DE102016112024A1 - Schnelltest für den Erreger- und Zellnachweis und Verfahren - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testsystem umfassend zumindest eines der folgenden Mittel: – Mittel zur Permeabilisierung 110 und/oder Lyse von zumindest einem Erreger 10 und/oder zumindest einer Zelle 10 – Mittel zum Fangen 80 und/oder Markierung 90 von Teilen (20 und/oder 40 und/oder 50) der Erreger 10 und/oder Zellen 10 – Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) eines Erregers 10 und/oder einer Zelle 10 – Mittel zur Bildverarbeitung 160 vorzugsweise umfassend eine optische Vergrößerungseinheit 161, wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 durchführbar ist.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 1 sowie ein Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 7 sowie eine Verwendung eines Testsystems und/oder Testverfahrens zur Diagnose von Erkrankungen gemäß des unabhängigen Anspruchs 10.
  • Testsysteme zur Diagnose von Erkrankungen sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise werden eine Vielzahl von analytischen Verfahren und Methoden eingesetzt, um Antikörperreaktionen, sogenannte Immunreaktionen, hervorzurufen, welche für die Bestimmung von (Bio)Markern und vielen weiteren Substanzen/Analyten eingesetzt werden. Weiterhin sind mikroskopiegestützte Verfahren auf dem Gebiet der Diagnostik beschrieben.
  • Patientennahe oder „Point-of-Care“ (PoC) Testverfahren sind diagnostische Untersuchungen, die nicht in einem Zentrallabor, sondern innerhalb kurzer Zeit vor Ort direkt und individuell am Patienten/Probanden durchgeführt werden können. Es gibt für einige wenige Parameter PoC-Testsysteme wie immunchromatographische Teststreifen, die über eine Antikörperbindung ein lösliches Biomolekül z.B. ein Hormon oder ein Protein in Blut, Urin oder Speichel mit Hilfe einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Bekannte PoC-Teststreifen sind beispielsweise Schwangerschaftstests, Blutgerinnungstests, die mit oder ohne Messgerät angeboten werden. Ferner sind zugehörige Schnelltestverfahren bekannt, wie der Lateral-Flow-Test (LFT), Flow-Through-Test (FTT), Agglutinations-Test (AT) oder Solid-Phase-Test (SPT). Alle diese Verfahren dienen zum schnellen Nachweis von Analyten und sind zur visuellen Auswertung im PoC-Bereich geeignet. Im PoC-Bereich ist eine robuste und schnelle Diagnostik erforderlich, die den besonderen Bedürfnissen z.B. der Notfallmedizin nachkommen ohne eine hohe Mobilität und/oder Konnektivität zu medizinisch behandelndem Fachpersonal erfordern.
  • Nachteiligerweise sind jedoch keine PoC-Tests für eine große Zahl der zum Teil lebensbedrohlichen Erkrankungen bekannt, die Gegenstand einer Erreger- oder Zelldiagnostik sind. Hierzu gehören schwere bakterielle Infektionen, die zu einer Sepsis führen können, Viruserkrankungen wie Influenza oder Diarrhö-Erregern, Erkrankungen wie Malaria, Cholera und Tuberkulose oder zur Quantifizierung bestimmter Blutzellen, z.B. von Lymphozyten, eines Krebspatienten. Für die Erreger- und Zelluntersuchungen ist eine apparativ und personell aufwändige Untersuchung im diagnostischen Labor unumgänglich, die entsprechend zeit- und kostenintensiv ist und zudem einen verzögerten Beginn einer individuell abgestimmten Behandlung oder Therapie verursacht. Insbesondere bei einer Malaria-Erkrankung basiert die Standardmethode zur Diagnose im Stand der Technik auf der Mikroskopie. Es wird eine kleine Menge Blut abgenommen, wovon ein Ausstrich oder ein Präparat als so genannter dicker Tropfen angefertigt und mit Giemsa-Farbstoff gefärbt wird. Nach Fixierung und Trocknung des Präparats kann der Parasit unter dem Mikroskop in den roten Blutkörperchen (Erythrozyten) erkannt und vom Fachmann differenziert werden. Diese Methode setzt nicht nur einen geschulten Durchführenden, sondern auch ein Laborumfeld und ein teures Mikroskop voraus. In den meisten Malaria-Gebieten ist ein derart ausgestattetes Labor ohnehin nicht vorhanden. Vorhandene molekularbiologische Tests sind zudem teuer und erfordern ebenfalls tiefergehende Anwenderkenntnisse. Ebenfalls bekannt sind Lateral-Flow-Schnelltests (supra), die zwar parasitenspezifische Antigene, nicht jedoch den Parasiten als solchen oder befallene Zellen nachweisen können und von daher keine Erreger- oder Zelldiagnostik erlauben. Auch im Bereich der Lebensmittel- und Trinkwasser-Analytik wird eine robuste und schnelle Diagnostik für den schnellen Nachweis von Erregern am Ort der Probenname benötigt, um die Infektionsquelle festzustellen, eine entsprechende Therapie von erkrankten Patienten einzuleiten und eine weitere Infektion von Menschen zu verhindern.
  • Für eine große Zahl der Erreger existieren jedoch keine Schnelltests am Analyseort, so dass aufwändige Laboruntersuchungen notwendig sind. Hierzu gehören z.B. Salmonellen, Legionellen, Enterohämorrhagische E.coli (EHEC), Campylobacter coli und Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis oder Influenzaviren. Insbesondere die Variabilität der Oberflächenantigene stellt ein Problem für jeden analytischen Nachweis dar, der auf der Erkennung von Erregern über ihre Oberflächenantigene beruht. Dazu gehören z.B. Immunnachweise der Erreger in Schnelltests wie der Lateral-Flow-Test (LFT), Flow-Through-Test (FTT), Agglutinations-Test (AT) oder Solid-Phase-Test (SPT). Von daher sind solche System von speziellem Interesse, die eine von Oberflächenantigen unabhängige Analyse der Erreger und Zellen aufweisen und als POC- und/oder Schnelltests genutzt werden können. Nachweisverfahren über eine DNA- oder RNA -Analytik z.B. mittels PCR oder eine Kultivierung der Erreger sind apparativ und zeitlich aufwendig und kostspielig. Damit besteht ein hohes Bedürfnis, ein Testsystem mit einer von Oberflächenantigenen unabhängigen Analyse als POC- und/oder Schnelltests zu entwickeln, das eine komplexe Diagnostik erlaubt. Die komplexe Diagnostik soll insbesondere eine Erreger- und Zelldiagnostik aus Körperflüssigkeiten oder Nahrungsmitteln und/oder Trinkwasser ermöglichen.
  • Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Patentanmeldung ein Testsystem sowie ein Testverfahren und eine Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens bereitzustellen, die die vorgenannten Nachteile zumindest teilweise beheben. Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kostengünstig und in kürzester Zeit verschiedenste Erreger und/oder Zellen nachzuweisen, insbesondere unabhängig von einer Laborausstattung.
  • Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen mit den technischen Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie ein Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen mit den Merkmalen des Patentanspruchs 7 sowie eine Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens mit den Merkmalen des Patentanspruchs 10 vorgeschlagen, denen nachfolgend besondere Bedeutung zukommt. Dabei gelten alle technischen Merkmale, die für das erfindungsgemäße Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen offenbart werden auch für das erfindungsgemäße Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen sowie zur Verwendung des Testsystems und/oder Testverfahrens und umgekehrt, sodass diesbezüglich jeweils wechselseitig Bezug genommen wird und/oder werden kann. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Unteransprüchen aufgeführt.
  • Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Testsystem zur Diagnose von Erkrankungen. Dabei umfasst das Testsystem zumindest ein Mittel zur Permeabilisierung und/oder Lyse von zumindest einem Erreger und/oder zumindest einer Zelle und/oder ein Mittel zur Bindung und/oder Markierung von Teilen der Erreger und/oder Zellen und/oder ein Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung von zumindest einem Bestandteil eines Erregers und/oder einer Zelle und/oder ein Mittel zur Bildverarbeitung, wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchführbar ist. Vorzugsweise kann die Auslesung über eine angeordnete optische Vergrößerungseinheit erfolgen. Alternativ und/oder zusätzlich ist es denkbar, dass die Auslesung über eine mobile Rechnereinheit erfolgen kann. Durch die erfindungsgemäße Permeabilisierung und/oder Lyse eines Erregers und/oder einer Zelle können Strukturen für Mittel zur Bindung und/oder Markierung vorzugsweise einer Fluoreszenzmarkierung zugänglich gemacht werden, welche ohne diese Mittel durch kompartimentierende Strukturen wie eine Lipidmembran oder Zellwand nicht zugänglich wären. In Kombination mit einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung können Teile der Erreger und/oder Zellen aus einer flüssigen Probe so angeordnet werden. Dadurch kann mit Hilfe eines Mittels zur Bildverarbeitung die Markierung optisch ausgelesen und eine hinreichende Intensität und Kontrastwirkung für ein oder mehrere Bild und/oder Bilder erhalten werden, welche über die optische Vergrößerungseinheit und Bildverarbeitungsvorrichtung in der mobilen Rechnereinheit ausgelesen werden können, so dass eine effektive Bildverarbeitung erfolgen kann und somit die gesuchten Erreger und Zellen bildgebend detektiert werden können. Bei einer spezifischen Immunfärbung und/oder spezifischen DNA-Färbung erscheinen infizierte Zellen im Kontrast als gefärbte und/oder fluoreszierende Punkte und/oder Flächen vor einem schwächer gefärbten und/oder schwächer fluoreszierenden Hintergrund, während nicht infizierte Zellen unsichtbar sein können und/oder nur schwach sichtbar bleiben können. In Gegenwart einer Beleuchtung, insbesondere einer Anregungsbeleuchtung, kann die Bildauswertung der Farbkontraste von gefärbten und/oder fluoreszierenden Zellen vor einem weniger gefärbten und/oder fluoreszierenden Hintergrund erfolgen. Durch die Bestimmung hellerer Punkte und/oder Flächen können die Zahl der infizierten Zellen pro Volumen Probe durch Zählen und Berechnung ermittelt werden. Im Rahmen dieser Erfindung kann eine optische Vergrößerungseinheit eine Einheit darstellen, die mindestens ein Objektiv enthalten und/oder eine Anordnung von einem oder mehreren Objektiven und/oder Linsen enthalten kann, ähnlich einem Mikroskop, die eine hinreichende Vergrößerung besitzen können. Eine derartige Vergrößerung kann beispielsweise über eine Verbindung mit einem Mikroskop erreicht werden. Wenn ein solches Mikroskop zum Einsatz kommt, können alternativ auch Bilddaten direkt an die Rechnereinheit übermittelt werden.
  • Im Rahmen der Erfindung sind bevorzugt Leistungen der optischen Vergrößerungseinheit in Gegenwart der Bildverarbeitungsvorrichtung mit Vergrößerungen von ungefähr 2,5-fach bis ungefähr 5-fach, vorzugsweise ungefähr 10-fach bis ungefähr 1000-fach denkbar. Die Auflösung kann dabei bei ungefähr 5 µm, vorzugsweise bei ungefähr 0,1 µm bis ungefähr 2 µm, insbesondere von ungefähr kleiner als 0,5 μm liegen. Damit kann eine hinreichende Vergrößerung von Zellen und/oder Erregern erreicht werden. Der Vergrößerungsfaktor kann fest oder variabel sein. Zur Einstellung der Schärfeebene und/oder der Vergrößerung kann eine variable Linse wie einer Flüssiglinse beispielsweise der Firmen Optotune Switzerland AG oder Vario-Optics AG eingesetzt werden. Die optische Vergrößerungseinheit oder Bildverarbeitungsvorrichtung kann vorzugsweise eine oder mehrere beliebige Lichtquellen aufweisen, wie z.B. eine Weisslicht- und/oder Fluoreszenzbeleuchtung. Die Fluoreszenzbeleuchtung kann dabei als Anregungslicht für Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.
  • Ferner kann eine Bildverarbeitungsvorrichtung erfindungsgemäß zur mobilen Rechnereinheit angeordnet sein, insbesondere in Form einer Kamera. Die Bildverarbeitungsvorrichtung kann dazu verwendet werden, Bilddaten von einer optischen Vergrößerungseinheit zu erfassen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine mobile Rechnereinheit eine Einheit darstellen, die beispielsweise durch ein Mobiltelefon mit Rechnerfunktion (Smartphone) und/oder durch einen Laptop- und/oder Tablettrechner (Tablet, Tablet Computer) zur Verfügung gestellt werden. Die mobile Rechnereinheit kann im Wesentlichen eine Zentraleinheit und/oder einen Prozessor aufweisen, die zur Bildverarbeitung erforderlichen Rechen- und Prozessschritte ausführen kann.
  • Die Bildverarbeitung kann ferner einen Analysemodus umfassen, wobei summarische Graustufen, Farbwerte und/oder Farbkontraste, vorzugsweise Fluoreszenzsignale, in einem Bildausschnitt erfasst werden können. Die Erfassung kann dabei qualitativ und/oder quantitativ sein. Im Rahmen einer einfachen quantitativen Auswertung kann beispielsweise ausgesagt werden, ob ein festgelegter kritischer Wert einer Intensität in Bereichen überschritten wird. Dieser kritische Wert wird für das Testsystem empirisch festgelegt und dient beispielsweise der Unterscheidung vom Hintergrundsignal des in der Lösung noch vorhandenen Markierungs-Liganden von spezifisch gebundenem Markierungs-Liganden in einer Immunfluoreszenz. Die Qualität der Bildverarbeitung kann erhöht werden, indem nacheinander einzelne Bildausschnitte eines größeren Feldes untersucht werden. Dies kann durch eine reine Auswahl in der Bildverarbeitung geschehen. Alternativ oder zusätzlich kann die Qualität der Bildverarbeitung ebenfalls durch eine optische Vergrößerung jeweils eines Bildausschnittes geschehen, wobei beispielsweise ein abgegrenztes Objekt mit einer Intensität über einem kritischen Wert als ein Erreger definiert werden kann.
  • Ferner ist es denkbar im Rahmen der Bildauswertung eine Qualitätsanalyse durchzuführen. Dabei kann die Standardabweichung der Ergebnisse in mehreren Bildausschnitten errechnet werden. Alternativ oder zusätzlich kann ebenfalls ermittelt werden, wie nahe ein berechneter Wert an einem kritischen Wert liegt. Eine große Nähe des berechneten Wertes an dem kritischen Wert oder bei großer Standardabweichung kann auf die schlechte Qualität der Messung geschlossen werden. Darüber hinaus kann auch zu einem neuen Test aufgefordert werden. Zur Nutzung der vorliegenden Erfindung kann somit ebenfalls ein Programm auf einer Rechnereinheit, beispielsweise als App auf einem Smartphone durchgeführt werden, welches zumindest eine der folgenden Grundfunktionen aufweist: Einlesen von Bilddaten, Bildverarbeitung, quantitative und/oder qualitative Ausgabe eines Bildverarbeitungs- und/oder Analyseergebnisses. Zusätzlich kann das Programm eine Qualitätsanalyse bezogen auf die Qualität der Analyse einer Probe umfassen. Ferner kommt die Verknüpfung mit weiterführenden Informationen in Betracht, insbesondere internen oder externen Datenbanken zu Krankheitsbildern, Adressen von medizinischen Diensten, Senden der Erreger-Bilder an medizinisches Fachpersonal und dergleichen.
  • Es ist ebenfalls denkbar, dass das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung Elemente zur Aufnahme eines Probefluids aufweist. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das Probefluid von einer Körperflüssigkeit und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser stammt. Bei einer Körperflüssigkeit kann es sich vorzugsweise um Blut, Vollblut, Urin, Speichel, Synovialflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis, Plasma und/oder Serum und/oder Tränenflüssigkeit, Schweiß, Lymphflüssigkeit und/oder Interzellularflüssigkeit handeln. Dabei kann beispielsweise eine Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten mit beliebigen Chemikalien, Reagenzien, insbesondere Färbemittel und Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, ggfs. samt üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen wie Gerinnungshemmern, Proteaseinhibitoren, Stabilisatoren und/oder Enzymhemmstoffen behandelt werden. Patienten sind dabei jeder Proband, unabhängig von einer Symptomatikund/oder Krankheit und zwar Mensch und Tier, insbesondere Säugetier. Derartige Körperflüssigkeiten enthalten Analyten, insbesondere Zellen, die infizierte Zellen und/oder Erreger als solche enthalten können. Erreger sind dabei insbesondere Bakterien, Pilze, Viren und/oder Parasiten. Dabei kann ein Probefluid einer Nahrungsmittelprobe eine beliebige Verdünnung, Lösung, ein Extraktund/oder Abstrich eines Nahrungsmittels umfassen. Ein Probefluid von Trinkwasser kann ferner eine unveränderte und/oder konzentrierte und/oder verdünnte Probe und/oder eine flüssige Aufnahme eines Filtrationsrückstandes umfassen.
  • Weiterhin kann es von Vorteil sein, wenn das Testsystem Mittel zur Permeabilisierung aufweist, wobei vorteilhafterweise ein Zugang für Liganden zu zumindest einem Biomolekül und/oder zu zumindest einer Struktur eines Erregers und/oder zu zumindest einer Zelle erzielbar sein kann. Insbesondere ist es denkbar, dass die Struktur und/oder die Zelle zumindest eine Öffnung mit einer Größe zwischen ungefähr 1 nm und ungefähr 12 µm aufweisen kann. Auch eine vollständige Lyse der Zelle kann erzeugbar sein. Eine Permeabilisierung und/oder Lyse von Erregern und/oder Zellen kann dabei ein Vorgang zur Erzeugung einer temporären und/oder dauerhaften Durchlässigkeit von äußeren und/oder inneren Zellmembranen, Zellwänden, Mureinhüllen, Virushülle und/oder Lipidmembranen und/oder sonstigen kompartimentierenden Strukturen darstellen, um eine Zugänglichkeit von Antikörpern, markierten Antikörpern, Liganden und/oder mit Liganden beladenen magnetischen Partikeln zu inneren Strukturen, Antigenen und/oder Biomolekülen der Erreger und/oder Zellen zu ermöglichen. Ein Mittel zur Permeabilisierung und/oder Lyse von Erregern und/oder Zellen kann eine Einheit und/oder Substanz umfassen, die eine Zugänglichkeit zu Biomolekülen und/oder Strukturen der Erreger und/oder Zellen bereitstellt, die in der Regel z.B. bei lebenden Erregern und/oder Zellen durch eine Lipidmembran, Zellwand, Virushülle und/oder sonstigen Zellumhüllenden Schicht abgetrennt sind und so z.B. für eine Immunanalytik nicht zugänglich sind. Ein derartiges Mittel kann beispielsweise durch Porenproteine Poren in einer Membran bereitstellen und/oder durch Cholesterinentzug die Membran destabilisieren und Öffnungen in der Membran erzeugen und/oder durch osmotische Effekte wie ein Anschwellen und Platzen der Zellen zu Öffnungen in der Zellmembran führen und/oder durch elektrische und/oder mechanische Impulse Öffnungen erzeugen. Ein Mittel kann ferner auch alle sonstigen Mittel umfassen, welche eine oder mehrere Öffnungen in Zellmembran, Zellwand, Virushülle, Lipidmembranen bereitstellen und/oder ein Durchdringen dieser z.B. durch ähnlich einer Transfektion angewandten Mitteln wie fusionierten und/oder importierten Vesikeln, magnetischen Partikeln und/oder eindringende Nanopartikel ermöglichen können. Diese Mittel können Substanzen für die Permeabilisierung und/oder Lyse sein, wie Saponine z.B. zur Lyse von Erythrozyten, Bakterien, Pilzzellen und/oder anderen eukaryonten Zellen, Digitonin für die temporäre Permeabilisierung z.B. von eukaryontischen Zellen, Porine z.B. zur Permeabilisierung von Lipidmembranen, Streptolysin O und Equinatoxin II, Ammoniumchlorid z.B. zur Lyse von Erythrozyten, Detergenzien wie Deoxycholate, Triton X100, NP-40 und/oder sonstigen Substanzen wie Aceton und/oder Ethanol zur Destabilisierung der Zellmembran, Ethylendiamintetraessigsäure zur Permeabilisierung der Außenmembran von gramnegativen Bakterien, Lysozym und/oder Autolysine z.B. zur Lyse der Peptidoglykanzellwand grampositiver Bakterien, Lactoferrin, Defensine und Cathelicidine gram-negativer Bakterien und andere Substanzen sein, aber auch ein elektrisches Feld, welches ähnlich einer Elektroporation die Zellmembran temporär und/oder dauerhaft durchlässig machen kann und/oder eine mechanische und/oder sonstige Einwirkung, die zu einer Permeabilisierung und/oder Lyse führt und eine erweiterte Zugänglichkeit von Biomolekülen der Erreger und/oder Zellen für Liganden bereitstellen. Diese Mittel können mit fixierenden Substanzen wie Paraformaldehyd, Glutaraldehyd, Aceton, Methanol, Ethanol kombiniert werden. Die Größen der erzeugten Öffnungen können im Bereich von ungefähr 1 nm bis ungefähr 12 µm betragen und zu einer temporären Permeabilisierung für wenige Millisekunden bis zur dauerhaften Lyse der Zellen führen. Ebenfalls können Mittel denkbar sein, die einer Aufnahme von Liganden und/oder Magnetpartikeln ohne eine Ausbildung von Öffnungen dienen können, wie z.B. Mittel, die auch bei einer Tranfektion eingesetzt werden können, wie Vesikel, magnetische Partikel, eindringende Nanopartikel, Import-auslösende Substanzen. Ferner kann es sich um Mittel handeln, die zu einer Freisetzung von biologischen Strukturen und/oder Molekülen und/oder sonstigen Teilen der Erreger und/oder Zellen führen, welche ohne diese Mittel im Inneren der Zellen und/oder Erreger verbleiben würden und somit vor einer Erkennung durch das Immunsystem abgeschirmt wären. Dies kann eine Lyse und/oder sonstige Zerstörung der Erreger und/oder Zellen und/oder die induzierte Abgabe und/oder Freisetzung von biologischen Strukturen und/oder Molekülen durch Export und/oder durch Poren und/oder Öffnungen umfassen.
  • Im Rahmen der Erfindung kann es ebenfalls vorteilhaft sein, wenn für das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung von zumindest einem Bestandteil von Erregern und/oder Zellen einsetzbar sind. Dabei kann zumindest ein Bestandteil von Erregern und/oder Zellen anreicherbar sein. In einer Ausführungsform kann das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung ein Reaktionsgefäß wie ein Eppendorf-Reaktionsgefäß und/oder eine Filtrationssäule sein. In dieser können eine Probe und/oder Mittel zur Permeabilisierung und/oder Mittel zur Bindung und/oder Mittel zur Markierung in miteinander mischbar sein und können beispielsweise über einen Magneten immobilisiert und über ein Mittel zur Bildverarbeitung wie ein Fluoreszenzspektrometer und/oder ein bildgebendes Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Zusätzlich oder alternativ ist es ebenfalls denkbar, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung eine mikrofluidische Struktur zur Auflösung und/oder Mischung von Substanzen aufweisen kann. Ein solches Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann vorzugsweise ein Teststreifen mit einer mikrofluidischen Struktur sein. Ein solcher Teststreifen besteht vorzugsweise aus einem oder mehreren transparenten Material und/oder Materialien, wie einem planaren Kunststoff und/oder Glas, der in der Lage sein kann eine Körperflüssigkeit und/oder eine andere flüssige Probe aufzunehmen. Eine Probe kann in einer bevorzugten Ausführungsform den Teststreifen durchlaufen, insbesondere mittels mindestens eines eingearbeiteten und/oder aufgebrachten Kanals und/oder Mikrokanals, insbesondere mit einem rechteckigen, trapezförmigen und/oder bogenförmigen Querschnitt. Der Kanal kann eine Kapillare sein und/oder einen lamianren und/oder nichtlaminaren Fluss durch Schwerkrafteinwirkung und/oder Kapillarkraft und/oder Pumpkräfte und/oder sonstige Kräfte erlauben.
  • Der Teststreifen kann vorzugsweise die Durchführung des Nachweisverfahrens von Erregern und/oder Zellen bestehend aus einer Probenaufnahme, einer Zugabe und Mischung mit einem oder mehreren Mitteln zur Permeabilisierung, einer Zugabe und Mischung mit einem oder mehreren Mitteln zur Bindung und/oder der Markierung von Strukturen der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile, eine Inkubation der Probe, eine anschließende Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung der Erreger und/oder Zellen und/oder deren Bestandteilen in einem Detektionsbereich umfassen. Für kleine Volumina von wenigen Mikrolitern kann der Teststreifen vorzugsweise außerdem eine Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des Flusses bereitstellen, für größere Volumina bis zu mehreren Litern Anschlüsse an externe Pumpsysteme. Die Probenaufnahme kann im einfachsten Fall ein Reservoir aufweisen, in das ein definiertes Volumen, insbesondere von wenigen Mikrolitern einer Probe z.B. mit einer Mikropipette gegeben werden kann. Bei Volumina von mehreren Litern können diese über einen Anschluss von einem externen System aufgegeben werden. Die Probenaufnahme kann mit (eingetrockneten) Chemikalien z.B. EDTA, Heparin zur Gerinnungshemmung und/oder Farbstoffen zur histologischen Zellfärbung versehen werden, die durch die aufgegebene Probe gelöst werden können. Im Fall von kapillarem Vollblut aus der Fingerbeere kann die Aufnahme vorzugsweise mittels einer Kapillare mit definiertem Volumen und einer Füllungsanzeige erfolgen. In diese kann das Vollblut vorzugsweise bis zur vollständigen Füllung eingesogen werden und somit ein definiertes Volumen bereitstellen. Befindet sich die Kapillare z.B. in einem zum Teststreifen passenden Deckel, so kann das definierte Blutvolumen anschließend durch Aufstecken des Deckels auf den Teststreifen in diesen appliziert werden. In dieser Ausführungsform kann der Deckel vorzugsweise Strukturen, die beim Aufstecken auf den Teststreifen irreversibel einrasten umfassen. Eine weitere Ausführungsform kann eine mikrofluidische Struktur mit definiertem Volumen zugehörig dem Teststreifen umfassen, in die das Vollblut eingesogen wird und die beispielsweise über ein Verschieben der Kapillare und/oder über Mikroventile und/oder sonstige Vorrichtungen nach der Volumendefinition mit dem weiteren mikrofluidischen System Kontakt bekommen kann, so dass das Vollblut in dieses appliziert werden kann. Die Applikation des Mittels zur Permeabilisierung und/oder Lyse und des Mittels zur Bindung und/oder zur Markierung von spezifischen Strukturen kann über eine Lösung von lyophilisierten Substanzen durch die vorbeifließende Probe erfolgen. Hierbei ist zwischen dem vorderen Volumen der Probe hinter der Lauffront und dem nachfolgenden Volumen der Probe zu unterscheiden. Bei diesem Vorgehen kann das vordere Volumen im Teststreifen mehr gelöste Substanz umfassen als das hintere Volumen. Aus diesem Grund kann der Teststreifen vorzugsweise zumindest eine Mischerstruktur aufweisen, welche die gelösten Substanzen mit der Probe mischen kann. Im Falle einer mikrofluidischen Struktur kann dies eine Mischkammer mit und/oder ohne externe mechanische Einwirkung, eine Zickzackstruktur und/oder eine andere Vorrichtung zur Mischung sein. Eine weitere Ausführungsform kann eine Aufspaltung des mikrofluidischen Probenflusses in mindestens zwei Kanäle umfassen, wobei in einem ersten Kanal die lyophilisierten Substanzen einem Probenteil zugemischt werden können und im zweiten Kanal ein Probenteil an diesem vorbeigeleitet werden kann. Anschließend können die Kanäle zumindest teilweise wieder zusammengeführt und in einer Mischerstruktur die beiden Probenteile miteinander gemischt werden. Die Fließraten können vorzugsweise durch die Kanaldimensionen bestimmt werden. Mit einer derartigen Ausführungsform kann erreicht werden, dass auch das hintere Probenvolumen aus dem zweiten Kanal noch mit Substanzen enthaltendem Probenvolumen aus dem ersten Kanal gemischt werden kann. Hierbei kann gleichzeitig eine Imunfluoreszenzfärbung mit einem Markierungs-Liganden erfolgen. Es kann die Färbung der infizierten Zellen und/oder Erreger durch Zugabe eines Markierungs-Liganden in den inzwischen entleerten Proben-Port erfolgen, durch Lösung lyophilisierter Substanzen und/oder aus einem Blister-Depot, dass durch mechanische Einwirkung geöffnet werden kann und dessen Inhalt teilweise oder vollständig in den Teststreifen entlassen werden kann. Der Teststreifen kann vorzugsweise für kleine Volumina von wenigen Mikrolitern eine Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des Flusses bereitstellen, für größere Volumina bis zu mehreren Litern Anschlüsse an externe Pumpsysteme. In einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung zur Aufrechterhaltung des mikrofluidischen Flusses vorzugsweise eine dem Detektionsbereich nachfolgender Kapillarpumpe umfassen, die durch kapillare Kräfte
  • Flüssigkeit in ein mit Mikrostrukturen unterteiltes Abfallkompartiment zieht. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Material, welches eine Saugkraft ausübt wie beispielsweise ein Filtervlies und/oder Saugvlies, so in den Teststreifen integriert werden, dass es zumindest temporär Kontakt mit dem mikrofluidischen Kanal erhalten kann und vorzugsweise Flüssigkeit durch den Teststreifen ziehen kann. In einer weiteren Ausführungsform kann vorzugsweise eine Mikropumpe in den Teststreifen integriert werden, welche den Fluss steuern kann. Dies kann ein Stempel sein, der Flüssigkeit aus einem Blister in den mikrofluidischen Kanal drückt, eine Saugvorrichtung, welche über Unterdruck Flüssigkeit aus dem Kanal saugt und/oder eine andere Vorrichtung wie beispielsweise die Mikropumpe mp6 der Firma Bartels Mikrotechnik GmbH. Des Weiteren kann auf einem Teststreifen ein Barcode aufgedruckt und/oder ein RFID-Element eingebaut werden, der übliche Informationen zum Teststreifen enthalten kann, z.B. die Art des Testes (z.B. Diagnostik für Malaria-Erreger, Legionella und/oder Sepsis) und/oder das Verfallsdatum des Teststreifens u.a.
  • Weiterhin kann das Testsystem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung umfassen, die zum einen mikrofluidische Struktur zur Inkubation eines Probefluids mit Fänger- und/oder Markierungs-Ligand aufweisen kann und zumindest einen Detektionsbereich. Dabei kann auf dem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung zumindest ein Bestandteil zumindest eines markierten Erregers und/oder zumindest einer markierten Zelle aufnehmbar sein. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann durch Zugabe eines Markierungs-Liganden und/oder vorzugsweise die Lösung von lyophilisiertem Markierungs-Liganden die spezifische Markierung von Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen vorzugsweise mit einem Farbstoff und/oder Fluoreszenzfarbstoff, fluoreszentem und/oder nicht-fluoreszentem Nanopartikel etc. und/oder kombiniert mit einem Liganden wie einem Antikörper erlauben. Besonders vorteilhaft ist, wenn erfindungsgemäß kein zusätzlicher Waschschritt erforderlich sein kann. Die Färbung kann je nach Analyt und/oder Testausführung vorzugsweise eine einfache histologische Färbung des Zellplasmas, einer Lipidmembran, Zellwand und/oder der DNA und/oder eine immunchemische Färbung wie einer Fluoreszenzfärbung sein. Das Hintergrundsignal der spezifischen Markierung durch die z.B. im Kanal verbleibende Färbelösung kann bei der Messung nicht relevant sein, da die Färbelösung vorzugsweise niedrig konzentriert sein kann. Sobald sich die Färbeflüssigkeit im Kanal verteilt, und/oder ihn durchflossen hat, können sich ein oder mehrere ungebundene Markierungs-Liganden im Kanal verteilt befinden, die an durch eine Permeabilisierung zugängliche Marker der Erreger und/oder Zellen binden können. Die Konzentration der Markierungs-Liganden in der Färbeflüssigkeit ist vorzugsweise in der Weise gewählt, dass Markierungs-Liganden an den infizierten Zellen, Erregern und/oder deren Bestandteile gegenüber den freien, in der Flüssigkeit vorhandenen Markierungs-Liganden angereichert werden können. Dadurch können Erreger, Zellen, infizierte Zellen und/oder deren Bestandteile vorzugsweise im Kontrast als heller gefärbte/ fluoreszierende Punkte und/oder Flächen vor einem gefärbten/fluoreszierenden Hintergrund erscheinen, während sonstige Flüssigkeitsbestandteile wie nicht infizierte Zellen unsichtbar und/oder nur schwach sichtbar bleiben können. Eine Inkubation der Probe kann beispielsweise durch eine Ausführungsform des Teststreifens erreicht werden, welche eine Inkubationsstruktur enthalten kann. Dies kann z.B. eine Zickzackstruktur sein, die in Zeiträumen von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten durchflossen werden kann und sowohl die Probe mischen als auch eine Inkubation erlauben kann. In einer weiteren Ausführungsform können Substanzen zur Permeabilisierung und/oder Lyse der Erreger und/oder Zellen lyophilisiert vorgelegt und wie beschrieben durch einen Teil des Probenvolumens gelöst, in die Probe eingemischt und inkubiert werden. Werden die Erreger und/oder Zellen anschließend in der mikrofluidischen Struktur unspezifisch oder spezifisch zurückgehalten, immobilisiert und/oder gefangen, so kann auch eine sequentielle Zugabe des Markierungs-Liganden zur Markierung der gesuchten Strukturen erfolgen. In einer Ausführungsform kann eine Flüssigkeit zum Waschen und/oder ein Fänger-Ligand und/oder ein Markierungs-Ligand extern zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Teststreifen einen mit Flüssigkeit gefüllten Blister umfassen, welcher vom Anwender und/oder einer Vorrichtung wie z.B. einem mechanischen Stempel im Mittel zur Aufnahme des Testreifens wie einem optischen Lesegerät geöffnet werden kann. Die Flüssigkeit kann dabei in den mikrofluidischen Kanal gelangen und kann entweder bereits die Liganden enthalten und/oder diese aus einer vorgelegten, lyophilisierten Form im Kanal aufgelöst sein und anschließend die Erreger und Zellen umspülen. Ein derartiger Teststreifen kann vorzugsweise einen Detektionsbereich des mikrofluidischen Kanalsystems aufweisen, in dem vorzugsweise fluoreszenzmarkierte Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile immobilisiert werden und vorzugsweise dadurch angereichert werden können, dass diese festgehalten werden, während die restliche Flüssigkeit weiter zu einem Auffang-Reservoir fließen kann. Der Detektionsbereich kann dabei beliebig groß und beliebig ausgewiesen ausgestaltet sein. Bevorzugt kann jedoch ein Ausmaß sein, das in einem oder mehreren Bildfeldern der Vergrößerungsoptik aufgenommen werden kann. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens können in und/oder neben dem Detektionsbereich vorzugsweise orthogonal zur Fließrichtung Balken und/oder Markierungen aufgedruckt sein. Sie können der visuellen Abgrenzung und/oder Unterteilung des Detektionsbereiches für die Bildverarbeitung und/oder zur Bestimmung der ausgeführten Durchzugsgeschwindigkeit des Teststreifens durch eine Auswertungssoftware dienen.
  • Ferner kann das Testsystem ebenfalls Mittel zur Bindung zumindest einen Fänger-Liganden und/oder zumindest einen Markierungs-Liganden zur Markierung, insbesondere Färbung aufweisen. Insbesondere können dafür zumindest einen Antikörper, ein Aptamer und/oder einen Liganden umfasst sein und/oder einen Mikro-Partikel, Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel umfasst sein, das mit einem Antikörper, Aptamer, Liganden koppelbar ist. Bevorzugt kann ferner ein zumindest magnetischer Nanopartikel, bevorzugt ein Turbobead und/oder ein Metallkern, über einen angekoppelten Liganden an zumindest einen Bestandteil von Erregern und/oder Zellen bindbar sein. Dabei kann vorzugsweise eine Sandwichstruktur aus zumindest einem Fänger-Liganden und zumindest einem Markierungs-Liganden erzeugbar sein. Mittel zur Bindung und/oder Markierung können einen oder mehrere Fänger-Liganden und/oder Markierungs-Liganden umfassen, welche vorzugsweise an Antigene und/oder Biomoleküle von ganzen oder von Teilen von Zellen und/oder Erregern binden können. Liganden können vorzugsweise Antikörper, Aptamere, Peptide, Protein-Liganden, Mikro-Partikel, Nano-Partikel, magnetische Beads, reaktive Substanzen, aber auch sonstige Liganden und/oder eine Kombination der genannten sein, welche an sogenannte Marker wie Antigene, Biomoleküle und/oder sonstige Strukturen der Erreger und/oder Zellen und/oder deren Bestandteile spezifisch binden können. Diese Liganden können erst durch ein Mittel zur Permeabilisierung mit Markern wie Biomolekülen, Strukturen und/oder Antigenen der Erreger und/oder Zellen, von denen sie ohne das Mittel zur Permeabilisierung durch eine Zellumhüllung, Zellmembran, Zellwand, Virushülle, Lipidmembran und/oder einer sonstigen kompartimentierenden Struktur getrennt wären, in Kontakt kommen. Fänger-Liganden können dabei der Immobilisierung der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile dienen, um vorzugsweise eine Anreicherung über einem Detektionsbereich zu erreichen. Im Falle von magnetischen Partikeln wie vorzugsweise magnetischen Nanopartikeln (MNP), insbesondere Turbobeads, aber auch sonstigen nicht-fluoreszenten und/oder fluoreszenten MNP, mit oder ohne angebundene Antikörper, Aptamere und/oder Liganden, kann dies die Immobilisierung gebundener Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile, vorzugsweise am Boden und/oder der Decke eines Mikrokanales, über einem Detektionsbereich mittels eines Magneten bedeuten. Bei einer immunchemischen Färbung können Markierungs-Liganden eingesetzt werden, die vorzugsweise an eine zweite, unabhängige Bindungsstelle von Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen binden können. Diese Liganden können vorzugsweise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, fluoreszenten Nanopartikel wie Quantum Dots und/oder auch Farbstoff, Magnetpartikel und/oder Goldpartikel gekoppelt sein, so dass durch ihre Bindung an die Zelloberfläche ein ausreichendes Signal, bevorzugt Fluoreszenzsignal, entstehen und vorzugsweise mittels einer optischen Vergrößerung vor dem Hintergrund sichtbar gemacht werden kann, so dass einzelne bildfähige Farbwerte, Graustufen und/oder Kontraste entstehen können. Daher kann die Erfindung ebenfalls ein Testsystem betreffen, wobei die auf dem Teststreifen gebundenen Analyten, Zellen, Erreger mittels eines Markierungs-Liganden, der an einen Farbstoff vorzugsweise einen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff, Nanopartikel, Magnetpartikel und/oder Goldpartikel gekoppelt ist, markiert werden und vorzugsweise einer Bildauswertung zugänglich gemacht werden können. Vorzugsweise kann eine doppelte Erkennung im Sandwichsystem einerseits beispielsweise durch einen Fänger-Liganden aus spezifischem Antikörper an magnetischem Partikel und andererseits durch einen Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörper stattfinden. Dies kann eine eindeutige Typisierung der infizierten Zellen und/oder Erreger erlauben und Falsch-Positive durch eine unspezifische Bindung anderer Zellen und/oder durch eine unspezifische Färbung anderer Zellen ausschließen. Beispielsweise können infizierte Zellen (z.B. bei Malaria) und/oder Erreger (z.B. Legionellen, Salmonellen, Streptokokken, etc.) entsprechende Marker aufweisen, die nach einer Permeabilisierung den Liganden (Fänger-Liganden und Markierungs-Liganden) zugänglich sind und von diesen erkannt werden können. Das Verfahren kann die Anreicherung und eindeutige visuelle Erkennung von Zelltypen wie z.B. Malaria-infizierten Erythrozyten, CD4+ Zellen und/oder ebenfalls infizierten Zellen in der HIV-Diagnostik, ebenfalls die Erkennung und Typisierung von Bakterien in der Diagnose von z.B. Sepsis, Legionella, Cholera, Tuberkulose etc. ermöglichen. Als Markierungs-Ligand können außerdem angekoppelte Enzyme für eine enzymatische Nachweisreaktion eingesetzt werden, so dass eine Farbreaktion und/oder elektrochemische Reaktion entstehen kann, die detektierbar ist. In einer Ausführungsform des Teststreifens kann sich eine Filtrationsvorrichtung beispielsweise bestehend aus einem Filtermaterial wie z.B. einer „Vivid“ Plasma Separation Membrane von Pall Corp., eine mikro- und/oder nanoporöse Membran mit subzellulären Porendurchmessern und/oder andere Strukturen mit einer Siebfunktion befinden. Diese kann den Durchtritt der Flüssigkeit erlauben, aber unspezifisch Erreger und/oder Zellen oder auch deren Bestandteile Größen-abhängig zurückhalten. Diese kann an einem Kanalende und/oder seitlich in eine Kanalwand integriert sein. Die aufgestauten Erreger, Zellen, infizierten Zellen und/oder deren Bestandteile können durch einen oder mehreren Markierungs-Liganden spezifisch markiert werden. Bei einem Einsatz von Markierungs-Liganden wie z.B. von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, Aptameren und/oder sonstigen Liganden kann eine spezifische Färbung der gesuchten Strukturen der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile erfolgen. In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Teststreifen einen Filter enthalten zum unspezifischen Aufstauen aller Zellen und/oder Erreger, während die Markierung der gesuchten Erreger vorzugsweise durch die spezifische Bindung von fluoreszenten Markierungs-Liganden in einer Immunfluoreszenzfärbung erfolgen kann. Besitzen nur die gesuchten Erreger eine DNA wie das z.B. bei Plasmodien im Gegensatz zu DNA-freien Erythrozyten der Fall ist, so kann auch eine Fluoreszenzfärbung der DNA erfolgen, welche spezifisch die Plasmodien markieren kann. Als Kontrolle kann parallel eine Membranfärbung zur Erkennung aller Zellumrisse mittels Weißlicht und/oder über eine spektral getrennte Fluoreszenzdetektion erfolgen. In einer Ausführungsform können vorzugsweise magnetische Partikel an die Liganden gekoppelt werden, welche spezifisch an die zellulären Strukturen binden können, so ist deren magnetisches Fangen und die Anreicherung durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes ermöglicht. Wird ein Magnet im Detektionsbereich in den Teststreifen und/oder in das Mittel zur Aufnahme des Teststreifens wie einem Lesegerät integriert, so kann die magnetische Kraft vorzugsweise zur Immobilisierung der magnetischen Partikel im Teststreifen führen, wie z.B. auf dem Boden und/oder an der Decke eines mikrofluidischen Kanales. Kommerzielle magnetische Partikel, die üblicherweise zum Fangen von Zellen über Oberflächenantigene mittels Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden eingesetzt werden können, können insbesondere einen Durchmesser von ungefähr 1 nm bis ungefähr 12 µm aufweisen. Diese Mikropartikel können zu groß sein, um durch die erzeugten Öffnungen in permeabilisierte Erreger und/oder Zellen eindringen zu können und/oder durch andere Techniken aufgenommen werden zu können. Dies kann erst erfolgen, wenn die Erreger und/oder Zellen lysiert und fragmentiert werden, so dass Strukturen aus dem Inneren für die Mikropartikel zugänglich sein können. Vorzugsweise können die Erreger und/oder Zellen permeabilisiert, aber in Ihrer Form durch das Zytoskelett erhalten und somit physiologisch erkennbar bleiben. Magnetische Nanopartikel (MNP) können einen Durchmesser von ungefähr 5 nm bis ungefähr 500 nm aufweisen und somit durch Öffnungen in permeabilisierten Erregern und/oder Zellen eindringen. In einer anderen Ausführungsform können nicht-fluoreszente MNPs mit gekoppelten Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden eingesetzt werden, um nach Permeabilisierung der gesuchten Erreger und/oder Zellen an Antigene und/oder Strukturen spezifisch binden zu können. Mittels Magnetkraft können die MNPs mit den gebundenen Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen im Detektionsbereich immobilisiert werden, beispielsweise an der Kanaldecke und/oder dem Kanalboden. Vorzugsweise durch einen Markierungs-Liganden kann an den gesuchten Erregern, Zellen und/oder deren Bestandteilen ein spezifisches, detektierbares Signal erzeugt werden. Im Falle des Einsatzes von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, Aptameren, Nanopartikeln und/oder Liganden kann eine Immunfluoreszenz im Sandwichaufbau entstehen. Alternativ kann die DNA von Plasmodien mittels eines fluoreszenten und/oder nicht-fluoreszenten DNA-Farbstoffes angefärbt werden. Die MagVigen-Partikel der Firma Nvigen Inc. haben Durchmesser von beispielsweise 200 nm bis 500 nm und sind an ihrer Oberfläche mit Kopplungsgruppen und/oder Proteinen erhältlich. So kann zur Bindung spezifischer Antikörper, Aptamere und/oder Liganden sowohl eine chemische Kopplung möglich werden als auch über an den MNP vorhandenen Proteinen wie Avidin und/oder einem Zweit-Antikörper. Ocean Nanotech Inc. verschiedene paramagnetische Beads ab 50 nm Durchmesser und ebenfalls mit verschiedenen Oberflächengruppen z.B. zur Antikörperkopplung anbietet. Turbobeads Llc. bietet ebenfalls magnetische Nanopartikel, genannt Turbobeads, mit verschiedenen Oberflächengruppen wie Streptavidin, Biotin und/oder chemischen Kopplungsgruppen wie Azid- und/oder Aminogruppen zur Anbindung von Biomolekülen, Antikörpern, Aptameren und/oder Liganden an. Turbobeads können einen Durchmesser von ungefähr 30 nm besitzen, aber vorzugsweise ungefähr dreifach stärkere magnetische Eigenschaften durch Verwendung eines metallischen Kernes an Stelle des bei MNP üblichen Ferritkernes. Die magnetische Separation kann damit bedeutend schneller und effizienter erfolgen als mit üblichen MNPs. Magnetische Nanopartikel, die gleichzeitig fluoreszent sind, können über gekoppelte Antikörper, Aptamere und/oder Liganden die Zielstrukturen binden und sowohl zum magnetischen Fangen als auch zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden. Die magnetischen und fluoreszenten MyQuVigen-Partikel von Nvigen Inc. und auch die NanoScreenMag-MNP der Firma Chemicell GmbH werden ebenfalls mit verschiedenen Oberflächengruppen z.B. zur Antikörperkopplung angeboten. Diese Kombination kann den Vorteil eines einfachen Verfahrens der gleichzeitigen Immobilisierung der markierten Erreger über einem Magneten und der Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Da jedoch alle magnetischen, fluoreszenten Nanopartikel gefangen werden können, kann ein Fluoreszenzhintergrund durch einzelne, ungebundene Partikel, der zuverlässig von an Erreger gebundenen MNP unterschieden werden muss entstehen. Vorzugsweise kann die Immobilisierung der Erreger, Zellen und/oder deren Bestandteile von der Markierung getrennt werden, also getrennte Fänger-Liganden und Markierungs-Liganden verwendet werden.
  • Ferner wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren bringt dabei die gleichen Vorteile mit sich, wie sie ausführlich in Bezug auf das erfindungsgemäße System beschrieben worden sind.
  • Erfindungsgemäß umfasst das Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen zumindest einen der folgenden Schritte: Aufbringen eines Probenfluids, insbesondere einer Flüssigkeit auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung. Dies kann im Falle einer mikrofluidischen Struktur die Anwendung am Point-of-Care beispielsweis durch einfaches Aufsaugen eines Tropfens von Kapillarblut aus der Fingerbeere auch durch eine ungeschulte Person und die automatisierte Prozessierung der Probe in einem abgeschlossenen Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung erlauben ohne dass ein weiterer Eingriff durch den Benutzer und/oder eine Laborausstattung z.B. zur genauen Substanzzugabe, Erregerkultur, Zentrifugation usw. notwendig ist.
  • Als weiteren Schritt kann ein Aufbringen und/oder Freisetzen eines Mittels zur Permeabilisierung auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchgeführt werden, wodurch ein Zugang von Liganden zu Strukturen von zumindest einem in dem Probefluid enthaltenen Erreger und/oder zumindest einer Zelle erzielt wird. Dies kann vorzugsweise durch Lösen einer im Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung lyophilisierten Substanz und/oder durch Öffnen eines Blisters mit der vorgelegten Substanz ohne Benutzereingriff erfolgen. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann die notwendige Mischung und Inkubation der Probe mit dem Mittel zur Permeabilisierung bereitstellen. Dies kann zu einer Permeabilisierung und/oder Lyse von kompartimentierenden Bestandteilen der Erreger und/oder Zellen wie einer Lipidmembran und/oder Zellwand führen.
  • Als weiteren Schritt kann ein Aufbringen und/oder Freisetzen eines Markierungs-Liganden, insbesondere eines Fluoreszenzfarbstoffs an zumindest einem Antikörper und/oder eines DNA-Farbstoffes und/oder Aufbringen und/oder Freisetzen eines Fängerliganden auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung durchgeführt werden. Dies kann vorzugsweise ohne Benutzereingriff durch Lösen einer im Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung lyophilisierten Substanz und/oder durch Öffnen eines Blisters mit der vorgelegten Substanz erfolgen. Das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung kann dabei die notwendige Mischung und Inkubation der Probe mit dem Mittel zur Bindung und dem Mittel zur Markierung bereitstellen.
  • Als weiterer Schritt ist ein Markieren zumindest eines Bestandteiles von zumindest einem Erreger und/oder zumindest einer Zelle denkbar. Durch eine Permeabilisierung und/oder Lyse der Zelle kann ein Mittel zur Bindung und/oder Markierung Zugang zu Strukturen der Erreger und/oder Zellen z.B. im Zellinneren erhalten, so dass eine spezifische Bindung beispielsweise von Antikörpern an Antigenen erfolgen kann. Im Falle von fluoreszenzmarkierten Antikörpern kann dies eine spezifische Immunfärbung erzeugen.
  • Als weiterer Schritt ist das Anreichern von zumindest einem Bestandteil eines Erregers und/oder einer Zelle, insbesondere mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung denkbar. Bei einem Einsatz von beispielsweise magnetischen Nanopartikeln als Mittel zur Bindung können diese z.B. über einen spezifischen Antikörper an Strukturen des Erregers und/oder der Zelle binden, wodurch diese mittels magnetischer Separation angereichert werden können. Alternativ kann ein Aufstauen z.B. mittels Filtration der Probenflüssigkeit zum Anreichern von Bestandteilen von Erregern und/oder Zellen führen.
  • Als weiterer Schritt kann ein bildgebender Nachweis eines Erregers und/oder einer Zelle durch mikroskopische Vergrößerung und/oder Bildaufnahme insbesondere mittels einer Kamera, Bildverarbeitung und/oder Auswertung in einem Mittel zur Bildverarbeitung und/oder einer mobilen Rechnereinheit vorgesehen sein. Dies umfasst insbesondere eine Objekterkennung ggf. nach Abzug eines Fluoreszenzhintergrundes und/oder ggf. nach Herausrechnen von durch den Aufbau des Testsystems verursachten optischen Artefakten. Im Falle einer Immunfluoreszenz-Markierung kann unter Verwendung einer Beleuchtungseinheit ein Fluoreszenzsignal durch ein Mittel zur Bildverarbeitung enthaltend vorzugsweise eine Vergrößerungseinheit und eine Kamera bildgebend aufgenommen werden, so dass im mikroskopischen Bild fluoreszente Strukturen von Erreger und/oder Zelle sichtbar werden können. Mittels der Mittel zur Bildverarbeitung und/oder der mobilen Rechnereinheit kann ohne Benutzereingriff eine Objekterkennung dieser fluoreszenten Strukturen und eine weitergehende Auswertung wie z.B. eine automatische Abschätzung der Erregerzahlen pro Probenvolumen erfolgen. Die Ergebnisse können mittels der mobilen Rechnereinheit auch an medizinisches Fachpersonal übermittelt werden, welches eine Diagnose erstellen und eine entsprechende Therapie einleiten kann.
  • Dabei ist es denkbar dass die einzelnen Schritte einzeln für sich und/oder in einer beliebigen Reihenfolge durchführbar sind.
  • Vorzugsweise kann das Testverfahren als ein Nachweis von Krankheiten eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere die folgenden Krankheiten denkbar: Infektionskrankheiten, Erkrankungen verursacht durch Pilze, Viren und/oder Bakterien, und/oder Pathogenen und/oder Erreger. Als Erreger sind dabei ferner insbesondere die folgenden Erreger denkbar: Adenoviren, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Borrelia recurrentis, Brucella sp., Campylobacter sp., Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, humanpathogene Cryptosporidium sp., Ebolavirus, Escherichia coli, enterohämorrhagische Stämme (EHEC), Francisella tularensis, FSME-Virus, Gelbfiebervirus, Giardia lamblia, Haemophilus influenzae, Hantaviren, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, Hepatitis-D-Virus, Hepatitis-E-Virus, Influenzaviren, Lassavirus, Legionella sp., humanpathogene Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Marburgvirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis/africanum, Mycobacterium bovis, Neisseria meningitidis, Norwalk-ähnliches Virus, Poliovirus, Pseudomonas aeruginosa, Rabiesvirus, Rickettsia prowazekii, Rotavirus, Rubellavirus, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhi, Shigella sp., Trichinella spiralis, Varizella-Zoster-Virus, Vibrio cholerae O 1 und O 139, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Treponema pallidum, HIV, Echinococcus sp., Plasmodium sp., Toxoplasma gondii, Streptococcus pneumoniae und/oder Streptococcus aureus.
  • Bei dem Testverfahren ist vorzugsweise ein Nachweis von Malariaerregern denkbar, die insbesondere in einer Blutprobe vorkommen.
  • Im Rahmen der Erfindung kann ebenfalls vorteilhaft sein, wenn das Testverfahren Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung zum Nachweis von Malariaerregern in einer Blutprobe eingesetzt werden kann. Dabei ist es möglich, dass zumindest eine Struktur in infizierten Erythrozyten verfügbar sein kann. Das Testverfahren kann ein Mittel zur Permeabilisierung, insbesondere Saponin und/oder Ammoniumchlorid, enthalten und für zumindest einen Fänger-Liganden, insbesondere zumindest einen Antikörper gegen plasmodiale Proteine, welcher vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Partikel, insbesondere einen Turbobead koppelbar sein, und/oder einen Markierungs-Liganden, vorzugsweise zumindest einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen plasmodiale Proteine und/oder zumindest einen DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA umfassen. Damit kann zumindest eine Struktur von Plasmodien und/oder des zumindest einen infizierten Erythrozyten in einer Sandwich-Struktur nachgewiesen werden und/oder zumindest ein infizierter Erythrozyt und/oder zumindest eine Struktur von Plasmodien können mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung gefangen werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Verwendung zur Diagnose von Erkrankungen mittels eines Testsystems und/oder eines Testverfahrens denkbar. Die erfindungsgemäße Verwendung bringt dabei die gleichen Vorteile mit sich wie sie bereits ausführlich in Bezug auf das erfindungsgemäße Testsystem sowie das erfindungsgemäße Testverfahren beschrieben worden sind. Insbesondere kann eine Diagnostik am Point-of-Care auch durch eine ungeschulten Person erfolgen, so dass die gesuchten Erreger und/oder Zellen vor Ort und zeitnah statt mittels aufwändiger Laborverfahren durch das Testsystem nachgewiesen werden können.
  • Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung zu einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung, welche in den Figuren schematisch dargestellt sind. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und/oder der Zeichnung hervorgehende Merkmale und/oder Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumliche Anordnungen und Verfahrensschritte, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Es zeigen:
  • 1a: schematische Darstellung einer Zielzelle vor der Permeabilisierung,
  • 1b: schematische Darstellung einer Zielzelle nach der Permeabilisierung,
  • 2a: schematische Darstellung eines Reaktionsgefäßes als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung,
  • 2b: schematische Darstellung eines Mikrokanals als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung,
  • 2c: schematische Darstellung eines Mikrokanals mit Aufstau-Vorrichtung,
  • 3: schematische Darstellung einer Bildaufnahme und Verarbeitung nach Permeabilisierung, Markierung und Fangen von Erregern und/oder Zellen und
  • 4: schematische Darstellung eines Testsystems.
  • 1a zeigt einen Erreger und/oder eine infizierte Zelle 10 mit spezifischen inneren Zielstrukturen 40, 50 wie z.B. einem Antigen, einem Protein, einem Lipid, einer Glycosaccharaidkette, einer Nukleinsäurekette, einem Peptid oder anderen Biomolekülen. Dies kann ein Erreger 10 wie ein Bakterium sein, welches eine kompartimentierende Struktur 30 wie z.B. eine Zellmembran und/oder eine Zellwand aufweist, welche das Zellinnere vom Zelläußeren im Wesentlichen abtrennt. Es enthält für diese Bakterien-Spezies spezifische Zielstrukturen 40, 50 z.B. an einer oder mehreren inneren Strukturen 20 wie z.B. einem Thylakoid, Ribosom, Plasmid, Chlorosom, Basisapparat einer Geißel, Nucleoid, cytoplasmatische Seite der Zellmembran und/oder andere Bestandteile, auf denen Zielstrukturen wie z.B. Antigene zu finden sind. Ein in die äußere Lösung zugegebener und/oder dort gelöster Fänger-Ligand 60 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper z.B. mit einem angekoppelten magnetischen Nanopartikel 70 wie beispielsweise einem Turbobead und/oder ein Markierungs-Ligand 80 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper mit angekoppelter Markierung 90 wie beispielsweise einem Fluorophor, Quantum-Dot, Enzym, Goldpartikel und/oder sonstiger Markierung kann auf Grund der kompartimentierenden Struktur 30 wie einer Zellwand und/oder Lipidmembran und/oder sonstigen Struktur nicht in das Innere des Bakteriums eindringen.
  • Die Zelle 10 kann beispielsweise ebenfalls ein mit einem Malariaerreger 20 (Plasmodium spec.) infizierter Erythrozyt 10 sein. Die Zielstrukturen 40, 50 können ebenfalls Plasmodiumspezifische Strukturen sein, die im Inneren des Erythrozyten angeordnet sind.
  • Der Erythrozyt ist durch eine Zellmembran umhüllt, welches eine als kompartimentierende Struktur 30 das Zellinnere vom Zelläußeren im Wesentlichen abtrennt. Es enthält für diese Plasmodien-Spezies spezifische Zieltrukturen 40, 50 z.B. an einer oder mehreren inneren Strukturen 20 wie etwa plasmodiale Proteine am Zytoskelett und/oder an einer inneren Membran. Ein in die äußere Lösung zugegebener und/oder dort gelöster Fänger-Ligand 60 wie beispielsweise ein spezifischer Antikörper z.B. mit einem angekoppelten magnetischen Nanopartikel 70 wie beispielsweise einem Turbobead und/oder ein Markierungs-Ligand 80 wie ein spezifischer Antikörper mit angekoppelter Markierung wie einem Fluorophor, Quantum-Dot, Enzym, Goldpartikel können auf Grund der kompartimentierenden Struktur 30 nicht in das Innere des Erythrozyten eindringen.
  • 1b stellt eine Zelle 10 nach Zugabe eines Mittels zur Permeabilisierung 110 wie z.B. Saponin, Porenbildner, lysierende Agenzien, Import-auslösende Agenzien, hypotone oder hypertone Lösungen und/oder andere Substanzen dar. Durch das Mittel zur Permeabilisierung können Öffnungen 31 als Risse, Poren, Löcher, destabilisierte Membranbereiche z.B. ohne Cholesterol, und/oder ein Aufnahmevorgang 31 wie Transportmechanismen in der kompartimentierenden Struktur 30 entstehen. In Folge dessen können in die äußere Lösung zugegebene Fänger-Ligand(en) 60 mit angekoppeltem magnetischem Nanopartikel 70 und/oder Markierungs-Ligand 80 mit angekoppelter Markierung 90 in die Zelle und/oder den Erreger eindringen und dort spezifisch an die jeweilige Zielstruktur 40 und/oder 50 binden. Fänger-Ligand 60 und Markierungs-Ligand 80 haben vorzugsweise keine Kreuzreaktivität, d.h. sie binden an verschiedene Zielstrukturen 40, 50, so dass vorzugsweise eine Sandwichstruktur entstehen kann. Vorzugsweise kann durch Anbinden des Markierungs-Liganden 80 wie beispielsweise einem fluoreszenzmarkiertem Antikörper an eine Zielstruktur 40 wie beispielsweise einem Erregertypischen Antigen eine Immunfärbung entstehen.
  • 2a ist eine schematische Darstellung eines Reaktionsgefäßes 121 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe mit Zellen 10, 11. Vorzugsweise können die Zellen 10 dabei Zielzellen und Zellen 11 dabei Nicht-Zielzelle darstellen. Das Reaktionsgefäß 121 kann beispielsweise ein Mikroreaktionsgefäß wie ein Eppendorf-Reaktionsgefäß und/oder eine chromatographische Säule sein. Ein zugeordneter Magnet 130 wie ein Hochgradientenmagnet und/oder ein Dauermagnet und/oder ein Elektromagnet und/oder ein sonstiger Magnet kann im Reaktionsgefäß 121 eine magnetische Anziehungskraft 131 erzeugen. Diese Anziehungskraft 131 kann dabei auf die magnetischen Nanopartikel 70 wirken, wodurch diese und die über den Fänger-Liganden gebundene Zielstruktur 50 angezogen werden und können, soweit in dem Reaktionsgefäß 10 möglich, in räumlicher Nähe des Magneten angereichert und immobilisiert werden. Bevorzugt kann die gebundene Ziel-Struktur 50 mit Bestandteilen und/oder dem Großteil der Zelle und/oder des Erregers 10 verbunden sein, so dass die gebundene Ziel-Struktur 50 mit anhängenden weiteren Bestandteilen in räumlicher Nähe des Magneten wie z.B. an der dem Magneten zugewandten Wand des Reaktionsgefäßes angereichert wird. Nicht-Zielzellen wie z.B. nicht-infizierte Erythrozyten können nicht durch Fänger-Liganden gebunden und nicht angereichert werden. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann eine Markierung von Strukturen der Zielzelle erfolgen.
  • 2b zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 140 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe unter Einsatz eines Fänger-Liganden mit magnetischem Nanopartikel. Eine mikrofluidische Sturktur besteht aus einem Bauteil mit enthaltener Kapillare und/oder Mikrostrukturen und/oder einem oder mehreren Mikrokanälen. Die Probenflüssigkeit mit enthaltenen Zellen 10, 11 kann die mikrofluidische Struktur 140 in Fließrichtung 141 durchfließen. Ein zugeordneter Magnet 130 kann eine magnetische Kraft 131 in einem Bereich der mikrofluidischen Struktur erzeugen. Diese Kraft kann anziehend auf den magnetischen Nanopartikel 70 wirken, wie in 2a gezeigt, und somit auf den gekoppelten Fänger-Liganden 60 und eine gebundene Zielstruktur 50 und/oder vorzugsweise einen angebundenen Großteil der Struktur 20 und/oder 10 wirken. Dies kann zu einer Anreicherung der Zielstruktur und vorzugsweise der Zellen 10 und/oder den Bestandteilen der mikrofluidischen Struktur 140, insbesondere an der Decke, den Seitenwänden und/oder dem Boden führen. Zellen 11 wie z.B. nicht-infizierte Erythrozyten können nicht durch Fänger-Liganden 60 gebunden und angereichert werden. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden 80 wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann eine Markierung von Zielstruktur(en) 40 der Zielzelle 10 erfolgen.
  • 2c ist eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 140 als Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung mit enthaltener Probe und einer Aufstau-Vorrichtung im mikrofluidischen Kanal. Die Probenflüssigkeit mit enthaltenen Zellen 10, 11 kann die mikrofluidische Struktur 140 in Fließrichtung 141 durchfließen. Eine Aufstau-Vorrichtung in einem Bereich der mikrofluidischen Struktur kann enthaltene Zellen 10, 11 (Ziel-Zellen und Nicht-Zielzellen) und/oder Ziel-Erreger 10 zurückhalten, während die restliche Flüssigkeit teilweise in/durch die Aufstau-Vorrichtung fließen kann. Über eine Bindung eines Markierungs-Liganden 80 wie einem fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes kann ferner eine Markierung von Strukturen der Zelle 10 erfolgen. Markierte Zellen 10 (Zielzellen) unter den aufgestauten Zellen 10, 11 (Zielzellen und Nicht-Zielzellen) können mittels Bildverarbeitungsvorrichtung detektiert werden.
  • 3 zeigt die schematische Darstellung einer Bildaufnahme und Verarbeitung nach Permeabilisierung, Markierung und/oder Anreicherung im Falle einer Fluoreszenzmarkierung und bildgebender Detektion. Die Probe mit den enthaltenen Zellen 10 kann mit einem Anregungslicht 151 z.B. Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 950 nm einer Anregungsbeleuchtung 150 wie z.B. einer LED und/oder einem Laser und/oder einer Beleuchtungsquelle bestrahlt werden. Diese Anregungsbeleuchtung kann so abgestimmt sein, dass sie die Markierung 90 zur Abgabe von Fluoreszenzlicht 152 wie z.B. Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 1000 nm stimuliert. Fluoreszenzlicht 152 kann daraufhin von einem Mittel zur Bildverarbeitung 160 aufgenommen werden. Diesem Mittel zur Bildverarbeitung 160 kann eine Vergrößerungseinheit 161 und eine Kamera 162 zugeordnet sein. Bilddaten der Kamera können prozessiert und mittels Datenübertragung 164 vorzugsweise kabellos an eine mobile Rechnereinheit 163 wie ein Smartphone gesendet werden. Die mobile Rechnereinheit 163 kann diese Bilddaten auswerten und außerdem eine Benutzerführung und eine Steuerung des Mittels zur Bildverarbeitung ausführen. Als Ergebnis können enthaltene Zellen und/oder Erreger auf den Bildern lokalisiert und angezeigt werden. Eine Diagnosestellung kann z.B. durch Übertragung der Erregerbilder an eine Rechnereinheit 164 wie ein weiteres mobiles Smartphone von medizinischem Fachpersonal durch dieses erfolgen.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Struktur 200, die z.B. eine Kapillare und/oder einen Mikrokanal und/oder eine sonstige mikrofluidische Struktur enthält. Diese kann eine Probenaufnahme 210 enthalten, in die ein Volumen einer flüssigen Proben gegeben wird. Dies kann beispielsweise eine Kapillare mit definiertem Volumen sein. Die Probenaufnahme 210 kann lyophilisierte Substanzen wie z.B. einen Gerinnungshemmer enthalten. Die Probe kann anschließend die mikrofluidische Struktur 200 beispielsweise auf Grund von Kapillarkräften durchfließen. Die Probe kann dort beispielsweise mittels einer Abzweigung eines Mikrokanales aufgeteilt werden, so dass ein erster Teil der Probe ein Depot für eine vorgelegte, feste Substanz 220 durchfließen kann und dort z.B. lyophilisierte Liganden lösen kann. In einer Mischer-/Inkubationsstruktur kann der erste Probenteil mit dieser/n Substanz(en) gemischt und inkubiert werden. Der erste Probenteil kann mit dem zweiten Probenteil zusammengeführt und in einer Mischer-/Inkubationsstruktur 240 gemischt und inkubiert werden. Im Detektionsbereich kann ein Fangen, eine Anreicherung und/oder Immobilisierung erfolgen. Das Mittel zur Bildverarbeitung kann die Ziel-Zellen/Ziel-Erreger im Detektionsbereich detektieren. Der Fließvorgana kann vorzugsweise durch eine Saugvorrichtung 250 wie ein Saugvlies und/oder eine Mikropumpe aufrechterhalten werden, kann aber auch durch eine externe Vorrichtung wie eine Pumpe erfolgen. Die Lösung kann anschließend in einem Abfallreservoir 260 gesammelt werden. Eine mikrofluidische Struktur als Teststreifen kann weiterhin eine Kodierung wie einen Barcode und/oder ein RFID-Bauteil zur Identifikation der Probe enthalten.
  • Beispiel der Detektion von Malaria-Erregern
  • Malariaerreger durchlaufen in ihrem Lebenszyklus mehrere Stadien. Im Kapillarblut aus der Fingerbeere findet man vorwiegend Plasmodien im Ringstadium in infizierten roten Blutkörperchen (iRBC). Die Plasmodien enthalten im Gegensatz zu den nicht infizierten roten Blutkörperchen (RBC) DNA. Auf der Oberfläche von iRBC findet man verschiedene parasitäre Antigene wie das PfEMP-1-Protein. Zum Unterlaufen der Immunantwort finden sich hierbei jedoch jeweils nur eines aus einem Pool von vielen variablen, genetisch kodierten Unterformen. Für den Erreger Plasmodium falciparum sind bisher keine Antikörper bekannt, welche universell möglichst alle Varianten erkennen und somit als universeller Antikörper für die diagnostische Erkennung aller mit Plas. falc. infizierten iRBC eingesetzt werden könnte. Im Inneren der iRBC mit Erregern im Ringstadium finden sich jedoch einige parasitäre Antigene, welche nicht variabel bei allen Plas. falc. auftreten. Kommerziell sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen plasmodiale Proteine zu erhalten wie z.B. monoklonale Maus IgM-Antikörper gegen Plasmodium falciparum „all stages“ sowie monoklonale anti-MSP-1 und/oder MSP-10-Antikörper. Ein weiteres Beispiel für ein parasitäres Antigen ist das Ring-infected erythrocyte surface antigen (RESA), welches entgegen seinem Namen nicht auf der Oberfläche der iRBC sondern an der Membraninnenseite infizierter Erythrozyten an Komponenten des iRBC-Zytoskeletts zu finden ist. Auf der parasitophoren Membran und nach Permeabilisierung der Plasmodiummembran auch im Cytoplasma der Plasmodien sind weitere Antigene zu finden, welche über spezifische Antikörper nachgewiesen werden können. In einer Ausführungsform wird ein definiertes Volumen von vorzugsweise 1 bis 10 µl Vollblut aus der Fingerbeere in den Teststreifen appliziert. Die Erythrozyten werden durch ein Mittel zur Permeabilisierung, vorzugsweise Saponin und/oder Ammoniumchlorid, permeabilisiert und/oder lysiert, so dass ein Markierungs-Ligand, vorzugsweise ein fluoreszenzmarkierter Antikörper wie der monoklonale Maus-IgM-Antikörper gegen mit Plas. falc. infizierte RBC, Klon IIIB6, markiert mit DyLight 488 und/oder ein fluoreszenzmarkierter anti-RESA-Antikörper, in den iRBC diffundieren kann. Dort bindet dieser an die infizierte RBC und erzeugt eine Immunfluoreszenzmarkierung. Alternativ kann über einen fluoreszenten DNA-Farbstoff wie Hoechst 33342 die parasitäre DNA markiert werden. Ein Filter hält jetzt alle Zellen und Zellbestandteile zurück. Die Fluoreszenzmarkierung kann mit der Vergrößerungseinheit mit Bildverarbeitungseinheit, welches als Fluoreszenzmikroskop dient, sichtbar gemacht werden. In einer anderen Ausführungsform wird als Mittel zur Bindung ein magnetischer Nanopartikel wie ein Turbobead-PEG-Streptavidin eingesetzt, an den ein biotinylierter Antikörper wie der monoklonale Maus-IgM-Antikörper gegen mit Plas. falc. infizierte RBC, Klon IIIB6, biotinyliert, gebunden wird. Nach der Permeabilisierung der RBC und iRBC diffundiert das MNP in die Erythrozyten und bindet dort spezifisch an Strukturen der infizierten RBC. Als zweites Mittel der Markierung wird ein fluoreszenter DNA-Farbstoff und/oder ein fluoreszenzmarkierter Antikörper zugegeben, welcher eine Immunfluoreszenz der iRBC und/oder Plasmodien erzeugt. Im Detektionsbereich werden die iRBC mittels eines Magneten immobilisiert und angereichert und können mittels Fluoreszenzmikroskopie bildgebend detektiert werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Nanopartikel wie die NanoScreenMag-Partikel der Chemicell GmbH und/oder die MyQuVigen-Nanopartikel von Nvigen Inc. als Mittel zur Bindung und Markierung zu den permeabilisierten iRBC zugegeben. Im Detektionsbereich können diese mittels eines Magneten immobilisiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie durch die optische Vergrößerungseinheit bildgebend nachgewiesen werden. Die Bilddaten mit den fluoreszenzmarkierten iRBC können jeweils an durch die Bildverarbeitungsvorrichtung einer ersten Bearbeitung unterzogen werden wie z.B. Hintergrund-Korrektur und/oder einer Kompression. Im nächsten Schritt können mittels einer Objekt-Erkennungs-App in den Bildern Objekte gesucht werden, deren Intensität über einem kritischen Wert liegen und die eine bestimmte Größe und/oder Pixelzahl aufweisen können und die somit als Erreger definiert werden. Diese Auswertung kann in der Bildverarbeitungsvorrichtung und/oder in der mobilen Rechnereinheit erfolgen. Die Objekt-Detektion kann durch entsprechende Kontrollen wie einer Zellerkennung bei Weißlicht-Beleuchtung und/oder einer Fluoreszenzerkennung nach Membranfärbung weiter abgesichert werden. Aus der Detektion von Erregern kann auf eine Diagnose des Patienten geschlossen werden.
  • Beispiel der Detektion von Sepsis-Erregern
  • Sepsis tritt jährlich beispielweise bei ca. 18 Mio. Patienten auf und hat eine Lethalität von ca. 50%. Verantwortlich für eine Sepsis können über 25 veschiedene Erreger sein wie z.B. Bakterien (Meningokokken, Streptokokken etc.) und/oder Pilzinfektionen. Beispielsweise für Streptokokken existieren bereits kommerzielle Schnelltests. Diese bestehen aber üblicherweise aus mehreren Schritten, da mittels mehreren Reagenzien zuerst das Antigen aus der Zellwand herausgelöst werden muss und anschließend in einer Indikatorreaktion nachgewiesen wird. Die hohe Spezifität von 95 bis 100 % ist gut dokumentiert. Die Sensitivität der Tests beträgt z.B. jedoch lediglich 70 bis 90 %; in 10 bis 30 % ist das Resultat also falsch negativ. Bei infektiösen Bakterien findet sich in der Regel eine regionale und zeitliche Veränderung der Oberflächenantigene. Ein Schnelltest gemäß der Erfindung kann unter Bindung und Markierung von anderen Antigenen, die ohne Permeabilisierung der Zellen nicht für Liganden zugänglich sind, erfolgen. Vergleichbar der Detektion am Beispiel eines Malaria-Erregers gibt es hier verschiedene Ausführungsformen wie A) Aufstauen aller Zellen und ein Immunfluoreszenz-Nachweis mittels eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers gegen ein internes, eher konserviertes Antigen, B) magnetisches Fangen und parallele Fluoreszenzmarkierung mittels eines fluoreszenten MNP, an das ein spezifischer Antikörper gekoppelt wird und/oder C) magnetisches Fangen mittels eine MNP, vorzugsweise Turbobead, mit spezifischem Antikörper und Fluoreszenzmarkierung mittels eines zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörpers und/oder eines DNA-Farbstoffes.
  • Beispiel für eine Anwendung der Erfindung für die Analyse von Nahrungsmitteln und/oder Trinkwasser: Nachweis von Legionellen in Trinkwasser
  • Legionellen sind bewegliche Stäbchenbakterien mit einer durchschnittlichen Länge von 2–5 µm und einem Durchmesser von 0,5–0,8 µm. Sie kommen in zahlreichen Arten und Serogruppen weltweit verbreitet in Oberflächenwässern und auch in Trinkwasserleitungen vor. Eine Infektion mit Legionella pneumophila erfolgt durch zerstäubtes, vernebeltes Wasser und kann zu der sogenannten Legionärskrankheit, einer schweren Pneumonie, führen, welche in 10–15 % der Fälle tödlich verläuft. Kommerzielle Schnelltests beinhaltet meist eine Probennahmevorrichtung, die zu einem Labor geschickt wird und dort mittels einer Bakterienkultur auf Agarplatten in ca. 10 Tagen analysiert wird. Eine Ausführungsform der Erfindung kann beispielsweise einen Teststreifen enthalten, der für die Filtration eines Volumen von Trinkwasser im Bereich von Milliliter bis mehreren Litern und/oder Kubikmetern ausgelegt ist, so dass alle enthaltenen Zellen, Bakterien und Erreger zurückgehalten werden und im Detektionsbereich angeordnet werden. Dies kann beispielsweise mit einer mikroporösen Filtrationsmembran mit einer Porengröße von 0,45 µm erfolgen. Anschließend wird ein Mittel zur Permeabilisierung der Erreger beispielsweise aus einem im Teststreifen enthaltenen Blister eingeleitet, so dass die Filtrationsmembran mit diesem inkubiert wird. Außerdem wird beispielsweise ein fluoreszenzmarkierter Antikörper und/oder fluoreszenter Nanopartikel mit Antikörper zugegeben, der spezifisch an Antigene und/oder zelluläre Strukturen der Legionellen bindet, die ohne Mittel zur Permeabilisierung nicht zugänglich wären und eine lokal und zeitlich weitgehend konstante Struktur aufweisen. Die Erreger können mittels Immunfluoreszenz durch die Vergrößerungseinheit mit Bildverarbeitungsvorrichtung bildgebend detektiert werden. In einer anderen Ausführungsform wird zuerst ein Volumen von Trinkwasser im Bereich von Millilitern bis zu mehreren Litern und/oder Kubikmetern in einer Mischkammer mit einem Mittel zur Permeabilisierung und magnetischen Nanopartikeln wie Turbobeads gemischt, an die ein spezifischer Antikörper gegen Antigene der Legionellen gekoppelt ist. Nach einer Inkubation wird die Mischung in einem Teststreifen an einem Magneten angeordnet bei einem Detektionsbereich vorbeigeleitet. Die MNPs werden dabei aus der Lösung gefangen, wodurch gebundene Legionellen und/oder deren Bestandteile immobilisiert werden. Die Fluoreszenzfärbung kann durch einen Markierungs-Liganden wie einem fluoreszenten DNA-Farbstoffes und/oder einem fluoreszenzmarkierten Antikörper und/oder einem fluoreszenten Nanopartikel mit gebundenem Antikörper erfolgen. Die Detektion kann wiederum mittels bildgebender Immunfluoreszenz erfolgen.
  • Die voranstehende Erläuterung der Ausführungsformen beschreibt die vorliegende Erfindung ausschließlich im Rahmen von Beispielen. Selbstverständlich können einzelne Merkmale der Ausführungsformen, sofern technisch sinnvoll, frei miteinander kombiniert werden, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Bezugszeichenliste
    • 10
    Zielzelle oder Zielerreger
    11
    Zelle
    20
    Struktur einer Zelle und/ oder eines Erregers
    30
    Struktur zur Kompartimentierung
    31
    Erzeugte Öffnung in 30 und/oder Aufnahmemechanismus durch 30
    40
    Ziel-Struktur
    50
    Ziel-Struktur
    60
    Fänger-Ligand
    70
    Magnetischer Nanopartikel
    80
    Markierungs-Ligand
    90
    Markierung
    110
    Mittel zur Permeabilisierung
    120
    Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung
    121
    Reaktionsgefäß
    122
    Aufstau-Vorrichtung
    130
    Magnet
    131
    Magnetische Anziehungskraft
    140
    Mikrofluidische Strruktur
    141
    Fließrichtung
    150
    Beleuchtungseinheit
    151
    Anregungslicht
    152
    Fluoreszenzlicht
    160
    Mittel zur Bildverarbeitung
    161
    Vergrößerungseinheit
    162
    Kamera
    163
    Mobile Rechnereinheit
    164
    Datenübertragung
    165
    Mobile Rechnereinheit
    200
    Mikrofluidische Struktur
    210
    Probenaufnahme
    220
    Depot
    230
    Blister-Depot
    240
    Mischerstruktur, Inkubationsstruktur
    250
    Saugvorrichtung
    260
    Abfallreservoir
    270
    Codierung
    280
    Detektionsbereich

Claims (10)

  1. Testsystem umfassend zumindest eines der folgenden Mittel: – Mittel zur Permeabilisierung 110 und/oder Lyse von zumindest einem Erreger 10 und/oder zumindest einer Zelle 10 – Mittel zum Fangen 80 und/oder Markierung 90 von Teilen (20 und/oder 40 und/oder 50) der Erreger 10 und/oder Zellen 10 – Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) eines Erregers 10 und/oder einer Zelle 10 – Mittel zur Bildverarbeitung 160 vorzugsweise umfassend eine optische Vergrößerungseinheit 161, wodurch eine optische Auslesung zumindest eines Mittels zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 durchführbar ist.
  2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 Elemente zur Aufnahme eines Probefluids aufweist, insbesondere einer Körperflüssigkeit und/oder einer Nahrungsmittelprobe und/oder von Trinkwasser.
  3. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Mittel zur Permeabilisierung 110 ein Zugang für Liganden (60, 80) zu zumindest einer Zielstruktur (40 und/oder 50) wie einem Biomolekül und/oder zu zumindest einer Struktur 20 eines Erregers und/oder zu zumindest einer Zelle 10/ Erreger 10 erzielbar ist, wobei insbesondere zumindest eine Öffnung 31, aufweisend eine Größe zwischen ungefähr 1 nm und ungefähr 12 µm, und/oder ein Aufnahmemechanismus 31 und/oder eine vollständigen Lyse 31 der Zelle 10 erzeugbar ist.
  4. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 von zumindest einem Bestandteil von Erregern 10 und/oder Zellen 10 einsetzbar ist, wobei zumindest ein Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20 und/oder 10) von Erregern 10 und/oder Zellen 10 anreicherbar ist und/oder dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 eine mikrofluidische Struktur (140 und/oder 200) zur Auflösung (220) und/oder Zugabe (230) und/oder Mischung 240 und/oder Inkubation 240 von Substanzen aufweist.
  5. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 zumindest eine mikrofluidische Struktur (140 und/oder 200) zur Inkubation eines Probefluids mit Fänger- 60 und/oder Markierungs-Ligand 80 aufweist und zumindest einen Detektionsbereich 280, wobei auf dem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 zumindest ein Bestandteil zumindest eines markierten Erregers 10 und/oder zumindest einer markierten Zelle 10 aufnehmbar ist.
  6. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Bindung zumindest einen Fänger-Liganden 60 und/oder zumindest einen Markierungs-Liganden 80 zur Markierung, insbesondere Färbung aufweist, wobei dies insbesondere zumindest einen Antikörper, ein Aptamer und/oder einen Ligand umfasst und/oder einen Mikro-Partikel 70, Nanopartikel 70, magnetischen Nanopartikel 70 umfasst, das mit einem Antikörper, Aptamer, Liganden koppelbar ist, wobei bevorzugt ein zumindest magnetischer Nanopartikel 70, bevorzugt ein Turbobead und/oder ein Metallkern, über einen angekoppelten Fänger-Liganden 60 an zumindest einen Bestandteil (z.B. 20 und/oder 40 und/oder 50) von Erregern 10 und/oder Zellen 10 bindbar ist, wobei vorzugsweise eine Sandwichstruktur aus zumindest einem Fänger-Liganden 60 und zumindest einem Markierungs-Liganden 80 erzeugbar ist.
  7. Testverfahren zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere mit einem Testsystem mit den Merkmalen von zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zumindest einen der folgenden Schritte: a) Aufbringen eines Probenfluids, insbesondere einer Flüssigkeit auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120, b) Aufbringen und/oder Freisetzen eines Mittels zur Permeabilisierung 110 auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120, wodurch ein Zugang von Liganden (z.B. 60 und/oder 80) zu Strukturen von zumindest einem in dem Probefluid enthaltenen Erreger 10 und/oder zumindest einer Zelle 10 erzielt wird, c) Aufbringen und/oder Freisetzen eines Markierungs-Liganden 80, insbesondere eines Fluoreszenzfarbstoffs an zumindest einem Antikörper und/oder eines DNA-Farbstoffes und/oder Aufbringen und/oder Freisetzen eines Fänger-Liganden 60 auf das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120, d) Markieren zumindest eines Bestandteiles (40 und/oder 50 und/oder 20) von zumindest einem Erreger 10 und/oder zumindest einer Zelle 10, e) Anreichern von zumindest einem Bestandteil (40 und/oder 50 und/oder 20) eines Erregers 10 und/oder einer Zelle 10, insbesondere mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherun 120, f) Nachweis des Erregers 10 und/oder der Zelle 10 durch mikroskopische Vergrößerung und/oder Bildaufnahme.
  8. Testverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nachweis von Infektionskrankheiten, Erkrankungen verursacht durch Pilze, Viren und/oder Bakterien, und/oder Pathogenen und/oder Erregern, insbesondere Adenoviren, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Borrelia recurrentis, Brucella sp., Campylobacter sp., Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, humanpathogene Cryptosporidium sp., Ebolavirus, Escherichia coli, enterohämorrhagische Stämme (EHEC), Francisella tularensis, FSME-Virus, Gelbfiebervirus, Giardia lamblia, Haemophilus influenzae, Hantaviren, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, Hepatitis-D-Virus, Hepatitis-E-Virus, Influenzaviren, Lassavirus, Legionella sp., humanpathogene Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Marburgvirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis/africanum, Mycobacterium bovis, Neisseria meningitidis, Norwalkähnliches Virus, Poliovirus, Pseudomonas aeruginosa, Rabiesvirus, Rickettsia prowazekii, Rotavirus, Rubellavirus, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhi, Shigella sp., Trichinella spiralis, Varizella-Zoster-Virus, Vibrio cholerae O 1 und O 139, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Treponema pallidum, HIV, Echinococcus sp., Plasmodium sp., Toxoplasma gondii, Streptococcus pneumoniae und/oder Streptococcus aureus, insbesondere ein Nachweis von Malariaerregern, insbesondere in einer Blutprobe, erzielbar ist.
  9. Testverfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 zum Nachweis von Malariaerregern in einer Blutprobe einsetzbar ist, wobei insbesondere zumindest eine Struktur in infizierten Erythrozyten (20 und/oder 40 und/oder 50) nach Einwirken eines Mittel zur Permeabilisierung 110, insbesondere Saponin und/oder Ammoniumchlorid, für zumindest einen Fänger-Liganden 60, insbesondere zumindest einen Antikörper gegen plasmodiale Proteine, welcher vorzugsweise an zumindest einen magnetischen Nanopartikel 70, insbesondere einen Turbobead koppelbar ist, und/oder für zumindest einen Markierungs-Liganden 80, vorzugsweise zumindest einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen plasmodiale Proteine und/oder zumindest einen DNA-Farbstoff gegen plasmodiale DNA, verfügbar ist, um damit insbesondere zumindest eine Struktur (40 und/oder 50 und/oder 20) von Plasmodien 20 und/oder von zumindest mit einem oder mehreren Plasmodien 20 infizierten Erythrozyten 10 nachzuweisen und/oder zumindest einen infizierten Erythrozyten 10 und/oder zumindest eine Struktur (40 und/oder 50 und/oder 20) von Plasmodien mittels Aufstauen und/oder magnetischer Separation in einem Mittel zur Lokalisation, Immobilisierung und/oder Anreicherung 120 zu fangen.
  10. Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder Testverfahrens nach Anspruch 7 zur Diagnose von Erkrankungen.
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