EP0791062A1 - Die genexpression in coryneformen bakterien regulierende dna - Google Patents

Die genexpression in coryneformen bakterien regulierende dna

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EP0791062A1
EP0791062A1 EP95936429A EP95936429A EP0791062A1 EP 0791062 A1 EP0791062 A1 EP 0791062A1 EP 95936429 A EP95936429 A EP 95936429A EP 95936429 A EP95936429 A EP 95936429A EP 0791062 A1 EP0791062 A1 EP 0791062A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
protein
dna fragment
acetate
cgc
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95936429A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Reinscheid
Bernhard Eikmanns
Hermann Sahm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP0791062A1 publication Critical patent/EP0791062A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the invention relates to a DNA regulating gene expression in coryneform bacteria.
  • Corynebacterium glutamicu and the species closely related to it are c. mela ⁇ ecolae, Brevibacterium flavum and B. lactofermentum counted among the coryneform bacteria. Furthermore, the mentioned species to the 'glutamic acid bacteria' because they are able to excrete large amounts of glutamate into the medium under certain growth conditions. The microorganisms mentioned are of great industrial interest since they can be used for the production of amino acids, purines and proteins. For C. glutamicum, C. mela ⁇ secolae, B. flavum and B.
  • lactofermentum growth on acetate or ethanol has already been demonstrated and it has been shown that they have a glyoxylate cycle, ie also the enzymes isocitrate lyase and malate synthase, (For an overview see: Kinoshita, Amino acids, in Biology of industrial organisms, 1985, pp. 115-142, Benjamin / cum ings Publishing).
  • coryneform bacteria can be genetically modified for specific purposes.
  • the genes to be cloned are cloned under the control of their own promoters onto vectors which are present in high copy numbers in coryneform bacteria. It was shown in several cases that a strong overexpression of individual genes had an adverse effect on the growth of coryneform bacteria and thus on the production of desired products. The reason for this was that the
  • a desired gene can be integrated into the chromosome of coryneform bacteria in a single copy number. Since there is only one copy of this gene in the organism, there are usually no toxic effects from the corresponding gene product. A weakness of this method lies in the labor-intensive methodology to achieve the desired goal. In addition, the simple copy number of the inserted gene rarely produces a sufficient amount of a desired substance.
  • An alternative to integrating a gene into the chromosome of coryneform bacteria is to clone a gene onto a low copy vector in coryneform bacteria. This has the advantage that the corresponding gene product is formed in a relatively small amount and is therefore usually not toxic to the cell. Allerdin ⁇ s is too in this case the relatively small amount of gene product for biotechnological applications is a disadvantage.
  • each of the three promoters needs to induce a gene are relatively uninteresting for industrial purposes.
  • the lac promoter requires the relatively expensive substance IPTG to induce a gene, which renders a large-scale application of this promoter unprofitable.
  • IPTG IPTG
  • Lambda P L is activated by heat. Heat not only damages the organism but could also have a harmful effect on the product formed, so that this promoter is of no industrial interest for coryneform bacteria 5 is.
  • the trp promoter is activated by tryptophan deficiency. Since coryneform bacteria usually do not suffer from tryptophan deficiency, the use of this promoter would require the production of coryneform tryptophan deficiency mutants. Since the generation of such mutants is relatively complex, the trp promoter has not yet found its way into the biotechnological use of coryneform bacteria.
  • the ideal case for a regulatable promoter was a coryneform promoter, which is regulated by an easily available, inexpensive substance.
  • the only coryneform promoter described so far is that of the gene for isocitrate lyase (EP-OS 0 530 765).
  • This promoter leads to the expression of genes as long as there is no sugar in the medium.
  • sugar since sugar is used as a carbon source in most fermentation media, it would make sense to obtain a regulable promoter which also leads to the expression of a gene in the presence of sugars with an inexpensive inducer.
  • the expression of the malate synthase gene in coryneform bacteria can be induced by the presence of inducers such as lactate, pyruvate and / or acetate.
  • inducers such as lactate, pyruvate and / or acetate.
  • This induction in particular through acetate, also occurs when there are other carbon sources in the medium. Even in the presence of sugars or in complex medium there is significant induction by acetate.
  • Inducer such as acetate and regardless of the composition of the fermentation medium to express genes regulated in coryneform bacteria.
  • the malate synthase gene of the present invention is a malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of the malate synthase gene of
  • Coryjie ⁇ acter UJD glutamicum upstream and isolated from this DNA fragment provided; i.e. the gene for malate synthase (aceB) was isolated and sequenced from C-glutamicum together with the structures required for expression and regulation.
  • the DNA sequence and the amino acid sequence derived from it are shown in Table 2.
  • the ribosome binding site of the aceB gene is underlined and marked with 'RBS'.
  • the potential terminator of aceB transcription is shown by antiparallel arrows.
  • the media used were 2xTY complete medium or CgC minimal medium (Eikmanns et al., Appl Microbiol Biotechnol 34 (1991) 617-622), each with 1% of glucose, acetate, pyruvate, lactate, citrate, succinate , Fumarate or glutamate used as a carbon source.
  • the cultures were incubated again at 30 ° C and the OD 60Q was followed.
  • the cells Upon reaching an OD of 60 o 8 ⁇ 10, the cells were harvested by centrifugation, washed once with buffer pH 7.6 (50 mM Tris / HCl), resuspended in 1 ml of the same buffer was added, and by sonication in a Branson Sonifier W250 (10 Minutes, pulsed with an interval of 20% and an output of 30 watts). To separate the cell debris, the homogenate was sigma at 13000 rpm for 30 minutes
  • the enzyme test contained in a final volume of 1.0 ml, 50 mM
  • the mixture was incubated at 30 ° C., the decrease in extinction at 232 nm was determined over a period of 2 minutes, which decrease results from the cleavage of the thioester bond of acetyl-CoA.
  • the extinction coefficient of acetyl-CoA at 232 nm is 4.5 mM -1 cm -1 (Stadtman, Methods in Enzy ology, Vol. 3, 1957, New York: Academic Press).
  • the protein content of the crude extracts was determined using the biuret method (Bradford, Anal Biochem 72 (1976) 248-254).
  • the specific malate synthase activities obtained are listed in Table 1.
  • Table 1 the activity of the MSY when growing on 2xTY complete medium and on CgC minimal medium with glucose, citrate, succinate, fumarate or glutamate as a carbon source is approximately 0.04 U / mg protein.
  • CgC minimal medium with lactate or pyruvate as carbon sources the MSY activity increases to values of 0.173 U / mg protein or 0.192 U / mg protein. The highest MSY activity is observed with 2.212 U / mg protein when growing on CgC minimal medium with acetate.
  • coli stam ED8654 (Murray et al. Mol Gen Genet 150 (1977) 53-61) was transfected therewith.
  • the recombinant cosmids were packaged in the protein envelope of the phage lambda by a method by Sternberg et al. (Gene 1 (1979) 255-280), the transfection of E. coli ED8654 according to a method by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the corresponding cosmids were isolated from a total of 30 of the recombinant E.
  • mutant DV21A05 (anderwinkel and De Vlieghere Eur J Biochem 5 (1968) 81-90) according to a known method (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Due to its MSY defect, mutant DV21A05 is no longer able to grow on acetate as the only carbon source. After transformation of the Cosmid gene bank into this mutant, a total of 1000 clones were obtained. Of these, three clones showed growth on M9 minimal medium (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) with acetate as the only carbon source. After isolating the corresponding cosmids (Sambrook et al.,
  • the plasmids generated in this way were used to generate deletion constructs according to the method of Henikoff (Gene 28 (1984) 351-359), which were subsequently used by the chain termination sequencing method (Sanger et al., Proc Natl Acad Sei USA, 74 (1977) 5463-5467) were sequenced.
  • the entire sequence of the 3 kb Bfrl-Pvul fragment obtained in this way is shown in Table 2.
  • the protein sequence derived from the aceB gene for the MSY from C. glutamicum, the ribosome binding site located in front of the gene and the termination structure for the transcription behind the gene are shown in Table 2.
  • Electroporation (Liebl et al., FEMS Microbiol Lett 65 (1989) 299-304) was used to isolate the plasmids pEKBla and pEKBlb in C. introduced glutamicum and the resulting strains as WT (pEKBla) and WT (pEKBlb) called.
  • WT pEKBla
  • WT pEKBlb
  • the newly constructed C. glutamicum strains were grown on CgC minimal medium with glucose, glucose / acetate or acetate as carbon sources up to an OD 60 o of 8-10, crude extracts were prepared and the specific MSY activity was determined in them .
  • the measured MSY activities are shown in Table 3.
  • This result proves that on the 3 kb Bfrl-Pvul fragment the aceB gene from C. Functionally available glutamicum.
  • aceB gene required structures, ie the promoter and regulatory sequences, are located. These structures are in front of the aceB gene. Since the cloned fragment still bears 584 bp before the actual aceB structural gene (see Table 2), the structures for expression and regulation must be located in this DNA region. 5. Studies on the regulation and expression of the aceB gene from C glutamicum.
  • MSY accounts for approximately 20% of the total cell protein in this strain.
  • the result shows that the structures necessary for the expression and regulation of aceB induce the re-synthesis of large amounts of protein under induced conditions.
  • the result shows that the observed increase in MSY activity after growth on acetate is due to the new synthesis of the MSY protein.
  • the DNA region in front of the aceB gene was isolated according to known methods as a 574 bp Bfrl-DraJ fragment, the overhanging ends were filled in to blunt ends with Klenow polymerase and into the Sall interface of the vector pEKplCm (Eikmanns.) Filled in with Klenow polymerase et al., Gene 102 (1991) 93-98).
  • This plasmid carries the chloramphenicol acetyltransferase gene (cat) behind the insertion site, but without its own promoter, ie the cat gene in C. glutamicum cannot be read from the plasmid pEKplCm.
  • the strains to be investigated were cultivated according to a known method on the above-mentioned media up to an OD 60 o 8 to 10, crude extracts were prepared and in these the specific CAT activity according to the method of Shaw (Meth Enzymol 43 (1975) 737-755).
  • the test contained in a final volume of 1.0 ml 100 mM Tris / HCl pH 7.8, 1 mM acetyl-coenzyme A, 1 mM 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) and crude extract and was treated with 2.5 mM chloramphenicol started. The mixture was incubated at 30 ° C. The increase in absorbance at 412 nm was determined over a period of 2 minutes.
  • the protein content of the crude extracts was determined using the biuret method (Bradford, Anal Biochem 72 (1976) 248-254).
  • the specific CAT activities obtained are listed in Table 4. While there was no CAT activity detected in the C. glutamicum WT under any of the conditions tested, the recombinant strain C. glutamicum WT (pIWI) showed CAT activity for all carbon sources. However, the CAT activity after growth on CgC glucose was about 20 times lower than after growth on CgC glucose / acetate and even 50 times lower than after growth on CgC acetate. This result confirms that the isolated 574 bp Bfrl-Dral fragment allows the regulated gene expression of foreign genes. The foreign gene is induced by acetate, even in the presence of sugar.
  • the supernatant was chromatographed on an FPLC system with an HR5 / 5 MonoQ anion exchange column (Pharmacia LKB, Freiburg Germany).
  • the MSY was eluted with a 0.1 M to 0.4 M NaCl gradient in 50 mM MES / NaOH pH 6.
  • the buffer of the partially purified MSY was changed from 50 mM MES / NaOH pH 6 to 50 mM Tris / HCl pH 8 by means of ultrafiltration.
  • MSY malate synthase
  • Table 4 Specific activity of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) in crude extracts of the C. glutamicum wild type (WT) and the recombinant C. glutamicum strain WT (pIWI) after growth on CgC minimal medium with glucose, glucose / acetate or acetate as Carbon sources.
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein DNA-Fragment, das dem Malatsynthase-Gen eines coryneformen Bakteriums vorgeschaltet und von diesem isoliert ist. Diesem DNA-Fragment kann ein beliebiges, für ein Protein kodierendes Strukturgen nachgeschaltet werden. Nach Transformation eines solchen Konstrukts in ein coryneformes Bakterium wird die Expression des dem DNA-Fragment nachgeschalteten Strukturgens reguliert. Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Synthese eines beliebigen Proteins durch Kultivierung eines transformierten coryneformen Bakteriums. Ein solches Bakterium enthält in replizierbarer Form ein vom Malatsynthasegen eines coryneformen Bakteriums isoliertes DNA-Fragment, dem das für das zu synthetisierende Protein kodierende Strukturgen nachgeschaltet ist. Da die Expression des für das zu synthetisierende Protein kodierende Strukturgen durch das vorgeschaltete DNA-Fragment reguliert ist, wird das Strukturgen exprimiert und das gewünschte Protein synthetisiert, sobald dem Medium ein entsprechender Induktor zugesetzt wird.

Description

B e s c h r e i b u n g
Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
Die Erfindung betrifft eine die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA.
Jeder Organismus ist im Laufe des Wachstums darauf angewiesen, Zellsubstanz neu zu synthetisieren. Dabei werden zahlreiche Zellbestandteile, wie z. B. Aminosäuren und Porphyrine, ausgehend von Metaboliten des Citrat-Zyklus neu gebildet. Dies setzt voraus, daß die dem Citrat-Zyklus entzogenen Metabolite neu synthetisiert werden. Bei Wachstum von Mikroorganismen auf Acetat, Ethanol oder Fettsäuren werden Metabolite des Citrat-Zyklus durch eine als Glyoxylat-Zyklus bezeichnete Reaktionsfolge neu synthetisiert (Kornberg, Biochem J 99 (1966) 1-11) Schlüsselenzyme des Glyoxylat-Zyklus sind die Enzyme Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase. Da die genannten Enzyme in vielen Organismen ausschließlich bei Wachstum auf Acetat, Ethanol bzw. Fettsäuren, nicht jedoch bei Wachstum auf Kohlenhydraten benötigt werden, wird die Aktivität bzw. die Neusynthese der beiden Enzyme häufig durch die Kohlenstoffquelle des Medium reguliert.
Aufgrund ihrer keulenförmigen Gestalt wird Corynebacterium glυtamicu und die mit diesem nah verwandten Arten c. melaεεecolae , Brevibacterium flavum und B. lactofermentum zu den coryneformen Bakterien gezählt. Weiterhin gehören die genannten Arten zu den 'Glutaminsäure-Bakterien', da sie in der Lage sind, unter gewissen Wachstumsbedingungen große Mengen an Glutamat in das Medium auszuscheiden. Die genannten Mikroorganismen sind von großem industriellen Interesse, da sie für die Herstellung von Aminosäuren, Purinen und Proteinen eingesetzt werden können. Für C. glutamicum, C. melaεsecolae , B. flavum und B. lactofermentum konnte Wachstum auf Acetat bzw. Ethanol bereits nachgewiesen werden und es wurde gezeigt, daß sie einen Glyoxylat-Zyklus, d.h. auch die Enzyme Isocitrat- Lyase und Malat-Synthase, besitzen (Für einen Überblick siehe: Kinoshita, Amino acids, in Biology of industrial organisms, 1985, pp. 115-142, Benjamin/cum ings Publishing).
Trotz langjähriger industrieller Anwendung dieser Organismen wurden erst in jüngerer Vergangenheit molekularbiologische Methoden entwickelt, mit deren Hilfe coryneforme Bakterien für angewandte Zwecke gezielt genetisch verändert werden können. In der Regel werden dazu die zu klonierenden Gene unter Kontrolle ihrer eigenen Promotoren auf Vektoren kloniert, die in hoher Kopienzahl in coryneformen Bakterien vorliegen. Dabei zeigte sich in mehreren Fällen, daß eine starke Überexpression einzelner Gene sich nachteilig auf das Wachstum coryneformer Bakterien und somit auf die Produktion gewünschter Produkte auswirkte . Dies hatte seine Ursache darin, daß die
Überproduktion eines entsprechenden Genprodukts zu toxischen Effekten innerhalb des Stoffwechsels der Zelle führte und somit das Wachstum dieser Zelle verlangsamte. Beispiele für derartige Fälle ist die homologe Überexpression von mutierten Genen, die für deregulierte Enzyme kodieren, d. h. solche Enzyme, deren 3
Aktivität keiner Endprodukt-Hemmung mehr unterliegt, z.B. die homologe Überexpression des homl-Gens, das für eine deregulierte Ho oserin-Dehydrogenase kodiert. (Reinscheid et al., Appl Environiu Microbiol 60 (1994), 126-132). Es sind aber auch Fälle bekannt, in denen die Überexpression eines nicht- mutierten Gens im homologen System für das Wachstum von C. glutamicum schädlich ist (z.B. Eikmanns et al., Microbiology 140 (1994) 1817-1828). Darüberhinaus kommt es häufig zu Problemen, wenn Gene, die nicht aus coryneformen Bakterien stammen, in diesen überexprimiert werden sollen. Um in coryneformen Bakterien ein gewünschtes Gen zu exprimieren, ohne eine Wachstumshemmung durch das entsprechende Genprodukt in Kauf nehmen zu wollen, existieren verschiedene Möglichkeiten: Ein gewünschtes Gen kann in einfacher Kopienzahl in das Chromosom von coryneformen Bakterien integriert werden. Da nur eine Kopie dieses Gens in dem Organismus vorliegt, treten in der Regel keine toxischen Effekte durch das entsprechende Genprodukt auf. Eine Schwäche diese Verfahrens liegt in der arbeitsaufwendigen Methodik, um das gewünschte Ziel zu erreichen. Darüberhinaus wird durch die einfache Kopienzahl des eingefügten Gens nur selten eine ausreichende Menge von einem gewünschten Stoff gebildet.
Eine Alternative zur Integration eines Gens in das Chromosom von coryneformen Bakterien ist die Klonierung eines Gens auf einem Vektor mit niedriger Kopienzahl in coryneformen Bakterien. Dies hat den Vorteil, daß das entsprechende Genprodukt in relativ geringer Menge gebildet wird und damit meistens nicht toxisch für die Zelle ist. Allerdinαs ist auch in diesem Falle die relativ geringe Menge an gebiltetem Genprodukt für biotechnologische Anwendungen ein Nachteil.
Es wäre daher wünschenswert, ein gewünschtes Genprodukt in großer Menge nur zu einem bestimmten Zeitpunkt zu bilden, um nachteilige Effekte dieses Genprodukts auf die Produktion bzw. das Wachstum des Organismus zu umgehen. Um dieses Ziel zu erreichen, bietet es sich an, ein gewünschtes Gen ohne seinen eigenen Promotor hinter einen regulierbaren Promotor zu klonieren. Für die regulierbaren Eεcherichia coli Promotoren lac, Lambda PL und trp konnte bereits gezeigt werden, daß sie in coryneformen Bakterien zur regulierten Expression verschiedener Gene eingesetzt werden können (Tsuchiya und Morinaga, Bio/Technology 6 (1988) 428-431). Allerdings besitzen diese Promotoren verschiedene Nachteile: Zum einen stammen die genannten Promotoren nicht aus coryneformen Organismen und stellen somit Fremd-DNA dar. Durch Einschleusung eines derartigen Promotors in coryneforme Bakterien werden diese zu reko binanten Organismen, für welche strengere Sicherheitsbestimmungen gelten. Zum anderen sind die
Bedingungen, die jeder der drei Promotoren zur Induktion eines Gens benötigt, für industrielle Zwecke relativ uninteressant. So benötigt der lac-Promotor zur Induktion eines Gens den verhältnismäßig teuren Stoff IPTG, welcher eine großtechnische Anwendung dieses Promotors unrentabel macht. Der Promotor
Lambda PL wird durch Hitze aktiviert. Hitze schadet aber nicht nur dem Organismus sondern könnte sich auch auf das gebildete Produkt schädlich auswirken, so daß dieser Promotor von keinerlei industriellem Interesse für coryneforme Bakterien 5 ist. Der trp-Promotor wird durch Tryptophan-Mangel aktiviert. Da coryneforme Bakterien in der Regel nicht unter Tryptophan- Mangel leiden, würde die Verwendung dieses Promotors die Herstellung coryneformer Tryptophan-Mangel-Mutanten voraussetzen. Da die Gewinnung solcher Mutanten relativ aufwendig ist, hat auch der trp-Promotor bislang keinen Einzug in die biotechnologische Nutzung bei coryneformen Bakterien gefunden.
Den Idealfall für einen regulierbaren Promotor stellte ein coryneformer Promotor dar, der durch einen leicht verfugbaren, preiswerten Stoff reguliert wird. Der bislang einzige beschriebene coryneforme Promotor ist der des Gens für Isocitrat-Lyase (EP-OS 0 530 765). Dieser Promotor führt zur Expression von Genen, solange sich kein Zucker im Medium befindet. Da jedoch in den meisten Fermentationsmedien Zucker als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, wäre es sinnvoll, einen regulierbaren Promotor zu erhalten, der auch in Anwesenheit von Zuckern mit einem preiswerten Induktor zur Expression eines Gens führt.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein DNA-Fragment bereit zu stellen, das unabhängig von der Kohlenstoffquelle des Kulturmediums eine regulierte Expression verschiedener Gene in coryneformen Bakterien ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein dem Malatsynthase-Ger eines coryneformen Bakteriums vorgeschaltetes und von diesem isoliertes DNA-Fragment gelöst, das die Expression eines beliebigen, für ein Protein kodierenden, dem DNA-Fragment 6 nachgeschalteten
Strukturgens nach Einbau in einen Vektor und Transformation in ein coryneformes Bakterium reguliert.
Es konnte ermittelt werden, daß die Expression des Malatsynthase-Gens in coryneformen Bakterien durch die Anwesenheit von Induktoren, wie beispielsweise Lactat, Pyruvat und/oder Acetat induzierbar ist. Diese Induktion insbesondere durch Acetat erfolgt auch dann, wenn sich noch andere Kohlenstoffquellen im Medium befinden. Sogar in Anwesenheit von Zuckern bzw. in Komplexmedium erfolgt eine signifikante Induktion durch Acetat.
Nach Isolierung eines dem Malatsynthase-Gen eines coryneformen Bakteriums vorgeschalteten DNA-Fragments wird diesem ein beliebiges, für ein zu synthetisierendes Protein kodierendes Strukturgen nachgeschaltet, dieses Konstrukt in einen Vektor ligiert und anschließend in ein coryneformes Bakterium transformiert. Wahrend der Kultivierung eines solchen Transformanten wird zu einem beliebigen Zeitpunkt dem Medium ein Induktor, wie Lactat, Pyruvat, vorzugsweise Acetat, zugegeben, worauf das Strukturgen zum gewünschten Zeitpunkt exprimiert und somit das gewünschte Protein synthetisiert wird. Das erfindungsgemäß bereitgestellte DNA-Fragment erlaubt damit die regulierte Expression von verschiedenen Genen in coryneformen Bakterien. Da die isolierte DNA selbst aus einem coryneformen Bakterium stammt, erfolgt die oben beschriebene Regulation innerhalb eines homologen Systems. Der erfindungsgemäße DNA-Bereich bietet daher zum ersten Mal die Möglichkeit, in einem homologen System, durch einen preiswerten
Induktor wie Acetat und unabhängig von der Zusammensetzung des Fermentationsmediums Gene in coryneformen Bakterien reguliert zu exprimieren.
Vorzugsweise wird ein dem Malatsynthase-Gen von
Coryjieϋacter UJD glutamicum vorgeschaltetes und von diesem isoliertes DNA-Fragment bereitgestellt; d.h. aus C- glutamicum wurde das Gen für Malatsynthase ( aceB) zusammen mit den für die Expression und Regulation benötigten Strukturen isoliert und sequenziert. Die DNA-Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Tab. 2 dargestellt. In der ~ b> . 2 ist die Ribosomenbindungsstelle des aceB-Gens unterstrichen und mit 'RBS' gekennzeichnet. Der potentielle Terminator der Transkription von aceB ist durch antiparallele Pfeile dargestellt.
Es konnte festgestellt werden, daß der vor dem Malatsynthase-Gen befindliche DNA-Bereich von Nucleotid 1 bis 574 gemäß Tα4> . 2 zur regulierten Expression auch anderer Gene führt.
Ausführungsbeispiel:
1. Untersuchungen zur Aktivität der Malatsynthase in Zellextrakten von Corynebacterium glutamicum nach Wachstum auf verschiedenen Medien.
In Extrakten des C. glutamicum-Stammes ATCC 13032 (Wildtyp) wurde die Aktivität der Malatsynthase (MSY) nach Wachstum auf verschiedenen Medien bestimmt, um den Einfluß der
Kohlenstoffquelle auf die Aktivität dieses Enzyms zu untersuchen. Es wurden dazu die Zellen für 14 h in 10 ml 2xTY- Vollmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) bei 30°C unter Schütteln (120 UpM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, einmal mit Puffer pH 6,8 (0,1 M Kaliumphosphat) gewaschen und in 1 ml des gleichen Puffers aufgenommen. Mit der erhaltenen Zellsuspension wurde anschließend jeweils 60 ml Mediun beimpft um eine optische Dichte (OD600) von 1,0 zu erhalten. Bei den verwendeten Medien handelte es sich um 2xTY-Vollmedium oder es wurde CgC- Minimalmedium (Eikmanns et al., Appl Microbiol Biotechnol 34 (1991) 617-622) mit jeweils 1% an Glukose, Acetat, Pyruvat, Laktat, Citrat, Succinat, Fumarat bzw. Glutamat als Kohlenstoffquelle verwendet. Die Kulturen wurden erneut bei 30°C inkubiert und die OD60Q wurde verfolgt. Bei Erreichen einer OD60o von 8 ~ 10 wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, einmal mit Puffer pH 7,6 (50 mM Tris/HCl) gewaschen, in 1 ml des gleichen Puffers aufgenommen, und durch Ultraschallbehandlung in einem Branson-Sonifier W250 (10 Minuten, gepulst mit einem Intervall von 20% und einer Leistung von 30 Watt) desintegriert. Zur Abtrennung der Zelltrümmer wurde das Homogenat für 30 Minuten bei 13000 UpM in einer Sigma
2K15 Kühlzentrifuge bei 4°C zentrifugiert, und anschließend der klare Überstand (Rohextrakt) zur Bestimmung der MSY-Aktivität verwendet.
Der Enzymtest enthielt in einem Endvolumen von 1,0 ml, 50 mM
Tris/HCl, (pH 7,6), 40 mM MgCl2, 2 mM Na-Glyoxylat, 0,15 mM Acetyl-CoenzymA und Rohextrakt. Der Ansatz wurde bei 30°C inkubiert, über einen Zeitraum von 2 Minuten wurde die Extinktionsabnahme bei 232 nm bestimmt, die sich aufgrund der Spaltung der Thioesterbindung von Acetyl-CoA ergibt. Der Extinktionskoeffinzient von Acetyl-CoA bei 232 nm liegt bei 4,5 mM-1 cm-1 (Stadtman, Methods in Enzy ology, Vol. 3, 1957, New York: Academic Press). Der Proteingehalt der Rohextrakte wurde mit Hilfe der Biuret-Methode (Bradford, Anal Biochem 72 (1976) 248-254) bestimmt. Die erhaltenen spezifischen Malatsynthase- Aktivitaten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, liegt die Aktivität der MSY bei Wachstum auf 2xTY-Vollmedium sowie auf CgC-Minimalmedium mit Glucose, Citrat, Succinat, Fumarat bzw. Glutamt als Kohlenstoffquelle bei ungefähr 0,04 U/mg Protein. Auf CgC- Minimalmedium mit Lactat bzw. Pyruvat als Kohlenstof quellen steigt die MSY-Aktivität auf Werte von 0,173 U/mg Protein bzw. 0,192 U/mg Protein an. Die höchste MSY-Aktivität wird mit 2,212 U/mg Protein bei Wachstum auf CgC-Minimalmedium mit Acetat beobachtet. Wurde Acetat den oben genannten Medien zugesetzt, so führte dies ebenfalls zu einem starken MSY-Aktivitätsanstieg auf Werte von 0,500 U/mg Protein bis 1,330 U/mg Protein. Diese Ergebnisse zeigen, daß in C glutamicum die Aktivität der MSY durch die Kohlenstoffquelle des Mediums reguliert wird.
2. Isolierung und Subklonierung des MSY-Gens aus Corynβbacterium glufcaaicum.
Zur Isolierung des MSY-Gens ( aceB) aus C. glutamicum wurde basierend auf dem Cosmid pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11 (1980) 291-298) eine corynebakterielle Cosmid-Genbank nach bekannter Methodik (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) angelegt. Dazu wurde aus C. glutamicum chromosomale DNS isoliert (Eikmanns et al., Microbiology 140 (1994) 1817-1828) und mit dem Restriktionsenzym Sau3A partiell verdaut. Nach Ligation der erhaltenen Fragmente in die BamHI-Schnittstelle des Cosmids pHC79 wurde der Ansatz in die Proteinhülle des Bakteriophagen Lambda verpackt und der E. coli-Stam ED8654 (Murray et al. Mol Gen Genet 150 (1977) 53-61) damit transfiziert. Die Verpackung der rekombinanten Cosmide in die Proteinhülle des Phagen Lambda erfolgte nach einer Methode von Sternberg et al. (Gene 1 (1979) 255-280), die Transfektion von E . coli ED8654 nach einer Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Aus insgesamt 30 der erhaltenen rekombinanten E. coli-Klone wurden die entsprechenden Cosmide isoliert (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) und einer Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hindlll unterzogen. Es zeigte sich, daß 24 der untersuchten Cosmide Inserts besaßen, und daß die Inserts Größen von ungefähr 35 kb aufwiesen. Insgesamt 2200 Cosmid-tragende E. coli-Klone wurden vereinigt und aus diesem Gemisch nach bekanntem Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) die Cosmid-DNA präpariert- Zur Isolierung des aceJS-Gens aus C. glutamicum wurde die Cosmid-Genbank in die MSY-defekte E. coli-Mutante DV21A05 ( anderwinkel und De Vlieghere Eur J Biochem 5 (1968) 81-90) nach bekanntem Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) transformiert. Die Mutante DV21A05 ist aufgrund ihres MSY-Defektes nicht mehr in der Lage, auf Acetat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Nach Transformation der Cosmid- Genbank in diese Mutante wurden insgesamt 1000 Klone erhalten. Von diesen zeigten auf M9-Minimalmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle insgesamt drei Klone Wachstum. Nach Isolierung der entsprechenden Cosmide (Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) aus diesen Klonen und erneuter Transformation in die E. coli-Mutante DV21A05 waren die resultierenden Klone erneut in der Lage, auf M9-Medium mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Dies läßt vermuten, daß auf den drei Cosmiden das aceB-Gen aus C. glutamicum lokalisiert ist.
Um das aceB-Gen aus C. glutamicum auf einem kleineren Fragment einzugrenzen, wurden die drei Cosmide mit dem Restriktionsenzym Sau3A partiell verdaut und nach bekannter
Methode (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) auf einem 0,8%igen Agarosegel im elektrischen Feld aufgetrennt. Fragmente 5 im Größenbereich von 3,0 kb bis 6,0 kb wurden durch Elektroelution (Sambrook et al-, Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) aus dem Gel isoliert und in die BamHI-Schnittstelle des Vektors pHCYC184 (Chang und Cohen, J Bacteriol (1978) 1141- ° 1156) ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli DV21A05 transformiert und die erhaltenen Transformanten wurden erneut auf ihre Fähigkeit untersucht, auf Acetat als alleiniger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Es konnten auf diese Weise neun Klone isoliert werden, deren Plasmide der Mutante DV21A05 5 Wachstum auf Acetat erlaubten. Aus den jeweiligen rekombinanten Stämmen wurden die entsprechenden Plasmide isoliert und einer Restriktionskartierung unterzogen. Die Restriktionskarte von einem der Plasmide, pAB-17, ist in Figur 1 dargestellt. Aus diesem Plasmid wurde nach bekanntem Verfahren das für die MSY o kodierende DNS-Fragment durch Bfrl-Pvul-Restriktion als 3 kb
Fragment isoliert und in den C. glutamicum/E . coli-Pendelvektor pEKO (Eikmanns et al., Gene 102 (1991) 93-98) ligiert. In Abhängigkeit von der Orientierung des Inserts im Vektor wurden die neu konstruierten Plasmide als pEKBla und pEKBlb 5 bezeichnet. Die Restriktionskarten beider Plasmide sind in Figur 2 präsentiert. 3. Analyse der Nukleotidsequenz des MSY-Strukturgens und angrenzender Bereiche
Für die Sequenzierung wurden zwei sich überlappende Teilfragmente, ein 1,6 kb Bf l-Kpnl und ein 1,8 kb Sphl-Pvul- Fragment, aus dem Plasmid pAB-17 nach bekannter Methode isoliert. Die überhängenden Enden beider Fragmente wurden mit JClenow-Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt (Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) und in geeignete Schnittstellen des Plasmids pUC18 (Vieira und Messing, Gene 19 (1982) 259-268) ligiert. Die so erzeugten Plasmide wurden benutzt, um nach der Methode von Henikoff (Gene 28 (1984) 351-359) Deletionskonstrukte zu erzeugen, die anschließend durch die Kettenabbruch-Seguenziermethode (Sanger et al., Proc Natl Acad Sei USA, 74 (1977) 5463-5467) sequenziert wurden. Die dabei erhaltene, gesamte Sequenz des 3 kb Bfrl-Pvul-Fragmentes ist in Tabelle 2 dargestellt. Außerdem ist in Tabelle 2 die von dem aceB-Gen abgeleitete Proteinsequenz für die MSY aus C. glutamicum , die vor dem Gen befindliche Ribosomenbindungsstelle und die hinter dem Gen liegende Terminationsstruktur für die Transkription abgebildet.
4. MSY-Aktivität von C. glutamicum-Stämmen, die das MSY-Gen auf Plasmid tragen.
Durch Elektroporation (Liebl et al., FEMS Microbiol Lett 65 (1989) 299-304) wurden die Plasmide pEKBla und pEKBlb in C . glutamicum eingeführt und die resultierenden Stämme als WT(pEKBla) und WT(pEKBlb) bezeichnet. Nach bekannter Methode wurden die neu konstruierten C. glutamicum-Stämme auf CgC- Minimalmedium mit Glukose, Glukose/Acetat bzw. Acetat als Kohlenstoffquellen bis zu einer OD60o von 8-10 gezüchtet, Rohextrakte hergestellt und in diesen die spezifische MSY- Aktivität bestimmt. Die gemessenen MSY-Aktivitäten sind in Tabelle 3 dargestellt.
Die C. glutamicujπ-Stamme WT(pEKBla) und WT(pEKBlb) zeigen auf allen drei Kohlenstoffguellen jeweils signifikant höhere Aktivitäten als der C. glutamicum-Wildtyp (WT) und der C. glutamicum-Stamm WT(pEKθ), der den Ausgangsvektor pEKO enthalt. Dieses Ergebnis beweist, daß auf dem 3 kb Bfrl-Pvul-Fragment das aceB-Gen aus C . glutamicum funktionell vorliegt. Nach Wachstum der C. glutamicum-Sta me WT(pEKBla) und WT(pEKBlb) auf CgC-Glukose/Acetat sind deren MSY-Aktivitaten ungefähr achtfach hoher als bei Wachstum dieser Stamme auf Glukose. Bei Wachstum der beiden Stamme auf CgC-Minimalmedium mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle ist die MSY-Aktivitat sogar 16- bis 18-fach hoher als bei Wachstum auf CgC-Glukose. Diese Ergebnisse belegen, daß sich auf dem isolierten Fragment alle zur
Expression und Regulation des aceB-Gens benötigten Strukturen, d.h. der Promotor und regulatorische Sequenzen, befinden. Diese Strukturen liegen vor dem aceB-Gen. Da das klonierte Fragment vor dem eigentlichen aceB-Strukturgen noch 584 bp tragt (siehe Tabelle 2), müssen die Strukturen für Expression und Regulation in diesem DNS-Bereich lokalisiert sein. 5. Untersuchungen zur Regulation und Expression des aceB-Gens aus C glutamicum .
Um zu beweisen, daß es sich bei der beobachteten Regulation der MSY um Regulation auf genetischer Ebene und nicht um eine Regulation des Enzyms selbst (z.B. durch Inhibition, Aktivierung oder kovalente Modifikation) handelt, wurden Rohextrakte von auf CgC-Minimalmedium mit Glukose gezüchteten C. glutamicum WT bzw. WT(pEKBla)-Zellen und von auf CgC- Minimalmedium mit Acetat gezüchteten C. glutamicum WT(pEKBla)- Zellen auf ihr Proteinmuster untersucht. Dazu wurden die genannten Stämme nach bekannter Methode auf den entsprechenden Medien gezüchtet, Rohextrakte hergestellt und diese nach der Methode von Laemmli (Nature 227 (1970) 680-685) unter denaturierenden Bedingungen auf einem 12,5%igen Polyacrylamid- Gel aufgetrennt (Figur 3). Zur Lokalisation der MSY- Proteinbande im Rohextrakt wurde die MSY aus C. glutamicum bis zur Homogenität gereinigt (siehe Anhang 1) und parallel zu den Rohextrakten einer Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen unterworfen (Figur 3). Nach Wachstum von C. glutamicum WT auf CgC-Acetat erkennt man auf der Höhe der MSY eine deutlich intensivere Proteinbande als nach Wachstum dieses Stammes auf CgC-Glukose. Der Stamm WT(pEKBla) zeigt nach Wachstum auf CgC-Acetat eine sehr intensive MSY-Proteinbande. Aus der Intensität dieser Bande kann man abschätzen, daß die
MSY in diesem Stamm circa 20% des Gesamtzellproteins ausmacht. Das Ergebnis zeigt, daß die für die Expression und Regulation von aceB notwendigen Strukturen, unter induzierten Bedingungen die Neusynthese großer Mengen an Protein herbeiführen. Außerdem wird durch das Ergebnis deutlich, daß die beobachtete Steigerung der MSY-Aktivität nach Wachstum auf Acetat auf die Neusynthese des MSY-Proteins zurückzuführen ist.
6. Test des vor dem aceB-Gen liegenden DNS-Bereiches auf Funktionalität in einem unabhängigen System.
Der DNS-Bereich vor dem aceB-Gen wurde nach bekannten Methoden als 574 bp Bfrl-DraJ-Fragment isoliert, die überhängenden Enden mit Klenow-Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt und in die mit Klenow-Polymerase aufgefüllte Sall-Schnittstelle des Vektors pEKplCm (Eikmanns et al . , Gene 102 (1991) 93-98) ligiert. Dieses Plasmid trägt hinter der Insertionsstelle das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen ( cat ) , jedoch ohne eigenen Promotor, d.h. vom Plasmid pEKplCm kann das cat-Gen in C. glutamicum nicht abgelesen werden. Nach der Ligation des Bfrl-Dral-Fragmentes in den Vektor pEKplCm wurde durch Sequenzierung nach bekannter Methode sichergestellt, daß die Orientierung des Bfrl-Dral-Frag entes vor dem cat-Gen derjenigen vor dem aceB-Gen entspricht. Das entsprechende Plasmid wurde als pIWI bezeichnet. Nach Einbringen des Plasmids pIWI in C. glutamicum nach bekannter Methode wurde in diesem Stamm die Aktivität der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) nach Wachstum auf CgC-Glukose, CgC-Glukose/Acetat bzw. CgC- Acetat bestimmt. Dazu wurden die zu untersuchenden Stämme nach bekannter Methode auf oben genannten Medien bis zu einer OD60o 8 bis 10 kultiviert, Rohextrakte hergestellt und in diesen die spezifische CAT-Aktivität nach der Methode von Shaw (Meth Enzymol 43 (1975) 737-755) bestimmt. Der Test enthielt in einem Endvolumen von 1,0 ml 100 mM Tris/HCl pH 7,8, 1 mM Acetyl- CoenzymA, 1 mM 5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) und Rohextrakt und wurde mit 2,5 mM Chloramphenicol gestartet. Der Ansatz wurde bei 30°C inkubiert. Über einen Zeitraum von 2 Minuten wurde die Extinktionszunahme bei 412 nm bestimmt. Der Proteingehalt der Rohextrakte wurde mit Hilfe der Biuret- Methode (Bradford, Anal Biochem 72 (1976) 248-254) bestimmt. Die erhaltenen spezifischen CAT-Aktivitäten sind in Tabelle 4 aufgeführt. Während in dem C. glutamicum WT unter keiner der getesteten Bedingungen CAT-Aktivität nachzuweisen war, zeigte der rekombinante Stamm C. glutamicum WT(pIWI) bei allen Kohlenstoffquellen CAT-Aktivität. Allerdings war die CAT- Aktivität nach Wachstum auf CgC-Glukose etwa 20-fach niedriger als nach Wachstum auf CgC-Glukose/Acetat und sogar 50-fach geringer als nach Wachstum auf CgC-Acetat. Dieses Ergebnis belegt, daß das isolierte 574 bp Bfrl-Dral-Fragment die regulierte Genexpression von Fremdgenen erlaubt. Eine Induktion des Fremdgens erfolgt durch Acetat, selbst in Anwesenheit von Zucker.
Anhang 1.
Reinigung von MSY aus C glutamicum.
Zur Reinigung von MSY aus C. glutamicum wurden 60 ml einer in CgC-Acetat-Medium wachsenden Kultur bei 0D600 8 bis 10 verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit 20 ml 50mM Morpholinoethansulfonsäure (MES)/NaOH pH 6,0 gewaschen und in 1 ml des gleichen Puffers nach Zugabe von 5U/ml DNase, 15 ug/mg RNase und 100 μM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid resuspendiert. Aufschluß und Entfernung von Zelltrümmern erfolgte nach bereits bekannter Methode. Alle Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Der Zellextrakt wurde mit 50 mM MES/NaOH pH 6 auf 10 ml verdünnt. Nach 2 h Ultrazentrifugation bei 183.000 x g wurde der Überstand auf einer FPLC-Anlage mit einer HR5/5 MonoQ-Anionenaustauschersäule (Pharmacia LKB, Freiburg Deutschland) chromatographiert. Während der ersten chromatographischen Aufreinigung wurde die MSY mit einem 0,1 M bis 0,4 M NaCl-Gradienten in 50 mM MES/NaOH pH 6 eluiert. Für die zweite Chromatographie wurde der Puffer der partiell gereinigten MSY mittels Ultrafiltration von 50 mM MES/NaOH pH 6 zu 50 mM Tris/HCl pH 8 gewechselt. Während der zweiten chromatographischen Aufreinigung wurde die MSY mit einem 0,2 M bis 0,5 M NaCl-Gradienten in 50 M Tris/HCl pH 8 eluiert. Während beider chromatographischen Auftrennungen wurde eine Flußrate von 1 ml/min eingestellt. Der Durchfluß beider
Auftrennungen wurde in jeweils 1 ml Fraktionen gesammelt und auf MSY-Aktivität getestet. Die Aktivität enthaltenen Fraktionen wurden jeweils vereinigt. Tabelle 1: Aktivität der Malat-Synthase (MSY) in Rohextrakten von Corynebacterium glutamicum nach Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen
Medium spezifische MSY-Aktivität
(U/mg Protein)
2xTY-Vollmedium 0,030
2xTY-Vollmedium + 1% Acetat 0,840 CgC-Minimalmedium (MM) + 1% Glucose 0,040
CgC-MM + 1% Acetat 2,212
CgC-MM + 1% Pyruvat 0,192
CgC-MM + 1% Lactat 0,173
CgC-MM + 1% Citrat 0,038 CgC-MM + 1% Succinat 0,045
CgC-MM + 1% Fumarat 0,034
CgC-MM + 1% Glutamat 0,041
CgC-MM + 1% Acetat + 1% Glucose 0,970 CgC-MM + 1% Acetat + 1% Pyruvat 0,730
CgC-MM + 1% Acetat + 1% Lactat 0,860
CgC-MM + 1% Acetat + 1% Citrat 0,500
CgC-MM + 1% Acetat + 1% Succinat 0,920 CgC-MM + 1% Acetat + 1% Fumarat 0,910
CgC-MM + 1% Acetat + 1% Glutamat 1,330 1 CTTAAGTGCTGATTCGCAATGGGCGGTGCCGACCACAAAGTATGAGCTAATGCACTGTCACTGTTTCGACGTGATGTGCATCGGTTTGCG -ι
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Tabelle 3. Spezifische Aktivität der Malatsynthase (MSY) in Rohextrakten des C. glutamicum Wildtyps (WT) und der rekombinanten C. glutamicum-Stämme mit den Plasmiden pEKO, pEKBla und pEKBlb nach Wachstum auf CgC-Minimalmedium mit Glukose, Glukose/Acetat bzw. Acetat als Kohlensto fguelle.
C. glutamicum- spezifische MSY-Aktivität (U/mg Protein) Stamm CgC-Glukose CgC-Glukose/Acetat CgC-Acetat
T 0,040 0,970 2,11
WT(pEKO) 0,038 0,954 2,23
WT(pEKBla) 0,350 3,120 6,22
WT(pEKBlb) 0,374 3,240 6,08
Tabelle 4. Spezifische Aktivität der Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT) in Rohextrakten des C. glutamicum Wildtyps (WT) und des rekombinanten C. glutamicum-Stammes WT(pIWI) nach Wachstum auf CgC-Minimalmedium mit Glukose, Glukose/Acetat bzw. Acetat als Kohlenstoffguelle.
C. glutamicum- spezifische CAT-Aktivität (U/mg Protein)
Stamm CgC-Glukose CgC-Glukose/Acetat CgC-Acetat
WT 0,001 0,001 0,00]
WT(pIWI) 0,026 0,620 ],320

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Ein dem Malatsynthase-Gen eines coryneformen Bakteriums vorge¬ schaltetes und von diesem isoliertes DNA-Fragment, das die Expression eines beliebigen, für ein Protein kodierenden, dem DNA-Fragment nachgeschalteten Strukturgens nach Einbau in einen Vektor und Transformation in ein coryneformes Bakterium regulier .
2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, vom Malatsynthase-Gen von Coryn«-- bakterium glutamicum stammend . 0
3. DNA-Fragment nach Anspruch 2 mit der Nucleotidsequenz von Nucleotid 1 bis 574 gemäß Tabelle 2, wobei Tabelle 2 Bestandteil dieses Anspruches ist.
4. DNA-Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3 5 mit einem beliebigen nachgeschalteten Strukturgen.
5. Vektor, enthaltend ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4
0 6. Rekombinante, coryneforme Zelle, enthaltend in repl zierbarer Form ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Rekombinante, corynef ormo Zolle nach Anspruch 6, enthaltend einen Vektor nach Ansprucli . J
8. Verfahren zur Synthese eines beliebigen Proteins durch Kulti¬ vierung eines transformierten, coryneformen Bakteriums, enthal¬ tend in replizierbarer Form ein vom Malatsynthase-Gen eines coryneformen Bakteriums isoliertes DNA-Fragment, dem das für das zu synthetisierende Protein kodierende Strukturgen nachge¬ schaltet ist und das die Expression des für das zu synthetisie¬ rende Protein kodierende Strukturgen reguliert, in einem Medium, dem ein Induktor zugegeben wird, worauf das Strukturgen exprimiert und somit das gewünschte Protein synthetisiert wir
9. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß dem Kulturmedium als Induktor Lactat, Pyruvat, vorzugswei
Acetat zugegeben wird.
EP95936429A 1994-11-11 1995-11-07 Die genexpression in coryneformen bakterien regulierende dna Withdrawn EP0791062A1 (de)

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