EP1392352A1 - Utilisation d'un antioxydant pour le traitement et/ou la prevention des affections oculaires de surface - Google Patents

Utilisation d'un antioxydant pour le traitement et/ou la prevention des affections oculaires de surface

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Publication number
EP1392352A1
EP1392352A1 EP02745499A EP02745499A EP1392352A1 EP 1392352 A1 EP1392352 A1 EP 1392352A1 EP 02745499 A EP02745499 A EP 02745499A EP 02745499 A EP02745499 A EP 02745499A EP 1392352 A1 EP1392352 A1 EP 1392352A1
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EP
European Patent Office
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lipoic acid
eye
alpha
sod
Prior art date
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Withdrawn
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EP02745499A
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German (de)
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Inventor
Marie-Thérèse Droy-Lefaix
Christophe Baudouin
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics

Definitions

  • the invention relates to the use of an antioxidant chosen from group 5 consisting of superoxide dismutases (SODs), superoxide dismutase mimetics, derivatives of superoxide dismutases, racemic alpha lipoic acid, enantiomers of alpha lipoic acid and mixtures of these antioxidants, for the manufacture of a medicament intended for the treatment and / or prevention of ocular surface conditions, in humans or
  • the ocular surface is the transition mucosa between the deep ocular medium and the external medium. It is necessary to maintain the integrity of the cornea, transparent eye window open to the outside for the transmission of images to the retina, the loss of its transparency being synonymous with blindness,
  • the ocular surface As an anatomical and functional barrier, protecting the eye from external aggressors. It is formed by a triad, the cornea, the tear film and the conjunctiva (Hoang-Xuant T 1998, Pouliquen Y. 1991, Rigal D., 1993, Baudouin Ch. 1998).
  • the corneal epithelium provides a barrier function necessary for the protection of the underlying corneal constituents and of the endocular environment.
  • the tear film consists of three layers: a lipid layer 0.1 ⁇ m thick, an aqueous intermediate layer 7 ⁇ m and a layer
  • mucus secreted by the goblet cells present in the conjunctival epithelium spreads over the ocular surface. It is related to the apical cytoplasmic membrane of the surface cells via the glycocalyx.
  • the tear film acts by physico-chemical properties
  • Tears actively participate in the non-specific defense mechanisms of the cornea thanks to the presence of lactoferrin, lysosyme and immunoglobulins. To these non-specific means brought by tears are added the specific elements of the conjunctival tissue.
  • the lacrimal mucus, glycolipids and glycoproteins complex of the epithelial plasma membranes conditions the quality of the coma surface.
  • the epithelial surface is hydrophobic and the aqueous phase of the tears, instead of spreading, is deposited in drops.
  • the mucin by decreasing the surface tension allows the aqueous component of the tears to spread and be adsorbed by the epithelial surface, thus maintaining a stable tear film between each blink.
  • any abnormality in the mucus layer will compromise the stability of the tear film and cause it to rupture to form dry spots and this very quickly after the effect of blinking resurfacing.
  • Apical expansions, such as microvilli, microplates of surface cells by increasing the adhesion of the tear film thus contribute to better stability of the tear film.
  • the alteration of this como-conjunctival surface promotes bacterial adhesion to the epithelial surfaces.
  • the cornea also has the conjunctiva.
  • the conjunctiva is a vascularized mucous membrane that covers the surface of the globe and the posterior surface of the upper and lower eyelids. It is responsible for the secretion of mucus essential for the stability of the tear film and the Comean transparency.
  • Oxidative stress plays a major role through oxygenated free radicals, species highly toxic to the mucous membranes, due to their high content of polyunsaturated fatty acids.
  • Free radicals are chemical species having on their peripheral orbital an electron not coupled, celibate, giving them a great instability compared to the presence of two electrons in periphery (Pryor ' WA.
  • the primary radicals are the superoxide anion (0 2 .-), the starting point of the radical chains starting from molecular oxygen.
  • the superoxide anion (0 2 .-) releases hydrogen peroxide (H 2 0 2 ) into the medium.
  • H 2 0 2 is then converted into a hydroxyl radical (OH.), A very reactive species.
  • Nitric oxide Is a simple molecule and a free radical centered on the nitrogen atom. It is formed in vivo by the constitutive NO synthases (NOS) but under certain pathological conditions, another NOS can be expressed, it is the inducible NOS.
  • N0 2 and N 2 0 3 are qualified as reactive nitrogen species, responsible for nitrosative stress.
  • the superoxide anion (0 2 .-) can react with nitrogen monoxide (NO.)
  • NO. nitrogen monoxide
  • ONOO- peroxynitrite anion
  • Secondary radicals come from the membrane lipid peroxidation of polyunsaturated fatty acids (arachidonic acid for example) which are the most sensitive targets.
  • This lipid peroxidation is a chain reaction initiated by the hydroxyl radical (OH.) With the carbon chain of a polyunsaturated fatty acid (L) thus forming an alkyl radical (L.).
  • O 2 molecular oxygen
  • the alkyl radicals (L.) lead to the release of peroxyl (ROO.) And alkoxyl (RO.) Radicals, during propagation reactions.
  • ROO. peroxyl
  • RO. alkoxyl Radicals
  • Oxidative attacks are directed on the side groups or on the asymmetric carbon of the amino acids.
  • carbonyl groups by the direct oxidation of amino acids is considered to be one of the major oxidative modifications of proteins. These carbonyl groups are used as markers for the oxidation of proteins (Dean RT et al. 1997).
  • the bases of DNA are very sensitive to the action of biological oxidants.
  • the superoxide anion (0 2 .-) can oxidize DNA through the formation of the hydroxyl radical (OH.) In the presence of iron (Henle ES and Linn S. 1997).
  • OH. hydroxyl radical
  • iron iron
  • Free radicals thus have deleterious effects on the cells of the cornea and conjunctiva, ranging from the presence of erosions to severe ulcers, very disabling.
  • Environmental factors are permanent sources of attack on the ocular surface.
  • Blepharitis and ocular rosacea are also frequent causes of qualitative dry eye, with infectious and inflammatory components. These conditions lead to a dysfunction of the Meibonian glands which disturbs the composition of the lipid phase of the tear film and increases the rate of evaporation of tears. These phenomena manifest themselves clinically by a shortening of the GOAL (resistance to the stretching of tears and lead to epithelial hyperosmolarity. These meibomian dysfunctions, result in cellular suffering, rupture of the intercellular junctions, loss of goblet cells and probably a deficit secretion of mucus by conjunctival cells (Toda I. et al. 1995).
  • a common dryness is observed by degenerative atrophy of the lacrimal glands, treated with eye drops, unable to relieve patients. Where irritant eye drops accumulate, particularly in the area of lower palpebral or nasal cleft, a toxic effect may be observed.
  • preservatives such as benzalkonium chloride, quaternary ammoniums. These preservatives also have a significant degree of toxicity through the production of free radicals. This results in reduced resistance to tear stretching, direct toxicity to epithelial cells, with epithelial erosions and an inflammatory reaction. It should be noted that the half-life of benzalkonium is 20 hours and that significant levels of preservatives persist 168 hours after instillation of a single drop (De Saint Jean et al. 1999).
  • the inflammatory reaction is an essential component of dry eye syndromes. It is therefore necessary to develop treatments adapted to dry eye syndrome and much more generally to affections of the ocular surface.
  • topical products containing preservatives (antiseptic substances) on the surface of the eye can modify the balance of the ocular surface and be at the origin of serious anomalies of the conjunctiva and the cornea which can develop at low noise and only appear very late, sometimes in completely unexpected ways.
  • BAC Benzalkonium chloride
  • racemic alpha-lipoic acid or its R + / R " enantiomers is an antioxidant which has been used in particular for protection against UV rays, peripheral neuropathies, certain lipodistrophies, and for slowing the replication of HIV.
  • compositions for oral administration for its protective effects in the retina, in age-related degeneration, glaucoma and increased pressure.
  • ocular that is to say for affections not of the ocular surface but of the posterior segment of the eye.
  • SODs superoxide dismutases
  • Cu / Zn SODs are used in cosmetics and for the treatment of cancers, in which case they are administered intravenously.
  • the object of the invention is to enable not only a basic treatment of the affections of the ocular surface which can cause dryness of the eye but also the prevention of these affections.
  • the invention provides the use of an antioxidant chosen from the group consisting of superoxide dismutases (SODs), mimetics, superoxide dismutases, derivatives of superoxide dismutases, racemic alpha lipoic acid, l enantiomeres R + of alpha-lipoic acid, enantiomer R " of alpha-lipoic acid and mixtures of these compounds, for the manufacture of a medicament intended for the treatment and / or prevention of ocular affections surface in humans or animals.
  • SODs superoxide dismutases
  • mimetics superoxide dismutases
  • derivatives of superoxide dismutases derivatives of superoxide dismutases
  • racemic alpha lipoic acid l enantiomeres R + of alpha-lipoic acid
  • enantiomer R " of alpha-lipoic acid and mixtures of these compounds
  • the antioxidant is an SOD and / or a derivative and / or a mimetic thereof.
  • the SOD is a wheat SOD.
  • SOD is present in the drug at a concentration between 1 jug / ml and 500 jug / mJ, preferably between 25 ⁇ g / ml and 50 ⁇ g / ml.
  • the antioxidant is racemic alpha-lipoic acid and / or one of its R + , R ⁇ enantiomers
  • racemic alpha lipoic acid it is preferred, however, in this embodiment, to use racemic alpha lipoic acid.
  • the racemic alpha-lipoic acid or one of its R + , R " enantiomers is present in the drug at a concentration of between 0.05 ⁇ g / ml and per 200 ⁇ g / ml, preferably between 0.5 ⁇ g / ml and 5 ⁇ g / ml.
  • the antioxidant is a mixture of racemic alpha-lipoic acid, and / or one of its R + , R " enantiomers, and one or more SODs, and / or a derivative and / or mimetic thereof.
  • alpha-lipoic acid, and / or its R + , R " enantiomers is present in the drug in a concentration of 0.05 ⁇ g / ml to 200 ⁇ g / ml, preferably of 0.5 ⁇ g / ml to 5 ⁇ g / ml and the SOD, and / or its derivative and / or its mimetic, is present in the drug at a concentration of between 1 ⁇ g / ml and 500 ⁇ g / ml, preferably between 25 ⁇ g / ml and 50 ⁇ g / ml.
  • the ocular surface conditions treated are those which cause dryness of the eye.
  • the surface eye conditions treated can be an alteration of corneal cells.
  • the treated eye conditions can be due to exposure to environmental agents such as ozone, nitrogen oxide, sulfur dioxide, volatile organic compounds and particles released by diesel engines. They may also have been caused by prolonged exposure to a computer screen, television screen or video monitor.
  • environmental agents such as ozone, nitrogen oxide, sulfur dioxide, volatile organic compounds and particles released by diesel engines. They may also have been caused by prolonged exposure to a computer screen, television screen or video monitor.
  • the surface eye conditions treated are those due to the wearing of lenses.
  • the eye conditions treated are those due to exposure to salt water and / or chlorinated water.
  • These eye conditions can also be due to exposure to ultraviolet A and / or B and / or C, X-rays.
  • the treated eye conditions can also be due to exposure to bacteria, viruses and / or fungi.
  • Gougerot-Sjôgren syndrome, blepharitis and ocular rosacea can also be treated.
  • eye conditions due to exposure to a preservative (s), present (s) in compositions administered to the eye by the topical route are not only treated but also, can be prevented thanks to the invention, and more particularly when the preservative is benzalkonium chloride.
  • the medicament produced by the invention may be in the form of an eye drop, an ointment or a gel and may also contain pharmaceutically acceptable excipients.
  • FIG. 1 represents a fluorescence peak, typical and representative of the inflammation of conjunctival cells, emitted by the DNA of conjunctival cells, this peak being obtained by analysis in flow cytofluorometry, and
  • the affections of the ocular surface concerned by the invention can be due to: - exposure to environmental agents such as city photochemical mists (ozone, nitrogen oxides, sulfur dioxide, volatile organic compounds, diesel particles),
  • UVs A, B, C ultraviolet
  • X-rays X-rays
  • ⁇ rays radioactive radiation
  • the pharmaceutical composition obtained by the use of these antioxidants will therefore contain, as active ingredient, one or more antioxidants and pharmaceutical excipients acceptable for local application in the eye.
  • antioxidants are superoxide dismutases, mimics of superoxide dismutases, derivatives of superoxide dismutases, racemic alpha lipoic acid or its enantiomers
  • SODs superoxides dismutases also called SODs, represent one of the three main classes of antioxidant enzymes with catalase and glutathione peroxidase in the body (Fridovich 1986).
  • Superoxide dismutases or SODs are antioxidant metallo-enzymes discovered in 1969 by Me Cord and Fridovich, capable of catalyzing the dismutation reaction of the superoxide anion (0 2 .-) into peroxide of hydrogen (H 2 0 2 ) and of oxygen in an aqueous medium according to the following reaction, which requires the presence of iron.
  • Cu / Zn SODs usually located in the cytosol of eukaryotic cells, in the extracellular fluid of mammals and in certain bacteria, the Mn SODs in prokaryotes or in the mitochondria and Fe SODs containing iron, localized in anaerobic bacteria and prokaryotes.
  • the Cu / Zn SODs group together the Cu / Zn SODs I and I
  • human Cu / Zn SOD in recombinant form
  • Cu / Zn SODs from plants either extraction, wheat, melon, tomato, pollen , spinach or rice, either recombinant.
  • Cu / Zn SODs of bacterial extraction including that of Saccharomyces Cerevisae and Cu / Zn SODs of animal extraction of bovine and Cu / Zn SODs of recombination.
  • the Mn SODs group together the Mn SODs I and II which exist in the form of extraction or recombinant.
  • Fe SODs exist in extracted or recombinant form.
  • Cu / Zn SODs are more particularly preferred for use in the invention.
  • SODs are enzymes with a molecular point of 32 kd. They are composed of two subunits, each containing a copper and zinc atom, linked noncovalently (Relier GA et al. 1991).
  • the complexes mimicking the effects of the different SODs at the extra or intra cellular level that is to say the mimetics of SODs are also compounds which are particularly preferred in the invention because they have better permeability and stability.
  • trans-bis (naproxenato) bis (3-Pyridylmethanol) monomeric copper II complexes derived from bioflavonoids such as rutin containing iron and copper, 1, 4, 7, 10, 13-pentoazacyclopentadecane, and SODase are particularly preferred.
  • heterologous SODs appear to exhibit significantly higher anti-inflammatory activity than the homologs.
  • These heterologous SODs which have a low incidence of immunological nature, do not induce a proinflammatory reaction and protect the cells from degeneration by inhibiting the formation of oxygenated free radicals. Consequently, the present invention proposes, because of the positive effects of SOD, to use it alone or in the presence of a pharmaceutical vehicle in the treatment of affections of the ocular surface.
  • SODs are molecules that are quickly eliminated from the cornea by tears. They cannot thus exert their full action when instilled in the eye.
  • the invention proposes to use as antioxidant alpha-lipoic acid and / or one of its R + or R " enantiomers.
  • Alpha lipoic acid discovered in 1937 and chemically characterized by Lester Reed in 1951, is known by a variety of names including 2-dithiolane-3 pentanoic acid, valeric acid 1,2 dithiolane 3, l thioctic acid. It is an antioxidant synthesized by the human body but also present in small quantities in potatoes, spinach and red meat.
  • alpha lipoic acid is a racemic form (alpha lipoic RAC, alpha lipoic DL) but it is also active by its R + or R " enantiomers. The most active is R + alpha lipoic acid or R- acid. thioctic or alpha lipoic acid R, dexlipotam 1200 22 2.
  • Alpha lipoic acid and its derivatives can thus be in the form of multiple chemical complexes.
  • DHLA dihydrolipoate
  • LA / DHLA can: - trap free radicals (hydroxyl radical OH., Hypochlorous acid HCLO, oxygen singuletO2, - chelate metals (stable complexes with Cu 2+ , Mn 2+ and Zn 2+ ), - regenerate the oxidized forms of vitamins E, C, glutathione and thioredoxin. In its presence, there is an increase in glutathione in the cells,
  • DHLA also protects from the deleterious effects of ischemia-reperfusion by inhibiting the activity of xanthine oxidase, an enzyme that releases superoxide anion (Prenn JH et al. 1990, 1992, Scheer B. and Zimmer G. 1993, Serbinova E. et al. 1992).
  • racemic alpha lipoic acid and its enantiomers are particularly advantageous active ingredients for treating and / or preventing surface eye conditions in humans or animals.
  • alpha-lipoic acid and its enantiomers alone or in combination with one another and, on the other hand, superoxide dismutases, alone or in combination with one another, have been found to be excellent active ingredients for the treatment of ocular surface conditions in humans and animals, it is advantageous to use alpha lipoic acid in combination with one or more of the above-mentioned superoxide dismutases.
  • SODs and alpha lipoic acid are particularly effective active ingredients, to be introduced into a pharmaceutical composition, for the treatment or prevention of affections of the ocular surface.
  • the tests are carried out by cytofiuorometric microtitration in cold light.
  • This new technique makes it possible by purifying the heat energy of the illumination system (infrared and Joule effect) to obtain very low background noise and therefore to have a good signal / noise ratio and good sensitivity. It combines the reproducibility of microplate methods with the sensitivity of cytometric methods, with a very wide detection spectrum (280-870 nm).
  • the microplate is scanned by a light brush of defined wavelength which illuminates each culture well for less than 0.3 seconds, which limits any phenomenon of extinction of the probes.
  • Dichlorofluorescein diacetate test Corneal and / or conjunctival cells of human origin in culture are exposed to various environmental agents to induce the release of free radicals.
  • the active compounds of the invention Cu / Zn SOD or alpha-lipoic acid
  • the fluorogenic probe becomes fluorescent when it binds to hydrogen peroxide.
  • the DCFH-DA solution used is a 20 ⁇ m solution in minimum modified essential medium from Dulbecco (DMEM).
  • DMEM Dulbecco
  • the cultures are then placed for 20 minutes in DMEM containing the probe and then they are extracted in order to measure the production of hydrogen peroxide. The measurement is made directly on the cells in 96-well plates (Debbasch C. et al. 2000).
  • Corneal and conjunctival cells of human origin in culture, exposed to various attacking agents to induce the release of free radicals are treated or not with the active compounds of the present invention (Cu / Zn SOD or alpha-lipoic acid) at different concentrations.
  • the hydroethidine solution used is a 5 ⁇ m solution.
  • the cell cultures are placed for 10 minutes in DMEM containing the probe and then the cells are extracted in order to measure the production of superoxide anion. The measurement is made in 96-well microplates. The analyzes are thus carried out on 5000 cells per well, each measurement being repeated six times. The results are expressed in fluorescence units. The mean fluorescence values are calculated in each group and compared by a non-parametric Mann-Whitney U test.
  • the active compounds of the invention significantly reduce the toxicity of benzalkonium chloride on the cells conjunctival in culture.
  • the active compounds of the invention reduce epithelial erosion.
  • quaternary ammoniums and in particular benzalkonium chloride are present in the vast majority of eye drops, gels and eye ointments, as preservatives.
  • the compounds of the invention which make it possible to counteract the harmful side effects of these preservatives, can therefore be used not only as active principles for curing the affections of the ocular surface already installed, but also as additives to other active ingredients for preventing the side effects of preservatives, both of the quaternary aluminum type and of all the other preservatives which can cause the formation of oxygenated free radicals and therefore apoptosis phenomena, present in the pharmaceutical composition administered.
  • SODs as well as alpha lipoic acid and their mixtures are useful both for curing and for preventing diseases of the ocular surface.
  • the apoptosis induced by benzalkonium chloride was chosen as the model for ocular surface conditions treated and / or prevented by the invention.
  • This apoptosis study is carried out by comparing, by flow cytofluorometry, the percentage of DNA in sub-Gl phase obtained before and after treatment with the compounds of the invention.
  • Apoptosis is characterized by a fragmentation of DNA into identical fragments of 200 basic people.
  • the cells involved in this process therefore have a reduced DNA content.
  • This DNA fragmentation can be measured in situ by flow cytofluorimetry with a DNA dye, propidium iodide.
  • the reduced DNA appears with a lower fluorescence intensity than that of normal cells.
  • cytofluorimetry a peak is obtained as shown in FIG. 1.
  • this peak is divided into three zones denoted M1, peak Gl and phase S and G2M.
  • the number of normal cells appears in the area of peak Gl.
  • cells having a lower fluorescence intensity that is to say those whose DNA has been fragmented, appear below this Gl peak, that is to say in that 'is called the sub-Gl peak located in the area denoted Ml in Figure 1.
  • Apoptosis was induced by adding 0.001%, by volume relative to the total volume of the sample, of benzalkonium chloride (BAC) in the culture medium D-MEM (modified Eagle medium from Dulbecco: references 21885, GibcoBRL products; enriched with 10%, by volume relative to the total volume of the sample, of fetal calf serum and supplemented with 50 mg / ml of streptomycin and 50IU / ml of penicillin) in which conjunctival cells are cultured, in 6-well plates.
  • D-MEM modified Eagle medium from Dulbecco: references 21885, GibcoBRL products; enriched with 10%, by volume relative to the total volume of the sample, of fetal calf serum and supplemented with 50 mg / ml of streptomycin and 50IU / ml of penicillin
  • conjunctival cells were cultured in the culture medium described above and, at 80% confluence, SOD, alpha-lipoic acid and their associations were
  • benzalkonium chloride was added to each well. After 15 minutes of incubation, the supernatants from each well were collected in 15 ml tubes; the cells were detached by the action of 0.25% trypsin for 5 minutes at 37 ° C. and added to their respective supernatants. The tubes were then centrifuged, then the cells were washed twice in phosphate buffer. The cell pellet was resuspended in phosphate buffer at a concentration of 1 million cells per milliliter.
  • BAC benzalkonium chloride
  • BAC benzalkonium chloride
  • FIG. 2 on the left side are represented the histograms corresponding to the controls and on the right side the histograms corresponding to the cells on which apoptosis has been induced by the addition of benzalkonium chloride (BAC).
  • BAC benzalkonium chloride
  • apha-lipoic acid has a healing effect, and therefore a prevention effect, more important than SOD, and this at much lower concentrations than those of SOD.
  • SODs are giant molecules and that alpha lipoic acid is a smaller molecule which would fit into the spaces between the different SOD molecules and which would thus form a particularly effective association with SOD.
  • compositions containing between 1 ⁇ g / ml to 500 ⁇ g / ml of SOD, preferably containing 25 at 50 ⁇ g / ml SOD for administration by instillation into the eye are very effective.
  • compositions containing racemic alpha-lipoic acid or one of its enantiomers will advantageously be used at concentrations between 0.05 ⁇ g / ml to 200 ⁇ g / ml in a pharmaceutical composition for instillation into the eye.
  • the compositions will contain between 0.05 ⁇ g / ml and 5 ⁇ g / ml of racemic alpha-lipoic acid and / or one of these enantiomers.
  • compositions for the treatment and / or prevention of affections of the ocular surface will contain a mixture of SOD or SOD derivatives or mimetics at the concentrations mentioned above for SOD alone, and alpha- racemic lipoic or in the form of its R + , R " enantiomers at the concentrations cited above for the compositions containing alpha-lipoic acid alone.

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Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique pour le traitement des affections oculaires de surface. Selon l'invention, un antioxydant sélectionné dans le groupe constitué par les SODs, les mimétiques et dérivés de ces SODs, l'acide alpha-lipoïque racémique et ses énantiomères R+, R- ainsi que les mélanges de ces composés, est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des affections oculaires de surface. L'invention trouve application en médecine humaine et vétérinaire.

Description

UTILISATION D'UN ANTIOXYDANT POUR LE TRAITEMENT ET/OU LA PREVENTION DES
AFFECTIONS OCULAIRES DE SURFACE
L'invention concerne l'utilisation d'un antioxydant choisi dans le groupe 5 constitué par les superoxydes dismutases (SODs), les mimétiques de superoxydes dismutases, les dérivés de superoxydes dismutases, l'acide alpha- lipoïque racémique, les énantiomères de l'acide alpha-lipoïque et les mélanges de ces antioxydants, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des affections oculaires de surface, chez l'homme ou
10 l'animal.
La surface oculaire est la muqueuse de transition entre le milieu oculaire profond et le milieu extérieur. Il est nécessaire de maintenir l'intégrité de la cornée, hublot oculaire transparent ouvert sur l'extérieur pour la transmission des images jusqu'à la rétine, la perte de sa transparence étant synonyme de cécité,
15 parfois définitive.
Il faut voir la surface oculaire comme une barrière anatomique et fonctionnelle, protégeant l'œil des agresseurs extérieurs. Elle est formée par une triade, la cornée, le film lacrymal et la conjonctive (Hoang-Xuant T 1998, Pouliquen Y. 1991, Rigal D., 1993, Baudouin Ch. 1998).
20 Par sa structure anatomique et la qualité de l'interface avec le film lacrymal, l'épithélium cornéen assure une fonction de barrière nécessaire à la protection des constituants cornéens sous jacents et du milieu endoculaire.
Le film lacrymal est constitué de trois couches : une couche lipidique de 0,1 μm d'épaisseur, une couche intermédiaire aqueuse de 7 μm et une couche
25 profonde riche en mucus. Ce mucus, sécrété par les cellules caliciformes présentes au sein de l'épithélium conjonctival s'étale sur la surface oculaire. Il est en relation avec la membrane cytoplasmique apicale des cellules superficielles par l'intermédiaire du glycocalyx.
Le film lacrymal agit par des propriétés physico-chimiques et
30 immunologiques. Grâce au clignement, il va drainer et éliminer en permanence les micro-organismes, les corps étrangers et les cellules épithéliales desquamées présentes à la surface coméenne en les enrobant dans le film muqueux du cul de sac conjonctival inférieur. Ce larmoiement bénéfique va contribuer à balayer et à assurer tout le nettoyage de la surface cornéo-conjonctivale en empêchant
35 l'adhérence de germes présents. Au rôle mécanique du flux lacrymal s'ajoute l'intervention du pH et de ses variations ainsi que celle de la température et de l'osmolarité des larmes. Les larmes participent activement aux moyens de défense non spécifiques de la cornée grâce à la présence de lactoferrine, de lysosyme et d'immunoglobulines. A ces moyens non spécifiques apportés par les larmes s'ajoutent les éléments spécifiques du tissu conjonctival.
Le complexe mucus lacrymal, glycolipides et glycoprotéines des membranes plasmiques épithéliales conditionne la qualité de la surface coméenne. En l'absence du film lacrymal, la surface épithéliale est hydrophobe et la phase aqueuse des larmes au lieu de s'étaler se dépose en gouttes. La mucine en diminuant la tension superficielle permet à la composante aqueuse des larmes de s'étaler et d'être adsorbée par la surface épithéliale, maintenant ainsi un film lacrymal stable entre chaque clignement.
Toute anomalie de la couche de mucus va compromettre la stabilité du film lacrymal et entraîner sa rupture pour former des taches sèches et ceci très rapidement après l'effet de resurfaçage du clignement. Les expansions apicales, comme les microvillosites, les microplis des cellules superficielles en augmentant l'adhésion du film lacrymal, concourent ainsi à une meilleure stabilité du film de larmes. L'altération de cette surface coméo-conjonctivale favorise l'adhésion bactérienne sur les surfaces épithéliales.
Pour se protéger, la cornée dispose aussi de la conjonctive. La conjonctive est une membrane muqueuse vascularisée qui couvre la surface du globe et de la face postérieure des paupières supérieures et inférieures. Elle est responsable de la sécrétion de mucus essentielle pour la stabilité du film lacrymal et la transparence coméenne.
Elle joue un rôle de défense important et est richement vascularisée. Elle contient de nombreuses cellules immunocompétentes capables d'initier une réaction inflammatoire, d'y participer et de synthétiser des immunoglobulines. De plus, les caractéristiques morphologiques comme les microvillosites et biochimiques comme l'activité enzymatique des cellules épithéliales les rendent capables d'englober et de phagocyter des particules étrangères comme des virus (Hoang-Xuan T. et al.1998). En conséquence, la triade cornée-conjonctive-film lacrymal, qui représente un ensemble d'une extrême richesse physiologique, est susceptible de faire l'objet d'une inflammation consécutive :
- à l'agression de la surface oculaire par des agents environnementaux, - à une altération qualitative ou quantitative du film lacrymal (syndrome de l'œil sec),
- à une allergie,
- à une infection chronique de la surface oculaire.
Cette inflammation est à l'origine d'une libération de radicaux libres, espèces chimiques très réactives (Lemp MA.1999, Savouré N. 1993). Ces radicaux libres provoquent une sécheresse de l'œil par un effet direct sur le film de larmes et \a cornée.
Dans la pathologie de la surface oculaire, le stress oxydatif tient une place majeure par le biais des radicaux libres oxygénés, espèces hautement toxiques pour les muqueuses, en raison de leur forte teneur en acides gras polyinsaturés. Les radicaux libres sont des espèces chimiques ayant sur leur orbitale périphérique un électron non couplé, célibataire, leur conférant une grande instabilité comparée à la présence de deux électrons en périphérie (Pryor' WA.
1986, Savouré N. 1993). Les radicaux primaires sont l'anion superoxyde (02.-), point de départ des chaînes radicalaires à partir de l'oxygène moléculaire. La réduction de l'oxygène moléculaire (02) par gain d'un électron, aboutit à la libération d'un anion superoxyde (02.-), forme agressive de l'oxygène. Par réaction de dismutation, l'anion superoxyde (02.-) libère dans le milieu du peroxyde d'hydrogène (H202). H202 est ensuite converti en radical hydroxyle (OH.), une espèce très réactive.
Cette réaction nécessite la présence de métaux de transition comme le fer à l'état ferreux ou le cuivre. L'hémoglobine serait un grand pourvoyeur de fer ferrique dans l'oxydation radicalaire.
Le monoxyde d'azote (NO.) est une molécule simple et un radical libre centré sur l'atome d'azote. Il est formé in vivo par les NO synthases (NOS) constitutives mais dans certaines conditions pathologiques, une autre NOS peut être exprimée, il s'agit de la NOS inductible.
En présence d'oxygène moléculaire (02) le monoxyde d'azote (NO.) forme le dioxyde d'azote (N02) lequel réagissant avec une molécule de (NO.) produit le trioxyde nitreux (N203). N02 et N203 sont qualifiées d'espèces réactives de l'azote, responsable du stress nitrosatif.
Par ailleurs, l'anion superoxyde (02.-) peut réagir avec le monoxyde d'azote (NO.) pour former l'anion peroxynitrite (ONOO-) un oxydant puissant capable d'induire un stress oxydatif menant à l'oxydation de nombreuses cibles cellulaires (Beckman JS. and Koppenol WH. 1996, Squadrito GL. and Pryor WA.
1998).
Les radicaux secondaires sont issus de la peroxydation lipidique membranaire des acides gras polyinsaturés (acide arachidonique par exemple) qui sont les cibles les plus sensibles. Cette peroxydation lipidique est une réaction en chaîne initiée par le radical hydroxyle (OH.) avec la chaîne carbonée d'un acide gras polyinsaturé (L) formant ainsi un radical alkyle (L.). En présence d'oxygène moléculaire (02), les radicaux alkyles (L.) conduisent à la libération de radicaux peroxyles (ROO.) et alcoxyles (RO.), au cours des réactions de propagation. La présence de métaux de transition comme le fer et le cuivre permet l'entretien de ces réactions de propagation. Ces peroxydes sont à l'origine d'une profonde désorganisation de l'architecture membranaire, avec de graves conséquences pour les interactions moléculaires (Fridovich I. 1997).
L'oxydation des protéines est principalement initiée par le radical hydroxyle (OH.) mais dépend aussi de la présence d'anion superoxyde (02.-). Les attaques oxydatives sont dirigées sur les groupements latéraux ou sur le carbone asymétrique des acides aminés.
La formation de groupements carbonyles par l'oxydation directe d'acides aminés est considérée comme une des modifications oxydatives majeures des protéines. Ces groupements carbonyles sont utilisés comme des marqueurs de l'oxydation des protéines (Dean RT et al. 1997).
Les bases de l'ADN sont très sensibles à l'action d'oxydants biologiques. L'anion superoxyde (02.-) peut oxyder l'ADN par le biais de la formation du radical hydroxyle (OH.) en présence de fer (Henle ES et Linn S. 1997). En conséquence, une libération accrue de radicaux libres altère la qualité des larmes en dégradant les protéines sériques comme l'albumine, le lysosyme, la lactoferrine, les immunoglobulines et les glycoprotéines du mucus. Les radicaux libres ont ainsi des effets délétères sur les cellules de la cornée et de la conjonctive, allant de la présence d'érosions à de sévères ulcérations, très invalidantes. Les facteurs environnementaux sont des sources permanentes d'at aque de la surface oculaire.
Dans ce domaine, les bactéries, les virus, les corps étrangers, la forte évaporation des larmes par un long travail sur ordinateur, les polluants atmosphériques des brouillards photochimiques sont de grands pourvoyeurs de radicaux libres.
Des dizaines de milliers de patients se plaignent chaque année de leurs effets délétères sur la surface oculaire. Ainsi plus de 10 millions de personnes aux USA, 15 % de la population âgée de 65 ans souffrent de l'agression de la surface oculaire.
Sur le plan clinique, la sécheresse oculaire est responsable de sensations souvent négligées de fatigue oculaire, d'un simple besoin de clignement, de sensations de picotements, de corps étrangers, jusqu'à des sensations plus sévères de brûlures, de douleurs, et en cas d'apparition de kératites superficielles douloureuses, de déficits visuels par l'epitheliopathie induite, et d'opacification coméenne.
La sévérité de la sécheresse permet de distinguer en pratique clinique :
- les syndromes secs simples provoqués par les facteurs environnementaux, favorisés par un terrain sous-jacent comme la ménopause et aggravés par un environnement agressif (Azzurolo A. et al. 1995),
- la maladie chronique de la surface oculaire, la kératoconjonctivite sèche où la souffrance cellulaire chronique aboutit à de véritables cercles vicieux pathogéniques souvent inextricables.
Dans les affections de la surface oculaire, les deux grands développements physiopathologiques sont la composante immuno-inflammatoire de l'atteinte oculaire et les phénomènes apoptotiques induits à la fois par l'inflammation et certains collyres substitutifs (Sullivan DA. et al. 1999).
Malgré sa symptomatologie souvent intense, son film lacrymal instable et parfois sa kératite, l'œil sec reste un oeil blanc bien différent des yeux rouges des conjonctivites chroniques. Cependant l'inflammation chronique est toujours omniprésente dans l'œil sec, que ce soit une inflammation primaire comme dans le syndrome auto-immun de Gougerot-Sjôgren ou secondaire à la kératite sèche, ou associée à une allergie oculaire, à une infection virale, à une blépharite ou une rosacée, ou une inflammation iatrogène. Le syndrome de Gougerot-Sjôgren est une des formes les plus caractéristiques de sécheresse inflammatoire. Il touche non seulement la glande lacrymale principale et aboutit à sa fibrose, mais également l'ensemble de la surface conjonctivale qui baigne dans un milieu riche en médiateurs inflammatoires. L'activation locale du système immunitaire entraîne une infiltration de la conjonctive par des cellules inflammatoires et modifie le métabolisme des cellules épithéliales. Celles-ci vont exprimer des marqueurs immunitaires, sécréter des cytokines et des radicaux libres. C'est cette inflammation généralisée qui fait la gravité du syndrome de Gougerot-Sjôgren (Jones DT et al. 1998).
L'induction d'un syndrome sec par une kérato-conjonctivite virale ou dans les suites d'une conjonctivite aiguë ou subaiguë est fréquente. Ces affections entraînent une perte parfois définitive des cellules à mucus de la surface conjonctivale même après un traitement par des collyres, les patients se plaignent de symptômes traînants, proches des sensations ressenties lors de la maladie initiale. Ils croient que la maladie n'a pas été soignée alors qu'il s'agit d'une sécheresse secondaire, souvent aggravée par des traitements agressifs permanents, qui enferment les patients dans un cercle vicieux.
Des infections chroniques sont de même fréquemment responsables d'une sécheresse oculaire sévère, d'autant plus difficile à traiter que les signes infectieux sont peu spécifiques, cachés ou méconnus (Hoang-Xuant T et al. 1998).
Les blépharites et la rosacée ocuiaire sont également des causes fréquentes de sécheresse oculaire qualitative, avec des composantes infectieuses et inflammatoires. Ces affections entraînent un dysfonctionnement des glandes de Meibonius qui perturbe la composition de la phase lipidique du film lacrymal et augmente le taux d'évaporation des larmes. Ces phénomènes se manifestent cliniquement par un raccourcissement du BUT (résistance à l'étirement des larmes et entraînent une hyperosmolarité épithéliale. Ces dysfonctionnements meibomiens, se traduisent par une souffrance cellulaire, une rupture des jonctions intercellulaires, une perte des cellules caliciformes et probablement un déficit de sécrétion du mucus par les cellules conjonctivales (Toda I. et al. 1995).
Une sécheresse banale s'observe par atrophie dégénérative des glandes lacrymales, traitée par des collyres substitutifs, incapables de soulager les patients. Là où s'accumulent les collyres irritants, particulièrement dans l'aire de la fente palpébrale ou nasale inférieure, un effet toxique peut être observé. Chez les patients présentant des glaucomes à angle ouvert ou secondaires, l'utilisation dans les collyres de conservateurs comme le chlorure de benzalkonium, ammoniums quaternaires. Ces conservateurs présentent aussi un degré significatif de toxicité passant par la production de radicaux libres. Il s'en suit une réduction de la résistance à l'étirement des larmes, une toxicité directe pour les cellules épithéliales, avec des érosions épithéliales et une réaction inflammatoire. Il faut savoir que la demi-vie du benzalkonium est de 20 heures et qu'il persiste des taux significatifs de conservateurs 168 heures après instillation d'une seule goutte (De Saint Jean et al. 1999).
En conséquence, qu'elle soit primitive ou secondaire, la réaction inflammatoire est une composante essentielle des syndromes de l'œil sec. Il est donc nécessaire de mettre au point des traitements adaptés au syndrome de l'œil sec et d'une manière beaucoup plus générale aux affections de la surface oculaire.
Or, à l'heure actuelle, tous les traitements proposés visent à calmer les symptômes des affections de la surface oculaire, c'est-à-dire la sécheresse oculaire et non à véritablement guérir la cause de l'affection qui provoque cette sécheresse oculaire. Ainsi, dès l'arrêt du traitement, les symptômes réapparaissent.
De plus, aucun traitement préventif n'a été proposé pour éviter l'apparition d'une inflammation de la surface oculaire, lorsque l'on sait qu'elle va être exposée à des agents inflammatoires, comme par exemple les conservateurs présents dans les compositions à instiller dans l'œil pour traiter différents états pathologiques.
En effet, l'administration de produits topiques contenant des conservateurs (substances antiseptiques) à la surface de l'œil peut modifier l'équilibre de la surface oculaire et être à l'origine d'anomalies graves de la conjonctive et de la cornée pouvant se développer à bas bruit et ne se manifestant que très tardivement, parfois de manière totalement inattendu.
Les effets toxiques des ammoniums quaternaires sont les mieux étudiés.
Le chlorure de benzalkonium (BAC) entre dans la quasi-totalité des collyres multidoses dont ceux des collyres antiglaucomateux. Même à de très faibles doses, il induit une apoptose cellulaire avec libération de radicaux libres oxygénés. Il altère de manière importante l'épithélium cornéen et stimule l'infiltration de la conjonctive par des cellules inflammatoires.
Par ailleurs, l'acide alpha-lipoïque racémique ou ses énantiomères R+/R" est un antioxydant qui a été utilisé notamment pour la protection contre les UV, les neuropathies périphériques, certaines lipodistrophies, et pour ralentir la réplication du VIH.
Il a également été utilisé en combinaison avec de nombreux autres ingrédients actifs dans des compositions pour administration par voie orale, pour ses effets protecteurs au niveau de la rétine, dans la dégénération liée à l'âge, le glaucome et l'augmentation de la pression oculaire, c'est-à-dire pour des affections non pas de la surface oculaire mais du segment postérieur de l'œil.
Quant aux superoxydes dismutases, ci-après appelées SODs, ce sont des enzymes présentes dans les organismes au niveau extra et intracellulaire.
Les Cu/Zn SODs sont utilisées en cosmétique et pour le traitement des cancers, auquel cas elles sont administrées par voie intraveineuse.
L'invention a pour but de permettre non seulement un traitement de fond des affections de la surface oculaire pouvant entraîner une sécheresse de l'œil mais également la prévention de ces affections.
Par traitement de fond, on entend une véritable guérison et non pas un simple traitement des symptômes dus à l'affection oculaire, tels que la sécheresse de l'œil.
A cet effet, l'invention propose l'utilisation d'un antioxydant choisi dans le groupe constitué par Jes superoxydes dismutases (SODs), Jes mimétiques, de superoxydes dismutases, les dérivés de superoxydes dismutases, l'acide alpha- lipoïque racémique, l'énantiomeres R+ de l'acide alpha-lipoïque, l'enantiomere R" de l'acide alpha-lipoïque et les mélanges de ces composés, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des affections oculaires de surface chez l'homme ou l'animal.
Selon un premier mode de réalisation, l'antioxydant est une SOD et/ou un dérivé et/ou un mimétique de celle-ci.
Dans ce premier mode de réalisation, de préférence, la SOD est une SOD de blé.
Cependant, quelle que soit la SOD, ou le mimétique ou le dérivé de celle- ci utilisée, de préférence, la SOD est présente dans le médicament à une concentration comprise entre 1 jug/ml et 500 jug/mJ, de préférence entre 25 μg/ml et 50 μg/ml.
Selon un second mode de réalisation particulièrement préféré, l'antioxydant est l'acide alpha-lipoïque racémique et/ou l'un de ses énantiomères R+, R\
On préfère cependant, dans ce mode de réalisation, utiliser l'acide alpha- lipoïque racémique.
Dans tous les cas, préférablement, l'acide alpha-lipoïque racémique ou l'un de ses énantiomères R+, R" est présent dans le médicament à une concentration comprise entre 0,05 μg/ml et par 200 μg/ml, de préférence entre 0,5 μg/ml et 5 μg/ml.
Selon un troisième mode de réalisation, également particulièrement préféré, l'antioxydant est un mélange d'acide alpha-lipoïque racémique, et/ou un de ses énantiomères R+, R", et de une ou plusieurs SODs, et/ou d'un dérivé et/ou mimétique de celles-ci.
Dans ce mode de réalisation, préférablement, l'acide alpha-lipoïque, et/ou ses énantiomères R+, R", est présent dans le médicament en une concentration de 0,05 μg/ml à 200 μg/ml, de préférence de 0,5 μg/ml à 5 μg/ml et la SOD, et/ou son dérivé et/ou son mimétique, est présente dans le médicament à une concentration comprise entre 1 μg/ml et 500 μg/ml, de préférence entre 25 μg/ml et 50 μg/ml.
Dans tous les modes de réalisation de l'invention, les affections oculaires de surface traitées sont celles qui entraînent une sécheresse de l'œil.
Plus particulièrement, les affections oculaires de surface traitées peuvent être une altération de cellules de la cornée.
Encore, les affections oculaires traitées peuvent être dues à une exposition à des agents environnementaux tels que l'ozone, l'oxyde d'azote, le dioxyde sulfureux, les composés organiques volatils et les particules libérées par les moteurs diesel. Elles peuvent également avoir été provoquées par une exposition prolongée à un écran d'ordinateur, à un écran de télévision ou un moniteur vidéo.
De plus, les affections oculaires de surface traitées sont celles dues au port de lentilles. Mais encore, les affections oculaires traitées sont celles dues à une exposition à de l'eau salée et/ou à de l'eau chlorée.
Ces affections oculaires peuvent également être dues à une exposition aux ultraviolets A et/ou B et/ou C, aux rayons X. Les affections oculaires traitées peuvent aussi être dues à une exposition à des bactéries, des virus et/ou des champignons.
Le syndrome de Gougerot-Sjôgren, les blépharites et la rosacée oculaire peuvent également être traités.
Les affections oculaires de surface dues à une exposition à des allergènes associée à une réaction inflammatoire et à une dégradation de la surface oculaire peuvent également être traitées.
En particulier, les affections oculaires dues à une exposition à un(des) conservateur(s), présent(s) dans des compositions administrées dans l'œil par voie topique, sont non seulement traitées mais également, peuvent être prévenues grâce à l'invention, et ce plus particulièrement lorsque le conservateur est le chlorure de benzalkonium.
Le médicament fabriqué grâce à l'invention peut être sous la forme d'un collyre, d'une pommade ou d'un gel et contenir de plus des excipients pharmaceutiquement acceptables. L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront mieux à la lecture de la description explicative qui suit, qui est faite en référence aux figures dans lesquelles :•
- la figure 1 représente un pic de fluorescence, typique et représentatif de l'inflammation des cellules conjonctivales, émis par l'ADN de cellules conjonctivales, ce pic étant obtenu par analyse en cytofluorometrie de flux, et
- la figure 2 représente sous forme d'histogrammes les résultats de l'analyse de tests effectués avec les composés de l'invention.
Les affections de la surface oculaire concernées par l'invention peuvent être dues : - une exposition aux agents environnementaux comme les brouillards photochimiques des villes (ozone, oxydes d'azote, dioxyde sulfureux, composés organiques volatils, particules de diesel),
- une exposition prolongée à un écran d'ordinateur, de télévision, d'un moniteur vidéo, - le port de lentilles de contact, - une exposition à de l'eau salée ou de l'eau chlorée,
- une exposition aux ultraviolets (UVs A, B, C), aux rayons X, aux rayons γ, au rayonnement radioactif,
- une exposition à des agents environnementaux comme les bactéries, les virus, les champignons,
- une altération de la surface oculaire choisie dans le syndrome de Gougerot- Sjôgren, les blépharites, la rosacée oculaire, et
- une exposition à des allergènes associée à une réaction inflammatoire et à une dégradation de la surface oculaire, - une exposition aux conservateurs contenus dans les compositions destinées à être installées dans l'œil.
Le traitement de ces différentes affections s'est jusqu'à présent limité à un traitement symptomatique consistant à soulager le patient humain ou animal en lui proposant d'appliquer par voie locale différents collyres, gels ou pommades afin de calmer la sécheresse oculaire et autres symptômes d'inconfort résultant de ces affections.
Cependant, aucun traitement de fond, c'est-à-dire permettant de réellement guérir et cicatriser la surface oculaire, n'a été proposé jusqu'à présent. Aucun traitement préventif n'a également jamais été proposé. Or, on a maintenant découvert que les antioxydants sont des composés actifs pour un traitement de fond des affections oculaires de surface.
La composition pharmaceutique obtenue par l'utilisation de ces antioxydants contiendra donc, en tant qu'ingrédient actif, un ou plusieurs antioxydants et des excipients pharmaceutiques acceptables pour une application locale dans l'œil.
Les antioxydants particulièrement appropriés sont les superoxydes dismutases, les mimétiques de superoxydes dismutases, les dérivés de superoxydes dismutases, l'acide alpha-lipoïque racémique ou ses énantiomères
R+/R" et les mélanges de ces composés. Les superoxydes dismutases également appelées SODs, représentent l'une des trois principales classes d'enzymes anti-oxydantes avec la catalase et le glutathion peroxydase de l'organisme (Fridovich 1986).
Les superoxydes dismutases ou SODs sont des métallo-enzymes antioxydantes découvertes en 1969 par Me Cord et Fridovich, capables de catalyser la réaction de dismutation de l'anion superoxyde (02.-) en peroxyde d'hydrogène (H202) et en oxygène en milieu aqueux selon la réaction suivante, qui nécessite la présence de fer.
(1) 2 02.- + 2 H+ → H202 + 02
(2) Fe2+ + H202 → Fe3+ + OH. (réaction de Fenton) Les superoxydes dismutases sont présentes dans les organismes au niveau extra et intra cellulaire.
Elles se répartissent en 3 groupes :
- Cu/Zn SODs,
- Mn SODs, - Fe SODs.
Elles peuvent être d'origine humaine, et dans ce cas on parle de SODs homologues, ou animales, végétales, bactériennes auxquels cas on parle de SODs hétérologues.
Elles peuvent être soit d'extractions soit recombinantes soit de synthèses. Leurs effets peuvent être minimisés par différents complexes appelés mimétiques de superoxydes dismutases
Les SODs endogènes ont pour rôle d'assurer la protection des cellules et des espaces extracellulaires contre une agression par les anions superoxydes
(02.-). A l'état normal, les taux de SODs comme l'activité spécifique de l'enzyme sont relativement constants pour un même tissu chez un même individu en bonne santé (Michelson AM.1987).
Dans les cas de stress oxydatif en raison de la forte production radicalaire et de la peroxydation lipidique qui en découle, les taux de SODs sont modifiés.
Des états pathologiques comme des inflammations aiguës ou chroniques, les maladies auto-immunes témoignent de la disparition des qualités adaptatives des
SODs. Des taux très bas de SODs ont été rapportés dans ce type de pathologie.
Trois types de SODs endogènes sont à l'heure actuelle décrites, les Cu/Zn SODs habituellement localisées dans le cytosol des cellules eucaryotes, dans le fluide extracellulaire des mammifères et chez certaines bactéries, les Mn SODs chez les procaryotes ou dans les mitochondries et les Fe SODs contenant du fer, localisées dans les bactéries anaérobies et les procaryotes. Les Cu/Zn SODs regroupent les Cu/Zn SODs I et I Il existe actuellement la Cu/Zn SOD humaine sous forme recombinante, et des Cu/Zn SODs végétales soit d'extraction, de blé, de melon, de tomate, de pollen, d'épinard ou de riz, soit recombinantes. IJ existe étalement des Cu/Zn SODs bactériennes d'extraction dont celle de Saccharomyces Cerevisae et des Cu/Zn SODs animales d'extraction bovine et des Cu/Zn SODs recombinantes.
Les Mn SODs regroupent les Mn SODs I et II qui existent sous forme d'extraction ou recombinante.
De même les Fe SODs existent sous forme extraite ou recombinante.
Parmi ces SODs, les Cu/Zn SODs sont plus particulièrement préférées pour une utilisation dans l'invention.
Les SODs sont des enzymes d'un point moléculaire de 32 kd. Elles sont composées de deux sous-unités contenant chacune un atome de cuivre et de zinc, liés de manière non covalente (Relier GA et al. 1991).
Les SODs exogènes existent sous forme native, d'extraction humaine
(protéine homologue), animales ou végétales (protéines hétérologues), ou sous forme recombinante. Pour permettre un allongement de leur temps de demi-vie et une meilleure distribution au niveau cellulaire, il est parfois intéressant de les vectoriser, sans toutefois intervenir dans leurs propriétés pharmacologiques.
Les complexes mimant les effets des différentes SODs au niveau extra ou intra cellulaire, c'est-à-dire les mimétiques de SODs sont également des composés particulièrement préférés dans l'invention car ils ont une meilleure perméabilité et stabilité.
De plus comme les SODs d'origine naturelle, ils catalysent l'anion superoxyde mais ils inhibent en outre les xanthine oxydases.
Parmi ces mimétiques, le trans-bis (naproxènato) bis (3-Pyridylméthanol) cuivre II monomérique, les complexes issus de bioflavonoïdes comme la rutine contenant du fer et du cuivre, le 1, 4, 7, 10, 13-pentoazacyclopentadécane, et la SODase sont particulièrement préférés.
Dans différents tests réalisés in vitro et in vivo, les SODs hétérologues s'avèrent présenter une activité anti-inflammatoire significativement plus élevée que les homologues. Ces SODs hétérologues qui ont une faible incidence de nature immunologique, n'induisent pas de réaction proinflammatoire et protègent les cellules de la dégénérescence en inhibant la formation des radicaux libres oxygénés. Par conséquent, la présente invention propose, en raison des effets positifs de la SOD, de l'utiliser seule ou en présence d'un véhicule pharmaceutiquement dans le traitement des affections de la surface oculaire.
Cependant, les SODs sont des molécules qui sont rapidement éliminées de la cornée, par les larmes. Elles ne peuvent ainsi exercer pleinement leur action lorsque instillées dans l'œil.
De plus, ce sont des molécules géantes qui diffusent mal vers les tissus cellulaires.
Par conséquent, dans un deuxième mode de réalisation, l'invention propose d'utiliser en tant qu'antioxydant l'acide alpha-lipoïque et/ou l'un de ses énantiomères R+ ou R".
L'acide alpha-lipoïque (LA) découvert en 1937 et caractérisé chimiquement par Lester Reed en 1951, est connu sous une variété de noms incluant l'acide 2-dithiolane-3 pentanoïque, l'acide valérique 1,2 dithiolane 3, l'acide thioctique. C'est un antioxydant synthétisé par le corps humain mais aussi présent en petites quantités dans les pommes de terre, les épinards et la viande rouge.
Chez l'homme, comme les autres antioxydants, sa production décline avec l'âge. II comporte une chaîne de huit carbones et un hétérocycle à deux atomes de soufre voisins, susceptible de donner très facilement un ou deux atomes d'hydrogène. !
Cet acide alpha-lipoïque est une forme racémique (RAC alpha-lipoïque, DL alpha-lipoïque) mais il est aussi actif par ses énantiomères R+ ou R". Le plus actif est l'acide R+ alpha-lipoïque ou acide R-thioctique ou acide R alpha-lipoïque, dexlipotam 1200 22 2.
L'acide alpha-lipoïque et ses dérivés peuvent ainsi se présenter sous la forme de multiples complexes chimiques.
Il est rapidement absorbé par les cellules et transformé en dihydrolipoate (DHLA), extrêmement réducteur. Ce dernier possède deux fonctions sulfurées lui permettant de donner très facilement un ou deux atomes d'hydrogène.
Le LA/DHLA peut : - piéger les radicaux libres (radical hydroxyl OH., acide hypochloreux HCLO, l'oxygène singuletO2, - chélater les métaux (complexes stables avec Cu2+, Mn2+ et Zn2+), - régénérer les formes oxydées des vitamines E, C, du glutathion et de la thioredoxine. En sa présence, on note dans les cellules une augmentation du glutathion,
- inhiber l'expression des gènes (facteur NF-KB au cours d'une réponse inflammatoire).
Le DHLA protège aussi des effets délétères de l'ischémie-reperfusion en inhibant l'activité de la xanthine oxydase, enzyme qui libère de l'anion superoxyde (Prenn JH et al. 1990, 1992, Scheer B. et Zimmer G. 1993, Serbinova E. et al. 1992). Pour ces raisons, l'acide alpha-lipoïque racémique et ses énantiomères sont des ingrédients actifs particulièrement avantageux pour traiter et/ou prévenir les affections oculaires de surface chez l'ho me ou l'animal.
Il entrera dans la composition d'un gel, d'un collyre, d'une pommade, éventuellement contenant des excipients pharmaceutiquement acceptables en tant qu'ingrédient actif pour le traitement de ces affections de surface.
Bien que, d'une part, l'acide alpha-lipoïque et ses énantiomères seuls ou en combinaison entre eux et, d'autre part, les superoxydes dismutases, seules ou en combinaison entre elles, se soient avérés être d'excellents principes actifs pour le traitement des affections oculaires de surface chez l'homme et l'animal, il est avantageux d'utiliser l'acide alpha-lipoïque en combinaison avec une ou plusieurs des superoxydes dismutases précédemment citées.
En effet, des études in vitro ont montré que les SODs et l'acide alpha- lipoïque, à différentes concentrations, sont des ingrédients actifs particulièrement efficaces, à introduire dans une composition pharmaceutique, pour le traitement ou la prévention des affections de la surface oculaire.
D'autres études in vitro ont été menées au cours desquelles, différentes concentrations d'acide alpha-lipoïque et différentes superoxydes dismutases ont été testées au moyen de différentes techniques d'exploration de la surface oculaire, en étroite complémentarité avec la recherche clinique. Ainsi, les tests suivants ont été menés.
Dans un premier temps, différentes concentrations des composés actifs de l'invention (Cu/Zn SOD, acide alpha-lipoïque) sont testées au moyen de différentes techniques d'exploration de la surface oculaire, en étroite complémentarité avec la recherche clinique. Evaluation des radicaux libres oxygénés
Les tests sont réalisés par microtitration cytofiuorométrique en lumière froide. Cette nouvelle technique permet en épurant l'énergie calorifique du système d'illumination (infra-rouge et effet Joule) d'obtenir un bruit de fond très faible et donc d'avoir un bon rapport signal/bruit et une bonne sensibilité. Elle associe la reproductibilité des méthodes en microplaques à la sensibilité des méthodes cytométrïques, avec un spectre de détection très large (280-870 nm). La microplaque est scannée par un pinceau de lumière de longueur d'onde définie qui illumine chaque puits de culture durant moins de 0,3 seconde, ce qui limite tout phénomène d'extinction des sondes.
Test à la dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA) Des cellules cornéennes et/ou conjonctivales d'origine humaine en culture sont exposées à divers agents environnementaux pour induire la libération de radicaux libres. Les composés actifs de l'invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha- lipoïque) sont testés à différentes concentrations sur ce modèle. La présence de radicaux libres dans le milieu du culture est évaluée par le test à la DCFH-DA (Molecular Probes, eugene, OR, USA) en fluorométrie (λexc. = 490 nm - λ ém. = 535 nm, I = 4 V). La sonde fluorogène devient fluorescente lorsqu'elle se lie au peroxyde d'hydrogène. La solution de DCFH-DA utilisée est une solution à 20 μm dans du milieu essentiel minimum modifié de Dulbecco (DMEM). Les cultures sont ensuite placées pendant 20 minutes dans du DMEM contenant la sonde puis elles sont extraites afin de mesurer la production de peroxyde d'hydrogène. La mesure est faite directement sur les cellules dans des plaques de 96 puits (Debbasch C. et al. 2000).
Les résultats montrent avec les composés actifs testés (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque), selon un effet dose, une diminution significative des effets délétères des radicaux libres sur les cellules cornéennes et/ou conjonctivales, les protégeant des dommages membranaires et des phénomènes de l'apoptose. L'apoptose est la mort programmée des cellules.
Test à l'hydroéthidine
Des cellules cornéennes et conjonctivales d'origine humaine en culture, exposées à divers agents agresseurs pour induire la libération de radicaux libres sont traitées ou non par les composés actifs de la présente invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) à différentes concentrations.
L'hydroéthidine (Molecular Probes) est une sonde fluorogène, oxydée en cation éthidium en présence d'anion superoxyde. Cette sonde devient fluorescente lorsqu'elle se lie à l'anion superoxyde (λ;exc. = 490 nm - λém. = 600 nm, I = 6 V). La solution d'hydroéthidine utilisée est une solution à 5 μm. Les cultures cellulaires est placée pendant 10 minutes dans du DMEM contenant la sonde puis les cellules sont extraites afin de mesurer la production d'anion superoxyde. La mesure est faite dans des microplaques de 96 puits. Les analyses sont ainsi réalisées sur 5000 cellules par puits, chaque mesure étant répétées six fois. Les résultats sont exprimés en unités de fluorescence. Les valeurs moyennes de fluorescence sont calculées dans chaque groupe et comparées par un test U non paramétrique de Mann-Whitney.
Les résultats observés confirment ceux notés avec le test DCFH-DA. En présence des composés actifs (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) selon un effet dose, on observe une réduction significative de la production d'anion superoxyde ainsi que de la dégénérescence cellulaire liée à la peroxydation lipidique des membranes.
Effets sur le chlorure de benzalkonium
Mise en évidence sur des cellules conjonctivales d'origine humaine en culture d'un effet protecteur des produits de l'invention (Cu/Zn SOD ou acide alpha-lipoïque) sur la nécrose induite par des conservateurs comme les ammoniums quaternaires (chlorure de benzalkonium) responsables de la production de radicaux libres. Les ammoniums quaternaires reconnus pour induire une sécheresse oculaire qualitative ont en effet des propriétés détergentes qui modifient la phase lipidique du film lacrymal et accélèrent son évaporation. Ils altèrent les microvillosites épithéliales et s'opposent ainsi à l'accrochage du mucus concourant à une instabilité supplémentaire du film lacrymal. A faible concentration (0,004 %) ils réduisent le temps de rupture et entraînent une toxicité directe des cellules superficielles avec des érosions épithéliales, pouvant aller selon la concentration de dégénérescence apoptotique à une véritable nécrose (Baudouin et al. 1991, De Saint Jean M et al. 1999).
Selon un effet dose, les composés actifs de l'invention réduisent significativement la toxicité du chlorure de benzalkonium sur les cellules conjonctivales en culture. En inhibant la production d'espèces radicalaires par ce détergent, les composés actifs de l'invention réduisent les érosions épithéliales.
Or, les ammoniums quaternaires et en particulier le chlorure de benzalkonium sont présents dans la grande majorité des collyres, gels et pommades oculaires, en tant que conservateurs.
Les composés de l'invention qui permettent de contrecarrer les effets secondaires néfastes de ces conservateurs, pourront donc être utilisés non seulement en tant que principes actifs pour guérir les affections de la surface oculaires déjà installées, mais également en tant qu'additifs à d'autres principes actifs pour prévenir les effets secondaires des conservateurs, aussi bien du type aluminium quaternaire que de tous les autres conservateurs pouvant engendrer une formation de radicaux libres oxygénés et donc des phénomènes d'apoptose, présents dans la composition pharmaceutique administrée.
En particulier, l'ajout de ces composés en tant qu'additifs dans des collyres destinés à traiter le glaucome est particulièrement recommandable.
Ainsi, les SODs ainsi que l'acide alpha-lipoïque et leurs mélanges sont utiles aussi bien pour guérir que pour prévenir les affections de la surface oculaire.
Les effets avantageux des composés de l'invention sont clairement prouvés par les résultats des tests suivants.
EXEMPLE
On a choisi, comme modèle des affections oculaires de surface traitées et/ou prévenues par l'invention, l'apoptose induite par du chlorure de benzalkonium.
Les effets :
- d'une SOD HP de blé commercialisée par les Laboratoires SILAB, - d'acide alpha-lipoïque racémique fourni par les Laboratoires LALILAB, Inc.
- ainsi que des mélanges de cette SOD et de cet acide alpha-lipoïque ont été analysés en cytofluorimétrie en flux, sur des cellules conjonctivales en lignée continue (Wong-Kilbourne derivative of Chang conjunctiva, clone 1-5C-4, ATCC CCL-20.2) par l'intermédiaire du pourcentage d'ADN cellulaire en phase sub-Gl, qui traduit l'importance de l'apoptose induite pour le chlorure de benzalkonium et donc de l'agression cellulaire.
Cette étude de l'apoptose est effectuée en comparant par cytofluorometrie de flux le pourcentage d'ADN en phase sub-Gl obtenu avant et après traitement avec les composés de l'invention.
En effet, l'apoptose se caractérise par une fragmentation de l'ADN en fragments identiques de 200 pers de base. Les cellules concernées par ce processus ont donc un contenu en ADN qui est réduit.
Cette fragmentation de l'ADN peut être mesurée in situ par cytofluorimetrie de flux par un colorant de l'ADN, l'iodure de propidium. L'ADN réduit apparaît avec une intensité de fluorescence plus faible que celle des cellules normales. Par cytofluorimetrie, on obtient un pic tel que représenté en figure 1. Comme on peut le voir en figure 1, ce pic se divise en trois zones notées Ml, pic Gl et phase S et G2M. Le nombre de cellules normales apparaît dans la zone du pic Gl. En revanche, les cellules ayant une intensité de fluorescence plus faible, c'est-à-dire celles dont l'ADN a été fragmenté apparaissent, elles, au-dessous de ce pic Gl, c'est-à-dire dans ce qu'on appelle le pic sub-Gl situé dans la zone notée Ml en figure 1.
Les conditions opératoires de ces tests sont les suivantes :
Matériels et méthodes
• SOD haute pureté de blé des Laboratoires SILAB, poids moléculaire = 3500 g pris par défaut. • Acide alpha-lipoïque racémique des laboratoires LALILAB, Inc., poids moléculaire = 205,3 g et 0,5 μg/ml et 5 μm/ml.
L'apoptose a été induite en ajoutant 0,001 %, en volume par rapport au volume total de l'échantillon, de chlorure de benzalkonium (BAC) dans le milieu de culture D-MEM (milieu de Eagle modifié de Dulbecco : références 21885, GibcoBRL products ; enrichi avec 10 %, en volume par rapport au volume total de l'échantillon, de sérum de veau fœtal et additionné de 50 mg/ml de streptomycine et 50IU/ml de pénicilline) dans lequel des cellules conjonctivales sont cultivées, dans des plaques à 6 puits. En pratique, les cellules conjonctivales ont été cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus et, à 80 % de confluence, la SOD, l'acide alpha-lipoïque et leurs associations ont été ajoutés, et laissés incuber 45 minutes à 37°C. Puis le chlorure de benzalkonium a été ajouté dans chaque puits. Après 15 minutes d'incubation, les surnageants de chaque puits ont été recueillis dans des tubes de 15 ml ; les cellules ont été décollées par action de la trypsine à 0,25 % pendant 5 minutes à 37°C et rajoutées à leurs surnageants respectifs. Les tubes ont alors été centrifugés, puis les cellules ont été lavées 2 fois en tampon phosphate. Le culot cellulaire a été remis en suspension en tampon phosphate à la concentration de 1 million de cellules par millilitre.
Cent microlitres de cette suspension cellulaire à 106/ml ont été préalablement fixés et perméabilisés dans un millilitre d'éthanol absolu à - 20°C pendant une heure ; puis après lavage en tampon phosphate, l'ADN a été coloré par l'iodure de propidium (100 microlitres à 0,5 mg/ml) pendant une heure à 4°C puis analysé au cytofluorimètre (Epies XL-MCL, Beckman).
Le pourcentage des pics sub-Gl, c'est-à-dire le pourcentage d'ADN fragmenté et, par conséquent, le nombre de cellules conjonctivales dégradées par l'apoptose a été mesurée. Ces mesures ont été effectuées :
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu de culture D-MEM uniquement en tant que témoin,
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu D-MEM, additionnées de 25 μg/ml de la SOD de blé, en tant que témoin,
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu D-MEM, additionnées de 50 μg/ml de la SOD de blé, en tant que témoin, - sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu D-MEM, additionnées de 0,5 μg/ml de l'acide alpha-lipoïque, en tant que témoin,
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu D-MEM, additionnées de 5 μg/ml de l'acide alpha-lipoïque racémique, en tant que témoin,
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu de culture D-MEM additionnées de chlorure de benzalkonium (BAC), en tant que référence : il s'agit là de l'apoptose induite par le chlorure de benzalkonium sur les cellules conjonctivales. La diminution de l'apoptose obtenue grâce à l'invention sera mesurée par référence à cette valeur maximale, - sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu de culture D-MEM, pour lesquelles l'apoptose a été induite avec le chlorure de benzalkonium, puis traitées avec 25 μg/ml de la SOD de blé,
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu D-MEM, traitées avec la SOD de blé à une concentration de 50 μg/ml, sur lesquelles l'apoptose a été induite par l'ajout du chlorure de benzalkonium (BAC),
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu de culture D-MEM traitées avec 5 μg/ml de l'acide alpha-lipoïque racémique sur lesquelles l'apoptose a été induite par l'ajout de chlorure de benzalkonium (BAC), - sur les cellules conjonctivales cultivées en milieu de culture des MEM traitées avec un mélange de 50 μg/ml de la SOD de blé et de 0,5 μg/ml de l'acide alpha- lipoïque racémique sur lesquelles l'apoptose a été induite par l'ajout de chlorure de benzalkonium (BAC), et
- sur les cellules conjonctivales cultivées dans le milieu de culture des MEM traitées avec un mélange de 50 μg/ml de la SOD de blé et de 5 μg/ml de l'acide alpha-lipoïque racémique, sur lesquelles l'apoptose a été induite par l'ajout du chlorure de benzalkonium (BAC).
Les résultats numériques de ces tests sont regroupés au tableau 1 ci- après :
TABLEAU 1
Ils sont également regroupés en figure 2 sous la forme d'histogramme.
En figure 2, sur la partie gauche sont représentés les histogrammes correspondant aux témoins et sur la partie droite les histogrammes correspondant aux cellules sur lesquelles une apoptose a été induite par l'ajout de chlorure de benzalkonium (BAC). On peut voir à partir du tableau 1 et de la figure 2 qu'une apoptose se produit déjà en l'absence de tout facteur externe déclenchant.
On peut constater à partir des histogrammes figurant sur la partie droite de la figure 2 que les composés de l'invention ont une action favorable sur l'apoptose des cellules conjonctivales.
Il est important de noter que l'acide apha-lipoïque a un effet de guérison, et donc de prévention, plus important que la SOD, et ce à des concentrations beaucoup plus faibles que celles de la SOD.
Il est également important de noter qu'alors que l'effet favorable de la SOD augmente avec sa concentration, l'inverse se produit pour l'acide alpha- lipoïque. On constate encore, à partir du tableau 1 et de la figure 2, un effet de synergie entre la SOD et l'acide alpha-lipoïque, notamment lorsque l'on utilise un mélange contenant la plus faible concentration en SOD testée, et la plus forte concentration en acide alpha-lipoïque, ce qui est surprenant dans la mesure où l'on a vu que c'est à faible concentration que l'acide alpha-lipoïque seul, agit le plus favorablement.
Une explication pourrait être que les SODs sont des molécules géantes et que l'acide alpha-lipoïque est une molécule plus petite qui viendrait s'emboîter dans les espaces entre les différentes molécules de SOD et qui ainsi formerait une association avec la SOD particulièrement efficace.
Ainsi, pour obtenir les effets bénéfiques des composés de l'invention pour le traitement et/ou la prévention des affections de la surface oculaire, des compositions pharmaceutiques contenant entre 1 μg/ml à 500 μg/ml de SOD, de préférence contenant de 25 à 50 μg/ml de SOD pour une administration par instillation dans l'œil sont très efficaces. Cependant, des compositions contenant de l'acide alpha-lipoïque racémique ou un des ses énantiomères seront avantageusement utilisées à des concentrations entre 0,05 μg/ml à 200 μg/ml dans une composition pharmaceutique pour instillation dans l'œil. De préférence, les compositions contiendront entre 0,05 μg/ml et 5 μg/ml d'acide alpha-lipoïque racémique et/ou l'un de ces énantiomères.
Encore plus favorablement, les compositions pour le traitement et/ou la prévention des affections de la surface oculaire contiendront un mélange de SOD ou de dérivés ou de mimétiques de SOD aux concentrations cités ci-dessus pour la SOD seule, et d'acide alpha-lipoïque racémique ou sous forme de ses énantiomères R+, R" aux concentrations citées ci-dessus pour les compositions contenant de l'acide alpha-lipoïque seul.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un antioxydant choisi dans le groupe constitué par les superoxydes dismutases (SODs), les mimétiques, les dérivés de superoxydes dismutases, l'acide alpha-lipoïque racémique, l'énantiomeres R+ de l'acide alpha- lipoïque, l'enantiomere R" de l'acide alpha-lipoïque et les mélanges de ces composés, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des affections oculaires de surface chez l'homme ou l'animal.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antioxydant est une SOD ou un dérivé ou un mimétique de celle-ci.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la SOD est une SOD de blé.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la SOD et/ou son dérivé et/ou mimétique est présente dans le médicament à une concentration comprise entre 1 μg/ml et 500 μg/ml, de préférence entre 25 μg/ml et 50 μg/ml.
5. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antioxydant est l'acide alpha-lipoïque racémique et/ou l'un de ses énantiomères R+, R'.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'antioxydant est l'acide alpha-lipoïque racémique.
7. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que l'acide alpha-lipoïque racémique et/ou l'un de ses énantiomères R+, R" est présent dans le médicament à une concentration comprise entre 0,05 μg/ml et par 200 μg/ml, de préférence entre 0,5 μg/ml et 5 μg/ml.
8. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antioxydant est un mélange d'acide alpha-lipoïque racémique et/ou de ses énantiomères R+, R" et de SODs ou de dérivés ou mimétiques de celles-ci.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'acide alpha-lipoïque ou ses énantiomères R+, R" est présent dans le médicament en une concentration de 0,05 μg/ml à 200 μg/ml, de préférence de 0,5 μg/ml à 5 μg/ml et la SOD et/ou son dérivé ou son mimétique est présente dans le médicament à une concentration comprise entre 1 μg/ml et 500 μg/ml, de préférence entre 25 μg/ml et 50 μg/ml.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les affections oculaires de surface entraînent une sécheresse de l'œil.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires de surface sont une altération de cellules de la cornée.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires sont dues à une exposition à des agents environnementaux tels que l'ozone, l'oxyde d'azote, le dioxyde sulfureux, les composés organiques volatils et les particules libérées par les moteurs diesel.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les affections oculaires de surface sont provoquées par une exposition prolongée à un écran d'ordinateur, à un écran de télévision ou un moniteur vidéo.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les affections oculaires de surface sont dues au port de lentilles.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires sont dues à une exposition à de l'eau salée et/ou à de l'eau chlorée.
16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires sont dues à une exposition aux ultraviolets A et/ou B et/ou C, aux rayons X, aux rayons γ ou à un rayonnement radioactif.
17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires sont dues à une exposition à des bactéries, des virus et/ou des champignons.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires de surface sont le syndrome de Gougerot-Sjôgren, les blépharites ou la rosacée oculaire.
19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires de surface sont dues à une exposition à des allergènes et consistent en une réaction inflammatoire à une dégradation de la surface oculaire.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que lesdites affections oculaires sont dues à une exposition à un(des) conservateur(s) présent(s) dans des compositions administrées dans l'œil par voie topique.
21. Utilisation selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit conservateur est le chlorure de benzalkonium.
22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est sous la forme de collyres, gels ou pommades contenant de plus des excipients pharmaceutiquement acceptables.
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