EP3063528A1 - Integrity and functionality test for adsorptive depth filter layers with an inorganic layered double hydroxide - Google Patents
Integrity and functionality test for adsorptive depth filter layers with an inorganic layered double hydroxideInfo
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- EP3063528A1 EP3063528A1 EP14771193.1A EP14771193A EP3063528A1 EP 3063528 A1 EP3063528 A1 EP 3063528A1 EP 14771193 A EP14771193 A EP 14771193A EP 3063528 A1 EP3063528 A1 EP 3063528A1
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Definitions
- the present invention relates to a method for determining the functionality and integrity of depth layer and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide for contaminant removal in biotechnological processes.
- Adsorbent material separation is meant the separation of one or more components from a fluid phase by selective adsorption of this component (s) on a solid phase, the “adsorbent” (plural “adsorbents”).
- the field of the invention generally relates to the separation of substances in liquids, the liquid being referred to below as “medium”.
- Adsorbents are porous solids which, via functional surface groups called “ligands”, can selectively bond with certain components of fluids.
- ligands functional surface groups
- more “nonparticular adsorbents” have been established, which are based on a completely different type of matrix.
- Target substance (s) and / or contaminant (s) are referred to as "adsorbent" according to the invention and used in the singular, although it may also be a number of different substances.
- adsorbent By the “capacity” of an adsorbent is meant a quantitative measure of its adsorptive capacity. The capacity is related to a fixed amount of adsorbent.
- the present invention relates to the technical field of depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxides, such as For example, in DE 10 2008 037 678 A1 described which are used for contaminants removal in biotechnological processes.
- these depth filter layers and depth filter layer systems are used with inorganic layered double hydroxides for separating unwanted biological components, such as nucleic acids, cell proteins, viruses or endotoxins, from process solutions as filtration medium, wherein the unwanted biological components are adsorptively bound to the depth filter, while the desired target products, such as Antibodies, hormones, enzymes, (poly) peptides and especially therapeutic proteins can pass through the depth filter unhindered.
- Nucleic acids are to be understood here as meaning all naturally occurring nucleic acids, such as ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA), in particular of genomic but also epigenomic origin from eukaryotic, prokaryotic and viral sources, and in particular nucleic acids having a chain length of more than 15 base pairs.
- RNA ribonucleic acid
- DNA deoxyribonucleic acid
- JP 3233357 B2 discloses an integrity test for depth filters in which it is subjected to a diffusion test at 0.2 bar. With this integrity test, only very large defects above a Bubble-Poinf value of 0.2 bar are detectable.Furthermore, in the integrity test known from JP 3233357 B2, there is no correlation between the result of the integrity test and the binding capability of the depth filter for biomolecules JP 3371366 B2 discloses a similar integrity test method as the aforementioned document in which water-wetted depth filters are subjected to a gas permeability test in the vicinity of the Bubble Poinf value.
- non-particulate adsorber For contaminant removal are also non-particulate adsorber, such as the membrane adsorber Sartobind® ® Q the company. Sartorius Stedim Biotech GmbH used.
- the applicant in DE 10 2010 004 188 A1 discloses a method in which the non-particulate ion exchanger adsorber a) is treated in the case of an anion exchanger with acid or in the case of a cation exchanger is charged with acid, b) with Water is rinsed, c) a medium containing liquid ions is detected by detecting the concentration of the erupted ions by means of an ion-sensitive probe and d) that in c) Detected concentration profile is compared with that of a non-particulate ion exchange adsorber known integrity.
- DE 10 2010 004 190 A1 discloses another process by the applicant in which a non-particulate adsorber (membrane adsorber) is charged with an adsorbent under conditions in which the adsorbent is retained by the non-particulate adsorber (membrane adsorber), the adsorbent breakthrough, e.g. of phosphate ions, is detected by secondary reaction with very high accuracy, and the breakdown characteristic of the phosphate ions is compared with that of a non-particulate adsorber of known integrity.
- a non-particulate adsorber membrane adsorber
- the adsorbent breakthrough e.g. of phosphate ions
- Both methods disclosed by the Applicant are based on the fact that when the membrane adsorber is charged with a liquid medium containing ions, these ions are completely retained until the breakthrough volume is reached and the excess ions in the filtrate are detected in a suitable manner only after reaching the breakthrough volume.
- the attachment of the ions to the matrix of the membrane adsorber takes place on the porous structure.
- the basis is a microfiltration membrane with its large number of pores with a relatively narrow pore size distribution with a minimum and a maximum pore size. At the surface of these pores, functional groups are chemically bound. By interacting with these functional groups, the adsorbents are adsorbed when flowing through the membrane.
- Depth filter layers have a completely different structure than membrane adsorbers. They consist of a layer of irregular cellulose fibers and powdered adsorbents, which are bound by a binder to the cellulose fibers. Depth filters have a wide pore distribution without exclusion minimum and maximum pore size. As a result, depth filters generally have no absolute separation limit. The pore shape and distribution of a depth filter due to the fiber structure is irregular and not clearly defined. Therefore, in a depth filter, the density and distribution of the adsorbent particles and their binding sites are more irregular than in a membrane adsorber.
- aids should be used for the qualification which do not impair the function of the depth filter or the product quality.
- This object is achieved by providing a method for determining the integrity and functionality of adsorptive depth filter layers and Depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide according to claim 1.
- the present invention provides a process by which the functionality and integrity of layered depth filter sheets and inorganic layered double-layered depth-filter-layered systems in their use for the retention of contaminants, e.g. Nucleic acids, cell proteins, viruses or endotoxins, can be tested.
- the method for determining the integrity and functionality of depth layer and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxides according to the present invention comprises the steps of
- condition under which the adsorbent is completely retained by the adsorptive depth filter layer until the breakthrough volume is reached mean conditions under which the depth filter layer is pretreated with a phosphate-free buffer solution in the range of pH 5 to 14.
- defects and defects in depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide can be detected with very high precision and sensitivity with this method.
- the retention ability to detect contaminants such as viruses, nucleic acids, cell proteins and endotoxins.
- the sensitivity of an analytical detection can be described by the limit concentration or the pD value.
- the term limiting concentration refers to that concentration in g / ml of a substance to be detected, in which the detection is still positive. Simplified, instead of the limiting concentration, the pD value is introduced, which is defined as the negative decadic logarithm of the limiting concentration.
- the negative decadic logarithm of the detected limit concentration is pD> 4, preferably pD> 5, more preferably pD> 6.
- any secondary reaction with which a corresponding detection sensitivity for the erupted adsorbent or parts thereof to the above raise the detectable limit concentration described. Examples of these are complex formations with precipitation reaction or with color reaction, a color reaction being preferred.
- the inorganic anions comprise phosphate ions selected from the group of oxygen acids of phosphorus.
- the loading of the depth filter layer with the phosphate ions preferably takes place in the form of their water-soluble metal salts.
- the detection of phosphate ion in the filtrate may preferably be in the form of a phosphomolybdenum blue complex, as described in CH Fiske et al., J. Biol. Chem. (1925) 375-400.
- no phosphate is detected in intact depth filter layers with inorganic layered double hydroxide before reaching the breakthrough in the filtrate despite the high analytical sensitivity of this detection.
- the phosphate detection described in this invention as the phosphorus molybdenum blue has for potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4) with the molar mass of 136.09 g / mol, a limit concentration of 1 nmol / ml and 1, 36 x 10 "7 g / ml and corresponds to a
- KH 2 PO 4 potassium dihydrogen phosphate
- the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide are preferably passed through with phosphate ions in a concentration range from 0.5 mmol / 1 to 50 mmol / l and their concentration in the collected filtrate determined as described above.
- the ion concentration in the adsorbent is 1.0 mmol / l or more, and more preferably 1.5 mmol / l or more.
- the upper limit of the ion concentration in the adsorbent is preferably 40 mmol / l, more preferably 30 mmol / l, and particularly preferably 20 mmol / l.
- the breakthrough volume apart from the integrity of the inorganic layered double hydroxide depth filter layer to be tested, is determined from the ion concentration of the adsorbent and the adsorbability of the depth filter layer, which is correlated with the concentration of inorganic layered double hydroxide.
- the above factors should be chosen such that the breakthrough volume of intact depth filter layers is sufficiently large in order to make a precise statement about defects and defects.
- the ion concentration of the adsorbent should be correspondingly lower, and in depth filter layers having a relatively large proportion of inorganic layer double hydroxide, the ion concentration of the adsorbent may be set correspondingly higher.
- the method according to the invention can be used for all known depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxides.
- they are depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide with cationic layer structure and exchangeable anions in the intermediate layers, as in DE 10 2008 037 678 A1 and in "Catalysis Today" 1991, 11 (2), p. 173-201, in particular p. 176 to p. 191, but without being limited to them. That is, the The present invention can be applied to all adsorptive depth filter layers and depth filter layer systems comprising an inorganic layered double hydroxide, especially hydrotalcite.
- the weight ratio of the inorganic layered double hydroxide in the adsorptive depth filter layer is 20% or more, more preferably 30% or more, particularly preferably 35% or more, and most preferably 39% or more.
- Preferred upper limits for the weight fraction of the inorganic layered double hydroxide are 80%, in particular 70%.
- the inorganic layered double hydroxide comprises hydrotalcite.
- the depth filter layers and depth filter layer systems preferably comprise diatomaceous earth as the powdered adsorbent in addition to the cellulose fibers and the inorganic layered double hydroxide.
- diatomaceous earth as the powdered adsorbent in addition to the cellulose fibers and the inorganic layered double hydroxide.
- Particularly preferred here is a mixture of hydrotalcite and diatomaceous earth, in which the weight fraction of hydrotalcite is greater, in particular at least twice as high as that of kieselguhr.
- the depth filter layers and depth filter layer systems comprise, in addition to the cellulose fibers and the inorganic layer double hydroxide, no further powdery adsorbent.
- the method according to the invention exclusively adjuvants are used whose use does not impair the functionality of the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide in most biotechnological applications.
- the adsorbent loading is reversible. Consequently, the method according to the invention can preferably be used as a so-called "pre-use test" before the application of the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide.
- the method according to the invention can also be carried out after the corresponding adsorptive substance separation as a so-called "post-use test".
- the loading of the inorganic ion adsorptive depth filter layer during the process according to the invention results in a loading of the depth filter layer with these inorganic ions, which can be removed again by treatment with, for example, carbonate-containing rinse solution (reload), so that the depth filter layer has its original binding ability for at least 90% of its intended subsequent use and at least 95% in accordance with a preferred embodiment of the reload.
- reload carbonate-containing rinse solution
- the inventive method is characterized in that the breakthrough of the inorganic ions correlates with the ability to retain biomolecules, such as BSA (bovine serum albumin), DNA or MG (intravenous immunoglobulin).
- these biomolecules are biomolecules selected from the group of serum albumins, nucleic acids and immunoglobulins, or combinations thereof. This advantageously allows a prediction of the binding ability be taken against these biomolecules. Since there is a linear correlation between the phosphate breakthrough and the binding capacity for biomolecules, eg BSA, MG and DNA, after the determination of a calibration line based on the experimentally determined value for the phosphate breakthrough, the probable binding ability for the said biomolecules can be predicted with high precision.
- FIG. 1 shows a calibration line for the photometric determination of the phosphate concentration as phosphomolybdenum blue at 820 nm by means of photometer Tecan
- Figure 2 shows the phosphate breakthrough curves on the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide No. 4 when exposed to phosphate ions at a concentration of 1 mmol / l according to Example 2 compared to conventional, commercially available diatomaceous earth depth filter layers,
- Figure 3 shows the phosphate breakthrough curves on depth filter layer systems with various concentrations of inorganic
- FIG. 4 shows the phosphate breakthrough curves on the adsorptive depth filter layer system with inorganic layer double hydroxide No. 4 when exposed to phosphate ions in accordance with Example 2 for various phosphate concentrations in the feed, FIG. 5. the phosphate breakthrough curves for adsorptive depth filter layer systems with different compositions of inorganic layer double hydroxide (Nos. 3 to No. 7) when exposed to phosphate ions at a concentration of 1 mmol / l according to Example 2,
- FIG. 6 shows the correlation of the phosphate loading coefficient Lp h0 sphat and the dynamic binding capacities for BSA, DNS and MG (DBT 50%) for various adsorptive depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide,
- the adsorptive depth filter layers with inorganic layer double hydroxide used were produced according to DE 10 2008 037 678 A1. They differ in the composition of the recipe, ie in the type of hydrotalcite, cellulose and / or kieselguhr, content of hydrotalcite, content of cellulose, and content of diatomaceous earth.
- Table 1 An overview of the composition of the adsorptive depth filter layers with inorganic layer double hydroxide used is shown in Table 1.
- the hydrotalcite type A has a magnesium oxide / alumina ratio of 1.65 and is not calcined.
- the hydrotalcite type B has a magnesium oxide / alumina ratio of 1.72 and is calcined.
- Hydrotalcite type C is chemically identical to type A and differs from type A in particle size.
- the hydrotalcite type A has a d (1, 0) value of 25 pm and type C has a d (1, 0) value of 280 pm.
- the d (1, 0) value is the value in pm at which 100% of the particles of a sample are smaller than the specified d (1, 0) value.
- the d (1, 0) value thus indicates up to which size ranges the largest particles of a sample are present.
- Comparative examples used were the conventional, commercially available deep-bed filter layers S9P from Sartorius Stedim Biotech GmbH and Beco Steril S100 from Begerow, which contain kieselguhr as powdered adsorbents and, as shown in Table 1, in the type and concentration of cellulose and kieselguhr differ.
- Example 1 Determination of the calibration line for the determination of phosphate as phosphomolybdenum blue
- Reagent A Dissolve 5 g of ascorbic acid in 50 ml of water.
- Reagent B 6N sulfuric acid (12 ml of a 98% sulfuric acid are added to 60 ml of water).
- Reagent C Dissolve 1, 25 g of ammonium heptamolybdate in 50 ml of water.
- the phosphate solution according to 1.2 was diluted with TBS buffer from 1.1 according to Table 2 to a standard solution with different phosphate concentrations. Then 1 ml of working solution was added to each 1 ml of this standard solution and mixed thoroughly. The batches were placed in a 70 ° C water bath for 10 minutes. Thereafter, the samples were measured in a spectrophotometer at 820 nm against a reagent blank (1 ml of water + 1 ml of working solution) in a suitable glass cuvette.
- Example 2 Breakthrough curve on a depth filter layer with inorganic layered double hydroxide on exposure to phosphate ions
- Impingement of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide with phosphate solution (5 mmol KH 2 P0 4 solution in 10 mmol TRIS, pH 7.4) at a flow rate of 4 ml / min.
- V D x + (0.03 -
- FIG. 2 shows the course of the phosphate concentration in the course during the loading of the adsorptive depth filter layer system containing inorganic layered double hydroxide, with KH 2 P0 4 - solution in the feed.
- the concentration of phosphate ions in the effluent during the application of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide is initially at zero, in order then to rise sharply upon reaching the saturation of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide.
- the position of the phosphate breakthrough on the x-axis can be detected very accurately on the basis of the occurring phosphate ions in the effluent.
- the depth filter layers of the comparative examples can therefore not be tested for their integrity by the method according to the invention, while depth filter layers with inorganic layered double hydroxide can be reproducibly and reliably tested for their integrity with the method according to the invention.
- Example 3 Breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with different concentrations of inorganic layer double hydroxide upon exposure to phosphate ions
- Adsorptive depth filter layer systems with various concentrations of inorganic layered double hydroxide have been used.
- the procedure was as in Example 2.
- the reaction was carried out with KH 2 PO 4 - solution according to the procedure in Example 2.
- Figure 3 shows the breakthrough curves for adsorptive depth filter layer systems with different concentrations of inorganic layered double hydroxide. It clearly shows that as the concentration of hydrotalcite increases, the position of the phosphate breakthrough shifts toward larger filtrate volumes as a result of their different adsorption capacity. It is further shown that a content of, for example, 39% hydrotalcite allows the testability of the depth filter, compared to the non-integrity testable filter of the comparative examples containing only diatomaceous earth.
- Example 4 Breakthrough curve on an adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide when exposed to phosphate ions with different concentrations in the feed
- the depth filter layer with inorganic layer double hydroxide No. 4 produced according to DE 10 2008 037 678 A1, having the composition shown in Table 1, was used.
- the procedure was carried out according to Example 2.
- the application was carried out with KH 2 P0 - solution with different concentrations, and the process was fractionated in volume units of 1 ml fractionated.
- the phosphate concentration was determined as in Example 1 and plotted as a function of filtrate volume.
- the breakthrough curves are shown in FIG.
- Example 5 Breakthrough curves on various compositions of inorganic layered double hydroxide adsorptive depth filter layer systems upon exposure to phosphate ions
- Various variants of inorganic layered double hydroxide adsorptive depth filter layer systems were used, differing in the components and their composition shown in Table 1.
- FIG. 5 shows the breakthrough curves for various compositions of adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide.
- the depth filter layer systems differ in the nature and composition of the hydrotalcites and cellulose and are characterized by the location of their phosphate breakthrough as a result of their different adsorption capacity.
- Example 6 Dynamic Protein Binding To determine the dynamic binding capacities of the depth filter layers, diecuts having a diameter of 47 mm and an effective filter area of 13.2 cm 2 are wetted with 10 ml of RO water, poured into a stainless steel filter. tion housing (Sartorius Stedim Biotech GmbH) and pre-rinsed with 100 ml of TBS (according to Example 1) at 4 ml / min and then with a Protein
- the extinctions of the filtrate are recorded in an online photometer at a wavelength of a) 280 nm for BSA, b) 260 nm for DNA and c) 280 nm for IVIG in fractions, and the concentration of the respective test substance is determined by means of standard series ,
- the extinction of the filtrate is divided by the extinction of the test solution used and this value is plotted against the filtration volume. Breakthrough curves are evaluated by determining the 50% dynamic breakthrough (DBT, Dynamic Breakthrough) and the cumulative binding over the entire filtration process. The results are shown in Table 3 and FIG.
- Table 4 shows that rinsing with a carbonate-free buffer solution results in a 60% recovery of BSA binding ability.
- Rinsing with carbonate-containing buffer solution and subsequent rinsing with carbonate-free buffer solution improve the regeneration of BSA binding ability to 65%.
- regeneration of BSA binding ability increases from 80% at 50 mmol / L to 91% at 500 mmol / L.
- an improvement in the regeneration of the BSA binding ability is achieved to 96% by using the depth filter with two portions of 25 ml of non-buffered carbonate (500 mmol / l) is applied, with an exposure time of 30 minutes between the two portions.
- the inventive method thus allows a simple, inexpensive and almost quantitative regeneration of the depth filter for the intended subsequent use for the adsorption of biomolecules.
- a filter punching ring with a diameter of 47 mm and an effective filter area of 13.2 cm 2 while still wetted in a stainless steel filtration housing (Fa Sartorius Stedim Biotech GmbH) or left directly after the previous phosphate test.
- the reload is carried out by rinsing with 2 ⁇ 25 ml of a 500 mmol / l potassium carbonate solution at a flow rate of 5 ml / min, the flow rate being between 0 ml for the first 25 ml flush volume and the second 25 ml flush volume for 30 min / min is set and then rinsed with 100 ml of TBS (according to Example 1) at a flow rate of 5 ml / min.
- TBS accordinging to Example 1
- the BSA binding capacity of the phosphate test treated depth filter is 96% that of BSA binding ability of an untreated depth filter die (see Table 4).
- a diecut of a 47 mm diameter adsorptive depth filter layer system with 14 mm diameter inorganic layer double hydroxide and an effective filter area of 13.2 cm 2 is provided in the dry state with a single hole by means of a stainless steel needle in the middle of the filter diecut. Were Needles with a diameter of 200 m or 400 pm used.
- the further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG. Example 10 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide on exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects
- a diecut of an adsorptive 47 mm diameter inorganic layered double hydroxide adsorbent layer system with 13.2 cm 2 effective filter area is wetted with 10 ml of RO water and 400 ⁇ m diameter stainless steel needle in the center of the single hole filter diecut Mistake.
- the further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2.
- the breakthrough curve is shown in FIG.
- Example 11 Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide upon exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects
- a diecut of an adsorptive depth filter layer system with 47 mm diameter inorganic layered double hydroxide and an effective filter area of 13.2 cm 2 is provided with a kink in the dry state, with the depth filter layer breaking at the surfaces.
- the further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2.
- the breakthrough curve is shown in FIG.
- Example 12 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide upon exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects The surface of a diecut of a 47 mm diameter, 0.37 mm thick, and 13.2 cm 2 effective filter surface adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide is destroyed in the dry state on the upstream side. For this purpose, about the upper half of the material was removed from the depth filter material in a dry state over the entire Anström measurements about using tweezers. A complete physical breakthrough through the entire depth filter layer thickness was avoided. The further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG.
- FIG. 7 illustrates that due to the high sensitivity of the method according to the invention even small defects in the filter can be detected very well because the position of the breakdown point is very sensitive to the presence of defects.
Abstract
The present invention relates to a method for determining the functionality and integrity of depth filter layers and depth filter layer systems with an inorganic layered double hydroxide for removing contaminants in bioengineering processes.
Description
Integritäts- und Funktionalitätstest für adsorptive Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Integrity and functionality test for adsorptive depth filter layers with inorganic layered double hydroxide
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität und Integrität von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid für die Kontaminantenentfernung in biotechnologischen Prozessen. The present invention relates to a method for determining the functionality and integrity of depth layer and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide for contaminant removal in biotechnological processes.
Der vorliegenden Erfindung liegen die im Folgenden beschriebenen Begriffs- bestimmungen zugrunde. Unter "adsorptiver Stofftrennung" wird die Abtrennung einer oder mehrerer Komponenten aus einer fluiden Phase durch selektive Adsorption dieser Komponente(n) an einer festen Phase, dem "Adsorbens" (Plural "Adsorbentien") verstanden. Das Feld der Erfindung betrifft im Allgemeinen die Stofftrennung in Flüssigkeiten, wobei die Flüssigkeit im Folgenden "Medium" genannt wird. Adsorbentien sind poröse Feststoffe, die über funktionelle Oberflächengruppen, welche "Liganden" genannt werden, mit bestimmten Komponenten von Fluiden selektiv Bindungen eingehen können. Neben den seit langem bekannten "partikulären Adsorbentien", auch Chromatographiegele genannt, haben sich weitere "nichtpartikuläre Adsorbentien" etabliert, welche auf einer gänzlich anders gearteten Matrix beruhen. Es handelt sich hierbei um sogenannte monolithische Adsorbentien aus einem dreidimensionalen porösen Festkörper oder Träger auf der Basis von mikroporösen Membranen aus diversen Polymeren. Als Adsorptionsmembranen werden flächige Adsorbentien mit von der einen Seite zur anderen durchgehenden Poren bezeichnet. The present invention is based on the definitions described below. By "adsorptive material separation" is meant the separation of one or more components from a fluid phase by selective adsorption of this component (s) on a solid phase, the "adsorbent" (plural "adsorbents"). The field of the invention generally relates to the separation of substances in liquids, the liquid being referred to below as "medium". Adsorbents are porous solids which, via functional surface groups called "ligands", can selectively bond with certain components of fluids. In addition to the well-known "particulate adsorbents", also called Chromatographiegele, more "nonparticular adsorbents" have been established, which are based on a completely different type of matrix. These are so-called monolithic adsorbents of a three-dimensional porous solid or carrier based on microporous membranes of various polymers. As Adsorptionsmembranen area adsorbents are referred to from one side to the other through pores.
Zielsubstanz(en) und/oder Kontaminant(en) werden erfindungsgemäß als "Adsor- bend" bezeichnet und im Singular gebraucht, wobei es sich aber auch um mehrere unterschiedliche Substanzen handeln kann. Unter der "Kapazität" eines Adsorbens versteht man ein quantitatives Maß für sein Aufnahmevermögen für Adsorbend. Die Kapazität wird auf eine festgelegte Menge Adsorbens bezogen. Target substance (s) and / or contaminant (s) are referred to as "adsorbent" according to the invention and used in the singular, although it may also be a number of different substances. By the "capacity" of an adsorbent is meant a quantitative measure of its adsorptive capacity. The capacity is related to a fixed amount of adsorbent.
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischen Schichtdoppelhydroxiden, wie
beispielsweise in DE 10 2008 037 678 A1 beschrieben, welche zur Kontami- nantenentfernung in biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden. Dabei werden diese Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischen Schichtdoppelhydroxiden zur Abtrennung unerwünschter biologischer Komponenten, wie z.B. Nukleinsäuren, Zellproteine, Viren oder Endotoxine, aus Prozesslösungen als Filtrationsmedium eingesetzt, wobei die unerwünschten biologischen Komponenten an dem Tiefenfilter adsorptiv gebunden werden, während die erwünschten Zielprodukte, wie beispielsweise Antikörper, Hormone, Enzyme, (Poly)Peptide und insbesondere therapeutische Proteine den Tiefenfilter ungehindert passieren können. The present invention relates to the technical field of depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxides, such as For example, in DE 10 2008 037 678 A1 described which are used for contaminants removal in biotechnological processes. In this case, these depth filter layers and depth filter layer systems are used with inorganic layered double hydroxides for separating unwanted biological components, such as nucleic acids, cell proteins, viruses or endotoxins, from process solutions as filtration medium, wherein the unwanted biological components are adsorptively bound to the depth filter, while the desired target products, such as Antibodies, hormones, enzymes, (poly) peptides and especially therapeutic proteins can pass through the depth filter unhindered.
Unter Nukleinsäuren sollen hierbei alle natürlich vorkommenden Nukleinsäuren wie Ribonukleinsäure (RNS) und Desoxyribonukleinsäure (DNS), insbesondere DNS genomischen aber auch epigenomischen Ursprungs aus eukaryotischen, prokaryotischen und viralen Quellen, und ganz besonders Nukleinsäuren mit einer Kettenlänge von mehr als 15 Basenpaaren verstanden werden. Nucleic acids are to be understood here as meaning all naturally occurring nucleic acids, such as ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA), in particular of genomic but also epigenomic origin from eukaryotic, prokaryotic and viral sources, and in particular nucleic acids having a chain length of more than 15 base pairs.
Diese Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischen Schichtdoppelhydroxiden zeichnen sich durch eine hohe Fähigkeit zur Abreicherung von DNS und anderen Kontaminanten bei gleichzeitig niedriger Menge an extrahierbaren Bestandteilen aus dem Filtermaterial aus, so dass sie für den Einsatz vor und nach dem chromatographischen Prozessschritt im Downstream-Prozess geeignet sind. Der Durchbruch von Kontaminanten ist ein kritischer Faktor in validierten biopharmazeutischen Prozessen. Der Einsatz von Tiefenfiltern und Tiefenfiltersystemen zur Kontaminantenentfernung erfordert eine Möglichkeit, die Qualität des Filters zu prüfen und eine Vorhersage über die Bindungsfähigkeit und die Unversehrtheit der Tiefenfilter und Tiefenfiltersysteme treffen zu können. Durch die neuartigen Eigenschaften von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilter- schichtsystemen und die dadurch bedingten neuen Einsatzgebiete zur Kontaminantenentfernung im Downstream-Prozess ist es notwendig, die Tiefenfilterschichten und Tiefenfiltersysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid
vor ihrem Einsatz hinsichtlich ihrer Integrität und Funktionalität zu testen. Die Weiterentwicklung von Tiefenfilterschichten für die kritischen Anwendungen erfordert auch die Weiterentwicklung der Testmöglichkeiten dieser neuen Eigenschaften. These multilayered inorganic layered depth-filter layers and depth-filter layer systems are characterized by a high ability to deplete DNA and other contaminants while having low extractables from the filter material, making them suitable for use before and after the downstream process chromatographic process step , The breakthrough of contaminants is a critical factor in validated biopharmaceutical processes. The use of depth filters and depth filter systems for contaminant removal requires a way to test the quality of the filter and make a prediction of the binding ability and integrity of the depth filters and depth filter systems. Due to the novel properties of depth filter layers and depth filter layer systems and the consequent new fields of application for contaminant removal in the downstream process, it is necessary to use the depth filter layers and depth filter systems with inorganic layered double hydroxide before their use in terms of their integrity and functionality. The further development of depth filter layers for critical applications also requires further development of the test capabilities of these new features.
Bisher werden herkömmliche Tiefenfilter und Tiefenfiltersysteme in biopharmazeutischen Prozessen zur Abtrennung von Partikeln eingesetzt, insbesondere bei der Aufreinigung von Zellkulturlösungen zur Abtrennung von Zellen und Zellbestandteilen. Eine Qualifizierung der Filter erfolgt dabei über die Prüfung der Filterdicken und Wasserflussraten. Eine zusätzliche Integritätsprüfung ist für diese unkritischen Anwendungen nicht notwendig. Conventional depth filters and depth filter systems have hitherto been used in biopharmaceutical processes for separating particles, in particular in the purification of cell culture solutions for the separation of cells and cell components. Qualification of the filters is carried out by checking the filter thicknesses and water flow rates. An additional integrity check is not necessary for these non-critical applications.
JP 3233357 B2 offenbart einen Integritätstest für Tiefenfilter, bei welchem dieser einem Diffusionstest bei 0,2 bar unterzogen wird. Mit diesem Integritätstest sind nur sehr große Defekte oberhalb eines "Bubble-Poinf-Wertes von 0,2 bar feststellbar. Bei dem aus JP 3233357 B2 bekannten Integritätstest besteht außerdem keine Korrelation zwischen dem Ergebnis des Integritätstests und der Bindungsfähigkeit des Tiefenfilters für Biomoleküle. JP 3371366 B2 offenbart ein ähnliches Integritätstestverfahren wie das vorgenannte Dokument, bei welchem mit Wasser benetzte Tiefenfilter einem Gaspermeabilitätstest in der Nähe des "Bubble-Poinf-Wertes unterzogen werden. JP 3233357 B2 discloses an integrity test for depth filters in which it is subjected to a diffusion test at 0.2 bar. With this integrity test, only very large defects above a Bubble-Poinf value of 0.2 bar are detectable.Furthermore, in the integrity test known from JP 3233357 B2, there is no correlation between the result of the integrity test and the binding capability of the depth filter for biomolecules JP 3371366 B2 discloses a similar integrity test method as the aforementioned document in which water-wetted depth filters are subjected to a gas permeability test in the vicinity of the Bubble Poinf value.
Zur Kontaminantenentfernung werden auch nichtpartikuläre Adsorber, wie z.B. der Membranadsorber Sartobind® Q der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH, eingesetzt. Zur Qualifizierung dieser nichtpartikulären Adsorber ist vom Anmelder in DE 10 2010 004 188 A1 ein Verfahren offenbart, bei dem der nichtpartikuläre lonenaustauscher-Adsorber a) im Falle eines Anionenaustauschers mit Lauge beaufschlagt wird bzw. im Falle eines Kationenaustauschers mit Säure beaufschlagt wird, b) mit Wasser gespült wird, c) mit einem flüssigen Ionen enthaltenden Medium unter Detektion der Konzentration der durchgebrochenen Ionen mittels einer ionensensitiven Sonde beaufschlagt wird und d) das in c)
detektierte Konzentrationsprofil mit demjenigen eines nichtpartikulären lonenaustauscher-Adsorbers bekannter Integrität verglichen wird. For contaminant removal are also non-particulate adsorber, such as the membrane adsorber Sartobind® ® Q the company. Sartorius Stedim Biotech GmbH used. For the qualification of these non-particulate adsorbers the applicant in DE 10 2010 004 188 A1 discloses a method in which the non-particulate ion exchanger adsorber a) is treated in the case of an anion exchanger with acid or in the case of a cation exchanger is charged with acid, b) with Water is rinsed, c) a medium containing liquid ions is detected by detecting the concentration of the erupted ions by means of an ion-sensitive probe and d) that in c) Detected concentration profile is compared with that of a non-particulate ion exchange adsorber known integrity.
In DE 10 2010 004 190 A1 ist vom Anmelder ein weiteres Verfahren offenbart, bei dem ein nichtpartikulärer Adsorber (Membranadsorber) mit einem Adsorbenden unter Bedingungen beladen wird, unter denen der Adsorbend vom nichtpartikulären Adsorber (Membranadsorber) zurückgehalten wird, der Durchbruch des Adsorbenden, z.B. von Phosphationen, mittels Sekundärreaktion mit sehr hoher Genauigkeit detektiert wird und die Durchbruchscharakteristik der Phosphationen mit derjenigen eines nichtpartikulären Adsorbers bekannter Integrität verglichen wird. DE 10 2010 004 190 A1 discloses another process by the applicant in which a non-particulate adsorber (membrane adsorber) is charged with an adsorbent under conditions in which the adsorbent is retained by the non-particulate adsorber (membrane adsorber), the adsorbent breakthrough, e.g. of phosphate ions, is detected by secondary reaction with very high accuracy, and the breakdown characteristic of the phosphate ions is compared with that of a non-particulate adsorber of known integrity.
Beiden vom Anmelder offenbarten Verfahren liegt zugrunde, dass bei der Beaufschlagung des Membranadsorbers mit einem flüssigen, Ionen enthaltenden Medium diese Ionen bis zum Erreichen des Durchbruchvolumens vollständig zurückgehalten werden und erst nach Erreichen des Durchbruchvolumens die überschüssigen Ionen im Filtrat in geeigneter Weise detektiert werden. Die Anbindung der Ionen an die Matrix des Membranadsorbers erfolgt dabei an die poröse Struktur. Basis bildet eine Mikrofiltrationsmembran mit ihrer Vielzahl von Poren mit einer relativ engen Porengrößenverteilung mit einer minimalen und einer maximalen Porengröße. An der Oberfläche dieser Poren sind funktionelle Gruppen chemisch gebunden. Durch die Wechselwirkung mit diesen funktionellen Gruppen werden die Adsorbenden beim Durchströmen durch die Membran adsorptiv gebunden. Both methods disclosed by the Applicant are based on the fact that when the membrane adsorber is charged with a liquid medium containing ions, these ions are completely retained until the breakthrough volume is reached and the excess ions in the filtrate are detected in a suitable manner only after reaching the breakthrough volume. The attachment of the ions to the matrix of the membrane adsorber takes place on the porous structure. The basis is a microfiltration membrane with its large number of pores with a relatively narrow pore size distribution with a minimum and a maximum pore size. At the surface of these pores, functional groups are chemically bound. By interacting with these functional groups, the adsorbents are adsorbed when flowing through the membrane.
Diese vom Anmelder offenbarten Verfahren sind für Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme generell nicht geeignet, da sofort ein Durchbruch des flüssige Ionen enthaltenden Mediums erfolgt, was angesichts der typischen Struktur eines Tiefenfilters zu erwarten ist. Tiefenfilterschichten haben eine gänzlich andere Struktur als Membranadsorber. Sie bestehen aus einer Schicht von unregelmäßig aufeinander liegenden Cellulosefasern und pulverförmigen Adsorbentien, welche durch ein Bindemittel an die Cellulosefasern angebunden sind. Tiefenfilter haben eine breite Porenverteilung ohne Ausschluss einer
minimalen und maximalen Porengröße. Dadurch weisen Tiefenfilter generell keine absolute Trenngrenze auf. Die Porenform und Verteilung ist bei einem Tiefenfilter aufgrund der Faserstruktur unregelmäßig und nicht eindeutig definiert. Daher sind in einem Tiefenfilter die Dichte und Verteilung der adsorbierenden Partikel sowie ihre Bindungsstellen unregelmäßiger als bei einem Membranadsorber. These methods disclosed by the Applicant are generally not suitable for depth filter layers and depth filter layer systems, as there is immediate breakthrough of the liquid ion-containing medium, which is expected in view of the typical structure of a depth filter. Depth filter layers have a completely different structure than membrane adsorbers. They consist of a layer of irregular cellulose fibers and powdered adsorbents, which are bound by a binder to the cellulose fibers. Depth filters have a wide pore distribution without exclusion minimum and maximum pore size. As a result, depth filters generally have no absolute separation limit. The pore shape and distribution of a depth filter due to the fiber structure is irregular and not clearly defined. Therefore, in a depth filter, the density and distribution of the adsorbent particles and their binding sites are more irregular than in a membrane adsorber.
Bei der Beaufschlagung eines Tiefenfilters mit Ionen enthaltenden Medien werden diese Ionen generell abgereichert, aber nicht vollständig zurückgehalten. So zeigt die Beaufschlagung von herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen, welche Kieselgur als pulverförmige Adsorbentien enthalten, wie beispielsweise S9P der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH oder Beco Steril S100 der Fa. Begerow, bei Beaufschlagung mit Ionen gemäß DE 10 2010 004 188 A1 oder DE 10 2010 004 190 A1 einen sofortigen Durchbruch der beschriebenen Ionen und Adsorbenden. Folglich sind diese vom Anmelder beschriebenen Integritätstestverfahren für die Qualifizierung von nichtpartikulären Adsorbentien für die Bestimmung der Integrität und Funktionalität, d.h. der Überprüfung der Qualität, insbesondere der Unversehrtheit des Filters sowie das Treffen einer Vorhersage über die Bindungsfähigkeit, von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen nicht geeignet. Upon exposure to a depth filter containing media containing ions, these ions are generally depleted, but not completely retained. Thus, the exposure of conventional, commercially available depth filter layers and depth filter layer systems which contain diatomaceous earth as powdered adsorbents, such as S9P Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH or Beco Steril S100 Fa. Begerow, when exposed to ions according to DE 10 2010 004 188 A1 or DE 10 2010 004 190 A1 an immediate breakthrough of the described ions and Adsorbenden. Thus, these integrity testing procedures described by the Applicant for the qualification of non-particulate adsorbents for the determination of integrity and functionality, i. checking the quality, in particular the integrity of the filter as well as making a prediction about the binding ability, of depth filter layers and depth filter layer systems unsuitable.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Qualifizierungsmethode für adsorptive Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bereitzustellen, welche eine hochempfindliche, robuste, einfache, nicht-destruktive Prüfung von Filtern und Filterelementen hinsichtlich ihrer Integrität und Funktionalität ermöglicht. Vorzugsweise sollen für die Qualifizierung Hilfsmittel verwendet werden, die keine Beeinträchtigung der Funktion des Tiefenfilters oder der Produktqualität bedeuten. It is an object of the present invention to provide a method of qualification for adsorptive depth filter layers and inorganic layered double hydroxide depth filter layer systems which enables a highly sensitive, robust, simple, nondestructive testing of filters and filter elements for integrity and functionality. Preferably, aids should be used for the qualification which do not impair the function of the depth filter or the product quality.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Integrität und Funktionalität adsorptiver Tiefenfilterschichten und
Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid nach Anspruch 1 gelöst. This object is achieved by providing a method for determining the integrity and functionality of adsorptive depth filter layers and Depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide according to claim 1.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, mit welchem die Funktionalität und die Integrität von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilter- schichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid in ihrer Anwendung zur Rückhaltung von Kontaminanten, wie z.B. Nukleinsäuren, Zellproteinen, Viren oder Endotoxinen, getestet werden kann. Das Verfahren zur Bestimmung der Integrität und Funktionalität von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischen Schichtdoppel- hydroxiden umfasst gemäß der vorliegenden Erfindung die Schritte des In particular, the present invention provides a process by which the functionality and integrity of layered depth filter sheets and inorganic layered double-layered depth-filter-layered systems in their use for the retention of contaminants, e.g. Nucleic acids, cell proteins, viruses or endotoxins, can be tested. The method for determining the integrity and functionality of depth layer and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxides according to the present invention comprises the steps of
Beiadens der Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit einem Adsorbenden, umfassend anorganische Anionen, unter Bedingungen, unter denen der Adsorbend von der adsorptiven Tiefenfilterschicht bis zum Erreichen des Durchbruchvolumens vollständig zurückgehalten wird, Loading said inorganic layered double hydroxide depth filter layer with an adsorbent comprising inorganic anions under conditions in which the adsorbent from the adsorptive depth filter layer is completely retained until the breakthrough volume is reached,
Detektierens des durchgebrochenen Adsorbenden mittels Sekundärreaktion, wobei der negative dekadische Logarithmus der detektierten Grenzkonzentration pD > 4 beträgt, und Detecting the erupted adsorbent by secondary reaction, wherein the negative decadic logarithm of the detected limit concentration is pD> 4, and
- Vergleichens der Durchbruchscharakteristik mit derjenigen einer adsorptiven Tiefenfilterschicht bekannter Integrität. Comparing the breakdown characteristic with that of an adsorptive depth filter layer of known integrity.
Erfindungsgemäß werden "unter Bedingungen, unter denen der Adsorbend von der adsorptiven Tiefenfilterschicht bis zum Erreichen des Durchbruchsvolumens vollständig zurückgehalten wird" Bedingungen verstanden, unter denen die Tiefenfilterschicht mit einer phosphatfreien Pufferlösung im Bereich eines pH- Werts von 5 bis 14 vorbehandelt wird. According to the invention, "conditions under which the adsorbent is completely retained by the adsorptive depth filter layer until the breakthrough volume is reached" mean conditions under which the depth filter layer is pretreated with a phosphate-free buffer solution in the range of pH 5 to 14.
Erfindungsgemäß lassen sich mit diesem Verfahren Fehlstellen und Defekte in Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit sehr hoher Präzision und Empfindlichkeit detektieren. Damit einhergehend lässt sich vorteilhafterweise mit diesem Verfahren die Rückhalte-
fähigkeit für Kontaminanten, wie z.B. Viren, Nukleinsäuren, Zellproteine und Endotoxinen, prüfen. According to the invention, defects and defects in depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide can be detected with very high precision and sensitivity with this method. Along with this, the retention ability to detect contaminants such as viruses, nucleic acids, cell proteins and endotoxins.
Die Empfindlichkeit eines analytischen Nachweises kann durch die Grenz- konzentration bzw. den pD-Wert beschrieben werden. Der Begriff Grenzkonzentration bezeichnet diejenige Konzentration in g/ml eines nachzuweisenden Stoffes, bei welcher der Nachweis noch positiv ist. Vereinfacht wird anstelle der Grenzkonzentration der pD-Wert eingeführt, der als negativ dekadischer Logarithmus der Grenzkonzentration definiert ist. The sensitivity of an analytical detection can be described by the limit concentration or the pD value. The term limiting concentration refers to that concentration in g / ml of a substance to be detected, in which the detection is still positive. Simplified, instead of the limiting concentration, the pD value is introduced, which is defined as the negative decadic logarithm of the limiting concentration.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt der negative dekadische Logarithmus der detektierten Grenzkonzentration pD > 4, bevorzugt pD > 5, mehr bevorzugt pD > 6. Erfindungsgemäß eignet sich jegliche Sekundärreaktion, mit der sich eine entsprechende Nachweisempfindlichkeit für den durchgebrochenen Adsorbenden bzw. Teile davon auf die vorstehend beschriebene detektierbare Grenzkonzentration anheben lässt. Beispiele hierfür sind Komplexbildungen mit Fällungsreaktion oder mit Farbreaktion, wobei eine Farbreaktion bevorzugt ist. According to the present invention, the negative decadic logarithm of the detected limit concentration is pD> 4, preferably pD> 5, more preferably pD> 6. According to the invention, any secondary reaction with which a corresponding detection sensitivity for the erupted adsorbent or parts thereof to the above raise the detectable limit concentration described. Examples of these are complex formations with precipitation reaction or with color reaction, a color reaction being preferred.
Es wurde gemäß der vorliegenden Erfindung überraschender- und vorteilhafterweise gefunden, dass bei der Beaufschlagung einer intakten Tiefenfilterschicht und eines Tiefenfilterschichtsystems, welche jeweils ein anorganisches Schichtdoppelhydroxid umfassen, mit anorganischen Anionen, entgegen der vorstehend beschriebenen Erwartung, wonach ein sofortiger Durchbruch des die Ionen enthaltenden Mediums erfolgen sollte, diese zunächst bis zum Erreichen des Durchbruchvolumens von den Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischen Schichtdoppelhydroxiden vollständig adsorbiert und zurückgehalten werden. Bei einer Beschädigung und/oder einem Fehler in der Herstellung einer adsorptiven Tiefenfilterschicht verschiebt sich der Durchbruch und dessen Charakteristik dergestalt, dass dieser früher erfolgt, da die Rückhaltefähigkeit der Tiefenfilterschicht beeinträchtigt ist
und somit mehr Adsorbend im Vergleich zu einer intakten adsorptiven Tiefenfilterschicht durchbrechen kann. It has surprisingly and advantageously been found according to the present invention that when an intact depth filter layer and a depth filter layer system each comprise an inorganic layer double hydroxide with inorganic anions, contrary to the expectation described above, an immediate breakdown of the medium containing the ions occurs should first be fully adsorbed and retained by the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxides until breakthrough volume is achieved. In the event of damage and / or failure in the production of an adsorptive depth filter layer, the breakthrough and its characteristics shifts to earlier, because the retention capability of the depth filter layer is compromised and thus can break more adsorbent compared to an intact adsorptive depth filter layer.
Da beim Vorhandensein eines Defekts in dem Tiefenfilterschichtsystem mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid der Durchbruch des Adsorbenden vorzeitig erfolgt und sich deutlich von dem Durchbruch eines intakten Tiefenfilter- schichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid unterscheidet, lässt sich vorteilhafterweise eine Vorhersage über die Unversehrtheit des Tiefenfilters treffen. Überraschender- und vorteilhafterweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung aufgrund der Empfindlichkeit des Verfahrens auch bei nur geringer Beeinträchtigung der adsorptiven Tiefenfilterschicht diese detektiert werden. Since, in the presence of a defect in the inorganic layered double hydroxide depth filter layer system, the adsorbent breakthrough occurs prematurely and differs significantly from the breakthrough of an intact layered double layered depth filter layer system, a prediction of the integrity of the depth filter can advantageously be made. Surprisingly and advantageously, according to the present invention, due to the sensitivity of the method, even with only slight impairment of the adsorptive depth filter layer, these can be detected.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die anorganischen Anionen Phosphationen, die aus der Gruppe der Sauerstoff- säuren des Phosphors ausgewählt sind. Dabei erfolgt das Beladen der Tiefenfilterschicht mit den Phosphationen vorzugsweise in Form ihrer wasserlöslichen Metallsalze. Für den bevorzugten Fall, dass die Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit Phosphationen beladen werden, kann der Nachweis der Phosphationen im Filtrat vorzugsweise in Form eines Phosphormolybdänblau-Komplexes erfolgen, wie in C. H. Fiske et al., J. Biol. Chem. 66, (1925) 375-400 beschrieben. Dabei wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bei intakten Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid vor dem Erreichen des Durchbruchs im Filtrat trotz der hohen analytischen Empfindlichkeit dieses Nachweises überraschenderweise kein Phosphat nachgewiesen. According to a preferred embodiment of the present invention, the inorganic anions comprise phosphate ions selected from the group of oxygen acids of phosphorus. The loading of the depth filter layer with the phosphate ions preferably takes place in the form of their water-soluble metal salts. For the preferred case that the layered inorganic layered double hydroxide depth filter layers and depth filter layer systems are loaded with phosphate ions, the detection of phosphate ion in the filtrate may preferably be in the form of a phosphomolybdenum blue complex, as described in CH Fiske et al., J. Biol. Chem. (1925) 375-400. In the process according to the invention, surprisingly, no phosphate is detected in intact depth filter layers with inorganic layered double hydroxide before reaching the breakthrough in the filtrate despite the high analytical sensitivity of this detection.
Der in dieser Erfindung beschriebene Phosphatnachweis als Phosphormolybdänblau weist für Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) mit der Molmasse von 136,09 g/mol eine Grenzkonzentration von 1 nmol/ml bzw. 1 ,36 x 10"7g/ml auf und entspricht einem pD von 6,9. Damit ist die Empfindlichkeit dieses Nachweises um mehrere Größenordnungen höher gegenüber den meisten bekannten Verfahren.
ln dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid vorzugsweise mit Phosphationen in einem Konzentrationsbereich von 0,5 mmol/1 bis 50 mmol/1 durchströmt und deren Konzentration im aufgefangenen Filtrat wie vorstehend beschrieben bestimmt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die lonenkonzentration im Adsorbenden 1 ,0 mmol/l oder mehr, und besonders bevorzugt 1 ,5 mmol/l oder mehr. Die Obergrenze der lonenkonzentration im Adsorbenden beträgt vorzugsweise 40 mmol/l, mehr bevorzugt 30 mmol/l und besonders bevorzugt 20 mmol/l. The phosphate detection described in this invention as the phosphorus molybdenum blue has for potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4) with the molar mass of 136.09 g / mol, a limit concentration of 1 nmol / ml and 1, 36 x 10 "7 g / ml and corresponds to a Thus, the sensitivity of this detection is several orders of magnitude higher than most known methods. In the method according to the invention, the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide are preferably passed through with phosphate ions in a concentration range from 0.5 mmol / 1 to 50 mmol / l and their concentration in the collected filtrate determined as described above. According to a preferred embodiment of the present invention, the ion concentration in the adsorbent is 1.0 mmol / l or more, and more preferably 1.5 mmol / l or more. The upper limit of the ion concentration in the adsorbent is preferably 40 mmol / l, more preferably 30 mmol / l, and particularly preferably 20 mmol / l.
Wie im Weiteren noch genauer beschrieben wird, wird das Durchbruchsvolumen, abgesehen von der Unversehrtheit der zu testenden Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid, von der lonenkonzentration des Adsorbenden und der Adsorptionsfähigkeit der Tiefenfilterschicht, die in Korrelation mit der Konzentration an anorganischem Schichtdoppelhydroxid steht, bestimmt. Um eine zuverlässige Bestimmung der Integrität und Funktionalität von Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid zu gewährleisten, sollten die vorstehenden Faktoren derart gewählt werden, dass das Durchbruchsvolumen bei intakten Tiefenfilterschichten ausreichend groß ist, um eine präzise Aussage über Defekte und Fehlstellen treffen zu können. Das heißt, bei Tiefenfilterschichten mit einem relativen kleinen Anteil an anorganischem Schichtdoppelhydroxid sollte die lonenkonzentration des Adsorbenden entsprechend geringer und bei Tiefenfilterschichten mit einem relativen großen Anteil an anorganischem Schichtdoppelhydroxid kann die lonenkonzentration des Adsorbenden entsprechend höher gewählt werden. As will be described in more detail below, the breakthrough volume, apart from the integrity of the inorganic layered double hydroxide depth filter layer to be tested, is determined from the ion concentration of the adsorbent and the adsorbability of the depth filter layer, which is correlated with the concentration of inorganic layered double hydroxide. In order to ensure a reliable determination of the integrity and functionality of depth layer and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide, the above factors should be chosen such that the breakthrough volume of intact depth filter layers is sufficiently large in order to make a precise statement about defects and defects. That is, in depth filter layers having a relatively small amount of inorganic layer double hydroxide, the ion concentration of the adsorbent should be correspondingly lower, and in depth filter layers having a relatively large proportion of inorganic layer double hydroxide, the ion concentration of the adsorbent may be set correspondingly higher.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für alle bekannten Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischen Schichtdoppelhydroxiden verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich um Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit kationischer Schichtstruktur und austauschbaren Anionen in den Zwischenschichten, wie in DE 10 2008 037 678 A1 und in "Catalysis Today" 1991 , 11 (2), S. 173-201 , insbesondere S. 176 bis S. 191 , beschrieben, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Das heißt, die
vorliegende Erfindung kann auf alle adsorptiven Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme angewendet werden, welche ein anorganisches Schichtdoppelhydroxid, insbesondere Hydrotalcit, umfassen. Mit zunehmender Konzentration bzw. Gewichtsanteilen des anorganischen Schichtdoppelhydroxids in der adsorptiven Tiefenfilterschicht verschiebt sich die Lage des lonendurchbruchs aufgrund unterschiedlicher Adsorptionsfähigkeit hin zu größeren Filtratvolumina. Dies ist für eine zuverlässige Bestimmung der Integrität und Funktionalität von Tiefenfilterschichten von Vorteil, da diesbezüglich eine genauere Aussage getroffen werden kann, ob beispielsweise ein Defekt in der Tiefenfilterschicht vorliegt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt der Gewichtsanteil des anorganischen Schichtdoppelhydroxids in der adsorptiven Tiefenfilterschicht 20 % oder mehr, mehr bevorzugt 30 % oder mehr, besonders bevorzugt 35 % oder mehr und am meisten bevorzugt 39 % oder mehr. Bevorzugte Obergrenzen für den Gewichtsanteil des anorganischen Schichtdoppelhydroxids sind 80 %, insbesondere 70 %. The method according to the invention can be used for all known depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxides. Preferably, they are depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide with cationic layer structure and exchangeable anions in the intermediate layers, as in DE 10 2008 037 678 A1 and in "Catalysis Today" 1991, 11 (2), p. 173-201, in particular p. 176 to p. 191, but without being limited to them. That is, the The present invention can be applied to all adsorptive depth filter layers and depth filter layer systems comprising an inorganic layered double hydroxide, especially hydrotalcite. With increasing concentration or weight proportions of the inorganic layered double hydroxide in the adsorptive depth filter layer, the position of the ion breakdown shifts due to different adsorption capacity towards larger filtrate volumes. This is advantageous for a reliable determination of the integrity and functionality of depth filter layers, since in this respect a more accurate statement can be made as to whether, for example, there is a defect in the depth filter layer. According to a preferred embodiment of the present invention, the weight ratio of the inorganic layered double hydroxide in the adsorptive depth filter layer is 20% or more, more preferably 30% or more, particularly preferably 35% or more, and most preferably 39% or more. Preferred upper limits for the weight fraction of the inorganic layered double hydroxide are 80%, in particular 70%.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das anorganische Schichtdoppelhydroxid Hydrotalcit. According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the inorganic layered double hydroxide comprises hydrotalcite.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme neben den Ceilulosefasern und dem anorganischen Schichtdoppelhydroxid vorzugsweise Kieselgur als pulverförmiges Adsorbens. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Mischung aus Hydrotalcit und Kieselgur, bei welcher der Gewichtsanteil von Hydrotalcit größer, insbesondere mindestens doppelt so hoch ist als der von Kieselgur. According to one embodiment of the present invention, the depth filter layers and depth filter layer systems preferably comprise diatomaceous earth as the powdered adsorbent in addition to the cellulose fibers and the inorganic layered double hydroxide. Particularly preferred here is a mixture of hydrotalcite and diatomaceous earth, in which the weight fraction of hydrotalcite is greater, in particular at least twice as high as that of kieselguhr.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme neben den Ceilulosefasern und dem anorganischen Schichtdoppelhydroxid aber kein weiteres pulverförmiges Adsorbens.
Vorteilhafterweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ausschließlich Hilfsmittel verwendet, deren Einsatz die Funktionalität der Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid in den meisten biotechnologischen Anwendungen nicht beeinträchtigt. Dadurch ist es gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung möglich, dass die Beladung mit einem Adsorbend reversibel ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann folglich vorzugsweise als sogenannter "pre-use test" vor der Anwendung der Tiefenfilterschichten und Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid eingesetzt werden. Damit ist gewährleistet, dass die adsorptive Tiefenfilterschicht nach der Qualifizierung zu ihrer entsprechenden Verwendung ohne Leistungseinbußen herangezogen werden kann. Sofern die Tiefenfilterschichten bestimmungsgemäß bereits zur Abtrennung von Kontaminanten, wie beispielsweise DNS, verwendet worden sind und diese Kontaminanten rückstandslos aus den Tiefenfilterschichten entfernt werden können, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch nach der entsprechenden adsorptiven Stofftrennung als sogenannter "post-use test" durchgeführt werden. However, according to a preferred embodiment, the depth filter layers and depth filter layer systems comprise, in addition to the cellulose fibers and the inorganic layer double hydroxide, no further powdery adsorbent. Advantageously, in the method according to the invention exclusively adjuvants are used whose use does not impair the functionality of the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide in most biotechnological applications. Thus, according to a preferred embodiment of the present invention, it is possible that the adsorbent loading is reversible. Consequently, the method according to the invention can preferably be used as a so-called "pre-use test" before the application of the depth filter layers and depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide. This ensures that the adsorptive depth filter layer after qualification can be used for its corresponding use without sacrificing performance. If the depth filter layers have already been used for the purpose of separating contaminants, such as DNA, for example, and these contaminants can be removed without residue from the depth filter layers, the method according to the invention can also be carried out after the corresponding adsorptive substance separation as a so-called "post-use test".
Wie vorstehend beschrieben, führt die Beaufschlagung der adsorptiven Tiefenfilterschicht mit anorganischen Ionen während des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einer Beladung der Tiefenfilterschicht mit diesen anorganischen Ionen, welche durch eine Behandlung mit beispielsweise carbonathaltiger Spüllösung wieder entfernt werden kann (Reload), so dass die Tiefenfilterschicht ihre ursprüngliche Bindungsfähigkeit für eine bestimmungsgemäße nachfolgende Anwendung zu mindestens 90 % und gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Reloads zu mindestens 95 % wieder erlangt. As described above, the loading of the inorganic ion adsorptive depth filter layer during the process according to the invention results in a loading of the depth filter layer with these inorganic ions, which can be removed again by treatment with, for example, carbonate-containing rinse solution (reload), so that the depth filter layer has its original binding ability for at least 90% of its intended subsequent use and at least 95% in accordance with a preferred embodiment of the reload.
Darüber hinaus zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, dass der Durchbruch der anorganischen Ionen mit der Rückhaltefähigkeit gegenüber Biomolekülen, wie z.B. BSA (bovines Serumalbumin), DNS oder MG (intravenöses Immunoglobulin) korreliert. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Biomolekülen um Biomoleküle, die aus der Gruppe der Serumalbumine, Nukleinsäuren und Immunoglobuline oder Kombinationen davon ausgewählt sind. Dadurch kann vorteilhafterweise eine Vorhersage über die Bindungsfähigkeit
gegenüber diesen Biomolekülen getroffen werden. Da eine lineare Korrelation zwischen dem Phosphatdurchbruch und der Bindungsfähigkeit für Biomoleküle, z.B. BSA, MG und DNS, besteht, kann nach der Ermittlung einer Eichgeraden auf Basis des experimentell bestimmten Werts für den Phosphatdurchbruch die voraussichtliche Bindungsfähigkeit für die genannten Biomoleküle mit hoher Präzision vorhergesagt werden. In addition, the inventive method is characterized in that the breakthrough of the inorganic ions correlates with the ability to retain biomolecules, such as BSA (bovine serum albumin), DNA or MG (intravenous immunoglobulin). Preferably, these biomolecules are biomolecules selected from the group of serum albumins, nucleic acids and immunoglobulins, or combinations thereof. This advantageously allows a prediction of the binding ability be taken against these biomolecules. Since there is a linear correlation between the phosphate breakthrough and the binding capacity for biomolecules, eg BSA, MG and DNA, after the determination of a calibration line based on the experimentally determined value for the phosphate breakthrough, the probable binding ability for the said biomolecules can be predicted with high precision.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Ausführungsbeispiele und der Figuren 1 bis 7 näher erläutert. Dabei zeigt The present invention will be explained in more detail with reference to the following embodiments and Figures 1 to 7. It shows
Figur 1 eine Eichgerade zur photometrischen Bestimmung der Phosphatkonzentration als Phosphormolybdänblau bei 820 nm mittels Photometer Tecan, Figur 2 die Phosphat-Durchbruchskurven an dem adsorptiven Tiefenfilter- schichtsystem mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Nr. 4 bei der Beaufschlagung mit Phosphationen bei einer Konzentration von 1 mmol/l gemäß Beispiel 2 im Vergleich zu herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Tiefenfilterschichten mit Kieselgur, 1 shows a calibration line for the photometric determination of the phosphate concentration as phosphomolybdenum blue at 820 nm by means of photometer Tecan, Figure 2 shows the phosphate breakthrough curves on the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide No. 4 when exposed to phosphate ions at a concentration of 1 mmol / l according to Example 2 compared to conventional, commercially available diatomaceous earth depth filter layers,
Figur 3 die Phosphat-Durchbruchskurven an Tiefenfilterschichtsystemen mit verschiedenen Konzentrationen an anorganischemFigure 3 shows the phosphate breakthrough curves on depth filter layer systems with various concentrations of inorganic
Schichtdoppelhydroxid (Nr. 1 bis Nr. 3) bei der Beaufschlagung mit Phosphationen gemäß Beispiel 2 im Vergleich zu herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Tiefenfilterschichten mit Kieselgur, Layered double hydroxide (Nos. 1 to 3) upon exposure to phosphate ions in accordance with Example 2 in comparison with conventional, commercially available diatomaceous earth depth filter layers,
Figur 4 die Phosphat-Durchbruchskurven an dem adsorptiven Tiefenfilter- schichtsystem mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Nr. 4 bei der Beaufschlagung mit Phosphationen gemäß Beispiel 2 für verschiedene Phosphatkonzentrationen im Zulauf,
Figur 5 . die Phosphat-Durchbruchskurven für adsorptive Tiefenfilterschicht- systeme mit verschiedenen Zusammensetzungen an anorganischem Schichtdoppelhydroxid (Nr. 3 bis Nr. 7) bei der Beaufschlagung mit Phosphationen bei einer Konzentration von 1 mmol/l gemäß Beispiel 2, 4 shows the phosphate breakthrough curves on the adsorptive depth filter layer system with inorganic layer double hydroxide No. 4 when exposed to phosphate ions in accordance with Example 2 for various phosphate concentrations in the feed, FIG. 5. the phosphate breakthrough curves for adsorptive depth filter layer systems with different compositions of inorganic layer double hydroxide (Nos. 3 to No. 7) when exposed to phosphate ions at a concentration of 1 mmol / l according to Example 2,
Figur 6 die Korrelation der Phosphatbeladungskennzahl Lph0sphat und den dynamischen Bindungskapazitäten für BSA, DNS und MG (DBT 50%) für verschiedene adsorptive Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid, FIG. 6 shows the correlation of the phosphate loading coefficient Lp h0 sphat and the dynamic binding capacities for BSA, DNS and MG (DBT 50%) for various adsorptive depth filter layer systems with inorganic layer double hydroxide,
Figur 7 die Phosphat-Durchbruchskurven an dem adsorptiven Tiefenfilter- schichtsystem mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Nr. 4 bei der Beaufschlagung mit Phosphationen bei einer Konzentration von 1 mmol/l gemäß Beispiel 2 nach dem Einbringen verschiedener Defekte. 7 shows the phosphate breakthrough curves on the adsorptive depth filter layer system with inorganic layer double hydroxide No. 4 when exposed to phosphate ions at a concentration of 1 mmol / l according to Example 2 after the introduction of various defects.
Filtermaterialien filter materials
Die verwendeten adsorptiven Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid wurden nach DE 10 2008 037 678 A1 hergestellt. Sie unterscheiden sich in der Zusammensetzung der Rezeptur, d.h. im Typ des Hydrotalcits, Cellulose und/oder Kieselgur, Gehalt an Hydrotalcit, Gehalt an Cellulose, sowie Gehalt an Kieselgur. Eine Übersicht über die Zusammensetzung der verwendeten adsorptiven Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid ist in Tabelle 1 dargestellt. Das Hydrotalcit Typ A hat ein Magnesiumoxid/Aluminiumoxid-Verhältnis von 1 ,65 und ist nicht kalziniert. Das Hydrotalcit Typ B hat ein Magnesiumoxid/Aluminiumoxid-Verhältnis von 1 ,72 und ist kalziniert. Das Hydrotalcit Typ C ist mit Typ A chemisch identisch und unterscheidet sich von Typ A in der Korngröße. Das Hydrotalcit Typ A hat einen d(1 ,0)-Wert von 25 pm und Typ C hat einen d(1 ,0)-Wert von 280 pm. Der d(1 ,0)- Wert ist der Wert in pm, bei dem 100 % der Partikel einer Probe kleiner sind als der angegebene d(1 ,0)-Wert. Der d(1 ,0)-Wert gibt somit an, bis in welchen Größenbereichen die größten Partikel einer Probe vorhanden sind.
Als Vergleichsbeispiele wurden die herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Tiefenfilterschichten S9P der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH und Beco Steril S100 der Fa. Begerow eingesetzt, welche Kieselgur als pulverförmige Adsorbentien enthalten und sich, wie in Tabelle 1 gezeigt, in Art und Konzentration an Cellulose und Kieselgur unterscheiden. The adsorptive depth filter layers with inorganic layer double hydroxide used were produced according to DE 10 2008 037 678 A1. They differ in the composition of the recipe, ie in the type of hydrotalcite, cellulose and / or kieselguhr, content of hydrotalcite, content of cellulose, and content of diatomaceous earth. An overview of the composition of the adsorptive depth filter layers with inorganic layer double hydroxide used is shown in Table 1. The hydrotalcite type A has a magnesium oxide / alumina ratio of 1.65 and is not calcined. The hydrotalcite type B has a magnesium oxide / alumina ratio of 1.72 and is calcined. Hydrotalcite type C is chemically identical to type A and differs from type A in particle size. The hydrotalcite type A has a d (1, 0) value of 25 pm and type C has a d (1, 0) value of 280 pm. The d (1, 0) value is the value in pm at which 100% of the particles of a sample are smaller than the specified d (1, 0) value. The d (1, 0) value thus indicates up to which size ranges the largest particles of a sample are present. Comparative examples used were the conventional, commercially available deep-bed filter layers S9P from Sartorius Stedim Biotech GmbH and Beco Steril S100 from Begerow, which contain kieselguhr as powdered adsorbents and, as shown in Table 1, in the type and concentration of cellulose and kieselguhr differ.
Tabelle 1 : Table 1 :
Übersicht über Komponenten und Zusammensetzungen der verwendeten adsorptiven Tiefenfilterschichten. Overview of components and compositions of the adsorptive depth filter layers used.
Beispiel 1 - Bestimmung der Eichgeraden für die Phosphatbestimmung als Phosphormolybdänblau Example 1 - Determination of the calibration line for the determination of phosphate as phosphomolybdenum blue
Es wurden folgende Reagenzien angesetzt: 1 .1 TBS-Puffer The following reagents were used: 1 .1 TBS buffer
10 mmol TBS-Puffer (TRIS-gepufferte Kochsalzlösung), pH 7,4, aus 1 ,21 g Tris- (hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 8,8 g NaCI mit Reverseosmose-Wasser (RO-Wasser) auf 1 I, eingestellt mit HCl auf pH 7,4.
1.2 Phosphatlösung 10 mmol TBS buffer (TRIS-buffered saline), pH 7.4, from 1.21 g tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 8.8 g NaCl with reverse osmosis water (RO water) to 1 l, adjusted to pH 7.4 with HCl. 1.2 phosphate solution
1 mmol PO4 3" - Lösung in 10 mmol TBS aus 0,178 g Na2HP04-2 H20 in 1000 ml TBS-Puffer (aus 1.1 ). 1.3 Nachweisreagenz 1 mmol PO 4 3 "-. Solution in 10 mM TBS from 0.178 g Na 2 HP0 4 -2 H 2 0 in 1000 ml of TBS buffer (from 1.1) 1.3 detection reagent
Reagenz A: 5 g Ascorbinsäure wird in 50 ml Wasser gelöst. Reagent A: Dissolve 5 g of ascorbic acid in 50 ml of water.
Reagenz B: 6N Schwefelsäure (12 ml einer 98%igen Schwefelsäure werden zu 60 ml Wasser gegeben). Reagent B: 6N sulfuric acid (12 ml of a 98% sulfuric acid are added to 60 ml of water).
Reagenz C: 1 ,25 g Ammoniumheptamolybdat werden in 50 ml Wasser gelöst. Reagent C: Dissolve 1, 25 g of ammonium heptamolybdate in 50 ml of water.
Es werden je 50 ml Reagenz A, B und C mit 100 ml RO-Wasser gründlich vermischt. Diese Arbeitslösung wird vor jeder Bestimmungsreihe frisch angesetzt. 50 ml reagents A, B and C are thoroughly mixed with 100 ml RO water. This working solution is freshly prepared before each determination series.
Um eine Konzentrationsreihe zu erhalten, wurde die Phosphatlösung nach 1.2 mit TBS-Puffer aus 1.1 entsprechend Tabelle 2 zu einer Standardlösung mit verschiedenen Phosphatkonzentrationen verdünnt. Anschließend wurde zu jeweils 1 ml dieser Standardlösung 1 ml Arbeitslösung gegeben und gründlich gemischt. Die Ansätze wurden für 10 min in ein Wasserbad mit 70 °C gestellt. Danach wurden die Ansätze in einem Spektralphotometer bei 820 nm gegen einen Reagenzienleerwert (1 ml Wasser + 1 ml Arbeitslösung) in einer geeigneten Glasküvette vermessen. In order to obtain a concentration series, the phosphate solution according to 1.2 was diluted with TBS buffer from 1.1 according to Table 2 to a standard solution with different phosphate concentrations. Then 1 ml of working solution was added to each 1 ml of this standard solution and mixed thoroughly. The batches were placed in a 70 ° C water bath for 10 minutes. Thereafter, the samples were measured in a spectrophotometer at 820 nm against a reagent blank (1 ml of water + 1 ml of working solution) in a suitable glass cuvette.
Eine typische Standardkurve ist in Tabelle 2 und Figur 1 dargestellt. Tabelle 2: A typical standard curve is shown in Table 2 and FIG. Table 2:
Werte der Eichgeraden für die Phosphatbestimmung als Phosphormolybdänblau mittels UV-Extinktion Values of the calibration line for the phosphate determination as phosphomolybdenum blue by means of UV absorbance
Phosphat in mmol/l Extinktion bei 820 nm Phosphate in mmol / l extinction at 820 nm
0,00781 0,0818 0.00781 0.0818
0,01563 0,1592
0,03125 0,3148 0.01563 0.1592 0.03125 0.3148
0,06250 0,6257 0.06250 0.6257
0,12500 1 ,2403 0,12500 1, 2403
0,25000 2,4496 0.25000 2.4496
Es zeigt sich eine lineare Abhängigkeit der UV-Extinktion zur eingesetzten Menge Phosphat. Das Bestimmtheitsmaß für die Gerade beträgt R2 = 1 ,000. Die Phosphationen werden hierbei als blauer Phosphormolybdänblau-Komplex gemäß T. G. Cooper, "The Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, 1977, S. 55-56, und C. H. Fiske und Y. P. Subbarow, J. Biol. Chem. 66, (1925), 375-400, erfaßt. It shows a linear dependence of the UV absorbance to the amount of phosphate used. The coefficient of determination for the straight line is R 2 = 1, 000. The phosphate ions are hereby identified as blue phosphomolybdenum blue complex according to TG Cooper, "The Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, 1977, pp. 55-56, and CH Fiske and YP Subbarow, J. Biol. Chem. 66, (1925 ), 375-400.
Beispiel 2 - Durchbruchskurve an einer Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen Example 2 - Breakthrough curve on a depth filter layer with inorganic layered double hydroxide on exposure to phosphate ions
Die Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Nr. 4, hergestellt nach DE 10 2008 037 678 A1 , mit der in Tabelle 1 aufgezeigten Zusammensetzung wurde in einer geeigneten Vorrichtung eingespannt und folgendermaßen verwendet: The depth filter layer with inorganic layer double hydroxide No. 4, produced according to DE 10 2008 037 678 A1, having the composition shown in Table 1, was clamped in a suitable device and used as follows:
1. Spülen des adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid (13,2 cm2) mit 100 ml einer TRIS-Pufferlösung (10 mmol, pH 7,4) bei einer Flussrate von 5 ml/min. 1. Rinse the adsorptive inorganic layered double hydroxide (13.2 cm 2 ) depth filter layer system with 100 ml of a TRIS buffer solution (10 mmol, pH 7.4) at a flow rate of 5 ml / min.
2. Beaufschlagung des adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit Phosphatlösung (5 mmol KH2P04- Lösung in 10 mmol TRIS, pH 7,4) bei einer Flussrate von 4 ml/min. 2. Impingement of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide with phosphate solution (5 mmol KH 2 P0 4 solution in 10 mmol TRIS, pH 7.4) at a flow rate of 4 ml / min.
3. Auffangen des Filtrats in Fraktionen zu je 1 ml. 3. Collect the filtrate in fractions of 1 ml each.
4. Bestimmung der Phosphatkonzentrationen in den einzelnen Fraktionen ge- maß Beispiel 1 . Die Konzentration c, der Fraktion i berechnet sich aus der 4. Determination of the phosphate concentrations in the individual fractions measured as in Example 1. The concentration c, the fraction i is calculated from the
Extinktion E, und der Steigung m der Eichgeraden nachExtinction E, and the slope m of the calibration line
5. Graphische Auftragung der Phosphatkonzentration im Filtrat als Funktion des Filtratvolumens in Form einer Durchbruchskurve.
6. Bestimmung des Durchbruchwertes VD 5. Graphical plot of phosphate concentration in filtrate as a function of filtrate volume in the form of a breakthrough curve. 6. Determination of the breakthrough value V D
VD ist das Filtratvolumen, bei dem erstmalig eine Phosphatkonzentration mit einer Extinktion E82o nm = 0,03 nachgewiesen werden kann (entspricht 1 % der hier maximal detektierbaren Extinktion). Sie wird bestimmt aus den beiden Fraktionen, deren Extinktion gerade unterhalb bzw. gerade oberhalb des Wertes von 0,03 beträgt. Zwischen diesen beiden Wertepaaren xi/yi und x2/y2 wird linear interpoliert und der x-Wert für y = 0,03 bestimmt. Es gilt dabei: V D is the filtrate volume at which, for the first time, a phosphate concentration with an extinction E 8 2o nm = 0.03 can be detected (corresponds to 1% of the maximum detectable extinction here). It is determined from the two fractions whose extinction is just below or just above the value of 0.03. Between these two value pairs xi / yi and x 2 / y 2 is linearly interpolated and the x-value for y = 0.03 is determined. It applies here:
(2) VD = x +(0,03 -
(2) V D = x + (0.03 -
7. Bestimmung der Beladungskennzahl Lph0Sphat für Phosphat 7. Determination of the load factor Lp h0S phat for phosphate
Die Beladungskennzahl Lph0sphat in mg/cm3 berechnet sich nach The load factor Lp h0 sphat in mg / cm 3 is calculated
,Q v r r / 3 -, C Phosphat lm°l H D ί™ί]■ M ' Phosphat ig 1 mol\ , Q vr r / 3 -, C phosphate l m ° l HD ί ™ ί] ■ M 'phosphate ig 1 mol \
(3) LPh hat[mglcm ] = p— — — (3) L Ph has [mglcm] = p - - -
t[cm]■ π · r\ cm\ t [cm] ■ π · r \ cm \
dabei gilt: where:
Radius des Stanzlings r = 2,35 cm Radius of the punching r = 2.35 cm
Mittlere Molmasse Phosphat bei pH = 7,4 Mph0sphat = 96,37 g/mol Average molecular weight of phosphate at pH = 7.4 Mp h0 sphat = 96.37 g / mol
Konzentration Phosphat in der Testlösung Cph0sphat = 0,001 mol/l Concentration of phosphate in the test solution Cp h0 sphat = 0.001 mol / l
Filterdicke t in cm Filter thickness t in cm
Durchbruch VD in ml bestimmt nach 6. Figur 2 zeigt den Verlauf der Phosphatkonzentration im Ablauf während der Beaufschlagung des adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems, welches anorganisches Schichtdoppelhydroxid enthält, mit KH2P04 - Lösung im Zulauf. Die Konzentration der Phosphationen im Ablauf während der Beaufschlagung des adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid liegt zunächst bei Null, um dann bei Erreichen der Sättigung des adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid stark anzusteigen. Die Lage des Phosphatdurchbruchs auf der x-Achse lässt sich anhand der auftretenden Phosphationen im Ablauf sehr genau detektieren. Im Vergleich dazu werden die Verläufe der Phosphatkonzentration im Ablauf während der Beaufschlagung herkömmlicher, kommerzieller adsorptiver
Tiefenfilterschichten S9P von Sartorius Stedim Biotech GmbH und Beco Steril S100 von Begerow, welche beide Kieselgur enthalten, mit KH2P04 - Lösung im Zulauf in Figur 2 dargestellt. Der Durchbruch der Phosphationen erfolgt bei den nicht hydrotalcithaltigen Tiefenfilterschichten der Vergleichsbeispiele sofort. Breakthrough VD in ml determined according to 6. Figure 2 shows the course of the phosphate concentration in the course during the loading of the adsorptive depth filter layer system containing inorganic layered double hydroxide, with KH 2 P0 4 - solution in the feed. The concentration of phosphate ions in the effluent during the application of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide is initially at zero, in order then to rise sharply upon reaching the saturation of the adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide. The position of the phosphate breakthrough on the x-axis can be detected very accurately on the basis of the occurring phosphate ions in the effluent. In comparison, the progressions of the phosphate concentration in the effluent during the loading become more conventional, more commercial adsorptive Depth filter layers S9P from Sartorius Stedim Biotech GmbH and Beco Steril S100 from Begerow, both of which contain diatomaceous earth, are shown in the feed stream in FIG. 2 with KH 2 P0 4 solution. The breakthrough of the phosphate ions takes place immediately in the non-hydrotalcite-containing depth filter layers of the comparative examples.
Die Tiefenfilterschichten der Vergleichsbeispiele können somit mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf ihre Integrität getestet werden, während Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit dem erfindungsgemäßen Verfahren reproduzierbar und zuverlässig auf ihre Integrität getestet werden können. The depth filter layers of the comparative examples can therefore not be tested for their integrity by the method according to the invention, while depth filter layers with inorganic layered double hydroxide can be reproducibly and reliably tested for their integrity with the method according to the invention.
Beispiel 3 - Durchbruchskurven an adsorptiven Tiefenfilterschichtsystemen mit verschiedenen Konzentrationen an anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen Example 3 - Breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with different concentrations of inorganic layer double hydroxide upon exposure to phosphate ions
Es wurden adsorptive Tiefenfilterschichtsysteme mit verschiedenen Konzentrationen an anorganischem Schichtdoppelhydroxid verwendet. Die Durchführung erfolgte gemäß Beispiel 2. Die Beaufschlagung erfolgte mit KH2PO4 - Lösung gemäß der Durchführung in Beispiel 2. Figur 3 zeigt die Durchbruchskurven für adsorptive Tiefenfilterschichtsysteme mit verschiedenen Konzentrationen an anorganischem Schichtdoppelhydroxid. Es zeigt sich deutlich, dass mit zunehmender Konzentration an Hydrotalcit sich als Folge ihrer unterschiedlichen Adsorptionsfähigkeit die Lage des Phosphatdurchbruchs hin zu größeren Filtrat- volumina verschiebt. Es zeigt sich weiterhin, dass ein Gehalt von beispielsweise 39 % Hydrotalcit die Testbarkeit des Tiefenfilters ermöglicht, gegenüber der nicht auf Integrität testbaren Filter der Vergleichsbeispiele, die nur Kieselgur enthalten. Adsorptive depth filter layer systems with various concentrations of inorganic layered double hydroxide have been used. The procedure was as in Example 2. The reaction was carried out with KH 2 PO 4 - solution according to the procedure in Example 2. Figure 3 shows the breakthrough curves for adsorptive depth filter layer systems with different concentrations of inorganic layered double hydroxide. It clearly shows that as the concentration of hydrotalcite increases, the position of the phosphate breakthrough shifts toward larger filtrate volumes as a result of their different adsorption capacity. It is further shown that a content of, for example, 39% hydrotalcite allows the testability of the depth filter, compared to the non-integrity testable filter of the comparative examples containing only diatomaceous earth.
Beispiel 4 - Durchbruchskurve an einem adsorptiven Tiefenfilterschichtsystem mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen mit unterschiedlichen Konzentrationen im Zulauf
Es wurde die Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid Nr. 4, hergestellt nach DE 10 2008 037 678 A1 , mit der in Tabelle 1 aufgezeigten Zusammensetzung verwendet. Die Durchführung erfolgte gemäß Beispiel 2. Die Beaufschlagung erfolgte mit KH2P0 - Lösung mit verschiedenen Konzentrationen, und der Ablauf wurde in Volumeneinheiten zu je 1 ml fraktioniert aufgefangen. Die Phosphatkonzentration wurde wie in Beispiel 1 bestimmt und als Funktion des Filtratvolumens aufgetragen. Die Durchbruchskurven sind in Figur 4 dargestellt. Example 4 - Breakthrough curve on an adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide when exposed to phosphate ions with different concentrations in the feed The depth filter layer with inorganic layer double hydroxide No. 4, produced according to DE 10 2008 037 678 A1, having the composition shown in Table 1, was used. The procedure was carried out according to Example 2. The application was carried out with KH 2 P0 - solution with different concentrations, and the process was fractionated in volume units of 1 ml fractionated. The phosphate concentration was determined as in Example 1 and plotted as a function of filtrate volume. The breakthrough curves are shown in FIG.
Beispiel 5 - Durchbruchskurven an verschiedenen Zusammensetzungen adsorptiver Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen Es wurden verschiedene Varianten von adsorptiven Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid verwendet, die sich in den Komponenten und ihrer Zusammensetzung gemäß Tabelle 1 unterscheiden. Example 5 - Breakthrough curves on various compositions of inorganic layered double hydroxide adsorptive depth filter layer systems upon exposure to phosphate ions Various variants of inorganic layered double hydroxide adsorptive depth filter layer systems were used, differing in the components and their composition shown in Table 1.
Die Durchführung erfolgte gemäß Beispiel 2. Die Beaufschlagung erfolgte mit KH2P04 - Lösung gemäß der Durchführung in Beispiel 2. Figur 5 zeigt die Durchbruchskurven für verschiedene Zusammensetzungen adsorptiver Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid. Die Tiefenfilterschichtsysteme unterscheiden sich in Art und Zusammensetzung der Hydrotalcite und der Cellulose und werden durch die Lage ihres Phosphatdurchbruchs als Folge ihrer unterschiedlichen Adsorptionsfähigkeit charakterisiert. The procedure was as in Example 2. The reaction was carried out with KH 2 P0 4 - solution according to the procedure in Example 2. Figure 5 shows the breakthrough curves for various compositions of adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide. The depth filter layer systems differ in the nature and composition of the hydrotalcites and cellulose and are characterized by the location of their phosphate breakthrough as a result of their different adsorption capacity.
Beispiel 6 - Dynamische Proteinbindung Zur Bestimmung der dynamischen Bindungskapazitäten der Tiefenfilterschichten werden Stanzlinge mit dem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 mit 10 ml RO-Wasser benetzt, in ein Edelstahlfiltra-
tionsgehäuse (Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH) eingelegt und mit 100 ml TBS (gemäß Beispiel 1 ) bei 4 ml/min vorgespült und anschließend mit einer Proteinbzw. DNS-Testlösung durchspült. Als Testlösungen werden Example 6 Dynamic Protein Binding To determine the dynamic binding capacities of the depth filter layers, diecuts having a diameter of 47 mm and an effective filter area of 13.2 cm 2 are wetted with 10 ml of RO water, poured into a stainless steel filter. tion housing (Sartorius Stedim Biotech GmbH) and pre-rinsed with 100 ml of TBS (according to Example 1) at 4 ml / min and then with a Proteinbzw. Flushed DNS test solution. As test solutions will be
a) eine frisch angesetzte Lösung aus BSA (Bovines Serum-Albumin der Fa. Roth) mit einer Konzentration von 1 g/l in TBS-Puffer (gemäß Beispiel 1 ) a) a freshly prepared solution of BSA (bovine serum albumin from Roth) with a concentration of 1 g / l in TBS buffer (according to example 1)
b) eine Lösung aus Lachssperma-DNS (Na-Salz, Größenverteilung 500-1000 Basenpaare, Produktnummer 54653 Fa. Biomol) mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml und b) a solution of salmon sperm DNA (Na salt, size distribution 500-1000 base pairs, product number 54653 Fa. Biomol) with a concentration of 0.5 mg / ml and
c) eine Lösung aus intravenösem Immunoglobulin IVIG mit einer Konzentration von 1 g/l (Cytoglobin®/ Firma Bayer Vital, Leverkusen) verwendet. c) a solution of IVIG immunoglobulin at a concentration of 1 g / l (Cytoglobin ® / Bayer Vital, Leverkusen) used.
Die Extinktionen des Filtrats wird in einem Online-Photometer bei einer Wellenlänge von a) 280 nm für BSA, b) 260 nm für DNS und c) 280 nm für IVIG in Fraktionen aufgezeichnet, und mit Hilfe von Standardreihen wird die Konzentration der jeweiligen Testsubstanz bestimmt. Zur Auswertung wird die Extinktion des Filtrats durch die Extinktion der eingesetzten Testlösung geteilt und dieser Wert gegen das Filtrationsvolumen aufgetragen. Die Auswertung der Durchbruchskurven erfolgt durch Bestimmung des 50%-dynamischen Durchbruchs (DBT, Dynamic Breakthrough) und der kumulativen Bindung über den gesamten Filtrationsverlauf. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und in Figur 6 dargestellt. The extinctions of the filtrate are recorded in an online photometer at a wavelength of a) 280 nm for BSA, b) 260 nm for DNA and c) 280 nm for IVIG in fractions, and the concentration of the respective test substance is determined by means of standard series , For evaluation, the extinction of the filtrate is divided by the extinction of the test solution used and this value is plotted against the filtration volume. Breakthrough curves are evaluated by determining the 50% dynamic breakthrough (DBT, Dynamic Breakthrough) and the cumulative binding over the entire filtration process. The results are shown in Table 3 and FIG.
Tabelle 3: Table 3:
Ergebnisse der dynamischen Bindungskapazitäten von BSA, DNS und IVIG, sowie der Phosphatbindungskapazität für verschiedene adsorptive Tiefenfilterschichten mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid. Results of the dynamic binding capacities of BSA, DNA and IVIG, as well as the phosphate binding capacity for different adsorptive depth filter layers with inorganic layered double hydroxide.
Filter Dicke VD Phosphat DDB DDB DDB Filter Thickness V D Phosphate DDB DDB DDB
BSA 0,5* DNS 0,5* IVIG 0,5* BSA 0.5 * DNA 0.5 * IVIG 0.5 *
[cm] [ml] [mg/cm3 [mg/cm2] [mg/cm2] [mg/cm2] [cm] [ml] [mg / cm 3 [mg / cm 2 ] [mg / cm 2 ] [mg / cm 2 ]
] ]
Nr. 1 (39% Hydrotalcit Typ A) 0,37 69,09 1 ,028 8,79 6,74 8,17 No. 1 (39% hydrotalcite type A) 0.37 69.09 1, 028 8.79 6.74 8.17
Nr. 2 (46% Hydrotalcit Typ A) 0,39 105,93 1 ,513 10,72 8,80 9,67
Nr. 3 (64% Hydrotalcit Typ A) 0,33 140,02 2,096 15,33 10,96 12,77No. 2 (46% hydrotalcite type A) 0.39 105.93 1, 513 10.72 8.80 9.67 No. 3 (64% hydrotalcite type A) 0.33 140.02 2.096 15.33 10.96 12.77
Nr. 4 (64% Hydrotalcit Typ C) 0,29 76,79 1 ,385 10,50 6,92 9,42No. 4 (64% hydrotalcite type C) 0.29 76.79 1, 385 10.50 6.92 9.42
Nr. 5 (58% Hydrotalcit Typ B) 0,35 51 ,23 0,818 5,23 5,19 3,89No. 5 (58% Hydrotalcite Type B) 0.35 51, 23 0.818 5.23 5.19 3.89
Nr. 6 (50,9% Hydrotalcit Typ B) 0,41 26,10 0,351 4,45 4,16 3,22No. 6 (50.9% Hydrotalcite Type B) 0.41 26.10 0.351 4.45 4.16 3.22
Nr. 7 (46,2% Hydrotalcit Typ B) 0,38 16,72 0,244 2,86 2,68 2,37 No. 7 (46.2% Hydrotalcite Type B) 0.38 16.72 0.244 2.86 2.68 2.37
* entspricht der Beladung bei 50%igem dynamischem Durchbruch der Ausgangskonzentration Es zeigt sich eine lineare Korrelation zwischen der Phosphatbeladungskennzahl Lphosp at (wie in Beispiel 2 berechnet) und den dynamischen Bindungskapazitäten von BSA, DNS und IVIG, die eine präzise und sichere Prognose über die Bindungskapazitäten für diese Biomoleküle in Abhängigkeit von der experimentell bestimmten Phosphatbeladungskennzahl erlaubt. * corresponds to the loading at 50% dynamic breakthrough of the initial concentration. There is a linear correlation between the phosphate load index Lphosp at (as calculated in Example 2) and the dynamic binding capacities of BSA, DNA and IVIG, which provide a precise and reliable prediction of the binding capacities allowed for these biomolecules depending on the experimentally determined phosphate loading index.
Beispiel 7 - Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit nach vorangegangener Phosphatbeladung zur Prüfung der Adsorptionsfähigkeit Example 7 - Restoration of Binding Capacity After Previous Phosphate Loading for Adsorption Capacity Testing
Zur Wiederherstellung (Reload) der Bindungsfähigkeit nach vorheriger Beauf- schlagung mit Phosphat während der Integritätsprüfung (gemäß Beispiel 2) wird ein Filterstanzling mit einem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 im noch benetzten Zustand in ein Edelstahlfiltrationsgehäuse (Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH) eingelegt bzw. direkt nach vorangegangenem Phosphattest in diesem belassen. Die Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit erfolgt durch Spülung mit 50 ml einer 500 mmol/l Kaliumcarbonatlösung und anschließender Spülung mit 100 ml TBS (gemäß Beispiel 1 ) bei einer Flussrate von 5 ml/min. Nach dieser Behandlung beträgt die BSA-Bindungsfähigkeit des mit dem Phosphattest behandelten Tiefenfilters 91 % derjenigen BSA-Bindungsfähigkeit eines unbehandelten Tiefenfilterstanzlings (siehe Tabelle 4).
Tabelle 4: To restore (reload) the bondability after prior exposure to phosphate during the integrity test (according to Example 2), a filter diecut with a diameter of 47 mm and an effective filter area of 13.2 cm 2 while still wetted in a stainless steel filtration housing (Fa Sartorius Stedim Biotech GmbH) or left directly after the previous phosphate test. The binding ability is restored by rinsing with 50 ml of a 500 mmol / l potassium carbonate solution and then rinsing with 100 ml of TBS (according to Example 1) at a flow rate of 5 ml / min. After this treatment, the BSA binding capacity of the phosphate test-treated depth filter is 91% that of BSA binding ability of an untreated depth filter puncher (see Table 4). Table 4:
Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit adsorptiver Tiefenfilterschichtsysteme mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid. Einfluss von Konzentration und Spülvolumen der carbonathaltigen Spüllösung auf die Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit (Reload). Restoration of the binding capacity of adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide. Influence of concentration and purging volume of the carbonate-containing rinse solution on the restoration of the binding ability (reload).
*DDB 0,5: Beladung des Filters bei 50%igem dynamischem Durchbruch der Ausgangskonzentration * DDB 0.5: Loading of the filter at 50% dynamic breakthrough of the initial concentration
**DDB 0,03: Beladung des Filters bei 3%igem dynamischem Durchbruch der Ausgangskonzentration * * DDB 0,03: Loading of the filter at 3% dynamic breakthrough of the initial concentration
Tabelle 4 zeigt, dass das Spülen mit einer carbonatfreien Pufferlösung zu einer 60%igen Regeneration der BSA-Bindungsfähigkeit führt. Table 4 shows that rinsing with a carbonate-free buffer solution results in a 60% recovery of BSA binding ability.
Spülen mit carbonathaltiger Pufferlösung und anschließendes Spülen mit carbonatfreier Pufferlösung verbessern die Regeneration der BSA-Bindungsfähigkeit auf 65 %. Bei Einsatz von nicht gepufferter Carbonatlösung steigt die Regeneration der BSA-Bindungsfähigkeit von 80 % bei 50 mmol/l auf 91 % bei 500 mmol/l. Gemäß der letzten Zeile der Tabelle 4 wird eine Verbesserung der Regeneration der BSA-Bindungsfähigkeit auf 96 % erreicht, indem der Tiefenfilter
mit zwei Portionen mit jeweils 25 ml an nicht gepufferter Carbonatlösung (500 mmol/1) beaufschlagt wird, wobei zwischen den beiden Portionen eine Einwirkzeit von 30 Minuten liegt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit eine einfache, kostengünstige und fast quantitative Regeneration des Tiefenfilters für den bestimmungsgemäßen nachfolgenden Gebrauch zur Adsorption von Biomolekülen. Rinsing with carbonate-containing buffer solution and subsequent rinsing with carbonate-free buffer solution improve the regeneration of BSA binding ability to 65%. When using unbuffered carbonate solution, regeneration of BSA binding ability increases from 80% at 50 mmol / L to 91% at 500 mmol / L. According to the last line of Table 4, an improvement in the regeneration of the BSA binding ability is achieved to 96% by using the depth filter with two portions of 25 ml of non-buffered carbonate (500 mmol / l) is applied, with an exposure time of 30 minutes between the two portions. The inventive method thus allows a simple, inexpensive and almost quantitative regeneration of the depth filter for the intended subsequent use for the adsorption of biomolecules.
Beispiel 8 - Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit nach vorangegangener Phosphatbeladung zur Prüfung der Adsorptionsfähigkeit Example 8 - Restoration of Binding Capacity After Previous Phosphate Loading for Adsorption Capacity Testing
Zur Wiederherstellung (Reload) der Bindungsfähigkeit nach vorheriger Beaufschlagung mit Phosphationen während der Integritätsprüfung (gemäß Beispiel 2) wird ein Filterstanziing mit einem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 im noch benetzten Zustand in ein Edelstahlfiltrations- gehäuse (Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH) eingelegt bzw. direkt nach vorangegangenem Phosphattest in diesem belassen. Das Reload erfolgt durch Spülung mit 2 x 25 ml einer 500 mmol/l Kaliumcarbonatlösung mit einer Flussrate von 5 ml/min, wobei zwischen den ersten 25 ml Spülvolumen und den zweiten 25 ml Spülvolumen für die Dauer von 30 min die Flussrate auf 0 ml/min gesetzt wird und anschließend mit 100 ml TBS (gemäß Beispiel 1) bei einer Flussrate von 5 ml/min gespült wird. Nach dieser Behandlung beträgt die BSA-Bindungsfähigkeit des mit dem Phosphattest behandelten Tiefenfilters 96 % derjenigen BSA- Bindungsfähigkeit eines unbehandelten Tiefenfilterstanzlings (siehe Tabelle 4). Beispiel 9 - Phosphat-Durchbruchskurven an adsorptiven Tiefenfilterschicht- systemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen nach Einbringen künstlicher Defekte To restore (reload) the binding ability after previous exposure to phosphate ions during the integrity test (according to Example 2), a filter punching ring with a diameter of 47 mm and an effective filter area of 13.2 cm 2 while still wetted in a stainless steel filtration housing (Fa Sartorius Stedim Biotech GmbH) or left directly after the previous phosphate test. The reload is carried out by rinsing with 2 × 25 ml of a 500 mmol / l potassium carbonate solution at a flow rate of 5 ml / min, the flow rate being between 0 ml for the first 25 ml flush volume and the second 25 ml flush volume for 30 min / min is set and then rinsed with 100 ml of TBS (according to Example 1) at a flow rate of 5 ml / min. After this treatment, the BSA binding capacity of the phosphate test treated depth filter is 96% that of BSA binding ability of an untreated depth filter die (see Table 4). Example 9 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide on exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects
Ein Stanzling eines adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit dem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 wird im trockenen Zustand mittels Edelstahlnadel in der Mitte des Filterstanzlings mit einem einzigen Loch versehen. Dabei wurden
Nadeln mit einem Durchmesser von 200 m bzw. 400 pm verwendet. Die weitere Durchführung zur Bestimmung des Phosphatdurchbruchs erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Durchbruchskurve ist in Figur 7 gezeigt. Beispiel 10 - Phosphat-Durchbruchskurven an adsorptiven Tiefenfilter- schichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen nach Einbringen künstlicher Defekte A diecut of a 47 mm diameter adsorptive depth filter layer system with 14 mm diameter inorganic layer double hydroxide and an effective filter area of 13.2 cm 2 is provided in the dry state with a single hole by means of a stainless steel needle in the middle of the filter diecut. Were Needles with a diameter of 200 m or 400 pm used. The further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG. Example 10 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide on exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects
Ein Stanzling eines adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit dem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 wird mit 10 ml RO-Wasser benetzt und mittels Edelstahlnadel mit einem Durchmesser von 400 pm in der Mitte des Filterstanzlings mit einem einzigen Loch versehen. Die weitere Durchführung zur Bestimmung des Phosphatdurchbruchs erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Durchbruchskurve ist in Figur 7 gezeigt. A diecut of an adsorptive 47 mm diameter inorganic layered double hydroxide adsorbent layer system with 13.2 cm 2 effective filter area is wetted with 10 ml of RO water and 400 μm diameter stainless steel needle in the center of the single hole filter diecut Mistake. The further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG.
Beispiel 11 - Phosphat-Durchbruchskurven an adsorptiven Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen nach Einbringen künstlicher Defekte Example 11 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide upon exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects
Ein Stanzling eines adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit dem Durchmesser von 47 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 wird im trocknen Zustand mit einem Knick versehen, wobei die Tiefenfilterschicht an den Oberflächen aufbricht. Die weitere Durchführung zur Bestimmung des Phosphatdurchbruchs erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Durchbruchskurve ist in Figur 7 gezeigt. A diecut of an adsorptive depth filter layer system with 47 mm diameter inorganic layered double hydroxide and an effective filter area of 13.2 cm 2 is provided with a kink in the dry state, with the depth filter layer breaking at the surfaces. The further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG.
Beispiel 12 - Phosphat-Durchbruchskurven an adsorptiven Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid bei der Beaufschlagung mit Phosphationen nach Einbringen künstlicher Defekte
Die Oberfläche eines Stanzlings eines adsorptiven Tiefenfilterschichtsystems mit anorganischem Schichtdoppelhydroxid mit dem Durchmesser von 47 mm, einer Dicke von 0,37 mm und einer effektiven Filterfläche von 13,2 cm2 wird im trocknen Zustand auf der Upstreamseite zerstört. Dazu wurde von dem Tiefenfiltermaterial in trockenem Zustand über die gesamte Anströmfläche hinweg ungefähr die obere Hälfte des Materials mit Hilfe einer Pinzette abgezogen. Ein kompletter physikalischer Durchbruch durch die gesamte Tiefenfilterschichtdicke wurde dabei vermieden. Die weitere Durchführung zur Bestimmung des Phosphatdurchbruchs erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Durchbruchskurve ist in Figur 7 gezeigt. Example 12 - Phosphate breakthrough curves on adsorptive depth filter layer systems with inorganic layered double hydroxide upon exposure to phosphate ions after introduction of artificial defects The surface of a diecut of a 47 mm diameter, 0.37 mm thick, and 13.2 cm 2 effective filter surface adsorptive depth filter layer system with inorganic layered double hydroxide is destroyed in the dry state on the upstream side. For this purpose, about the upper half of the material was removed from the depth filter material in a dry state over the entire Anströmfläche about using tweezers. A complete physical breakthrough through the entire depth filter layer thickness was avoided. The further procedure for the determination of the phosphate breakthrough is carried out as described in Example 2. The breakthrough curve is shown in FIG.
Figur 7 verdeutlicht, dass aufgrund der hohen Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens schon kleine Defekte im Filter sehr gut detektiert werden können, weil die Lage des Durchbruchspunkts sehr sensibel auf das Vorhandensein von Defekten anspricht.
FIG. 7 illustrates that due to the high sensitivity of the method according to the invention even small defects in the filter can be detected very well because the position of the breakdown point is very sensitive to the presence of defects.
Claims
Ansprüche claims
Verfahren zur Bestimmung der Integrität und Funktionalität von Tiefen- filterschichten und Tiefenfilterschichtsystemen mit anorganischen Schicht- doppelhydroxiden, umfassend die Schritte des Method for determining the integrity and functionality of depth filter layers and depth layer filter layer systems with inorganic layered double hydroxides, comprising the steps of
Beiadens der Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppel- hydroxid mit einem Adsorbenden, umfassend anorganische Anionen, unter Bedingungen, unter denen der Adsorbend von der adsorptiven Tiefenfilterschicht bis zum Erreichen des Durchbruchvolumens vollständig zurückgehalten wird, Loading the inorganic layer double hydroxide depth filter layer with an adsorbent comprising inorganic anions under conditions in which the adsorbent is completely retained by the adsorptive depth filter layer until the breakthrough volume is reached,
Detektierens des durchgebrochenen Adsorbenden mittels Sekundärreaktion, wobei der negative dekadische Logarithmus der detektierten Grenzkonzentration pD > 4 beträgt, und Detecting the erupted adsorbent by secondary reaction, wherein the negative decadic logarithm of the detected limit concentration is pD> 4, and
Vergleichens der Durchbruchscharakteristik mit derjenigen einer adsorptiven Tiefenfilterschicht bekannter Integrität. Comparing the breakdown characteristic with that of an adsorptive depth filter layer of known integrity.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die anorganischen Anionen Phosphationen aus der Gruppe der Sauerstoffsäuren des Phosphors umfassen. The method of claim 1, wherein the inorganic anions comprise phosphate ions from the group of the oxygen acids of the phosphor.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sekundärreaktion eine Komplexbildung mit Farbreaktion unter Bildung eines Phosphormolybdänblau-Komplexes umfasst. The method of claim 2, wherein the secondary reaction comprises complexing with color reaction to form a phosphomolybdenum blue complex.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Beladung mit dem Adsorbenden reversibel ist. A method according to any one of claims 1 to 3, wherein the loading of the adsorbent is reversible.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend den Schritt des Spülens der Tiefenfilterschicht mit anorganischem Schichtdoppel- hydroxid mit einer carbonathaltigen Spüllösung, wodurch die
Tiefenfilterschicht mindestens 90 % ihrer ursprünglichen Bindungsfähigkeit für eine bestimmungsgemäße nachfolgende Anwendung wiedererlangt. The method of any one of claims 1 to 4, further comprising the step of rinsing the layered double layered inorganic oxide double-layered hydroxide layer with a carbonated rinse solution, whereby the Depth filter layer recovers at least 90% of its original bondability for proper subsequent use.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Gewichtsanteil des anorganischen Schichtdoppelhydroxids in der Tiefenfilterschicht 20 % oder mehr beträgt. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the weight ratio of the inorganic layer double hydroxide in the depth filter layer is 20% or more.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das anorganische Schichtdoppelhydroxid Hydrotalcit umfasst. The method of any of claims 1 to 6, wherein the inorganic layered double hydroxide comprises hydrotalcite.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Durchbruch der anorganischen Ionen mit der Rückhaltefähigkeit gegenüber Biomolekülen korreliert. The method of any one of claims 1 to 7, wherein the breakdown of the inorganic ions correlates with the bio-molecular retention capability.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Biomoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe der Serumalbumine, Nukleinsäuren und Immunoglobuline oder Kombinationen davon.
The method of claim 8, wherein the biomolecules are selected from the group of serum albumins, nucleic acids and immunoglobulins or combinations thereof.
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