EA039892B1 - Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов - Google Patents

Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов Download PDF

Info

Publication number
EA039892B1
EA039892B1 EA201291100A EA201291100A EA039892B1 EA 039892 B1 EA039892 B1 EA 039892B1 EA 201291100 A EA201291100 A EA 201291100A EA 201291100 A EA201291100 A EA 201291100A EA 039892 B1 EA039892 B1 EA 039892B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
eleven
gene
lipid
independently
alkyl
Prior art date
Application number
EA201291100A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201291100A1 (ru
Inventor
Мутиах Манохаран
Мартин Майер
Мутусами Джаяраман
Сигео Мацуда
Нараянаннаир К. Джаяпракаш
Каллантоттатил Г. Раджив
Акин Акинг
Томас А. Бэйли
Original Assignee
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority claimed from PCT/US2011/039164 external-priority patent/WO2011153493A2/en
Publication of EA201291100A1 publication Critical patent/EA201291100A1/ru
Publication of EA039892B1 publication Critical patent/EA039892B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/62—Quaternary ammonium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к катионному липиду, имеющему одну или более биоразлагаемых групп, расположенных в средней или дистальной части липидного фрагмента (например, гидрофобной цепи) катионного липида, и представляющему собой соединение формулы IA-1или его соль. Эти катионные липиды могут быть включены в липидные частицы для доставки активных агентов, таких как нуклеиновые кислоты. Изобретение также относится к липидным частицам, содержащим нейтральные липиды, липиды, способные снизить агрегацию, катионный липид настоящего изобретения и, возможно, стеролы. Липидная частица может дополнительно включать в себя терапевтический агент, такой как нуклеиновая кислота.

Description

Заявление об установлении приоритета
Данная заявка утверждает приоритет заявки на патент США № 61/351146, поданной 3 июня 2010 года, и заявки на патент США № 61/489197, поданной 23 мая 2011, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники
Настоящее изобретение относится к биологическим липидам и их использованию для доставки активных агентов, таких как нуклеиновые кислоты.
Уровень техники
Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, например, малые интерферирующие РНК (миРНК), микро-РНК (микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антисмысловые, антагомир, антимир, модели микроРНК, супермир, U1 адаптер и аптамер. Эти нуклеиновые кислоты действуют через различные механизмы. В случае миРНК или микроРНК эти нуклеиновые кислоты могут понижать внутриклеточные уровни определенных белков в процессе, называемом РНК-интерференция (РНКи). После введения миРНК или микроРНК в цитоплазму клетки, эти двухцепочечные РНК образуют связи с белком, называемым RISC. Смысловые нити миРНК или микроРНК смещаются от комплекса RISC, обеспечивающего шаблон в RISC, который может распознавать и связывать мРНК с комплементарной последовательностью, что и связанные миРНК или микроРНК. Имеющаяся связь комплементарной мРНК с комплексом RISC расщепляет мРНК и высвобождает расщепляемые нити. РНКи может обеспечить понижающее регулирование конкретных белков, ориентированных на специфическую деструкцию соответствующих мРНК, которые кодируют синтез белка.
Терапевтическое применение РНК-интерференции чрезвычайно широко, так как миРНК и микроРНК конструкции могут быть синтезированы с любой нуклеотидной последовательностью, направленной против целевого белка. На сегодняшний день миРНК конструкции показали способность специфически понижающе регулировать целевые белки в in vitro и in vivo моделях. Кроме того, миРНК конструкции в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях.
Тем не менее, двумя проблемами, с которыми сталкивается в настоящее время миРНК или микроРНК конструкции являются, во-первых, их восприимчивость к нуклеазам расщепления в плазме крови и, во-вторых, их ограниченные возможности для получения доступа к внутриклеточной области, где они могут связывать RISC при системном введении в виде свободного миРНК или микроРНК. Эти двухцепочечные конструкции могут быть стабилизированы путем включения химически модифицированного нуклеотидного линкера внутрь молекулы, например, фосфоротиоатных групп. Однако эти химические модификации обеспечивают только ограниченную защиту от нуклеаз расщепления и могут снижать активность конструкции. Внутриклеточная доставка миРНК или микроРНК может быть облегчена путем использования систем переноса, таких как полимеры, катионные липосомы или путем химической модификации конструкции, например, путем ковалентного присоединения молекул холестерина. Тем не менее, улучшение систем доставки необходимо для повышения потенции миРНК и микроРНК молекул и уменьшения или устранения потребности в химической модификации.
Антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы могут также ингибировать мРНК трансляцию в белки. В случае антисмысловых конструкций, эти одноцепочечные диоксинуклеотидные кислоты имеют комплементарные последовательности, что и мРНК белка-мишени, и могут связываться с мРНК путем спаривания оснований Уотсона-Крика. Это связывание либо препятствует трансляции мРНКмишени и/или триггеров РНКазы H деградации мРНК транскриптов. Следовательно, антисмысловые олигонуклеотиды имеют огромный потенциал для специфичности действия (т.е. понижающего регулирования конкретных заболеваний, связанных с белком). На сегодняшний день эти соединения показали себя многообещающими в нескольких in vitro и in vivo моделях, включая модели воспалительных заболеваний, рака и ВИЧ (см. обзор в Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)). Антисмысловые также могут влиять на клеточную активность путем гибридизации именно с хромосомной ДНК. Расширенные клинические оценки на людях нескольких антисмысловых препаратов в настоящее время ведутся. Цели этих препаратов включают гены bcl2 и аполипопротеина B и мРНК продуктов.
Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают дезоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты. В случае дезоксирибонуклеиновой кислоты, определение последовательностей или мотивов показало запрещенную иммунную стимуляцию у млекопитающих. Эти последовательности или мотивы включают CpG мотив, богатые пиримидином последовательности и палиндромные последовательности. Считается, что CpG мотив в дезоксирибонуклеиновой кислоте специфически распознается эндосомальным рецептором, толл-подобным рецептором 9 (TLR 9), который затем запускает как врожденный, так и приобретенный иммунитет путем стимуляции. О некоторых иммуностимулирующих последовательностях рибонуклеиновой кислоты также сообщается. Считается, что эти последовательности РНК могут вызвать иммунную активацию путем связывания с толл-подобными рецепторами 6 и 7 (TLR 6 и TLR 7). Кроме того, двухцепочечные РНК, как также сообщается, могут быть иммуностимулирующими, и они предположительно активируются путем связывания с TLR3.
Одна известная проблема с использованием терапевтических нуклеиновых кислот относится к ус- 1 039892 тойчивости фосфодиэфирной межнуклеотидной связи и восприимчивостью этого линкера к нуклеазам. Наличие экзонуклеаз и эндонуклеаз в сыворотке крови приводит к быстрому расщеплению нуклеиновых кислот, обладающих фосфодиэфирными линкерами и, следовательно, терапевтические нуклеиновые кислоты могут иметь очень короткий период полураспада в присутствии сыворотки или внутри клеток. (Zelphati, O., et al.,Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); и Thierry, A.R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)). Терапевтические нуклеиновые кислоты, которые в настоящее время разрабатываются, не используют основной фосфодиэфирной химии в природных нуклеиновых кислотах из-за этих и других известных проблем.
Эта проблема была частично преодолена химическими модификациями, которые уменьшают сывороточную или внутриклеточную деградацию. Изменения были протестированы на межнуклеотидном фосфодиэфирном мосте (например, используя фосфоротиоатное, метилфосфонатное или фосфорамидатное связывание), в нуклеотидных основаниях (например, 5-пропинилпиримидинов) или на сахаре (например, 2'-модифицированных сахарах) (Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). Другие пытались улучшить стабильность при использовании 2'-5' связывания сахара (см., например, патент США № 5532130). Другие изменения были испробованы. Однако ни одно из этих решений не оказалось вполне удовлетворительным, и in vivo свободные терапевтические нуклеиновые кислоты показывают только ограниченную эффективность.
Кроме того, как отмечалось выше, связанные с миРНК и микроРНК проблемы остаются с ограниченными возможностями терапевтических нуклеиновых кислот для пересечения клеточных мембран (см. Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) и в проблемах, связанных с системной токсичностью, таких как комплемент-опосредованная анафилаксия, изменения коагуляционных свойств и цитопения (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994)).
Чтобы попытаться улучшить эффективность, исследователи также использовали липидные системы на базе носителя для доставки химически модифицированных или немодифицированных терапевтических нуклеиновых кислот. В Zelphati, O и Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996), авторы ссылаются на использование анионных (обычно) липосом, pH чувствительных липосом, иммунолипосом, способных к слиянию липосом и катионных липидов/антисмысловых агрегатов. Точно так же миРНК были введены системно в катионные липосомы, и эти нуклеиновые кислоты - липидные частицы, как сообщается, обеспечивают улучшенное понижающее регулирование целевых белков у млекопитающих, в том числе нечеловеческих приматов (Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)).
Несмотря на этот прогресс, остается потребность в данной области техники для улучшения липидных терапевтических композиций нуклеиновых кислот, которые подходят для общего терапевтического использования. Предпочтительно, чтобы эти композиции инкапсулировали нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью, имели высокое отношение лекарство:липид, защиту инкапсулированной нуклеиновой кислоты от деградации и расщепления в сыворотке крови, были пригодными для системной доставки, а также обеспечивали внутриклеточную доставку инкапсулированной нуклеиновой кислоты. Кроме того, эти липидно - нуклеиновокислотные частицы должны быть хорошо переносимы и обеспечивать адекватный терапевтический индекс, такой, что стационарное лечение в эффективной дозе нуклеиновых кислот не было связано с существенной токсичностью и/или риском для пациента. Композиции, способы получения композиций и способы применения композиций введения нуклеиновых кислот в клетки, в том числе для лечения болезней, приводятся.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к катионному липиду, имеющему одну или более биоразлагаемых групп, расположенных в середине или дистальной части липидного фрагмента (например, гидрофобной цепи) катионных липидов. Эти катионные липиды могут быть включены в липидные частицы для доставки активных агентов, таких как нуклеиновые кислоты (например, миРНК). Включение биоразлагаемых(ой) групп(ы) в катионных липидах приводит в результате к более быстрому обмену веществ и удалению катионных липидов из организма после доставки активного агента в целевую область. В результате эти катионные липиды имеют существенно более низкую токсичность, чем аналогичные катионные липиды без биоразлагаемых групп.
В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IA-1
R1
(IA-1) или его соль, где
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C24-алкил, C2-C24-алкенил, C2-C24-алкинил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил(C1-C24)алкил, C5-C8-моноциклический гетероцикл, содержащий
- 2 039892 от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C5-C8-гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R4)-;
в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси, NH2, C1-C24-алкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C3-C10-циклоалкильную группу;
Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
в каждом случае R5 представляет собой независимо H или C1-C24-алкил;
a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
b равно 0, 1, 2 или 3;
R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-алкил;
каждый из R9 и R10 независимо представляет собой C12-C24-алкил, C12-C24-алкенил или C12-C24-алкокси, имеющий одну или более биоразлагаемую группу; каждая биоразлагаемая группа независимо прерывает C12-C24-алкил, C12-C24-алкенил или C12-C24-алкоксигруппу, или представляет собой заместитель на конце C12-C24-алкила, C12-C24-алкенила или C12-C24-алкоксигруппы; причем (i) соединение не содержит следующий фрагмент:
где----является опциональной связью; и (ii) концы R9 и R10 отделены от третичного атома углерода, отмеченного звездочкой (*), цепочкой из 8 или более атомов, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
В одном варианте воплощения соединения формулы IA-1, в каждом случае R3 и R4 представляют собой независимо H или C1-C4-алкил и R' представляет собой C1-C4-алкил.
В одном варианте воплощения соединения формулы IA-1, Q отсутствует или R'R1R2N-(R)a-Q-(R)bгруппа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.
В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IB:
R1 R, Ml—R r\ IN Q
R2 R10-M2-R12 (В) где
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C24-алкил, C2-C24-алкенил, C2-C24-алкинил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил (C1-C24)алкил или C5-C8-моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, воз можно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
R1 и R2 вместе с атомом азота к которому они присоединены образуют C5-C8-гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома ки- 3 039892 слорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R4)-;
в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси, NH2, C1-C24-алкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C3-C10-циклоалкильную группу;
Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
в каждом случае R5 представляет собой, независимо, H или C1-C24-алкил; a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6; b равно 0, 1, 2 или 3;
R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-алкил; M1 и M2 каждый независимо представляет собой биоразлагаемую группу; каждый из R9 и R10 независимо представляют собой C1C24-алкилен или C2-C24-алкенилен, и каждый из R11 и R12 независимо представляют собой C1-C24-αлкил или C2-C24-алкенил, возможно заканчивающийся COOR13, где каждый R13 независимо представляет собой C1-C24-алкил;
при условии, что:
R9, M1 и R11 вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину; и R10, M2 и R12 вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R9 и R10 независимо друг от друга представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенилен, M1 и M2 представляют собой -C(O)O-, и R11 и R12 представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенилен.
В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R9, M1 и R11 вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.
В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R10, M2 и R12 вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.
В одном варианте воплощения соединения формулы IB, группа R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N(CH2)3-C(CH3)=N-O-.
В еще одном варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IC:
в котором
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C24-aлкил, C2-C24-алкенил, C2-C24-αлкинил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил C1-C24-алкил, Cs-Cs моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
в каждом случае R независимо независимо представляет собой -(CR3R4)-;
в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси,NH2, C1-C24-алкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C3-C10-циклоалкильную группу;
Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
в каждом случае R5 представляет собой, независимо, H или C1.C24-алкил; a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
b равно 0, 1, 2 или 3;
R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-алкил;
каждый из R9 и R10 независимо друг от друга представляют собой C12-C24-aлкил или C2-C24алкенил, замещенный на его конце биоразлагаемой группой,
- 4 039892 причем биоразлагаемая группа представляет собой COOR13, где каждый R13 независимо представляет собой C1-C24-алкил.
В одном варианте воплощения соединения формулы IC, R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-группа представляет собой (СНз)2К-(СН2)з-С(О)О-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (СНз)2К-(СН2)2-ОС(О)-КН- или (СНзЖ (СН2)з-С(СНз)=К-О-.
В другом варианте воплощения катионный липид выбран из соединений формул II-VII:
и их соли, причем m, n, o и p, каждый в отдельности, равен 1-25, при условии, что в формулах (II), (IV), (VI) и (VII) m и p больше или равны 4.
В одном варианте воплощения соединение согласно настоящему изобретению представлено в форме фармацевтически приемлемой соли.
Еще одним вариантом воплощения является липидная частица для доставки активных агентов, содержащая нейтральный липид, липид, способный снизить агрегацию, и катионный липид согласно настоящему изобретению.
В одном варианте воплощения указанный нейтральный липид выбирают из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1 - пαльмитоил-2-олеоил-snфосфатидилхолина (РОРС), 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламина (DOPE) или сфингомиелина (SM); липид, способный уменьшить агрегацию, является PEG-липидом, и липидная частица дополнительно содержит стерол.
В одном варианте воплощения указанный катионный липид присутствует в количестве от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%; нейтральный липид присутствует в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.%; стерол присутствует в количестве от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%; и PEG -липид представляет собой PEG - DMA, PEG-DMG, или их сочетание, и присутствует в количестве от примерно 0,5 мол.% до примерно 15 мол.%.
В одном варианте воплощения указанная липидная частица дополнительно содержит активный агент.
В одном варианте воплощения указанный активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из плазмиды, иммуностимулирующих олигонуклеотидов, миРНК, антисмыслового олигонуклеотида, микроРНК, антагомира, аптамера и рибозима.
В одном варианте воплощения указанная липидная частица in vivo имеет период полураспада (t1/2) менее чем 3 ч.
В одном варианте воплощения указанная липидная частица in vivo имеет период полураспада (t1/2), который составляет менее 10%, чем для липидной частицы, содержащей тот же катионный липид без биоразлагаемой группы.
Еще одним вариантом воплощения является фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте или индукции иммунного ответа у субъекта, содержащая липидную частицу согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще одним вариантом воплощения является способ модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающий предоставление в клетку липидной частицы согласно настоящему изобретению.
В одном варианте воплощения указанный ген-мишень выбран из группы, состоящей из: Factor
- 5 039892
VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin А ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(K1P1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, опухолевый супрессорный ген и p53 опухолевый супрессорный ген.
В одном варианте воплощения указанный ген-мишень содержит одну или несколько мутаций.
Еще одним вариантом воплощения является способ лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, микроРНК и антисмыслового олигонуклеотида, и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид включает в себя полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид или комплементарен ему.
Еще одним вариантом воплощения является способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активное вещество представляет собой плазмиду, которая кодирует указанный полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.
Еще одним вариантом воплощения является способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активный агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом.
Еще одним вариантом воплощения является способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку или ткань субъекта, включающий введение субъекту нуклеиновой липидной частицы, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и катионный липид согласно настоящему изобретению.
Другие признаки и аспекты будут очевидны из описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в печени мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.
На фиг. 2 показан ожидаемый метаболический путь для соединений 1 и 3 из примера 14.
На фиг. 3 показан график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в селезенке мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.
На фиг. 4 показан график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в плазме мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.
Подробное описание
В одном аспекте настоящее изобретение относится к липидной частице, которая включает в себя нейтральные липиды, липиды, способные снизить агрегацию, катионные липиды и, необязательно, стеролы. В некоторых вариантах воплощения липидная частица дополнительно включает в себя активное вещество (например, терапевтический агент). Различные примерные варианты воплощения этих липидов, липидных частиц и композиций, содержащие то же самое, и их использование для доставки терапевтических агентов и модуляции генной экспрессии белка описаны более подробно ниже.
Катионный липид
В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IXXIII. В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение одной из формул II-ХХШ. В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы I. В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IA-1, IA-2, IB, IC или ID. Следующие раскрытия представляют различные варианты воплощения соединения формулы I.
В одном из вариантов воплощения M1 и M2, каждый независимо:
- OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
В другом варианте воплощения M1 и M2, каждый независимо:
- OC(O)-, -C(O)-O-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-,-OC(S)-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
В еще одном варианте воплощения M1 и M2, каждый независимо:
- C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -C(R5)=N-O-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -C(S)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
- 6 039892
В другом варианте воплощения M1 и M2, каждый, -C(O)O-.
В одном варианте воплощения R1 и R2, каждый в отдельности, опционально замещенный алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил или гетероцикл. В одном варианте воплощения R1 представляет собой алкил, R2 представляет собой алкил, циклоалкил или циклоалкилалкил. В одном варианте воплощения R1 и R2, каждый в отдельности представляет собой алкил (например, С1-С4-алкил, такой как метил, этил или изопропил). В одном варианте воплощения R1 и R2 оба представляют собой метил. В другом варианте воплощения R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют опционально замещенное гетероциклическое кольцо (например, N-метилпиперазинил). В другом варианте воплощения, один из R1 и R2 представляет собой или
(например, R1 является одной из двух вышеупомянутых групп и R2 представляет собой водород).
В одном варианте воплощения R' представляет собой водород или алкил. В другом варианте воплощения R' представляет собой водород или метил. В одном варианте воплощения R' отсутствует. В одном варианте воплощения R' отсутствует или метил.
Для соединений, в которых R' не отсутствует, атом азота, к которому R' присоединяется, несет на себе положительный заряд, а соединение также содержит отрицательно заряженные противоионы. Противоионом может быть любой анион, такой как органический или неорганический анион. Подходящие примеры анионов включают, но не ограничиваются, тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, а-кетоглутарат, а-глицерофосфат, галогенид (например, хлорид), сульфат, нитрат, бикарбонат и карбонат. В одном варианте воплощения противоион является галогенидом (например, Cl).
В одном варианте воплощения каждый R является, независимо, - (CR3R4) -, где R3 и R4, каждый независимо, - водород или алкил (например, C1-C4-алкил). Например, в одном варианте воплощения каждый R является, независимо, - (CHR4)-, где каждый R4 является, независимо, H или алкил (например, C1-C4-алкил). В другом варианте воплощения каждый R является, независимо, -CH2-, -C(CH3)2или
-CH(iPr)- (где iPr - изопропил). В другом варианте воплощения каждый R представляет собой -CH2-.
В другом варианте воплощения R5 представляет собой, в каждом случае, водород или метил. Например, R5 может быть, в каждом случае, водородом.
В одном из вариантов воплощения Q отсутствует, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-. В одном из вариантов воплощения Q представляет собой -C(O)O-.
В одном варианте воплощения Q1 и Q2, каждый независимо, отсутствует или -O-. Например, в одном варианте воплощения Q1 и Q2,каждый, отсутствует. В другом варианте воплощения, Q1 и Q2, каждый, -O-.
В одном из вариантов воплощения пунктирная линия к Q отсутствует, b равен 0, а R'R1R2N-(R)aQ- и третичный углерод, прилегающий к нему (C *), образуют следующую группу:
где n= от 1 до 4 (например, n=2).
В одном из вариантов воплощения пунктирная линия к Q отсутствует, b равен 0, а R'R1R2N-(R)aQ- и третичный углерод, прилегающий к нему, образуют следующую группу:
R1
R'-----N r/ NrV где n= от 1 до 4 (например, n=2), и R1, R2, R, a и b такие, как определено по формуле (I). В одном
- 7 039892 варианте воплощения a=3.
В одном из вариантов воплощения пунктирная линия к Q отсутствует, b равен 0, а R'R1R2N-(R)aQ- и третичный углерод, прилегающий к нему, образуют следующую группу:
где n= от 1 до 4 (например, n=2), и R1, R2, R, a и b такие, как определено по формуле (I). В одном варианте воплощения a=0. Например, группа может быть:
В одном варианте воплощения b=0. В другом варианте воплощения a=2, 3 или 4 и b=0. Например, в одном варианте воплощения a=3 и b=0. В другом варианте воплощения a=3, b=0, и Q представляет собой -C(O)O-.
В одном варианте воплощения соединение формулы (I) имеет подформулу:
Формула (IF), где R, R', R1, R2, A1, A2, A3, A4, Q1, Q2, Q3, Q4, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q и r такие, как определено в любом из вариантов воплощения, описанных здесь.
В дополнительных вариантах воплощения соединение формулы (IF) отвечает одному или нескольким из следующих условий:
(i) Q1 и Q2 отсутствуют;
(ii) M1 и M2 являются -C(O)O-;
(iii) g и h оба равны 1;
(iv) g и h оба равны 0;
(v) c и e всего 7;
(vi) d и f всего 7;
(vii) c, e, и i всего 7;
(viii) d, f и j всего 7;
(ix) i и j каждый 7;
(x) k и l оба равны 1;
(xi) m и n оба равны 0;
(xii) m и q всего 1 или m и q всего 2;
(xiii) m и l всего 6;
(xiv) r и n всего 6;
(xv) p и o оба равны 0;
(xvi) n и r всего 2 или n и r всего 1; и (xvii) Q3 является H.
В некоторых вариантах воплощения биоразлагаемые группы, которые присутствуют в катионном липиде, выбирают из эфирных (например, -C(O)O- или -OC(O)-), дисульфидных (-SS-), оксимных (например, -C(H)=N-O- или -O-N=C(H)-), -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5), -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, (NR5)C(S)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-, -OC(S)-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
В одном варианте воплощения алифатическая группа в одном или обоих гидрофобных хвостах катионного липида включает в себя по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь.
Подходящий фрагмент холестерина для катионных липидов настоящего изобретения (в том числе соединений формулы (I), IA-2, ID, IE и IF) имеет формулу:
- 8 039892
Дополнительные варианты воплощения включают катионный липид, имеющий головную группу, один или более гидрофобный хвост и линкер между головной группой и одним или несколькими хвостами. Головная группы может включать в себя амины, например амин, имеющий желаемые рКа. рКа, может зависеть от структуры липида, в частности, характера головной группы, например, наличия, отсутствия и расположения функциональных групп, таких как анионные функциональные группы, водородная связь донора функциональных групп, водородная связь акцепторных групп, гидрофобные группы (например, алифатические группы), гидрофильные группы (например, гидроксильные или метокси) или арил группы. Амин головной группы может быть катионным амином, первичным, вторичным и третичным амином, головная группы может включать в себя одну аминогруппу (моноамин), две аминогруппы (диамин), три аминогруппы (триамин), или большее число аминогрупп, как и в олигоамине или полиамине. Головная группа может включать в себя функциональную группу, которая слабее, чем основные амины, такие как, например, имидазол, пиридин или группа гуанидиния. Головная группа может быть цвиттерионной. Другие головные группы также являются подходящими.
Один или более гидрофобный хвост может включать в себя две гидрофобные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными. Хвосты могут быть алифатическими, например, они могут состоять из углерода и водорода, либо насыщенными или ненасыщенными, но без ароматических колец. Хвосты могут быть хвостами жирных кислот. Некоторые из таких групп включают в себя октанил, нонанил, децил, лаурил, миристил, пальмитил, стеарил, α-линолеил, стеаридонил, линолеил, у-линоленил, арахадонил и олеил. Другие гидрофобные хвосты также являются подходящими.
Линкер может включать в себя, например, глицеридный линкер, ациклических глицеридов аналоговый линкер или циклический линкер (в том числе линкер спиро, бициклический линкер и полициклический линкер). Линкер может включать в себя функциональные группы, такие как простые эфирные, сложноэфирные, фосфатные, фосфонатные, фосфоротиоатные, сульфонатные, дисульфидные, ацетальные, кетальные, иминные, гидразонные или оксимные. Другие линкеры и функциональные группы также являются подходящими.
В одном варианте воплощения катионный липид является рацемической смесью. В другом варианте воплощения, катионный липид обогащен одним диастереомером, например, катионный липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% диастереомера в избытке. В еще одном варианте воплощения, катионный липид обогащен одним энантиомером, например, липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере 70% энантиомера в избытке. В еще одном варианте воплощения катионный липид хирально чистый, например, является отдельным оптическим изомером. В еще одном варианте воплощения катионный липид обогащен одним оптическим изомером.
В случае если двойная связь присутствует (например, углерод-углеродная двойная связь или углерод-азот двойная связь), может быть изомерия в конфигурации двойной связи (т.е. цис/транс или E/Z изомерия). Там, где конфигурация двойной связи показана в химической структуре, следует понимать, что соответствующий изомер может также присутствовать. Сумма присутствующих изомеров может варьироваться, в зависимости от относительной устойчивости изомеров и энергии, необходимой для перехода между изомерами. Соответственно, некоторые двойные связи, для практических целей, присутствуют только в одной конфигурации, тогда как другие (например, когда относительная стабильность похожа и энергия перехода низкая) могут присутствовать в качестве неотъемлемой равновесной смеси конфигураций.
В некоторых случаях ненасыщенная двойная связь может быть заменена на циклические ненасыщенные. Циклические ненасыщенные могут быть циклоалифатическими ненасыщенными, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил группы. В некоторых случаях, циклическая группа может быть полициклической группой, например, бициклической группой или трициклической группой. Бициклическая группа может быть мостиковой, смешанной или иметь спиро структуру.
В некоторых случаях фрагмент двойной связи может быть заменен фрагментом циклопропила,
-9039892
может быть заменен
например,
Например, фрагмент, показанный ниже, имеет две двойных углерод-углеродных связей, каждая из которых может самостоятельно заменить циклический фрагмент, например, циклопропил фрагмент. Таким образом, заместители для
включают
Для следующего примера заместители для
JWV
I включают
Для следующего примера заместители для
включают
Для следующего примера заместители для включают
COOEt
Катионный липид включает в себя одну или более биоразлагаемых групп. Биоразлагаемая(е) группа(ы) включают одну или более связь, которые могут подвергаться реакции разрыва связей в биологической среде, например, в организме, органе, ткани, клетке или органелле. Функциональные группы, которые содержат биоразлагаемые связи, включают, например, сложные эфиры, дитиолы и оксимы. Биодеградация может быть фактором, который влияет на выведение соединения из организма при введении субъекту. Биодеградация может быть измерена в клетке на основе анализа, когда композиция, включающая катионный липид, вводится в клетки и образцы берутся в различные моменты времени. Липидные фракции могут быть извлечены из клеток и разделены и проанализированы LC-MS. По LCMS данным скорость биодеградации (например, как t1/2 значение) может быть измерена. Например, соединение
О
Соединение 1 включает в себя эфирную связь в каждой алифатической цепи, которые могут подвергнуться гидролизу в биологической среде, например, при воздействии, например, липазы или эстеразы. Структура
- 10 039892 соединения, конечно, влияет на скорость, с которой соединение подвергается биодеградации. Таким образом, связанные соединения, такие как
можно было бы ожидать, что будут обладать различной скоростью биодеградации. Большого влияния на этот показатель можно было бы ожидать от изменений в структуре соединения в месте гидролиза. Одной из модификаций, которая может влиять на скорость гидролиза, и тем самым влиять на скорость биодеградации и выведение из тела субъекта, является уходящая группа реакции гидролиза первичная спиртовая группа легче, чем вторичная.
Например, не желая быть связанными теорией, соединения 1 и 2, показанные выше, могут быть метаболизированы, как показано на фиг. 2.
В одном варианте воплощения катионный липид любого из описанных здесь вариантов имеет in vivo период полураспада (t1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем примерно 3 ч, например, менее чем около 2,5 ч, менее чем около 2 ч, менее чем около 1,5 ч, менее чем около 1 ч, менее чем около 0,5 ч или менее около 0,25 ч.
В другом варианте воплощения катионный липид любого из описанных здесь вариантов воплощения, содержащий биоразлагаемую группу или группы, которые имеют in vivo период полураспада (t1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем примерно 10% (например, менее чем около 7,5%, менее чем около 5%, менее чем около 2,5%), чем тот же катионный липид без биоразлагаемой группы или групп.
Некоторые катионные липиды могут быть удобно представлены в виде гидрофобных групп в сочетании с головной группой. Так, например, соединение
О
Соединение 1 можно рассматривать как сочетание головной группы и гидрофобной группы следующим образом: О
Головная группа Гидрофобная группа
Таким образом, некоторые подходящие головные группы включают приведенные в табл. 1.
Таблица 1
1 о 1 ο 1 / Ν ο
о 1 Z 1 Η ο 1 ζ
1 ίι Ο 1 ζ 1 °
1 0 х^о^\ 0 1 1 0
1 9 хоА -Ν___^_Ρ4 \ Τ' Ο Ο xCL °''ο ζ— / << о о xCL °' О —Z \
ι ч χοΑ Η °Α / —ζ -χθ Τ’ / \ Ο Ο Α-Ά- ι ч χθΑ й °А
- 11 039892
! V о ,n^Ao_| о Cn^Ao.| % о 1
О rA N о c/4 1 ° /N^-nAn-| Η Η ξ
1 1 \ ΛΛ / VV^ o-y
, V о О О— о Ст % к___N
О N о o-v 1 ° / N N—\ H H X
O ' / H %Νχ 1 \ °~l / VNC^^=NXo_ ।
v Λ-ι N \ / ^=N^Q_ | —N \ y)=NM —N \
—N \ / | —N \ ZN^ /=Ν-Ο-1
>=hk A' / H )=N4 \ _/—/ O”V / z /
P z ^z^ —N \ y>N'°-y —N \
- 12 039892
(углерод со звездочкой третичный углерод катионного липида и не является частью головной
(углерод со звездочкой третичный углерод катионного липида и не является частью головной группы) группы)
R = Н, алкил (например, метил) X = галоген (например, С1)
R = Н, алкил (например, метил)
X = галоген (например, С1)
Некоторые подходящие группы гидрофобного хвоста включают те, что приведены в табл. 2.
Таблица 2
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения соединения любой из формул I-XXIII. Подходящие образцовые синтетические способы проиллюстрированы на схемах A-G ниже. Переменные в схемах ниже, такие же, как эти переменные в той же позиции в формулах I-XXIII выше.
- 13 039892
Схема A
TBDPSCI
Е1.Ж) МАРСИО,
(I) CsOjiNMOft-BuCH/ ТГФ/Н2О (ii) МаО^диоксан/НгО
Длина цепи липида и длина линкера в схеме A может быть изменена. Кроме того, группа R в функциональном эфире и заместители у атома азота могут быть модифицированы.
Схема B
Как показано на схеме B, медно-опосредованная связь дает ди-ин содержащие цепи липидов с концевыми функциональными группами R, которые могут быть уменьшены для создания ди-ен содержащих липидных цепочек. Длина цепи линкера и липида может быть изменена и функциональные группы заместителей (R, R1, R2) могут быть модифицированы.
- 14 039892
Схема C
где Rx представляет собой алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил и головную группу, как определено в табл. 1.
Головная группа в схеме C может быть любой головной группой, описанной здесь (см., например, табл. 1).
НОГАлисЬатическая) О Вп
Схема D
HNMe2
CI
NaOH гранулы
Cat. N(Bu4)Br о
О(Али(Ьатическая)ОВп IPA
Toluene, 90 0С
ОГАлисЬатическаяЮГОЮКх
Me2N
О(Алифатическая)С(О)ОКх
- 15 039892
Схема E
Схема F
- 16 039892
Схема G
Примеры катионных липидов настоящего изобретения включают те, что приведены в табл. 3-13 ниже и их соли (в том числе фармацевтически приемлемые соли).
Таблица 3
- 17 039892
Таблица 4
- 18 039892
- 19 039892
- 20 039892
- 21 039892
- 22 039892
- 23 039892
- 24 039892
- 25 039892
- 26 039892
- 27 039892
- 28 039892
m = 1-6; η = 0-3
R-, = R2 = Me, Et, |РгИт.д.
0 X/ \Z - X/ X/ z^/^COOMe ^^x^COOMe
4NZ x^^^/COOMe
П 0 n = 0-2 (n = 1; ALNY-322 ^^^.COOMe
^^/^^COOEt
П 0 XXXX^ n = 0-2 ^/^/==^/^/4 •^/^^COQEt
4NZ ^/4/=4/4^ x\/x^COOBn
n о n = 0-2 ^^^^COOBn
V /x^^^COO'Bu
n 0 Lxx n = 0-2 ^^^COO'Bu
^N' ^^x/^x/^^^x/^x
I n о LJxxn = 0-2 ^^^.COOH
1 n о n = 0-2 /^/^/^=^/^4 ^^COOMe ^^COOMe
x<rr^ 1 о n = 0-2 ^^^^COOH ^^COOH
- 29 039892
- 30 039892
- 31 039892
- 32 039892
- 33 039892
- 34 039892
- 35 039892
о O=( Ρ ο 41 , J
m η Ρ q m η Ρ q
1 12 1 12 12 1 12 1
2 11 2 11 11 2 11 2
3 10 3 10 10 3 10 3
4 9 4 9 9 4 9 4
5 8 5 8 8 5 8 5
6 7 6 7 7 6 7 6
7 6 7 6 6 7 6 7
8 5 8 5 5 8 5 8
9 4 9 4 4 9 4 9
10 3 10 3 3 10 3 10
11 2 11 2 2 11 2 11
12 1 12 1 1 12 1 12
1 12 2 11 12 1 11 2
2 11 3 10 11 2 10 3
3 10 4 9 10 3 9 4
4 9 5 8 9 4 8 5
5 8 6 7 8 5 7 6
6 7 7 6 7 6 6 7
7 6 8 5 6 7 5 8
8 5 9 4 5 8 4 9
9 4 10 3 4 9 3 10
10 3 11 2 3 10 2 11
11 2 12 1 2 11 1 12
12 1 1 12 1 12 12 1
1 12 3 10 12 1 10 3
2 11 4 9 11 2 9 4
3 10 5 8 10 3 8 5
4 9 6 7 9 4 7 6
5 8 7 6 8 5 6 7
6 7 8 5 7 6 5 8
7 6 9 4 6 7 4 9
8 5 10 3 5 8 3 10
- 36 039892
9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 11 12 2 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 2 1 11 9 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 7 6 5 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 6 7 8
4 9 9 4 9 4 4 9
5 8 10 3 8 5 3 10
6 7 11 2 7 6 2 11
7 6 12 1 6 7 1 12
8 5 2 11 5 8 11 2
- 37 039892
9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 3 4 5 6 7 8 9 8 9 10 11 10 9 8 7 6 5 4 5 4 3 2 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 10 11 12 1 6 5 4 3 2 1 11 3 2 1 12 7 8 9 10 11 12 2
8 5 12 1 5 8 10 3
9 4 2 11 4 9 11 2
10 3 3 10 3 10 12 1
11 2 4 9 2 11 1 12
12 1 5 8 1 12 2 11
Таблица 6
р 0 1 ο >'m 0 % 0
m η Ρ q m η Ρ q
1 12 1 12 12 1 12 1
2 11 2 11 11 2 11 2
3 10 3 10 10 3 10 3
4 9 4 9 9 4 9 4
5 8 5 8 8 5 8 5
6 7 6 7 7 6 7 6
7 6 7 6 6 7 6 7
8 5 8 5 5 8 5 8
9 4 9 4 4 9 4 9
10 3 10 3 3 10 3 10
11 2 11 2 2 11 2 11
12 1 12 1 1 12 1 12
1 12 2 11 12 1 11 2
2 11 3 10 11 2 10 3
- 38 039892
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 9 9 8 7 6 5 4 3 2 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
10 3 2 11 3 10 11 2
11 2 3 10 2 11 10 3
12 1 4 9 1 12 11 2
1 12 5 8 12 1 8 5
2 11 6 7 11 2 7 6
- 39 039892
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 8 9 10 11 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 5 4 3 2 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 1 6 5 4 3 2 1 11 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 12 7 8 9 10 11 12 2
8 5 12 1 5 8 10 3
9 4 2 11 4 9 11 2
10 3 3 10 3 10 12 1
11 2 4 9 2 11 1 12
12 1 5 8 1 12 2 11
- 40 039892
Таблица 7
0 АоУ \ 1 ''η I О 1 II Kim / /у p о о 0 \ 1 lb 0 о q
m η P q m n P q
1 13 1 13 1 13 1 13
2 12 2 12 2 12 2 12
3 11 3 11 3 11 3 11
4 10 4 10 4 10 4 10
5 9 5 9 5 9 5 9
6 8 6 8 6 8 6 8
7 7 7 7 7 7 7 7
8 6 8 6 8 6 8 6
9 5 9 5 9 5 9 5
10 4 10 4 10 4 10 4
11 3 11 3 11 3 11 3
12 2 12 2 12 2 12 2
13 1 13 1 13 1 13 1
1 13 2 12 1 13 2 12
2 12 3 11 2 12 3 11
3 11 4 10 3 11 4 10
4 10 5 9 4 10 5 9
5 9 6 8 5 9 6 8
6 8 7 7 6 8 7 7
7 7 8 6 7 7 8 6
8 6 9 5 8 6 9 5
9 5 10 4 9 5 10 4
10 4 11 3 10 4 11 3
11 3 12 2 11 3 12 2
12 2 13 1 12 2 13 1
13 1 1 13 13 1 1 13
1 13 3 11 1 13 3 11
2 12 4 10 2 12 4 10
3 11 5 9 3 11 5 9
4 10 6 8 4 10 6 8
-41 039892
5 9 7 7 5 9 7 7
6 8 8 6 6 8 8 6
7 7 9 5 7 7 9 5
8 6 10 4 8 6 10 4
9 5 11 3 9 5 11 3
10 4 12 2 10 4 12 2
11 3 13 1 11 3 13 1
12 2 1 13 12 2 1 13
13 1 2 12 13 1 2 14
Таблица 8
О'°^=41~н Р , о Vp
ш η Р m η Р
1 12 18 12 1 18
2 11 18 11 2 18
3 10 18 10 3 18
4 9 18 9 4 18
5 8 18 8 5 18
6 7 18 7 6 18
7 6 18 6 7 18
8 5 18 5 8 18
9 4 18 4 9 18
10 3 18 3 10 18
И 2 18 2 11 18
12 1 18 1 12 18
1 12 17 12 1 17
2 11 17 11 2 17
3 10 17 10 3 17
4 9 17 9 4 17
5 8 17 8 5 17
6 7 17 7 6 17
7 6 17 6 7 17
8 5 17 5 8 17
9 4 17 4 9 17
- 42 039892
10 3 17 3 10 17
и 2 17 2 11 17
12 1 17 1 12 17
1 12 16 12 1 16
2 11 16 11 2 16
3 10 16 10 3 16
4 9 16 9 4 16
5 8 16 8 5 16
6 7 16 7 6 16
7 6 16 6 7 16
8 5 16 5 8 16
9 4 16 4 9 16
10 3 16 3 10 16
И 2 16 2 11 16
12 1 16 1 12 16
1 12 15 12 1 15
2 11 15 11 2 15
3 10 15 10 3 15
4 9 15 9 4 15
5 8 15 8 5 15
6 7 15 7 6 15
7 6 15 6 7 15
8 5 15 5 8 15
9 4 15 4 9 15
10 3 15 3 10 15
И 2 15 2 11 15
12 1 15 1 12 15
1 12 14 12 1 14
2 11 14 11 2 14
3 10 14 10 3 14
4 9 14 9 4 14
5 8 14 8 5 14
6 7 14 7 6 14
7 6 14 6 7 14
8 5 14 5 8 14
9 4 14 4 9 14
-43 039892
10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11
5 8 11 8 5 11
6 7 11 7 6 11
7 6 11 6 7 11
8 5 11 5 8 11
9 4 11 4 9 11
- 44 039892
10 11 12 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 2 1 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 — 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8
10 3 8 2 11 8
И 2 8 1 12 8
12 1 8 12 1 8
- 45 039892
Таблица 9
Р , 0 Wp Uq
m η Р q m η P q
1 12 8 8 12 1 8 8
2 11 8 8 11 2 8 8
3 10 8 8 10 3 8 8
4 9 8 8 9 4 8 8
5 8 8 8 8 5 8 8
6 7 8 8 7 6 8 8
7 6 8 8 6 7 8 8
8 5 8 8 5 8 8 8
9 4 8 8 4 9 8 8
10 3 8 8 3 10 8 8
11 2 8 8 2 11 8 8
12 1 8 8 1 12 8 8
1 12 9 7 12 1 9 7
2 11 9 7 11 2 9 7
3 10 9 7 10 3 9 7
4 9 9 7 9 4 9 7
5 8 9 7 8 5 9 7
6 7 9 7 7 6 9 7
7 6 9 7 6 7 9 7
8 5 9 7 5 8 9 7
9 4 9 7 4 9 9 7
10 3 9 7 3 10 9 7
11 2 9 7 2 11 9 7
12 1 9 7 1 12 9 7
1 12 10 6 12 1 10 6
2 11 10 6 11 2 10 6
- 46 039892
3 10 10 6 10 3 10 6
4 9 10 6 9 4 10 6
5 8 10 6 8 5 10 6
6 7 10 6 7 6 10 6
7 6 10 6 6 7 10 6
8 5 10 6 5 8 10 6
9 4 10 6 4 9 10 6
10 3 10 6 3 10 10 6
11 2 10 6 2 11 10 6
12 1 10 6 1 12 10 6
1 12 11 5 12 1 11 5
2 11 11 5 11 2 11 5
3 10 11 5 10 3 11 5
4 9 11 5 9 4 11 5
5 8 11 5 8 5 11 5
6 7 11 5 7 6 11 5
7 6 11 5 6 7 11 5
8 5 11 5 5 8 11 5
9 4 11 5 4 9 11 5
10 3 11 5 3 10 11 5
11 2 11 5 2 11 11 5
12 1 11 5 1 12 11 5
1 12 12 4 12 1 12 4
2 11 12 4 11 2 12 4
3 10 12 4 10 3 12 4
4 9 12 4 9 4 12 4
5 8 12 4 8 5 12 4
6 7 12 4 7 6 12 4
7 6 12 4 6 7 12 4
8 5 12 4 5 8 12 4
9 4 12 4 4 9 12 4
10 3 12 4 3 10 12 4
11 2 12 4 2 11 12 4
12 1 12 4 1 12 12 4
1 12 13 3 12 1 13 3
2 11 13 3 11 2 13 3
-47039892
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9
10 3 7 9 3 10 7 9
11 2 7 9 2 11 7 9
12 1 7 9 1 12 7 9
12 1 6 10 12 1 6 10
1 12 6 10 11 2 6 10
- 48 039892
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 И 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 И 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12
8 5 4 12 4 9 4 12
9 4 4 12 3 10 4 12
10 3 4 12 2 11 4 12
11 2 4 12 1 12 4 12
12 1 4 12 12 1 4 12
- 49 039892
Таблица 10
Р о
m η Р m η Р
1 12 18 12 1 18
2 11 18 11 2 18
3 10 18 10 3 18
4 9 18 9 4 18
5 8 18 8 5 18
6 7 18 7 6 18
7 6 18 6 7 18
8 5 18 5 8 18
9 4 18 4 9 18
10 3 18 3 10 18
И 2 18 2 И 18
12 1 18 1 12 18
1 12 17 12 1 17
2 11 17 11 2 17
3 10 17 10 3 17
4 9 17 9 4 17
5 8 17 8 5 17
6 7 17 7 6 17
7 6 17 6 7 17
8 5 17 5 8 17
9 4 17 4 9 17
10 3 17 3 10 17
11 2 17 2 11 17
12 1 17 1 12 17
1 12 16 12 1 16
2 11 16 11 2 16
3 10 16 10 3 16
4 9 16 9 4 16
5 8 16 8 5 16
6 7 16 7 6 16
-50039892
7 6 16 6 7 16
8 5 16 5 8 16
9 4 16 4 9 16
10 3 16 3 10 16
И 2 16 2 11 16
12 1 16 1 12 16
1 12 15 12 1 15
2 11 15 11 2 15
3 10 15 10 3 15
4 9 15 9 4 15
5 8 15 8 5 15
6 7 15 7 6 15
7 6 15 6 7 15
8 5 15 5 8 15
9 4 15 4 9 15
10 3 15 3 10 15
И 2 15 2 11 15
12 1 15 1 12 15
1 12 14 12 1 14
2 11 14 11 2 14
3 10 14 10 3 14
4 9 14 9 4 14
5 8 14 8 5 14
6 7 14 7 6 14
7 6 14 6 7 14
8 5 14 5 8 14
9 4 14 4 9 14
10 3 14 3 10 14
И 2 14 2 11 14
12 1 14 1 12 14
1 12 13 12 1 13
2 11 13 11 2 13
3 10 13 10 3 13
4 9 13 9 4 13
5 8 13 8 5 13
6 7 13 7 6 13
-51 039892
7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 12 10 11 2 10
2 11 10 10 3 10
3 10 10 9 4 10
4 9 10 8 5 10
5 8 10 7 6 10
- 52 039892
6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8
7 6 8 5 8 8
8 5 8 4 9 8
9 4 8 3 10 8
10 3 8 2 11 8
11 2 8 1 12 8
12 1 8 12 1 8
Таблица 11
zp 1 0 0 % \/q
- 53 039892
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 η 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 Ρ 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 q 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 m 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 η 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 Ρ 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 q 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6
7 6 10 6 6 7 10 6
8 5 10 6 5 8 10 6
9 4 10 6 4 9 10 6
10 3 10 6 3 10 10 6
11 2 10 6 2 11 10 6
- 54 039892
12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3
7 6 13 3 6 7 13 3
8 5 13 3 5 8 13 3
9 4 13 3 4 9 13 3
10 3 13 3 3 10 13 3
11 2 13 3 2 11 13 3
- 55 039892
12 1 13 3 1 12 13 3
1 12 14 2 12 1 14 2
2 11 14 2 11 2 14 2
3 10 14 2 10 3 14 2
4 9 14 2 9 4 14 2
5 8 14 2 8 5 14 2
6 7 14 2 7 6 14 2
7 6 14 2 6 7 14 2
8 5 14 2 5 8 14 2
9 4 14 2 4 9 14 2
10 3 14 2 3 10 14 2
11 2 14 2 2 11 14 2
12 1 14 2 1 12 14 2
1 12 7 9 12 1 7 9
2 11 7 9 11 2 7 9
3 10 7 9 10 3 7 9
4 9 7 9 9 4 7 9
5 8 7 9 8 5 7 9
6 7 7 9 7 6 7 9
7 6 7 9 6 7 7 9
8 5 7 9 5 8 7 9
9 4 7 9 4 9 7 9
10 3 7 9 3 10 7 9
11 2 7 9 2 11 7 9
12 1 7 9 1 12 7 9
12 1 6 10 12 1 6 10
1 12 6 10 11 2 6 10
2 11 6 10 10 3 6 10
3 10 6 10 9 4 6 10
4 9 6 10 8 5 6 10
5 8 6 10 7 6 6 10
6 7 6 10 6 7 6 10
7 6 6 10 5 8 6 10
8 5 6 10 4 9 6 10
9 4 6 10 3 10 6 10
10 3 6 10 2 11 6 10
-56039892
11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12
8 5 4 12 4 9 4 12
9 4 4 12 3 10 4 12
10 3 4 12 2 11 4 12
11 2 4 12 1 12 4 12
12 1 4 12 12 1 4 12
Таблица 12
\ 0 N YY J/ Vim ° Am н о
ш η m η
1 12 12 1
2 11 11 2
3 10 10 3
4 9 9 4
- 57 039892
- 58 039892
Таблица 13
0 0 ¢¢^0¾ rTW JCA А X J \ 0 Ξ 1 I 0 1 \J^ __0А ι N Yim Vr?14 ГрД °—Q 1 1 1/ Ч/'4'—
m η m n
1 12 12 1
2 11 11 2
3 10 10 3
4 9 9 4
5 8 8 5
6 7 7 6
7 6 6 7
8 5 5 8
9 4 4 9
10 3 3 10
11 2 2 11
12 1 1 12
I 0 У 0 А„А A X 3 ιν-н Y\Jn I \ 0 Λ = 1 । 9 X X X^^^ 0—\ IA XX --0*^/4/
1 12 12 1
2 11 11 2
3 10 10 3
4 9 9 4
5 8 8 5
6 7 7 6
7 6 6 7
8 5 5 8
9 4 4 9
10 3 3 10
11 2 2 11
12 1 1 12
Следующие соединения могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов в синтезе катионных липидов в соответствии с настоящим изобретением.
-59039892
Таблица 14
В одном варианте воплощения катионный липид настоящего изобретения выбран из следующих соединений и их солей (в том числе фармацевтически приемлемых солей):
О
Соединение 1
Соединение 3
Катионные липиды включают те, которые имеют альтернативные группы жирных кислот и другие диалкиламино группы, в том числе те, в которых алкильные заместители различны (например, N-этилN-метиламино-, N-пропил-N-этиламино- и т.п.). Для тех вариантов воплощения, в которых R1 и R2 являются длинными цепями алкил, алкенил, алкинил или циклоалкилалкил групп, они могут быть одинаковыми или разными. В общем, липиды (например, катионный липид), имеющие менее насыщенные ацильные цепи меньшего размера, особенно когда комплексы размером меньше примерно 0,3 мкм, для целей фильтровой стерилизации. Катионные липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от Сю до C20, являются типичными. Другие структурные компо- 60 039892 ненты также могут быть использованы для разделения аминокислотной группы (например, аминогруппы катионных липидов) и жирные кислоты или жирные алкильные части катионных липидов. Подходящие структуры известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах воплощения катионные липиды имеют по меньшей мере одну протонированную или депротонированную группу, такие, что липид положительно заряжен при pH на уровне или ниже физиологического pH (например, pH 7,4), и нейтральный при втором pH, предпочтительно на уровне или выше физиологических значения pH. Такие липиды также называют катионными липидами. Конечно, следует понимать, что добавление или удаление протонов в зависимости от pH равновесного процесса и что ссылка на заряженные или нейтральные липиды относится к характеру преобладающего вида и не требует, чтобы все липиды находились в заряженной или нейтральной форме. Липид может иметь более одной протонированной или депротонированной группы или может быть цвиттерионом.
В некоторых вариантах воплощения протонированные липиды (например, катионные липиды) имеют рКа протонированной группы в диапазоне от 4 до 11. Как правило, липиды будет иметь рКа примерно от 4 до 7, например, между 5 и 7, например, между примерно 5,5 и 6,8, при введении в липидные частицы. Такие липиды будут катионными при более низких значениях pH, в то время как частицы будут в значительной степени (хотя и не полностью) поверхностно нейтрализованы при физиологическом pH около pH 7,4. Одним из преимуществ рКа в диапазоне между 4 и 7 является то, что по меньшей мере некоторые нуклеиновые кислоты, связанные с внешней поверхностью частиц, будут терять свое электростатическое взаимодействие при физиологическом pH и будут удалены простым диализом, таким образом значительно уменьшая восприимчивость частиц к выведению. Измерение рКа липидов в липидных частицах может быть выполнено, например, с помощью флуоресцентного зонда 2(p-толуuдино)-6-нафталин сульфокислоты (TNS), с использованием способов, описанных в Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40, 127-144, который включен в качестве ссылки в полном объеме.
В конкретных вариантах воплощения липиды являются заряженными липидами. Как здесь используется, термин заряженный липид означает включение этих липидов, имеющих одну или две жирные ацильные или жирные алкильные цепи и четвертичные аминоголовные группы. Четвертичные амины обеспечивают постоянный положительный заряд. Головная группа может по желанию включать ионизируемые группы, такие как первичный, вторичный или третичный амин, которые могут быть протонированы при физиологическом значении pH. Наличие четвертичных аминов может изменить рКа ионизируемые группы по отношению к рКа группы в структурно подобных соединениях, где не хватает четвертичных аминов (например, четвертичный амин заменен на третичный амин). В некоторых вариантах воплощения заряженный липид называют амино липидом. См., например, предварительную заявку на патент США 61/267 419, поданную 7 декабря 2009 года, которая включена в качестве ссылки в полном объеме.
Один или несколько дополнительных катионных липидов, которые несут в себе положительный заряд примерно в физиологическом значении pH, в дополнение к тем, которые описаны выше, могут быть также включены в липидные частицы и композиции, описанные здесь. Такие катионные липиды включают, но не ограничиваются этим, N,N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид (DODAC); N-(2,3диолеилокси)пропил-N,N-N-триэтиламмонuя хлорид (DOTMA), N,N-дистеарил-N,N-диметиламмоний бромид (DDAB), N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTAP); 1,2диолеилокси-3-триметиламинопропан хлорида соль (DOTAP.Cl); 3β-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин (DC-Chol), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-2-(сперминекарбоксамидо)этил-N,N-диметиламмоний трифторацетат (DOSPA), диоктадециламидоглицил карбоксиспермин (DOGS), 1,2-дuолеоил-sn-3 фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA) и N-(1,2-димиристилоксипроп-3ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтил бромид (DMRTE). Кроме того, ряд коммерческих препаратов катионных липидов могут быть использованы, такие как, например, LIPOFECTIN (в том числе DOTMA и DOPE, доступные от GIBCO/BRL) и LIPOFECTAMINE (включая DOSPA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL). В конкретных вариантах воплощений катионный липид является аминолипидом.
Нейтральный липид
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут также включать один или больше нейтральных липидов. Нейтральные липиды, когда они присутствуют, могут быть любыми из ряда видов липидов, которые существуют либо в незаряженной или нейтральной цвиттерионной формах при физиологическом значении pH. Такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, керамиды, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, цефалин и цереброзиды. При выборе нейтральных липидов для использования в частицах, описанных здесь, как правило, руководствуются путем рассмотрения, например, размера липосомы и стабильности липосом в кровотоке. Предпочтительно, нейтральный липидный компонент представляет собой липид с двумя ацильными группами (т.е. диацилфосфатидилхолин и диацилфосфатидилэтаноламин). Липиды, имеющие различные ацильные группы с цепями разной длины и степени насыщенности имеются или могут быть выделены или синтезированы известными методами. В одной группе вариантов воплощения липиды, содержащие насыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от C10 до C20, являются
- 61 039892 предпочтительными. В другой группе вариантов воплощения липиды с моно или диненасыщенными жирными кислотами с длиной углеродной цепи в диапазоне от Сю до C20 используются. Кроме того, липиды, имеющих смесь цепей насыщенных и ненасыщенных жирных кислот могут быть использованы. Предпочтительно, нейтральными липидами, которые используются, являются DOPE, DSPC, POPC, DPPC или любые связанные с фосфатидилхолином. Нейтральные липиды также могут состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипиды с другими головными группами, такими как серин и инозит.
Липиды, способные уменьшить агрегацию
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут также включать один или больше липидов, способных уменьшить агрегацию. Примеры липидов, которые снижают агрегацию частиц при формировании, включают полиэтиленгликоль (PEG)-модифицированные жиры, моносиалоганглиозид Gm1 и олигомеры полиамида (PAO), такие как (описано в патенте США № 6320017, который включен в качестве ссылки в полном объеме). Другие соединения с незаряженными, гидрофильными, стерическими фрагментами барьеров, которые препятствуют агрегации во время подбора состава, как PEG, Gm1 или ATTA, также могут быть связаны с липидами. ATTA липиды описаны, например, в патенте США № 6320017, и конъюгаты PEG липидов, описаны, например, в патентах США № 5820873, № 5534499 и № 5885613, каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме. Как правило, концентрация липидного компонента, выбранного для уменьшения агрегации, составляет от около 1 до 15% (по мольным процентам липидов).
Конкретные примеры PEG модифицированных липидов (или липидных конъюгатов полиоксиэтилена), которые могут иметь различные якорные липидные части, чтобы обеспечить PEG части на поверхности липидных везикул, включают PEG модифицированный фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, керамиды PEG конъюгатов (например, PEG-CerC14 или PEG-CerC20), которые описаны в патенте США № 5820873, который включен сюда в качестве ссылки, PEG модифицированные диалкиламины и PEG модифицированные 1,2-диацилоксипропан-3-амины. Особенно предпочтительными являются PEG модификации диацилглицеринов и диалкилглицеринов.
В вариантах воплощения, где пространственно большой фрагмент, такой как PEG или ATTA, сопряжены с липидным якорем, выбор липидного якоря зависит от того, какой тип ассоциации конъюгат должен иметь с липидной частицей. Хорошо известно, что mPEG (mw2000)диастиароилфосфатидилэтаноламин (PEG-DSPE) останется связанным с липосомами, пока частицы экскретируются, возможно, несколько дней. Другие конъюгаты, такие как PEG-CerC20 имеют аналогичное время устойчивости. PEG CerC14, однако, быстро обменивается из созданного состава при воздействии сыворотки, с T1/2 менее чем 60 мин в некоторых анализах. Как показано в патенте США № 5820873, по меньшей мере, три характеристики влияют на скорость обмена: длина ацильной цепи, насыщенность ацильной цепи и размер стерически-барьерной головной группы. Соединения, имеющие подходящие варианты этих функций, могут быть полезными. Для некоторых терапевтических применений могут быть предпочтительными PEG модифицированные липиды, которые быстро выводятся из частицы липидов с нуклеиновыми кислотами in vivo и, следовательно, модифицированные липиды будут обладать относительно коротким липидным якорем. В других терапевтических применениях может быть предпочтительным для частиц липидов с нуклеиновыми кислотами проявление более длительного срока службы в плазменном кровообращении и, следовательно, PEG модифицированные липиды будут обладать относительно более длинными липидными якорями.
Следует отметить, что предотвращение агрегации соединений не требует от липидов конъюгации функционировать должным образом. Свободный PEG или свободный ATTA в растворе может быть достаточным условием для предотвращения агрегации. Если частицы стабильны после введения в состав, PEG или ATTA может быть подвергнут диализу до введения субъекту.
Липидные частицы
В другом аспекте настоящее изобретение относится к липидным частицам, которые включают в себя один или более катионных липидов, описанных здесь. В одном варианте воплощения липидная частица включает в себя одно или более соединение формулы I-XXIII. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя одно или более соединения формулы II-ХХШ. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя одну или несколько соединений формулы I. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя соединение формулы IA-1, IA-2, IB, IC, ID или IE.
Липидные частицы включают, но не ограничиваются этим, липосомы. Как здесь используется, липосома является структурой, имеющей липиды-содержащие мембраны, вмещающие водное содержимое. Липосомы могут иметь одну или несколько липидных мембран. Липосомы могут иметь один слой, называемые однослойными, или много слоев, называемые многослойными. Когда в комплексе есть нуклеиновые кислоты, липидные частицы также могут быть липоплексными, которые состоят из бислоев катионных липидов, зажатых между слоями ДНК.
Липидные частицы могут дополнительно содержать один или более дополнительный липид и/или другие компоненты, такие как холестерин. Другие липиды могут быть включены в липосомные композиции для различных целей, например, для предотвращения окисления липидов или прикрепления ли- 62 039892 гандов на поверхности липосомы. Любой из числа липидов может присутствовать в липосомах, в том числе амфипатический, нейтральный, катионный и анионный липид. Такие липиды могут быть использованы отдельно или в комбинации.
Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в липидном бислое частицы включают стабилизирующие компоненты, такие как полиамид олигомеров (см., например, патент США № 6320017, который включен в качестве ссылки в полном объеме), пептиды, белки, детергенты, липидные производные, такие как PEG, связанный с фосфатидилэтаноламином, и PEG, конъюгированный с керамидами (см., патент США № 5885613, который включен в качестве ссылки в полном объеме).
В одном варианте воплощения липидные частицы включают в себя один или несколько вторичных аминолипидов или катионных липидов, нейтральных липидов, стеролов и липидов, выбранных для уменьшения агрегации липидных частиц в процессе формирования, которая может возникнуть в результате пространственной стабилизации частиц, которая предотвращает заряд-индуцированную агрегацию в процессе формирования.
Липидные частицы могут включать в себя два или более катионных липида. Липиды могут быть выбраны по вносимому вкладу в различные полезные свойства. Например, катионные липиды, которые отличаются по свойствам, таким как аминная рКа, химическая стабильность, период полураспада в обращении, период полураспада в тканях, чистое накопление в тканях или токсичности, могут быть использованы в липидных частицах. В частности, катионные липиды могут быть выбраны так, что свойства смешанных липидных частиц будут более желательными, чем свойства однолипидных частиц индивидуальных липидов.
Чистое накопление в ткани и долгосрочная токсичность (если таковые имеются) катионных липидов могут быть модулированными выгодным способом путем выбора смесей катионных липидов вместо выбора одного катионного липида в данном составе. Такие смеси могут также обеспечить лучшую инкапсуляцию и/или высвобождение препарата. Сочетание катионных липидов также может повлиять на системную стабильность по сравнению с единым целым в составе.
В одном примере серии структурно подобных соединений могут иметь различные величины рКа, которые охватывают диапазон, например, менее чем 1 рКа единицы, от 1 до 2 рКа единиц или диапазон более чем 2 единицы рКа. В рамках серии может быть обнаружено, что рКа в середине диапазона связано с усилением полезных свойств (повышение эффективности) или уменьшением невыгодных свойств (например, пониженной токсичностью), по сравнению с соединениями, имеющими рКа значения ближе к концу диапазона. В таком случае два (или более) различных соединения, имеющих рКа на противоположных концах спектра, могут быть выбраны для совместного использования в липидных частицах. Таким образом, чистые свойства липидной частицы (например, заряд в зависимости от местных pH) может быть ближе к частице в том числе одного липида из середины диапазона. Катионные липиды, которые структурно разнородны (например, не входят в ряд структурно подобных соединений, упомянутых выше) также могут быть использованы в смешанных липидных частицах.
В некоторых случаях два или более различных катионных липида могут иметь весьма различные величины рКа, например, различающиеся на 3 или более единиц рКа. В этом случае свойства смешанной липидной частицы не обязательно имитируют свойства однолипидной частицы, имеющей промежуточные значения рКа. Скорее, чистые свойства могут быть такими же, как и у частицы с двумя различными протонированными (или депротонированными, в случае необходимости) сайтами с различными значениями рКа. В случае одного липида, доля протонированных сайтов, которые на самом деле являются протонированными, резко меняется, когда pH движется от нижнего рКа к высшему рКа (когда pH равен значению рКа, 50% сайтов протонированы). Когда два или более различных катионных липида, возможно, имеют весьма различные величины рКа (например, различающихся на 3 или более единиц рКа), объединены в липидные частицы, липидные частицы могут показать более постепенный переход от непротонированного к протонированному состоянию, когда значения pH разнообразны.
В других примерах два или более липида могут быть выбраны на основе других соображений. Например, если один липид сам по себе является весьма эффективным, но умеренно токсичным, он может быть объединен с липидом, который является менее эффективным, но не токсичным. В некоторых случаях комбинация может оставаться весьма эффективной, но иметь значительно сниженную токсичность, даже там, где она может быть предсказана, так что комбинация была бы лишь умеренно эффективной и лишь немного менее токсичной.
При выборе можно руководствоваться измеренными значениями экспериментально определяемых характеристик, например, характерными могут быть назначены числовые значения из результатов эксперимента. Экспериментально определяемые характеристики могут включать в себя меры безопасности, меры эффективности, меры взаимодействия с заданной биомолекулой или рКа.
Меры безопасности могут включать в себя выживаемость, LD50 или уровень биомаркеров (например, сывороточных биомаркеров), связанных с повреждением тканей (например, печеночных ферментов печени; CPK для мышц; ионный баланс для почек). Мерой эффективности может быть любое измерение, которое указывает, производит ли терапевтический агент эффект, в частности, того и/или до какой степени он производит желаемый эффект, например, лечения, профилактики, улучшения или
- 63 039892 иным образом улучшающий заболевания, расстройства или другие клинические состояния. Мерой эффективности может быть косвенный показатель, например, если терапевтическое средство предназначено для получения определенного эффекта на клеточном уровне, измерение этого эффекта на клеточных культурах может быть мерой эффективности. Меры взаимодействия с заданными биомолекулами могут включать в себя Kd для связывания конкретного белка или меру характера, степени или степень взаимодействия с другими липидами, в том числе клеточной подструктуры, такой как клеточные мембраны, мембраны эндосом, ядерной мембраны и т.п.
Катионные липиды могут быть выбраны на основе механизма действия, например, следует ли, при каких условиях и в какой степени липиды взаимодействуют с заданными биомолекулами. Например, первый катионный липид может быть выбран, в частности, потому, что он связан с ApoEзависимым механизмом, второй катионный липид может быть выбран, в частности, потому, что он связан с ApoE-независимым механизмом.
Например, липидная частица также может включать в себя смесь катионных липидов, как описано, например, в WO 2009/086558 и предварительной заявке на патент США № 61/104 219, поданной 9 октября 2008 года (каждый из которых включен в качестве ссылки полностью), и их эфирные аналоги. В другом примере липидная частица может включать в себя смесь липидов, например, липидов A, описанных в PCT/US10/22614, поданной 29 января 2010 года, и липидов, например, липидной формулы V или формулы VI, описанных в предварительной заявке США 61/175 770, поданной 5 мая 2009 года.
В некоторых вариантах воплощения он является желательно нацеленным на липидные частицы с помощью таргетинга фрагментов, относящихся к типу клеток или тканей. Таргетинг липидных частиц, используя различные ориентации фрагментов, таких как лиганды, рецепторы клеточной поверхности, гликопротеины, витамины (например, рибофлавин) и моноклональные антитела, был описан ранее (см., например, патенты США № № 4957773 и 4603044, каждый из который включен в качестве ссылки в полном объеме). Целевые остатки могут содержать весь белок или его фрагменты. Таргетинг механизмы обычно требуют, чтобы агенты таргетинга были расположены на поверхности липидных частиц таким образом, что целевой фрагмент доступен для взаимодействия с мишенью, например, рецептором клеточной поверхности. Различные агенты таргетинга и способы известны и доступны в данной области, в том числе описаны, например, в Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); и Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002).
Использование липидных частиц, т.е. липосом, с поверхностью, покрытой гидрофильными полимерными цепями, такими как полиэтиленгликоля (PEG) цепи, для таргетинга было предложено (Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); U.S. Patent No. 5,013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995). В одном подходе лиганды, такие как антитела, для таргетинга липидных частиц связаны с полярными направляющими группами липидов для формирования липидных частиц. При другом подходе таргетинг лиганд присоединен к дистальным концам PEG цепочек, образующим гидрофильные полимерные покрытия (Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).
Стандартные способы для связывания агентов таргетинга могут быть использованы. Например, фосфатидилэтаноламин, который может быть активирован для присоединения агентов таргетинга, или производные липофильных соединений, таких как липидные производные блеомицина, могут быть использованы. Антитела целевых липосом могут быть построены с использованием, например, липосом, которые включают белок (см. Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) и Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990). Другие примеры антител сопряжения раскрыты в патенте США № 6027726, учения которых включены здесь в качестве ссылки. Примеры таргетинг фрагментов могут также включать другие белки, характерные для клеточных компонентов, в том числе антигены, связанные с новообразованиями или опухолями. Белки, используемые в качестве таргетинг фрагментов, могут быть присоединены к липосоме с помощью ковалентных связей (см. Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). Другие методы таргетинга включают в себя биотин-авидин системы.
В некоторых вариантах воплощения липидная частица включает в себя смесь катионного липида и липида, способствующего слиянию. Липидная частица может дополнительно включать в себя нейтральный липид, стерол, PEG -модифицированный липид или комбинацию из них. Например, липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид (например, DPPC) и нейтральный липид, но не стерол или PEG -модифицированный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид и нейтральный липид, но не стерол или PEG -модифицированный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид и PEG -модифицированный липид, но не стерол или нейтральный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол и нейтральный липид, но не PEG-модифицированный липид. Липидная частица может включать
- 64 039892 в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол и PEG-модифицированный липид, но не нейтральный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, нейтральный липид и PEG-модифицированный липид, но не стерол. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол, нейтральный липид и PEG-модифицированный липид.
В одном примере варианта воплощения, липидная частица представляет собой смесь катионных липидов, способствующих слиянию липидов, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стеринов (например, холестерина) и PEG-модифицированных липидов (например, PEG DMG или PEG DMA). В некоторых вариантах воплощения смесь липидов состоит или состоит по существу из катионных липидов, способствующих слиянию липидов, нейтральных липидов, холестерина и PEGмодифицированных липидов. В других предпочтительных вариантах воплощения липидные частицы включают в себя вышеописанные смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионный липид:0,1-50% способствующих слиянию липидов:5-45% нейтральных липидов:20-55% холестерина:0,5-15% PEG-модифицированных липидов. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%. В некоторых вариантах воплощения слиянию способствующие липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 10-50%, 20-50% или 30-50%. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0.5-45%, 1-40%, 1%35%, 1%-30% или 1%-20%.
В других предпочтительных вариантах воплощения липидная частица состоит или состоит по существу из указанной выше смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионный липид:0,1-50% способствующий слиянию липид:5-45% нейтральный липид:20-55% холестерин:0,5-15% PEG-модифицированный липид.
В конкретных вариантах воплощения молярное соотношение липидов, в соотношении мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA составляет примерно 40/10/40/10, 35/15/40/10 или 52/13/30 /5; эту смесь дополнительно комбинируют со способствующим слиянию липидом в молярном соотношении 0,1-50%, 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%, другими словами, когда 40/10/40/10 смесь липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA в сочетании со способствующим слиянию липидом в молярном соотношении 50%, полученные частицы липидов могут иметь общее молярное отношение (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEGDMA/способствующий слиянию липид) 20/5/20/5/50. В другой группе вариантов воплощения нейтральные липиды, DSPC в этих композициях заменяются POPC, DPPC, DOPE или SM.
Липидные частицы, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя один или несколько терапевтических агентов. Таким образом, композиции, которые включают частицы липидов и активный агент, где активный агент связан с липидной частицей, обеспечены. В конкретных вариантах воплощения активный агент является терапевтическим агентом. В конкретных вариантах воплощения активный агент инкапсулирован в водном интерьере липидной частицы. В других вариантах воплощения активный агент присутствует в одном или нескольких липидных слоях липидных частиц. В других вариантах воплощения активный агент связан с внешней или внутренней липидной поверхностью липидных частиц.
Полностью инкапсулированный, используемый здесь, означает, что нуклеиновые кислоты в частицах не сильно деградировали после воздействия сывороткой или анализа нуклеазы, которые существенно разрушают свободные нуклеиновые кислоты. В полностью инкапсулированной системе предпочтительно менее 25% частиц нуклеиновой кислоты разлагается в лечении, которые обычно ухудшают 100% свободной нуклеиновой кислоты, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от нуклеиновой кислоты частиц деградировали. Кроме того, полная инкапсуляция может быть определена анализом Oligreen®. Oligreen® является ультрачувствительным флуоресцентным окрашиванием нуклеиновой кислоты для количественного определения олигонуклеотидов и одноцепочечной ДНК в растворе (доступен Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Полностью инкапсулированный также предполагает, что частицы сыворотки стабильны, то есть что они не разлагаются быстро на составные части при введении in vivo.
В одном варианте воплощения липидные частицы содержат катионный липид настоящего изобретения, нейтральный липид, стерол и PEG-модифицированный липид. В одном варианте воплощения липидные частицы включают от примерно 25% до примерно 75% на молярной основе катионных липидов, например, от около 35 до около 65%, от около 45 до около 65%, около 60%, около 57,5%, около 57,1%, около 50% или около 40% на молярной основе. В одном варианте воплощения липидные частицы включают от около 0% до около 15% на молярной основе нейтральных липидов, например, от примерно 3 до примерно 12%, от примерно от 5 до примерно 10%, около 15%, около 10%, около 7,5%, около 7,1% или около 0% на молярной основе. В одном из вариантов воплощения нейтральный липид является DPPC. В одном из вариантов воплощения нейтральный липид является DSPC. В одном вари- 65 039892 анте воплощения состав включает в себя от примерно 5% до примерно 50% на молярной основе стерола, например, около 15 до около 45%, около 20 до около 40%, около 48%, около 40%, около 38,5%, около 35%, около 34,4%, около 31,5% или около 31% на молярной основе. В одном варианте воплощения стеролом является холестерин.
В одном варианте воплощения липидные частицы включают от примерно 0,1% до примерно 20% на молярной основе PEG -модифицированных липидов, например, от примерно 0,5 до примерно 10%, от примерно 0,5 до примерно 5%, около 10%, около 5%, около 3,5%, 1,5%, 0,5% или около 0,3% на молярной основе. В одном варианте воплощения PEG-модифицированный липид является PEG-DMG. В одном варианте воплощения PEG модифицированный липид является PEG-c-DMA. В одном варианте воплощения липидные частицы включают 25-75% катионных липидов, 0,5-15% нейтральных липидов, 5-50% стеринов и 0,5-20% PEG -модифицированных липидов на молярной основе.
В одном варианте воплощения липидные частицы включают 35-65% катионных липидов, 3-12% нейтральных липидов, 15-45% стеролов, 0.5-10% PEG-модифицированных липидов на молярной основе. В одном варианте воплощения липидные частицы включают 45-65% катионных липидов, 5-10% нейтральных липидов, 25-40% стерола и 0,5-5% PEG -модифицированных липидов на молярной основе. В одном варианте воплощения PEG-модифицированные липиды содержат PEG молекулы со средней молекулярной массой 2000 Да. В одном варианте воплощения PEG-модифицированные липиды являются PEG-дистирил глицерином (PEG-DSG).
В одном варианте воплощения соотношение липидов:миРНК составляет по меньшей мере, примерно 0,5:1, по меньшей мере, примерно 1:1, по меньшей мере, примерно 2:1, по меньшей мере, примерно 3:1, по меньшей мере, примерно 4:1, по меньшей мере около 5:1, по меньшей мере, примерно 6:1, по меньшей мере, примерно 7:1, по меньшей мере, примерно 11:1 или, по меньшей мере, примерно 33:1. В одном варианте воплощения соотношение липидов: миРНК соотношение составляет примерно от 1:1 до примерно 35:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 15:1 или от примерно 5:1 до примерно 13:1. В одном варианте воплощения соотношение липидов:миРНК соотношение составляет между от примерно 0,5:1 до примерно 12:1.
В одном варианте воплощения липидные частицы являются наночастицами. В дополнительных вариантах воплощения липидные частицы имеют средний размер диаметром от примерно 50 нм до примерно 300 нм, например, от примерно 50 нм до примерно 250 нм, например, от примерно 50 нм до примерно 200 нм.
В одном варианте воплощения липидная частица, содержащая катионный липид по любому из описанных здесь вариантов воплощения имеет in vivo период полураспада (t1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем около 3 ч, такой как меньше чем около 2,5 ч, менее чем около 2 ч, менее чем около 1,5 ч, менее чем около 1 ч, менее чем примерно 0,5 ч или менее 0,25 ч.
В другом варианте воплощения липидная частица, содержащая катионный липид по любому из описанных здесь вариантов воплощения, имеет in vivo период полураспада (t1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем около 10% (например, менее чем около 7,5%, меньше, чем около 5%, менее чем около 2,5%), что тот же катионный липид без биоразрушаемой группы или групп.
Дополнительные компоненты
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя аполипопротеин. Как здесь используется, термин аполипопротеин или липопротеин относится к аполипопротеинам, известным специалистам в данной области, и вариантам и их фрагментам и аполипопротеина агонистам, аналогам или их фрагментам, описанным ниже.
Подходящие аполипопротеины включают, но не ограничиваются этим, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V и ApoE и активные полиморфные формы, изоформы, варианты и мутанты, а также фрагменты или усеченные формы. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин является тиолсодержащим аполипопротеином. Тиолсодержащий аполипопротеин относится к аполипопротеину, варианту, фрагменту или изоформе, которая содержит по меньшей мере один остаток цистеина. Наиболее распространенными тиолсодержащими аполипопротеинами являются ApoA-I Milano (ApoA-IM) и ApoA-I Paris (ApoA-IP), которые содержат один остаток цистеина (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 и ApoE3 также являются тиолсодержащими аполипопротеинами. Изолированные ApoE и/или активные фрагменты полипептида и их аналоги, в том числе их рекомбинантные формы, описаны в патентах США №№ 5672685, 5525472, 5473039, 5182364, 5177189, 5168045, 5116739, описания которых включены здесь в качестве ссылки. ApoE3 раскрыта в Weisgraber, et al., Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms, J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; и Rall, et al., Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects, Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700. См. также инвентарный номер GenBank K00396.
В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин может быть в своей зрелой форме, в своей препроаполипопротеиновой форме или в форме проаполипопротеина. Гомо- и гетеродимеры (где это возможно) про- и зрелые ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29), ApoA-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)167-987; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:
- 66 039892
1632-35), ApoA-I Paris (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol.
Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al.,
1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83) и ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000) также могут быть использованы.
В некоторых вариантах воплощения аполипопротеином может быть фрагмент, вариант или изоформа аполипопротеина. Термин фрагмент относится к любому аполипопротеину, имеющему аминокислотную последовательность короче, чем у природного аполипопротеина, и у которого фрагмент сохраняет активность природного аполипопротеина, в том числе липид-связывающие свойства. Под вариантом подразумевается замена или изменения в аминокислотной последовательности гена аполипопротеина, которая путем замены или изменений, например, добавления и удаления аминокислотных остатков, не отменяют активности природного аполипопротеина, в том числе липид-связывающих свойств. Таким образом, вариант может содержать белок или пептид, имеющий по существу идентичную аминокислотную последовательность природному аполипопротеину, здесь предоставленному, в которых один или более аминокислотных остатков были консервативно замещены химически подобными аминокислотами. Примеры консервативных замен включают замену по меньшей мере одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, метионин или другого. Точно так же, например, возможна замена по меньшей мере одного гидрофильного остатка, такого как, например, между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, а также между глицином и серином (см. патенты США. №№ 6004925, 6037323 и 6046166), которые являются консервативными заменами. Термин изоформы относится к белку, имеющему те же, большие или частичные функции и аналогичную, идентичную или частичную последовательность, и может или не может быть продуктом одного и того же гена и, как правило, тканеспецифический (см. Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8): 1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3): 181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(l-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23): 14888-93 и патент США № 6372886).
В некоторых вариантах воплощения липидные частицы и композиции, описанные здесь, включают химерные конструкции аполипопротеина. Например, химерные конструкции аполипопротеина могут содержать домен аполипопротеина с высокой связывающей способностью липидов, связанных с доменом аполипопротеина, содержащего защитные свойства по отношению к реперфузионной ишемии. Химерной конструкцией аполипопротеина может быть конструкция, которая включает в себя отдельные регионы внутри аполипопротеина (т.е. гомологичные конструкции), или химерной конструкцией может быть конструкция, которая включает в себя отдельные регионы между разными аполипопротеинами (т.е. гетерологичные конструкции). Композиции, содержащие химерные конструкции, могут также включать сегменты, в которых аполипопротеина варианты или сегменты имеют специфический характер (например, липидное связывание, связывание с рецепторами, ферментативные, ферментактивирующие, антиоксидантные свойства или уменьшение окисления) (см. Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10): 1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84).
В качестве аполипопротеинов использованы также рекомбинантные, синтетические, полусинтетические или очищенные аполипопротеины. Способы получения аполипопротеинов или их эквивалентов хорошо известны в данной области. Например, аполипопротеин может быть отделен от плазмы или натуральных продуктов, например, центрифугированием в градиенте плотности или иммуноаффинной хроматографией, или производятся синтетически, полусинтетически или с помощью технологий рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области (см., например, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2):83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; патенты США №№ 5059528, 5834596, 5876968 и 5721114; и PCT публикации WO 86/04920 и WO 87/02062).
Аполипопротеины могут дополнительно включать в себя аполипопротеина агонисты, такие как пептиды и пептидные аналоги, которые имитируют активность ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-IM), ApoA-I Paris (ApoA-IP), ApoA-II, ApoA-IV и ApoE. Например, аполипопротеином может быть любой из
- 67 039892 тех, которые описаны в патентах США №№ 6004925, 6037323, 6046166 и 5840688, содержание которых включено здесь в качестве ссылки во всей их полноте.
Аполипопротеина агониста пептиды или пептидные аналоги могут быть синтезированы или изготовлены с использованием любой технологии для синтеза пептидов, известной в данной области, включая, например, методы, описанные в патентах США №№ 6004925, 6037323 и 6046166. Например, пептиды могут быть получены с использованием твердофазного синтеза, методика изначально описывается Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2154). Другие методы синтеза пептида могут быть найдены в Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976), и другие ссылки доступны специалистам в данной области. Обзоры методов синтеза полипептида можно найти в Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984). Пептиды также могут быть синтезированы способами в растворе, как описано The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976). Соответствующие защитные группы для использования в различных синтезах пептидов описаны в вышеупомянутых текстах, а также в McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973). Пептиды могут быть также получены путем химического или ферментативного расщепления из крупных частей, например, аполипопротеина A-I.
В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин может быть смесью аполипопротеинов. В одном из вариантов воплощения аполипопротеин может быть гомогенной смесью, то есть одним типом аполипопротеина. В другом варианте воплощения аполипопротеин может быть гетерогенной смесью аполипопротеинов, то есть смесью двух или более различных аполипопротеинов. Варианты воплощения гетерогенной смеси аполипопротеинов могут содержать, например, смесь аполипопротеина из животных источников и аполипопротеина из полусинтетических источников. В некоторых вариантах воплощения гетерогенная смесь может содержать, например, смесь ApoA-I и ApoA-I Milano. В некоторых вариантах воплощения гетерогенная смесь может содержать, например, смесь ApoA-I Milano и ApoA-I Paris. Подходящие смеси для использования в способах и композициях описаны здесь и будут очевидны для специалиста в данной области.
Если аполипопротеин получают из природных источников, он может быть получен из растительного или животного источников. Если аполипопротеин получается из животного источника, аполипопротеин может быть из любого вида. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеины могут быть получены из животных источников. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеины могут быть получены из человеческого источника. В предпочтительных вариантах воплощения аполипопротеин происходит от того же вида, в который аполипопротеин вводят.
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно содержать стериновые компоненты смеси липидов. Если они присутствуют, стерины могут быть любыми из тех стеринов, которые обычно используются в области липосом, липидных везикул или подготовки липидных частиц. В одном варианте воплощения стерин является холестерином.
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя анионный липид. Анионные липиды, пригодные для использования в липидных частицах, включают, но не ограничиваются этим, фосфатидилглицерин, кардиолипин, диацилфосфатидилстерин, диацилфосфатидиловую кислоту, N-додеканоил фосфатидилэтаноламин, N-сукцинил фосфатидилэтаноламин, Nглутарил фосфатидилэтаноламин, лизилфосфатидилглицерин и другие анионные модифицированные группы, присоединенные к нейтральным липидам.
В дополнительных вариантах воплощения амфипатические липиды также включены в липидные частицы и композиции, описанные здесь. К амфипатическим липидам относится любой подходящий материал, в котором гидрофобная часть липидного материала ориентируется к гидрофобной фазе, в то время как гидрофильные части ориентируется в сторону водной фазы. Такие соединения включают, но не ограничиваются этим, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Представленные фосфолипиды включают сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, пальмитоилолеил фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или дилинолеоилфосфатидилхолин. Другие фосфороподобные соединения, такие как сфинголипиды, гликосфинголипидные семейства, диацилглицерины и β-ацилоксикислоты, также могут быть использованы. Кроме того, такие амфипатические липиды могут быть легко смешаны с другими липидами, такими как триглицериды и стерины.
Также подходящими для включения в липидные частицы и композиции, описанные здесь, являются программируемые липиды слияния или слиянию способствующие липиды. Такие липидные частицы имеют небольшую тенденцию сливаться с клеточными мембранами и доставлять их содержимое до данного сигнального события. Это позволяет липидным частицам более равномерно распределяться после инъекции в организме или сайта болезни до их начала слияния с клетками. Сигнальным событием может быть, например, изменение pH, температуры, ионной окружающей среды или времени. Слиянию способствующие липиды могут быть, например, соединениями формулы (I), как описано выше. В некоторых случаях сигнальное событие может быть изменением pH, например, таким как разница в pH
- 68 039892 между экстрацеллюлярной окружающей средой и внутриклеточной средой или между внутриклеточной средой и эндосомной окружающей средой.
Когда время является сигнальным событием, задерживающие слияние или компоненты маскировки, такие как ATTA-липидные конъюгаты или PEG-липидные конъюгаты, могут просто обменяться с мембраной липидной частицы с течением времени. К тому времени, когда липидные частицы соответствующим образом распределяться в организме, они потеряют достаточную часть агента маскировки, чтобы быть способными к слиянию. С другими сигнальными событиями может быть желательно выбрать сигнал, который связан с сайтом заболевания или клеткой-мишенью, такими как повышенная температура в месте воспаления.
Активные (терапевтические) агенты
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя один или более активных агентов (например, терапевтических агентов). Активные агенты, используемые здесь, включают любые молекулы или соединения, способные оказывать желаемое воздействие на клетки, ткани, органы или субъект. Такие эффекты могут быть, например, биологические, физиологические или косметические. Липидные частицы и композиции могут быть использованы для доставки любого из множества активных агентов. Активный агент может быть нуклеиновой кислотой, пептидом, полипептидом (например, антителом), цитокином, фактором роста, фактором апоптоза, фактором, вызывающим дифференциацию, клеточной поверхности рецепторами и их лигандами, гормонами и малыми молекулами. Подходящие терапевтические агенты также включают противовоспалительные соединения, антидепрессанты, стимуляторы, анальгетики, антибиотики, лекарства контроля над рождаемостью, жаропонижающие средства, сосудорасширяющие средства, антиангиогенные, цитоваскулярные агенты, ингибиторы передачи сигнала, сердечно-сосудистые препараты, например, антиаритмические агенты, вазоконстрикторы, гормоны и стероиды. Липидные частицы по настоящему изобретению могут также доставлять аптамеры.
В некоторых вариантах воплощения терапевтический агент является онкологическим препаратом, который также может быть отнесен к противоопухолевым лекарствам, противораковым лекарствам, опухолевым лекарствам, противоопухолевым агентам и тому подобное. Примеры онкологических препаратов, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, адриамицин, алкеран, аллопуринол, альтретамин, амифостин, анастрозол, araC, триоксид мышьяка, азатиоприн, бексаротен, biCNU, блеомицин, бусульфан внутривенный, пероральный бусульфан, капецитабин (Xeloda), карбоплатин, кармустин, CCNU, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклоспорин A, цитарабин, цитозинарабинозид, даунорубицин, цитоксан, даунорубицин, дексаметазон, дексразоксан, додетаксел, доксорубицин, доксорубицин, DTIC, эпирубицин, эстрамустин, этопозида фосфат, этопозид и VP-16, экземестан, FK506, флударабин, фторурацил, 5-FU, гемцитабин (гемзар), гемтузумаб озогамицин, гозерелина ацетат, гидреа, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, мезилат иматиниба, интерферон, иринотекан (Camptostar, CPT 111), летрозол, лейковорин, лейстатин, лейпролид, левамизол, литретиноин, мегастрол, мелфалан, L-PAM, месны, метотрексат, метоксален, митрамицин, митомицин, митоксантрон, азотистый иприт, паклитаксел, памидронат, Pegademase, пентостатин, порфимир натрия, преднизолон, ритуксан, стрептозоцин, STI-571, тамоксифен, таксотер, тимозоламид, тенипозид, VM-26, топотекан (Hycamtin), торемифен, третиноин, ATRA, валрубицин, велбан, винбластин, винкристин, VP16 и винорелбин. Другими примерами онкологических препаратов, которые могут быть использованы, являются эллиптицин и эллиптицина аналоги или производные, эпотилон, внутриклеточные ингибиторы киназы и камптотецинов.
В предпочтительном варианте воплощения активный агент представляет собой нуклеиновые кислоты, такие как миРНК. Например, активный агент может быть нуклеиновой кислотой кодирующей представляющий интерес продукт, включая, но не ограничиваясь этим, РНК, антисмысловой олигонуклеотид, антагомир, ДНК, плазмиды, рибосомальную РНК (рРНК), микро-РНК (микроРНК) (например, микроРНК которая является одноцепочечной и 17-25 нуклеотидов в длину), транспортные РНК (тРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК), малые ядерные РНК (мяРНК), антигены, их фрагменты, белки, пептиды, вакцины и малые молекулы или их смеси. В еще одном предпочтительном варианте воплощения нуклеиновая кислота является олигонуклеотидом (например, 15-50 нуклеотидов в длину (или 15-30 или 20-30 нуклеотидов в длину)). МиРНК может иметь, например, дуплекс регион, который состоит из 16-30 нуклеотидов. В другом варианте воплощения нуклеиновая кислота является иммуностимулирующим олигонуклеотидом, олигонуклеотидной приманкой, супермиром, имитирующей микроРНК или ингибитором микроРНК. Супермир относится к одноцепочечному, двухцепочечному или частично двухцепочечному олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или обеим, или их модификации, которая имеет нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична микроРНК и которая является антисмысловой по отношению к своей цели. Имитирующие микроРНК представляют собой класс молекул, которые могут быть использованы для имитации способности генов из одного или нескольких микроРНК. Таким образом, термин микроРНК имитирующие относится к синтетическим, не кодирующим РНК (т.е. микроРНК не получена путем очистки от источника эндогенного микроРНК), которые способны проникать
- 69 039892 путем РНК-интерференции и регуляции экспрессии генов.
Нуклеиновая кислота, которая присутствует в липид-нуклеиновая кислота частице может быть в любой форме. Нуклеиновая кислота может быть, например, одноцепочечной ДНК или РНК, или двухцепочечной ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибридом. Не ограничивающие примеры двухцепочечной РНК включают миРНК. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК и триплекс формирующие олигонуклеотиды. Липидные частицы по настоящему изобретению могут также доставлять нуклеиновые кислоты, которые сопряжены с одним или несколькими лигандами.
Фармацевтические композиции
Липидные частицы, особенно в сочетании с терапевтическим агентом, могут быть образованы в виде фармацевтической композиции, например, такой, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, выбранный в соответствии с маршрутом введения и стандартной фармацевтической практикой.
В некоторых вариантах воплощения композиции для доставки молекул миРНК описаны. Эти составы эффективны в понижающем регулировании уровня белка и/или мРНК белков-мишеней. На активность этих композиций может влиять присутствие катионных липидов и молярное соотношения катионного липида в составе.
В конкретных вариантах воплощения фармацевтические композиции, содержащие липидные частицы нуклеиновых кислот, получают в соответствии со стандартными методами, и дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Как правило, физиологический раствор будет использоваться в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители включают в себя, например, воду, буферный раствор, 0,9% солевой раствор, 0,3% глицин и т.п., в том числе гликопротеины для повышенной стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. В композициях, содержащих физиологический раствор или другие соли, содержащие носители, носитель предпочтительно добавляется после формирования липидных частиц. Таким образом, после того как липидная композиция нуклеиновой кислоты образуется, композиции могут быть разведены в фармацевтически приемлемых носителях, таких как физиологический раствор.
В результате фармацевтические препараты могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными методами стерилизации. Водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как pH корректоры и буферные агенты, агенты тонусрегулирующие и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д. Кроме того, липидная суспензия может включать в себя липидные защитные агенты, которые защищают липиды от свободных радикалов и повреждений перекисными липидами при хранении. Липофильные свободно-радикальные ловушки, такие как α-токоферол и водорастворимые железоспецифические хелатирующие агенты, такие как ферриоксамин, являются подходящими.
Концентрация липидной частицы или липид- нуклеиновая кислота частицы в фармацевтических препаратах может широко варьироваться, т.е. от менее чем около 0,01%, как правило, или по меньшей мере около 0,05-5%, до целых 10 до 30% по весу и будет выбрана прежде всего от объема жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть увеличена, чтобы снизить нагрузку жидкостью, связанную с лечением. Это может быть особенно желательным у больных с атеросклерозом, связанным с застойной сердечной недостаточностью или тяжелой артериальной гипертензией. Кроме того, комплексы, состоящие из раздражающих липидов, могут быть разведены до низких концентраций, чтобы уменьшить воспаление в месте введения. В одной группе вариантов воплощения нуклеиновые кислоты будут иметь прилагаемые этикетки и будут использоваться для диагностики (с указанием наличия дополнительных нуклеиновых кислот). В этом случае количество комплексов введения будет зависеть от конкретной используемой этикетки, болезненного состояния, диагностируемого по мнению врача, но обычно составляет от около 0,01 до около 50 мг на килограмм веса тела, предпочтительно от около 0,1 до около 5 мг/кг массы тела.
Как отмечалось выше, липид- терапевтический агент (например, нуклеиновые кислоты) частицы могут включать в себя полиэтиленгликоль (PEG), модифицированные фосфолипиды, PEG керамиды, или ганглиозид GMl-модифицированный липид, или другие липиды, эффективные для предотвращения или ограничения агрегации. Добавление таких компонентов не только предотвращает сложные агрегации. Скорее, оно может также служить средством для увеличения времени циркуляции и повышения доставки липид-нуклеиновая кислота композиции в ткани-мишени.
Липид-терапевтический агент композиции также могут быть представлены в виде набора. Комплект, как правило, будет состоять из контейнера, который делится на ячейки для хранения различных элементов комплекта. Комплект будет содержать частицы или фармацевтические композиции, предпочтительно в обезвоженном или концентрированном виде, с инструкциями по их регидратации или
- 70 039892 разбавлению и введению. В некоторых вариантах воплощения частицы содержат активное вещество, в то время как в других вариантах воплощения они его не содержат.
Способы производства
Способы изготовления катионных липидов, липидных частиц, содержащих их, и фармацевтических композиций, содержащих катионные липиды и/или липидные частицы описаны, например, в международных публикациях №№ WO 2010/054406, WO 2010/054401, WO 2010/054405, и WO 2010/054384, WO 2010/042877, WO 2010/129709, WO 2009/086558 и WO 2008/042973, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме.
Способы получения липидных частиц и фармацевтических композиций, содержащих липидные частицы также описаны, например, в публикациях США №№ 2004/0142025, 2006/0051405 и 2007/0042031, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме. В дополнение, способы получения липидных частиц, в том числе связанных с терапевтическим агентом, например, нуклеиновыми кислотами, описаны. В описанных здесь способах смесь липидов является сочетанием с буфером водного раствора нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновые кислоты, инкапсулированные в липидные частицы. В одном из вариантов воплощения инкапсулированные нуклеиновые кислоты, присутствуют в смеси нуклеиновая кислота/липид в соотношении от примерно 3 мас.% до примерно 25 мас.%, предпочтительно от 5 до 15 мас.%. Промежуточная смесь может быть опционального размера для получения частицы липидов с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, в которой липидные порции однослойной везикулы, предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от около 40 до 90 нм. pH затем поднимают, чтобы нейтрализовать хотя бы часть поверхностных зарядов на липид-нуклеиновые кислоты частицах, обеспечивая тем самым хотя бы частичную нейтрализацию поверхности липид- инкапсулированные нуклеиновые кислоты композиции.
Например, в одном из вариантов воплощения раствор одного или нескольких липидов (в том числе катионного липида любого из описанных здесь вариантов воплощения) в органическом растворе (например, этаноле) подготовлен. Кроме того, раствор одного или более активных (терапевтических) агентов (таких, как, например, молекулы миРНК или 1: 1 молярная смесь двух молекул миРНК) в водном буферном (например, цитрат буфер) растворе приготовлен. Эти два раствора смешивают и разбавляют с образованием коллоидной суспензии частиц миРНК липидов. В одном варианте воплощения частицы миРНК липидов имеют средний размер частиц около 80-90 нм. В других вариантах воплощения дисперсию фильтруют через 0,45/2 мкм фильтры, концентрируют и диафильтруют посредством тангенциальной фильтрации. В еще одном варианте воплощения концентрацию полученного продукта доводят до примерно 2 мг/мл. В еще одном варианте воплощения продукт фильтруют, асептически фильтруют и упаковывают. Как описано выше, некоторые из этих катионных липидов являются аминокислотными липидами, которые имеют заряженные при pH ниже рКа аминогруппы и по существу нейтральны при pH выше рКа. Эти катионные липиды называют титруемыми катионными липидами и они могут быть использованы в композициях с использованием двух этапов. Во-первых, липидные пузырьки могут быть сформированы при низком pH с титруемым катионным липидом и другими компонентами везикул в присутствии нуклеиновых кислот. Таким образом, пузырьки будут инкапсулированы и вовлекут нуклеиновые кислоты. Во-вторых, поверхностный заряд вновь образованных пузырьков может быть нейтрализован увеличением pH среды до уровня выше рКа настоящего титруемого катионного липида, т.е. к физиологическому pH или выше. Особенно преимущественные аспекты этого процесса включают в себя поверхностное удаление с любой поверхности адсорбированных нуклеиновых кислот, в результате нуклеиновые кислоты доставляются средствами, которые имеют нейтральную поверхность. Липосомы, или липидные частицы, имеющие нейтральную поверхность, как ожидается, будут избегать быстрого выведения из обращения и избегать определенной токсичности, которая связана с катионными липосомами препаратов. Дополнительные подробности, касающиеся этих видов использования таких титруемых катионных липидов в получении нуклеиновые кислоты- липиды частиц, приведены в патенте США 6287591 и патенте США 6858225, которые включены сюда в качестве ссылки.
Надо также отметить, что пузырьки, которые образуются таким образом, обеспечивают образование одинакового размера пузырька с высоким содержанием нуклеиновых кислот. Кроме того, пузырьки могут иметь размер от примерно 30 до примерно 150 нм, более предпочтительно от около 30 до около 90 нм.
Не желая быть связанным с какой-либо конкретной теорией, считается, что самая высокая эффективность инкапсуляции нуклеиновых кислот является результатом электростатического взаимодействия при низких значениях pH. При pH кислом (например, pH 4,0) поверхность пузырьков заряжена и связывает части нуклеиновых кислот посредством электростатических взаимодействий. Когда внешний кислый буфер заменяют более нейтральным буфером (например, pH 7,5),на поверхности липидной частицы или липосомы нейтрализуются, что позволяет любой внешней нуклеиновой кислоте быть удаленной. Более подробная информацию о процессе получения приводится в различных изданиях (например, патент США 6287591 и патент США 6858225).
В связи с вышеизложенным, способы получения липиды/нуклеиновые кислоты составов описаны.
- 71 039892
В описанных здесь способах смесь липидов в сочетании с буфером водного раствора нуклеиновой кислоты для получения промежуточных смесей, содержащих нуклеиновые кислоты, инкапсулированные в липидные частицы, например, где инкапсулированные нуклеиновые кислоты, присутствующие в нуклеиновая кислота/липид отношении примерно от 10 мас.% до примерно 20 мас.%. Промежуточная смесь может быть опционального размера для получения частицы липидов с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, в которой липидные порции представляют собой однослойные везикулы, предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от 40 до 90 нм. pH затем поднимают, чтобы нейтрализовать хотя бы часть поверхностных зарядов на липид-нуклеиновые кислоты частицах, обеспечивая тем самым хотя бы частичную нейтрализацию поверхности липидинкапсулированные нуклеиновые кислоты композиции.
В некоторых вариантах воплощения смесь липидов включает, по меньшей мере, два липидных компонента: первый компонент - липиды, которые выбирают из липидов, которые имеют рКа, как катионные липиды при pH ниже рКа и нейтральные при pH выше рКа, и второй компонент - липиды, которые выбирают из липидов, которые препятствуют агрегации частиц во время формирование липид нуклеиновая кислота частиц. В конкретных вариантах воплощения аминолипиды являются катионными липидами.
При приготовлении нуклеиновые кислоты-липид частиц, смесь липидов, как правило, является раствором липидов в органическом растворителе. Эта смесь липидов может быть высушена с образованием тонкой пленки или лиофилизирована с получением порошка, прежде чем гидратирована с водным буфером для формирования липосом. Кроме того, в предпочтительном способе, смеси липидов могут быть растворены в воде, смешанной со спиртом, таким как этанол, и этот спиртовой раствор добавляют к водному буферу, в результате происходит спонтанное образование липосом. В большинстве вариантов воплощения спирт используется в том виде, в котором он имеется в продаже. Например, этанол может использоваться в качестве абсолютного этанола (100%), или 95% этанола, остальное вода. Этот способ более подробно описан в патенте США № 5976567).
В одном варианте воплощения смесь липидов представляет собой смесь катионных липидов, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стеринов (например, холестерин) и PEGмодифицированных липидов (например, PEG-DMG или PEG-DMA) в спиртовом растворителе. В предпочтительных вариантах воплощения смесь липидов состоит в основном из катионных липидов, нейтральных липидов, холестерина и PEG-модифицированных липидов в спирте, более предпочтительно этаноле. В других предпочтительных вариантах воплощения первый раствор состоит из указанной выше смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионного липида:5-45% нейтральных липидов:20-55% холестерина:0,5-15% PEG-модифицированных липидов. В еще более предпочтительном варианте воплощения, первый раствор состоит в основном из смеси катионных липидов, выбранных из липидов, описанных в табл. 1-5, DSPC, Chol и PEG-DMG или PEG-DMA, более предпочтительно в молярном соотношении примерно 20-60% катионного липида:5-25% DSPC:25-55% Chol:0,5-15% PEG-DMG или PEG-DMA. В конкретных вариантах воплощения молярное липидное отношение составляет примерно 40/10/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA), 35/15/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA) или 52/13/30/5 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA). В другой группе предпочтительных вариантов воплощения нейтральные липиды в этих композициях заменяются POPC, DPPC, DOPE или SM.
Липидная смесь является сочетанием с буферным водным раствором, который может содержать нуклеиновые кислоты. Буферный водный раствор, как правило, раствор, в котором буфер имеет pH меньше, чем рКа протонированных липидов в смеси липидов. Примеры подходящих буферов включают цитрат, фосфат, ацетат, MES. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительные буферы будут находиться в диапазоне 1-1000 мМ по аниону, в зависимости от химии нуклеиновых кислот инкапсуляции, и оптимизации концентрации буфера могут быть существенными для достижения высоких уровней загрузки (см., например, патент США 6287591 и патент США 6858225, каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме). Кроме того, чистую воду подкисляют до pH 5-6 с хлоридом, сульфатом и т.п., которые могут быть полезны. В этом случае он может быть подходящим, чтобы добавить 5% раствор глюкозы или другое неионное растворенное вещество, которое будет балансировать осмотический потенциал через мембраны частицы, когда частицы диализуются для удаления этанола, увеличения pH или смешиваются с фармацевтически приемлемым носителем, таким как обычный физиологический раствор. Количество нуклеиновых кислот в буфере может варьироваться, но обычно составляет от около 0,01 мг/мл до около 200 мг/мл, более предпочтительно от около 0,5 мг/мл до около 50 мг/мл.
Смесь липидов и буферного водного раствора терапевтических нуклеиновых кислот объединяют, чтобы обеспечить промежуточные смеси. Промежуточные смеси, как правило, являются смесью липидных частиц, имеющих инкапсулированные нуклеиновые кислоты. Кроме того, промежуточная смесь может также содержать некоторую часть нуклеиновых кислот, которые крепятся к поверхности липидной частицы (липосомы или липидных пузырьков) за счет ионного притяжения отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и положительно заряженных липидов на поверхности липидных час
- 72 039892 тиц (аминолипидов или других липидов, составляющих протонированный первый компонент липидов, положительно заряженных в буфере с pH меньше, чем рКапротонированной группы липидов). В одной группе предпочтительных вариантов воплощения смесь липидов является спиртовым раствором липидов и объемы каждого из растворов регулируется таким образом, что после комбинации, в результате содержание алкоголя составляет от примерно 20% по объему до около 45% по объему. Способ объединения смесей может включать в себя любые из множества процессов, часто в зависимости от масштабов производства смеси. Например, при общем объеме, который составляет около 10-20 мл или менее, растворы могут быть объединены в пробирке и перемешаны вместе с помощью вихревого смесителя. Крупномасштабные процессы могут быть осуществлены в соответствующей посуде серийного производства.
Опционально, липид-инкапсулированный терапевтический агент (например, нуклеиновые кислоты) комплексы, которые получают путем объединения смеси липидов и буферного водного раствора терапевтического агента (нуклеиновые кислоты), может быть рассчитан для достижения желаемого диапазона размеров с относительно узким распределением размеров липидных частиц. Предпочтительно, композиции, представленные здесь, будут такого размера, чтобы средний диаметр составлял от около 70 до около 200 нм, более предпочтительно от около 90 до около 130 нм. Некоторые методы доступны для определения размера липосом нужного размера. Один способ калибровки описан в патенте США № 4737323, который включен сюда в качестве ссылки. Ультразвуковое облучение суспензии липосом либо с помощью ванны либо ультразвуковым зондом производит постепенное уменьшение размеров вплоть до мелких однослойных везикул (SUV) менее 0,05 мкм в размере. Гомогенизация является другим способом, который опирается на сдвиг энергии фрагментов больших липосом на более мелкие. В обычной процедуре гомогенизации многослойные пузырьки циркулируют через стандартный эмульсионный гомогенизатор до выбранного размера липосомы, как правило, примерно от 0,1 до 0,5 мкм. В обоих способах распределение частиц по размерам можно контролировать с помощью обычного лазерного пучка определения размера частиц. Для некоторых способов здесь используется экструзия для получения одинакового размера пузырька.
Экструзия липосом композиции через поликарбонатную мембрану с небольшими порами или асимметричную керамическую мембрану дает в результате относительно четко определенное распределение по размерам. Как правило, суспензия пропускается циклически через мембрану один или несколько раз, пока не достигается желаемое сложное распределение размера липосом. Липосомы могут последовательно выдавливаться через мембраны с меньшими порами, чтобы достичь постепенного сокращения размера липосом. В некоторых случаях липид-нуклеиновая кислота композиции, которые образуются, могут быть использованы без калибровки.
В конкретных вариантах воплощения способы дополнительно включают стадию нейтрализации, по меньшей мере, некоторых из поверхностных зарядов на липидной части липид - нуклеиновая кислота композиции. По меньшей мере, частично нейтрализуя поверхностные заряды, разинкапсулированная нуклеиновая кислота, освобождается с поверхности липидных частиц и может быть удалена из состава при использовании обычных методов. Предпочтительно, разинкапсулированые и поверхностноадсорбированные нуклеиновые кислоты удаляют из полученной композиции путем обмена буферных растворов. Например, замена цитрат буфера (pH около 4,0, используемый для формирования составов) на HEPES буферный солевой (HBS pH около 7,5) раствор приводит к нейтрализации поверхности липосомы, и нуклеиновые кислоты высвобождаются с поверхности. Высвобожденные нуклеиновые кислоты могут быть удалены с помощью хроматографии с использованием стандартных способов, а затем переведены в буфер с pH выше рКа использованных липидов.
Опционально липидные пузырьки (т.е. липидные частицы) могут быть сформированы путем гидратации в водном буфере и формирования с использованием любого из способов, описанных выше, до введения в их состав нуклеиновых кислот. Как описано выше, водный буфер должен иметь pH ниже рКа аминолипидов. Раствор нуклеиновых кислот могут быть добавлен в эти предварительно сформированные пузырьки. Для обеспечения инкапсуляции нуклеиновых кислот в такие предварительно сформированные пузырьки смесь должна содержать алкоголь, такой как этанол. В случае этанола, он должен присутствовать в концентрации от около 20% (м/м) до около 45% (м/м). Кроме того, может быть необходимо нагреть смесь предварительно сформированных пузырьков и нуклеиновых кислот в водной смеси этанольного буфера до температуры от около 25°C до около 50°C в зависимости от состава липидных везикул и характера нуклеиновой кислоты. Это будет очевидно для специалиста в данной области, что оптимизация процесса инкапсуляции для достижения желаемого уровня нуклеиновых кислот в липидных везикулах потребует манипуляции переменными, такими как концентрация этанола и температура. Примеры подходящих условий для инкапсуляции нуклеиновых кислот приведены в примерах. После того, как нуклеиновые кислоты заключены в предварительно сформированные пузырьки, внешний pH может быть увеличен для, по меньшей мере частичной, нейтрализации заряда поверхности. Разинкапсулированые и поверхностно адсорбированные нуклеиновые кислоты могут быть удалены как описано выше.
- 73 039892
Способы лечения
Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут быть использованы для различных целей, в том числе доставки связанных или инкапсулированных терапевтических агентов к клеткам, как in vitro, так и in vivo. Соответственно, способы лечения заболеваний или нарушений у субъекта, нуждающегося в этом, могут включать в себя контакт субъекта с липидной частицей, связанной с подходящим терапевтическим средством.
Как описано здесь, липидные частицы особенно полезны для доставки нуклеиновых кислот, в том числе, например, молекул миРНК и плазмид. Таким образом, липидные частицы и композиции могут быть использованы для модуляции экспрессии целевых генов и белков, как in vitro, так и in vivo, путем контакта с клетками липидных частиц, связанных с нуклеиновой кислотой, которая снижает экспрессию генов мишеней (например, миРНК) или нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для увеличения экспрессии нужного белка (например, плазмиды, кодирующей нужный белок).
Липидные частицы могут быть использованы для доставки терапевтических агентов в клетку, in vitro или in vivo. В конкретных вариантах воплощения терапевтический агент представляет собой нуклеиновые кислоты, которые поступают в клетку с помощью нуклеиновых кислот - липидных частиц. В то время как следующее описание различных способов применения липидных частиц и связанных с ними фармацевтических композиций является примером описания связанных с нуклеиновой кислотой липидных частиц, следует понимать, что эти способы и композиции могут быть легко приспособлены для доставки любого терапевтического средства для лечения любого заболевания или расстройства, которые выиграют от такого лечения.
В некоторых вариантах воплощения способы введения нуклеиновых кислот в клетку описаны. Предпочтительные нуклеиновые кислоты для введения в клетки - миРНК, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые и рибозимы. Эти способы могут быть выполнены при контакте частиц или композиций с клетками в течение периода времени, достаточного для внутриклеточной доставки.
Композиции могут адсорбироваться практически в любой тип клеток. После адсорбирования, нуклеиновые кислоты - липидные частицы могут быть либо эндоцитированы частично клетками, путем обмена липидов с клеточными мембранами, или сливаются с клетками. Передача или включения в состав нуклеиновокислотной части комплекса может осуществляться с помощью любого из этих путей. Не желая быть ограниченными, можно считать, что в случае частиц, поступивших в клетку путем эндоцитоза, частицы затем взаимодействуют с эндосомной мембраной, что приводит к дестабилизации мембраны эндосом, возможно, с образованием небислойной фазы, в результате чего происходит введение инкапсулированных нуклеиновых кислот в цитоплазму клетки. Точно так же в случае прямого слияния частиц с клеточной плазматической мембраной, когда происходит слияние, липосомальная мембрана интегрирована в клеточные мембраны, и содержимое липосомы комбинируется с внутриклеточной жидкостью. Контакты между клетками и липид-нуклеиновые кислоты композициями, когда проводятся in vitro, происходят в биологически совместимой среде. Концентрация композиции может варьироваться в зависимости от конкретного применения, но обычно составляет от около 1 мкмоль и до около 10 ммоль. В некоторых вариантах воплощения обработка клеток липидной композицией нуклеиновых кислот, как правило, будет осуществляться при физиологической температуре (около 37°C) в течение периода времени от 1 до 24 ч, предпочтительно от 2 до 8 ч. При применении in vitro, доставка нуклеиновых кислот может быть в любую клетку, выращенную в культуре, будь то растительного или животного происхождения, позвоночных и беспозвоночных, а также любые ткани или типы. В предпочтительных вариантах воплощения клетки будут клетками животных, более предпочтительно - клетками млекопитающих, наиболее предпочтительно - клетками человека.
В одной группе вариантов воплощения липид-нуклеиновых кислот суспензия частиц добавляется к 60-80% вырожденному покрытию клеток, имеющему плотность клеток от примерно 103 до примерно 105 клеток/мл, более предпочтительно около 2х104 клеток/мл. Концентрация суспензии, добавляемой к клеткам, предпочтительно равна примерно от 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно примерно 1 мкг/мл.
В другом варианте воплощения липидные частицы могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в клетки или клеточные линии (например, линии опухолевых клеток). Неограничивающие примеры таких клеточных линий включают в себя:
HELA (АТСС CatN: CCL-2), КВ (АТСС CatN: CCL-17), НЕРЗВ (АТСС CatN:
НВ-8064), SKOV-3 (АТСС CatN: НТВ-77), НСТ-116 (АТСС CatN: CCL-247), НТ-29 (АТСС CatN: НТВ-38), РС-3 (АТСС CatN: CRL-1435), А549 (АТСС CatN: CCL-185), MDA-MB-231 (АТСС CatN: НТВ-26).
Типичные области применения включают использование хорошо известных процедур для обеспечения внутриклеточной доставки миРНК, чтобы подавить или отключить специфические клеточные мишени. Альтернативные применения включают в себя доставку ДНК или мРНК последовательности, кодирующие терапевтически полезные полипептиды. Таким образом, терапия предназначена для гене- 74 039892 тического заболевания путем подачи недостаточных или отсутствующих генных продуктов (т.е. при дистрофии Дюшенна, см. Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989), а также для муковисцидоза, см. Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)). Другие применения композиции включают введение антисмысловых олигонуклеотидов в клетки (см., Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)).
Кроме того, композиции могут быть также использованы для доставки нуклеиновых кислот в клетки in vivo, используя способы, которые известны специалистам в данной области. Что касается доставки ДНК или мРНК последовательности, Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993), включено здесь в качестве ссылки, описывает внутривенное введения цитомегаловируса (CMV) плазмиды для экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) с использованием комплексов DOTMA-DOPE.
Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993), включено здесь в качестве ссылки, описывает доставку муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) генов в эпителии дыхательных путей и альвеол легких мышей, с использованием липосом. Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989), включено здесь в качестве ссылки, описывает in vivo трансфекцию легких мышей с функционированием прокариотических генов, кодирующих внутриклеточный фермент, хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). Таким образом, композиции могут быть использованы в лечении инфекционных заболеваний.
Для введения in vivo, фармацевтические композиции предпочтительно вводят парентерально, т. е. интраартикулярно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. В конкретных вариантах воплощения фармацевтические композиции вводят внутривенно или внутрибрюшинно при болюсной инъекции. Для примера, см. Stadler, et al., патент США № 5286634, который включен здесь в качестве ссылки. Внутриклеточная доставка нуклеиновых кислот также обсуждалась в Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), и Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993). Тем не менее другие способы терапии и введения на липидной основе описаны, например, Ruhman et al., патент США № 3993754;. Sears, патент США № 4145410; Papahadjopoulos et al., патент США № 4235871;. Schneider, патент США № 4224179;. Lenk et al., патент США № 4522803, а также Fountain et al., патент США № 4588578.
В других способах, фармацевтические препараты могут контактировать с тканью-мишенью путем прямого применения препарата в ткани. Применение может быть сделано топикально, открытой или закрытой процедурами. Топикально - это означает прямое применение фармацевтических препаратов в ткани, которая подвергается воздействию окружающей среды, таких как кожа, ротоглотка, наружный слуховой проход и тому подобное. Открытые процедуры - те процедуры, которые включают надрезание кожи пациента и непосредственно визуализацию основной ткани, к которой подаются фармацевтические препараты. Это обычно достигается путем хирургического вмешательства, такого как торакотомия для доступа к легким, брюшная лапаротомия для доступа к брюшной полости, или другого прямого хирургического подхода к ткани-мишени. Закрытые процедуры являются инвазивными процедурами, в которых внутренние ткани-мишени непосредственно не визуализируется, но доступны через вставку инструментов через небольшие раны на коже. Например, препараты могут быть введены в брюшину хирургической иглой. Кроме того, фармацевтические препараты могут быть введены в мозговые оболочки и спинной мозг путем инфузии во время спинномозговой пункции вслед за соответствующим позиционированием пациента, как обычно практикуется для спинальной анестезии или метразамидной визуализации спинного мозга. Кроме того, препараты могут быть введены через эндоскопические устройства.
Липид-нуклеиновые кислоты композиции также могут быть введены в виде аэрозоля, который попадает в легкие (см., Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)) либо по прямым впрыскиванием в место заболевания (Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994)).
Дозы для липид-терапевтических агентов частиц будут зависеть от соотношения терапевтического агента к липиду и мнения лечащего врача в зависимости от возраста, веса и состояния пациента.
В одном из вариантов воплощения способ модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида описаны. Эти способы обычно включают контактирование клетки с липидной частицей, связанной с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Как здесь используется, термин модулирующей относится к изменению экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. В разных вариантах воплощения модуляция может означать увеличение или расширение, или это может означать уменьшение или сокращение. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны в области науки и включают, например, способы, использующие обратной транскрипции полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимические методы. В конкретных вариантах воплощения уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида увеличивается или уменьшается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50% по сравнению с соответствующим контрольным значением.
Например, если повышенная экспрессия полипептида желательна, нуклеиновая кислота может
- 75 039892 быть вектором экспрессии, который включает в себя полинуклеотид, который кодирует желаемый полипептид. С другой стороны, если уменьшить экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида, то нуклеиновыми кислотами могут быть, например, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК или микроРНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется к полинуклеотиду, который кодирует целевой полипептид, тем самым нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть плазмидой, которая экспрессирует такой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или микроРНК.
В конкретных вариантах воплощения терапевтический агент выбран из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмыслового олигонуклеотида, и где миРНК, микроРНК, или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или ему комплементарный, так что экспрессия полипептида уменьшается.
В других вариантах воплощения нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или функциональный вариант или его фрагмент, такой, что экспрессия полипептида или функционального варианта или фрагмента увеличивается.
В соответствующих вариантах воплощения способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося избыточной экспрессией полипептида в субъекте, включает в себя предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтический агент выбран из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способных экспрессировать миРНК, микроРНК, или антисмыслового олигонуклеотида, и где миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или комплементарный ему.
В одном варианте воплощения фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит или состоит по существу из смеси катионных липидов, выбранных из липидов, описанных в табл. 1-5, DSPC, Chol и PEG-DMG или PEG-DMA, например, в молярном соотношении примерно 2060% катионного липида: 5 -25% DSPC: 25- 55% Chol:0,5- 15% PEG- DMG или PEG-DMA, в котором липидная частица ассоциирована с терапевтической нуклеиновой кислотой. В конкретных вариантах воплощения молярное липидное отношение составляет примерно 40/10/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA), 35/15/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEGDMG или PEG-DMA) или 52/13/30/5 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEGDMA). В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменяют на POPC, DPPC, DOPE или SM.
В другом родственном варианте воплощения способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида в субъекте, включает в себя предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтический агент представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.
Способ индукции иммунного ответа у субъекта может включать предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтическим средством является иммуностимулирующий олигонуклеотид. В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ является гуморальным или мукозальным иммунным ответом.
В других вариантах воплощения фармацевтическая композиция предоставляется субъекту в сочетании с вакциной или антигеном. Таким образом, вакцины могут включать липидную частицу, которая включает в себя иммуностимулирующий олигонуклеотид, а также связанный антиген, с которым иммунный ответ является лучшим. В конкретных вариантах воплощения антиген является антигеном опухоли или связан с инфекционным агентом, таким как, например, вирусы, бактерии или паразиты.
Различные опухолевые антигены, антигены инфекционных агентов, и антигены, связанные с другими заболеваниями, хорошо известны в данной области, и примеры из них описаны в цитируемых здесь источниках. Примеры подходящих антигенов включают, но не ограничиваются этим, полипептидные антигены и ДНК-антигены. Конкретными примерами антигена являются антигены гепатита A, гепатита B, оспы, полиомиелита, сибирской язвы, гриппа, сыпного тифа, столбняка, кори, ротавируса, дифтерии, коклюша, туберкулеза и краснухи. В предпочтительном варианте воплощения антиген гепатита B является рекомбинантным антигеном. В других аспектах антиген гепатита является рекомбинантным антигеном. В другом аспекте антиген является антигеном опухоли. Примерами таких антигенов опухолей являются MUC-1, EBV антигены и антигены, связанные с лимфомой Беркитта. В еще одном аспекте антиген является антигеном тирозиназ-связанного белка опухолевого рекомбинантного антигена. Специалистам в данной области известны другие антигены, пригодные для использования.
Опухолевые антигены, пригодные для использования, включают в себя как мутированные, так и немутированные молекулы, которые могут указывать на один тип опухоли, распределяются между несколькими типами опухолей, и/или исключительно экспрессируются или избыточно экспрессируются в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. В дополнение к белкам и гликопротеинам, опухоль-специфические формы экспрессируют углеводы, ганглиозиды, гликолипиды и муцин также были документированы. Примерами антигенов опухолей для использования в субъекте являются
- 76 039892 вакцины рака, которые включают белковые продукты онкогенов, генов-супрессоров опухолей и других генов с мутациями или перестановками, уникальными для опухолевых клеток, активизируемых эмбриональных генных продуктов, онкофетальных антигенов, тканьспецифических (но не опухольспецифические) антигенов дифференциации, рецепторов факторов роста, клеточной поверхности углеводных остатков, иностранных вирусных белков и ряда других собственных белков.
Конкретные варианты воплощения опухолевых антигенов включают, например, мутировавшие антигены, такие как белковые продукты Ras p21 протоонкогенов, супрессоры опухолей p53 и BCR-abl онкогенов, а также CDK4, MUM1, каспазы 8 и beta-катенин; сверхэкспрессированные антигены, такие как галектин 4, галектин 9, карбоангидразы, альдолаза A, PRAME, Her2/neu, ErbB 2 и КСА, онкофетальные антигены, такие как альфа-фетопротеин (AFP), хорионического гонадотропина человека (hCG); собственные антигены, такие как раковоэмбриональный антиген (CEA) и антигены дифференциации меланоцитов, такие как Mart 1/Melan A, gp100, gp75, тирозиназы, TRP1 и TRP2; антигены простаты, таких как PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 и PSM-P2; реактивированные эмбриональные генные продукты, таких как MAGE I, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE и другие антигены рака яичка, такие как NY-ESO1, SSX2 и SCP1; муцины, такие как Muc-1 и Muc-2; ганглиозиды, такие как GM2, GD2 и GD3, нейтральные гликолипиды и гликопротеины, такие как Lewis (y) и globo-H; и гликопротеины, такие как Tn, Томпсона-Фрейденрейха антиген (TF) и sTn. Также включают как опухольассоциированные антигены здесь - целые клетки и клеточные лизаты опухолей, а также иммуногенных их частей, а также иммуноглобулины идиотипов, экспрессированные на моноклональных пролиферирующих лимфоцитах B для использования против B клеточной лимфомы.
Патогены включают, но не ограничиваются ими, инфекционные агенты, например, вирусы, которые заражают млекопитающих и, в частности, людей. Примеры инфекционных вирусов включают, но не ограничиваются этим: Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ 1 (также известный как HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или ВИЧ-III, а также другие штаммы, такие как ВИЧ LP; Picornaviridae (например, вирусы полиомиелита, вирус гепатита A, энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Togaviridae (например, лошадиного вирусного энцефалита, вирусы краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronoviridae (например, коронавирус); Rhabdoviradae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Coronaviridae (например, коронавирус); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, лихорадки Эбола вирус); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, Хантаан вирусы, вирусы Bunga, плебовирусы и Nairo вирусы); Arena viridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита B); Parvovirida (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae простого герпеса вирус (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса; Poxviridae (натуральной оспы вирусы, вирусы коровьей оспы, вирусы оспы), и Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней) и неклассифицированные вирусы (например, возбудители губчатой энцефалопатии, агент дельта-гепатита (считается дефектным спутником вируса гепатита B), агенты не-A, не-B гепатита (класс 1 = передается внутренне; класс 2 = передается парентерально (например, гепатит C); Norwalk и связанные вирусы и астровирусы).
Кроме того, грамотрицательные и грамположительные бактерии служит в качестве антигенов у позвоночных животных. Такие грамположительные бактерии, включают, но не ограничиваются этим, Pasteurella species, Staphylococci species и Streptococcus species. Грамотрицательные бактерии, включают, но не ограничиваются этим, Escherichia coli, Pseudomonas species и Salmonella species. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, но не ограничиваются этим: Helicobacterpyloris, Borelia Burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (например, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Group В Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.
Дополнительные примеры патогенов включают, но не ограничиваются ими, инфекционные грибы, которые заражают млекопитающих и, в частности, людей.
Примеры инфекционных грибов включают, но не ограничиваются этим: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Примеры инфекционных паразитов включают такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale и Plasmodium vivax. Другие инфекционные организмы (например, простей- 77 039892 шие) включают Toxoplasma gondii.
В одном из вариантов воплощения композиции могут быть использованы, чтобы заставить утихнуть или модулировать гены-мишени, такие как, но не ограничиваясь этим, FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin A ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(K1P1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, гены опухолевых супрессоров, p53 опухолевого супрессора ген, p53 семейства член DN-p63, pRb опухолевого супрессора ген, APC1 опухолевого супрессора ген, BRCA1 опухолевого супрессора ген, PTEN опухолевого супрессора ген, mLL слияния ген, BCR/ABL слияния ген, TEL/AML1 слияния ген, EWS/FLI1 слияния ген, TLS/FUS1 слияния ген, PAX3/FKHR слияния ген, AML1/ETO слияния ген, alpha v-интегрин ген, Flt-1 рецептора ген, тубулина ген, вируса человеческой папилломы ген, ген, необходимый для репликации вируса человеческой папилломы, ген вируса иммунодефицита человека, ген, необходимый для репликации вируса иммунодефицита человека, ген вируса гепатита A, ген, необходимый для репликации вируса гепатита A, вируса гепатита B ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита B, вируса гепатита C ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита C, вируса гепатита D ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита D, вируса гепатита E ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита E, вируса гепатита F ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита F, вируса гепатита G ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита G, вируса гепатита H ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита H, респираторного синцитиального вируса ген, ген, необходимый для репликации респираторного синцитиального вируса, Herpes Simplex Virus ген, ген, необходимый для репликации Herpes Simplex Virus, герпес Cytomegalovirus ген, ген, необходимый для репликации герпес Cytomegalovirus, герпес Epstein Barr Virus ген, ген, необходимый для репликации герпес Epstein Barr Virus, Kaposi's Sarcoma-ассоциированный Herpes Virus ген, ген, необходимый для репликации Kaposi's Sarcoma-ассоциированный Herpes Virus, JC Virus ген, человеческий ген, необходимый для репликации JC Virus, миксовируса гена, ген, необходимый для репликации миксовируса, риновируса ген, ген, необходимый для репликации риновируса, коронавирус ген, ген, необходимый для репликации коронавируса, West Nile Virus ген, ген, необходимый для репликации West Nile Virus, St. Louis Encephalitis ген, ген, необходимый для репликации St. Louis Encephalitis, Tick-borne encephalitis virus ген, ген, необходимый для репликации Tick-borne encephalitis virus, Murray Valley encephalitis virus ген, ген, необходимый для репликации Murray Valley encephalitis virus, dengue virus ген, ген, необходимый для репликации dengue virus, Simian Virus 40 ген, ген, необходимый для репликации Simian Virus 40, Human T Cell Lymphotropic Virus ген, ген, необходимый для репликации Human T Cell Lymphotropic Virus, Moloney-Murine Leukemia Virus ген, ген, необходимый для репликации Moloney-Murine Leukemia Virus, энцефаломиокардита вирус ген, ген, необходимый для репликации энцефаломиокардита вируса, measles virus ген, ген, необходимый для репликации measles virus, Vericella zoster virus ген, ген, необходимый для репликации Vericella zoster virus, аденовирус ген, ген, необходимый для репликации аденовируса, вирус желтой лихорадки ген, ген, необходимый для репликации вируса желтой лихорадки, полиовирус ген, ген, необходимый для репликации полиовируса, поксвирус ген, ген, необходимый для репликации поксвируса, плазмодий ген, ген, необходимый для репликации плазмодия, Mycobacterium ulcerans ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus ген, ген, необходимый для репликации Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes ген, ген, необходимый для репликации Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Mycoplasma pneumoniae, интегрин ген, селектин ген, comple системы комплемента ген, хемокина ген, хемокина рецептора ген, GCSF ген, Gro1 ген, Gro2 ген, Gro3 ген, PF4 ген, MIG ген, ProPlatelet Basic Protein ген, MIP-1I ген, MIP-1J ген, RANTES ген, MCP-1 ген, MCP-2 ген, MCP-3 ген, CMBKR1 ген, CMBKR2 ген, CMBKR3 ген, CMBKR5v, AIF-1 ген, I-309 ген, ген компонента ионного канала, ген нейротрансмиттерного рецептора, а ген нейротрансмиттерного лиганда, амилоидного семейства ген, пресенилин ген, HD ген, DRPLA ген, SCA1 ген, SCA2 ген, MJD1 ген, CACNL1A4 ген, SCA7 ген, SCA8 ген, аллельный ген находящийся в LOH клетках, или один аллельный ген полиморфного гена.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу доставки молекулы нуклеиновой кислоты, включающему введение нуклеиновых липидных частиц, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и катионных липидов, катионных липидов, имеющих (i) центральный атом углерода, (ii) головную группу, непосредственно связанную с центральным атомом, и (iii) два гидрофобных хвоста, непосредственно связанные с центральным атомом углерода, каж
- 78 039892 дый гидрофобный хвост, содержащий Си или более алифатическую группу, присоединенную к центральному атому, где алифатическая группа (a) разрываемая биоразлагаемая группа, такая, что имеет цепь по меньшей мере из четырех атомов углерода между биоразлагаемой группой и центральным атомом углерода, или (b) включает в себя биоразлагаемую группу на терминальном конце гидрофобного хвоста, такую, что катионный липид остается нетронутым до доставки молекулы нуклеиновой кислоты, после чего расщепление гидрофобного хвоста происходит in vivo.
Определения
Как здесь используется, термин катионный липид включает все те липиды, имеющие одну или две жирные кислоты или жирные алифатические цепи и головную аминогруппу (в том числе алкиламино или диалкиламино группу), которая может быть протонирована с образованием катионных липидов при физиологическом значении pH. В некоторых вариантах воплощенияя катионный липид называют амино липидом.
Субъект или пациент, у которого введение комплекса является эффективной схемой лечения болезни или расстройства - предпочтительно человек, но может быть любое животное, в том числе лабораторное животное в условиях клинических испытаний или скрининга или активного эксперимента. Таким образом, можно легко понять любому из специалистов в данной области техники, что способы, соединения и композиции настоящего изобретения особенно подходят для введения любым животных, особенно млекопитающим, и в том числе, но отнюдь не ограничиваясь ими, людям, домашним животным, таким как кошачий или собачий субъекты, сельскохозяйственным животным, таким как, но не ограничиваясь ими, коровы, лошади, козы, овцы, свиньи, диким животным (будь то в дикой природе или в зоологическом саду), исследовательским животным, таких как мыши, крысы, кролики, козы, овцы, свиньи, собаки и кошки, птицы, такие как куры, индейки и певчие птицы, т.е. для ветеринарного использования.
Многие из химических групп перечисляются в дженерических формулах выше и написаны в определенном порядке (например, -OC(O)-). Предполагается, что химические группы должны быть включены в общую формулу в представленном порядке, если не указано иное. Например, общая формула вида -(R)i-(M1)k-(R)m-, где M1 является -C(O)O- и k=1 относится к -(R)j-C(O)O-(R)m-, если не указано иное. Следует понимать, что если химическая группа написана в определенном порядке, обратный порядок также предполагается, если не указано иное. Например, в общей формуле -(R)i-(M1)k-(R)m-, где M1 определяется как C(O)NH- (т.е. -(R)1-C(O)-NH-(R)m-), соединение, где M1 является -NHC(O)- (т.е. -(R)i-NHC(O)-(R)m-) также предполагается, если не указано иное.
Как здесь используется, термин биоразлагаемая группа относится к группе, которая включает одну или несколько связей, которые могут подвергаться реакции разрыва связей в биологической среде, например, в организме, органе, ткани, клетке или органелле. Например, биоразлагаемая группа может быть метаболизирована в теле млекопитающих, таких как человек (например, путем гидролиза). Некоторые группы, которые содержат биоразлагаемые связи, включают, например, но не ограничиваясь этим, эфиры, дитиолы и оксимы. Неограничивающие примеры из биоразлагаемых групп: -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
Как здесь используется, алифатическая группа является неароматической группой, в которой атомы углерода соединены в цепочки, либо насыщенные, либо ненасыщенные.
Термины алкил и алкилен относятся к прямой или разветвленной цепи, насыщенному углеводородному фрагменту. В одном варианте воплощения алкильной группой является прямая цепь насыщенных углеводородов. Если не указано иное, алкил или алкилен группа содержит от 1 до 24 атомов углерода. Представители насыщенных прямых групп алкильной цепи включают метил, этил, нпропил, н-бутил, н-пентил и н-гексил. Представители насыщенных разветвленных алкильных групп включают изопропил, вторбутил, изобутил, третбутил и изопентил.
Термин алкенил относится к прямой или разветвленной части углеводородной цепи, имеющей одну или более двойных углерод-углеродных связей. В одном варианте воплощения алкенил содержит 1, 2 или 3 двойные связи и иные насыщенные. Если не указано иное, алкенил группа содержит от 2 до 24 атомов углерода. Алкенильные группы включают в себя как цис-, так и транс-изомеры. Представители прямых и разветвленных алкенильных групп включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил и 2,3-диметил2-бутенил.
Термин алкинил относится к прямой или разветвленной цепи углеводородного фрагмента, имеющей один или несколько углерод-углеродных тройных связей. Если не указано иное, алкинил группа содержит от 2 до 24 атомов углерода. Представители прямых и разветвленных алкинильных групп включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил и 3-метил-1-бутинил.
Термин ацил относится к карбонильной группе, замещенной водородом, алкилом, частично насыщенный или полностью насыщенный циклоалкил, частично насыщенный или полностью насыщенный гетероцикл, арил или гетероарил. Например, ацильные группы включают группы, такие как (C1
- 79 039892
С2о)алканоил (например, формил, ацетил, пропионил, бутирил, валерил, капроил и третбутилацетил), (С3-С20)циклоалкилкарбонил (например, циклопропилкарбонил, циклобутилкарбонил, циклопентилкарбонил и циклогексилкарбонил), гетероциклический карбонил (например, пирролидинилкарбонил, пирролид-2-он-5-карбонил, пиперидинилкарбонил, пиперазинилкарбонил и тетрагидрофуранилкарбонил), ароил (например, бензоил) и гетероароил (например, тиофенил-2-карбонил, тиофенил-3карбонил, фуранил-2-карбонил, фуранил-3-карбонил, 1H-пирроил-2-карбонил, 1H-пирроил-3-карбонил и бензо[b]тиофенил-2-карбонил).
Термин арил относится к ароматическим моноциклическим, бициклическим или трициклическим кольцевым системам углеводородов. Если не указано иное, арил группа содержит от 6 до 14 атомов углерода. Примеры арильных остатков включают, но не ограничиваются ими, фенил, нафтил, антраценил и пиренил.
Термины циклоалкил и циклоалкилен относятся к насыщенному моноциклическому или бициклическому фрагменту углеводородов, таких как циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Если не указано иное, циклоалкил или циклоалкиленовая группа содержит от 3 до 10 атомов углерода.
Термин циклоалкилалкил относится к циклоалкильной группе, связанной с алкильной группой, где алкильные группы связаны с остальной частью молекулы.
Термин гетероцикл (или гетероциклил) относится к неароматической от 5 до 8 членной моноциклической, или от 7 до 12 членной бициклической, или от 11 до 14 членной трициклической кольцевой системе, которая либо насыщенна либо ненасыщенна, и которая содержит от 1 до 3 гетероатомов, если моноциклическая, 1-6 гетероатомов, если бициклическая, или 1-9 гетероатомов, если трициклическая, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и в которой гетероатомы азота и серы могут быть опционально окислены, а гетероатом азота может быть опционально кватернизован. Например, гетероцикл может быть циклоалкокси группой. Гетероцикл может быть присоединен к остальной части молекулы через любой гетероатом или атом углерода в гетероцикле. Гетероциклы включают, но не ограничиваются этим, морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил и тетрагидротиопиранил.
Термин гетероарил относится к ароматической 5-8 членной моноциклической, 7-12 членной бициклической или 11-14 членной трициклической кольцевой системе, имеющей 1-3 гетероатома, если моноциклическая, 1-6 гетероатомов, если бициклическая, или 1-9 гетероатомов, если трициклическая, где гетероатомы выбранных из O, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов N, O или S если моноциклическая, бициклическая или трициклическая, соответственно). Гетероарильные группы, описанные здесь, могут также содержать конденсированных кольца, которые разделяют общие связи углерод-углерод.
Термин замещенный, если не указано иное, относится к замене одного или нескольких радикалов водорода в данной структуре радикалом указанного заместителя, включая, но не ограничиваясь ими: галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил тиол, алкилтио, оксо, тиокси, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галогеналкил, амино, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоновые кислоты, сульфокислоты, сульфонил, фосфоновая кислота, арил, гетероарил, гетероциклические и алифатические группы. Понятно, что заместитель может быть замещен. Примеры заместителей включают амино, алкиламино, диалкиламино и циклические аминосоединения.
Термин галоген или гало относится к фтору, хлору, брому и йоду.
Термины алкиламин и диалкиламин относятся к -NH(алкил) и -N(алкил)2 радикалам соответственно.
Термин алкилфосфат относится к -O-P(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q, каждый независимо, O, S, N(R)2, опционально замещенный алкил или алкокси, и R представляет собой опционально замещенный алкил, ω-аминоалкил или ω-(замещенный)аминоалкил.
Термин алкилфосфоротиоат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере одна из Q' или Q является S.
Термин алкилфосфонат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере одна из Q' или Q представляет собой алкил.
Термин гидроксиалкил относится к -O-алкильному радикалу.
Термин алкилгетероцикл относится к алкилу, где по меньшей мере один метилен был заменен гетероциклом
Термин ω-аминоалкил относится к -алкил-NH2-радикалу.
- 80 039892
А термин ω-(замещенный)аминоалкил относится к ω-аминоалкилу, где по меньшей мере, один из H на N был заменен на алкил.
Термин ω-фосфоалкил относится к -алкил-O-Р(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q, каждый независимо, является O или S и R опционально замещенный алкил.
Термин ω-тиофосфоалкил относится к ω-фосфоалкилу, где по меньшей мере, один из Q' или Q является S.
Следующие сокращения, которые используются в этом приложении: DSPC: дистеароилфосфатидилхолин; DPPC: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин; POPC: 1 - пальмитоил-2-олеоил-snфосфатидилхолин; DOPE: 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламин; PEG-DMG как правило, относится к 1,2-димиристоил-sn-глицерин-метокси полиэтиленгликолю (например, PEG 2000); TBDPSCl: третбутилхлородифенилсилан; DMAP: диметиламинопиридин; NMO: N-метилморфолин-N-оксид; LiHDMS: литий бис(триметилсилил)амид; HMPA: гексаметилфосфорамид; EDC: 1-этил-3-(3диметиламинопропил) карбодиимид; DIPEA: диизопропилэтиламин; DCM: дихлорметан; TEA: триэтиламин; TBAF: тетрабутиламмонийфторид.
В некоторых вариантах воплощения способ может потребовать использование защитных групп. Методологии защитных групп хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Короче говоря, защитной группой является любая группа, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональных групп. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе, чтобы замаскировать ее реактивность в определенной реакции и затем удаляется, чтобы показать оригинальную функциональную группу. В некоторых вариантах воплощения спирт защитная группа используется. Спирт защитная группа означает любую группу, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональных групп спирта. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с помощью методов, хорошо известных в данной области.
Соединения могут быть получены по меньшей мере, одним из методов, описанным здесь, или известным из органического синтеза.
- 81 039892
Примеры
Соединение 2. К раствору соединения 1 (10,0 г, 18,8 ммоль, см. международную публикацию WO 2010/054406), в CH2Cl2 (80 мл) добавляли триэтиламин (7,86 мл, 56,4 ммоль), DMAP (459 мг, 3,76 ммоль) и трет-бутил(хлор)дифенилсилан (9,62 мл, 37,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч. Затем смесь разбавляли CH2Cl2 и промывали насыщенным водным раствором NaHCO3. Органический слой отделяли и сушили над безводным Na2SO4. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% EtOAc в гексане), получая 2 (12,4 г, 16,1 ммоль, 86%, Rf=0,24 с гексаном). 1H ЯМР (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.42 (m, 6H), 5.305.39 (m, 4H), 3.67-3.72 (m, 1H), 1.97-2.04 (m, 8H), 1.07-1.42 (m, 52H), 1.05 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).
Соединение 3. К раствору 2 (12,4 г, 16,1 ммоль) в трет-бутаноле (100 мл), ТГФ (30 мл) и H2O (10 мл) добавляли 4-метилморфолин N-оксид (4,15 г, 35,4 ммоль) и осмия тетроксид (41 мг, 0,161 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч, затем гасили путем добавления бисульфита натрия. После удаления растворителя путем выпаривания, остаток экстрагировали Et2O (500 мл) и H2O (300 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na2SO4. После фильтрации и концентрации, сырец очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=1:1, Rf=0,49) с получением 3 (12,7 г, 15,1 ммоль, 94%). 1H ЯМР (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.43 (m, 6H), 3.67-3.73 (m, 1H), 3.57-3.62 (m, 4H), 1.82 (t, J=5.0 Hz, 4H), 1.10-1.51 (m, 60H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).
Соединение 4. К раствору 3 (12,6 г, 15,0 ммоль) в 1,4-диоксане (220 мл), CH2Cl2 (70 мл), MeOH (55 мл) и H2O (55 мл) добавляли NaIO4 (7,70 г, 36,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Смесь экстрагировали Et2O (500 мл) и H2O (300 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na2SO4. После фильтрации и концентрации, сырец очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,30), получая 4 (7,98 г, 14,5 ммоль, 97%). Молекулярный вес для C35H54NaO3Si (M+Na)+ Расч. 573,3740, Найденный 573,3.
Соединение 7. К раствору 5 (см. Tetrahedron, 63, 1140-1145, 2006; 1,09 г, 2,18 ммоль) в ТГФ (20 мл) и
- 82 039892
HMPA (4 мл), LiHMDS (1 M раствор в ТГФ, 4,36 мл, 4,36 ммоль) был добавлен при -20°C. Полученную смесь перемешивали в течение 20 мин при той же температуре, затем охлаждали до -78°C. Раствор 4 (500 мг, 0,908 ммоль) в ТГФ (4 мл) был добавлен. Смесь перемешали и дали нагреться до комнатной температуры в течение ночи. MS анализ показал формирование ди-кислоты (6; C53H85O5Si (M-H) расч. 829,6166, наблюдаемая 829,5). К смеси, NaHCO3 (1,10 г, 13,1 ммоль) и диметилсульфат (1,24 мл, 13,1 ммоль) были добавлены и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением насыщенного водного раствора NH4Cl (50 мл), затем экстрагировали Et2O (2x100 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na2SO4. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,35), получая 7 (270 мг, 0,314 ммоль, 35%). Молекулярный вес для C55H90NaO5Si (M+Na)+ Расч. 881,6455, Найденный 881,6484.
Соединение 8. К раствору 7 (265 мг, 0,308 ммоль) в ТГФ (2,5 мл), н-TBAF (1 М раствор в ТГФ, 0,555 мл, 0,555 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч при 45°C. После концентрации смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=3:1, Rf=0,52), получая 8 (155 мг, 0,250 ммоль, 81%). Молекулярный вес для C39H72NaO5 (M+Na)+ Расч. 643,5277, найденный 643,5273.
Соединение 9. К раствору соединения 8 (150 мг, 0,242 ммоль) и 4 - (диметиламино) масляной кислоты гидрохлорида (49 мг, 0,290 ммоль) в CH2Cl2 (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,126 мл, 0,726 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид (56 мг, 0,290 ммоль) и DMAP (6 мг, 0,0484 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов. Затем реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO3 (50 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH2Cl2) с получением соединения 9 (121 мг, 0,165 ммоль, 68%, Rf=0,25 получен с 5% MeOH в CH2Cl2). Молекулярный вес для C45H84NO6 (M+H)+ Расч. 734,6299, найденный 734,5.
Соединение 10. Получение соединения 9 с CH3Cl в CH3CN и CHCl3 может предоставить соединение 10.
- 83 039892
Пример 2. Схема 2.
Схема 2
ЕОС1.ДМАП
СН2С1гДИПЭА
: ch3ci/ch3cn/chci3 ♦
Θ
Cl
МеООС — NC \ J о '
Соединение 12. К раствору 11 (см., J. Med Chem, 38, 636-46, 1995; 1,25 г, 2,58 ммоль) в ТГФ (20 мл) и HMPA (4 мл), LiHMDS (1 М ТГФ раствор, 2,58 мл, 2,58 ммоль) был добавлен при -20°C. Смесь перемешивали в течение 20 мин при той же температуре, затем охлаждали до -78°C. Раствор 4 (500 мг, 0,908 ммоль) в ТГФ (9 мл) и HMPA (0,9 мл) был добавлен. Смесь перемешивали и дали нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Реакцию останавливали путем добавления H2O (40 мл) и экстрагировали Et2O (150 млх3). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na2SO4. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,35), получая 12 (136 мг, 0,169 ммоль, 19%). Молекулярный вес для C51H82NaO5Si (M+Na)+.Расч. 825,5829, найденный 825,5.
Использование 13 в место 5, по методике, описанной для соединения 7, последовало, с получением соединения 12 (135 мг, 0,168 ммоль, 46%).
Соединение 15/соединение 16. К раствору 12 (800 мг, 0,996 ммоль) в ТГФ (5 мл), н-TBAF (1 М раствор в ТГФ, 5 мл, 5,00 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при 45°C. После концентрации смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением 15 (гексан: EtOAc= 3:1, Rf=0,46, 372 мг, 0,659 ммоль, 66%) и 16 (CH2Cl2: MeOH=95:5, Rf=0,36, 135 мг, 0,251 ммоль, 25%). Молекулярный вес 15; C35H64NaO5 (M+Na)+ Расч. 587,4651, найденный 587,4652. Молекулярный вес 16; C33H61O5 (M+H)+Расч. 537,4519, найденный 537,5.
Соединение 17. К раствору соединения 15 (164 мг, 0,290 ммоль) и 4-(диметиламино)масляной кислоты гидрохлорида (58 мг, 0,348 ммоль) в CH2Cl2 (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,152 мл,
- 84 039892
0,870 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида хлорид (67 мг, 0,348 ммоль) и DMAP (7 мг, 0,058 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO3 (50 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH2Cl2) с получением соединения 17 (158 мг, 0,233 ммоль, 80%, Rf=0,24 получен с 5% MeOH в CH2Cl2). Молекулярный вес для C45H84NO6 (м+H)+.Расч. 734,6299, найденный 734,5.
Соединение 18. Обработка соединения 17 с CH3Cl в CH3CN и CHCl3 может привести к получению соединения 18.
Соединение 19. К раствору 16 (130 мг, 0,242 ммоль) в ТГФ (2 мл) и MeOH (2 мл), триметилсилилдиазометан (2 М раствор в Et2O, 0,158 мл, 0,315 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч. После выпаривания остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=3:1, Rf= 0,50), получая 19 (99 мг, 0,180 ммоль, 74%). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 5.29-5.40 (m, 4H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.55-3.59 (m, 1H), 2.30 (dd, J=14.7, 7.2 Hz, 4H), 1.98-2.07 (m, 8H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.43 (m, 37H).
Соединение 20. К раствору соединения 19 (95 мг, 0,168 ммоль) и 4-(диметиламино)масляной кислоты гидрохлорида (42 мг, 0,252 ммоль) в CH2Cl2 (3 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,088 мл, 0,504 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид (48 мг, 0,504 ммоль) и DMAP (4 мг, 0,034 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO3 (50 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH2Cl2) с получением соединения 20 (103 мг, 0,155 ммоль, 92%, Rf=0,19 получен с 5% MeOH в CHiCli). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 5.295.40 (m, 4H), 4.83-4.89 (m, 1H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.28-2.34 (m, 8H), 2.23 (s, 6H), 1.982.07 (m, 8H), 1.76-1.83 (m, 2H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.51 (m, 35H).
Соединение 21. Обработка соединения 20 с CH3Cl в CH3CN и CHCl3 может привести к получению соединения 21.
Пример 3. Альтернативный синтез для ди-альдегида промежуточного соединения 4. Схема 3.
Схема 3
Ди-альдегид 4 может быть синтезирован как показано на схеме 3, используя 1-бром-9-децен. Диальдегид, содержащий головную группу 27, может быть полезным для синтеза терминальных эфирзамещенных липидов, используя, например, реакцию Виттига. Озонолиз может привести к получению ди-альдегида 4 и 27.
- 85 039892
Пример 4. Альтернативные синтезы для соединения 8. Схема 4.
Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 4.
Соединение 29. К перемешанной суспензии NaH (60% в масле, 82 г, 1,7096 моль) в 500 мл безводного ДМФ, раствор соединения 28 (250 г, 1,7096 моль) в 1,5 л ДМФ медленно, используя капельную воронку, был добавлен при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, затем бензилбромид (208,86 мл, 1,7096 моль) медленно добавляли в атмосфере азота. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 ч. Затем смесь охлаждали колотым льдом (~2 кг) и экстрагировали этилацетатом (2x1 л). Органический слой промывали водой (1л), чтобы удалить нежелательный ДМФ, сушили над Na2SO4 и упаривали досуха в вакууме. Неочищенное соединение очищали на 60-120 силикагеле, элюент 0-5% MeOH в DCM с получением соединения 29 (220 г, 54%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).
Соединение 30. Соединение 29 (133 г, 0,5635 моль) растворяли в 1,5 л DCM, CBr4 (280,35 г, 0,8456 моль) добавляли при перемешивании раствора и реакционную смесь охлаждали до 0°C в атмосфере инертного газа. PPh3 (251,03 г, 0,9571 моль), затем добавляли порциями, поддерживая температуру ниже 20°C. После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции твердый (PPh3O), который осаждали из реакционной смеси, удаляли фильтрацией и фильтрат разбавляли с колотым льдом (~1,5 кг) и экстрагировали DCM (3x750 мл). Органический слой отделяли, сушили над безводным Na2SO4 и перегоняли в вакууме. Полученное сырое соединение хроматографировали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-5% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 30 (150 г, 89%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).
Соединение 31. К свежеактивированной Mg стружке (24,08 г, 1,003 моль) добавляют 200 мл безводного ТГФ, с последующим добавлением щепотки йода в смесь в инертной атмосфере. Раствор соединения 30 (150 г, 0,5016 моль) в 1 л сухого ТГФ медленно, контролируя экзотермическую реакцию, был добавлен. Затем реакционную смесь кипятили в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. Метилформиат (60,24 г, 1,0033 моль) затем медленно добавляли и реакция продолжалась в течение
- 86 039892
ч. После завершения реакцию остановили медленным добавлением 10% HCl, а затем водой (1 л) и экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органический слой был делюирован в 5-литровый стакан, разбавлен 500 мл метанола и охлажден до 0°C. К этому раствору избыток NaBH4 (~5eq) был добавлен частями для обеспечения гидролиза эфиров муравьиной кислоты, которые не расщепляются при добавлении HCl. Полученный раствор перемешивали в течение часа, а затем летучий компонент удаляли под вакуумом. Остаток промывали в воде (1 л) и подкисляли 10% раствором HCl (pH 4). Затем продукт экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органическую фазу затем сушили и концентрировали на роторном испарителе с получением желаемого соединения 31 (57 г, 24%) в виде твердого вещества. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m, 4H), 1.44-1.34 (m, 28H). 13C NMR (100 MHz, CDCI3): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.
Соединение 32. Соединение 31 (56 г, 0,1196 моль) растворяли в 700 мл сухого ТГФ и охлаждали до 0°C. TBSCl (36,06 г, 0,2396 моль) медленно добавляли, с последующим добавлением имидазола (32,55 г, 0,4786 моль) в инертной атмосфере. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. После завершения реакцию останавливали льдом (~1 кг) и экстрагировали этилацетатом (3x500 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaHCO3 для удаления кислотных примесей, сушили над Na2SO4 и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения, которое очищали на силикагеле (60-120 меш) и элюировали 0-10% этилацетата в гексане, получая (60 г, 82%) соединения 32 в виде желтоватого масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.411.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Соединение 33. Соединение 32 (60 г, 0,1030 моль) растворяли в 500 мл этилацетата и дегазировали с N2 в течение 20 мин. Добавляли (10% по массе) Pd на угле (12 г) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 18 ч. После завершения смесь фильтровали через слой целита и промывали этилацетатом. Фильтрат упаривают в вакууме, получая соединение 33 (19 г, 46%), которое было достаточно чистым для использования в следующей синтетической последовательности. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Соединение 34. Соединение 33 (8,2 г, 0,0199 моль) растворяли в 100 мл сухого DCM и охлаждали до 0°C. TEA (22,14 мл, 0,1592 моль) добавляли в инертной атмосфере. После перемешивания смеси в течение 5 мин, мезилхлорид (4,6 мл, 0,059 моль) по каплям добавляли и реакционную смесь, перемешивали еще в течение 3 ч. После завершения реакции смесь останавливали льдом (~200 г) и экстрагировали DCM (3x75 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали, получая сырое соединение, которое очищали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-30% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 34 (8,2 г, 73%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=4.22-4.19 (m, 4H), 3.60-3.58 (m, 1H), 2.99 (s, 6H), 1.75-1.69 (m, 4H), 1.38-1.28 (m, 28H), 0.86 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Соединение 35. К раствору соединения 34 (8,2 г, 0,0146 моль) в 400 мл сухого эфира добавляли MgBr2-Et2O (22,74 г, 0,08817 моль) порциями при 0°C в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь кипятили в течение 28 ч. После завершения реакции неорганический материал, образованный в реакции, удаляли путем фильтрации. Фильтрат выпаривали и полученное сырое соединение очищали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-3% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 35 (6,6 г, 85%) в виде бесцветной жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.61-3.58 (m, 1H), 3.41-3.37 (t, 4 H, J=6.8 Hz), 1.87-1.80 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.012 (s, 6H).
Соединение 36. Раствор этинил триметил силана (5,3 мл, 0,0378 моль) в 60 мл сухого ТГФ охлаждали до -78°C и 1,4 М н-BuLi (23 мл, 0,03405 моль) в гексане медленно добавляли в инертной атмосфере. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, затем HMPA (2,3 г, 0,01324 моль) добавляли и полученную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°C, затем охлаждали до -78°C. К этому раствору добавляли медленно соединение 35 (5 г, 0,0094 моль) в 60 мл сухого ТГФ и после полного добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и выдерживали в течение 18 ч. Реакционный прогресс контролировался 1H ЯМР. После завершения реакции смесь охлаждали до 0°C и останавливали осторожным добавлением насыщенного раствора NH4C1 (50 мл), затем воды (200 мл). Водную фазу экстрагировали гексаном (3x250 мл). Органический слой сушили и растворитель удаляли в вакууме с получением соединения 36 (5 г, 94%), которое использовали без дальнейшей очистки. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.62-3.56 (m, 1H), 2.21-2.17 (m, 4H), 1.49-1.47 (m, 4H), 1.37-1.26 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.13 (s, 18H), 0.021 (s, 6H).
Соединение 37. К раствору соединения 36 (5 г, 0,0088 моль) в 50 мл метанола, добавляли K2CO3 (6,1 г, 0,044 моль) в одной порции и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Летучую часть удаляли на роторном испарителе и неочищенную смесь разбавляли 100 мл воды и экстрагировали гексаном (3x100 мл). Органический слой сушили над Na2SO4 и упаривали
- 87 039892 в вакууме с получением соединения 37 (3,5 г, 97%), которое использовали без дополнительной очистки. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.60-3.58 (m, 1H), 2.19-2.14 (m, 4H), 1.93-1.92 (m, 2H), 1.54-1.49 (m,
4H), 1.37-1.27 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Соединение 39. Соединение 37 (2,5 г, 0,00598 моль) растворяли в 25 мл сухого ТГФ и охлаждали до -40°C. н-BuLi (1,4 М в гексане 12,9 мл, 0,01794 моль) медленно добавляли, затем, после 10минутного интервала, путем медленного добавления HMPA (25 мл). Полученную смесь выдерживали в течение 30 минут при -40°C в атмосфере азота. Раствор соединения 38 (3,5 г, 1,01196 моль) в 25 мл сухого ТГФ добавляли по каплям к охлажденной реакционной смеси. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры в течение 2 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем смесь останавливали добавлением насыщенного раствора NI ЦО (~50 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Растворитель удаляли на роторном испарителе и полученный сырой продукт очищали на колонке силикагеля (100-200 меш), используя 0-3% этилацетата в дихлорметане в качестве элюента системы с получением соединения 39 (0,9 г, 18%) в виде желтого масла. 1Н ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=4.56-4.55 (m, 2H), 3.87-3.83 (m, 2H), 3.74-3.68 (m, 2H), 3.59-3.57 (m, 1H), 3.49-3.46 (m, 2H), 3.39-3.33 (m, 2H), 2.13-2.10 (m, 8H), 1.87-1.75 (m, 2H), 1.74-1.66 (m, 2H), 1.57-1.42 (m, 20H), 1.401.19 (m, 40H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Соединение 40. К раствору соединения 39 (504 мг, 0,598 ммоль) в 10 мл сухого эфира добавляли MgBr2-Et2O (926 мг, 3,59 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч, затем останавливали добавлением насыщенного водного раствора NaHCO3. Продукт экстрагировали CH2Cl2. Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением соединения 40 (307 мг, 0,455 ммоль, 76%, Rf=0,36 получен с гексаном: EtOAc=2:1). 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3) δ 3.59-3.66 (m, 5H), 2.14 (t, J=6.6 Hz, 8H), 1.21-1.59 (m, 52H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).
Соединение 41. К раствору 40 (180 мг, 0,267 ммоль) в безводном ДМФ (5 мл) добавляли пиридина дихромат (603 мг, 1,60 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 ч. После разбавления водой (20 мл), смесь экстрагировали Et2O (3x40 мл). Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением соединения 41 (53 мг, 0,075 ммоль, 28%, Rf=0,25 получен с CH2Cl2:MeOH:уксусная кислота=95:4,5:0,5). Молекулярный вес для C43H77O5Si (М-H)- Расч. 701,5540, Найденный 701,5. Это соединение может быть синтезировано посредством TEMPO окисления.
Соединение 42. Процедура, аналогичная описанной для соединения 19, дает соединение 42 (23 мг 0,032 ммоль, 21% из соединения 40). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 3.67 (s, 6H), 3.59-3.62 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.13 (t, J=6.8 Hz, 8H), 1.27-1.64 (m, 48H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).
Ограниченное использование условий P-2 никеля может дать соединение 43 и последующее снятие защиты посредством TBAF может привести к получению соединения 8.
Пример 5. Альтернативные синтезы для соединения 8.
Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 5. Бромид 51 может быть преобразован в этот реактив Гриньяра и в сочетании с этилформиатом даст соединение 52. Последующая обработка кислотой, окисление и восстановление может дать соединение 8.
- 88 039892
Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 6. Бромиды эфиров соединений 58, 60 или 62 могут взаимодействовать с этилформиатом для создания терминально-функциональной ди-олефинной цепи. Соединение 8 может быть получено из ди-олефинной цепи соединений с использованием стандартных химических реакций.
Пример 7.
Схема 7 /Χ^χΧ^-χ^χ,ΟΗ ВП~ВГ г /~х^~χχ-χ/-χ .ОВП но NaH, ТГ *но рри, дам г
2 3
Синтез 8-бензилокси-октан-1-ола (2).
К перемешанной суспензии NaH (60% в масле, 82 г, 1,7096 моль) в 500 мл безводного ДМФ до
- 89 039892 бавляли раствор соединения 1 (250 г, 1,7096 моль) в 1,5 л ДМФ медленно, используя капельную воронку при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, затем бензилбромид (208,86 мл, 1,7096 моль) медленно добавляли в атмосфере азота. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 ч. После завершения реакции смесь останавливали с колотым льдом (~2 кг) и экстрагировали этилацетатом (2x1 л). Органический слой промывают водой (1л), чтобы удалить нежелательный ДМФ, сушили над Na2SO4 и упаривали досуха в вакууме. Неочищенное соединение очищали на 60-120 силикагеле, элюент 0-5% MeOH в DCM с получением соединения 2 (220 г, 54%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).
Синтез (8-бром-октилоксиметил)-бензола (3).
Соединение 2 (133 г, 0,5635 моль) растворяли в 1,5 л DCM, CBr4 (280,35 г, 0,8456 моль) добавляли к нему при перемешивании раствора и реакционную смесь охлаждали до 0°C в атмосфере инертного газа. PPh3 (251,03 г, 0,9571 моль) затем добавляли порциями, поддерживая температуру ниже 20°C и после завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции твердое вещество (PPh3O), выпавшее в осадок из реакционной смеси, было выделено фильтрацией, при этом фильтрат разбавляли с колотым льдом (~1,5 кг) и экстрагировали DCM (3x750 мл). Органический слой отделяли, сушили над безводным Na2SO4 и перегоняли в вакууме. Полученное сырое соединение хроматографировали на 60-120 меш на колонке с силикагелем с использованием 0-5% этилацетата в гексане в качестве системы элюента с получением соединения 3 (150 г, 89%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).
Синтез 1, 17-бис-бензилокси-гептадекан-9-ола (4).
К свежеактивированной стружке Mg (24,08 г, 1,003 моль) добавляли 200 мл безводного ТГФ, с последующим добавлением щепотки йода к смеси в инертной атмосфере. После начала формирования реактива Гриньяра раствор соединения 3 (150 г, 0,5016 моль) в 1 л сухого ТГФ медленно добавляли для контроля экзотермической реакции. После завершения добавления реакционную смесь кипятили в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. Метилформиат (60,24 г, 1,0033 моль) затем добавляли медленно и реакция продолжалась в течение 2 ч. После завершения реакцию останавливали медленным добавлением 10% HCl, а затем воды (1 л) и экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органический слой был декантирован в 5-литровый стакан, его разбавляли 500 мл метанола и охлаждали до 0°C. К этому раствору добавляли избыток NaBH4 (~5eq) для обеспечения гидролиза эфира муравьиной кислоты, который не расщепляется при добавлении HCl. Полученный раствор перемешивали в течение часа, а затем летучую часть удаляли под вакуумом. Остаток промывали в воде (1 л) и подкисляли 10% раствором HCl (pH 4). Затем продукт экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органическую фазу затем сушили и концентрировали на роторном испарителе с получением соединения 4 (57 г, 24%) в виде твердого вещества. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m,4H), 1.44-1.34 (m,28H). 13C NMR(100 MHz, CDCl·,): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.
Синтез [9-бензилокси-1-(8-бензилокси-октил)нонилокси]трет-бутил-диметил-силана (5).
Соединение 4 (56 г, 0,1196 моль) растворяли в 700 мл безводного ТГФ и охлаждали до 0°C. TBMS-Cl (36,06 г, 0,2396 моль) медленно добавляли с последующим добавлением имидазола (32,55 г, 0,4786 моль) в инертной атмосфере. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч, затем останавливали со льдом (~1 кг). Продукт экстрагировали этилацетатом (3x500 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaHCO3 для удаления кислых примесей, сушили над Na2SO4 и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения, которое очищали на силикагеле (60-120 меш) и элюировали 0-10% этилацетатом в гексане, получая (60 г, 82%) соединение 5 в виде желтоватого масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.41-1.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Синтез 9-(трет-бутил-диметил-силанилокси)гептадекан-1,17-диола (6).
Соединение 5 (60 г, 0,1030 моль) растворяли в 500 мл этилацетата и дегазировали N2 в течение 20 мин. Добавляли (10% по массе) Pd на угле (12 г) и реакционную смесь перемешивавали в атмосфере водорода в течение 18 ч. После завершения смесь фильтровали через слой целита и промывали этилацетатом. Фильтрат выпаривали в вакууме. Соединение 6 (19 г, 46%), полученное таким образом, было достаточно чистым для проведения последующей реакции. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
Синтез 9-(трет-бутил-диметил-силанилокси)гептадекандиоивой кислоты (7).
К раствору 6 (2 г, 0,0049 моль) в безводном ДМФ (40 мл) добавляли пиридин бихромат (2,7 г, 0,0074 моль) при 0°C в атмосфере инертного газа. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры в течение 10-15 мин и продолжали реакцию в течение 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли водой (100 мл). Водную фазу экстрагировали DCM (3x40 мл). Органическую фазу промывали
- 90 039892 рассолом (1x25 мл) и концентрируровали в вакууме с получением неочищенной кислоты, которую затем очищали (100-200 меш) на колонке с силикагелем, используя систему 0-30% этилацетата в гексане.
Чистый продукт (7) был получен (0,7 г, 33%) в виде бледно-желтого масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3):
δ=3.61-3.56 (m, 1H), 2.35-2.32 (m, 4H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.40-1.19 (m, 24H), 0.86 (s, 9H), 0.017 (s, 6H);
LC-MS [M+H] - 431.00; HPLC (ELSD) purity -96.94%
Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((трет-бутилдиметилсилил)окси)гептадекандиоата (8).
Дикислоту 7 (0,42 г, 0,97 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и к нему добавляли цис-2нонен-1-ол (0,35 г, 2,44 ммоль) с последующим добавлением основания Хюнига (0,68 г, 4,9 ммоль) и DMAP (12 мг). К этой смеси добавляли EDCI (0,47 г, 2,44 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (40 мл) и промывали насыщенным NaHCO3 (50 мл), водой (60 мл) и рассолом (60 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. Сырой, полученный таким образом продукт очищали с помощью Combiflash Rf системы очистки (40 г силикагеля, 0-10% MeOH в CH2Cl2) с получением чистого продукта 8 (0,35 г, 53%) в виде бесцветного масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.58 - 5.43 (m, 2H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 3.71 - 3.48 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.6 Hz, 4H), 2.20 - 1.98(m, 4H), 1.71 - 1.53 (m,4H), 1.31 (ddd, J=8.3, 7.0, 3.7 Hz, 34H), 1.07-0.68 (m, 14H), 0.02 (s, 5H). 13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 178.18, 139.81, 127.78, 81.73, 81.42, 81.10, 76.72, 64.59, 41.52, 41.32, 38.76, 36.09, 34.10, 33.93, 33.80, 33.70, 33.59, 33.55, 33.26, 31.95, 30.34, 29.69, 29.58, 29.39, 27.01, 22.56, 18.48, 0.01.
Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-гидроксигептадекандиоата (9).
Силильный защищенный диэфир 8 (0,3 г, 0,44 ммоль) растворяли в 1 М растворе TBAF в ТГФ (6 мл) и раствор выдерживали при 40°C в течение двух дней. Реакционную смесь разбавляли водой (60 мл) и экстрагировали эфиром (2x50 мл). Объединенные органические слои концентрировали и полученный таким образом сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии, чтобы выделить чистый продукт (0,097 г, 39%). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl·,) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.52 (dt, J=11.0, 6.8 Hz, 2H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 3.57 (s, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.09 (q, J=7.1 Hz, 4H), 1.75 - 1.53 (m, 4H), 1.53 - 1.06 (m, 36H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCI3) δ 173.98, 135.64, 123.57, 77.54, 77.22, 76.91, 72.14, 60.41, 37.69, 34.54, 31.89, 29.70, 29.60, 29.44, 29.29, 29.07, 27.76, 25.80, 25.15, 22.82, 14.29.
Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1 -ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата.
Спирт 9 (0,083 г, 0,147 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и к нему добавляли диметиламиномасляной кислоты гидрохлорид (0,030 г, 0,176 ммоль) с последующим добавлением основания Хюнига (0,045 г, 0,44 ммоль) и DMAP (2 мг). К этой смеси добавляли EDCI (0,034 г, 0,176 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и TLC (силикагель, 10% MeOH в CH2Cl2) показал полное исчезновение исходного спирта. Реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (40 мл) и промывали насыщенным NaHCO3 (50 мл), водой (60 мл) и рассолом (60 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. Сырой, полученный таким образом продукт очищали с помощью Combiflash Rf системы очистки (40 г силикагеля, 0-10% MeOH в CH2Cl2), чтобы изолировать чистый продукт (0,062 г, 62%) в виде бесцветного масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3) δ 5.74 - 5.58 (m, 2H), 5.51 (dtt, J=9.7, 6.8, 1.3 Hz, 2H), 4.95-4.75 (m, 1H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 2.35 -2.24 (m, 8H), 2.22 (d, J=7.9 Hz, 6H), 2.09 (q, J=6.9 Hz, 4H), 1.83 - 1.72 (m, 2H), 1.60 (dd, J =14.4, 7.2 Hz, 4H), 1.49 (d, J=5.7 Hz, 4H), 1.41-1.13 (m, 30H), 0.88 (t, J=6.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCI3) δ 173.72, 173.36, 135.40, 123.35, 74.12, 60.18, 58.95, 45.46, 34.30, 34.11, 32.45, 31.67, 29.38, 29.35, 29.17, 29.07, 28.84, 27.53, 25.28, 24.93, 23.16, 22.59, 14.06. MW расч. для C41H75NO6 (MH): 678,04, найд: 678,5.
Пример 8.
Следующий короткий маршрут может быть использован для синтеза соединения 1 настоящего изобретения. Коммерческий 9-бромонон-1-ен 10, обработанный с магнием с образованием соответствующего реагента Гриньяра, который взаимодействует с этилформиатом с получением соответствующего аддукта 11, который при взаимодействии с бромобутирил хлоридом обеспечивает бромэфир 12. Бромэфир 12 при взаимодействии с RuO4 дает дикислоту 13. Бромодикислота 13 при взаимодействии с диметиламином дает аминодикислоту 14. Аминодикислота 14 при связывании со спиртом 15 дает продукт с хорошими выходами.
- 91 039892
Схема 8 о
1. RuO4
2. О3/Н2О
3. КМпО4
Синтез нонадека-1,18-диен-10-ола (11).
На открытом пламени сушат 500 мл RB колбу, свежеактивированную Mg стружку (9 г) помещают в колбу, снабженную магнитной мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником. Эта установка была дегазирована и промыта аргоном и 100 мл безводного эфира добавили в колбу с помощью шприца. Бромид 3 (51,3 г, 250 ммоль) растворили в безводном эфире (100 мл) и добавили в капельную воронку. Около 5 мл этого эфирного раствора добавили к Mg стружке при интенсивном перемешивании. Экзотермическая реакция была замечена (для подтверждения/ускорения формирования реагента Гриньяра, 5 мг йода было добавлено и немедленное обесцвечивание наблюдалось, подтверждающее формирование реактива Гриньяра) и эфир начали дефлегмировать. Остальной раствор бромида добавляли по каплям при сохранении реакции при легком дефлегмировании при охлаждении колбы в воде. После завершения добавления реакционную смесь выдерживали при 35°C в течение 1 ч, а затем охлаждали в ледяной бане. Этилформиат (9 г, 121 ммоль) растворяли в безводном эфире (100 мл), переносили в капельную воронку и добавляли по каплям к реакционной смеси при перемешивании. Экзотермическая реакция наблюдалась и реакционную смесь начали дефлегмировать. После начала реакции остальной эфирный раствор формиата быстро добавили в виде потока и реакционную смесь перемешивали в течение еще 1 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 10 мл ацетона по каплям следом за ледяной водой (60 мл). Реакционную смесь обрабатывали водной H2SO4 (10% по объему, 300 мл), пока раствор не стал однородным и слои разделили. Водную фазу экстрагировали эфиром (2x200 мл). Объединенные эфирные слои сушили (Na2SO4) и концентрируровали, получая сырой продукт, который очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 0-10% эфира в гексане). Полученные фракции выпаривали до получения чистого продукта 11 в виде белого твердого вещества (30,6 г, 90%). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 5.81 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 8H), 5.04 - 4.88 (m, 16H), 3.57 (dd, J=7.6, 3.3 Hz, 4H), 2.04 (q, J=6.9 Hz, 16H), 1.59 (s, 1H), 1.45 (d, J=7.5 Hz, 8H), 1.43-1.12 (m, 94H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 2H). 13C ЯМР (101 MHz, cdcl3) δ 139.40, 114.33, 77.54, 77.22, 76.90, 72.21, 37.70, 34.00, 29.86, 29.67, 29.29, 29.12, 25.85.
Синтез нонадека-1,18-диен-10-ил 4-бромбутаноата (12).
К раствору спирта 11 (5,6 г, 20 ммоль) в безводном DCM (300 мл) медленно и осторожно добавляли бромобутирил хлорид (20 ммоль) при 0°C в инертной атмосфере. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 20 ч и контролировали с помощью TLC (силикагель, 10% этилацетат в гексане). После завершения реакции смесь разбавляли водой (400 мл) и органический слой отделяли. Органическую фазу промывали раствором NaHCO3 (1x400 мл), затем рассолом (1x100 мл) и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали на силикагелевой (100-200 меш) колонке, элюировали 2-3% этилацетата в гексане, получая 6 г (90%) желаемого продукта 12 в виде бесцветной жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 5.80 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.05 - 4.81 (m, 5H), 3.46 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.48 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.17 (p, J=6.8Hz, 2H), 2.11-1.93 (m, 4H), 1.65 - 1.44 (m, 4H), 1.43 - 1.17 (m,
- 92 039892
19H). 13C ЯМР (101 MHz, cdcl3) δ 172.51, 139.37, 114.35, 77.54, 77.23, 76.91, 74.86, 34.31, 33.99, 33.01,
32.96, 29.65, 29.56, 29.24, 29.09, 28.11, 25.52.
Синтез 9-((4-бромобутаноил)окси)гептадекандиоевой кислоты (13).
К раствору бромэфира 12 (12,1 г, 28,2 ммоль) в дихлорметане (300 мл) и ацетонитриле (300 мл), добавляли RuCl3 (1,16 г, 5 мол%), и смесь охлаждали до 10°C и метапериодат натрия (60 г) в воде (400 мл) добавляли по каплям. Эту смесь перемешивали при 10°C в течение 20 ч. Реакционную смесь разбавляли водой, слои разделяли и органический слой был добавлен насыщенным солевым раствором при перемешивании, затем добавили по каплям 3% раствор сульфида натрия до обесцвечивания (от темнозеленого до бледно-желтого цвета). Слои разделяли, органический слой сушили над сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении с получением чистого продукта. MB рассчитан для С2оН35Вг07 467,39; найдено 465,4 (М-2И).
Синтез 9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоевой кислоты (14).
Бромокислоту 13 (2 ммоль) растворяли в 2М раствора диметиламина в ТГФ (20 мл) и к нему добавляли 1 г безводного K2CO3 и смесь нагревали в сосуде под давлением при 50°C в течение ночи. TLC показала завершение реакции. Реакционную смесь подкисляли уксусной кислотой и разбавляли водой (100 мл) и экстрагировали дихлорметаном (2x60 мл). Объединенные органические слои концентрировали, сушили и использовали без дополнительной очистки в следующей реакции. MB рассчитан для C23H43NOe 429,59; найден 430,6 (MH)+.
Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата.
Дикислота 14 преобразуется в соответствующий диэфир как описано для синтеза 8 и аналитические и спектральные данные согласуются с этим продуктом.
Пример 9.
В другом подходе следующий синтетический подход используется для синтеза соединения 1 настоящего изобретения.
Схема 9
1.Ag2O/BnBr 1) Mg, МеОСНО
2. Бензилтрифторацетамид/ 1θ
Трифлатная кислота (кат)
Пример 10. FVII в оценке in vivo использования катионных липидов полученных липосом.
C57BL/6 мыши (Charles River Labs, MA) получают либо с физиологическим раствором либо миРНК в желаемых составах через хвост инъекции в вену в объеме 0,01 мл/г. В разные точки времени после введения животные анестезировались изофлуорановой ингаляцией и кровь собиралась в сывороточные разделяющие пробирки при ретро-орбитальном кровотечении из забитого животного. Сывороточные уровни белка Фактора VII определяли в образцах с использованием хромогенного анализа (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH) в зависимости от протоколов производителя. Стандартная кривая генерировалась с использованием сыворотки, собранной из подопытных животных. В опытах, где уровни мРНК печени оценивались в различное время после введения, животных скарифицировали и печень собирали и замораживали в жидком азоте. Заморожен- 93 039892 ные ткани печени измельчали в порошок. Лизаты ткани готовили и уровни мРНК Фактора VII и apoB в печени определяли с использованием разветвленного анализа ДНК (QuantiGene Assay, Panomics, CA).
Пример 11. Определение эффективности липидных частиц препаратов, содержащих различные катионные липиды с использованием In Vivo сайлесинга фактора VII модели грызунов.
Фактор VII (FVII), известный белок в каскаде коагуляции, синтезируется в печени (гепатоцитах) и выделяется в плазму. FVII в плазме крови можно определить с помощью простого планшетного колориметрического анализа. Таким образом, FVII представляет собой удобную модель для определения миРНК опосредованного подавления продукции белков гепатоцитами, также как мониторинга концентрации в плазме и тканях распределения нуклеиновая кислота - липид частиц и миРНК, таких как миРНК, показано в табл. 19.
Таблица 19
Дуплекс Последовательность 5'-3' SEQ ID NO: Цель
AD-1661 GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCdTsdT FVII
GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdTsdT
Нижний случай 2'OMe модификации и Nf является 2'F модификацией нуклеооснований, dT является дезокситимидином, s является фосфотиоатом.
Катионные липиды, описанные здесь, используются для образования липосом, содержащих AD1661duplex при использовании в соответствии с методом смешивания в линию, как описано в международной публикации WO 2010/088537, которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Липидные частицы, сформированные с помощью следующего молярного соотношения: 50% катионных липидов/10% дистеароилфосфатидилхолина (DSPC)/38,5% холестерина/1,5% PEG-DMG (1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин, со средней молекулярной массой PEG 2000).
C57BL/6 мыши (Charles River Labs, MA) получают либо с физиологическим раствором либо миРНК в желаемых составах через при помощи инъекции в хвостовую вену. В разные точки времени после введения образцы сыворотки собирали путем ретроорбитального кровотечения. Сывороточные уровни белка фактора VII определяли в образцах с использованием хромогенного анализа (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH). Чтобы определить уровень фактора VII мРНК печени, животных скарифицировали и печень собирали и замораживали в жидком азоте. Лизаты ткани готовили из замороженных тканей и уровень фактора VII мРНК печени количественно определяли с использованием разветвленного ДНК-анализа (QuantiGene Assay, Panomics, CA).
FVII активность оценивалась в FVII миРНК подопытных животных в течение 48 ч после внутривенного (болюсного) введения в C57BL/6 мышей. FVII измеряется с использованием коммерчески доступного набора для определения уровня белка в сыворотке или ткани, следуя инструкциям производителя микропланшет. FVII уменьшение определяется в отношении необработанных контрольных мышей, а результаты выражаются как % остаточного FVII. Два уровня доз (0,05 и 0,005 мг/кг FVII миРНК) используются для скрининга каждой новой липосомальной композиции.
Пример 12. миРНК состав с использованием готовых везикул.
Катионный липид, содержащий частицы, производят с использованием способа предварительного пузырька. Катионный липид, DSPC, холестерин и PEG-липид растворяли в этаноле при молярном соотношении 40/10/40/10, соответственно. Липидную смесь добавляли в водный буфер (50 мМ цитрат, pH 4) при перемешивании до конечной концентрации этанола и липидов на 30% (об./об.) и 6,1 мг/мл соответственно, и оставляли для уравновешивания при комнатной температуре в течение 2 мин перед экструзией. Гидратированные липиды экструдировали через два стека с порами размером 80 нм фильтрами (Nuclepore) при 22°С, с использованием Lipex Extruder (Northern Lipids, Vancouver, BC), пока пузырек диаметром 70-90 нм, как определено анализом Nicomp, получается. Как правило, это требует 1-3 проходов. Для некоторых смесей катионных липидов, которые не образуют мелкие пузырьки, увлажнение липидной смеси буфером с более низким pH (50 мМ цитрат, pH 3) для протонирования фосфатной группы на DSPC головной группы помогает формировать стабильные пузырьки 70-90 нм.
МиРНК FVII (растворяют в 50 мМ цитрате, pH 4 водным раствором, содержащим 30% этанола) добавляли в пузырьки, предварительно уравновешенные до 35°С, при скорости ~5 мл/мин при перемешивании. После того, как конечная цель отношения миРНК/липид 0,06 (вес./вес.) достигается, смесь выдерживают в течение еще 30 мин при 35°C, чтобы пузырек образовался повторно и произошла инкапсуляция миРНК FVII. Этанол затем удаляли и внешний буфер заменили на PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na2HPO, 1 мМ KH2PO4, pH 7,5), либо диализом или диафильтрацией тангенциального потока. Окончательное отношение инкапсулированной миРНК в липиде определяется после удаления разинкапсулированной миРНК с использованием гель-эксклюзионной колоночной или ионообменной колоночной хроматографии.
- 94 039892
Пример 13. In Vivo определение эффективности липидных составов.
Тест составов первоначально оценивается по их FVII нокдауну на самках возрастом 7-9 недель, 15-25 г, самках мышей C57Bl/6 при 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг/кг с 3 мышами в группе лечения. Все исследования включают в себя животных, получавших либо фосфатный буферный раствор (PBS, контрольная группа), или эталонный состав. Препараты разводят до соответствующей концентрации в PBS непосредственно перед тестированием. Мышей взвешивали и соответствующие объемы дозирования рассчитывали (10 мкл/г веса тела). Испытания и тесты составов, а также PBS (по контролю за животными) вводили внутривенно через латеральную хвостовую вену. Животных анестезировали через 24 ч после внутрибрюшинного введения кетамина/ксилазина и 500-700 мкл крови собирали путем сердечной пункции в сывороточные разделительные пробирки (BD Microtainer). Кровь центрифугировали при 2000х g в течение 10 мин при 15°C и сыворотку собирали и хранили при температуре -70°C до анализа. Образцы сыворотки оттаивали при 37°C в течение 30 мин, разбавляли в PBS и аликвоты вносили в 96луночные планшеты для анализа. Уровень фактора VII оценивали с использованием хромогенного анализа (Biophen FVII kit, Hyphen BioMed) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, и поглощение измеряли в планшетном сканере, оснащенным фильтром с длиной волны 405 нм. Плазменные FVII уровни количественно определяли и ED50s (доза в результате которой наблюдается 50% снижение в плазме уровня FVII по сравнению с контрольными животными) рассчитывали по стандартной кривой, полученной от совокупной выборки из сыворотки от контрольных животных. Эти представляющие интерес составы показывают высокие уровни нокдауна FVII (ED50<<0,1 мг/кг) и проходят испытания в независимых исследованиях при более низких дозах, чтобы подтвердить эффективность и установить ED50 уровень.
Пример 14. Исследования для определения липидного профиля и клиренса в тканях у мышей.
Было проведено исследование для определения липидного профиля и тканевого клиренса у мышей для катионных липидов в соответствии с настоящим изобретением.
Самцы мышей (C57BL, 20-30 г) были разделены на четыре группы и им вводили (внутривенно) одно из соединений 1, 2 или 3 настоящего изобретения или референсный липид, как показано ниже в табл. 20.
Таблица 20
Мышей не кормили. Кровь, печень и селезенка были взяты на образцы (два образца в момент времени в группе) на 0,17, 8, 24, 72, 168, 336 и 672 часы после введения дозы.
На фиг. 1 показана концентрация липидов печени в течение долгого времени для мышей, в каж- 95 039892 дой из групп I-IV. Фармакокинетические данные печени представлены в табл. 21 ниже.
Таблица 21
Липид Стах (нг/мл) AUC (ч. нг/мл) MRTo-t (ч)
Референсный Липид 22,400 6,954,787 221
Соединение 1 1,136 4,594 NC
Соединение 2 118 436 NC
Соединение 3 208 NC NC
MRT выступает за среднее время пребывания. NC означает не рассчитываемое.
Ожидаемый метаболический путь для соединений 1 и 3 показан на фиг. 2. Концентрацию этих метаболитов измеряли в печени. Результаты представлены в табл. 22 ниже. Все измерения, проводимые через 24 ч (в том числе полученные на 72, 168, 336 и 672 часы после введения), были ниже количественного уровня (BLQ).
Таблица 22
Время (ч) Соединение 1 Соединение 2 Соединение 3
Моно- Ди- Моно - Ди- Моно - Ди-
кислота кислота кислота кислота кислота кислота
0.17 126.00 125.50 10.62 14.75 20.15 23.95
8 1.25 1.31 0.40 0.56 BLQ BLQ
24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ
На фиг. 3 показана концентрация липидов селезенки с течением времени для мышей в каждой из групп I-IV. Селезеночные фармакокинетические данные представлены в табл. 23 ниже. ____________________________________Таблица 23
Липид Стах (нг/мл) AUC (ч.нг/мл) MRTo-t (ч)
Референсный Липид 9,152 3,426,038 229.7
Соединение 1 7,460 41,967 2.8
Соединение 2 13,640 238,044 11.1
Соединение 3 4368 18,686 0.7
Концентрация метаболита соединений 1-3 в селезенке была измерена и результаты представлены в табл. 24 ниже.
- 96 039892
дой из групп I-IV. Плазмовые фармакокинетические данные представлены в табл. 25 ниже.
Таблица 25
Липид Стах (нг/мл) AUC (ч. нг/мл) MRTo-t (ч)
Референсный Липид 2,110 63,775 201
Соединение 1 38,750 155,012 0.0006
Соединение 2 28,800 115,612 0.0285
Соединение 3 30,600 122,412 0.0008
Концентрацию метаболита соединений 1-3 в плазме измерили, и результаты представлены в табл. 26 ниже. Все измерения через 24 ч (в том числе полученные на 72, 168, 336 и 672 часы после введения) были ниже количественного уровня (BLQ).
_______________________________________________________________________Таблица 26
Время (ч) Соединение 1 Соединение 2 Соединение 3
Моно- кислота Дикислота Моно кислота Дикислота Монокислота Дикислота
0.17 181.43 1186.40 1355.56 605.56 1037.63 871.64
8 BLQ BLQ 2.66 3.53 BLQ 21.18
24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 2.45
Как видно из фиг. 1, 3, 4 и табл. 22, 24 и 26, соединения 1, 2 и 3 настоящей презентации изобретения демонстрируют значительное улучшение клиренса тканей и активности по сравнению с референсным липидом.
Эти и другие изменения могут быть внесены в варианты воплощения в свете вышеизложенного подробного описания. В общем, в следующей формуле изобретения, используемые термины не должны рассматриваться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами воплощения, раскрытыми в описании и формуле изобретения, но должны быть истолкованы так, чтобы включить все возможные варианты воплощения вместе с полным объемом эквивалентов, в которых такая формула изобретения имеет право. Соответственно, формула изобретения не ограничивается данным раскрытием.
- 97 039892
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы IA-1
    или его соль, где
    R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C24-алкил, C2-C24-алкенил, C2-C24-алкинил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил(C1-C24)алкил, C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
    R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C5-C8 гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
    в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R4)-;
    в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси, -NH2, C1-C24-алкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
    или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C3-C10-циклоалкильную группу;
    Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
    в каждом случае R5 представляет собой независимо H или C1-C24-алкил;
    a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
    b равно 0, 1, 2 или 3;
    R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-алкил;
    каждый из R9 и R10 независимо представляет собой C12-C24-алкил, C12-C24-алкенил или C12-C24-алкокси, имеющий одну или более биоразлагаемую группу; каждая биоразлагаемая группа независимо прерывает C12-C24-алкил, C12-C24-алкенил или C12-C24-алкоксигруппу или представляет собой заместитель на конце C12-C24-алкила, C12-C24-алкенила или C12-C24-алкоксигруппы; причем (i) соединение не содержит следующий фрагмент:
    где----является опциональной связью; и (ii) концы R9 и R10 отделены от третичного атома углерода, отмеченного звездочкой (*), цепочкой из 8 или более атомов, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
  2. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что в каждом случае R3 и R4 представляют собой независимо H или C1-C4-алкил и R' представляет собой C1-C4-алкил.
  3. 3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Q отсутствует или R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-группа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.
  4. 4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу IB
    - 98 039892
    R1
    (IB) где
    R1 и R2 каждый независимо представляет собой С1-С24-алкил, С2-С24—алкенил, С2-С24-алкинил, С3-С10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил(C1-C24)алкил или C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
    R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
    в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R4)-;
    в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси, -NH2, C1-C24-αлкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
    или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C3-C10-циклоалкильную группу;
    Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
    в каждом случае R5 представляет собой, независимо, H или C1-C24-алкил;
    a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
    b равно 0, 1, 2 или 3;
    R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-алкил;
    M1 и M2 каждый независимо представляет собой биоразлагаемую группу;
    каждый из R9 и R10 независимо представляет собой C1-C24-αлкилен или C2-C24-алкенилен, и каждый из R11 и R12 независимо представляет собой C1-C24-алкил или C2-C24-алкенил, возможно заканчивающийся COOR13, где каждый R13 независимо представляет собой C1-C24-алкил;
    при условии, что:
    R9, M1 и R11 вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину; и
    R10, M2 и R12 вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- или -OC(O)(CR3R4)C(O)-.
  5. 5. Соединение по п.4, отличающееся тем, что R9 и R10 независимо друг от друга представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенuлен, M1 и M2 представляют собой -C(O)O-, и R11 и R12 представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенилен.
  6. 6. Соединение по п.4 или 5, отличающееся тем, что R9, M1 и R11 вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.
  7. 7. Соединение по п.4 или 5, отличающееся тем, R10, M2 и R12 вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.
  8. 8. Соединение по любому из пп.4-7, отличающееся тем, что группа R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b- представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.
  9. 9. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу IC
    R1
    в которой
    R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C24-алкил, C2-C24-алкенил, C2-C24-алкинил, C3-C10-циклоалкил, C3-C10-циклоалкил(C1-C24)алкил, или C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или
    R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;
    - 99 039892 в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R4)-;
    в каждом случае R3 и R4 независимо представляют собой H, OH, C1-C24-алкил, C1-C24-алкокси,
    -NH2, C1-C24-алкиламино или ди(C1-C24)алкиламино;
    или R3 и R4 вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют
    C3-C10-циклоалкильную группу;
    Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R5)=N-O-C(O)-;
    в каждом случае R5 представляет собой, независимо, H или C1-C24-алкил;
    a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
    b равно 0, 1, 2 или 3;
    R' отсутствует или представляет собой водород или C1-C24-αлкил;
    каждый из R9 и R10 независимо друг от друга представляют собой C12-C24-алкил или C2-C24-αлкенил, замещенный на его конце биоразлагаемой группой, причем биоразлагаемая группа представляет собой COOR13, где каждый R13 независимо представляет собой C1-C24-алкил.
  10. 10. Соединение по 9, отличающееся тем, что R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-группа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.
  11. 11. Соединение по п.1, выбранное из соединений формул II-VII:
    и их соли, причем m, n, o и p, каждый в отдельности, равен 1-25, при условии, что в формулах (II), (IV), (VI) и (VII) m и p больше или равны 4.
  12. 12. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что соединение представлено в форме фармацевтически приемлемой соли.
  13. 13. Липидная частица для доставки активных агентов, содержащая нейтральный липид, липид, способный снизить агрегацию, и катионный липид по любому из предыдущих пунктов.
  14. 14. Липидная частица по п.13, отличающаяся тем, что нейтральный липид выбран из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1-пальмитоил-2олеоил-sn-фосфатидилхолина (POPC), 1,2-диолеоил-8и-3-фосфоэтаноламина (DOPE) или сфингомиелина (SM); липид, способный уменьшить агрегацию, является PEG-липидом, и липидная частица дополнительно содержит стерол.
  15. 15. Липидная частица по п.14, отличающаяся тем, что катионный липид присутствует в количестве от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%; нейтральный липид присутствует в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.%; стерол присутствует в количестве от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%; и PEG-липид представляет собой PEG-DMA, PEG-DMG, или их сочетание, и присутствует в количестве от примерно 0,5 мол.% до примерно 15 мол.%.
  16. 16. Липидная частица по любому из пп.13-15, дополнительно содержащая активный агент.
  17. 17. Липидная частица по п.16, отличающаяся тем, что активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из плазмиды, иммуностимулирующих олигонуклеотидов, миРНК, антисмыслового олигонуклеотида, микроРНК, антагомира, аптамера и рибозима.
  18. 18. Липидная частица по любому из пп.13-15, отличающаяся тем, что липидная частица in vivo имеет период полураспада (t1/2) менее чем 3 ч.
    - 100 039892
  19. 19. Липидная частица по любому из пп.13-15, отличающаяся тем, что липидная частица in vivo имеет период полураспада (t1/2), который составляет менее 10%, чем для липидной частицы, содержащей тот же катионный липид без биоразлагаемой группы.
  20. 20. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте или индукции иммунного ответа у субъекта, содержащая липидную частицу по любому из пп.16 или 17 и фармацевтически приемлемый носитель.
  21. 21. Способ модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающий предоставление в клетку липидной частицы по любому из пп.16 или 17.
  22. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из: Factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin А ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(KIP1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, опухолевый супрессорный ген и p53 опухолевый супрессорный ген.
  23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что ген-мишень содержит одну или несколько мутаций.
  24. 24. Способ лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, микроРНК и антисмыслового олигонуклеотида, и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид включает в себя полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид или комплементарен ему.
  25. 25. Способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активное вещество представляет собой плазмиду, которая кодирует указанный полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.
  26. 26. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активный агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом.
  27. 27. Способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку или ткань субъекта, включающий введение субъекту нуклеиновой липидной частицы, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и катионный липид по любому из пп.1-12.
EA201291100A 2011-05-23 2011-06-03 Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов EA039892B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161489197P 2011-05-23 2011-05-23
PCT/US2011/039164 WO2011153493A2 (en) 2010-06-03 2011-06-03 Biodegradable lipids for the delivery of active agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201291100A1 EA201291100A1 (ru) 2013-05-30
EA039892B1 true EA039892B1 (ru) 2022-03-24

Family

ID=81077489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291100A EA039892B1 (ru) 2011-05-23 2011-06-03 Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA039892B1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010054401A1 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010054401A1 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGTAO LV, SHUBIAO ZHANG, BING WANG, SHAOHUI CUI, JIE YAN: "Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 114, no. 1, 10 August 2006 (2006-08-10), AMSTERDAM, NL , pages 100 - 109, XP002664605, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/J.JCONREL.2006.04.014 *
S CHESNOY, L HUANG: "Structure and function of lipid-DNA complexes for gene delivery", ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOMOLECULAR STRUCTURE, ANNUAL REVIEWS, vol. 29, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 27 - 47, XP002664604, ISSN: 1056-8700 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201291100A1 (ru) 2013-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020200286B2 (en) Biodegradable lipids for the delivery of active agents
JP6505912B2 (ja) 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
JP6356171B2 (ja) Ｐｅｇ化脂質および薬剤送達のためのそれらの使用
JP2021152033A (ja) 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物
US9701623B2 (en) Di-aliphatic substituted pegylated lipids
AU2015210364B2 (en) Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
WO2010048536A2 (en) Processes for preparing lipids
AU2010208035A1 (en) Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
AU2022204146B2 (en) Biodegradable lipids for the delivery of active agents
EA039892B1 (ru) Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов