EP2217364A2 - Flexibles extraktionsverfahren für die herstellung sequenzspezifischer molekülbibliotheken - Google Patents

Flexibles extraktionsverfahren für die herstellung sequenzspezifischer molekülbibliotheken

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Publication number
EP2217364A2
EP2217364A2 EP08851271A EP08851271A EP2217364A2 EP 2217364 A2 EP2217364 A2 EP 2217364A2 EP 08851271 A EP08851271 A EP 08851271A EP 08851271 A EP08851271 A EP 08851271A EP 2217364 A2 EP2217364 A2 EP 2217364A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecules
capture
target molecules
sample
support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08851271A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Beier
Stephan Bau
Daniel Summerer
Mark Matzas
Peer STÄHLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Febit Holding GmbH
Original Assignee
Febit Holding GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Febit Holding GmbH filed Critical Febit Holding GmbH
Publication of EP2217364A2 publication Critical patent/EP2217364A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to an extraction method for isolating target molecules from a sample using a library of molecules. o
  • the selective extraction of molecules is a central and important process in many areas of biochemistry, biology and medicine. These areas include the extraction and purification of nucleic acids, proteins, sugars and other biochemical functional molecules. 5
  • nucleic acids usually DNA and RNA.
  • Essential steps of recombination techniques are to isolate and purify certain nucleic acids, e.g. of plasmid DNA or genomic DNA.
  • mRNA messenger RNA
  • Biochemical, biological and medical analysis methods can be enormously increased in their efficiency and significance by miniaturization and parallelization.
  • miniaturization relates, for example, to the analysis of genetic material by means of hybridization experiments on DNA microarrays.
  • DNA probes as receptors
  • methods have also been miniaturized and parallelized, which serve to screen for molecules with special properties, eg, ribozymes.
  • receptors on microarrays are proteins and those molecules that are not found in nature, such as peptide nucleic acids (PNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • Many such assay formats are grouped under the Biochips heading. All of these assay formats and biochips are potentially useful for isolation and purification of sample material and sample preparation.
  • Microreaction techniques can be coupled with such microarrays to provide fast and efficient systems both in sample preparation and in the fabrication of the actual array. This also includes the use of microfluidic methods.
  • mRNA molecules can be isolated relatively specifically by growing on a solid phase, e.g. Latex beads, magnetic beads, controlled pore glass beads or the matrix of a column immobilized poly-thymidine strands (poly-T strands). These poly-T strands, upon addition of total RNA, hybridize with the poly-adenine (poly-A) tail of mRNA molecules and allow separation of the unbound RNA molecules. The mRNA molecules are then isolated by appropriately changing the buffer so that hybridization in favor of single strands is abolished. The liberated mRNA molecules can then be eluted.
  • a solid phase e.g. Latex beads, magnetic beads, controlled pore glass beads or the matrix of a column immobilized poly-thymidine strands (poly-T strands).
  • poly-T strands upon addition of total RNA, hybridize with the poly-adenine (poly-A) tail of mRNA molecules and allow separation of the unbound RNA molecules.
  • the information content of such an isolation matrix is comparatively small, since only two categories of target molecules can be distinguished, namely with or without poly-A tail.
  • immunoglobulins are often isolated by an isolation matrix in an immobilized Protein A (from Staphylococcus aureus) column (Brown et al., Biochem. Soc. Transactions (England) 26 (1998), 249).
  • proteins from Staphylococcus aureus
  • antibodies to one or a few target molecules are bound to the isolation matrix.
  • U.S. Patent 6,013,440 describes a method of making an affinity matrix wherein a set of different nucleic acid probes are immobilized on a solid support to thereby enrich target nucleic acids of a still unknown sequence from a sample.
  • the proposed method uses sheet carriers as the isolation matrix, allowing only unfavorable elution. Even with this method, the known from the prior art disadvantages can not be eliminated.
  • WO 03/031965 describes a method and an apparatus in which a microfluidic carrier is used as the isolation matrix, which allows a selective isolation of certain biochemical functional molecules (target molecules), in particular a sequence-specific parallel isolation of multiple species of target molecules from a mixture.
  • a microfluidic carrier is used as the isolation matrix, which allows a selective isolation of certain biochemical functional molecules (target molecules), in particular a sequence-specific parallel isolation of multiple species of target molecules from a mixture.
  • the present invention relates to a method of isolating target molecules from a sample using a library of molecules comprising free capture receptors that are specific - A -
  • the method preferably comprises parallel isolation of multiple target molecules using a library of several different capture receptors.
  • the synthesis of the molecule library takes place on a solid support, in particular on a microfluidic support.
  • the catcher receptors forming the molecule library are detached from the carrier, in particular by chemical or / and physical methods, or copied off or copied off, in particular by enzymatic methods.
  • the capture receptors are tagged with functional groups and then contacted with the sample so that binding of the target molecules to targeting receptor specific receptors can occur and complexes of target molecules and capture receptors are formed.
  • the complexes formed e.g. consist of a capture receptor and a target molecule are then separated from remaining sample components, preferably by immobilization to a solid phase, e.g. about the functional group. Subsequently, the target molecules bound to the solid phase can be eluted.
  • the functionality of a target molecule is defined by its ability to selectively bind to a targeting molecule-specific capture receptor, preferably through bioaffinity interactions such as hybridization, receptor-ligand binding, antigen-antibody binding, saccharide-lectin binding, etc.
  • the method according to the invention comprises the provision of a carrier with a molecule library, ie an array of selectively binding receptors or capture probes which are suitable for isolating the target molecules.
  • a carrier ie an array of selectively binding receptors or capture probes which are suitable for isolating the target molecules.
  • an in situ synthesis of the receptors takes place on or in the carrier, preferably a microfluidic reaction carrier.
  • This procedure allows for the use of appropriate methods for in situ synthesis a very high information content of the molecule library.
  • nucleic acids as Target molecules can make a suitable system for the in situ synthesis of the corresponding capture probes thousands of defined sequences of a molecule library.
  • the invention provides a way to selectively isolate hundreds to thousands or even millions of individual DNA or RNA molecules from a mixture.
  • a variation of the method described above is to use the sample containing several different target molecules, e.g. Nucleic acids, to contact with a carrier having reversibly bound different freely selectable capture molecules. After removal of unbound or insufficiently bound components of the sample, the complexes of target molecules and capture receptors are detached from the carrier. Subsequently, a separation of the target molecules from the capture receptors, e.g. via functional groups of capture receptors that allow biophysical separation.
  • target molecules e.g. Nucleic acids
  • the method of the invention may e.g. They are used in academic research, basic research, industrial research, quality control, pharmaceutical research, biotechnology, clinical research, clinical diagnostics, screening, patient-specific diagnostics, and clinical trials , in forensics, for genetic testing, such as parenting, in animal and plant breeding or in environmental monitoring.
  • An object of the invention is thus a method for isolating target molecules from a sample, comprising the steps:
  • step (c) labeling the capture molecules, wherein marking occurs before or after Detachment of the capture molecules according to step (b) can take place
  • Another object of the invention is a method for the isolation of target molecules from a sample, comprising the steps: (a) providing a support with an array of several different optional catcher molecule matrices immobilized at respectively different positions on or in the support (b) copying the capture molecule templates to obtain capture molecules in free form,
  • step (c) marking the catcher molecules, wherein the marking can take place during or after the copying according to step (b),
  • Target molecules can specifically bind to the labeled capture molecules
  • Yet another subject of the invention is a method for isolating target molecules from a sample comprising the steps:
  • the target molecules isolated by the method of the invention are preferably selected from biological polymers such as nucleic acids, e.g. double-stranded or single-stranded DNA molecules, e.g. genomic DNA molecules or cDNA molecules, or RNA molecules, polypeptides such as proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, etc., peptides and saccharides.
  • biological polymers such as nucleic acids, e.g. double-stranded or single-stranded DNA molecules, e.g. genomic DNA molecules or cDNA molecules, or RNA molecules, polypeptides such as proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, etc., peptides and saccharides.
  • the target molecules are nucleic acids and the capture molecules are selected from hybridization probes complementary thereto.
  • the hybridization probes can likewise be nucleic acids, in particular DNA molecules, but also nucleic acid analogs, such as peptide nucleic acids (PNA) 1 Locked nucleic acids (LNA), etc.
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked nucleic acids
  • the hybridization probes preferably have a length corresponding to 10-100 nucleotides and do not necessarily consist of building blocks with bases, ie they may also contain, for example, abasic building blocks, linkers, spacers, etc.
  • the hybridization probes or their complements may be attached to the support at the 3'-end, 5'-end or therebetween or at several positions.
  • capture molecules are peptides.
  • low molecular weight substance libraries can be used as receptors.
  • the capture molecules or capture molecule matrices immobilized on the support are generated on the support by in situ synthesis, for example by stepwise synthesis from synthesis building blocks, and are thus freely selectable.
  • the building blocks for this in situ synthesis may be monomers of the relevant substance class, ie, in the case of nucleic acids, for example nucleotide building blocks. However, it may also be more complex components, such as oligonucleotides or oligopeptides of several, for example, 2, 3, or 4, monomer units.
  • the sample used for the method according to the invention is preferably a complex sample, i. the target molecules must be selectively isolated from a variety of similar molecular species.
  • the sample may be a biological sample, e.g. a sample from a biological organism, e.g. from a body fluid, a sample from a cell or microorganism culture, etc.
  • the sample may also be made from synthetic sources, e.g. from a synthesizer, or be a mixture of biological and synthetic material.
  • synthetic sources e.g. from a synthesizer
  • the use of prefabricated molecular libraries in which specific target molecules may be present is also possible.
  • the sample may optionally be processed prior to contacting the receptors, e.g. by enzymatic reaction such as amplification, restriction cleavage, labeling, transcription, translation, fractionation, pre-purification etc.
  • enzymatic reaction such as amplification, restriction cleavage, labeling, transcription, translation, fractionation, pre-purification etc.
  • the target molecules to be isolated can thus be present in labeled or unlabeled form.
  • the array containing the capture molecules or capture molecule matrices in immobilized form is preferably provided on a structured support, more preferably on a support with channels, for example with closed channels.
  • the channels are, for example, microchannels with a cross section of 10-10,000 microns.
  • suitable carriers with channels are described in WO 00/13017 and WO 00/13018.
  • a carrier is used which is at least partially in the range the positions with the immobilized capture molecules or capture molecule matrices is optically transparent and / or electrically conductive.
  • other types of supports for example planar supports such as microscope slides, can be used, which allow the preparation of defined molecule libraries of capture molecules.
  • the support used for the method of the invention contains an array of several different species of immobilized capture molecules or capture molecule templates, e.g. with at least 10, preferably at least 100, particularly preferably at least 1000 different species of catcher molecules or catcher molecule matrices.
  • the individual immobilized species differ in that they have a different structure, e.g. Nucleic acid sequence, and optionally - in the case of catcher molecules - bind different target molecules and - in the case of catcher molecule matrices - result in the write off different catcher molecules.
  • the capture molecules or capture molecule matrices are preferably built up in situ stepwise by local or / and time-specific coupling of synthesis building blocks at the respectively predetermined positions on or in the support.
  • a single capture molecule species or capture molecule template species or a mixture of several different capture molecule species or capture molecule template species may be immobilized or synthesized.
  • the capture molecules can also be synthesized externally and then immobilized on the support, e.g. by spotting.
  • the carrier is integrated in a device comprising a programmable light source matrix, a Detector matrix, a preferably arranged between the light source and detector matrix carrier and means for supplying fluids into the carrier and for discharging fluids from the carrier.
  • the programmable light source or exposure matrix may be a reflection matrix, a light valve matrix, eg, an LCD matrix or a self-emitting exposure matrix.
  • Such light matrices are disclosed in WO00 / 13017 and WO00 / 13018.
  • the detector matrix can be integrated in the carrier body.
  • the in situ buildup of capture molecules on the support can include fluid chemical steps, photochemical steps, electrochemical steps, or combinations of two or more of these steps.
  • An example of an electrochemical synthesis of catcher molecules on a carrier is described in DE 101 20 633.1.
  • An example of a hybrid process comprising the combination of fluid chemical steps and photochemical steps is described in DE 101 22 357.9.
  • the inventive method is also suitable for the production of multiple libraries of capture molecules on a single carrier.
  • catcher molecules after the replacement of catcher molecules or after copying catcher molecule matrices another synthesis Abansviz. Connect write-down cycle.
  • very different molecular species such as mRNA molecules or DNA sequences, can be isolated with a carrier.
  • a switch to new target molecules with a single carrier is possible.
  • the method is easy to automate and can be combined with further subsequent processing steps, such as an amplification reaction, e.g. using a PCR thermocycler, detection or in vitro translation.
  • the capture molecules which can specifically bind to the target molecules are provided directly on the support.
  • the capture molecules which can specifically bind to the target molecules are provided directly on the support.
  • the capture molecules are coupled via a cleavable bond to the carrier, so that a detachment of the capture molecules from the carrier can follow, for example, by photochemical and / or fluid chemical steps.
  • photolabile and / or chemically labile e.g. provided by acids, bases and / or reduction cleavable bonds between the capture molecule and the carrier.
  • the capture molecules are marked. This is preferably done by introducing one or more functional groups. These functional groups can be introduced, for example, during synthesis in the form of functionalized synthesis building blocks and / or after synthesis (on the support or after release) by reaction of the capture molecule with suitable functional groups.
  • a carrier with immobilized capture molecule matrices is provided.
  • the capture molecules are prepared in free form, for example by enzymatic elongation of primer molecules which bind to partial sequences of the templates, e.g. hybridize, or by other methods, such as described in WO 2005/051970, the disclosure of which is hereby made the subject of the present application.
  • the capture molecule matrices are preferably nucleic acids and the capture molecules thereof complementary nucleic acid molecules.
  • the introduction of tag groups into the capture molecules may occur during preparation, e.g. during the enzymatic synthesis, for example by using primer molecules derivatized with functional groups and / or synthesis building blocks, or after the capture molecules have been prepared by derivatization with suitable reactive functional groups.
  • amplification of the molecule library consisting of the capture receptors can also be carried out.
  • this is a distortion-free Amplification method used in which the original composition of the molecule library is preserved.
  • An example of this is the emulsion PCR.
  • the functional groups intended for labeling may be introduced, for example, by using labeled amplification primers or labeled nucleoside triphosphate derivatives.
  • the catcher molecules are provided directly on the carrier, wherein - as described above - they can be coupled to the carrier via a cleavable bond.
  • the immobilized capture molecules are labeled as described above by introduction of one or more functional groups.
  • the immobilized labeled capture molecules are now brought into contact with the sample to be examined, wherein the target molecules contained in the sample bind to the immobilized capture molecules.
  • the remaining sample components may be, e.g. by rinsing the carrier, to be separated.
  • complexes of the capture molecules and the target sequences are detached from the carrier, from which the target molecules can be isolated.
  • contacting the capture molecules immobilized on the support with the sample may be under conditions of variable stringency, eg stringent or less stringent hybridization conditions, such that target molecules having weaker interactions with the immobilized capture molecules (eg nucleic acid sequences having one or more mismatches) , depending on the setting of the stringency bind to the capture molecules or not.
  • the separation of undesired sample components can be controlled by setting more or less stringent washing conditions.
  • the stringency can be controlled by temperature and / or buffer composition.
  • the functional groups with which the catcher molecules in the are labeled according to the invention preferably solid phase binding groups, ie groups which can be bound to a suitable solid phase, for example to another carrier as indicated above, a microtiter plate, a column or particulate solid phases such as spheres.
  • the functional group used is preferably a first member of a bioaffinity binding pair which can react with high affinity and specificity with the complementary second partner of the binding pair.
  • suitable pairs of binding partners are antigen or hapten / antibody, biotin / streptavidin, sugar / lectin, ligand / receptor, etc.
  • the functional group is biotin and the complementary group of the solid phase is streptavidin or avidin.
  • biotin derivatives which are capable of binding with streptavidin or avidin instead of biotin.
  • the target molecules bound to the capture molecules can be separated from other sample components, for example components of the sample that can not be bound with the capture molecules, in the method according to the invention.
  • the immobilization of the capture molecules on the solid phase can be location-specific, but also - when using different functionalized groups - also site-specific, e.g. on different particles or in different spatial areas of a common solid phase.
  • sub-fractions of the molecule library of capture molecules used to isolate the target molecules are prepared. These subfractions, which are preferably capable of binding with different species or groups of target molecules, can be prepared on a support spatially separated from other subfractions and spatially or / and temporally detached from / / copied from / to other subfractions from the support. Alternatively, sub-fractions of the molecule library can also be prepared separately on multiple supports. If necessary, different Subfractions of the molecule library can also be labeled with different functional groups. For example, a first subfraction of capture molecules can be labeled with biotin and bind to streptavidin or avidin-coated solid phase. Another subfraction may in turn be labeled with an antigen or hapten and bind to a solid phase coated with the appropriate antibody directed against the antigen or hapten.
  • Isolation of the target molecules preferably comprises elution of the target molecules from the solid phase under conditions in which the binding of the target molecule to the capture molecule is resolved, but the capture molecule remains bound to the solid phase.
  • the elution of the target molecules immobilized on the solid phase can take place in a single step.
  • a location- or / and time-specific elution can be carried out, wherein individual target molecules or individual groups of target molecules are eluted first in a first step of the solid phase and the elution of other target molecules or
  • Groups of target molecules in one or more subsequent steps takes place.
  • the elution is carried out by means of a temperature change, e.g. a temperature increase that leads to a denaturation of nucleic acid double strands.
  • the method according to the invention can also be used for the isolation of proteins and other molecules, in particular DNA-binding molecules, if capture probes suitable as catcher molecules are selected.
  • DNA-binding proteins can therefore be isolated with the aid of DNA capture probes, which can be in the form of a double or single strand.
  • peptide capture probes may also be used for the isolation of proteins or DNA molecules be used.
  • the capture probes used are nucleic acids having specific binding properties, for example aptamers or ribozymes.
  • the isolated target molecules can be used directly or indirectly for diagnostic or therapeutic purposes.
  • the extracted material can be used in follow-up reactions.
  • from extracted nucleic acids, proteins or peptides e.g. by transfer into suitable vectors (cloning), or into suitable target cells (transformation or transfection) or by in vitro translation, in particular isolation of mRNA target molecules.
  • follow-up reactions to which the isolated target molecules can be subjected are, in particular with nucleic acid target molecules, sequencing reactions or microarray analyzes.
  • nucleic acid fragments to be isolated / extracted from the support via suitable reagents and suitable temperatures (see FIG. 1G); 13. Further use of the selectively extracted nucleic acids, e.g. in a sequencing, PCR, cloning, microarray experiments.
  • the sample to be tested may be pretreated to selectively remove certain components from a sample containing a target molecule or a target molecule mixture.
  • Disturbing components may be removed, eg, repetitive elements or telomeric sequences upon analysis of gene fragments; Filtering out certain genes (eg housekeeping genes) in transcriptional analyzes; Protein or Protein classes that interfere with the proteome analysis of (rare) proteins.
  • known components can be trapped by binding to specific ("negative") catcher molecules specific for these interfering complements and only desired, eg known or unknown, target molecules eluted, resulting in a concentration of desired nucleic acids or proteins or other desired biomolecules for example, by a method comprising the steps of:
  • Positions are immobilized on or in the support, and (ii) passing a sample containing target molecules to be isolated through or over the support under conditions where interfering components from a sample can specifically bind to the capture molecule immobilized on the support.
  • interfering components are depleted so that subsequent analysis of the desired molecules can be performed with higher precision. Furthermore, a concentration of the desired target molecules of the sample to be examined is achieved and interfering molecules, e.g. several species in parallel, can be selectively removed from the molecule mixture.
  • the present invention also encompasses an embodiment relating to a method for isolating target molecules from a sample, wherein at least one process cycle in which the target molecules bind to immobilized capture molecules on a support, as in
  • WO 03/031965 and at least one process cycle in which the target molecules bind to free labeled capture molecules are combined.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Extraktionsverfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung einer Molekülbibliothek.

Description

Flexibles Extraktionsverfahren für die Herstellung sequenzspezifischer
Molekülbibliotheken
s Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Extraktionsverfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung einer Molekülbibliothek. o Die selektive Extraktion von Molekülen ist für viele Arbeitsgebiete in der Biochemie, Biologie und Medizin ein zentraler und wichtiger Prozess. Zu diesen Arbeitsgebieten gehört die Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren, Proteinen, Zuckern und weiteren biochemischen funktionellen Molekülen. 5
Auch in der Genetik spielen biochemische Methoden zur Extraktion von bestimmten Molekülen, Verbindungen oder Stoffklassen eine wichtige Rolle. Besondere Bedeutung kommt dabei der Aufreinigung von Nukleinsäuren, meist DNA und RNA, zu. Wesentliche Schritte der Rekombinationstechniko setzen die Isolation und Reinigung von bestimmten Nukleinsäuren, z.B. von Plasmid-DNA oder genomischer DNA, voraus. Auch die Konstruktion von Gen-Bibliotheken aus messenger-RNA (mRNA), die eine zentrale Bedeutung in der Gentechnik hat, ist auf die Isolation einer gewünschten RNA-Population angewiesen. Aus solchen Bibliotheken werden Gene oder Genfragmente "gefischt", um sie weiter untersuchen oder manipulieren zu können.
Biochemische, biologische und medizinische Analyseverfahren lassen sich durch Miniaturisierung und Parallelisierung in ihrer Effizienz und Aussagekraft enorm steigern. Solche Miniaturisierungen betreffen z.B. die Analyse von genetischem Material mit Hilfe von Hybridisierungs- experimenten auf DNA-Mikroarrays. Durch Entwicklung von Mikroarrays aus geeigneten DNA-Sonden als Rezeptoren lassen sich ganze Genome und Transkriptome analysieren. Neben den recht weit verbreiteten DNA- Mikroarrays sind auch Verfahren miniaturisiert und parallelisiert worden, die dem Screening nach Molekülen mit besonderen Eigenschaften dienen, z.B. Ribozymen. Weitere Beispiele für Rezeptoren auf Mikroarrays sind Proteine und solche Moleküle, die in der Natur nicht vorkommen, wie z.B. Peptidnukleinsäuren (PNA). Viele solcher Assay-Formate werden unter der Rubrik Biochips zusammengefasst. Alle diese Assay-Formate und Biochips sind potenziell für die Isolation und Reinigung des Probenmaterials und die Probenvorbereitung nutzbar.
Mikroreaktionstechniken können mit solchen Mikroarrays gekoppelt werden, um sowohl bei Probenvorbereitung als auch bei Herstellung des eigentlichen Arrays zu schnellen und effizienten Systemen zu kommen. Dies schließt auch die Verwendung von mikrofluidischen Verfahren mit ein.
Für die biochemische Isolation von Nukleinsäuren stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Die Methoden erlauben zwar die Isolation und gegebenenfalls auch Aufreinigung von RNA oder DNA über ihre biophysikalischen Eigenschaften, sind dabei aber völlig unspezifisch in Bezug auf die Sequenz des Nukleinsäurestranges.
So können aus Gesamt-RNA, die unterschiedliche Sorten RNA enthält, mRNA-Moleküle relativ spezifisch isoliert werden, indem man auf einer festen Phase, z.B. Latex-Beads, Magnet-Beads, Controlled Pore Glass- Beads oder der Matrix einer Säule Poly-Thymidin Stränge (poly-T Stränge) immobilisiert. Diese PoIy-T Stränge hybridisieren nach Zugabe von Gesamt- RNA mit dem Poly-Adenin (poly-A) Schwanz von mRNA-Molekülen und erlauben das Abtrennen der nichtgebundenen RNA-Moleküle. Die mRNA- Moleküle werden dann isoliert, indem der Puffer entsprechend so geändert wird, dass die Hybridisierung zugunsten von Einzelsträngen aufgehoben wird. Die frei werdenden mRNA-Moleküle kann man anschließend eluieren.
Der Informationsgehalt einer solchen Isolationsmatrix ist vergleichsweise gering, da nur zwei Kategorien von Zielmolekülen unterschieden werden können, nämlich mit oder ohne poly-A Schwanz.
Im Falle von Isolationsverfahren für Proteine verhält es sich zumeist ähnlich. So werden Immunglobuline häufig durch eine Isolationsmatrix in einer Säule mit immobilisiertem Protein A (aus Staphylococcus aureus) isoliert (Brown et al., Biochem. Soc. Transactions (England) 26 (1998), 249). In anderen Versionen des Verfahrens werden Antikörper für eines oder wenige Zielmoleküle an die Isolationsmatrix gebunden.
Solche Isolationsverfahren werden allgemein als Affinitätschromatographie bezeichnet. Ein Nachteil dieser Verfahren besteht darin, dass keine parallele selektive Isolation unterschiedlicher Zielmoleküle möglich ist.
US-Patent 6,013,440 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, wobei ein Satz unterschiedlicher Nukleinsäuresonden auf einem festen Träger immobilisiert wird, um auf diese Weise Zielnukleinsäuren einer noch unbekannten Sequenz aus einer Probe anzureichern. Neben anderen Nachteilen ist hervorzuheben, dass das vorgeschlagene Verfahren flächige Träger als Isolationsmatrix verwendet, die nur eine ungünstige Elution erlauben. Auch mit diesem Verfahren können somit die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht beseitigt werden.
WO 03/031965 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung, bei denen ein mikrofluidischer Träger als Isolationsmatrix verwendet wird, der eine selektive Isolation von bestimmten biochemischen funktionellen Molekülen (Zielmolekülen), insbesondere eine sequenzspezifische parallele Isolation mehrerer Spezies von Zielmolekülen, aus einem Gemisch erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung einer Molekülbibliothek, bestehend aus freien Fänger-Rezeptoren, die spezifische - A -
Wechselwirkungen mit den Zielmolekülen aufweisen. Das Verfahren umfasst vorzugsweise eine parallele Isolierung von mehreren Zielmolekülen unter Verwendung einer Bibliothek von mehreren unterschiedlichen Fänger- Rezeptoren. Die Synthese der Molekülbibliothek findet auf einem festen Träger, insbesondere auf einem mikrofluidischen Täger statt. Vor Inkontaktbringen mit der Probe werden die die Molekülbibliothek bildenden Fänger-Rezeptoren vom Träger abgelöst, insbesondere durch chemische oder/und physikalische Verfahren, oder abgeschrieben bzw. abkopiert, insbesondere durch enzymatische Verfahren. Die Fänger-Rezeptoren werden mit funktionellen Gruppen markiert und dann mit der Probe in Kontakt gebracht, so dass eine Bindung der Zielmoleküle an die für die Zielmoleküle spezifischen Fänger-Rezeptoren erfolgen kann, und Komplexe der Zielmoleküle und der Fänger-Rezeptoren entstehen. Die gebildeten Komplexe, die z.B. aus einem Fänger-Rezeptor und einem Zielmolekül bestehen, werden anschließend von übrigen Probenkomponenten abgetrennt, vorzugsweise durch Immobilisierung an eine Festphase, z.B. über die funktionelle Gruppe. Anschließend können die an die Festphase gebundenen Zielmoleküle eluiert werden.
Die Funktionalität eines Zielmoleküls ist durch seine Fähigkeit zur selektiven Bindung an einen für das Zielmolekül spezifischen Fänger-Rezeptor, vorzugsweise durch bioaffine Wechselwirkungen wie Hybridisierung, Rezeptor-Ligand-Bindung, Antigen-Antikörper-Bindung, Saccharid-Lectin- Bindung etc., definiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Bereitstellung eines Trägers mit einer Molekülbibliothek, d.h. einen Array von selektiv bindenden Rezeptoren bzw. Fängersonden, die zur Isolierung der Zielmoleküle geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine in situ Synthese der Rezeptoren auf oder in dem Träger, vorzugsweise einem mikrofluidischen Reaktionsträger. Diese Vorgehensweise erlaubt bei Einsatz entsprechender Verfahren für die in situ Synthese einen sehr hohen Informationsgehalt der Molekülbibliothek. Im Fall von Nukleinsäuren als Zielmoleküle kann ein geeignetes System für die in situ Synthese der entsprechenden Fängersonden Tausende von definierten Sequenzen einer Molekülbibliothek herstellen. Somit wird durch die Erfindung ein Weg eröffnet, um gezielt Hunderte bis Tausende oder sogar Millionen von individuellen DNA- oder RNA-Molekülen gezielt aus einem Gemisch zu isolieren.
Eine Abwandlung des zuvor beschriebenen Verfahrens besteht darin, die Probe, welche mehrere verschiedene Zielmoleküle, z.B. Nukleinsäuren, aufweist, mit einem Träger zu kontaktieren, der verschiedene frei wählbare Fängermoleküle daran reversibel gebunden aufweist. Nach Entfernung ungebundener oder nicht ausreichend gebundener Bestandteile der Probe werden die Komplexe aus Zielmolekülen und Fänger-Rezeptoren vom Träger abgelöst. Anschließend erfolgt eine Abtrennung der Zielmoleküle von den Fänger-Rezeptoren, z.B. über funktionelle Gruppen der Fänger- Rezeptoren, die eine biophysikalische Separierung erlauben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. zum Einsatz kommen in der akademischen Forschung, der Grundlagenforschung, der industriellen Forschung, in der Qualitätskontrolle, in der Pharmaforschung, in der Biotechnologie, in der klinischen Forschung, in der klinischen Diagnostik, in Screening-Verfahren, in der patientenindividuellen Diagnostik, in klinischen Studien, in der Forensik, für genetische Tests, wie Elternschaftsbestimmungen, in der Tier- und Pflanzenzucht oder im Umweltmonitoring.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekülen, die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
(b) Ablösen der Fängermoleküle von dem Träger,
(c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren vor oder nach dem Ablösen der Fängermoleküle gemäß Schritt (b) erfolgen kann,
(d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die markierten Fängermoleküle binden können,
(e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe und
(f) Isolieren der Zielmoleküle.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekül-Matrizen, die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind, (b) Abschreiben der Fängermolekül-Matrizen, um Fängermoleküle in freier Form zu erhalten,
(c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren während oder nach dem Abschreiben gemäß Schritt (b) erfolgen kann,
(d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen
Zielmoleküle spezifisch an die markierten Fängermoleküle binden können,
(e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe und (f) Isolieren der Zielmoleküle.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekül-Matrizen, die markiert und an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
(b) Inkontaktbringen der markierten immobilisierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die markierten immobilisierten Fängermoleküle binden können,
(c) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe,
(d) Ablösen der Fängermoleküle und daran gebundener Zielmoleküle von dem Träger und
(e) Isolieren der Zielmoleküle.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren isolierten Zielmoleküle werden vorzugsweise aus biologischen Polymeren, wie Nukleinsäuren, z.B. doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA-Molekülen, z.B. genomischen DNA-Molekülen oder cDNA-Molekülen, oder RNA-Molekülen, Polypeptiden, wie etwa Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Nukleoproteinen etc., Peptiden und Sacchariden ausgewählt.
Bevorzugt handelt es sich bei den Zielmolekülen um Nukleinsäuren und die Fängermoleküle werden aus dazu komplementären Hybridisierungssonden ausgewählt. Bei den Hybridisierungssonden kann es sich ebenfalls um Nukleinsäuren, insbesondere DNA-Moleküle, jedoch auch um Nukleinsäureanaloga, wie Peptidnukleinsäuren (PNA)1 Locked- Nukleinsäuren (LNA) etc. handeln. Die Hybridisierungssonden haben vorzugsweise eine Länge entsprechend 10-100 Nukleotiden und müssen nicht durchgängig aus Bausteinen mit Basen bestehen, d.h. sie können beispielsweise auch abasische Bausteine, Linker, Spacer etc. enthalten. Die Hybridisierungssonden oder deren Komplemente können am 3'-Ende, 5'- Ende oder dazwischen oder an mehreren Positionen am Träger gebunden sein.
Ein anderes bevorzugtes Beispiel für Fängermoleküle sind Peptide. Des Weiteren können selbstverständlich auch niedermolekulare Substanzbibliotheken als Rezeptoren eingesetzt werden. Vorzugsweise werden die auf dem Träger immobilisierten Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen, z.B. die Hybridisierungssonden, durch in situ Synthese, z.B. durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen, auf dem Träger erzeugt und sind damit frei wählbar. Die Bausteine für diese in situ Synthese können Monomere der betreffenden Stoffklasse sein, also im Fall von Nukleinsäuren z.B. Nukleotidbausteine. Es kann sich aber auch um komplexere Bausteine handeln, so z.B. Oligonukleotide oder Oligopeptide aus mehreren, z.B. 2, 3, oder 4, Monomereinheiten.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Probe ist vorzugsweise eine komplexe Probe, d.h. die Zielmoleküle müssen aus einer Vielzahl ähnlicher Molekülspezies selektiv isoliert werden. Die Probe kann eine biologische Probe sein, z.B. eine Probe aus einem biologischen Organismus, z.B. aus einer Körperflüssigkeit, eine Probe aus einer Zell- oder Mikroorganismenkultur etc. Weiterhin kann die Probe auch aus synthetischen Quellen, z.B. aus einer Synthesevorrichtung, stammen, oder ein Gemisch aus biologischem und synthetischem Material sein. Auch die Verwendung aus vorgefertigten Molekülbibliotheken, in denen spezifische Zielmoleküle vorhanden sein können, ist möglich.
Die Probe kann vor dem Inkontaktbringen mit den Rezeptoren gegebenenfalls prozessiert werden, z.B. durch enzymatische Reaktion wie Amplifikation, Restriktionsspaltung, Markierung, Transkription, Translation, Fraktionierung, Vorreinigung etc. Die zu isolierenden Zielmoleküle können somit in markierter oder unmarkierter Form vorliegen.
Der die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen in immobilisierter Form enthaltende Array wird bevorzugt auf einem strukturierten Träger, besonders bevorzugt an einem Träger mit Kanälen, z.B. mit geschlossenen Kanälen, bereitgestellt. Die Kanäle sind beispielsweise Mikrokanäle mit einem Querschnitt von 10-10 000 μm. Beispiele für geeignete Träger mit Kanälen sind in WO 00/13017 und WO 00/13018 beschrieben. Vorzugsweise wird ein Träger verwendet, der zumindest teilweise im Bereich der Positionen mit den immobilisierten Fängermolekülen bzw. Fängermolekül-Matrizen optisch transparent oder/und elektrisch leitfähig ist. Alternativ können jedoch auch andere Arten von Trägern, z.B. planare Träger wie etwa Mikroskopslides, Verwendung finden, die eine Herstellung definierter Molekülbibliotheken von Fängermolekülen ermöglichen.
Der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Träger enthält einen Array mit mehreren verschiedenen Spezies von immobilisierten Fängermolekülen bzw. Fängermolekül-Matrizen, z.B. mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 100, besonders bevorzugt mindestens 1000 verschiedenen Spezies von Fängermolekülen bzw. Fängermolekül-Matrizen. Die einzelnen immobilisierten Spezies unterscheiden sich darin, dass sie eine unterschiedliche Struktur, z.B. Nukleinsäuresequenz, aufweisen und gegebenenfalls - im Falle von Fängermolekülen - unterschiedliche Zielmoleküle binden und - im Falle von Fängermolekül-Matrizen - beim Abschreiben unterschiedliche Fängermoleküle ergeben. Die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen werden vorzugsweise in situ schrittweise durch orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln von Synthesebausteinen an den jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Träger aufgebaut.
An einer vorbestimmten Position kann nur eine einzige Fängermolekül- Spezies bzw. Fängermolekül-Matrizenspezies oder ein Gemisch von mehreren verschiedenen Fängermolekül-Spezies bzw. Fängermolekül- Matrizenspezies immobilisiert oder synthetisiert werden. Beispielsweise kann man Gemische von Spezies verwenden, die für das gleiche zu isolierende Zielmolekül spezifisch sind, z.B. ein Satz von verschiedenen Hybridisierungssonden für die Isolierung einer einzigen bestimmten Ziel- Nukleinsäure. Alternativ können die Fängermoleküle auch extern synthetisiert und anschließend auf dem Träger immobilisiert werden, z.B. durch Spotting.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger in einer Vorrichtung integriert, umfassend eine programmierbare Lichtquellenmatrix, eine Detektormatrix, einen vorzugsweise zwischen Lichtquellen- und Detektormatrix angeordneten Träger sowie Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger. Die programmierbare Lichtquellen- bzw. Belichtungsmatrix kann eine Reflexionsmatrix, eine Lichtventilmatrix, z.B. eine LCD-Matrix oder eine selbstemittierende Belichtungsmatrix, sein. Derartige Lichtmatrices sind in WO00/13017 und WO00/13018 offenbart. Die Detektormatrix kann gegebenenfalls im Trägerkörper integriert sein.
Der in situ Aufbau von Fängermolekülen auf dem Träger kann fluidchemische Schritte, photochemische Schritte, elektrochemische Schritte oder Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Schritte umfassen. Ein Beispiel für eine elektrochemische Synthese von Fängermolekülen auf einem Träger ist in DE 101 20 633.1 beschrieben. Ein Beispiel für ein Hybridverfahren, umfassend die Kombination von fluidchemischen Schritten und photochemischen Schritten, ist in DE 101 22 357.9 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Herstellung von mehrere Bibliotheken von Fängermolekülen auf einem einzigen Träger. So kann sich nach der Ablösung von Fängermolekülen bzw. nach dem Abschreiben von Fängermolekül-Matrizen ein weiterer Synthese-Ablösungsbzw. Abschreib-Zyklus anschließen. Auf diese Weise lassen sich mit einem Träger auch sehr unterschiedliche Molekülspezies, wie mRNA-Moleküle oder DNA-Sequenzen, isolieren. Darüber hinaus ist eine Umstellung auf neue Zielmoleküle mit einem einzigen Träger möglich. Das Verfahren ist gut automatisierbar und kann mit weiteren nachfolgenden Prozessierungsschritten, wie einer Amplifikationsreaktion, z.B. unter Verwendung eines PCR-Thermocyclers, einer Detektion oder einer in vitro Translation kombiniert werden.
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Fängermoleküle, die spezifisch an die Zielmoleküle binden können, direkt auf dem Träger bereitgestellt. In dieser Ausführungsform der 51
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Erfindung sind die Fängermoleküle über eine spaltbare Bindung an den Träger gekoppelt, so dass ein Ablösen der Fängermoleküle vom Träger beispielsweise durch photochemische oder/und fluidchemische Schritte folgen kann. Hierzu werden vorzugsweise photolabile oder/und chemisch labile, z.B. durch Säuren, Basen oder/und Reduktion spaltbare Bindungen zwischen dem Fängermolekül und dem Träger vorgesehen. Vor oder nach dem Ablösen vom Träger werden die Fängermoleküle markiert. Dies erfolgt vorzugsweise durch Einführung von einer oder mehreren funktionellen Gruppen. Diese funktionellen Gruppen können beispielsweise während der Synthese in Form von funktionalisierten Synthesebausteinen oder/und nach der Synthese (auf dem Träger oder nach dem Ablösen) durch Reaktion des Fängermoleküls mit geeigneten funktionellen Gruppen eingeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Träger mit immobilisierten Fängermolekül-Matrizen bereitgestellt. Auf diesem Träger werden durch Abschreiben der Matrizen vorzugsweise mittels enzymatischer Methoden die Fängermoleküle in freier Form hergestellt, beispielsweise durch enzymatische Elongation von Primer-Molekülen, die an Teilsequenzen der Matrizen binden, z.B. hybridisieren, oder mittels anderer Methoden, wie etwa in WO 2005/051970 beschrieben, deren Offenbarung hiermit zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. In dieser Ausführungsform sind die Fängermolekül-Matrizen vorzugsweise Nukleinsäuren und die Fängermoleküle hierzu komplementäre Nukleinsäuremoleküle. Die Einführung von Markierungsgruppen in die Fängermoleküle kann während der Herstellung, z.B. während der enzymatischen Synthese, beispielsweise durch Verwendung von mit funktionellen Gruppen derivatisierten Primer-Molekülen und/oder Synthesebausteinen, oder nach dem Herstellen der Fängermoleküle durch Derivatisierung mit geeigneten reaktiven funktionellen Gruppen erfolgen.
Nach dem Eluieren der Fängermoleküle von dem Träger kann auch eine Amplifikation der aus den Fänger-Rezeptoren bestehenden Molekülbibliothek erfolgen. Vorzugsweise wird hierzu ein verzerrungsfreies Amplifikationsverfahren verwendet, bei dem die ursprüngliche Zusammensetzung der Molekülbibliothek gewahrt bleibt. Ein Beispiel hierfür ist die Emulsions-PCR. In dieser Ausführungsform können die zur Markierung vorgesehenen funktionellen Gruppen beispielsweise durch Verwendung markierter Amplifikationsprimer oder markierter Nukleosidtriphosphat-Derivate eingeführt werden.
In noch einer weiteren abgewandelten Ausführungsform der Erfindung werden die Fängermoleküle direkt auf dem Träger bereitgestellt, wobei sie - wie oben beschrieben - über eine spaltbare Bindung an den Träger gekoppelt sein können. Die immobilisierten Fängermoleküle sind - wie oben beschrieben - durch Einführung von einer oder mehreren funktionellen Gruppen markiert.
Die immobilisierten markierten Fängermoleküle werden nun mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht, wobei die in der Probe enthaltenen Zielmoleküle an die immobilisierten Fängermoleküle binden. Die übrigen Probenbestandteile können, z.B. durch Spülen des Trägers, abgetrennt werden. Anschließend werden Komplexe der Fängermoleküle und der Zielsequenzen vom Träger abgelöst, aus denen die Zielmoleküle isoliert werden können. In dieser Ausführungsform kann das Inkontaktbringen der auf dem Träger immobilisierten Fängermoleküle mit der Probe unter Bedingungen variabler Stringenz, z.B stringenten oder weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen, erfolgen, so dass Zielmoleküle, die schwächere Wechselwirkungen mit den immobilisierten Fängermolekülen aufweisen (z.B. Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Mismatches), je nach Einstellung der Stringenz an die Fängermoleküle binden oder nicht. Entsprechend kann auch die Trennung unerwünschter Probenbestandteile durch Einstellung mehr oder weniger stringenter Waschbedingungen gesteuert werden. Die Stringenz kann dabei über Temperatur und/oder Pufferzusammensetzung gesteuert werden.
Die funktionellen Gruppen, mit denen die Fängermoleküle im erfindungsgemäßen Verfahren markiert werden, sind vorzugsweise Festphasenbindungsgruppen, d.h. Gruppen, die an eine geeignete Festphase, z.B. an einen weiteren Träger wie oben angegeben, eine Mikrotiterplatte, eine Säule oder partikuläre Festphasen wie Kugeln, gebunden werden können. Vorzugsweise wird als funktionelle Gruppe ein erster Parter eines bioaffinen Bindepaares verwendet, der mit hoher Affinität und Spezifität mit dem komplementären zweiten Partner des Bindepaares reagieren kann. Beispiele für geeignete Paare von Bindepartnern sind Antigen bzw. Hapten/Antikörper, Biotin/Streptavidin, Zucker/Lectin, Ligand/Rezeptor etc. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die funktionelle Gruppe Biotin und die komplementäre Gruppe der Festphase Streptavidin oder Avidin. Selbstverständlich können anstelle von Biotin auch mit Streptavidin bzw. Avidin bindefähige Biotinderivate verwendet werden.
Durch Immobilisierung von funktionalisierten Fängermolekülen können im erfindungsgemäßen Verfahren die an die Fängermoleküle gebundenen Zielmoleküle von anderen Probenkomponenten, beispielsweise von nicht mit den Fängermolekülen bindefähigen Komponenten der Probe, abgetrennt werden. Die Immobilisierung der Fängermoleküle auf der Festphase kann ortsunspezifisch, aber auch - bei Verwendung unterschiedlicher funktionalisierter Gruppen - auch ortsspezifisch erfolgen, z.B. auf verschiedenen Partikeln oder an verschiedenen räumlichen Bereichen einer gemeinsamen Festphase.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden mehrere Subfraktionen der zur Isolierung der Zielmoleküle verwendeten Molekülbibliothek von Fängermolekülen hergestellt. Diese Subfraktionen, die vorzugsweise mit verschiedenen Spezies oder Gruppen von Zielmolekülen bindefähig sind, können auf einem Träger räumlich getrennt von anderen Subfraktionen hergestellt und räumlich oder/und zeitlich von anderen Subfraktionen vom Träger abgelöst bzw. abgeschrieben/abkopiert werden. Alternativ können Subfraktionen der Molekülbibliothek auch auf mehreren Trägern jeweils separat hergestellt werden. Gegebenenfalls können verschiedene Subfraktionen der Molekülbibliothek auch mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen markiert werden. Beispielsweise kann eine erste Subfraktion von Fängermolekülen mit Biotin markiert werden und an Streptavidin- bzw. Avidin-beschichtete Festphase binden. Eine andere Subfraktion kann wiederum mit einem Antigen oder Hapten markiert werden und an eine mit dem entsprechenden gegen das Antigen oder Hapten gerichteten Antikörper beschichteten Festphase binden.
Das Isolieren der Zielmoleküle umfasst vorzugsweise eine Elution der Zielmoleküle von der Festphase unter Bedingungen, bei denen die Bindung des Zielmoleküls an das Fängermolekül gelöst wird, aber das Fängermolekül weiter an der Festphase gebunden bleibt.
Die Elution der auf der Festphase immobilisierten Zielmoleküle kann in einem einzigen Schritt erfolgen. Andererseits kann jedoch eine orts- oder/und zeitspezifische Elution erfolgen, wobei einzelne Zielmoleküle oder einzelne Gruppen von Zielmolekülen zunächst in einem ersten Schritt von der Festphase eluiert werden und die Elution weiterer Zielmoleküle oder
Gruppen von Zielmolekülen in einem oder mehreren nachfolgenden Schritten erfolgt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Elution mittels einer Temperaturänderung, z.B. einer Temperaturerhöhung, die zu einer Denaturierung von Nukleinsäure-Doppelsträngen führt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für die Isolierung von Proteinen und anderen Molekülen, insbesondere DNA-bindenden Molekülen, eingesetzt werden, wenn als Fängermoleküle geeignete Fängersonden ausgewählt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können daher DNA-bindende Proteine mit Hilfe von DNA- Fängersonden, die als Doppel- oder Einzelstrang vorliegen können, isoliert werden. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können auch Peptidfängersonden für die Isolierung von Proteinen oder DNA-Molekülen verwendet werden. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Fängersonden Nukleinsäuren mit speziellen Bindungseigenschaften verwendet, z.B. Aptamere oder Ribozyme.
Die isolierten Zielmoleküle können direkt oder indirekt für diagnostische oder therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Weiterhin kann das extrahierte Material in Nachfolgereaktionen eingesetzt werden. So können aus extrahierten Nukleinsäuren Proteine oder Peptide, z.B. durch Transfer in geeignete Vektoren (Klonierung), oder in geeignete Zielzellen (Transformation bzw. Transfektion) oder durch in vitro Translation, insbesondere Isolierung von mRNA-Zielmolekülen, erzeugt werden. Weitere Beispiele für Nachfolgereaktionen, denen die isolierten Zielmoleküle unterzogen werden können, sind - insbesondere bei Nukleinsäure- Zielmolekülen - Sequenzierungsreaktionen oder Mikroarray-Analysen.
Im Folgenden ist der schematische Ablauf einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens am Beispiel von Nukleinsäuren als Zielmolekülen erläutert:
1. Ermittlung von Daten zu den Sequenzen der Zielmoleküle, die aus der Probe extrahiert werden sollen, z.B. Gene aus einem Modellorganismus, der gerade untersucht wird;
2. Ermittlung von geeigneten Fängersonden, die komplementär zu Bereichen in den ausgewählten Genen sind, bevorzugt mit Hilfe eines Computers;
3. Vorbereitung der zu untersuchenden Probe, z.B. durch Isolation der Nukleinsäuremoleküle aus einem Organismus;
4. Bereitstellen eines Geräts zur in situ Synthese von entsprechenden Fängersonden in oder auf einem mikrofluidischen Reaktionsträger oder einem anderen geeigneten Träger;
5. Einspeisen der ermittelten Fängersonden-Sequenz in eine Synthese- Steuerungseinheit, die mit dem Träger integriert sein kann;
6. Synthetisieren der ausgewählten Fängersonden-Sequenzen in oder auf dem Träger (siehe Figur 1A);
7. Ablösen der auf dem mikrofluidischen Träger synthetisierten Fängersonden und Elution vom Träger (siehe Figur 1B). Alternativ kann die Gewinnung der Molekülbibliothek auch über eine Kopierreaktion von Fängersonden-Matrizen erfolgen. Dies kann z.B. enzymatisch über eine
Polymerase-Reaktion erfolgen. Hierbei resultiert das Komplement der trägergebundenen Molekülbibliothek;
8. Amplifikation und Markierung der Fängersonden, Synthese doppelsträngiger, markierter Moleküle (siehe Figur 1C); 9. Mischung der markierten Fängersonden und der Probe (beispielsweise fragmentierte genomische DNA), so dass eine Bindung zwischen Zielmolekülen und Fängersonden (Hybridisierung) bei geeigneten Pufferbedingungen und geeigneter Temperatur erfolgen kann (siehe Figuren 1 D und E); 10. Immobilisierung der Fängersonden/Zielmolekül-Komplexe über die im Fängermolekül enthaltene Modifikation (z.B. Biotin) an ein spezifisches Trägermaterial (wie z.B. beschichtete magnetische Kugeln, beschichtete Mikrotiterplatten oder ein geeignetes Säulenmaterial, z.B. Strepavidin- beschichtet) (siehe Figur 1 F); 11. Entfernen ungebundener bzw. unspezifisch gebundener Komponenten über geeignete Pufferbedingungen und geeignete Temperatur; 12. Ablösen und Auffangen der zu isolierenden/extrahierenden Nukleinsäurefragmente vom Träger über geeignete Reagenzien und geeignete Temperaturen (siehe Figur 1G); 13. Weitere Verwendung der selektiv extrahierten Nukleinsäuren, z.B. in einer Sequenzierung, PCR, Klonierung, Mikroarray-Experimente.
Gegebenenfalls kann die zu untersuchende Probe vorbehandelt werden, um bestimmte Komponenten aus einer ein Zielmolekül oder ein Zielmolekül- Gemisch enthaltenden Probe selektiv zu entfernen. Störende Komponenten können entfernt werden, z.B. repetitive Elemente oder Telomersequenzen bei Analyse von Genfragmenten; Herausfiltern von bestimmten Genen (z.B. Housekeeping Genes) bei Transkriptionsanalysen; Protein- oder Proteinklassen, die die Proteomanalyse von (seltenen) Proteinen stören. So können bekannte Komponenten durch Bindung an für diese störenden Komplementen spezifische („negative") Fängermoleküle abgefangen und nur noch erwünschte, z.B. bekannte oder unbekannte, Zielmoleküle eluiert werden. Das führt zu einer Aufkonzentration erwünschter Nukleinsäuren oder Proteine oder anderer erwünschter Biomoleküle. Diese Vorbehandlung kann beispielsweise durch ein Verfahren erfolgen, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen eines weiteren Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen Fängermolekülen, die auf jeweils unterschiedlichen
Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind, und (ii) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch oder über den Träger unter Bedingungen, bei denen störende Komponenten aus einer Probe spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten Fängermolekül binden können.
Durch diese Vorgehensweise werden störende Komponenten abgereichert, so dass nachfolgende Analyse der gewünschten Moleküle mit höherer Präzision durchgeführt werden können. Weiterhin wird eine Aufkonzentrierung der gewünschten Zielmoleküle der zu untersuchenden Probe erreicht und störende Moleküle, z.B. mehrere Spezies parallel, können gezielt aus dem Molekülgemisch entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst schließlich auch eine Ausführungsform betreffend ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, wobei mindestens ein Verfahrenszyklus, bei dem die Zielmoleküle an immobilisierte Fängermoleküle auf einem Träger binden, wie in
WO 03/031965 beschrieben und mindestens einen Verfahrenszyklus, bei dem die Zielmoleküle an freie markierte Fängermoleküle binden, kombiniert werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekülen, die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind, (b) Ablösen der Fängermoleküle von dem Träger,
(c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren vor oder nach dem Ablösen der Fängermoleküle gemäß Schritt (b) erfolgen kann,
(d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die markierten Fängermoleküle binden können,
(e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe und
(f) Isolieren der Zielmoleküle.
2. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekül-Matrizen, die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
(b) Abschreiben der Fängermolekül-Matrizen, um Fängermoleküle in freier Form zu erhalten,
(c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren während oder nach dem Abschreiben der Fängermoleküle gemäß Schritt (b) erfolgen kann,
(d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die markierten Fängermoleküle binden können, (e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe und s (f) Isolieren der Zielmoleküle.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielmoleküle ausgewählt werden aus Nukleinsäuren,o Polypeptiden, Peptiden und Sacchariden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielmoleküle aus Nukleinsäuren, insbesondere DNA- und/oder RNA-Molekülen ausgewählt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermoleküle Hybridisierungssonden verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hybridisierungssonden Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonden eine Länge entsprechend 10-100 Nukleotiden aufweisen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe biologischen oder/und synthetischen Ursprungs verwendet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe verwendet, die einem oder mehreren
Vorbehandlungsschritten unterzogen worden ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mikrofluidischen Träger mit geschlossenen Kanälen, insbesondere mit Mikrokanälen mit einem Durchmesser von 10-1000 μm, verwendet.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Array auf dem Träger mindestens 10, vorzugsweise mindestens 100 Positionen mit verschiedenen Fängermolekülen bzw. Fängermolekül-Matrizen enthält.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen an den einzelnen Positionen Einzelsequenzen oder/und Sequenzgemische enthalten.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen des Arrays in situ schrittweise durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Synthesebausteinen an den jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Träger aufgebaut werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man den Träger für einen oder mehrere integrierte Synthese- Analyse-Zyklen einsetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man den Träger zusammen mit einer programmierbaren Lichtquellenmatrix und einer Detektionsmatrix verwendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Ablösen der Fängermoleküle vom Träger durch photochemische oder/und fluidchemische Schritte erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Abschreiben der Fängermolekül-Matrizen eine enzymatische Polymerase-Reaktion umfasst.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Markieren die Einführung einer oder mehrerer funktioneller Gruppen, insbesondere Festphasenbindungsgruppen in die Fängermoleküle umfasst.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material eine Bindung an eine Festphase und die Abtrennung von nicht an die
Festphase gebundenem Material aus der Probe umfasst.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Isolieren der Zielmoleküle ein Eluieren der Zielmoleküle von der Festphase umfasst.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluieren ohne Ablösen der Fängermoleküle von der Festphase erfolgt.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die isolierten Zielmoleküle einer Nachfolgereaktion, z.B. einer Sequenzierung und/oder Microarray-Analyse, unterzieht.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die isolierten Zielmoleküle direkt oder indirekt für diagnostische oder therapeutische Zwecke einsetzt.
24. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend mindestens einen Verfahrenszyklus nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Probe einem Vorbehandlungsschritt unterzogen wird, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen eines weiteren Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen Fängermoleküle, die auf jeweils unterschiedlichen
Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind, und
(ii) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch oder über den Träger unter Bedingungen, bei denen störende Komponenten aus einer Probe spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten
Fängermoleküle binden können.
25. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte
(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekül-Matrizen, die markiert und an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
(b) Inkontaktbringen der markierten immobilisierten Fängermoleküle mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die markierten immobilisierten Fängermoleküle binden können,
(c) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material aus der Probe,
(d) Ablösen der Fängermoleküle und daran gebundener Zielmoleküle von dem Träger und (e) Isolieren der Zielmoleküle.
26. Verfahren nach Anspruch 25, umfassend die Merkmale von einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 24.
EP08851271A 2007-11-23 2008-11-24 Flexibles extraktionsverfahren für die herstellung sequenzspezifischer molekülbibliotheken Withdrawn EP2217364A2 (de)

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