EP1616619A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Bereitstellen einer Hybridisierkammer und zum Beeinflussen von Luftblasen in derselben - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a device according to the preamble of independent claim 1 and to a corresponding process unit according to claim 15 and to an automatic system according to the preamble of claim 17 for the hybridization of nucleic acid samples, proteins and tissue sections.
- the present invention also relates to a corresponding method.
- DNA deoxyribose nucleic acid
- microarrays of such samples provides research with an important technique for the simultaneous analysis of thousands of genes.
- This technique involves the immobilization of DNA samples from many genes on a solid substrate surface, such as on a glass slide for a light microscope.
- the DNA samples are preferably arranged in an array of sample spots or "spots", ie in a two-dimensional grid on the substrate, and it is possible later on - starting from a specific one Position within such an array back to the origin of the corresponding DNA sample.
- RNA patterns are often provided with a so-called “tag” or “label”, ie a molecule which, for example, emits a fluorescent light having a specific wavelength.
- Immobilized samples may also include amino acid-containing (eg, proteins, peptides) or nucleic acid-containing (eg, cDNA, RNA) samples. Samples added to the immobilized samples may comprise any molecules or chemical compounds that hybridize or otherwise associate with the immobilized samples.
- RNA patterns hybridize or bind to immobilized DNA samples and together form hybrid DNA-RNA strands.
- differences in the hybridization among the DNA samples can be determined by measuring the intensity and wavelength dependency of the fluorescence of each individual microarray element to determine whether the level of gene expression in the DNA sample varies the examined DNA samples.
- DNA microarrays have established themselves as successful tools and devices for carrying out DNA hybridization have been continuously improved (cf., for example, US Pat. No. 6,238,910 or US 2003/0013184 A1 or EP 1 260 265 A1 of the present applicant).
- These documents disclose a device for providing a hybridization space for the hybridization of nucleic acid samples on a slide, which is designed to be movable relative to this slide and an annular seal for closing the Hybridisierraums by applying a surface of this slide comprises.
- the disclosed apparatus includes conduits for feeding media into and out of the media Hybridization in or out of the Hybridisierraum out and a sample feed.
- the object of the present invention according to a first aspect relates to the provision of an alternative device and according to a second aspect the provision of a method with which or with which air bubbles in a hybridization chamber can be influenced in a simple manner.
- This object according to the first aspect is achieved with the combination of features of independent claim 1 and is characterized in that the device delimits a slit-shaped hybridization space which on a surface of the device and / or the slide directed towards the interior of this hybridization space has relief structures for conducting and / or or blocking air bubbles.
- This object according to the second aspect is achieved by moving and / or trapping air bubbles according to the features of independent claim 19 within the hybridization chamber.
- the present invention is based on the consideration that on the one hand gas molecules of the ambient air can diffuse into the hybridization chamber and thus air bubbles are formed. On the other hand, for example, as a result of changes the solubility of gases, spontaneously form gas bubbles in Hybridisiermedium. In the context of this invention, therefore, all gas bubbles in the hybridization medium - regardless of the formation process in the hybridization chamber - are referred to as "air bubbles".
- FIG. 1 shows a vertical longitudinal section, corresponding to FIG. 7 of US 2003/0013184 A1 or EP 1 260 265 A1 of the present applicant, through a device 1 for the hybridization of nucleic acid samples, proteins and tissue sections.
- This device 1 is movable like a cover in relation to a slide 3 (in this case pivotable about an axis 34, so that the hybridization space 2 can be opened by a simple movement (compare Fig. 1A) and closed (see Fig. 1B).
- An annular seal or sealing surface 4 is used to close the Hybridisierraums 2 by applying a surface 5 of this slide 3.
- This sealing surface 4 may be a stepped surface or step 104 of the lid or the device 1, which is flat on the surface 5 of the slide 3 Alternatively, for example, a lip seal may also be used, but preference is given to an O-ring seal 103 as a sealing surface 4.
- the arrangement comprises lines 6, 6 'for feeding or discharging media into or out of the hybridization space 2 the hybridization space 2.
- Such media may contain reagents for carrying out the hybridization reaction, such as wash liquors or buffer solutions, but also inert gases (such as e.g. Nitrogen) for drying the hybridization products on the slides 3 or for blowing out the Hybridisierhuntn 2 and the media lines 6,6 'be.
- the assembly also includes a sealable pattern feeder 7 through which RNA-containing liquids or other sample liquids can be pipetted by hand.
- the pattern feeder 7 is preferably closed with a plastic plug (not shown).
- an automatic or robotized pattern feeder can be provided, as disclosed in different embodiments in US 2003/0013184 Al or EP 1 260 265 A1 of the present applicant, to which reference is expressly made.
- the devices 1 are arranged parallel to each other and in a group of four, because this arrangement just allows a measure of a temperature control plate 20, on which a frame 21 in the size of a microplate with four parallel to each other arranged slides 3 fits.
- Each of these groups of four is associated with a temperature control plate 20 connected to a temperature controller.
- a temperature control plate 20 is designed for the areal reception of a frame 21 carrying four slides 3. Because the slides 3 are held softly in the frame 21 and because the temperature control plate 20 is formed so that the frame can be slightly lowered towards it, the slides 3 lie directly on the surface of the temperature control plate 20.
- Each group of four of a processing unit 18 comprises one an axle 34 pivotable and relative to a base plate 35 lockable bracket 36 with four seats 37, wherein in each of these seats 37, a device 1 is inserted.
- Each processing unit 18 also includes a terminal plate 22 for sealingly connecting the unit lines 23, 23 ', 23 "of the system 38 to the lines 6, 6', 6" of the devices 1. O-rings are preferred as seals for these connections (not shown) ).
- the arrangement preferably comprises a media-separating agitation device 8 for moving liquids against nucleic acid- or amino acid-containing samples or tissue sections immobilized on the surface 5 of the slides 3.
- the agitation device 8 of the arrangement comprises a membrane 9. This membrane 9 separates a pressure chamber 10, which is designed to be filled with a pressure fluid (gas or liquid) via a pressure line 6 ", from an agitation space 11 which passes over an agitation conduit 12 is connected to the hybridization space 2.
- RNA sample liquid and sealing the pattern feed 7 air or other gas is preferably delivered via the pressure conduit 6 "(but it could also be a liquid) brought into the pressure chamber 10 in blocks (Überduckversion) or sucked from it (vacuum version), so that the membrane 9 bends in the same rhythm and correspondingly reduces or increases the agitation space 11.
- the sample liquid is moved in the same rhythm of overpressure or underpressure and relaxation in Hybridisierraum 2 against one or the other end, preferably located on the directed against the interior of the Hybridisierraums 2 surface 14 of the lid or the device 1 each one Querströmkanal 15,15 'is located.
- these transverse flow channels 15, 15 ' facilitate the transverse distribution of RNA molecules contained in the sample solution. This has the effect that the sample liquid or the washing liquids are distributed homogeneously over the entire volume present in the hybridization chamber 2.
- the cross-flow channels 15, 15 ' also serve as a liquid reservoir, so that the oscillating motion of the model solution generated by the agitation device 8 built into the device does not cause parts of the hybridization chamber 2 to be unintentionally dry.
- a second agitation space 11 ' is connected to the hybridization space 2 via a second agitation conduit 12 '. If a pressure surge delivered to the pressure chamber 10 now presses the first diaphragm 9 into the first agitation space 11, this pulse is transmitted via the first agitation conduit 12 to the sample fluid in the hybridization space 2.
- the pattern liquid differs somewhat from the second agitation conduit 12 '(and may even partially fill it) and increases the pressure in the second agitation space 11'.
- the second membrane 9 ' bends upwards and is elastically stretched.
- a sample liquid having a minimum volume in the range of approximately 100 ⁇ l
- a negative pressure in the pressure chamber 10 is generated, so that the backward movement of the sample liquid in the hybridization space 2, which is opposite to the preceding pressure surge, is enhanced.
- FIG. 1A illustrates an open holder 36
- FIG. 1B shows a vertical section through a processing unit 18 for hybridizing nucleic acid samples, proteins or tissue slices with closed holder 36. All four hybridization spaces 2 of these groups of four are associated with a temperature control plate 20 connected to a temperature controller. To ensure that the devices 1 are placed plane-parallel to the slides 3
- the holder 36 also has a central joint (not shown) with a mobility parallel to the axis 34.
- an additional pressure is exerted on the devices 1 via the holder 36; this can be accomplished via screws, rocker arms or similar known devices (not shown).
- Each processing unit 18 also includes a terminal plate 22 for sealingly connecting the unit conduits 23, 23 ', 23 "to the conduits 6, 6', 6" of the devices 1. As seals for these compounds, O-rings are preferred (not shown).
- Figures 2 and 3 show schematic views of the closed arrangement of Figure 1B, seen from below.
- the gap-shaped hybridization chamber 2 between a device 1 and a slide 3, on which this device 1 is placed defined in its volume.
- the O-ring seal 103 laterally delimits the hybridization space 2, which preferably has a respective transverse flow channel 15, 15 'at its opposite ends, which are provided as a depression in the surface 14 of the cover or device 1.
- the slide 3 here a glass slide for light microscopy
- its optional handle and / or barcode field 33 are shown in dashed lines.
- Clearly visible is also a Abdrückfeder 17, which presses on the handle panel 33 of the slide 3. It can also be provided several Abdschreibfedern (not shown).
- 1 centering springs may be arranged (preferably not shown) on the side edges of the device, with which slides with special formats are centered on the device 1, so that maximum utilization of the slide surface is ensured.
- this Abdgurfeder 17 facilitates the automatic separation of the slide 3 from the lid or of the device 1. Also visible are the openings of the inlet conduit 6 and the outlet conduit 6 'and the pattern supply 7, in one of the two Querströmkanäle 15, 15 'lead.
- FIG. 2A shows a device 1 with an arrangement of relief structures 101 for blocking air bubbles 102 according to a first variant.
- These relief structures 101 are formed here as depressions 105 and arranged in boundary regions 106 of the hybridization space 2 along at least part of the sealing surface 4. As shown, no lines 6,6 ', 7 open into these recesses 105.
- a plurality of depressions are arranged in a row to the left and right of the hybridization chamber 2, these rows extending over the entire boundary region 106 between the two terminal transverse flow channels 15 , 15 'extend.
- the depressions 105 are in the immediate vicinity of the O-ring 103, they are all the same length and interrupted by narrow webs 107, so that the air bubbles 102 are trapped in the respective recess 105 and do not connect to the slide 3 and thus a hybridization prevent or obstruct the underlying samples. In addition, air bubbles 102 trapped in the depressions 105 can not spread over the hybridization space 2.
- FIG. 2B shows an arrangement of relief structures 101 for blocking air bubbles 102 according to a second and third variant.
- the recesses 105 are in the immediate vicinity of the O-ring 103, they are all the same length and interrupted by narrow webs 107, so that the air bubbles 102 are trapped in the respective recess 105.
- the second variant left only a few, long recesses 105 are provided; it could also be arranged only a single recess on each side of the hybridization chamber 2 (not shown), it is important that a web 107 these wells 105 from the Querströmkanälen 15,15 'separates.
- the third variant (right), a large number of short (for example round) depressions 105 are provided. These have the advantage that many individual compartments for blocking air bubbles 102 are created.
- FIG. 2C shows an arrangement of relief structures 101 for blocking air bubbles 102 according to a fourth and fifth variant.
- the recesses 105 are in the immediate vicinity of the O-ring 103, they have a different length and are interrupted by narrow webs 107, so that the air bubbles 102 are trapped in the respective recess 105.
- the fourth variant left
- only a few, long depressions 105 are provided, between which short (eg round) depressions can be arranged.
- the fifth variant (right) several recesses 105 are provided with increasing length.
- the arrangements shown here have the advantage that compartments to block air bubbles 102 which are individually distributed according to certain process parameters or chamber characteristics. For example, it is thus possible to provide recesses which are arranged correspondingly to the gradient occurring in the experience (in the hybridization medium and / or in the appearance of the air bubbles).
- relief structures 101 formed as depressions 105 are particularly suitable for blocking air bubbles 102 produced by diffusion through the O-ring 103, namely in the immediate vicinity of their point of origin.
- the variation in the width and / or depth of such depressions 105 is also within the scope of the present invention.
- catch channels for air bubbles along the lateral O-rings.
- Such collecting channels are then formed as a single depression, which is only separated by a thin web of the two Querströmkanälen 15,15 '.
- the recesses 105 according to the invention can also be used in hybridization chambers 2, which does not comprise an agitation device.
- FIG. 3A shows an arrangement of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a first variant.
- the relief structures 101 are here designed as elevations 108 for conducting air bubbles 102 and distributed substantially over the entire hybridization space 2.
- the elevations 108 are arranged regularly and in an entangled, orthogonal grid 109.
- an entangled, orthogonal grid 109 which is arranged rotated by 45 ° to a flow axis 110. Deviations from the orthogonal arrangement are possible, so that by a smaller angle to the direction of flow than 45 ° (steeper arrangement) the detachment is facilitated.
- steereper arrangement steereper arrangement
- a greater distance is achieved when pushing away.
- FIG. 3B shows an arrangement of relief structures 101 for conducting and blocking air bubbles 102.
- the blocking relief structures 101 are in the form of depressions 105 is formed and arranged in boundary regions 106 of the hybridization space 2 along at least part of the O-ring 103 (see FIG.
- the conductive relief structures 101 are formed as elevations 108 for conducting air bubbles 102 and distributed substantially over the entire hybridization space 2 (see Fig. 3A).
- the combination of blocking and conductive relief structures 101 also makes it possible to combine the already described positive effects of these relief structures.
- the arrangement and the size of all relief structures 101 used for influencing air bubbles 102 are preferably adapted to one another.
- the volume of the hybridization chamber preferably about 60 .mu.l
- the stroke of the agitation device preferably about 5 .mu.l
- the length of the hybridization chamber preferably about 50 mm
- the pendulum path of the hybridization chamber resulting from the agitation Hybridization media over the immobilized samples preferably about 5 mm.
- the frequency of Agitationszyklen is adjustable. This means that different periods of agitation are alternated with different long times without agitation. However, the agitation times are preferably chosen so long that results in a large number of agitation movements per minute and thus a multiple mixing of the chamber volume. Mixing tests with dyes have shown that after just a few minutes a virtually 100% thorough mixing takes place.
- Figure 3C shows an alternative arrangement of relief structures for guiding and blocking air bubbles.
- the blocking relief structures 101 are formed as smaller depressions 105 (see FIG. 3B).
- the conductive relief structures 101 are formed as finer and more closely spaced raised bumps 108 for directing air bubbles 102 (see Fig. 3B).
- FIG. 4 shows vertical partial sections through an arrangement according to FIG. 1B with the device 1 folded down or the hybridization chamber 2 closed. Arrows indicate the direction of flow of the sample fluid relative to the samples immobilized on the slide 3. This movement of the sample liquid, in interaction with the relief structures 101 shown, causes the air bubbles 102 to be displaced away from the actual flow direction or flow axis 110.
- FIG. 4A shows an embodiment of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a first variant.
- This relief structure is formed as a recess 105, which has a flat and a steep edge.
- the flanks of the depression 105 each form a line of intersection with the surface 14 of the device 1.
- these intersecting lines run parallel to one another (compare FIG. 5).
- FIG. 5 shows an embodiment of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a first variant.
- This relief structure is formed as a recess 105, which has a flat and a steep edge.
- the flanks of the depression 105 each form a line of intersection with the surface 14 of the device 1.
- FIG. 5 With increasing height difference and constant slope of the depression 105 diverge these intersections; For example, a fish scale-like relief on the surface 14 of the device 1 can be generated.
- the inclination angle of the steep flank and the angle between the flow axis 110 and the intersection between the steep flank and the surface 14 of the device 1 together determine the influence on an air bubble 102 which is flushed against this steep flank.
- these two angles are selected such that the flow resistance of the air bubble 102 is greater in relation to the steep flank in the direction of the flow axis 110 than in the direction of the relief structure 101.
- the air bubble 102 is forced away from the general direction of flow.
- This displacement is additionally supported by the, in the same direction deflected, local microflow caused by the relief structure 101.
- These microcurrents occur at all relief structures 101 arranged at an angle to the flow axis 110 and additionally support a more effective mixing of the sample liquid.
- a further preferred variant comprises the formation of conductive recesses 105, which begin at one end in the depressions 105 for blocking the air bubbles 102 and which extend beyond the middle of the hybridization space 2 (by those shown in FIGS. 2 and 3) drawn file 110 marked).
- These conductive recesses 105 are also preferably oriented at an angle of 45 ° to the flow axis 110 and arranged alternately starting from the left or right side of the Hybridisierhunt 2 and lying at 90 ° to each other.
- These conductive recesses 105 may be formed consistently deep or tapered to the center of the Hybridisierraums 2.
- FIG. 4B shows an embodiment of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a second variant.
- This relief structure is formed as a survey 108, which has a flat and a steep edge.
- FIG. 4C shows an embodiment of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a third variant.
- This relief structure is partially formed as a recess 105 and partially as a survey 108 and has two steep and a flat edge. All comments on FIG. 4A also apply mutatis mutandis to FIGS. 4B and 4C.
- FIG. 4D shows an embodiment of relief structures 101 for conducting air bubbles 102 according to a fourth variant.
- This relief structure is formed as an elevation 108 and has two steep flanks and a flat (raised) surface. All comments on Figure 4A apply mutatis mutandis here.
- Another variant (not shown) comprises the formation of relief structures 101 for conducting air bubbles 102, in which this relief structure 101 is formed as a depression 105 and has two steep flanks and a flat (recessed) surface.
- Both variants have in common that the lines of intersection of the steep flanks with the surface 14 of the device 1 can have a parallel course, so that the height difference of these relief structures 101 is constant (shown). However, both variants also have in common that the intersection lines of the steep flanks with the surface 14 of the device 1 may have a divergent course, and that the height difference of these relief structures 101 is nonetheless constant (not shown).
- relief structures 101 formed as elevations 108 with a dome-shaped cross section are also preferred (not shown). With such elevations 108, air bubbles 102 having a diameter of at most about 50 ⁇ m are more likely to only make a point contact. Thus, even with relatively little agitation, the air bubbles do not remain attached to the elevations 108 and are also further flushed into the transverse flow channels 15, 15 '. If the air bubbles 102 do not remain trapped in recesses 105 on the way, they are collected in the crossflow channels 15, 15 '.
- depressions 105 is in most cases preferred to the elevations 108, because wells always also mean an increase in the height of the preferably about 60-70 ⁇ m high hybridization chamber 2. This reduces the risk that an air bubble will affect the hybridization of a sample.
- Particularly preferred is an at least approximate, volumetric compensation of recesses 105 and elevations 108, so that a defined volume for the gap between the device 1 and the slide 3 and thus a defined volume for the Hybridisierhunt 2 can be maintained.
- the blocking of air bubbles 102 with devices 1 according to the invention basically functions in systems equipped with or without agitation means for moving the sample solution with respect to the immobilized samples.
- a system 38 for hybridizing nucleic acid samples, proteins or tissue sections is equipped with an agitation device (for example as shown and described in FIG. 1), a pendulum movement of the sample fluid relative to the samples immobilized on the slide 3 occurs.
- Figure 5 shows a schematic partial view of a Hybridisierhunt 2 between a device 1 and a slide 3, on which this device 1 is placed.
- the device 1 has an arrangement of relief structures 101 for guiding and blocking air bubbles 102 according to a respective first variant (see Fig. 3B) and an embodiment of these relief structures 101 as elevations 108 according to the fourth variant (compare Fig. 4D) ,
- the track which the Tracing pattern molecules on average during a pendulum motion generated by an agitator is marked with two opposing arrows. This distance can also be much longer but not much shorter than outlined in the schematic diagram.
- a distance of two behind each other in the direction of agitation the same direction relief structures of about 2/3 of the pendulum motion or about 4 mm.
- the typical path of an air bubble 102 begins at an arbitrary position (1) in the Hybridisierraum 2.
- This air bubble 102 with a diameter of at most about 50 microns (with a chamber height or gap height of preferably 30-200 microns) of the (in the sketch detected upward flow) and moved substantially in a straight line until it abuts a trained as a survey 108, the first relief structure 101 (2).
- the resistance to escape of the air bubble 102 (here: below 45 ° to the top right) remains considerably smaller than standing, it is pulled along by the flow as far as the end of the relief structure 101 (3, 4).
- the air bubble 102 then continues to move in a straight line until it encounters a second relief structure 101 (FIG. 5), is distracted therefrom (here: at 45 ° to the top left) and stops after breaking off the flow (6).
- the flow sets in the opposite direction and pulls the air bubble 102 until it hits the back of the first relief structure 101 (FIG. 7), is deflected again by it (here: at 45 ° to the bottom left) and into the depression 105 formed relief structure 101 enters (8).
- the air bubble 102 is trapped and can only follow the pendulum flow within these narrow limits (9). If other air bubbles are already blocked in the depression 105, an aggregation of the existing air bubbles or even a fusion thereof is often observed. These two processes additionally increase the probability that none of the air bubbles can leave the depression 105 again.
- the relief structures 101 according to the invention (elevations and depressions) on the cover or on the device 1 preferably have a height difference from the otherwise flat surface 14 of the lid or device 1 of at most 1/3 of the preferred gap height of 30 .mu.m to 200 .mu.m. Especially preferred are differences in height of 30 microns at wells and 20 microns at elevations.
- These relief structures 101 may enter the device 1 during the manufacturing process (eg injection molding, processing of bar material) are formed. Recesses can also be incorporated later (eg by milling). Also surveys can be subsequently applied to the actual manufacturing process of the device 1 (eg by gluing or depositing of resins). This can be done for example by means of a template or prefabricated on adhesive strips semi-finished products.
- Object slides 3 can also be provided with relief structures 101, be these recesses 105 and / or elevations 108.
- the relief structures 101 are preferably arranged on the object carriers 101 on the surface 5 corresponding to the expected sample distributions. Thus, e.g. square so-called "low density arrays" be separated by channel-like depressions.
- the slides 3 may include a seal that is part of or disposed on the slide. Such seals may e.g. be produced in a two-component injection molding process with plastic slides. The spraying of such, preferably soft seals 4 on glass slides is also possible.
- the device 1, or the lid closing off the hybridization space 2 may comprise a hard seal 4 for maintaining the defined gap width or height of the hybridization space.
- the use of e.g. composite gaskets produced by the two-component injection molding method with a soft (sealing) component and a hard component (defining the gap height) are also conceivable.
- the material of the device 1 preferably polysulfone
- Each annular assembly or ring with sealing function is referred to in the context of the present invention as an O-ring.
- Such an O-ring may optionally have a e.g. have round, elliptical or polygonal cross-section or be formed as a sealing lip.
- the surface 5 of the object carrier 3 is arranged on the surface plane-parallel to the surface 14 of the device 1.
- the hybridization space 2 is not dependent on an approximately rectangular base area, as in FIGS. 2 and 3 will be shown.
- the recesses 105 can be arranged according to the seal 4.
- bumps 108 may be arranged according to the present invention in an eg tangential direction of agitation.
- the device 1 for influencing the air bubbles need not necessarily be transparent or have transparent parts.
- the device 1, the slide 3, or even both of these components may have relief structures 101, be these depressions 105 and / or elevations 108.
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Abstract
Betrifft Vorrichtungen (1), entsprechende Verfahrenseinheiten (18) bzw. Systeme (38) zum Bereitstellen eines spaltförmigen Hybridisierraums (2) für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten über einem Objektträger (3). Solche Vorrichtungen (1) sind gegenüber diesem Objektträger (3) bewegbar ausgebildet und umfassen eine ringförmige Dichtfläche (4) zum Abschliessen des Hybridisierraums (2) durch Beaufschlagen einer Oberfläche (5) dieses Objektträgers (3). Solche Vorrichtungen (1) umfassen zudem Leitungen (6,6') zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum (2) hinein bzw. aus dem Hybridisierraum (2) heraus. Ferner umfassen diese Vorrichtungen (1) eine Musterzuführung (7) und vorzugsweise auch eine Agitationseinrichtung (8) zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche (5) des Objektträgers (3) immobilisierten Proben. Die erfindungsgemässen Vorrichtungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Hybridisierraum (2) begrenzen, der an zumindest einer gegen das Innere dieses Hybridisierraums (2) gerichteten Oberfläche (5,14) der Vorrichtung (1) und/oder des Objektträgers (3) Reliefstrukturen (101) zum Leiten und/oder Blockieren von Luftblasen (102) aufweist. Entsprechend dem erfindungsgemässen Verfahren werden im Hybridisierraum (2) anwesende Luftblasen (102) durch diese Reliefstrukturen (101) geführt und/oder gefangen.
Description
- Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1 sowie eine entsprechende Verfahrenseinheit gemäss Anspruch 15 und ein automatisches System gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 17 für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben, Proteinen und Gewebeschnitten. Gemäss Anspruch 19 betrifft die vorliegende Erfindung zudem ein entsprechendes Verfahren.
- Die Verwendung von DNA-Proben (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) und insbesondere von Mikroarrays solcher Proben stellt der Forschung eine wichtige Technik zur gleichzeitigen bzw. simultanen Analyse von Tausenden von Genen zur Verfügung. Diese Technik umfasst die Immobilisierung von DNA-Proben aus vielen Genen auf einer festen Substrat-Oberfläche, wie z.B. auf einem gläsernen Objektträger für ein Lichtmikroskop. Die DNA-Proben werden bevorzugt in einem Array von Probenflecken oder "spots", d.h. in einem zweidimensionalen Gitter auf dem Substrat angeordnet und man kann später - ausgehend von einer bestimmten Position innerhalb eines solchen Arrays auf den Ursprung der entsprechenden DNA-Probe zurückschliessen. Die Technik umfasst typischerweise die Kontaktierung des DNA-Proben-Arrays mit RNA-Muster-Suspensionen bzw. -Lösungen (RNA = Ribosenukleinsäure) um damit spezifische Nukleotidsequenzen in den DNA-Proben nachzuweisen. Diese RNA-Muster werden oft mit einem sogenannten "tag" oder "label", d.h. einem Molekül versehen, welches z.B. ein Fluoreszenzlicht mit einer spezifischen Wellenlänge aussendet. Immobilisierte Proben können auch aminosäurehaltige (z.B. Proteine, Peptide) oder nukleinsäurehaltige (z.B. cDNA, RNA) Proben umfassen. Zu den immobilisierten Proben zugegebene Muster können beliebige Moleküle bzw. chemische Verbindungen umfassen, welche mit den immobilisierten Proben hybridisieren oder sich sonstwie mit diesen verbinden.
- Unter guten experimentellen Bedingungen hybridisieren bzw. binden RNA-Muster an immobilisierten DNA-Proben und bilden mit diesen zusammen hybride DNA-RNA-Stränge. Für jede der immobilisierten DNA-Proben und für spezielle RNA-Muster kann man Unterschiede in der Hybridisierung unter den DNA-Proben durch die Messung der Intensität und der Wellenlängenabhängigkeit der Fluoreszenz jedes einzelnen Mikroarray-Elements feststellen und so herausfinden, ob der Grad der Genexpression in den untersuchten DNA-Proben variiert. Mit der Verwendung von DNA-Mikroarrays können somit über die Expression von grossen Mengen von Genen und über deren Expressionsmuster umfassende Aussagen gemacht werden, obwohl nur geringe Mengen an biologischem Material eingesetzt werden müssen.
- DNA-Mikroarrays haben sich als erfolgreiche Werkzeuge etabliert und die Geräte zur Durchführung der DNA-Hybridisierung wurden laufend verbessert (vgl. z.B. US 6,238,910 oder US 2003/0013184 Al bzw. EP 1 260 265 Al des aktuellen Anmelders). Diese Dokumente offenbaren eine Vorrichtung zum Bereitstellen eines Hybridisierraums für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben auf einem Objektträger, welche gegenüber diesem Objektträger bewegbar ausgebildet ist und eine ringförmige Dichtung zum Abschliessen des Hybridisierraums durch Beaufschlagen einer Oberfläche dieses Objektträgers umfasst. Zudem umfasst die offenbarte Vorrichtung Leitungen zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum hinein bzw. aus dem Hybridisierraum heraus sowie eine Probenzuführung. Eine verbesserte Temperaturkontrolle und eine Bewegung der Flüssigkeit mit den RNA-Mustern gegenüber den auf dem Objektträger immobilisierten DNA-Proben sind ebenfalls offenbart. Allerdings dauert es insbesondere bei einer Vorrichtung entsprechend US 6,238.910 zu lange, bis eine einigermassen gute Verteilung der Musterflüssigkeit gegenüber den an der Oberfläche der Objektträger immobilisierten Proben erreicht wird, zudem wird der Verbrauch an Musterflüssigkeit als zu hoch betrachtet.
- Es kommt einerseits immer wieder vor, dass Luftblasen beim Einfüllen von Flüssigkeiten oder auch später in der Hybridisierkammer entstehen. Andererseits wurde versucht (vgl. z.B. US 6,186,659), Luftblasen gezielt als Agitationsmittel einzusetzen, um in der Hybridisierkammer eine gründlichere Durchmischung der Reagenzien zu erzielen. Im allgemeinen sind aber im Hybridisiermedium anwesende Luftblasen nicht erwünscht, weil diese den meist sehr dünnen Flüssigkeitsfilm über den immobilisierten Proben stören. Dies kann zu einer Inhomogenität der Verteilung von Reagenzien im Hybridisiermedium und damit zu einer Verfälschung der Hybridisier-Resultate führen; schlimmstenfalls verdrängen grössere Luftblasen sogar das Hybridisiermedium von Teilen der auf dem Objektträger immobilisierten Proben.
- Aus dem Stand der Technik sind zudem zahlreiche Methoden bekannt, um das spontane Auftreten von Luftblasen oder das Verbleiben derselben in der Kammer zu behindern. So wurde z.B. ein nichtparalleles Anordnen der die Hybridisierkammer definierenden Objektträger und Deckel vorgeschlagen (vgl. US 5,922, 591), oder die Hybridisiermedien werden während dem ganzen Hybridisierprozess aus der Kammer hinaus und wieder hinein befördert. Andere mischen die Oberflächenspannung reduzierende Agenzien in das Hybridisiermedium oder behandeln die Oberflächen der Kammer mit wasserabstossenden chemischen Verbindungen.
- Aus US 6,458,526 ist eine Anordnung bekannt, mir welcher in den Hybridisierraum hineinragende "Blasenhälften" aus einem mit Lösungsmittel gesättigten Gas erzeugt werden. Es handelt sich bei diesen "Blasenhälften" eigentlich um kalottenförmige Grenzflächen von Gasräumen mit einem definierten Krümmungsradius. Diese "Blasenhälften" befinden sich an definierten Stellen der Kammer, wo sie die Hybridisierung der Proben nicht stören können. In einem vom Hybridisierraum abgetrennten Kompartiment befindet sich ein Lösungsmittel, welches im Hybridisiermedium enthalten ist. Über diesem Lösungsmittel wird eine gesättigte Atmosphäre aufrecht erhalten, welche konstant mit den Gasräumen hinter den "Blasenhälften" verbunden ist. Damit wird konstant eine mit dem Lösungsmittel gesättigte Atmosphäre an die kalottenförmigen Grenzflächen gebracht und dadurch der Partialdruck des im Hybridisiermedium anwesenden Lösungsmittel so beeinflusst, dass allenfalls vorhandene Luftblasen schrumpfen und eliminiert werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass diese kalottenförmigen Grenzflächen mittels speziellen Vorrichtungen geschaffen und aufrechterhalten werden müssen.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft gemäss einem ersten Aspekt das Bereitstellen einer alternativen Vorrichtung und gemäss einem zweiten Aspekt das Bereitstellen eines Verfahrens mit welcher bzw. mit welchem Luftblasen in einer Hybridisierkammer auf einfache Art und Weise beeinflusst werden können.
- Diese Aufgabe gemäss dem ersten Aspekt wird mit der Merkmalskombination des unabhängigen Anspruchs 1 gelöst und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen spaltförmigen Hybridisierraum begrenzt, der an einer gegen das Innere dieses Hybridisierraums gerichteten Oberfläche der Vorrichtung und/oder des Objektträgers Reliefstrukturen zum Leiten und/oder Blockieren von Luftblasen aufweist. Diese Aufgabe gemäss dem zweiten Aspekt wird dadurch gelöst, dass Luftblasen entsprechend den Merkmalen des unabhängigen Anspruches 19 innerhalb der Hybridisierkammer bewegt und/oder gefangen werden.
- Vorteilhafte Weiterbildungen und zusätzliche Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die Überlegung zu Grunde, dass einerseits Gasmoleküle der Umgebungsluft in die Hybridisierkammer diffundieren können und so Luftblasen gebildet werden. Andererseits können sich, z.B. in Folge einer Veränderungen der Löslichkeit von Gasen, spontan Gasblasen im Hybridisiermedium bilden. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden deshalb alle Gasblasen im Hybridisiermedium - ungeachtet des Entstehungsprozesses in der Hybridisierkammer - als "Luftblasen" bezeichnet.
- Die Erfindung soll nun an Hand von schematischen und beispielhaften Zeichnungen, welche den Umfang der Erfindung nicht beschränken sollen, näher erläutert werden. Dabei zeigt:
- Fig. 1A
- einen senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung zum Bereitstellen einer Hybridisierkammer mit aufgeklappter Vorrichtung;
- Fig. 1B
- einen senkrechten Längsschnitt durch die Anordnung von Fig. 1A mit heruntergeklappter Vorrichtung bzw. geschlossener Hybridisierkammer;
- Fig. 2A
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf den diese Vorrichtung aufgesetzten ist, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen gemäss einer ersten Variante aufweist;
- Fig. 2B
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer gemäss Fig. 2A, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen gemäss einer zweiten und dritten Variante aufweist;
- Fig. 2C
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer gemäss Fig. 2A, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen gemäss einer vierten und fünften Variante aufweist;
- Fig. 3A
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf den diese Vorrichtung auf- gesetzten ist, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer ersten Variante aufweist;
- Fig. 3B
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen gemäss der jeweils ersten Variante aufweist;
- Fig. 3C
- eine schematische Ansicht einer Hybridisierkammer, wobei die Vorrichtung eine alternative Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen aufweist;
- Fig. 4A
- einen senkrechten Teilschnitt durch die Anordnung gemäss Fig. 1B mit heruntergeklappter Vorrichtung bzw. geschlossener Hybridisierkammer; wobei die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer ersten Variante aufweist;
- Fig. 4B
- einen senkrechten Teilschnitt entsprechend Fig. 4A; wobei die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer zweiten Variante aufweist;
- Fig. 4C
- einen senkrechten Teilschnitt entsprechend Fig. 4A; wobei die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer dritten Variante aufweist;
- Fig. 4D
- einen senkrechten Teilschnitt entsprechend Fig. 4A; wobei die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer vierten Variante aufweist;
- Fig. 5
- eine schematische Teilansicht einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf den diese Vorrichtung aufgesetzt ist, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen gemäss einer jeweils ersten Variante und eine Ausbildung dieser Reliefstrukturen gemäss der vierten Variante aufweist.
- Figur 1 zeigt einen der Fig. 7 von US 2003/0013184 A1 bzw. EP 1 260 265 A1 des aktuellen Anmelders entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Vorrichtung 1 für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben, Proteinen und Gewebeschnitten. Diese Vorrichtung 1 ist wie ein Deckel gegenüber einem Objektträger 3 bewegbar (hier um eine Achse 34 schwenkbar ausgebildet, so dass der Hybridisierraum 2 durch eine einfache Bewegung geöffnet (vgl. Fig. 1A) und geschlossen (vgl. Fig. 1B) werden kann. Eine ringförmige Dichtung bzw. Dichtfläche 4 dient zum Abschliessen des Hybridisierraums 2 durch Beaufschlagen einer Oberfläche 5 dieses Objektträgers 3. Diese Dichtfläche 4 kann eine abgesetzte Oberfläche oder Stufe 104 des Deckels bzw. der Vorrichtung 1 sein, welche flach auf der Oberfläche 5 des Objektträgers 3 liegt; alternativ dazu kann z.B. auch eine Lippendichtung verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch eine O-Ring-Dichtung 103 als Dichtfläche 4. Die Anordnung umfasst Leitungen 6,6' zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum 2 hinein bzw. aus dem Hybridisierraum 2 heraus. Solche Medien können Reagenzien zum Durchführen der Hybridisierungsreaktion, wie z.B. Waschflüssigkeiten oder Puffer-Lösungen, aber auch inerte Gase (wie z.B. Stickstoff) zum Trocknen der Hybridisierungsprodukte auf den Objektträgern 3 bzw. zum Ausblasen der Hybridisierkammern 2 und der Medienleitungen 6,6' sein. Diese Zu- bzw. Ableitungen 6,6' für Hybridisiermedien münden bevorzugt in je einen Agitationsraum 11, 11'. Die Anordnung umfasst zudem eine verschliessbare Musterzuführung 7, durch welche von Hand RNAenthaltende Flüssigkeiten oder andere Musterflüssigkeiten zupipettiert werden können. Die Musterzuführung 7 wird vorzugsweise mit einem Kunststoffpfropfen (nicht gezeigt) verschlossen. Alternativ dazu kann eine automatische bzw. robotisierte Musterzuführung vorgesehen werden, wie diese in unterschiedlichen Ausführungsformen in US 2003/0013184 Al bzw. EP 1 260 265 Al des aktuellen Anmelders offenbart sind, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
- Bevorzugt sind die Vorrichtungen 1 parallel zueinander und in einer Vierergruppe angeordnet, weil diese Anordnung gerade ein Mass für eine Temperaturkontrollplatte 20 zulässt, auf welche ein Rahmen 21 in der Grösse einer Mikroplatte mit vier parallel zu einander angeordneten Objektträgern 3 passt. Jede dieser Vierergruppen ist einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen Temperaturkontrollplatte 20 zugeordnet. Eine Temperaturkontrollplatte 20 ist zur flächigen Aufnahme eines vier Objektträger 3 tragenden Rahmens 21 ausgebildet. Weil die Objektträger 3 im Rahmen 21 sanft federnd gehalten sind und weil die Temperaturkontrollplatte 20 so ausgebildet ist, dass der Rahmen ihr gegenüber etwas abgesenkt werden kann, liegen die Objektträger 3 direkt auf der Oberfläche der Temperaturkontrollplatte 20. Jede Vierergruppe einer Verfahrenseinheit 18 umfasst eine um eine Achse 34 schwenkbare und gegenüber einer Grundplatte 35 verriegelbare Halterung 36 mit vier Sitzen 37, wobei in jeden dieser Sitze 37 eine Vorrichtung 1 einlegbar ist. Jede Verfahrenseinheit 18 umfasst zudem eine Anschlussplatte 22 zum dichtenden Verbinden der Einheitsleitungen 23,23',23" des Systems 38 mit den Leitungen 6,6',6" der Vorrichtungen 1. Als Dichtungen für diese Verbindungen werden O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt).
- Die Anordnung umfasst vorzugsweise eine medientrennende Agitationseinrichtung 8 zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche 5 der Objektträger 3 immobilisierten nukleinsäure- bzw. aminosäurehaltigen Proben oder Gewebeschnitten. In der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform umfasst die Agitationseinrichtung 8 der Anordnung eine Membran 9. Diese Membran 9 trennt einen Druckraum 10, der über eine Druckleitung 6" mit einem Druckfluid (Gas oder Flüssigkeit) befüllbar ausgebildet ist, von einem Agitationsraum 11, der über eine Agitationsleitung 12 mit dem Hybridisierraum 2 verbunden ist. Nach dem Erreichen des thermischen Gleichgewichtes der Anordnung, dem Zugeben eines bestimmten Volumens an RNA-Musterflüssigkeit und dem Verschliessen der Musterzuführung 7 wird über die Druckleitung 6" vorzugsweise Luft oder ein anderes Gas (es könnte aber auch eine Flüssigkeit sein) stossweise in den Druckraum 10 gebracht (Überduckversion) oder daraus abgesogen (Unterdruckversion), so dass sich die Membran 9 im gleichen Rhythmus durchbiegt und entsprechend den Agitationsraum 11 verkleinert bzw. vergrössert. Dadurch wird die Musterflüssigkeit im gleichen Rhythmus des Über- bzw. Unterdrucks und Entspannens im Hybridisierraum 2 gegen das eine oder das andere Ende bewegt, wo sich vorzugsweise an der gegen das Innere des Hybridisierraums 2 gerichteten Oberfläche 14 des Deckels bzw. der Vorrichtung 1 je ein Querströmkanal 15,15' befindet.
- Diese Querströmkanäle 15,15' erleichtern einerseits das Querverteilen von in der Musterlösung enthaltenen RNA-Molekülen. Dadurch wird bewirkt, dass die Musterflüssigkeit bzw. die Waschflüssigkeiten homogen über das gesamte im Hybridisierraum 2 anwesende Volumen verteilt werden. Andrerseits dienen die Querströmkanäle 15,15' auch als Flüssigkeits-Reservoir, so dass bei der durch die in der Vorrichtung eingebauten Agitationseinrichtung 8 erzeugte Pendelbewegung der Musterlösung nicht dazuführt, dass Teile des Hybridisierraums 2 unbeabsichtigt trocken liegen.
- Vorzugsweise ist ein zweiter, ebenfalls mit einer Membran 9' versehener Agitationsraum 11' über eine zweite Agitationsleitung 12' mit dem Hybridisierraum 2 verbunden. Wenn jetzt ein auf den Druckraum 10 abgegebener Druckstoss die erste Membran 9 in den ersten Agitationsraum 11 drückt, wird dieser Impuls über die erste Agitationsleitung 12 auf die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 2 übertragen. Die Musterflüssigkeit weicht etwas gegen die zweite Agitationsleitung 12' aus (kann diese sogar zum Teil füllen) und erhöht den Druck im zweiten Agitationsraum 11'. Dadurch biegt sich die zweite Membran 9' nach oben und wird dabei elastisch gedehnt. Sobald der Überdruck im Druckraum 10 nachlässt, federn beide Membranen 9,9' in ihre Ruheposition zurück und bewegen die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 2 in die entgegengesetzte Richtung. Durch diese Pendelbewegung kann mit der gezeigten Anordnung eine Musterflüssigkeit mit einem minimalen Volumen (im Bereich von ca. 100 µl) in weniger als einer Minute praktisch homogen im Hybridisierraum 2 verteilt werden. Vorzugsweise wird unmittelbar anschliessend an den Druckabbau im Druckraum 10 ein Unterdruck im Druckraum 10 erzeugt, so dass die dem vorangehenden Druckstoss entgegengesetzte Rückwärtsbewegung der Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 2 noch verstärkt wird.
- Währenddem Figur 1A eine offene Halterung 36 darstellt, zeigt Figur 1B einen Vertikalschnitt durch eine Verfahrenseinheit 18 zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten mit geschlossener Halterung 36. Alle vier Hybridisierräume 2 dieser Vierergruppen sind einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen Temperaturkontrollplatte 20 zugeordnet. Um sicherzustellen, dass die Vorrichtungen 1 planparallel zu den Objektträgern 3 platziert werden können, weist die Halterung 36 zudem noch ein Mittelgelenk (nicht gezeigt) mit einer zur Achse 34 parallelen Beweglichkeit auf. Damit die Dichtungen 4 die Hybridisierräume 2 zuverlässig abschliessen, wird über die Halterung 36 ein zusätzlicher Druck auf die Vorrichtungen 1 ausgeübt, dies kann über Schrauben, Kipphebel oder ähnliche bekannte Vorrichtungen (nicht gezeigt) bewerkstelligt werden. Jede Verfahrenseinheit 18 umfasst zudem eine Anschlussplatte 22 zum dichtenden Verbinden der Einheitsleitungen 23,23',23" mit den Leitungen 6,6',6" der Vorrichtungen 1. Als Dichtungen für diese Verbindungen werden O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt).
- Die Figuren 2 und 3 zeigen schematische Ansichten auf die geschlossene Anordnung von Figur 1B, von unten gesehen. Dabei ist die spaltförmige Hybridisierkammer 2 zwischen einer Vorrichtung 1 und einem Objektträger 3, auf den diese Vorrichtung 1 aufgesetzt ist, in ihrem Volumen definiert. Die O-Ring-Dichtung 103 begrenzt lateral den Hybridisierraum 2, der an seinen einander entgegengesetzten Enden vorzugsweise je einen Querströmkanal 15,15' aufweist, welche als Vertiefung in der Oberfläche 14 des Deckels bzw. der Vorrichtung 1 vorgesehen sind. Der Objektträger 3 (hier ein Glasobjektträger für die Lichtmikroskopie) und dessen optionales Griff- und/oder Barcodefeld 33 sind gestrichelt eingezeichnet. Klar ersichtlich ist auch eine Abdrückfeder 17, welche auf das Grifffeld 33 des Objektträgers 3 drückt. Es können auch mehrere Abdrückfedern vorgesehen sein (nicht gezeigt). Zusätzlich können - bevorzugt auf den Seitenflanken der Vorrichtung - 1 Zentrierfedern angeordnet sein (nicht gezeigt) mit welchen Objektträger mit speziellen Formaten on der Vorrichtung 1 zentriert werden, so dass eine maximale Ausnützung der Objektträgeroberfläche gewährleistet ist. Beim Öffnen des Hybridisierraums 2 erleichtert diese Abdrückfeder 17 die automatische Trennung des Objektträgers 3 vom Deckel bzw. von der Vorrichtung 1. Ebenfalls ersichtlich sind die Öffnungen der Einlassleitung 6 und der Auslassleitung 6' sowie der Musterzuführung 7, die in einen der beiden Querströmkanäle 15,15' münden.
- Figur 2A zeigt eine Vorrichtung 1 mit einer Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer ersten Variante. Diese Reliefstrukturen 101 sind hier als Vertiefungen 105 ausgebildet und in Grenzbereichen 106 des Hybridisierraums 2 entlang zumindest eines Teils der Dichtfläche 4 angeordnet. Wie gezeigt münden keine Leitungen 6,6',7 in diese Vertiefungen 105. Gemäss dieser bevorzugten ersten Variante sind mehrere Vertiefungen in einer Reihe links und rechts der Hybridisierkammer 2 angeordnet, wobei diese Reihen sich über den ganzen Grenzbereich 106 zwischen den beiden endständigen Querströmkanälen 15,15' erstrecken. Die Vertiefungen 105 befinden sich in unmittelbarer Nähe des O-Rings 103, sie sind alle gleich lang und durch schmale Stege 107 unterbrochen, so dass die Luftblasen 102 in der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen sind und sich nicht mit dem Objektträger 3 verbinden und damit ein Hybridisieren der darunter liegenden Proben verhindern oder behindern können. Zudem können sich so in den Vertiefungen 105 gefangene Luftblasen 102 nicht über den Hybridisierraum 2 verteilen.
- Figur 2B zeigt eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer zweiten und dritten Variante. Die Vertiefungen 105 befinden sich in unmittelbarer Nähe des O-Rings 103, sie sind alle gleich lang und durch schmale Stege 107 unterbrochen, so dass die Luftblasen 102 in der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen sind. Gemäss der zweiten Variante (links) sind nur wenige, lange Vertiefungen 105 vorgesehen; es könnte auch nur eine einzige Vertiefung auf jeder Seite der Hybridisierkammer 2 angeordnet werden (nicht gezeigt), wichtig ist, dass ein Steg 107 diese Vertiefungen 105 von den Querströmkanälen 15,15' trennt. Gemäss der dritten Variante (rechts) sind sehr viele kurze (z.B. runde) Vertiefungen 105 vorgesehen. Diese haben den Vorteil, dass sehr viele individuelle Kompartimente zum Blockieren von Luftblasen 102 geschaffen werden.
- Figur 2C zeigt eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer vierten und fünften Variante. Die Vertiefungen 105 befinden sich in unmittelbarer Nähe des O-Rings 103, sie weisen eine unterschiedliche Länge auf und sind durch schmale Stege 107 unterbrochen, so dass die Luftblasen 102 in der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen sind. Gemäss der vierten Variante (links) sind nur wenige, lange Vertiefungen 105 vorgesehen, zwischen welchen kurze (z.B. runde) Vertiefungen angeordnet sein können. Gemäss der fünften Variante (rechts) sind mehrere Vertiefungen 105 mit zunehmender Länge vorgesehen. Die hier gezeigten Anordnungen haben den Vorteil, dass Kompartimente zum Blockieren von Luftblasen 102 geschaffen werden, die entsprechend von bestimmten Prozessparametern oder Kammereigenschaften individuell verteilt sind. Z.B. lassen sich so Vertiefungen vorsehen, welche entsprechend von erfahrungsgemäss auftretenden Gradienten (im Hybridisiermedium und/oder im Auftreten der Luftblasen) angeordnet sind.
- Diese gezeigten Anordnungen von als Vertiefungen 105 ausgebildeten Reliefstrukturen 101 eignen sich besonders zum Blockieren von durch Diffusion durch den O-Ring 103 entstandenen Luftblasen 102 und zwar in unmittelbarer Nähe ihres Entstehungsortes. Zusätzlich zur Variation der Anzahl und Länge der als Vertiefungen 105 ausgebildeten Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102, gehört auch die Variation der Breite und/oder Tiefe solcher Vertiefungen 105 zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Es können auch sogenannte Fangkanäle für Luftblasen entlang der seitlichen O-Ringe vorgesehen sein. Solche Fangkanäle (nicht gezeigt) sind dann als eine einzige Vertiefung ausgebildet, welche lediglich durch je einen dünnen Steg von den beiden Querströmkanälen 15,15' getrennt ist. Dabei ist zu erwähnen, dass die erfindungsgemässen Vertiefungen 105 auch in Hybridisierkammern 2 eingesetzt werden können, welche keine Agitationseinrichtung umfasst.
- Figur 3A zeigt eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer ersten Variante. Die Reliefstrukturen 101 sind hier als Erhebungen 108 zum Leiten von Luftblasen 102 ausgebildet und im wesentlichen über den ganzen Hybridisierraum 2 verteilt angeordnet. Bevorzugt sind die Erhebungen 108 regelmässig und in einem verschränkten, orthogonalen Raster 109 angeordnet. Speziell bevorzugt ist ein verschränkter, orthogonaler Raster 109, der um 45 ° verdreht zu einer Fliessachse 110 angeordnet ist. Abweichungen von der orthogonalen Anordnung sind möglich, so dass durch einen kleineren Winkel zur Fliessrichtung als 45 ° (steilere Anordnung) das Abdrängen erleichtert wird. Andererseits wird durch die Wahl von grösseren Winkeln als 45 ° zur Fliessrichtung (flachere Anordnung) eine grössere Distanz beim Abdrängen erreicht.
- Figur 3B zeigt eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen 102. Die blockierenden Reliefstrukturen 101 sind als Vertiefungen 105 ausgebildet und in Grenzbereichen 106 des Hybridisierraums 2 entlang zumindest eines Teils des O-Rings 103 angeordnet (vgl. Fig. 2A). Die leitenden Reliefstrukturen 101 sind als Erhebungen 108 zum Leiten von Luftblasen 102 ausgebildet und im wesentlichen über den ganzen Hybridisierraum 2 verteilt angeordnet (vgl. Fig. 3A). Die Kombination von blockierenden und leitenden Reliefstrukturen 101 ermöglicht auch das Vereinigen der bereits beschriebenen positiven Effekte dieser Reliefstrukturen. Dabei werden bevorzugt die Anordnung und die Grösse aller zum Beeinflussen von Luftblasen 102 eingesetzten Reliefstrukturen 101 einander angepasst. Wichtige Kriterien für ein solches Anpassen sind das Volumen der Hybridisierkammer (bevorzugt ca. 60 µl), der Hub der Agitationseinrichtung (bevorzugt ca. 5 µl), die Länge der Hybridisierkammer (bevorzugt ca. 50 mm) sowie die aus der Agitation resultierende Pendelstrecke der Hybridisiermedien über den immobilisierten Proben (bevorzugt ca. 5 mm). Zudem ist wünschbar, dass die Frequenz der Agitationszyklen einstellbar ist. Das heisst, es werden unterschiedlich lange Agitationszeiten mit unterschiedlichen langen Zeiten ohne Agitation abgewechselt. Die Agitationszeiten sind jedoch vorzugsweise so lange gewählt, dass sich eine grosse Zahl von Agitationsbewegungen pro Minute und dadurch eine Mehrfachdurchmischung des Kammervolumens ergibt. Mischversuche mit Farbstoffen haben gezeigt, dass nach wenigen Minuten eine praktisch 100 %ige Durchmischung stattfindet.
- Figur 3C eine alternative Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen. Die blockierenden Reliefstrukturen 101 sind als kleinere Vertiefungen 105 ausgebildet (vgl. Fig. 3B). Die leitenden Reliefstrukturen 101 sind als feinere und engmaschiger verteilte Erhebungen 108 zum Leiten von Luftblasen 102 ausgebildet (vgl. Fig. 3B).
- Figur 4 zeigt senkrechte Teilschnitte durch eine Anordnung gemäss Fig. 1B mit heruntergeklappter Vorrichtung 1 bzw. geschlossener Hybridisierkammer 2. Pfeile bezeichne die Fliessrichtung der Musterflüssigkeit gegenüber den auf dem Objektträger 3 immobilisierten Proben. Diese Bewegung der Musterflüssigkeit bewirkt in Wechselwirkung mit den gezeigten Reliefstrukturen 101 ein Abdrängen der Luftblasen 102 von der eigentlichen Fliessrichtung oder Fliessachse 110.
- Figur 4A zeigt eine Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer ersten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Vertiefung 105 ausgebildet, welche eine flache und eine steile Flanke aufweist. Die Flanken der Vertiefung 105 bilden je eine Schnittlinie mit der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1. Bei konstanter Höhendifferenz und Flankenneigung der Vertiefung 105 verlaufen diese Schnittlinien parallel zu einander (vgl. Fig. 5). Bei zunehmender Höhendifferenz und konstanter Flankenneigung der Vertiefung 105 divergieren diese Schnittlinien; so kann beispielsweise ein Fischschuppen ähnliches Relief auf der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 erzeugt werden. Der Neigungswinkel der steilen Flanke und der Winkel zwischen der Fliessachse 110 und der Schnittlinie zwischen der steilen Flanke und der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 bestimmen zusammen den Einfluss auf eine Luftblase 102, die gegen diese steile Flanke gespült wird. Diese beiden Winkel sind erfindungsgemäss so gewählt, dass der Fliesswiderstand der Luftblase 102 gegenüber der steilen Flanke in Richtung der Fliessachse 110 grösser ist als in Richtung der Reliefstruktur 101. Dadurch erfolgt ein Abdrängen der Luftblase 102 von der allgemeinen Fliessrichtung. Dieses Abdrängen wird zusätzlich durch die von der Reliefstruktur 101 verursachte, in die gleiche Richtung abgelenkte, örtliche Mikroströmung unterstützt. Diese Mikroströmungen treten an allen in einem Winkel zur Fliessachse 110 angeordneten Reliefstrukturen 101 auf und unterstützen zusätzlich eine effektivere Durchmischung der Musterflüssigkeit.
- Eine weitere bevorzugte Variante (nicht gezeigt) umfasst das Ausbilden von leitenden Vertiefungen 105, die an deren einem Ende in den Vertiefungen 105 zum Blockieren der Luftblasen 102 beginnen und die bis über die Mitte des Hybridisierraums 2 (durch die in den Fig. 2 und 3 eingezeichnete Fliessache 110 markiert) reichen. Diese leitenden Vertiefungen 105 sind ebenfalls bevorzugt unter einem Winkel von 45 ° zur Fliessachse 110 orientiert und abwechselnd von der linken oder rechten Seite der Hybridisierkammer 2 ausgehend und unter 90 ° zu einander liegend angeordnet. Diese leitenden Vertiefungen 105 können gleichbleibend tief ausgebildet oder nach der Mitte des Hybridisierraums 2 spitz zulaufend ausgebildet sein.
- Figur 4B zeigt eine Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer zweiten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Erhebung 108 ausgebildet, welche eine flache und eine steile Flanke aufweist. Figur 4C zeigt eine Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer dritten Variante. Diese Reliefstruktur ist teilweise als Vertiefung 105 und teilweise als Erhebung 108 ausgebildet und weist zwei steile und eine flache Flanke auf. Alle Bemerkungen zu Figur 4A gelten sinngemäss auch für Fig. 4B und Fig. 4C.
- Figur 4D zeigt eine Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer vierten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Erhebung 108 ausgebildet und weist zwei steile Flanken und eine flache (erhöhte) Oberfläche auf. Alle Bemerkungen zu Figur 4A gelten sinngemäss auch hier. Eine weitere Variante (nicht gezeigt) umfasst die Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102, bei welcher diese Reliefstruktur 101 ist als Vertiefung 105 ausgebildet ist und zwei steile Flanken und eine flache (vertiefte) Oberfläche aufweist. Beiden Varianten ist gemeinsam, dass die Schnittlinien der steilen Flanken mit der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 einen parallelen Verlauf haben können, so dass die Höhendifferenz dieser Reliefstrukturen 101 konstant ist (gezeigt). Beiden Varianten ist aber auch gemeinsam, dass die Schnittlinien der steilen Flanken mit der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 einen divergierenden Verlauf haben können, und dass die Höhendifferenz dieser Reliefstrukturen 101 trotzdem konstant ist (nicht gezeigt).
- Abweichend von den in Fig. 4 gezeigten Reliefformen werden auch als Erhebungen 108 ausgebildeten Reliefstrukturen 101 mit einem kalottenförmigen Querschnitt bevorzugt (nicht gezeigt). Mit solchen Erhebungen 108 gehen Luftblasen 102 mit einem Durchmesser von höchstens etwa 50 µm mit grösserer Wahrscheinlichkeit lediglich eine Punktberührung ein. Somit bleiben die Luftblasen schon bei relativ geringer Agitation nicht an den Erhebungen 108 hängen und werden auch bis in die Querströmkanäle 15,15' weitergespült. Falls die Luftblasen 102 nicht unterwegs in Vertiefungen 105 gefangen bleiben, werden sie in den Querströmkanälen 15,15' gesammelt.
- Das Anordnen von Vertiefungen 105 wird in den meisten Fällen den Erhebungen 108 vorgezogen, weil Vertiefungen immer auch eine Zunahme der Höhe der bevorzugt ca. 60-70 µm hohen Hybridisierkammer 2 bedeuten. Dadurch wird das Risiko vermindert, dass eine Luftblase die Hybridisierung einer Probe beeinträchtigt. Besonders bevorzugt wird ein zumindest annähernder, volumenmässiger Ausgleich von Vertiefungen 105 und Erhebungen 108, so dass ein definiertes Volumen für den Spalt zwischen der Vorrichtung 1 und dem Objektträger 3 und damit ein definiertes Volumen für die Hybridisierkammer 2 eingehalten werden kann.
- Das Blockieren von Luftblasen 102 mit erfindungsgemässen Vorrichtungen 1, die Reliefstrukturen 101 gemäss einem der in Figur 2 dargestellten Beispiele aufweisen, funktioniert grundsätzlich in Systemen, die mit oder ohne Agitationseinrichtung für das Bewegen der Musterlösung gegenüber den immobilisierten Proben ausgestattet sind. Ist ein solches System 38 zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten jedoch mit einer Agitationseinrichtung (beispielsweise wie in Fig. 1 gezeigt und beschrieben) ausgestattet, so entsteht eine Pendelbewegung der Musterflüssigkeit gegenüber den auf dem Objektträger 3 immobilisierten Proben. In einem solchen System - wie es beispielsweise in US 2003/0013184 A1 bzw. EP 1 260 265 A1 des aktuellen Anmelders offenbart ist - welches mit erfindungsgemässen Vorrichtungen 1 bestückt ist, werden im Hybridisierraum 2 spontan entstehende oder schon (durch Einschleppen) vorhandene Luftblasen 102 hin und her bewegt und durch leitende Reliefstrukturen 101 in Grenzbereiche 106 des Hybridisierraums 2 abgedrängt, wie dies in der Folge erläutert wird. Auf die veröffentlichten Patentanmeldungen US 2003/0013184 Al bzw. EP 1 260 265 Al des aktuellen Anmelders wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
- Figur 5 zeigt eine schematische Teilansicht einer Hybridisierkammer 2 zwischen einer Vorrichtung 1 und einem Objektträger 3, auf den diese Vorrichtung 1 aufgesetzt ist. Die Vorrichtung 1 weist eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer jeweils ersten Variante (vgl. Fig. 3B) und eine Ausbildung dieser Reliefstrukturen 101 als Erhebungen 108 gemäss der vierten Variante (vgl. Fig. 4D) auf. Die Strecke, welche die Mustermoleküle im Mittel während einer durch eine Agitationseinrichtung erzeugten Pendelbewegung zurücklegen ist mit zwei einander entgegengesetzten Pfeilen markiert. Diese Strecke kann auch wesentlich länger aber nicht viel kürzer sein, als dies in der schematischen Darstellung skizziert ist. Bevorzugt wird eine Distanz von zwei hinter einander in Agitationsrichtung liegenden, gleich gerichteten Reliefstrukturen von ca. 2/3 der Pendelbewegung oder ca. 4 mm. Der typische Weg einer Luftblase 102 beginnt an einer beliebigen Position (1) im Hybridisierraum 2. Diese Luftblase 102 mit einem Durchmesser von höchstens etwa 50 µm (bei einer Kammerhöhe bzw. Spalthöhe von bevorzugt 30-200 µm) wird von der (in der Skizze nach oben gerichteten) Strömung erfasst und im wesentlichen in gerader Linie mitbewegt, bis sie an eine als Erhebung 108 ausgebildete, erste Reliefstruktur 101 anstösst (2). Weil der Widerstand für ein Ausweichen der Luftblase 102 (hier: unter 45 ° nach rechts oben) erheblich kleiner ist als ein Stehen bleiben, wird sie bis an das Ende der Reliefstruktur 101 von der Strömung mitgezogen (3,4). Darauf bewegt sich die Luftblase 102 wieder geradlinig weiter, bis sie auf eine zweite Reliefstruktur 101 trifft (5), von dieser wieder abgelenkt wird (hier: unter 45 ° nach links oben) und nach dem Abbrechen der Strömung stehen bleibt (6). Nun setzt die Strömung in der Gegenrichtung ein und zieht die Luftblase 102 mit, bis sie auf die Rückseite der ersten Reliefstruktur 101 trifft (7), von dieser erneut abgelenkt wird (hier: unter 45 ° nach links unten) und in die als Vertiefung 105 ausgebildete Reliefstruktur 101 eintritt (8). In dieser Vertiefung 105 ist die Luftblase 102 dann gefangen und kann nur noch innerhalb dieser engen Grenzen der Pendelströmung folgen (9). Sind bereits andere Luftblasen in der Vertiefung 105 blockiert, so wird oft ein Aggregieren der vorhandenen Luftblasen oder sogar ein Fusionieren derselben beobachtet. Diese beiden Vorgänge erhöhen zusätzlich die Wahrscheinlichkeit, dass keine der Luftblasen die Vertiefung 105 wieder verlassen kann.
- Die erfindungsgemässen Reliefstrukturen 101 (Erhebungen und Vertiefungen) am Deckel bzw. an der Vorrichtung 1 weisen bevorzugt eine Höhendifferenz zur sonst ebenen Oberfläche 14 des Deckels bzw. der Vorrichtung 1 von maximal 1/3 der bevorzugten Spalthöhe von 30 µm bis 200 µm auf. Speziell bevorzugt sind Höhendifferenzen von 30 µm bei Vertiefungen und von 20 µm bei Erhebungen. Diese Reliefstrukturen 101 können in die Vorrichtung 1 während dem Herstellungsprozess (z.B. Spritzguss, Bearbeitung von Stangenmaterial) eingeformt werden. Vertiefungen können auch nachträglich eingearbeitet (z.B. mittels Fräsen). Auch Erhebungen können nachträglich zum eigentlichen Herstellungsprozess der Vorrichtung 1 aufgebracht (z.B. mittels Kleben bzw. Deponieren von Harzen) werden. Dies kann z.B. mittels einer Schablone oder mittels auf Haftstreifen vorgefertigten Halbfabrikaten geschehen.
- Auch Objektträger 3 können mit Reliefstrukturen 101 versehen sein, seien dies nun Vertiefungen 105 und/oder Erhebungen 108. Bevorzugt werden die Reliefstrukturen 101 auf den Objektträgern 101 entsprechend den zu erwartenden Probenverteilungen auf deren Oberfläche 5 angeordnet. So können z.B. quadratische sogenannte "low density arrays" durch kanalartige Vertiefungen getrennt sein. Auch können die Objektträger 3 eine Dichtung umfassen, die ein Teil des Objektträgers ist oder die auf diesem angeordnet ist. Solche Dichtungen können z.B. im Zweikomponenten-Spritzgussverfahren mit Objektträgern aus Kunststoff hergestellt werden. Das Aufspritzen von solchen, bevorzugt weichen Dichtungen 4 auf Glasobjektträger ist ebenfalls möglich. Ergänzend kann die Vorrichtung 1, bzw. der den Hybridisierraum 2 abschliessende Deckel, eine harte Dichtung 4 zum Aufrechterhalten der definierten Spaltbreite bzw. Höhe des Hybridisierraums umfassen. Auch die Verwendung von z.B. ebenfalls im Zweikomponenten-Spritzgussverfahren hergestellten Verbunddichtungen mit einer weichen (dichtenden) Komponente und einer harten (die Spalthöhe definierenden) Komponente ist denkbar. Dabei spielt das Material der Vorrichtung 1 (vorzugsweise Polysulfon) eine eher untergeordnete Bedeutung.
- Jede ringförmige Anordnung bzw. Ring mit Dichtfunktion wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als O-Ring bezeichnet. So ein O-Ring kann wahlweise einen z.B. runden, elliptischen oder vieleckigen Querschnitt aufweisen oder auch als Dichtlippe ausgeformt sein.
- Wesentlich ist, dass zumindest im Bereich des Hybridisierraums 2 die Oberfläche 5 des Objektträgers 3 im Mittel planparallel zu der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 angeordnet ist. Grundsätzlich ist der Hybridisierraum 2 jedoch nicht auf eine annähernd rechteckige Grundfläche angewiesen, wie dies in den Figuren 2 und 3 gezeigt wird. In von der rechteckigen Grundfläche abweichenden Hybridisierräumen mit z.B. runder Form, können die Vertiefungen 105 entsprechend entlang der Dichtung 4 angeordnet werden. Auch Erhebungen 108 können entsprechend der vorliegenden Erfindung in einer z.B. tangentialen Agitationsrichtung angeordnet werden. Ebenso muss die Vorrichtung 1 für das Beeinflussen der Luftblasen nicht unbedingt transparent sein oder transparente Teile aufweisen.
- Falls in einem Hybridisiermedium regelmässig besonders viele aber sehr kleine Blasen auftreten, deren Durchmesser wesentlich kleiner ist als der Abstand zwischen Vorrichtung 1 und Objektträger 3, können diese Luftblasen durch ein in die Oberfläche der 14 Vorrichtung 1 eingekratztes Gittermuster an der Stelle ihres Entstehens blockiert werden. So wird verhindert, dass die kleinen Luftblasen durch Aggregation oder Fusion grössere Gebilde formen, welche die Hybridisierungsreaktion irritieren könnten.
- Die Bezugszeichen bezeichnen jeweils gleiche Merkmale, auch wenn nicht zu jeder Figur alle Merkmale ausdrücklich benannt werden. Beliebige Abwandlungen und Kombinationen der hier offenbarten Varianten gehören mit zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Insbesondere können die Vorrichtung 1, der Objektträger 3, oder auch beide dieser Komponenten Reliefstrukturen 101 aufweisen, seien dies nun Vertiefungen 105 und/oder Erhebungen 108.
Claims (21)
- Vorrichtung (1) zum Bereitstellen eines spaltförmigen Hybridisierraums (2) für die Hybridisierung von auf einem Objektträger (3) immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, wobei die Vorrichtung (1) gegenüber diesem Objektträger (3) bewegbar ausgebildet ist und eine ringförmige Dichtfläche (4) zum Abschliessen des Hybridisierraums (2) durch Beaufschlagen einer Oberfläche (5) dieses Objektträgers (3), Leitungen (6,6') zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum (2) hinein bzw. aus dem Hybridisierraum (2) heraus sowie eine Musterzuführung (7) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (1) einen Hybridisierraum (2) begrenzt, der an zumindest einer gegen das Innere dieses Hybridisierraums (2) gerichteten Oberfläche (5,14) der Vorrichtung (1) und/oder des Objektträgers (3) Reliefstrukturen (101) zum Leiten und/oder Blockieren von Luftblasen (102) aufweist.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ringförmige Dichtfläche (4) als Ring (103) mit Dichtfunktion oder als Stufe (104) ausgebildet ist.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ring (103) als O-Ring oder als Dichtlippe ausgebildet ist.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe (104) in der Oberfläche (14) der Vorrichtung (1) oder in der Oberfläche (5) des Objektträgers (3) ausgebildet ist.
- Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie an ihrer gegen das Innere des Hybridisierraums (2) gerichteten Oberfläche (14) im Bereich der beiden einander gegenüber liegenden Enden des Hybridisierraums (2) je einen Querströmkanal (15,15') aufweist.
- Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reliefstrukturen (101) als Vertiefungen (105) zum Blockieren von Luftblasen (102) ausgebildet, in Grenzbereichen (106) des Hybridisierraums (2) und entlang zumindest eines Teils der Dichtfläche (4) angeordnet und frei von Leitungen (6,6',7) sind.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen (105) links und rechts des Hybridisierraums (2) entlang der Dichtfläche (4) und zumindest durch Stege (107) von den Querströmkanälen getrennt angeordnet sind.
- Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Agitationseinrichtung (8) zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche (5) des Objektträgers (3) immobilisierten Proben umfasst.
- Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Reliefstrukturen (101) als Erhebungen (108) zum Leiten von Luftblasen (102) ausgebildet und im wesentlichen über den ganzen Hybridisierraum (2) verteilt angeordnet sind.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhebungen (108) regelmässig und in einem verschränkten Raster (109) angeordnet sind.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der verschränkte Raster (109) orthogonal und um 45 ° verdreht zu einer Fliessachse (110) angeordnet ist.
- Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Reliefstrukturen (101) als Vertiefungen (105) zum Blockieren und als Erhebungen (108) zum Leiten von Luftblasen (102) ausgebildet und im wesentlichen über den ganzen Hybridisierraum (2) verteilt angeordnet sind.
- Vorrichtung (1) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen (105) und Erhebungen (108) in ihrer Grösse und Verteilung aufeinander abgestimmt sind und zumindest teilweise ineinander übergehen.
- Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Agitationseinrichtung (8) zumindest eine Membran (9) umfasst, welche einen Druckraum (10), der über eine Leitung (6") mit einem Druckfluid befüllbar ausgebildet ist, von einem Agitationsraum (11), der über eine Agitationsleitung (12) mit dem Hybridisierraum (2) verbunden ist, trennt.
- Verfahrenseinheit (18) zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, welche zumindest eine an ein Temperatursteuergerät angeschlossene Temperaturkontrollplatte (20) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest eine Vorrichtung (1) gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 umfasst.
- Verfahrenseinheit (18) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtungen (1) in Vierergruppen angeordnet sind, wobei die Temperaturkontrollplatte (20) jeder Vierergruppe zur Aufnahme eines vier Objektträger (3) tragenden Rahmens (21) ausgebildet ist.
- System (38) zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest eine Verfahrenseinheit (18) nach einem oder beiden der Ansprüche 15 oder 16, ein Zentralsteuergerät, einen Monitor sowie mit den Einheitsleitungen (23,23', 23") und den Leitungen (6,6'6") kommunizierende Behälter zum Aufbewahren von Reagenzien bzw. zum Sammeln von Abfällen umfasst.
- System (38) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Pipettierautomaten umfasst mit welchem Muster in Musteraufnahmegefässe der Vorrichtungen (1) abgegeben werden können, wobei der Pipetierautomat über das Zentralsteuergerät ansteuerbar bzw. regelbar ist.
- Verfahren zum Beeinflussen von Luftblasen in einer Vorrichtung (1) zum Bereitstellen eines spaltförmigen Hybridisierraums (2) für die Hybridisierung von auf einem Objektträger (3) immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, wobei die Vorrichtung (1) gegenüber diesem Objektträger (3) bewegbar ausgebildet ist und eine ringförmige Dichtfläche (4) zum Abschliessen des Hybridisierraums (2) durch Beaufschlagen einer Oberfläche (5) dieses Objektträgers (3), Leitungen (6,6') zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum (2) hinein bzw. aus dem Hybridisierraum (2) heraus sowie eine Musterzuführung (7) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass im Hybridisierraum (2) vorhandene Luftblasen (102) durch Reliefstrukturen (101) geleitet und/oder blockiert werden, wobei diese Reliefstrukturen (101) an zumindest einer gegen das Innere dieses Hybridisierraums (2) gerichteten Oberfläche (5,14) der Vorrichtung (1) und/oder des Objektträgers (3) angeordnet sind.
- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Luftblasen (102) durch eine Agitationseinrichtung (8) zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche (5) des Objektträgers (3) immobilisierten Proben bewegt werden, wobei diese Luftblasen (102) in Reliefstrukturen (101) in der Form von Vertiefungen (105) gefangen werden.
- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Luftblasen (102) durch eine Agitationseinrichtung (8) zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche (5) des Objektträgers (3) immobilisierten Proben bewegt werden, wobei diese Luftblasen (102) durch Reliefstrukturen (101) in der Form von Erhebungen (108) geleitet und in Reliefstrukturen (101) in der Form von Vertiefungen (105) gefangen werden.
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