EP2477745A1 - Dispositif d'amplification d'acides nucléiques simplifié et son procédé de mise en oeuvre - Google Patents

Dispositif d'amplification d'acides nucléiques simplifié et son procédé de mise en oeuvre

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Publication number
EP2477745A1
EP2477745A1 EP10771795A EP10771795A EP2477745A1 EP 2477745 A1 EP2477745 A1 EP 2477745A1 EP 10771795 A EP10771795 A EP 10771795A EP 10771795 A EP10771795 A EP 10771795A EP 2477745 A1 EP2477745 A1 EP 2477745A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amplification
sample
constituents
compartment
interest
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10771795A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrick Broyer
Laurent Drazek
Agnès Dupont Filliard
Michel Guy
Frédéric PINSTON
Magaly Ponsard-Fillette
Thierry Kollaroczy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2477745A1 publication Critical patent/EP2477745A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B01L3/0217—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0621—Control of the sequence of chambers filled or emptied
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the present invention relates to a disposable device for amplifying at least one targeted nucleic acid.
  • the present invention also relates to a method of amplifying such a target nucleic acid, which uses a previously cited device.
  • the device like the method, can be used with any type of amplification technique, such as PCR or a post-transcriptional amplification technique, such as TMA or NASBA.
  • the state of the art is constituted by the document O-A-99/33559 which relates to an integrated cartridge allowing the manipulation of fluids, but also of the same applicant, the document WO-A-2006 / 132886v which deals with a method and apparatus for storing and using reagents, in the form of beads.
  • This system consists of a compact instrument with four identical modules and. removable and a multi-well cartridge that incorporates a ' multi-way valve. A piston moves liquids from one well to another of the cartridge to mix them. Of the different . areas of the cartridge, each of them can either allow:
  • the amplification is carried out by transferring all or part of the eluate to the amplification and detection zone (PCR) of the cartridge.
  • PCR amplification and detection zone
  • the cartridge can integrate solid or liquid reagents or both simultaneously. This system is fully integrated and automated, with a result of short enough time (of the order of one hour).
  • the cartridge is relatively complex and expensive. It is therefore not very suitable for a high speed system. In addition, it does not make it possible to perform several tests per sample other than by multiplexing the amplification primers and / or detection probes in the same volume. This makes the development of biological assays much more complex and time consuming with inevitable compromises in detection performance.
  • Our invention is much better suited to high speeds because the card we protect can be easily manipulated by a PLC in the manner of a simple pipetting cone.
  • the card can be easily moved in front of the different read heads (different wavelengths).
  • High speed means a rate of over 300 tests per day, with a low cost per test and a small footprint.
  • the present invention makes it possible to have costs per test compatible with routine viral or microbiological diagnosis, at a high rate, but also for tests that are deported to patients, otherwise known as POCT (Point Of Care Testing).
  • POCT Point Of Care Testing
  • the cost per test thanks in particular to the simplicity of the developed consumable, its integrated pipetting function and the reduced volume of amplification reaction, making it possible to reduce the cost per test (the enzymes in molecular biology constitute the major part of this cost per test for the "reagents" part and a decrease in the reaction volume therefore makes it possible to have a reduction proportional to the volume reduction) (5 ⁇ L instead of 50 to 80 ⁇ L in these applications).
  • the state of the art also includes document WO-A-2004/004904 which relates to an apparatus designed to carry out rapid tests in an autonomous and mobile manner, notably in the context of bioterrorism, bacteriological warfare, and POCTs. , device that requires a minimum of manual operations.
  • This system uses a cartridge with input ports connected to a flexible pouch with one or more compartments in which the amplification reagents (PCR) are lyophilized. The fluorescence is read directly through the deformable flexible film.
  • the pouches are kept under vacuum which allows, after the introduction of the nucleic acid samples via the inlet of the consumable port, to carry out an automatic and calibrated filling and to dissolve the lyophilized reagents prior to the amplification by PCR.
  • This device is not suitable for performing routine high speed tests.
  • This system of distribution and / or fluidic division by vacuum is effective for single-stage fluidic (filling) protocols that can be used in the case of PCR amplification.
  • it is poorly adapted to the process amplification of nucleic acids, which require successively resuspend several reagents, as is the case for NASBA or TMA amplifications.
  • This therefore requires adding a valve and maintaining a partial vacuum between the two chambers containing the amplification reagents, resulting in a complexification of the consumable and the associated instrument.
  • the consumable does not allow to suck directly, without manual intervention, the sample containing nucleic acids (pipetting); there is no pipetting function.
  • this device which combines a rigid part and a flexible pouch part, is not easily manageable in an architecture in which the user can put a sample at any time even during the operation of the instrument, architecture called " Random Access.
  • Our invention proposes a card which can easily be manipulated by a robot and be used as a cone for pipetting solutions, mixing them, taking up the eluate and sucking it in to effect reactions such as reactions. amplification.
  • the card according to the present invention, can therefore be used as a pipette cone for making additions, aspirate liquid reagents in tubes, and thus perform the steps prior to the amplification / detection step.
  • said card can also take and remove several cones at the same time. For this purpose embodiments, comprising more than one fluidic path, are presented later in this document.
  • the present invention of the Applicant allows to adapt to both PCR amplification protocol (or RT-PCR) requiring only a reagent (and therefore achievable in a single chamber) or protocol two-step amplification process requiring separation, in two distinct chambers, amplification reagents, as is the case with post-transcriptional amplifications.
  • the invention also solves the problem of architecture of the instrument, by proposing a consumable (or card) that can be used either in a POCT system (a few tests per day) or in a high-speed routine diagnostic system (greater than 300 tests per day) by the integration of the pipetting function, which uses conventional cones (reported or integrated).
  • the state of the art is also constituted for the document WO-A-2007/100500. It is a very POCT-oriented system or the low flow in molecular biology. This easy-to-use system makes it possible to work directly from a drop of blood (some 10 pL).
  • the associated instrument is also compact thanks to a combination of actuators making it possible to isolate the compartments of the tubular shaped consumable and thus to allow the transfer and the mixing of the liquids in the order defined during manufacture by the prior filling of the consumable.
  • a major disadvantage of this system is its lack of flexibility on the biological protocol to achieve.
  • the volumes of samples and buffers are fixed by the volume of each compartment of the consumable, as defined in the manufacture of the consumable. It is known that it is often necessary to use the modification of the biological protocol, in order to obtain better performance of capture, amplification and detection of nucleic acids according to different parameters, for example the nature of of the biological sample treated, the presence or absence of inhibitors (sputum, BAL, plasma, urine, whole blood, etc.).
  • the modification of protocols requires to create each time a different consumable with different volumes for each compartment and thus to modify the sealing zones, with a very strong constraint related to the location of the zones of implantation of the mobile actuators in the associated instrument ( valves and pistons for overpressure breaking said sealing areas).
  • the sample volume remains very small and therefore does not cover all user needs, especially those related to tests starting from several milliliters of sample.
  • the flexible object is difficult to manage by a PLC except to have a significant additional cost. It has no pipetting function or flexibility in the choice of elution and wash volumes, and therefore less flexibility in sample preparation.
  • a problem of this type of device is that it is obliged to operate using valves which consist of deformable elements under the action of an actuator which causes the direct or indirect closure of the channels associated with the valves.
  • the essential problem with this device is the complexity.
  • the presence of valves considerably complicates the production of the analysis card thus formed and strikes its production price, and secondly, there is a need for numerous external elements (actuators) to enable the actuation of the assembly. said valves.
  • the present invention proposes to solve the problems highlighted by all the documents of the state of the art mentioned above. To do this, it offers a device that is disposable and that meets a number of technical characteristics.
  • the device is a consumable which is considered as a pipette, carrying the dried or lyophilized reagents necessary for amplification of RNA or DNA targets from a reduced volume of nucleic acids. (5 to 10 ⁇ ), which reduces reagent costs and incorporates a valve to eliminate any risk of contamination. It is a slide valve, normally open and closed after location of the reaction volume in the reading zone, when there are no more steps to achieve.
  • This type of device has many unknown qualities of the state of the art:
  • the present invention relates to a disposable device for the amplification of at least one target nucleic acid, present in a liquid and biological sample of interest, which consists of a solid body, at least one fluid channel connecting an inlet , by which all or part of the sample of interest can be sucked and / or discharged, and an outlet, which is itself connected to a suction-discharge means of said sample of interest, the fluidic channel comprising off the entrance to the exit: A first compartment containing all or part of the thermostable constituents necessary for carrying out the amplification,
  • a means for mixing the constituents with the sample of interest A means for mixing the constituents with the sample of interest
  • the device for the detection of amplicons is characterized in that it further comprises at the second compartment, all or part of the detection components necessary for the detection of amplicons.
  • the device allowing the detection of amplicons, is characterized in that it further comprises at the level of the fluidic channel a third compartment containing all or part of the constituents necessary for the detection of amplicons.
  • the device further comprises at the level of the fluidic channel a third compartment containing nothing but for the subsequent detection of amplicons in a clean environment.
  • the third compartment is located between the second compartment and the output of the device.
  • the inlet of the device receives a pipette cone or the pipette tip has a pipette cone configuration.
  • the suction-discharge device is of piston type such as for example a pipette.
  • the section of the channel is constant and the compartments are of a larger section.
  • the input is in relation with at least two fluidic channels.
  • the output consists of at least two fluidic channels.
  • the constituents are formed of freeze-dried or dried biological compounds, soluble in the sample of interest.
  • the suction-discharge means is an integral part of the disposable device.
  • the suction-discharge means consists of a cylinder connected to the fluidic channel and a piston movable within the cylinder manually or via an actuator.
  • the mixing means is constituted by the fluid channel whose path comprises at least one baffle.
  • the present invention also proposes a method for amplifying at least one target nucleic acid, present in a liquid and biological sample of interest, produced within a device previously described, which consists of:
  • thermostable amplification components of step (b) also contain restriction enzymes, which are not necessarily thermostable, but which allow cleavage at predetermined positions of the nucleic acids of interest, which are deoxyribonucleic acids, prior to the application of the first temperature gradient of step (d).
  • the detection of the amplicons consists, after step (g), in:
  • the amplification is a PCR amplification, for which the first temperature gradient is between 90 and 100 ° C., and the second temperature gradients is an alternation of temperature in three different stages:
  • the amplification is a post-transcriptional amplification (NASBA or TMA), for which the first temperature gradient is between 60 and 70 ° C, preferably about 65 ° C, and the second temperature gradient is between 40 and 50 ° C for the second polymerization temperature gradient.
  • NASBA post-transcriptional amplification
  • the first temperature gradient is applied at the level of the first compartment and / or the mixing means
  • the second gradient or gradients temperature is or are applied at the level of the mixing means and / or the second compartment and / or the third compartment.
  • the first temperature gradient is applied for 5 to 20 minutes, preferably 15 minutes, and the second temperature gradient or gradients is or are applied:
  • reagent means both "reagent”, “amplification reagent”, “extraction reagent” or “purification reagent” or “raw material” and refers to reagents, such as reaction buffers, enzymes, the mono-, bi- or triphosphate nucleosides, but also the solvents, the salts necessary for carrying out an extraction, purification or enzymatic amplification reaction of a nucleic acid.
  • container or "plastic container” within the meaning of the present invention is meant any container such as tubes, cones or tips pipettes, whether plastic (eg Eppendorf type) or glass or in all other materials ...
  • nucleic acid in the sense of the present invention is meant a sequence of at least two nucleotides, preferably at least ten nucleotides chosen from the four types of nucleotides of the genetic code, namely whether the nucleic acid is a DNA:
  • DGMP deoxyguanosine 5'-monophosphate
  • DCMP deoxycytidine 5'-monophosphate
  • nucleic acid is an RNA: • AMP (adenosine 5'-monophosphate),
  • the nucleic acid may also optionally comprise at least one inosine and / or at least one modified nucleotide.
  • modified nucleotide means, in the present invention, a nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified nucleotide base, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base, preferentially with the exception of 5-methyl-cytosine.
  • the nucleic acid may also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, at the level of the backbone such as, for example, the alpha-oligonucleotides (FR-A-2.60.507). or the polyamide nucleic acids (PMA) (Egholm M. et al., J.
  • the 2'-O-alkyl-ribonucleotides are preferred, but the 5-propinyl pyrimidine oligonucleotides (Seitz 0., Angewandte Chemie International Edition 1999; 38 (23)) can also be used. Dec .: 3466-69).
  • nucleotide defines either a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide.
  • biological sample or "liquid biological sample”, any sample capable of containing nucleic acids. These can be extracted from tissue, blood, serum, saliva, circulating cells of a patient or from a food product, food or environmental origin. Extraction is made by any protocol known to those skilled in the art, for example by the isolation method described in patent EP-B-0.369.063.
  • contaminant or “contaminating acid” or “contaminating nucleic acid” or “contaminating element” is intended to mean any nucleic acid whose amplification is not desired and which is capable of generating a result. false positive during detection.
  • amplification or “amplification reaction” is meant any nucleic acid amplification technique well known to those skilled in the art, such as:
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • RT-PCR Reverse Transcription PCR
  • the PCR is carried out on a single strand with a single pair of primer.
  • target or “target nucleic acid” or “nucleic target” or “target of interest” or “nucleic acid of interest” means a nucleic acid (an oligonucleotide, a polynucleotide, a fragment nucleic acid, ribosomal RNA, messenger RNA, transfer RNA) to be amplified and / or detected.
  • the target can be extracted from a cell or synthesized chemically.
  • the target may be free in solution or bound to a solid support.
  • liquid and biological sample of interest means a homogeneous or heterogeneous aqueous solution.
  • solid support particles which may be latex, glass (GPC), silica, polystyrene, agarose, sepharose, nylon, etc. These materials may possibly allow the confinement of magnetic material. It can also be a filter, a film, a membrane or a strip. These materials are well known to those skilled in the art.
  • the target may be a viral, bacterial, fungal, or yeast nucleic acid, present in a mixture, as a single or double strand of DNA and / or RNA.
  • the target is between 50 and 10,000 nucleotides long, but most often it is between 100 and 1000 nucleotides.
  • marker is meant a molecule carried by a nucleotide.
  • the link between the marker and the nucleotide can be done in different ways known to those skilled in the art. Manual coupling is by the use of markers bearing an activated group, typically a carboxyl or a thiol, which are coupled to a modified internal nucleotide carrying the corresponding reactive group (amine or thiol, for example), or on one end of the nucleotide strand modified with these same reactive groups.
  • the automatic coupling is done by the use of phosphoramidites bearing the marker, and then the coupling is done during the automated synthesis of the nucleotide strand, either on one end of the strand, or on an internal position, depending on the type of phosphoramidite used.
  • the marker may be a fluorophore or a fluorescent quencher.
  • fluorophore is meant a molecule that emits a fluorescence signal when it is excited by light at a suitable wavelength.
  • the fluorophore may be in particular a rhodamine or a derivative such as Texas Red, a fluorescein or a derivative (for example FAM), a fluorophore of the Alexa family such as Alexa532 and Alexa647, Alexa 405, Alexa 700, Alexa 680, Cy5 or any other fluorophore that is suitable for the measuring device used.
  • the fluorophores available for detection probes are very varied and known to those skilled in the art.
  • fluorescein means an aromatic chemical molecule that emits a fluorescence signal with a maximum emission around 530 nm, when it is excited by light at a wavelength in the vicinity. from 490 to 500 nm, preferably 495 nm.
  • fluorescent extinguisher or “quencher” is meant a molecule that interferes with the fluorescence emitted by a fluorophore.
  • This extinguisher can be chosen from non-fluorescent aromatic molecules, to avoid parasitic emissions.
  • said extinguisher is a Dabsyl or a Dabcyl or a "black hole quencher TM" (BHQ) which are non-fluorescent aromatic molecules that prevent the emission of fluorescence when they are physically near a fluorophore.
  • BHQ black hole quencher
  • the fluorescence resonance energy transfer technique (FRET) can also be used as described, for example, in Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes, p. 4, Ed.
  • the quencher may also be selected from fluorescent molecules, such as for example TAMRA (carboxytetramethylrhodamine).
  • TAMRA carboxytetramethylrhodamine
  • S3B is a probe as defined above and which, in addition to the preceding characteristics, consists of a nucleotide sequence of three different types of bases chosen from the group adenine, thymine, guanine, cytosine.
  • the probe will consist of a part of a sequence whose nucleotide sequence will be composed of nucleotides of four different types of bases and of a sequence whose nucleotide sequence will be composed of nucleotides of three different types of bases ( sequence for hybridization and detection of amplicons).
  • the probes according to the invention may occasionally contain uracil instead of thymine.
  • the probes according to the invention will consist of a nucleotide sequence of four different types of bases (uracil, guanine, adenine, thymine).
  • hybridization is meant the process in which, under appropriate conditions, two single-stranded nucleotide fragments, having all or part of complementary sequences, are capable of forming a double-strand or “duplex" stabilized by hydrogen bonds between the nucleic bases.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor and low salinity of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is carried out with higher stringency.
  • the stringency is defined in particular according to the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature.
  • concentration and type of ionic species present in the hybridization solution such as concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be performed will depend primarily on the hybridization probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art.
  • FIG. 1 represents a first embodiment of the disposable device according to the invention, which contains a single and only fluidic channel.
  • the device is ready to aspirate a biological sample to be treated in which at least one target nucleic acid is likely to be present.
  • FIG. 2 again represents this first embodiment, but in another particular configuration, in which the device is sucking up the biological sample to be treated (not shown in this figure).
  • FIG. 3 represents a second embodiment of the disposable device according to the invention, which contains two fluidic channels in parallel.
  • the device is ready to aspirate said biological sample containing at least one target nucleic acid, which may be present.
  • FIG. 4 also represents this second embodiment, but in another particular configuration, in which the device is sucking up the biological sample to be treated (not shown in this figure).
  • FIG. 5 represents a third embodiment of the disposable device according to the invention, which contains eight fluidic channels in parallel. In this particular configuration, the device is ready to aspirate said biological sample containing at least one target nucleic acid, which may be present.
  • FIG. 6 represents a section along A-A of FIG. 5 making it possible to better visualize the manner in which the suction and delivery actions are performed within said device.
  • FIGS. 7 to 10 show the device according to a variant of the second embodiment, but in use:
  • Figure 7 The disposable device does not contain the liquid sample of interest. Its tip is just in contact with it which is present in a container.
  • Figure 8 The tip being in contact with the sample, the pistons are moved to allow the aspiration of the sample of interest within the disposable device.
  • the sample is found at the level of the first compartment and the thermostable constituents that it contains.
  • the disposable device is mounted and / or the container is lowered, so that device and sample of said container are no longer in contact and that the single channel is filled more than air, as is the case in this figure 8.
  • the two downstream channels each containing a liquid column of an aliquot of the sample.
  • suction by the pistons is stopped when the device is removed from the remaining sample at the container.
  • FIG. 9 Aspiration of the sample of interest by said pistons continues and said sample is moved to the mixing means, where back-and-forth movements allow the mixing of the sample and thermostable constituents to be well mixed.
  • the sample assembly associated with thermostable constituents is thereafter always called “sample” for reasons of ease of reading and comprehension.
  • Figure 10 The pistons are moved to allow aspiration of the sample of interest within the disposable device. In this case the sample is found in the second compartment and the non-thermostable constituents it contains.
  • Figure 12 The pistons are moved to allow aspiration of the sample of interest within the disposable device. In this case, the sample is found at the level of the third compartment and the constituents necessary for the detection it contains.
  • Figure 13 shows NASBA amplification curves for the state of the art (EasyQ) according to increasing values of the target quantity (see scale from 0 to 10000 in the high position - see reference B).
  • the curves corresponding to the amplification of the HIV target sequence are plotted in the lower position (see reference to the arrow A), the curves corresponding to the calibrator are in the upper position.
  • FIG. 14 represents NASBA amplification curves for the invention under the same conditions as those applied in FIG. 13 (likewise for the use of the arrows A and B). Note that to improve the readability in this figure, the curves corresponding to the HIV target were expanded by a factor of 5.
  • the curves corresponding to the target vary from 8 to 40 rfu (Relative Fluorescence Unit) approx.
  • the curves of the calibrator ranging from 50 to 250, the graph is not readable if we put the two curves with the same scale.
  • the HIV curves vary between 40 and 200 and are therefore more readable.
  • they are relative values that do not prejudge.
  • the efficiency of the amplification is in fact the points of inflection of each curve which, they have a value of interpretation.
  • FIG. 15 proposes the variable quantization calculated by the HIV v.2.0 algorithm for the EasyQ instruments (on the left) and on the invention (on the right).
  • Figure 16 relates to the quantization result as a function of the target amount.
  • FIG. 17 represents a longitudinal section along B-B of FIG. 2 of the device according to the invention.
  • the present invention is well represented in all of FIGS. 1 to 17. Three embodiments are more particularly represented.
  • a first embodiment shown in Figures 1 and 2 represents a very simple embodiment of the present invention. It consists of a disposable device which is formed of a solid body 2 in which is etched on the surface a circuit or fluidic channel 3.
  • this fluidic circuit 3 is delimited by a film of BOPP type (Bi-Oriented PolyPropylen ), not referenced in these two figures, but present with the reference 14 in Figure 17, which prevents the liquid sample from leaving said circuit 3.
  • the fluidic channel 3 comprises on the one hand a through hole 4, called input, located at the bottom of each figure and another hole opening , said output, located at the top of each figure, which allows the channel 3 to have two openings on the outside.
  • the inlet 4 is formed by a pipette tip, referenced 16, that is to say molded in one piece with the entire body 2.
  • a pipette tip referenced 16
  • Figure 1 in pipette tip reported 27 is shown , showing a particular embodiment using a conventional tip.
  • the outlet 5 is present within a cylinder 17, which constitutes one of the parts of the discharge suction means 7.
  • this discharge suction means 7 is constituted by a piston 18 which can slide, within the cylinder 17, moved by an actuator, not represented here, according to the arrow Fl, on the one hand, which is a movement of the piston 18 in the cylinder 19 in which the volume of fluid within the circuit fluid 3 decreases, or according to the arrow F2, which is a movement of the piston 18 in the cylinder 19 which is totally different from the previous one, that is to say that it increases the volume of fluid within the fluidic circuit 3.
  • the actuator can act on the piston via a connection means 21. This system is particularly relevant in the case where it is desired to automate the entire system.
  • the fluidic circuit is relatively simple since it comprises along the channel 3 of substantially constant section, a first compartment 8, a second compartment 9 and, between the two 8 and 9, a mixing means 15 consisting of a set of baffles 19. The roles of these compartments 8 and 9 and mixing means 15 will be discussed further later.
  • FIGS. 3 and 4 The second embodiment is shown in FIGS. 3 and 4.
  • This is an embodiment substantially identical to the previous one, but in which two fluidic channels which are in parallel with each other are represented.
  • This device is referenced 100 even if all the other elements have the same reference numbers as those previously used.
  • FIG. 3 is substantially identical to FIG. 1 in that the piston 18 is in the rest position, that is to say that it is in the lower position within the cylinder 17 and that the actuator or the manipulator moves said piston 18 through the connecting means 21.
  • a third compartment 10 there is upstream a third compartment 10.
  • a siphon is formed between the second and third compartments 9 and 10, namely that the first bend of the siphon is located above the first compartment 9 and the third compartment 10 is located at the level of the second c or siphon.
  • the compartment 10 can be deleted and the reading performed directly in the compartment 9.
  • the role of the compartment 9 or 10 is first of all to secure any unwanted movement of the liquid towards the lower part of the card, said card being used in an upright position, and then, to increase the volume of liquid that can be used for the fluorescence detection by maximizing the diameter of the reading cap, made in the associated heating block in the instrument and position in relation to the compartment 9 or 10.
  • Another characteristic of this embodiment is that for an inlet 4, there are two outlets 5 since each channel 3 is connected upstream to a discharge suction means 7.
  • each channel 3 is associated with a cylinder 17 and a piston 18.
  • the two pistons 18 are independent of each other, as can be seen in FIG. 4, that is to say that they can be actuated according to F1 and F2 independently of one another. the other.
  • the individualized two-piston configuration makes it possible to correct the positioning defect of the liquid segments in each fluid channel individually, in particular by a registration of said segments in the detection zone, for example, the offset that may be due to a non-homogeneous viscous sample, a slight molding defect in the fluid circuit of the board or an undesired displacement due to a thermal gradient momentarily causing a differential pressure on either side of the fluidic segment.
  • This therefore makes it possible to increase the robustness of operation of the device.
  • This system works as soon as there is more than one channel, using position sensors placed at appropriate places, on the one hand within the device, and on the other hand with respect to the card. according to the invention.
  • each piston 18 may be provided with a guide 23 which is connected at one end to the upper end of the connecting rod.
  • This anti ⁇ extraction system is naturally adaptable to all embodiments contemplated by the present invention.
  • FIGS. 5 and 6 show a third embodiment which is substantially identical to the previous embodiment, except that it comprises in parallel eight fluidic channels 3.
  • this third embodiment comprises pistons 18 which are manipulable via the connecting means 21 independently and independently from the other pistons 18 adjacent.
  • FIG. 6 shows a longitudinal section along the axis AA of FIG. 5, which makes it possible to better visualize the connection that exists between the channel 3 and the discharge suction means 7.
  • This section makes it possible to see the body 2 the device 200, which has on its upper surface a channel 3 delimited with respect to the outside by means of a partition film 14 made of a suitable material.
  • the film is preferably BOPP (Bi-oriented PolyPropylene) with a silicone adhesive, but can also be made of PP (PolyPropylene), PET (Polyethylene Terephthalate), TPE (ThermoPlastic Elastomer), PP / PE-type complex films that can be sealed by laser process around the fluidic channels.
  • This channel 3 leads to a transverse hole 25 which opens into the cylinder 17.
  • the piston 18 whose piston head 26 forms a seal with the liner of said cylinder 17.
  • the piston head 26 may be composed of two parts (body with groove and elastomer O-ring) or consist of a one-piece piston, in one piece, simplifying assembly operations of the card and reducing the cost per test. It is therefore obvious that when the actuator or the manipulator exerts a force, according to F2 on the piston 18, it will allow the suction of the gaseous or liquid fluid present in the channel 3, while the action according to Fl will allow to bring out this fluid through the outlet 4, not shown in Figure 6.
  • the intrinsic positioning accuracy is improved compared to a simple piston (having the same diameter) because the volume of pumped liquid is determined / calibrated by the difference in volume between the two sections of said piston (the suction is located between the two diameters of this piston).
  • FIGS. 7 to 14 show the second embodiment of FIGS. 3 and 4 during the use of the device 100. It should be noted that this device 100 is very slightly different from that already exhibited since the two pistons are, in the case present, secured to each other so that the fluidic movement in each of the two channels 3 is identical. This is of course an option and we can predict that the pistons can be detached from each other, either automatically by the controller, or manually by the manipulator as needed. It is also possible that the bridge connecting the two pistons is deformable without being physically cut.
  • the liquid and biological sample 6 is included in a container 20 only although it 6 is in contact with the device 100; in particular the tip 16 is partially immersed in said liquid 6.
  • the device 100 comprises in addition to what has been shown in Figures 3 and 4 thermostable constituents 12 present in the first compartment 8 and non-thermostable constituents
  • the constituents are stored in solid form, for example according to the technical information disclosed in EP-B-0,641,389, to which the reader is asked to refer for more details on this subject.
  • the nozzle is provided with a pipetting cone 27, as shown in FIG. 1, for example 50 to 200 ⁇ L of capacity or else, and this is not shown in the figures but is well known to those skilled in the art, a polyethylene straw which can be thermally sealed, after completion of all the fluidic sequences in the card.
  • the container of the sample biological may be in contact with the tip, or it will be the card that will be moved by the instrument to come into contact with the liquid contained in the container, the latter case corresponding to the case of architectures for high-speed machines.
  • the device will then be used as a conventional pipetting cone and will therefore move along the X, Y and / or Z axes by a robot to collect in the container or containers.
  • the connecting means 21 is moved along F2 so that the pistons 18 suck the liquid sample present in the container 20 within the card.
  • the device 100 has been raised while the pistons 18 continue their aspiration, which explains the presence of two columns of liquid in each of the channels 3.
  • the volume sucked is related to the section of the piston integrated in the card and to the length of displacement of the piston.
  • the first stop of each liquid sample 6 is at the first compartment 8, that is to say at the thermostable components 12, which allows to dilute said components that are actually stored in lyophilized or dried form, as is the case for the other components 9 and 10.
  • the liquid segment is maintained on the position of the reagent to facilitate resuspension of the dried or lyophilized reagent, typically ten seconds, usually less than a minute.
  • FIG. 9 it is noted that there is a first zone for heating 11 represented by dashed lines.
  • This zone symbolically represents the place where the manipulator or the automaton will come to apply a source of heat in order to proceed with the treatment of the liquid sample 6 + 12, that is to say of the sample 6 in the presence thermostable constituents 12, in order to start an amplification technique, such as NASBA.
  • Non-thermostable constituents essentially mean the enzymes necessary for amplification. These include, in the context of a post-transcriptional amplification of AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus- Reverse Transcriptase), RNase H and T7 polymerase (DNA depend RNA polymerase).
  • the flow rate is typically 1 ⁇ per second.
  • an optical sensor of the instrument not shown on the FIGS, positioned approximately two millimeters before each reagent, embedded in the card, makes it possible to detect the presence of the liquid segments and thus to guarantee a sufficient robustness of operation by offsetting the effects related to the difference of each sample.
  • optical sensors also makes it possible to measure the length of the liquid segment and therefore to verify the accuracy of the liquid division performed during the suction step and loading of the sample in the card.
  • each column of liquid is then lowered again along Fl at the mixing means 15.
  • the whole of the mixture 6 + 12 + 13 is also moved along F3 and F, so that the baffles 19 allow an appropriate mixture of the thermostable constituents 12 and non-heat-stable 13 within the sample 6.
  • the arrival in the chambers can be advantageously detected by the fluorescence read head integrated in the instrument to perform the real-time measurement of the amplification reaction.
  • FIG. 11 shows, like FIG. 9, a second zone for heating 22 which also makes it possible to carry out NASBA amplification.
  • the suction according to F2 allows the liquid columns 6 + 12 + 13 to go up to the third compartment 10, which then acts as a read zone.
  • this reading zone can be either the first 8, the second 9 or the third compartment 10.
  • the third compartment 10 acts as a buffer zone to prevent any inappropriate rise in liquid to the top of the device, this action is reinforced by closing the valve 27.
  • the suction according to F2 is more important. which allows the liquid columns 6 + 12 + 13 to go up to said third compartment 10, where the reading can take place.
  • thermostable constituents 12 are split into two spheres, called "pellets" in English.
  • a first sphere present in the first compartment 8, containing the amplification primers, nucleotides and any other thermostable ingredient necessary to allow the elongation of the primers during amplification.
  • a second sphere present in the third compartment 10, containing the detection probe or probes necessary for the detection of the amplicons, after the amplification step.
  • the baffles 19 allow an appropriate mixture of thermostable constituents 12 and non-thermostable 13 within 6. The reading can be done in any of compartments 8, 9 or 10.
  • said valve can be removed and replaced by a straw, as mentioned above, which can be sealed, for example to heat, valve which will then have two functions, first pipetting into the sample container and then closing by using a heating wire within the associated instrument.
  • the first tube contains the biological sample to be treated
  • At least one second tube contains a wash buffer
  • a fourth tube for recovering the eluate for recovering the eluate.
  • the latter is optional, but useful if it is desired to take an aliquot, for example, to carry out sequencing before a new aspiration into the device to carry out the amplification.
  • a silica filter is added either at the cone 16 or at the level of the pipette cone 28.
  • This silica filter comes from Akonni (Ref .: 300-10606, Frederick, MD, USA) .
  • the device of the invention descends to aspirate all or part of the biological sample to be tested (blood, urine, etc.) for about 5 to 100 ⁇ l in the first tube. These values are approximate because they are limited by the stroke and volume of (Figure 1) or pistons (Figure 3 for two pistons and Figure 5 for eight pistons).
  • the size (stroke and diameter) of the pistons integrated in the card may be increased in order to arrive at the best compromise between suction of a large volume of sample, on the one hand, and accuracy of displacement of the eluate in said device, on the other hand, during the amplification steps.
  • the sample is previously lysed, optionally in the carousel in the presence of GuSCn or ultrasound, in this case the tube is coupled to a sonotrode . placed under the carousel. This sample is sucked into the silica filter with, if necessary, round trips to increase the time sample residence in the filter and improve the capture efficiency of nucleic acids (RNA / DNA).
  • the remaining sample is then released into the first tube or into another container or tube containing the waste.
  • the carousel then rotates to bring the second wash tube under the pipetting cone.
  • the wash buffer is sucked by the pistons, mixed in the filter if necessary, and then discharged into the first tube or into another container or tube containing the waste.
  • the washing can be performed at least one other time.
  • either the device will suck the same wash buffer as before, if it has not already been used, or the carousel rotates to bring another second wash tube under the pipetting cone.
  • the washing procedure is thus repeated with the washing buffer which is sucked by the pistons, with mixing in the filter if necessary, then rejected in the second tube or in the waste tube.
  • the carousel then rotates to bring the third tube containing the elution buffer under the pipetting cone.
  • the tube rack may optionally be provided with a heating block for maintaining the temperature of the elution buffer between room temperature and 75 ° C, in order to improve if necessary the release of the nucleic acids of the filter.
  • a buffer volume of 10 to 160 ⁇ L (depending on the reaction volume by fluidic circuits 3 and the number of circuits 3 per device) is sucked by the pistons, with mixing in the filter if necessary, and then rejected either in the empty tube after rotation the carousel (for recovery of the eluate) is directly transferred by suction into the card to start the amplification process.
  • This example shows the quantization performance obtained with a disposable device according to the second embodiment of the invention, namely the card with two fluidic channels in parallel (see FIGS. 3 and 4).
  • the tests were conducted using the Human Immunodeficiency Virus (HIV) as a target.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • the transcripts were introduced into the two Nuclisens EasyQ devices and according to the invention. There is no sample preparation step, such as extraction.
  • P / B A mixture of primers and probes, hereinafter referred to as P / B: there are in fact two P / B spheres (Batch No. 83283SXX), to which are added 180 ⁇ L of diluent for P / B 2X ( 83272AXX).
  • the disposable device according to the invention is completely automated to allow amplification and detection. It makes it possible to take the sample of the biological sample to be tested, containing the targets.
  • the experimental protocol of the device according to the invention is defined so that the reagents (primers, probes and enzymes in particular) have the same concentration as in the EasyQ protocol. Nevertheless, the volume per test used in our invention is 5 ⁇ L instead of 40 L with EasyQ. The quantity of reagents is thus divided by eight.
  • the reagents from the PVB1 kit were lyophilized and put into the device according to the invention.
  • the lyophilization bench is associated with a Hamilton pipettor robot (Order No. 202997, Bonaduz, Switzerland) which allows the reproducible deposition of droplets of 1 ⁇ L for P / B and 1.25 ⁇ L for ENZ in the dedicated compartments of the inventive device. .
  • the amplification and detection instrument used with the invention performs all functions necessary to obtain an amplification curve, i.e., sample aspiration, reagent mixing, heating and fluorescence readout. This concept removes most of the mandatory manual steps with EasyQ.
  • the biological sample used for this study contains HIV targets. This sample is then diluted for EasyQ experiments and the invention, but the same dilution series are used. Table 2 below shows the number of HIV targets per test as well as the number of experiments performed with each of the two devices (EasyQ and invention).
  • the number of copies "equivalent" pre-extraction corresponds to the number of copies that would be necessary before an extraction step to obtain the number of copies per test (that is to say "equivalent” pre-extraction equal number of copies per test divided by the extraction yield).
  • Table 2 Number of HIV targets per test as well as the number of experiments performed with each of the two devices
  • plicate is meant the number of times that the test has been run in parallel from the same starting sample.
  • the number of copies for internal control purposes is 290 per test, both for EasyQ and for the invention.
  • the detection limit claimed for EasyQ is 25 copies (pre-extraction equivalent), which corresponds to 7.5 copies per test.
  • the data acquired with EasyQ was processed with EasyQ Director software (BioMérieux S.A., La Balme, France), using the HIV-lDB 2.0 test protocol (Ref 285033, bioMérieux B.V., Boxtel, The Netherlands).
  • EasyQ Director software BioMérieux S.A., La Balme, France
  • HIV-lDB 2.0 test protocol Ref 285033, bioMérieux B.V., Boxtel, The Netherlands.
  • Each amplification curve, measured with the instrument using the invention was processed using an internal tool called EDrecalc recalculation on the algorithm for calculating and interpreting the amplification curves, which is included in FIG. the commercial software EasyQ Director cited above, with the same algorithm used by the EasyQ Director software and the HIV-lDB 2.0 test protocol.
  • the raw fluorescence curves are shown in FIG. 13 for the device according to the state of the art (EasyQ) and in FIG. 14 for the invention.
  • the curves amplification obtained with the invention are very similar to those obtained with EasyQ.
  • a broad distribution of the fluorescence values for the fluorescence plateau of the signal from the calibrator can be observed. Since this distribution exists with each instrument, this propagation is not related to the instrumentation.
  • the limit of detection claimed for the NucliSENS HIV 2.0 test is 25 copies (detection limit at 95% positive). With this input value, all the tests carried out with the device according to the invention are positive. With 12.5 copies, about 50% of the tests are positive with EasyQ and slightly more with the invention. We can therefore legitimately consider that our invention has results at least similar to the detection limit of the state of the art, EasyQ. 3.2 - Quantification performance:
  • Figure 15 shows the Qratio (quantization variable) as a function of the number of copies in input. The distribution of points corresponding to the data is similar for both instruments.
  • the precision ie the standard deviation of the results of the different replicates, must be less than 0.3 log.
  • the prototype complies well with the accuracy specification (that is, the difference between the result and the number of copies at the input of the test) is 0.25.
  • the linearity for the invention is the same as for EasyQ but needs to be measured beyond the 4 copies of this study.
  • the present invention in its configuration with two parallel fluidic channels has been used to detect HIV targets via the HIV v.2.0 kit. The results were compared with the EasyQ analyzer, which was used as a reference.
  • the performances of the invention are in line with the most important constraints necessary for carrying out an HIV test (HIV v.2.0) and are at least comparable to those recorded with the EasyQ analyzer.
  • the invention used a reaction volume of 5 L (instead of 40 ⁇ L for EasyQ), the amount of reagents per test was divided by eight. This leads to a much lower cost of production per test, because this cost is mainly due to the enzymes, representing about 80% of all the ingredients of the kit.
  • the device according to the invention also greatly reduces the number of manual steps, since only three basic actions are necessary to launch a test:

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif jetable (100) d'amplification d'au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon liquide et biologique d'intérêt, qui est constitué d'un corps solide (2), d'au moins un canal fluidique (3) connectant une entrée (4), par laquelle tout ou partie de l'échantillon d'intérêt peut être aspiré et/ou refoulé, et une sortie (5), qui est elle-même raccordée à un moyen d'aspiration-refoulement dudit échantillon d'intérêt, le canal fluidique (3) comprenant en outre de l'entrée (4) jusqu'à la sortie (5); un premier compartiment (8) contenant tout ou partie des constituants thermostables, un moyen de mélange (15) des constituants avec l'échantillon d'intérêt, un deuxième compartiment (9) contenant tout ou partie des constituants non-thermostables, et en plus au moins une zone destinée au chauffage dudit échantillon d'intérêt (6) mélangé auxdits constituants d'amplification, afin de permettre l'amplification de l'acide nucléique cible. L'invention propose également un procédé d'amplification mettant en œuvre un tel dispositif. Ladite invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic médical.

Description

« Dispositif d'amplification d'acides nucléiques simplifie et son procédé de mise en oeuvre »
La présente invention concerne un dispositif jetable permettant l'amplification, d'au moins un , acide nucléique ciblé. La présente invention concerne également un procédé d'amplification d'un tel acide nucléique cible, qui utilise un dispositif précédemment cité. Le dispositif, comme le procédé, sont utilisables avec tout type de technique d'amplification, tel que la PCR ou une technique d'amplification post- transcriptionnelle, telle que la TMA ou la NASBA.
L'état de la technique est constitué par le document 0- A- 99 /33559 qui concerne une cartouche intégrée permettant la manipulation de fluides, mais également du même déposant, le document WO-A-2006/ 132886v qui traite d'une méthode et un appareil pour stocker et utiliser des réactifs ·, sous forme de billes. Ce système se compose d'un instrument compact à quatre modules identiques et. démontables et d'une cartouche à puits multiple qui intègre une 'Vanne multivoies. Un piston permet de déplacer les liquides d'un puits à un autre de la cartouche afin de les mélanger. Parmi les différentes . zones de la cartouche, chacune d'elles peut soit permettre :
• la filtration sur matrice de silice pour réaliser une capture, une purification et une concentration de l'échantillon étudié,' -
• la lyse qui, par l'intermédiaire de billes dè verre et sous l'action d'ultrasons, générer par un . instrument, permet de lyser les membranes cellulaires des cellules présentes dans l'échantillon,
• l'amplification est réalisée par transfert de tout ou partie de l'éluat dans la zone d'amplification et de détection (PCR) de la cartouche. La cartouche peut intégrer des réactifs solides, liquides ou -les deux simultanément. Ce système est donc totalement intégré et automatisé, avec une temps de rendu de résultat assez court (de l'ordre d' une heure ) .
Cependant, de part le concept choisi, la cartouche est relativement complexe et coûteuse. Elle est donc peu adaptée à un système haute cadence. De plus elle ne permet pas de réaliser plusieurs tests par échantillon autrement que par multiplexage des amorces d'amplification et/ou des sondes de détection dans le même volume. Ceci rend le développement d'essais biologiques beaucoup plus complexe et long avec des compromis inévitables au niveau des performances de détection.
Notre invention est nettement mieux adaptée à de hautes cadences car la carte que nous protégeons peut être facilement manipulée par un automate à la manière d'un simple cône de pipetage .
De plus son encombrement latéral est réduit ce qui permet d'envisager une architecture haute cadence utilisant un carrousel de lecture en fluorescence de diamètre acceptable pour un système dimensionné pour la haute cadence. Enfin le design allongé, avec une surface plane, permet facilement de mouvoir cette carte au sein d'un carrousel de lecture nécessitant :
• d'assurer un bon contact thermique pour les cycles thermiques (type PCR) ou une température constante et homogène (type NASBA, TMA) tout en permettant de déplacer ladite carte par glissement sur les blocs d' incubation, et
• de réaliser une lecture en fluorescence, la carte pouvant être aisément déplacée devant les différentes têtes de lecture (différentes longueurs d'onde).
Par haute cadence on veut dire une cadence supérieure à 300 tests par jour, avec un coût par test faible et un encombrement réduit . Comparativement à ce système, la présente invention permet d'avoir des coûts par test compatibles avec du diagnostic viral ou microbiologique en routine, à haute cadence, mais également pour les tests déportés auprès des patients, autrement appelés en anglais POCT (Point Of Care Testing) , grâce notamment à la simplicité du consommable développé, à sa fonction de pipetage intégrée et au volume réduit de réaction d'amplification, permettant de réduire le coût par test (les enzymes en biologie moléculaire constituent la majeure partie de ce coût par test pour la partie « réactifs » et une diminution du volume réactionnel permet donc d'avoir une réduction proportionnelle à la réduction du volume) (5 pL au lieu de 50 à 80 μL dans ces demandes) .
L' état de la technique comprend également le document W0- A-2004/004904 qui concerne un appareil conçu pour réaliser des tests rapides de manière autonome et mobile, dans le cadre notamment du bio-terrorisme, de la guerre bactériologique, et des POCT, appareil qui nécessite un minimum d'opérations manuelles. Ce système utilise une cartouche munie de ports d'entrées reliés à une pochette souple à un ou plusieurs compartiments dans lesquels sont lyophilisés les réactifs d'amplification (PCR). La lecture de la fluorescence s'effectue directement au travers du film souple déformable. Les pochettes sont maintenues sous vide ce qui permet après l'introduction des échantillons d'acides nucléiques via l'entrée du port du consommable, d'effectuer un remplissage automatique et calibré et de dissoudre les réactifs lyophilisés préalablement à l'amplification par PCR.
Ce dispositif n'est pas adapté pour réaliser des tests de routine à haute cadence. Ce système de répartition et/ou division fluidique par vide est efficace pour des protocoles à une seule étape fluidique (remplissage) utilisable dans le cas d'une amplification par PCR. Mais il est mal adapté au procédé d'amplification d'acides nucléiques, qui nécessitent de remettre en suspension successivement plusieurs réactifs, tel que, c'est le cas pour les amplifications NASBA ou TMA. Ceci nécessite donc d'ajouter une vanne et de maintenir un vide partiel entre les deux chambres contenants les réactifs d'amplification, entraînant une complexification du consommable et de l'instrument associé. De plus le consommable ne permet pas d'aspirer directement, sans intervention manuelle, l'échantillon contenant des acides nucléiques (dépôt à la pipette) ; il n'y a donc pas de fonction pipetage. De plus, ce dispositif, qui associe une partie rigide et une partie poche souple, n'est pas aisément gérable dans une architecture dans laquelle l'utilisateur peut mettre un échantillon à tout moment même pendant le fonctionnement de l'instrument, architecture dite « Random Access ».
Notre invention, au contraire, propose une carte qui peut facilement être manipulée par un robot et être utilisée comme un cône pour pipeter des solutions, les mélanger, reprendre l'éluat et l'aspirer en son sein pour effectuer des réactions telles que des réactions d'amplification. La carte, selon la présente invention, peut donc être utilisée comme un cône de pipette permettant de réaliser des ajouts, d'aspirer des réactifs liquides dans des tubes, et ainsi effectuer les étapes préalablement à l'étape d'amplification/détection. Avec une automatisation adaptée, ladite carte . peut également prélever et retirer plusieurs cônes en même temps. A cette fin des modes de réalisation, comportant plus d'une voie fluidique, sont présentés dans la suite de ce document.
La présente invention de la Demanderesse, par son design original, permet de s'adapter à la fois au protocole d'amplification PCR (ou RT-PCR) ne nécessitant qu'un réactif (et donc réalisable dans une seule chambre) ou au protocole d'amplification à deux étapes nécessitant de séparer, dans deux chambres distinctes, les réactifs d'amplification, comme c'est le cas avec les amplifications post-transcriptionnelles . L'invention résout également le problème d'architecture de l'instrument, en proposant un consommable (ou carte) pouvant être utilisé soit dans un système POCT (quelques tests par jour) soit dans un système de diagnostic de routine haute cadence (supérieure à 300 tests par jour) par l'intégration de la fonction de pipetage, qui utilise des cônes classiques (rapportés ou intégrés) .
L'état de la technique est aussi constitué pour le document WO-A-2007/100500. Il s'agit d'un système très orienté POCT ou le bas débit en biologie moléculaire. Ce système simple d'utilisation permet de travailler directement à partir d'une goutte de sang (quelques dizaine de pL) . L'instrument associé est également compact grâce à une combinaison d' actionneurs permettant d'isoler les compartiments du consommable de forme tubulaire et ainsi de permettre le transfert et le mélange des liquides dans l'ordre défini lors de la fabrication par le remplissage préalable du consommable.
Un inconvénient majeur de ce système est son manqué de flexibilité sur le protocole biologique à réaliser. D'une part, les volumes d'échantillons et de tampons (particules magnétiques de capture des acides nucléiques, tampons de lavage et d'élution) sont figés par le volume de chaque compartiment du consommable, tel que défini à la fabrication du consommable. Il est connu qu'il est souvent nécessaire d'avoir recours à la modification du protocole biologique, afin d'obtenir de meilleures performances de capture, d'amplification et de détection des acides nucléiques en fonction de différents paramètres, comme par exemple la nature de l'échantillon biologique traités, la présence ou non d'inhibiteurs (crachat, LBA, plasma, urine, sang total, etc.). Avec ce système de l'état de la technique, la modification des protocoles nécessite de créer à chaque fois un consommable différent avec des volumes différents pour chaque compartiment et ainsi de modifier les zones de scellement, avec une contrainte très forte liée à l'emplacement des zones d'implantation des actionneurs mobiles dans l'instrument associé (vannes et pistons pour la rupture par sur-pression desdites zones de scellage) . D'autre part, le volume d' échantillon reste très réduit et ne couvre donc pas l'ensemble des besoins des utilisateurs notamment ceux liés aux tests partant de plusieurs millilitres d'échantillon. D'autre part, l'objet souple est difficilement gérable par un automate sauf à avoir un coût supplémentaire important. Il n'a pas de fonction pipetage ni de souplesse sur le choix des volumes d'élution et de lavage, et donc moins de flexibilité dans la préparation des échantillons.
La demanderesse a également déposé un certain nombre de documents qui peuvent constituer l'état de la technique il s'agit notamment de la demande de brevet EP-B-1.187.678 qui concerne un dispositif de mise en œuvre d'une carte d'analyse au sein de laquelle des étapes réactionnelles et des transferts de fluides sont réalisés sous l'effet de moyens de contrôle interne à la carte.
Un problème de ce genre de dispositif est qu'il est obligé de fonctionner à l'aide de vannes qui sont constituées d'éléments déformables sous l'action d'un actionneur ce qui entraîne la fermeture directe ou indirecte des canaux associés aux vannes. Le problème essentiel avec ce dispositif est la complexité. Ainsi la présence de vannes complexifie considérablement la réalisation de la carte d'analyse ainsi formée et grève son prix de production, et d'autre part, il y a besoin de nombreux éléments extérieurs (actionneurs) pour permettre l' actionnement de l'ensemble desdites vannes. La présente invention se propose de résoudre les problèmes mis en exergue par l'ensemble des documents de l'état de la technique ci-dessus mentionnés. Pour ce faire, elle propose un dispositif qui est jetable et qui répond à un certain nombre de caractéristiques techniques.
Dans un mode particulièrement intéressant de réalisation de l'invention, le dispositif est un consommable qui est considéré comme une pipette, embarquant les réactifs séchés ou lyophilisés nécessaires à une amplification de cibles ARN ou ADN à partir d'un volume réduit d'acides nucléiques (5 à 10 μΐι) , d'où une réduction des coûts liés aux réactifs, et intégrant une vanne pour éliminer tous risques de contamination. Il s'agit d'une vanne à tiroir, normalement ouverte puis fermée après localisation du volume réactionnel dans la zone de lecture, lorsqu'il n'y a plus d'étapes à réaliser. Ce type de dispositif a de nombreuses qualités inconnues de l'état de la technique :
• Capacité à réaliser, à partir de ce concept, des automates dans une version POCT (traitement par lot de 8-24 échantillons par lot) et dans une version d'automate haute cadence en utilisant le même consommable.
• Prélèvement automatique, par déplacement de l'embout rapporté ou faisant partie intégrante du dispositif selon l'invention, du volume d'acide nucléique purifié permettant de réduire le nombre d'étapes manuelles, ce qui par conséquent permet de simplifier l'automatisation d'un appareil automate utilisant de tels consommables.
• Capacité à intégrer dans un même instrument associé une amplification PCR ou NASBA pour le POCT.
• Simplification de l'instrumentation par l'intégration dans le dispositif de réactifs embarqués et lyophilisés ou séchés, pouvant être dissous et mélangés successivement par simple déplacement au sein dudit dispositif dont la 6
8 configuration du circuit fluidique facilite cette dissolution et ce mixage.
• Capacité à effectuer des mono-tests (un jeu d'amorces d'amplification par canal fluidique au sein du dispositif) , des tests multiplex (avec au moins deux jeux d'amorces par canal) ou par panel (au moins deux jeux d'amorces séparés dans au moins deux canaux) à partir d'une architecture instrumentale commune.
• Automatisation totale du protocole d'amplification avec un dispositif peu onéreux et une instrumentation associée qui est compact.
• Réduction de la durée totale d'amplification (notamment en NASBA) par réduction du temps de dénaturation par rapport à une amplification « conventionnelle » (1 minute versus 5 à 10 minutes) du fait d'un chauffage à travers le film fin d'operculage du canal réactionnel, en lieu et place d'un tube plastique plus épais, dont l'inertie thermique est défavorable .
• Pas de contrainte de temps de vie de l'enzyme par rapport à une automatisation classique, les réactifs, embarqués dans ledit dispositif, restant secs jusqu'à leur reprise par l'échantillon liquide à amplifier.
La présente invention concerne un dispositif jetable permettant l'amplification d'au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon liquide et biologique d'intérêt, qui est constitué d'un corps solide, d'au moins un canal fluidique connectant une entrée, par laquelle tout ou partie de l'échantillon d'intérêt peut être aspiré et/ou refoulé, et une sortie, qui est elle-même raccordée à un moyen d'aspiration- refoulement dudit échantillon d'intérêt, le canal fluidique comprenant en outre de l'entrée jusqu'à la sortie : • un premier compartiment contenant tout ou partie des constituants thermostables nécessaires à la réalisation de l'amplification,
• un moyen de mélange des constituants avec l'échantillon d'intérêt,
• un deuxième compartiment contenant tout ou partie des constituants non-thermostables nécessaires à la réalisation de l'amplification,
• et en plus au moins une zone destinée au chauffage dudit échantillon d' intérêt mélangé auxdits constituants d'amplification, afin de permettre l'amplification de l'acide nucléique cible.
Selon un mode de réalisation, le dispositif permettant la détection des amplicons est caractérisé par le fait qu'il comprend de surcroît au niveau du deuxième compartiment, tout ou partie des constituants de détection nécessaires à la détection des amplicons.
Selon une autre mode de réalisation, le dispositif, permettant la détection des amplicons, se caractérise par le fait qu'il comprend de surcroît au niveau du canal fluidique un troisième compartiment contenant tout ou partie des constituants nécessaires à la détection des amplicons.
Toujours selon un autre mode de réalisation, le dispositif comprend de surcroît au niveau du canal fluidique un troisième compartiment ne contenant rien mais servant à la détection ultérieure des amplicons dans un environnement propre.
Selon une variante de réalisation, le dispositif, décrit au paragraphe précédent, le troisième compartiment est situé entre le deuxième compartiment et la sortie du dispositif.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, l'entrée du dispositif reçoit un cône de pipette ou l'embout de pipette possède une configuration en forme de cône de pipette. Quel que soit le mode ou la variante de réalisation qui précède, le dispositif d'aspiration-refoulement est de type à piston tel que par exemple une pipette.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation qui précède, la section du canal est constante et les compartiments sont d'une section plus importante.
Selon un mode de réalisation multi-voies, l'entrée est en relation avec au moins deux canaux fluidiques.
Toujours selon un mode de réalisation multivoies, la sortie est constituée par au moins deux canaux fluidiques.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation qui précède, les constituants sont formés de composés biologiques lyophilisés ou séchés, solubles dans l'échantillon d'intérêt.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation qui précède, le moyen d'aspiration-refoulement est partie intégrante du dispositif jetable.
Selon cette dernière variante de réalisation, le moyen d'aspiration-refoulement est constitué d'un cylindre connecté au canal fluidique et d'un piston mobile au sein du cylindre manuellement ou par l'intermédiaire d'un actionneur.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation qui précède, le moyen de mélange est constitué du canal fluidique dont le cheminement comprend au moins une chicane.
La présente invention propose également un procédé d'amplification d'au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon liquide et biologique d'intérêt, réalisé au sein d'un dispositif précédemment décrit, qui consiste :
(a) aspirer par l'entrée tout ou partie de l'échantillon d'intérêt au sein du dispositif,
(b) déplacer ledit échantillon pour y dissoudre les constituants d'amplification thermostables,
(c) mélanger échantillon et constituants thermostables, (d) appliquer un premier gradient de température afin de dénaturer l'acide nucléique d'intérêt,
(e) déplacer la mixture pour y dissoudre les constituants d'amplification non-thermostables,
(f) mélanger mixture et constituants non-thermostables, et
(g) appliquer au moins un second gradient de température afin d'amplifier l'acide nucléique dénaturé.
Selon un mode de réalisation, les constituants d'amplification thermostables de l'étape (b) contiennent également des enzymes de restriction, qui ne sont pas forcément thermostables, mais qui permettent le clivage en des positions prédéterminées des acides nucléiques d'intérêt, qui sont des acides désoxyribonucléiques, préalablement à l'application du premier gradient de température de l'étape (d) .
Selon un autre mode de réalisation, qui peut être utilisé en complément avec le mode précédemment mentionné, la détection des amplicons consiste, après l'étape (g) à :
(h) déplacer la nouvelle mixture pour y dissoudre les constituants de détection,
(i) mélanger mixture et constituants de détection, et (j) détecter la présence d' amplicons.
Selon un autre mode de réalisation, qui peut être utilisé en complément avec au moins l'un des modes précédemment mentionné, l'amplification est une amplification PCR, pour laquelle le premier gradient de température est compris entre 90 et 100°C, et les seconds gradients de température est une alternance de la température en trois étapes différentes :
• entre 90 et 100 °C pour la première température de dénaturation, préférentiellement d'environ 94 °C,
• entre 50 et 60 °C pour la deuxième température d'hybridation, préférentiellement d'environ 55 °C, • entre 70 et 75°C pour la troisième température de polymérisation, préfèrenttellement d'environ 72°C.
Selon un autre mode de réalisation, qui peut être utilisé en complément avec au moins l'un des modes précédemment mentionnés, l'amplification est une amplification post transcriptionnelle (NASBA ou TMA) , pour laquelle le premier gradient de température est compris entre 60 et 70°C, préférentiellement d'environ 65°C, et le second gradient de température est compris entre entre 40 et 50°C pour le second gradient de température de polymérisation.
Selon un autre mode de réalisation, qui peut être utilisé en complément avec au moins l'un des modes précédemment mentionné, le premier gradient de température est appliqué au niveau du premier compartiment et/ou du moyen de mélange, et le ou les seconds gradients de température est ou sont appliqués au niveau du moyen de mélange et/ou du second compartiment et/ou du troisième compartiment.
Toujours selon un autre mode de réalisation, qui peut être utilisé en complément avec au moins l'un des modes précédemment mentionné le premier gradient de température est appliqué pendant 5 à 20 minutes, préférentiellement 15 minutes, et que le ou les seconds gradients de température est ou sont appliqués :
• dans le cas d'une amplification PCR :
- pour la dénaturation, pendant moins de une minute, préférentiellement de 2 à 20 secondes, préférentiellement 5 secondes,
- pour l'hybridation, pendant moins de une minute, préférentiellement de 2 à 20 secondes, préférentiellement 5 secondes, et
- pour la polymérisation, pendant moins de deux minutes, préférentiellement de 5 à 80 secondes, préférentiellement 10 secondes, • dans le cas d'une amplification post- transcriptionnelle, pendant moins de deux heures, préférentiellement de 5 à 80 minutes, et encore plus préférentiellement :
environ 60 minutes dans le cas d' acides nucléiques cibles ARN, ou
environ 90 minutes dans le cas d'acides nucléiques cibles ADN.
Les termes suivants peuvent être indifféremment utilisés au singulier ou au pluriel.
Le terme « constituant » veut aussi bien dire « réactif », « réactif d'amplification », « réactif d'extraction » ou « réactif de purification » ou « matière première » et désignent les réactifs, tels que les tampons de réaction, les enzymes, les nucléosides mono-, bi- ou triphosphates , mais aussi les solvants, les sels nécessaires à la réalisation d'une réaction d'extraction, de purification ou d'amplification enzymatique d'un acide nucléique.
Par « contenant » ou « contenant plastique » au sens de la présente invention, on entend désigner tout récipient tel que les tubes, les cônes ou embouts de pipettes, qu'ils soient en plastique (par exemple de type Eppendorf) ou en verre ou en tous autres matériaux...
Par « acide nucléique » au sens de la présence invention, on entend un enchaînement d'au moins deux nucléotides, préférentiellement au moins dix nucléotides choisis parmi les quatre types de nucléotides du code génétique, à savoir si l'acide nucléique est un ADN:
• le dAMP (désoxyadénosine 5' -monophosphate) ,
• le dGMP (désoxyguanosine 5 ' -monophosphate ) ,
• le dTMP (désoxythymidine 5' -monophosphate) , et
• le dCMP (désoxycytidine 5' -monophosphate) ,
si l'acide nucléique est un ARN : • l'AMP (adénosine 5' -monophosphate) ,
• le GMP (guanosine 5' -monophosphate) ,
• l'UMP (uridine 5' -monophosphate) , et
• le CMP (cytidine 5' -monophosphate) .
L' acide nucléique peut également comprendre éventuellement au moins une inosine et/ou au moins un nucléotide modifié. Le terme « nucléotide modifié » signifie dans la présence invention, un nucléotide par exemple au moins un nucléotide comportant une base nucléique modifiée, la désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée, préférentiellement à l'exception de la 5-méthyl-cytosine . L'acide nucléique peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates , les H-phosphonates , les alkyl- phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR-A-2.60 .507 ) ou les acides nucléiques polyamides (PMA) (Egholm M. et al. ; J. Am. Chem. Soc. ; 1992 ; 114 ; 1895-97) ou les 2 ' -O-alkyl-ribonucléotides et/ou un nucléotide 2'-0-fluoro et/ou un nucléotide 2' -aminé et/ou un nucléotide arabinose, et les LNA (Sun B.W. et al., Biochemistry ; 2004 ; Apr 13 ; 43 (14) : 4160-69). Parmi les 2' -O-alkyl-ribonucléotides, les 2' -O-méthyl-ribonucléotides sont les préférés, mais on peut également utiliser les 5- Propinyl Pyrimidine Oligonucléotides (Seitz 0., Angewandte Chemie International Edition 1999 ; 38(23) ; Dec : 3466-69).
Le terme « nucléotide » définit soit un ribonucléotide soit un désoxyribonucléotide .
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique » ou « échantillon biologique liquide », tout échantillon susceptible de contenir des acides nucléiques. Ces derniers peuvent être extraits de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes d'un patient ou provenir d'un produit alimentaire, agroalimentaire ou encore être d'origine environnementale. L'extraction se fait par tout protocole connu de l'homme du métier, par exemple selon le procédé d'isolation décrit dans le brevet EP- B-0.369.063.
Par « contaminant » ou « acide contaminant » ou « acide nucléique contaminant » ou « élément contaminant », on entend au sens de la présente invention, tout acide nucléique dont l'amplification n'est pas désirée et qui est susceptible de générer un résultat faux-positif lors de la détection.
Par « amplification » ou « réaction d'amplification » on entend toute technique d' amplification d' acides nucléiques bien connue par l'homme du métier, telle que :
- La PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US-A-4, 683, 195, US-A-4, 683, 202 et US-A-4 , 800, 159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR) , notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B- 0.569.272. De préférence, la PCR est réalisée sur un seul brin avec un seul couple d'amorce.
— La LCR (Ligase Chain Reaction) , exposée par exemple dans la demande de brevet EP-B-0.201.18 ,
- La RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90 /01069 ,
- La 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,
- La NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet O-A-91/02818,
— La TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-5, 399, 491, et
— La RCA (Rolling Circle Amplification) décrite dans le brevet US-6, 576, 48.
Au sens de la présente invention, on entend par « cible » ou « acide nucléique cible » ou « cible nucléique » ou « cible d'intérêt » ou « acide nucléique d'intérêt », un acide nucléique (un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert) à amplifier et/ou à détecter. La cible peut être extraite d'une cellule ou synthétisée par voie chimique. La cible peut être libre en solution ou bien liée à un support solide.
Le terme « échantillon liquide et biologique d' intérêt » signifie une solution aqueuse homogène ou hétérogène.
Par « support solide », on entend des particules qui peuvent être en latex, en verre (CPG) , en silice, en polystyrène, en agarose, en sépharose, en nylon, etc. Ces matériaux peuvent éventuellement permettre le confinement de matière magnétique. Il peut s'agir également d'un filtre, d'un film, d'une membrane ou d'une bandelette. Ces matériaux sont bien connus de l'homme du métier.
La cible peut être un acide nucléique viral, bactérien, fongique, ou de levure, présent dans un mélange, sous forme de simple ou double brin d'ADN et/ou d'ARN. En général, la cible est d'une longueur comprise entre 50 et 10000 nucléotides, mais le plus souvent elle est comprise entre 100 et 1000 nucléotides .
Par « marqueur », on entend une molécule portée par un nucléotide. Le lien entre le marqueur et le nucléotide peut se faire de différentes façons connues de l'homme du métier. Le couplage manuel se fait par l'utilisation de marqueurs portant un groupement activé, typiquement un carboxyle ou un thiol, qui sont couplés sur un nucléotide interne modifié portant le groupement réactif correspondant (aminé ou thiol, par exemple) , ou sur une extrémité du brin nucléotidique modifiée avec ces mêmes groupements réactifs. Le couplage automatique se fait par l'utilisation de phosphoramidites portant le marqueur, et alors le couplage se fait pendant la synthèse automatisée du brin nucléotidique, soit sur une extrémité du brin, soit sur une position interne, en fonction du type de phosphoramidite utilisé. Le marqueur peut être un fluorophore ou un extincteur de fluorescence.
Par « fluorophore », on entend une molécule qui émet un signal de fluorescence quand elle est excitée par de la lumière à une longueur d'onde qui convient. Le fluorophore peut être notamment une rhodamine ou un dérivé tel que Texas Red, une fluorescéine ou un dérivé (par exemple le FAM) , un fluorophore de la famille des Alexa tels que l'Alexa532 et l'Alexa647, Alexa 405, Alexa 700, Alexa 680, Cy5 ou tout autre fluorophore qui convienne en fonction de l'appareil de mesure utilisé. Les fluorophores disponibles pour les sondes de détection sont très variés et connus de l'homme du métier.
Au sens de la présente invention, on entend par « fluorescéine » une molécule chimique aromatique qui émet un signal de fluorescence avec un maximum d'émission autour de 530 nm, quand elle est excitée par de la lumière à une longueur d'onde aux alentours de 490 à 500 nm, préférentiellement de 495 nm.
Par « extincteur de fluorescence » ou « quencher », on entend une molécule qui interfère avec la fluorescence émise par un fluorophore. Cet extincteur peut être choisi parmi des molécules aromatiques non fluorescentes, pour éviter des émissions parasites. Préférentiellement , le dit extincteur est un Dabsyl ou un Dabcyl ou un « Black hole quencher™ » (BHQ) qui sont des molécules aromatiques non fluorescentes qui empêchent l'émission de fluorescence quand elles se trouvent physiquement à proximité d'un fluorophore. La technique de transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) peut également être utilisée tel que décrit par exemple dans Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes, p. 4, Ed. V.V. Didenko, Humana Press 2006, ISSN 1064-3745. Le quencher peut également être choisi parmi des molécules fluorescentes, telles que par exemple la TAMRA ( carboxytetramethylrhodamine) . La « sonde de détection trois bases » ou « sonde trois bases », dite S3B, est une sonde telle que définie précédemment et qui en plus des précédentes caractéristiques est constituée d'un enchaînement nucléotidique de trois types de bases différentes choisies parmi le groupe d'adénine, thymine, guanine, cytosine. Il est bien compris par l'homme du métier que suivant la forme des sondes (Molecular Beacon, voir EP95/904 104.7, EP96/303 544.9 et EP97/923 412.7, ou O-probe, voir PCT/FR2009/051315, etc.), la sonde sera constituée d'une partie d'une séquence dont l'enchaînement nucléotidique sera composé de nucléotides de quatre types de bases différentes et d'une séquence dont l'enchaînement nucléotidique sera composé de nucléotides de trois types de bases différentes (séquence permettant l'hybridation et la détection des amplicons).
Dans certains cas, pour améliorer l'hybridation avec les amplicons et donc leur détection, les sondes selon l'invention peuvent ponctuellement contenir de l'uracile à la place de la thymine. Dans ce cas, les sondes selon l'invention seront constituées d'un enchaînement nucléotidique de quatre types de bases différentes (uracile, guanine, adénine, thymine) .
Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques simple brin, ayant en tout ou partie des séquences complémentaires, sont susceptibles de former un double brin ou « duplex » stabilisé par des liaisons hydrogènes entre les bases nucléiques. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur et la faible salinité des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
Les exemples et figures ci-joints représentent des modes particuliers de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
La figure 1 représente un premier mode de réalisation du dispositif jetable selon l'invention, qui contient un seul et unique canal fluidique. Dans cette configuration particulière, le dispositif est prêt pour aspirer un échantillon biologique à traiter dans lequel au moins un acide nucléique cible est susceptible d'être présent.
La figure 2 représente encore ce premier mode de réalisation, mais dans une autre configuration particulière, dans laquelle le dispositif est en train d'aspirer l'échantillon biologique à traiter (non représenté sur cette figure) .
La figure 3 représente un deuxième mode de réalisation du dispositif jetable selon l'invention, qui contient deux canaux fluidiques en parallèle. Dans cette configuration particulière, le dispositif est prêt pour aspirer ledit échantillon biologique contenant au moins un acide nucléique cible, susceptible d'être présent.
La figure 4 représente également ce deuxième mode de réalisation, mais dans une autre configuration particulière, dans laquelle le dispositif est en train d'aspirer l'échantillon biologique à traiter (non représenté sur cette figure) . La figure 5 représente un troisième mode de réalisation du dispositif jetable selon l'invention, qui contient huit canaux fluidiques en parallèle. Dans cette configuration particulière, le dispositif est prêt pour aspirer ledit échantillon biologique contenant au moins un acide nucléique cible, susceptible d'être présent.
La figure 6 représente une coupe selon A-A de la figure 5 permettant de mieux visualiser la manière dont les actions d' aspiration et de refoulement sont réalisées au sein dudit dispositif .
Enfin les figures 7 à 10 montrent le dispositif selon une variante du deuxième mode de réalisation, mais en cours d'utilisation :
• la figure 7 : Le dispositif jetable ne contient pas l'échantillon liquide d'intérêt. Son embout est juste en contact avec celui-ci qui est présent dans un contenant.
• la figure 8 : L'embout étant en contact avec l'échantillon, les pistons sont déplacés pour permettre l'aspiration de l'échantillon d'intérêt au sein du dispositif jetable. Dans ce cas l'échantillon se retrouve au niveau du premier compartiment et des constituants thermostables qu'il contient. Avant que les pistons aient terminé leur aspiration au niveau de cette phase, le dispositif jetable est monté et/ou le contenant est baissé, afin que dispositif et échantillon dudit contenant ne soient plus en contact et que le canal unique ne soit rempli plus que d'air, comme c'est le cas sur cette figure 8. Les deux canaux aval, contenant chacun une colonne liquide d'un aliquote de l'échantillon. Préférentiellement l'aspiration par les pistons est stoppée lorsque l'on retire le dispositif par rapport à l'échantillon restant présent au niveau du contenant.
• la figure 9 : L'aspiration de l'échantillon d'intérêt par lesdits pistons continue et ledit échantillon est déplacé vers le moyen de mélange, où des mouvements de va-et vient permettent le bon mixage de l'échantillon et des constituants thermostables. L'ensemble échantillon associé aux constituants thermostables est par la suite toujours appelé « échantillon » pour des raisons de facilité de lecture et de compréhension.
• la figure 10 : Les pistons sont déplacés pour permettre l'aspiration de l'échantillon d'intérêt au sein du dispositif jetable. Dans ce cas l'échantillon se retrouve au niveau du second compartiment et des constituants non- thermostables qu'il contient.
• la figure 11 : Il n'y a plus d'aspiration, mais un refoulement de l'échantillon d'intérêt par lesdits pistons et ledit échantillon est déplacé vers le moyen de mélange, où des mouvements de va-et-vient permettent le bon mixage de l'échantillon et des constituants non-thermostables. Encore une fois l'ensemble échantillon associé aux constituants thermostables et non-thermostables est par la suite toujours appelé « échantillon » pour des raisons de facilité de lecture et de compréhension.
• la figure 12 : Les pistons sont déplacés pour permettre l'aspiration de l'échantillon d'intérêt au sein du dispositif jetable. Dans ce cas l'échantillon se retrouve au niveau du troisième compartiment et des constituants nécessaires à la détection qu'il contient.
La figure 13 présente des courbes d'amplification NASBA pour l'état de la technique (EasyQ) selon des valeurs croissantes de la quantité de cible (voir échelle de 0 à 10000 en position haute - voir référence à la flèche B) . Les courbes correspondantes à l'amplification de la séquence cible HIV sont tracées en position inférieure (voir référence à la flèche A) , les courbes correspondantes au calibrateur sont en position supérieure . La figure 14 représente des courbes d'amplification NASBA pour l'invention dans les mêmes conditions que celles appliquées à la figure 13 (de même pour l'utilisation des flèches A et B) . A noter que pour améliorer la lisibilité sur cette figure, les courbes correspondantes à la cible HIV ont été dilatées d'un facteur 5. Ainsi avec le dispositif selon la présente invention, les courbes correspondantes à la cible (HIV) varient de 8 à 40 rfu (Relative Fluorescence Unit) environ. Les courbes du calibrateur variant de 50 à 250, le graphe n'est pas lisible si on met les deux courbes avec la même échelle. Ainsi fait, les courbes HIV varient entre 40 et 200 et sont donc plus lisibles. Enfin ce sont des valeurs relatives qui ne préjugent pas. de l'efficacité de l'amplification, c'est en fait les points d'inflexion de chaque courbe qui, eux ont une valeur d'interprétation.
La figure 15 propose la quantification variable calculée par l'algorithme HIV v.2.0 pour les instruments EasyQ (à gauche) et selon l'invention (à droite).
La figure 16 a trait au résultat de quantification en fonction de la quantité de cible.
Enfin la figure 17 représente une coupe longitudinale selon B-B de la figure 2 du dispositif selon l'invention.
La présente invention est bien représentée sur l'ensemble des figures 1 à 17. Trois modes de réalisation sont plus particulièrement représentés.
Un premier mode de réalisation présenté aux figures 1 et 2 représente un mode tout à fait simple de réalisation de la présente invention. Il est constitué d'un dispositif jetable à qui est formé d'un corps solide 2 dans lequel est gravé en surface un circuit ou canal fluidique 3. Bien entendu ce circuit fluidique 3 est délimité par un film de type BOPP (Bi- Oriented PolyPropylen) , non référencé sur ces deux figures, mais présent avec la référence 14 en figure 17, qui empêche l'échantillon liquide de sortir dudit circuit 3. Le canal fluidique 3 comporte d'une part un trou débouchant 4, appelé entrée, situé en bas de chaque figure et un autre trou débouchant, dit sortie, situé en haut de chaque figure, ce qui permet au canal 3 d'avoir deux ouvertures sur l'extérieur. En fait l'entrée 4 est formée par un embout de pipette, référencé 16, c'est-à-dire moulé d'une seule pièce avec l'ensemble du corps 2. Sur la figure 1 en embout de pipette rapporté 27 est représenté, montrant un mode de réalisation particulier utilisant un embout conventionnel. De l'autre côté, la sortie 5 est présente au sein d'un cylindre 17, qui constitue une des parties du moyen d'aspiration refoulement 7. L'autre partie de ce moyen d'aspiration refoulement 7 est constituée par un piston 18 qui peut coulisser, au sein du cylindre 17, mû par un actionneur, non représenté ici, selon la flèche Fl, d'une part, qui est un mouvement du piston 18 dans le cylindre 19 dans lequel le volume de fluide au sein du circuit fluide 3 diminue, ou selon la flèche F2, qui est un mouvement du piston 18 dans le cylindre 19 qui est totalement différent du précédent, c'est-à-dire qu'il augmente le volume de fluide au sein du circuit fluidique 3. L' actionneur peut agir sur le piston par l'intermédiaire d'un moyen de liaison 21. Ce système est particulièrement intéressent dans le cas ou l'on souhaite automatiser l'ensemble du système. Sur ce mode de réalisation des figures 1 et 2, on note que le circuit fluidique est relativement simple puisqu'il comprend le long du canal 3, de section sensiblement constante, un premier compartiment 8, un second compartiment 9 et, entre les deux 8 et 9, un moyen de mélange 15 constitué d'un ensemble de chicanes 19. Les rôles de ces compartiments 8 et 9 et de ce moyen de mélange 15 seront exposés plus avant ultérieurement.
Le deuxième mode de réalisation est représenté aux figures 3 et 4. Il s'agit d'un mode de réalisation sensiblement identique au précédent, mais dans lequel deux canaux fluidiques qui sont en parallèle l'un de l'autre sont représentés. Ce dispositif est référencé 100 même si l'ensemble des autres éléments reprend les mêmes numéros de références que ceux précédemment utilisés. La figure 3 est sensiblement identique à la figure 1 du fait que le piston 18 est en position de repos, c'est-à-dire qu'il est en position basse au sein du cylindre 17 et que l'actionneur ou le manipulateur déplace ledit piston 18 par l'intermédiaire du moyen de liaison 21. Dans ce mode de réalisation il y a donc une entrée 4, un unique canal 3 sur la partie avale, qui se scinde ensuite en deux canaux de section identique qui vont remonter parallèlement le long du corps 2 du dispositif 100. Le long de chacun des canaux 3, on va donc trouver comme c'était le cas précédemment un premier compartiment 8, un moyen de mélange 15 et un deuxième compartiment 9. Mais en plus, il y a en amont un troisième compartiment 10. Pour des raisons pratiques, un siphon est formé entre le deuxième et troisième compartiments 9 et 10, à savoir que le premier coude du siphon est situé au-dessus du premier compartiment 9 et que le troisième compartiment 10 est situé au niveau du deuxième coude du siphon. Alternativement, le compartiment 10 peut être supprimé et la lecture effectuée directement dans le compartiment 9. Le rôle du compartiment 9 ou 10 est tout d'abord de sécuriser tout déplacement non désiré du liquide vers la partie basse de la carte, ladite carte étant utilisée en position verticale, et ensuite, d'augmenter le volume de liquide utilisable pour la détection en fluorescence en maximisant le diamètre de l'opercule de lecture, réalisé dans le bloc chauffant associé dans l'instrument et positionner en vis-à-vis du compartiment 9 ou 10. Une autre caractéristique de ce mode de réalisation est que pour une entrée 4, il y a deux sorties 5 puisque chaque canal 3 est connecté en amont à un moyen d'aspiration refoulement 7. Donc chaque canal 3 est associé à un cylindre 17 et à un piston 18. Dans ce mode de réalisation particulier les deux pistons 18 sont indépendants l'un de l'autre, comme on le voit bien à la figure 4, c'est-à- dire qu'on peut les actionner selon Fl et F2 de manière indépendante l'un de l'autre.
La configuration à deux pistons individualisés, à mouvement indépendant l'un de l'autre, permet de corriger le défaut de positionnement des segments liquides dans chaque canal fluidique individuellement, notamment par un recalage desdits segments dans la zone de détection, par exemple, le décalage pouvant être dû à un échantillon à visqueux non homogène, à un léger défaut de moulage dans le circuit fluidique de la carte ou un déplacement non désiré par le fait d'un gradient thermique entraînant momentanément un différentiel de pression de part et d'autre du segment fluidique. Ceci permet donc d'augmenter la robustesse de fonctionnement du dispositif. Ce système fonctionne dès qu'il y a plus d'une voie et ce, à l'aide de capteurs de position placés à des endroits adéquates, d'une part au sein du dispositif, et d'autre part par rapport à la carte selon 1' invention.
A noter qu'il est particulièrement intéressant d'avoir un système anti-extraction de chaque piston 18. Ainsi et avantageusement, chaque piston 18 peut être muni d'un guide 23 qui est relié par une extrémité à l'extrémité supérieure de la bielle du piston 18 et à son autre extrémité, non représentée sur les figures, à une forme de plus grande section interdisant l'extraction accidentelle du piston post-amplification lors de la manipulation par l'opérateur (ex : déchargement du consommable de l'instrument en fin d'analyse, ou erreur de positionnement des pistons par l'instrument). Ce système anti¬ extraction est bien entendu adaptable à tous les modes de réalisation envisagés par la présente invention. Les figures 5 et 6 représentent un troisième mode de réalisation qui est sensiblement identique au précédent, sauf en ce qu'il comporte en parallèle huit canaux fluidiques 3. Comme pour les deux précédents modes de réalisation, il n' y a qu'une entrée 4 située au niveau d'un embout 16 duquel part un seul canal 3. Celui-ci se divise en 2 à 3 reprises ce qui donne un nombre total de huit canaux 3 au niveau de la partie active du dispositif 200 et donc huit sorties 5. Chaque canal 3 est alors constitué de :
• un premier compartiment 8 suivi d'un moyen de mélange 15 composé d'un certain nombre de chicanes 19,
• un deuxième compartiment 9, et enfin
• un troisième compartiment 10.
Chaque canal aboutit bien entendu à un moyen d'aspiration refoulement 7 constitué, comme à l'accoutumée, par un cylindre 17 et un piston 18. De la même manière que le second mode de réalisation, ce troisième mode de réalisation comporte des pistons 18 qui sont manipulables par l'intermédiaire du moyen de liaison 21 de manière autonome et indépendante par rapport aux autres pistons 18 adjacents.
Sur la figure 6 est représentée une coupe longitudinale selon l'axe A-A, de la figure 5, qui permet de mieux visualiser la connexion qui existe entre le canal 3 et le moyen d'aspiration refoulement 7. Cette coupe permet de voir le corps 2 du dispositif 200, qui comporte sur sa surface supérieure un canal 3 délimité par rapport à l'extérieur à l'aide d'un film de cloisonnement 14 fabriqué en une matière adéquate. Le film est préférentiellement en BOPP (Bi-oriented PolyPropylene) avec une colle silicone, mais peut également être réalisé en PP (PolyPropylene), PET (PolyEthylen Terephtalate) , TPE (ThermoPlastic Elastomer) , en film complexes type PP/PE pouvant être scellé par procédé laser autour des canaux fluidiques. Ce canal 3 aboutit à un trou transversal 25 qui débouche au sein du cylindre 17. Au sein de ce cylindre 17 est présent le piston 18 dont la tête de piston 26 forme un joint d' étanchéité avec la chemise dudit cylindre 17. La tête du piston 26 peut être composée de deux pièces (corps avec gorge et joint torique élastomère) ou être constituée d'un piston monobloc, en une seule pièce, simplifiant les opérations d'assemblage de la carte et permettant de diminuer le coût par test. Il est donc bien évident que lorsque l'actionneur ou le manipulateur exerce une force, selon F2 sur le piston 18, celui-ci va permettre l'aspiration du fluide gazeux ou liquide présent dans le canal 3, alors que l'action selon Fl va permettre de faire ressortir ce fluide par l'intermédiaire de la sortie 4, non représenté sur la figure 6.
Il existe deux manières différentes de réalisation de pistons intégrés. Il peut s'agir d'un simple piston avec ou sans segment (« o-ring » en anglais), comme c'est le cas ci- dessus, ou bien un piston à double section. Bien que ce type de piston soit bien connu de l'homme du métier, les avantages d'utilisation d'un piston à double section sont les suivants :
La précision de positionnement intrinsèque est améliorée par rapport à un simple piston (ayant le même diamètre) car le volume de liquide pompé est déterminé/calibré par la différence de volume entre les deux sections dudit piston (l'aspiration est donc localisée entre les deux diamètres de ce piston) .
- Après l'action de pompage, le piston est complètement poussé dans la chemise/cartouche où il est mû. De ce fait, il n'y a aucun risqué que le piston soit extrait par inadvertance par l'utilisateur.
Les figures 7 à 14 montrent le deuxième mode de réalisation des figures 3 et 4 lors de l'utilisation du dispositif 100. Il est à noter que ce dispositif 100 est très légèrement différent de celui déjà exposé puisque les deux pistons sont, dans le cas présent, solidarisés l'un par rapport à l'autre afin que le mouvement fluidique dans chacun des deux canaux 3 soit identique. Il s'agit bien entendu d'une option et l'on peut prévoir que les pistons puissent être désolidarisés l'un par rapport à l'autre, soit automatiquement par l'automate, soit manuellement par le manipulateur en fonction des besoins. Il est également possible que le pont reliant les deux pistons soit déformable sans pour autant être coupé physiquement .
Sur la figure 7 on note que l'échantillon liquide et biologique 6 est compris dans un contenant 20 uniquement bien que celui-ci 6 soit en contact avec le dispositif 100 ; notamment l'embout 16 est partiellement immergé dans ledit liquide 6. Pour sa part, le dispositif 100 comporte en plus de ce qui a été représenté aux figures 3 et 4 des constituants thermostables 12 présents au sein du premier compartiment 8 et des constituants non thermostables 13 au sein du deuxième compartiment 9. En fait les constituants sont stockés sous forme solide, par exemple selon les informations techniques révélées dans le brevet EP-B-0.641.389, auquel le lecteur est prié de se référer pour avoir plus de précisions sur ce sujet.
Il est bien évident que l'on peut imaginer qu'il n'y ait que deux compartiments 8 et 9, comme c'est le cas sur les figures 1 et 2. Dans ce cas, il est nécessaire d'avoir des constituants non thermostables et de détection 13 et 14 qui sont présents ensemble dans le second compartiment 9. De même si l'on utilise une amplification n'ayant que des constituants thermostables, il est également possible d'avoir tous les ingrédients présents dans un seul compartiment, notamment 8 ou 9. Préférentiellement l'embout est assorti d'un cône de pipetage 27, tel que représenté à la figure 1, par exemple de 50 à 200 pL de capacité ou bien, et ceci n'est pas représenté sur les figures mais est bien connu de l'homme du métier, d'une paille en polyéthylène pouvant être scellée thermiquement , après réalisation de l'ensemble des séquences fluidiques dans la carte. Dans la figure 7, soit le contenant de l'échantillon biologique peut monter au contact de l'embout, soit ce sera la carte qui sera déplacée par l'instrument pour venir en contact avec le liquide contenu dans le contenant, ce dernier cas correspondant au cas des architectures pour les machines à haute cadence. Le dispositif sera alors utilisé comme un cône de pipetage classique et sera donc déplacer selon les axes X, Y et /ou Z par un robot pour aller prélever dans le ou les contenants.
Sur la figure 8, le moyen de liaison 21 est mû selon F2, afin que les pistons 18 aspirent l'échantillon liquide présent dans le contenant 20 au sein de la carte. A la fin de cette étape, non représenté sur cette figure, le dispositif 100 a été relevé alors que les pistons 18 continuent leur aspiration, ce qui explique la présence de deux colonnes de liquide dans chacun des canaux 3. A noter que le volume aspiré est lié à la section du piston intégré dans la carte et à la longueur de déplacement du piston. Outre l'éventuel arrêt initial au niveau du cône de pipette, le premier arrêt de chaque échantillon liquide 6 se fait au niveau du premier compartiment 8, c'est-à- dire au niveau des constituants thermostables 12, ce qui permet de diluer lesdits constituants qui sont stockés en fait sous forme lyophilisée ou séchée, comme c'est le cas pour les autres constituants 9 et 10. Le segment liquide est maintenu sur la position du réactif afin de faciliter la remise en suspension du réactif séché ou lyophilisé, typiquement dix secondes, généralement moins d'une minute.
Selon la figure 9 maintenant, le mouvement du fluide continue selon F4 en direction du moyen de mélange 15. Ce mouvement selon F4 correspond à l'aspiration selon F2 du piston. Lorsque le mélange 6+12 a atteint les chicanes 19 un mouvement de va-et-vient selon F3 et F4 est généré par un mouvement des pistons selon Fl et F2, afin de permettre un passage plus ou moins rapide et ce à de multiples occasions dudit mélange au sein du moyen de mélange 15. Typiquement le nombre d'aller-retour de mélange dans la carte est compris entre un et dix aller-retours, typiquement cinq aller-retours pour garantir une homogénéisation satisfaisante des composés de la réaction. Les changements de direction dus à la présence des chicanes 19 permettent ainsi un bon mélange des constituants dilués, dit constituants thermostables 12, au sein de l'échantillon liquide d'intérêt 6. Par constituants thermostables 12, on entend notamment les amorces d'amplification, la ou les sondes de détection, les nucléotides et tous autres ingrédients thermostables nécessaires à l'élongation des amorces lors de l'amplification.
Sur la figure 9 on note qu' il existe une première zone destinée au chauffage 11 représentée par des pointillés. Cette zone représente symboliquement l'endroit où le manipulateur ou bien l'automate va venir appliquer une source de chaleur afin de procéder au traitement de l'échantillon liquide 6+12, c'est- à-dire de l'échantillon 6 en présence des constituants thermostables 12, afin de débuter une technique d'amplification, telle que la NASBA.
Lorsque ceci est réalisé, la figure 10 montre que l'aspiration selon F2 continue, afin que les colonnes de liquide remontent jusqu'au second compartiment 9 ou les constituants non thermostables 13 soient à leur tour dilués. Ce mouvement selon F4 est toujours dû à la montée des pistons selon F2. Par constituants non-thermostables, on entend essentiellement les enzymes nécessaires à l'amplification. Il s'agit notamment dans le cadre d'une amplification post- transcriptionnelle de l'AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus- Reverse Transcriptase) , la RNase H et la polymérase T7 (DNA dépendent RNA polymérase) .
Pour toutes les étapes de déplacement du liquide, le débit est typiquement de 1 μΐ, par seconde. Avantageusement, un capteur optique de l'instrument, non représenté sur les figures, positionné deux millimètres environ avant chaque réactif, embarqué dans la carte, permet de détecter la présence des segments liquides et ainsi de garantir une robustesse suffisante de fonctionnement en compensant les effets liés à la différence de chaque échantillon.
Alternativement, l'utilisation des capteurs optiques permet également de mesurer la longueur du segment liquide et donc de vérifier la précision de la division liquide effectuée lors de l'étape d'aspiration et chargement de l'échantillon dans la carte.
Sur la figure 11 maintenant, chaque colonne de liquide est ensuite redescendue selon Fl au niveau du moyen de mélange 15. A ce niveau l'ensemble du mélange 6+12+13 est également mû selon F3 et F , afin que les chicanes 19 permettent un mélange approprié des constituants thermostables 12 et non thermostables 13 au sein de l'échantillon 6. L'arrivée dans les chambres peut être avantageusement détectée par la tête de lecture en fluorescence intégrée dans l' instrument pour réalisée la mesure en temps réelle de la réaction d' amplification.
La figure 11 montre, à l'instar de la figure 9, une seconde zone destinée au chauffage 22 qui permet, elle aussi, de procéder à l'amplification NASBA.
Sur la figure 12 enfin, l'aspiration selon F2 permet aux colonnes de liquide 6+12+13 de remonter jusqu'au troisième compartiment 10, qui fait alors office de zone de lecture. Il est à noter que cette zone de lecture peut être soit le premier 8, soit le deuxième 9, soit le troisième compartiment 10. Dans le cas présent, le troisième compartiment 10 fait office de zone tampon pour empêcher toute remontée inappropriée de liquide vers le haut du dispositif, cette action est renforcée par la fermeture de la vanne 27.
Si par contre le troisième compartiment 10 fait office de zone de lecture, l'aspiration selon F2 est plus importante ce qui permet aux colonnes de liquide 6+12+13 de remonter jusqu' audit troisième compartiment 10, où la lecture peut avoir lieu .
Toujours selon un autre mode de réalisation, il est possible de prévoir que les constituants thermostables 12 sont scindés en deux sphères, dites « pellets » en anglais. Une première sphère, présente dans le premier compartiment 8, contenant les amorces d'amplification, les nucléotides et tout autre ingrédient thermostable nécessaire à permettre l'élongation des amorces lors de l'amplification. Une seconde sphère, présente dans le troisième compartiment 10, contenant la ou les sondes de détection nécessaires à la détection des amplicons, après l'étape d'amplification. Dans ce le mélange, devra retourner au niveau du moyen de mélange 15, au sein duquel l'ensemble du mélange est toujours mû selon F3 et F4 , afin que les chicanes 19 permettent un mélange approprié des constituants thermostables 12 et non thermostables 13 au sein de l'échantillon 6. La lecture pouvant s'effectuer dans n'importe lequel des compartiments 8, 9 ou 10.
Une dernière étape existe, non représentée sur les figures, qui consiste, immédiatement après le fin du positionnement dans le troisième compartiment, à fermer la vanne 27 à l'aide d'un actionneur intégré dans l'instrument. Alternativement, ladite vanne peut être supprimée et remplacée par une paille, comme évoqué plus haut, qui peut être scellée, par exemple à la chaleur, vanne qui aura alors deux fonctions, tout d'abord de pipetage dans le contenant de l'échantillon et ensuite de fermeture par utilisation d'un fil chauffant au sein de l'instrument associé.
Selon un mode particulier de réalisation, il est possible d'avoir un petit carrousel associé au dispositif selon la présente invention. Ce carrousel porte les différents tubes nécessaires à la réalisation d'une étape d'extraction préalable à la réalisation du procédé selon ladite invention :
• le premier tube contient l'échantillon biologique à traiter,
• au moins un deuxième tube contient un tampon de lavage,
• un troisième tube pour le tampon d'élution, et
• un quatrième tube de récupération de l'éluat.
Ce dernier est optionnel, mais utile si l'on souhaite prendre un aliquote par exemple pour effectuer du séquençage avant une nouvelle aspiration dans le dispositif pour réaliser 1' amplification.
Selon ce nouveau mode de réalisation, un filtre de silice est ajouté soit au niveau du cône 16 soit au niveau du cône de pipette 28. Ce filtre de silice provient de chez Akonni (Réf. : 300-10606, Frederick, MD, USA) .
Selon le procédé d'utilisation, le dispositif de l'invention descend pour aspirer tout ou partie de l'échantillon biologique à tester (sang, urine, etc.) pour environ 5 à 100 ]ïL dans le premier tube. Ces valeurs sont approximatives car limiter par la course et le volume du (Figure 1) ou des pistons (Figure 3 pour deux pistons et Figure 5 pour huit pistons) .
Quand il y a plusieurs pistons, ceux-ci se déplacent en même temps pour maximiser le volume aspiré. Alternativement la taille (course et diamètre) des pistons intégrés à la carte peuvent être augmenter afin d'arriver au meilleur compromis entre aspiration d'un volume important d'échantillon, d'une part, et précision de déplacement de 1 ' éluât dans ledit dispositif, d'autre part, lors des étapes d'amplification.
L'échantillon est préalablement lysé, éventuellement dans le carrousel en présence de GuSCn ou par ultrasons, dans ce cas le tube est couplé à une sonotrode. placée sous le carrousel. Cet échantillon est aspiré dans le filtre de silice avec, si nécessaire, des aller-retour pour augmenter le temps de résidence de l'échantillon dans le filtre et améliorer le rendement de capture des acide nucléiques (ARN/ADN) .
L'échantillon restant est ensuite rejeté dans le premier tube ou bien dans un autre récipient ou tube contenant les déchets .
Le carrousel tourne alors pour amener le deuxième tube de lavage sous le cône de pipetage. Le tampon de lavage est aspiré par les pistons, avec mélange dans le filtre si nécessaire, puis rejeté dans le premier tube ou bien dans un autre récipient ou tube contenant les déchets.
Optionnellement , la lavage peut être effectué au moins une autre fois. Dans ce cas, soit le dispositif va aspiré le même tampon de lavage que précédemment, si celui-ci n'a pas déjà été utilisé, soit le carrousel tourne pour amener un autre deuxième tube de lavage sous le cône de pipetage. La procédure de lavage est ainsi répétée avec le tampon de lavage qui est aspiré par les pistons, avec mélange dans le filtre si nécessaire, puis rejeté dans le second tube ou dans le tube des déchets.
Le carrousel tourne ensuite pour amener le troisième tube contenant le tampon d'élution sous le cône de pipetage. Le portoir de tube peut être optionnellement muni d'un bloc chauffant permettant de maintenir à température le tampon d'élution entre la température ambiante et 75°C, ceci afin d'améliorer si nécessaire le relargage des acides nucléiques du filtre.
Un volume de tampon de 10 à 160 μL (dépendant du volume réactionnel par circuits fluidiques 3 et du nombre de circuits 3 par dispositif) est aspiré par les pistons, avec mélange dans le filtre si nécessaire, puis rejeté soit dans le tube vide après rotation du carrousel (pour récupération de l'éluât) soit directement transféré par aspiration dans la carte pour démarrer le processus d'amplification. EXEMPLE :
Cet exemple montre les performances de quantification obtenues avec un dispositif jetable selon le deuxième mode de réalisation de l' invention, à savoir la carte avec deux canaux fluidiques en parallèle (voir figures 3 et 4). Les tests ont été réalisés en utilisant comme cible le Virus d' Immunodéficience Humaine (VIH) .
Notre invention a été comparée à un produit déjà commercialisé, appelé Nuclisens EasyQ analyzer (Réf. 285060, bioMérieux S.A., Marcy l'Etoile, France), en utilisant les mêmes échantillons biologiques, contenant des cibles synthétiques VIH.
1 - Préparation des cibles :
Les transcrits ont été introduit dans les deux appareils Nuclisens EasyQ et selon l'invention. Il n'y a pas d'étape de préparation d'échantillon, comme par exemple l'extraction.
2 - Matérial et méthodes : Les expérimentations sur EasyQ ont été réalisées en utilisant le kit bioMérieux HIV2.0 (ci-après appelé PVB1) (Réf. 285033, bioMérieux B.V., Boxtel, Pays-Bas), en suivant les instructions d'utilisation. Celui-ci contient :
• un mélange d'enzymes : une sphère d'enzymes, ci-après appelé ENZ (N° de lot : 83281SXX + 45 uL diluant d'enzymes (83301AXX), et
• un mélange d'amorces et de sondes, appelé par la suite P/B : il y a en fait deux sphères P/B (N° de lot : 83283SXX) , auxquelles sont ajoutés 180 μL de diluant pour P/B 2X (83272AXX) .
Ceci donne un mélange NASBA avec 5 pL de mélange ENZ et 20 μL de mélange P/B + 15 μL de cibles. Le dispositif jetable selon l'invention est complètement automatisé pour permettre l'amplification et la détection. Il permet de réaliser le prélèvement de l'échantillon biologique à tester, contenant les cibles.
Le protocole expérimental du dispositif selon l'invention est défini pour que les réactifs (amorces, sondes et enzymes notamment) aient une même concentration que dans le protocole EasyQ. Néanmoins le volume par test utilise dans notre invention est de 5 μL au lieu de 40 L avec EasyQ. La quantité de réactifs est donc divisée par huit.
Les réactifs provenant du kit PVBl ont été lyophilisés et mis dans le dispositif selon l'invention. Le banc de lyophilisation est associé avec un robot pipetteur Hamilton (Réf. 202997, Bonaduz, Suisse) qui autorise le dépôt reproductible de gouttelettes de 1 μL pour P/B et de 1,25 ]i pour ENZ dans les compartiments dédiés du dispositif inventif. L'instrument d'amplification et de détection utilisé avec l'invention exécute toutes les fonctions nécessaires pour obtenir une courbe d'amplification, c'est-à-dire aspiration de l'échantillon, mélange des réactifs, chauffage et lecture de fluorescence. Ce concept supprime la plupart des étapes manuelles obligatoires avec EasyQ.
Le tableau 1 suivant présente les principales différences existantes entre EasyQ et l'invention.
EasyQ Invention
Volume 40 pL 5 ]iL
P/B 20 L 1 L (incorporé)
ENZ 5 μΙ> 1,25 μL (incorporé)
Volume 15 μΐ, 5 L
d' échantillon
utilisé
Etapes • diluer les accusphères, charger le tube manuelles • ajouter amorces et dans l'analyser et sondes à l'éluat, démarrer .
• transférer vers
l' incubateur,
• ajouter la solution
d'enzymes dans le
bouchon,
• fermer le tube avec le
bouchon
• centrifuger,
• passer au vortex,
• centrifuger encore,
• charger le tube dans
l'analyser et démarrer.
Nombre de Jusqu'à 48 tests 2 avec le
tests/série dispositif proposé
Tableau 1 : Comparaison des données techniques et du procédé mis en œuvre par le dispositif de l'état de la technique
(EasyQ) et par l'invention
Comme dit précédemment, l'échantillon biologique utilise pour cette étude contient des cibles VIH. Cet échantillon est ensuite dilué pour les expériences sur EasyQ et l'invention, mais ce sont les mêmes séries de dilution qui sont utilisées. Le tableau 2 ci-dessous montre le nombre de cibles VIH par tests ainsi que le nombre d'expériences réalisées avec chacun des deux dispositifs (EasyQ et invention) . Le nombre de copies « équivalent » pré-extraction correspond au nombre de copies qu'il faudrait en amont d'une étape d'extraction pour obtenir le nombre de copies par test (c'est-à-dire « équivalent » préextraction égal nombre de copies par test divisé par le rendement d'extraction).
Nombre de copies de
la cible par test 0 3.75 7.5 15 22.5 30 300 3000 (EasyQ et invention)
Nombre de copies de
« Equivalent » pré0 12.5 25 50 75 100 1000 10000 extraction par test
Nombre de réplicats
15 12 12 15 12 15 15 15 avec EasyQ
Nombre de réplicats 8 8 8 4 4 4 4 4
Tableau 2 : Nombre de cibles VIH par tests ainsi que le nombre d'expériences réalisées avec chacun des deux dispositifs
(EasyQ et invention)
Par « réplicat », on entend le nombre de fois que le test a été réalisé en parallèle à partir du même échantillon de départ .
Le nombre de copies à usage de contrôle interne est de 290 par test, aussi bien pour EasyQ que pour l'invention.
Il faut noter que l'invention, dans le cas présent, n'autorise que deux tests en parallèle, de ce fait nombre de réplicats est considérablement plus bas avec notre invention qu'avec EasyQ.
La limite de détection revendiquée pour EasyQ est de 25 copies (équivalent préextraction), ce qui correspond à 7,5 copies par test .
Les données acquises avec EasyQ ont été traitées avec le logiciel EasyQ Director software (BioMérieux S.A., La Balme, France), utilisant le protocole du test HIV-lDB 2.0 (Réf. 285033, bioMérieux B.V., Boxtel, Pays-Bas). Chaque courbe d'amplification, mesurée avec l'instrument utilisant l'invention, a été traitée par utilisation d'un outil interne nommé EDrecalc recalculation portant sur l'algorithme de calcul et d'interprétation des courbes d'amplification, qui est inclus dans le logiciel commercial EasyQ Director cité ci- dessus, avec le même algorithme que celui utilisé par le logiciel EasyQ Director et le protocole du test HIV-lDB 2.0.
3 - Résultats :
Les courbes de fluorescence brutes sont présentées sur la figure 13 pour le dispositif selon l'état de la technique (EasyQ) et sur la figure 14 pour l'invention. Les courbes d'amplification obtenues avec l'invention sont très similaires à celles obtenues avec EasyQ. On peut observer une large distribution des valeurs de fluorescence pour le plateau de fluorescence du signal issu du calibrateur. Comme cette distribution existe avec chaque instrument, cette propagation n'est pas liée à l'instrumentation.
3.1 - Limite de détection :
Du fait du petit nombre de réplicats, il n'est pas possible de déterminer la limite de détection avec un intervalle de confiance étroit. Ainsi, dans le tableau 3 ci-dessous, nous avons seulement comparé le nombre de résultats positifs obtenus avec les deux instruments pour quelques valeurs de nombre de copies extraites du tableau 2 :
Tableau 3 : Limite de détection avec chacun des deux
dispositifs (EasyQ et invention)
La limite de détection revendiquée pour le test NucliSENS HIV 2.0 est de 25 copies (limite de détection à 95% de positifs) . Avec cette valeur d'entrée, tous les tests réalisés avec le dispositif selon l'invention sont positifs. Avec 12,5 copies, environ 50% des tests sont positifs avec EasyQ et légèrement plus avec l'invention. On peut donc légitimement considérer que notre invention a des résultats au moins similaire à la limite de détection de l'état de la technique, EasyQ. 3.2 - Performances de la quantification :
La figure 15 présente le Qratio (variable de quantification) en fonction du nombre de copies en entrée. La répartition des points correspondant aux données est similaire pour les deux instruments .
En utilisant les paramètres liés au lot de réactifs, un homme du métier peut obtenir par calcul le nombre de copies, dont la moyenne est tracé en échelle logarithmique sur la figure 16. Les tableaux 4 et 5 suivants montrent les performances de la qualification associées à ces deux instruments :
D'après les spécifications de haut niveau du test HIV2.0, la précision, c'est-à-dire l'écart type des résultats de différents réplicats, doit être inférieure à 0,3 log. Certaines valeurs de précision pour les données du prototype d' instrument associé au dispositif sont au-dessus de cette spécification. Ceci peut être dû au faible nombre de réplicats qui ne permet pas de donner une estimation correcte de la précision .
Le prototype respecte bien la spécification sur la justesse (c'est-à-dire la différence entre le résultat et le nombre de copies en entrée du test) est de 0,25.
La linéarité pour l'invention est la même que pour EasyQ mais nécessite d'être mesurée au-delà des 104 copies de cette étude.
4 - Conclusion
La présente invention, dans sa configuration à deux canaux fluidiques parallèles a été utilisée pour détecter des cibles HIV par l'intermédiaire du kit HIV v.2.0. Les résultats ont été comparés avec l'analyseur EasyQ, qui a servi de référence.
Les performances de l'invention sont en ligne avec les plus importantes contraintes nécessaires à la réalisation d'un test VIH (HIV v.2.0) et sont au moins comparables à celles enregistrées avec l'analyseur EasyQ.
Du fait que l'invention a utilisé un volume réactionnel de 5 L (au lieu de 40 pL pour EasyQ) , la quantité de réactifs par test a été divisée par huit. Ceci conduit à un coût de production par test bien plus bas, car ce coût est surtout dû aux enzymes, représentant environ 80% de l'ensemble des ingrédients du kit. Le dispositif selon l'invention réduit également grandement le nombre d'étapes manuelles, puisque seulement trois actions basiques sont nécessaires pour lancer un test :
• chargement du dispositif selon l'invention, charger le tube contenant les cibles extraites (par l'appareil d'extraction Easy AG (Réf. 200111, bioMérieux S.A., Marcy l'Etoile, France), et
démarrer le test.
REFERENCES
1 - Dispositif jetable
2 - Corps solide du dispositif 1
3 - Circuit ou canal fluidique au sein du corps 2
4 - Trou débouchant du canal appelé entrée
5 - Trou débouchant du canal appelé sortie
6 - Echantillon liquide et biologique d' intérêt
7 - Moyen d' aspiration-refoulement
8 - Premier compartiment le long du canal 3
9 - Deuxième compartiment le long du canal 3
10 - Troisième compartiment le long du canal 3
11 - Première zone destinée au chauffage
12 - Constituants thermostables contenus dans le
compartiment 8
13 - Constituants non-thermostables contenus dans le
compartiment 9
14 - Film délimitant
15 - Moyen de mélange
16 - Cône de pipette intégré ou mandrin récepteur d'un cône 28
17 - Cylindre du moyen d'aspiration-refoulement 7
18 - Piston du moyen d'aspiration-refoulement 7
19 - Chicane du moyen de mélange 15
20 - Contenant où l'échantillon 6 est initialement présent 21 - Moyen de liaison avec un actionneur
22 - Seconde zone destinée au chauffage
23 - Guide du piston 18
25 - Trou transversal
26 - Tête du piston
27 - Vanne de fermeture définitive ou de scellement
28 - Cône de pipette conventionnel
100 - Dispositif jetable à deux canaux 3 parallèles
200 - Dispositif jetable à huit canaux 3 parallèles
Fl - Mouvement du piston 18 dans le cylindre 19 qui diminue le volume de fluide au sein du circuit fluidique 3
F2 - Mouvement du piston 18 dans le cylindre 19 qui augmente le volume de fluide au sein du circuit fluidique 3
F3 - Mouvement de l'échantillon 6 sous l'action du mouvement Fl F4 - Mouvement de l'échantillon 6 sous l'action du mouvement F2 F5 - Emmanchement du cône 28 sur le manchon 16

Claims

REVENDICATIONS
Dispositif jetable (1) permettant l'amplification d'au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon liquide et biologique d'intérêt (6), qui est constitué d'un corps solide
(2), d'au moins un canal fluidique (3) connectant une entrée (4), par laquelle tout ou partie de l'échantillon d'intérêt (6) peut être aspiré et/ou refoulé, et une sortie (5), qui est elle- même raccordée à un moyen d'aspiration-refoulement (7) dudit échantillon d'intérêt, le canal fluidique (3) comprenant en outre de l'entrée (4) jusqu'à la sortie (5) :
• un premier compartiment (8) contenant tout ou partie des constituants thermostables (12) nécessaires à la réalisation de l'amplification,
• un moyen de mélange (15) des constituants (12 éventuellement associés à 13) avec l'échantillon d' intérêt ( 6) ,
• un deuxième compartiment (9) contenant tout ou partie des constituants non-thermostables (13) nécessaires à la réalisation de l'amplification,
• et en plus au moins une zone destinée au chauffage (11) dudit échantillon d'intérêt (6) mélangé auxdits constituants d'amplification (12 associés à 13), afin de permettre l'amplification de l'acide nucléique cible .
Dispositif, selon . la revendication 1, permettant la détection des amplicons, caractérisé par le fait qu'il comprend de surcroît au niveau du deuxième compartiment (9), tout ou partie des constituants de détection nécessaires à la détection des amplicons.
3. Dispositif, selon la revendication 1, permettant la détection des amplicons, caractérisé par le fait qu'il comprend de surcroit au niveau du canal fluidique (3) un troisième compartiment (10) contenant tout ou partie des constituants nécessaires à la détection des amplicons.
4. Dispositif, selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le troisième compartiment (10) est situé entre le deuxième compartiment (9) et la sortie (5) du dispositif ( 1 ) .
5. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'entrée (3) reçoit un cône (28) de pipette (16) ou l'embout (3) de pipette possède une configuration en forme de cône de pipette.
6. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le dispositif d'aspiration-refoulement (7) est de type à piston tel que par exemple une pipette (7) .
7. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait la section du canal (3) est constante et que les compartiments (8, 9 et éventuellement 10) sont d'une section plus importante.
8. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'entrée (4) est en relation avec au moins deux canaux fluidiques (3) .
9. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait la sortie (5) est constituée par au moins deux canaux fluidiques (3).
10. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait les constituants (12 & 13) sont formés de composés biologiques lyophilisés ou séchés, solubles dans l'échantillon d'intérêt (6).
11. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait le moyen d'aspiration- refoulement (7) est partie intégrante du dispositif jetable (1) .
12. Dispositif, selon la revendication 11, caractérisé par le fait le moyen d'aspiration-refoulement (7) est constitué d'un cylindre (17) connecté au canal fluidique (3) et d'un piston (18) mobile au sein du cylindre (17) manuellement ou par l'intermédiaire d'un actionneur.
13. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait le moyen de mélange (15) est constitué du canal fluidique (3) dont le cheminement comprend au moins une chicane (19).
14. Procédé d'amplification d'au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon liquide et biologique d'intérêt (6), réalisé au sein d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, qui consiste :
(a) aspirer par l'entrée (4) tout ou partie de l'échantillon d'intérêt (6) au sein du dispositif (D ,
(b) déplacer ledit échantillon (6) pour y dissoudre les constituants d'amplification thermostables (12),
(c) mélanger échantillon (6) et constituants thermostables (12), (d) appliquer un premier gradient de température afin de dénaturer l'acide nucléique d'intérêt,
(e) déplacer la mixture (6 + 12) pour y dissoudre les constituants d'amplification non-thermostables (13),
(f) mélanger mixture (6 + 12) et constituants non- thermostables (13), et
(g) appliquer au moins un second gradient de température afin d'amplifier l'acide nucléique dénaturé.
Procédé, selon la revendication 14, caractérisé en ce que les constituants d'amplification thermostables (12) de l'étape (b) contiennent également des enzymes de restriction, qui ne sont pas forcément thermostables, mais qui permettent la digestion des acides nucléiques d'intérêt, qui sont des acides désoxyribonucléiques (ADN), préalablement à l'application du premier gradient de température de l'étape (d) .
Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, permettant la détection des amplicons, caractérisé en ce qu'il consiste, après l'étape (g) à :
(h) mélanger mixture (6 + 12 + 13),
(i) déplacer la nouvelle mixture (6 + 12 + 13) pour y dissoudre les constituants de détection (14), et
(j) détecter la présence d' amplicons.
Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'amplification est une amplification PCR, pour laquelle le premier gradient de température est compris entre 90 et 100°C, et les seconds gradients de température est une alternance de la température en trois étapes différentes :
• entre 90 et 100 °C pour la première température de dénaturation, préférentiellement d'environ 94 °C, entre 50 et 60 °C pour la deuxième température d'hybridation, préférentiellement d'environ 55°C, entre 70 et 75°C pour la troisième température de polymérisation, préférentiellement d'environ 72°C.
18. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 à
16, caractérisé en ce que l'amplification est une amplification post transcriptionnelle (NASBA ou TMA) , pour laquelle le premier gradient de température est compris entre 60 et 70°C, préférentiellement d'environ 65 °C, et le second gradient de température est compris entre entre 40 et 50°C pour le second gradient de température de polymérisation.
19. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 à
18, caractérisé en ce que le premier gradient de température est appliqué au niveau du premier compartiment (8) et/ou du moyen de mélange (15), et que le ou les seconds gradients de température est ou sont appliqués au niveau du moyen de mélange (15) et/ou du second compartiment (9) et /ou du troisième compartiment (10) .
20. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 à
18, caractérisé en ce que le premier gradient de température est appliqué pendant 5 à 20 minutes, préférentiellement 15 minutes, et que le ou les seconds gradients de température est ou sont appliqués :
· dans le cas d'une amplification PCR :
- pour la dénaturâtion, pendant moins de une minute, préférentiellement de 2 à 20 secondes, préférentiellement 5 secondes, - pour l'hybridation, pendant moins de une minute, préférentiellement de 2 à 20 secondes, préférentiellement 5 secondes, et
- pour la polymérisation, pendant moins de deux minutes, préférentiellement de 5 à 80 secondes, préférentiellement 10 secondes,
dans le cas d'une amplification post- transcriptionnelle, pendant moins de deux heures, préférentiellement de 5 à 80 minutes, et encore plus préférentiellement :
environ 60 minutes dans le cas d'acides nucléiques cibles ARN, ou
environ 90 minutes dans le cas d'acides nucléiques cibles ADN.
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