EP1358512A2 - Dispositif d'observation d'echantillons par fluorescence, notamment de facon sequentielle - Google Patents

Dispositif d'observation d'echantillons par fluorescence, notamment de facon sequentielle

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Publication number
EP1358512A2
EP1358512A2 EP02702453A EP02702453A EP1358512A2 EP 1358512 A2 EP1358512 A2 EP 1358512A2 EP 02702453 A EP02702453 A EP 02702453A EP 02702453 A EP02702453 A EP 02702453A EP 1358512 A2 EP1358512 A2 EP 1358512A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
objective
observation
samples
support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02702453A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Peltie
Dominique Derou-Madeline
Raymond Campagnolo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1358512A2 publication Critical patent/EP1358512A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/02—Objectives
    • G02B21/04—Objectives involving mirrors
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a device for observing samples by fluorescence, in particular sequentially.
  • This support is for example a micro-titration plate ("microtiter plate”) at the bottom of the wells ("wells") from which the biological samples are deposited.
  • microtiter plate a micro-titration plate
  • a particularly important application of the invention relates to high-throughput cellular analysis where cells labeled with a fluorophore are deposited at the bottom of the wells of an icititration plate comprising for example 96 or 384 wells.
  • the images of the cells are then formed by observing the wells one after the other. These images are stored and then processed sequentially.
  • the object of the invention is in particular to analyze this kind of plate at a high rate, the analysis time of each well being of the order of 1 second to 2 seconds, and thus makes it possible to complete the cellular instrumentation which uses a lot cytometers.
  • these are limited to the analysis of cells suspended in a fluid and often only allow a low reading rate.
  • biochips are images of biochips (“biochips”) of low complexity from the fluorescence of these biochips, each of these being housed at the bottom of a well of a micro plate. -titration comprising for example 96 wells. It is therefore advantageous to use a large quantity (several tens) of microchips of the MICAM genus (registered trademark), comprising 128 electrodes, and to correlate the results obtained for these chips, for example when studying the expression of the t gene. s.
  • the plate supporting the biochips can be provided with various devices, for example means for circulating fluids or means for monitoring (“monitoring") temperatures.
  • a device for sequential observation of samples is already known. It is an epi-illumination and fluorescence microscope, equipped with a camera.
  • This microscope includes a motorized stage making it possible to move a microtitration plate to successively illuminate the wells and thus successively acquire the images relating to these wells.
  • This kind of light source has a wide spectrum but its lifespan does not exceed 200 to
  • FIG. 1 schematically illustrates an example of such a known device, intended for the observation of samples 2 placed in the wells
  • the samples are excited by radiation 12 from a laser 14 and provide fluorescence radiation 16 as a result of this excitation.
  • the bottom of the micro-titration plate is transparent to light from the laser as well as to this fluorescence radiation.
  • the light coming from the laser is shaped using an appropriate optic 18 and then filtered using an appropriate filter 20.
  • the light thus filtered is reflected, thanks to a dichroic mirror 22, in the direction of the objective 24 of the microscope. It crosses this objective 24 which focuses it on the sample studied. It is specified that the samples are studied one after the other, the micro-titration plate being for this purpose arranged on suitable displacement means, not shown.
  • FIG. 1 a camera 26 which is intended to capture the image of the sample studied, thanks to the fluorescence radiation 16 emitted by this sample.
  • This fluorescence radiation 16 also passes through the objective 24 of the microscope and then the dichroic mirror 22 (the latter being able to reflect the radiation 12 and transmit the radiation 16) and reaches the camera 26 after having passed through another filter 28 provided for eliminate the light from the laser that may also reach this camera. It should be noted that the use of the dichroic mirror is made necessary, for the separation of the radiations 12 and 16 (whose respective wavelengths are for example equal to 488 nm and to 520 nm), by the existence of a path common to these radiations.
  • the filter is not perfect so that a small amount of stray light always reaches the camera.
  • Fluorimeters They either use lasers or wide spectrum lamps that are filtered. However, these fluorimeters use a photomultiplier to detect the total emission of fluorescence from a well studied. Consequently, they do not provide any image and therefore cannot be used when one wants to obtain it.
  • the subject of the present invention is a device for observing samples by fluorescence, which is quick and simpler than the known device, represented in FIG. 1.
  • a device according to the invention is capable of forming 384 fluorescence images in approximately 10 minutes.
  • the subject of the present invention is a device for observation, by fluorescence, of at least one sample placed on a support, this device comprising:
  • these lighting means comprising at least one light source
  • this observation objective being provided for forming an image of the sample when the latter is illuminated
  • this device being characterized in that the observation objective is a catadioptric objective and in that the lighting means further comprise means for reflecting the light supplied by the source towards the sample, these reflection means being arranged between the observation objective and the support.
  • the catadiotric objective comprises: - a parabolic mirror intended to capture and then reflect light emitted by the sample when the latter receives the light emitted by the source, and - a auxiliary mirror which is placed at the focal point of the parabolic mirror and intended to capture the light reflected by this parabolic mirror and to reflect this light towards the acquisition means, the means for reflecting the light supplied by the source being disposed between the auxiliary mirror and the support .
  • the lighting means further comprise means for shaping the light emitted by the source.
  • the lighting means comprise a plurality of sources, capable of emitting lights of different wavelengths, and means for activating any of these sources.
  • the acquisition means may include a camera with charge transfer device, or CCD camera.
  • the device which is the subject of the invention further comprises filtering means arranged between the retro-reflecting objective and the acquisition means and designed to allow only the light emitted by the sample to pass when the latter is illuminated.
  • a support capable of receiving a plurality of samples is used and the relative displacement means are provided for successively placing these samples on the observation axis, so as to sequentially observe these samples.
  • This support is for example a micro-titration plate comprising a plurality of wells in which the samples are respectively placed.
  • the device can also comprise means for automatically positioning the well on the observation axis.
  • These positioning means comprise, for example, a four-quadrant photodiode.
  • the device which is the subject of the invention may further comprise means for processing each image acquired by the acquisition means.
  • the processing preferably includes a step of image segmentation and a step of calculating parameters for each well.
  • FIG. 1 is a schematic view of a known device, allowing the observation of samples, and has already been described,
  • Figure 2 is a schematic perspective view of a particular embodiment of the device object of the invention
  • Figure 3 is a schematic view of different optical means forming part of the device of Figure 2
  • Figure 4 schematically and partially illustrates another device according to the invention, using lasers of different wavelengths
  • Figure 5 is a schematic and partial view of another device according to the invention, using a four-quadrant photodiode.
  • the device that can be seen in these figures is intended for the observation of the samples 2 contained in the wells 4 of the micro-titration plate 6.
  • This device comprises an inverted microscope 30 which is equipped for 1 epi-illumination.
  • the micro-titration plate 6 comprises for example 384 wells. This plate is held horizontally on a plate support frame 32 which is movable relative to the frame 34 of the inverted microscope.
  • a plate 36 is provided which can be displaced in translation relative to the microscope frame 34, in a horizontal direction x, and the plate support frame 32 also forms a plate which is movable in translation relative to the plate 36, according to a another horizontal direction y which is perpendicular to the x direction.
  • the device of FIGS. 2 and 3 also includes a microscope optic forming a catadioptric objective 38 also called "reflection objective". This catadioptric objective is carried by the turret (not shown) which comprises the frame 34 of the microscope.
  • the device also includes an excitation laser 42 provided for emitting radiation 44 intended to excite the sample 2 that is observed.
  • this excitation radiation 44 is shaped by means of an optical shaping assembly 46. It is then reflected, via a mirror 48, towards the well 4 in which is located the sample to be studied 2.
  • the excitation radiation reflected by the mirror propagates along the vertical axis Z of the catadioptric objective 38, this axis constituting the optical axis of the microscope. It is specified that, by means of appropriate displacements in the directions x and y, the well, in which the sample to be studied, is placed on this optical axis Z.
  • the sample thus excited emits fluorescence radiation 50 which propagates along the Z axis and which is sent, via the catadioptric objective 38, to a camera 52 which the device comprises, after having been filtered by a filter 54 designed to let pass only this fluorescence radiation 50.
  • magnification of the catadioptric objective 38 is of the order of 4 to 15 and the camera 52 is a CCD type camera, cooled by appropriate means (not shown).
  • FIGS. 2 and 3 show the field-reducing extension ring 56 with which the camera 52 is provided and which is located on the input face of this camera.
  • the device of FIGS. 2 and 3 also comprises electronic processing means 58 (computer) intended to process the images supplied by the camera 52 and also to control the latter as well as the displacements in the directions x and y.
  • the computer 58 is provided with a video monitor 60 making it possible, in particular, to observe the images acquired thanks to the camera 52.
  • a camera comprising 1300 x is used for example 1020 pixels whose size can range from 6.5 mm x 6.5 mm to 10 mm x 10 mm, this camera being cooled to 0 ° C. To form the image of a 3 mm well, this corresponds to a resolution better than 3 ⁇ m. .
  • the catadioptric objective used 38 includes a parabolic mirror 62 and a small mirror 64.
  • the reflecting face of this mirror 64 is turned towards the mirror 62 and the mirror 64 is placed at the focal point of this mirror 62.
  • the mirror 48 intended to reflect the radiation emitted by the laser is a small mirror, which is substantially the same size as the mirror 64 and which is fixed to this mirror 64, above the latter so as to be between the plate 6 and the mirror 64.
  • the radiation emitted by the laser 42 in a horizontal direction is reflected by the mirror 48, along the optical axis Z, towards the studied sample.
  • This sample is then excited and emits fluorescence radiation 50.
  • This fluorescence radiation is picked up by the mirror 62 and reflected towards the mirror 64 which in turn reflects this radiation, along the optical axis Z, towards the camera 52, through the filter 54.
  • the parabolic mirror 62 the axis of which is the Z axis, is provided with a central hole 66 which is crossed by this optical axis Z and allows the passage of the fluorescence radiation 50 reflected by the mirror 64.
  • FIGS. 2 and 3 An important characteristic of the device in FIGS. 2 and 3 therefore resides in the fact that the light beam emitted by the laser is located outside the optical path in the microscope. This laser beam does not pass through the retro-reflecting objective.
  • the beam emitted by the laser is therefore not mixed with the fluorescence radiation. Therefore, a simpler device is obtained than that which is shown in FIG. 1.
  • the device of FIGS. 2 and 3 only requires a filter intended to eliminate the stray light capable of being mixed with the fluorescent light.
  • the shaping of the beam emitted by the laser, or excitation beam is simpler than in the device of FIG. 1 since it is not focused by the objective of the microscope.
  • the optical assembly 46 for shaping the beam 44 emitted by the laser comprises two successive optics 68 and 70, provided to enlarge at least three times the beam emitted by the laser, so as to cover each well studied.
  • the beam emitted by the laser has a diameter of the order of 0.8 mm and a divergence of the order of 1 mrad.
  • this laser beam 44 enlarged approximately three times by this assembly 46, has a diameter of the order of 2.5 mm.
  • a fluorescein (excitation wavelength: 488 ⁇ m - emission wavelength: 520 ⁇ m) and a rhodamine are combined (excitation wavelength: 550 ⁇ m - wavelength of emission: 580 ⁇ m) or the couple cy 3 / cy 5 (cy 3 : 540/570 ⁇ m - cy 5 : 630/670 ⁇ m).
  • a device In a device according to the invention, it is easy to mix two or three separate laser beams and to use a multiband filter, which exists in two or three colors, as well as two or three shutters automatically switched by software allowing the successive activation of the lasers emitting the beams, and the acquisition of two or three superimposed images, of distinct colors (or even more if a greater number of lasers are used), and this for each well .
  • This is schematically illustrated in FIG. 4 where we see, schematically and partially, a device according to the invention comprising three lasers 72, 74 and 76 designed to emit excitation radiation from samples having lengths d '' different wave (for example 488 ⁇ m, 532 ⁇ m and 550 ⁇ m).
  • Each of these lasers 72, 74 or 76 is successively followed by an optical assembly 78, 80 or 82 for shaping the beam supplied by this laser, a shutter 84, 86 or 88 (each shutter being controlled by the computer 58) and a mirror 90, 92 or 94.
  • These mirrors are provided to obtain, as a function of the shutter which is actuated, a laser beam directed along an axis Y perpendicular to the optical axis Z and meeting the mirror 48.
  • the mirror 94 associated with the laser 76 is a 45 ° mirror, simply provided for reflecting the beam corresponding to this laser along an axis X parallel to the optical axis Z.
  • the mirror 92 associated with the laser 74 is arranged above the mirror 94 and designed to transmit the beam reflected by this mirror 94 and to reflect the beam corresponding to the laser 74 along this axis X.
  • the mirror 90 associated with the laser 72 is provided for transmitting the beam emitted by this laser along the Y axis and reflecting the light coming from the mirror 92 so that the radiation thus reflected propagates along this Y axis (before being reflected on the mirror 48).
  • a buffer memory in the computer 58 associated with the camera 52 for transferring an image of a color there while an image is being acquired in another color.
  • the acquisition is carried out in a time between 200 ms and 500 ms.
  • the transfer is carried out in less than 500 ms.
  • FIG. 5 An example of such a device is schematically illustrated in FIG. 5.
  • automatic recognition means 96 comprising a four-quadrant photodiode 98.
  • FIG. 5 we see the micro-titration plate 6 which receives the excitation laser beam 44. Part of this beam emerges at the upper end of the well studied 4.
  • the laser beam 100 emerging from this upper end has a substantially conical shape.
  • the four-quadrant photodiode 98 is arranged above the micro-titration plate 6 so that the optical axis Z of the microscope constitutes the axis of this four-quadrant photodiode 98, the latter thus intercepting the emerging beam 100.
  • the four electrical outputs of this four-quadrant photodiode are well balanced if the spot resulting from the emerging beam 100 is circular. However, when the well is well positioned relative to the optical axis Z, this spot is circular. There is therefore a setpoint for immobilizing the translation plates at the desired position: if the laser spot is symmetrical, the intensities of the currents I ⁇ , I 2 , I 3 and I supplied by the diode with four quadrants are equal.
  • the sum I of these four currents leaving the photodiode represents the light intensity contained in this laser spot.
  • the sum of these four currents can be used either to regulate the laser which emits the beam 44 or as information on the proper functioning of this laser or also for laser safety.
  • means can be provided to prevent the protective cover from being removed from the device when the laser is in operation.
  • This image processing can be applied in real time or in deferred time. If this treatment is applied in real time, the cell analysis device successively link the following tasks for each of the N wells of the micro-titration plate: (1) displacement on ' well n (l ⁇ n ⁇ N) of the micro-titration plate, (2) image acquisition of this well n, (3) image processing of this well n.
  • the device which is the subject of the invention allows cytometric analysis of cells of various types, for example neurons, keratinocytes, fibroblasts and tumor cells.
  • the purpose of image processing is to analyze the cells present in the samples and to extract interesting parameters from them.
  • image processing can be more or less specific. In all cases, this image processing comprises a step of image segmentation and a step of calculating parameters for each well.
  • the segmentation of the image makes it possible to identify and separate the cells from the background.
  • the gray level histogram is advantageously used to determine the binarization threshold, and morphology algorithms mathematical.
  • the parameters calculated for each well are for example parameters of cell size and shape, the maximum level of fluorescence for each cell and the number of cells.
  • connectivity analysis algorithms On this subject, consult the documents [1] and [3] mentioned above.

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Abstract

Pour observer au moins un échantillon (2), tel qu'un échantillon biologique, disposé sur un support (6), le dispositif comprend au moins une source de lumière (42) pour éclairer l'échantillon, des moyens (48) de réflexion de cette lumière vers l'échantillon, un objectif catadioptrique (38) pour observer l'échantillon, cet objectif formant une image de l'échantillon, et des moyens (52) d'acquisition de cette image. Les moyens de réflexion sont disposés entre l'objectif et le support.

Description

DISPOSITIF D'OBSERVATION D'ECHANTILLONS PAR FLUORESCENCE, NOTAMMENT DE FAÇON SÉQUENTIELLE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne un dispositif d'observation d'échantillons par fluorescence, notamment de façon séquentielle.
Elle s'applique en particulier à l'analyse de la fluorescence d'échantillons biologiques qui sont déposés sur un support, selon des motifs régulièrement espacés les uns des autres.
Ce support est par exemple une plaque de micro-titration (« microtiter plate ») au fond des puits (« wells ») de laquelle sont déposés les échantillons biologiques.
Une application particulièrement importante de l'invention concerne l'analyse cellulaire à haut débit où des cellules marquées par un fluorophore sont déposées au fond des puits d'une plaque de icro- titration comportant par exemple 96 ou 384 puits.
On forme alors les images des cellules en observant les puits les uns après les autres. On mémorise ces images puis on les traite séquentiellement.
L'invention a notamment pour but d'analyser ce genre de plaque à grande cadence, le temps d'analyse de chaque puits étant de l'ordre de 1 seconde à 2 secondes, et permet ainsi de compléter l'instrumentation cellulaire qui utilise beaucoup les cytomètres . Toutefois, ces derniers sont limités à l'analyse de cellules en suspension dans un fluide et ne permettent souvent qu'une faible cadence de lecture.
Une autre application de l'invention consiste à former des images de biopuces (« biochips ») de faible complexité à partir de la fluorescence de ces biopuces, chacune de celles-ci étant logée au fond d'un puits d'une plaque de micro-titration comportant par exemple 96 puits. II est alors intéressant d'utiliser une grande quantité (plusieurs dizaines) de biopuces du genre MICAM (marque déposée) , comportant 128 électrodes, et de corréler les résultats obtenus pour ces puces, par exemple lorsqu'on étudie l'expression de gènets .
La plaque supportant les biopuces peut être pourvue de divers dispositifs, par exemple de moyens de circulation de fluides ou de moyens de surveillance (« monitoring ») de températures.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
On connaît déjà un dispositif d'observation séquentielle d'échantillons. Il s'agit d'un microscope à épi- illumination et fluorescence, muni d'une caméra.
Ce microscope comporte une platine motorisée permettant de déplacer une plaque de micro- titration pour en illuminer successivement les puits et acquérir ainsi successivement les images relatives à- ces puits.
On utilise fréquemment un microscope inversé pour former l'image du fond de chaque puits. Ce dispositif connu est commercialement disponible auprès de la société Cellomics, Inc.
La plupart du temps, il utilise une source de lumière blanche, utilisant une lampe à mercure ou à xénon, pour l'illumination des échantillons contenus dans les puits.
Ce genre de source lumineuse possède un large spectre mais sa durée de vie n'excède pas 200 à
300 heures. Lorsqu'on dispose de marqueurs fluorescents classiques tels que la fluorescéine, les rhodamines ou les cynanines, il est préférable d'utiliser des lasers de faible puissance, de l'ordre de 10 mW à 50 mW, lasers dont la durée de vie est supérieure à 2000 heures.
La figure 1 illustre schématiquement un exemple d'un tel dispositif connu, destiné à l'observation d'échantillons 2 disposés dans les puits
4 d'une plaque de micro-titration 6 dont on voit le fond 8 ainsi que les parois 10 délimitant les puits.
Les échantillons sont excités par un rayonnement 12 issu d'un laser 14 et fournissent un rayonnement de fluorescence 16 à la suite de cette excitation. Le fond de la plaque de micro-titration est transparent à la lumière issue du laser ainsi qu'à ce rayonnement de fluorescence.
La lumière issue du laser est mise en forme grâce à une optique appropriée 18 puis filtrée grâce à un filtre approprié 20. La lumière ainsi filtrée est réfléchie, grâce à un miroir dichroïque 22, en direction de l'objectif 24 du microscope. Elle traverse cet objectif 24 qui la focalise sur l'échantillon étudié. On précise que les échantillons sont étudiés les uns à la suite des autres, la plaque de micro-titration étant pour ce faire disposée sur des moyens de déplacement appropriés, non représentés.
On voit aussi sur la figure 1 une caméra 26 qui est prévue pour capter l'image de l'échantillon étudié, grâce au rayonnement de fluorescence 16 émis par cet échantillon.
Ce rayonnement de fluorescence 16 traverse également l'objectif 24 du microscope puis le miroir dichroïque 22 (ce dernier étant apte à réfléchir le rayonnement 12 et à transmettre le rayonnement 16) et parvient à la caméra 26 après avoir traversé un autre filtre 28 prévu pour éliminer la lumière du laser susceptible de parvenir également à cette caméra. II convient de noter que l'utilisation du miroir dichroïque est rendue nécessaire, pour la séparation des rayonnements 12 et 16 (dont les longueurs d'onde respectives sont par exemple égales à 488 nm et à 520 nm) , par l'existence d'un trajet commun à ces rayonnements.
Il convient également de noter que le filtre n'est pas parfait de sorte qu'une petite quantité de lumière parasite parvient toujours à la caméra . On connaît aussi des dispositifs appelés
« fluorimètres ». Ils utilisent soit des lasers soit des lampes à large spectre que l'on filtre. Mais ces fluorimètres utilisent un photomultiplicateur pour détecter l'émission totale de fluorescence d'un puits étudié. Par conséquent, ils ne fournissent aucune image et ne peuvent donc être utilisés lorsqu'on veut en obtenir .
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet un dispositif d'observation d'échantillons par fluorescence, qui est rapide et plus simple que le dispositif connu, représenté sur la figure 1.
A titre d'exemple, un dispositif conforme à l'invention est susceptible de former 384 images de fluorescence en 10 minutes environ. De façon précise, la présente invention a pour objet un dispositif d'observation, par fluorescence, d'au moins un échantillon disposé sur un support, ce dispositif comprenant :
- des moyens d'éclairage de l'échantillon, ces moyens d'éclairage comprenant au moins une source de lumière,
- un objectif d'observation de l'échantillon suivant un axe d'observation, cet objectif d'observation étant prévu pour former une image de l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé,
- des moyens de déplacement relatif du support par rapport à l'objectif d'observation, pour disposer l'échantillon sur l'axe d'observation, et
- des moyens d'acquisition de l'image formée par l'objectif d'observation, ce dispositif étant caractérisé en ce que l'objectif d'observation est un objectif catadioptrique et en ce que les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens de réflexion de la lumière fournie par la source vers l'échantillon, ces moyens de réflexion étant disposés entre l'objectif d'observation et le support.
Selon un mode de réalisation préféré du dispositif objet de l'invention, l'objectif catadiotrique comprend : - un miroir parabolique prévu pour capter puis réfléchir une lumière émise par l'échantillon lorsque ce dernier reçoit la lumière émise par la source, et - un miroir auxiliaire qui est placé au foyer du miroir parabolique et prévu pour capter la lumière réfléchie par ce miroir parabolique et réfléchir cette lumière vers les moyens d'acquisition, les moyens de réflexion de la lumière fournie par la source étant disposés entre le miroir auxiliaire et le support . De préférence, les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens de mise en forme de la lumière émise par la source.
Cette source est de préférence un laser. Selon un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, les moyens d'éclairage comprennent une pluralité de sources, aptes à émettre des lumières de longueurs d'onde différentes, et des moyens d'activation de l'une quelconque de ces sources. Les moyens d'acquisition peuvent comprendre une caméra à dispositif à transfert de charges, ou caméra CCD . De préférence, le dispositif objet de l'invention comprend en outre des moyens de filtrage disposés entre l'objectif catadioptrique et les moyens d'acquisition et prévus pour ne laisser passer que la lumière émise par l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé .
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise un support apte à recevoir une pluralité d'échantillons et les moyens de déplacement relatif sont prévus pour disposer successivement ces échantillons sur l'axe d'observation, de façon à observer séquentiellement ces échantillons.
Ce support est par exemple une plaque de micro-titration comprenant une pluralité de puits dans lesquels s'ont respectivement placés les échantillons.
Dans ce cas, le dispositif peut comprendre en outre des moyens de positionnement automatique de puits sur l'axe d'observation.
Ces moyens de positionnement comprennent, par exemple, une photodiode à quatre quadrants.
Le dispositif objet de l'invention peut comprendre en outre des moyens de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition.
Dans le cas où le support est une plaque de micro-titration, le traitement comprend, de préférence, une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : " la figure 1 est une vue schématique d'un dispositif connu, permettant l'observation d'échantillons, et a déjà été décrite,
" la figure 2 est une vue en perspective schématique d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, " la figure 3 est une vue schématique de différents moyens optiques faisant partie du dispositif de la figure 2, " la figure 4 illustre schématiquement et partiellement un autre dispositif conforme à l'invention, utilisant des lasers de longueurs d'onde différentes, et
" la figure 5 est une vue schématique et partielle d'un autre dispositif conforme à l'invention, utilisant une photodiode à quatre quadrants.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
On décrit maintenant un exemple du dispositif objet de l'invention en faisant référence aux figures 2 et 3.
Le dispositif que l'on voit sur ces figures est destiné à l'observation des échantillons 2 contenus dans les puits 4 de la plaque de micro-titration 6.
Ce dispositif comprend un microscope inversé 30 qui est équipé pour 1 ' épi-illuminâtion.
La plaque de micro-titration 6 comprend par exemple 384 puits. Cette plaque est maintenue horizontalement sur un cadre de support de plaque 32 qui est mobile par rapport au bâti 34 du microscope inversé .
Pour ce faire, on prévoit une platine 36 déplaçable en translation par rapport au bâti de microscope 34, suivant une direction horizontale x, et le cadre de support de plaque 32 forme aussi une platine mobile en translation par rapport à la platine 36, suivant une autre direction horizontale y qui est perpendiculaire à la direction x. Le dispositif des figures 2 et 3 comprend aussi une optique de microscope formant un objectif catadioptrique 38 également appelé « objectif à réflexion ». Cet objectif catadioptrique est porté par la tourelle (non représentée) que comporte le bâti 34 du microscope.
Le dispositif comprend aussi un laser d'excitation 42 prévu pour émettre un rayonnement 44 destiné à exciter l'échantillon 2 que l'on observe.
On précise que les échantillons sont étudiés les uns après les autres grâce à des déplacements appropriés du cadre de support 32 et de la platine 36 suivant les directions x et y.
A sa sortie du laser, ce rayonnement d'excitation 44 est mis en forme grâce à un ensemble optique de mise en forme 46. Il est ensuite réfléchi, par l'intermédiaire d'un miroir 48, vers le puits 4 dans lequel se trouve l'échantillon à étudier 2.
Le rayonnement d'excitation réfléchi par le miroir se propage suivant l'axe vertical Z de l'objectif catadioptrique 38, cet axe constituant l'axe optique du microscope. On précise que, grâce à des déplacements appropriés suivant les directions x et y, on a disposé le puits, dans lequel se trouve l'échantillon à étudier, sur cet axe optique Z. L'échantillon ainsi excité émet un rayonnement de fluorescence 50 qui se propage suivant l'axe Z et qui est envoyé, par l'intermédiaire de l'objectif catadioptrique 38, vers une caméra 52 que comporte le dispositif, après avoir été filtré par un filtre 54 prévu pour ne laisser passer que ce rayonnement de fluorescence 50.
A titre d'exemple, le grossissement de l'objectif catadioptrique 38 est de l'ordre de 4 à 15 et la caméra 52 est une caméra du genre CCD, refroidie par des moyens appropriés (non représentés) .
On voit sur les figures 2 et 3 la bague- allonge réductrice de champ 56 dont est munie la caméra 52 et qui se trouve sur la face d'entrée de cette caméra . Le dispositif des figures 2 et 3 comprend aussi des moyens électroniques de traitement 58 (ordinateur) destinés à traiter les images fournies par la caméra 52 et aussi à commander cette dernière ainsi que les déplacements suivant les directions x et y. L'ordinateur 58 est muni d'un moniteur vidéo 60 permettant, en particulier, d'observer les images acquises grâce à la caméra 52.
Dans l'exemple des figures 2 et 3, on utilise un seul laser mais, comme on le verra mieux par la suite, on peut utiliser plusieurs lasers si l'on utilise plusieurs marqueurs qui nécessitent plusieurs longueurs d'onde d'excitation.
De plus, dans cet exemple, on utilise des platines permettant des translations de grande précision mais on sait que de telles platines sont lentes .
Comme on le verra par la suite, pour minimiser le coût du dispositif on peut, au contraire, utiliser des platines de translation moins précises mais beaucoup plus rapides, conduisant donc à un dispositif beaucoup plus rapide, à condition d'utiliser, avec de telles platines moins précises, des moyens de positionnement automatique des puits, les uns après les autres, sur l'axe Z. En ce qui concerne la caméra 58 utilisée dans le dispositif des figures 2 et 3, on utilise par exemple une caméra comprenant 1300 x 1020 pixels dont la taille peut aller de 6,5 mm x 6,5 mm à 10 mm x 10 mm, cette caméra étant refroidie à 0°C. Pour former l'image d'un puits de 3 mm, cela correspond à une résolution meilleure que 3 μm. .
On peut donc travailler avec un grandissement de 4 x - 0,5 (0,5 correspondant à la bague-allonge réductrice de champ qui est placée devant la caméra), pour une caméra de petit format (6,5 mm), ou avec un grandissement de 15 x - 0,25 pour une caméra de grand format .
En ce qui concerne l'excitation des échantillons, l'objectif catadioptrique utilisé 38 comprend un miroir parabolique 62 et un petit miroir 64. La face réflectrice de ce miroir 64 est tournée vers le miroir 62 et le miroir 64 est disposé au foyer de ce miroir 62.
Le miroir 48 destiné à réfléchir le rayonnement émis par le laser est un petit miroir, qui a sensiblement la même taille que le miroir 64 et qui est fixé à ce miroir 64, au-dessus de ce dernier de façon à se trouver entre la plaque 6 et le miroir 64.
Le rayonnement émis par le laser 42 suivant une direction horizontale est réfléchi par le miroir 48, suivant l'axe optique Z, vers l'échantillon étudié.
Cet échantillon est alors excité et émet le rayonnement de fluorescence 50.
Ce rayonnement de fluorescence est capté par le miroir 62 et réfléchi vers le miroir 64 qui réfléchit à son tour ce rayonnement, suivant l'axe optique Z, vers la caméra 52, à travers le filtre 54.
On précise que le miroir parabolique 62, dont l'axe est l'axe Z, est -pourvu d'un trou central 66 qui est traversé par cet axe optique Z et permet le passage du rayonnement de fluorescence 50 réfléchi par le miroir 64.
Une caractéristique importante du dispositif des figures 2 et 3 réside donc dans le fait que le faisceau lumineux émis par le laser se trouve à l'extérieur du trajet optique dans le microscope. Ce faisceau laser ne traverse pas l'objectif catadioptrique .
On ne mélange donc pas le faisceau émis par le laser avec le rayonnement de fluorescence. De ce fait, on obtient un dispositif plus simple que celui qui est représenté sur la figure 1. Le dispositif des figures 2 et 3 nécessite seulement un filtre destiné à éliminer la lumière parasite susceptible d'être mélangée à la lumière de fluorescence . De plus, la mise en forme du faisceau émis par le laser, ou faisceau d'excitation, est plus simple que dans le dispositif de la figure 1 puisqu'il n'est pas focalisé par l'objectif du microscope.
En outre, du fait que le faisceau laser est placé à l'extérieur du trajet optique dans le microscope, on n'a pas besoin de miroir dichroïque pour séparer le faisceau laser d'excitation du faisceau fluorescent émis par l'échantillon étudié. Un seul filtre d'arrêt (coupant la longueur d'onde excitatrice) est suffisant .
L'ensemble optique 46 de mise en forme du faisceau 44 émis par le laser comprend deux optiques successives 68 et 70, prévues pour agrandir au moins trois fois le faisceau émis par le laser, de façon à couvrir chaque puits étudié.
A titre d'exemple, le faisceau émis par le laser a un diamètre de l'ordre de 0,8 mm et une divergence de l'ordre de 1 mrad. A la sortie de l'ensemble de mise en forme 46, ce faisceau laser 44, agrandi environ trois fois par cet ensemble 46, a un diamètre de l'ordre de 2,5 mm.
A titre purement indicatif et nullement limitatif, on utilise un objectif catadioptrique 15 x - ouverture 0,3 à 0,5, du genre de ceux qui sont commercialisés par la société Cohérent. De plus, a titre purement indicatif et nullement limitatif, on utilise une caméra CCD refroidie, du genre de celles qui sont commercialisées par la société Soft Imaging System. Dans le domaine de l'analyse cellulaire, on tend de plus en plus à utiliser plusieurs marqueurs (généralement deux ou trois) de couleurs différentes. On associe par exemple une fluorescéine (longueur d'onde d'excitation : 488 μm - longueur d'onde d'émission : 520 μm) et une rhodamine (longueur d'onde d'excitation : 550 μm - longueur d'onde d'émission : 580 μm) ou bien le couple cy3/cy5 (cy3 : 540/570 μm - cy5 : 630/670 μm) .
Dans un dispositif conforme à l'invention, il est facile de mélanger deux ou trois faisceaux laser distincts et d'utiliser un filtre multibande, qui existe en deux ou trois couleurs, ainsi que deux ou trois obturateurs (« shutters ») commutés automatiquement par logiciel et permettant d'activer successivement les lasers émettant les faisceaux, et de faire l'acquisition de deux ou trois images superposées, de couleurs distinctes (voire plus si l'on utilise un plus grand nombre de lasers) , et ceci pour chaque puits . Ceci est schématiquement illustré par la figure 4 où l'on voit, de façon schématique et partielle, un dispositif conforme à l'invention comprenant trois lasers 72, 74 et 76 prévus pour émettre des rayonnements d'excitation d'échantillons ayant des longueurs d'onde différentes (par exemple 488 μm, 532 μm et 550 μm) . Chacun de ces lasers 72, 74 ou 76 est successivement suivi par un ensemble optique 78, 80 ou 82 de mise en forme du faisceau fourni par ce laser, un obturateur 84, 86 ou 88 (chaque obturateur étant commandé par l'ordinateur 58) et un miroir 90, 92 ou 94. Ces miroirs sont prévus pour obtenir, en fonction de l'obturateur qui est actionné, un faisceau laser dirigé suivant un axe Y perpendiculaire à l'axe optique Z et rencontrant le miroir 48. Plus précisément, le miroir 94 associé au laser 76 est un miroir à 45°, simplement prévu pour réfléchir le faisceau correspondant à ce laser suivant un axe X parallèle à l'axe optique Z.
Le miroir 92 associé au laser 74 est disposé au-dessus du miroir 94 et prévu pour transmettre le faisceau réfléchi par ce miroir 94 et réfléchir le faisceau correspondant au laser 74 suivant cet axe X.
Le miroir 90 associé au laser 72 est prévu pour transmettre le faisceau émis par ce laser suivant l'axe Y et réfléchir la lumière provenant du miroir 92 pour que le rayonnement ainsi réfléchi se propage suivant cet axe Y (avant de se réfléchir sur le miroir 48) . Dans le cas du dispositif de la figure 4, on peut alors prévoir une mémoire-tampon dans l'ordinateur 58 associé à la caméra 52 pour y transférer une image d'une couleur pendant que l'on fait l'acquisition d'une image d'une autre couleur. Typiquement, l'acquisition est réalisée en un temps compris entre 200 ms et 500 ms . Le transfert est, quant à lui, effectué en moins de 500 ms .
Comme on l'a vu plus haut, dans un dispositif conforme à l'invention, on peut utiliser des platines de translation très précises et donc lentes, la précision étant de l'ordre 0,1 μm.
Cependant, il est possible d'utiliser des platines de translation beaucoup moins précises mais beaucoup plus rapides et peu chères, la précision étant de l'ordre de 10 μm ou supérieure à cette valeur.
L'utilisation de ces platines plus rapides est possible si l'on prévoit, dans le dispositif, des moyens de reconnaissance automatique d'un puits que l'on veut étudier lorsque ce puits passe devant l'objectif 38 du microscope.
Un exemple d'un tel dispositif est schématiquement illustré par la figure 5. On y utilise des moyens de reconnaissance automatique 96 comprenant une photodiode à quatre quadrants 98.
Sur la figure 5, on voit la plaque de micro-titration 6 qui reçoit le faisceau laser d'excitation 44. Une partie de ce faisceau émerge à l'extrémité supérieure du puits étudié 4. Le faisceau laser 100 émergeant de cette extrémité supérieure a une forme sensiblement conique.
La photodiode à quatre quadrants 98 est disposée au-dessus de la plaque de micro-titration 6 de façon que l'axe optique Z du microscope constitue l'axe de cette photodiode à quatre quadrants 98, cette dernière interceptant ainsi le faisceau émergent 100. Les quatre sorties électriques de cette photodiode à quatre quadrants sont bien équilibrées si le spot résultant du faisceau émergent 100 est circulaire . Or, lorsque le puits est bien positionné par rapport à l'axe optique Z, ce spot est circulaire. On dispose donc d'une consigne pour immobiliser les platines de translation à la position voulue : si le spot laser est symétrique les intensités des courants Iχ, I2, I3 et I fournis par la diode à quatre quadrants sont égales.
De plus, la somme I de ces quatre courants sortant de la photodiode représente l'intensité lumineuse contenue dans ce spot laser. On peut utiliser la somme de ces quatre courants soit pour réguler le laser qui émet le faisceau 44 soit comme information du bon fonctionnement de ce laser soit aussi pour la sécurité laser. Par exemple, on peut prévoir des moyens permettant d'empêcher d'enlever le couvercle de protection du dispositif lorsque le laser est en fonctionnement .
On considère maintenant le traitement des images.
On considère d'abord un procédé d'application du traitement d'images.
Ce traitement d'images peut être appliqué en temps réel ou en temps différé. Dans le cas où ce traitement est appliqué en temps réel, le dispositif d'analyse cellulaire enchaîne successivement les tâches suivantes pour chacun des N puits de la plaque de micro-titration : (1) déplacement sur' le puits n (l≤n≤N) de la plaque de micro-titration, (2) acquisition de l'image de ce puits n, (3) traitement de l'image de ce puits n.
Dans le cas du traitement en temps différé, seules les opérations (1) et (2) sont réalisées et ce, successivement pour tous les puits. Une fois que l'on a acquis toutes les images pour la plaque de micro- titration considérée, le traitement d'images est effectué pour chacun des puits.
On considère maintenant la nature du traitement d'images. Le dispositif objet de l'invention permet l'analyse cytométrique de cellules de divers types par exemple les neurones, les kératinocytes , les fibroblastes et les cellules tumorales. Le traitement d'images a pour but d'analyser les cellules présentes dans les échantillons et d'en extraire des paramètres intéressants .
En fonction de l'application, le traitement d'images peut être plus ou moins spécifique. Dans tous les cas, ce traitement d'images comprend une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.
La segmentation de l'image permet d'identifier et de séparer les cellules du fond. Dans cette étape, on utilise avantageusement l'histogramme des niveaux de gris, pour déterminer le seuil de binarisation, et des algorithmes de morphologie mathématique. A ce sujet, on consultera les documents suivants :
[1] Digital image processing, Pratt William K, éd. Wiley, New York, 1978
[2] Rapport segmentation, GDR134 Traitement du signal et des images, CNRS-GRECO, décembre 1991
[3] Image analysis and mathematical morphology, J. Serra, Académie Press, Londres, 1982.
A titre purement indicatif et nullement limitatif, on peut utiliser un logiciel du genre de celui qui est commercialisé par la Société Soft Imaging
Systems sous le nom Analysis ou encore le logiciel qui est commercialisé par la Société Khoral Research sous le nom Khoros Pro . Les paramètres calculés pour chaque puits sont par exemple des paramètres de taille et de forme des cellules, le niveau maximal de fluorescence pour chaque cellule et le nombre de cellules. Dans cette étape, il est avantageux de faire appel à des algorithmes d'analyse de connexité . A ce sujet, on consultera les documents [1] et [3] susmentionnés.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif d'observation, par fluorescence, d'au moins un échantillon (2) disposé sur un support (6) , ce dispositif comprenant : - des moyens d'éclairage de l'échantillon, ces moyens d'éclairage comprenant au moins une source de lumière (42 ; 72, 74, 76),
- un objectif (38) d'observation de l'échantillon suivant un axe d'observation (Z) , cet objectif d'observation étant prévu pour former une image de l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé,
- des moyens (32, 36) de déplacement relatif du support
(6) par rapport à l'objectif d'observation (38), pour disposer l'échantillon sur l'axe d'observation, et — des moyens (52) d'acquisition de l'image formée par l'objectif d'observation, ce dispositif étant caractérisé en ce que l'objectif d'observation est un objectif catadioptrique (38) et en ce que les moyens (48) d'éclairage comprennent en outre des moyens (48) de réflexion de la lumière fournie par la source vers l'échantillon, ces moyens de réflexion étant disposés entre l'objectif d'observation (38) et le support (6) .
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'objectif catadioptrique (38) comprend :
- un miroir parabolique (62) prévu pour capter puis réfléchir une lumière émise par l'échantillon lorsque ce dernier reçoit la lumière émise par la source (42) , et - un miroir auxiliaire (64) qui est placé au foyer du miroir parabolique et prévu pour capter la lumière réfléchie par ce miroir parabolique et réfléchir cette lumière vers les moyens d'acquisition (52), les moyens (48) de réflexion de la lumière fournie par la source étant disposés entre le miroir auxiliaire (64) et le support (48) .
3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens (46) de mise en forme de la lumière émise par la source.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans t lequel la source de lumière est un laser (42 ; 72, 74, 76) .
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les moyens d'éclairage comprennent une pluralité de sources (72, 74, 76) aptes à émettre des lumières de longueurs d'onde différentes, et des moyens (84, 86, 88) d'activation de l'une quelconque de ces sources.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les moyens d'acquisition comprennent une caméra (52) à dispositif à transfert de charges.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre des moyens de filtrage (54) disposés entre l'objectif catadioptrique (38) et les moyens d'acquisition (52) et prévus pour ne laisser passer que la lumière émise par l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le support (6) est apte à recevoir une pluralité d'échantillons (2) et les moyens de déplacement relatif (32, 36) sont prévus pour disposer successivement ces échantillons sur l'axe d'observation (Z) , de façon à observer séquentiellement ces échantillons.
9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le support est une plaque de micro- titration (6) comprenant une pluralité de puits (4) dans lesquels sont respectivement placés les échantillons (2) .
10. Dispositif selon la revendication 9, comprenant en outre des moyens (96) de positionnement automatique de puits sur l'axe d'observation.
11. Dispositif selon la revendication 10, dans lequel les moyens de positionnement automatique comprennent une photodiode à quatre quadrants (98) .
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre des moyens
(58) de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition (52) .
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, comprenant en outre des moyens
(58) de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition (52), ce traitement comprenant une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.
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