EP1945192A2 - Nanoskalige partikel als kontrastmittel für die kernspintomographie - Google Patents
Nanoskalige partikel als kontrastmittel für die kernspintomographieInfo
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- EP1945192A2 EP1945192A2 EP06806318A EP06806318A EP1945192A2 EP 1945192 A2 EP1945192 A2 EP 1945192A2 EP 06806318 A EP06806318 A EP 06806318A EP 06806318 A EP06806318 A EP 06806318A EP 1945192 A2 EP1945192 A2 EP 1945192A2
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Definitions
- the invention relates to nanoscale particles which consist of a core with an inert matrix, one or more covalently bound organic complexing agents in which one or more metal ions are bound with unpaired electrons and optionally one or more biomolecules covalently bound to the surface of the nuclei and a process for their preparation.
- gadolinium Because of its optimal signaling (T1 shortening, strong paramagnetism by 7 unpaired electrons) gadolinium (Gd) is used in MRI (Magnetic Resonance Imaging or Magnetic Resonance Imaging). Due to the 7 unpaired pairs of electrons, the gadolinium induces a strong alternating electromagnetic field, which influences the spin of the neighboring water protons in such a way that their relaxation time is reduced.
- complexing agents with very high complex formation constants are used.
- these complexing agents are DOTA and DTPA.
- Gd-DOTA macrocyclic gadoteric acid
- Gadoteric acid here has a half-life of over a month.
- the exchange of gadolinium for endogenous metal ions such as copper or zinc is well below 1%, while it can be up to 35% in other complexes.
- Gd is literally enclosed by the organic acid DOTA and lies in the center of the chelate molecule as in a cavity, as shown by X-ray crystallographic studies.
- the toxicity of gadolinium is thus virtually completely concealed, while its paramagnetic
- contrast agents in MRI increases the significance of the visualization of organs. Normally, 10 to 15 ml (0.2 ml / kg
- Body weight contrast agent injected intravenously.
- the Gd-containing contrast agent used leads to a shortening of the relaxation time and thus to a stronger signal in the images produced.
- contrast agents based on the transition elements manganese, iron or copper are used.
- Paramagnetic complexes such as gadoteric acid have hydrophilic
- Gd a contrast medium which is particularly suitable for the diagnosis of shifts in the extracellular fluid, as it occurs in tumors, edema, necrosis and ischemia.
- Gd-DOTA The compatibility of Gd-DOTA is very good. For example, two studies involving more than 5,000 patients have shown that the rate of side effects is between 0.84% and 0.97%. Of 4,169 patients in the larger of the two studies (Caille 1991), 8 had nausea and 5 vomiting, giving a total of 0.31% for these side effects. Heat, headache, discomfort, rash, and unpleasant mouthfeel occurred in less than 0.15% of all patients. The systemic osmolality load is also negligible with gadoteric acid. The only organ that shows an increased accumulation of Gd-DOTA is the kidney, which has probably pharmacokinetic reasons. However, CDU studies with creatinine clearance below 60 ml / min showed no negative impact of Gd-DOTA on vital signs or renal function. Gd-DOTA, unlike Gd-DTPA-BMA, has not given rise to any pseudo-hypocalcaemia. The recommendation at
- Renal Insufficiency Monitoring + take all measures to prevent renal insufficiency (hydration, dose restriction, risk / Benefit assessment). For all these reasons, gadoteric acid is approved as an MRI contrast agent not only for adults, but also for children until infancy.
- Nanoscale gadolinium (III) -containing particles have been known for some years and have advantages over individual complexed gadolinium (III) ions, which are significant in use as contrast agents in diagnostics:
- Zeolite GdNaY nanoparticles with very high relaxivity for application as contrast agents in magnetic resonance imaging are Gd 3+ -supported zeolite NaY nanoparticles, where gadolinium is bound only by Coloumb forces, ie not covalently the pore size of the Y zeolite is only 1.3 nm, the free proton exchange with the surrounding tissue is severely hindered.
- WO 00/30688 (Bracco) describes substituted polycarboxylate ligand molecules and corresponding metal complexes such as Gd-DTPA and GD-DOTA derivatives as contrast agents for MRI.
- WO 2004/009134 (Bracco) describes Gd-chelate complexes as MRI contrast agents that are trapped by the cell.
- WO 96/09840 describes a diagnostic agent comprising a particulate material whose particles are a diagnostically effective, essentially water-insoluble crystalline material of a metal oxide (iron oxide) and a polyionic coating agent (eg chitosan, hyaluronic acid, chondroitin).
- a metal oxide iron oxide
- a polyionic coating agent eg chitosan, hyaluronic acid, chondroitin
- Nanoparticles e.g., Gd chelates
- a biocompatible coating e.g., phospholipid-polyethylene glycol
- biomolecules such as nucleic acids, antibodies, etc.
- WO 03/082105 Barnes Jewish Hospital describes Gd-DTPA-PE and Gd-DTPA-BOA chelate complexes surrounded by a lipid / surfactant coating.
- Object of the present invention was to produce new contrast agents that avoid the disadvantages of the aforementioned compounds.
- the present invention thus nanoscale particles consisting of a core with an inert matrix, one or more covalently bonded organic complexing agents in which a metal ion is bound with unpaired electrons and optionally one or more biomolecules covalently bound to the surface of the nuclei.
- nanoscale particles consisting of a core with an inert matrix, optionally one or more, covalently bound to the surface of the nuclei biomolecules and one or more, on the surface of the nuclei via a linker covalently bonded organic complexing agent in which a metal ion is bound with unpaired electrons.
- the core or carrier preferably consists of the inert matrix
- silica Silica, titania, alumina or zirconia. Particularly preferred is silica.
- the monodisperse silica particles are prepared by known processes (see EP 0216278) by the hydrolysis of tetraalkoxysilanes.
- the average particle diameter of the monodisperse particles is 10 to 500 nm, preferably 30 to 300 nm.
- polymers can also be used, for example. Polystyrene latexes are used.
- nanoparticles are suspended in an ethanolic-aqueous solution and a silica ester, for example tetraethyl orthosilicate (TEOS) is added.
- TEOS tetraethyl orthosilicate
- the hydrolysis of the kieselesters is initiated by the addition of aqueous ammonia solution.
- the precipitated silica preferably lies on the nanoparticles in the suspension.
- the layer thickness can be set very accurately.
- ultrafiltration or centrifuging at particle diameters> 50 nm the coated nanoparticles can be separated and purified.
- metal ions are preferably paramagnetic ions from the
- Gadolinium (III) ions are particularly preferably used.
- organic complexing agent compounds from the group of oligo- or polycarboxylates are preferably used.
- Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) or 1, 4,7,10-tetraazacyclodecane-1, 4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) are particularly preferably used.
- the metal chelate complexes are covalently linked to the surface of the support via a linker, preferably via a silane.
- a preferred linker is 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES).
- APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
- Another object of the present invention is a process for producing nanoscale particles comprising the following
- Process steps a) Preparation of nanoparticles, preferably of silicon dioxide, titanium dioxide, aluminum oxide and / or zirconium dioxide by wet-chemical methods b) Coating of the nanoparticles with a monomolecular layer of a halosilane. c) reaction of the nanoparticles with an azide-containing agent into azide-functionalized nanoparticles d) Preparation of one or more organic complexing agents containing one or more amines and one or more
- Polycarboxylic acids Polycarboxylic acids, polycarboxylic acid anhydrides, polycarboxylic acid chlorides or polycarboxylic esters e) Loading of one or more complexing agents with metal ions from the group of the lanthanides f) Reaction of the azide groups functionalized nanoparticles
- halosilane e.g. 3- (chloropropyl) triethoxysilane is used.
- alkynamines it is possible to use all known alkynamines, preference being given to using propargylamine or 6-aminohexine (1).
- This is reacted with a polycarboxylic acid suitable for complexing, a polycarboxylic anhydride, a polycarboxylic acid chloride or else also a polycarboxylic acid ester having a good leaving group.
- the synthesis of a carboxylic acid amide is carried out by known methods.
- the polycarboxylic acids DOTA and DTPA or their derivatives are reacted with a corresponding amine.
- covalent biomolecules such as, for example, enzymes, peptides / proteins, receptor ligands or antibodies can be bound to the nanoparticles.
- nanoparticles may be coated with dextran or polyethylene glycol to increase biocompatibility.
- Another object of the present invention is the use of nanoscale particles as contrast agents for magnetic resonance imaging.
- the particles according to the invention can be used as contrast agents in magnetic resonance tomography, since the superficially arranged metal ions can interact with the surrounding protons, for example from tissue fluid.
- EP0216278 B1 by the hydrolysis of tetraalkoxysilanes in aqueous-alcoholic-ammoniacal medium, wherein initially generates a sol of primary particles and then by a continuous, controlled in accordance with the Abreagierens metered addition of tetraalkoxysilane, the resulting SiO 2 particles to the desired particle size brings.
- the suspension obtained in the third step was treated with 0.486 g of gadolinium (III) chloride anhydrous and stirred for 8 hours at room temperature. Subsequently, the suspension was washed with deionized water with a centrifuge until chloride was no longer detectable in the wash water by means of silver nitrate solution. Thereafter, the reaction product was dried by freeze-drying.
- gadolinium (III) chloride anhydrous
- the dried gadolinium-loaded silica particles were dissolved in dilute hydrofluoric acid and the content of gadolinium determined by ICP-MS. 0.13% gadolinium was found in the sample.
- a sample of the silica particles was again extensively (3x) washed with deionized water and after drying again analyzed by ICP-MS.
- the content of gadolinium was determined to be 0.14%.
- the slightly higher content of gadolinium can be explained by the different degrees of drying or limitations in the measuring method.
- Crucial is that by the multiple washing of the silica particles, the content of gadolinium did not decline. That is, the gadolinium is obviously tightly covalently bound to the surface of the non-porous silica particles. The same result is also obtained in the treatment with 1 N hydrochloric acid.
- the suspension was by means of a centrifuge at 4000 min -1 8 times with
- silica particles functionalized in the second step with APTES were admixed with 25 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) and the propanol-2 was distilled off on a rotary evaporator under reduced pressure.
- DMSO dimethylsulfoxide
- the suspension obtained in the third step was treated with 1, 0 g of gadolinium (III) chloride anhydrous and at 8 hours
- the dried gadolinium-loaded silica particles were dissolved in dilute hydrofluoric acid and the content of gadolinium determined by ICP-MS.
- gadolinium 0.2% gadolinium was found in the sample.
- the higher Gd content compared to the particles produced in Example 1 can be explained by the higher surface area to volume ratio of the smaller particles. Calculated are about 1200 gadolinium ions at the
- the nanoparticles produced in the first step are coated with a monomolecular layer of a halosilane.
- ⁇ O ⁇ l 3- (chloropropyl) - triethoxysilane was added to the reaction mixture from the 1st step and stirred at 8O 0 C for 5h. Subsequently, the particles are centrifuged off and washed neutral with deionized water.
- Reaction control is carried out by thin-layer chromatography.
- the reaction mixture is taken up in 10 ml of dichloromethane, 3 times with 20 ml of 0.1 molar hydrochloric acid and extracted twice with 20 ml of ß saturated aqueous NaHCO 3. Finally, it is extracted by shaking with saturated aqueous sodium chloride solution and dried over anhydrous sodium sulfate.
- the dichloromethane is stripped off and the oily residue is dissolved in 4 ml of tetrahydrofuran / ethanol (1: 1 by volume).
- To the mixture are added 1 ml of water and 0.1 g (4.4 mmol) of lithium hydroxide to cleave the ester protecting groups.
- the hydrolysis mixture is stirred overnight and concentrated to dryness on a rotary evaporator.
- the reaction product is taken up in 10 ml of water and 1 molar
- the azide-functionalized nanoparticle suspension prepared in step 3 was adjusted to neutral pH using TRIS buffer.
- the previously calculated amount of polycarboxylic monoalkynamide (from step 5) was added dropwise to the nanoparticle suspension in the presence of 50 mg of copper (I) chloride.
- the reaction was stopped for 16 hours at room temperature.
- the particles are centrifuged off and washed thoroughly with 0.1 molar hydrochloric acid, finally with demineralized water.
- the gadolinium content of the particles is determined to be 0.3%
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Abstract
Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Partikel als Kontrastmittel für die Kernspintomographie bestehend aus einem Kern mit einer inerten Matrix, einem oder mehreren kovalent gebundenen organischen Komplexbildnern in welchem ein oder mehrere Metallionen mit ungepaarten Elektronen gebunden sind und ggf. einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Nanopartikel.
Description
Nanoskalige Partikel als Kontrastmittel für die Kernspintomographie
Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Partikel, die aus einem Kern mit einer inerten Matrix, einem oder mehreren kovalent gebundenen organischen Komplexbildnern in welchem ein oder mehrere Metallionen mit ungepaarten Elektronen gebunden sind und gegebenenfalls einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen, bestehen sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Wegen seiner optimalen Signalgebung (T1 -Verkürzung, starker Paramagnetismus durch 7 ungepaarte Elektronen) wird Gadolinium (Gd) in der MRT (Magnetresonanztomographie bzw. Kernspintomographie) eingesetzt. Bedingt durch die 7 ungepaarten Elektronenpaare, induziert das Gadolinium ein starkes elektromagnetisches Wechselfeld, das den Spin der benachbarten Wasser-Protonen der Gestalt beeinflusst, dass deren Relaxationszeit reduziert wird.
Intravenös applizierte Lösungen von Gadoliniumsalzen wirken akut toxisch. Von der Toxizität betroffen sind unter anderem die glatte und die quergestreifte Muskulatur, die Funktion der Mitochondrien und die Blutgerinnung. Deshalb wurden Wege gesucht, um die Toxizität dieses Metalls zu reduzieren, ohne seine paramagnetischen Eigenschaften - also die Tendenz, in Magnetfelder hineinzuwandern - zu beeinträchtigen. Der beste Weg zu diesem Ziel, der auch zur kommerziellen Produktion von Gd-haltigen Kontrastmitteln führte, ist die Chelatbildung.
Hierzu werden Komplexbildner mit sehr hohen Komplexbildungskonstanten eingesetzt. Beispiele für diese Komplexbildner sind DOTA und DTPA.
DOTA DTPA
1 ,4,7,10-Tetraazacyclododecan- Diethylentriaminpentaessigsäure
1 ,4,7, 10- tetraessigsäure
Der bisher stabilste kommerzielle Gadolinium-Chelatkomplex ist die makrozyklische Gadotersäure (Gd-DOTA; im Handel beispielsweise als
DOTAREM®, Fa. Guerbet). Die Gefahr der Dissoziation und damit des
Freiwerdens von toxischen Gadolinium-Ionen (LD50 ca. 0.1 mmol kg"1) bei Verwendung von Gadotersäure als MRT-Kontrastmittel ist sehr gering. Im Gegensatz zu anderen Komplexen, deren Freisetzungs-Halbwertszeit- Stabilität im sauren Magensaft (gemessen in 0,1 -molarer HCl Lösung als standardisiertes Modell) im Bereich von Sekunden bis Stunden liegt, hat
Gadotersäure hier eine Halbwertszeit von über einem Monat. Auch der Austausch von Gadolinium gegen endogene Metallionen wie Kupfer oder Zink liegt deutlich unter 1%, während er bei anderen Komplexen bis zu 35% betragen kann.
Gd wird von der organischen Säure DOTA regelrecht umschlossen und liegt wie in einer Höhle im Zentrum des Chelatmoleküls, wie röntgenkristallo- graphische Untersuchungen zeigen. Die Toxizität des Gadoliniums wird somit praktisch vollständig kaschiert, während seine paramagnetischen
Eigenschaften, die es als MRT-Kontrastmittel interessant machen, erhalten bleiben.
Die Verwendung von Kontrastmitteln bei einer MRT erhöht die Aussagekraft der Darstellung von Organen. Im Normalfall werden 10 bis 15 ml (0,2 ml/kg
Körpergewicht) Kontrastmittel intravenös injiziert. Das verwendete Gd- haltige Kontrastmittel führt zu einer Verkürzung der Relaxationszeit und damit zu einem stärkeren Signal in den erzeugten Bildern.
Nur bei speziellen, insbesondere die Leber betreffenden Fragestellungen kommen Kontrastmittel zur Anwendung, die auf den Übergangselementen Mangan, Eisen oder Kupfer basieren.
Paramagnetische Komplexe wie die Gadotersäure haben hydrophile
Eigenschaften und passieren nicht die Blut-Hirn-Schranke. Nach intravenöser Injektion kommt es zu einer raschen vaskulären, gefolgt von einer interstitiellen Verteilung; eine Bevorzugung eines bestimmten Organs ist nicht zu beobachten. Die Komplexe werden innerhalb weniger Stunden unverändert mittels glomerulärer Filtration über die Nieren ausgeschieden. Gadotersäure ist nach drei Stunden zu 75% eliminiert. Die beschriebene Pharmakokinetik macht Gd zu einem Kontrastmittel, das vor allem für die Diagnostik von Verschiebungen der Extrazellulärflüssigkeit geeignet ist, wie sie bei Tumoren, Ödemen, Nekrosen und Ischämien vorkommt.
Die Verträglichkeit von Gd-DOTA ist sehr gut. So haben zwei Studien mit über 5.000 Patienten gezeigt, dass die Rate von Nebenwirkungen zwischen 0,84% und 0,97% liegt. Von 4.169 Patienten in der größeren der beiden Studien (Caille 1991) litten ganze 8 an Übelkeit und 5 an Erbrechen, was eine Rate von insgesamt 0,31% für diese Nebenwirkungen ergibt. Hitze, Kopfschmerzen, Unwohlsein, Hautausschlag und unangenehmer Geschmack im Mund traten bei weniger als 0,15% aller Patienten auf. Auch die systemische Osmolalitätsbelastung ist bei Gadotersäure zu vernachlässigen. Das einzige Organ, in dem eine verstärkte Anreicherung von Gd-DOTA zu verzeichnen ist, ist die Niere, was wohl pharmakokinetische Gründe hat. Verträglichkeitsstudien mit Niereninsuffizienz- Patienten, deren Kreatinin-Clearance unter 60ml/min lag, zeigten jedoch keinerlei negativen Einfluss von Gd-DOTA auf Vitalparameter oder Nierenfunktion. Gd-DOTA hat im Unterschied zu Gd-DTPA-BMA zu keiner Pseudo-Hypokalzämie Anlass gegeben. Die Empfehlung bei
Niereninsuffizienz: Überwachung + alle Maßnahmen zur Verhinderung einer Niereninsuffizienz ergreifen (Hydratation, Dosisbeschränkung, Risiko-
/Nutzenbeurteilung). Aus all diesen Gründen ist Gadotersäure als MRT- Kontrastmittel nicht nur für Erwachsene, sondern auch für Kinder bis ins Kleinkindalter zugelassen.
Nanoskalige Gadolinium (III) enthaltende Partikel sind seit einigen Jahren bekannt und haben gegenüber einzelnen komplexierten Gadolinium (III) Ionen Vorteile, die in der Anwendung als Kontrastmittel in der Diagnostik signifikant sind:
- Die Ansammlung von einer Vielzahl von komplexierten Gadolinium (III) Ionen auf einer Kugeloberfläche, führt zu einem deutlich stärkeren Signal im Kernspintomographen, gegenüber einzelnen Gadolinium-Komplexen. Dadurch ist es möglich entweder die Kontrastmitteldosis zu senken oder aber bei gleicher Dosis ein stärkeres Signal durch das verbesserte Signal/Rausch-Verhältnis zu erhalten.
Aus C. Platas-Iglesias et al., Chem. Eur. J. 2002, 8, No. 22, 5121-5131 „Zeolite GdNaY Nanoparticles with very high relaxivity for application as contrast agents in Magnetic resonance imaging" sind Gd3+ beladene Zeolite NaY Nanopartikel bekannt, wobei Gadolinium nur über Coloumb-Kräfte, also nicht kovalent, gebunden ist. Da hier die Porengröße der Y Zeolite nur 1 ,3 nm beträgt, ist der freie Protonenaustausch mit dem umliegenden Gewebe stark gehindert.
WO 00/30688 (Bracco) beschreibt substituierte Polycarboxylat-Ligand- Moleküle und entsprechende Metallkomplexe wie Gd-DTPA- und GD-DOTA- Derivate als Kontrastmittel für MRT.
WO 2004/009134 (Bracco) beschreibt Gd-Chelat-Komplexe als MRT- Kontrastmittel, die von der Zelle eingeschlossen werden.
WO 96/09840 (Nycomed) beschreibt ein diagnostisches Mittel, umfassend ein teilchenförmiges Material, dessen Teilchen ein diagnostisch wirksames,
im Wesentlichen wasserunlösliches kristallines Material eines Metalloxids (Eisenoxid) und ein polyionisches Überzugsmittel (z.B. Chitosan, Hyaluronsäure, Chondroitin) umfassen.
WO 04/083902 (Georgia Tech Research Corp.) beschreibt magnetische
Nanopartikel (z.B. Gd-Chelate) mit einer biokompatiblem Beschichtung (z.B. Phospholipid-Polyethylenglycol), die Biomoleküle wie Nucleinsäuren, Antikörper etc. tragen können.
WO 03/082105 (Barnes Jewish Hospital) beschreibt Gd-DTPA-PE und Gd - DTPA-BOA-Chelatkomplexe, die von einer Lipid/Tensid-Beschichtung umgeben sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es neue Kontrastmittel herzustellen, die die Nachteile der vorher genannten Verbindungen vermeiden.
Dies konnte nun überraschend durch den Einsatz von hochreinem Siliciumdioxid als Träger der kovalent gebundenen Lanthanid-Komplexe (vorzugsweise Gadolinium-Komplexe) erreicht werden. Die gute
Verträglichkeit von Siliciumdioxid im Körper des Patienten ist ausgezeichnet und damit vielen anderen Materialien aus dem Stand der Technik deutlich überlegen. Beispiele hierzu liefern u.a.: Jain, T.K.; Roy, I. ; Dee, T.K.; Maitra, A.N. J. Am. Chem. Soc.1998, 120,11092-11095, Shimada, M.; Shoji, N. Takahashi, A. Anticancer Res.1995, 15, 109-115 und LaI, M. Levy, L.; Kim, K.S.; He1 G.S. Wang, X.; Min, Y.H.; Pakatchi, S.; Prasad, P.N. Chem. Mater. 2000, 12, 2632-2639.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit nanoskalige Partikel bestehend aus einem Kern mit einer inerten Matrix, einem oder mehreren kovalent gebundenen organischen Komplexbildnern in welchem ein Metallion mit ungepaarten Elektronen gebunden ist und gegebenenfalls
einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nanoskalige Partikel bestehend aus einem Kern mit einer inerten Matrix, gegebenenfalls einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen und einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne über einen Linker kovalent gebundenen organischen Komplexbildner in welchem ein Metallion mit ungepaarten Elektronen gebunden ist. Bevorzugt besteht der Kern bzw. Träger mit der inerten Matrix aus
Siliciumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid oder Zirkoniumdioxid. Besonders bevorzugt ist Siliciumdioxid. Die monodispersen Siliciumdioxid-Partikel werden nach bekannten Verfahren (siehe EP 0216278) durch die Hydrolyse von Tetraalkoxysilanen hergestellt. Der mittlere Partikeldurchmesser der monodispersen Partikel beträgt dabei 10 bis 500 nm, vorzugsweise 30 bis 300 nm. Prinzipiell können aber auch Polymere z.B. Polystyrol-Latices verwendet werden.
Des weiteren ist es möglich andere Nanopartikel in einem ersten Schritt mit einer dünnen Schicht von Siliziumdioxid zu beschichten. Die BeSchichtung ist auf einfache Weise durch den dem Fachmann bekannten SoI-GeI- Prozess möglich. Hierzu werden Nanopartikel in einer ethanolisch-wässrigen Lösung suspendiert und einem Kieselester, z.B. Tetraethylorthosilikat (TEOS) versetzt. Bei ggf. erhöhten Temperaturen wird durch den Zusatz von wässriger Ammoniaklösung die Hydrolyse des Kieselesters eingeleitet. Dabei legt sich das ausgefällte Siliziumdioxid bevorzugt auf die in der Suspension befindlichen Nanopartikel. Durch die Menge an eingesetzten Kieselester kann, bei bekannter Menge und bekanntem mittleren Durchmesser der zu beschichtenden Nanopartikel, die Schichtstärke sehr genau eingestellt werden.
Durch Ultrafiltration oder Abzentrifugieren bei Partikeldurchmessern > ca. 50 nm, können die beschichteten Nanopartikel abgetrennt und aufgereinigt werden.
Als Metallionen werden vorzugsweise paramagnetische Ionen aus der
Gruppe der Lanthanide eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Gadolinium (lll)-lonen eingesetzt.
Als organischer Komplexbildner werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Oligo- oder Polycarboxylate eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder 1 ,4,7,10- Tetraazacyclodecan-1 ,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) verwendet.
Die Metall-Chelat-Komplexe sind über einen Linker, vorzugsweise über ein Silan, kovalent mit der Oberfläche des Trägers verbunden. Ein bevorzugter Linker ist 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES). Besonders vorteilhaft ist es die Metall-Chelat-Komplexe über die kupferkatalysierte dipolare 1 ,3-Cycloaddition von Aziden an Alkine, die sogenannte Huisgen-Reaktion, durchzuführen. Diese dem Fachmann bekannte Reaktion, führt unter sehr milden Bedingungen, mit ausgezeichneten Ausbeuten zu stabilen 1 ,2,3-Triazolen und ermöglicht auf einfach Weise den Aufbau auch sehr komplexer Moleküle. In jüngster Zeit erfährt diese Reaktion deshalb unter dem Begriff „Klick-Chemie" wieder verstärktes Interesse, was sich in einer Vielzahl von Publikationen niederschlägt (siehe Bräse et al, Angew. Chem. 2005, 117, 5336; KoIb, Finn und Sharpless, Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions, Angew. Chem. Int. Ed. 2001 , 40, 2004-2021)
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die o.g. Huisgen-Reaktion auch vorteilhaft für die Funktionalisierung der Oberfläche von Nanopartikeln verwendet werden kann. Das bedeutet, dass die „Klick-Chemie" auch bei
heterogenen Festphasenreaktionen an nanoskaligen Partikeln eingesetzt werden kann.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nanoskaligen Partikel umfassend die folgenden
Verfahrensschritte: a) Herstellen von Nanopartikeln vorzugsweise aus Siliciumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid und/oder Zirkoniumdioxid nach nasschemischen Methoden b) Belegung der Nanopartikel mit einer monomolekularen Schicht eines Halogensilans. c) Umsetzung der Nanopartikel mit einem Azid-haltigen Agens zu Azid-Gruppen funktionalisierten Nanopartikeln d) Herstellen eines oder mehrerer organischer Komplexbildner enthaltend ein oder mehrere Amine und eine oder mehrere
Polycarbonsäuren, Polycarbonsäureanhydride, Polycarbonsäurechloride oder Polycarbonsäureester e) Beladung eines oder mehrer Komplexbildner mit Metallionen aus der Gruppe der Lanthanide f) Umsetzung der Azid-Gruppen funktionalisierten Nanopartikel aus
Schritt c) mit dem oder den Metallionen-beladenen organischen Komplexbildner aus Schritt e)
Bevorzugt ist es, wenn als Halogensilan z.B. 3-(Chlorpropyl)-triethoxysilan eingesetzt wird.
Als Alkinamine können alle bekannten Alkinamine eingesetzt werden, wobei bevorzugt Propargylamin oder 6-Aminohexin-(1) eingesetzt werden. Dieses wird mit einer zur Komplexbildung geeigneten Polycarbonsäure, einem Polycarbonsäureanhydrid, einem Polycarbonsäurechlorid oder auber auch einem Polycarbonsäureester mit guter Abgangsgruppe umgesetzt. Die Synthese eines Carbonsäureamids erfolgt nach bekannten Verfahren.
Vorzugsweise werden als Polycarbonsäuren DOTA und DTPA bzw. deren Derivate (z.B. als Li-Salze) mit einem entsprechenden Amin umgesetz.. Es wird bei der Reaktion darauf geachtet, dass nur eine Carbonsäurefunktion der Polycarbonsäure mit dem Amin in Reaktion tritt (1 :1 Ansatz). Die Umsetzung von beispielweise DTPA-Dianhydrid mit Propargylamin erfolgt nach der bekannten Schotten-Baumann-Methode.
An die Nanopartikel können zusätzlich kovalent Biomoleküle, wie beispielsweise Enzyme, Peptide/Proteine, Rezeptorliganden oder Anti- körper, gebunden sein. Durch ihre spezifische Kopplung an das Zielgewebe im Körper des Patienten, wird die Bildgebung und die daraus folgende Diagnostik erleichtert.
Ferner können die Nanopartikel mit Dextran oder Polyethylenglykol beschichtet sein um die Biokompatibilität zu erhöhen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der nanoskaligen Partikel als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. Die erfindungsgemäßen Partikel sind als Kontrastmittel in der Kernspintomographie anwendbar, da die oberflächlich angeordneten Metallionen mit den umgebenen Protonen, beispielsweise aus Gewebeflüssigkeit, in Wechselwirkung treten können.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1:
Herstellung monodisperser Siliciumdioxid-Partikel mit einem mittleren
Teilchendurchmesser von 250 nm mit oberflächlich gebundenem Gd (III)
1.1 Herstellung monodisperer Siliciumdioxid-Partikel Die Herstellung der monodispersen Siliciumdioxid-Partikel erfolgt wie in
EP0216278 B1 beschrieben, durch die Hydrolyse von Tetraalkoxysilanen in wässrig-alkoholisch-ammoniakalischem Medium, wobei man zunächst ein SoI von Primärteilchen erzeugt und anschließend durch ein kontinuierliches, nach Maßgabe des Abreagierens kontrolliertes Zu- dosieren von Tetraalkoxysilan die erhaltenen SiO2-Partikel auf die gewünschte Teilchengröße bringt.
1.2 Funktionalisierunq mit 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)
10 g der im ersten Schritt hergestellten Siliciumdioxid-Partikel wurden in 20 ml Propanol-2 suspendiert. Anschließend wurden 0,25 ml APTES1 verdünnt mit 5 ml Propanol-2 zugetropft und für 2 Stunden bei 80 0C am Rückflusskühler gerührt. Die Suspension wurde mit Hilfe einer Zentrifuge bei 4000 min'1 8 mal mit
Propanol-2 gewaschen, bis in der Waschlösung kein APTES - mittels einer Tüpfelprobe mit Ninhydrin - mehr nachzuweisen war.
1.3 Amidbildunq mit Diethylentriaminpentaessiqsäure (DTPA) Die im zweiten Schritt mit APTES funktionalisierten Siliciumdioxid-
Partikel wurden mit 25 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt und das Propanol-2 an einem Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.
Anschließend wurde die Suspension mit 0,58 g Diethylentriaminpentaessigsäure-dianhydrid (DTPA-ca) versetzt und 2 Stunden bei 1500C gerührt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsprodukt auf 200 ml 0,1 N TRIS-Puffer (pH 7,0) gegossen und in einer Zentrifuge mehrmals mit deionisiertem Wasser gewaschen.
1.4 Beladung mit Gadolinium (IM) Ionen
Die im 3. Schritt erhaltene Suspension wurde mit 0,486 g Gadolinium- (lll)chlorid wasserfrei versetzt und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension mit einer Zentrifuge so lange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis im Waschwasser kein Chlorid mehr mittels Silbernitratlösung nachweisbar war. Danach wurde das Reaktionsprodukt per Gefriertrocknung getrocknet.
Charakterisierung:
Die getrockneten, mit Gadolinium beladenen Siliciumdioxid Partikel, wurden in verdünnter Flusssäure aufgelöst und per ICP-MS der Gehalt an Gadolinium bestimmt. Es wurden 0,13 % Gadolinium in der Probe gefunden. Eine Probe der Siliciumdioxid Partikel wurde nochmals intensiv (3x) mit deionisiertem Wasser gewaschen und nach der Trocknung erneut per ICP-MS analysiert. Der Gehalt an Gadolinium wurde zu 0,14 % bestimmt. Der geringfügig höhere Gehalt an Gadolinium ist durch die unterschiedliche Trocknungsgrade bzw. Limitierungen in der Messmethode zu erklären. Entscheidend ist jedoch, dass durch das mehrfache Waschen der Siliciumdioxid Partikel, der Gehalt an Gadolinium nicht zurückging. D.h. das Gadolinium ist ganz offensichtlich fest kovalent an der Oberfläche der unporösen Siliciumdioxid Partikel gebunden. Das gleiche Ergebnis wird auch bei der Behandlung mit 1 N Salzsäure erhalten.
Beispiel 2
Herstellung monodisperser Siliciumdioxid-Partikel mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 90 nm mit oberflächlich gebundenem Gd (III)
2.1 Herstellung der Partikel
Wie in Beispiel 4 von EP0216278 B1 beschrieben
2.2 Funktionalisierunq der Partikel
10 g der im ersten Schritt hergestellten Siliciumdioxid-Partikel wurden in 20 ml Propanol-2 suspendiert. Anschließend wurden 0,50 ml APTES, verdünnt mit 5 ml Propanol-2 zugetropft und für 2 Stunden bei 80 0C am
Rückflusskühler gerührt.
Die Suspension wurde mit Hilfe einer Zentrifuge bei 4000 min'1 8 mal mit
Propanol-2 gewaschen, bis in der Waschlösung kein APTES - mittels einer Tüpfelprobe mit Ninhydrin - mehr nachzuweisen war.
2.3 Amidbildunq mit Diethylentriaminpentaessiqsäure (DTPA)
Die im zweiten Schritt mit APTES funktionalisierten Siliciumdioxid- Partikel wurden mit 25 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt und das Propanol-2 an einem Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.
Anschließend wurde die Suspension mit 1 ,0 g Diethylentriaminpentaessigsäure-dianhydrid (DTPA-ca) versetzt und 2 Stunden bei 1500C gerührt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsprodukt auf 200 ml 0,1 N TRIS-Puffer (pH 7,0) gegossen und in einer Zentrifuge mehrmals mit deionisiertem Wasser gewaschen.
2.4 Beladung mit Gadolinium (III) Ionen
Die im 3. Schritt erhaltene Suspension wurde mit 1 ,0 g Gadolinium(lll)chlorid wasserfrei versetzt und 8 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension mit einer Zentrifuge so lange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis im
Waschwasser kein Chlorid mehr mittels Silbernitratlösung nachweisbar war. Danach wurde das Reaktionsprodukt per Gefriertrocknung getrocknet.
Charakterisierung
Die getrockneten, mit Gadolinium beladenen Siliciumdioxid Partikel, wurden in verdünnter Flusssäure aufgelöst und per ICP-MS der Gehalt an Gadolinium bestimmt.
Es wurde 0,2 % Gadolinium in der Probe gefunden. Der höhere Gd- Gehalt, gegenüber den im Beispiel 1 erzeugten Partikel, lässt sich durch das höhere Oberflächen zu Volumen-Verhältnis der kleineren Partikel erklären. Rechnerisch befinden sich ca. 1200 Gadolinium-Ionen an der
Oberfläche eines der 90 nm Partikel.
Beispiel 3
Herstellung monodisperser Siliciumdioxid-Partikel mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 250 nm mit oberflächlich gebundenem Gd(III)
3.1 Herstellung der Siliciumdioxid Nanopartikel In ein Gemisch aus 41,5 ml vollentsalztem Wasser und 111 ml Ethanol werden bei Raumtemperatur 16,7 ml Tetraethylorthosilikat gegeben und durch Rühren eine homogene Lösung erzielt. Anschließend werden 26 ml 25 Gew. % Ammoniak-Lösung zu der Vorlage gegeben, noch 15 Sek. intensiv gerührt und danach 1 h stehen gelassen. Ca. 1 Min. nach Zugabe der Ammoniak-Lösung kann durch Eintrübung der Lösung die fortschreitende Kondensation zu Siliciumdioxid-Nanopartikeln beobachtet werden. Das Reaktionsgemisch wird nicht aufgearbeitet, sondern direkt dem nächsten Reaktionsschritt zugeführt.
3.2 Umsetzung mit einem Halogensilan
Die im ersten Schritt hergestellten Nanopartikel werden mit einer monomolekularen Schicht eines Halogensilans belegt. Dazu werden zu
dem Reaktionsgemisch aus dem 1. Schritt δOμl 3-(Chlorpropyl)- triethoxysilan zugegeben und 5h bei 8O0C gerührt. Anschließend werden die Partikel abzentrifugiert und mit entsalztem Wasser neutral gewaschen.
3.3 Herstellung des oberflächlich gebundenen Azides Die in Schritt 2 hergestellten und gewaschenen Nanopartikel werden in 50ml vollentsalztem Wasser suspendiert und mit 66 mg Natriumazid versetzt und für 24 h bei 500C gerührt. Per nukleophiler Substitution wird das Halogen Chlor durch das Pseudohalogen-Azid ersetzt. Die azid- haltigen Nanopartikel werden in der Zentrifuge von den Edukten abgetrennt, mit vollentsalztem Wasser gewaschen und als wässrige Suspension gelagert.
3.4 Herstellung des Alkins (Polycarbonsäuremonoalkinamid) durch
Umsetzung von DTPA-Dianhydrid mit Propargylamin (Schotten- Baumann-Methode)
0,62 g (1 mmol) Diethylentriamin-1 ,7-tetrakis(f-butylacetat)-4-essigsäure der Artikel B-365 der Firma Macrocyclics werden mit 0,19 g (1mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- hydrochlorid (EDC) der Firma Aldrich und 0,15 g (1 ,5 mmol) Triethyl-amin der Firma Merck und 2 ml Dimethylformamid (Merck) versetzt. Nach 10 min intensiven Rührens bei Raumtemperatur werden 0,06 g (1 mmol) Propargylamin zur Vorlage gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 8 h bei Raumtemperatur weitergerührt. Die
Reaktionskontrolle erfolgt per Dünnschichtchromatographie. Das Reaktionsgemisch wird in 10ml Dichlormethan aufgenommen, 3 mal mit 20 ml 0,1 molarer Salzsäure und 3 mal mit 20 ml gesättigter wässriger NaHCOß ausgeschüttelt. Abschließend wird mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung ausgeschüttelt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. An einem Rotationsverdampfer wird das Dichlormethan abgezogen und der ölige Rückstand wird in 4 ml Tetrahydrofuran/Ethanol
(1 :1 nach Volumen) aufgenommen. Zu dem Gemisch werden 1ml Wasser und 0,1 g (4,4 mmol) Lithiumhydroxid gegeben um die Esterschutzgruppen abzuspalten. Das Hydrolysegemisch wird über Nacht gerührt und am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Reaktionsprodukt wird in 10 ml Wasser aufgenommen und mit 1 molarer
Salzsäure auf pH 7 eingestellt.
3.5 Beladung des Komplexbildners mit Gadolinium-(lll)-lonen
Die in Schritt 4 hergestellte Lösung des Lithiumsalzes von Diethylen- triaminpentaessigsäure-4-propargylamid wird mit 10 ml 0,1 molarer
Gadolinium(lll)chlorid-Lösung (=1 mmol) versetzt und für 30 Minuten gerührt.
3.6 Herstellung von mit Komplexbildner-Molekülen modifizierten Nanopartikel (Huisgen-Reaktion)
Die in Schritt 3 hergestellte und mit Azid-Gruppen funktionalisierte Nanopartikel-Suspension wurde mittels TRIS-Puffer auf einen neutralen pH-Wert eingestellt. Die zuvor berechnete Menge an Polycarbonsäuremonoalkinamid (aus Schritt 5) wurd in Gegenwart von 50 mg Kupfer (I) Chlorid zu der Nanopartikel-Suspension getropft. Nach
16 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion beendet. Die Partikel werden abzentrifugiert und 3 x mit 0,1 molarer Salzsäure, abschließend mit vollentsalztem Wasser intensiv gewaschen.
Mittels ICP-MS wird der Gadolinium-Gehalt der Partikel zu 0,3% bestimmt Bestimmung
Claims
1. Nanoskalige Partikel bestehend aus:
- einem Kern mit einer inerten Matrix
- einem oder mehreren kovalent gebundenen organischen Komplexbildnern in welchem ein oder mehrere Metallionen mit ungepaarten Elektronen gebunden sind und - gegebenenfalls einem oder mehreren, an der Oberfläche der
Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen.
2. Nanoskalige Partikel bestehend aus:
- einem Kern mit einer inerten Matrix - gegebenenfalls einem oder mehreren, an der Oberfläche der
Kerne kovalent gebundenen Biomolekülen und
- einem oder mehreren, an der Oberfläche der Kerne über einen Linker kovalent gebundenen organischen Komplexbildner in welchem ein Metallion mit ungepaarten Elektronen gebunden ist.
3. Nanoskalige Partikel nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern aus Siliciumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid und/oder Zirkoniumdioxid besteht.
4. Nanoskalige Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern aus Siliciumdioxid besteht.
5. Nanoskalige Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen mittleren Partikeldurchmesser von 10 bis 500 nm, vorzugsweise von 30 bis 300 nm, besitzen und monodispers sind.
6. Nanoskalige Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Metallion aus der Gruppe der Lanthanide gewählt wird.
7. Nanoskalige Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Metallion ein Gadolinium-(lll)-ion ist.
8. Nanoskalige Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Komplexbildner aus der Gruppe der Oligo- oder Polycarboxylate gewählt wird.
9. Nanoskalige Partikel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Komplexbildner Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder 1 ,4,7,10-Tetraaza-cyclododecan-1 ,4,7, 10-tetraessigsäure (DOTA) ist.
10. Nanoskalige Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als kovalent gebundene Biomoleküle Enzyme, Peptide/Proteine, Rezeptorliganden oder Antikörper eingesetzt werden.
11. Nanoskalige Partikel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Linker ein Silan eingesetzt wird.
12. Nanoskalige Partikel nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass als Linker 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) eingesetzt wird.
13. Verfahren zur Herstellung nanoskaliger Partikel mit folgenden Verfahrensschritten: a) Herstellen von Nanopartikeln vorzugsweise aus Siliciumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid und/oder Zirkoniumdioxid nach nasschemischen Methoden b) Belegung der Nanopartikel mit einer monomolekularen Schicht eines Halogensilans. c) Umsetzung der Nanopartikel mit einem Azid-haltigen Agens zu Azid- Gruppen funktionalisierten Nanopartikeln d) Herstellen eines oder mehrer organischer Komplexbildner enthaltend ein oder mehrere Amine und eine oder mehrere Polycarbonsäuren, Polycarbonsäureanhydride, Polycarbonsäurechloride oder Polycarbonsäureester e) Beladung eines oder mehrerer Komplexbildner mit Metallionen aus der Gruppe der Lanthanide f) Umsetzung der Azid-Gruppen funktionalisierten Nanopartikel aus Schritt c) mit dem oder den Metallionen-beladenen organischen Komplexbildnern aus Schritt e)
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt d) ein Polycarbonsäuremonoalkinamid aus organischen Komplexbildnern wie 1 ,4,7, 10-Tetraazacyclododecan-1 ,4,7, 10-tetraessigsäure (DOTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder deren Derivate und einem entsprechenden Alkin-Amin hergestellt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 und/oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt d) als Alkin-Amin Propargylamin oder 6-Aminohexin-(1) eingesetzt werden.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt e) als Metallionen Gadolinium (lll)-lonen eingesetzt werden.
17. Verwendung der nanoskaligen Partikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 als Kontrastmittel für die Kernspintomographie.
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