den mikrofluidischen Kanal drückt, eine Saugvorrichtung, welche über Unterdruck Flüssigkeit aus dem Kanal saugt und/oder eine andere Vorrichtung wie beispielsweise die Mikropumpe mp6 der Firma Bartels Mikrotechnik GmbH. Des Weiteren kann auf einem Teststreifen ein Barcode aufgedruckt und/oder ein RFID-Element eingebaut werden, der übliche Informationen zum Teststreifen enthalten kann, z.B. die Art des Testes (z.B. Diagnostik für Malaria-Erreger, Legionella und/oder Sepsis) und/oder das Verfallsdatum des Teststreifens u.a.
Weiterhin kann das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung umfassen, die zum einen mikrofluidische Struktur zur Inkubation eines Probefluids mit Fänger- und/oder Markierungs-Ligand aufweisen kann und zumindest einen Detektionsbereich. Dabei kann auf dem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung zumindest ein Bestandteil zumindest eines markierten Erregers und/oder zumindest einer markierten Zelle aufnehmbar sein. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann durch Zugabe eines Markierungs-Liganden und/oder vorzugsweise die Lösung von lyophilisiertem Markierungs-Liganden die spezifische Markierung von Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen vorzugsweise mit einem Farbstoff und/oder Fluoreszenzfarbstoff, fluoreszentem und/oder nicht-fluoreszentem Nanopartikel etc. und/oder kombiniert mit einem Liganden wie einem Antikörper erlauben. Besonders vorteilhaft ist, wenn erfindungsgemäß kein zusätzlicher Waschschritt erforderlich sein kann. Die Färbung kann je nach Analyt und/oder Testausführung vorzugsweise eine einfache histologische Färbung des Zellplasmas, einer Lipidmembran, Zellwand und/oder der DNA und/oder eine immunchemische Färbung wie einer Fluoreszenzfärbung sein. Das Hintergrundsignal der spezifischen Markierung durch die z.B. im Kanal verbleibende Färbelösung kann bei der Messung nicht relevant sein, da die Färbelösung vorzugsweise niedrig konzentriert sein kann. Sobald sich die Färbeflüssigkeit im Kanal verteilt, und/oder ihn durchflössen hat, können sich ein oder mehrere ungebundene Markierungs-Liganden im Kanal verteilt befinden, die an durch eine Permeabilisierung zugängliche Marker der Erreger und/oder Zellen binden können. Die Konzentration der Markierungs-Liganden in der Färbeflüssigkeit ist vorzugsweise in der Weise gewählt, dass Markierungs-Liganden an den infizierten Zellen, Erregern und/oder deren Bestandteile gegenüber den freien, in der Flüssigkeit vorhandenen Markierungs-Liganden angereichert werden können. Dadurch können Erreger, Zellen, infizierte Zellen und/oder deren Bestandteile vorzugsweise im Kontrast als heller gefärbte/ fluoreszierende Punkte und/oder Flächen vor einem gefärbten/fluoreszierenden Hintergrund erscheinen, während sonstige Flüssigkeitsbestandteile wie nicht infizierte Zellen unsichtbar und/oder nur schwach sichtbar bleiben können. Eine Inkubation der Probe kann beispielsweise durch eine Ausführungsform des Teststreifens erreicht werden, welche eine Inkubationsstruktur enthalten kann. Dies kann z.B. eine Zickzackstruktur sein, die in Zeiträumen von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten durchflössen werden kann und sowohl die Probe mischen als auch eine Inkubation erlauben kann. In einer weiteren Ausführungsform können Substanzen zur Permeabilisierung und/oder Lyse der Erreger und/oder Zellen lyophilisiert vorgelegt und wie beschrieben durch einen Teil des Probenvolumens gelöst, in die Probe eingemischt und inkubiert werden. Werden die Erreger und/oder Zellen anschließend in der mikrofluidischen Struktur unspezifisch oder spezifisch zurückgehalten, immobilisiert und/oder gefangen, so kann auch eine sequentielle Zugabe des Markierungs-Liganden zur Markierung der gesuchten Strukturen erfolgen. In einer Ausführungsform kann eine Flüssigkeit zum Waschen und/oder ein Fänger-Ligand und/oder ein Markierungs-Ligand extern zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Teststreifen einen mit Flüssigkeit gefüllten Blister umfassen, welcher vom Anwender und/oder einer Vorrichtung wie z.B. einem mechanischen Stempel im Mittel zur Aufnahme des Testreifens wie einem optischen Lesegerät geöffnet werden kann. Die Flüssigkeit kann dabei in den mikrofluidischen Kanal gelangen und kann entweder bereits die Liganden enthalten und/oder diese aus einer vorgelegten, lyophilisierten Form im Kanal aufgelöst sein und anschließend die Erreger und Zellen umspülen. Ein derartiger Teststreifen kann vorzugsweise einen Detektionsbereich des mikrofluidischen Kanalsystems aufweisen, in dem vorzugsweise fluoreszenzmarkierte Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile immobilisiert werden und vorzugsweise dadurch angereichert werden können, dass diese festgehalten werden, während die restliche Flüssigkeit weiter zu einem Auffang-Reservoir fließen kann. Der Detektionsbereich kann dabei beliebig groß und beliebig ausgewiesen ausgestaltet sein. Bevorzugt kann jedoch ein Ausmaß sein, das in einem oder mehreren Bildfeldern der Vergrößerungsoptik aufgenommen werden kann. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens können in und/oder neben dem Detektionsbereich vorzugsweise orthogonal zur Fließrichtung Balken und/oder Markierungen aufgedruckt sein. Sie können der visuellen Abgrenzung und/oder Unterteilung des Detektionsbereiches für die Bildverarbeitung und/oder zur Bestimmung der ausgeführten Durchzugsgeschwindigkeit des Teststreifens durch eine Auswertungssoftware dienen. Ferner kann das Testsystem ein Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung zumindest eine mikrofluidische Struktur aus PET enthalten, in welche eine wässrige Flüssigkeit durch die Materialeigenschaften des PET vorzugsweise passiv ohne weitere Beschichtung einströmen. Diese mikrofluidische Struktur kann statt mit einem starren Deckel ganz und/oder zum Teil mit einer Folie verschlossen werden. Die Struktur kann in einen oder mehrere Bereiche unterteilt werden, welche erst verschlossen sind, also eine Sackgasse bilden, wodurch die Flüssigkeit diese nicht weitergehend durchströmt und welche nach Öffnen wie z.B. Aufstechen einer Folie über dahinterliegenden Belüftungsöffnung von der Flüssigkeit durchströmt werden kann. Dies kann insbesondere eine Unterteilung in einen Probeaufnahmebereich, einen Mischungsbereich und einen Detektionsbereich bilden. Im Probenaufnahmebereich kann auf Grund von Kapillarkräften ein definiertes Probenvolumen einer Flüssigkeit wie beispielsweise Vollblut aus der Fingerbeere aufgenommen werden. Sobald eine erste Belüftungsöffnung erreicht ist, kommt der Einfluss zum Stillstand und der Nutzer kann an einem Sichtfenster den Füllstand ablesen. Nachfolgend oder zumindest teilweise gleichzeitig kann ein Mischungsbereich angeordnet sein, hinter dem ein zweites Belüftungsloch angeordnet sein kann, welches zunächst verschlossen ist. Wird die Folie über diesem geöffnet und z.B. durchstochen, so fließt die Probe in den Mischungsbereich, in dem die Probe vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem Fänger-Liganden mit oder ohne Magnetbeads und/oder einem oder mehreren Markierungsliganden und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung gemischt werden kann. Zur Verstärkung der Mischung können mit Mischstrukturen wie Fischgrätmuster im Kanal, einem Richtungs-wechselndem externen Magnetfeld, Vibrationen, Schall oder anderen Mischverfahren eingesetzt werden. Der Probenaufnahmebereich und der Mischungsbereich können auch überlappend oder identisch sein. Nachfolgend kann ein Detektionsbereich angeordnet sein, der ein Sichtfenster für eine bildgebende mikroskopische Messung bereitstellt. Wird ein weiteres hinter dem Detektionsbereich liegendes z.B. mit Folie verschlossenes Belüftungsloch geöffnet, so fließt die Probe in den Detektionsbereich. In diesem können die Erreger lokalisiert und/oder angereichert und/oder, vorzugsweise durch ein externes Magnetfeld, immobilisiert und bildgebend dargestellt werden.
Ferner kann das Testsystem ebenfalls Mittel zur Bindung zumindest einen Fänger-Liganden und/oder zumindest einen Markierungs-Liganden zur Markierung, insbesondere Färbung aufweisen. Insbesondere können dafür zumindest einen Antikörper, ein Aptamer und/oder einen Liganden umfasst sein und/oder einen Mikro-Partikel, Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel umfasst sein, das mit einem Antikörper, Aptamer, Liganden koppelbar ist. Bevorzugt kann ferner ein zumindest magnetischer Nanopartikel, bevorzugt ein Turbobead und/oder ein Metallkern, über einen angekoppelten Liganden an zumindest einen Bestandteil von Erregern und/oder Zellen bindbar sein. Dabei kann vorzugsweise eine Sandwichstruktur aus zumindest einem Fänger-Liganden und zumindest einem Markierungs-Liganden erzeugbar sein. Mittel zur Bindung und/oder Markierung können einen oder mehrere Fänger- Liganden und/oder Markierungs-Liganden umfassen, welche vorzugsweise an Antigene und/oder Biomoleküle von ganzen oder von Teilen von Zellen und/oder Erregern binden können. Liganden können vorzugsweise Antikörper, Aptamere, Peptide, Protein-Liganden, Mikro-Partikel, Nano-Partikel, magnetische Beads, reaktive Substanzen, aber auch sonstige Liganden und/oder eine Kombination der genannten sein, welche an sogenannte Marker wie Antigene, Biomoleküle und/oder sonstige Strukturen der Erreger und/oder Zellen und/oder deren Bestandteile spezifisch binden können. Diese Liganden können erst durch ein Mittel zur Permeabilisierung mit Markern wie Biomolekülen, Strukturen und/oder Antigenen der Erreger und/oder Zellen, von denen sie ohne das Mittel zur Permeabilisierung durch eine Zellumhüllung, Zellmembran, Zellwand, Virushülle, Lipidmembran und/oder einer sonstigen kompartimentierenden Struktur getrennt wären, in Kontakt kommen. Fänger-Liganden können dabei der Immobilisierung der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile dienen, um vorzugsweise eine Anreicherung über einem Detektionsbereich zu erreichen. Im Falle von magnetischen Partikeln wie vorzugsweise magnetischen Mikropartikeln, insbesondere Dynabeads oder magnetischen Nanopartikeln (MNP), insbesondere Turbobeads, aber auch sonstigen nicht-fluoreszenten und/oder fluoreszenten MNP, mit oder ohne angebundene Antikörper, Aptamere und/oder Liganden, kann dies die Immobilisierung gebundener Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile, vorzugsweise am Boden und/oder der Decke eines Mikrokanales, über einem Detektionsbereich mittels eines Magneten bedeuten. Bei einer immunchemischen Färbung können Markierungs-Liganden eingesetzt werden, die vorzugsweise an eine zweite, unabhängige Bindungsstelle von Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen binden können. Diese Liganden können vorzugsweise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, fluoreszenten Nanopartikel wie Quantum Dots und/oder auch Farbstoff, Magnetpartikel und/oder Goldpartikel gekoppelt sein, so dass durch ihre Bindung an die Zelloberfläche ein ausreichendes Signal, bevorzugt Fluoreszenzsignal, entstehen und vorzugsweise mittels einer optischen Vergrößerung vor dem Hintergrund sichtbar gemacht werden kann, so dass einzelne bildfähige Farbwerte, Graustufen und/oder Kontraste entstehen können. Daher kann die Erfindung ebenfalls ein Testsystem betreffen, wobei die auf dem Teststreifen gebundenen Analyten, Zellen, Erreger mittels eines Markierungs- Liganden, der an einen Farbstoff vorzugsweise einen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff, Nanopartikel, Magnetpartikel und/oder Goldpartikel gekoppelt ist, markiert werden und vorzugsweise einer Bildauswertung zugänglich gemacht werden können. Vorzugsweise kann eine doppelte Erkennung im Sandwichsystem einerseits beispielsweise durch einen Fänger-Liganden aus spezifischem Antikörper an magnetischem Partikel und andererseits durch einen Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenz-markierten Antikörper stattfinden. Dies kann eine eindeutige Typisierung der infizierten Zellen und/oder Erreger erlauben und Falsch-Positive durch eine unspezifische Bindung anderer Zellen und/oder durch eine unspezifische Färbung anderer Zellen ausschließen. Beispielsweise können infizierte Zellen (z.B. bei Malaria) und/oder Erreger (z.B. Legionellen, Salmonellen, Streptokokken, etc.) entsprechende Marker aufweisen, die nach einer Permeabilisierung den Liganden (Fänger- Liganden und Markierungs-Liganden) zugänglich sind und von diesen erkannt werden können. Das Verfahren kann die Anreicherung und eindeutige visuelle Erkennung von Zelltypen wie z.B. Malaria-infizierten Erythrozyten, CD4+ Zellen und/oder ebenfalls infizierten Zellen in der HIV-Diagnostik, ebenfalls die Erkennung und Typisierung von Bakterien in der Diagnose von z.B. Sepsis, Legionella, Cholera, Tuberkulose etc. ermöglichen. Als Markierungs-Ligand können außerdem angekoppelte Enzyme für eine enzymatische Nachweisreaktion eingesetzt werden, so dass eine Farbreaktion und/oder elektrochemische Reaktion entstehen kann, die detektierbar ist. In einer Ausführungsform des Teststreifens kann sich eine Filtrationsvorrichtung beispielsweise bestehend aus einem Filtermaterial wie z.B. einer „Vivid" Plasma Separation Membrane von Pall Corp., eine mikro- und/oder nanoporöse Membran mit subzellulären Porendurchmessern und/oder andere Strukturen mit einer Siebfunktion befinden. Diese kann den Durchtritt der Flüssigkeit erlauben, aber unspezifisch Erreger und/oder Zellen oder auch deren Bestandteile Größen-abhängig zurückhalten. Diese kann an einem Kanalende und/oder seitlich in eine Kanalwand integriert sein. Die aufgestauten Erreger, Zellen, infizierten Zellen und/oder deren Bestandteile können durch einen oder mehreren Markierungs-Liganden spezifisch markiert werden. Bei einem Einsatz von Markierungs-Liganden wie z.B. von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, Aptameren und/oder sonstigen Liganden kann eine spezifische Färbung der gesuchten Strukturen der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile erfolgen. In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Teststreifen einen Filter enthalten zum unspezifischen Aufstauen aller Zellen und/oder Erreger, während die Markierung der gesuchten Erreger vorzugsweise durch die spezifische Bindung von fluoreszenten Markierungs-Liganden in einer Immunfluoreszenzfärbung erfolgen kann. Besitzen nur die gesuchten Erreger eine DNA wie das z.B. bei Plasmodien im Gegensatz zu DNA-freien Erythrozyten der Fall ist, so kann auch eine Fluoreszenzfärbung der DNA erfolgen, welche spezifisch die Plasmodien markieren kann. Als Kontrolle kann parallel eine Membranfärbung zur Erkennung aller Zellumrisse mittels Weißlicht und/oder über eine spektral getrennte Fluoreszenzdetektion erfolgen. In einer Ausführungsform können vorzugsweise magnetische Partikel an die Liganden gekoppelt werden, welche spezifisch an die zellulären Strukturen binden können, so ist deren magnetisches Fangen und die Anreicherung durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes ermöglicht. Wird ein Magnet im Detektionsbereich in den Teststreifen und/oder in das Mittel zur Aufnahme des Teststreifens wie einem Lesegerät integriert, so kann die magnetische Kraft vorzugsweise zur Immobilisierung der magnetischen Partikel im Teststreifen führen, wie z.B. auf dem Boden und/oder an der Decke eines mikrofluidischen Kanales. Kommerzielle magnetische Partikel, die üblicherweise zum Fangen von Zellen über Oberflächenantigene mittels Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden eingesetzt werden können, können insbesondere einen Durchmesser von ungefähr 1 nm bis ungefähr 12 μηη aufweisen. Die Firma Thermo Fisher Scientific bietet beispielsweise magnetische Mikropartikel Dynabeads Myone mit 1 μηη Durchmesser oder Dynebeads mit 2,8 μηη Durchmesser mit verschiedenen Oberflächengruppen wie Streptavidin, Biotin und/oder chemischen Kopplungsgruppen wie Azid- und/oder Aminogruppen zur Anbindung von Biomolekülen, Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden an.
Diese Mikropartikel können zu groß sein, um durch die erzeugten Öffnungen in perme- abilisierte Erreger und/oder Zellen eindringen zu können und/oder durch andere Techniken aufgenommen werden zu können. Dies kann beispielsweise erst erfolgen, wenn die Erreger und/oder Zellen lysiert und fragmentiert werden, so dass Strukturen aus dem Inneren für die Mikropartikel zugänglich sein können. Vorzugsweise können die Erreger und/oder Zellen permeabilisiert, aber in Ihrer Form durch das Zytoskelett erhalten und somit physiologisch erkennbar bleiben. Magnetische Nanopartikel (MNP) können einen Durchmesser von ungefähr 5 nm bis ungefähr 500 nm aufweisen und somit durch Öffnungen in permeabilisierten Erregern und/oder Zellen eindringen. In einer anderen Ausführungsform können nicht-fluoreszente MNPs mit gekoppelten Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden eingesetzt werden, um nach Permeabilisierung der gesuchten Erreger und/oder Zellen an Antigene und/oder Strukturen spezifisch binden zu können. Mittels Magnetkraft können die MNPs mit den gebundenen Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen im Detektionsbereich immobilisiert werden, beispielsweise an der Kanaldecke und/oder dem Kanalboden. Vorzugsweise durch einen Markierungs-Liganden kann an den gesuchten Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen ein spezifisches, detektierbares Signal erzeugt werden. Im Falle des Einsatzes von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, Aptameren, Nanopartikeln und/oder Liganden kann eine Immunfluoreszenz im Sandwichaufbau entstehen. Alternativ kann die DNA von Plasmodien mittels eines fluoreszenten und/oder nicht-fluoreszenten DNA-Farbstoffes angefärbt werden. Die MagVigen-Partikel der Firma Nvigen Inc. haben Durchmesser von beispielsweise 200 nm bis 500 nm und sind an ihrer Oberfläche mit Kopplungsgruppen und/oder Proteinen erhältlich. So kann zur Bindung spezifischer Antikörper, Aptamere und/oder Liganden sowohl eine chemische Kopplung möglich werden als auch über an den MNP vorhandenen Proteinen wie Avidin und/oder einem Zweit-Antikörper. Ocean Nanotech Inc. verschiedene paramagnetische Beads ab 50 nm Durchmesser und ebenfalls mit verschiedenen Oberflächengruppen z.B. zur Antikörperkopplung anbietet. Turbobeads Llc. bietet ebenfalls magnetische Nanopartikel, genannt Turbobeads, mit verschiedenen Oberflächengruppen wie Streptavidin, Biotin und/oder chemischen Kopplungsgruppen wie Azid- und/oder Aminogruppen zur Anbindung von Biomolekülen, Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden an. Turbobeads können einen Durchmesser von ungefähr 30 nm besitzen, aber vorzugsweise ungefähr dreifach stärkere magnetische Eigenschaften durch Verwendung eines metallischen Kernes an Stelle des bei MNP üblichen Ferritkernes. Die magnetische Separation kann damit bedeutend schneller und effizienter erfolgen als mit üblichen MNPs. Magnetische Nanopartikel, die gleichzeitig fluoreszent sind, können über gekoppelte Antikörper, Aptamere und/oder Liganden die Zielstrukturen binden und sowohl zum magnetischen Fangen als auch zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden. Die magnetischen und fluoreszenten MyQuVigen-Partikel von Nvigen Inc. und auch die NanoScreenMag-MNP der Firma Chemicell GmbH werden ebenfalls mit verschiedenen Oberflächengruppen z.B. zur Antikörperkopplung angeboten. Diese Kombination kann den Vorteil eines einfachen Verfahrens der gleichzeitigen Immobilisierung der markierten Erreger über einem Magneten und der Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Da jedoch alle magnetischen, fluoreszenten Nanopartikel gefangen werden können, kann ein Fluoreszenzhintergrund durch einzelne, ungebundene Partikel, der zuverlässig von an Erreger gebundenen MNP unterschieden werden muss entstehen. Vorzugsweise kann die Immobilisierung der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile von der Markierung getrennt werden, also getrennte Fänger- Liganden und Markierungs-Liganden verwendet werden.
Ferner wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren bringt dabei die gleichen Vorteile mit sich, wie sie ausführlich in Bezug auf das erfindungsgemäße System beschrieben worden sind.
Erfindungsgemäß umfasst das Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen zumindest einen der folgenden Schritte: Aufbringen eines Probenfluids, insbesondere einer Flüssigkeit auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung. Dies kann im Falle einer mikrofluidischen Struktur die Anwendung am Point-of-Care beispielsweis durch einfaches Aufsaugen eines Tropfens von Kapillarblut aus der Fingerbeere auch durch eine ungeschulte Person und die automatisierte Prozessierung der Probe in einem abgeschlossenen Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung erlauben ohne dass ein weiterer Eingriff durch den Benutzer und/oder eine Laborausstattung z.B. zur genauen Substanzzugabe, Erregerkultur, Zentrifugation usw. notwendig ist. Als weiteren Schritt kann ein Aufbringen und/oder Freisetzen eines Mittels zur Permeabilisierung auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchgeführt werden, wodurch ein Zugang von Liganden zu Strukturen von zumindest einem in dem Probefluid enthaltenen Erreger und/oder zumindest einer Zelle erzielt wird. Dies kann vorzugsweise durch Lösen einer im Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung lyophilisierten Substanz und/oder durch Öffnen eines Blisters mit der vorgelegten Substanz ohne Benutzereingriff erfolgen. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann die notwendige Mischung und Inkubation der Probe mit dem Mittel zur Permeabilisierung bereitstellen. Dies kann zu einer Permeabilisierung und/oder Lyse von kompartimentierenden Bestandteilen der Erreger und/oder Zellen wie einer Lipidmembran und/oder Zellwand führen.
Als weiteren Schritt kann ein Aufbringen und/oder Freisetzen eines Markierungs-Liganden, insbesondere eines Fluoreszenzfarbstoffs an zumindest einem Antikörper und/oder eines DNA-Farbstoffes und/oder Aufbringen und/oder Freisetzen eines Fängerliganden auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchgeführt werden. Dies kann vorzugsweise ohne Benutzereingriff durch Lösen einer im Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung lyophilisierten Substanz und/oder durch Öffnen eines Blisters mit der vorgelegten Substanz erfolgen. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann dabei die notwendige Mischung und Inkubation der Probe mit dem Mittel zur Bindung und dem Mittel zur Markierung bereitstellen.
Als weiterer Schritt ist ein Markieren zumindest eines Bestandteiles von zumindest einem Erreger und/oder zumindest einer Zelle denkbar. Durch eine Permeabilisierung und/oder Lyse der Zelle kann ein Mittel zur Bindung und/oder Markierung Zugang zu Strukturen der Erreger und/oder Zellen z.B. im Zellinneren erhalten, so dass eine spezifische Bindung beispielsweise von Antikörpern an Antigenen erfolgen kann. Im Falle von fluoreszenzmarkierten Antikörpern kann dies eine spezifische Immunfärbung erzeugen. Als weiterer Schritt ist das Anreichern von zumindest einem Bestandteil eines Erregers und/oder einer Zelle, insbesondere mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung denkbar. Bei einem Einsatz von beispielsweise magnetischen Nanopartikeln als Mittel zur Bindung können diese z.B. über einen spezifischen Antikörper an Strukturen des Erregers und/oder der Zelle binden, wodurch diese mittels magnetischer Separation angereichert werden können. Alternativ kann ein Aufstauen z.B. mittels Filtration der Probenflüssigkeit zum Anreichern von Bestandteilen von Erregern und/oder Zellen führen.
Als weiterer Schritt kann ein bildgebender Nachweis eines Erregers und/oder einer Zelle durch mikroskopische Vergrößerung und/oder Bildaufnahme insbesondere mittels einer Kamera, Bildverarbeitung und/oder Auswertung in einem Mittel zur Bildverarbeitung und/oder einer mobilen Rechnereinheit vorgesehen sein. Dies umfasst insbesondere eine Objekterkennung ggf. nach Abzug eines Fluoreszenzhintergrundes und/oder ggf. nach Herausrechnen von durch den Aufbau des Testsystems verursachten optischen Artefakten. Im Falle einer Immunfluoreszenz-Markierung kann unter Verwendung einer Beleuchtungseinheit ein Fluoreszenzsignal durch ein Mittel zur Bildverarbeitung enthaltend vorzugsweise eine Vergrößerungseinheit und eine Kamera bildgebend aufgenommen werden, so dass im mikroskopischen Bild fluoreszente Strukturen von Erreger und/oder Zelle sichtbar werden können. Mittels der Mittel zur Bildverarbeitung und/oder der mobilen Rechnereinheit kann ohne Benutzereingriff eine Objekterkennung dieser fluoreszenten Strukturen und eine weitergehende Auswertung wie z.B. eine automatische Abschätzung der Erregerzahlen pro Probenvolumen erfolgen. Die Ergebnisse können mittels der mobilen Rechnereinheit auch an medizinisches Fachpersonal übermittelt werden, welches eine Diagnose erstellen und eine entsprechende Therapie einleiten kann.
Dabei ist es denkbar dass die einzelnen Schritte einzeln für sich und/oder in einer beliebigen Reihenfolge durchführbar sind.
Vorzugsweise kann das Testverfahren als ein Nachweis von Krankheiten eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere die folgenden Krankheiten denkbar: Infektionskrankheiten, Erkrankungen verursacht durch Pilze, Viren und/oder Bakterien, und/oder Pathogenen und/oder Erreger. Als Erreger sind dabei ferner insbesondere die folgenden Erreger denkbar: Adenoviren, Amylostoma, Ascaris, Babesia, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Bordetella Parapertussis, Borrelia recurrentis, Brucella sp., Campylobacter sp., Cestoda, Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, humanpathogene Cryptosporidium sp., Ebolavirus, Echinococcus multilocularis, Echinococcus granulosus, Escherichia coli, enterohämorrhagische Stämme (EHEC), Eucestoda, Francisella tularensis, FSME-Virus, Gelbfiebervirus, Giardia lamblia, Haemophilus influenzae, Hantaviren, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, Hepatitis-D-Virus, Hepatitis-E-Virus, Influenzaviren, Lassavirus, Legionella sp., humanpathogene Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Marburgvirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis/africanum, Mycobacterium bovis, Neisseria meningitidis, Norwalk-ähnliches Virus, Poliovirus, Pseudomonas aeruginosa, Rabiesvirus, Rickettsia prowazekii, Rotavirus, Rubellavirus, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhi, Schistosoma, Shigella sp., Taenia saginata, Taenia solium, Trichiuris, Tripanosoma, Tripanosoma brucei, Tripanosoma congolense, Tripanosoma vivax, Trichinella spiralis, Varizella-Zoster-Virus, Vibrio cholerae O 1 und O 139, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Treponema pallidum, HIV, Echinococcus sp., Plasmodium sp., Toxoplasma gondii, Streptococcus pneumoniae und/oder Streptococcus, insbesondere Malariaerreger Plasmodium wie P. falciparum, P. vivax, P. malariae, insbesondere in einer Blutprobe.
Bei dem Testverfahren ist vorzugsweise ein Nachweis von Malariaerregern denkbar, die insbesondere in einer Blutprobe vorkommen. Im Rahmen der Erfindung kann ebenfalls vorteilhaft sein, wenn das Testverfahren Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung zum Nachweis von Malariaerregern in einer Blutprobe eingesetzt werden kann. Dabei ist es möglich, dass zumindest eine Struktur in infizierten Erythrozyten verfügbar sein kann. Das Testverfahren kann ein Mittel zur Permeabilisierung, insbesondere Saponin und/oder Ammoniumchlorid, enthalten und für zumindest einen Fänger-Liganden, insbesondere zumindest einen Antikörper gegen plasmodiale Proteine, welcher vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Partikel, insbesondere einen Turbobead koppelbar sein, und/oder einen Markierungs-Liganden, vorzugsweise zumindest einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen plasmodiale Proteine und/oder zumindest einen DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA umfassen. Damit kann zumindest eine Struktur von Plasmodien und/oder des zumindest einen infizierten Erythrozyten in einer Sandwich-Struktur nachgewiesen werden und/oder zumindest ein infizierter Erythrozyt und/oder zumindest eine Struktur von Plasmodien können mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung gefangen werden.
Ferner kann das Testverfahren mit einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung ausgestattet sein, welches zumindest eine Mikroküvette auch in Kombination mit einer mikrofluididischen Struktur enthält, in die eine Probenflüssigkeit vorzugsweise eine definierte Menge Vollblut aus der Fingerbeere aufgenommen wird. In dieser Mikroküvette mit oder ohne mikrofluidischer Struktur kann die Probenflüssigkeit vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem Fänger-Liganden mit oder ohne Magnetbeads und/oder einem oder mehreren Mitteln zur Markierung und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung gemischt werden. Die Mischung kann beispielsweise durch Anlegen eines umschaltbaren externen Magnetfeldes, durch das enthaltene Magnetpartikel durch die Lösung geführt werden können, Fischgrätmuster im Kanal, Vibrationen, Schall oder anderen Mischverfahren verstärkt werden. Anschließend können die an das Mittel zur Immobilisierung wie magnetische Mikro- oder Nanopartikel gebundenen Erreger oder Erregerbestandteile auf einem Sichtfenster immobilisiert und mikroskopisch detektiert werden. Ferner kann das Testverfahren ein Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit zumindest einer mikrofluidische Struktur in Kombination mit einer Filterstruktur, wie vorzugsweise einem saugenden Filterpad wie beispielsweise in Lateral Flow Tests vorhanden, enthalten.
In die mikrofluidische Struktur kann eine Probenflüssigkeit wie eine definierte Menge Vollblut aus der Fingerbeere gegeben wird. Die Probenflüssigkeit kann vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem oder mehreren Mitteln zur Markierung wie beispielsweise Antikörpern mit einer Fluoreszenzmarkierung oder Goldpartikeln und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung gemischt werden. Anschließend kann die Flüssigkeit in Kontakt mit der Filterstruktur beispielsweise durch Öffnen einer Belüftungsöffnung und/oder beispielsweise durch Verschieben und/oder durch Umknicken des Chips und/oder durch Überwinden einer Flußbarriere gebracht werden. Die Filterstruktur saugt nachfolgend die Flüssigkeit aus der Kapillare auf. An der Filterstruktur kann ein Fängerligand wie ein spezifischer Antikörper gegen Erreger-Antigene an der Filterstruktur immobilisiert werden. Durch die geringe Porengröße der Filterstruktur wie einem Saugpad und das Einsaugen der Flüssigkeit kommen die Erreger oder die Bestandteile in Kontakt mit dem Fängerliganden und werden immobilisiert. Ähnlich einem Lateral Flow Test entsteht dabei eine Bande, die aber nicht wie bei Lateral flow tests üblich aus einem Protein mit gebundenen Antikörpern sondern aus markierten Erregern und/oder Zellen und/ oder deren Bestandteilen besteht. Je nach Konzentration und Markierungsmethode beispielsweise mit Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, Goldpartikeln, Beads kann diese Bande mikroskopisch und/oder fotografisch und/oder per Auge analysiert werden. Als mögliche Membranen sind beispielsweise zumindest eine der folgenden verwendbar: BA83, BA85, CF1 , CF3, CF4, CF5, CF6, CF7, LF1 , MF1 , VF2, Fusion 5, GF/DVA, AE, FF120HPFFHP.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Verwendung zur Diagnose von Erkrankungen mittels eines Testsystems und/oder eines Testverfahrens denkbar. Die erfindungsgemäße Verwendung bringt dabei die gleichen Vorteile mit sich wie sie bereits ausführlich in Bezug auf das erfindungsgemäße Testsystem sowie das erfindungsgemäße Testverfahren beschrieben worden sind. Insbesondere kann eine Diagnostik am Point-of- Care auch durch eine ungeschulten Person erfolgen, so dass die gesuchten Erreger und/oder Zellen vor Ort und zeitnah statt mittels aufwändiger Laborverfahren durch das Testsystem nachgewiesen werden können.
Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung zu einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung, welche in den Figuren schematisch dargestellt sind. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und/oder der Zeichnung hervorgehende Merkmale und/oder Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumliche Anordnungen und Verfahrensschritte, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Es zeigen: Figur 1 a: schematische Darstellung einer Zielzelle vor der Permeabilisierung,
Figur 1 b: schematische Darstellung einer Zielzelle nach der Permeabilisierung, Figur 2a: schematische Darstellung eines Reaktionsgefäßes als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung,
Figur 2b: schematische Darstellung eines Mikrokanals als Mittel zur Lokalisation,
Immobilisierung und/oder Anreicherung,
Figur 2c: schematische Darstellung eines Mikrokanals mit Aufstau-Vorrichtung,
Figur 3: schematische Darstellung einer Bildaufnahme und Verarbeitung nach
Permeabilisierung, Markierung und Fangen von Erregern und/oder Zellen und
Figur 4: schematische Darstellung eines Testsystems. Figur 1 a zeigt einen Erreger und/oder eine infizierte Zelle 10 mit spezifischen inneren Zielstrukturen 40, 50 wie z.B. einem Antigen, einem Protein, einem Lipid, einer Glycosaccharaidkette, einer Nukleinsäurekette, einem Peptid oder anderen Biomolekülen. Dies kann ein Erreger 10 wie ein Bakterium sein, welches eine kompartimentierende Struktur 30 wie z.B. eine Zellmembran und/oder eine Zellwand aufweist, welche das Zellinnere vom Zelläußeren im Wesentlichen abtrennt. Es enthält für diese Bakterien-Spezies spezifische Zielstrukturen 40, 50 z.B. an einer oder mehreren inneren Strukturen 20 wie z.B. einem Thylakoid, Ribosom, Plasmid, Chlorosom, Basisapparat einer Geißel, Nucleoid, cytoplasmatische Seite der Zellmembran und/oder andere Bestandteile, auf denen Zielstrukturen wie z.B. Antigene zu finden sind. Ein in die äußere Lösung zugegebener und/oder dort gelöster Fänger-Ligand 60 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper z.B. mit einem angekoppelten magnetischen Nanopartikel 70 wie beispielsweise einem Turbobead und/oder ein Markierungs-Ligand 80 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper mit angekoppelter Markierung 90 wie beispielsweise einem Fluorophor, Quantum- Dot, Enzym, Goldpartikel und/oder sonstiger Markierung kann auf Grund der kompartimentierenden Struktur 30 wie einer Zellwand und/oder Lipidmembran und/oder sonstigen Struktur nicht in das Innere des Bakteriums eindringen. Die Zelle 10 kann beispielsweise ebenfalls ein mit einem Malariaerreger 20 (Plasmodium spec.) infizierter Erythrozyt 10 sein. Die Zielstrukturen 40, 50 können ebenfalls Plasmodium- spezifische Strukturen sein, die im Inneren des Erythrozyten angeordnet sind. Der Erythrozyt ist durch eine Zellmembran umhüllt, welches eine als kompartimentierende Struktur 30 das Zellinnere vom Zelläußeren im Wesentlichen abtrennt. Es enthält für diese Plasmodien-Spezies spezifische Zieltrukturen 40, 50 z.B. an einer oder mehreren inneren Strukturen 20 wie etwa plasmodiale Proteine am Zytoskelett und/oder an einer inneren Membran. Ein in die äußere Lösung zugegebener und/oder dort gelöster Fänger-Ligand 60 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper z.B. mit einem angekoppelten magnetischen Nanopartikel 70 wie beispielsweise einem Turbobead und/oder ein Markierungs-Ligand 80 wie ein spezifischer Antikörper mit angekoppelter Markierung wie einem Fluorophor, Quantum-Dot, Enzym, Goldpartikel können auf Grund der kompartimentierenden Struktur 30 nicht in das Innere des Erythrozyten eindringen.
Figur 1 b stellt eine Zelle 10 nach Zugabe eines Mittels zur Permeabilisierung 1 10 wie z.B. Saponin, Porenbildner, lysierende Agenzien, Import-auslösende Agenzien, hypotone oder hypertone Lösungen und/oder andere Substanzen dar. Durch das Mittel zur Permeabilisierung können Öffnungen 31 als Risse, Poren, Löcher, destabilisierte Membranbereiche z.B. ohne Cholesterol, und/oder ein Aufnahmevorgang 31 wie Transportmechanismen in der kompartimentierenden Struktur 30 entstehen. In Folge dessen können in die äußere Lösung zugegebene Fänger-Ligand(en) 60 mit angekoppeltem magnetischem Nanopartikel 70 und/oder Markierungs-Ligand 80 mit angekoppelter Markierung 90 in die Zelle und/oder den Erreger eindringen und dort spezifisch an die jeweilige Zielstruktur 40 und/oder 50 binden. Fänger-Ligand 60 und Markierungs-Ligand 80 haben vorzugsweise keine Kreuzreaktivität, d.h. sie binden an verschiedene Zielstrukturen 40, 50, so dass vorzugsweise eine Sandwichstruktur entstehen kann. Vorzugsweise kann durch Anbinden des Markierungs-Liganden 80 wie beispielsweise einem fluoreszenzmarkiertem Antikörper an eine Zielstruktur 40 wie beispielsweise einem Erreger- typischen Antigen eine Immunfärbung entstehen.
Figur 2a ist eine schematische Darstellung eines Reaktionsgefäßes 121 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe mit Zellen 10, 1 1. Vorzugsweise können die Zellen 10 dabei Zielzellen und Zellen 1 1 dabei Nicht-Zielzelle darstellen. Das Reaktionsgefäß 121 kann beispielsweise ein Mikroreaktionsgefäß wie ein Eppendorf-Reaktionsgefäß und/oder eine chromatographische Säule sein. Ein zugeordneter Magnet 130 wie ein Hochgradientenmagnet und/oder ein Dauermagnet und/oder ein Elektromagnet und/oder ein sonstiger Magnet kann im Reaktionsgefäß 121 eine magnetische Anziehungskraft 131 erzeugen. Diese Anziehungskraft 131 kann dabei auf die magnetischen Nanopartikel 70 wirken, wodurch diese und die über den Fänger-Liganden gebundene Zielstruktur 50 angezogen werden und können, soweit in dem Reaktionsgefäß 10 möglich, in räumlicher Nähe des Magneten angereichert und immobilisiert werden. Bevorzugt kann die gebundene Ziel-Struktur 50 mit Bestandteilen und/oder dem Großteil der Zelle und/oder des Erregers 10 verbunden sein, so dass die gebundene Ziel-Struktur 50 mit anhängenden weiteren Bestandteilen in räumlicher Nähe des Magneten wie z.B. an der dem Magneten zugewandten Wand des Reaktionsgefäßes angereichert wird. Nicht-Zielzellen wie z.B. nicht-infizierte Erythrozyten können nicht durch Fänger-Liganden gebunden und nicht angereichert werden. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann eine Markierung von Strukturen der Zielzelle erfolgen.
Figur 2b zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 140 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe unter Einsatz eines Fänger-Liganden mit magnetischem Nanopartikel. Eine mikrofluidische Sturktur besteht aus einem Bauteil mit enthaltener Kapillare und/oder Mikrostrukturen und/oder einem oder mehreren Mikrokanälen. Die Probenflüssigkeit mit enthaltenen Zellen 10, 1 1 kann die mikrofluidische Struktur 140 in Fließrichtung 141 durchfließen. Ein zugeordneter Magnet 130 kann eine magnetische Kraft 131 in einem Bereich der mikrofluidischen Struktur erzeugen. Diese Kraft kann anziehend auf den magnetischen Nanopartikel 70 wirken, wie in Figur 2a gezeigt, und somit auf den gekoppelten Fänger-Liganden 60 und eine gebundene Zielstruktur 50 und/oder vorzugsweise einen angebundenen Großteil der Struktur 20 und/oder 10 wirken. Dies kann zu einer Anreicherung der Zielstruktur und vorzugsweise der Zellen 10 und/oder den Bestandteilen der mikrofluidischen Struktur 140, insbesondere an der Decke, den Seitenwänden und/oder dem Boden führen. Zellen 1 1 wie z.B. nicht-infizierte Erythrozyten können nicht durch Fänger-Liganden 60 gebunden und angereichert werden. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden 80 wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann eine Markierung von Zielstruktur(en) 40 der Zielzelle 10 erfolgen.
Figur 2c ist eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 140 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe und einer Aufstau-Vorrichtung im mikrofluidischen Kanal. Die Probenflüssigkeit mit enthaltenen Zellen 10, 1 1 kann die mikrofluidische Struktur 140 in Fließrichtung 141 durchfließen. Eine Aufstau- Vorrichtung in einem Bereich der mikrofluidischen Struktur kann enthaltene Zellen 10, 1 1 (Ziel-Zellen und Nicht-Zielzellen) und/oder Ziel-Erreger 10 zurückhalten, während die restliche Flüssigkeit teilweise in/durch die Aufstau-Vorrichtung fließen kann. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden 80 wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann ferner eine Markierung von Strukturen der Zelle 10 erfolgen. Markierte Zellen 10 (Zielzellen) unter den aufgestauten Zellen 10 ,1 1 (Zielzellen und Nicht-Zielzellen) können mittels Bildverarbeitungsvorrichtung detektiert werden.
Figur 3 zeigt die schematische Darstellung einer Bildaufnahme und Verarbeitung nach Permeabilisierung, Markierung und/oder Anreicherung im Falle einer Fluoreszenzmarkierung und bildgebender Detektion. Die Probe mit den enthaltenen Zellen 10 kann mit einem Anregungslicht 151 z.B. Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 950 nm einer Anregungsbeleuchtung 150 wie z.B. einer LED und/oder einem Laser und/oder einer Beleuchtungsquelle bestrahlt werden. Diese Anregungsbeleuchtung kann so abgestimmt sein, dass sie die Markierung 90 zur Abgabe von Fluoreszenzlicht 152 wie z.B. Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 1000 nm stimuliert. Fluoreszenzlicht 152 kann daraufhin von einem Mittel zur Bildverarbeitung 160 aufgenommen werden. Diesem Mittel zur Bildverarbeitung 160 kann eine Vergrößerungseinheit 161 und eine Kamera 162 zugeordnet sein. Bilddaten der Kamera können prozessiert und mittels Datenübertragung 164 vorzugsweise kabellos an eine mobile Rechnereinheit 163 wie ein Smartphone gesendet werden. Die mobile Rechnereinheit 163 kann diese Bilddaten auswerten und außerdem eine Benutzerführung und eine Steuerung des Mittels zur Bildverarbeitung ausführen. Als Ergebnis können enthaltene Zellen und/oder Erreger auf den Bildern lokalisiert und angezeigt werden. Eine Diagnosestellung kann z.B. durch Übertragung der Erregerbilder an eine Rechnereinheit 164 wie ein weiteres mobiles Smartphone von medizinischem Fachpersonal durch dieses erfolgen.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 200, die z.B. eine Kapillare und/oder einen Mikrokanal und/oder eine sonstige mikrofluidische Struktur enthält. Diese kann eine Probenaufnahme 210 enthalten, in die ein Volumen einer flüssigen Proben gegeben wird. Dies kann beispielsweise eine Kapillare mit definiertem Volumen sein. Die Probenaufnahme 210 kann lyophilisierte Substanzen wie z.B. einen Gerinnungshemmer enthalten. Die Probe kann anschließend die mikrofluidische Struktur 200 beispielsweise auf Grund von Kapillarkräften durchfließen. Die Probe kann dort beispielsweise mittels einer Abzweigung eines Mikrokanales aufgeteilt werden, so dass ein erster Teil der Probe ein Depot für eine vorgelegte, feste Substanz 220 durchfließen kann und dort z.B. lyophilisierte Liganden lösen kann. In einer Mischer-/lnkubationsstruktur kann der erste Probenteil mit dieser/n Substanz(en) gemischt und inkubiert werden. Der erste Probenteil kann mit dem zweiten Probenteil zusammengeführt und in einer Mischer-/lnkubationsstruktur 240 gemischt und inkubiert werden. Im Detektionsbereich kann ein Fangen, eine Anreicherung und/oder Immobilisierung erfolgen. Das Mittel zur Bildverarbeitung kann die Ziel-Zellen/Ziel-Erreger im Detektionsbereich detektieren. Der Fließvorgana kann vorzugsweise durch eine Saugvorrichtung 250 wie ein Saugvlies und/oder eine Mikropumpe aufrechterhalten werden, kann aber auch durch eine externe Vorrichtung wie eine Pumpe erfolgen. Die Lösung kann anschließend in einem Abfallreservoir 260 gesammelt werden. Eine mikrofluidische Struktur als Teststreifen kann weiterhin eine Kodierung wie einen Barcode und/oder ein RFID-Bauteil zur Identifikation der Probe enthalten. Beispiel der Detektion von Malaria-Erregern
Malariaerreger durchlaufen in ihrem Lebenszyklus mehrere Stadien. Im Kapillarblut aus der Fingerbeere findet man vorwiegend Plasmodien im Ringstadium in infizierten roten Blutkörperchen (iRBC). Die Plasmodien enthalten im Gegensatz zu den nicht infizierten roten Blutkörperchen (RBC) DNA. Auf der Oberfläche von iRBC findet man verschiedene parasitäre Antigene wie das PfEMP-1 -Protein. Zum Unterlaufen der Immunantwort finden sich hierbei jedoch jeweils nur eines aus einem Pool von vielen variablen, genetisch kodierten Unterformen. Für den Erreger Plasmodium falciparum sind bisher keine Antikörper bekannt, welche universell möglichst alle Varianten erkennen und somit als universeller Antikörper für die diagnostische Erkennung aller mit Pias. falc. infizierten iRBC eingesetzt werden könnte. Im Inneren der iRBC mit Erregern im Ringstadium finden sich jedoch einige parasitäre Antigene, welche nicht variabel bei allen Pias. falc. auftreten. Kommerziell sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen plasmodiale Proteine zu erhalten wie z.B. monoklonale Maus IgM-Antikörper gegen Plasmodium falciparum„all stages" sowie monoklonale anti-MSP-1 und/oder MSP-10- Antikörper. Ein weiteres Beispiel für ein parasitäres Antigen ist das Ring-infected erythrocyte surface antigen (RESA), welches entgegen seinem Namen nicht auf der Oberfläche der iRBC sondern an der Membraninnenseite infizierter Erythrozyten an Komponenten des iRBC-Zytoskeletts zu finden ist. Auf der parasitophoren Membran und nach Permeabilisierung der Plasmodiummembran auch im Cytoplasma der Plasmodien sind weitere Antigene zu finden, welche über spezifische Antikörper nachgewiesen werden können. In einer Ausführungsform wird ein definiertes Volumen von vorzugsweise 1 bis 10 μΙ Vollblut aus der Fingerbeere in den Teststreifen appliziert. Die Erythrozyten werden durch ein Mittel zur Permeabilisierung, vorzugsweise Saponin und/oder Ammoniumchlorid, permeabilisiert und/oder lysiert, so dass ein Markierungs-Ligand, vorzugsweise ein fluoreszenzmarkierter Antikörper wie der monoklonale Maus-IgM-Antikörper gegen mit Pias. falc. infizierte RBC, Klon IIIB6, markiert mit DyLight 488 und/oder ein fluoreszenzmarkierter anti-RESA-Antikörper, in den iRBC diffundieren kann. Dort bindet dieser an die infizierte RBC und erzeugt eine Immunfluoreszenzmarkierung. Alternativ kann über einen fluoreszenten DNA-Farbstoff wie Hoechst 33342 die parasitäre DNA markiert werden. Ein Filter hält jetzt alle Zellen und Zellbestandteile zurück. Die Fluoreszenzmarkierung kann mit der Vergrößerungseinheit mit Bildverarbeitungseinheit, welches als Fluoreszenzmikroskop dient, sichtbar gemacht werden. In einer anderen Ausführungsform wird als Mittel zur Bindung ein magnetischer Nanopartikel wie ein Turbobead-PEG-Streptavidin eingesetzt, an den ein biotinylierter Antikörper wie der monoklonale Maus-IgM-Antikörper gegen mit Pias. falc. infizierte RBC, Klon IIIB6, biotinyliert, gebunden wird. Nach der Permeabilisierung der RBC und iRBC diffundiert das MNP in die Erythrozyten und bindet dort spezifisch an Strukturen der infizierten RBC. Als zweites Mittel der Markierung wird ein fluoreszenter DNA-Farbstoff und/oder ein fluoreszenzmarkierter Antikörper zugegeben, welcher eine Immunfluoreszenz der iRBC und/oder Plasmodien erzeugt. Im Detektionsbereich werden die iRBC mittels eines Magneten immobilisiert und angereichert und können mittels Fluoreszenzmikroskopie bildgebend detektiert werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Nanopartikel wie die NanoScreenMag-Partikel der Chemicell GmbH und/oder die MyQuVigen-Nanopartikel von Nvigen Inc. als Mittel zur Bindung und Markierung zu den permeabilisierten iRBC zugegeben. Im Detektionsbereich können diese mittels eines Magneten immobilisiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie durch die optische Vergrößerungseinheit bildgebend nachgewiesen werden. Die Bilddaten mit den fluoreszenzmarkierten iRBC können jeweils an durch die Bildverarbeitungsvorrichtung einer ersten Bearbeitung unterzogen werden wie z.B. Hintergrund-Korrektur und/oder einer Kompression. Im nächsten Schritt können mittels einer Objekt-Erkennungs-App in den Bildern Objekte gesucht werden, deren Intensität über einem kritischen Wert liegen und die eine bestimmte Größe und/oder Pixelzahl aufweisen können und die somit als Erreger definiert werden. Diese Auswertung kann in der Bildverarbeitungsvorrichtung und/oder in der mobilen Rechnereinheit erfolgen. Die Objekt- Detektion kann durch entsprechende Kontrollen wie einer Zellerkennung bei Weißlicht- Beleuchtung und/oder einer Fluoreszenzerkennung nach Membranfärbung weiter abgesichert werden. Aus der Detektion von Erregern kann auf eine Diagnose des Patienten geschlossen werden.
Eine weitere Möglichkeit als Anwendungsbeispiel zur Detektion von Malaria-Erregern ist die Zugabe von Saponin als Mittel zur Lyse und Permeabilisierung zu mit Plasmodien infizierten Erythrozyten in einer Vollblutprobe. Durch das Einwirken von Saponin wird die äußere Erythrozytenmembran lysiert und der Parasit kann daraus freigesetzt werden, wobei die parasitophore Vakuole erhalten bleibt. Auf dieser parasitophoren Membran befinden sich zumindest eine Struktur wie parasitophore Antigene wie die Proteine RAP1 oder EXP2. Diese werden beispielsweise in Rhoptrien, Mikronemen oder Dense Granules gespeichert und sind somit auch in frühen Trophozoiten bereits vorhanden. An diese kann zumindest ein Fänger-Ligand 60, insbesondere zumindest ein Antikörper gegen plasmodiale Proteine wie RAP1 oder EXP2 wie den monoklonalen Antikörper anti-RAP-1 , Klon 2.29 oder den monoklonalen Antikörper anti-EXP-2, Klon 2.2 binden. Dieser Antikörper ist vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Mikro- oder Nanopartikel 70, insbesondere einen Dynabead oder Dynabead Myone und/oder zumindest einen oder mehrere Markierungs-Liganden 80, vorzugsweise zumindest einen oder mehrere markierten Antikörper wie den monoklonalen Antikörper anti-RAP-1 , Klon 2.29 oder den monoklonalen Antikörper anti-EXP-2, Klon 2.2 gegen plasmodiale Proteine wie beispielsweise RAP1 oder EXP2 gebunden. Diese Antikörper können vorzugsweise mit einem spektral unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoff wie beispielsweise DY-396XL von Dyomics GmbH oder Quantum dots wie Qdots von Thermo Fisher Scientific oder Candots von Candots GmbH markiert sein. Auch kann zumindest ein (vorzugsweise fluoreszenter) DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA, eingesetzt werden, um damit insbesondere zumindest eine Struktur 40, 50, 20 von Plasmodien 20 und/oder von zumindest mit einem oder mehreren Plasmodien 20 infizierten Erythrozyten 10 nachzuweisen und/oder zumindest einen infizierten Erythrozyten 10 und/oder zumindest eine Struktur 40, 50, 20 von Plasmodien mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 wie einer Mikrotiterplatte mit zumindest 96, insbesondere 1536 Vertiefungen, einer Mikroküvette, einer Filterstruktur ohne oder beschichtet mit Fänger- Liganden oder einer fluidischen Struktur zu fangen.
Beispiel der Detektion von Sepsis-Erregern
Sepsis tritt jährlich beispielweise bei ca. 18 Mio. Patienten auf und hat eine Lethalität von ca. 50%. Verantwortlich für eine Sepsis können über 25 veschiedene Erreger sein wie z.B. Bakterien (Meningokokken, Streptokokken etc.) und/oder Pilzinfektionen. Beispielsweise für Streptokokken existieren bereits kommerzielle Schnelltests. Diese bestehen aber üblicherweise aus mehreren Schritten, da mittels mehreren Reagenzien zuerst das Antigen aus der Zellwand herausgelöst werden muss und anschließend in einer Indikatorreaktion nachgewiesen wird. Die hohe Spezifität von 95 bis 100 % ist gut dokumentiert. Die Sensitivität der Tests beträgt z.B. jedoch lediglich 70 bis 90 %; in 10 bis 30 % ist das Resultat also falsch negativ. Bei infektiösen Bakterien findet sich in der Regel eine regionale und zeitliche Veränderung der Oberflächenantigene. Ein Schnelltest gemäß der Erfindung kann unter Bindung und Markierung von anderen Antigenen, die ohne Permeabilisierung der Zellen nicht für Liganden zugänglich sind, erfolgen. Vergleichbar der Detektion am Beispiel eines Malaria-Erregers gibt es hier verschiedene Ausführungsformen wie A) Aufstauen aller Zellen und ein Immunfluoreszenz-Nachweis mittels eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers gegen ein internes, eher konserviertes Antigen, B) magnetisches Fangen und parallele Fluoreszenzmarkierung mittels eines fluoreszenten MNP, an das ein spezifischer Antikörper gekoppelt wird und/oder C) magnetisches Fangen mittels eine MNP, vorzugsweise Turbobead, mit spezifischem Antikörper und Fluoreszenzmarkierung mittels eines zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder eines DNA-Farbstoffes.
Beispiel für eine Anwendung der Erfindung für die Analyse von Nahrungsmitteln und/oder Trinkwasser: Nachweis von Legionellen in Trinkwasser
Legionellen sind bewegliche Stäbchenbakterien mit einer durchschnittlichen Länge von 2 - 5 μηη und einem Durchmesser von 0,5-0,8 μηη. Sie kommen in zahlreichen Arten und Serogruppen weltweit verbreitet in Oberflächenwässern und auch in Trinkwasserleitungen vor. Eine Infektion mit Legionella pneumophila erfolgt durch zerstäubtes, vernebeltes Wasser und kann zu der sogenannten Legionärskrankheit, einer schweren Pneumonie, führen, welche in 10-15 % der Fälle tödlich verläuft. Kommerzielle Schnelltests beinhaltet meist eine Probennahmevorrichtung, die zu einem Labor geschickt wird und dort mittels einer Bakterienkultur auf Agarplatten in ca. 10 Tagen analysiert wird. Eine Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise einen Teststreifen enthalten, der für die Filtration eines Volumen von Trinkwasser im Bereich von Milliliter bis mehreren Litern und/oder Kubikmetern ausgelegt ist, so dass alle enthaltenen Zellen, Bakterien und Erreger zurückgehalten werden und im Detektionsbereich angeordnet werden. Dies kann beispielsweise mit einer mikroporösen Filtrationsmembran mit einer Porengröße von 0,45 μηη erfolgen. Anschließend wird ein Mittel zur Permeabilisierung der Erreger beispielsweise aus einem im Teststreifen enthaltenen Blister eingeleitet, so dass die Filtrationsmembran mit diesem inkubiert wird. Außerdem wird beispielsweise ein fluoreszenzmarkierter Antikörper und/oder fluoreszenter Nanopartikel mit Antikörper zugegeben, der spezifisch an Antigene und/oder zelluläre Strukturen der Legionellen bindet, die ohne Mittel zur Permeabilisierung nicht zugänglich wären und eine lokal und zeitlich weitgehend konstante Struktur aufweisen. Die Erreger können mittels Immunfluoreszenz durch die Vergrößerungseinheit mit Bildverarbeitungsvorrichtung bildgebend detektiert werden. In einer anderen Ausführungsform wird zuerst ein Volumen von Trinkwasser im Bereich von Millilitern bis zu mehreren Litern und/oder Kubikmetern in einer Mischkammer mit einem Mittel zur Permeabilisierung und magnetischen Mikropartikeln wie Dynabeads oder Nanopartikeln wie Turbobeads gemischt, an die ein spezifischer Antikörper gegen Antigene der Legionellen gekoppelt ist. Nach einer Inkubation wird die Mischung in einem Teststreifen an einem Magneten angeordnet bei einem Detektionsbereich vorbeigeleitet. Die MNPs werden dabei aus der Lösung gefangen, wodurch gebundene Legionellen und/oder deren Bestandteile immobilisiert werden. Die Fluoreszenzfärbung kann durch einen Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes und/oder einem fluoreszenzmarkierten Antikörper und/oder einem fluoreszenten Nanopartikel mit gebundenem Antikörper erfolgen. Die Detektion kann wiederum mittels bildgebender Immunfluoreszenz erfolgen.
Als Erweiterung dieses Anwendungsbeispieles kann eine Probe insbesondere einer Körperflüssigkeit wie Urin und/oder Stuhl und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser eingesetzt werden, die zum Auflösen mit einem Puffer gemischt werden kann. Feste Bestandteile können anschließend beispielsweise durch Filtration, Sedimentation und/oder Zentrifugation abgetrennt werden. Erreger wie Legionella und/oder Eier der Erreger wie der Würmer Ascaris, Trichiuris, Amylostoma, Taenia können mit einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung 1 10 lysiert und/oder permabilisiert werden. Die Erreger, Eier der Erreger und/oder deren Bestandteile können anschließend mit einem Markierungs-Ligand 80 markiert und/oder über ein Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 wie eine Filterstruktur und/oder magnetische Partikel angereichert werden und/oder mittels bildgebender Mikroskopie detektiert werden.
Die voranstehende Erläuterung der Ausführungsformen beschreibt die vorliegende Erfindung ausschließlich im Rahmen von Beispielen. Selbstverständlich können einzelne Merkmale der Ausführungsformen, sofern technisch sinnvoll, frei miteinander kombiniert werden, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Bezugszeichen l iste
10 Zielzelle oder Zielerreger
11 Zelle
20 Struktur einer Zelle und/ oder eines Erregers
30 Struktur zur Kompartimentierung
31 Erzeugte Öffnung in 30 und/oder Aufnahmemechanismus durch 30
40 Ziel-Struktur
50 Ziel-Struktur
60 Fänger-Ligand
70 Magnetischer Nanopartikel
80 Markierungs-Ligand
90 Markierung
110 Mittel zur Permeabilisierung
120 Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung
121 Reaktionsgefäß
122 Aufstau-Vorrichtung
130 Magnet
131 Magnetische Anziehungskraft
140 Mikrofluidische Strruktur
141 Fließrichtung
150 Beleuchtungseinheit
151 Anregungslicht
152 Fluoreszenzlicht
160 Mittel zur Bildverarbeitung
161 Vergrößerungseinheit
162 Kamera
163 Mobile Rechnereinheit
164 Datenübertragung
165 Mobile Rechnereinheit
200 Mikrofluidische Struktur 210 Probenaufnahme
220 Depot
230 Blister-Depot
240 Mischerstruktur, Inkubationsstruktur
250 Saugvorrichtung
260 Abfall reservoir
270 Codierung
280 Detektionsbereich

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1 . Testsystem umfassend zumindest eines der folgenden Mittel:
Mittel zur Permeabilisierung (1 10) und/oder Lyse von zumindest einem Erreger 10 und/oder zumindest einer Zelle (10)
Mittel zum Fangen (80) und/oder Markierung (90) von Teilen (20 und/oder 40 und/oder 50) der Erreger (10) und/oder Zellen (10),
Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) eines Erregers (10) und/oder einer Zelle (10),
Mittel zur Bildverarbeitung (160) vorzugsweise umfassend eine optische Vergrößerungseinheit (161 ), wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) durchführbar ist.
2. Testsystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,
dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) Elemente zur Aufnahme eines Probefluids aufweist, insbesondere einer Körperflüssigkeit und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser.
3. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Mittel zur Permeabilisierung (1 10) ein Zugang für Liganden (60, 80) zu zumindest einer Zielstruktur (40 und/oder 50) wie einem Biomolekül und/oder zu zumindest einer Struktur (20) eines Erregers und/oder zu zumindest einer Zelle (10)/ Erreger (10) erzielbar ist, wobei insbesondere zumindest eine Öffnung (31 ), aufweisend eine Größe zwischen ungefähr 1 nm und ungefähr 12 μηη, und/oder ein Aufnahmemechanismus (31 ) und/oder eine vollständigen Lyse (31 ) der Zelle (10) erzeugbar ist oder ein Parasit aus der Zelle (10) freigesetzt wird. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) von zumindest einem Bestandteil von Erregern (10) und/oder Zellen (10) einsetzbar ist, wobei zumindest ein Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) von Erregern (10) und/oder Zellen (10) anreicherbar ist und/oder dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) eine mikrofluidische Struktur (140 und/oder 200) zur Auflösung (220) und/oder Zugabe (230) und/oder Mischung (240) und/oder Inkubation (240) von Substanzen aufweist.
Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zumindest eine mikrofluidische Struktur (140 und/oder 200) zur Inkubation eines Probefluids mit Fänger- (60) und/oder Markierungs-Ligand (80) aufweist und zumindest einen Detektionsbereich (280), wobei auf dem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zumindest ein Bestandteil zumindest eines markierten Erregers (10) und/oder zumindest einer markierten Zelle (10) aufnehmbar ist.
Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zumindest eine mikrofluidische Struktur 140, 200 aus PET enthält, in welches wässrige Flüssigkeit vorzugsweise passiv ohne weitere Beschichtung einströmbar ist, wobei insbesondere das Mittel zumindest zum Teil mit einer Folie verschließbar ist und/oder in einen oder mehrere Bereiche unterteilbar ist, welches zunächst verschlossen ist, wodurch die Flüssigkeit dieses nicht weitergehend durchströmt und welches nach Aufstechen einer dahinterliegenden Belüftungsöffnung von der Flüssigkeit durchströmbar ist,
insbesondere eine Unterteilung in einen Probeaufnahmebereich, in welchem ein definiertes Probenvolumen wie beispielsweise Vollblut aus der Fingerbeere aufnehmbar ist,
und/oder einem Mischungsbereich, in dem die Probe vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem Fänger-Liganden mit oder ohne Magnetbeads und/oder einem oder mehreren Markierungsliganden und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung mischbar ist,
und/oder einem Detektionsbereich, in dem die Erreger lokalisierbar und/oder anreicherbar und/oder, vorzugsweise durch ein externes Magnetfeld, immobilisierbar sind.
Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Bindung zumindest einen Fänger-Liganden (60) und/oder zumindest einen Markierungs-Liganden (80) zur Markierung, insbesondere Färbung aufweist, wobei dies insbesondere zumindest einen Antikörper, ein Aptamer und/oder einen Ligand umfasst und/oder einen Mikro-Partikel (70), Nanopartikel (70), magnetischen Mikropartikel (70), magnetischen Nanopartikel (70) umfasst, das mit einem Antikörper, Aptamer, Liganden koppelbar ist, wobei bevorzugt ein zumindest magnetischer Nanopartikel (70), bevorzugt ein Turbobead und/oder ein Metallkern, über einen angekoppelten Fänger-Liganden (60) an zumindest einen Bestandteil (z.B. 20 und/oder 40 und/oder 50) von Erregern (10) und/oder Zellen (10) bindbar ist, wobei vorzugsweise eine Sandwichstruktur aus zumindest einem Fänger-Liganden (60) und zumindest einem Markierungs-Liganden (80) erzeugbar ist.
Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere mit einem Testsystem mit den Merkmalen von zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zumindest einen der folgenden Schritte:
a) Aufbringen eines Probenfluids, insbesondere einer Flüssigkeit auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120),
b) Aufbringen und/oder Freisetzen eines Mittels zur Permeabilisierung (1 10) auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120), wodurch ein Zugang von Liganden (z.B. 60 und/oder 80) zu Strukturen von zumindest einem in dem Probefluid enthaltenen Erreger (10) und/oder zumindest einer Zelle (10) erzielt wird,
c) Aufbringen und/oder Freisetzen eines Markierungs-Liganden (80), insbesondere eines Fluoreszenzfarbstoffs an zumindest einem Antikörper und/oder eines DNA- Farbstoffes und/oder Aufbringen und/oder Freisetzen eines Fänger-Liganden (60) auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120), d) Markieren zumindest eines Bestandteiles (40 und/oder 50 und/oder 20) von zumindest einem Erreger (10) und/oder zumindest einer Zelle (10), e) Anreichern von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20) eines Erregers (10) und/oder einer Zelle (10), insbesondere mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherun (120),
f) Nachweis des Erregers (10) und/oder der Zelle (10) durch mikroskopische Vergrößerung und/oder Bildaufnahme.
Testverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Nachweis von Infektionskrankheiten, Erkrankungen verursacht durch Pilze, Viren und/oder Bakterien, und/oder Pathogenen und/oder Erregern, insbesondere Adenoviren, Amylostoma, Ascaris, Babesia, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Bordetella Parapertussis, Borrelia recurrentis, Brucella sp., Campylobacter sp., Cestoda, Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, humanpathogene Cryptosporidium sp., Ebolavirus, Echinococcus multilocularis, Echinococcus granulosus, Escherichia coli, enterohämorrhagische Stämme (EHEC), Eucestoda, Francisella tularensis, FSME-Virus, Gelbfiebervirus, Giardia lamblia, Haemophilus influenzae, Hantaviren, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B- Virus, Hepatitis-C-Virus, Hepatitis-D-Virus, Hepatitis-E-Virus, Influenzaviren, Lassavirus, Legionella sp., humanpathogene Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Marburgvirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis/africanum, Mycobacterium bovis, Neisseria meningitidis, Norwalk- ähnliches Virus, Poliovirus, Pseudomonas aeruginosa, Rabiesvirus, Rickettsia prowazekii, Rotavirus, Rubellavirus, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhi, Schistosoma, Shigella sp., Taenia saginata, Taenia solium, Trichiuris, Tripanosoma, Tripanosoma brucei, Tripanosoma congolense, Tripanosoma vivax, Trichinella spiralis, Varizella-Zoster-Virus, Vibrio cholerae 1 und 139, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Treponema pallidum, HIV, Echinococcus sp., Plasmodium sp., Toxoplasma gondii, Streptococcus pneumoniae und/oder Streptococcus aureus, insbesondere ein Nachweis von Malariaerregern, insbesondere in einer Blutprobe, erzielbar ist.
10. Testverfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zum Nachweis von Malariaerregern in einer Blutprobe einsetzbar ist, wobei insbesondere zumindest eine Struktur in infizierten Erythrozyten (20 und/oder 40 und/oder 50) nach
Einwirken eines Mittel zur Permeabilisierung (1 10), insbesondere Saponin und/oder Ammoniumchlorid, für zumindest einen Fänger-Liganden (60), insbesondere zumindest einen Antikörper gegen plasmodiale Proteine, welcher vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Mikro- oder Nanopartikel (70), insbesondere einen Turbobead koppelbar ist, und/oder für zumindest einen Markierungs-Liganden (80), vorzugsweise zumindest einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen plasmodiale Proteine und/oder zumindest einen DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA, verfügbar ist, um damit insbesondere zumindest eine Struktur (40 und/oder 50 und/oder 20) von Plasmodien (20) und/oder von zumindest mit einem oder mehreren Plasmodien (20) infizierten Erythrozyten (10) nachzuweisen und/oder zumindest einen infizierten Erythrozyten (10) und/oder zumindest eine Struktur (40 und/oder 50 und/oder 20) von Plasmodien mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zu fangen.
1 1 . Testverfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet,
dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zum Nachweis von Malariaerregern, insbesondere Plasmodium falciparum in einer Blutprobe einsetzbar ist, wobei insbesondere nach Einwirken eines Mittel zur Permeabilisierung (1 10), insbesondere Saponin, Erreger mit umhüllender parasitophorer Vakuole in infizierten Erythrozyten 20, 40, 50 zugänglich, vorzugsweise aus dem Erythrozyten freisetzbar ist,
und zumindest eine Struktur, für zumindest einen Fänger-Liganden (60), insbesondere zumindest einen Antikörper gegen plasmodiale Proteine wie RAP1 oder EXP2 wie den monoklonalen Antikörper anti-RAP-1 , Klon 2.29 oder den monoklonalen Antikörper anti-EXP-2, Klon 2.2, welcher vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Mikro- oder Nanopartikel (70), insbesondere einen Dynabead oder Dynabead Myone koppelbar ist,
und/oder für zumindest einen oder mehrere Markierungs-Liganden (80), vorzugsweise zumindest einen oder mehrere markierte Antikörper wie den monoklonalen Antikörper anti-RAP-1 , Klon 2.29 und/oder den monoklonalen Antikörper anti-EXP-2, Klon 2.2 gegen plasmodiale Proteine wie beispielsweise RAP1 oder EXP2
und/oder zumindest ein vorzugsweise fluoreszenten, DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA, verfügbar ist, um damit insbesondere zumindest eine Struktur 40, 50, 20 von Plasmodien (20) und/oder von zumindest mit einem oder mehreren Plasmodien (20) infizierten Erythrozyten (10) nachzuweisen und/oder zumindest einen infizierten Erythrozyten (10) und/oder zumindest eine Struktur 40, 50, 20 von Plasmodien mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) wie einer Mikrotiterplatte mit zumindest 96, insbesondere 1536 Vertiefungen, einer Mikroküvette oder einer einfachen fluidischen Struktur zu immobilisieren.
12. Testverfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet,
dass eine Probe insbesondere einer Körperflüssigkeit wie Urin und/oder Stuhl und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser mit einem Puffer mischbar ist
und/oder feste Bestandteile abtrennbar sind beispielsweise durch Filtration, Sedimentation und/oder Zentrifugation,
und/oder Erreger wie Legionella oder Eier der Erreger wie Ascaris, Trichiuris, Amylostoma, Taenia mit einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung (1 10) permeabilisierbar sind,
und/oder Erreger, Eier der Erreger oder deren Bestandteile über ein Mittel zur
Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) wie eine Filterstruktur oder magnetische Partikel anreicherbar sind,
und/ oder diese mit einem Markierungs-Ligand (80) markierbar
und/ oder mittels bildgebender Mikroskopie detektierbar sind.
13. Testverfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zumindest eine Mikroküvette enthält, in die eine Probenflüssigkeit vorzugsweise eine definierte Menge Vollblut aus der Fingerbeere aufgenehmbar ist,
und/oder die Probenflüssigkeit vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem Fänger-Liganden mit oder ohne Magnetbeads (80) und/oder einem oder mehreren Mitteln zur Markierung (90) und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung (1 10) mischbar ist,
wobei die Mischung beispielsweise durch Anlegen eines umschaltbaren externen Magentfeldes durchführbar ist, so dass enthaltene Magnetpartikel durch die Lösung leitbar sind,
wobei insbesondere eine anschließende Immobilisierung der an das Mittel zur Immobilisierung (80) gebundenen Erreger
und/oder eine mikroskopische Detektion durch ein Sichtfenster erfolgt.
14. Testverfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung (120) zumindest eine mikrofluidische Struktur (140, 200) in Kombination mit einer
Filterstruktur, wie vorzugsweise eine saugende Struktur enthält
und/oder in die mikrofluidische Struktur eine Flüssigkeit, insbesondere eine definierte Menge Vollblut hinzugebbar ist,
und/oder die Probenflüssigkeit vorzugsweise mit lyophilisierten Substanzen wie einem Antikoagulanz und/oder einem oder mehreren Mitteln zur Markierung (90) wie beispielsweise Antikörpern mit einer Fluoreszenzmarkierung oder Goldpartikeln und/oder Stabilisatoren und/oder einem Mittel zur Lyse und/oder Permeabilisierung (1 10) mischbar ist,
wobei insbesondere die Flüssigkeit in Kontakt mit der Filterstruktur bringbar ist beispielsweise durch Öffnen einer Belüftungsöffnung und/oder beispielsweise durch
Verschieben und/oder durch Umknicken eines Chips und/oder durch Überwinden einer Flußbarriere bringbar ist,
wobei insbesondere anschließend die Flüssigkeit aus der Kapillare durch die Filterstruktur aufsaugbar ist,
wobei insbesondere ein Fängerligand (80) an der Filterstruktur immobilisierbar ist, wobei insbesondere die Erreger in Kontakt mit dem Fängerliganden (80) bringbar ist, wobei insbesondere eine Bande entsteht, die aus markierten Erregern und/oder deren Bestandteilen besteht,
wobei insbesondere diese Bande mikroskopisch und/oder fotografisch und/oder per Auge analysierbar ist.
15. Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder Testverfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Diagnose von Erkrankungen.
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