EA043299B1 - NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER, NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS AND/OR LIVER FIBROSIS - Google Patents

Description

Неалкогольная жировая дистрофия печени (NAFLD) представляет собой бессимптомное заболевание, определяемое как накопление жира в печени (стеатоз) по причинам, отличным от чрезмерного употребления алкоголя. NAFLD является наиболее частой причиной повышенного уровня аминотрансфераз у пациентов, обращающихся к гепатологам. NAFLD варьирует от доброкачественного простого стеатоза до патологического состояния у некоторых пациентов, неалкогольного стеатогепатита (NASH), когда некроз/ воспалительный процесс приводит к прогрессирующему накоплению фиброза в печени, что в конечном итоге приводит к циррозу, печеночной недостаточности, гепатоцеллюлярной карциноме (HCC), пересадке печени и отказу печени. Как с эпидемиологической, так и с патофизиологической точки зрения, NAFLD и NASH тесно связаны с ожирением, метаболическим синдромом и диабетом 2 типа. Таким образом, параллельно с эпидемиями ожирения и диабета 2 типа, распространенность NAFLD и NASH в последние десятилетия резко возросла, и NASH становится основной причиной трансплантации печени в США. Следовательно, NASH считается растущей общемировой проблемой общественного здравоохранения с учетом того, что не существует оптимального решения для диагностики и отсутствует утвержденное лечение для NASH.Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is an asymptomatic disease defined as the accumulation of fat in the liver (steatosis) for reasons other than excessive alcohol consumption. NAFLD is the most common cause of elevated aminotransferases in patients presenting to hepatologists. NAFLD ranges from benign simple steatosis to the pathological condition in some patients, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), where necrosis/inflammation leads to progressive accumulation of fibrosis in the liver, eventually leading to cirrhosis, liver failure, hepatocellular carcinoma (HCC), transplant liver and liver failure. Both epidemiologically and pathophysiologically, NAFLD and NASH are strongly associated with obesity, metabolic syndrome, and type 2 diabetes. Thus, in parallel with the epidemics of obesity and type 2 diabetes, the prevalence of NAFLD and NASH has increased dramatically in recent decades, and NASH is becoming the leading cause of liver transplantation in the United States. Consequently, NASH is considered a growing global public health problem given that there is no optimal solution for diagnosis and there is no approved treatment for NASH.

Если NAFLD может быть диагностирована путем обнаружения накопления жира в печени с помощью ультразвуковых методик, то NASH и NASH-ассоциированный фиброз печени могут быть диагностированы только путем гистологического исследования биопсии печени. При микроскопическом исследовании биопсии печени NASH определяют по накоплению жирных кислот (липидных капель), ассоциированному с поврежденными гепатоцитами (баллонирование или некроз гепатоцитов) и признакам лобулярного воспаления. Хотя фиброз не является обязательным гистологическим признаком для диагностики NASH, наличие и стадия фиброза печени имеют решающее значение для оценки тяжести заболевания и риска развития цирроза, HCC (гепатоцеллюлярной карциномы) и отказа печени, который представляет собой связанную с печенью смерть пациента.While NAFLD can be diagnosed by detecting fat accumulation in the liver using ultrasound techniques, NASH and NASH-associated liver fibrosis can only be diagnosed by histological examination of a liver biopsy. On microscopic examination of liver biopsies, NASH is determined by accumulation of fatty acids (lipid droplets) associated with damaged hepatocytes (ballooning or necrosis of hepatocytes) and signs of lobular inflammation. Although fibrosis is not a mandatory histological feature for diagnosing NASH, the presence and stage of liver fibrosis are critical in assessing the severity of the disease and the risk of developing cirrhosis, HCC (hepatocellular carcinoma), and liver failure, which is a liver-related death of the patient.

Для оценки уровня активности NAFLD и стадии фиброза и оценки риска развития клинических исходов для печени были разработаны гистологические системы оценки/определения стадии. Шкала оценки активности NALFD (NAS) была разработана для оценки активности заболевания. NAS представляет собой сумму индивидуальных невзвешенных показателей биопсии по стеатозу (от 0 до 3), лобулярному воспалению (от 0 до 3), гепатоцеллюлярному баллонированию (от 0 до 2). Согласно Kleiner и соавт. (Hepatology, 2005; 41:1313-21), NAS представляет собой сумму трех гистологических показателей, полученных для срезов биопсии печени:Histological scoring/staging systems have been developed to assess NAFLD activity level and fibrosis staging and assess the risk of liver clinical outcomes. The NALFD Activity Score (NAS) was developed to assess disease activity. NAS is the sum of individual unweighted biopsy scores for steatosis (0 to 3), lobular inflammation (0 to 3), hepatocellular ballooning (0 to 2). According to Kleiner et al. (Hepatology, 2005; 41:1313-21), NAS is the sum of three histological scores obtained from liver biopsy sections:

S: балл по стеатозу: 0: <5%; 1: 5-33%; 2: 34-66% и 3: >66%,S: steatosis score: 0: <5%; 1: 5-33%; 2: 34-66% and 3: >66%,

LI: балл по лобулярному воспалению (фокус на поле 20x): 0: нет; 1: <2; 2: 2-4 и 3: >4,LI: Lobular inflammation score (field focus 20x): 0: no; 1: <2; 2: 2-4 and 3: >4,

HB: балл баллонирующей дистрофии: 0: нет; 1: мало; 2: много клеток/выраженное баллонирование.HB: ballooning dystrophy score: 0: none; 1: few; 2: many cells/pronounced ballooning.

При использовании этой системы пациент с NASH имеет NAS>3 и, по меньшей мере, 1 балл по стеатозу, по меньшей мере, 1 балл лобулярного воспаления и, по меньшей мере, 1 балл по баллонированию гепатоцитов. Пациент считается имеющим активный NASH, когда NAS>4, и он имеет, по меньшей мере, 1 балл стеатозу, по меньшей мере, 1 балл воспаления и, по меньшей мере, 1 балл по баллонированию гепатоцитов.Using this system, a patient with NASH has NAS>3 and at least 1 steatosis score, at least 1 lobular inflammation score, and at least 1 hepatocyte ballooning score. A patient is considered to have active NASH when NAS>4 and has at least 1 steatosis score, at least 1 inflammation score, and at least 1 hepatocyte ballooning score.

Локализация и степень фиброза при гистологическом исследовании указывает на тяжесть (прогресс) заболевания, и NASH-CRN разработала специальную систему стадирования фиброза (Kleiner и соавт., Hepatology, 2005; 41:1313-21):The location and extent of fibrosis on histological examination indicates the severity (progress) of the disease, and NASH-CRN has developed a specific fibrosis staging system (Kleiner et al., Hepatology, 2005; 41:1313-21):

Перисинусоидальный или перипортальный фиброз1Perisinusoidal or periportal fibrosis1

Легкий перисинусоидальный фиброз (зона 3)1аMild perisinusoidal fibrosis (zone 3)1a

Умеренный перисинусоидальный фиброз (зона 3)1bModerate perisinusoidal fibrosis (zone 3)1b

Портальный/перипортальный фиброз1сPortal/periportal fibrosis1c

Перисинусоидальный и портальный/перипортальный фиброз2Perisinusoidal and portal/periportal fibrosis2

Мостовидный фиброз3Bridge fibrosis3

Цирроз4Cirrhosis4

При использовании этой системы стадирования фиброза, пациенты с отсутствующим или минимальным фиброзом (F=0-1), как правило, не считаются имеющими риск развития цирроза, HCC или отказа печени. Пациенты со значительным (F=2) и умеренным фиброзом (F=3) имеют повышенный риск развития цирроза, печеночной недостаточности, HCC и отказа печени. Пациенты с компенсированным циррозом печени имеют тяжелый фиброз (F=4) и подвержены высокому риску печеночной недостаточ- 1 043299 ности (декомпенсированный цирроз), HCC и связанной с печенью смерти.When using this fibrosis staging system, patients with no or minimal fibrosis (F=0-1) are generally not considered at risk of developing cirrhosis, HCC, or liver failure. Patients with significant (F=2) and moderate fibrosis (F=3) have an increased risk of developing cirrhosis, liver failure, HCC, and liver failure. Patients with compensated liver cirrhosis have severe fibrosis (F=4) and are at high risk for liver failure (decompensated cirrhosis), HCC, and liver-related death.

В последнее время особое внимание уделяется индексу активности (AI), полученному на основе этих двух широко используемых систем оценки и стадирования, который может быть определен как сумма баллов лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов. Кроме того, Munteanu и соавт., Aliment Pharmacol Ther., 2016, 44(8):877-89 предложили признак SAF, чтобы отдельно выдавать баллы стеатоза, активности болезни и фиброза.Recently, there has been a focus on the activity index (AI) derived from these two widely used scoring and staging systems, which can be defined as the sum of the scores for lobular inflammation and hepatocyte ballooning. In addition, Munteanu et al., Aliment Pharmacol Ther., 2016, 44(8):877-89 proposed the SAF feature to separately provide steatosis, disease activity and fibrosis scores.

Диагностика NAFLD и NASH, а также оценка активности заболевания с использованием вышеупомянутых NAS, AI и стадирования фиброза печени требуют биопсии печени, которая имеет ряд очевидных недостатков, исключающих ее рутинное применение. Действительно, биопсия печени является инвазивной процедурой, которая может быть обременительной, беспокоящей и болезненной для пациента, и биопсия печени связана с риском кровоизлияний и даже смерти. Соответственно, вследствие нарастающей эпидемии NASH и фиброза печени, а также вследствие того, что биопсия не может рассматриваться как достаточно эффективная и безопасная процедура, существует острая необходимость в новых неинвазивных способах диагностики NAFLD, NASH и/или фиброза печени.Diagnosis of NAFLD and NASH, as well as evaluation of disease activity using the aforementioned NAS, AI, and liver fibrosis staging, require liver biopsy, which has a number of obvious disadvantages that preclude its routine use. Indeed, liver biopsy is an invasive procedure that can be burdensome, distressing, and painful for the patient, and liver biopsy is associated with a risk of hemorrhage and even death. Accordingly, due to the growing epidemic of NASH and liver fibrosis, and because biopsy cannot be considered as a sufficiently effective and safe procedure, there is an urgent need for new non-invasive methods for diagnosing NAFLD, NASH and/or liver fibrosis.

Для диагностики NAFLD были разработаны методики ультразвукового исследования и визуализации (ультразвуковая эхография, контролируемый параметр затухания, магнитно-резонансная визуализация (MRI) и измерение доли жира, взвешенной по протонной плотности, с помощью магнитнорезонансной визуализации (MRI-DPFF)). Однако эти методики ограничены вариабельностью как между наблюдателями, так и для одного и того же наблюдателя, стоимостью и/или занимают много времени. Кроме того, MRI-DPFF обычно является недоступным и слишком сложным для применения в клинической практике. Кроме того, стадия фиброза ассоциирована со смертностью по любой причине в зависимости от дозы, при этом повышенный риск проявляется у пациентов с фиброзом F2. Ультразвуковая эластография, такая как Фиброскан и эластография на сдвиговых волнах, имеет умеренную или высокую точность в диагностике прогрессирующего фиброза или цирроза. Однако фиброз F2 не является прогрессирующей стадией фиброза и, следовательно, не может быть точно обнаружен с помощью этих методик.Ultrasound and imaging techniques (ultrasound echography, controlled attenuation parameter, magnetic resonance imaging (MRI), and proton density-weighted fat fraction measurement using magnetic resonance imaging (MRI-DPFF)) have been developed for the diagnosis of NAFLD. However, these techniques are limited by both inter-observer and intra-observer variability, cost, and/or are time consuming. In addition, MRI-DPFF is usually unavailable and too complex for clinical use. In addition, fibrosis stage is associated with all-cause mortality in a dose-dependent manner, with an increased risk in patients with F2 fibrosis. Ultrasound elastography, such as Fibroscan and shear wave elastography, has moderate to high accuracy in the diagnosis of advanced fibrosis or cirrhosis. However, F2 fibrosis is not an advanced stage of fibrosis and therefore cannot be accurately detected using these techniques.

Помимо ультразвуковых и визуализационных методик, были предприняты интенсивные усилия для идентификации и проверки новых циркулирующих биомаркеров для надежного, простого и экономически эффективного неинвазивного выявления NAFLD, NASH и/или фиброза печени. В следующей таблице перечислены отдельные биомаркеры, которые были описаны как модулированные при NAFLD/NASH и/или фиброзе печени.__________________________________________________________________In addition to ultrasound and imaging techniques, intensive efforts have been made to identify and validate new circulating biomarkers for reliable, simple, and cost-effective non-invasive detection of NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis. The following table lists individual biomarkers that have been described as being modulated in NAFLD/NASH and/or liver fibrosis.__________________________________________________________________

Функция гепатоцитов Function of hepatocytes Жировая ткань fatty textile Метаболизм Metabolism Окислитель ный стресс/апопт 03 Oxidative stress/apopt 03 Фиброз Fibrosis Воспаление Inflammation ALT AST ALP GGT Г аптоглоби Η Альбумин Билирубин Количество тромбоцито в ALT AST ALP GGT Gaptoglobi Η Albumin Bilirubin Platelet count in Адипонектин Лептин Резистин Adiponectin Leptin resistin Глюкоза плазмы натощак Инсулин натощак Индекс НОМА Триглицери ДЫ Холестерин Л11ВП VLCL-C Аполипопр отеины (ApoAl, АроВ, АроСШ) Fasting Plasma Glucose Fasting Insulin HOMA Index Triglycerides DY Cholesterol L11VP VLCL-C Apolipoproteins (ApoAl, ApoB, ApoCSH) Малоновый диальдегид TBARS OxLDL СК18-М30 СК18-М65 Ферритин YKL-40 (CHI3L1) Malondialdehyde TBARS OxLDL CK18-M30 CK18-M65 Ferritin YKL-40 (CHI3L1) Фибронек тин Г иалурон овая кислота Коллаген типа IV PIIINP TIMP-1 Fibronec tin Hyaluronic Acid Type IV Collagen PIIINP TIMP-1 TNFa ILlb, IL6, IL8, IFNg, TGFb hs-CRP MCP1 sCD14 TNFa ILlb, IL6, IL8, IFNg, TGFb hs-CRP MCP1 sCD14

Некоторые исследования показали, что некоторые из этих сывороточных биомаркеров имели луч- 2 043299 шие диагностические значения, чем обычные сывороточные маркеры дисфункции печени, такие как трансаминазы (Naveau S. и соавт., Clin Gastroenterol Hepatol., 2005; 3 (2): 167-74; Castera L и соавт., J. Hepatol. 2000; 32: 412-8; Annoni G. и соавт. Hepatology. 1989; 9: 693-7; Nojgaard C. и соавт. J Hepatol. 2003; 39: 179-86; Chossegros P. 1995; 22 (2 Suppl): 96-9). Однако ни одно из этих исследований не позволило выявить и валидировать эффективный биомаркер для диагностики NAFLD, NASH и/или фиброза печени. В попытках улучшить диагностические характеристики, были получены многопараметрические оценки, объединяющие несколько биомаркеров и/или обычных переменных, но их диагностические характеристики для идентификации пациентов с NAFLD, NASH и/или фиброзом печени остаются в значительной степени ненадежными.Some studies have shown that some of these serum biomarkers had better diagnostic values than common serum markers of liver dysfunction, such as transaminases (Naveau S. et al., Clin Gastroenterol Hepatol., 2005; 3 (2): 167 -74 Castera L et al J Hepatol 2000 32: 412-8 Annoni G et Hepatology 1989 9 693-7 Nojgaard C et al J Hepatol 2003 39: 179-86; Chossegros P. 1995; 22 (2 Suppl): 96-9). However, none of these studies have identified and validated an effective biomarker for diagnosing NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis. In attempts to improve diagnostic performance, multivariate scores combining multiple biomarkers and/or common variables have been generated, but their diagnostic performance for identifying patients with NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis remains largely unreliable.

NASH ассоциируется с более быстрым прогрессированием фиброза, чем NAFLD, и в настоящее время является основной целью фармакологического лечения. У пациентов с NASH чаще развивается цирроз печени, и они умирают от сердечно-сосудистых и связанных с печенью причин, причем прогноз ухудшается по мере прогрессирования стадии фиброза (Ekstedt et al, 2015). Несмотря на большое количество сывороточных биомаркеров, комбинированных панелей и биомаркеров визуализации, которые были предложены, по-прежнему существует потребность в идентификации эффективных, менее инвазивных и более доступных способов диагностики и мониторинга NAFLD, NASH и фиброза печени, в частности, способов, подтвержденных независимой панелью клинической проверки.NASH is associated with faster progression of fibrosis than NAFLD and is currently the main target of pharmacological treatment. Patients with NASH are more likely to develop cirrhosis of the liver and die from cardiovascular and liver-related causes, with a worsening prognosis as the stage of fibrosis progresses (Ekstedt et al, 2015). Despite the large number of serum biomarkers, combination panels, and imaging biomarkers that have been proposed, there is still a need to identify effective, less invasive, and more affordable ways to diagnose and monitor NAFLD, NASH, and liver fibrosis, in particular, ways that have been validated by an independent panel. clinical check.

Выявление пациентов с риском развития HCC, цирротических осложнений и смерти, связанных с печенью, является основной причиной оценки состояния печени.Identification of patients at risk of developing HCC, cirrhotic complications, and liver-related death is the main reason for assessing the state of the liver.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Авторы настоящего изобретения провели несколько очень точных и полных анализов различных групп пациентов в целях предоставления новых и высокочувствительных неинвазивных способов диагностики и мониторинга неалкогольной жировой дистрофии печени (NAFLD), неалкогольного стеатогепатита (NASH) и фиброза печени. Представленные в настоящем описании данные демонстрируют, что miR-193 является эффективным циркулирующим биомаркером, связанным с NAFLD, NASH и/или фиброзом печени. Этот биомаркер был валидирован в трех независимых клинических когортах. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют диагностировать, контролировать и классифицировать риск для субъекта, страдающего NAFLD, NASH и/или фиброзом печени. Авторы настоящего изобретения также предоставляют способ диагностики, мониторинга и классификации риска субъектов, потенциально страдающих NAFLD, NASH и/или фиброзом печени. Способы по настоящему изобретению могут также способствовать разработке новых терапевтических способов лечения.The inventors of the present invention conducted several very accurate and complete analyzes of various patient groups in order to provide new and highly sensitive non-invasive methods for diagnosing and monitoring non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and liver fibrosis. The data presented herein demonstrate that miR-193 is an effective circulating biomarker associated with NAFLD, NASH and/or liver fibrosis. This biomarker has been validated in three independent clinical cohorts. Thus, the methods of the present invention allow for the diagnosis, monitoring and classification of risk for a subject suffering from NAFLD, NASH and/or hepatic fibrosis. The authors of the present invention also provide a method for diagnosing, monitoring and classifying the risk of subjects potentially suffering from NAFLD, NASH and/or liver fibrosis. The methods of the present invention may also contribute to the development of new therapeutic treatments.

Соответственно, изобретение предоставляет способ диагностики NAFLD, NASH или фиброза печени у субъекта, включающий в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.Accordingly, the invention provides a method for diagnosing NAFLD, NASH, or hepatic fibrosis in a subject, comprising determining the level of miR-193 in a body fluid sample of said subject.

Эти способы основаны на определении уровня miR-193 в биологической жидкости субъекта. Во всех представленных в настоящем описании способах и вариантах осуществления микроРНК miR-193, внедренная в настоящем изобретении, может представлять собой микроРНК hsa-miR-193, такую как hsamiR-193, выбранную из группы, состоящей из hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p и hsamiR-193b-3p. В конкретном варианте осуществления определяют уровень hsa-miR-193b-3p. Во всех представленных в настоящем описании способах и вариантах осуществления образец биологической жидкости может представлять собой образец крови, жидкости, полученной из крови (такой как сыворотка и плазма, в частности плазма, не содержащая тромбоцитов, например, образец бесклеточной плазмы, не содержащей тромбоцитов, полученной с использованием цитрата), образец слюны, спинномозговой жидкости или мочи. В конкретном варианте осуществления биологическая жидкость представляет собой плазму или сыворотку без тромбоцитов или с тромбоцитами.These methods are based on determining the level of miR-193 in the biological fluid of the subject. In all of the methods and embodiments provided herein, miR-193 microRNA implemented in the present invention may be hsa-miR-193 miRNA, such as hsamiR-193, selected from the group consisting of hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p and hsamiR-193b-3p. In a specific embodiment, determine the level of hsa-miR-193b-3p. In all of the methods and embodiments provided herein, the body fluid sample may be a blood sample, a fluid derived from blood (such as serum and plasma, in particular platelet-free plasma, such as platelet-free cell-free plasma obtained from using citrate), a saliva, cerebrospinal fluid or urine sample. In a specific embodiment, the biological fluid is plasma or serum without or with platelets.

В способах по настоящему изобретению уровень miR-193 в биологической жидкости субъекта могут сравнивать с контрольным уровнем miR-193. Контрольный уровень обозначает заранее определенный стандарт или уровень, определенный экспериментально в образце, обработанном аналогичным образом, от контрольного субъекта. В зависимости от цели способа по настоящему изобретению контрольный субъект может являться здоровым субъектом, субъектом, имеющим NAFLD, но не имеющим NASH, субъектом, имеющим NASH, но не имеющим активного NASH, или субъектом, у которого фиброз печени отсутствует или минимален. Контрольным субъектом также может являться пациент, получавший плацебо. Контрольным уровнем также может являться уровень miR-193, определенный в аналогично обработанном образце биологической жидкости, полученном в прошлом от того же субъекта, что позволяет определять эволюцию NAFLD, NASH или фиброза печени у субъекта, в частности, позволяет определить эволюцию активности заболевания или фиброза, или эффективность лечения заболевания, в зависимости от реализуемого способа.In the methods of the present invention, the level of miR-193 in a subject's body fluid can be compared to a control level of miR-193. Control level refers to a predetermined standard or level determined experimentally in a similarly treated sample from a control subject. Depending on the purpose of the method of the present invention, the control subject may be a healthy subject, a subject with NAFLD but no NASH, a subject with NASH but no active NASH, or a subject with no or minimal hepatic fibrosis. The control subject can also be a patient receiving a placebo. The control level can also be the level of miR-193 determined in a similarly treated biological fluid sample obtained in the past from the same subject, which allows you to determine the evolution of NAFLD, NASH or liver fibrosis in the subject, in particular, allows you to determine the evolution of disease activity or fibrosis, or the effectiveness of the treatment of the disease, depending on the implemented method.

Соответственно, в конкретном варианте осуществления диагностика и/или обнаружение NAFLD или диагностика и/или обнаружение потенциальной NAFLD у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у здоровых людей без стеатоза печени.Accordingly, in a specific embodiment, the diagnosis and/or detection of NAFLD, or the diagnosis and/or detection of potential NAFLD in a subject, is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in healthy individuals without hepatic steatosis.

В конкретном варианте осуществления диагностика и/или обнаружение NASH, или диагностикаIn a specific embodiment, diagnosing and/or detecting NASH, or diagnosing

- 3 043299 и/или обнаружение потенциального NASH у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта без NASH, такого как здоровый субъект, субъект с NAS<3 или субъект по меньшей мере с одним компонентом NAS, имеющим оценку 0.- 3 043299 and/or detection of potential NASH in a subject is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a biological fluid sample relative to a control level measured in a subject without NASH, such as a healthy subject, a subject with NAS<3, or a subject with at least one NAS component with a score of 0.

В другом варианте осуществления диагностика и/или обнаружение активного NASH, или диагностика и/или обнаружение потенциально активного NASH у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у здорового субъекта, субъекта с NAS<4 или субъекта по меньшей мере с одним компонентом NAS, имеющим оценку 0. В конкретном варианте осуществления для диагностики и обнаружения активного NASH или потенциально активного NASH контрольный уровень представляет собой уровень miR193, измеренный у субъекта с NAS=3, 1 баллом по стеатозу, 1 баллом по лобулярному воспалению и 1 баллом по баллонированию гепатоцитов.In another embodiment, the diagnosis and/or detection of active NASH, or the diagnosis and/or detection of potentially active NASH in a subject, is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a healthy subject, a subject with NAS<4, or a subject with at least one NAS component having a score of 0. In a specific embodiment, for diagnosing and detecting active NASH or potentially active NASH, the reference level is the miR193 level measured in a subject with NAS=3, steatosis score 1, lobular inflammation and 1 point for hepatocyte ballooning.

В дополнительном варианте осуществления диагностика и выявление фиброза печени (F>1) или потенциального фиброза печени (F>1) у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у здорового субъекта без фиброза печени (F=0).In a further embodiment, the diagnosis and detection of liver fibrosis (F>1) or potential liver fibrosis (F>1) in a subject is based on the detection of elevated levels of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a healthy subject without liver fibrosis (F =0).

В другом варианте осуществления диагностика и выявление значительного (F=2), умеренного (F=3) или тяжелого (F=4; то есть цирроза) фиброза печени или потенциального значительного фиброза печени, потенциального умеренного фиброза печени или потенциального тяжелого фиброза печени у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта без (F=0) или с минимальным (F=1) фиброзом печени.In another embodiment, diagnosing and identifying significant (F=2), moderate (F=3), or severe (F=4; i.e., cirrhosis) hepatic fibrosis or potential significant hepatic fibrosis, potential moderate hepatic fibrosis, or potential severe hepatic fibrosis in a subject are based on the detection of elevated levels of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a subject with no (F=0) or minimal (F=1) hepatic fibrosis.

В другом варианте осуществления диагностика и выявление значительного (F=2), умеренного (F=3) или тяжелого (F=4) фиброза печени, или потенциального значительного фиброза печени, потенциального умеренного фиброза печени или потенциального тяжелого фиброза печени у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта с минимальным фиброзом печени (F=1). В другом конкретном варианте осуществления контрольный уровень измеряют у субъекта с F=1a, 1b или 1c.In another embodiment, the diagnosis and detection of significant (F=2), moderate (F=3), or severe (F=4) liver fibrosis, or potential significant liver fibrosis, potential moderate liver fibrosis, or potential severe liver fibrosis in a subject is based on the detection of an elevated miR-193 level in a body fluid sample relative to a control level measured in a subject with minimal hepatic fibrosis (F=1). In another specific embodiment, the control level is measured in a subject with F=1a, 1b or 1c.

В другом варианте осуществления диагностика и выявление значительного фиброза печени или потенциального значительного фиброза печени у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта с минимальным фиброзом.In another embodiment, the diagnosis and detection of significant liver fibrosis or potential significant liver fibrosis in a subject is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a subject with minimal fibrosis.

В другом варианте осуществления диагностика и выявление умеренного фиброза печени или потенциального умеренного фиброза печени у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта со значительным фиброзом.In another embodiment, the diagnosis and detection of moderate hepatic fibrosis or potential moderate hepatic fibrosis in a subject is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a subject with significant fibrosis.

В другом варианте осуществления диагностика и выявление тяжелого фиброза или потенциального тяжелого фиброза у субъекта основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта с умеренным фиброзом.In another embodiment, the diagnosis and detection of severe fibrosis or potential severe fibrosis in a subject is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in a subject with moderate fibrosis.

Согласно еще одной цели, изобретение относится к способу классификации субъекта как потенциально получающего (подлежащего лечению, или TBT) или не получающего (не подлежащего лечению, или NTBT) лечение NAFLD, NASH или фиброза печени, на основании обнаружения повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня miR-193, измеренного у пациентов NTBT, как определено ниже.According to another object, the invention relates to a method for classifying a subject as potentially receiving (to be treated, or TBT) or not receiving (not to be treated, or NTBT) treatment for NAFLD, NASH, or liver fibrosis, based on the detection of elevated levels of miR-193 in a sample. biological fluid relative to miR-193 control level measured in NTBT patients, as defined below.

В дополнительном варианте осуществления изобретение также предоставляет способ определения уровня активности NAFLD, уровня активности NASH и/или стадии фиброза печени у субъекта на основании определения уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта.In a further embodiment, the invention also provides a method for determining the level of NAFLD activity, the level of NASH activity, and/or the stage of liver fibrosis in a subject based on determining the level of miR-193 in a subject's body fluid sample.

В другом аспекте изобретение также позволяет клинически прогнозировать фиброз, а именно, прогнозировать фактор риска развития фиброза печени в цирроз и другие исходы для печени (такие как HCC и связанные с печенью смерти) пациента с NAFLD или NASH, на основании уровня miR-193, определенного в образце биологической жидкости субъекта.In another aspect, the invention also allows clinical prediction of fibrosis, namely, prediction of the risk factor for liver fibrosis to cirrhosis and other liver outcomes (such as HCC and liver-related death) of a patient with NAFLD or NASH, based on the miR-193 level determined in a sample of the subject's body fluid.

Изобретение также предоставляет способ для мониторинга эволюции уровня активности NAFLD, уровня активности NASH и/или стадии фиброза печени у субъекта на основе эволюции уровня MIR-193 в образце биологической жидкости субъекта относительно контрольного уровня miR-193 в одном или более образцов биологической жидкости, собранных у того же самого субъекта в прошлом. В этом способе повышение уровня miR-193 указывает на то, что активность заболевания и фиброз возрастают, тогда как снижение уровня miR193 указывает на то, что активность заболевания и фиброз снижаются.The invention also provides a method for monitoring the evolution of the level of NAFLD activity, the level of NASH activity, and/or the stage of liver fibrosis in a subject based on the evolution of the level of MIR-193 in a body fluid sample of the subject relative to a control level of miR-193 in one or more body fluid samples collected from the same subject in the past. In this method, an increase in miR-193 indicates that disease activity and fibrosis are increasing, while a decrease in miR193 indicates that disease activity and fibrosis are decreasing.

Изобретение, кроме того, предоставляет способ определения эффективности лечения NAFLD, NASH или фиброза печени у субъекта на основе эволюции уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта относительно контрольного уровня miR-193 в одном или более образцах биологической жидкости, собранных у того же самого субъекта в прошлом. В этом способе повышение уровня miR-193 или стабильный уровень miR-193 указывает на то, что лечение является неэффективным, тогдаThe invention further provides a method for determining the efficacy of treating NAFLD, NASH, or liver fibrosis in a subject based on the evolution of miR-193 level in a subject's body fluid sample relative to a miR-193 control level in one or more body fluid samples collected from the same subject. in past. In this method, an increase in miR-193 or a stable level of miR-193 indicates that the treatment is ineffective, then

- 4 043299 как снижение уровня miR-193 указывает на то, что лечение является эффективным. В другом варианте осуществления этого способа стабильный уровень miR-193 может также указывать на то, что лечение является эффективным в отношении стабилизации состояния NASH, NAFLD или фиброза печени у субъекта, посредством чего снижается риск развития у субъекта таких критических исходов, как цирроз печени, HCC или связанная с печенью смерть.- 4 043299 as a decrease in the level of miR-193 indicates that the treatment is effective. In another embodiment of this method, a stable miR-193 level may also indicate that the treatment is effective in stabilizing the subject's NASH, NAFLD, or liver fibrosis, thereby reducing the subject's risk of developing critical outcomes such as cirrhosis, HCC. or liver-related death.

Изобретение, кроме того, предоставляет способ прогнозирования ответа субъекта (например, прогнозирования изменений NAFLD, активности NASH и стадии фиброза печени) на конкретное лечение (субъект-респондер) на основе обнаружения дифференциального уровня miR-193 в образце биологической жидкости относительно контрольного уровня, измеренного у субъекта, не отвечающего на лечение.The invention further provides a method for predicting a subject's response (e.g., predicting changes in NAFLD, NASH activity, and liver fibrosis stage) to a particular treatment (responder subject) based on the detection of a differential level of miR-193 in a body fluid sample relative to a control level measured in subject not responding to treatment.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ диагностики NAFLD, NASH или фиброза печени, или потенциального NAFLD, NASH или фиброза печени, или идентификации субъекта с риском прогрессирования до клинических исходов от NAFLD, NASH или фиброза печени (например, цирроз печени, цирротические осложнения и/или смерти, связанные с печенью), при этом способ включает в себя определение уровня miR-193 и, по меньшей мере, одного маркера, выбранного из группы, состоящей из YKL-40 (CHI3L1), тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP)-1), количества тромбоцитов, гиалуроновой кислоты (HYUA2) и гликированного гемоглобина (HbA1c). В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя определение статуса метаболического синдрома (ms) пациента. В конкретном варианте осуществления способ включает в себя определение уровня miR-193 и YKL-40. В дополнительном конкретном варианте осуществления этого аспекта способ включает в себя:In another aspect, the present invention provides a method for diagnosing NAFLD, NASH, or hepatic fibrosis, or potential NAFLD, NASH, or hepatic fibrosis, or identifying a subject at risk of progressing to clinical outcomes from NAFLD, NASH, or hepatic fibrosis (e.g., hepatic cirrhosis, cirrhotic complications, and/ or liver-related death), the method comprising determining the level of miR-193 and at least one marker selected from the group consisting of YKL-40 (CHI3L1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP)-1 ), platelet count, hyaluronic acid (HYUA2) and glycated hemoglobin (HbA1c). In a specific embodiment, the method further includes determining the metabolic syndrome (ms) status of the patient. In a specific embodiment, the method includes determining the level of miR-193 and YKL-40. In a further specific embodiment of this aspect, the method includes:

(i) определение уровня miR-193, такого как количество hsa-miR-193a-5p, hsa-miR193a-3p, hsa-miR193b-5p или hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости от субъекта;(i) determining the level of miR-193, such as the amount of hsa-miR-193a-5p, hsa-miR193a-3p, hsa-miR193b-5p or hsa-miR-193b-3p in a body fluid sample from the subject;

(ii) анализ:(ii) analysis:

количества YKL-40 (CHI3L1), тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP-1), количества тромбоцитов, гиалуроновой кислоты (HYUA2) и гликированного гемоглобина HbA1c; или анализ количества YKL-40 (CHI3L1), тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP-1), количества тромбоцитов в образце биологической жидкости от субъекта и определение наличия у субъекта метаболического синдрома (ms);amounts of YKL-40 (CHI3L1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), platelets, hyaluronic acid (HYUA2), and glycated hemoglobin HbA1c; or analysis of the amount of YKL-40 (CHI3L1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), the number of platelets in a sample of biological fluid from the subject and determining whether the subject has metabolic syndrome (ms);

(iii) определение балла для субъекта на основании результатов, полученных на этапах (i) и (ii); и (iv) сравнение балла с пороговым значением для определения риска прогрессирования NASH у субъекта. В иллюстративном варианте осуществления количество каждого из miR-193b-3p, YKL-40, TIMP-1 и количества тромбоцитов, а также определение ms анализируют в способе. В другом иллюстративном варианте осуществления количество каждого из miR-193b-3p, YKL-40, TIMP-1, HYUA2, HbA1c и количества тромбоцитов анализируют в способе, и пороговые значения определяют с помощью уровней микроРНК по Cq или log10 копий.мкл-1 в образце крови.(iii) determining a score for the subject based on the results obtained in steps (i) and (ii); and (iv) comparing the score to a threshold value to determine the subject's risk of NASH progression. In an exemplary embodiment, the amount of each of miR-193b-3p, YKL-40, TIMP-1, and platelet counts, as well as the determination of ms, are analyzed in the method. In another exemplary embodiment, miR-193b-3p, YKL-40, TIMP-1, HYUA2, HbA1c, and platelet counts are each assayed in the method, and thresholds are determined using miRNA levels by Cq or log10 copies.µl-1 in blood sample.

В другом варианте осуществления способ включает в себя определение уровня miR-193, YKL-40, TIMP-1, количества тромбоцитов, гиалуроновой кислоты (HYUA2) и гликированного гемоглобина HbA1c. В другом варианте осуществления способ включает в себя определение уровня miR-193, YKL-40, TIMP-1, количества тромбоцитов и гиалуроновой кислоты (HYUA2) и определение статуса метаболического синдрома у пациента. В любом из вариантов осуществления этого аспекта предпочтительный вариант включает в себя определение уровня hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p или hsamiR-193b-3p, в частности, hsa-miR-193b-3p.In another embodiment, the method includes determining the level of miR-193, YKL-40, TIMP-1, platelet count, hyaluronic acid (HYUA2), and glycated hemoglobin HbA1c. In another embodiment, the method includes determining miR-193, YKL-40, TIMP-1, platelet and hyaluronic acid (HYUA2) levels and determining the metabolic syndrome status of the patient. In any of the embodiments of this aspect, the preferred option includes determining the level of hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p or hsamiR-193b-3p, in particular, hsa-miR -193b-3p.

Описание чертежейDescription of drawings

Фиг. 1. Сывороточный уровень hsa-miR-193b-3p у пациентов, не подлежащих лечению (NTBT), и у пациентов, подлежащих лечению (TBT) GOLDEN-DIAG при включении в соответствии с тремя различными определениями пациентов TBT: TBT1, TBT2 и TBT7, и у здоровых субъектов (n=100). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическая значимость была рассчитана с применением критерия ANOVA Крускала-Уоллиса с последующим применением критерия множественного сравнения Данна:***, p-значение <0,001. NTBT1 n=83, TBT1 n=187; NTBT2 n=161, TBT2 n=109, NTBT7 n=119, TBT7 n=151Fig. 1. Serum level of hsa-miR-193b-3p in non-treatable patients (NTBT) and in patients eligible for treatment (TBT) GOLDEN-DIAG at inclusion according to three different definitions of TBT patients: TBT1, TBT2 and TBT7. and in healthy subjects (n=100). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Kruskal-Wallis ANOVA test followed by Dunn's multiple comparison test:***, p-value<0.001. NTBT1 n=83, TBT1 n=187; NTBT2 n=161, TBT2 n=109, NTBT7 n=119, TBT7 n=151

TBT1=балл для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1, NAS>4, F>1,TBT1=score for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1, NAS>4, F>1,

TBT2=балл для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1,NAS>4, F>2,TBT2=score for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1, NAS>4, F>2,

TBT7=балл для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1, NAS>4, F=1b, 1c, 2, 3 или 4.TBT7=score for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1, NAS>4, F=1b, 1c, 2, 3, or 4.

Фиг. 2. Сывороточный уровень hsa-miR-193b-5p у пациентов NTBT и TBT GOLDEN-DIAG при включении в соответствии с тремя различными определениями пациентов TBT: TBT1, TBT2 и TBT7. Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия Манна-Уитни: ***, p-значение <0,001.Fig. 2. Serum level of hsa-miR-193b-5p in NTBT and TBT GOLDEN-DIAG patients at inclusion according to three different definitions of TBT patients: TBT1, TBT2 and TBT7. Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney test: ***, p-value <0.001.

TBT1=баллы для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1 каждый, NAS>4, F>1TBT1=scores for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1 each, NAS>4, F>1

TBT2=баллы для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1 каждый,TBT2=scores for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1 each,

- 5 043299- 5 043299

NAS>4, F>2NAS>4, F>2

TBT7= баллы для стеатоза, лобулярного воспаления и баллонирования гепатоцитов >1 каждый,TBT7= scores for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning >1 each,

NAS>4, F=1b, 1c, 2, 3 или 4.NAS>4, F=1b, 1c, 2, 3 or 4.

Фиг. 3. Сывороточный уровень hsa-miR-19 3a-5p у пациентов NTBT и TBT GOLDEN-DIAG при включении в соответствии с тремя различными определениями пациентов TBT: TBT1, TBT2 и TBT7. Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия Манна-Уитни: ***, p-значение <0,001.Fig. 3. Serum level of hsa-miR-19 3a-5p in NTBT and TBT GOLDEN-DIAG patients at inclusion according to three different definitions of TBT patients: TBT1, TBT2 and TBT7. Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney test: ***, p-value <0.001.

Фиг. 4. Сывороточный уровень hsa-miR-193b-3p у здоровых доноров крови, у пациентов NTBT2 и TBT2 (слева), у пациентов с NAS<4 и NAS>4 (в середине) и у пациентов с F<2 и F>2 (справа) GOLDENDIAG при включении (вверху) и когорты OBESE (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия Крускала-Уоллиса ANOVA и последующим применением критерия множественного сравнения Данна (Golden Diag) и критерия МаннаУитни: ***, p-значение <0,001.Fig. Fig. 4. Serum level of hsa-miR-193b-3p in healthy blood donors, in NTBT2 and TBT2 patients (left), in patients with NAS<4 and NAS>4 (in the middle) and in patients with F<2 and F>2 (right) GOLDENDIAG at inclusion (top) and OBESE cohort (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Kruskal-Wallis ANOVA test followed by Dunn's multiple comparison test (Golden Diag) and Mann-Whitney's test: ***, p-value <0.001.

(Ожирение)(Obesity)

Фиг. 5. Сывороточный уровень hsa-miR-193a-5p у пациентов NTBT2 и TBT2 (слева), у пациентов с NAS<4 и NAS>4 (в центре) и у пациентов с F<2 и F>2 (справа) в когортах GOLDEN-DIAG при включении (вверху) и OBESE (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия Манна-Уитни: ***, p-значение <0,001.Fig. Fig. 5. Serum level of hsa-miR-193a-5p in NTBT2 and TBT2 patients (left), in patients with NAS<4 and NAS>4 (center) and in patients with F<2 and F>2 (right) in cohorts GOLDEN-DIAG when turned on (top) and OBESE (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney test: ***, p-value <0.001.

Фиг. 6. Сывороточный уровень hsa-miR-193b-5p у пациентов NTBT2 и TBT2 (слева), у пациентов с NAS<4 и NAS>4 (в центре) и у пациентов с F<2 и F>2 (справа) в когортах GOLDEN-DIAG при включении (вверху) и OBESE (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическая значимость была рассчитана с применением критерия не Манна-Уитни: ***, p-значение <0,001.Fig. Fig. 6. Serum level of hsa-miR-193b-5p in NTBT2 and TBT2 patients (left), in patients with NAS<4 and NAS>4 (center) and in patients with F<2 and F>2 (right) in cohorts GOLDEN-DIAG when turned on (top) and OBESE (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the non-Mann-Whitney test: ***, p-value <0.001.

Фиг. 7. Сывороточные уровни hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-193b-5p и hsa-miR-193a-5p у пациентов NTBT2 и TBT2 (слева), у пациентов с NAS<4 и NAS>4 (в центре) и у пациентов с F<2 и F>2 (справа) исследования RESOLVE-IT. Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическая значимость была рассчитана с применением критерия не Манна-Уитни: ** p-значение <0,005; ***, p-значение <0,001.Fig. 7. Serum levels of hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-193b-5p and hsa-miR-193a-5p in NTBT2 and TBT2 patients (left), in patients with NAS<4 and NAS>4 (center) and in patients with F<2 and F>2 (right) of the RESOLVE-IT study. Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the non-Mann-Whitney test: ** p-value <0.005; ***, p-value <0.001.

Фиг. 8. Корреляция между сывороточными уровнями hsa-miR-193b-3p с NAS, стадией фиброза, индексом активности, баллом стеатоза, баллом баллонирования гепатоцитов, баллом лобулярного воспаления у пациентов когорты GOLDEN-DIAG (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия ANOVA Крускала-Уоллиса с последующим применением критерия множественного сравнения Данна: *, p-значение <0,05; ** p-значение <0,005; ***, p-значение <0,001.Fig. 8. Correlation between serum levels of hsa-miR-193b-3p with NAS, fibrosis stage, activity index, steatosis score, hepatocyte ballooning score, lobular inflammation score in GOLDEN-DIAG cohort patients (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Kruskal-Wallis ANOVA test followed by Dunn's multiple comparison test: *, p-value <0.05; ** p-value <0.005; ***, p-value <0.001.

Фиг. 9. Корреляция между уровнями hsa-miR-193b-5p в сыворотке крови с NAS, стадией фиброза, индексом активности, баллом стеатоза, баллом баллонирования гепатоцитов, баллом лобулярного воспаления у пациентов когорты GOLDEN-DIAG (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия ANOVA Крускала-Уоллиса с последующим применением критерия множественного сравнения Данна: *, p-значение <0,05; ** p-значение <0,005; ***, p-значение <0,001.Fig. 9. Correlation between serum levels of hsa-miR-193b-5p with NAS, fibrosis stage, activity index, steatosis score, hepatocyte ballooning score, lobular inflammation score in GOLDEN-DIAG cohort patients (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Kruskal-Wallis ANOVA test followed by Dunn's multiple comparison test: *, p-value <0.05; ** p-value <0.005; ***, p-value <0.001.

Фиг. 10. Корреляция между уровнями hsa-miR-193a-5p в сыворотке крови с NAS, стадией фиброза, индексом активности, баллом стеатоза, баллом баллонирования гепатоцитов, баллом лобулярного воспаления у пациентов из группы GOLDEN-DIAG (внизу). Результаты выражены как Среднее±SEM. Статистическую значимость рассчитывали с применением критерия ANOVA Крускала-Уоллиса с последующим применением критерия множественного сравнения Данна: *, p-значение <0,05; ** p-значение <0,005; ***, p-значение <0,001.Fig. 10. Correlation between serum levels of hsa-miR-193a-5p with NAS, fibrosis stage, activity index, steatosis score, hepatocyte ballooning score, lobular inflammation score in GOLDEN-DIAG patients (bottom). Results are expressed as Mean±SEM. Statistical significance was calculated using the Kruskal-Wallis ANOVA test followed by Dunn's multiple comparison test: *, p-value <0.05; ** p-value <0.005; ***, p-value <0.001.

Фиг. 11. Анализ кривой соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) алгоритма Y1 с hsa-miR-193b-3p (log10 копий.мкл-1), TIMP-1, YKL-40, количеством тромбоцитов и метаболическим синдромом. Сравнение площади под кривой (AUC) между этим алгоритмом (NIS) и отдельными переменными в исследовании GOLDEN-DIAG при включении.Fig. Fig. 11. True/false detection (ROC) curve analysis of Y1 algorithm with hsa-miR-193b-3p (log10 copies.µl-1), TIMP-1, YKL-40, platelet count, and metabolic syndrome. Comparison of area under the curve (AUC) between this algorithm (NIS) and individual variables in the GOLDEN-DIAG study at inclusion.

Фиг. 12. Анализ кривой соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) алгоритма Y2 с hsa-miR-193b-3p (log10 копий.мкл-1), YKL-40, TIMP-1, HbA1c, HYUA2 и количеством тромбоцитов.Fig. Fig. 12. True/false detection (ROC) curve analysis of Y2 algorithm with hsa-miR-193b-3p (log10 copies.µl-1), YKL-40, TIMP-1, HbA1c, HYUA2 and platelet count.

Фиг. 13. Анализ кривой соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) алгоритма Y3 с hsa-miR-193b-3p (Cq), YKL-40, TIMP-1, HbA1c, HYUA2 и количеством тромбоцитов.Fig. Fig. 13. True/false detection (ROC) curve analysis of Y3 algorithm with hsa-miR-193b-3p (Cq), YKL-40, TIMP-1, HbA1c, HYUA2 and platelet count.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Авторы настоящего изобретения предоставляют новый способ диагностики, мониторинга и классификации риска субъектов, страдающих или потенциально страдающих NAFLD, NASH и/или фиброзом печени.The authors of the present invention provide a new method for diagnosing, monitoring and classifying the risk of subjects suffering from or potentially suffering from NAFLD, NASH and/or liver fibrosis.

Настоящее изобретение основано на очень точном анализе биопсий пациентов во время клинического испытания в целях сопоставления наличия или уровня циркулирующих биологических маркеров и классификации пациентов как подлежащих лечению или не подлежащих лечению. В частности, изобретение также предоставляет оценку NAS, как описано ниже. В частности, настоящее изобретение неогра- 6 043299 ничивающим образом определяет три класса пациентов с NASH, подлежащих лечению. Этих пациентов классифицируют в отношении оценки характеристик NASH.The present invention is based on the very precise analysis of patient biopsies during a clinical trial in order to correlate the presence or level of circulating biological markers and classify patients as treatable or non-treatable. In particular, the invention also provides NAS estimation as described below. In particular, the present invention defines in a non-limiting manner three classes of NASH patients to be treated. These patients are classified in relation to the assessment of NASH characteristics.

Представленные в настоящем описании экспериментальные данные, неожиданно, идентифицируют miR-193 в качестве циркулирующего биомаркера для NAFLD, NASH и/или фиброза печени в двух больших независимых когортах пациентов, а именно, GOLDEN-DIAG (N=270 при включении; N=223 на 52 неделе) и когорте OBESE (N=253) с оцененными биопсиями печени и соответствующими образцами крови, плазмы и сыворотки. Результаты были подтверждены в третьей независимой когорте RESOLVEIT (N=263).Experimental data presented herein surprisingly identifies miR-193 as a circulating biomarker for NAFLD, NASH and/or liver fibrosis in two large independent patient cohorts, namely GOLDEN-DIAG (N=270 at inclusion; N=223 at 52 weeks) and the OBESE cohort (N=253) with assessed liver biopsies and corresponding blood, plasma and serum samples. The results were confirmed in the third independent RESOLVEIT cohort (N=263).

Изобретение теперь будет представлено более подробно.The invention will now be presented in more detail.

ОпределенияDefinitions

Согласно настоящему изобретению термины NAFLD или неалкогольная жировая дистрофия печени относятся к состоянию, при котором жир откладывается в печени (стеатоз печени), с признаками воспаления и фиброза или без них, в отсутствие чрезмерного потребления алкоголя.According to the present invention, the terms NAFLD or non-alcoholic fatty liver refers to a condition in which fat is deposited in the liver (hepatic steatosis), with or without signs of inflammation and fibrosis, in the absence of excessive alcohol consumption.

Согласно изобретению термины уровень активности NAFLD относятся к прогрессированию NAFLD и определяются по повышению балла стеатоза, как определено в настоящем описании. Уровень активности NAFLD также относится к прогрессированию NAFLD в направлении NASH или фиброза и тяжести NASH.According to the invention, the terms NAFLD activity level refer to the progression of NAFLD and are defined by an increase in steatosis score as defined herein. The level of NAFLD activity also refers to the progression of NAFLD towards NASH or fibrosis and severity of NASH.

Согласно изобретению термин стеатоз относится к процессу, описывающему аномальное удержание липидов или накопление жира в печени.According to the invention, the term steatosis refers to a process describing abnormal lipid retention or accumulation of fat in the liver.

Согласно изобретению, термин NASH или неалкогольный стеатогепатит относится к состоянию NAFLD, характеризующемуся сопутствующим наличием стеатоза печени, баллонирования гепатоцитов и воспаления печени при гистологическом исследовании (то есть, NAS>3, по меньшей мере, с 1 баллом по стеатозу, по меньшей мере, 1 баллом по лобулярному воспалению и, по меньшей мере, 1 баллом по баллонированию гепатоцитов) при отсутствии чрезмерного употребления алкоголя и после исключения других заболеваний печени, таких как вирусный гепатит (HCV, HBV).According to the invention, the term NASH or non-alcoholic steatohepatitis refers to a NAFLD condition characterized by the concomitant presence of hepatic steatosis, hepatocyte ballooning, and liver inflammation on histological examination (i.e., NAS>3 with at least 1 steatosis score of at least 1 lobular inflammation score and at least 1 hepatocyte ballooning score) in the absence of excessive alcohol consumption and after exclusion of other liver diseases such as viral hepatitis (HCV, HBV).

Согласно изобретению, термины уровень активности NASH относятся к прогрессированию NASH и определяются по повышению балла NAS выше минимальных параметров для определения NASH, которые представляют собой S=1, LI=1 и HB=1. Уровень активности NASH также относится к прогрессированию NASH в направлении необратимого NASH и/или фиброза и тяжести NASH.According to the invention, the terms NASH activity level refer to the progression of NASH and are defined as an increase in the NAS score above the minimum parameters for determining NASH, which are S=1, LI=1 and HB=1. The level of NASH activity also refers to the progression of NASH towards irreversible NASH and/or fibrosis and the severity of NASH.

Согласно изобретению, термин активный NASH относится к NASH, характеризующемуся NAS>4, по меньшей мере, 1 баллом по стеатозу, по меньшей мере, 1 баллом по лобулярному воспалению, и, по меньшей мере, 1 баллом по баллонированию гепатоцитов.According to the invention, the term active NASH refers to a NASH characterized by a NAS>4, at least 1 on steatosis, at least 1 on lobular inflammation, and at least 1 on hepatocyte ballooning.

В соответствии с настоящим изобретением термин гепатоцеллюлярное баллонирование обычно определяют на уровне светового микроскопа на основе окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е) как увеличение клеток в 1,5-2 раза от нормального диаметра гепатоцитов, с разреженной цитоплазмой. В более общем смысле термин относится к процессу гибели клеток гепатоцитов.In accordance with the present invention, the term hepatocellular ballooning is usually defined at the level of a light microscope based on hematoxylin and eosin (H&E) staining as an increase in cells 1.5-2 times the normal diameter of hepatocytes, with sparse cytoplasm. In a more general sense, the term refers to the process of cell death of hepatocytes.

Согласно настоящему изобретению термин лобулярное воспаление относится к наличию очагов лобулярного воспаления (сгруппированных воспалительных клеток) при микроскопическом исследовании окрашенного гематоксилином и эозином (Н&Е) среза биопсии печени.According to the present invention, the term lobular inflammation refers to the presence of foci of lobular inflammation (aggregated inflammatory cells) on microscopic examination of a hematoxylin and eosin (H&E) stained liver biopsy section.

В соответствии с настоящим изобретением балл активности NAFLD или NAS относится к сумме баллов стеатоза, гепатоцеллюлярного баллонирования, лобулярного воспаления следующим образом:According to the present invention, the NAFLD or NAS activity score refers to the sum of the steatosis, hepatocellular ballooning, lobular inflammation scores as follows:

S: балл по стеатозу: 0: <5%; 1: 5-33%; 2: 34-66% и 3:>66%;S: steatosis score: 0: <5%; 1: 5-33%; 2: 34-66% and 3:>66%;

LI: балл по лобулярному воспалению (очаги/поле x20): 0: нет; 1: <2; 2: 2-4 и 3:>4;LI: score for lobular inflammation (lesions/field x20): 0: no; 1: <2; 2:2-4 and 3:>4;

HB: балл дегенерации вследствие баллонирования: 0: нет; 1: мало; 2: много.HB: ballooning degeneration score: 0: none; 1: few; 2: a lot.

Согласно настоящему изобретению индекс активности относится к сумме баллов гепатоцеллюлярного баллонирования и лобулярного воспаления.According to the present invention, the activity index refers to the sum of the scores of hepatocellular ballooning and lobular inflammation.

Согласно настоящему изобретению термин фиброз или фиброз печени относится к наличию фиброзной соединительной ткани при микроскопическом исследовании окрашенной (Н&Е, окрашивание трихромом или пикросириусом красным) биопсии печени.According to the present invention, the term fibrosis or fibrosis of the liver refers to the presence of fibrous connective tissue on microscopic examination of a stained (H&E, trichrome or picrosirius red stain) liver biopsy.

В контексте настоящего изобретения термин стадия фиброза обозначает локализацию и степень фиброза при гистологическом исследовании следующим образом:In the context of the present invention, the term fibrosis stage refers to the location and degree of fibrosis on histological examination as follows:

Перисинусоидальный или перипортальный фиброз,Perisinusoidal or periportal fibrosis,

Легкий перисинусоидальный фиброз (зона 3),Mild perisinusoidal fibrosis (zone 3),

Умеренный перисинусоидальный фиброз (зона 3),Moderate perisinusoidal fibrosis (zone 3),

Портальный/перипортальный фиброз,Portal / periportal fibrosis,

Перисинусоидальный и портальный/перипортальный фиброз,Perisinusoidal and portal/periportal fibrosis,

Мостовидный фиброз,bridging fibrosis,

Цирроз.Cirrhosis.

Альтернативно, стадия фиброза может быть определена следующим образом в контексте настоящего изобретения:Alternatively, the stage of fibrosis can be defined as follows in the context of the present invention:

F=0: нет фиброза,F=0: no fibrosis,

- 7 043299- 7 043299

F=1: минимальный фиброз,F=1: minimal fibrosis,

F=2: значительный фиброз,F=2: significant fibrosis,

F=3: умеренный фиброз,F=3: moderate fibrosis,

F=4: тяжелый фиброз (то есть, цирроз).F=4: severe fibrosis (ie, cirrhosis).

Согласно настоящему изобретению подлежащий лечению субъект или субъект TBT представляет собой субъекта, у которого оценка активности заболевания (например, NAS или индекс активности) и/или стадия фиброза печени делают субъекта пригодным для лечения NAFLD, NASH и/или фиброза печени. В противоположность этому не подлежащий лечению субъект, или субъект NTBT, является субъектом, у которого показатель активности заболевания (например, NAS или индекс активности) и/или стадия фиброза печени являются недостаточно высокими для того, чтобы сделать его пригодным для лечения NAFLD, NASH и/или фиброза печени. Следовательно, субъекта TBT также называют получателем или потенциальным получателем лечения NAFLD, NASH и/или фиброза печени. В настоящем изобретении предпочтительными субъектами TBT являются:According to the present invention, a subject to be treated or a TBT subject is a subject whose disease activity score (e.g., NAS or Activity Index) and/or stage of liver fibrosis makes the subject eligible for the treatment of NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis. In contrast, a non-treatable subject, or NTBT subject, is a subject whose disease activity score (e.g., NAS or activity index) and/or liver fibrosis stage is not high enough to make it suitable for the treatment of NAFLD, NASH, and / or liver fibrosis. Therefore, a TBT subject is also referred to as a recipient or potential recipient of treatment for NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis. In the present invention, the preferred TBT subjects are:

i) субъекты с NASH, ii) субъекты с активным NASH, iii) субъекты со значительным, умеренным или тяжелым фиброзом печени, iv) субъекты с NASH и фиброзом.i) subjects with NASH, ii) subjects with active NASH, iii) subjects with significant, moderate or severe liver fibrosis, iv) subjects with NASH and fibrosis.

Определение охватывает различные баллы активности NASH и стадии фиброза, определяющие различные варианты изобретения.The definition encompasses various NASH activity scores and fibrosis stages defining various embodiments of the invention.

Предпочтительные варианты изобретения детализируются следующим образом.Preferred embodiments of the invention are detailed as follows.

Первый вариант TBT (TBT2).The first version of TBT (TBT2).

Субъект TBT2 определяется как субъект, имеющий следующие оценки, полученные при биопсии печени:A TBT2 subject is defined as a subject having the following liver biopsy scores:

S>1,S>1,

HB>1,HB>1,

LI>1,LI>1,

NAS (балл активности NAFLD) >4, стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3).NAS (NAFLD activity score) >4, fibrosis stage >2 (such as fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).

Таким образом, субъект с NTBT2 отличается от субъекта с TBT2 более низкой оценкой, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза. Для ясности, субъектом NTBT2 может являться, например, субъект с NASH, имеющий NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и стадию фиброза 1 (такую как стадия фиброза 1a, 1b или 1c) или NAS, равный 3, и стадию фиброза >2 (например, стадия фиброза, равная 2, 3 или 4), или любую другую комбинация баллов, как определено выше.Thus, a subject with NTBT2 differs from a subject with TBT2 by at least one lower score on steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or fibrosis stage. For clarity, an NTBT2 subject may be, for example, a subject with NASH having NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 and fibrosis stage 1 (such as fibrosis stage 1a, 1b or 1c) or NAS equal to 3 , and fibrosis stage >2 (eg, fibrosis stage equal to 2, 3, or 4), or any other combination of scores as defined above.

Второй вариант TBT (TBT1).The second variant of TBT (TBT1).

Субъект TBT1 определяется как субъект, имеющий следующие оценки, полученные при биопсии печени:A TBT1 subject is defined as a subject having the following liver biopsy scores:

балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1,

NAS (балл активности NAFLD) >4, стадия фиброза >1 (например, стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).NAS (NAFLD Activity Score) >4, fibrosis stage >1 (eg, fibrosis stage 1, 2, 3, or 4).

Аналогично, субъект NTBT1 отличается от субъекта TBT1 более низкой оценкой, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза. Для ясности, субъектом NTBT1 может являться, например, субъект с NASH, имеющий NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и стадию фиброза 0, или NAS, равный 3, и стадию фиброза > 1 (например, стадия фиброза, равная 1a, 1b или 1c, 2, 3 или 4), или любую другую комбинацию баллов, как определено выше.Similarly, an NTBT1 subject differs from a TBT1 subject by having at least one lower score for steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or fibrosis stage. For clarity, an NTBT1 subject may be, for example, a subject with NASH having NAS=4, S>1, LI>1, HB>1, and fibrosis stage 0, or NAS equal to 3 and fibrosis stage >1 (e.g., stage fibrosis equal to 1a, 1b or 1c, 2, 3 or 4), or any other combination of scores as defined above.

Третий вариант TBT (TBT7).The third variant of TBT (TBT7).

Субъект TBT7 определяется как субъект, демонстрирующий следующие оценки биопсии печени:A TBT7 subject is defined as a subject demonstrating the following liver biopsy scores:

балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1,

NAS (балл активности NAFLD) >4, стадия фиброза=1b, 1c, 2, 3 или 4.NAS (NAFLD activity score) >4, fibrosis stage=1b, 1c, 2, 3, or 4.

Таким образом, субъект NTBT7 отличается от субъекта TBT7 более низкой оценкой, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза. Для ясности, субъектом NTBT7 может являться, например, субъект с NASH, имеющий NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и стадию фиброза, равную 0 или 1a, или NAS, равный 3, и стадию фиброза, равную 1b, 1c, 2, 3 или 4, или любую другую комбинацию баллов, как определено выше.Thus, an NTBT7 subject differs from a TBT7 subject in having at least one lower score on steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or fibrosis stage. For clarity, an NTBT7 subject may be, for example, a subject with NASH having NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 and a fibrosis stage of 0 or 1a, or a NAS of 3 and a fibrosis stage of 1b, 1c, 2, 3 or 4, or any other combination of scores as defined above.

- 8 043299- 8 043299

В конкретном варианте осуществления микроРНК miR-193, используемую в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p и hsa-miR193b-3p, последовательности которых доступны в базе данных miRBase (http://mirbase.org), соответственно, под кодами доступа miRBase MIMAT0000459, MIMAT0004614, MIMAT004767 и MIMAT0002819, соответственно.In a specific embodiment, the miR-193 microRNA used in the present invention is selected from the group consisting of hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p and hsa-miR193b-3p, the sequences of which are available in the miRBase database (http://mirbase.org), respectively, under miRBase access codes MIMAT0000459, MIMAT0004614, MIMAT004767, and MIMAT0002819, respectively.

В другом варианте осуществления микроРНК miR-193, используемая в настоящем изобретении, представляет собой форму шпильки miR-193, такую как микроРНК miR-193, выбранная из группы, состоящей из hsa-miR-193a, также называемой HGNC:MIR193A, и hsa-miR-193b, последовательности которых доступны в базе данных miRBase (http://mirbase.org), соответственно, под кодами доступа miRBase miRBase=MI0000487 и MI0003137.In another embodiment, miR-193 miRNA used in the present invention is a miR-193 hairpin form, such as miR-193 miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-193a, also referred to as HGNC:MIR193A, and hsa- miR-193b, the sequences of which are available in the miRBase database (http://mirbase.org), respectively, under miRBase access codes miRBase=MI0000487 and MI0003137.

В конкретном варианте осуществления микроРНК miR-193, используемая в настоящем изобретении, представляет собой hsa-miR-193b-3p.In a specific embodiment, the miR-193 miRNA used in the present invention is hsa-miR-193b-3p.

Образцы и подготовка образцовSamples and sample preparation

Согласно настоящему изобретению, термин образец биологической жидкости обозначает любой образец биологической жидкости, полученный от субъекта, такой как кровь и жидкости, полученные из крови (такие как плазма и сыворотка), лимфатическая жидкость, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча, слюна, слизистые, слизь и мокрота. В конкретном варианте осуществления биологическую жидкость выбирают из крови и жидкостей, полученных из крови (таких как плазма и сыворотка), слюны, спинномозговой жидкости и мочи. В конкретном варианте осуществления образец биологической жидкости представляет собой кровь или полученную из крови жидкость (такую как плазма и сыворотка), слюну, спинномозговую жидкость или мочу. В еще одном конкретном варианте осуществления биологическая жидкость представляет собой кровь, плазму или сыворотку. Образец биологической жидкости может быть взят любым подходящим способом. Подходящими биологическими жидкостями могут являться бесклеточные жидкости. Такие бесклеточные биологические жидкости обычно получают путем обработки содержащей клетки биологической жидкости посредством, например, центрифугирования или фильтрации для удаления клеток. Как правило, бесклеточная биологическая жидкость не содержит интактных клеток, однако, некоторые жидкости могут содержать клеточные фрагменты или клеточный дебрис. Образец биологической жидкости может использоваться немедленно или может храниться для последующего использования. Любой подходящий способ хранения, известный в данной области техники, можно использовать для хранения образца биологической жидкости: например, образец может быть заморожен при температуре от -20 до -80°C.According to the present invention, the term body fluid sample means any body fluid sample obtained from a subject, such as blood and blood-derived fluids (such as plasma and serum), lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine, saliva, mucous membranes, mucus and phlegm. In a particular embodiment, the biological fluid is selected from blood and fluids derived from blood (such as plasma and serum), saliva, cerebrospinal fluid, and urine. In a particular embodiment, the body fluid sample is blood or a blood-derived fluid (such as plasma and serum), saliva, cerebrospinal fluid, or urine. In yet another specific embodiment, the biological fluid is blood, plasma or serum. The biological fluid sample may be taken by any suitable means. Suitable biological fluids may be cell-free fluids. Such cell-free biological fluids are typically obtained by treating the cell-containing biological fluid by, for example, centrifugation or filtration to remove cells. As a rule, a cell-free biological fluid does not contain intact cells, however, some fluids may contain cell fragments or cellular debris. The body fluid sample may be used immediately or may be stored for later use. Any suitable storage method known in the art can be used to store the biological fluid sample: for example, the sample can be frozen at -20 to -80°C.

Выделение и количественное определение микроРНКIsolation and quantification of miRNAs

Тотальная РНК, включая микроРНК, может быть выделена из образца различными методами экстракции, которые включают: фенол:хлороформную экстракцию с последующим осаждением спиртом (TRIzol), фенол:хлороформную экстракцию с последующей твердофазной экстракцией (на колонках; например, miRVana и miRNeasy) и твердофазное разделение с/без магнитными частицами аффинной смолы (Norgen total и Isolate II) или методы прямого лизиса. При применении на практике настоящего изобретения микроРНК экстрагировали с помощью набора для экстракции miRVana Paris для последующего анализа количественной OT-ПЦР(RTqPCR) или захватывали с помощью специальных зондов для дальнейшего анализа HTG Edge Sequence.Total RNA, including miRNA, can be isolated from a sample by various extraction methods, which include: phenol:chloroform extraction followed by alcohol precipitation (TRIzol), phenol:chloroform extraction followed by solid phase extraction (on columns; e.g. miRVana and miRNeasy) and solid phase separation with/without magnetic affinity resin particles (Norgen total and Isolate II) or direct lysis methods. In the practice of the present invention, microRNAs were extracted using the miRVana Paris extraction kit for subsequent quantitative RT-PCR (RTqPCR) analysis or captured using special probes for further HTG Edge Sequence analysis.

Затем микроРНК детектируют в клинических образцах с применением любой методики, доступной специалистам в данной области технкии, такой как методы на основе секвенирования, на основе амплификации или на основе гибридизации. Общие подходы к клиническому тестированию микроРНК включают секвенирование коротких РНК (Hafner et al, 2012; Vigneault et al, 2012), HTG Edge Whole Transcriptome, платформа профилирования микроРНК на основе секвенирования следующего поколения (Lizarraga et al, 2016; Satake и соавт., 2018), количественная ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией микроРНК (qRT-PCR) (Chen и соавт., 2005), микрочип микроРНК (Castoldi и соавт., 2007), мультиплексное обнаружение микроРНК с помощью пар зондов с цветовой кодировкой (экспрессионная система NanoString n Counter) (Geiss и соавт., 2008), капельная цифровая ПЦР (ddPCR) после обратной транскрипции (Miotto и соавт., 2014) и in situ гибридизация микроРНК (Nelson и соавт., 2006). Уровень miR193 может быть определен с помощью общепринятых методологий, хорошо известных в данной области техники, таких как иммунные анализы (например, ELISA) или молекулярно-биологические анализы (количественная OT-ПЦР или секвенирование следующего поколения) или биохимические анализы (колориметрические или другие анализы). В конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроРНК детектируют с помощью анализов полных транскриптомов HTG Edge или секвенирования HTG Edge и количественной OT-ПЦР.The miRNAs are then detected in clinical samples using any technique available to those skilled in the art, such as sequencing-based, amplification-based, or hybridization-based methods. Common approaches to clinical testing of miRNAs include short RNA sequencing (Hafner et al, 2012; Vigneault et al, 2012), HTG Edge Whole Transcriptome, a next-generation sequencing-based miRNA profiling platform (Lizarraga et al, 2016; Satake et al, 2018 ), quantitative real-time miRNA reverse transcription PCR (qRT-PCR) (Chen et al., 2005), miRNA microarray (Castoldi et al., 2007), multiplex microRNA detection using color-coded probe pairs (NanoString expression system n Counter) (Geiss et al., 2008), spot digital PCR (ddPCR) after reverse transcription (Miotto et al., 2014), and in situ microRNA hybridization (Nelson et al., 2006). The level of miR193 can be determined using conventional methodologies well known in the art such as immunoassays (e.g. ELISA) or molecular biology assays (quantitative OT-PCR or next generation sequencing) or biochemical assays (colorimetric or other assays) . In a specific embodiment of the method of the present invention, miRNAs are detected using HTG Edge whole transcriptome assays or HTG Edge sequencing and quantitative OT-PCR.

При практическом применении настоящего изобретения любой из вышеописанных способов может дополнительно включать в себя нормализацию уровня miR-193 в образце биологической жидкости от субъекта по уровню или микроРНК, уровень которой не изменяется у субъектов с NAFLD, NASH и/или фиброзом печени относительно здоровых пациентов. В целях сокращения потенциального источника технической изменчивости, перед экстракцией РНК в образец можно добавить добавочную или экзогенную синтетическую микроРНК с известной последовательностью и количеством, такую как miR-39 C.In the practice of the present invention, any of the methods described above may further include normalizing the level of miR-193 in a body fluid sample from a subject to a level or microRNA level that does not change in subjects with NAFLD, NASH and/or liver fibrosis relative to healthy patients. In order to reduce a potential source of technical variability, an additional or exogenous synthetic microRNA of known sequence and quantity, such as miR-39C, can be added to the sample prior to RNA extraction.

- 9 043299 elegans. Добавочная или экзогенная синтетическая микроРНК может представлять собой микроРНК, которая не экспрессируется в образцах человека, например, cel-miR-38 Caenorhabditis elegans или ath-miR159a Arabidopsis thaliana. Эти синтетические микроРНК могут быть добавлены после добавления лизирующего буфера в образцы крови перед экстракцией РНК и обеспечивают контроль процесса в отношении технической нормализации. Таким образом, эффективность экстракции РНК, синтеза комплементарной ДНК и ПЦР-амплификации можно контролировать с использованием этих экзогенных синтетических микроРНК.- 9 043299 elegans. The additive or exogenous synthetic miRNA may be a miRNA that is not expressed in human samples, such as cel-miR-38 Caenorhabditis elegans or ath-miR159a Arabidopsis thaliana. These synthetic microRNAs can be added after the addition of lysis buffer to blood samples prior to RNA extraction and provide process control with respect to technical normalization. Thus, the efficiency of RNA extraction, complementary DNA synthesis and PCR amplification can be controlled using these exogenous synthetic miRNAs.

Нормализатор микроРНК или малые некодирующие РНК-контроли для нормализации данных количественной ПЦР, представляющие собой эндогенные контроли, на которые воздействуют те же источники изменчивости, что и на гены-мишени, на всех этапах процесса эксперимента, могут использоваться для нормализации уровня целевой микроРНК, miR-193.A microRNA normalizer or small non-coding RNA controls for normalizing quantitative PCR data, which are endogenous controls exposed to the same sources of variability as target genes at all stages of the experimental process, can be used to normalize the level of target miRNA, miR- 193.

Предоставлен стандартный протокол для измерения miR-193 с помощью количественной OT-ПЦР. Кратко, измерения проводят для тотальной РНК, выделенной из образца биологической жидкости, такого как образец крови, плазмы или сыворотки, в частности, образца бесклеточный плазмы, не содержащий тромбоцитов, полученной с использованием цитрата. Соответствующий внутренний контроль (такой как микроРНК с известной последовательностью и количеством, например, miR-39 C. elegans) может быть добавлен к образцу перед экстракцией РНК. Значения Cq определяют с использованием количественной OT-ПЦР. Коммерческие наборы доступны для проведения таких анализов. Например, анализ Taqman miRNA RT-qPCR: набор для обратной транскрипции Taqman MicroRNA, анализ TaqMan MicroRNA 20X и TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) могут использоваться в соответствии с инструкциями производителя. Обратная транскрипция может быть выполнена с использованием легкодоступных систем ПЦР, таких как термоциклер GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), с соответствующими параметрами циклирования, такими как 16°C в течение 30 минут, затем 42°C в течение 30 минут и 85°C в течение 5 минут и последующей выдержкой при 4°C. Обратная транскрипция может быть реализована в мультиплексированном формате. Затем проводят количественную ПЦР с применением системы количественной ПЦР, такой как система в реальном времени CFX96TM (C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad). Предпочтительно, количественную ПЦР проводят с применением системы ПЦР-детекции в реальном времени CFX96 - C1000 - сертифицированной диагностики in vitro (IVD), Bio-Rad. Условия циклирования могут быть следующими: 95°C в течение 10 минут, затем 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 60 с в общей сложности 50 циклов, а затем 30°C в течение 30 с. Режимом определения Cq может быть, например, режим регрессии в системе количественной ПЦР. В конкретном варианте осуществления значение Cq, определенное в соответствии со способом изобретения, представляет собой значение Cq, которое можно получить с использованием вышеуказанных конкретных параметров и материала. Значения Cq образцов могут быть исключены из анализа, если значения превышают максимальный Cq стандартной кривой каждой микроРНК. Стандартная кривая может быть использована для оценки эффективности реакции ПЦР. Последовательные разведения могут быть выполнены в восьми точках, начиная с наиболее концентрированного образца кДНК, чтобы гарантировать, что стандартная кривая охватывает все потенциальные концентрации матрицы, которые могут встретиться во время исследования. Стандартная кривая может быть построена путем построения логарифма начального количества матрицы относительно полученных значений Cq. Для получения абсолютных количественных данных синтетические микроРНК (например, производства Integrated DNA Technologies, 5'-фосфат, З'ОН, очищенная ВЭЖХ), разведенные, например, в 3,125 фмоль/мл и 5 мкл, могут быть использованы для обратной транскрипции одновременно с РНК, экстрагированной из образцов сыворотки. Затем продукт можно последовательно разводить и проводить ПЦР для всех образцов (стандартов и РНК, полученных из сыворотки). Стандартная кривая может быть построена однократно, двукратно или трехкратно и использована для преобразования данных Cq в копии/мкл жидкости.A standard protocol for measuring miR-193 by quantitative OT-PCR is provided. Briefly, measurements are made on total RNA isolated from a biological fluid sample, such as a blood, plasma or serum sample, in particular a platelet-free cell-free plasma sample obtained using citrate. An appropriate internal control (such as miRNA of known sequence and quantity, eg C. elegans miR-39) can be added to the sample prior to RNA extraction. Cq values are determined using quantitative OT-PCR. Commercial kits are available for such assays. For example, the Taqman miRNA RT-qPCR assay: Taqman MicroRNA reverse transcription kit, TaqMan MicroRNA 20X assay, and TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) can be used according to the manufacturer's instructions. Reverse transcription can be performed using readily available PCR systems such as the GeneAmp® PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems) with appropriate cycling settings such as 16°C for 30 minutes followed by 42°C for 30 minutes and 85° C for 5 minutes and subsequent holding at 4°C. Reverse transcription may be implemented in a multiplexed format. Quantitative PCR is then carried out using a quantitative PCR system such as the CFX96TM real-time system (C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad). Preferably, quantitative PCR is carried out using Bio-Rad's CFX96-C1000 Certified In Vitro Diagnostic (IVD) Real Time PCR Detection System. Cycling conditions can be as follows: 95°C for 10 minutes, then 95°C for 15 s and 60°C for 60 s for a total of 50 cycles, followed by 30°C for 30 s. The Cq determination mode may be, for example, the regression mode in a quantitative PCR system. In a specific embodiment, the Cq value determined in accordance with the method of the invention is the Cq value that can be obtained using the above specific parameters and material. The Cq values of the samples may be excluded from the analysis if the values exceed the maximum Cq of the standard curve of each miRNA. The standard curve can be used to evaluate the performance of the PCR reaction. Serial dilutions can be made at eight points, starting with the most concentrated cDNA sample, to ensure that the standard curve covers all potential template concentrations that may be encountered during the assay. The standard curve can be constructed by plotting the logarithm of the initial amount of the matrix with respect to the obtained Cq values. For absolute quantitation, synthetic miRNAs (e.g. from Integrated DNA Technologies, 5'-phosphate, 3'OH, HPLC purified) diluted to e.g. 3.125 fmol/ml and 5 µl can be used for reverse transcription simultaneously with RNA extracted from serum samples. The product can then be serially diluted and PCR performed on all samples (standards and serum-derived RNA). The standard curve can be drawn once, twice, or three times and used to convert Cq data to copies/µl of fluid.

Альтернативно, для оценки уровня miR-193 можно использовать метод дельта Ct (порог цикла) или дельта Cq (количественное определение цикла). Дельта Ct или дельта Cq соответствует разности между Ct или Cq мишени в тестируемом образце пациента и Ct или Cq мишени в контрольном образце (то есть, здоровые субъекты, контрольный образец).Alternatively, delta Ct (cycle threshold) or delta Cq (cycle quantification) can be used to assess miR-193 levels. Delta Ct or delta Cq corresponds to the difference between the Ct or Cq of the target in the patient test sample and the Ct or Cq of the target in the control sample (ie, healthy subjects, control sample).

Альтернативно, уровень miR-193 может быть определен с помощью количественной OT-ПЦР с использованием реакции обратной транскрипции (RT) шпилек вместе с TaqMan qPCR или с ОТ с поли(А)хвостом вместе с детектированием SYBR Green и праймеров закрытой нуклеиновой кислоты (LNA).Alternatively, miR-193 levels can be determined by quantitative RT-PCR using a hairpin reverse transcription (RT) reaction along with TaqMan qPCR or poly(A) tail RT along with detection of SYBR Green and closed nucleic acid (LNA) primers .

Способы по изобретениюMethods of the invention

Во всех приведенных ниже аспектах, вариантах осуществления и вариантах предпочтительный вариант осуществления относится к определению уровня hsa-miR-193 в образце крови, сыворотки или плазмы. Предпочтительный вариант этого аспекта относится к определению уровня hsa-miR-193b-3p.In all of the following aspects, embodiments, and embodiments, the preferred embodiment relates to determining the level of hsa-miR-193 in a blood, serum, or plasma sample. A preferred embodiment of this aspect relates to determining the level of hsa-miR-193b-3p.

Настоящее изобретение относится к способу диагностики или обнаружения NAFLD у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. Настоящее изобретение относится к способу диагностики или обнаружения потенциальной NAFLD у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления NAFLD или потенциальную NAFLD обнару- 10 043299 живают на основании повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости от субъекта относительно контрольного уровня, измеренного в образце от субъекта без стеатоза печени. В дополнительном конкретном варианте осуществления диагностика или обнаружение NAFLD или потенциальной NAFLD основана на обнаружении повышенного уровня miR-193 в образце биологической жидкости по сравнению с уровнями, обычно измеряемыми у здоровых людей без стеатоза печени. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя этап подтверждения того, что субъект страдает NAFLD. Такое подтверждение может быть осуществлено в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области техники, таким как взятие биопсии печени или методики ультразвукового исследования или визуализации (такие как ультразвуковое исследование, измерение параметра контролируемого затухания с помощью транзиентной эластографии (Fibroscan), магнитнорезонансная визуализация (MRI), измерение доли жира, взвешенной по протонной плотности, с помощью магнитно-резонансной визуализации (MRI-DPFF), и измерение доли жира, взвешенной по протонной плотности, с помощью магнитно-резонансной спектроскопии (MRS-DPFF)). Альтернативно, стеатоз печени могут оценивать по нескольким показателям и баллам, включая, без ограничения:The present invention relates to a method for diagnosing or detecting NAFLD in a subject, including determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. The present invention relates to a method for diagnosing or detecting potential NAFLD in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. In a specific embodiment, NAFLD or potential NAFLD is detected based on an elevated level of miR-193 in a body fluid sample from a subject relative to a control level measured in a sample from a subject without hepatic steatosis. In a further specific embodiment, the diagnosis or detection of NAFLD or potential NAFLD is based on the detection of elevated levels of miR-193 in a body fluid sample compared to levels normally measured in healthy individuals without hepatic steatosis. In a specific embodiment, the method further includes the step of confirming that the subject is suffering from NAFLD. Such confirmation can be carried out in accordance with any method known to those skilled in the art, such as taking a liver biopsy or ultrasound or imaging techniques (such as ultrasound, measurement of the controlled attenuation parameter using transient elastography (Fibroscan), magnetic resonance imaging ( MRI), Proton Density Weighted Fat Fraction Measurement by Magnetic Resonance Imaging (MRI-DPFF), and Proton Density Weighted Fat Fraction Measurement by Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS-DPFF)). Alternatively, hepatic steatosis can be assessed by several indicators and scores, including, without limitation:

жировой индекс печени (FLI), который включает ИМТ, окружность талии и уровни триглицеридов и гамма-глутарилтрансферазы (GGT) в сыворотке, индекс стеатоза печени (HIS), который включает отношение аспартатаминотрансферазы (AST) к аланинаминотрансферазе (ALT) в сыворотке, ИМТ, пол и наличие сахарного диабета, балл жировой ткани NAFLD (метаболический синдром, диабет 2 типа, сывороточный инсулин натощак и AST, соотношение AST :ALT), стеатотест (альфа 2 макроглобулин (A2M), гаптоглобин, аполипопротеин A1, общий билирубин, GGT, уровень глюкозы в крови натощак и поправка на возраст, пол, вес и рост), и балл по шкале NAFLD (ALT, холестерин, триглицериды, гликированный гемоглобин A1c (HbA1 и количество лейкоцитов) и данные о сопутствующей патологии (гипертония)).liver fat index (FLI), which includes BMI, waist circumference and serum triglyceride and gamma-glutaryltransferase (GGT) levels, liver steatosis index (HIS), which includes the ratio of aspartate aminotransferase (AST) to alanine aminotransferase (ALT) in serum, BMI, gender and presence of diabetes, NAFLD (metabolic syndrome, type 2 diabetes, fasting serum insulin and AST, AST:ALT ratio), steatotest (alpha 2 macroglobulin (A2M), haptoglobin, apolipoprotein A1, total bilirubin, GGT, fasting blood glucose and adjusted for age, sex, weight, and height), and NAFLD score (ALT, cholesterol, triglycerides, glycated hemoglobin A1c (HbA1 and WBC count) and data on comorbidities (hypertension)).

В конкретном варианте осуществления по генетическим и геномным маркерам могут оценивать риск и тяжесть NAFLD (однонуклеотидные полиморфизмы (SNP):rs738409 (SNP в PNPLA3), бесклеточные некодирующие РНК, miR-122, составная панель полученных из сыворотки омиксных данных).In a specific embodiment, genetic and genomic markers can assess the risk and severity of NAFLD (single nucleotide polymorphisms (SNPs): rs738409 (SNPs in PNPLA3), cell-free non-coding RNAs, miR-122, a composite panel of serum-derived omics data).

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или обнаружения NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или обнаружения потенциального NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления диагностика или обнаружение NASH или потенциального NASH основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в биологической жидкости от субъекта относительно контрольного уровня miR-193, измеренного у здорового субъекта, у субъекта с NAS<3 или у субъекта по меньшей мере с одним компонентом NAS, оцененным как 0. В конкретном варианте осуществления контрольный образец берут у субъекта с NAS<3, по меньшей мере, с одним компонентом NAS, оцененным как 0, такого как субъект со следующими баллами: S=1, LI=1 и HB=0; S=1, LI=0 и HB=1; S=0, LI=1 и HB=1. В конкретном варианте осуществления диагностика или обнаружение NASH или потенциального NASH основаны на обнаружении повышенного уровня экспрессии hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p и hsa-miR-193b-5p в крови, сыворотке или плазме крови относительно контрольных уровней, измеренных у субъектов без NASH, включая здоровых субъектов, субъектов с NAS<3 или субъектов по меньшей мере с одним компонентом NAS, оцененным как 0. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя этап подтверждения того, что субъект страдает NASH. Такое подтверждение может быть выполнено в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области техники, таким как проведение биопсии печени или визуализация биомаркеров, измеренных посредством методик визуализации, таких как методики на основе MRI, MRI с использованием гадоксетической кислоты, MRI с суперпарамагнитным оксидом железа, внутриклеточный уровень АТФ с использованием 32P-MRS и MRE. Альтернативно, несколько индексов и баллов могут оценивать потенциальные биомаркеры NASH, включая, без ограничений:The present invention also relates to a method for diagnosing or detecting NASH in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. The present invention also relates to a method for diagnosing or detecting potential NASH in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. In a specific embodiment, the diagnosis or detection of NASH or potential NASH is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid from a subject relative to a control level of miR-193 measured in a healthy subject, in a subject with NAS<3, or in a subject with at least one NAS component scored as 0. In a specific embodiment, a control sample is taken from a subject with NAS<3 with at least one NAS component scored as 0, such as a subject with the following scores: S=1, LI=1, and HB =0; S=1, LI=0 and HB=1; S=0, LI=1 and HB=1. In a specific embodiment, the diagnosis or detection of NASH or potential NASH is based on the detection of elevated levels of hsa-miR-193 expression, in particular hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p and hsa-miR-193b-5p in blood, serum, or plasma relative to control levels measured in subjects without NASH, including healthy subjects, subjects with NAS<3, or subjects with at least one NAS component scored as 0. In a particular embodiment, carrying out the method further includes the step of confirming that the subject suffers from NASH. Such confirmation can be performed according to any method known to those skilled in the art, such as taking a liver biopsy or imaging biomarkers measured by imaging techniques such as MRI-based techniques, gadoxetic acid MRI, superparamagnetic iron oxide MRI. , intracellular ATP level using 32P-MRS and MRE. Alternatively, several indices and scores can evaluate potential NASH biomarkers, including, without limitation:

маркеры апоптоза (фрагмент CK18, общий цитокератин, сывороточный уровень апоптозопосредующего поверхностного антигена FAS), маркеры воспаления (C-реактивный белок (CRP), TNF, IL-8, хемокиновый лиганд CXC 10 (CXCL10)), продукты окисления липидов (11-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (HETE), 9гидроксидекадиеновая кислота (HODE), 13-HODE, 13-оксооктадекадиеновая кислота (ODE), LA-13HODE (балл OxNASH), 11,12-дигидрокси)-эйкозатриеновая кислота (diHETrE)), адипоцитокины и гормоны (адипонектин, лептин, резистин, висфатин, связывающий ретинол белок (RBP) 4, связывающий жирные кислоты (FABP) белок 4, фактор роста фибробластов (FGF21)), лизосомальные ферменты (катепсин D) и комбинированные панели (тест NASH, диагностическая панель NASH).apoptosis markers (CK18 fragment, total cytokeratin, serum level of apoptosis-mediated FAS surface antigen), inflammatory markers (C-reactive protein (CRP), TNF, IL-8, chemokine ligand CXC 10 (CXCL10)), lipid oxidation products (11-hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), 9hydroxydecadienoic acid (HODE), 13-HODE, 13-oxooctadecadienoic acid (ODE), LA-13HODE (OxNASH score), 11,12-dihydroxy)-eicosatrienoic acid (diHETrE)), adipocytokines and hormones (adiponectin , leptin, resistin, visfatin, retinol binding protein (RBP) 4, fatty acid binding protein (FABP) 4, fibroblast growth factor (FGF21)), lysosomal enzymes (cathepsin D), and combination panels (NASH test, NASH diagnostic panel).

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или обнаружения активного NASHThe present invention also relates to a method for diagnosing or detecting active NASH

- 11 043299 у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или обнаружения потенциального активного NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления диагностика или обнаружение активного NASH или потенциального активного NASH основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в биологической жидкости от субъекта по сравнению с контрольным уровнем miR-193, измеренным у здорового субъекта, у субъекта с NAS<4 или у субъекта по меньшей мере с одним компонентом NAS, оцененным как 0. В конкретном варианте осуществления контрольный образец берут от субъекта с NAS=3, с S=1, LI=1 и HB=1. В конкретном варианте осуществления диагностика или обнаружение активного NASH или потенциального активного NASH основаны на обнаружении повышенного уровня экспрессии hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b3p и hsa-miR-193b-5p в образцах крови, сыворотки или плазмы субъекта по сравнению с контрольными уровнями, измеренными у здоровых субъектов, субъектов с NAS<4 или субъектов по меньшей мере с одним компонентом NAS, оцененным как 0. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя этап подтверждения того, что субъект страдает активным NASH. Такое подтверждение может быть выполнено в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области техники, таким как взятие биопсии печени или методики визуализации, такие как методики на основе MRI, MRI с суперпарамагнитным оксидом железа, мультипараметрическая MRI, MRS и MRE. Альтернативно, несколько индексов и баллов могут оценивать потенциальные биомаркеры NASH, включая, без ограничений:- 11 043299 in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of biological fluid of the specified subject. The present invention also relates to a method for diagnosing or detecting potential active NASH in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. In a specific embodiment, the diagnosis or detection of active NASH or potential active NASH is based on the detection of an elevated level of miR-193 in a body fluid from a subject compared to a control level of miR-193 measured in a healthy subject, in a subject with NAS<4, or in a subject with at least one NAS component scored as 0. In a specific embodiment, the control sample is taken from a subject with NAS=3, S=1, LI=1, and HB=1. In a specific embodiment, the diagnosis or detection of active NASH or potential active NASH is based on the detection of elevated levels of hsa-miR-193 expression, in particular hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b3p and hsa-miR-193b-5p in blood, serum, or plasma samples of a subject compared to control levels measured in healthy subjects, subjects with NAS<4, or subjects with at least one NAS component scored as 0. In a particular embodiment, the method further includes the step of confirming that the subject is suffering from active NASH. Such confirmation can be performed according to any method known to those skilled in the art, such as liver biopsy or imaging techniques such as MRI-based, superparamagnetic iron oxide MRI, multiparametric MRI, MRS, and MRE. Alternatively, several indices and scores can evaluate potential NASH biomarkers, including, without limitation:

маркеры апоптоза (фрагмент CK18, общий цитокератин, сывороточный уровень апоптозопосредующего поверхностного антигена FAS), маркеры воспаления (C-реактивный белок (CRP), TNF, IL-8, хемокиновый лиганд CXC 10 (CXCL10)), продукты окисления липидов (11-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (HETE), 9гидроксидекадиеновая кислота (HODE), 13-HODE, 13-оксооктадекадиеновая кислота (ODE), LA-13HODE (балл OxNASH), 11,12-дигидрокси)-эйкозатриеновая кислота (diHETrE)), адипоцитокины и гормоны (адипонектин, лептин, резистин, висфатин, связывающий белок ретинол (RBP) 4, связывающий жирные кислоты белок (FABP) 4, фактор роста фибробластов (FGF21)), лизосомальные ферменты (катепсин D) и комбинированные панели (тест NASH, диагностическая панель NASH).apoptosis markers (CK18 fragment, total cytokeratin, serum level of apoptosis-mediated FAS surface antigen), inflammatory markers (C-reactive protein (CRP), TNF, IL-8, chemokine ligand CXC 10 (CXCL10)), lipid oxidation products (11-hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), 9hydroxydecadienoic acid (HODE), 13-HODE, 13-oxooctadecadienoic acid (ODE), LA-13HODE (OxNASH score), 11,12-dihydroxy)-eicosatrienoic acid (diHETrE)), adipocytokines and hormones (adiponectin , leptin, resistin, visfatin, retinol binding protein (RBP) 4, fatty acid binding protein (FABP) 4, fibroblast growth factor (FGF21)), lysosomal enzymes (cathepsin D), and combination panels (NASH test, NASH diagnostic panel).

Такое подтверждение может быть выполнено путем измерения риска NAFLD (прогрессирование к NASH или фиброзу) и маркеров тяжести, таких как генетические и геномные маркеры, такие как SNP (rs738409 в PNPLA3), бесклеточные некодирующие РНК (miR-122, miR-1290, miR-192 и miR-7b), составная панель полученных из сыворотки омиксных данных, таких как rs738409, и протеомных данных, включая ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 и SERPINC1, SNP в нескольких локусах (PNPLA3, SOD2, KLF6 и LPIN1), miR-122, составная панель, включающая miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, бесклеточную ДНК, такую как циркулирующий метилированный PPARG.Such confirmation can be done by measuring the risk of NAFLD (progression to NASH or fibrosis) and severity markers such as genetic and genomic markers such as SNPs (rs738409 in PNPLA3), cell free non-coding RNAs (miR-122, miR-1290, miR- 192 and miR-7b), a composite panel of serum-derived omics data such as rs738409 and proteomic data including ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 and SERPINC1, SNPs at multiple loci (PNPLA3, SOD2, KLF6 and LPIN1), miR-122, a composite panel including miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, cell-free DNA such as circulating methylated PPARG.

Настоящее изобретение также относится к способу характеристики возникновения или степени лобулярного воспаления печени у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The present invention also relates to a method for characterizing the occurrence or extent of lobular inflammation of the liver in a subject, including determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject.

Настоящее изобретение также относится к способу характеристики возникновения или степени баллонирования гепатоцитов у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The present invention also relates to a method for characterizing the occurrence or degree of ballooning of hepatocytes in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject.

Настоящее изобретение также относится к способу характеристики возникновения или степени стеатоза печени у субъекта, включающему в себя определение уровня hsa-miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The present invention also relates to a method for characterizing the occurrence or degree of hepatic steatosis in a subject, including determining the level of hsa-miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject.

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или выявления фиброза печени у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsa-miR-193) в образце биологической жидкости указанного субъекта. Настоящее изобретение также относится к способу диагностики или выявления потенциального фиброза печени у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления фиброз является, по меньшей мере, значительным фиброзом (то есть F>2). В варианте этого варианта осуществления диагностика или обнаружение фиброза печени или потенциального фиброза печени основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в биологической жидкости от субъекта относительно контрольного уровня miR-193, измеренного у субъекта с отсутствием фиброза или минимальным фиброзом, в частности, с минимальным фиброзом. В следующем конкретном варианте осуществления фиброз представляет собой, по меньшей мере, умеренный фиброз или цирроз печени (то есть, F>3). В варианте этого варианта осуществления диагностика или обнаружение фиброза печени или потенциального фиброза печени основаны на обнаружении повышенного уровня miR-193 в биологической жидкости от субъекта по сравнению с контрольным уровнем miR-193, измеренным у субъекта без фиброза, сThe present invention also relates to a method for diagnosing or detecting hepatic fibrosis in a subject, including determining the level of miR-193 (such as hsa-miR-193) in a sample of the biological fluid of the specified subject. The present invention also relates to a method for diagnosing or detecting potential liver fibrosis in a subject, which includes determining the level of miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject. In a specific embodiment, the fibrosis is at least significant fibrosis (ie, F>2). In a variant of this embodiment, the diagnosis or detection of liver fibrosis or potential liver fibrosis is based on the detection of an elevated level of miR-193 in the body fluid from the subject relative to a control level of miR-193 measured in a subject with no fibrosis or minimal fibrosis, in particular with minimal fibrosis . In a further specific embodiment, the fibrosis is at least moderate fibrosis or cirrhosis of the liver (ie, F>3). In a variant of this embodiment, the diagnosis or detection of liver fibrosis or potential liver fibrosis is based on the detection of an elevated level of miR-193 in the body fluid from a subject compared to a control level of miR-193 measured in a subject without fibrosis, with

- 12 043299 минимальным фиброзом или с тяжелым фиброзом, в частности, с тяжелым фиброзом. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя этап подтверждения того, что субъект страдает фиброзом печени, или подтверждения стадии фиброза печени. Такое подтверждение может быть выполнено в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области техники, например, путем взятия биопсии печени или посредством биомаркеров визуализации, включая, без ограничения:- 12 043299 minimal fibrosis or with severe fibrosis, in particular with severe fibrosis. In a specific embodiment, the method further includes the step of confirming that the subject is suffering from liver fibrosis or confirming the stage of liver fibrosis. Such confirmation may be performed in accordance with any method known to those skilled in the art, such as by taking a liver biopsy or by means of imaging biomarkers, including, without limitation:

FibroScan (транзиентная эластография), точечная поперечно-волновая эластография pSWE, импульс силы акустического излучения (ARFI), 2D 3D сдвиговолновая эластография 2D-3D SWE, магнитно-резонансная эластография MRE, многопараметрическая MRI.FibroScan (transient elastography), point transverse wave elastography pSWE, acoustic radiation force impulse (ARFI), 2D 3D shear wave elastography 2D-3D SWE, magnetic resonance elastography MRE, multiparametric MRI.

Альтернативно, несколько неинвазивных тестов фиброза и цирроза печени:Alternatively, several non-invasive tests for fibrosis and cirrhosis of the liver:

соотношение AST :ALT и индекс отношения AST :тромбоциты (APRI), индекс фиброза-4 (FIB-4), который включает возраст, AST, ALT и количество тромбоцитов, балл фиброза NAFLD (возраст, ИМТ, нарушение уровня глюкозы натощак и/или диабет, AST, ALT, количество тромбоцитов и альбумин), ядро BARD (AST, ALT, ИМТ и диабет).AST:ALT ratio and AST:platelet ratio index (APRI), fibrosis index-4 (FIB-4) which includes age, AST, ALT and platelet count, NAFLD fibrosis score (age, BMI, impaired fasting glucose and/or diabetes, AST, ALT, platelet count and albumin), BARD core (AST, ALT, BMI and diabetes).

В другом варианте осуществления конкретные маркеры фиброза печени и панель могут оценивать фиброз печени:In another embodiment, specific liver fibrosis markers and a panel can assess liver fibrosis:

специфичные маркеры фиброза: гиалуроновая кислота, N-концевой пропептид коллагена типа III (PIIINP), специфичный конкурентный иммуноферментный анализ нео-эпитопов для PIIINP (Pro-C3), тканевый ингибитор металлопротеиназ (TIMP-1), ламинин.specific markers of fibrosis: hyaluronic acid, type III collagen N-terminal propeptide (PIIINP), specific competitive neo-epitope immunoassay for PIIINP (Pro-C3), tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-1), laminin.

Специфичные для фиброза панели: улучшенная панель для фиброза печени (ELF), которая включает PIIINP, гиалуроновую кислоту и TIMP-1; Fibrotest (гамма-глутамилтрансфераза (GGT), общий билирубин, альфа-2-макроглобулин (A2M), аполипопротеин A1 и гаптоглобин; FibroMeter NAFLD (масса тела, индекс протромбина, ALT, AST, ферритин и глюкоза натощак).Fibrosis-specific panels: improved panel for liver fibrosis (ELF), which includes PIIINP, hyaluronic acid and TIMP-1; Fibrotest (gamma-glutamyltransferase (GGT), total bilirubin, alpha-2 macroglobulin (A2M), apolipoprotein A1 and haptoglobin; FibroMeter NAFLD (body weight, prothrombin index, ALT, AST, ferritin and fasting glucose).

Настоящее изобретение также относится к способу определения стадии фиброза печени у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsa-miR-193) в образце биологической жидкости указанного субъекта.The present invention also relates to a method for determining the stage of liver fibrosis in a subject, including determining the level of miR-193 (such as hsa-miR-193) in a sample of the body fluid of the specified subject.

В конкретном варианте осуществления стадия F=4 может быть определена, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце от субъекта со стадией фиброза F<4, например, при F=0, F=1, F=2 или F=3. В конкретном варианте контрольный образец берут от субъекта с F=3.In a specific embodiment, stage F=4 can be determined if the level of miR-193 in the body fluid sample of the specified subject is higher than the level of miR-193 in the control sample from the subject with stage F<4 fibrosis, for example, when F=0, F =1, F=2 or F=3. In a specific embodiment, the control sample is taken from a subject with F=3.

В конкретном варианте осуществления стадия F=3 может быть определена, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце от субъекта со стадией фиброза F<3, например, с F=0, F=1 или F=2. В конкретном варианте контрольный образец берут от субъекта с F=2.In a specific embodiment, stage F=3 can be determined if the level of miR-193 in the body fluid sample of the specified subject is higher than the level of miR-193 in the control sample from the subject with stage F<3 fibrosis, for example, with F=0, F =1 or F=2. In a specific embodiment, the control sample is taken from a subject with F=2.

В конкретном варианте осуществления стадия F=2 может быть определена, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце от субъекта со стадией фиброза F<2, например, с F=0 или F=1. В конкретном варианте контрольный образец берут от субъекта с F=1.In a specific embodiment, stage F=2 can be determined if the level of miR-193 in the body fluid sample of the specified subject is higher than the level of miR-193 in the control sample from the subject with stage F<2 fibrosis, for example, with F=0 or F =1. In a specific embodiment, the control sample is taken from a subject with F=1.

В конкретном варианте осуществления стадия F=1 может быть определена, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце от субъекта со стадией фиброза F<1, например, с F=0.In a specific embodiment, stage F=1 can be determined if the level of miR-193 in the body fluid sample of the specified subject is higher than the level of miR-193 in the control sample from the subject with stage F<1 fibrosis, for example, with F=0.

В конкретном варианте осуществления способ предназначен для диагностики и выявления значительного или тяжелого фиброза (F>2) и прогрессирующего фиброза печени (F>3) у субъекта с NAFLD или NASH на основе обнаружения повышенного уровня экспрессии hsa-miR-193, в частности, hsa-miR193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p и hsa-miR-193b-5p, в образцах крови, сыворотки или плазмы крови субъекта по сравнению с контрольными уровнями, измеренными у пациентов без фиброза и/или с минимальным фиброзом (F=0-1).In a specific embodiment, the method is for diagnosing and detecting significant or severe fibrosis (F>2) and progressive liver fibrosis (F>3) in a subject with NAFLD or NASH based on the detection of elevated levels of hsa-miR-193 expression, in particular hsa -miR193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p, and hsa-miR-193b-5p, in blood, serum, or plasma samples from the subject compared to control levels measured in patients without fibrosis and /or with minimal fibrosis (F=0-1).

В конкретном варианте осуществления способ определения стадии фиброза печени дополнительно включает в себя этап подтверждения стадии фиброза печени у субъекта. Такое подтверждение может быть осуществлено в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области техники, например, путем взятия биопсии печени или с помощью других средств, таких как биомаркеры для визуализации, перечисленные выше для диагностики фиброза.In a specific embodiment, the method for determining the stage of liver fibrosis further includes the step of confirming the stage of liver fibrosis in the subject. Such confirmation may be carried out in accordance with any method known to those skilled in the art, for example by taking a liver biopsy or by other means such as the imaging biomarkers listed above for diagnosing fibrosis.

Поскольку фиброз печени является распространенным следствием большинства хронических заболеваний печени, настоящее изобретение также относится к диагностике и выявлению значительного или прогрессирующего фиброза печени, вызванного другими фиброзными заболеваниями печени, такими как вирусный гепатит (HBV, HCV, ...), алкогольный стеатогепатит, заболевания желчевыводящих путей (первичный желчный холангит, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, альфа-1-антитрипсиновый дефицит).Since liver fibrosis is a common consequence of most chronic liver diseases, the present invention also relates to the diagnosis and detection of significant or progressive liver fibrosis caused by other fibrotic liver diseases such as viral hepatitis (HBV, HCV, ...), alcoholic steatohepatitis, biliary tract diseases. pathways (primary biliary cholangitis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, Wilson's disease, alpha-1 antitrypsin deficiency).

- 13 043299- 13 043299

Настоящее изобретение также относится к способу классификации субъекта в качестве потенциально получающего или не получающего лечение NAFLD, NASH и/или фиброза печени, включающему в себя определение уровня miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления способ предназначен для классификации субъекта в качестве потенциально получающего или не получающего лечение NAFLD. В другом конкретном варианте осуществления способ предназначен для классификации субъекта в качестве потенциально получающего или не получающего лечение NASH. В дополнительном варианте осуществления способ предназначен для классификации субъекта в качестве потенциального потенциально получающего или не получающего лечение фиброза печени.The present invention also relates to a method for classifying a subject as potentially receiving or not receiving treatment for NAFLD, NASH and/or liver fibrosis, which includes determining the level of miR-193 in a sample of said subject's body fluid. In a specific embodiment, the method is for classifying a subject as potentially receiving or not receiving NAFLD treatment. In another specific embodiment, the method is for classifying a subject as potentially receiving or not receiving NASH treatment. In a further embodiment, the method is for classifying a subject as a potential potentially treated or untreated liver fibrosis.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу классификации субъекта в качестве потенциально получающего (TBT) или не получающего (NTBT) лечение NASH и/или фиброза, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsa-miR-193) в образце биологической жидкости указанного субъекта.More specifically, the present invention relates to a method for classifying a subject as potentially receiving (TBT) or not receiving (NTBT) NASH and/or fibrosis treatment, comprising determining the level of miR-193 (such as hsa-miR-193) in a biological sample. fluids of said subject.

В конкретном варианте осуществления субъекта классифицируют как субъекта TBT2, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце субъекта NTBT2. В конкретном варианте субъектом NTBT2 является субъект с NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и F=1 (например, стадия фиброза 1a, 1b или 1c).In a specific embodiment, a subject is classified as a TBT2 subject if the miR-193 level in said subject's body fluid sample is higher than the miR-193 level in the subject's control NTBT2 sample. In a specific embodiment, an NTBT2 subject is a subject with NAS=4, S>1, LI>1, HB>1, and F=1 (eg, fibrosis stage 1a, 1b, or 1c).

В конкретном варианте осуществления субъекта классифицируют как субъекта TBT1, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце субъекта NTBT1. В конкретном варианте субъектом NTBT1 является субъект с NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и F=0.In a specific embodiment, a subject is classified as a TBT1 subject if the miR-193 level in the subject's body fluid sample is higher than the miR-193 level in the subject's control NTBT1 sample. In a particular embodiment, an NTBT1 subject is a subject with NAS=4, S>1, LI>1, HB>1, and F=0.

В конкретном варианте осуществления субъекта классифицируют как субъекта TBT7, если уровень miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта выше, чем уровень miR-193 в контрольном образце субъекта NTBT7. В конкретном варианте субъектом NTBT7 является субъект с NAS=4, S>1, LI>1, HB>1 и F=1a.In a specific embodiment, a subject is classified as a TBT7 subject if the miR-193 level in the subject's body fluid sample is higher than the miR-193 level in the subject's control NTBT7 sample. In a specific embodiment, an NTBT7 subject is a subject with NAS=4, S>1, LI>1, HB>1, and F=1a.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению предназначен для классификации субъекта как субъекта TBT2.In a specific embodiment, the method of the invention is for classifying a subject as a TBT2 subject.

Другие варианты изобретения относятся к способу классификации пациентов как потенциально получающих (TBT) или не получающих (NTBT) лечение NASH и/или фиброза на основании обнаружения повышенного уровня экспрессии hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p и hsa-miR193b-5p, в крови, сыворотке или плазме по сравнению с контрольными уровнями hsa-miR-193, измеренными у пациентов NTBT.Other embodiments of the invention relate to a method for classifying patients as potentially receiving (TBT) or not receiving (NTBT) treatment for NASH and/or fibrosis based on the detection of increased expression of hsa-miR-193, in particular hsa-miR-193a-5p, hsa -miR-193b-3p and hsa-miR193b-5p, in blood, serum, or plasma compared to hsa-miR-193 control levels measured in NTBT patients.

Такая классификация может также служить основой для определения того, должен ли субъект пройти, прежде чем будет принято решение о лечении, дальнейшие исследования печени, такие как современные исследования печени, такие как ультразвуковые исследование, эластография, методики визуализации, включая MRI, или биопсию печени.Such a classification may also serve as a basis for determining whether a subject should undergo further liver tests, such as modern liver tests such as ultrasound, elastography, imaging techniques, including MRI, or a liver biopsy, before a treatment decision is made.

Определение TBT, или получающего лечение пациента, в отличие от NTBT, или не получающего лечение пациента, может варьироваться в зависимости от соотношения эффективности лекарственного препарата и безопасности лекарственного препарата при различных значениях активности заболевания (NAS или индекс активности) и различных значениях стадии фиброза, как указано выше.The definition of TBT, or treated patient, as opposed to NTBT, or untreated patient, may vary depending on the balance of drug efficacy and drug safety at different values of disease activity (NAS or activity index) and different values of fibrosis stage, as above.

Настоящее изобретение также относится к способу определения активности NAFLD или NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsa-miR-193) в образце биологической жидкости указанного субъекта.The present invention also relates to a method for determining NAFLD or NASH activity in a subject, including determining the level of miR-193 (such as hsa-miR-193) in a sample of a biological fluid of the specified subject.

Изобретение также относится к способу прогнозирования риска развития активности NAFLD или NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsa-miR-193) в образце биологической жидкости указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления способ предназначен для прогнозирования риска развития активности NAFLD или NASH в отсутствие лечения.The invention also relates to a method for predicting the risk of developing NAFLD or NASH activity in a subject, which includes determining the level of miR-193 (such as hsa-miR-193) in a sample of the body fluid of the specified subject. In a specific embodiment, the method is designed to predict the risk of developing NAFLD or NASH activity in the absence of treatment.

Изобретение также относится к способу прогнозирования риска развития фиброза до цирроза печени и клинических исходов у пациента, включающему в себя определение уровня miR-193 (такой как hsamiR-193) в образце биологической жидкости указанного пациента. В конкретном варианте осуществления способ предназначен для прогнозирования риска развития фиброза до цирроза и клинических исходов для печени при отсутствии лечения.The invention also relates to a method for predicting the risk of developing fibrosis to cirrhosis of the liver and clinical outcomes in a patient, including determining the level of miR-193 (such as hsamiR-193) in a sample of the biological fluid of the specified patient. In a specific embodiment, the method is designed to predict the risk of developing fibrosis to cirrhosis and clinical outcomes for the liver in the absence of treatment.

Изобретение также относится к способу мониторинга развития (то есть, прогрессирования или регрессирования) активности NAFLD или NASH у субъекта, включающему в себя определение уровня hsamiR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The invention also relates to a method for monitoring the development (ie, progression or regression) of NAFLD or NASH activity in a subject, which includes determining the level of hsamiR-193 in a sample of said subject's body fluid.

Изобретение также относится к способу мониторинга развития (то есть, прогрессирования или регрессирования) фиброза печени у субъекта, включающему в себя определение уровня hsa-miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The invention also relates to a method for monitoring the development (ie, progression or regression) of liver fibrosis in a subject, which includes determining the level of hsa-miR-193 in a sample of the biological fluid of the specified subject.

Изобретение также относится к способу прогнозирования реакции пациента на конкретное лечение NAFLD, NASH и/или фиброза печени, включающему в себя определение уровня hsa-miR-193 в образце биологической жидкости указанного субъекта.The invention also relates to a method for predicting a patient's response to a particular treatment for NAFLD, NASH and/or liver fibrosis, which includes determining the level of hsa-miR-193 in a sample of a biological fluid of the specified subject.

- 14 043299- 14 043299

Согласно другому варианту изобретение относится к способу определения стадии стеатоза у субъекта на основании определения уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта.According to another embodiment, the invention relates to a method for determining the stage of steatosis in a subject based on determining the level of miR-193 in a sample of a subject's body fluid.

Согласно другому варианту, изобретение относится к способу определения степени гепатоцеллюлярного баллонирования у субъекта на основании определения уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта.According to another embodiment, the invention relates to a method for determining the degree of hepatocellular ballooning in a subject based on determining the level of miR-193 in a sample of a subject's body fluid.

Согласно другому варианту, изобретение относится к способу определения степени лобулярного воспаления у субъекта на основании определения уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта.According to another embodiment, the invention relates to a method for determining the degree of lobular inflammation in a subject based on determining the level of miR-193 in a sample of a subject's body fluid.

При практическом применении настоящего изобретения пороговые концентрации miR-193 могут быть рассчитаны для облегчения принятия решения лицом, реализующим способы по настоящему изобретению. Используемое в настоящем описании выражение пороговая концентрация относится к концентрации miR-193, выше которой делается статистическое предсказание симптома или заболевания и ниже которого делается статистическое предсказание отсутствия заболевания или симптома. Такие пороговые концентрации могут быть определены следующим образом для различных сценариев.In the practice of the present invention, miR-193 threshold concentrations can be calculated to facilitate decision making by the person implementing the methods of the present invention. As used herein, the expression threshold concentration refers to the concentration of miR-193 above which a symptom or disease is statistically predicted and below which a disease or symptom is not statistically predicted. Such threshold concentrations can be determined as follows for various scenarios.

Пороговая концентрация для классификации субъекта как субъекта с NAFLD (или потенциальной NAFLD) или как здорового субъекта без NAFLD может быть определена посредством:The threshold concentration for classifying a subject as a subject with NAFLD (or potential NAFLD) or as a healthy subject without NAFLD can be determined by:

i) измерения концентрации miR-193 в образцах биологической жидкости из контрольных когорт субъектов, включая субъектов с NAFLD и здоровых субъектов без NAFLD, ii) применения специального статистического анализа к контрольному множеству данных с целью определения оптимальной пороговой концентрации.i) measuring the concentration of miR-193 in body fluid samples from control cohorts of subjects, including subjects with NAFLD and healthy subjects without NAFLD, ii) applying a specific statistical analysis to the control data set to determine the optimal concentration threshold.

В частности, современный статистический метод ROC (соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов) можно применять для расчета оптимальной пороговой концентрации для различения NAFLD и здоровых субъектов в контрольных когортах.In particular, the current statistical ROC (Correct/False Detection Ratio) method can be applied to calculate the optimal concentration threshold to distinguish between NAFLD and healthy subjects in control cohorts.

Предельная концентрация для классификации субъекта как субъекта с NASH (или потенциальным NASH) или как субъекта без NASH может быть определена посредством:The cutoff for classifying a subject as a subject with NASH (or potential NASH) or as a subject without NASH can be determined by:

i) измерения концентраций miR-193 в образцах биологической жидкости контрольных когорт субъектов, включающих как субъектов с NASH, так и субъектов без NASH, ii) применения специального статистического анализа к контрольному множеству данных с целью определения оптимальной пороговой концентрации. В частности, современный статистический метод ROC (соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов) можно применять для расчета оптимальной пороговой концентрации для различения субъектов с NASH (или потенциальным NASH) и субъектов без NASH в контрольных когортах.i) measuring miR-193 concentrations in body fluid samples of control cohorts of subjects, including both NASH and non-NASH subjects, ii) applying a specific statistical analysis to the control data set to determine the optimal concentration threshold. In particular, the current statistical ROC (correct/false detection ratios) method can be applied to calculate the optimal cut-off concentration to distinguish between subjects with NASH (or potential NASH) and subjects without NASH in control cohorts.

Пороговая концентрация для классификации субъекта как субъекта с активным NASH (или потенциальным активным NASH) или как субъекта без активного NASH может быть определена посредством:The threshold concentration for classifying a subject as a subject with active NASH (or potential active NASH) or as a subject without active NASH can be determined by:

i) измерения концентраций miR-193 в образцах биологической жидкости контрольных когорт субъектов, включая субъектов с активным NASH и субъектов без активного NASH, ii) применения специального статистического анализа к контрольному множеству данных с целью определения оптимальной пороговой концентрации. В частности, современный статистический метод ROC (соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов) можно применять для расчета оптимальной пороговой концентрации для различения пациентов с активным NASH (или потенциальным активным NASH) и субъектов без активного NASH в контрольных когортах.i) measuring miR-193 concentrations in body fluid samples of control cohorts of subjects, including subjects with active NASH and subjects without active NASH, ii) applying a specific statistical analysis to the control data set to determine the optimal concentration threshold. In particular, the modern statistical method of ROC (correct/false detection ratios) can be applied to calculate the optimal threshold concentration to distinguish between patients with active NASH (or potential active NASH) and subjects without active NASH in control cohorts.

Пороговая концентрация для классификации субъекта как субъекта со значительным фиброзом печени (F>2) (или потенциальным значительным фиброзом печени) или как субъекта без фиброза или с минимальным фиброзом может быть определена посредством:The threshold concentration for classifying a subject as having significant hepatic fibrosis (F>2) (or potentially significant hepatic fibrosis) or as having no fibrosis or minimal fibrosis can be determined by:

i) измерения концентраций miR-193 в образцах биологической жидкости контрольных когорт пациентов, включающих как пациентов со значительным или тяжелым фиброзом печени (F>2) или прогрессирующим фиброзом печени (F>3), так и субъектов без фиброза или с минимальным фиброзом (F=0-1), ii) применения специального статистического анализа к контрольному множеству данных с целью определения оптимальной пороговой концентрации. В частности, современный статистический метод ROC (соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов) можно применять для расчета оптимальной пороговой концентрации для различения субъектов со значительным фиброзом печени (F>2) или тяжелым фиброзом печени (F>3) и субъектов с отсутствием фиброза или минимальным фиброзом (F=0-1) в контрольных когортах.i) measurements of miR-193 concentrations in body fluid samples of control cohorts of patients, including both patients with significant or severe liver fibrosis (F>2) or advanced liver fibrosis (F>3), and subjects without fibrosis or with minimal fibrosis (F =0-1), ii) applying a special statistical analysis to the control data set to determine the optimal threshold concentration. In particular, the modern statistical method of ROC (correct/false detection ratios) can be used to calculate the optimal threshold concentration to distinguish between subjects with significant liver fibrosis (F>2) or severe liver fibrosis (F>3) and subjects with no fibrosis or minimal fibrosis (F=0-1) in control cohorts.

Пороговая концентрация для классификации субъекта как субъекта TBT или субъекта NTBT может быть определена посредством:The threshold concentration for classifying a subject as a TBT subject or an NTBT subject can be determined by:

i) измерения концентраций miR-193 в образцах биологической жидкости контрольных когорт субъектов, включающих как субъектов TBT, так и субъектов NTBT, ii) применения специального статистического анализа к контрольному множеству данных с целью определения оптимальной пороговой концентрации. В частности, современный статистический метод ROC (соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов) можно применять для расчета оптимальной пороговой концентрации для различения субъектов TBT и NTBT в контрольных когортах.i) measuring concentrations of miR-193 in body fluid samples of control cohorts of subjects, including both TBT and NTBT subjects, ii) applying a specific statistical analysis to the control data set to determine the optimal concentration threshold. In particular, the modern statistical method of ROC (correct and false detection ratios) can be applied to calculate the optimal concentration threshold for distinguishing between TBT and NTBT subjects in control cohorts.

- 15 043299- 15 043299

Представленные в настоящем описании данные показывают, что miR-193 является циркулирующим диагностическим биомаркером для неинвазивной классификации гистологических очагов (стеатоз, лобулярное воспаление, баллонирование гепатоцитов), оценки уровня активности NAFLD, уровня активностиThe data presented herein show that miR-193 is a circulating diagnostic biomarker for non-invasive classification of histological lesions (steatosis, lobular inflammation, hepatocyte ballooning), assessment of NAFLD activity level, activity level

NASH и оценки тяжести фиброза печени у субъекта.NASH and assessment of the severity of liver fibrosis in the subject.

Согласно другому варианту настоящего изобретения, предложен способ прогнозирования риска развития активности NAFLD или NASH у субъекта в отсутствие лечения на основе уровня miR-193 в образце биологической жидкости субъекта.According to another embodiment of the present invention, a method is provided for predicting the risk of developing NAFLD or NASH activity in a subject in the absence of treatment based on the level of miR-193 in a subject's body fluid sample.

Другой вариант изобретения относится к способу прогнозирования риска развития фиброза до цирроза и исходов для печени у пациента с NAFLD или NASH на основе уровня miR-193, измеренного в образце биологической жидкости субъекта. Настоящее изобретение также предназначено для прогнозирования риска развития фиброза у пациентов, страдающих другими фиброзными заболеваниями печени, такими как: вирусный гепатит (HBV, HCV, ...), алкогольный стеатогепатит, заболевания желчевыводящих путей (первичный желчный холангит, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, альфа-1-антитрипсиновый дефицит).Another embodiment of the invention relates to a method for predicting the risk of fibrosis to cirrhosis and liver outcomes in a patient with NAFLD or NASH based on miR-193 levels measured in a subject's body fluid sample. The present invention is also intended to predict the risk of developing fibrosis in patients suffering from other fibrotic liver diseases such as: viral hepatitis (HBV, HCV, ...), alcoholic steatohepatitis, diseases of the biliary tract (primary biliary cholangitis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis , Wilson's disease, alpha-1 antitrypsin deficiency).

Авторы настоящего изобретения также показали наличие корреляции между изменениями уровней циркулирующего miR-193 и повышением гистологических показателей, в частности, повышением индекса активности, NAS и стадии фиброза. Эти анализы поддерживают применение miR-193 в способе мониторинга гистологического развития у субъекта, независимо от того, подвергается ли он или нет лечению лекарственным препаратом против NAFLD, лекарственным препаратом против NASH или противофиброзным лекарственным препаратом. Кроме того, способ по изобретению может быть применен для оценки активности лекарственного препарата против NAFLD, против NASH и/или против фиброза в интервенционных испытаниях, предполагающих изменения уровня miR-193 в сыворотке в качестве суррогатов гистологических эволюции.The present inventors have also shown a correlation between changes in circulating miR-193 levels and an increase in histological parameters, in particular an increase in activity index, NAS and fibrosis stage. These assays support the use of miR-193 in a method for monitoring histological progression in a subject, whether or not they are being treated with an anti-NAFLD drug, an anti-NASH drug, or an anti-fibrotic drug. In addition, the method of the invention can be used to evaluate the activity of a drug against NAFLD, against NASH and/or against fibrosis in intervention trials involving changes in serum miR-193 levels as surrogates for histological evolution.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу для мониторинга эволюции (то есть, прогрессирования или регрессирования) активности NAFLD или NASH на основе эволюции уровня MIR-193 в образцах биологической жидкости, собранных в два или более различных моментов времени от одного и того же субъекта.Thus, another embodiment of the present invention relates to a method for monitoring the evolution (i.e., progression or regression) of NAFLD or NASH activity based on the evolution of the level of MIR-193 in body fluid samples collected at two or more different time points from the same same subject.

Таким образом, другой вариант изобретения относится к способу мониторинга эволюции (то есть прогрессирования или регрессирования) стадии фиброза печени, основанному на эволюции уровня miR193 в образцах биологической жидкости, взятых два или более раз отдельно от одного и того же субъекта.Thus, another embodiment of the invention relates to a method for monitoring the evolution (i.e., progression or regression) of the stage of liver fibrosis, based on the evolution of miR193 levels in body fluid samples taken two or more times separately from the same subject.

Настоящее изобретение также относится к определению стадии развития фиброза при других фиброзных заболеваниях печени, таких как: вирусный гепатит (HBV, HCV, ...), алкогольный стеатогепатит, заболевания желчевыводящих путей (первичный желчный холангит, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, альфа-1-антитрипсиновый дефицит).The present invention also relates to the staging of fibrosis in other fibrotic liver diseases such as: viral hepatitis (HBV, HCV, ...), alcoholic steatohepatitis, diseases of the biliary tract (primary biliary cholangitis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, Wilson's disease , alpha-1 antitrypsin deficiency).

Другой вариант изобретения относится к способу предсказания реакции субъекта (прогноз изменения активности NAFLD, активности NASH и стадии фиброза печени) на конкретное лечение (субъектреспондер) на основе обнаружения уровня дифференциальной экспрессии miR-193 в образце биологической жидкости субъекта по сравнению с контрольными уровнями, измеренными у субъектов, не отвечающих на терапию.Another aspect of the invention relates to a method for predicting a subject's response (predicting changes in NAFLD activity, NASH activity, and liver fibrosis stage) to a particular treatment (responder subject) based on detecting the level of miR-193 differential expression in a subject's body fluid sample compared to control levels measured in subjects not responding to therapy.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предоставлены способы для:Thus, the present invention provides methods for:

характеризации наличия NAFLD у субъекта, характеризации наличия NASH у субъекта, характеризации наличия фиброза печени у субъекта, характеризации наличия гепатоцеллюлярного баллонирования у субъекта, характеризации наличия лобулярного воспаления у субъекта, или характеризации наличия стеатоза печени у субъекта.characterizing the presence of NAFLD in a subject, characterizing the presence of NASH in a subject, characterizing the presence of hepatic fibrosis in a subject, characterizing the presence of hepatocellular ballooning in a subject, characterizing the presence of lobular inflammation in a subject, or characterizing the presence of hepatic steatosis in a subject.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предоставлены способы для: диагностирования у субъекта NAFLD и/или более тяжелой NAFLD, диагностирования у субъекта NASH и/или более тяжелого NASH, диагностирования у субъекта наличия фиброза печени и/или более поздней стадии фиброза печени, диагностирования у субъекта гепатоцеллюлярного баллонирования и/или более высокого балла по гепатоцеллюлярному баллонированию, диагностирования у субъекта лобулярного воспаления и/или более высокого балла по лобулярному воспалению, или диагностирования у субъекта наличия стеатоза печени и/или более высокого балла по стеатозу печени.In addition, the present invention provides methods for: diagnosing a subject for NAFLD and/or more severe NAFLD, diagnosing a subject for NASH and/or more severe NASH, diagnosing a subject as having liver fibrosis and/or advanced liver fibrosis, diagnosing the subject having hepatocellular ballooning and/or a higher hepatocellular ballooning score, diagnosing the subject with lobular inflammation and/or a higher score for lobular inflammation, or diagnosing the subject as having hepatic steatosis and/or a higher hepatic steatosis score.

Кроме того, способы согласно настоящему изобретению позволяют:In addition, the methods according to the present invention allow:

определить активность NAFLD или NASH у субъекта, определить стадию фиброза у субъекта, определить степень тяжести NASH у субъекта, или определить прогрессирование или регрессирование патологии у пациента с NASH.determine NAFLD or NASH activity in a subject, determine the stage of fibrosis in a subject, determine the severity of NASH in a subject, or determine the progression or regression of pathology in a patient with NASH.

Кроме того, способы согласно настоящему изобретению позволяют:In addition, the methods according to the present invention allow:

классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение NAFLD,classify the subject as receiving or not receiving NAFLD treatment,

- 16 043299 классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение для NASH, классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение фиброза печени, классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение гепатоцеллюлярного баллонирования, классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение лобулярного воспаления, или классифицировать субъекта как получающего или не получающего лечение стеатоза печени.classify the subject as treated or untreated for NASH, classify the subject as treated or untreated for hepatic fibrosis, classify the subject as treated or untreated for hepatocellular ballooning, classify the subject as treated or untreated for lobular inflammation, or classify the subject as treated or untreated for hepatic steatosis.

Кроме того, способы согласно настоящему изобретению позволяют:In addition, the methods according to the present invention allow:

оценить эффективность медикаментозного лечения, основанного на введении лекарственного препарата для лечения заболевания NAFLD, оценить эффективность медикаментозного лечения, основанного на введении лекарственного препарата для лечения болезни NASH, оценить эффективность медикаментозного лечения, основанного на введения лекарственного препарата для лечения заболевания фиброза, оценить эффективность медикаментозного лечения, основанного на введении лекарственного средства для лечения заболевания гепатоцеллюлярного баллонирования, или оценить эффективность медикаментозного лечения, основанного на введении лекарственного средства для лечения заболевания лобулярного воспаления.evaluate the effectiveness of drug treatment based on the administration of a drug for the treatment of NAFLD disease, evaluate the effectiveness of drug treatment based on the administration of a drug for the treatment of NASH disease, evaluate the effectiveness of drug treatment based on the administration of a drug for the treatment of fibrosis disease, evaluate the effectiveness of drug treatment, based on the administration of a drug for the treatment of a hepatocellular ballooning disease, or to evaluate the effectiveness of a drug treatment based on the administration of a drug for the treatment of a lobular inflammation disease.

Кроме того, способы согласно настоящему изобретению позволяют:In addition, the methods according to the present invention allow:

определить прогрессирование или регрессирования патологии у пациента с NAFLD после введения медикаментозного лечения, определить прогрессирование или регрессирование патологии у пациента с NASH после введения медикаментозного лечения, определить прогрессирование или регрессирование патологии у пациента, страдающего фиброзом, после введения медикаментозного лечения, определить прогрессирование или регрессирование патологии у пациента, страдающего заболеванием гепатоцеллюлярного баллонирования, после введения медикаментозного лечения, или определить прогрессирование или регрессирование патологии у пациента, страдающего заболеванием лобулярного воспаления, после введения медикаментозного лечения.determine the progression or regression of pathology in a patient with NAFLD after administration of drug treatment, determine the progression or regression of pathology in a patient with NASH after administration of drug treatment, determine the progression or regression of pathology in a patient suffering from fibrosis after administration of drug treatment, determine the progression or regression of pathology in of a patient suffering from hepatocellular ballooning disease after administration of drug treatment, or to determine the progression or regression of pathology in a patient suffering from lobular inflammation disease after administration of drug treatment.

Кроме того, способы согласно настоящему изобретению позволяют:In addition, the methods according to the present invention allow:

предсказать, будет ли пациент отвечать или нет, то есть, является ли он потенциально респондером или не является респондером на конкретное медикаментозное лечение для лечения NAFLD, предсказать, будет ли пациент отвечать или нет, то есть, является ли он (потенциально) респондером или (потенциально) не является респондером на медикаментозное лечение для лечения заболевания NASH, предсказать, будет ли пациент отвечать или нет, то есть является ли он (потенциально) респондером или (потенциально) не является респондером на медикаментозное лечение для лечения фиброза печени, предсказать, будет ли пациент отвечать или нет, то есть, является ли он (потенциально) респондером или (потенциально) не является респондером на медикаментозное лечение для лечения гепатоцеллюлярного заболевания, или предсказать, будет ли пациент отвечать или нет, то есть, является ли он (потенциально) респондером или (потенциально) не является респондером на медикаментозное лечение заболевания лобулярного воспаления.predict whether a patient will respond or not, i.e., whether they are a potential responder or not a responder to a particular NAFLD drug treatment, predict whether a patient will respond or not, i.e., whether they are (potentially) a responder or ( potentially) is not a Responder to drug treatment for NASH, predict whether the patient will respond or not, i.e. whether he is (potentially) a Responder or (potentially) not a Responder to drug treatment for liver fibrosis, predict whether whether the patient responds or not, i.e. whether he is (potentially) a responder or (potentially) not a responder to medication for the treatment of hepatocellular disease, or to predict whether the patient will respond or not, i.e. whether he is (potentially) a responder or (potentially) is not a responder to medical treatment of lobular inflammation disease.

В некоторых вариантах осуществления способы определения того, имеет ли субъект NAFLD или NASH, или активный NASH, или фиброз печени (такой как значительный фиброз печени), или лобулярное воспаление, или баллонирование гепатоцитов, или определения, является ли субъект получателем лекарственных препаратов (TBT) или потенциальным респондером на конкретный лекарственный препарат, включает в себя забор образца биологической жидкости от субъекта, у которого подозревают наличие оцениваемого состояния, и определение уровня miR-193; при этом уровень, более высокий, чем контрольный уровень miR-193, указывает на наличие оцениваемого состояния, или диагноз субъекта, как имеющего NAFLD или NASH, или активный NASH или фиброз печени (такой как значительный фиброз), или лобулярное воспаление, или баллонирование гепатоцитов, или на то, что субъект является потенциальным получателем лекарственных препаратов (TBT) или респондером.In some embodiments, methods for determining whether a subject has NAFLD or NASH, or active NASH, or hepatic fibrosis (such as significant liver fibrosis), or lobular inflammation, or hepatocyte ballooning, or determining whether a subject is a drug recipient (TBT) or a potential responder for a particular drug, includes taking a body fluid sample from a subject suspected of having the condition being assessed and determining miR-193 levels; wherein a level higher than the control level of miR-193 indicates the presence of the condition being assessed, or the diagnosis of the subject as having NAFLD or NASH, or active NASH, or hepatic fibrosis (such as significant fibrosis), or lobular inflammation, or ballooning of hepatocytes , or that the subject is a potential drug recipient (TBT) or responder.

В конкретных вариантах осуществления субъект является субъектом с риском развития NALFD, NASH, активного NASH или фиброза печени, или субъектом с риском развития NAFLD, NASH, активного NASH или фиброза печени в будущем, таким как субъект, имеющий ожирение, диабет, страдающий метаболическим синдромом и/или имеющий повышенные уровни ферментов печени и/или имеющий другие признаки дисфункции печени. Субъект также может являться субъектом с ранее идентифицированными NAFLD, NASH или активным NASH или фиброзом печени, при этом способ по изобретению позволяет определить активность заболевания и стадию фиброза и оценить риски развития заболевания в направлении цирроза, цирротических осложнений, гепатокарциномы, трансплантации печени, сердечнососудистых заболеваний или смерти, связанной с печенью.In specific embodiments, the subject is a subject at risk of developing NALFD, NASH, active NASH, or hepatic fibrosis, or a subject at risk of developing NAFLD, NASH, active NASH, or hepatic fibrosis in the future, such as a subject that is obese, diabetic, suffering from metabolic syndrome, and /or having elevated levels of liver enzymes and/or having other signs of liver dysfunction. The subject may also be a subject with previously identified NAFLD, NASH, or active NASH, or hepatic fibrosis, whereby the method of the invention allows disease activity and fibrosis staging to be determined and the risks of disease progression towards cirrhosis, cirrhotic complications, hepatocarcinoma, liver transplantation, cardiovascular disease, or death associated with the liver.

- 17 043299- 17 043299

В конкретных вариантах осуществления субъект страдает NASH, при этом способ по изобретению позволяет определить эффективность лекарственного препарата для лечения заболевания NASH, классифицировать субъекта как респондера/не-респондера на лечение NASH, или позволяет осуществлять мониторинг эволюции состояния NASH у субъекта.In specific embodiments, the subject suffers from NASH, wherein the method of the invention determines the efficacy of a drug in the treatment of NASH, classifies the subject as a NASH responder/non-responder, or monitors the evolution of the subject's NASH condition.

Согласно конкретному аспекту изобретения для каждого типа пациента, подлежащего лечению, может быть получен балл по шкале NASH.According to a specific aspect of the invention, for each type of patient to be treated, a NASH score can be obtained.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения для диагностики NAFLD, NASH или фиброза печени и/или для определения активности заболевания, стадии фиброза у субъекта и/или для оценки эффективности медикаментозного лечения, и/или для определения эволюции (прогрессирования или регрессирования) патологии у субъекта с NAFLD, с NASH или фиброзом печени и/или для классификации субъекта в качестве потенциального респондера не-респондера на медикаментозное лечение, и/или для предсказания исхода заболевания для субъекта измерение уровня miR-193 может быть введено в математические модели (алгоритмы) для комбинирования с другими переменными, такими как пол, возраст, индекс массы тела, вес, состояние здоровья, артериальное давление или другие маркеры биологических жидкостей, такие как циркулирующие маркеры крови, сыворотки или плазмы, в частности те, которые указаны в приведенной ниже таблице.______________________________________In specific embodiments of the present invention, to diagnose NAFLD, NASH, or liver fibrosis and/or to determine disease activity, stage of fibrosis in a subject, and/or to assess the effectiveness of drug treatment, and/or to determine the evolution (progression or regression) of pathology in a subject with NAFLD, with NASH or liver fibrosis, and/or to classify a subject as a potential non-responder to drug treatment, and/or to predict disease outcome for a subject, miR-193 measurement can be introduced into mathematical models (algorithms) to be combined with other variables such as sex, age, body mass index, weight, health status, blood pressure, or other body fluid markers such as circulating blood, serum, or plasma markers, such as those listed in the table below.

Функция гепатоцит ов Function of hepatocytes Жировая ткань fatty textile Метаболизм Metabolism Окислительн ый стресс/апопто 3 Oxidative stress/apopto 3 Фиброз Fibrosis Воспаление Inflammation ALT AST ALP GGT Г аптоглоб ин Альбумин Билируби н Количеств о тромбоцит ов ALT AST ALP GGT Haptoglobin Albumin Bilirubin n Platelet count Адипонек тин Лептин резистин Adiponec tin Leptin resistin Глюкоза плазмы натощак Инсулин натощак Индекс НОМА Триглицериды Холестерин ливп VLCL-C Аполипопроте ины (ApoAl, АроВ, АроСШ) Fasting plasma glucose Fasting insulin HOMA index Triglycerides Cholesterol livp VLCL-C Apolipoproteins (ApoAl, ApoB, ApoCSH) Малоновый диальдегид TBARS OxLDL CK18-M30 СК18-М65 ферритин YKL-40 (CHI3L1) Malondialdehyde TBARS OxLDL CK18-M30 CK18-M65 ferritin YKL-40 (CHI3L1) Фибронектин Г иалуроновая кислота Коллаген типа IV PIIINP TIMP-1 Fibronectin Hyaluronic acid Collagen type IV PIIINP TIMP-1 TNFa ILlb, IL6, IL8, IFNg, TGFb hs-CRP MCP1 sCD14 TNFa ILlb, IL6, IL8, IFNg, TGFb hs-CRP MCP1 sCD14

Согласно другому варианту осуществления, способы по настоящему изобретению включают в себя определение уровня других биомаркеров в дополнение к miR-193.According to another embodiment, the methods of the present invention include the determination of the level of other biomarkers in addition to miR-193.

В конкретном варианте осуществления такие биомаркеры выбирают из группы, состоящей из альфа-2-макроглобулина (A2M), гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина, N-концевого пропептида коллагена типа III (PIIINP) и YKL-40.In a specific embodiment, such biomarkers are selected from the group consisting of alpha-2 macroglobulin (A2M), glycated hemoglobin (HbA1c), fasting glucose or fructosamine levels, N-terminal type III collagen propeptide (PIIINP), and YKL-40.

В дополнительном конкретном варианте осуществления такие биомаркеры выбирают из группы, состоящей из TIMP-1, YKL-40, количества тромбоцитов, метаболического синдрома, гиалуроновой кислоты и HbA1c.In a further specific embodiment, such biomarkers are selected from the group consisting of TIMP-1, YKL-40, platelet count, metabolic syndrome, hyaluronic acid, and HbA1c.

В другом дополнительном конкретном варианте осуществления такие биомаркеры выбирают из группы, состоящей из TIMP-1, YKL-40, количества тромбоцитов и метаболического синдрома.In another additional specific embodiment, such biomarkers are selected from the group consisting of TIMP-1, YKL-40, platelet count, and metabolic syndrome.

В другом конкретном варианте осуществления такие биомаркеры выбирают из группы, состоящей из TIMP-1, YKL-40, количества тромбоцитов, гиалуроновой кислоты и HbA1c.In another specific embodiment, such biomarkers are selected from the group consisting of TIMP-1, YKL-40, platelet count, hyaluronic acid, and HbA1c.

В более конкретном варианте осуществления таким биомаркером является YKL-40, TIMP-1, PIIINP, HbA1c, количество тромбоцитов или A2M.In a more specific embodiment, such a biomarker is YKL-40, TIMP-1, PIIINP, HbA1c, platelet count, or A2M.

В другом варианте осуществления такие биомаркеры представляют собой маркеры NAFLD, NASH или фиброза печени, такие как степень стеатоза, некровоспаления и фиброза, оцененные с помощью магнитно-резонансной визуализации (MRI), магнитно-резонансной эластографии (MRE), магнитнорезонансной спектроскопии (MRS), измерения контролируемого параметра затухания (CAP) и жесткости печени методом транзиентной эластографии (TE), ультразвукового исследования (USG), FibroScan, точечной поперечно-волновой эластографии (pSWE), 2D эластографии со сдвиговыми волнами (2D-SWE), однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), бесклеточных ДНК, бесклеточной некодирующей РНК и по- 18 043299 лиморфизмов генов (такие как PNPLA3 и TM6SF2).In another embodiment, such biomarkers are markers of NAFLD, NASH, or liver fibrosis, such as the degree of steatosis, non-inflammation, and fibrosis, as assessed by magnetic resonance imaging (MRI), magnetic resonance elastography (MRE), magnetic resonance spectroscopy (MRS), measurements of controlled attenuation parameter (CAP) and liver stiffness by transient elastography (TE), ultrasound (USG), FibroScan, point transverse wave elastography (pSWE), 2D shear wave elastography (2D-SWE), single nucleotide polymorphisms (SNP) , cell-free DNA, cell-free non-coding RNA, and polymorphisms of genes (such as PNPLA3 and TM6SF2).

В конкретном варианте осуществления такие биомаркеры представляют собой маркеры NAFLD, такие как маркеры, связанные с индексом жира в печени, маркеры, связанные с индексом стеатоза печени, маркеры, связанные с баллом жира в печени NAFLD, параметры SteatoTest, параметры балла по шкале NAFLD, циркулирующие триглицериды, индекс массы тела (BMI); биомаркеры визуализации, такие как степень рассеяния луча на ткани (USG), степень ослабления ультразвука печеночным жиром (CAP), доля жира, взвешенная по протонной плотности (MRI-PDFF), содержание триглицеридов в печени, доля жира, оцененная по сигналу (MRS).In a specific embodiment, such biomarkers are NAFLD markers, such as markers associated with liver fat index, markers associated with liver steatosis index, markers associated with NAFLD liver fat score, SteatoTest parameters, NAFLD score parameters, circulating triglycerides, body mass index (BMI); imaging biomarkers such as degree of beam scatter on tissue (USG), degree of ultrasound attenuation by liver fat (CAP), proportion of fat weighted by proton density (MRI-PDFF), content of triglycerides in the liver, proportion of fat estimated by signal (MRS) .

В конкретном варианте осуществления такие биомаркеры представляют собой биохимические маркеры крови NASH, такие как маркеры апоптоза (фрагмент CK18, общий цитокератин, сывороточный уровень апоптоз-опосредующего поверхностного антигена FAS), маркеры воспаления (C-реактивный белок (CRP), TNF, IL-8, хемокиновый лиганд CXC 10 (CXCL10)), продукты окисления липидов (11гидроксиэйкозатетраеновая кислота (HETE), 9-гидроксидекадиеновая кислота (HODE), 13-HODE, 13оксооктадекадиеновая кислота (ODE), LA-13-HODE (балл oxNASH), 11,12-дигидрокси-эйкозатриеновая кислота (diHETrE)), адипоцитокины и гормоны (адипонектин, лептин, резистин, висфатин, связывающий ретинол белок (RBP) 4, связывающий жирные кислоты белок (FABP) 4, фактор роста фибробластов (FGF21), лизосомальные ферменты (катепсин D) и/или комбинированные панели (тест NASH, диагностическая панель NASH); биомаркеры визуализации, такие как функция поглощения клеток Купфера (MRI), усиление функции печени при использовании гадоксетовой кислоты (MRI), метаболизм мембран гепатоцитов и внутриклеточная АТФ (MRS), жесткость печени (MRE).In a specific embodiment, such biomarkers are NASH blood biochemical markers, such as markers of apoptosis (CK18 fragment, total cytokeratin, serum level of apoptosis-mediated surface antigen FAS), markers of inflammation (C-reactive protein (CRP), TNF, IL-8 , chemokine ligand CXC 10 (CXCL10)), lipid oxidation products (11hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), 9-hydroxydecadienoic acid (HODE), 13-HODE, 13oxooctadecadienoic acid (ODE), LA-13-HODE (oxNASH score), 11, 12-dihydroxy-eicosatrienoic acid (diHETrE)), adipocytokines and hormones (adiponectin, leptin, resistin, visfatin, retinol binding protein (RBP) 4, fatty acid binding protein (FABP) 4, fibroblast growth factor (F21), lysosomal enzymes ( cathepsin D) and/or combination panels (NASH test, NASH diagnostic panel); imaging biomarkers such as Kupffer cell uptake function (MRI), enhancement of liver function with gadoxetic acid (MRI), hepatocyte membrane metabolism and intracellular ATP (MRS) , liver stiffness (MRE).

В конкретном варианте осуществления такие биомаркеры представляют собой маркеры фиброза печени: биомаркеры визуализации, такие как механически индуцированный импульс, количественное измерение скорости поперечной волны (FibroScan-транзиентная эластография, pSWE-ARFI, 2D-3DSWE), метод ультразвуковой лучевой импульсной визуализации при смерти (pSWE-ARFI), применение модифицированного фазово-контрастного метода для визуализации распространения поперечной волны в паренхиме печени (MRE); биохимические маркеры крови, такие как соотношение AST:ALT, индекс соотношения AST:тромбоциты (APRI), параметры индекса FIB4, параметры оценки фиброза NAFLD, параметры оценки BARD, специфичные маркеры фиброза, такие как HA, PIIINP, Pro-C3, TIMP-1, ламинин, ELF-связанные панели, параметры фибротеста, параметры фиброметра NAFLD.In a specific embodiment, such biomarkers are liver fibrosis markers: imaging biomarkers such as mechanically induced pulse, quantitative measurement of shear wave velocity (FibroScan-transient elastography, pSWE-ARFI, 2D-3DSWE), ultrasonic beam pulsed death imaging (pSWE -ARFI), the use of a modified phase-contrast method to visualize the propagation of a transverse wave in the liver parenchyma (MRE); blood biochemical markers such as AST:ALT ratio, AST:platelet ratio index (APRI), FIB4 index parameters, NAFLD fibrosis score parameters, BARD score parameters, specific fibrosis markers such as HA, PIIINP, Pro-C3, TIMP-1 , laminin, ELF-bonded panels, fiber test parameters, NAFLD fibrometer parameters.

В другом дополнительном варианте осуществления такими маркерами являются маркеры риска и тяжести NAFLD, такие как генетические и геномные маркеры, такие как SNP (rs738409 в PNPLA3), бесклеточные некодирующие РНК (miR-122, miR-1290, miR-192 и miR-7b), составная панель полученных из сыворотки омиксных данных, таких как rs738409, и протеомных данных, включая ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 и SERPINC1, SNP в нескольких локусах (PNPLA3, SOD2, KLF6 и LPIN1), miR-122, составная панель, включающая miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, бесклеточная ДНК, такая как циркулирующая метилированная PPARG.In another additional embodiment, such markers are NAFLD risk and severity markers such as genetic and genomic markers such as SNPs (rs738409 in PNPLA3), cell free non-coding RNAs (miR-122, miR-1290, miR-192 and miR-7b) , a composite panel of serum derived omics data such as rs738409 and proteomic data including ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 and SERPINC1, SNPs at multiple loci (PNPLA3, SOD2, KLF6 and LPIN1), miR- 122, composite panel including miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, cell-free DNA such as circulating methylated PPARG.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления другие биомаркеры представляют собой другие циркулирующие микроРНК, в дополнение к miR-193. В частности, иллюстративные дополнительные микроРНК, которые могут быть полезными при практическом применении настоящего изобретения, включают: miR-34a, miR-122 и miR-200.According to a further embodiment, the other biomarkers are other circulating miRNAs in addition to miR-193. In particular, illustrative additional microRNAs that may be useful in the practice of the present invention include: miR-34a, miR-122, and miR-200.

Согласно этим вариантам осуществления способы могут включать в себя этапы:According to these embodiments, the methods may include the steps of:

i) измерения уровня miR-193 и по меньшей мере одного другого циркулирующего маркера повреждения печени (такого как циркулирующий в крови, сыворотке или плазме маркер повреждения печени), и ii) объединения этих измерений для генерации математических моделей (алгоритмов) с помощью биоинформатических подходов (например, линейная логистическая регрессия или случайный лес) с целью получения показателя NAFLD, NASH и/или фиброза печени с высокими диагностическими/мониторинговыми/прогностическими/ предсказательными показателями для оценки NALFD, NASH, активного NASH или фиброза печени у субъекта.i) measuring the level of miR-193 and at least one other circulating marker of liver injury (such as a circulating marker of liver injury in blood, serum, or plasma), and ii) combining these measurements to generate mathematical models (algorithms) using bioinformatics approaches ( for example, linear logistic regression or random forest) to obtain a score of NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis with high diagnostic/monitoring/prognostic/predictive scores for assessing NALFD, NASH, active NASH, or liver fibrosis in a subject.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению включает в себя этапы:In a particular embodiment, the method of the invention includes the steps of:

измерения уровня hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, hsa-miR-193b-3p или hsa-miR-193b-5p, или hsa-miR-193a, более конкретно, hsa-miR-193a-5p или hsa-miR-193a-3p; и измерение уровня по меньшей мере одного другого маркера, предпочтительно, всех, выбранного из группы, состоящей из:hsa-miR-193 level measurements, in particular hsa-miR-193b, more specifically hsa-miR-193b-3p or hsa-miR-193b-5p, or hsa-miR-193a, more specifically hsa-miR- 193a-5p or hsa-miR-193a-3p; and measuring the level of at least one other marker, preferably all, selected from the group consisting of:

тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP-1);tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1);

YKL-40;YKL-40;

количества тромбоцитов;platelet count;

метаболического синдрома (ms).metabolic syndrome (ms).

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению включает в себя этапы:In a particular embodiment, the method of the invention includes the steps of:

измерения уровня hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, hsa-miR-193b-3p или hsa-miR-193b-5p, или hsa-miR-193a, более конкретно, hsa-miR-193a-5p или hsa-miR-193a-3p; и измерения уровня по меньшей мере одного другого маркера, предпочтительно всего, выбранного из группы, состоящей из:hsa-miR-193 level measurements, in particular hsa-miR-193b, more specifically hsa-miR-193b-3p or hsa-miR-193b-5p, or hsa-miR-193a, more specifically hsa-miR- 193a-5p or hsa-miR-193a-3p; and measuring the level of at least one other marker, preferably all selected from the group consisting of:

- 19 043299 тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP-1);- 19 043299 tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1);

YKL-40;YKL-40;

количества тромбоцитов;platelet count;

и определения, имеет ли субъект метаболический синдром.and determining whether the subject has metabolic syndrome.

Диагностика метаболического синдрома может быть выполнена в соответствии с критериями, изложенными в Kotronen и соавт., Gastroenterology 2009, 137: 865-872.The diagnosis of the metabolic syndrome can be made according to the criteria set out in Kotronen et al., Gastroenterology 2009, 137: 865-872.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению включает в себя измерение уровня следующих маркеров:In a specific embodiment, the method of the invention includes measuring the levels of the following markers:

уровень miR-193b (в частности, miR-193b-3p); и уровень TIMP-1; и уровень YKL-40; и количество тромбоцитов; и метаболический синдром.miR-193b level (in particular, miR-193b-3p); and TIMP-1 level; and YKL-40 level; and platelet count and metabolic syndrome.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению можно применять для вычисления балла, или балла NASH, по уровням биомаркеров, уровни которых были измерены.In a specific embodiment, the method of the invention can be used to calculate a score, or NASH score, from levels of biomarkers that have been measured.

В конкретном варианте осуществления балл S1 NASH определяют как логистическую функцию:In a particular embodiment, the S1 NASH score is defined as a logistic function:

гдеWhere

Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, при этомY=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, while

S1 представляет собой балл NASH согласно настоящему изобретению;S1 is the NASH score according to the present invention;

A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копий.мкл^-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl ^-1 ;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l;

F представляет собой метаболический синдром;F is metabolic syndrome;

k представляет собой константу логистической функции;k is a logistic function constant;

а представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p;

b представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b is the coefficient associated with the level of TIMP-1;

c представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c is the coefficient associated with the level of YKL-40;

d представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов;d is a coefficient related to platelet count;

f представляет собой коэффициент, связанный с метаболическим синдромом.f is a coefficient associated with metabolic syndrome.

В конкретном варианте осуществления метаболический синдром определяют как имеющий значение 1, если у субъекта имеется метаболический синдром, или 0, если у субъекта нет метаболического синдрома. В этом конкретном варианте осуществления коэффициент f применяется к значению 1, когда у пациента имеется метаболический синдром.In a specific embodiment, the metabolic syndrome is defined as having a value of 1 if the subject has the metabolic syndrome, or 0 if the subject does not have the metabolic syndrome. In this particular embodiment, the factor f is applied to a value of 1 when the patient has a metabolic syndrome.

Таким образом, балл NASH представляет собой вероятность наличия активности NASH от умеренной до высокой, или тяжелого NASH.Thus, the NASH score represents the probability of having moderate to high NASH activity, or severe NASH.

Если S1 больше или равно пороговому значению, субъекта классифицируют как имеющего NASH, или как имеющего, или потенциально имеющего балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов > 1, балл по лобулярному воспалению > 1, NAS > 4 и стадию фиброза > 2, и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH, или потенциально подлежащего лечению NASH, или классифицируют как подлежащего лечению NASH и/или как получателя рекомендаций по диете и/или образу жизни. Согласно конкретному варианту осуществления, если S1 ниже порогового значения, субъект может быть классифицирован как подлежащий лечению или не подлежащий лечению, в частности, не подлежащий лечению, и/или субъекта классифицируют как получателя или потенциального получателя рекомендаций по диете и/или по образу жизни для контроля его/ее NASH с низкой активностью или умеренного NASH.If S1 is greater than or equal to the threshold, the subject is classified as having NASH, or as having or potentially having a steatosis score > 1, a hepatocyte ballooning score > 1, a lobular inflammation score > 1, a NAS > 4, and a fibrosis stage > 2, and/or classified as being treated for NASH or potentially being treated for NASH, or being classified as being treated for NASH and/or receiving dietary and/or lifestyle advice. In a specific embodiment, if S1 is below a threshold value, the subject may be classified as treatable or not treatable, in particular not treatable, and/or the subject is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle advice for control his/her NASH with low activity or moderate NASH.

В другом конкретном варианте осуществления, полученном из модели бутстреппинга, как описано в экспериментальной части настоящего изобретения:In another specific embodiment, derived from the bootstrap model as described in the experimental part of the present invention:

k представляет собой число от -8,39 до -2,67, а представляет собой число от 0,58 до 2,50 b представляет собой число от 2,29E-03 до 1,87E-02, c представляет собой число в диапазоне от 2,14E-06 до 1,65E-05, d представляет собой число в диапазоне от -1,56E-02 до -1,05E-03, f представляет собой число в диапазоне от 0,03 до 1,63, и при этом пороговое значение составляет от 0,3050 до 0,6518 и, более конкретно, равно 0,3993±10%, в частности, равно 0,3993.k is a number from -8.39 to -2.67, a is a number from 0.58 to 2.50 b is a number from 2.29E-03 to 1.87E-02, c is a number in the range 2.14E-06 to 1.65E-05, d is a number in the range of -1.56E-02 to -1.05E-03, f is a number in the range of 0.03 to 1.63, and wherein the threshold value is from 0.3050 to 0.6518, and more specifically, it is 0.3993±10%, in particular, it is 0.3993.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH или как имеющего, или потенциально имеющего, балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифици- 20 043299 руют как получателя или потенциального получателя лечения, если балл S1 для NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,3050 до 0,6518, и, в частности, равному 0,3993±10%, в частности, равному 0,3993.In accordance with a particular embodiment, the subject is classified as having NASH or as having, or potentially having, a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2, and/ or classified as a recipient or potential recipient of treatment if the S1 score for NASH is greater than or equal to a threshold value between 0.3050 and 0.6518, and in particular equal to 0.3993±10%, in particular, equal to 0.3993.

В конкретном варианте осуществления, также выведенном из модели бутстреппинга:In a specific embodiment, also derived from the bootstrapping model:

k равно -5,53;k is -5.53;

a равно 1,54;a is 1.54;

b равно 0,0105;b is equal to 0.0105;

c равно 0,00000934;c is 0.00000934;

d равно -0,00832;d is -0.00832;

f равно 0,83; и и при этом пороговое значение составляет от 0,3050 до 0,6518, и, более конкретно, равно 0,3993±10%, в частности, равно 0,3993.f is 0.83; and wherein the threshold value is from 0.3050 to 0.6518, and more specifically, is 0.3993±10%, in particular, is 0.3993.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH или имеющего, или потенциально имеющего, балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов > 1, балл по лобулярному воспалению > 1, NAS > 4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как получателя или потенциального получателя лечения, если показатель S1 NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,3050 до 0,6518, и, в частности, равному 0,3993±10%, в частности, равному 0,3993.In accordance with a specific embodiment, the subject is classified as having NASH or having, or potentially having, a steatosis score > 1, a hepatocyte ballooning score > 1, a lobular inflammation score > 1, a NAS > 4, and a fibrosis stage >2, and/or be classified as a recipient or potential recipient of treatment if the S1 NASH score is greater than or equal to a threshold value between 0.3050 and 0.6518, and in particular equal to 0.3993±10%, in particular equal to 0.3993.

Согласно этому конкретному варианту AUC составляет, по меньшей мере, 0,80.According to this particular embodiment, the AUC is at least 0.80.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению включает в себя этапы:In a particular embodiment, the method of the invention includes the steps of:

измерения уровня hsa-miR-193, в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, hsa-miR-193b-3p или hsa-miR-193b-5p, или hsa-miR-193a, более конкретно, hsa-miR-193a-5p или hsa-miR-193a-3p; и измерения уровня по меньшей мере одного другого маркера, предпочтительно, всех, выбранного из группы, состоящей из:hsa-miR-193 level measurements, in particular hsa-miR-193b, more specifically hsa-miR-193b-3p or hsa-miR-193b-5p, or hsa-miR-193a, more specifically hsa-miR- 193a-5p or hsa-miR-193a-3p; and measuring the level of at least one other marker, preferably all, selected from the group consisting of:

YKL-40;YKL-40;

тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP-1);tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1);

гиалуроновой кислоты (HYUA2);hyaluronic acid (HYUA2);

HbA1c; и количества тромбоцитов.HbA1c; and platelet count.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению включает в себя измерение уровня следующих маркеров:In a specific embodiment, the method of the invention includes measuring the levels of the following markers:

уровень miR-193b (в частности, miR-193b-3p); и уровень YKL-40; и уровень TIMP-1; и гиалуроновая кислота (HYUA2);miR-193b level (in particular, miR-193b-3p); and YKL-40 level; and TIMP-1 level; and hyaluronic acid (HYUA2);

HbA1c; и количество тромбоцитов.HbA1c; and platelet count.

В конкретном варианте осуществления балл S2 по шкале NASH определяют как логистическую функцию:In a specific embodiment, the S2 score on the NASH scale is defined as a logistic function:

гдеWhere

Y2=l+a2*A+c2*C+b2*B+e*E+g*G+d2*D, при этомY2=l+a2*A+c2*C+b2*B+e*E+g*G+d2*D, while

S2 представляет собой балл NASH согласно настоящему изобретению;S2 is the NASH score according to the present invention;

A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копий.мкл^-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl ^-1 ;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

E представляет собой уровень HbA1c в процентах;E is the HbA1c level in percent;

G представляет собой уровень гиалуроновой кислоты в нг/мл;G is the level of hyaluronic acid in ng/ml;

D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l;

l представляет собой константу логистической функции;l is a constant of the logistic function;

a2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a2 is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p;

c2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c2 is the coefficient associated with the level of YKL-40;

b2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b2 is the coefficient associated with the level of TIMP-1;

e представляет собой коэффициент, связанный с уровнем HbA1c;e is the coefficient associated with the level of HbA1c;

g представляет собой коэффициент, связанный с уровнем гиалуроновой кислоты;g is a coefficient related to the level of hyaluronic acid;

d2 представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов.d2 is a coefficient related to platelet count.

Таким образом, балл S2 NASH представляет собой вероятность наличия активности NASH от умеренной до высокой, или тяжелого NASH.Thus, the S2 NASH score represents the probability of having moderate to high NASH activity, or severe NASH.

Если S2 больше или равен пороговому значению, субъекта классифицируют как имеющего NASH,If S2 is greater than or equal to the threshold, the subject is classified as having NASH,

- 21 043299 или имеющего или потенциально имеющего балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов > 1, балл по лобулярному воспалению > 1, NAS > 4 и стадию фиброза > 2, и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH, или потенциально подлежащего лечению NASH, или классифицируют как подлежащего лечению NASH и/или получателя рекомендаций по диете и/или образу жизни. Согласно конкретному варианту осуществления, если S2 ниже порогового значения, субъект может быть классифицирован как подлежащий лечению или не подлежащий лечению, в частности, не подлежащий лечению, и/или субъекта классифицируют как получателя или потенциального получателя рекомендаций по диете и/или образу жизни для контроля его/ее NASH с низкой активностью или умеренного NASH.- 21 043299 or having or potentially having steatosis score > 1, hepatocyte ballooning score > 1, lobular inflammation score > 1, NAS > 4, and fibrosis stage > 2, and/or classified as treatable NASH, or potentially treatable NASH or is classified as being treated for NASH and/or receiving dietary and/or lifestyle advice. In a specific embodiment, if S2 is below a threshold value, the subject may be classified as treatable or not treatable, in particular not treatable, and/or the subject is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle advice for monitoring. his/her NASH with low activity or moderate NASH.

В другом конкретном варианте осуществления, полученном из модели бутстреппинга, как описано в экспериментальной части настоящего изобретения:In another specific embodiment, derived from the bootstrap model as described in the experimental part of the present invention:

l представляет собой число в диапазоне от -10,92 до -3,89, a2 представляет собой число в диапазоне от 0,44 до 2,17, c2 представляет собой число в диапазоне от 0,0035 до 0,02, b2 представляет собой число в диапазоне от 0,0016 до 0,018, e представляет собой число в диапазоне от -0,0053 до 0,0057, g представляет собой число в диапазоне от 0,13 до 1,08, d2 представляет собой число в диапазоне от -0,017 до -0,0027, и при этом пороговое значение составляет от 0,2461 до 0,6252 и, в частности, равно 0,4216±10%, в частности равно 0,4216.l is a number in the range of -10.92 to -3.89, a2 is a number in the range of 0.44 to 2.17, c2 is a number in the range of 0.0035 to 0.02, b2 is a number in the range of 0.0016 to 0.018, e is a number in the range of -0.0053 to 0.0057, g is a number in the range of 0.13 to 1.08, d2 is a number in the range of -0.017 to -0.0027, wherein the threshold value is from 0.2461 to 0.6252, and in particular is 0.4216±10%, in particular is 0.4216.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH, или имеющего или потенциально имеющего балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов > 1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как получателя или потенциального получателя лечения, если балл S2 NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,2461 до 0,6252, и, в частности, равному 0,4216±10%, в частности равному 0,4216.In accordance with a specific embodiment, the subject is classified as having NASH, or having or potentially having a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2, and/or is classified as a recipient or potential recipient of treatment if the S2 NASH score is greater than or equal to the cut-off value between 0.2461 and 0.6252, and in particular equal to 0.4216±10%, in particular equal to 0.4216.

В конкретном варианте осуществления, также выведенном из модели бутстреппинга:In a specific embodiment, also derived from the bootstrapping model:

l равно -7,52;l is -7.52;

a2 равно 1,29;a2 is 1.29;

c2 равно 0,01;c2 is 0.01;

b2 равно 0,0092;b2 is 0.0092;

e равно -0,0024;e is -0.0024;

g равно 0,59;g is 0.59;

d2 равно -0,009; и и при этом пороговое значение составляет от 0,2461 до 0,6252 и, в частности, равно 0,4216±10%, в частности, равно 0,4216.d2 is -0.009; and while the threshold value is from 0.2461 to 0.6252 and, in particular, is equal to 0.4216±10%, in particular, is equal to 0.4216.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH, или имеющего или потенциально имеющего балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как получателя или потенциального получателя лечения, если балл S2 NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,2461 до 0,6252, и, в частности, равен 0,4216±10%, в частности, равен 0,4216.In accordance with a specific embodiment, the subject is classified as having NASH, or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >2, and/or classified as a recipient or potential recipient of treatment if the NASH S2 score is greater than or equal to the cut-off value between 0.2461 and 0.6252, and in particular 0.4216±10%, in particular 0.4216.

Согласно этому конкретному варианту AUC составляет, по меньшей мере, 0,80.According to this particular embodiment, the AUC is at least 0.80.

В конкретном варианте осуществления балл S3 NASH определяют как логистическую функцию:In a particular embodiment, the S3 NASH score is defined as a logistic function:

S3 - ——гт l + e^V3 гдеS3 - ——rm l + e ^V3 where

Y3=m+a3*A+c3*C+b3*B+e2*E+g2*G+d3*D, при этомY3=m+a3*A+c3*C+b3*B+e2*E+g2*G+d3*D, while

S3 представляет собой балл NASH согласно настоящему изобретению;S3 is the NASH score according to the present invention;

A' представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в Cq;A' represents the level of hsa-miR-193b-3p in Cq;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

E представляет собой уровень HbA1c в процентах;E is the HbA1c level in percent;

G представляет собой уровень гиалуроновой кислоты в нг/мл;G is the level of hyaluronic acid in ng/ml;

D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l;

m представляет собой константу логистической функции;m is a constant of the logistic function;

a3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a3 is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p;

c3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c3 is the coefficient associated with the level of YKL-40;

b3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b3 is the coefficient associated with the level of TIMP-1;

e2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем HbA1c;e2 is the coefficient associated with the level of HbA1c;

g2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем гиалуроновой кислоты;g2 is the coefficient associated with the level of hyaluronic acid;

- 22 043299 d3 представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов.- 22 043299 d3 is the coefficient associated with the number of platelets.

Таким образом, балл S3 NASH представляет собой вероятность наличия умеренной или высокой активности NASH, или тяжелого NASH.Thus, the S3 NASH score represents the probability of having moderate or high NASH activity, or severe NASH.

Если S3 больше или равно пороговому значению, субъекта классифицируют как имеющего NASH, или имеющего или потенциально имеющего балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH, или потенциально подлежащего лечению NASH, или классифицируют как подлежащего лечению NASH и/или получателя рекомендаций по диете и/или образу жизни. Согласно конкретному варианту осуществления, если S3 ниже порогового значения, субъект может быть классифицирован как подлежащий лечению или не подлежащий лечению, в частности, не подлежащий лечению, и/или субъекта классифицируют как получателя или потенциального получателя рекомендаций по диете и/или образу жизни для контроля его/ее NASH с низкой активностью или умеренного NASH.If S3 is greater than or equal to the threshold, the subject is classified as having NASH, or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >2, and/ or classified as being treated for NASH, or potentially being treated for NASH, or being classified as being treated for NASH and/or receiving dietary and/or lifestyle advice. In a specific embodiment, if S3 is below a threshold value, the subject may be classified as treatable or not treatable, in particular not treatable, and/or the subject is classified as a recipient or potential recipient of dietary and/or lifestyle advice for monitoring. his/her NASH with low activity or moderate NASH.

В другом конкретном варианте осуществления, выведенном из модели бутстреппинга, как описано в экспериментальной части настоящего изобретения:In another specific embodiment, derived from the bootstrapping model as described in the experimental part of the present invention:

m представляет собой число в диапазоне от -1,27 до 17,54, a3 представляет собой число в диапазоне от -0,64 до -0,09, c3 представляет собой число в диапазоне от 0,005 до 0,019, b3 представляет собой число в диапазоне от 0,001 до 0,016, e2 представляет собой число в диапазоне от -0,0054 до 0,0045, g2 представляет собой число в диапазоне от 0,12 до 1,08, d3 представляет собой число в диапазоне от -0,0164 до -0,0016, и при этом пороговое значение составляет от 0,2270 до 0,6364 и, в частности, равно 0,3741±10%, в частности равно 0,3741.m is a number in the range of -1.27 to 17.54, a3 is a number in the range of -0.64 to -0.09, c3 is a number in the range of 0.005 to 0.019, b3 is a number in the range 0.001 to 0.016, e2 is a number in the range -0.0054 to 0.0045, g2 is a number in the range 0.12 to 1.08, d3 is a number in the range -0.0164 to -0 .0016, wherein the threshold value is between 0.2270 and 0.6364, and in particular is 0.3741±10%, in particular is 0.3741.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH, или имеющего или потенциально имеющего балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как получателя или потенциального получателя лечения, если балл S3 NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,2270 до 0,6364, и, в частности, равному 0,3741±10%, в частности равному 0,3741.In accordance with a specific embodiment, the subject is classified as having NASH, or having or potentially having a steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS >4, and fibrosis stage >2, and/or classified as a recipient or potential recipient of treatment if the S3 NASH score is greater than or equal to the cut-off value between 0.2270 and 0.6364, and in particular equal to 0.3741±10%, in particular equal to 0.3741.

В конкретном варианте осуществления, также выведенном из модели бутстреппинга:In a specific embodiment, also derived from the bootstrapping model:

m равно 8,08;m is 8.08;

a3 равно -0,38;a3 is -0.38;

c3 равно 0,01;c3 is 0.01;

b3 равно 0,01;b3 is 0.01;

e2 равно -0,0024;e2 is -0.0024;

g2 равно 0,57;g2 is 0.57;

d3 равно -0,0090; и и при этом пороговое значение составляет от 0,2270 до 0,6364 и, в частности, равно 0,3741±10%, в частности, равно 0,3741.d3 is -0.0090; and while the threshold value is from 0.2270 to 0.6364 and, in particular, is equal to 0.3741±10%, in particular, is equal to 0.3741.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления субъекта классифицируют как имеющего NASH или имеющего, или потенциально имеющего, балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2, и/или классифицируют как получателя или потенциального получателя лечения, если балл S3 NASH выше или равен пороговому значению, составляющему от 0,2270 до 0,6364, и, в частности, равному 0,3741±10%, в частности равному 0,3741.In accordance with a specific embodiment, the subject is classified as having NASH or having, or potentially having, a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2, and/or classify as a recipient or potential recipient of treatment if the S3 NASH score is greater than or equal to a threshold value of 0.2270 to 0.6364, and in particular equal to 0.3741±10%, in particular equal to 0.3741.

Согласно этому конкретному варианту AUC составляет, по меньшей мере, 0,80.According to this particular embodiment, the AUC is at least 0.80.

В дополнительном конкретном варианте осуществления приведенные выше способы, описанные для вычисления балла NASH, реализованы для образца крови, сыворотки или плазмы, в частности, образца плазмы.In a further specific embodiment, the above methods described for calculating a NASH score are implemented on a blood, serum or plasma sample, in particular a plasma sample.

В другом варианте осуществления диагностику, обнаружение, мониторинг, оценку риска или оценку эффективности лечения NAFLD, NASH или фиброза печени проводят путем определения уровня miR193 в образце биологической жидкости субъекта и направления субъекта на диагностику посредством физических неинвазивных методик, таких как ультразвук, эластография или методики визуализации, такие как MRI.In another embodiment, diagnosing, detecting, monitoring, risk assessing, or evaluating the efficacy of treating NAFLD, NASH, or liver fibrosis is performed by determining the level of miR193 in a subject's body fluid sample and referring the subject for diagnosis through non-invasive physical techniques such as ultrasound, elastography, or imaging techniques. such as MRI.

В других вариантах осуществления способы по настоящему изобретению могут быть объединены со способом, раскрытым в WO 2017046181, принадлежащем тому же заявителю.In other embodiments, the implementation of the methods of the present invention can be combined with the method disclosed in WO 2017046181, belonging to the same applicant.

В некоторых вариантах осуществления, благодаря способам по изобретению, может быть принято решение дать пациенту рекомендации по образу жизни (например, режиму питания или рекомендации по физической активности), предоставить субъекту медицинскую помощь (например, посредством планирования регулярных посещений врача или регулярных осмотров, например, для регулярного мониторинга маркеров повреждения печени) или ввести субъекту по меньшей мере одну терапию NAFLD,In some embodiments, through the methods of the invention, a decision may be made to provide lifestyle advice to the patient (e.g., dietary or physical activity advice), to provide medical care to the subject (e.g., by scheduling regular doctor visits or regular check-ups, e.g., for routine monitoring of markers of liver damage) or to administer to the subject at least one NAFLD therapy,

- 23 043299- 23 043299

NASH или фиброза печени. Такая классификация субъекта как получателя, или TBT, основана на повышенном уровне miR-193 по сравнению с контрольными уровнями miR-193, измеренными у пациентов, не являющихся получателями (NTBT), как указано выше.NASH or liver fibrosis. This classification of a subject as a recipient, or TBT, is based on elevated levels of miR-193 compared to control levels of miR-193 measured in non-recipients (NTBTs) as described above.

Таким образом, изобретение, кроме того, относится к соединению против NAFLD, против NASH или против фиброза для применения в способе лечения NAFLD, NASH или фиброза печени у субъекта, нуждающегося в этом, при этом субъект был идентифицирован посредством способа согласно изобретению.Thus, the invention further provides an anti-NAFLD, anti-NASH, or anti-fibrosis compound for use in a method for treating NAFLD, NASH, or liver fibrosis in a subject in need thereof, the subject having been identified by the method of the invention.

В частности, изобретение относится к соединению против NAFLD для применения в способе лечения NAFLD у субъекта, нуждающегося в этом, при этом субъект был классифицирован как получатель указанного лечения посредством способа согласно изобретению.In particular, the invention relates to an anti-NAFLD compound for use in a method of treating NAFLD in a subject in need thereof, the subject having been classified as a recipient of said treatment by means of the method of the invention.

В частности, изобретение относится к соединению против NASH для применения в способе лечения NASH у субъекта, нуждающегося в этом, при этом субъект был классифицирован как получатель указанного лечения посредством способа согласно изобретению.In particular, the invention relates to an anti-NASH compound for use in a method of treating NASH in a subject in need thereof, the subject having been classified as a recipient of said treatment by the method of the invention.

В частности, изобретение относится к соединению против фиброза для применения в способе лечения фиброза печени у субъекта, нуждающегося в этом, при этом субъект был классифицирован как получатель указанного лечения посредством способа согласно изобретению.In particular, the invention relates to an anti-fibrosis compound for use in a method for treating liver fibrosis in a subject in need thereof, the subject having been classified as a recipient of said treatment by means of the method of the invention.

Иллюстративные соединения против NAFLD, против NASH и против фиброза перечислены ниже. Соединение формулы (I):Exemplary anti-NAFLD, anti-NASH, and anti-fibrosis compounds are listed below. Compound of formula (I):

Rs в которойRs in which

X1 представляет собой галоген, группу R1 или G1-R1;X1 is halo, R1 or G1-R1;

A представляет собой CH=CH или группу CH2-CH2;A represents CH=CH or a CH2-CH2 group;

X2 представляет группу G2-R2;X2 represents the G2-R2 group;

G1 и G2, одинаковые или разные, представляют собой атом кислорода или серы;G1 and G2, identical or different, represent an oxygen or sulfur atom;

R1 представляет собой атом водорода, незамещенную алкильную группу, арильную группу или алкильную группу, которая замещена одним или несколькими атомами галогена, алкокси или алкилтиогруппу, циклоалкильные группы, циклоалкилтиогруппы или гетероциклические группы;R1 represents a hydrogen atom, an unsubstituted alkyl group, an aryl group, or an alkyl group which is substituted by one or more halogen atoms, an alkoxy or alkylthio group, cycloalkyl groups, cycloalkylthio groups, or heterocyclic groups;

R2 представляет собой алкильную группу, замещенную, по меньшей мере, группой -COOR3, где R3 представляет собой атом водорода или алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами или гетероциклическими группами.R2 is an alkyl group substituted with at least a -COOR3 group, where R3 is a hydrogen atom or an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups or heterocyclic groups.

R4 и R5, одинаковые или разные, представляют собой алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами, гетероциклическими группами;R4 and R5, the same or different, represent an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups, heterocyclic groups;

или его фармацевтически приемлемая соль;or a pharmaceutically acceptable salt thereof;

ингибиторы ацетил-КоА-карбоксилазы, такие как GS-0976, ND-654, AC-8632, PF05175157, CP640186, Gemcabene, MK-4074 и PF05175157;acetyl-CoA carboxylase inhibitors such as GS-0976, ND-654, AC-8632, PF05175157, CP640186, Gemcabene, MK-4074 and PF05175157;

агонисты рецептора аденозина A3, такие как 2-(1-гексинил)-N-метиладенозин, пиклиденозон CF101 (IB-MECA), намоденозон CF-102, 2-Cl-IB-MECA, CP-532,903, инозин, LUF-6000 и MRS-3558;adenosine A3 receptor agonists such as 2-(1-hexynyl)-N-methyladenosine, piclidenosone CF101 (IB-MECA), namodenosone CF-102, 2-Cl-IB-MECA, CP-532,903, inosine, LUF-6000 and MRS-3558;

антагонисты альдостерона и антагонисты минералокортикоидных рецепторов, такие как апараренон (MT 3995), амилорид, спиронолактон, эплеренон, канренон и канреноат калия, прогестерон, дроспиренон, гестоден и бенидипин;aldosterone antagonists and mineralocorticoid receptor antagonists such as apararenone (MT 3995), amiloride, spironolactone, eplerenone, canrenone and potassium canrenoate, progesterone, drospirenone, gestodene and benidipine;

AMP-активированные протеинкиназные стимуляторы, такие как PXL-770, MB-11055 Debio-0930B метформин, CNX-012, O-304, кальциевая соль мангиферина, элтромбопаг, каротуксимаб и имеглимин;AMP-activated protein kinase stimulants such as PXL-770, MB-11055 Debio-0930B metformin, CNX-012, O-304, mangiferin calcium, eltrombopag, carotuximab, and imeglimine;

агонисты рецептора амилина и агонисты рецептора кальцитонина включают KBP-042 и KBP-089, но не ограничиваются ими;amylin receptor agonists and calcitonin receptor agonists include, but are not limited to, KBP-042 and KBP-089;

ингибиторы ангиопоэтин-родственного белка-3, такие как ARO-ANG3, IONIS-ANGGPTL3-LRx или AKCEA-ANGPTL3LRx, эвинакумаб и ALN-ANG;angiopoietin-related protein-3 inhibitors such as ARO-ANG3, IONIS-ANGGPTL3-LRx or AKCEA-ANGPTL3LRx, evinacumab and ALN-ANG;

антитела против LPS, такие как IMM-124-E;anti-LPS antibodies such as IMM-124-E;

антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на трансформирующий фактор роста бета 2, включает ASPH-0047, IMC-TR1 и ISTH-0047, но не ограничивается ими;an antisense oligonucleotide targeting transforming growth factor beta 2 includes, but is not limited to, ASPH-0047, IMC-TR1, and ISTH-0047;

ингибиторы апикального натрий-созависимого транспортера желчной кислоты, такие как A-4250, воликсибат, мараликсибат, ранее называвшийся SHP-625, GSK-2330672, элобиксибат и CJ-14199;apical sodium codependent bile acid transporter inhibitors such as A-4250, volixibate, maralixibate formerly SHP-625, GSK-2330672, elobixibate and CJ-14199;

бетаин безводный или PM-003.betaine anhydrous or PM-003.

Желчные кислоты включают в себя обетихоловую кислоту (OCA) и UDCA, норурсодезоксихолевую кислоту и урсодиол.Bile acids include obeticholic acid (OCA) and UDCA, norursodeoxycholic acid, and ursodiol.

Биоактивные липиды, такие как 5-гидроксиэйкозапентаеновая кислота (15-HEPE, DS-102), ненасыщенные жирные кислоты, такие как 25-арахидоновая кислота, икосапентетиловый эфир, эйкозапентановая кислота и докозагексаеновая кислота.Bioactive lipids such as 5-hydroxyeicosapentaenoic acid (15-HEPE, DS-102), unsaturated fatty acids such as 25-arachidonic acid, icosapentetyl ester, eicosapentanoic acid and docosahexaenoic acid.

- 24 043299- 24 043299

Антагонисты каннабиноидного рецептора CB1, такие как GRC-10801, MRI-1569, MRI-1867, DBPR211, AM-6527, AM-6545, NESS-11-SM, CXB-029, GCC-2680, TM-38837, Org- 50189, PF-514273, BMS812204, ZYO-1, AZD-2207, AZD-1175, отенабант, ибипинабант, суринабант; римонабант, дринабант,Cannabinoid CB1 receptor antagonists such as GRC-10801, MRI-1569, MRI-1867, DBPR211, AM-6527, AM-6545, NESS-11-SM, CXB-029, GCC-2680, TM-38837, Org-50189 , PF-514273, BMS812204, ZYO-1, AZD-2207, AZD-1175, otenabant, ibipinabant, surinabant; rimonabant, drinabant,

SLV-326, V-24343 и O-2093.SLV-326, V-24343 and O-2093.

Миметики каннабиноидного рецептора CB2, такие как анабазум (резунаб, JKT-101).Cannabinoid CB2 receptor mimetics such as anabasum (Resunab, JKT-101).

Двойной каннабиноидный рецептор CB1/ингuбитор iNOS.Dual cannabinoid CB1 receptor/iNOS inhibitor.

Ингибиторы каспазы, такие как эмрикасан, белнаказан, нивоказан, IDN-7314, F-573, VX-166, YJP60107, MX-1122, IDN-6734, TLC-144, SB-234470, IDN-1965, VX-799, SDZ-220-976 и L-709049.Caspase inhibitors such as emricasan, belnakasan, nivokasan, IDN-7314, F-573, VX-166, YJP60107, MX-1122, IDN-6734, TLC-144, SB-234470, IDN-1965, VX-799, SDZ -220-976 and L-709049.

Ингибиторы катепсина, такие как VBY-376, VBY-825, VBY-036, VBY-129, VBY-285, Org-219517, LY3000328, RG-7236 и BF/PC-18.Cathepsin inhibitors such as VBY-376, VBY-825, VBY-036, VBY-129, VBY-285, Org-219517, LY3000328, RG-7236 and BF/PC-18.

Антагонисты CCR, такие как ценикривирок (антагонист CCR2/5), PG-092, RAP-310, INCB-10820, RAP-103, PF-04634817 и CCX-872.CCR antagonists such as cenicriviroc (CCR2/5 antagonist), PG-092, RAP-310, INCB-10820, RAP-103, PF-04634817 and CCX-872.

Модуляторы хемокинов CCR3 и ингибиторы лиганда эотаксина 2CCR3 chemokine modulators and eotaxin 2 ligand inhibitors

Ингибиторы диαцилглицерол-O-αцилтрαнсферазы (DGAT), такие как IONIS-DGAT2Rx ранее называвшийся ISIS-DGAT2Rx, ISIS 703802, LY-3202328, BH-03004, KR-69530, OT-13540, AZD-7687, PF039064646 и ABT-046.Diαcylglycerol-O-αcyltransferase (DGAT) inhibitors such as IONIS-DGAT2Rx formerly ISIS-DGAT2Rx, ISIS 703802, LY-3202328, BH-03004, KR-69530, OT-13540, AZD-7687, PF039064646 and A BT-046.

Ингибиторы дипептидилпептидазы IV (DPP4), эвоглиптин, вилдаглиптин, фотаглиптин, алоглиптин, сахаглиптин, тилоглиптин, анаглиптин, ситаглиптин, ретаглиптин, мелоглиптин, госоглиптин, трелаглиптин, тенелиглиптин, утоглиптин, линаглиптин, гемиглиптин, йоглиптин, бетаглиптин, имиглиптин, омариглиптин, вилдаглиптин и денаглиптин.Dipeptidyl peptidase IV (DPP4) inhibitors, evogliptin, vildagliptin, fotagliptin, alogliptin, sahagliptin, tylogliptin, anagliptin, sitagliptin, retagliptin, melogliptin, gosogliptin, trelagliptin, teneligliptin, utogliptin, linagliptin, gemigliptin, yogliptin, betagliptin , imigliptin, omarigliptin, vildagliptin and denagliptin .

Агонисты инсулинового лиганда и рецептора инсулина.Insulin ligand and insulin receptor agonists.

Менсибилизатор инсулина и антагонист рецептора MCH-1.Insulin mensibilizer and MCH-1 receptor antagonist.

Ингибиторы NOX (NADPH-оксидазы), такие как ингибиторы Dual NOX (NADPH-оксидазы) 1 и 4; GKT-831 (2-(2-хлорфенил)-4-[3-(диметиламино)фенил]-5-метил-1H-пирαзоло[4,3-c]пиридин-3,6(2H,5H)дион), ранее называвшийся GKT137831 и GKT-901.NOX (NADPH oxidase) inhibitors such as Dual NOX (NADPH oxidase) inhibitors 1 and 4; GKT-831 (2-(2-chlorophenyl)-4-[3-(dimethylamino)phenyl]-5-methyl-1H-pyrαzolo[4,3-c]pyridine-3,6(2H,5H)dione), formerly called GKT137831 and GKT-901.

Модуляторы белка внеклеточного матрикса, такие как CNX-024, CNX-025 и SB-030.Extracellular matrix protein modulators such as CNX-024, CNX-025 and SB-030.

Ингибиторы синтеза жирных кислот (FAS), такие как TVB-2640; TVB-3664; TVB-3166, TVB-3150, TVB-3199, TVB-3693BZL-101, 2-октадециновая кислота, MDX-2, Fasnall, MT-061, G28UCM, MG-28, HS160, GSK-2194069, KD-023 и цилостазол.Fatty acid synthesis inhibitors (FAS) such as TVB-2640; TVB-3664; TVB-3166, TVB-3150, TVB-3199, TVB-3693BZL-101, 2-octadecic acid, MDX-2, Fasnall, MT-061, G28UCM, MG-28, HS160, GSK-2194069, KD-023 and Cilostazol .

В конкретном варианте осуществления ингибитор FAS представляет собой соединение, выбранное из следующего списка соединений:In a specific embodiment, the FAS inhibitor is a compound selected from the following list of compounds:

- 25 043299- 25 043299

- 26 043299- 26 043299

и TVB-2640. В другом конкретном варианте осуществления ингибитор FAS выбирают из:and TVB-2640. In another specific embodiment, the FAS inhibitor is selected from:

В конкретном варианте осуществления ингибитор FAS представляет собой TVB-2640.In a specific embodiment, the FAS inhibitor is TVB-2640.

жирные кислоты, такие как омега-3 жирные кислоты, омакор или MF4637, рыбий жир, полиненасыщенные жирные кислоты (эфамакс, optiEPA);fatty acids such as omega-3 fatty acids, omacor or MF4637, fish oil, polyunsaturated fatty acids (efamax, optiEPA);

конъюгаты стеароил-КоА-десатуразы-1/жирной кислоты и желчных кислот (FABAC);stearoyl-CoA desaturase-1/fatty acid bile acid conjugates (FABAC);

агонисты фарнезоидного X-рецептора (FXR); обетихоловая кислота, (OCA), GS-9674, LJN-452, EDP-305; AKN-083, INT-767, GNF-5120, LY2562175, INV-33, NTX-023-1, EP-024297, Px-103, SR-45023;farnesoid X receptor (FXR) agonists; obeticholic acid, (OCA), GS-9674, LJN-452, EDP-305; AKN-083, INT-767, GNF-5120, LY2562175, INV-33, NTX-023-1, EP-024297, Px-103, SR-45023;

лиганд рецептора фактора роста фибробластов 19 (FGF-19) или функционально сконструированный вариант FGF-19;fibroblast growth factor 19 receptor ligand (FGF-19) or an operably engineered variant of FGF-19;

рекомбинантные варианты фактора роста фибробластов 19 (FGF-19), такие как NGM-282;recombinant variants of fibroblast growth factor 19 (FGF-19) such as NGM-282;

агонисты фактора роста фибробластов 21 (FGF-21), такие как PEG-FGF21, ранее называвшийсяFibroblast growth factor 21 (FGF-21) agonists such as PEG-FGF21, formerly

- 27 043299- 27 043299

BMS-986036, YH-25348, BMS-986171, YH-25723, LY-3025876 и NNC-0194-0499;BMS-986036, YH-25348, BMS-986171, YH-25723, LY-3025876 and NNC-0194-0499;

ингибиторы галектина 3, такие как GR-MD-02, TD-139, ANG-4021, галектин-3С, LJPC-201, TFD100, GR-MD-03, GR-MD-04, GM-MD-01, GM-CT-01, GM-CT-02, Gal-100 и Gal-200;galectin 3 inhibitors such as GR-MD-02, TD-139, ANG-4021, galectin-3C, LJPC-201, TFD100, GR-MD-03, GR-MD-04, GM-MD-01, GM- CT-01, GM-CT-02, Gal-100 and Gal-200;

аналоги глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), такие как семаглутид, лираглутид, эксенатид, альбиглютид, дулаглутид, ликсисенатид, локсенатид, эфпегленатид, таспоглютид, MKC-253, DLP-205 и 0RM;glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogs such as semaglutide, liraglutide, exenatide, albiglutide, dulaglutide, lixisenatide, loxenatide, efpeglenatide, taspoglutide, MKC-253, DLP-205 and 0RM;

агонисты рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), такие как LY-3305677 и оксинтомодулин длительного действия;glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists such as LY-3305677 and long acting oxyntomodulin;

модуляторы рецептора, связанного с G-белком (GPCR), такие как CNX-023;G protein-coupled receptor (GPCR) modulators such as CNX-023;

антагонист рецептора 84, связанного с G-белком (антагонист GPR84), ингибитор лиганда фактора роста соединительной ткани и агонист рецептора 1 свободной жирной кислоты (агонист FFAR1), такой как PBI-4050, PBI-4265, PBI-4283 и PBI-4299;a G protein-coupled receptor 84 antagonist (GPR84 antagonist), a connective tissue growth factor ligand inhibitor, and a free fatty acid receptor 1 agonist (FFAR1 agonist) such as PBI-4050, PBI-4265, PBI-4283 and PBI-4299;

гормон роста;a growth hormone;

ингибиторы клеточного сигнального пути Hedgehog, такие как висмодегиб, TAK-441, IPI-926, саридегиб, сонидегиб/эрисмодегиб, BMS-833923/XL139, PF-04449913, таладегиб/LY2940680, ETS-2400, sHr1514 и CUR-1514, CUR-1514, CUR-1514, CUR-1514, и CUR-1514, CUR-1514, ингибиторы натрий-зависимого котранспортера желчной кислоты подвздошной кишки, такие как A-4250, GSK-2330672, volixibat, CJ-14199 и элобиксибат;Hedgehog cell signaling inhibitors such as vismodegib, TAK-441, IPI-926, saridegib, sonidegib/erismodegib, BMS-833923/XL139, PF-04449913, taladegib/LY2940680, ETS-2400, sHr1514 and CUR-1514, CUR- 1514, CUR-1514, CUR-1514, and CUR-1514, CUR-1514 inhibitors of the sodium dependent ileal bile acid cotransporter such as A-4250, GSK-2330672, volixibat, CJ-14199 and elobixibate;

иммуномодуляторы, такие как PBI-4050, PBI-4265, PBI-4283, PBI-4299 и AIC-649;immunomodulators such as PBI-4050, PBI-4265, PBI-4283, PBI-4299 and AIC-649;

сенсибилизатор инсулина и антагонист рецептора MCH, такой как MSDC-0602k, MSDC-0602, CSTI100 и AMRI;an insulin sensitizer and an MCH receptor antagonist such as MSDC-0602k, MSDC-0602, CSTI100 and AMRI;

ингибиторы интегрина; ингибиторы интегрина Pliant Therapeutics, ингибиторы интегрина Indalo Therapeutics, ингибиторы интегрина университета Сент-Луиса, ProAgio и GSK-3008348;integrin inhibitors; Pliant Therapeutics Integrin Inhibitors, Indalo Therapeutics Integrin Inhibitors, Saint Louis University Integrin Inhibitors, ProAgio and GSK-3008348;

ингибиторы кетогексокиназы, такие как JNJ-28165722; JNJ-42065426; JNJ-42152981; JNJ-42740815; JNJ-42740828 и PF-06835919;ketohexokinase inhibitors such as JNJ-28165722; JNJ-42065426; JNJ-42152981; JNJ-42740815; JNJ-42740828 and PF-06835919;

ингибиторы лейкотриена (LT)/фосфодиэстеразы (PDE)/липоксигеназы (LO), такие как типелукаст (ранее называвшийся MN-001), томелукаст, сулукаст, масилукаст, зафирлукаст, пранлукаст, монтелукаст, гемилукаст, верлукаст, аклукаст, побиликаст, циналукаст и иралукаст;leukotriene (LT)/phosphodiesterase (PDE)/lipoxygenase (LO) inhibitors such as tipelukast (formerly called MN-001), tomelukast, sulukast, masilukast, zafirlukast, pranlukast, montelukast, hemilukast, verlukast, aclukast, pobilikast, cinalukast, and iralukast ;

ингибиторы гомолога 2 лизилоксидазы, такие как Раппапорт, InterMune, Pharmaxis, AB-0023, симтузумаб, PXS-5382A и PXS-5338;lysyl oxidase homologue 2 inhibitors such as Rappaport, InterMune, Pharmaxis, AB-0023, simtuzumab, PXS-5382A and PXS-5338;

макролиды, подобные лисолитромицину, азитромицину и эритромицину;macrolides like lysolithromycin, azithromycin and erythromycin;

модуляторы рецепторов маннозы макрофагов, такие как AB-0023, MT-1001, [18F] FB18mHSA, Xemys, технеций Tc 99m тилманоцепт и CDX-1307;macrophage mannose receptor modulators such as AB-0023, MT-1001, [18F]FB18mHSA, Xemys, technetium Tc 99m tilmanocept and CDX-1307;

модулятор метил-CpG-связывающего белка 2 и ингибиторы трансглутаминазы включают, но не ограничиваются указанным, цистеамин, EC цистеамин, энтеросолюбильный битартрат цистеамина, битартрат цистеамина (с энтеросолюбильным покрытием), Bennu, битартрат цистеамина (с энтеросолюбильным покрытием), Raptor, битартрат цистеамина, DR цистеамин, битартрат цистеамина с замедленным высвобождением и энтеросолюбильным покрытием, меркаптамин, меркаптамин (с энтеросолюбильным покрытием), Bennu, меркаптамин (с энтеросолюбильным покрытием), Raptor, RP-103, RP-104, PROCYSBI и меркаптамин (с энтеросолюбильным покрытием);methyl CpG binding protein 2 modulator and transglutaminase inhibitors include, but are not limited to, cysteamine, EC cysteamine, enteric cysteamine bitartrate, cysteamine bitartrate (enteric coated), Bennu, cysteamine bitartrate (enteric coated), Raptor, cysteamine bitartrate, DR cysteamine, sustained-release enteric-coated cysteamine bitartrate, mercaptamine, mercaptamine (enteric-coated), Bennu, mercaptamine (enteric-coated), Raptor, RP-103, RP-104, PROCYSBI, and mercaptamine (enteric-coated);

антагонисты микроРНК, такие как RG-125, ранее называвшийся AZD4076, RGLS-5040, RG-101, MGN-5804 и MRG-201;miRNA antagonists such as RG-125 formerly AZD4076, RGLS-5040, RG-101, MGN-5804 and MRG-201;

стимулятор металлопротеиназы-9 (MMP9), такой как стимулятор MMP9 Elastomic Ab;a metalloproteinase-9 (MMP9) stimulator such as the MMP9 stimulator Elastomic Ab;

ингибитор семейства митохондриальных носителей и ингибитор митохондриального фосфатного белка-носителя включают, но не ограничиваются указанным, TRO-19622, Trophos, олесоксим, RG-6083 или RO-7090919;a mitochondrial carrier family inhibitor and a mitochondrial phosphate carrier protein inhibitor include, but are not limited to, TRO-19622, Trophos, olesoxime, RG-6083, or RO-7090919;

ингибиторы миелопероксидазы включают, но не ограничиваются указанным, PF-06667272;myeloperoxidase inhibitors include, but are not limited to, PF-06667272;

моноклональные антитела, такие как бертилимумам, NGM-313, нацеленные на IL-20 моноколональные антитела, фрезолимумаб (анти-TGFe), ранее называвшийся GC1008, тимолумаб, ранее называвшийся BTT-1023, намацизумаб, омализумаб, ранибизумаб, бевацизумаб, лебрикизумаб, эпратузумаб, фелвизумаб, матузумаб, монализумаб, реслизумаб, форалумаб (NI-0401, анти-CD3), симбезумаб (GS6624), моноклональное антитело против LOXL2, устекинумаб, антитело против TNF, и инебилизумаб;monoclonal antibodies such as bertilimumam, NGM-313, IL-20 targeting monocolonal antibodies, frezolimumab (anti-TGFe), formerly GC1008, thymolumab, formerly BTT-1023, namacizumab, omalizumab, ranibizumab, bevacizumab, lebrikizumab, epratuzumab, felvizumab, matuzumab, monalizumab, reslizumab, foralumab (NI-0401, anti-CD3), simbezumab (GS6624), anti-LOXL2 monoclonal antibody, ustekinumab, anti-TNF antibody, and inebilizumab;

моноклональные антитела, такие как анти-IL20 моноклональных антитела, анти-TGFe антитела, анtu-CD3 антитела, анти-LOXL2 антитела и анти-TNF антитела;monoclonal antibodies such as anti-IL20 monoclonal antibodies, anti-TGFe antibodies, antu-CD3 antibodies, anti-LOXL2 antibodies and anti-TNF antibodies;

NAD-зависимый деацетилазный стимулятор сиртуина; ингибитор PDE 5, такой как NS-0200;NAD-dependent deacetylase sirtuin stimulator; a PDE 5 inhibitor such as NS-0200;

ингибиторы NF-каппа B, такие как LC-280126;NF-kappa B inhibitors such as LC-280126;

никотиновая кислота, такая как ниацин или витамин B3;nicotinic acid such as niacin or vitamin B3;

агонисты никотиновой кислоты (GPR109), такие как ARI-3037MO, MMF, LUF 6283, ацифран, IBC 293, MK-1903, GSK256073, MK-6892, MK-0354, SLx-4090, ломитапид, лексибулин, апабеталон, ацифран, ларопипрант, дапоринад, анацетрапиб, INCB-19602, ST-07-02, ломефлоксацин, ниацин и ларопипрант с контролируемым высвобождением;nicotinic acid agonists (GPR109) such as ARI-3037MO, MMF, LUF 6283, acifran, IBC 293, MK-1903, GSK256073, MK-6892, MK-0354, SLx-4090, lomitapide, lexibulin, apabetalone, acifran, laropiprant , daporinad, anacetrapib, INCB-19602, ST-07-02, lomefloxacin, niacin and controlled release laropiprant;

- 28 043299 нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) включают, но не ограничиваются указанным, F-351, салицилаты (аспирин), ацетаминофен, производные пропионовой кислоты (ибупрофен, напроксен), производные уксусной кислоты (индометацин, диклофенак), производные эноловой кислоты (пироксикам, фенилбутазон), производные антраниловой кислоты (меклофеналминовая кислота, флуфенамовая кислота), селективные ингибиторы COX-2 (целекоксиб, парекоксиб) и сульфонанилиды (нимесулид);- 28 043299 non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) include, but are not limited to, F-351, salicylates (aspirin), acetaminophen, propionic acid derivatives (ibuprofen, naproxen), acetic acid derivatives (indomethacin, diclofenac), enolic acid derivatives (piroxicam , phenylbutazone), anthranilic acid derivatives (meclofenalmic acid, flufenamic acid), selective COX-2 inhibitors (celecoxib, parecoxib) and sulfonanilides (nimesulide);

модуляторы mTOR, такие как MSDC-0602, и генная терапия AAV, вводимая совместно с SVPсиролимусом;mTOR modulators such as MSDC-0602 and AAV gene therapy co-administered with SVPsirolimus;

лиганды ядерного рецептора, такие как DUR-928, ранее называвшийся DV 928;nuclear receptor ligands such as DUR-928, formerly DV 928;

агонисты белка P2Y13, такие как CER-209;P2Y13 protein agonists such as CER-209;

модуляторы PDGFR, такие как BOT-501 и BOT-191;PDGFR modulators such as BOT-501 and BOT-191;

стимуляторы фенилаланин-гидроксилазы, такие как пегвалиаза, сапроптерин, AAV-PAH, CDX6114, сепиаптерин, RMN-168, ALTU-236, ETX-101, HepaStem, ролипрам и альпростадил;phenylalanine hydroxylase stimulants such as pegvalase, sapropterin, AAV-PAH, CDX6114, sepiapterin, RMN-168, ALTU-236, ETX-101, HepaStem, rolipram, and alprostadil;

антагонисты активируемого протеазой рецептора (PAR)-2, такие как PZ-235 и NP-003;protease-activated receptor (PAR)-2 antagonists such as PZ-235 and NP-003;

модуляторы протеинкиназы, такие как CNX-014, MB-11055, ALF-1, мангиферин, амлексанокс, GS444217, REG-101 и валин;protein kinase modulators such as CNX-014, MB-11055, ALF-1, mangiferin, amlexanox, GS444217, REG-101 and valine;

агонисты PPAR-альфа, такие как фенофибрат, ципрофибрат, пемафибрат, гемфиброзил, клофибрат, бинифибрат, клинофибрат, клофибриновая кислота, никофибрат, пирифибрат, плафибрид, ронифибрат, теофибрат, токофибрат и SR10171;PPAR-alpha agonists such as fenofibrate, ciprofibrate, pemafibrate, gemfibrozil, clofibrate, binifibrate, clinofibrate, clofibric acid, nicofibrate, pyrifibrate, plafibride, ronifibrate, theofibrate, tocofibrate and SR10171;

агонисты PPAR-гамма, такие как пиоглитазон, дейтерированный пиоглитазон, росиглитазон, эфатутазон, ATx08-001, OMS-405, CHS-131, THR-0921, SER-150-DN, KDT-501, GED-0507-34-Levo, CLC-3001 и ALL-4;PPAR-gamma agonists such as pioglitazone, deuterated pioglitazone, rosiglitazone, efatutazone, ATx08-001, OMS-405, CHS-131, THR-0921, SER-150-DN, KDT-501, GED-0507-34-Levo, CLC-3001 and ALL-4;

агонисты PPAR-дельта, такие как GW501516 (эндурабол или ({4-[({4-метил-2-[4(трифторметил)фенил]-1,3-тиазол-5-ил}метил)сульфанил]-2-метилфенокси}уксусная кислота)),PPAR delta agonists such as GW501516 (endurabol or ({4-[({4-methyl-2-[4(trifluoromethyl)phenyl]-1,3-thiazol-5-yl}methyl)sulfanyl]-2-methylphenoxy }acetic acid)),

MBX8025 (селаделпар или {2-метил-4-[5-метил-2-(4-трифторметилфенил)-2H-[1,2,3]триазол-4илметилсилфанил]фенокси}-уксусная кислота), GW0742 ([4-[[[2-[3-фтор-4-(трифторметил)фенил]-4метил-5-тиазолил]метил]тио]-2-метилфенокси]уксусная кислота), L165041, HPP-593 и NCP-1046;MBX8025 (celadelpar or {2-methyl-4-[5-methyl-2-(4-trifluoromethylphenyl)-2H-[1,2,3]triazol-4ylmethylsilfanyl]phenoxy}-acetic acid), GW0742 ([4-[ [[2-[3-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-4methyl-5-thiazolyl]methyl]thio]-2-methylphenoxy]acetic acid), L165041, HPP-593 and NCP-1046;

агонисты PPAR-альфа/гамма (также называемые глитазарами), такие как сароглитазар, алеглитазар, мураглитазар, тесаглитазар, DSP-8658;PPAR alpha/gamma agonists (also called glitazars) such as saroglitazar, aleglitazar, muraglitazar, tesaglitazar, DSP-8658;

агонисты PPAR-альфа/дельта, такие как элафибранор и T913659;PPAR alpha/delta agonists such as elafibranor and T913659;

PPAR гамма/дельта-подобная конъюгированная линолевая кислота (CLA), T3D-959;PPAR gamma/delta-like conjugated linoleic acid (CLA), T3D-959;

агонисты PPAR-альфа/гамма/дельта или панагонисты PPAR, такие как IVA337 (ланифибранор), TTA (тетрадецилтиоуксусная кислота), бавахинин, GW4148, GW9135, безафибрат, лобеглитазон и CS038;PPAR alpha/gamma/delta agonists or PPAR panagonists such as IVA337 (lanifibranor), TTA (tetradecylthioacetic acid), bavaquinine, GW4148, GW9135, bezafibrate, lobeglitazone and CS038;

пребиотические волокна, пробиотики;prebiotic fibers, probiotics;

рецепторы прегнана X, такие как рифампицин;pregnane X receptors such as rifampicin;

ингибиторы Rho-ассоциированной протеинкиназы 2 (ROCK2), такие как KD-025, TRX-101, BA1049, LYC-53976, INS-117548 и RKI-1447;Rho-associated protein kinase 2 (ROCK2) inhibitors such as KD-025, TRX-101, BA1049, LYC-53976, INS-117548 and RKI-1447;

ингибиторы регулирующей сигнал киназы 1 (ASK1), такие как GS-4997;signal regulating kinase 1 (ASK1) inhibitors such as GS-4997;

ингибиторы натрий-глюкозного транспорта (SGLT) 1, такие как LX-4212/LX-4211/сотаглифлозин, SAR-439954, LIK-066 (ликоглифозин), LX-2761, GSK-161235, LP-925219, KGA-2727, SAR- 7226, SAR474832, SY-008 и AVX-3030;sodium glucose transport inhibitors (SGLT) 1 such as LX-4212/LX-4211/sotagliflozin, SAR-439954, LIK-066 (lycoglyfosin), LX-2761, GSK-161235, LP-925219, KGA-2727, SAR - 7226, SAR474832, SY-008 and AVX-3030;

ингибиторы натрий-глюкозного транспорта (SGLT) 2, такие как ремоглифлозин, дапаглифлозин, эмпаглифлозин, эртуглифлозин, сотаглифлозин, ипраглифлозин, тианаглифлозин, канаглифлозин, тофоглифлозин, джанаглифлозин, бексаглифлозлифлозин, бексаглифлозлифлозин, HEC-44616, AST-1935 и PLD-101;sodium glucose transport (SGLT) 2 inhibitors such as remogliflozin, dapagliflozin, empagliflozin, ertugliflozin, sotagliflozin, ipragliflozin, tianagliflozin, canagliflozin, tofogliflozin, janagliflozin, bexagliflozliflozin, bexagliflozliflozin, HEC-44616, AST-1935 and PLD -101;

статины, такие как аторвастатин или симвастатин;statins such as atorvastatin or simvastatin;

конъюгаты стеароил-CoA-десатуразы-1/жирной кислоты, такие как арамхол, GRC-9332, стеамхол, TSN-2998, GSK-1940029 и XEN-801;stearoyl-CoA desaturase-1/fatty acid conjugates such as aramchol, GRC-9332, steamchol, TSN-2998, GSK-1940029 and XEN-801;

агонисты рецептора щитовидной железы β (THR β), такие как VK-2809, MGL-3196, MGL-3745, SKL-14763, собетиром, BCT-304, ZYT-1, MB-07811 и эпротиром;thyroid receptor β (THR β) agonists such as VK-2809, MGL-3196, MGL-3745, SKL-14763, sobetirome, BCT-304, ZYT-1, MB-07811 and eprotirom;

антагонисты Toll-подобного рецептора 2 и 4 (TLR-2), такие как CI-201, также известный как VB201;Toll-like receptor 2 and 4 (TLR-2) antagonists such as CI-201, also known as VB201;

антагонисты Toll-подобного рецептора 4 (TLR-4), такие как налтрексон, JKB-121, M-62812, резаторвид, дендрофилин, CS-4771, AyuV-1, AyuV-25, NI-0101, EDA-HPVE7 и эриторан;Toll-like receptor 4 (TLR-4) antagonists such as naltrexone, JKB-121, M-62812, rezatorvid, dendrofilin, CS-4771, AyuV-1, AyuV-25, NI-0101, EDA-HPVE7, and eritoran;

ингибиторы естественных клеток-киллеров типа I, такие как GRI-0621;type I natural killer cell inhibitors such as GRI-0621;

модуляторы рецептора тирозинкиназы (RTK), такие как CNX-025, KBP-7018, нинтеданиб и сорафениб;tyrosine kinase receptor (RTK) modulators such as CNX-025, KBP-7018, nintedanib and sorafenib;

ингибиторы уратного анионита 1 и ингибиторы ксантиноксидазы, такие как лесинурад, RLBN-1001, веринурад, KUX-1151 и лесинурад+аллопуринол;urate anion exchanger 1 inhibitors and xanthine oxidase inhibitors such as lesinurad, RLBN-1001, verinurad, KUX-1151 and lesinurad + allopurinol;

ингибиторы белка васкулярной адгезии-1 (VAP-1), также называемые содержащие аминоксидазу меди 2 (AOC3), такие как BI-1467335, ранее называвшийся PXS-4728A, CP-664511, PRX-167700, ASP8232, RTU-1096, RTU-007 и BTT-1023;vascular adhesion protein-1 (VAP-1) inhibitors, also called containing copper amine oxidase 2 (AOC3), such as BI-1467335, formerly PXS-4728A, CP-664511, PRX-167700, ASP8232, RTU-1096, RTU- 007 and BTT-1023;

- 29 043299 агонисты рецептора витамина D (VDR), такие как кальциферол, альфакальцидол, 1,25дигидроксивитамин D3, витамин D2, витамин D3, кальцитриол, витамин D4, витамин D5, дигидротахистерол, кальципотриол, такальцитол, 1,24-дигидроксивитамин D3 и парикальцитол;- 29 043299 Vitamin D receptor (VDR) agonists such as calciferol, alfacalcidol, 1,25 dihydroxy vitamin D3, vitamin D2, vitamin D3, calcitriol, vitamin D4, vitamin D5, dihydrotachysterol, calcipotriol, tacalcitol, 1,24 dihydroxy vitamin D3 and paricalcitol ;

витамин E и изоформы, витамин E в сочетании с витамином C и аторвастатином.vitamin E and isoforms, vitamin E in combination with vitamin C and atorvastatin.

Другие анти-NASH агенты включают KB-GE-001, и NGM-386, и NGM-395, и NC-10, и TCM-606F. Другие анти-NASH агенты включают икосабутат, NC-101, NAIA-101, колесевелам и PRC-4016. Другие антифиброзные агенты включают HEC-585, INV-240, терапевтическую PHKi (Silence Therapeutics) и программу SAMiRNA (Bioneer Corp).Other anti-NASH agents include KB-GE-001 and NGM-386 and NGM-395 and NC-10 and TCM-606F. Other anti-NASH agents include icosabutate, NC-101, NAIA-101, colesevelam, and PRC-4016. Other antifibrotic agents include HEC-585, INV-240, therapeutic RNAi (Silence Therapeutics) and the SAMiRNA program (Bioneer Corp).

Другие иллюстративные антифиброзные агенты включают ингибиторы пирфенидона или рецепторной тирозинкиназы (RTKI), такие как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторы рецепторов ангиотензина II (ATI), или ингибитор CTGF, или любое антифибротическое соединение, чувствительное к интерференции с TGFe- и BMP-активированными путями, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как MMP2, MMP9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, анти-гормон Мюллера, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III) или компоненты SMAD-зависимого канонического пути, включая регуляторные или ингибирующие белки SMAD, или члены SMAD-1-независимых или неканонических путей, включая различные ветви передачи сигналов MAPK, TAK1, Rho-подобные GTPase сигнальные пути, пути фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFe-индуцированный процесс EMT или канонические и неканонические пути передачи сигналов Hedgehog, в том числе лиганды Hh или гены-мишени, или любые члены WNT, или пути Notch, которые чувствительны к влиянию TGFe.Other exemplary antifibrotic agents include pirfenidone or receptor tyrosine kinase (RTKI) inhibitors such as nintedanib, sorafenib, and other RTKIs, or angiotensin II receptor blockers (ATIs), or a CTGF inhibitor, or any antifibrotic compound susceptible to interference with TGFe- and BMP- activated pathways including TGFe latent complex activators such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, type I (TGFBRI) or type II (TGFBRII) TGFe receptors and their ligands such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti- Mueller hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors (also known as type III receptors) or components of an SMAD-dependent canonical pathway, including regulatory or inhibitory SMAD proteins, or members of SMAD-1-independent or non-canonical pathways, including various branches of MAPK signaling, TAK1, Rho-like GTPase signaling pathways, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT pathways, TGFe-induced EMT, or canonical and non-canonical Hedgehog signaling pathways, including Hh ligands or target genes, or any members of WNT, or Notch pathways, which are sensitive to the influence of TGFe.

В конкретном варианте осуществления лечение NASH или фиброза печени включает в себя введение соединения формулы (I), выбранного из группы, состоящей из следующего: 1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5диметил-4-карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, 1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5-диметил-4изопропилоксикарбонилдиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, 1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5-диметил-4трет-бутилоксикарбонилдиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, 1-[4-трифторметилфенил]-3-[3,5диметил-4-трет-бутилоксикарбонил диметилметилоксифенил]проп-2-ен-1 -он, 1 -[4-трифторметилфенил] -3 [3,5-диметил-4-карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, 1-[4-трифторметилоксифенил]-3-[3,5Диметил-4-трет-бутилоксикарбонилдиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, 1-[4-трифторметилоксифенил]3-[3,5-диметил-4-карбоксидиметилметилоксиоксифенил]проп-2-ен-1-он 2-[2,6-диметил-4-[3-[4(метилтио)фенил]-3-оксопропил]фенокси]-2-метилпропановая кислота и 2-[2,6-диметил-4-[3-[4(метилтио)фенил]-3-оксопропил]фенокси]-2-метилпропановой кислоты изопропиловый эфир; или их фармацевтически приемлемая соль. В дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) представляет собой 1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5-диметил-4карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он, или его фармацевтически приемлемую соль.In a specific embodiment, the treatment of NASH or liver fibrosis comprises administering a compound of formula (I) selected from the group consisting of the following: 1-[4-methylthiophenyl]-3-[3,5dimethyl-4-carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2- en-1-one, 1-[4-methylthiophenyl]-3-[3,5-dimethyl-4isopropyloxycarbonyldimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one, 1-[4-methylthiophenyl]-3-[3,5- dimethyl-4tert-butyloxycarbonyldimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one, 1-[4-trifluoromethylphenyl]-3-[3,5dimethyl-4-tert-butyloxycarbonyl dimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one, 1 - [4-trifluoromethylphenyl]-3[3,5-dimethyl-4-carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one, 1-[4-trifluoromethyloxyphenyl]-3-[3,5dimethyl-4-tert-butyloxycarbonyldimethylmethyloxyphenyl]prop -2-en-1-one, 1-[4-trifluoromethyloxyphenyl]3-[3,5-dimethyl-4-carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one 2-[2,6-dimethyl-4-[ 3-[4(methylthio)phenyl]-3-oxopropyl]phenoxy]-2-methylpropanoic acid and 2-[2,6-dimethyl-4-[3-[4(methylthio)phenyl]-3-oxopropyl]phenoxy] -2-methylpropanoic acid isopropyl ether; or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In a further specific embodiment, the compound of formula (I) is 1-[4-methylthiophenyl]-3-[3,5-dimethyl-4carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В частности, изобретение относится к комбинированному продукту, содержащему, по меньшей мере, анти-NAFLD и/или анти-NASH, и/или анти-фиброзный агент для применения в способе лечения NAFLD, NASH, активного NASH и/или фиброза печени у субъекта, нуждающегося в этом, при этом субъект был классифицирован как получатель указанного лечения посредством способа согласно изобретению.In particular, the invention relates to a combination product containing at least an anti-NAFLD and/or anti-NASH and/or an anti-fibrotic agent for use in a method of treating NAFLD, NASH, active NASH and/or liver fibrosis in a subject in need thereof, wherein the subject has been classified as a recipient of said treatment by means of the method of the invention.

В более конкретном варианте осуществления изобретение относится к лечению NAFLD, NASH, активного NASH и/или фиброза печени комбинированным продуктом, включающим по меньшей мере один агент, выбранный из группы соединений против NAFLD, против NASH и/или против фиброза, или их фармацевтически приемлемые соли.In a more specific embodiment, the invention relates to the treatment of NAFLD, NASH, active NASH and/or liver fibrosis with a combined product comprising at least one agent selected from the group of anti-NAFLD, anti-NASH and/or anti-fibrosis compounds, or pharmaceutically acceptable salts thereof. .

В более конкретном варианте осуществления изобретение относится к лечению NAFLD, NASH, активного NASH и/или фиброза печени с помощью элафибранора.In a more specific embodiment, the invention relates to the treatment of NAFLD, NASH, active NASH and/or liver fibrosis with elafibranor.

В следующем варианте осуществления лечение NASH или фиброза печени включает в себя введение витамина E или пиоглитазона, обетихоловой кислоты, элафибранора, селонсертиба, сароглитазара и/или ценикривока.In a further embodiment, treatment for NASH or liver fibrosis comprises administering vitamin E or pioglitazone, obeticholic acid, elafibranor, seloncertib, saroglitazar and/or cenicrivoc.

Учитывая роль микро-РНК в модуляции экспрессии генов, результаты, полученные авторами изобретения, также подтверждают патофизиологическую роль miR-193 в развитии и эволюции NAFLD, NASH и/или фиброза печени.Considering the role of miRNAs in modulating gene expression, the results obtained by the inventors also confirm the pathophysiological role of miR-193 in the development and evolution of NAFLD, NASH and/or liver fibrosis.

Таким образом, способы по изобретению могут быть применены для идентификации специфичных субпопуляций субъектов с NAFLD, NASH и/или фиброзом печени на основе уровней циркулирующей miR-193. Эти субпопуляции могут иметь зависимое от miR-193 заболевание, которое заставляет этих пациентов реагировать на специфичные лекарственные препараты, действующие непосредственно (миметики miR-193 или анти-miR-193) или косвенно на зависимые пути miR-193.Thus, the methods of the invention can be used to identify specific subsets of subjects with NAFLD, NASH, and/or liver fibrosis based on circulating miR-193 levels. These subpopulations may have miR-193 dependent disease that causes these patients to respond to specific drugs acting directly (miR-193 or anti-miR-193 mimetics) or indirectly on miR-193 dependent pathways.

Кроме того, на основании этого наблюдения, в дополнительном аспекте изобретение относится к соединению-ингибитору miR-193 для применения при лечении NAFLD, NASH или фиброза печени у субъекта, нуждающегося в этом.Furthermore, based on this observation, in a further aspect, the invention provides a miR-193 inhibitory compound for use in the treatment of NAFLD, NASH, or liver fibrosis in a subject in need thereof.

Используемый в настоящем описании термин соединение-ингибитор miR-193 и его склонения от- 30 043299 носятся к любому соединению, такому как соединение нуклеиновой кислоты, способному предотвращать действие miR-193 и, в частности, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p или hsa-miR-193b-5p. В конкретном варианте осуществления соединение-ингибитор miR-193 по настоящему изобретению представляет собой соединение, которое ингибирует или снижает активность miR-193, например, посредством связывания с miR-193, или которое ингибирует экспрессию miR-193. Термин ингибирование экспрессии miR-193 означает, что продуцирование miR-193 в печени или гепатоцитах после обработки указанным ингибирующим соединением меньше, чем количество, продуцируемое до лечения. Специалист в данной области техники с может легко определить, была ли ингибирована экспрессия miR-193 в печени или гепатоцитах, используя, например, методики определения уровня транскриптов микроРНК.As used herein, the term miR-193 inhibitor compound and its declensions refer to any compound, such as a nucleic acid compound, capable of preventing the action of miR-193 and in particular hsa-miR-193a-5p, hsa- miR-193b-3p or hsa-miR-193b-5p. In a specific embodiment, the miR-193 inhibitory compound of the present invention is a compound that inhibits or reduces the activity of miR-193, for example, by binding to miR-193, or that inhibits the expression of miR-193. The term inhibition of miR-193 expression means that miR-193 production in the liver or hepatocytes after treatment with said inhibitory compound is less than the amount produced before treatment. One of skill in the art can readily determine whether miR-193 expression has been inhibited in the liver or hepatocytes using, for example, microRNA transcript level techniques.

Подходящие соединения-ингибиторы miR-193 включают в себя двухцепочечную РНК (такую как короткую или малую интерферирующую РНК или миРНК), антагомиры, антисмысловые нуклеиновые кислоты и ферментативные молекулы для РНК, такие как рибозимы. Каждое из этих соединений может быть нацелено на заданную микроРНК и может разрушать или индуцировать разрушение целевой микроРНК. Например, экспрессия заданной микроРНК может быть ингибирована посредством индуцирования РНК-интерференции микроРНК с изолированной молекулой двухцепочечной РНК (дцРНК), которая имеет по меньшей мере 90%, например, 95%, 98%, 99% или 100%, гомологию последовательности, по меньшей мере, с частью или, предпочтительно, со всей микроРНК. В предпочтительном варианте осуществления молекула дцРНК представляет собой миРНК. миРНК, подходящие для представленных способов, включают короткую двухцепочечную РНК длиной от около 17 нуклеотидов до около 29 нуклеотидов, предпочтительно, от около 19 до около 25 нуклеотидов. миРНК содержит цепочку смысловой РНК и цепочку комплементарной антисмысловой РНК, отожженных вместе с помощью стандартных взаимодействий спаривания оснований Уотсона-Крика (далее спаренные по основаниям). Смысловая цепь содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в миРНК-мишени.Suitable miR-193 inhibitory compounds include double-stranded RNA (such as short or small interfering RNA or siRNA), antagonists, antisense nucleic acids, and RNA enzymatic molecules such as ribozymes. Each of these compounds can be targeted to a given microRNA and can destroy or induce destruction of the target microRNA. For example, expression of a given microRNA can be inhibited by inducing RNA interference of the microRNA with an isolated double-stranded RNA (dsRNA) molecule that has at least 90%, e.g., 95%, 98%, 99%, or 100% sequence homology of at least at least with a part or, preferably, with all miRNA. In a preferred embodiment, the dsRNA molecule is an siRNA. siRNAs suitable for the present methods include a short double-stranded RNA of about 17 nucleotides to about 29 nucleotides in length, preferably about 19 to about 25 nucleotides. The siRNA contains a strand of sense RNA and a strand of complementary antisense RNA annealed together using standard Watson-Crick base-pairing interactions (hereinafter base-paired). The sense strand contains a nucleic acid sequence that is substantially identical to the nucleic acid sequence contained in the target siRNA.

НаборыSets

Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к набору, содержащему средство для определения уровня:According to a further aspect, the present invention relates to a kit containing a means for determining the level:

(i) miR-193 в образце биологической жидкости и, необязательно, (ii) по меньшей мере, одного другого циркулирующего маркера повреждения печени.(i) miR-193 in the body fluid sample, and optionally (ii) at least one other circulating marker of liver injury.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средство для определения уровня:According to another aspect, the present invention also relates to a kit containing a means for determining the level:

(i) miR-193 в образце биологической жидкости и, необязательно, (ii) по меньшей мере, одного другого маркера NAFLD, NASH или фиброза печени.(i) miR-193 in the body fluid sample, and optionally (ii) at least one other marker for NAFLD, NASH, or liver fibrosis.

Набор по изобретению является полезным для реализации способов, описанных выше. Кроме того, он может дополнительно содержать инструкции для реализации указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для проведения измерений уровней miR-193 и любого другого циркулирующего маркера повреждения печени, как указано выше. В частности, набор может содержать антитела, специфичные для белка, подлежащего количественной оценке, и/или необходимые праймеры. В более конкретном варианте осуществления набор может содержать праймеры и/или зонды для количественного определения уровней микроРНК, как хорошо известно в данной области техники.The kit of the invention is useful for implementing the methods described above. In addition, it may further contain instructions for implementing these methods. The kit may contain reagents and buffers suitable for measuring levels of miR-193 and any other circulating marker of liver injury as described above. In particular, the kit may contain antibodies specific for the protein to be quantified and/or the necessary primers. In a more specific embodiment, the kit may contain primers and/or probes for quantifying microRNA levels, as is well known in the art.

Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для проведения измерений уровней miR193 и любого другого маркера NAFLD и/или NASH.The kit may contain reagents and buffers suitable for measuring levels of miR193 and any other NAFLD and/or NASH marker.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня:The present invention also relates to a kit containing means for determining the level:

по меньшей мере, одного маркера, выбранного из группы, состоящей из hsa-miR-193 (в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, miR-193b-3p); и по меньшей мере одного другого, в частности всех, маркеров, выбранных из группы, выбранной из:at least one marker selected from the group consisting of hsa-miR-193 (particularly hsa-miR-193b, more specifically miR-193b-3p); and at least one other, in particular all, markers selected from a group selected from:

TIMP-1;TIMP-1;

YKL-40;YKL-40;

количества тромбоцитов; и балла метаболического синдрома.platelet count; and metabolic syndrome score.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня:The present invention also relates to a kit containing means for determining the level:

по меньшей мере, одного маркера, выбранного из группы, состоящей из hsa-miR-193 (в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, miR-193b-3p); и, по меньшей мере, одного другого, в частности всех, маркеров, выбранных из группы, выбранной из:at least one marker selected from the group consisting of hsa-miR-193 (particularly hsa-miR-193b, more specifically miR-193b-3p); and at least one other, in particular all, markers selected from a group selected from:

YKL-40;YKL-40;

TIMP-1;TIMP-1;

HbA1c;HbA1c;

гиалуроновой кислоты и количества тромбоцитов.hyaluronic acid and platelet count.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня:The present invention also relates to a kit containing means for determining the level:

по меньшей мере, одного маркера, выбранного из группы, состоящей из hsa-miR-193 (в частности, hsa-miR-193b, более конкретно, miR-193b-3p); и, по меньшей мере, одного другого, в частности всех,at least one marker selected from the group consisting of hsa-miR-193 (particularly hsa-miR-193b, more specifically miR-193b-3p); and at least one other, in particular all,

- 31 043299 маркеров, выбранных из группы, выбранной из:- 31 043299 markers selected from a group selected from:

YKL-40;YKL-40;

TIMP-1;TIMP-1;

HbA1c;HbA1c;

гиалуроновой кислоты и количества тромбоцитов.hyaluronic acid and platelet count.

В предпочтительном варианте осуществления набор содержит средства для определения уровня miR-193b-3p.In a preferred embodiment, the kit contains means for determining the level of miR-193b-3p.

Набор по изобретению является полезным для реализации способов, описанных выше, и может дополнительно содержать инструкции по реализации указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для проведения измерений уровней маркеров, указанных выше. В частности, набор может содержать антитела, специфичные для белка, подлежащего количественной оценке, и/или праймеры, полезные для количественной оценки уровней микроРНК, как хорошо известно в данной области техники.The kit according to the invention is useful for implementing the methods described above, and may additionally contain instructions for implementing these methods. The kit may contain reagents and buffers suitable for measuring the levels of the markers mentioned above. In particular, the kit may contain antibodies specific for the protein to be quantified and/or primers useful for quantifying miRNA levels, as is well known in the art.

Следует понимать, что приведенное выше описание, а также приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации в пределах объема изобретения будут очевидны для специалистов в области техники, к которой относится изобретение.It should be understood that the above description, as well as the examples below, are intended to illustrate and not to limit the scope of the invention. Other aspects, advantages and modifications within the scope of the invention will be apparent to those skilled in the art to which the invention pertains.

ПримерыExamples

Материалы и методы.Materials and methods.

A. Клинические образцы.A. Clinical samples.

Клиническое испытание (фаза 2 GOLDEN-505 в NASH (GFT505-212-7 -NCT01694849) представляет собой многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование для оценки эффективности и безопасности элафибранора (1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5-диметил-4карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-он) один раз в день при стеатогепатите у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом (NASH). Биопсия печени была взята для подтверждения диагноза NASH после соответствующего исключения заболевания печени другой этиологии. NASH был диагностирован как стеатогепатит, оцененный посредством биопсии печени в течение 6 месяцев до рандомизации. Подтверждение стеатогепатита было основано на централизованном прочтении биопсий печени. Пациенты с NASH были определены как имеющие NAS>3, включая балл по стеатозу >1, и по баллонированию гепатоцитов >1, и по лобулярному воспалению >1.The clinical trial (Phase 2 GOLDEN-505 at NASH (GFT505-212-7 -NCT01694849) is a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate the efficacy and safety of elafibranor (1-[4-methylthiophenyl]-3-[3.5 -dimethyl-4carboxydimethylmethyloxyphenyl]prop-2-en-1-one) once daily for steatohepatitis in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Liver biopsy was taken to confirm the diagnosis of NASH after appropriate exclusion of other liver disease. NASH was diagnosed as steatohepatitis assessed by liver biopsy within 6 months prior to randomization Confirmation of steatohepatitis was based on centralized reading of liver biopsies Patients with NASH were defined as having NAS>3, including steatosis score >1, and hepatocyte ballooning score >1, and lobular inflammation>1.

Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами в каждом участвующем центре, и все пациенты дали согласие на участие в медицинском исследовании.The study was approved by the relevant regulatory authorities at each participating center and all patients consented to participate in the medical study.

Образцы крови, использованные в этом исследовании биомаркеров, были взяты у пациентов исследования GOLDEN-DIAG при включении (270 образцов) и через год (223 образца).The blood samples used in this biomarker study were from patients in the GOLDEN-DIAG study at entry (270 samples) and one year later (223 samples).

Авторы настоящего изобретения также имели доступ к образцам крови человека от субъектов с биопсией печени и связанными с ними клиническим и биологическим данным из биобанка UZA, когорты OBESE. Эта когорта, состоящая из пациентов с патологическим ожирением, также включает пациентов с NAFLD/не-NASH, пациентов с NASH, пациентов с циррозом и здоровых людей. Сыворотка 253 пациентов была обработана для проверки кандидатной циркулирующей микроРНК, идентифицированной в исследовании GOLDEN-DIAG, с использованием технологии секвенирования следующего поколения (NGS) и количественной OT-ПЦР, соответственно.The present inventors also had access to human blood samples from liver biopsy subjects and associated clinical and biological data from the UZA biobank, OBESE cohort. This morbidly obese cohort also includes NAFLD/non-NASH patients, NASH patients, cirrhotic patients, and healthy controls. Sera from 253 patients were processed to test the candidate circulating miRNA identified in the GOLDEN-DIAG study using next-generation sequencing (NGS) technology and quantitative OT-PCR, respectively.

Для обеих когорт GOLDEN и OBESE письменное информированное согласие на сбор, хранение и использование дополнительных образцов было получено от каждого пациента.For both the GOLDEN and OBESE cohorts, written informed consent for the collection, storage, and use of additional samples was obtained from each patient.

Авторы настоящего изобретения также имели доступ к образцам крови человека от субъектов с биопсией печени и связанным с ними клиническим и биологическим данным из исследования RESOLVE-IT. RESOLVE-IT представляет собой многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование III фазы (NCT02704403) для оценки эффективности и безопасности элафибранора у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом (NASH) и фиброзом. Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами, все пациенты дали информированное согласие на участие. Биопсия печени при включении в исследование была использована для изучения и оценки гистологических повреждений. Образцы крови были отобраны при скрининге. У пациентов, которые подписали специальное информированное согласие, были взяты дополнительные образцы крови для исследования новых диагностических биомаркеров NASH.The present inventors also had access to human blood samples from liver biopsy subjects and associated clinical and biological data from the RESOLVE-IT study. RESOLVE-IT is a phase III, multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial (NCT02704403) to evaluate the efficacy and safety of elafibranor in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and fibrosis. The study was approved by the relevant regulatory authorities, and all patients gave informed consent to participate. Liver biopsy at study entry was used to study and evaluate histological lesions. Blood samples were taken at screening. Additional blood samples were taken from patients who signed a special informed consent for the study of new diagnostic biomarkers of NASH.

Сыворотка 370 пациентов в исследовании RESOLVE-IT при скрининге с 263 соответствующими биопсиями печени была обработана для идентификации циркулирующей микроРНК с помощью анализа последовательности HTG Edge.Sera from 370 patients in the RESOLVE-IT study at screening with 263 matching liver biopsies were processed to identify circulating miRNAs using HTG Edge sequence analysis.

Сыворотка крови 370 пациентов в исследовании RESOLVE-IT при скрининге с 263 соответствующими биопсиями печени была обработана для проверки кандидатной циркулирующей микроРНК, идентифицированной в исследовании GOLDEN-DIAG, с помощью анализа последовательности HTG Edge и количественной OT-ПЦР.Serum from 370 patients in the RESOLVE-IT study at screening with 263 matching liver biopsies was processed to validate the candidate circulating miRNA identified in the GOLDEN-DIAG study by HTG Edge sequence analysis and quantitative OT-PCR.

- 32 043299- 32 043299

Сыворотка 100 субъектов из EFS (Etablissement Fran^ais u Sang) была обработана для оценки уровней кандидатных циркулирующих микроРНК у здоровых с помощью анализа последовательности HTGSera from 100 subjects from EFS (Etablissement Français u Sang) were processed to assess levels of candidate circulating miRNAs in healthy subjects using HTG sequence analysis.

Edge и количественной OT-ПЦР.Edge and quantitative OT-PCR.

Образцы сыворотки были использованы для анализа посредством NGS и количественной ПЦР.Serum samples were used for analysis by NGS and quantitative PCR.

Забор крови и лабораторные исследованияBlood sampling and laboratory tests

Образцы крови были собраны в соответствии с центральным лабораторным протоколом и руководством Genfit - GFT505-212-7.Blood samples were collected in accordance with the central laboratory protocol and Genfit guidelines - GFT505-212-7.

Согласно протоколу исследования, были проведены следующие анализы.According to the study protocol, the following analyzes were carried out.

Г ематология включает в себя гемоглобин, гематокрит, количество эритроцитов, лейкоциты, дифференциальное количество лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы - значения и %), количество тромбоцитов и ретикулоциты.Hematology includes hemoglobin, hematocrit, red blood cell count, white blood cell count, differential white blood cell count (neutrophils, lymphocytes, eosinophils, monocytes, basophils - values and %), platelet count and reticulocytes.

Биохимия,Biochemistry,

Панель I, включает глюкозу в плазме крови, триглицериды (TG), креатинин, клиренс креатинина, гамма-глутамилтрансферазу (GGT), аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), креатинфосфокиназу (CPK), щелочную фосфатазу, тиреотропный гормон (TSH) и HbA1c.Panel I, includes plasma glucose, triglycerides (TG), creatinine, creatinine clearance, gamma-glutamyl transferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine phosphokinase (CPK), alkaline phosphatase, thyroid stimulating hormone (TSH), and HbA1c.

Биохимия,Biochemistry,

Панель II, включает глюкозу в плазме, креатинин, клиренс креатинина, общий белок, альбумин, натрий, калий, хлорид, кальций, мочевую кислоту, мочевину, выраженную как азот мочевины крови (BUN), аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), гамма-глутамилтрансферазу (GGT), щелочную фосфатазу, креатинфосфокиназу (CPK), общий билирубин, конъюгированный билирубин, C-реактивный белок (hsCRP), соотношение AST/ALT и HbA1c.Panel II, includes plasma glucose, creatinine, creatinine clearance, total protein, albumin, sodium, potassium, chloride, calcium, uric acid, urea expressed as blood urea nitrogen (BUN), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transferase (GGT), alkaline phosphatase, creatine phosphokinase (CPK), total bilirubin, conjugated bilirubin, C-reactive protein (hsCRP), AST/ALT ratio and HbA1c.

Уринализ включает в себя анализ индикаторной полоски (удельный вес, pH, RBC, лейкоциты, глюкоза, белок, кетоны, билирубин, уробилиноген и нитрит).Urinalysis includes test strip analysis (specific gravity, pH, RBC, leukocytes, glucose, protein, ketones, bilirubin, urobilinogen, and nitrite).

Микроскопический анализ включает RBC, WBC, цилиндры, кристаллы, бактерии, эпителиальные клетки и дрожжи.Microscopic analysis includes RBCs, WBCs, casts, crystals, bacteria, epithelial cells, and yeasts.

Химический анализ (альбумин и креатинин).Chemical analysis (albumin and creatinine).

Серология включает антитела к ВИЧ I/II, антитела к HCV, РНК HCV (тестируется только после получения образцов РНК HCV при посещении и в случае реактивного или неопределенного результата для антител HCV) и HbsAg.Serology includes HIV I/II antibodies, HCV antibodies, HCV RNA (tested only after receiving HCV RNA samples at the visit and in case of reactive or indeterminate result for HCV antibodies) and HbsAg.

Липидная панель включает триглицериды (TG), общий холестерин, не-HDL-C (расчет), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C), липопротеин низкой плотности (LDL-C) (расчет), рассчитанный холестерин липопротеинов очень низкой плотности (VLDL-C) (расчет), аполипопротеин AI (ApoAI) и аполипопротеин B (ApoB).Lipid panel includes triglycerides (TG), total cholesterol, non-HDL-C (estimated), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein (LDL-C) (estimated), very low density lipoprotein cholesterol (VLDL) calculated -C) (calculation), apolipoprotein AI (ApoAI) and apolipoprotein B (ApoB).

Химия мочи включает альфа-1-микроглобулин, бета-N-ацетилглюкозаминидазу (бета-NAG) и липокалин, связанный с нейтрофил-желатиназой (N-Gal).Urine chemistry includes alpha-1-microglobulin, beta-N-acetylglucosaminidase (beta-NAG), and neutrophil-gelatinase-associated lipocalin (N-Gal).

Маркеры безопасности включают гомоцистеин, NT-ProBNP, тропонин T, цистатин C и бета2-микроглобулин.Safety markers include homocysteine, NT-ProBNP, troponin T, cystatin C, and beta2-microglobulin.

Гликемические и другие липидические параметры включают лептин, инсулин, оценку гомеостатической модели (HOMA-IR), сывороточную глюкозу (для расчета HOMA-IR), фруктозамин, C-пептид и свободные жирные кислоты (FFA).Glycemic and other lipid parameters include leptin, insulin, homeostatic model assessment (HOMA-IR), serum glucose (for HOMA-IR calculation), fructosamine, C-peptide, and free fatty acids (FFA).

Маркеры воспаления включают в себя гаптоглобин, фибриноген, фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), интерлейкин 6 (IL-6) и ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) Ag (цитрат).Inflammatory markers include haptoglobin, fibrinogen, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) Ag (citrate).

Маркеры печени включают цитокератин-18 (CK18) (M65 и M30), адиопектин, ферритин, альфа2 макроглобулин, FGF19 и FGF21, гиалуроновую кислоту (Advia centaur, реагенты, закупаемые Siemens Belgium и оплачиваемые Genfit при переносе затрат), N-концевой пропептид коллагена типа III (PIIINP) (Advia centaur, реагенты, закупаемые Siemens Belgium) и тканевый ингибитор матричной металлопротеазы-1 (TIMP-1) (Advia centaur, реагенты, закупаемые Siemens).Liver markers include cytokeratin-18 (CK18) (M65 and M30), adiopectin, ferritin, alpha2 macroglobulin, FGF19 and FGF21, hyaluronic acid (Advia centaur, reagents procured by Siemens Belgium and paid for by Genfit at cost transfer), N-terminal collagen propeptide type III (PIIINP) (Advia centaur, reagents purchased from Siemens Belgium) and tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1 (TIMP-1) (Advia centaur, reagents purchased from Siemens).

Список методов, инструментов и производителей для каждого биохимического анализа представлен в данной таблице.The list of methods, instruments and manufacturers for each biochemical analysis is presented in this table.

параметр parameter метод method инструмент tool производитель manufacturer лептин leptin ELISA ELISA вручную manually R&D Systems R&D Systems

- 33 043299- 33 043299

инсулин insulin CLIA CLIA Immulite 2000 Immulite 2000 Siemens Siemens HOMA-IR HOMA-IR Расчет с глюкозой и инсулином Calculation with glucose and insulin фруктозамин fructosamine колориметрический colorimetric Modular Р800 Modular P800 Roche Diagnostics Roche Diagnostics С-пептид C-peptide CLIA CLIA Иммулит 2000 Immulitis 2000 Siemens Siemens гаптоглобин haptoglobin иммунотурбидиметрия immunoturbidimetry Modular Р800 Modular P800 Roche Diagnostics Roche Diagnostics фибриноген fibrinogen Метод Клаусса Clauss method STAR- evolution STAR- evolution Stago Stago TNF альфа TNF alpha флюорокиновое мульти профилирование анализируемого вещества fluorokine multi profiling analyte Luminex Luminex Millipore Millipore IL-6 IL-6 флюорокиновое мульти профилирование анализируемого вещества fluorokine multi profiling analyte Luminex Luminex Millipore Millipore PAI-1 Ag PAI-1Ag ELISA ELISA вручную manually Stago Stago FFA FFA ACS-ACOD ACS-ACOD Modular P800 Modular P800 Roche Diagnostics Roche Diagnostics СК18М30 SK18M30 ELISA ELISA вручную manually Peviva Peviva СК18М65 SK18M65 ELISA ELISA вручную manually Peviva Peviva адипонектин adiponectin ELISA ELISA вручную manually Millipore Millipore ферритин ferritin ECLIA ECLIA Modular E170 Modular E170 Roche Diagnostics Roche Diagnostics альфа2 макр оглобулин alpha2 macro oglobulin нефелометрия nephelometry БН II BN II Siemens Siemens гиалуроновая кислота hyaluronic acid иммунологический анализ immunological analysis Advia centaur advia centaur Siemens Siemens PIIINP PIIINP иммунологический анализ immunological analysis Advia centaur advia centaur Siemens Siemens TIMP-1 TIMP-1 иммунологический анализ immunological analysis Advia centaur advia centaur Siemens Siemens FGF-19 FGF-19 ELISA ELISA вручную manually R&D Systems R&D Systems FGF-21 FGF-21 ELISA ELISA вручную manually R&D Systems R&D Systems висфатин visfatin ELISA ELISA вручную manually Alpco immunoassays Alpco immunoassays резистин resistin ELISA ELISA вручную manually R&D Systems R&D Systems YKL-40, CHI3L1 YKL-40, CHI3L1 Иммунологический анализ на человеческий хитиназа-3-подобный белок 1 Quantikine® ELISA Номер по каталогу DC3L10 Для количественного определения концентраций человеческого хитиназа-3-подобного белка 1 (CHI3L1) в супернатантах клеточной культуры, сыворотке, плазме и моче. Immunological assay for human chitinase-3-like protein 1 Quantikine® ELISA Part number DC3L10 For the quantitative determination of human chitinase-3-like protein 1 (CHI3L1) concentrations in cell culture supernatants, serum, plasma and urine.

Сбор и хранение образцов.Collection and storage of samples.

Образцы крови, использованные в этом исследовании биомаркеров, были взяты у пациентов из исследования 505.212.7 до начала лечения. Письменное информированное согласие на сбор, хранение и использование дополнительных образцов было получено от каждого пациента.The blood samples used in this biomarker study were taken from patients in study 505.212.7 prior to treatment. Written informed consent for the collection, storage and use of additional samples was obtained from each patient.

Кровь, собранную в пробирки, содержащие цитрат объемом 2,7 мл, обрабатывали путем отделения бесклеточной плазмы от клеток крови в течение 15 минут после сбора путем центрифугирования на 1500Blood collected in tubes containing citrate with a volume of 2.7 ml was processed by separating cell-free plasma from blood cells within 15 minutes after collection by centrifugation at 1500

- 34 043299 об/мин в течение 15 минут. Супернатантную плазму переносили в новую пробирку. Пробирки хранили при -70°C.- 34 043299 rpm for 15 minutes. The supernatant plasma was transferred to a new tube. The tubes were stored at -70°C.

Для того, чтобы приступить к экстракции РНК, пробирки с плазмой затем центрифугировали наIn order to proceed with the RNA extraction, the plasma tubes were then centrifuged on

13000 об/мин в течение 2 минут для осаждения и удаления тромбоцитов. Супернатантную плазму без тромбоцитов переносили в новую пробирку, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.13,000 rpm for 2 minutes to sediment and remove platelets. The platelet-free supernatant plasma was transferred to a new tube, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C.

Кровь, собранную в пробирку для отделения сыворотки (SST), объемом 8,5 мл, обрабатывали через один час после взятия образца путем отделения бесклеточной сыворотки от клеток крови путем центрифугирования в диапазоне от 1300 до 2000 об/мин в течение 10 минут. Затем сыворотку переносили в новую пробирку. Пробирки хранили при -70°C. Экстракцию РНК проводили без дополнительного центрифугирования.Blood collected in an 8.5 ml Serum Separation Tube (SST) was processed one hour after sampling by separating cell-free serum from blood cells by centrifugation at 1300 to 2000 rpm for 10 minutes. The serum was then transferred to a new tube. The tubes were stored at -70°C. RNA extraction was performed without additional centrifugation.

B. Секвенирование следующего поколения.B. Next generation sequencing.

Система секвенирования HTG Edge была использована для секвенирования микроРНК, содержащихся в образцах сыворотки.The HTG Edge sequencing system was used to sequence miRNAs contained in serum samples.

Использовали набор для полного транскриптома микроРНК (WTA) HTG. Подготовка библиотеки и секвенирование выполнялись в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого образца было получено в среднем 931000 прочтений на образец. Данные были нормализованы по рекомендации производителя в целях обеспечения возможности прямого сравнения между различными образцами путем корректировки количества прочтений.A complete microRNA transcriptome (WTA) HTG kit was used. Library preparation and sequencing were performed according to the manufacturer's recommendations. For each sample, an average of 931,000 reads per sample was obtained. The data were normalized at the manufacturer's recommendation to enable direct comparison between different samples by adjusting the number of reads.

Limma, пакет программного обеспечения R/Bioconductor, включал дифференциальный анализ для секвенирования HTG Edge.Limma, an R/Bioconductor software suite, included differential analysis for HTG Edge sequencing.

C. Количественная OT-ПЦР микроРНК в сыворотке.C. Quantitative RT-PCR of miRNAs in serum.

Тотальную РНК сыворотки с сохраненными микроРНК экстрагировали из 100 мкл сыворотки с помощью набора для экстракции miRVanaParis (AMI556, Ambion) в соответствии с инструкциями производителя. Синтетическая добавленная miR-39 C. Elegans была добавлена к образцам [3125 ммоль] (MSY0000010, Qiagen) перед экстракцией РНК в качестве внутреннего контроля процесса экстракции РНК. Элюирование проводили в 100 мкл элюирующего буфера.Total serum RNA with preserved miRNAs was extracted from 100 µl of serum using the miRVanaParis extraction kit (AMI556, Ambion) according to the manufacturer's instructions. Synthetic added miR-39 C. elegans was added to the samples [3125 mmol] (MSY0000010, Qiagen) before RNA extraction as an internal control of the RNA extraction process. Elution was carried out in 100 μl of elution buffer.

Экспрессию зрелых микроРНК определяли в соответствии с инструкциями производителя с применением OT-ПЦР анализа Taqman MicroRNA: Набор для обратной транскрипции TaqMan MicroRNA (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), анализа TaqMan MicroRNA 20X (Ref: 4440887, Applied Biosystems) и TaqMan Universal Master Mix II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).Mature miRNA expression was determined according to the manufacturer's instructions using the Taqman MicroRNA OT-PCR assay: TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), TaqMan MicroRNA 20X Assay (Ref: 4440887, Applied Biosystems) and TaqMan Universal Master Mix II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).

Обратную транскрипцию выполняли с использованием термоциклера GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems). Обратная транскрипция была мультиплексирована с 4 специфичными для обратной РНК праймерами.Reverse transcription was performed using a GeneAmp® PCR System 9700 thermal cycler (Ref: 200005, Applied Biosystems). Reverse transcription was multiplexed with 4 reverse RNA specific primers.

Количественные ПЦР проводили с использованием системы реального времени CFX96™ (С 1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad).Quantitative PCR was performed using the CFX96™ real time system (C 1000 Touch™ Thermal Cycler, BioRad).

Последовательности микроРНК, представляющей интерес, и идентификаторы анализов Taq Man представлены в следующей таблице.__________________________________________________MicroRNA sequences of interest and Taq Man assay identifiers are shown in the following table.

ID микроРНК miRNA ID Последовательность Subsequence номер miRbase miRbase number ID теста Test ID hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU (ID последовательности:1) AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU (sequence ID:1) MIMAT0000459 MIMAT0000459 002250 002250 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA (ID последовательности: 2) UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA (Sequence ID: 2) MIMAT0004614 MIMAT0004614 002281 002281 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA (ID последовательности: 3) CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA (Sequence ID: 3) MIMAT004767 MIMAT004767 002366 002366 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU (ID последовательности: 4) AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU (Sequence ID: 4) MIMAT0002819 MIMAT0002819 002367 002367

Синтетические hsa-микроРНК (Integrated DNA Technologies) разводили до 3,125 фмоль/мл и 5 мкл использовали для обратной транскрипции одновременно с РНК, выделенной из образцов сыворотки. Продукт серийно разводили и проводили ПЦР для всех образцов (стандартов и РНК, полученных из сыворотки). Стандартную кривую строили и использовали для преобразования данных Cq в копии/мкл. Режим определения Cq - регрессия. Количественная оценка выражена в копиях/мкл сывороточного формата.Synthetic hsa miRNAs (Integrated DNA Technologies) were diluted to 3.125 fmol/ml and 5 μl were used for reverse transcription simultaneously with RNA isolated from serum samples. The product was serially diluted and PCR was performed on all samples (standards and RNA obtained from serum). A standard curve was built and used to convert Cq data to copies/µl. Cq determination mode - regression. Quantification is expressed in copies/µl serum format.

Для всех синтетических hsa-микроРНК поставщиком являлся IDT.All synthetic hsa miRNAs were supplied by IDT.

D. Статистический анализ.D. Statistical analysis.

Цель и определение.Purpose and definition.

Целью данных анализов было выявление биомаркеров, которые могут быть связаны с идентификацией пациентов с NASH, подлежащих лечению. Пациентов, подлежащих лечению (TBT), определяют поразному в зависимости от различных частей исследования.The aim of these analyzes was to identify biomarkers that may be associated with the identification of NASH patients eligible for treatment. Patients to be treated (TBT) are defined differently depending on the different parts of the study.

Согласно первой классификации, TBT определяют как:According to the first classification, TBT is defined as:

- 35 043299 балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,- 35 043299 steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1,

NAS (показатель активности NAFLD) >4 (NAS определяется как сумма балла по стеатозу, балла по баллонированию гепатоцитов и балла по лобулярному воспалению), стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3).NAS (NAFLD activity score) >4 (NAS is defined as the sum of the steatosis score, the hepatocyte ballooning score, and the lobular inflammation score), fibrosis stage >2 (such as a fibrosis stage of 2, 3, or 4, such as 2 or 3).

Согласно второй классификации, TBT определяют как:According to the second classification, TBT is defined as:

балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1,

NAS (показатель активности NAFLD) >4 (NAS определяется как сумма балла по стеатозу, балла по баллонированию гепатоцитов и балла по лобулярному воспалению), стадия фиброза >1 (например, стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).NAS (NAFLD activity score) >4 (NAS is defined as the sum of the steatosis score, the hepatocyte ballooning score, and the lobular inflammation score), fibrosis stage >1 (eg, fibrosis stage equal to 1, 2, 3, or 4).

Согласно третьей классификации, TBT определяют как:According to the third classification, TBT is defined as:

балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1,

NAS (показатель активности NAFLD) >4 (NAS определяется как сумма балла по стеатозу, балла по баллонированию гепатоцитов и балла по лобулярному воспалению), стадия фиброза=1b, 1c, 2, 3 или 4.NAS (NAFLD activity score) >4 (NAS defined as the sum of the steatosis score, the hepatocyte ballooning score, and the lobular inflammation score), fibrosis stage=1b, 1c, 2, 3, or 4.

Другие пациенты были установлены как не подлежащие лечению (NTBT). Для анализа пациенты TBT были классифицированы как 1 и NTBT как 0 в зависимой переменной. Как показано выше, объясняющие переменные охватывают широкий спектр биомаркеров, измеряемых в образцах крови (гематология, биохимия, коагуляция, маркеры печени, циркулирующая микроРНК) или мочи (индикаторная полоска, осадок), до демографических (возраст, пол, раса), регион (исследовательский центр, страна, континент) или медицинских карт (диабет).Other patients were designated as non-treatable (NTBT). For analysis, TBT patients were classified as 1 and NTBT as 0 in the dependent variable. As shown above, the explanatory variables cover a wide range of biomarkers measured in blood samples (hematology, biochemistry, coagulation, liver markers, circulating miRNA) or urine (dipstick, sediment), to demographic (age, sex, race), region (research center, country, continent) or medical records (diabetes).

Бутстрэп-модель.Bootstrap model.

В бутстрэп-моделировании логистическая обобщенная линейная модель зависимой переменной (определяющей пациентов TBT/NTBT) в отношении объясняющих переменных (биомаркеров) рассчитывается для всех пациентов из общего набора данных. Выполняется обратный выбор переменных, и оптимальный алгоритм выбирается с помощью AIC. Значимость переменных коэффициентов из этого оптимального алгоритма затем проверяется путем запуска алгоритма с использованием 1000 бутстрэпобразцов. Коэффициенты, которые показывают 95% доверительный интервал, исключая ноль, считаются значимыми. Затем алгоритм проверяется путем расчета ROC, AUC, оптимального порога, общей точности, чувствительности, специфичности, положительной прогностической ценности и отрицательной прогностической ценности.In bootstrap modeling, a logistic generalized linear model of the dependent variable (defining TBT/NTBT patients) in relation to explanatory variables (biomarkers) is calculated for all patients from a common data set. Variable selection is reversed and the optimal algorithm is selected using AIC. The significance of the variable coefficients from this optimal algorithm is then tested by running the algorithm using 1000 bootstrap samples. Coefficients that show a 95% confidence interval, excluding zero, are considered significant. The algorithm is then tested by calculating ROC, AUC, optimal threshold, overall accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value.

Результатыresults

Во-первых, циркулирующие уровни 2083 видов микроРНК были одновременно измерены в 517 образцах сыворотки из GOLDEN-DIAG и OBESE с помощью секвенирования следующего поколения на Edge Sequencing для беспристрастного отбора микроРНК, циркулирующие уровни которых могли бы различать пациентов TBT2 (определение TBT2=NAS >4 и F> 2, и, по меньшей мере, один балл по стеатозу, лобулярному воспалению и баллонированию гепатоцитов) и субъектов NTBT2 (субъект NTBT2 отличается от субъекта TBT2, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза). Пациентов TBT2 следует лечить в связи с повышенным риском развития таких серьезных заболеваний печени, как цирроз печени, HCC, печеночная недостаточность, пересадка печени и отказ печени.First, circulating levels of 2083 microRNA species were simultaneously measured in 517 serum samples from GOLDEN-DIAG and OBESE using next-generation sequencing at Edge Sequencing to unbiasedly select miRNAs whose circulating levels could distinguish between TBT2 patients (definition TBT2=NAS >4 and F > 2, and at least one score for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning) and NTBT2 subjects (an NTBT2 subject differs from a TBT2 subject by at least one point in scores for steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS and/or fibrosis stages). TBT2 patients should be treated due to an increased risk of developing serious liver diseases such as cirrhosis, HCC, liver failure, liver transplant, and liver failure.

Из этого анализа авторы изобретения идентифицировали mir193, которая обычно имела повышенную экспрессию в образцах сыворотки пациентов TBT2 по сравнению с пациентами NTBT2 в когорте GOLDEN-DIAG и OBESE при включении.From this analysis, the inventors identified mir193, which generally had increased expression in serum samples from TBT2 patients compared to NTBT2 patients in the GOLDEN-DIAG and OBESE cohort at inclusion.

Как показано в табл. 1, и является значимым и неожиданным, в когортах GOLDEN-DIAG и OBESE число прочтений на миллион для hsa-miR193a-5p, hsa-miR193a-3p и hsa-miR193b-3p было значимо выше у пациентов TBT2, чем у пациентов NTBT2.As shown in Table. 1, and is significant and unexpected, in the GOLDEN-DIAG and OBESE cohorts, the RPM for hsa-miR193a-5p, hsa-miR193a-3p, and hsa-miR193b-3p was significantly higher in TBT2 patients than in NTBT2 patients.

Например, 778, 592 и 632 RPM (прочтений на миллион) было получено у пациентов TBT2 по сравнению с 516, 439 и 392 RPM для пациентов NTBT2 для hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p и hsa-miR193b-3p, соответственно.For example, 778, 592 and 632 RPM (reads per million) were obtained in TBT2 patients compared to 516, 439 and 392 RPM for NTBT2 patients for hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p and hsa-miR193b -3p, respectively.

Авторы изобретения также использовали биопсию печени и образцы сыворотки, собранные в конце годичного периода лечения в испытании GOLDEN, в качестве третьего независимого набора данных и еще раз подтвердили, что число прочтений на миллион для hsa-miR193a-5p и hsa-miR193b-3p были значимо выше у пациентов TBT2, чем у пациентов NTBT2. Уровень hsa-miR-193b-5p также был значимо выше у пациентов TBT2, чем у пациентов NTBT2.The inventors also used liver biopsy and serum samples collected at the end of the one year treatment period in the GOLDEN trial as a third independent dataset and further confirmed that the RPMs for hsa-miR193a-5p and hsa-miR193b-3p were significant higher in TBT2 patients than in NTBT2 patients. The hsa-miR-193b-5p level was also significantly higher in TBT2 patients than in NTBT2 patients.

Эти результаты были подтверждены в независимой когорте OBESE между пациентами TBT2 иThese results were confirmed in an independent OBESE cohort between TBT2 patients and

- 36 043299- 36 043299

NTBT2.NTBT2.

Кроме того, биопсия и образцы сыворотки, собранные в независимой клинической когорте RESOLVE-IT, были также обработаны посредством анализа HTG Edge Sequencing. Повышенная регуляция hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p и hsa-miR-193b-3p была подтверждена в этом дополнительном наборе данных и клинической когорте.In addition, biopsy and serum samples collected from the independent RESOLVE-IT clinical cohort were also processed through the HTG Edge Sequencing assay. Upregulation of hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-5p and hsa-miR-193b-3p was confirmed in this additional data set and clinical cohort.

Все протестированные кандидаты hsa-miR-193, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193b-5p и hsa-miR-193b-3p имели повышенную регуляцию у пациентов с NAFLD с минимальными гистологическими очагами (NTBT2) по сравнению с сывороткой от здоровых субъектов (табл. 1).All hsa-miR-193, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193b-5p and hsa-miR-193b-3p candidates tested were upregulated in NAFLD patients with minimal histologic foci (NTBT2) compared with serum from healthy subjects (Table 1).

Таблица 1Table 1

Эксперименты по секвенированию следующего поколения HGT-Edge и число прочтений на миллион (RPM), полученных для hsa-miR-193a-3p, и hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p и hsa-miR-193b-5p у пациентов, подлежащих лечению (TBT2), по сравнению с пациентами, не подлежащими лечению (NTBT2)HGT-Edge next generation sequencing experiments and reads per million (RPM) obtained for hsa-miR-193a-3p and hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p and hsa-miR-193b- 5p in patients eligible for treatment (TBT2) compared with patients not eligible for treatment (NTBT2)

Golden Diag - при включении Golden Diag - when turned on hsa_MHKpoPHK hsa_MHKpoPHK RPM у в RPM in RPM у TBT2 RPM for TBT2 Кратность multiplicity р-значение p-value NTBT2 NTBT2 изменения changes hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p 516 516 778 778 1,33 1.33 3,ЗЗЕ-04 3,ZZE-04 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p 439 439 592 592 1,38 1.38 4Д6Е-06 4D6E-06 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p 392 392 632 632 1,76 1.76 8,08Е-09 8.08Е-09 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p 18 18 31 31 1,72 1.72 4,22Е-06 4.22E-06 Golden Diag - на 52 недел Golden Diag - for 52 weeks e e hsa микроРНК hsa miRNA RPM у NTBT2 RPM for NTBT2 RPM у TBT2 RPM for TBT2 Кратность multiplicity р-значение p-value изменения changes hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p 512 512 598 598 1,11 1.11 3,О8Е-О1 3,O8E-O1 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p 382 382 636 636 1,61 1.61 1Д4Е-06 1D4E-06 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p 354 354 720 720 1,83 1.83 1,71Е-06 1.71E-06 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p 16 16 35 35 1,91 1.91 6,41Е-06 6.41Е-06 OBESE - при включении OBESE - when turned on hsa микроРНК hsa miRNA RPM у NTBT2 RPM for NTBT2 RPM у TBT2 RPM for TBT2 Кратность multiplicity р-значение p-value изменения changes hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p 811 811 1075 1075 1,19 1.19 1Д2Е-01 1D2E-01 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p 300 300 465 465 1,45 1.45 6,99Е-06 6.99E-06 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p 95 95 244 244 1,96 1.96 1,21Е-11 1.21E-11 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p 4 4 13 13 1,78 1.78 1, ОЗЕ-ОЗ 1, OZE-OZ RESOLVE-IT - при вклю RESOLVE-IT - when turned on чении cheniya hsa микроРНК hsa miRNA RPM у NTBT2 RPM for NTBT2 RPM у TBT2 RPM for TBT2 Кратность multiplicity р-значение p-value изменения changes hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p 658 658 796 796 1,15 1.15 1Д6Е-01 1D6E-01 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p 442 442 653 653 1,44 1.44 2,38Е-06 2.38E-06 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p 387 387 607 607 1,69 1.69 8,22Е-08 8.22E-08 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p 17 17 27 27 1,81 1.81 4,82Е-06 4.82E-06

Субъекты EFSSubjects of EFS

ЬвамикроРНК vamiRNA RPM у здоровых RPM y healthy hsa-miR-193a-3p hsa-miR-193a-3p 198,05 198.05 hsa-miR-193a-5p hsa-miR-193a-5p 212,04 212.04 hsa-miR-193b-3p hsa-miR-193b-3p 69,93 69.93 hsa-miR-193b-5p hsa-miR-193b-5p 3,44 3.44

- 37 043299- 37 043299

Прочтения на миллион (RPM) выражены как среднее для групп пациентов NTBT2 и TBT2 (исследование Golden Diag - при включении (109 пациентов TBT2 и 161 NTBT2) и Golden Diag - через год (76 TBT2 и 147 NTBT2); OBESE (50 TBT2 и 202 NTBT2 пациентов, RESOLVE-IT (137 TBT2 и 117 NTBT2)), соответственно; TBT2 относится к пациентам с NAS >4, по меньшей мере, с 1 баллом по стеатозу, баллонированию гепатоцитов и лобулярному воспалению и стадией фиброза >2 при гистологическом исследовании биопсии печени. Субъект NTBT2 отличается от субъекта TBT2, по меньшей мере по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза. Субъекты EFS (Etablissement Francais du Sang) являются здоровыми субъектами, не принимающими лекарства.Reads per million (RPM) are expressed as the mean of the NTBT2 and TBT2 patient groups (Golden Diag study - at inclusion (109 TBT2 and 161 NTBT2 patients) and Golden Diag - one year later (76 TBT2 and 147 NTBT2); OBESE (50 TBT2 and 202 NTBT2 patients, RESOLVE-IT (137 TBT2 and 117 NTBT2)), respectively; TBT2 refers to patients with NAS >4 with at least 1 score for steatosis, hepatocyte ballooning, and lobular inflammation and fibrosis stage >2 on biopsy histology liver.An NTBT2 subject differs from a TBT2 subject by at least one point in terms of steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or stage of fibrosis.EFS (Etablissement Francais du Sang) subjects are healthy subjects not taking medicines.

В целях подтверждения уровни hsa-miR193a-5p, hsa-miR193b-3p и hsa-miR-193b-5p были затем измерены с использованием метода золотого стандарта для количественного определения олигонуклеотидов в жидкостях организма, количественной OT-ПЦР, с использованием специальных анализов микроРНК TaqMan. Результаты можно подвести следующим образом:For confirmation, hsa-miR193a-5p, hsa-miR193b-3p, and hsa-miR-193b-5p levels were then measured using the gold standard method for oligonucleotide quantification in body fluids, quantitative OT-PCR, using dedicated TaqMan miRNA assays . The results can be summarized as follows:

Как показано в табл. 2 и на фиг. 2, в обеих когортах при включении и в GOLDEN-DIAG на неделе 52, концентрации hsa-miR193a-5p, hsa-miR193b-3p и hsa-miR-193b-5p в сыворотке были значимо выше у пациентов TBT2, чем у пациентов NTBT2. В GOLDEN-DIAG концентрации hsa-miR193b-3p в сыворотке были значимо выше у пациентов с NAFLD с минимальными гистологическими изменениями (NTBT2), чем в сыворотке от здоровых субъектов (фиг. 1 и фиг. 4).As shown in Table. 2 and in FIG. 2, in both cohorts at inclusion and in the GOLDEN-DIAG at week 52, serum concentrations of hsa-miR193a-5p, hsa-miR193b-3p, and hsa-miR-193b-5p were significantly higher in TBT2 patients than in NTBT2 patients. In GOLDEN-DIAG, serum concentrations of hsa-miR193b-3p were significantly higher in NAFLD patients with minimal histological changes (NTBT2) than in serum from healthy subjects (Fig. 1 and Fig. 4).

Таблица 2 Эксперименты количественной OT-ПЦР для подтверждения/валидации сверхэкспрессии hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p и hsa-miR-193b-5p у подлежащих лечению пациентов (TBT2) по сравнению с не подлежащими лечению пациентами (NTBT2) в трех _______________когортах (GOLDE, OBESE и RESOLVE-IT)_______________Table 2 Quantitative RT-PCR experiments to confirm/validate hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b-3p, and hsa-miR-193b-5p overexpression in treated patients (TBT2) versus untreated patients ( NTBT2) in three _______________cohorts (GOLDE, OBESE and RESOLVE-IT)_______________

Golden DiagПри включени и Golden Diag Копий/мкл у NTBT2 Copies/µl NTBT2 Копий/мкл у ТВТ2 Copies/µl for TBT2 TBT2/NTBT2 TBT2/NTBT2 Пациент ы Patients (N=161) (N=161) (N=109) (N=109) Копий, мк л-1 в сыворотк е Copies, mk l-1 in serum Сред нее Average SD SD SE М SE M Среднее Average SD SD SE М SE M соотношение ratio значение Р meaning R AU С AU WITH hsa-miR193а-5р hsa-miR193а-5р 400 400 285 285 22 22 609 609 412 412 39 39 1,52 1.52 <0,0001 <0.0001 0,68 0.68

- 38 043299- 38 043299

hsa-miR193b-3p hsa-miR193b-3p 161 161 196 196 15 15 290 290 350 350 34 34 1,80 1.80 <0,0001 <0.0001 0,68 0.68 hsa-miR193b-5p hsa-miR193b-5p 20 20 37 37 3 3 40 40 49 49 5 5 1,98 1.98 <0,0001 <0.0001 0,67 0.67 Golden Diag Один год спустя на неделе 52 Golden Diag One year later at week 52 Копий/мкл у NTBT2 Copies/µl NTBT2 Копий/мкл у ТВТ2 Copies/µl for TBT2 TBT2/NTBT2 TBT2/NTBT2 Пациент ы Patients (N=147) (N=147) (N=76) (N=76) Копий, мк л-1 в сыворотк е Copies, mk l-1 in serum Сред нее Average SD SD SE М SE M Среднее Average SD SD SE М SE M отношение attitude Р - значение R - meaning AU С AU WITH hsa-miR193а-5р hsa-miR193а-5р 412 412 260 260 21 21 613 613 401 401 33 33 1,49 1.49 <0,0001 <0.0001 0,65 0.65 hsa-miR193b-3p hsa-miR193b-3p 155 155 179 179 15 15 286 286 281 281 23 23 1,84 1.84 <0,0001 <0.0001 0,69 0.69 hsa-miR193b-5p hsa-miR193b-5p 22 22 40 40 3 3 50 50 69 69 8 8 2,32 2.32 <0,0001 <0.0001 0,69 0.69 Ожирение - при включени и Obesity - at turn on And Копий/мкл у NTBT2 Copies/µl NTBT2 Копий/мкл у ТВТ2 Copies/µl for TBT2 TBT2/NTBT2 TBT2/NTBT2 Пациент ы (N=202) Patient s (N=202) (N=50) (N=50) Копий.мк л-1 в сыворотк е Copies.mk l-1 in serum Сред нее Average SD SD SE М SE M Среднее Average SD SD SE М SE M отношение attitude Р - значение R - meaning AU С AU WITH hsa-miR193а-5р hsa-miR193а-5р 452 452 269 269 19 19 637 637 412 412 58 58 1,41 1.41 <0,0001 <0.0001 0,65 0.65

- 39 043299- 39 043299

hsa-miR193b-3p hsa-miR193b-3p 67 67 53 53 4 4 190 190 218 218 31 31 2,85 2.85 <0,0001 <0.0001 0,74 0.74 hsa-miR193b-5p hsa-miR193b-5p 27 27 20 20 1 1 48 48 39 39 6 6 1,78 1.78 <0,0001 <0.0001 0,69 0.69 RESOLV E-IT - при включени и RESOLV E-IT - when turned on and Копий/мкл у NTBT2 Copies/µl NTBT2 Копий/мкл у ТВТ2 Copies/µl for TBT2 TBT2/NTBT2 TBT2/NTBT2 Пациент ы Patients (N=112) (N=112) (N=136) (N=136) Копий, мк л-1 в сыворотк е Copies, mk l-1 in serum Сред нее Average SD SD SEM SEM Среднее Average SD SD SE М SE M отношение attitude Р - значение R - meaning AU С AU WITH hsa-miR193а-5р hsa-miR193а-5р 334 334 254 254 27 27 503 503 332 332 33 33 1,51 1.51 <0,0001 <0.0001 0,70 0.70 hsa-miR193b-3p hsa-miR193b-3p 56 56 73 73 8 8 105 105 112 112 11 eleven 1,88 1.88 <0,0001 <0.0001 0,73 0.73 hsa-miR193b-5p hsa-miR193b-5p 11 eleven 18 18 2 2 19 19 24 24 2 2 1,71 1.71 0,0010 0.0010 „65 „65

Статистическая значимость TBT2 по сравнению с NTBT2 была рассчитана с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. TBT2 относится к пациентам с NAS >4, баллами по стеатозу, баллонированию гепатоцитов и лобулярному воспалению >1 и стадией фиброза >2 при гистологическом исследовании биопсии печени. AUROC=Площадь под кривой соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов была получена для идентификации TBT2 по сравнению с NTBT2.The statistical significance of TBT2 versus NTBT2 was calculated using the non-parametric Mann-Whitney test. TBT2 refers to patients with NAS >4, steatosis, hepatocyte ballooning, and lobular inflammation scores >1, and fibrosis stage >2 on liver biopsy histology. AUROC=Area under the curve of true/false detection ratios was derived to identify TBT2 versus NTBT2.

Как показано на фиг. 1, 2 и 3, при применении второго определения пациентов TBT и пациентов NTBT (TBT1 против NTNT) в двух когортах при включении анализы показали, что для hsa-miR193b-3p (фиг. 1), hsa-miR193b-5p (фиг. 2) и hsa-miR193a-5p (фиг. 3), сывороточные концентрации были значительно выше у пациентов TBT1, чем у пациентов NTBT1. В GOLDEN-DIAG концентрации hsa-miR193b3p в сыворотке были значимо выше у пациентов с NAFLD с минимальными гистологическими очагами (NTBT1), чем в сыворотке от здоровых субъектов (фиг. 1). В этих анализах TBT1 относится к пациентам с NAS >4 по меньшей мере с 1 баллом по стеатозу, баллонированию гепатоцитов и лобулярному воспалению и стадией фиброза > 1 при гистологическом исследовании биопсии печени. Субъект NTBT1 отличается от субъекта TBT1, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза.As shown in FIG. 1, 2, and 3, using the second definition of TBT patients and NTBT patients (TBT1 vs. NTNT) in the two cohorts, at inclusion, analyzes showed that for hsa-miR193b-3p (Fig. 1), hsa-miR193b-5p (Fig. 2 ) and hsa-miR193a-5p (Fig. 3), serum concentrations were significantly higher in TBT1 patients than in NTBT1 patients. In GOLDEN-DIAG, serum hsa-miR193b3p concentrations were significantly higher in NAFLD patients with minimal histological lesions (NTBT1) than in serum from healthy subjects (Figure 1). In these analyzes, TBT1 refers to patients with NAS >4 with at least 1 score for steatosis, hepatocyte ballooning, and lobular inflammation and fibrosis stage >1 on liver biopsy histology. The NTBT1 subject differs from the TBT1 subject by at least one point in terms of steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or fibrosis stage scores.

Как показано на фиг. 1, 2 и 3, при применении третьего определения пациентов TBT и пациентов NTBT (TBT7 против NTBT7) в двух группах при включении анализы показали, что сывороточные концентрации hsa-miR193b-3p (фиг. 1), hsa-miR193b-5p (фиг. 2) и hsa-miR193a-5p (фиг. 3) были значимо выше у пациентов TBT7, чем у пациентов NTBT7. При GOLDEN-DIAG концентрации hsa-miR193b-3p в сыворотке были значительно выше у пациентов с минимальными гистологическими очагами (NTBT7), чем в сыворотке от здоровых субъектов (фиг. 1). В этих анализах TBT7 относится к пациентам с NAS >4 по меньшей мере с 1 баллом по стеатозу, баллонированию гепатоцитов и лобулярному воспалению и стадией фиброза > 1 при гистологическом исследовании биопсии печени. Субъект NTBT1 отличается от субъекта TBT1, по меньшей мере на один пункт, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS и/или стадии фиброза.As shown in FIG. 1, 2 and 3, using the third definition of TBT patients and NTBT patients (TBT7 vs. NTBT7) in the two groups, at inclusion analyzes showed that serum concentrations of hsa-miR193b-3p (Fig. 1), hsa-miR193b-5p (Fig. 2) and hsa-miR193a-5p (FIG. 3) were significantly higher in TBT7 patients than in NTBT7 patients. In GOLDEN-DIAG, hsa-miR193b-3p serum concentrations were significantly higher in patients with minimal histological lesions (NTBT7) than in serum from healthy subjects (Fig. 1). In these analyzes, TBT7 refers to patients with NAS >4 with at least a score of 1 for steatosis, hepatocyte ballooning, and lobular inflammation and fibrosis stage >1 on liver biopsy histology. An NTBT1 subject differs from a TBT1 subject by at least one point in steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, and/or fibrosis scores.

Как показано на фиг. 4, 5 и 6, в двух группах, hsa-miR193b-3p (фиг. 4), hsa-miR193a-5p (фиг. 5) и hsa-miR-193b-5p (фиг. 6), сывороточные концентрации были значимо выше у пациентов с активным NASH (NAS >4 по меньшей мере с 1 баллом по стеатозу, баллонированию гепатоцитов и лобулярному воспалению), чем у пациентов без NASH и с легким NASH (NAS<4). В GOLDEN-DIAG концентрации hsa-miR-193b-3p в сыворотке были значимо выше у пациентов с минимальной активностью заболевания (NAS<4), чем в сыворотке от здоровых субъектов.As shown in FIG. 4, 5 and 6, in two groups, hsa-miR193b-3p (Fig. 4), hsa-miR193a-5p (Fig. 5) and hsa-miR-193b-5p (Fig. 6), serum concentrations were significantly higher in patients with active NASH (NAS >4 with at least 1 score for steatosis, hepatocyte ballooning, and lobular inflammation) than in patients without NASH and with mild NASH (NAS<4). In GOLDEN-DIAG, hsa-miR-193b-3p serum concentrations were significantly higher in patients with minimal disease activity (NAS<4) than in serum from healthy subjects.

Как показано на фиг. 4, 5 и 6, в двух группах: hsa-miR-193b-3p (фиг. 4), hsa-miR-193a-5p (фиг. 5) и hsa-miR-193b-5p (фиг. 6), концентрации в сыворотке были значимо выше у пациентов со значительнымAs shown in FIG. 4, 5 and 6, in two groups: hsa-miR-193b-3p (Fig. 4), hsa-miR-193a-5p (Fig. 5) and hsa-miR-193b-5p (Fig. 6), concentrations in serum were significantly higher in patients with significant

- 40 043299 фиброзом или более высокой стадией фиброза (F>2), чем у пациентов без фиброза или с минимальным фиброзом (F<2). В GOLDEN-DIAG сывороточные концентрации hsa-miR-193b-3p были значимо выше у пациентов с NAFLD без фиброза или с минимальным фиброзом (F<2), чем у здоровых людей.- 40 043299 fibrosis or a higher stage of fibrosis (F>2) than in patients without fibrosis or with minimal fibrosis (F<2). In GOLDEN-DIAG, serum concentrations of hsa-miR-193b-3p were significantly higher in NAFLD patients with no or minimal fibrosis (F<2) than in healthy controls.

Эти результаты были подтверждены в исследовании RESOLVE-IT для hsa-miR-193b-3p, hsa-miR193a-5p и hsa-miR-193b-5p (фиг. 7).These results were confirmed in the RESOLVE-IT study for hsa-miR-193b-3p, hsa-miR193a-5p and hsa-miR-193b-5p (FIG. 7).

Дальнейший анализ экспериментов количественной OT-ПЦР, выполненных на образцах сыворотки из GOLDEN-DIAG при включении, показывает сильную корреляцию между уровнями циркулирующих видов miR-193 и гистологическими баллами и стадией фиброза (аналогичные результаты были получены с использованием образцов OBESE и RESOLVE-IT).Further analysis of quantitative OT-PCR experiments performed on serum samples from GOLDEN-DIAG at inclusion shows a strong correlation between levels of circulating miR-193 species and histological scores and fibrosis stage (similar results were obtained using OBESE and RESOLVE-IT samples).

Как показано на фиг. 8, циркулирующий уровень hsa-miR193b-3p положительно коррелирует с баллом по стеатозу, баллом по лобулярному воспалению и баллом по баллонированию гепатоцитов. Следовательно, уровень циркулирующей miR193b-3p значимо и положительно коррелирует с NAS и индексом активности. Наконец, имелась сильная корреляция между уровнем циркулирующей 193b-5p и стадией фиброза в GOLDEN DIAG при включении.As shown in FIG. 8, circulating hsa-miR193b-3p levels are positively correlated with steatosis score, lobular inflammation score, and hepatocyte ballooning score. Therefore, the level of circulating miR193b-3p significantly and positively correlates with NAS and activity index. Finally, there was a strong correlation between circulating 193b-5p levels and fibrosis stage in the GOLDEN DIAG at inclusion.

Как показано на фиг. 9, уровень циркулирующей hsa-miR193b-5p положительно коррелирует с баллом по стеатозу, баллом по лобулярному воспалению и баллом по баллонированию гепатоцитов. Следовательно, уровень циркулирующей miR193b-3p значимо и положительно коррелирует с NAS и индексом активности. Наконец, имелась сильная корреляция между уровнем циркулирующей miR193b-5p и стадией фиброза в GOLDEN DIAG при включении.As shown in FIG. 9, circulating hsa-miR193b-5p levels are positively correlated with steatosis score, lobular inflammation score, and hepatocyte ballooning score. Therefore, the level of circulating miR193b-3p significantly and positively correlates with NAS and activity index. Finally, there was a strong correlation between circulating miR193b-5p levels and fibrosis stage in the GOLDEN DIAG at inclusion.

Как показано на фиг. 10, уровень циркулирующей miR193a-5p положительно коррелирует с баллом по стеатозу, баллом по лобулярному воспалению и баллом по баллонированию гепатоцитов. Следовательно, уровень циркулирующей miR193b-3p значимо и положительно коррелирует с NAS и индексом активности. Наконец, имелась сильная корреляция между уровнем циркулирующей miR193a-5p и стадией фиброза в GOLDEN DIAG при включении.As shown in FIG. 10, circulating miR193a-5p levels are positively correlated with steatosis score, lobular inflammation score, and hepatocyte ballooning score. Therefore, the level of circulating miR193b-3p significantly and positively correlates with NAS and activity index. Finally, there was a strong correlation between circulating miR193a-5p levels and fibrosis stage in the GOLDEN DIAG at inclusion.

Результаты, представленные в следующей табл. 3, иллюстрируют значимые корреляции между изменениями уровней циркулирующей hsa-miR-193a-5p и эволюцией активности NAFLD и NASH через 52 недели у пациентов GOLDEN. Аналогичным образом, результаты, представленные в следующей табл. 3, иллюстрируют значимые корреляции между изменениями уровней циркулирующей hsa-miR-193b-3p и эволюцией активности NAFLD и NASH через 52 недели у пациентов GOLDEN.The results presented in the following table. 3 illustrate significant correlations between changes in circulating hsa-miR-193a-5p levels and the evolution of NAFLD and NASH activity at 52 weeks in GOLDEN patients. Similarly, the results presented in the following table. 3 illustrate significant correlations between changes in circulating hsa-miR-193b-3p levels and the evolution of NAFLD and NASH activity at 52 weeks in GOLDEN patients.

Таблица 3Table 3

Соотношение изменений уровней в сыворотке hsa-miR193a-5p и hsa-miR193b-3p и эволюции индекса активности (AI) и NAS в течение однолетнего исследования GOLDENRelationship between changes in serum levels of hsa-miR193a-5p and hsa-miR193b-3p and evolution of activity index (AI) and NAS during the one-year GOLDEN study

GOLDEN-DIAG (Неделя 52-Включение) Изменение концентрации miR в сыворотке (Л miR) в сравнении с индексом эволюции активности (АА1) GOLDEN-DIAG (Week 52-Power On) Change in serum miR concentration (L miR) compared to the activity evolution index (AA1) Улучшение (А AI <0) Improvement (A AI<0) стабильный (А А1=0) stable (A A1=0) Обострение (А А1> 0) Aggravation (A A1> 0) Р-значение (Тест КрускалаУоллиса) P-value (Kruskal Wallis test) AmiR-193a-5p (копий/мкл) AmiR-193a-5p (copies/µl) -72±33 -72±33 -7±41 -7±41 +202±91 +202±91 0,02 0.02 AmiR-193b-3p (копий/мкл) AmiR-193b-3p (copies/µl) -41±26 -41±26 -7±29 -7±29 +49±36 +49±36 0,17 0.17 GOLDEN-DIAG (Неделя 52-Включение) Изменение концентрации miR в сыворотке (AmiR) в сравнении с эволюцией NAS (А NAS) GOLDEN-DIAG (Week 52-Power On) Change in serum miR concentration (AmiR) versus evolution of NAS (A NAS) Улучшение (А Improvement (A стабильный stable Ухудшение (А Deterioration (A Р-значение p-value

- 41 043299- 41 043299

NAS <0) NAS<0) (A NAS=0) (A NAS=0) NAS> 0) NAS > 0) (Тест КрускалаУоллиса) (Kruskal Wallis test) AmiR-193a-5p (копий/мкл) AmiR-193a-5p (copies/µl) -87±33 -87±33 +23±50 +23±50 +107±62 +107±62 0,02 0.02 AmiR-193b-3p (копий/мкл) AmiR-193b-3p (copies/µl) -62±26 -62±26 +8±38 +8±38 +48±22 +48±22 0,008 0.008

Моделирование с использованием подхода бутстрэп позволило отобрать четыре значимые переменные с miR-193b-3p для дифференциации пациентов TBT2 и пациентов NTBT2 (табл. 4). Эта модель сочетает miR-193b-3p, тканевый ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP-1), YKL-40, также называемый хитиназа-3-подобный белок 1 (CHI3L1), количество тромбоцитов и метаболический синдром (MS) для диагностики подлежащих лечению пациентов с NASH или пациентов с риском развития NASH.Modeling using the bootstrap approach allowed the selection of four significant variables with miR-193b-3p to differentiate between TBT2 patients and NTBT2 patients (Table 4). This model combines miR-193b-3p, tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), YKL-40, also called chitinase-3-like protein 1 (CHI3L1), platelet count, and metabolic syndrome (MS) to diagnose eligible patients with NASH or patients at risk of developing NASH.

Пациенты из группы риска, подлежащие лечению, соответствуют следующим классам, полученным по биопсии печени: балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS (показатель активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (например, стадия фиброза равна 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3).Patients at risk for treatment fit the following liver biopsy grades: steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (NAFLD activity score) >4, and fibrosis stage >2 (for example, fibrosis stage is 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).

Таблица 4Table 4

Выбранные переменные в оптимальной модели бутстрэп для идентификации пациентов TBT2 в Golden. Доверительный ингервал—CI, SE: стандартная ошибкаSelected variables in the optimal bootstrap model for identifying TBT2 patients in Golden. Confidence Ingerval—CI, SE: standard error

Коэффициент SE 95% CISE ratio 95% CI

Постоянная Constant -5,53 -5.53 1,46 1.46 -8,39 -8.39 -2,67 -2.67 miR-193b-3p (LoglO копий.мкл1) miR-193b-3p (LoglO copies.mcl1) 1,54 1.54 0,49 0.49 0,58 0.58 2,50 2.50 Тканевый ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP-1) tissue inhibitor metalloproteinase 1 (TIMP-1) 1,05Е-02 1.05Е-02 4Д7Е-03 4D7E-03 2,29Е-03 2.29E-03 1,87Е-02 1.87E-02 YKL-40 или CHI3L1 YKL-40 or CHI3L1 9,34Е-06 9.34Е-06 3,67Е-06 3.67E-06 2Д4Е-06 2D4E-06 1,65Е-05 1.65Е-05 Количество тромбоцитов Platelet count -8,32Е-03 -8.32E-03 3,71Е-03 3.71E-03 -1,56Е-02 -1.56E-02 -1,05Е-03 -1.05Е-03 Метаболический синдром metabolic syndrome 0,83 0.83 0,41 0.41 0,03 0.03 1,63 1.63

Балл определяется как логистическая функция:The score is defined as a logistic function:

гдеWhere

Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, гдеY=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, where

S представляет собой балл NASH;S is the NASH score;

A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копий.мкл-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl-1;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

D представляет собой количество тромбоцитов в 10⁹/л;D is the number of platelets in 10 ⁹ /l;

F представляет собой балл метаболического синдрома;F is the metabolic syndrome score;

k представляет собой число в диапазоне от -8,39 до -2,67.k is a number in the range -8.39 to -2.67.

Оценка AUC для модели бутстреппинга, соответствующей пациенту с риском, как описано ранее, и объединение нескольких переменных лучше, чем оценка AUC, полученная для отдельных переменных. Таким образом, комбинация нескольких переменных с помощью логистической функции в соответствии с настоящим изобретением лучше и точнее, чем изучение одной переменной (табл. 5 и фиг. 11).The AUC estimate for the bootstrapping model corresponding to the patient at risk, as described earlier, and the pooling of several variables is better than the AUC estimate obtained for individual variables. Thus, the combination of multiple variables with a logistic function in accordance with the present invention is better and more accurate than studying a single variable (Table 5 and FIG. 11).

- 42 043299- 42 043299

Таблица 5Table 5

Сравнение оценок модели бутстреппинга по настоящему изобретению с индивидуальными переменными в GOLDEN-DIAG. Сравнение диагностических характеристик.Comparison of the estimates of the bootstrapping model of the present invention with individual variables in the GOLDEN-DIAG. Comparison of diagnostic characteristics.

Неинвазивный профиль=NIS=алгоритм с miR-193b-3p Non-invasive profile=NIS=algorithm with miR-193b-3p AU С AU WITH Оптимальн ый порог Optimal threshold точност ь accuracy b чувствительност ь sensitivity специфичное ть specific be PPV PPV NPV NPV Genfit NIS Genfit NIS 0,80 0.80 0,3993 0.3993 72,62% 72.62% 81,25% 81.25% 64,77% 64.77% 67,71 % 67.71 % 79,17 % 79.17 % hsa-miR193b-3p hsa-miR193b-3p 0,68 0.68 2,1829 2.1829 67,26% 67.26% 65,00% 65.00% 69,32% 69.32% 65,82 % 65.82 % 68,54 % 68.54 % TIP-1 TIP-1 0,68 0.68 248,50 248.50 64,88% 64.88% 65,00% 65.00% 64,77% 64.77% 62,65 % 62.65 % 67,06 % 67.06% CHI3L1 CHI3L1 0,68 0.68 56512,88 56512.88 65,48% 65.48% 65,00% 65.00% 65,91% 65.91% 63,42 % 63.42 % 67,44 % 67.44 % Количество тромбоцит OB Number of platelets OB 0,62 0.62 212,50 212.50 61,91% 61.91% 65,00% 65.00% 59,09% 59.09% 59,09 % 59.09% 65,00 % 65.00%

Оптимальная модель проверяется путем расчета AUC в 1000 бутстрэп-выборках. AUC составляла 0,80 (95% CI: 0,73-0,86). С использованием AUC оптимальной модели были определены 3 порога для предсказания пациентов как TBT или NTBT.The optimal model is tested by calculating the AUC in 1000 bootstrap samples. AUC was 0.80 (95% CI: 0.73-0.86). Using the AUC of the optimal model, 3 thresholds were determined to predict patients as TBT or NTBT.

1. Порог, ближайший к точке с 1-специфичность=0% и чувствительностью=100%, равнялся 0,3993. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.1. The threshold closest to the point with 1-specificity=0% and sensitivity=100% was 0.3993. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 72,62%.Overall accuracy: 72.62%.

Чувствительность: 81,25%.Sensitivity: 81.25%.

Специфичность: 64,77%.Specificity: 64.77%.

PPV: 67,71%.PPV: 67.71%.

NPV (отрицательная прогностическая ценность): 79,17%.NPV (Negative Predictive Value): 79.17%.

2. Порог, дающий чувствительность на уровне 90%, равнялся 0,3050. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.2. The threshold giving 90% sensitivity was 0.3050. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 70,24%.Overall accuracy: 70.24%.

Чувствительность: 90,00%.Sensitivity: 90.00%.

Специфичность: 52,27%.Specificity: 52.27%.

PPV (положительная прогностическая ценность): 63,16%.PPV (Positive Predictive Value): 63.16%.

NPV (отрицательная прогностическая ценность): 85,19%.NPV (Negative Predictive Value): 85.19%.

3. Порог, дающий специфичность, превышающую 90%, составил 0,6518. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.3. The threshold giving a specificity greater than 90% was 0.6518. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 70,24%.Overall accuracy: 70.24%.

Чувствительность: 47,50%.Sensitivity: 47.50%.

Специфичность: 90,91%.Specificity: 90.91%.

PPV (положительная прогностическая ценность): 82,61%.PPV (Positive Predictive Value): 82.61%.

NPV (отрицательная прогностическая ценность): 65,57%.NPV (Negative Predictive Value): 65.57%.

Второе моделирование с использованием подхода бутстрэп с уровнями микроРНК в log10 (копий.мкл-1) и биохимическими данными позволило отобрать шесть значимых переменных с miR-193b-3p для дифференциации пациентов TBT2 и пациентов NTBT2 (табл. 6). Эта модель сочетает в себе miR193b-3p, YKL-40, также называемым хитиназа-3 подобный белок 1 (CHI3L1), тканевый ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP-1), гликированный гемоглобин (HbA1c), гиалуроновую кислоту (HYUA2) и количество тромбоцитов для диагностирования подлежащих лечению пациентов с NASH или пациентов, имеющих риск развития NASH.A second modeling using a bootstrap approach with miRNA levels in log10 (copy.μl-1) and biochemical data allowed the selection of six significant variables with miR-193b-3p to differentiate between TBT2 patients and NTBT2 patients (Table 6). This model combines miR193b-3p, YKL-40, also called chitinase-3 like protein 1 (CHI3L1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), glycated hemoglobin (HbA1c), hyaluronic acid (HYUA2), and platelet count to diagnosing eligible patients with NASH or those at risk of developing NASH.

Пациенты из группы риска, подлежащие лечению, соответствуют следующим классам, полученным по биопсии печени: балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов > 1, балл по лобулярному воспалению > 1, NAS (показатель активности NAFLD) > 4 и стадия фиброза > 2 (например, стадия фиброза равна 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3).Patients at risk for treatment fit the following liver biopsy grades: steatosis score > 1, hepatocyte ballooning score > 1, lobular inflammation score > 1, NAS (NAFLD activity score) > 4, and fibrosis stage > 2 (for example, fibrosis stage is 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).

- 43 043299- 43 043299

Таблица 6Table 6

Выбранные переменные в оптимальной бутстрэп-модели для идентификации пациентов TBT2 в Golden_______________Selected Variables in the Optimal Bootstrap Model for TBT2 Patient Identification in Golden_______________

Постоянная I miR-193b-3p (loglO копий.мкл-1) YKL-40 или CHI3L1 TIMP-1 Constant I miR-193b-3p (loglO copies.µl-1) YKL-40 or CHI3L1 TIMP-1 Коэффициент -7,52 1,29 0,01 0,0092 Coefficient -7.52 1.29 0.01 0.0092 Р-значение 3,72Е-06 0,0028 0,0028 0,0097 p-value 3.72E-06 0.0028 0.0028 0.0097 95% CI -10,92 0,44 0,0035 0,0016 95%CI -10.92 0.44 0.0035 0.0016 -3,89 2,17 0,020 0,0018 -3.89 2.17 0.020 0.0018 HYUA2 HYUA2 -0,0024 -0.0024 0,0131 0.0131 -0,0053 -0.0053 0,0057 0.0057 HbAlc HbAlc 0,59 0.59 0,0042 0.0042 0,13 0.13 1,08 1.08 Количество тромбоцитов Platelet count -0,009 -0.009 0,0043 0.0043 -0,017 -0.017 -0,0027 -0.0027 Доверительный интервал=CI. Балл определяется как логистическая функция: ⁵²'1Confidence interval=CI. The score is defined as a logistic function: ⁵² '1 + е™ + e™

гдеWhere

Y2=I+a2 *A+c2 *C+b2 *B+e*E+g*G+d2 *D, гдеY2=I+a2 *A+c2 *C+b2 *B+e*E+g*G+d2 *D, where

S2 представляет собой балл NASH;S2 is the NASH score;

A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копии.мкл-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl-1;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

E представляет собой уровень HYUA2 в нг/мл;E is the level of HYUA2 in ng/ml;

G представляет собой уровень HbA1c в %;G is the HbA1c level in %;

D представляет собой количество тромбоцитов;D is the number of platelets;

I представляет собой число в диапазоне от -10,92 до -3,89.I is a number in the range -10.92 to -3.89.

Оптимальная модель проверяется путем расчета AUC в 1000 бутстрэп-выборках. AUC составляла 0,80 (95% CI: 0,74-0,86). С использованием AUC оптимальной модели был определен оптимальный порог для предсказания пациентов как TBT или NTBT.The optimal model is tested by calculating the AUC in 1000 bootstrap samples. AUC was 0.80 (95% CI: 0.74-0.86). Using the AUC of the optimal model, the optimal threshold for predicting patients as TBT or NTBT was determined.

1. Порог, ближайший к точке с 1-специфичность=0% и чувствительностью=100%, составил 0,4216. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.1. The threshold closest to the point with 1-specificity=0% and sensitivity=100% was 0.4216. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 74,31%.Overall accuracy: 74.31%.

Чувствительность: 73,68%.Sensitivity: 73.68%.

Специфичность: 74,80% PPV: 69,31%.Specificity: 74.80% PPV: 69.31%.

NPV: 78,63%.NPV: 78.63%.

2. Порог, дающий чувствительность выше 90%, составил 0,2461. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.2. The threshold giving a sensitivity above 90% was 0.2461. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 66,51%.Overall accuracy: 66.51%.

Чувствительность: 90,53%.Sensitivity: 90.53%.

Специфичность: 45,97%.Specificity: 45.97%.

PPV: 57,33%.PPV: 57.33%.

NPV: 86,76%.NPV: 86.76%.

3. Порог, дающий специфичность, превышающую 90%, составил 0,6252. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.3. The threshold giving a specificity greater than 90% was 0.6252. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 72,02%.Overall accuracy: 72.02%.

Чувствительность: 48,42%.Sensitivity: 48.42%.

Специфичность: 90,24%.Specificity: 90.24%.

PPV: 79,31%.PPV: 79.31%.

NPV: 69,38%.NPV: 69.38%.

Третье моделирование с использованием подхода бутстрэп с уровнями микроРНК в Cq и биохимическими данными позволило отобрать те же шесть значимых переменных с miR-193b-3p для дифференциации пациентов TBT2 и пациентов NTBT2 (табл. 6). Эта модель сочетает в себе miR-193b-3p, YKL-40, хитиназа-3 подобный белок 1 (CHI3L1), тканевый ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP-1), гликированный гемоглобин (HbA1c), гиалуроновую кислоту (HYUA2) и количество тромбоцитов для диагности- 44 043299 рования подлежащих лечению пациентов с NASH или пациентов, имеющих риск развития NASH.A third modeling using a bootstrap approach with miRNA levels in Cq and biochemical data allowed selection of the same six significant variables with miR-193b-3p to differentiate between TBT2 patients and NTBT2 patients (Table 6). This model combines miR-193b-3p, YKL-40, chitinase-3 like protein 1 (CHI3L1), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), glycated hemoglobin (HbA1c), hyaluronic acid (HYUA2), and platelet count to diagnosing eligible patients with NASH or those at risk of developing NASH.

Пациенты из группы риска, подлежащие лечению, соответствуют следующим классам, полученным при биопсии печени: балл по стеатозу > 1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS (показатель активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (например, стадия фиброза равна 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3).Patients at risk for treatment fit into the following liver biopsy grades: steatosis score > 1, hepatocyte ballooning score > 1, lobular inflammation score > 1, NAS (NAFLD activity score) > 4, and fibrosis stage > 2 (for example, fibrosis stage is 2, 3 or 4, in particular 2 or 3).

Таблица 6Table 6

Выбранные переменные в оптимальной модели бутстрэп для идентификации пациентов TBT2 в Golden ___________________Selected variables in the optimal bootstrap model for identifying TBT2 patients in Golden ___________________

Коэффициент Р-значение 95% CICoefficient P-value 95% CI

Постоянная ш constant w 8,08 8.08 0,0828 0.0828 -1,27 -1.27 17,54 17.54 miR193b-3p (Cq) miR193b-3p (Cq) -0,38 -0.38 0,0030 0.0030 -0,64 -0.64 -0,09 -0.09 YKL-40 или CHI3L1 YKL-40 or CHI3L1 0,01 0.01 0,0031 0.0031 0,005 0.005 0,019 0.019 TIMP-1 TIMP-1 0,01 0.01 0,0095 0.0095 0,001 0.001 0,016 0.016 HYUA2 HYUA2 -0,0024 -0.0024 0,0138 0.0138 -0,0054 -0.0054 0,0045 0.0045 HbAlc HbAlc 0,57 0.57 0,00460 0.00460 0,12 0.12 1,08 1.08 Количество тромбоцитов Platelet count -0,009 -0.009 0,0042 0.0042 -0,0164 -0.0164 -0,0016 -0.0016

Доверительный интервал=С1.Confidence interval=C1.

Балл определяется как логистическая функция:The score is defined as a logistic function:

S3гдеS3 where

Y3=m+a3 *A+c3 *C+b3 *B+e2*E+g2*G+d3 *D, гдеY3=m+a3 *A+c3 *C+b3 *B+e2*E+g2*G+d3 *D, where

S3 представляет собой балл NASH;S3 is the NASH score;

A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копии.мкл-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl-1;

C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml;

B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml;

E представляет собой уровень HYUA2 в нг/мл;E is the level of HYUA2 in ng/ml;

G представляет собой уровень HbA1c в %;G is the HbA1c level in %;

D представляет собой количество тромбоцитов;D is the number of platelets;

m представляет собой число в диапазоне от -1,27 до 17,54.m is a number in the range -1.27 to 17.54.

Оптимальная модель проверяется путем расчета AUC в 1000 бутстрэп-выборках. AUC составляла 0,80 (95% CI: 0,74-0,86). С использованием AUC оптимальной модели был определен оптимальный порог для предсказания пациентов как TBT или NTBT.The optimal model is tested by calculating the AUC in 1000 bootstrap samples. AUC was 0.80 (95% CI: 0.74-0.86). Using the AUC of the optimal model, the optimal threshold for predicting patients as TBT or NTBT was determined.

1. Порог, ближайший к точке с 1-специфичность=0% и чувствительностью=100%, составил 0,3741. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.1. The threshold closest to the point with 1-specificity=0% and sensitivity=100% was 0.3741. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 73,39%.Overall accuracy: 73.39%.

Чувствительность: 78,95%.Sensitivity: 78.95%.

Специфичность: 69,11%.Specificity: 69.11%.

PPV: 66,37% NPV: 80,95%.PPV: 66.37% NPV: 80.95%.

2. Порог, дающий чувствительность выше 90%, составил 0,2270. Соответствующие факторная таблица дала следующие показатели.2. The threshold giving a sensitivity above 90% was 0.2270. The corresponding factorial table gave the following figures.

Общая точность: 63,76%.Overall accuracy: 63.76%.

Чувствительность: 90,53%.Sensitivity: 90.53%.

Специфичность: 43,09%.Specificity: 43.09%.

PPV: 55,13%.PPV: 55.13%.

NPV: 85,48%.NPV: 85.48%.

3. Порог, дающий специфичность, превышающую 90%, составил 0,6364. Соответствующая факторная таблица дала следующие показатели.3. The threshold giving a specificity greater than 90% was 0.6364. The corresponding factor table gave the following figures.

Общая точность: 71,56%.Overall accuracy: 71.56%.

Чувствительность: 47,37%.Sensitivity: 47.37%.

Специфичность: 90,24%.Specificity: 90.24%.

PPV: 78,95%.PPV: 78.95%.

NPV: 68,94%.NPV: 68.94%.

- 45 043299- 45 043299

Как показано на фиг. 12 и 13, валидация алгоритмов Y2 (hsa-miR-193b-3p (log10 копий.мкл-1),As shown in FIG. 12 and 13, validation of Y2 algorithms (hsa-miR-193b-3p (log10 copies.µl-1),

YKL-40 или CHI3L1, TIMP-1, гиалуроновая кислота, HbA1c и количество тромбоцитов) и Y3 (hsa-miR193b-3p (Cq), YKL-40 или CHI3L1, TIMP-1, гиалуроновая кислота, HbA1c и количество тромбоцитов) в независимой когорте RESOLVE-IT привела к сопоставимой и даже большей AUC, составившей 0,81.YKL-40 or CHI3L1, TIMP-1, hyaluronic acid, HbA1c and platelet count) and Y3 (hsa-miR193b-3p (Cq), YKL-40 or CHI3L1, TIMP-1, hyaluronic acid, HbA1c and platelet count) in independent RESOLVE-IT cohort resulted in a comparable and even greater AUC of 0.81.

Как показано в табл. 7, выявление пациентов с повышенным риском даже улучшилось в независимой когорте, о чем свидетельствует положительная прогностическая ценность.As shown in Table. 7, the identification of patients at increased risk even improved in the independent cohort, as evidenced by the positive predictive value.

Таблица 7 Диагностические характеристики моделей Y2 и Y3 в GOLDEN-DIAG и RESOLVE-ITTable 7 Diagnostic characteristics of models Y2 and Y3 in GOLDEN-DIAG and RESOLVE-IT

Производитель ность Manufacturer ness Общая точность Overall Accuracy Чувствительно сть Sensitivity специфичность specificity PPV (%) PPV (%) NPV (%) NPV (%) Y2 GOLDEN DIAG Y2 GOLDEN DIAG 74,31% 74.31% 73,68 73.68 74,80 74.80 69,31 69.31 78,63 78.63 Y2 RESOLVE- IT Y2 RESOLVE- IT 70,61% 70.61% 55,73 55.73 87,72 87.72 83,91 83.91 63,29 63.29 Y3 GOLDEN DIAG Y3 GOLDEN DIAG 73,58% 73.58% 72,34 72.34 74,58 74.58 69,39 69.39 77,19 77.19 Y3 RESOLVE- IT Y3 RESOLVE- IT 74,79% 74.79% 77,69 77.69 71,43 71.43 75,94 75.94 73,39 73.39

PPV=положительная прогностическая ценность, NPV=отрицательная прогностическая ценность.PPV=Positive Predictive Value, NPV=Negative Predictive Value.

В заключение:Finally:

i) данные результаты, основанные на измерении уровней микроРНК в образцах сыворотки и плазмы с использованием двух разных методологий (HTG Edge-Seq NGS и количественная OT-ПЦР), подтверждают использование относящихся к hsa-mir193a-5p, hsa-miR193b-3p и hsa-193b-5p и, в более общем виде, hsa-miR193, олигонуклеотидов в качестве циркулирующих диагностических биомаркеров для идентификации пациентов с NAFLD (NAS>1), NASH (NAS>3, по меньшей мере 1 балл по стеатозу, по меньшей мере 1 балл по лобулярному воспалению и по меньшей мере 1 балл по баллонированию гепатоцитов), активным NASH (NAS>4, по меньшей мере 1 балл по стеатозу, по меньшей мере 1 балл по лобулярному воспалению и по меньшей мере 1 балл по баллонированию гепатоцитов), значительным фиброзом (F>2) и/или активным NASH и фиброзом (TBT1, TBT2, TBT7);i) These results, based on measuring miRNA levels in serum and plasma samples using two different methodologies (HTG Edge-Seq NGS and quantitative OT-PCR), confirm the use of hsa-mir193a-5p, hsa-miR193b-3p and hsa -193b-5p and, more generally, hsa-miR193, oligonucleotides as circulating diagnostic biomarkers to identify patients with NAFLD (NAS>1), NASH (NAS>3, at least 1 steatosis score, at least 1 lobular inflammation score and at least 1 hepatocyte ballooning score), active NASH (NAS>4, at least steatosis score 1, lobular inflammation score at least 1, and hepatocyte ballooning score of at least 1), significant fibrosis (F>2) and/or active NASH and fibrosis (TBT1, TBT2, TBT7);

ii) данные результаты, основанные на измерении уровней микроРНК в образцах сыворотки и плазмы, подтверждают использование видов hsa-miR193 в качестве циркулирующих диагностических биомаркеров для неинвазивной классификации гистологических очагов (стеатоз, лобулярное воспаление, баллонирование гепатоцитов), оценки активности NASH (NAS или индекс активности) и оценки тяжести заболевания (стадия фиброза) у субъекта;ii) these results, based on the measurement of microRNA levels in serum and plasma samples, support the use of hsa-miR193 species as circulating diagnostic biomarkers for non-invasive classification of histological lesions (steatosis, lobular inflammation, hepatocyte ballooning), assessment of NASH activity (NAS or activity index ) and assessment of disease severity (fibrosis stage) in the subject;

iii) данные результаты, основанные на измерении уровней микроРНК в образцах сыворотки и плазмы, подтверждают использование видов hsa-miR193 в качестве циркулирующих диагностических биомаркеров для неинвазивной классификации гистологических очагов (стеатоз, лобулярное воспаление, баллонирование гепатоцитов), оценки активности NASH (NAS или индекс активности) и оценки тяжести заболевания (стадия фиброза) у субъекта;iii) these results, based on the measurement of microRNA levels in serum and plasma samples, confirm the use of hsa-miR193 species as circulating diagnostic biomarkers for non-invasive classification of histological lesions (steatosis, lobular inflammation, hepatocyte ballooning), assessment of NASH activity (NAS or activity index ) and assessment of disease severity (fibrosis stage) in the subject;

iv) данные результаты, основанные на измерении уровней микроРНК в образцах сыворотки и плазмы, подтверждают использование видов hsa-miR193 в качестве циркулирующих биомаркеров для мониторинга эволюции активности NAFLD, активности NASH или стадии фиброза у одного и того же пациента, подвергающегося или не подвергающегося лечению лекарственным препаратом против NAFLD, лекарственным препаратом против NASH или противофиброзным лекарственным препаратом;iv) These results, based on measurements of miRNA levels in serum and plasma samples, support the use of hsa-miR193 species as circulating biomarkers to monitor the evolution of NAFLD activity, NASH activity, or fibrosis stage in the same drug-treated or untreated patient. an anti-NAFLD drug, an anti-NASH drug, or an anti-fibrosis drug;

v) наконец, уровень техники, связывающий уровень активности NASH с риском развития фиброза и связывающий стадию фиброза с риском отдаленных исходов печени (цирроз печени, трансплантация печени, HCC или отказ печени), поддерживает виды miR193 в качестве прогностических биомаркеров для оценки риска развития фиброза до цирроза и оценки риска долгосрочных серьезных осложнений.v) Finally, the state of the art linking the level of NASH activity to the risk of developing fibrosis and linking the stage of fibrosis to the risk of long-term liver outcomes (liver cirrhosis, liver transplantation, HCC or liver failure) supports miR193 species as predictive biomarkers for assessing the risk of developing fibrosis before cirrhosis and assess the risk of long-term serious complications.

vi) Оценка AUC для модели бутстреппинга, соответствующей пациенту с риском, как описано ранее, и объединение нескольких переменных статистически лучше, чем оценка AUC, полученная для отдельных переменных. Таким образом, комбинация нескольких переменных с помощью логистической функции согласно настоящему изобретению лучше и точнее, чем изучение одной переменной.vi) The AUC estimate for the bootstrapping model corresponding to the patient at risk as described previously and the pooling of several variables is statistically better than the AUC estimate obtained for the individual variables. Thus, the combination of several variables using the logistic function according to the present invention is better and more accurate than the study of one variable.

vii) Моделирование с помощью hsa-miR-193b-3p в Cq и моделирование с помощью hsa-miR-193b-3p в log10 копий.мкл-1 приводит к одинаковому выбору переменных: YKL-40 или CHI3L1, TIMP-1, гиалуроновая кислота, HbA1c и количество тромбоцитов.vii) Modeling with hsa-miR-193b-3p in Cq and modeling with hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl-1 results in the same choice of variables: YKL-40 or CHI3L1, TIMP-1, hyaluronic acid , HbA1c and platelet count.

viii) Сходство AUC между GOLDEN-DIAG и RESOLVE-IT и проверка диагностической ценности алгоритмов Y2 и Y3 в независимой когорте перекрестно проверяет мощность этих составных панелей биомаркеров.viii) AUC similarity between GOLDEN-DIAG and RESOLVE-IT and testing the diagnostic value of the Y2 and Y3 algorithms in an independent cohort cross-checks the power of these composite panels of biomarkers.

Claims (30)

1. Способ диагностики неалкогольной жировой дистрофии печени (NAFLD), включающий в себя определение уровня hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости субъекта, где уровень hsa-miR193b-3p сравнивают с контрольными уровнями hsa-miR-193b-3p, где уровень hsa-miR-193b-3p, который более высокий, чем контрольные уровни, полученные из образцов от здоровых субъектов без жирового гепатоза, указывает на присутствие NAFLD.1. A method for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which includes determining the level of hsa-miR-193b-3p in a sample of a biological fluid of a subject, where the level of hsa-miR193b-3p is compared with control levels of hsa-miR-193b-3p, where an hsa-miR-193b-3p level that is higher than control levels obtained from samples from healthy subjects without fatty liver indicates the presence of NAFLD. 2. Способ диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH), включающий в себя определение уровня hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости субъекта, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольными уровнями hsa-miR-193b-3p, где уровень hsa-miR-193b-3p, который более высокий, чем уровни контрольных диапазонов, полученные из образцов от субъекта, не страдающего NASH, указывает на присутствие NASH, определенное как 1 балл по стеатозу, лобулярному воспалению и баллонированию гепатоцитов;2. A method for diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which includes determining the level of hsa-miR-193b-3p in a sample of a biological fluid of a subject, where the level of hsa-miR-193b-3p is compared with control levels of hsa-miR-193b-3p, where an hsa-miR-193b-3p level that is higher than control range levels obtained from samples from a non-NASH subject indicates the presence of NASH, defined as 1 for steatosis, lobular inflammation, and hepatocyte ballooning; где уровень hsa-miR-193b-3p, который более высокий, чем уровень контрольного диапазона, полу- 47 043299 ченный из образцов от субъектов, не имеющих активную форму NASH, указывает на присутствие активной формы NASH.where an hsa-miR-193b-3p level that is higher than the control range level obtained from samples from subjects without active NASH indicates the presence of active NASH. 3. Способ диагностики фиброза печени, включающий определение уровня hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольными уровнями hsamiR-193b-3p, где уровень hsa-miR-193b-3p, который более высокий, чем контрольные уровни, полученные из образцов с отсутствующим или минимальным фиброзом печени (F=0 или 1), указывает на присутствие значительного (F=2), умеренного (F=3) или тяжелого (F=4) фиброза печени.3. A method for diagnosing liver fibrosis, including determining the level of hsa-miR-193b-3p in a sample of biological fluid, where the level of hsa-miR-193b-3p is compared with the control levels of hsamiR-193b-3p, where the level of hsa-miR-193b-3p , which is higher than control levels obtained from samples with no or minimal liver fibrosis (F=0 or 1), indicating the presence of significant (F=2), moderate (F=3), or severe (F=4) fibrosis liver. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором образец биологической жидкости представляет собой образец крови, плазмы или сыворотки.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the biological fluid sample is a blood, plasma or serum sample. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий в себя классификацию субъекта как потенциального получающего (TBT) или не получающего (NTBT) лечение NASH и/или фиброза печени, на основании обнаружения повышенного уровня hsa-miR-193b-3p относительно контрольного уровня hsa-miR-193b-3p, измеренного у субъектов NTBT.5. A method according to any one of the preceding claims, comprising classifying a subject as potentially receiving (TBT) or not receiving (NTBT) treatment for NASH and/or liver fibrosis, based on detection of an elevated level of hsa-miR-193b-3p relative to a control level of hsa -miR-193b-3p measured in NTBT subjects. 6. Способ по п.5, в котором субъекты, подлежащие лечению (TBT) и не подлежащего лечению (NTBT), имеют следующие оценки, полученные при биопсии печени:6. The method of claim 5, wherein the eligible (TBT) and non-treatable (NTBT) subjects have the following liver biopsy scores: a) TBT1:a) TBT1: балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (показатель активности NAFLD) >4, стадия фиброза >1 (например, стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4),NAS (NAFLD activity score) >4, fibrosis stage >1 (e.g., fibrosis stage of 1, 2, 3, or 4), NTBT1:NTBT1: отличается от TBT1 по меньшей мере на один пункт меньше, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS или стадии фиброза;differs from TBT1 by at least one point less in terms of steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, or fibrosis stage; илиor b) TBT2:b) TBT2: балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (показатель активности NAFLD) >4, стадия фиброза >2 (например, стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3),NAS (NAFLD activity score) >4, fibrosis stage >2 (e.g., fibrosis stage of 2, 3 or 4, in particular 2 or 3), NTBT2:NTBT2: отличается от TBT по меньшей мере на один пункт меньше, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS или стадии фиброза;differs from TBT by at least one point less in terms of steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, or fibrosis stage; илиor c) TBT7:c) TBT7: балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1,steatosis score >1, hepatocyte ballooning score >1, lobular inflammation score >1, NAS (показатель активности NAFLD) >4, стадия фиброза=1b, 1c, 2, 3 или 4,NAS (NAFLD activity score) >4, fibrosis stage=1b, 1c, 2, 3 or 4, NTBT7:NTBT7: отличается от TBT по меньшей мере на один пункт меньше, по баллам стеатоза, баллонирования гепатоцитов, лобулярного воспаления, NAS или стадии фиброза.differs from TBT by at least one point less in terms of steatosis, hepatocyte ballooning, lobular inflammation, NAS, or fibrosis stage. 7. Способ мониторинга NAFLD, NASH и/или фиброза печени, включающий определение уровня hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости субъекта, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольными уровнями hsa-miR-193b-3p из одного или более образцов биологической жидкости, полученных от того же субъекта в прошлом.7. A method for monitoring NAFLD, NASH and/or liver fibrosis, comprising determining the level of hsa-miR-193b-3p in a sample of a biological fluid of a subject, where the level of hsa-miR-193b-3p is compared with control levels of hsa-miR-193b-3p from one or more body fluid samples obtained from the same subject in the past. 8. Способ по п.7, включающий в себя мониторинг эволюции активности NAFLD, активности NASH или фиброза печени у субъекта на основе эволюции уровня hsa-miR-193b-3p в образцах, собранных в два или более разных моментов времени у одного и того же субъекта.8. The method of claim 7, comprising monitoring the evolution of NAFLD activity, NASH activity, or liver fibrosis in a subject based on the evolution of hsa-miR-193b-3p levels in samples collected at two or more different time points from the same subject. 9. Способ определения эффективности лечения NAFLD, NASH и/или фиброза, включающий определение уровня hsa-miR-193b-3p в образце биологической жидкости субъекта, где уровень hsa-miR-193b3p сравнивают с контрольными уровнями hsa-miR-193b-3p из одного или более образцов биологической жидкости, полученных от того же субъекта в прошлом.9. A method for determining the effectiveness of the treatment of NAFLD, NASH and/or fibrosis, including determining the level of hsa-miR-193b-3p in a sample of a biological fluid of a subject, where the level of hsa-miR-193b3p is compared with control levels of hsa-miR-193b-3p from one or more body fluid samples obtained from the same subject in the past. 10. Способ по п.9 для оценки эффективности лечения NAFLD, NASH или фиброза печени, основанный на эволюции уровня hsa-miR-193b-3p в образцах, собранных в два или более разных моментов времени у одного и того же субъекта, прошедшего лечение.10. The method of claim 9 for evaluating the efficacy of treatment for NAFLD, NASH, or liver fibrosis based on the evolution of hsa-miR-193b-3p levels in samples collected at two or more different time points from the same treated subject. 11. Применение соединения против NAFLD в способе лечения субъекта, имеющего NAFLD, при этом субъект диагностирован или классифицирован как подлежащий лечению пациент вследствие NAFLD по любому из пп.1, 4-6, и введение указанного соединения указанному диагностированному11. Use of an anti-NAFLD compound in a method of treating a subject having NAFLD, wherein the subject is diagnosed or classified as a treatable patient due to NAFLD according to any one of claims 1, 4-6, and administering said compound to said diagnosed patient. - 48 043299 субъекту, где указанная молекула представлена формулой (I)- 48 043299 to the subject, where the specified molecule is represented by formula (I) гдеWhere X1 представляет собой галоген, группу R1 или G1-R1;X1 is halo, R1 or G1-R1; A представляет собой CH=CH или группу CH2-CH2;A represents CH=CH or a CH2-CH2 group; X2 представляет собой группу G2-R2;X2 is a G2-R2 group; G1 представляет собой атом кислорода;G1 represents an oxygen atom; G2 представляет собой атом кислорода или серы;G2 represents an oxygen or sulfur atom; R1 представляет собой атом водорода, незамещенную алкильную группу, арильную группу или алкильную группу, которая замещена одним или несколькими атомами галогена, алкокси или алкилтиогруппу, циклоалкильные группы, циклоалкилтиогруппы или гетероциклические группы;R1 represents a hydrogen atom, an unsubstituted alkyl group, an aryl group, or an alkyl group which is substituted by one or more halogen atoms, an alkoxy or alkylthio group, cycloalkyl groups, cycloalkylthio groups, or heterocyclic groups; R2 представляет собой алкильную группу, замещенную, по меньшей мере, группой -COOR3, где R3 представляет собой атом водорода или алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами или гетероциклическими группами,R2 is an alkyl group substituted with at least a -COOR3 group, where R3 is a hydrogen atom or an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups or heterocyclic groups, R4 и R5, одинаковые или разные, представляют собой алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами, гетероциклическими группами;R4 and R5, the same or different, represent an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups, heterocyclic groups; или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 12. Применение соединения против NASH в способе лечения субъекта, имеющего NASH, при этом субъект диагностирован или классифицирован как подлежащий лечению пациент вследствие NASH по любому из пп.2, 4-6, и введение указанного соединения указанному диагностированному субъекту, где указанная молекула представлена формулой (I)12. Use of an anti-NASH compound in a method of treating a subject having NASH, wherein the subject is diagnosed or classified as a treatable patient due to NASH according to any one of claims 2, 4-6, and administering said compound to said diagnosed subject, wherein said molecule is represented by the formula (I) гдеWhere X1 представляет собой галоген, группу R1 или G1-R1;X1 is halo, R1 or G1-R1; A представляет собой CH=CH или группу CH2-CH2;A represents CH=CH or a CH2-CH2 group; X2 представляет собой группу G2-R2;X2 is a G2-R2 group; G1 представляет собой атом кислорода;G1 represents an oxygen atom; G2 представляет собой атом кислорода или серы;G2 represents an oxygen or sulfur atom; R1 представляет собой атом водорода, незамещенную алкильную группу, арильную группу или алкильную группу, которая замещена одним или несколькими атомами галогена, алкокси или алкилтиогруппу, циклоалкильные группы, циклоалкилтиогруппы или гетероциклические группы;R1 represents a hydrogen atom, an unsubstituted alkyl group, an aryl group, or an alkyl group which is substituted by one or more halogen atoms, an alkoxy or alkylthio group, cycloalkyl groups, cycloalkylthio groups, or heterocyclic groups; R2 представляет собой алкильную группу, замещенную, по меньшей мере, группой -COOR3, где R3 представляет собой атом водорода или алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами или гетероциклическими группами,R2 is an alkyl group substituted with at least a -COOR3 group, where R3 is a hydrogen atom or an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups or heterocyclic groups, R4 и R5, одинаковые или разные, представляют собой алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами, гетероциклическими группами;R4 and R5, the same or different, represent an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups, heterocyclic groups; или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 13. Применение соединения против фиброза в способе лечения субъекта, имеющего фиброз печени, соответственно, при этом субъект диагностирован или классифицирован как подлежащий лечению пациент вследствие фиброза печени по любому из пп.3-6, и введение указанного соединения указанному диагностированному субъекту, где указанная молекула представлена формулой (I)13. Use of an anti-fibrosis compound in a method of treating a subject having liver fibrosis, respectively, wherein the subject is diagnosed or classified as a patient to be treated due to liver fibrosis according to any one of claims 3 to 6, and administering said compound to said diagnosed subject, wherein said molecule represented by formula (I) гдеWhere X1 представляет собой галоген, группу R1 или G1-R1;X1 is halo, R1 or G1-R1; A представляет собой CH=CH или группу CH2-CH2;A represents CH=CH or a CH2-CH2 group; - 49 043299- 49 043299 X2 представляет собой группу G2-R2;X2 is a G2-R2 group; G1 представляет собой атом кислорода;G1 represents an oxygen atom; G2 представляет собой атом кислорода или серы;G2 represents an oxygen or sulfur atom; R1 представляет собой атом водорода, незамещенную алкильную группу, арильную группу или алкильную группу, которая замещена одним или несколькими атомами галогена, алкокси или алкилтиогруппу, циклоалкильные группы, циклоалкилтиогруппы или гетероциклические группы;R1 represents a hydrogen atom, an unsubstituted alkyl group, an aryl group, or an alkyl group which is substituted by one or more halogen atoms, an alkoxy or alkylthio group, cycloalkyl groups, cycloalkylthio groups, or heterocyclic groups; R2 представляет собой алкильную группу, замещенную, по меньшей мере, группой -COOR3, где R3 представляет собой атом водорода или алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами или гетероциклическими группами,R2 is an alkyl group substituted with at least a -COOR3 group, where R3 is a hydrogen atom or an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups or heterocyclic groups, R4 и R5, одинаковые или разные, представляют собой алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами, гетероциклическими группами;R4 and R5, the same or different, represent an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups, heterocyclic groups; или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 14. Применение ингибирующего hsa-miR-193b-3p соединения в способе лечения субъекта, имеющего NAFLD, где ингибирующее hsa-miR-193b-3p соединение выбирают из двухцепочечных РНК, антагомиров, антисмысловых нуклеиновых кислот и ферментативных молекул для РНК.14. Use of an hsa-miR-193b-3p inhibitory compound in a method of treating a subject having NAFLD, wherein the hsa-miR-193b-3p inhibitory compound is selected from double-stranded RNAs, antagonists, antisense nucleic acids, and RNA enzymatic molecules. 15. Применение ингибирующего hsa-miR-193b-3p соединения в способе лечения субъекта, имеющего NASH, где ингибирующее hsa-miR-193b-3p соединение выбирают из двухцепочечных РНК, антагомиров, антисмысловых нуклеиновых кислот и ферментативных молекул для РНК.15. Use of an hsa-miR-193b-3p inhibitory compound in a method of treating a subject having NASH, wherein the hsa-miR-193b-3p inhibitory compound is selected from double-stranded RNAs, antagonists, antisense nucleic acids, and RNA enzymatic molecules. 16. Применение ингибирующего hsa-miR-193b-3p соединения в способе лечения субъекта, имеющего фиброз печени, где ингибирующее hsa-miR-193b-3p соединение выбирают из двухцепочечных РНК, антагомиров, антисмысловых нуклеиновых кислот и ферментативных молекул для РНК.16. Use of an hsa-miR-193b-3p inhibitory compound in a method of treating a subject having hepatic fibrosis, wherein the hsa-miR-193b-3p inhibitory compound is selected from double-stranded RNAs, antagonists, antisense nucleic acids, and RNA enzymatic molecules. 17. Применение ингибирующего hsa-miR-193b-3p соединения по любому из пп.14-16, при этом субъект был диагностирован или классифицирован для лечения по любому из пп.1-6.17. Use of an hsa-miR-193b-3p inhibitory compound according to any one of claims 14-16, wherein the subject has been diagnosed or classified for treatment according to any one of claims 1-6. 18. Способ диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH) и/или определения активности, стадии или тяжести NASH у субъекта, включающий в себя измерение уровня циркулирующей hsa-miR193b-3p в крови, сыворотке или плазме крови и по меньшей мере одного другого циркулирующего в крови, сыворотке или плазме маркера повреждения печени, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольным уровнем hsa-miR-193b-3p.18. A method for diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and/or determining the activity, stage or severity of NASH in a subject, comprising measuring the level of circulating hsa-miR193b-3p in blood, serum or blood plasma and at least one other circulating in blood, serum or plasma marker of liver damage, where the level of hsa-miR-193b-3p is compared with the control level of hsa-miR-193b-3p. 19. Способ классификации субъекта как получающего или не получающего лечение NASH и/или для классификации пациента в качестве потенциального респондера или нереспондера на медикаментозное лечение, включающий в себя измерение уровня циркулирующей hsa-miR-193b-3 в крови, сыворотке или плазме крови и по меньшей мере одного другого циркулирующего в крови, сыворотке или плазме маркера повреждения печени, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольным уровнем hsa-miR193b-3p.19. A method for classifying a subject as receiving or not receiving NASH treatment and/or for classifying a patient as a potential responder or non-responder to drug treatment, comprising measuring the level of circulating hsa-miR-193b-3 in blood, serum or plasma and at least one other circulating blood, serum, or plasma marker of liver injury, wherein the hsa-miR-193b-3p level is compared to a control hsa-miR193b-3p level. 20. Способ определения прогрессирования или репрессирования патологии у пациентов с NASH и/или для предсказания исхода заболевания у пациента, включающий в себя измерение уровня циркулирующей hsa-miR-193b-3p в крови, сыворотке или плазме крови и по меньшей мере одного другого циркулирующего в крови, сыворотке или плазме маркера повреждения печени, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольным уровнем hsa-miR-193b-3p.20. A method for determining the progression or repression of pathology in patients with NASH and/or for predicting the outcome of the disease in a patient, including measuring the level of circulating hsa-miR-193b-3p in blood, serum or blood plasma and at least one other circulating in blood, serum or plasma marker of liver damage, where the level of hsa-miR-193b-3p is compared with the control level of hsa-miR-193b-3p. 21. Способ определения суррогатных маркеров клинически значимых результатов, включающий в себя измерение уровня циркулирующей hsa-miR-193b-3p в крови, сыворотке или плазме крови и по меньшей мере одного другого циркулирующего в крови, сыворотке или плазме маркера повреждения печени, где уровень hsa-miR-193b-3p сравнивают с контрольным уровнем hsa-miR-193b-3p.21. A method for determining surrogate markers of clinically significant results, including measuring the level of circulating hsa-miR-193b-3p in blood, serum or plasma and at least one other circulating blood, serum or plasma marker of liver damage, where the level of hsa -miR-193b-3p is compared with the control level hsa-miR-193b-3p. 22. Способ по любому из пп.18 или 21, в котором указанный по меньшей мере один другой циркулирующий маркер повреждения печени выбирают из группы, состоящей из TIMP-1, YKL-40, количества тромбоцитов, HbA1c и гиалуроновой кислоты.22. The method of any one of claims 18 or 21, wherein said at least one other circulating liver injury marker is selected from the group consisting of TIMP-1, YKL-40, platelet count, HbA1c, and hyaluronic acid. 23. Способ по п.22, дополнительно включающий в себя определение балла метаболического синдрома у субъекта.23. The method of claim 22, further comprising determining a metabolic syndrome score in the subject. 24. Способ по любому из пп.18-23, включающий в себя этапы:24. The method according to any one of claims 18-23, including the steps: измерение уровня hsa-miR-193b-3p и по меньшей мере одного маркера повреждения печени, циркулирующего в крови, сыворотке или плазме, и объединение результатов с помощью математического алгоритма для получения балла NASH.measuring the level of hsa-miR-193b-3p and at least one marker of liver damage circulating in the blood, serum or plasma, and combining the results using a mathematical algorithm to obtain a NASH score. 25. Способ по п.23, в котором балл NASH рассчитывают в соответствии со следующей логистической функцией:25. The method of claim 23, wherein the NASH score is calculated according to the following logistic function: г¹ гдеr ¹ where Y1=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, при этомY1=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F, while S1 представляет собой балл NASH;S1 is the NASH score; - 50 043299- 50 043299 A представляет собой уровень miR-193b-3p в log10 копий.мкл^-1;A is the level of miR-193b-3p in log10 copies.µl ^-1 ; B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml; C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml; D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l; F представляет собой метаболический синдром в категории;F represents the metabolic syndrome in the category; k представляет собой константу логистической функции;k is a logistic function constant; a представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p; b представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b is the coefficient associated with the level of TIMP-1; c представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c is the coefficient associated with the level of YKL-40; d представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов; и f представляет собой коэффициент, связанный с метаболическим синдромом, при этом способ получен из модели бутстреппинга, в которой k представляет собой число в диапазоне от -8,39 до -2,67, в частности -5,53, a представляет собой число в диапазоне от 0,58 до 2,50, в частности 1,54, b представляет собой число в диапазоне от 2,29E-03 до 1,87E-02, в частности 1,05E-02, с представляет собой число в диапазоне от 2,14E-06 до 1,65E-05, в частности 9,34E-06, d представляет собой число в диапазоне от -1,56E-02 до -1,05E-03, в частности -8,32E-03, f представляет собой число в диапазоне от 0,03 до 1,63, в частности 0,83, и при этом пороговое значение составляет от 0,3050 до 0,6518, в частности 0,3993, при этом балл NASH, превышающий пороговое значение, составляющее от 0,2017 до 0,4645, в частности, равное 0,2302, указывает на тяжелый NASH или на умеренную или высокую активность NASH; и, следовательно, является показателем того, что пациент имеет балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2.d is a coefficient related to platelet count; and f is a coefficient associated with the metabolic syndrome, wherein the method is derived from a bootstrapping model where k is a number in the range -8.39 to -2.67, in particular -5.53, a is a number in in the range from 0.58 to 2.50, in particular 1.54, b is a number in the range from 2.29E-03 to 1.87E-02, in particular 1.05E-02, c is a number in the range from 2.14E-06 to 1.65E-05, in particular 9.34E-06, d is a number in the range -1.56E-02 to -1.05E-03, in particular -8.32E-03, f is a number in the range of 0.03 to 1.63, such as 0.83, with a threshold value of 0.3050 to 0.6518, such as 0.3993, with a NASH score greater than the threshold 0.2017 to 0.4645, in particular 0.2302, indicates severe NASH or moderate or high NASH activity; and therefore is an indication that the patient has a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2. 26. Способ по п.23, в котором балл NASH рассчитывают в соответствии со следующей логистической функцией:26. The method of claim 23, wherein the NASH score is calculated according to the following logistic function: гдеWhere Y2=l+a2*A+c2*C+b2*B+e*E+g*G+d2*D, при этомY2=l+a2*A+c2*C+b2*B+e*E+g*G+d2*D, while S2 представляет собой балл NASH;S2 is the NASH score; A представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в log10 копий.мкл^-1;A is the level of hsa-miR-193b-3p in log10 copies.µl ^-1 ; C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml; B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml; E представляет собой уровень HbA1c в процентах;E is the HbA1c level in percent; G представляет собой уровень гиалуроновой кислоты в нг/мл;G is the level of hyaluronic acid in ng/ml; D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l; l представляет собой константу логистической функции;l is a constant of the logistic function; а2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a2 is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p; c2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c2 is the coefficient associated with the level of YKL-40; b2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b2 is the coefficient associated with the level of TIMP-1; e представляет собой коэффициент, связанный с уровнем HbA1c;e is the coefficient associated with the level of HbA1c; g представляет собой коэффициент, связанный с уровнем гиалуроновой кислоты;g is a coefficient related to the level of hyaluronic acid; d2 представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов, при этом способ получен из модели бутстреппинга, в которой l представляет собой число в диапазоне от -10,92 до -3,89, в частности -7,52, a2 представляет собой число в диапазоне от 0,44 до 2,17, в частности 1,29, с2 представляет собой число в диапазоне от 0,0035 до 0,02, в частности 0,01, Ь2 представляет собой число в диапазоне от 0,0016 до 0,018, в частности 0,0092, e представляет собой число в диапазоне от -0,0053 до 0,0057, в частности -0,0024, g представляет собой число в диапазоне от 0,13 до 1,08, в частности 0,59, d2 представляет собой число в диапазоне от -0,017 до -0,0027, в частности -0,009, и при этом пороговое значение составляет от 0,2461 до 0,6252, в частности 0,4216, при этом балл NASH, превышающий пороговое значение, составляющее от 0,2461 до 0,6252, в частности, равное 0,4216, указывает на тяжелый NASH или умеренную или высокую активность NASH; и, следовательно, является показателем того, что пациент имеет балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2.d2 is a factor related to platelet count, the method being derived from a bootstrapping model where l is a number in the range -10.92 to -3.89, in particular -7.52, a2 is a number in the range from 0.44 to 2.17, in particular 1.29, c2 is a number in the range from 0.0035 to 0.02, in particular 0.01, b2 is a number in the range from 0.0016 to 0.018, in in particular 0.0092, e is a number in the range -0.0053 to 0.0057, in particular -0.0024, g is a number in the range 0.13 to 1.08, in particular 0.59, d2 is a number in the range -0.017 to -0.0027, such as -0.009, and wherein the threshold is from 0.2461 to 0.6252, such as 0.4216, with a NASH score greater than the threshold of from 0.2461 to 0.6252, in particular, equal to 0.4216, indicates severe NASH or moderate or high NASH activity; and therefore is an indication that the patient has a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2. 27. Способ по п.23, в котором показатель NASH рассчитывают в соответствии со следующей логистической функцией:27. The method of claim 23, wherein the NASH score is calculated according to the following logistic function: - 51 043299 «Л³ - 51 043299 "L ³ S3 - ——γ7S3 - ——γ7 1 + e^V3 где1 + e ^V3 where Y3=m+a3 *A'+c3 *C+b3 *B+e2*E+g2*G+d3 *D, при этомY3=m+a3 *A'+c3 *C+b3 *B+e2*E+g2*G+d3 *D, while S3 представляет собой балл NASH согласно настоящему изобретению;S3 is the NASH score according to the present invention; A' представляет собой уровень hsa-miR-193b-3p в Cq;A' represents the level of hsa-miR-193b-3p in Cq; C представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;C is the level of YKL-40 in pg/ml; B представляет собой уровень TIMP-1 в нг/мл;B is the level of TIMP-1 in ng/ml; E представляет собой уровень HbA1c в процентах;E is the HbA1c level in percent; G представляет собой уровень гиалуроновой кислоты в нг/мл;G is the level of hyaluronic acid in ng/ml; D представляет собой количество тромбоцитов: 10⁹/л;D is the number of platelets: 10 ⁹ /l; m представляет собой константу логистической функции;m is a logistic function constant; a3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем hsa-miR-193b-3p;a3 is the coefficient associated with the level of hsa-miR-193b-3p; c3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем YKL-40;c3 is the coefficient associated with the level of YKL-40; b3 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем TIMP-1;b3 is the coefficient associated with the level of TIMP-1; e2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем HbA1c;e2 is the coefficient associated with the level of HbA1c; g2 представляет собой коэффициент, связанный с уровнем гиалуроновой кислоты;g2 is the coefficient associated with the level of hyaluronic acid; d3 представляет собой коэффициент, связанный с количеством тромбоцитов, при этом способ получен из модели бутстреппинга, в которой m представляет собой число в диапазоне от -1,27 до 17,54, в частности 8,08, a3 представляет собой число в диапазоне от -0,64 до -0,09, в частности -0,38, c3 представляет собой число в диапазоне от 0,005 до 0,019, в частности 0,01, b3 представляет собой число в диапазоне от 0,001 до 0,016, в частности 0,01, e2 представляет собой число в диапазоне от -0,0054 до 0,0045, в частности 0,0024, g2 представляет собой число в диапазоне от 0,12 до 1,08, в частности 0,57, d3 представляет собой число в диапазоне от -0,0164 до -0,0016, в частности -0,0090, и при этом пороговое значение составляет от 0,2270 до 0,6364, в частности 0,3741, при этом балл NASH выше порогового значения, составляющего от 0,2270 до 0,6364, в частности, равного 0,3741, указывает на тяжелый NASH или умеренную или высокую активность NASH; и, следовательно, является показателем того, что пациент имеет балл по стеатозу >1, балл по баллонированию гепатоцитов >1, балл по лобулярному воспалению >1, NAS >4 и стадию фиброза >2.d3 is a factor related to platelet count, the method being derived from a bootstrapping model where m is a number in the range -1.27 to 17.54, in particular 8.08, a3 is a number in the range - 0.64 to -0.09, in particular -0.38, c3 is a number in the range of 0.005 to 0.019, in particular 0.01, b3 is a number in the range of 0.001 to 0.016, in particular 0.01, e2 is a number in the range of -0.0054 to 0.0045, in particular 0.0024, g2 is a number in the range of 0.12 to 1.08, in particular 0.57, d3 is a number in the range of -0.0164 to -0.0016, in particular -0.0090, and wherein the threshold is between 0.2270 and 0.6364, in particular 0.3741, with a NASH score above a threshold of 0, 2270 to 0.6364, in particular equal to 0.3741, indicates severe NASH or moderate to high NASH activity; and therefore is an indication that the patient has a steatosis score >1, a hepatocyte ballooning score >1, a lobular inflammation score >1, a NAS >4, and a fibrosis stage >2. 28. Набор для определения уровня (i) hsa-miR-193b-3p, (ii) по меньшей мере одного маркера повреждения печени, циркулирующего в крови, плазме или сыворотке, где набор содержит средства для определения уровней hsa-miR-193b-3p и циркулирующий (циркулирующие) маркер(ы) повреждения печени.28. A kit for determining the level of (i) hsa-miR-193b-3p, (ii) at least one marker of liver damage circulating in blood, plasma or serum, where the kit contains means for determining the levels of hsa-miR-193b-3p and circulating marker(s) of liver injury. 29. Набор по п.28, содержащий средство для определения уровня (i) hsa-miR-193b-3p;29. Set according to item 28, containing a tool for determining the level of (i) hsa-miR-193b-3p; (ii) по меньшей мере одного маркера повреждения печени, циркулирующего в крови, плазме или сыворотке, соответствующего применяемому в способе по любому из пп.1-27.(ii) at least one liver injury marker circulating in blood, plasma or serum, corresponding to that used in the method according to any one of claims 1-27. 30. Применение молекулы против NASH в способе лечения NASH, при этом указанную молекулу против NASH вводят пациенту, нуждающемуся в этом, диагностированному как имеющему NASH или классифицированному по способу по любому из пп.2, 4-6, в частности классифицированному как получатель лечения NASH, при этом указанная молекула имеет формулу (I)30. The use of an anti-NASH molecule in a method of treating NASH, wherein said anti-NASH molecule is administered to a patient in need thereof, diagnosed as having NASH or classified by the method of any one of claims 2, 4-6, in particular classified as a recipient of NASH treatment , wherein said molecule has the formula (I) в которойwherein X1 представляет собой галоген, группу R1 или G1-R1;X1 is halo, R1 or G1-R1; A представляет собой CH=CH или группу CH2-CH2;A represents CH=CH or a CH2-CH2 group; X2 представляет группу G2-R2;X2 represents the G2-R2 group; G1 представляет собой атом кислорода;G1 represents an oxygen atom; G2 представляет собой атом кислорода или серы;G2 represents an oxygen or sulfur atom; R1 представляет собой атом водорода, незамещенную алкильную группу, арильную группу или алкильную группу, которая замещена одним или несколькими атомами галогена, алкокси или алкилтиогруппу, циклоалкильные группы, циклоалкилтиогруппы или гетероциклические группы;R1 represents a hydrogen atom, an unsubstituted alkyl group, an aryl group, or an alkyl group which is substituted by one or more halogen atoms, an alkoxy or alkylthio group, cycloalkyl groups, cycloalkylthio groups, or heterocyclic groups; - 52 043299- 52 043299 R2 представляет собой алкильную группу, замещенную, по меньшей мере, группой -COOR3, где R3 представляет собой атом водорода или алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами или гетероциклическими группами,R2 is an alkyl group substituted with at least a -COOR3 group, where R3 is a hydrogen atom or an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups or heterocyclic groups, R4 и R5, одинаковые или разные, представляют собой алкильную группу, которая замещена или не замещена одним или несколькими атомами галогена, циклоалкильными группами, гетероциклическими группами;R4 and R5, the same or different, represent an alkyl group which is substituted or unsubstituted by one or more halogen atoms, cycloalkyl groups, heterocyclic groups; или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.