EP1021533A1 - Acides nucleiques codant pour des proteines capables d'interagir avec les presenilines - Google Patents

Acides nucleiques codant pour des proteines capables d'interagir avec les presenilines

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Publication number
EP1021533A1
EP1021533A1 EP98946534A EP98946534A EP1021533A1 EP 1021533 A1 EP1021533 A1 EP 1021533A1 EP 98946534 A EP98946534 A EP 98946534A EP 98946534 A EP98946534 A EP 98946534A EP 1021533 A1 EP1021533 A1 EP 1021533A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequence
ser
leu
pro
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98946534A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Alain Fournier
Luc Mercken
Laurent Pradier
Marie-Françoise PAUL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9712221A external-priority patent/FR2769021B1/fr
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Publication of EP1021533A1 publication Critical patent/EP1021533A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to new nucleotide and peptide sequences, and their pharmaceutical use. More particularly, the present invention relates to nucleic acids coding for proteins capable of interacting with presenilms, the processes for producing said proteins as well as compositions containing them.
  • Alzheimer's disease is the most common form of dementia. Its overall frequency increases with age, it is 5 to 10% after 65 years and 20% beyond 80 years.
  • Alzheimer's disease is linked to organic brain lesions constituting histological signs: senile plaques, neuronal neurofibrillary degeneration, loss and atrophy of neurons in the cortex.
  • the etiology of the disease is complex, many genes are involved, and the different pathophysiological mechanisms in which they participate are not fully understood.
  • Alzheimer type Anatomical brain changes observed in patients under the age of 65 have been described, linked to presenile dementia.
  • the term "dementia of the Alzheimer type” includes presenile dementia (before 65 years) as well as senile dementia (after 65 years) having the same characteristics.
  • sporadic forms that is to say not linked to heredity and familial forms.
  • Familial forms of the disease represent 10 to 40% of cases. They are classified into two groups, late forms (after 65 years) and early forms (before 65 years). In early cases, the disease is transmitted in a dominant and autosomal character.
  • the gene is made up of 12 exons, exons 3 to 12 code for the protein. It is expressed ubiquitously and generates a majority transcript of 2.7 kb and a minority transcript of 7.5 kb (Kovacs, 1996).
  • the protein comprises 467 amino acids and has the structure of a membrane protein. It presents at least 8 potential transmembrane domains.
  • the amino acids corresponding to the codons affected by the listed mutations are distributed throughout the protein, they are located in both hydrophobic regions (TM) and in hydrophilic loops (BL), with, however, two preferred regions, TM2 and BL6.
  • PS-1 presenilin 1
  • PS-1 could have a role in cell traffic.
  • This hypothesis is supported by an immunocytochemical result which made it possible to localize PS-1 at the level of the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus in human neuroglioma cells (Kovacs et al., 1996).
  • PS-1 plays a role in cell communication and the endocytosis mechanisms and proteolysis of APP (Dewji and Singer, 1996).
  • a third hypothesis involves PS-1 in interactions with the cytoskeleton and in particular the microtubules associated with the Tau protein (Lew and Wang, 1996).
  • PS-1 could play the role of a receptor coupled to G proteins participating in signal transduction or that of a transporter or ion channel (Van Broeckhoven, 1995).
  • the present invention results from the discovery by the applicant of nucleic acids coding for proteins capable of interacting with presenilins.
  • the demonstration of such nucleic acids makes it possible to envisage the preparation of new polypeptides which can be used pharmaceutically.
  • a first object of the invention therefore relates to nucleotide sequences coding for proteins capable of interacting with presenilins.
  • the nucleotide sequences according to the invention encode proteins or polypeptides capable of interacting with all or part of the large loop of presenilin PS-1. More preferably, the nucleotide sequences according to the invention comprise all or part of SEQ ID No. 1 or its derivatives or all or part of SEQ ID No. 2 or its derivatives.
  • derived nucleotide sequence designates any sequence different from the sequence considered due to the degeneration of the genetic code, obtained by one or more modifications of genetic and / or chemical nature, as well as any sequence hybridizing with these sequences or fragments thereof and coding for a polypeptide according to the invention.
  • modification of genetic and / or chemical nature one can hear any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • derivative also includes sequences homologous to the sequence considered, derived from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms. Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments. Hybridizations can be carried out from a nucleic acid library, using as probe, the native sequence or a fragment thereof, under variable hybridization conditions (Maniatis et al .; 1989).
  • the nucleotide sequences according to the invention can be of artificial origin or not. They can be genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained for example by screening of DNA libraries (cDNA library, genomic DNA library) by means of probes produced on the basis of sequences presented above. Such libraries can be prepared from cells of different origins by standard molecular biology techniques known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequences of the invention can also be prepared by chemical synthesis or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries.
  • the nucleic acids of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to proteins or polypeptides capable of interacting with presenilins.
  • the polypeptides according to the invention are capable of interacting with the large loop of presenilin PS-1 and / or the large loop of presenilin PS-2. More preferably, they are polypeptides capable of interacting with the amino acid sequence 310-463 of the large loop of presenilin PS-1.
  • the name presenilin covers the presenilins PS-1 and PS-2 in themselves as well as their homologous forms corresponding in particular to mutated forms of these proteins.
  • the present invention also relates to polypeptides comprising all or part of a peptide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 or a derivative thereof.
  • derived polypeptide sequence designates any polypeptide sequence differing from the sequences presented in sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, obtained by one or more modifications of genetic and / or chemical nature, and having the ability to interact with presenilins. By modification of genetic and / or chemical nature, one can hear any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of increasing their therapeutic efficacy or reducing their side effects, or that of conferring on them new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • the term derivative also includes sequences homologous to the sequence considered, derived from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms, and having an activity of the same type. They may also be fragments of the peptide sequences indicated above. Such fragments can be generated in different ways. In particular, they can be synthesized chemically, on the basis of the sequences given in the present application, using the peptide synthesizers known to those skilled in the art. They can also be synthesized genetically, by expression in a cellular host of a nucleotide sequence coding for the peptide sought.
  • the nucleotide sequence can be prepared chemically using an oligonucleotide synthesizer, on the basis of the peptide sequence given in the present application and the genetic code.
  • the nucleotide sequence can also be prepared from the sequences given in the present application, by enzymatic cleavages, ligation, cloning, etc., according to techniques known to those skilled in the art, or by screening DNA libraries with elaborate probes from these sequences.
  • a subject of the present invention is also the use of the polypeptides according to the invention, for slowing down, inhibiting, stimulating or modulating the activity of Presenilins.
  • Another object of the present invention relates to a process for the preparation of the polypeptides according to the invention according to which a cell containing a nucleotide sequence according to the invention is cultivated, under conditions of expression of said sequence and the polypeptide produced is recovered.
  • the part coding for said polypeptide is generally placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • the choice of these signals can vary depending on the cell host used.
  • the nucleotide sequences of the invention can be part of a vector which can be autonomously replicating or integrative. More particularly, autonomously replicating vectors can be prepared by using autonomous replicating sequences in the chosen host.
  • integrative vectors these can be prepared, for example, using sequences homologous to certain regions of the host genome, allowing, by homologous recombination, integration of the vector.
  • the present invention also relates to host cells transformed with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence according to the invention.
  • the cellular hosts which can be used for the production of the peptides of the invention by the recombinant route are both eukaryotic and prokaryotic hosts.
  • suitable eukaryotic hosts there may be mentioned animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • animal cells mention may be made of COS, CHO, C127, human neuroblastoma cells, etc.
  • Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp As prokaryotic hosts, it is preferred to use the following bacteria E.coli, Bacillus, or Streptomyces.
  • the host cells are advantageously represented by recombinant yeast strains for the expression of the nucleic acids of the invention as well as the production of proteins derived from these.
  • the host cells comprise at least one sequence or a sequence fragment chosen from the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, for the production of the proteins according to the invention.
  • nucleic acid sequences Another application of the nucleic acid sequences according to the invention is the production of antisense oligonucleotides or genetic antisenses usable as pharmaceutical agents.
  • the antisense sequences are small oligonucleotides, complementary to the strand coding for a given gene, and therefore capable of specifically hybridizing with the transcribed mRNA, inhibiting its translation into protein.
  • the subject of the invention is therefore the antisense sequences capable of inhibiting, at least partially, the expression of proteins capable of interacting with presenilins.
  • Such sequences can consist of all or part of the nucleotic sequences defined above and can be obtained by fragmentation, etc. or by chemical synthesis.
  • the claimed sequences can be used in the context of gene therapies, for the transfer and in vivo production of antisense sequences or the expression of proteins or polypeptides capable of modulating the activity of presenilins.
  • the sequences can be incorporated into viral or non-viral vectors, allowing their administration in vivo.
  • the vector can be a plasmid, the production of which is known to a person skilled in the art.
  • viral vectors in accordance with the invention mention may very particularly be made of vectors of the adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus or herpes virus type.
  • the present application also relates to defective recombinant viruses comprising a heterologous nucleic sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • the invention also allows the production of nucleotide probes, synthetic or not, capable of hybridizing with the nucleotide sequences defined above or of the corresponding mRNAs, which can be used in the context of gene therapy.
  • probes can be used in vitro as a diagnostic tool, for the detection of presenilins, or even for the detection of genetic anomalies (poor splicing, polymorphism, point mutations, etc.).
  • These probes can also be used for the detection and isolation of homologous nucleic acid sequences coding for peptides as defined above, from other cellular sources and preferably from cells of human origin.
  • the probes of the invention generally comprise at least 10 bases, and they can for example comprise up to the entirety of one of the abovementioned sequences or of their complementary strand. Preferably, these probes are, prior to their use, marked. For this, different techniques known to those skilled in the art can be used (radioactive, enzymatic labeling, etc.).
  • Another object of the invention resides in antibodies or fragment of polyclonal or monoclonal antibodies directed against a polypeptide as defined above.
  • Such antibodies can be generated by methods known to those skilled in the art.
  • these antibodies can be prepared by immunization of an animal against a polypeptide whose sequence is chosen from the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 or any fragment or derivative thereof, then collection of blood and isolation of antibodies.
  • These antibodies can also be generated by preparing hybridomas according to techniques known to those skilled in the art.
  • the antibodies or antibody fragment according to the invention can in particular be used to inhibit and / or reveal the interaction between the presenilins and the polypeptides as defined above.
  • Another object of the present invention relates to a method for identifying compounds capable of modulating or totally or partially inhibiting the interaction between the presenilins and the polypeptides according to the invention.
  • a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified is brought into contact with a recombinant cell as described above expressing a polypeptide of the invention under conditions allowing the interaction between said polypeptide and said molecule in the case where the latter has an affinity for said polypeptide, and,
  • this method of the invention is suitable for the detection and / or isolation of agonists and antagonists of the interaction between the presenilins and the polypeptides of the invention.
  • Another object of the invention relates to the use of a ligand or of a modulator identified and / or obtained according to the process described above as a medicament.
  • ligands or modulators can indeed make it possible to treat certain neurological conditions.
  • the subject of the invention is also any pharmaceutical composition comprising as active principle at least one polypeptide as defined above.
  • composition comprising as active ingredient at least one antibody and / or an antibody fragment as defined above, and / or an antisense oligonucleotide, as well as any pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one nucleotide sequence as defined above.
  • compositions in which the peptides, antibodies and nucleotide sequences defined above or fragments thereof are associated with each other or with other active ingredients.
  • compositions in which the nucleotide sequences according to the invention are incorporated into a viral or non-viral recombinant vector are incorporated into a viral or non-viral recombinant vector.
  • compositions according to the invention can be used to modulate the activity of presenilins. More preferably, these compositions are intended to slow down or at least partially inhibit the activity of presenilins and in particular the mutated forms. More preferably, these are pharmaceutical compositions intended for the treatment of neurodegenerative diseases such as, for example, Alzheimer's disease and trisomy 21.
  • Figure 1 Diagram of the presenilin I and of the part used for the double hybrid test.
  • Figure 4 Diagram of the mammalian expression vector used.
  • Figure 5. Expression of C and D fusion proteins in mammalian cells.
  • yeast strains used are the following:
  • S.cerevisiae HF7 C (MATa, ura3, his3, ade2, trpl, leiû, lys 2, gal4, gal80, can, URA3 :: GAL4 bindingsite- CYCl-lacZ, LYS2 rr GAL1- HIS3).
  • E.coli TGl F '[traD 36, lacl q , lacZ D Ml 5, proA + B + J, supE, thi-1, D (lac-pro AB), D (hsdM-mcrB) 5 (r ⁇ -m ⁇ - McrB-).
  • E.coli BL21 (DE3) (F-, ompT, hsdS ⁇ (rB ⁇ mB), gay, dcm, (DE3).
  • This medium can be solidified by adding agar (20 g / l) and made sterile at 110 ° C for 20 min in an autoclave.
  • This medium can be solidified by adding agar (20g / l) and sterilized by autoclaving. The amino acids or nitrogen bases necessary for the growth of auxotrophic yeasts are then added at 50 mg / l. Ampicillin is also added at 100 ⁇ g / ml to avoid bacterial contamination.
  • This medium can be solidified by adding agar (12 g / 1) and sterilized by autoclave. Ampicillin or kanamycin are added to 100 ⁇ g / ml to select the bacteria which have been transformed by the plasmids carrying the corresponding resistance markers.
  • the plasmids used are the following:
  • the vector pGBT9 (fig. 6 (a)) is a 5.5 kb shuttle plasmid which can be propagated and selected in E. coli bacteria as well as in yeasts. It has an origin of ColEl replication and an ampicillin resistance gene (propagation and selection in E. coli) as well as a 2mm origin of replication and a TRP1 gene (selection in trpl-deficient yeasts for the synthesis of tryptophan). This plasmid is used to express in yeast fusion proteins between the DNA binding domain (DLA) of GAL4 and peptides of interest.
  • DLA DNA binding domain
  • the DLA of GAL4 contains a signal sequence for nuclear localization.
  • the vector pGADIO (fig. 6 (a)) is a 6.6 kb shuttle plasmid. It has an origin of ColEl replication and an ampicillin resistance gene which allow its propagation and selection in E. coli. It also contains an origin of yeast replication (2mm) and a LEU2 selection gene to isolate processed yeasts. It has a multiple cloning site downstream of the sequence coding for the activation domain (DA) of GAL4 between the promoter and the ADH1 terminator.
  • the GAL4 DA contains a nuclear localization signal sequence.
  • This plasmid was used to make a commercial human brain cDNA library (Clontech).
  • the cDNA sequences were inserted at the EcoRI cloning site.
  • the vector pLex 9 (fig. 6 (b)) is a 5 kb shuttle plasmid. Like pGBT9, it has the ColEl origin, the Amp gene, as well as the 2mm replication origin and the TRP1 gene. However, the sequence coding for the DNA binding domain is that of the bacterial repressor Lex A. The promoter and the terminator used for the expression of the fusion protein are also those of the ADH1 gene. Lex DLA contains the nuclear localization signal sequence of SN40.
  • the sequences corresponding to the large loop of PS-I were inserted at the EcoRI / SalI cloning sites.
  • the vector pGEX-4Tl (fig. 6 (b)), is a bacterial plasmid of 4.9 kb. It has an origin of replication pBR322, a gene for resistance to rampicillin, a laclq gene to repress the bet ⁇ -galactosidase system. This plasmid is used to express in the bacteria fusion proteins between the protein glutathione S-transferase (GST) and peptides of interest. It has a multiple cloning site downstream of the GST gene to insert the sequences encoding the peptides.
  • GST protein glutathione S-transferase
  • the whole is controlled by the tac promoter with a high level of expression inducible by 1TPTG.
  • the peptide of interest can be separated from the GST by cleavage with thrombin, since the sequence recognized and cleaved by this enzyme has been introduced between these two regions.
  • the vector pET-29a (fig. 6 (c)), is a 5.4 kb bacterial plasmid. It has an origin of replication pBR322, an origin of replication of phage fl, a gene for resistance to kanamycin, a laclq gene.
  • This plasmid is used to express in the bacterium peptides of interest fused to an S-Tag sequence (catalytic part of the protein S ribonuclease) and a His-Tag sequence (peptide of 10 histidines) which facilitate the detection and the purification of fusion protein.
  • S-Tag sequence catalytic part of the protein S ribonuclease
  • His-Tag sequence peptide of 10 histidines
  • Oligonucleotides A and B were used to obtain the BL6 and BM fragments from the large loop.
  • Oligonucleotides C and D were used to obtain the BR fragment from a shorter region of the large loop.
  • the oligonucleotides E and F were used to obtain the Ct fragment, derived from the C-terminal part of PSI.
  • the oligonucleotides G and H were used to obtain the Nt fragment, originating from the N-terminal part of PSI.
  • Oligonucleotides I, J and K were used to amplify and sequence the inserts of the plasmids pGBT9 and pGADIO. They are, respectively, complementary to the sequences of the DLA of GAL4, of the DA of GAL4 and of the ADH1 terminator.
  • thermostable Taq polymerase or PCR
  • PCR makes it possible to amplify a DNA sequence between two known regions where oligonucleotides (of around 20 bp) can bind, which will serve as primers for a thermostable polymerase.
  • the reactions are carried out in a final volume of 100 ⁇ l in the presence of the DNA matrix (50 ng), dNTP (0.2 mM), PCR buffer (TrisHCl pH 8.5, 10 mM, 1 mM MgCl2, 5 mM KC1, 0.01% gelatin), two oligonucleotides (500 ng each) and 2.5 IU of Taq DNA polymerase Amplifier.
  • the mixture is covered with 2 drops of paraffin oil to limit the evaporation of the sample.
  • the program used has 32 cycles: 1 cycle of denaturation of the matrix (5 min at 95 ° C), 30 cycles (1 min of denaturation at 95 ° C, 1 min of hybridization of the oligonucleotides on the DNA matrix at 50 ° C, 1 min elongation with Taq polymerase at 72 ° C) finally 1 final elongation cycle (5 min at 72 ° C).
  • PCR can be performed directly on bacteria or yeast cultures in the exponential growth phase.
  • the sequencing technique used is derived from the method of Sanger et al. (1977) and adapted for fluorescence sequencing developed by Applied Biosy stems.
  • the protocol used is that described by the designers of the system (Perkin Elmer, 1995).
  • the insert originating from a plasmid DNA or from a PCR reaction and the vector plasmid are digested for 1 hour by restriction enzymes with 1 U / ⁇ g of DNA in their respective buffer (Biolabs).
  • the enzymes are chosen according to the cloning sites to introduce the insert in phase with the other domains of the vector.
  • the fragments from the digestion are separated according to their size by electrophoresis on a 0.8% "preparative" agarose gel made in TBE (Tris 90 mM, 90 mM borate, 2 mM EDTA, pH 8) with 0.5 ⁇ g / ml BET. Deposition blue (1/10 volume) is added to the samples before loading onto the gel next to a molecular weight marker (1 Kb ladder, Gibco BRL). Migration takes place at 90 constant volts / cm in TBE.
  • DNA is revealed under UN. by the fluorescence of the BET which is interposed between the bases.
  • the gel pieces containing the DNA fragments of desired sizes are cut with a scalpel, introduced into a dialysis rod with TBE and subjected to electrophoresis for 15 min at 100 volts.
  • the DNA extracted from the gel is then recovered, treated with one volume of phenol / chloroform / isoamylate (25/24/1), precipitated with 3 volumes of absolute ethanol in the presence of 0.25 M NaCl, washed once with 1 70% ethanol, dried and finally taken up in 20 ⁇ l of H2 d'H.
  • the latter are mixed in a ratio of 1/1 in the presence of 40 IU of T4 DNA ligase, of the final ligation buffer IX (TrisHCl 50 mM, pH 7, 5, 10 mM MgC_2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) in a total volume of 20 ⁇ l. Ligation takes place at 20
  • the so-called "TSB” method (after Chung and Miller, NAR vol 16, 1988) consists in weakening the wall of the bacteria by treatment with DMSO to allow the entry of DNA into the cells. Its efficiency is 10 6 transformants / ⁇ g of DNA.
  • RNA About 50 ng of DNA (10 ⁇ l for the ligation product) are added to 100 ⁇ l of competent bacteria, then the mixture is incubated for 30 min at 4 ° C. After addition of TSBglu (TSB, 20 mM glucose) and incubation at 37 ° C for 45 min, the bacteria are spread on LB media with the antibiotic corresponding to the resistance gene carried by the plasmid.
  • Electroporation is a technique 1000 times more effective than the TSB method, it is used when very small quantities of DNA are available (as after the extraction of the plasmids contained in yeasts). It consists in weakening the bacterial wall by an electric shock to introduce the DNA into the cells.
  • the bacteria are cultivated in a liquid LB medium with stirring until A f ⁇ oo ⁇ O ⁇ .
  • the culture incubated beforehand 15 min at 4 ° C., is centrifuged for 10 min at 3000 rpm and the pellet is washed successively with 1 volume of ice-cold H2 ⁇ , 1/2 volume of ice-cold H2 ⁇ , and 1/5 volume of glycerol 10 % ice cream. Between each wash, the bacteria are centrifuged 10 min at 3000 rpm to finally be taken up in 1/1000 volume of ice-cold 10% glycerol. 40 ⁇ l of this suspension of bacteria are mixed with 1 ⁇ l of DNA in an electroporation tank.
  • the tanks are placed in the BioRad Squeeze Gene so that the bacteria undergo an electric shock (25 mF, 2.5kN, 200 W). After incubation at 37 ° C for 45 min, the bacteria are spread on LB medium containing the antibiotic used for selection.
  • the membranes used are Clontech commercial nitrocellulose membranes where the mRNAs from different human tissues have already been transferred and fixed.
  • the radioactive DNA probe is prepared according to the Amersham "Rediprime DNA Labeling System" protocol. This protocol provides a rate incorporation of [ 32 P] dCTP (50 mCi) greater than 55% into the DNA fragment after an incubation of 10 min at 37 ° C. and to detect an RNA band equivalent to 0.5 pg after hybridization 2 hours and one night of autoradiography.
  • the membranes are prehybridized with 8 ml of hybridization solution (1 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO4 pH 7.4; Ficoll 10 mg / ml, polyvinylpyrrolidone 10 mg / ml, BSA 10 mg / ml, salmon sperm DNA 100 mg / ml, SDS 2%) approximately 2 hours at 42 ° C with stirring, then they are hybridized with the 2J0 6 cpm ml probe mixed with 8 ml of hybridization solution for 24 hours at 42 ° C with stirring, they are then rinsed several times with washing solution 1 (0.3 M NaCl, 30 mM sodium citrate pH 7, 0.05% SDS), washed for 40 min in this same solution, incubated 40 min at 50 ° C in washing solution 2 (15 mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate pH 7, 0.1% SDS) and finally they are subjected to autoradiography.
  • hybridization solution 1 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO
  • the double hybrid system developed by Song and Fields since 1989, is a technique of cloning by interaction in vivo, in the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is based on the fact that certain eukaryotic transactivators require only two domains to function: a DNA binding domain (DLA) which binds to a specific sequence and an activation domain (DA) which recruits the transcription machinery. (RNA polll). When the two domains are separated, the DA cannot be positioned correctly and transcription is not induced.
  • DLA DNA binding domain
  • DA activation domain
  • the DLA is fused to a protein X and the DA to a protein Y. If the proteins X and Y interact, a functional transactivating complex is formed and induces the expression of a reporter gene placed downstream of the sequence recognized by the DLA. Expression of the gene indirectly reveals the interaction between the two proteins. Transformation of yeast with one or two different plasmids.
  • the yeasts are made competent by treatment with LiAc / PEG according to the method described by Gietz (Gietz et al., 1995).
  • yeasts are cultured on YPD solid medium at 28 ° C. overnight. They are then resuspended in 1 ml of sterile solution I (0.1 M LiAc, 10 mM TrisHCl,
  • EDTA ImM pH7.5 centrifuged for 1 min at 3000 rpm and taken up again in 1 ml of solution I. 50 ⁇ l of the suspension are then mixed with 5 ⁇ g of salmon sperm DNA (carrier DNA), 1 to 5 ⁇ g of plasmid DNA and 300 ⁇ l of sterile solution II (0.1 M LiAc, 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA pH 7.5, PEG 4000 50%). The mixture is incubated for 30 min at 28 ° C. and then undergoes a thermal shock for 20 min at 42
  • the cells are washed once with sterile water and taken up in 100 ⁇ l of sterile water. Then, the yeasts are spread on YNB agar medium supplemented with amino acids and nitrogen bases necessary for their growth. To allow the selection of transformed yeast strains, the amino acids and nitrogen bases corresponding to the selection markers carried by the plasmids are not not added. The boxes are placed in an oven at 28 ° C for 3 days.
  • Transformation of yeast by a cDNA library Transformation of yeast by a cDNA library.
  • the cDNA bank used is a commercial bank (Clontech) formed from mRNA from a normal human brain (37-year-old man who died following a brain trauma).
  • the cDNAs were cloned into the plasmid pGADIO downstream of the DA region of GAL4 at the EcoRI site.
  • the average size of the inserts is 1.4 kb with a standard deviation of 1 kb.
  • the library was amplified once in E.coli DH5a to obtain 1.2 ⁇ 10 6 independent clones, 80% of which contain an insert.
  • the yeasts YCM79 previously transformed with the plasmid pGBT9 containing a sequence corresponding to a region of PS-I are cultivated overnight in 50 ml of YNB + His + Lys + Ade + Met + Leu + Ura medium at 28 ° C with stirring.
  • the cells are then harvested by centrifugation at 3000 rpm for 10 min, washed twice with 100 ml of sterile H 2 O, taken up in 10 ml of transformation solution I.
  • the suspension is centrifuged for 10 min at 3000 rpm and the cells resuspended in 2.5 ml of this same solution. Part of the suspension is taken (200 ⁇ l): half will serve as an untransformed negative control, the other half will be transformed by a control plasmid whose transformation efficiency is known.
  • the remaining suspension is mixed with 100 ⁇ l of plasmid bank of cDNA at 1 mg / ml and 20 ml of solution II.
  • the mixture is incubated for 1 hour at 28 ° C with shaking then 20 min at 42 ° C before being centrifuged for 15 min at 3000 rpm.
  • the cell pellet is washed once with water and twice with PBS in order to remove the PEG which has a toxic effect on yeasts, then is taken up in 2.5 ml of sterile PBS (Na 2 HPO 4 50 mM, 10 mM KC1, 1 mM MgSO 4 , pH 7).
  • the cells are then centrifuged for 10 min at 3000 rpm, washed twice with sterile water, taken up in 10 ml of NYNB and spread on 10 boxes of 435 cm " each containing 200 ml of selective medium YNB + His + Lys + Ade + Met The boxes are placed in an oven at 28 ° C for 3 days.
  • This technique extracts both plasmids and genomic DNA contained in yeasts. To isolate the plasmids, it is sufficient to transform bacteria where only the plasmid DNA can replicate and analyze each clone after mini-preparation.
  • the yeasts containing the plasmids are cultured on selective YNB solid medium at 28 ° C. overnight. They are then resuspended in 200 ml of breaking solution (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) in the presence of glass beads (450 ⁇ m in diameter) and 200 ml of phenol / chloroform.
  • breaking solution Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM
  • the mixture is stirred for 15 min on a vortex and then centrifuged for 2 min at 14,000 rpm.
  • the aqueous phase is dialyzed for one hour on a membrane. This solution can be used for the transformation of bacteria by electroporation.
  • This test makes it possible to verify the expression of the LacZ reporter gene coding for ⁇ -galactosidase in the transformed yeasts.
  • a nitrocellulose sheet is deposited on the individualized yeast clones.
  • the replica is immersed 3 times for 30 seconds in liquid nitrogen to break the yeasts and allow the substrate to access the beto-galactosidase.
  • the sheet is then placed, colonies upwards, on Whatman paper soaked in a PBS / Xgal solution prepared immediately (100 ⁇ l of a Xgal substrate solution at 40 mg / ml of dimethylformamide in 5 ml of PBS) then placed at 37 ° C, optimal temperature for the enzymatic activity tested.
  • the time of appearance of the blue color which reveals the ⁇ -gal activity is very variable, from a few minutes to several hours.
  • the test is carried out in the presence of a positive interaction control which quickly turns blue and a negative control which remains white.
  • This test makes it possible to analyze the phenotype of a yeast strain.
  • a drop (approximately 5 ml) of a slightly cloudy yeast suspension is deposited on various selective and non-selective agar media, and the growth of the yeasts is observed after 2 days of incubation at 28 ° C.
  • the yeasts are cultivated overnight on complete YPD medium at 28 ° C.
  • This non-selective medium allows the growth of yeasts conserving or not conserving the plasmids after cell division. Different dilutions of this culture are spread out to obtain between 50 and 100 clones per dish of YPD medium after an overnight incubation at 28 ° C. The phenotype of the clones is then tested by replicas on velvet on different selective media and the frequency of cells not containing plasmid can be estimated after 2 days of incubation at 28 ° C.
  • the fusion proteins are produced in E.coli BL21 (DE3) via the expression vectors pET and pGEX inducible by 1TPTG (Studier, 1991).
  • the bacterial pellets containing the fusion proteins are resuspended in 5 ml of TE (50 mM TrisHCl pH 8, 2 mM EDTA).
  • the cells are lysed with lysozyme 0.1 mg / ml final and 1% Triton X-100. They are incubated for 15 min at 30 ° C before being placed in ice to be subjected to ultrasound until the bacterial suspension becomes fluid.
  • the bacterial lysate is centrifuged for 15 min at 10,000 rpm at 4 ° C.
  • the supernatant containing the solubilized fusion protein can be stored at -20 ° C.
  • the various fractions obtained are analyzed by denaturing gel electrophoresis (SDS PAGE). 60 ⁇ l of the bacterial suspension before centrifugation (total fraction), 60 ⁇ l of supernatant (soluble fraction) as well as 60 ⁇ l of the pellet resuspended in 5 ml of TE (insoluble fraction) are taken. The proteins contained in the different fractions are denatured for 10 min at 95 ° C.
  • the proteins found in the insoluble fractions are denatured with 6 M urea and 10 mM DTT for 10 min at 37 ° C. and then renatured by dialysis in three successive buffers for at least 6 hours each (5 mM TrisHCl pH 8 / 2 M urea; 5 mM TrisHCl, pH 8/1 M urea; 5 mM TrisHCl, pH 8). After 15 min of centrifugation at 10,000 rpm, about 5 to 10% of the protein is in the supernatant which can be stored at -20 ° C.
  • the protein concentration of the samples must be greater than 40 mg / ml. This concentration can be estimated by a colorimetric method (Bradford reagent, for example).
  • the nitrocellulose membrane is saturated with 1% of gelatin in TBST (10 mM TrisHCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) for 15 min and incubated 15 min with protein S linked to alkaline phosphatase. After 4 washes with TBST, the activity of alkaline phosphatase is revealed by adding a PA IX buffer containing NBT and BCIP according to the Novagen method.
  • sequences ID No. 1 and ID No. 2 were subcloned by conventional methods into a vector under the control of a strong viral promoter (CMV).
  • CMV strong viral promoter
  • the established method for COS1 cells or CHO cells consists in using a lipofectant in a ratio of 1 to 8 (weight / weight) compared to DNA and a synthetic peptide (Hl) in the same ratio in order to optimize DNA compaction and transfection efficiency.
  • This method is based in particular on the neutralization of the charges of DNA phosphates by the positive charges of the lipofectant.
  • COS1 cells are cultured in an incubator at 37 ° C, 95% humidity and 5% CO 2 in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing 4.5 g / 1 glucose (Gibco-BRL) supplemented with 3% L -Glutamine, 1% penicillin- streptomycin and 10% Fetal Calf Serum.
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Gibco-BRL 4.5 g / 1 glucose
  • penicillin- streptomycin 1% penicillin- streptomycin and 10% Fetal Calf Serum.
  • the cells are seeded at a density of 2.5 ⁇ 10 10 cells per 100 mm dish.
  • the cells are rinsed twice with PBS (Phosphate Buffer Saline) and once with OptiMEM (patented composition; Gibco-BRL) for habituation of at least 15 minutes in an incubator.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • OptiMEM patented composition; Gibco-BRL
  • plasmid DNA per 100 mm box equivalent, 8 ⁇ g of plasmid DNA in total are added to 300 ⁇ l of OptiMEM and 64 ⁇ g of synthetic peptide (Hl). After having vigorously vortexed for 10 seconds, the lipofectamine (32 ⁇ l, i.e. 64 ⁇ g) diluted in
  • the whole is again vigorously vortexed and then left to stand for 30 minutes.
  • Five milliliters of OptiMEM are added per tube and the vortexed mixture is placed on the cells (from which the medium has previously been aspirated).
  • the cells are then placed in an incubator for 4 hours, at the end of which the mixture is replaced by complete medium.
  • the cells are most often lyzed 48 hours after transfection (at the usual maximum expression).
  • the lysis buffer contains 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1% Triton X100, 1% NP40 and a cocktail of protease inhibitors
  • the soluble proteins are then dosed according to the BCA kit (Pierce) in order to be able to standardize the following experiments.
  • the samples are denatured in an equal volume of deposition buffer (125 mM Tris pH 6.8, 4% m / v SDS, 20% glycerol, 0.02% Bromophenol Blue, 50 mM Dithiothreitol) at 95 ° C for 5 minutes.
  • deposition buffer 125 mM Tris pH 6.8, 4% m / v SDS, 20% glycerol, 0.02% Bromophenol Blue, 50 mM Dithiothreitol
  • the samples are deposited on Tris-Glycine gels (Novex), with a different percentage of acrylamide depending on the molecular weight to be discriminated.
  • a molecular weight marker is also deposited (Broad Range, BioRad). The migration takes place for approximately 2 hours at 100 constant volts in final SDS IX buffer (Novex). The gel is then transferred to a nitrocellulose or PVDF membrane (final IX transfer buffer (Novex) with 10% methanol) for 2 hours at 150 m constant A.
  • the membrane is blocked for 2 hours at room temperature in 50 ml of PBS-T (PBS with 0.5% Tween) containing 2% skimmed milk (Merck).
  • the primary antibody (diluted to the optimal concentration of the order of 1 / 1000th to 1 / 5000th, in PBS-T with or without 2% skim milk) is left overnight at 4 ° C.
  • the membrane is incubated for 45 minutes in the presence of the second antibody (anti-mouse or anti-rabbit Ig G as the case may be, coupled with horseradish peroxidase) diluted to l / 5000 e in a buffer.
  • the second antibody anti-mouse or anti-rabbit Ig G as the case may be, coupled with horseradish peroxidase
  • ECL Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 0J%).
  • the membrane is then rinsed 4 times 15 minutes in the "ECL” buffer. It can be revealed by the ECL reagent (Amersham) consisting of 2 buffers to be mixed extemporaneously in equal volume. Different exposures of a photographic film (Hyperfilm ECL; Amersham) are carried out, followed by development.
  • Example 1 Isolation of specific partners of PS 1 by screening of brain cDNA fusion library
  • a human brain cDNA library was screened by the double-hybrid technique.
  • a cDNA library fused with the DA of GAL4 was used and different bait proteins were constructed by fusing the hydrophilic regions of PS-I with the DLA of GAL4.
  • fusion proteins were produced using the vector pGBT9 into which the sequences corresponding to different hydrophilic regions of PS 1 were introduced in the same reading frame as the DLA sequence of GAL4. It was chosen to identify proteins interacting with the N-terminal region (Nt, codons 1 to 81), the large loop (BL6, codons 263 to 407), the large loop with the L286V (BM) mutation, a region shorter of the large loop (BR, codons 290 to 376) and finally the C-terminal part of the protein (Ct, codons 421 to 467).
  • the DNA fragments corresponding to these different regions were obtained by PCR from the entire PS 1 cDNA sequence.
  • the various oligonucleotides used allowed the introduction of the EcoRI and SalI sites to ends of each amplified sequence.
  • the PCR fragments could be inserted between the EcoRI and SalI sites of the pGBT9 cloning multisite downstream and in phase with the DLA sequence of GAL4.
  • the different constructions obtained, pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR and pGBT-Ct were verified by DNA sequencing. This verification showed that the fragments did not present any mutation generated by the PCR and that they were indeed in the same open reading frame as that of the DLA sequence of GAL4.
  • yeast strain previously transformed by the vector coding for the bait protein was used, in order to have the best possible efficiency during cDNA library screening.
  • the yeast strain YCM 79 was transformed with each of the plasmids pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR and pGBT-Ct.
  • the yeasts containing these plasmids were selected for their Trp + phenotype on medium not containing tryptophan and respectively called yNt, yBL6, yBM, yBR and yCt.
  • the presence of these different plasmids in each strain was verified by carrying out a PCR directly on the yeasts, using oligonucleotides complementary to the DLA and tADH1 sequences located 5 'and 3' of the insert. The size of the PCR fragments obtained makes it possible to distinguish the different strains with the exception of the yBL6 and yBM strains.
  • the first test therefore consists in verifying that the hydrophilic regions of PS-I do not have transactivating activity when they are fused to the DLA of GAL4, that is to say capable of inducing, on their own, transcription reporter genes.
  • This type of activity can, for example, be linked to the presence of an acid domain in the fusion protein.
  • the strains yNt, yBL6, yBM, yBR and yCt of phenotype Trp + Leu- were transformed by the plasmid pGAD424 (equivalent pGADIO) which codes for the DA of GAL4.
  • the yeasts were selected on a medium without tryptophan or leucine and the expression of the reporter genes LacZ and URA3 making it possible to control the interaction was tested on the clones obtained.
  • the fusion proteins containing the hydrophilic parts of PS-I therefore do not have an intrinsic transactivating property and do not interact with the activation domain of GAL4. They can therefore be used as bait proteins for screening the bank.
  • the screening of the fusion library makes it possible to identify clones expressing peptides fused to the DA of GAL4 interacting with the bait protein. If this interaction exists, it must allow the reconstitution of a transactivator functional capable of inducing the expression of the reporter genes URA3 and LacZ in the strain containing the bait protein.
  • each independent plasmid constituting the library is present in, at least, a yeast clone after transformation.
  • a protocol theoretically making it possible to obtain a number of transformants greater than the number of plasmids independent of the bank was used (cf. materials and methods).
  • the 5 strains yNt, yBL6, yBM, yBR and yCt of phenotype His-, Lys-, Ade-, Met-, Ura-, Leu-, were successively transformed by 100 ⁇ g of plasmid DNA from the fusion bank and the cells transformants were selected on YNB + His + Lys + Ade + Met medium.
  • the plasmids contained in the yeasts yBM.C and yBM.D were extracted.
  • the plasmids present in DNA preparations have been used to transform bacteria by electroporation.
  • the plasmids extracted from the bacterial clones obtained, were digested with different enzymes. This analysis revealed 5 different restriction profiles.
  • the digests of the plasmids extracted from yBM.C and yBM.D yeasts have a common profile corresponding to the plasmid pGBT-BM and two different profiles corresponding to the plasmid pGADIO containing an insert of 2900bp corresponding to the sequence ID No. 1 (pGAD-C being from the strain yBM.C) and an insert of 1400 bp corresponding to the sequence ID No. 2 (pGAD-D being from the strain yBM.D).
  • HF7 C has two reporter genes HIS3 and LacZ.
  • the LacZ gene has a promoter environment different from that existing in the YCM 79 strain, which makes it possible to control that the obtaining of ⁇ -gal + clones is not linked to a specific promoter environment but indeed to an interaction between the proteins tested.
  • PCY 2 has the advantage of having only one LacZ reporter gene which is expressed more strongly than in the other two strains when the GAL4 transactivator is functional.
  • the interaction is confirmed when the transformed YCM 79 and HF7 C yeasts develop on selective media without uracil or histidine, that is to say that they express, in a safe manner, at least one of their reporter gene.
  • the intensity of the response (more or less blue, more or less developed colonies) is assumed to be proportional to the rate of expression of the reporter genes.
  • the variations in this rate can be explained in different ways.
  • a low level can result from a weak interaction between the proteins reconstituting the GAL4 transactivator. It may also be due to the intervention of a third protein which would destabilize the formation of the complex, or else to an instability of the fusion proteins in the yeast, or else to the state of the yeasts.
  • the yeasts may be in a state of low transcriptional activity linked, for example, to a problem of toxicity of exogenous proteins.
  • the brain fusion proteins that have been isolated do not interact with the N-terminal part and with the C-terminal of PS 1. On the other hand, they all seem to interact with the hydrophilic region BL6, the hydrophilic region BL6 mutated (BM), as well as the reduced form of this region (BR).
  • the yeasts thus transformed were capable of expressing their reporter genes.
  • the YCM 79 yeasts had the Ura-, ⁇ -gal- phenotype, the HF7 C yeasts were all His-, ⁇ -gal- and the PCY 2, ⁇ -gal- yeasts.
  • BL6 and BM fragments were fused to another DLA, that of the bacterial repressor LexA.
  • Two additional plasmid constructs (pLex-BS and pLex-BM) were performed, where the sequences of the hydrophilic loop BL6 and of the mutated form were fused to the LexA gene at the EcoRI / SalI sites of the plasmid pLex9.
  • yeast strain L40 in which the expression of the reporter genes HIS3 and LacZ is induced by the fixation of the DLA-LexA / DA-GAL4 complex on the operator site of LexA has been transformed.
  • Interaction with the pairs of plasmids was tested: pLex-BL6 / pGAD-Y (Y for C or D), pLex-BM / pGAD-Y, pLex- RAS / pGAD-RAF (positive interaction control) ( Vojtek et al, 1993) and pLex- RAS / ⁇ GAD424, ⁇ Lex-BL6 / pGAD424, pLex-BL6 / pGAD-RAF, pLex- BM / pGAD424, pLex-BM / pGAD-RAF (negative interaction controls).
  • Insert D has an open reading phase over its entire sequence (Seq ID No. 2).
  • insert C contains a stop codon at the end of the sequence (Seq ID No. 1).
  • nucleic acid and peptide sequences of the inserts were compared with sequences listed in the “Gen Bank” and “EMBL” (European Molecular Biology Lab) databases. No significant similarity was found between the inserts and the genes (or proteins) stored in these libraries.
  • the radioactive probe prepared from insert C made it possible to hybridize a 9.5 kb mRNA expressed specifically in the brain and more particularly in the cerebral cortex, the frontal lobe and the temporal lobe. (cf. Fig3). The size of this mRNA suggests that the translated protein is large.
  • EXAMPLE 4 In vitro interaction test.
  • the proteins are produced in E. coli BL21 (DE3) in order to obtain a large quantity thereof.
  • the 2 isolated peptides have been fused to tag peptides allowing their detection and their fixation on supports. For this, it was chosen to merge the GST protein, which binds to glutathione, to the various forms of the BL6 region and the S-Tag peptide, recognized specifically by the S protein, to the isolated peptides (cf. material and method for the principle of the test).
  • a plasmid (pET-D) was obtained containing the insert corresponding to PepD.
  • the partial sequencing of this plasmid showed that the insertion was carried out in the desired reading phase.
  • This plasmid made it possible to obtain a 52kDa protein corresponding to the STag-PepD fusion protein.
  • the STag-PepD protein is produced in BL21 (DE3) bacteria after induction at 1TPTG.
  • the vector pGEX-4Tl was used in which the EcoRI / SalI fragments originating from the plasmids pGBT-BL6, pGBT-BM and pGBT-BR been introduced.
  • the plasmid pGEX-BM corresponding to the mutated loop of PS-I was obtained.
  • the sequencing showed that the insertion was indeed carried out in the context of reading the GST sequence.
  • This plasmid allowed the production of the GST-BM fusion protein of 42kDa in the bacteria BL21 (DE3) after induction at 1TPTG.
  • the GST-BM protein After the lysis of the bacteria, the GST-BM protein remains entirely in the insoluble fraction while the STag peptide as well as the STag-PepD protein and the GST are partly found in the soluble fraction.
  • the solubilization of the fusion proteins is absolutely necessary for carrying out the affinity chromatography.
  • the GST-BM protein was specifically fixed on a glutathione resin covalently coupled to agarose beads in order to then be able to test the interaction of GST-BM with the peptide partners of PS 1 merged with STag (cf. Materials and methods). If the proteins are not dissolved, they sediment with the beads in the absence of any specific bond with them.
  • the 1400 bp pGAD-D EcoRI restriction fragment was isolated and phase-subcloned into the EcoRI site of the expression vector.
  • the constructs carrying the cDNA in the correct orientation were chosen by enzyme restriction analysis.
  • the EcoRI (1) -HindIII (391) fragment of pGAD-C was first isolated.
  • a second HindIII (392) -MscI (2892) fragment was then isolated by partial digestion.
  • the EcoRI (1) - HindIII (391) and HindIII (392) -MscI (2892) fragments were ligated together with the expression vector digested with EcoRI and EcoRV, the latter site being blunt-ended.
  • the correct constructs carrying the entire coding sequence of C were identified by restriction analysis.
  • constructs were transfected into COS1 cells by standard methods. After cell lysis, the samples are analyzed by immunoblot and revelation with the anti-myc antibody. The expression of the partners could be detected by immunoblotting using the anti-Myc antibody 9E10 (FIG. 5). We were able to detect a very intense 120 kDa band as expected for pepC, demonstrating strong expression (lane C). For D, the intensity of the band detected was not always constant. On the other hand, the expression in CHO cells could be detected. In this cell type, D is perhaps a little more stable and appears as a protein migrating towards 80 kDa (lane D).
  • the two proteins could therefore be expressed and detected in mammalian cells.
  • GAG GAG CAA AAA CAG GTA TAT AAG AGG AAA ACT GAG GCT GCC AAG AAA 864 Glu Glu Gin Lys Gin Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys 1185 1190 1195 1200

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne des acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.

Description

ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR DES PROTEINES CAPABLES D'INTERAGIR AVEC LES PRESENILINES
La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne des acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilmes, les procédés de production des dites protéines ainsi que des compositions les contenant.
La maladie d'Alzheimer est la plus courante des démences. Sa fréquence globale augmente avec l'âge, elle est de 5 à 10% après 65 ans et de 20% au delà de 80 ans.
Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique et seuls des soins palliatifs peuvent être offerts aux patients. Cette maladie n'est vraiment confirmée qu'après l'analyse histologique du cerveau en post-mortem par manque d'un diagnostic précis et précoce.
La maladie d'Alzheimer est liée à des lésions cérébrales organiques constituant des signes histologiques: plaques séniles, dégénérescences neurofibrillaires neuronales, perte et atrophie des neurones au niveau du cortex.
L'étiologie de la maladie est complexe, de nombreux gènes y sont impliqués et les différents mécanismes physiopathologiques auxquels ils participent ne sont pas entièrement compris.
Il a été décrit des altérations anatomiques du cerveau observées chez des patients de moins de 65 ans, liées aux démences préséniles. Actuellement, on englobe sous le terme "démences de type Alzheimer", les démences préséniles (avant 65 ans) aussi bien que les démences séniles (après 65 ans) présentant les mêmes caractéristiques.
Il existe deux formes de la maladie : des formes sporadiques, c'est-à-dire non liées à l'hérédité et des formes familiales.
Les formes sporadiques de la maladie sont les plus fréquentes, elles concernent 60 à 90% des patients et apparaissent le plus souvent après 65 ans. Les origines de la pathologie demeurent inconnues dans la plupart des cas. Cependant, il a été établi que des traumatismes crâniens, des inflammations, des chocs affectifs ou des situations de grand stress augmentent la probabilité d'apparition de la maladie (Seubert et al, 1992).
Les formes familiales de la maladie représentent 10 à 40% des cas. Elle sont classées en deux groupes, les formes tardives (après 65 ans) et les formes précoces (avant 65 ans). Dans les cas précoces, l'affection se transmet selon un caractère dominant et autosomal.
En 1992, l'existence d'un locus AD3 a été mise en évidence sur le chromosome 14 et en 1995 le gène de la préséniline 1 (PS-1) a été isolé (le gène a été initialement appelé S182) (Sherrington et al., 1995). Des mutations du gène de la préséniline 1 sont impliquées dans 70% des formes très précoces de la maladie (avant 55 ans). De très rare cas de formes précoces sont liées à des mutations du gène de la préséniline 2 situé sur le chromosome 1 (Levy-Lahad et al. 1995). Ce gène présente 67% d'identité avec le gène de la préséniline 1.
Le gène est formé de 12 exons, les exons 3 à 12 codent pour la protéine. Il est exprimé de façon ubiquitaire et génère un transcript majoritaire de 2,7 kb et un transcript minoritaire de 7,5 kb (Kovacs, 1996). La protéine, comprend 467 acides aminés, et présente la structure d'une protéine membranaire. Elle présente au moins 8 domaines transmembranaires potentiels. Les acides aminés correspondant aux codons touchés par les mutations répertoriées se répartissent sur l'ensemble de la protéine, ils se situent aussi bien dans les régions hydrophobes (TM) que dans les boucles hydrophiles (BL), avec cependant, deux régions privilégiées, TM2 et BL6.
Actuellement, plus de 35 mutations ponctuelles ont été rapportées et les mutations identifiées jusqu'à présent sont presque toutes de type "faux sens" (c'est à dire qu'elles aboutissent au changement ponctuel d'un acide aminé sur la séquence de la protéine). Toutefois, un autre type de mutation affectant l'épissage a récemment été rapporté (Perez-Tûr et al., 1995), dans ce cas, le gène est altéré par la perte de l'exon 9.
Le rôle des présénilines dans la cellule normale est encore mal connu. De nombreuses hypothèses ont été émises. Parmi ces hypothèses,la préséniline 1 (PS-1) pourrait avoir un rôle dans le trafic cellulaire. Cette hypothèse est confortée par un résultat immunocytochimique qui a permis de localiser PS-1 au niveau du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi dans des cellules de neurogliome humain (Kovacs et al., 1996). Par ailleurs, PS-1 jouerait un rôle dans la communication cellulaire et les mécanismes d'endocytose et la protéolyse de l'APP (Dewji et Singer, 1996). Une troisième hypothèse implique PS-1 dans des interactions avec le cytosquelette et notamment les microtubules associés à la protéine Tau (Lew et Wang, 1996). Enfin, compte tenu de sa structure, PS-1 pourrait jouer le rôle d'un récepteur couplé aux protéines G participant à la transduction du signal ou encore celui d'un transporteur ou d'un canal ionique (Van Broeckhoven, 1995).
La recherche de partenaires interagissant avec les présénilines permettrait de comprendre le rôle exacte des présénilines.
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse d'acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines. La mise en évidence de tels acides nucléiques permet d'envisager la préparation de nouveaux polypeptides utilisables pharmaceutiquement.
Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.
Selon un mode particulier, les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec tout ou partie de la grande boucle de la préséniline PS- 1. Plus préférentiellement les séquences nucléotidiques selon l'invention comprennent tout ou partie de la SEQ ID N°l ou de ses dérivées ou tout ou partie de la SEQ ID N°2 ou de ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation (Maniatis et al.; 1989).
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d',ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origine par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier. La présente invention a également pour objet des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec les présénilines. De manière préférée, les polypeptides selon l'invention son capables d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-1 et/ou la grande boucle de la préséniline PS-2. Plus préférentiellement, il s'agit de polypeptides capables d'interagir avec la séquence d'amino-acides 310-463 de la grande boucle de la préséniline PS-1.
Au sens de la présente invention la dénomination préséniline couvre les présénilines PS-1 et PS-2 en elles même ainsi que leurs formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de ces protéines.
La présente invention concerne également des polypeptides comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 ou d'un dérivé de celles-ci.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant des séquences présentées en séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'interagir avec les présénilines. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. Il peut également s'agir de fragments des séquences peptidiques indiquées ci- dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de l'homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de l'homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides selon l'invention, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de l'activité des Présénilines.
En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement des Présénilines par le biais des protéines selon l'invention et notamment d'inhiber ou de ralentir l'activité des Présénilines mutées.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonomes chez l'hôte choisi. S 'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces .
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour l'expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2, pour la production des protéines selon l'invention.
Une autre application des séquences d'acides nucléiques selon l'invention est la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement , l'expression de protéines capables d'interagir avec les présénilines. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotiques définies ci-avant et peuvent être obtenus par fragmentation, etc. ou par synthèse chimique. Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et la production in vivo de séquences antisens ou l'expression de protéines ou de polypeptides capables de moduler l'activité des présénilines. A cet égard les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vivo. Le vecteur peut être un plasmide dont l'obtention est connue de l'homme du métier. A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés ou virus de l'herpès. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant ou des ARNm correspondants, utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection des présénilines, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent par exemple comporter jusqu'à l'intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc).
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/ ou de révéler l'interaction entre les présénilines et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les présénilines et les polypeptides selon l'invention.
La mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs ou de ligands des polypeptides selon l'invention, est réalisé selon les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle- ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre les présénilines et les polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologiques. L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps et séquences nucléotidiques définis ci-avant ou des fragments de ceux-ci sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Elle a également pour objet les compositions dans lesquelles les séquences nucléotidiques selon l'invention sont incorporées dans un vecteur recombinant viral ou non viral.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'activité des présénilines. Plus préférentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement l'activité des présénilines et notamment les formes mutées. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégéneratives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
Liste des figures
Figure 1. Schéma de la préséniline I et de la partie utilisée pour le test en double hybride.
Figure 2. Isolation de souches yBM-C et yBM-D par test d'auxotrophie des levures portant différents plasmides contenant notamment le clone C (correspondant à la SEQ ID N°l) et le clone D (correspondant à la SEQ ID N°2)
Figure 3. Expression des ARNm correspondants aux peptides C et D dans les tissus humains
Figure 4. Schéma du vecteur d'expression mammifère utilisé. Figure 5. Expression des protéines de fusion C et D en cellules mammifères.
Figure 6 (a, b, c). Cartes des principaux vecteurs
MATERIELS ET METHODES
1) Les souches de levures utilisées sont les suivantes:
S.cerevisiae YCM 79 (MATa, ade2, trpl, leu2, lys2, ura3, his3, gal4, gal80, met 16 rr GALl/10-URA3 lacZ ,HIS3 rr GAL7-phleoR ).
S.cerevisiae PCY 2 (MATa, DgaU, Dgal80, ade2, trpl, leu2, lys2, his3 URA3 :: GAL1/10- lacZ .
S.cerevisiae HF7 C (MATa, ura3, his3, ade2, trpl, leiû, lys 2, gal4, gal80, can , URA3 :: GAL4 bindingsite- CYCl-lacZ, LYS2 rr GAL1- HIS3).
S.cerevisiae L 40 (MATa, his3, ade2, trpl, leu2, lys2, URA3 :: LexA-lacZ, LYS2 rr LexA-HIS3).
2) Les souches de bactéries utilisées sont les suivantes :
E.coli TGl (F'[ traD 36, lacl q , lacZ D Ml 5, proA+B+J, supE, thi-1, D (lac-pro AB), D (hsdM-mcrB)5 (rκ-mκ- McrB-).
E.coli BL21 (DE3) ( F-, ompT, hsdSβ (rB~mB ), gai, dcm, (DE3).
3) Les milieux de culture mis en oeuvre pour les diverses souches sont les suivants :
milieu YPD complet pour les levures :
-Bacto-yeast extract (10 g/1) (Difco)
-Bacto-peptone (20 g/1) (Difco) -Glucose (20 g/1) (Merk)
Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20 g/1) et rendu stérile à 110 °C pendant 20 min dans un autoclave.
milieu YNB minimum pour les levures :
-Bacto-yeast nitrogen base without amino acids (6,7 g/1) (Difco)
-Glucose (20g l) (Merk)
Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20g/l) et stérilisée par autoclavage. Les acides aminés ou les bases azotées nécessaires à la croissance des levures auxotrophes sont ajoutés ensuite à 50mg/l. On ajoute aussi de l'Ampicilline à lOOμg/ml pour éviter les contaminations bactériennes.
milieu LBcomplet pour les bactéries :
-Bacto-yeast extract (5 g/1) (Difco)
-Bacto-tryptone (10 g/1) (Difco)
-NaCl (5 g/1) (Difco)
Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (12 g/1) et stérilisé par autoclave. L'ampicilline ou la kanamycine sont ajoutées à 100 μg/ml pour sélectionner les bactéries ayant été transformées par les plasmides portant les marqueurs de résistance correspondants.
4) Les plasmides utilisés sont les suivants :
Le vecteur pGBT9 (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 5,5 kb pouvant être propagé et sélectionné dans les bactéries E.coli aussi bien que dans les levures. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance à l'ampicillme (propagation et sélection dans E.coli.) ainsi qu'une origine de réplication 2mm et un gène TRP1 (sélection chez les levures trpl- déficientes pour la synthèse du tryptophane). Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la levure des protéines de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN (DLA) de GAL4 et des peptides d'intérêt. Il possède un site multiple de clonage en aval de la région DLA de GAL4, le tout étant situé entre le promoteur et le terminateur du gène ADHl codant pour l'alcool deshydrogènase 1. Le DLA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Les séquences correspondant à différentes parties de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SalI.
Le vecteur pGADIO (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 6,6 kb. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance à l'ampicilline qui permettent sa propagation et sa sélection dans E.coli.. Il contient aussi une origine de réplication de levure (2mm) et un gène de sélection LEU2 pour isoler les levures transformées. Il possède un site multiple de clonage en aval de la séquence codant pour le domaine d'activation (DA) de GAL4 entre le promoteur et le terminateur de ADHl. Le DA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Ce plasmide a été utilisé pour réaliser une banque d'ADNc de cerveau humain commerciale (Clontech). Les séquences d'ADNc ont été insérées au site de clonage EcoRI.
Le vecteur pLex 9 (fig. 6 (b)), est un plasmide navette de 5 kb. Comme pGBT9, il possède l'origine ColEl, le gène Amp , ainsi que l'origine de réplication 2mm et le gène TRPl. Cependant, la séquence codant pour le domaine de liaison à l'aADN est celle du répresseur bactérien Lex A. Le promoteur et le terminateur servant à l'expression de la protéine de fusion sont également ceux du gène ADHl . Le DLA de Lex A contient la séquence signal de localisation nucléaire de SN40.
Les séquences correspondantes à la grande boucle de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SalI. Le vecteur pGEX-4Tl (fig. 6 (b)), est un plasmide bactérien de 4,9 kb. Il possède une origine de réplication pBR322, un gène de résistance à rampicilline, un gène laclq pour réprimer le système betα-galactosidase. Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la bactérie des protéines de fusion entre la protéine glutathion S-transferase (GST) et des peptides d'intérêt. Il possède un site multiple de clonage en aval du gène de la GST pour insérer les séquences codant pour les peptides. L'ensemble est contrôlé par le promoteur tac à haut niveau d'expression inductible par 1TPTG. Après production de la protéine, le peptide d'intérêt peut être séparé de la GST par clivage à la thrombine, car la séquence reconnue et clivée par cette enzyme a été introduite entre ces deux régions.
Le vecteur pET-29a (fig. 6 (c)), est un plasmide bactérien de 5,4 kb. Il possède une origine de réplication pBR322, une origine de réplication du phage fl, un gène de résistance à la kanamycine, un gène laclq. Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la bactérie des peptides d'intérêt fusionnés à une séquence S-Tag (partie catalytique de la protéine S ribonucléase) et une séquence His-Tag (peptide de 10 histidines) qui facilitent la détection et la purification de la protéine de fusion. Le promoteur de transcription T7 permet une forte expression après induction à 1TPTG. Une séquence reconnue et clivée par la thrombine a été introduite entre les séquences S-Tag et His- Tag.
5) Les oligonucléotides de synthèse employés :
A partir de la séquence de PS-I (Sherrington et al., 1995), différents couples d'oligonucléotides on été définis afin d'obtenir les fragments d'ADN correspondant aux régions hydrophiles de PS-I. Ces oligonucléotides permettent d'introduire un site EcoRI en 5' et un site Sali en 3' de la séquence après amplification par PCR.
oligoA CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT (SEQ ID N° 3)
oligoB CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC (SEQ ID N° 4) Les oligonucléotides A et B ont servi à obtenir les fragments BL6 et BM issus de la grande boucle.
oligoC CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG (SEQ ID N° 5)
oligoD CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC (SEQ ID N° 6)
Les oligonucléotides C et D ont servi à obtenir le fragment BR issu d'une région plus courte de la grande boucle.
oligoE CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC (SEQ ID N° 7)
oligoF CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA (SEQ ID N° 8)
Les oligonucléotides E et F ont servi à obtenir le fragment Ct, issu de la partie C- terminale de PSI.
oligoG CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA (SEQ ID N° 9)
oligoH AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT (SEQ ID N° 10)
Les oligonucléotides G et H ont servi à obtenir le fragment Nt, issu de la partie N- terminale de PSI.
Les oligonucléotides I, J et K ont été utilisés pour amplifier et séquencer les inserts des plasmides pGBT9 et pGADIO. Ils sont, respectivement, complémentaires des séquences du DLA de GAL4, du DA de GAL4 et du terminateur ADHl .
oligol GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG (SEQ ID N° 11 )
oligo J CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC (SEQ ID N° 12)
oligoK GGC GAA GAA GTC CAA AGC (SEQ ID N° 13)
6) Les méthodes de biologie moléculaire. Préparation de l'ADN plasmidique.
Les préparations en petite quantité et en grande quantité d'ADN plasmidique ont été effectuées selon les protocoles décrits dans Maniatis et al. (1989).
Amplification en chaîne par la polymerase Taq thermostable (ou PCR).
La PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN entre deux régions connues où peuvent se fixer des oligonucléotides (de 20 pb environ) qui serviront d'amorces à une polymerase thermostable. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 100 μl en présence de la matrice d'ADN (50 ng), de dNTP (0,2 mM), de tampon PCR (TrisHCl pH 8,5, 10 mM, MgCl2 1 mM, KC1 5 mM, gélatine 0,01%), des deux oligonucléotides (500 ng chacun) et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymerase. Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon.
Le programme utilisé comporte 32 cycles : 1 cycle de dénaturation de la matrice (5 min à 95 °C), 30 cycles (1 min de dénaturation à 95 °C, 1min d'hybridation des oligonucléotides sur la matrice d'ADN à 50 °C, 1 min d'élongation par la Taq polymerase à 72 °C) enfin 1 cycle d'élongation finale (5 min à 72 °C).
La PCR peut être effectuée directement sur des cultures de bactéries ou de levures en phase exponentielle de croissance.
Séquençage par fluorescence.
La technique de séquençage utilisée est dérivée de la méthode de Sanger et al. (1977) et adapté pour le séquençage par fluorescence développé par Applied Biosy stems. Le protocole utilisé est celui décrit par les concepteurs du système (Perkin Elmer, 1995).
Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide par ligation.
L'insert provenant d'un ADN plasmidique ou d'une réaction de PCR et le plasmide vecteur sont digérés 1 heure par des enzymes de restriction à 1 U/μg d'ADN dans leur tampon respectif (Biolabs). Les enzymes sont choisies en fonction des sites de clonage pour introduire l'insert en phase avec les autres domaines du vecteur.
Les fragments issus de la digestion sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur un gel " préparatif " d'agarose 0,8% fait dans du TBE (Tris 90 mM, borate 90 mM, EDTA 2mM, pH 8) avec 0,5 μg/ml de BET. Du bleu de dépôt (1/10 de volume) est ajouté aux échantillons avant leur chargement sur le gel à côté d'un marqueur de poids moléculaire (1 Kb ladder, Gibco BRL). La migration s'effectue à 90 volts/cm constants dans du TBE.
L'ADN est révélé sous UN. par la fluorescence du BET qui s'est intercalé entre les bases. Les morceaux de gel contenant les fragments d'ADN de tailles voulues (vecteur et insert) sont découpés au scalpel, introduits dans un boudin à dialyse avec du TBE et soumis à une électrophorèse pendant 15 min à 100 volts. L'ADN extrait du gel est ensuite récupéré, traité par un volume de phénol/chloroforme/isoamylate (25/24/1), précipité par 3 volumes d'éthanol absolu en présence de NaCl 0,25 M, lavé une fois à l'éthanol 70%, séché et enfin repris dans 20μl d'H2θ.
Après avoir estimé sur gel les quantités respectives de vecteur et d' insert, ces derniers sont mélangés dans un rapport de 1/1 en présence de 40 U.I. de T4 DNA ligase, du tampon de ligation IX final (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, MgC_2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) dans un volume total de 20 μl. La ligation s'effectue à 20
_C pendant au moins une heure.
Transformation des bactéries par un plasmide.
1) La méthode dite au " TSB " (d'après Chung et Miller, N.A.R. vol 16, 1988) consiste à fragiliser la paroi des bactéries par un traitement au DMSO pour permettre l'entrée de l'ADN dans les cellules. Son efficacité est de 106 transformants/μg d'ADN. Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide pendant environ 3 heures sous agitation (jusqu'à A600=0,6). La culture est centrifugée 10 min à 3000 rpm, le culot est repris dans 1/10 du volume initial par du TSB (milieu LB, PEG400o 10%, DMSO 5%, MgCl2 10 mM, MgSθ4 10 mM), et incubé 15 min à 4°C. Environ 50 ng d'ADN (10 μl pour le produit de ligation) sont ajoutés à lOOμl de bactéries compétentes, puis le mélange est incubé 30 min à 4 °C. Après addition de TSBglu (TSB, glucose 20 mM) et incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieux LB avec l'antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le plasmide.
2) L'électroporation est une technique 1000 fois plus efficace que la méthode au TSB, elle est utilisée lorsqu'on dispose de très faibles quantités d'ADN (comme après l'extraction des plasmides contenus dans les levures). Elle consiste à fragiliser la paroi bactérienne par un choc électrique pour introduire l'ADN dans les cellules.
Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide sous agitation jusqu'à Af^oo≈O^. La culture, incubée préalablement 15 min à 4 °C, est centrifugée 10 min à 3000 rpm et le culot est lavé successivement par 1 volume d'H2θ glacée, 1/2 volume d'H2θ glacée, et 1/5 volume de glycérol 10% glacé. Entre chaque lavage, les bactéries sont centrifugées 10 min à 3000 rpm pour enfin être reprises dans 1/1000 volume de glycérol 10% glacé. 40 μl de cette suspension de bactéries sont mélangés avec l μl d'ADN dans une cuve à électroporation. Les cuves sont placées dans le Gène Puiser BioRad pour que les bactéries subissent un choc électrique (25 mF, 2,5kN, 200 W) . Après incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieu LB contenant l'antibiotique servant à la sélection.
Hybridation des ARΝm après transfert sur membrane (ou Northern Blot).
Les membranes utilisées sont des membranes de nitrocellulose commerciales Clontech où les ARNm issus de différents tissus humain ont déjà été transférés et fixés.
La sonde d'ADN radioactive est préparée suivant le protocole « Rediprime DNA Labelling System » Amersham. Ce protocole permet d'obtenir un taux d'incorporation du [32P] dCTP (50 mCi) supérieur à 55 % dans le fragment d'ADN après une incubation de 10 min à 37 °C et de détecter une bande d'ARN équivalent à 0,5 pg après une hybridation de 2 heures et une nuit de mise en autoradiographie.
Les membranes sont préhybridées avec 8 ml de solution d'hybridation (NaCl 1 M, NaH2PO4 10 mM pH 7,4 ; Ficoll 10 mg/ml, polyvinylpyrrolidone 10 mg/ml, BSA 10 mg/ml, ADN de sperme de saumon 100 mg/ml, SDS 2%) environ 2 heures à 42 °C sous agitation, puis elles sont hybridées avec la sonde à 2J06 cpm ml mélangée avec 8 ml de solution d'hybridation pendant 24 heures à 42 °C sous agitation, elles sont ensuite rincées plusieurs fois avec la solution 1 de lavage (NaCl 0,3 M, sodium citrate 30 mM pH 7, SDS 0,05%), lavées pendant 40 min dans cette même solution, incubées 40 min à 50 °C dans la solution 2 de lavage (NaCl 15 mM, sodium citrate 1,5 mM pH 7, SDS 0,1%) et enfin elles sont soumises à une autoradiographie.
7) Les méthodes pour le système double hybride.
Principe du système.
Le système double hybride, développé par Song et Fields depuis 1989, est une technique de clonage par interaction in vivo, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il repose sur le fait que certains transactivateurs eucaryotes ne nécessitent que deux domaines pour fonctionner: un domaine de liaison à l'ADN (DLA) qui se fixe sur une séquence spécifique et un domaine d'activation (DA) qui recrute la machinerie de transcription (ARN polll). Lorsque les deux domaines sont séparés, le DA ne peut pas se positionner correctement et la transcription n'est pas induite.
Dans ce système, le DLA est fusionné à une protéine X et le DA à une protéine Y. Si les protéines X et Y interagissent, un complexe transactivateur fonctionnel se forme et induit l'expression d'un gène rapporteur placé en aval de la séquence reconnue par le DLA. L'expression du gène permet de révéler indirectement l'interaction entre les deux protéines. Transformation de la levure par un ou deux plasmides différents.
Les levures sont rendues compétentes par un traitement au LiAc/PEG d'après la méthode décrite par Gietz (Gietz et al., 1995).
Les levures sont cultivées sur milieu solide YPD à 28 °C pendant une nuit. Elles sont ensuite resuspendues dans 1 ml de solution I stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCl 10 mM,
EDTA ImM pH7,5), centrifugées 1 min à 3000 rpm et reprises à nouveau dans 1 ml de solution I. 50 μl de la suspension sont alors mélangés à 5 μg d'ADN de sperme de saumon (ADN entraîneur), 1 à 5 μg d'ADN plasmidique et 300 μl de solution II stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5, PEG4000 50%). Le mélange est incubé 30 min à 28 °C puis subit un choc thermique pendant 20 min à 42
°C. Après centrifugation 1 min à 3000 rpm, les cellules sont lavées une fois à l'eau stérile et reprises dans 100 μl d'eau stérile. Puis, les levures sont étalées sur milieu gélose YNB additionné des acides aminés et bases azotées nécessaires à leur croissance.Pour permettre la sélection des souches de levure transformées, les acides aminés et les bases azotées correspondant aux marqueurs de sélection portés par les plasmides ne sont pas ajoutés. Les boîtes sont mises à l'étuve à 28 °C pendant 3 jours.
Transformation de la levure par une banque d'ADNc.
La banque d'ADNc utilisée est une banque commerciale (Clontech) constituée à partir d'_ARNm d'un cerveau humain normal (homme de 37 ans décédé à la suite d'un traumatisme cérébral). Les ADNc ont été clones dans le plasmide pGADIO en aval de la région du DA de GAL4 au site EcoRI. La moyenne de la taille des inserts est de 1,4 kb avec un écart type de 1 kb. La banque a été amplifiée une fois dans E.coli DH5a pour obtenir l,2xl06 clones indépendants dont 80% contiennent un insert.
Pour préserver une bonne représentativité de la banque, il est nécessaire d'avoir un nombre de transformants deux à dix fois plus grand que celui des clones indépendants obtenus lors de la construction de la banque. Nous utilisons donc un protocole qui permet d'obtenir une bonne efficacité de transformation (environ 107 transformants/ 100 μg d'ADN).
Les levures YCM79 préalablement transformées par le plasmide pGBT9 contenant une séquence correspondant à une région de PS-I sont cultivées une nuit dans 50 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Leu +Ura à 28 °C sous agitation. La densité optique de cette préculture est mesurée pour évaluer le nombre de cellules par ml et permettre le calcul du volume à inoculer dans 250 ml de milieu YPD afin d'obtenir une culture de 10 cellules/ml (environ A600=0,8) après une nuit à 28 °C sous agitation.
Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation à 3000 rpm pendant 10 min, lavées deux fois avec 100 ml d'H2O stérile, reprises dans 10 ml de solution I de transformation. La suspension est centrifugée 10min à 3000rpm et les cellules resuspendues dans 2,5 ml de cette même solution. Une partie de la suspension est prélevée (200 μl): la moitié servira de témoin négatif non transformé, l'autre moitié sera transformée par un plasmide contrôle dont l'efficacité de transformation est connue. La suspension restante est mélangée à 100 μl de banque plasmidique d'ADNc à lmg/ml et 20 ml de solution II. Le mélange est incubé 1 heure à 28 °C sous agitation puis 20 min à 42 °C avant d'être centrifugé 15 min à 3000 rpm. Le culot cellulaire est lavé une fois à l'eau et deux fois au PBS afin de bien éliminer le PEG qui a un effet toxique sur les levures, puis est repris dans 2,5 ml de PBS stérile (Na2HPO4 50 mM, KC1 10 mM, MgSO4 1 mM, pH 7).
250 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura sont ensemencés par cette suspension et incubés 4 heures à 28 °C sous agitation pour permettre l'expression des protéines hybrides, leur interaction éventuelle et l'expression du gène rapporteur URA3. Cependant, cette étape a pour conséquence de multiplier le nombre de clones positifs. Pour évaluer le taux d'amplification du nombre de colonies, 1 ml de culture est prélevé avant et après cette incubation et différentes dilutions sont étalées sur milieu gélose YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura. Après croissance, le nombre de clones Leu+ Trp+ est déterminé pour évaluer la fréquence de transformation avant et après la période d'incubation et le taux d'amplification en est déduit.
Les cellules sont alors centrifugées 10 min à 3000 rpm, lavées deux fois à l'eau stérile, reprises dans 10 ml d'YNB et étalées sur 10 boîtes de 435 cm" contenant chacune 200 ml de milieu sélectif YNB +His +Lys +Ade +Met. Les boîtes sont mises à l'étuve à 28 °C pendant 3 jours.
Extraction de l'ADN plasmidique des levures.
Cette technique extrait aussi bien les plasmides que l'ADN génomique contenu dans les levures. Pour isoler les plasmides, il suffit de transformer des bactéries où seul l'ADN plasmidique peut se répliquer et d'analyser chaque clone après minipréparation .Les levures contenant les plasmides sont cultivées sur milieu solide YNB sélectif à 28 °C pendant une nuit. Elles sont ensuite resuspendues dans 200 ml de solution de cassage (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) en présence de billes de verre (450 μm de diamètre) et de 200 ml de phénol/chloroforme. Le mélange est agité 15 min sur un vortex puis centrifugé 2 min à 14000 rpm. La phase aqueuse est dialysée lheure sur membrane. Cette solution peut servir à la transformation des bactéries par électroporation.
Révélation de l'activité betα-galactosidase.
Ce test permet de vérifier l'expression du gène rapporteur LacZ codant pour la β- galactosidase dans les levures transformées.
Une feuille de nitrocellulose est déposée sur les clones de levures individualisés. La réplique est plongée 3 fois pendant 30 secondes dans de l'azote liquide pour casser les levures et permettre l'accès du substrat à la beto-galactosidase. La feuille est ensuite posée, colonies vers le haut, sur un papier Whatman imbibé d'une solution de PBS/Xgal préparée extemporanément (100 μl d'une solution de substrat Xgal à 40 mg/ml en diméthylformamide dans 5 ml de PBS) puis placée à 37 °C, température optimale pour l'activité enzymatique testée.
Le temps d'apparition de la couleur bleue qui révèle l'activité β-gal est très variable, de quelques minutes à plusieurs heures. Le test s'effectue en présence d'un témoin positif d'interaction qui vire rapidement au bleu et d'un témoin négatif qui reste blanc.
Test en goutte.
Ce test permet d'analyser le phénotype d'une souche de levure. Une goutte (environ 5 ml) d'une suspension de levures légèrement trouble est déposée sur différents milieux géloses sélectifs et non sélectifs, et la croissance des levures est observée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
Ségrégation des plasmides.
Il s'agit de tester par une ségrégation plasmidique si le phénotype des levures transformées est bien lié à la présence des plasmides.
Les levures sont cultivées une nuit sur milieu complet YPD à 28 °C. Ce milieu non sélectif permet la croissance des levures conservant ou ne conservant pas les plasmides après la division cellulaire. Différentes dilutions de cette culture sont étalées pour obtenir entre 50 et 100 clones par boîte de milieu YPD après une nuit d'incubation à 28 °C. Le phénotype des clones est alors testé par répliques sur velours sur différents milieux sélectifs et la fréquence des cellules ne contenant pas de plasmide peut être estimée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
8) Les méthodes pour le test d'interaction in vitro .
Principe du test.
Il s'agit de vérifier l'interaction entre deux protéines en utilisant une technique biochimique de chromato graphie d'affinité. Un extrait cellulaire contenant un des partenaires supposés de la protéine est ajouté à un support où la protéine appât a été préalablement fixée. Si l'interaction existe entre la protéine et son éventuel partenaire, celui-ci aussi, sera retenu sur le support.
Expression des protéines de fusion chez E.coli .
Les protéines de fusion sont produites dans E.coli BL21(DE3) par l'intermédiaire des vecteurs d'expression pET et pGEX inductible par 1TPTG (Studier, 1991).
Les bactéries BL21(DE3), préalablement transformées par les plasmides recombinants, sont cultivées une nuit sous agitation dans du milieu LB avec l'antibiotique servant à la sélection (ampicilline pour pGEX ou kanamycine pour pET à lOOμg/ml). 5 ml de cette préculture sont inoculés dans 45 ml de milieu LB+antibiotique afin d'obtenir une culture à A600=0,6 après 1 heure d'agitation à 37 °C. La production des protéines est alors induite par addition de 0,1 mM d'IPTG et les bactéries sont remises à 37 °C sous agitation entre 1 heure et 4 heures. Les cellules exprimant les protéines sont récoltées par centrifugation à 6000 rpm pendant 5 min. Les culots peuvent être gardés à -20 °C.
Extraction et analyse des protéines produites chez la bactérie.
Les culots bactériens contenant les protéines de fusion sont resuspendus dans 5 ml de TE (TrisHCl 50 mM pH 8, EDTA 2 mM). Les cellules sont lysées par du lysozyme 0,1 mg/ml final et 1% Triton X-100. Elles sont incubées 15 min à 30 °C avant d'être placées dans la glace pour être soumises aux ultra-sons jusqu'à ce que la suspension bactérienne devienne fluide. Le lysat bactérien est centrifugé 15 min à 10000 rpm à 4 °C. Le surnageant contenant la protéine de fusion solubilisée peut être conservé à -20 °C.
A cette étape, les différentes fractions obtenues sont analysées par électrophorèse sur gel dénaturant (SDS PAGE). 60 μl de la suspension bactérienne avant la centrifugation (fraction totale), 60 μl de surnageant (fraction soluble) ainsi que 60 μl du culot resuspendu dans 5 ml de TE (fraction insoluble) sont prélevés. Les protéines contenues dans les différentes fractions sont dénaturées 10 min à 95 °C en présence de 1/4 de volume de bleu de dépôt 4xL (TrisHCl 0,2 M pH 6,8, SDS 5%, glycérol 5%, 2-mercaptoethanol 0,5%, bleu de bromophénol) et chargées sur un gel de SDS polyacrylamide 12% où elles sont séparées en fonction de leur masse moléculaire par électrophorèse. Après migration à 125 volts/cm, les protéines sont détectées par coloration du gel au bleu de Coomassie.
Solubilisation des protéines.
Lors de l'expression d'un gène exogène dans E.coli peuvent apparaître des agrégats de la protéine exogène formant des corps d'inclusion. La protéine recombinante est alors facile à purifier par centrifugation mais elle est souvent difficile à solubiliser.
Les protéines se trouvant dans les fractions insolubles sont dénaturées par de l'urée 6 M et du DTT 10 mM pendant 10 min à 37 °C puis renaturées par dialyse dans trois tampon successifs pendant au moins 6 heures chacun (TrisHCl 5 mM pH 8 / urée 2 M; TrisHCl 5 mM, pH 8 / urée 1 M; TrisHCl 5 mM, pH 8). Après 15 min de centrifugation à 10000 rpm, environ 5 à 10% de la protéine se trouve dans le surnageant qui peut être conservé à -20 °C.
Chromato graphie d'affinité.
Pour que la rétention des protéines s'opère dans de bonnes conditions, la concentration protéique des échantillons doit être supérieure à 40 mg/ml. Cette concentration peut être estimée par une méthode colorimétrique (réactif de Bradford, par exemple).
200 μl de fraction soluble contenant la GST non fusionnée ou la GST-BM (boucle mutée de la préséniline 1) sont incubés 2 min à 20 °C en présence de 300 μl de « résine glutathion ». La fraction non retenue par les billes est prélevée. La résine est lavée 4 fois par du tampon de lavage (TrisHCl pH 8, 20 mM, NaCl 150 mM, Triton XI 00 0,1%) afin d'éliminer les protéines fixées par adsorption non spécifique. 150 μl de résine ayant liée la GST ou la GST-BM sont incubés 1 heure à 4 °C sous agitation avec 600 μl de fraction soluble contenant STag ou STag-Pepl26 . Les billes d'agarose sont ensuite centrifugées 1 min à 3000 rpm et lavées 4 fois par du tampon de lavage après prélèvement de la fraction non retenue.
Un aliquote de chaque fraction (soluble, non retenue et retenue par les billes) est déposée sur gel SDS PAGE après dénaturation à 95 °C en présence de bleu de dépôt et séparées par électrophorèse. Les protéines sont, ensuite, transférées sur membrane de nitrocellulose puis la membrane est colorée au rouge Ponceau (20 μg/ml) pour vérifier que le transfert des protéines a bien été réalisé.
Pour pouvoir détecter spécifiquement les protéines fusionnées avec le S-Tag, la membrane de nitrocellulose est saturée avec 1% de gélatine dans du TBST (TrisHCl 10 mM pH 8, NaCl 150 mM, 0,1% Tween20) pendant 15 min et incubée 15 min avec la protéine S liée à la phosphatase alcaline. Après 4 lavages avec le TBST, l'activité de la phosphatase alcaline est révélée par addition d'un tampon PA IX contenant du NBT et du BCIP selon la méthode Novagen.
9) Les méthodes d'expression des protéines recombinantes en cellules mammifères.
Construction d'un vecteur d'expression en cellules mammifères
Pour l'expression en cellules mammifères, les séquences ID N° 1 et ID N° 2 ont été sousclonées par des méthodes classiques dans un vecteur sous le contrôle d'un promoteur viral fort (CMV).
Transfection de cellules La méthode établie pour les cellules COS1 ou les cellules CHO, consiste à utiliser un lipofectant dans un ratio de 1 pour 8 (poids/poids) par-rapport à l'ADN et un peptide synthétique (Hl) au même ratio afin d'optimiser la compaction de l'ADN et l'efficacité de transfection. Cette méthode repose notamment sur la neutralisation des charges des phosphates de l'ADN par les charges positives du lipofectant.
Les cellules COS1 sont cultivées en incubateur à 37 °C, 95% d'humidité et 5 % de CO2 dans le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) contenant 4.5 g/1 glucose (Gibco-BRL) supplementé avec 3 % de L-Glutamine, 1% de pénicilline- streptomycine et 10 % de Sérum de Veau Foetal.
La veille de la transfection, les cellules sont ensemencées à une densité de 2.5 10 cellules par boite de 100 mm. Le jour de la transfection les cellules sont rincées 2 fois par du PBS (Phosphate Buffer Saline) et une fois en OptiMEM (composition brevetée; Gibco-BRL) pour une habituation d'au moins 15 minutes en incubateur.
Par équivalent-boite de 100 mm, 8 μg d'ADN plasmidique au total sont ajoutés à 300 μl d'OptiMEM et 64 μg de peptide synthétique (Hl). Après avoir vortexé vigoureusement pendant 10 secondes, la lipofectamine (32 μl, soit 64 μg) diluée dans
300 μl d'OptiMEM est ajoutée au mélange précédent, après 5 minutes d'attente.
L'ensemble est une nouvelle fois vortexé vigoureusement puis laissé 30 minutes reposer. Cinq millilitres d'OptiMEM sont ajoutés par tube et le mélange vortexé est placé sur les cellules (dont on a au préalable aspiré le milieu). Les cellules sont alors placées en incubateur pendant 4 heures, au terme desquelles le mélange est remplacé par du milieu complet.
Lyse des cellules et dosage des protéines
Les cellules sont le plus souvent lysées 48 heures après la transfection (au maximum habituel d'expression). Le tampon de lyse contient 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM d'EDTA, 1 % de Triton X100, 1 % de NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases
(Complète©, Boehringer-Mannheim). Pour chaque plaque, après un rinçage au PBS, 800 μl du tampon froid sont ajoutés. Les lysats subissent alors une sonication suivie d'une agitation au barreau magnétique à 4 °C pendant une nuit. Une centrifugation de 30 minutes à 15000 x g sépare le culot du surnageant.
Les protéines solubles sont alors dosées selon le kit BCA (Pierce) afin de pouvoir normaliser les expériences suivantes.
Immunotransfert
Les échantillons (lysats de cellules) sont dénaturés dans un volume égal de tampon de dépôt (125 mM Tris pH 6.8, 4% m/v SDS, 20 % glycérol, 0.02 % Bromophénol Blue, 50 mM Dithiothreitol) à 95 °C pendant 5 minutes. Pour l'analyse de l'expression des présénilines, les échantillons sont dénaturés en présence de 8 M urée et à 37 °C afin d'éviter l'agrégation propre aux présénilines à 95 °C.
Les échantillons sont déposés sur des gels Tris-Glycine (Novex), avec un pourcentage d'acrylamide différent selon le poids moléculaire à discriminer. Un marqueur de poids moléculaire est également déposé (Broad Range, BioRad). La migration a lieu pendant environ 2 heures à 100 volts constants dans du tampon SDS IX final (Novex). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (tampon de transfert IX final (Novex) avec 10 % de méthanol) pendant 2 heures à 150 m A constants.
Après transfert, la membrane est bloquée pendant 2 heures à température ambiante dans 50 ml de PBS-T (PBS avec 0.5 % Tween) contenant 2 % de lait écrémé (Merck). L'anticorps primaire (dilué à la concentration optimale de l'ordre du 1/1000e au 1 /5000e, dans du PBS-T avec ou sans 2 % de lait écrémé) est laissé sur une nuit à 4 °C. Après un bref rinçage en PBS-T, la membrane est incubée 45 minutes en présence du deuxième anticorps (Ig G anti-souris ou anti-lapin selon le cas, couplé à la peroxydase de raifort) dilué au l/5000e dans un tampon dit « ECL » (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 0J %). La membrane est alors rincée 4 fois 15 minutes dans le tampon «ECL». Elle peut être révélée par le réactif ECL (Amersham) constitué de 2 tampons à mélanger extemporanément en volume égal. Différentes expositions d'un film photographique (Hyperfilm ECL ; Amersham) sont effectuées, suivies d'un développement.
EXEMPLES
Exemple 1: Isolement de partenaires spécifiques de PS 1 par criblage de banque de fusion d'ADNc de cerveau
Dans le but d'isoler des partenaires spécifiques de la protéine PS 1, une banque d'ADNc de cerveau humain a été criblée par la technique du double-hybride. Une banque d'ADNc fusionnés avec le DA de GAL4 a été utilisée et différentes protéines appâts ont été construites en fusionnant les régions hydrophiles de PS-I avec le DLA de GAL4.
1J Construction des vecteurs permettant l'expression de protéines de fusion entre le DLA de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
Cinq protéines de fusion ont été réalisées grâce au vecteur pGBT9 dans lequel ont été introduites les séquences correspondant à différentes régions hydrophiles de PS 1 dans le même cadre de lecture que la séquence du DLA de GAL4. Il a été choisi d'identifier des protéines interagissant avec la région N-terminale (Nt, codons 1 à 81), la grande boucle (BL6, codons 263 à 407), la grande boucle avec la mutation L286V (BM), une région plus courte de la grande boucle (BR, codons 290 à 376) et enfin la partie C-terminale de la protéine (Ct, codons 421 à 467).
Les fragments d'ADN correspondant à ces différentes régions ont été obtenus par PCR à partir de la séquence entière de l'ADNc de PS 1. Les différents oligonucléotides utilisés ont permis l'introduction des sites EcoRI et Sali aux extrémités de chaque séquence amplifiée. Ainsi, les fragments de PCR ont pu être insérés entre les sites EcoRI et Sali du multisite de clonage de pGBT9 en aval et en phase avec la séquence du DLA de GAL4. Les différentes constructions obtenues, pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct, ont été vérifiées par séquençage de l'ADN. Cette vérification a montré que les fragments ne présentaient aucune mutation générée par la PCR et qu'ils étaient bien dans le même cadre ouvert de lecture que celui de la séquence du DLA de GAL4.
1.2 Obtention des souches de levures exprimant les protéines de fusion entre le DLA de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
Comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents est un événement moins fréquent que sa transformation par un seul plasmide, une souche de levure préalablement transformée par le vecteur codant pour la protéine appât a été utilisée, afin d'avoir la meilleure efficacité possible lors du criblage de la banque d'ADNc.
Pour cela, la souche de levure YCM 79 a été transformée par chacun des plasmides pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct. Les levures contenant ces plasmides ont été sélectionnées pour leur phénotype Trp+ sur milieu ne contenant pas de tryptophane et respectivement appelées yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt. La présence de ces différents plasmides dans chaque souche a été vérifiée en effectuant une PCR directement sur les levures, à l'aide d'oligonucléotides complémentaires des séquences DLA et tADHl situées en 5' et 3' de l'insert. La taille des fragments de PCR obtenus permet de distinguer les différentes souches à l'exception des souches yBL6 et yBM.
1.3 Tests d'activité transactivatrice et d'interaction avec le DA de GAL4 des protéines de fusion contenant les régions hydrophiles de PS 1.
Si une des protéines de fusion présente une activité transactivatrice ou si elle interagit avec le DA de GAL4, elle ne peut pas être utilisée comme appât dans le système double hybride car elle donne systématiquement une réponse positive en dehors de toute interaction protéine-protéine.
Le premier test consiste, donc, à vérifier que les régions hydrophiles de PS-I ne possèdent pas d'activité transactivatrice lorsqu'elles sont fusionnées au DLA de GAL4, c'est à dire capables d'induire, à elles seules, la transcription des gènes rapporteurs. Ce type d'activité peut, par exemple, être lié à la présence d'un domaine acide dans la protéine de fusion.
Pour ce test, l'expression des gènes rapporteurs LacZ et URA3 ont été contrôlés directement sur les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt.
Pour le deuxième test qui consiste à contrôler l'absence d'interaction entre les protéines de fusion et le DA de GAL4, les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype Trp+ Leu- ont été transformées par le plasmide pGAD424 (équivalent au pGADIO) qui code pour le DA de GAL4. Les levures ont été sélectionnées sur un milieu sans tryptophane ni leucine et l'expression des gènes rapporteurs LacZ et URA3 permettant de contrôler l'interaction a été testée sur les clones obtenus.
Dans tous les cas, les résultats des tests de l'activité β-galactosidase ainsi que ceux des tests en goutte sur milieu sélectif sans uracile se sont révélés négatifs.
Les protéines de fusions contenant les parties hydrophiles de PS-I ne présentent donc pas de propriété transactivatrice intrinsèque et n' interagissent pas avec le domaine d'activation de GAL4. Elles peuvent donc être utilisées comme protéines appâts pour le criblage de la banque.
1.4 Transformation des différentes souches de levure par la banque de fusion d'ADNc.
Le criblage de la banque de fusion permet d'identifier des clones exprimant des peptides fusionnés au DA de GAL4 interagissant avec la protéine appât. Si cette interaction existe, elle doit permettre la reconstitution d'un transactivateur fonctionnel capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs URA3 et LacZ dans la souche contenant la protéine appât.
Pour que le criblage soit représentatif, il est nécessaire que chaque plasmide indépendant constituant la banque soit présent dans, au moins, un clone de levure après transformation. Pour cela, un protocole permettant théoriquement d'obtenir un nombre de transformants supérieur au nombre de plasmides indépendants de la banque a été utilisé (cf. matériels et méthodes).
Les 5 souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype His-, Lys-, Ade-, Met-, Ura-, Leu-, ont été transformées successivement par lOOμg d'ADN plasmidique de la banque de fusion et les cellules transformées ont été sélectionnées sur un milieu YNB +His +Lys +Ade +Met.
A l'issue de la première sélection, nous avons obtenu 32 clones ayant un phénotype Ura+ avec la souche yNt, 450 clones Ura+ avec yBL6, 128 avec yBM, 250 avec yBR et 67 avec yCt. Un test d'activité β-galactosidase a été effectué sur ces transformants afin de vérifier l'expression du deuxième gène rapporteur LacZ. Au total 6 clones présentaient le double phénotype Ura+, β-gal+: 1 clone pour la souche yNt, 1 clone pour yBL6, 2 clones pour chacune des souches yBM et yBR, aucun clone pour yCt. Les clones sont respectivement nommés yNt.A, yBL6.B, yBM.C, yBM.D.
EXEMPLE 2 : Isolement des plasmides de la banque.
Afin d'identifier les protéines pouvant interagir avec la boucle mutée ou la boucle réduite de PS 1, les plasmides contenus dans les levures yBM.C et yBM.D ont été extraits. Les plasmides présents dans les préparations d'ADN ont été utilisés pour transformer des bactéries par électroporation.
Les plasmides, extraits des clones bactériens obtenus, ont été digérés par différentes enzymes. Cette analyse a mis en évidence 5 profils de restriction différents. Les digestions des plasmides extraits des levures yBM.C et yBM.D présentent un profil commun correspondant au plasmide pGBT-BM et deux profils différents correspondant au plasmide pGADIO contenant un insert de 2900pb correspondant à la séquence ID N° 1 (pGAD-C étant issu de la souche yBM.C) et un insert de 1400pb correspondant à la séquence ID N° 2 (pGAD-D étant issu de la souche yBM.D).
2J Contrôle des plasmides isolés par transformation de différentes souches de levure.
Lors de la transformation des levures par les plasmides de la banque de cerveau, il est possible que plusieurs plasmides différents soient introduits dans une même cellule. Afin de vérifier que les résultats d'interaction sont bien dûs à la présence des plasmides isolés et non à des plasmides surnuméraires, nous avons de nouveau testé les protéines de fusion issues du criblage de la banque contre les différentes régions hydrophiles de PS-I dans la souche YCM 79 mais aussi dans les souches HF7 C et PCY 2.
HF7 C possède deux gènes rapporteurs HIS3 et LacZ . Le gène LacZ a un environnement promoteur différent de celui existant chez la souche YCM 79, ce qui permet de contrôler que l'obtention de clones β-gal+ n'est pas liée à un environnement promoteur spécifique mais bien à une interaction entre les protéines testées. PCY 2 présente l'avantage de ne posséder qu'un seul gène rapporteur LacZ qui est exprimé plus fortement que dans les deux autres souches lorsque le transactivateur GAL4 est fonctionnel.
Nous avons transformé les trois souches de levure YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les différents couples de plasmides pGBT-X pGAD-Y (X correspondant à Nt, BL6, BM, BR ou Ct; Y correspondant à C ou D), pGBT9/pGAD424 (témoin d'interaction négatif) et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin d'interaction positif) (Russo et al, 1995). Nous avons testé l'auxotrophie et l'activité β-gal sur 3 à 5 clones issus de chaque transformation. Les résultats des boites sont présentés dans la figure 2. Compte tenu de la différence de sensibilité des tests, l'interaction est confirmée quand les levures YCM 79 et HF7 C transformées se développent sur les milieux sélectifs sans uracile ou sans histidine, c'est à dire qu'elles expriment, de manière sûre, au moins un de leur gène rapporteur.
L'intensité de la réponse (colonies plus ou moins bleues, plus ou moins développées) est supposée être proportionnelle au taux d'expression des gènes rapporteurs. Les variations de ce taux peuvent s'expliquer de différentes manières. Un faible taux peut résulter d'une faible interaction entre les protéines reconstituant le transactivateur GAL4. Il peut, aussi, être dû à l'intervention d'une troisième protéine qui déstabiliserait la formation du complexe, ou bien à une instabilité des protéines de fusion dans la levure, ou encore à l'état des levures. Les levures peuvent être dans un état de faible activité transcriptionnelle lié, par exemple, à un problème de toxicité des protéines exogènes.
Les protéines de fusions de la banque de cerveau qui ont été isolées n' interagissent pas avec la partie N-terminale et avec le C-terminal de PS 1. Par contre, elles semblent toutes interagir avec la région hydrophile BL6, la région hydrophile BL6 mutée (BM), ainsi que la forme réduite de cette région (BR).
2.2 Tests d'interaction des protéines de fusion de la banque avec des protéines ne contenant pas la boucle de PS 1.
Ce test permet de déterminer si les protéines de fusion issues de la banque interagissent de façon non spécifique par leur structure, leur charge, leur hydrophobicité avec les protéines appâts (faux positifs de type III) ou avec le DLA de GAL4 (faux positifs de type II).
Nous avons transformé les souches YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les couples de plasmides: pGBT9/pGAD-Y (Y correspondant à C ou D), pGBT-LAM/ pGAD-Y, pGBT9/pGAD424 (témoin négatif) et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin positif). Le pGBT9 code uniquement pour le DLA de GAL4 alors que le pGBT-LAM fourni par Clontech code pour une protéine de fusion entre le DLA de GAL4 et la lamine qui interagit de façon non spécifique avec les régions hydrophobes d'autres protéines.
Il en résulte qu'aucune des levures ainsi transformée n'était capable d'exprimer leurs gènes rapporteurs. Ainsi, les levures YCM 79 présentaient le phénotype Ura-, β-gal-, les levures HF7 C étaient toutes His-, β-gal- et les levures PCY 2, β-gal-.
Ces résultats suggèrent que les protéines de fusion de la banque ainsi isolées, interagissent spécifiquement avec la région hydrophile BL6 de PS-I et ne se lient pas avec la lamine ou le DLA de GAL4.
2.3 Test d'interaction sur des levures transformées par le vecteur pLex 9 contenant la région codant pour la boucle de PS 1.
Ce test permet de s'assurer que l'interaction des protéines n'est pas due à une structure adoptée par les différents fragments de BL6 uniquement lorsqu'ils sont fusionnés au DLA de GAL4.
Pour vérifier cela, les fragments BL6 et BM ont été fusionnés à un autre DLA, celui du répresseur bactérien LexA. Deux constructions plasmidiques supplémentaires (pLex-BS et pLex-BM) ont été réalisée, où les séquences de la boucle hydrophile BL6 et de la forme mutée ont été fusionnées au gène de LexA au niveau des sites EcoRI/SalI du plasmide pLex9.
Ensuite la souche de levure L40 dans laquelle l'expression des gènes rapporteurs HIS3 et LacZ est induite par la fixation du complexe DLA-LexA/DA-GAL4 sur le site opérateur de LexA a été transformée. L'interaction avec les couples de plasmides a été testée : pLex-BL6/pGAD-Y (Y pour C ou D), pLex-BM/pGAD-Y, pLex- RAS/pGAD-RAF (témoin d'interaction positif) (Vojtek et al, 1993) et pLex- RAS/ρGAD424, ρLex-BL6/pGAD424, pLex-BL6/pGAD-RAF, pLex- BM/pGAD424, pLex-BM/pGAD-RAF (témoins d'interaction négatif). Les résultats des tests en goutte sur milieux sélectifs sans histidine et des tests de l'activité β-gal se sont révélés positifs pour les souches contenant le plasmide pLex- BL6 quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Il en est de même pour les souches contenant pLex-BM quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Ce test montre que l'interaction obtenue n'est pas liée à une conformation particulière qu'adopterait la région BL6 de PS-I lorsqu'elle est fusionnée avec le domaine de liaison à l'ADN de GAL4.
EXEMPLE 3 : Identification des inserts des plasmides issus du criblage.
3J Séquençage des inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D.
Les inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D ont été entièrement séquences. Nous avons commencé le séquençage en utilisant les oligonucléotides complémentaires du DA de GAL4 et du tADHl afin de connaître la séquence du début et de la fin de chaque insert. Puis, à partir de l'extrémité de chaque séquence, nous avons constitué des oligonucléotides de synthèse qui nous ont permis d'avancer dans les séquences sur les deux brins. De cette façon, nous avons séquence totalement les 1400 pb de l'insert D correspondant à la séquence SEQ ID N°2. Par contre, pour l'insert C de 2900 pb (séquence SEQ ID N°l), il a été nécessaire d'établir une carte de restriction puis d'effectuer un sous clonage de différents fragments afin d'obtenir la totalité de la séquence.
L'insert D présente une phase ouverte de lecture sur la totalité de sa séquence (Seq ID N°2 ). En revanche, l'insert C contient un codon stop en fin de séquence (Seq ID N°l).
Leur séquence peptidique présente un profil plutôt hydrophile ce qui est en conformité avec le choix de la méthode de criblage qui s'applique plutôt à des protéines hydrophiles.
3.2 Comparaison des séquences Cette comparaison doit permettre de savoir si les inserts codent pour un domaine peptidique dont la fonction est connue.
Les séquences nucléiques et peptidiques des inserts ont été comparées avec des séquences répertoriées dans les banques de données « Gen Bank » et « EMBL » (European Molecular Biology Lab). Aucune similitude significative n'a été trouvée entre les inserts et les gènes (ou les protéines) enregistrés dans ces banques.
Les séquences des inserts ont aussi été comparées entre elles. Elles ne présentent aucune similitude.
De plus, l'existence de motifs peptidiques susceptibles d'apporter des informations sur la fonction des peptides codés par les insert a été recherché. Quelques sites potentiels de glycosylation, de phosphorylation et de myristylation ont été trouvés mais qui ne permettent pas de formuler d'hypothèse quant à une éventuelle fonction des peptides.
3.3 Expression des ARNm correspondant aux peptides sélectionnés dans différents tissus humains.
Afin de conforter l'idée que l'interaction entre ces peptides et PS 1 existe bien in vivo, il a été vérifié que l'expression des ARNm des peptides isolés de la banque se situe dans les mêmes tissus que l'expression de l'ARNm de PS 1. L'expression dans des tissus spécifiques, des gènes contenant les séquences isolées a été recherchée et le taux d'expression des ARNm correspondant aux insert C et D dans différents tissus humains a été analysé par Northern blot.
La sonde radioactive préparée à partir de l'insert C (séquence ID N°l) a permis d'hybrider un .ARNm de 9,5kb exprimé spécifiquement dans le cerveau et plus particulièrement dans le cortex cérébral, le lobe frontal et le lobe temporal (cf. Fig3). La taille de cet ARNm suggère que la protéine traduite est de grande taille. EXEMPLE 4 : Test d'interaction in vitro .
Ce test permet de savoir que les interactions ne sont pas dépendantes du contexte levure. La reconstitution du transactivateur fonctionnel GAL4 n'est pas toujours due à une interaction directe entre les deux protéines, mais peut aussi être le résultat de la formation d'un complexe protéique entre les protéines de fusion et une ou plusieurs protéines endogènes de la levure. Ainsi, les interactions n'existeraient qu'en présence de protéines intermédiaires provenant de la levure et n'auraient pas de réalité en dehors de ce contexte.
Il a été choisi de confirmer les interactions entre la région hydrophile BL6 de PS 1 et les peptides isolés respectivement appelés PepC et PepD dans un système acellulaire.
Les protéines sont produites dans E.coli BL21 (DE3) afin d'en obtenir de grande quantité.Les 2 peptides isolés, ont été fusionnés à des peptides tag permettant leur détection et leur fixation sur des supports. Pour cela, il a été choisi de fusionner la protéine GST, qui se lie au glutathion, aux différentes formes de la région BL6 et le peptide S-Tag, reconnu spécifiquement par la protéine S, aux peptides isolés (cf. matériel et méthode pour le principe du test).
4J Production d'une protéine de fusion entre le S-Tag et les peptides isolés lors du criblage de la banque d'ADNc.
Afin de construire les protéines de fusion entre le S-Tag et les deux peptides PepC et PepD. Les différents fragments EcoRI/EcoRI issus des plasmides pGAD-C et pGAD- D ont été insérés dans le même cadre de lecture que la séquence de S-Tag du vecteur pET-29a.
A ce stade, un plasmide (pET-D) a été obtenu contenant l'insert correspondant au PepD. Le séquençage partiel de ce plasmide a montré que l'insertion a été réalisée dans la phase de lecture souhaitée. Ce plasmide a permis l'obtention d'une protéine de 52kDa correspondant à la protéine de fusion STag-PepD. La protéine STag-PepD est produite dans les bactéries BL21 (DE3) après induction à 1TPTG.
4.2 Production d'une protéine de fusion entre la GST et la boucle hydrophile de PS 1.
Pour fusionner la GST avec l'une des trois formes de la région hydrophile BL6 de PS 1, le vecteur pGEX-4Tl a été utilisé dans lequel les fragments EcoRI/SalI provenant des plasmides pGBT-BL6, pGBT-BM et pGBT-BR ont été introduits.
Le plasmide pGEX-BM correspondant à la boucle mutée de PS-I a été obtenu. Le séquençage a montré que l'insertion a bien été réalisée dans le cadre de lecture de la séquence GST.
Ce plasmide a permis la production de la protéine de fusion GST-BM de 42kDa dans les bactéries BL21 (DE3) après induction à 1TPTG.
4.3 Solubilisation de la protéine de fusion GST-BM.
Après la lyse des bactéries, la protéine GST-BM reste entièrement dans la fraction insoluble alors que le peptide STag ainsi que la protéine STag-PepD et la GST se trouvent en partie dans la fraction soluble.
La solubilisation des protéines de fusion est absolument nécessaire pour réaliser la chromatographie d'affinité. Dans un premier temps, la protéine GST-BM a été fixée de manière spécifique sur une résine de glutathion couplée de façon covalente à des billes d'agarose afin de pouvoir tester, ensuite, l'interaction de GST-BM avec les partenaires peptidiques de PS 1 fusionné au STag (cf. Matériels et méthodes). Si les protéines ne sont pas solubilisées, elles sédimentent avec les billes en absence de toute liaison spécifique avec celles-ci.
Après solubilisation de la protéine de fusion GST-BM, le test est réalisé selon les conditions décrites au paragraphe 8 de la section matériels et méthodes. EXEMPLE 5: Expression des partenaires spécifiques des PS-1 en cellules mammifères.
5J Construction des vecteurs d'expression appropriés.
Ce test permet de vérifier si les interactions protéiques révélées en levure sont aussi détectables dans le contexte de cellules mammifères et avec la protéine PSI complète insérée dans son environnement membranaire. Les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2, des partenaires, ont été sousclonées dans un vecteur d'expression de cellules mammifères pCDNA3 portant une séquence additionnelle correspondant à l'épitope myc en 5 'terminale et un site de restriction EcoRI (Fig. 4) permettant le sousclonage en phase des séquences des partenaires.
Le fragment de restriction EcoRI de pGAD-D de 1400 bp a été isolé et souscloné en phase dans le site EcoRI du vecteur d'expression. Les constructions portant l'ADNc dans l'orientation correcte ont été choisies par analyse de restriction enzymatique.
En ce qui concerne le clone C, le fragment EcoRI(l)-HindIII(391)de pGAD-C a d'abord été isolé. Un second fragment HindIII(392)-MscI(2892) (ce dernier site à bout franc se trouvant au sein du vecteur pGADIO en aval de la région codante du clone C) a ensuite été isolé par digestion partielle. Les fragments EcoRI(l)- HindIII(391) et HindIII(392)-MscI(2892) ont été mis en ligation ensemble avec le vecteur d'expression digéré avec EcoRI et EcoRV, ce dernier site étant à bout franc. Les constructions correctes portant l'intégralité de la séquence codante de C ont été identifiées par analyse de restriction.
Ces constructions permettent de générer des protéines fusion portant l'épitope myc et les peptides correspondant respectivement aux séquences ID N° 1 et ID N° 2.
5.2 Expression dans des cellules de mammifères
Ces constructions ont été transfectées en cellules COS1 par des méthodes standard. Après lyse cellulaire, les échantillons sont analysés par immunotransfert et révélation avec l'anticorps anti-myc. L'expression des partenaires a pu être détectée par immunotransfert en utilisant l'anticorps anti-Myc 9E10 (fig 5). Nous avons pu détecter une bande très intense de 120 kDa comme attendu pour pepC, démontrant une forte expression (piste C). Pour D, l'intensité de la bande détectée n'était pas toujours constante. Par contre, l'expression en cellules CHO a pu être détectée. Dans ce type cellulaire, D est peut-être un peu plus stable et apparaît comme une protéine migrant vers 80 kDa (piste D).
Les deux protéines ont donc pu être exprimées et détectées en cellules mammifères.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
(B) RUE: 20 avenue Raymon Aron (C) VILLE: Antony
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 01.55.71. G9.22 (H) TELECOPIE: 01.55.71.72.91
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D1 EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE 1:
(A) LONGUEUR: 2892 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT : 1..2736
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: CGG ATG ATT CCC ATC TTT CAT GAC ATG ATG GAC TGG GAG CAG AGA AAA 48 Arg Met Ile Pro Ile Phe His Asp Met Met Asp Trp Glu Gin Arg Lys 1 5 10 15 AAT GGC AAC TTC AAA CAG GTG GAG GCC GAG TTG ATT GAC AAG CTG GAC 96 Asn Gly Asn Phe Lys Gin Val Glu Ala Glu Leu Ile Asp Lys Leu Asp 20 25 30
AGC ATG GTG TCA GAA GGG AAA GGT GAC GAG AGC TAC AGG GAG CTC TTC 144 Ser Met Val Ser Glu Gly Lys Gly Asp Glu Ser Tyr Arg Glu Leu Phe 35 40 45 AGC CTA CTA ACC CAG CTG TTT GGG CCC TAC CCC AGC CTG CTG GAG AAG 192 Ser Leu Leu Thr Gin Leu Phe Gly Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Lys 50 55 60
GTT GAA CAA GAA ACA TGG CGC GAG ACC GGC ATT TCC TTT GTG ACC TCA 240 Val Glu Gin Glu Thr Trp Arg Glu Thr Gly Ile Ser Phe Val Thr Ser 65 70 75 80
GTC ACC CGC CTC ATG GAA CGT CTT CTT GAC TAC AGG GAC TGC ATG AAA 288 Val Thr Arg Leu Met Glu Arg Leu Leu Asp Tyr Arg Asp Cys Met Lys 85 90 95
GGA GAG GAA ACA GAG AAT AAG AAG ATA GGC TGC ACT GTT AAC CTG ATG 336 Gly Glu Glu Thr Glu Asn Lys Lys Ile Gly Cys Thr Val Asn Leu Met 100 105 110
AAT TTT TAC AAA TCT GAG ATT AAC AAG GAA GAA ATG TAT ATC CGC TAC 384 Asn Phe Tyr Lys Ser Glu Ile Asn Lys Glu Glu Met Tyr Ile Arg Tyr 115 120 125 ATC CAT AAG CTT TGT GAC ATG CAC TTG CAG GCC GAA AAC TAC ACA GAG 432 Ile His Lys Leu Cys Asp Met His Leu Gin Ala Glu Asn Tyr Thr Glu 130 135 140
GCC GCA TTT ACC CTG CTC CTT TAC TGT GAG CTG CTG CAG TGG GAG GAC 480 Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Tyr Cys Glu Leu Leu Gin Trp Glu Asp 145 150 155 160
CGG CCA CTA CGG GAA TTC CTC CAC TAC CCA TCG CAG ACA GAG TGG CAG 528 Arg Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Tyr Pro Ser Gin Thr Glu Trp Gin 165 170 175
CGG AAG GAG GGA CTG TGC CGG AAG ATC ATT CAC TAC TTC AAC AAA GGC 576 Arg Lys Glu Gly Leu Cys Arg Lys Ile Ile His Tyr Phe Asn Lys Gly 180 185 190
AAG AGC TGG GAG TTT GGG ATC CCA CTG TGC AGG GAG CTG GCG TGT CAG 624 Lys Ser Trp Glu Phe Gly Ile Pro Leu Cys Arg Glu Leu Ala Cys Gin 195 200 205 TAC GAG AGC CTC TAT GAT TAC CAG AGC CTC AGC TGG ATT CGG AAA ATG 672 Tyr Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Gin Ser Leu Ser Trp Ile Arg Lys Met 210 215 220 GAG GCC AGC TAC TAT GAC AAC ATT ATG GAG CAG CAA CGC CTG GAG CCT 720 Glu Ala Ser Tyr Tyr Asp Asn Ile Met Glu Gin Gin Arg Leu Glu Pro 225 230 235 240 GAG TTC TTT CGG GTC GGC TTC TAT GGC AGG AAG TTT CCT TTC TTT CTT 768 Glu Phe Phe Arg Val Gly Phe Tyr Gly Arg Lys Phe Pro Phe Phe Leu 245 250 255
CGG AAC AAA GAA TAC GTG TGC CGT GGC CAT GAC TAC GAG AGG CTG GAG 816 Arg Asn Lys Glu Tyr Val Cys Arg Gly His Asp Tyr Glu Arg Leu Glu 260 265 270
GCC TTC CAG CAG AGG ATG CTC AGT GAG TTT CCG CAG GCT GTC GCC ATG 864 Ala Phe Gin Gin Arg Met Leu Ser Glu Phe Pro Gin Ala Val Ala Met 275 280 285
CAG CAC CCC AAC CAT CCT GAT GAC GCC ATC CTA CAG TGC GAT GCC CAG 912 Gin His Pro Asn His Pro Asp Asp Ala Ile Leu Gin Cys Asp Ala Gin 290 295 300
TAC TTG CAG ATC TAT GCA GTG ACG CCC ATT CCA GAT TAT GTG GAT GTT 960 Tyr Leu Gin Ile Tyr Ala Val Thr Pro Ile Pro Asp Tyr Val Asp Val 305 310 315 320 CTG CAG ATG GAT AGG GTA CCA GAT CGA GTC AAG AGC TTC TAT CGC GTC 1008 Leu Gin Met Asp Arg Val Pro Asp Arg Val Lys Ser Phe Tyr Arg Val 325 330 335
AAC AAT GTG AGG AAG TTC CGG TAT GAC AGG CCT TTT CAC AAA GGC CCC 1056 Asn Asn Val Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Arg Pro Phe His Lys Gly Pro 340 345 350
AAG GAC AAG GAG AAT GAA TTC AAG AGC CTG TGG ATT GAA CGT ACC ACA 1104 Lys Asp Lys Glu Asn Glu Phe Lys Ser Leu Trp Ile Glu Arg Thr Thr 355 360 365
CTG ACC CTG ACC CAC AGC TTG CCT GGC ATC TCT CGG TGG TTT GAA GTG 1152 Leu Thr Leu Thr His Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Trp Phe Glu Val 370 375 380
GAG AGG AGG GAA CTG GTG GAG GTG AGC CCT CTG GAG AAT GCC ATC CAA 1200 Glu Arg Arg Glu Leu Val Glu Val Ser Pro Leu Glu Asn Ala Ile Gin 385 390 395 400 GTG GTT GAG AAT AAG AAC CAG GAG CTA CGC TCC CTG ATC AGC CAG TAT 1248 Val Val Glu Asn Lys Asn Gin Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Gin Tyr 405 410 415
CAA CAC AAG CAG GTG CAT GGC AAC ATT AAC CTG CTA AGC ATG TGC CTG 1296 Gin His Lys Gin Val His Gly Asn Ile Asn Leu Leu Ser Met Cys Leu 420 425 430
AAT GGT GTC ATT GAT GCA GCT GTC AAT GGA GGC ATT GCA CGC TAT CAG 344 Asn Gly Val Ile Asp Ala Ala Val Asn Gly Gly Ile Ala Arg Tyr Gin 435 440 445
GAG GCC TTC TTT GAT AAA GAT TAC ATC AAC AAG CAC CCA GGA GAT GCT 1392 Glu Ala Phe Phe Asp Lys Asp Tyr Ile Asn Lys His Pro Gly Asp Ala 450 455 460
GAG AAG ATC ACC CAG CTC AAG GAG CTT ATG CAG GAG CAG GTT CAT GTC 1440 Glu Lys Ile Thr Gin Leu Lys Glu Leu Met Gin Glu Gin Val His Val 465 470 475 480
CTT GGA GTT GGG CTA GCA GTT CAT GAG AAG TTT GTG CAC CCA GAA ATG 488 Leu Gly Val Gly Leu Ala Val His Glu Lys Phe Val His Pro Glu Met 485 490 495
CGG CCT CTG CAT AAG AAG CTA ATT GAT CAG TTC CAG ATG ATG CGG GCC 1536 Arg Pro Leu His Lys Lys Leu Ile Asp Gin Phe Gin Met Met Arg Ala 500 505 510 AGT CTC TAC CAT GAG TTT CCA GGT TTG GAT AAG CTA AGT CCT GCA TGT 1584 Ser Leu Tyr His Glu Phe Pro Gly Leu Asp Lys Leu Ser Pro Ala Cys 515 520 525
TCA GGC ACC AGC ACC CCA CGG GGA AAT GTT CTG GCA TCC CAT AGC CCC 1632 Ser Gly Thr Ser Thr Pro Arg Gly Asn Val Leu Ala Ser His Ser Pro 530 535 540
ATG AGT CCG GAG AGC ATC AAG ATG ACC CAC CGG CAC AGC CCC ATG AAC 1680 Met Ser Pro Glu Ser Ile Lys Met Thr His Arg His Ser Pro Met Asn 545 550 555 560
TTG ATG GGC ACA GGC CGC CAT TCA TCA TCC TCT CTC TCC TCA CAT GCG 1728 Leu Met Gly Thr Gly Arg His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser His Ala 565 570 575
TCT AGT GAA GCA GGA AAC ATG GTG ATG CTG GGT GAC GGC TCC ATG GGT 1776 Ser Ser Glu Ala Gly Asn Met Val Met Leu Gly Asp Gly Ser Met Gly 580 585 590 GAT GCT CCT GAG GAC CTG TAC CAC CAC ATG CAG CTC GCG TAT CCC AAC 1824 Asp Ala Pro Glu Asp Leu Tyr His His Met Gin Leu Ala Tyr Pro Asn 595 600 605
CCC AGG TAC CAA GGC TCA GTC ACC AAC GTC TCT GTT CTG TCC TCG TCC 1872 Pro Arg Tyr Gin Gly Ser Val Thr Asn Val Ser Val Leu Ser Ser Ser 610 615 620
CAG GCA AGC CCT TCT TCC TCC AGC CTG AGT TCC ACT CAC TCA GCA CCA 1920 Gin Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Thr His Ser Ala Pro 625 630 635 640
TCC CAG ATG ATT ACC TCT GCC CCT TCC AGT GCC CGA GAT AAG TAC CGC 1968 Ser Gin Met Ile Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ala Arg Asp Lys Tyr .Arg 645 650 655
CAT GCC CGT GAA ATG ATG TTG TTG CTG CCC ACA TAC CGG GAC CGC CCA 2016 His Ala Arg Glu Met Met Leu Leu Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Arg Pro 660 665 670
AGC AGT GCC ATG TAT CCA GCA GCC ATC CTG GAG AAC GGA CAG CCG CCG 2064 Ser Ser Ala Met Tyr Pro Ala Ala Ile Leu Glu Asn Gly Gin Pro Pro 675 680 685
AAT TTC CAG CGA GCC CTG TTC CAG CAA GTG GTC GGA GCC TGC AAA CCC 2112 Asn Phe Gin Arg Ala Leu Phe Gin Gin Val Val Gly Ala Cys Lys Pro 690 695 700 TGC AGT GAT CCC AAT CTG TCT GTG GCT GAA AAA GGT CAT TAC TCC CTA 2160 Cys Ser Asp Pro Asn Leu Ser Val Ala Glu Lys Gly His Tyr Ser Leu 705 710 715 720
CAC TTT GAC GCC TTC CAC CAC CCT CTG GGT GAT ACC CCC CCA GCC CTC 2208 His Phe Asp Ala Phe His His Pro Leu Gly Asp Thr Pro Pro Ala Leu
725 730 735
CCT GCC CGG ACC CTG CGC AAG TCT CCT CTC CAC CCT ATC CCA GCC TCC 2256 Pro Ala Arg Thr Leu Arg Lys Ser Pro Leu His Pro Ile Pro Ala Ser 740 745 750
CCC ACA AGC CCC CAG TCA GGT CTG GAC GGC AGC AAC TCT ACG CTG TCC 2304 Pro Thr Ser Pro Gin Ser Gly Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Leu Ser 755 760 765
GGC AGT GCC AGC AGC GGC GTG TCC TCC TTG AGT GAG AGT AAC TTT GGG 2352 Gly Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Leu Ser Glu Ser Asn Phe Gly 770 775 780 CAC TCC TCG GAG GCC CCA CCT CGC ACT GAC ACC ATG GAC TCC ATG CCA 2400 His Ser Ser Glu Ala Pro Pro Arg Thr Asp Thr Met Asp Ser Met Pro 785 790 795 800
AGT CAG GCC TGG AAT GCT GAC GAA GAT CTT GAG CCA CCC TAC CTC CCT 2448 Ser Gin Ala Trp Asn Ala Asp Glu Asp Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro
805 810 815
GTC CAC TAC AGC CTC TCT GAG TCT GCC GTC CTG GAC TCC ATC AAG GCC 2496 Val His Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Ala Val Leu Asp Ser Ile Lys Ala 820 825 830
CAG CCA TGC CGA AGC CAC TCA GCC CCA GGG TGC GTC ATC CCT CAG GAC 2544 Gin Pro Cys Arg Ser His Ser Ala Pro Gly Cys Val Ile Pro Gin Asp 835 840 845
CCC ATG GAC CCG CCT GCG CTG CCG CCC AAG CCC TAC CAC CCC CGC CTG 2592 Pro Met Asp Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Pro Tyr His Pro Arg Leu 850 855 860 CCG GCC CTG GAG CAC GAT GAG GGG GTG CTG CTG CGT GAA GAG ACT GAG 2640
Pro Ala Leu Glu His Asp Glu Gly Val Leu Leu Arg Glu Glu Thr Glu
865 870 875 880
AGG CCT CGA GGC CTG CAC CGC AAG GCT CCA TTG CCT CCT GGG AGC GCT 2688
Arg Pro Arg Gly Leu His Arg Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Ser Ala 885 890 895 AAG GAG GAG CAG GCC CGC ATG GCC TGG GAG CAC GGC CGA GGG GAG CAG 2736 Lys Glu Glu Gin Ala Arg Met Ala Trp Glu His Gly Arg Gly Glu Gin 900 905 910
TGAGGGGCAA CGAGGCGGCT GGGATGCCGC CCTCAGTAAG CAGCTTGCCA ATCACTCCAG 2796
GTCTGAAAAG CAAGTCCCCC AGCCCCACCC CAGGGAGCCA GAGAGGCTTG CACTCAGGAG 2856 AGAACCACCC CCAAGTCTCC GTTCTACTGC CGCCCG 2892
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1363 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1363
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2
GAA TTC CGG GGT TGT GTG AAG ATG GAG TTT CCC GGA GGA AAT GAC AAT 48 Glu Phe Arg Gly Cys Val Lys Met Glu Phe Pro Gly Gly Asn Asp Asn 915 920 925
TAC CTG ACG ATC ACA GGG CCT TCG CAC CCC TTC CTG TCA GGG GCC GAG 96 Tyr Leu Thr Ile Thr Gly Pro Ser His Pro Phe Leu Ser Gly Ala Glu 930 935 940
ACA TTC CAT ACA CCA AGC TTG GGT GAT GAG GAA TTT GAA ATC CCA CCT 144 Thr Phe His Thr Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Phe Glu Ile Pro Pro 945 950 955 960
ATC TCC TTG GAT TCT GAT CCC TCA TTG GCT GTC TCA GAT GTG GTT GGC 192 Ile Ser Leu Asp Ser Asp Pro Ser Leu Ala Val Ser Asp Val Val Gly 965 970 975 CAC TTT GAT GAC CTG GCA GAC CCT TCC TCT TCA CAG GAT GGC AGT TTT 240 His Phe Asp Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ser Ser Gin Asp Gly Ser Phe 980 985 990
TCA GCC CAG TAT GGG GTC CAG ACA TTG GAC ATG CCT GTG GGC ATG ACC 288 Ser Ala Gin Tyr Gly Val Gin Thr Leu Asp Met Pro Val Gly Met Thr 995 1000 1005
CAT GGC TTG ATG GAG CAG GGC GGG GGG CTC CTG AGT GGG GGC TTG ACC 336 His Gly Leu Met Glu Gin Gly Gly Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Thr 1010 1015 1020
ATG GAC TTG GAC CAC TCT ATA GGA ACT CAG TAT AGT GCC AAC CCA CCT 384 Met Asp Leu Asp His Ser Ile Gly Thr Gin Tyr Ser Ala Asn Pro Pro 1025 1030 1035 1040
GTT ACA ATT GAT GTA CCA ATG ACA GAC ATG ACA TCT GGC TTG ATG GGG 432 Val Thr Ile Asp Val Pro Met Thr Asp Met Thr Ser Gly Leu Met Gly 1045 1050 1055
CAT AGC CAG TTG ACC ACC ATT GAT CAG TCA GAA CTG AGT TCC CAG CTG 480 His Ser Gin Leu Thr Thr Ile Asp Gin Ser Glu Leu Ser Ser Gin Leu 1060 1065 1070
GGT TTG AGC CTA GGG GGT GGC ACC ATC CTG CCA CCT GCC CAG TCA CCT 528 Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Pro Pro Ala Gin Ser Pro 1075 1080 1085 GAA GAT CGT CTT TCA ACC ACC CCT TCA CCT ACT AGT TCA CTT CAC GAA 576 Glu Asp Arg Leu Ser Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Ser Leu His Glu 1090 1095 1100
GAT GGT GTT GAG GAT TTC CGG AGG CAA CTT CCC AGC CAG AAG ACA GTC 624 Asp Gly Val Glu Asp Phe Arg Arg Gin Leu Pro Ser Gin Lys Thr Val 1105 1110 1115 1120
GTG GTG GAA GCA GGG AAA AAG CAG AAG GCC CCA AAG AAG AGA AAA AAG 672 Val Val Glu Ala Gly Lys Lys Gin Lys Ala Pro Lys Lys Arg Lys Lys 1125 1130 1135
AAA GAT CCT AAT GAA CCT CAG AAA CCA GTT TCA GCA TAT GCT TTA TTC 720 Lys Asp Pro Asn Glu Pro Gin Lys Pro Val Ser Ala Tyr Ala Leu Phe 1140 1145 1150
TTT CGT GAT ACA CAG GCT GCC ATC AAG GGA CAG AAT CCT AAT GCC ACT 768 Phe Arg Asp Thr Gin Ala Ala Ile Lys Gly Gin Asn Pro Asn Ala Thr 1155 1160 1165 TTT GGT GAG GTT TCA AAA ATT GTG GCC TCC ATG TGG GAT AGT CTT GGA 816 Phe Gly Glu Val Ser Lys Ile Val Ala Ser Met Trp Asp Ser Leu Gly 1170 1175 1180
GAG GAG CAA AAA CAG GTA TAT AAG AGG AAA ACT GAG GCT GCC AAG AAA 864 Glu Glu Gin Lys Gin Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys 1185 1190 1195 1200
GAG TAT CTG AAG GCA CTG GCT GCT TAC AAA GAC AAC CAG GAG TGT CAG 912 Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Gin Glu Cys Gin 1205 1210 1215
GCC ACT GTG GAA ACA GTG GAA TTG GAT CCA GCA CCA CCA TCA CAA ACT 960 Ala Thr Val Glu Thr Val Glu Leu Asp Pro Ala Pro Pro Ser Gin Thr 1220 1225 1230
CCT TCT CCA CCT CCT ATG GCT ACT GTT GAC CCA GCA TCT CCA GCA CCA 1008 Pro Ser Pro Pro Pro Met Ala Thr Val Asp Pro Ala Ser Pro Ala Pro 1235 1240 1245 GCT TCA ATA GAG CCC CCT GCC CTG TCC CCA TCC ATT GTT GTT AAC TCC 1056
Ala Ser Ile Glu Pro Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ile Val Val Asn Ser 1250 1255 1260
ACC CTT TCA TCC TAT GTG GCA AAC CAG GCA TCT TCT GGA GCT GGG GGT 1104
Thr Leu Ser Ser Tyr Val Ala Asn Gin Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly 1265 1270 1275 1280 CAG CCC AAT ATC ACC AAG TTG ATT ATT ACC AAA CAA ATG TTG CCC TCT 1152 Gin Pro Asn Ile Thr Lys Leu Ile Ile Thr Lys Gin Met Leu Pro Ser 1285 1290 1295
TCT ATT ACT ATG TCT CAA GGA GGG ATG GTT ACT GTT ATC CCA GCC ACA 1200 Ser Ile Thr Met Ser Gin Gly Gly Met Val Thr Val Ile Pro Ala Thr 1300 1305 1310
GTG GTG ACC TCC CGG GGG CTC CAA CTA GGC CAA ACC AGT ACA GCT ACT 1248 Val Val Thr Ser Arg Gly Leu Gin Leu Gly Gin Thr Ser Thr Ala Thr 1315 1320 1325
ATC CAG CCC AGT CAA CAA GCC CAG ATT GTC ACT CGG TCA GTG TTG CAG 1296 Ile Gin Pro Ser Gin Gin Ala Gin Ile Val Thr Arg Ser Val Leu Gin 1330 1335 1340
GCA GCA GCA GCT GCT GCT GCT GCT GCT TCT ATG CAA CTG CCT CCA CCC 1344 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Met Gin Leu Pro Pro Pro 1345 1350 1355 1360 CGA GTA CAG CCC GGA ATT C 1363
Arg Val Gin Pro Gly Ile 1365

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique codant pour une protéine capable d'interagir avec les présénilines.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide ou une protéine capable d'interagir avec tout ou partie de la grande boucle de la préséniline PS-1.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 1 ou de ses dérivées
4. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N°2 ou de ses dérivées
5. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec les présénilines.
6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS- 1.
7. Polypeptide selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la séquence d'amino-acides 310-463 de la grande boucle de la préséniline PS-1.
8. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-2
9. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°l ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
10. Polypeptide selon l'une des revendication 5 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
11. Utilisation d'un polypeptide selon les revendications 5 à 10 pour l'obtention d'un médicament destiné à ralentir, stimuler ou moduler l'activité des présénilines.
12. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 10 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit
13. Cellule hôte pour la production de polypeptide selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4.
14. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 3 ou 4
15. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4 ou l' ARNm correspondant.
16. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 10.
17. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence choisie parmi les séquences peptidiques présentées en SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 ou leurs dérivées.
18. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 16 ou 17 caractérisé en ce qu'il possède la faculté d'inhiber et/ ou de révéler l'interaction entre les présénilines et un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 10.
19. Procédé de mise en évidence ou d'isolement de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre les présénilines et les polypeptides tels que définis dans les revendication 5 à 10, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle- ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
20. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 5 à 10, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 19.
21. Utilisation d'un ligand selon la revendication 20 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des affections neurologiques.
22. Virus recombinant defectif comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une de revendication 5 à 10.
23. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4.
24. Vecteur selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
25. Vecteur selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
26. Vecteur selon la revendication 25 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus defectif pour la réplication.
27. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 23 à 26.
28. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 10.
29. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une des revendications 16 à 18, et/ou un oligonucléotide antisens selon la revendication 14 et/ou un composé préparé selon la revendication 19.
30. Composition selon la revendication 27 à 29 destinée à moduler ralentir ou inhiber l'activité des présénilines ou de leurs formes mutées.
31 Composition selon l'une des revendications 27 à 29 destinée au traitement des maladies neurodégéneratives.
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