EA039892B1

EA039892B1 - Biodegradable lipids for the delivery of active agents

Info

Publication number: EA039892B1
Application number: EA201291100A
Authority: EA
Inventors: Мутиах Манохаран; Мартин Майер; Мутусами Джаяраман; Сигео Мацуда; Нараянаннаир К. Джаяпракаш; Каллантоттатил Г. Раджив; Акин Акинг; Томас А. Бэйли
Original assignee: Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2022-03-24
Also published as: EA201291100A1

Abstract

The invention relates to a cationic lipid having one or more biodegradable groups located in the mid- or distal section of a lipidic moiety (e.g., a hydrophobic chain) of the cationic lipid, the lipid representing a compound of formula IA-1or a salt thereof. These cationic lipids may be incorporated into lipid particles for delivering active agents, such as nucleic acids. The invention also relates to lipid particles comprising neutral lipids, lipids capable of reducing aggregation, a cationic lipid of the invention and, optionally, sterols. The lipid particle may further include a therapeutic agent such as a nucleic acid.

Description

Заявление об установлении приоритетаPriority Statement

Данная заявка утверждает приоритет заявки на патент США № 61/351146, поданной 3 июня 2010 года, и заявки на патент США № 61/489197, поданной 23 мая 2011, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме.This application asserts the priority of US Patent Application No. 61/351,146, filed June 3, 2010, and US Patent Application No. 61/489,197, filed May 23, 2011, each of which is incorporated by reference in its entirety.

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к биологическим липидам и их использованию для доставки активных агентов, таких как нуклеиновые кислоты.The present invention relates to biological lipids and their use in the delivery of active agents such as nucleic acids.

Уровень техникиState of the art

Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, например, малые интерферирующие РНК (миРНК), микро-РНК (микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антисмысловые, антагомир, антимир, модели микроРНК, супермир, U1 адаптер и аптамер. Эти нуклеиновые кислоты действуют через различные механизмы. В случае миРНК или микроРНК эти нуклеиновые кислоты могут понижать внутриклеточные уровни определенных белков в процессе, называемом РНК-интерференция (РНКи). После введения миРНК или микроРНК в цитоплазму клетки, эти двухцепочечные РНК образуют связи с белком, называемым RISC. Смысловые нити миРНК или микроРНК смещаются от комплекса RISC, обеспечивающего шаблон в RISC, который может распознавать и связывать мРНК с комплементарной последовательностью, что и связанные миРНК или микроРНК. Имеющаяся связь комплементарной мРНК с комплексом RISC расщепляет мРНК и высвобождает расщепляемые нити. РНКи может обеспечить понижающее регулирование конкретных белков, ориентированных на специфическую деструкцию соответствующих мРНК, которые кодируют синтез белка.Therapeutic nucleic acids include, for example, small interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs), antisense oligonucleotides, ribozymes, plasmids, immunostimulatory nucleic acids, antisense, antagonism, antiworld, miRNA models, superworld, U1 adapter, and aptamer. These nucleic acids act through various mechanisms. In the case of miRNAs or microRNAs, these nucleic acids can lower the intracellular levels of certain proteins in a process called RNA interference (RNAi). After introducing miRNAs or microRNAs into the cytoplasm of the cell, these double-stranded RNAs form bonds with a protein called RISC. The sense strands of the siRNA or miRNA are displaced from the RISC complex, providing a template in the RISC that can recognize and bind an mRNA with a complementary sequence to that of the associated siRNA or microRNA. The existing association of the complementary mRNA with the RISC complex cleaves the mRNA and releases the cleavable strands. RNAi can provide down regulation of specific proteins targeting the specific destruction of the respective mRNAs that code for protein synthesis.

Терапевтическое применение РНК-интерференции чрезвычайно широко, так как миРНК и микроРНК конструкции могут быть синтезированы с любой нуклеотидной последовательностью, направленной против целевого белка. На сегодняшний день миРНК конструкции показали способность специфически понижающе регулировать целевые белки в in vitro и in vivo моделях. Кроме того, миРНК конструкции в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях.The therapeutic application of RNA interference is extremely wide, since miRNA and microRNA constructs can be synthesized with any nucleotide sequence directed against the target protein. To date, siRNA constructs have shown the ability to specifically down-regulate target proteins in in vitro and in vivo models. In addition, siRNA constructs are currently being evaluated in clinical trials.

Тем не менее, двумя проблемами, с которыми сталкивается в настоящее время миРНК или микроРНК конструкции являются, во-первых, их восприимчивость к нуклеазам расщепления в плазме крови и, во-вторых, их ограниченные возможности для получения доступа к внутриклеточной области, где они могут связывать RISC при системном введении в виде свободного миРНК или микроРНК. Эти двухцепочечные конструкции могут быть стабилизированы путем включения химически модифицированного нуклеотидного линкера внутрь молекулы, например, фосфоротиоатных групп. Однако эти химические модификации обеспечивают только ограниченную защиту от нуклеаз расщепления и могут снижать активность конструкции. Внутриклеточная доставка миРНК или микроРНК может быть облегчена путем использования систем переноса, таких как полимеры, катионные липосомы или путем химической модификации конструкции, например, путем ковалентного присоединения молекул холестерина. Тем не менее, улучшение систем доставки необходимо для повышения потенции миРНК и микроРНК молекул и уменьшения или устранения потребности в химической модификации.However, two problems that miRNA or miRNA constructs currently face are, firstly, their susceptibility to plasma cleavage nucleases and, secondly, their limited ability to gain access to the intracellular region where they can bind RISC when administered systemically as free siRNA or miRNA. These double-stranded constructs can be stabilized by incorporating a chemically modified nucleotide linker into the molecule, such as phosphorothioate groups. However, these chemical modifications provide only limited protection against cleavage nucleases and may reduce the activity of the construct. Intracellular delivery of siRNA or microRNA can be facilitated by the use of transport systems such as polymers, cationic liposomes, or by chemical modification of the construct, for example by covalent attachment of cholesterol molecules. However, improved delivery systems are needed to increase the potency of siRNA and miRNA molecules and reduce or eliminate the need for chemical modification.

Антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы могут также ингибировать мРНК трансляцию в белки. В случае антисмысловых конструкций, эти одноцепочечные диоксинуклеотидные кислоты имеют комплементарные последовательности, что и мРНК белка-мишени, и могут связываться с мРНК путем спаривания оснований Уотсона-Крика. Это связывание либо препятствует трансляции мРНКмишени и/или триггеров РНКазы H деградации мРНК транскриптов. Следовательно, антисмысловые олигонуклеотиды имеют огромный потенциал для специфичности действия (т.е. понижающего регулирования конкретных заболеваний, связанных с белком). На сегодняшний день эти соединения показали себя многообещающими в нескольких in vitro и in vivo моделях, включая модели воспалительных заболеваний, рака и ВИЧ (см. обзор в Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)). Антисмысловые также могут влиять на клеточную активность путем гибридизации именно с хромосомной ДНК. Расширенные клинические оценки на людях нескольких антисмысловых препаратов в настоящее время ведутся. Цели этих препаратов включают гены bcl2 и аполипопротеина B и мРНК продуктов.Antisense oligonucleotides and ribozymes can also inhibit mRNA translation into proteins. In the case of antisense constructs, these single stranded dioxynucleotides have complementary sequences to the mRNA of the target protein and can bind to the mRNA by Watson-Crick base pairing. This binding either prevents translation of the target mRNA and/or triggers RNase H degradation of mRNA transcripts. Therefore, antisense oligonucleotides have great potential for specificity of action (ie, down-regulation of specific protein-related diseases). To date, these compounds have shown promise in several in vitro and in vivo models, including models of inflammatory disease, cancer, and HIV (for a review, see Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)). Antisense can also influence cellular activity by hybridization specifically with chromosomal DNA. Extended human clinical evaluations of several antisense drugs are currently underway. The targets of these drugs include the bcl2 and apolipoprotein B genes and mRNA products.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают дезоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты. В случае дезоксирибонуклеиновой кислоты, определение последовательностей или мотивов показало запрещенную иммунную стимуляцию у млекопитающих. Эти последовательности или мотивы включают CpG мотив, богатые пиримидином последовательности и палиндромные последовательности. Считается, что CpG мотив в дезоксирибонуклеиновой кислоте специфически распознается эндосомальным рецептором, толл-подобным рецептором 9 (TLR 9), который затем запускает как врожденный, так и приобретенный иммунитет путем стимуляции. О некоторых иммуностимулирующих последовательностях рибонуклеиновой кислоты также сообщается. Считается, что эти последовательности РНК могут вызвать иммунную активацию путем связывания с толл-подобными рецепторами 6 и 7 (TLR 6 и TLR 7). Кроме того, двухцепочечные РНК, как также сообщается, могут быть иммуностимулирующими, и они предположительно активируются путем связывания с TLR3.Immunostimulatory nucleic acids include deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids. In the case of deoxyribonucleic acid, sequencing or motif determination has shown forbidden immune stimulation in mammals. These sequences or motifs include the CpG motif, pyrimidine-rich sequences, and palindromic sequences. It is believed that the CpG motif in deoxyribonucleic acid is specifically recognized by the endosomal receptor, Toll-like receptor 9 (TLR 9), which then triggers both innate and adaptive immunity by stimulation. Some immunostimulatory ribonucleic acid sequences have also been reported. It is believed that these RNA sequences can induce immune activation by binding to toll-like receptors 6 and 7 (TLR 6 and TLR 7). In addition, double-stranded RNAs have also been reported to be immunostimulatory and are presumably activated by binding to TLR3.

Одна известная проблема с использованием терапевтических нуклеиновых кислот относится к ус- 1 039892 тойчивости фосфодиэфирной межнуклеотидной связи и восприимчивостью этого линкера к нуклеазам. Наличие экзонуклеаз и эндонуклеаз в сыворотке крови приводит к быстрому расщеплению нуклеиновых кислот, обладающих фосфодиэфирными линкерами и, следовательно, терапевтические нуклеиновые кислоты могут иметь очень короткий период полураспада в присутствии сыворотки или внутри клеток. (Zelphati, O., et al.,Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); и Thierry, A.R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)). Терапевтические нуклеиновые кислоты, которые в настоящее время разрабатываются, не используют основной фосфодиэфирной химии в природных нуклеиновых кислотах из-за этих и других известных проблем.One known problem with the use of therapeutic nucleic acids relates to the stability of the phosphodiester internucleotide bond and the susceptibility of this linker to nucleases. The presence of exonucleases and endonucleases in serum leads to rapid degradation of nucleic acids having phosphodiester linkers and therefore therapeutic nucleic acids may have a very short half-life in the presence of serum or within cells. (Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); and Thierry, A. R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992) Therapeutic nucleic acids currently being developed do not use the basic phosphodiester chemistry in natural nucleic acids due to these and other known problems.

Эта проблема была частично преодолена химическими модификациями, которые уменьшают сывороточную или внутриклеточную деградацию. Изменения были протестированы на межнуклеотидном фосфодиэфирном мосте (например, используя фосфоротиоатное, метилфосфонатное или фосфорамидатное связывание), в нуклеотидных основаниях (например, 5-пропинилпиримидинов) или на сахаре (например, 2'-модифицированных сахарах) (Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). Другие пытались улучшить стабильность при использовании 2'-5' связывания сахара (см., например, патент США № 5532130). Другие изменения были испробованы. Однако ни одно из этих решений не оказалось вполне удовлетворительным, и in vivo свободные терапевтические нуклеиновые кислоты показывают только ограниченную эффективность.This problem has been partly overcome by chemical modifications that reduce serum or intracellular degradation. Changes have been tested on the internucleotide phosphodiester bridge (eg, using phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphoramidate binding), in nucleotide bases (eg, 5-propynylpyrimidines), or on sugar (eg, 2'-modified sugars) (Uhlmann E., et al. Antisense : Chemical Modifications Encyclopedia of Cancer, Vol X, pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). Others have attempted to improve stability by using 2'-5' sugar binding (see, for example, US Pat. No. 5,532,130). Other changes have been tried. However, none of these solutions has proven to be entirely satisfactory, and free therapeutic nucleic acids show only limited efficacy in vivo.

Кроме того, как отмечалось выше, связанные с миРНК и микроРНК проблемы остаются с ограниченными возможностями терапевтических нуклеиновых кислот для пересечения клеточных мембран (см. Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) и в проблемах, связанных с системной токсичностью, таких как комплемент-опосредованная анафилаксия, изменения коагуляционных свойств и цитопения (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994)).In addition, as noted above, problems associated with miRNAs and microRNAs remain with the limited ability of therapeutic nucleic acids to cross cell membranes (see Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) and in problems associated with systemic toxicity such as complement-mediated anaphylaxis, changes in coagulation properties and cytopenia (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994)).

Чтобы попытаться улучшить эффективность, исследователи также использовали липидные системы на базе носителя для доставки химически модифицированных или немодифицированных терапевтических нуклеиновых кислот. В Zelphati, O и Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996), авторы ссылаются на использование анионных (обычно) липосом, pH чувствительных липосом, иммунолипосом, способных к слиянию липосом и катионных липидов/антисмысловых агрегатов. Точно так же миРНК были введены системно в катионные липосомы, и эти нуклеиновые кислоты - липидные частицы, как сообщается, обеспечивают улучшенное понижающее регулирование целевых белков у млекопитающих, в том числе нечеловеческих приматов (Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)).To try to improve efficiency, researchers have also used carrier-based lipid systems to deliver chemically modified or unmodified therapeutic nucleic acids. In Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996), we refer to the use of anionic (typically) liposomes, pH sensitive liposomes, immunoliposomes capable of fusion liposomes, and cationic lipid/antisense aggregates. Similarly, siRNAs have been introduced systemically into cationic liposomes, and these nucleic acid lipid particles are reported to provide improved down regulation of target proteins in mammals, including non-human primates (Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006 )).

Несмотря на этот прогресс, остается потребность в данной области техники для улучшения липидных терапевтических композиций нуклеиновых кислот, которые подходят для общего терапевтического использования. Предпочтительно, чтобы эти композиции инкапсулировали нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью, имели высокое отношение лекарство:липид, защиту инкапсулированной нуклеиновой кислоты от деградации и расщепления в сыворотке крови, были пригодными для системной доставки, а также обеспечивали внутриклеточную доставку инкапсулированной нуклеиновой кислоты. Кроме того, эти липидно - нуклеиновокислотные частицы должны быть хорошо переносимы и обеспечивать адекватный терапевтический индекс, такой, что стационарное лечение в эффективной дозе нуклеиновых кислот не было связано с существенной токсичностью и/или риском для пациента. Композиции, способы получения композиций и способы применения композиций введения нуклеиновых кислот в клетки, в том числе для лечения болезней, приводятся.Despite this progress, there remains a need in the art to improve nucleic acid lipid therapeutic compositions that are suitable for general therapeutic use. Preferably, these compositions encapsulate nucleic acids with high efficiency, have a high drug:lipid ratio, protect the encapsulated nucleic acid from degradation and cleavage in blood serum, be suitable for systemic delivery, and also provide intracellular delivery of the encapsulated nucleic acid. In addition, these lipid nucleic acid particles must be well tolerated and provide an adequate therapeutic index such that inpatient treatment with an effective dose of nucleic acids is not associated with significant toxicity and/or risk to the patient. Compositions, methods for preparing compositions, and methods for using compositions for introducing nucleic acids into cells, including for the treatment of diseases, are provided.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение относится к катионному липиду, имеющему одну или более биоразлагаемых групп, расположенных в середине или дистальной части липидного фрагмента (например, гидрофобной цепи) катионных липидов. Эти катионные липиды могут быть включены в липидные частицы для доставки активных агентов, таких как нуклеиновые кислоты (например, миРНК). Включение биоразлагаемых(ой) групп(ы) в катионных липидах приводит в результате к более быстрому обмену веществ и удалению катионных липидов из организма после доставки активного агента в целевую область. В результате эти катионные липиды имеют существенно более низкую токсичность, чем аналогичные катионные липиды без биоразлагаемых групп.The present invention relates to a cationic lipid having one or more biodegradable groups located in the middle or distal part of the lipid fragment (eg, hydrophobic chain) of cationic lipids. These cationic lipids can be incorporated into lipid particles to deliver active agents such as nucleic acids (eg, siRNAs). The incorporation of biodegradable group(s) in cationic lipids results in faster metabolism and removal of cationic lipids from the body after delivery of the active agent to the target area. As a result, these cationic lipids have substantially lower toxicity than similar cationic lipids without biodegradable groups.

В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IA-1In one embodiment, the cationic lipid is a compound of formula IA-1

R¹ ^R1

(IA-1) или его соль, где(IA-1) or its salt, where

R¹ и R² каждый независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил, C₂-C₂₄-алкенил, C₂-C₂₄-алкинил, C₃-C₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил(C₁-C₂₄)алкил, C₅-C₈-моноциклический гетероцикл, содержащийR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₂ -C ₂₄ alkenyl, C ₂ -C ₂₄ alkynyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl(C ₁ -C ₂₄ )alkyl, C ₅ -C ₈ -monocyclic heterocycle containing

- 2 039892 от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; или- 2 039892 from 1 to 3 heteroatoms, while the heteroatoms are independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C₅-C₈-гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form a C ₅ -C ₈ heterocyclic ring containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally a quaternized nitrogen atom;

в каждом случае R независимо представляет собой -(CR³R⁴)-;at each occurrence, R is independently -(CR ³ R ⁴ )-;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси, NH₂, C₁-C₂₄-алкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;in each case R ³ and R ⁴ are independently H, OH, C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₁ -C ₂₄ alkoxy, NH ₂ , C ₁ -C ₂₄ alkylamino, or di(C ₁ -C ₂₄ ) alkylamino;

или R³ и R⁴ вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуют C₃-C₁₀-циклоалкильную группу;or R ³ and R ⁴ together with the carbon atom to which they are directly attached, form a C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl group;

Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R⁴)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R⁵)-, -N(R5)C(O)N(R⁵)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R⁵)=N-O-C(O)-;Q is absent or is -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R ⁴ )-, -N(R5)C (O)-, -SS-, -OC(O)O-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(R5)=NO-, -OC(O)N(R ⁵ )-, -N (R5)C(O)N(R ⁵ )-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- or -C(R ⁵ )=NOC (O)-;

в каждом случае R⁵ представляет собой независимо H или C₁-C₂₄-алкил;in each case R ⁵ is independently H or C ₁ -C ₂₄ alkyl;

a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6;

b равно 0, 1, 2 или 3;b is 0, 1, 2, or 3;

R' отсутствует или представляет собой водород или C₁-C₂₄-алкил;R' is absent or represents hydrogen or C ₁ -C ₂₄ -alkyl;

каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо представляет собой C₁₂-C₂₄-алкил, C₁₂-C₂₄-алкенил или C₁₂-C₂₄-алкокси, имеющий одну или более биоразлагаемую группу; каждая биоразлагаемая группа независимо прерывает C₁₂-C₂₄-алкил, C₁₂-C₂₄-алкенил или C₁₂-C₂₄-алкоксигруппу, или представляет собой заместитель на конце C₁₂-C₂₄-алкила, C₁₂-C₂₄-алкенила или C₁₂-C₂₄-алкоксигруппы; причем (i) соединение не содержит следующий фрагмент:each of R ⁹ and R ¹⁰ is independently C ₁₂ -C ₂₄ alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ alkenyl, or C ₁₂ -C ₂₄ alkoxy having one or more biodegradable groups; each biodegradable group independently interrupts C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ -alkenyl or C ₁₂ -C ₂₄ -alkoxy group, or is a substituent at the end of C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ -alkenyl or C ₁₂ -C ₂₄ alkoxy groups; where (i) the connection does not contain the following fragment:

где----является опциональной связью; и (ii) концы R⁹ и R¹⁰ отделены от третичного атома углерода, отмеченного звездочкой (*), цепочкой из 8 или более атомов, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.where ---- is an optional link; and (ii) the ends of R ⁹ and R ¹⁰ are separated from the tertiary carbon atom, marked with an asterisk (*), by a chain of 8 or more atoms, and the biodegradable group is -OC(O)-, -C(O)O-, - SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -SS-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R ⁵ )=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -C(S )(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -OSi(R ⁵ ) 2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

В одном варианте воплощения соединения формулы IA-1, в каждом случае R³ и R⁴ представляют собой независимо H или C₁-C₄-алкил и R' представляет собой C₁-C₄-алкил.In one embodiment of compounds of formula IA-1, in each occurrence R ³ and R ⁴ are independently H or C ₁ -C ₄ alkyl and R' is C ₁ -C ₄ alkyl.

В одном варианте воплощения соединения формулы IA-1, Q отсутствует или R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)_bгруппа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.In one embodiment of a compound of formula IA-1, Q is absent or R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R) _b is (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O -, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)NH- or (CH3)2N-(CH2)3-C( CH3)=NO-.

В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IB:In another embodiment, the cationic lipid is a compound of formula IB:

R¹ _R, ^Ml—^R r\ IN QR ¹ _R , ^Ml — ^R r\ IN Q

R² R¹⁰-M²-R¹² (В) гдеR ² R ¹⁰ -M ² -R ¹² (B) where

R¹ и R² каждый независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил, C₂-C₂₄-алкенил, C₂-C₂₄-алкинил, C₃-C₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил (C₁-C₂₄)алкил или C₅-C₈-моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, воз можно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; илиR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₂ -C ₂₄ alkenyl, C ₂ -C ₂₄ alkynyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl (C ₁ -C ₂₄ alkyl or C ₅ -C ₈ monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

R¹ и R² вместе с атомом азота к которому они присоединены образуют C₅-C₈-гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома ки- 3 039892 слорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form a C ₅ -C ₈ -heterocyclic ring containing from 1 to 3 heteroatoms, while the heteroatoms are independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or possibly a quaternized nitrogen atom;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси, NH2, C₁-C₂₄-алкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;in each occurrence R ³ and R ⁴ are independently H, OH, C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₁ -C ₂₄ alkoxy, NH2, C ₁ -C ₂₄ alkylamino or di(C ₁ -C ₂₄ )alkylamino ;

Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R⁴)-, -N(R⁵)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -OC(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R⁵)=N-O-C(O)-;Q is absent or is -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R ⁴ )-, -N(R ⁵ ) C(O)-, -SS-, -OC(O)O-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(R ⁵ )=NO-, -OC(O)N(R ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- or -C(R ⁵ )=NOC(O)-;

в каждом случае R⁵ представляет собой, независимо, H или C₁-C₂₄-алкил; a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6; b равно 0, 1, 2 или 3;in each case, R ⁵ represents, independently, H or C ₁ -C ₂₄ -alkyl; a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6; b is 0, 1, 2, or 3;

R' отсутствует или представляет собой водород или C₁-C₂₄-алкил; M¹ и M² каждый независимо представляет собой биоразлагаемую группу; каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой C1C24-алкилен или C2-C24-алкенилен, и каждый из R¹¹ и R¹² независимо представляют собой C1-C₂₄-αлкил или C₂-C₂₄-алкенил, возможно заканчивающийся COOR¹³, где каждый R¹³ независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил;R' is absent or represents hydrogen or C ₁ -C ₂₄ -alkyl; M ¹ and M ² are each independently a biodegradable group; R ⁹ and R ¹⁰ are each independently C1C24 alkylene or C2-C24 alkenylene and R ¹¹ and R ¹² are each independently C1-C ₂₄ -αkyl or C ₂ -C ₂₄ alkenyl, optionally ending in COOR ¹³ , where each R ¹³ independently represents C ₁ -C ₂₄ -alkyl;

при условии, что:provided that:

R⁹, M¹ и R¹¹ вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину; и R¹⁰, M² и R¹² вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)₂O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.R ⁹ , M ¹ and R ¹¹ together have at least 8 carbon atoms in length; and R ¹⁰ , M ² and R ¹² together have at least 8 carbon atoms in length, and the biodegradable group is -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C( O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -SS-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R ⁵ ) =NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -C(S)(NR ⁵ )-, -N (R ⁵ )C(O)-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -OSi(R ⁵ ) ₂ O-, -C(O) (CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R⁹ и R¹⁰ независимо друг от друга представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенилен, M¹ и M² представляют собой -C(O)O-, и R¹¹ и R¹²представляют собой C4-C₁₂-алкилен или C₄-C₁₂-алкенилен.In one embodiment, compounds of formula IB, R ⁹ and R ¹⁰ are independently C4-C12 alkylene or C4-C12 alkenylene, M ¹ and M ² are -C(O)O-, and R ¹¹ and R ¹² are C4-C ₁₂ alkylene or C ₄ -C ₁₂ alkenylene.

В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R⁹, M¹ и R¹¹ вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.In one embodiment, compounds of formula IB, R ⁹ , M ¹ and R ¹¹ together are from 12 to 24 carbon atoms in length.

В одном варианте воплощения соединения формулы IB, R¹⁰, M² и R¹² вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.In one embodiment, compounds of formula IB, R ¹⁰ , M ² and R ¹² together are from 12 to 24 carbon atoms in length.

В одном варианте воплощения соединения формулы IB, группа R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)_b-представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N(CH2)3-C(CH3)=N-O-.In one embodiment of a compound of formula IB, the group R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R) _b - is (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3 )2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- or (CH3)2N(CH2)3-C(CH3)=NO -.

В еще одном варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IC:In yet another embodiment, the cationic lipid is a compound of formula IC:

в которомwherein

R¹ и R² каждый независимо представляет собой C₁-C₂₄-aлкил, C₂-C₂₄-алкенил, C₂-C₂₄-αлкинил, C₃-C₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил C₁-C₂₄-алкил, Cs-Cs моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; илиR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ -alkyl, C ₂ -C ₂₄ -alkenyl, C ₂ -C ₂₄ -alkynyl, C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl C ₁ -C ₂₄ -alkyl, Cs-Cs monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form a heterocyclic ring containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom;

в каждом случае R независимо независимо представляет собой -(CR³R⁴)-;at each occurrence, R is independently -(CR ³ R ⁴ )-;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси,NH2, C₁-C₂₄-алкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;in each occurrence R ³ and R ⁴ are independently H, OH, C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₁ -C ₂₄ alkoxy, NH2, C ₁ -C ₂₄ alkylamino, or di(C ₁ -C ₂₄ )alkylamino ;

в каждом случае R⁵ представляет собой, независимо, H или C₁.C₂₄-алкил; a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;in each occurrence R ⁵ is independently H or C ₁ .C ₂₄ alkyl; a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6;

b равно 0, 1, 2 или 3;b is 0, 1, 2, or 3;

каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо друг от друга представляют собой C₁₂-C₂₄-aлкил или C₂-C₂₄алкенил, замещенный на его конце биоразлагаемой группой,each of R ⁹ and R ¹⁰ is independently C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl or C ₂ -C ₂₄ alkenyl substituted at its end with a biodegradable group,

- 4 039892 причем биоразлагаемая группа представляет собой COOR¹³, где каждый R¹³ независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил.- 4 039892 moreover, the biodegradable group is COOR ¹³ where each R ¹³ independently represents C ₁ -C ₂₄ -alkyl.

В одном варианте воплощения соединения формулы IC, R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)b-группа представляет собой (СНз)2К-(СН2)з-С(О)О-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (СНз)2К-(СН2)2-ОС(О)-КН- или (СНзЖ (СН2)з-С(СНз)=К-О-.In one embodiment of a compound of formula IC, R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R)b-group is (CH3)2K-(CH2)3-C(O)O-, (CH3 )2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CHz)2K-(CH2)2-OC(O)-KH- or (CH3(CH2)3-C(CH3)=K-O -.

В другом варианте воплощения катионный липид выбран из соединений формул II-VII:In another embodiment, the cationic lipid is selected from compounds of formulas II-VII:

и их соли, причем m, n, o и p, каждый в отдельности, равен 1-25, при условии, что в формулах (II), (IV), (VI) и (VII) m и p больше или равны 4.and their salts, and m, n, o and p, each separately, is equal to 1-25, provided that in formulas (II), (IV), (VI) and (VII) m and p are greater than or equal to 4 .

В одном варианте воплощения соединение согласно настоящему изобретению представлено в форме фармацевтически приемлемой соли.In one embodiment, a compound of the present invention is in the form of a pharmaceutically acceptable salt.

Еще одним вариантом воплощения является липидная частица для доставки активных агентов, содержащая нейтральный липид, липид, способный снизить агрегацию, и катионный липид согласно настоящему изобретению.Another embodiment is a lipid particle for delivering active agents comprising a neutral lipid, a lipid capable of reducing aggregation, and a cationic lipid according to the present invention.

В одном варианте воплощения указанный нейтральный липид выбирают из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1 - пαльмитоил-2-олеоил-snфосфатидилхолина (РОРС), 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламина (DOPE) или сфингомиелина (SM); липид, способный уменьшить агрегацию, является PEG-липидом, и липидная частица дополнительно содержит стерол.In one embodiment, said neutral lipid is selected from distearoylphosphatidylcholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-phosphatidylcholine (POPC), 1,2-dioleoyl- sn-3-phosphoethanolamine (DOPE) or sphingomyelin (SM); the lipid capable of reducing aggregation is a PEG lipid, and the lipid particle further contains a sterol.

В одном варианте воплощения указанный катионный липид присутствует в количестве от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%; нейтральный липид присутствует в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.%; стерол присутствует в количестве от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%; и PEG -липид представляет собой PEG - DMA, PEG-DMG, или их сочетание, и присутствует в количестве от примерно 0,5 мол.% до примерно 15 мол.%.In one embodiment, said cationic lipid is present in an amount of from about 20% mole to about 60% mole; neutral lipid is present in an amount of from about 5 mol.% to about 25 mol.%; the sterol is present in an amount of from about 25 mol.% to about 55 mol.%; and the PEG lipid is PEG-DMA, PEG-DMG, or a combination thereof, and is present in an amount of from about 0.5 mole % to about 15 mole %.

В одном варианте воплощения указанная липидная частица дополнительно содержит активный агент.In one embodiment, said lipid particle further comprises an active agent.

В одном варианте воплощения указанный активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из плазмиды, иммуностимулирующих олигонуклеотидов, миРНК, антисмыслового олигонуклеотида, микроРНК, антагомира, аптамера и рибозима.In one embodiment, said active agent is a nucleic acid selected from a plasmid, immunostimulatory oligonucleotides, siRNA, antisense oligonucleotide, microRNA, antagonist, aptamer, and ribozyme.

В одном варианте воплощения указанная липидная частица in vivo имеет период полураспада (t_1/2) менее чем 3 ч.In one embodiment, said lipid particle in vivo has a half-life (t _1/2 ) of less than 3 hours.

В одном варианте воплощения указанная липидная частица in vivo имеет период полураспада (t_1/2), который составляет менее 10%, чем для липидной частицы, содержащей тот же катионный липид без биоразлагаемой группы.In one embodiment, said lipid particle has an in vivo half-life (t _1/2 ) that is less than 10% than a lipid particle containing the same cationic lipid without a biodegradable group.

Еще одним вариантом воплощения является фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте или индукции иммунного ответа у субъекта, содержащая липидную частицу согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.Another embodiment is a pharmaceutical composition for treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject or induction of an immune response in a subject, comprising a lipid particle of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Еще одним вариантом воплощения является способ модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающий предоставление в клетку липидной частицы согласно настоящему изобретению.Another embodiment is a method for modulating the expression of a target gene in a cell, comprising providing a lipid particle according to the present invention to the cell.

В одном варианте воплощения указанный ген-мишень выбран из группы, состоящей из: FactorIn one embodiment, said target gene is selected from the group consisting of: Factor

- 5 039892- 5 039892

VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin А ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(K1P1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, опухолевый супрессорный ген и p53 опухолевый супрессорный ген.VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta gene, Erb-B gene, Src gene, CRK gene, GRB2 gene, RAS gene, MEKK gene, JNK gene, RAF gene, Erk1/2 gene , PCNA(p21) gene, MYB gene, JUN gene, FOS gene, BCL-2 gene, Cyclin D gene, VEGF gene, EGFR gene, Cyclin A gene, Cyclin E gene, WNT-1 gene, beta-catenin gene, c -MET gene, PKC gene, NFKB gene, STAT3 gene, survivin gene, Her2/Neu gene, SORT1 gene, XBP1 gene, topoisomerase I gene, topoisomerase II alpha gene, p73 gene, p21(WAF1/CIP1) gene, p27(K1P1 ) gene, PPM1D gene, RAS gene, caveolin I gene, MIB I gene, MTAI gene, M68 gene, tumor suppressor gene and p53 tumor suppressor gene.

В одном варианте воплощения указанный ген-мишень содержит одну или несколько мутаций.In one embodiment, said target gene contains one or more mutations.

Еще одним вариантом воплощения является способ лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, микроРНК и антисмыслового олигонуклеотида, и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид включает в себя полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид или комплементарен ему.Another embodiment is a method of treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention, wherein the active agent is a nucleic acid selected from the group consisting of miRNA, miRNA, and an antisense oligonucleotide, and wherein the siRNA, microRNA or antisense oligonucleotide comprises a polynucleotide that specifically binds to a polynucleotide that encodes or is complementary to said polypeptide.

Еще одним вариантом воплощения является способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активное вещество представляет собой плазмиду, которая кодирует указанный полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.Another embodiment is a method of treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention, wherein the active agent is a plasmid that encodes said polypeptide or functional variant or fragment thereof.

Еще одним вариантом воплощения является способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем активный агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом.Another embodiment is a method of inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention, wherein the active agent is an immunostimulatory oligonucleotide.

Еще одним вариантом воплощения является способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку или ткань субъекта, включающий введение субъекту нуклеиновой липидной частицы, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и катионный липид согласно настоящему изобретению.Another embodiment is a method for delivering a nucleic acid molecule to a cell or tissue of a subject, comprising administering to the subject a nucleic acid particle comprising the nucleic acid molecule and a cationic lipid according to the present invention.

Другие признаки и аспекты будут очевидны из описания и формулы изобретения.Other features and aspects will be apparent from the description and claims.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг. 1 представлен график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в печени мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.In FIG. 1 is a graph of the concentration of cationic lipids (compound 1-3 and reference lipid) in the liver of mice over time, after the administration of cationic lipids in lipid particles, as described in example 14.

На фиг. 2 показан ожидаемый метаболический путь для соединений 1 и 3 из примера 14.In FIG. 2 shows the expected metabolic pathway for compounds 1 and 3 from Example 14.

На фиг. 3 показан график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в селезенке мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.In FIG. 3 is a graph of the concentration of cationic lipids (compound 1-3 and reference lipid) in the spleen of mice over time, after administration of cationic lipids in lipid particles as described in Example 14.

На фиг. 4 показан график концентрации катионных липидов (соединения 1-3 и референсного липида) в плазме мышей с течением времени, после введения катионных липидов в липидных частицах, как описано в примере 14.In FIG. 4 shows a plot of cationic lipid (compound 1-3 and reference lipid) plasma concentrations in mice over time following administration of cationic lipids in lipid particles as described in Example 14.

Подробное описаниеDetailed description

В одном аспекте настоящее изобретение относится к липидной частице, которая включает в себя нейтральные липиды, липиды, способные снизить агрегацию, катионные липиды и, необязательно, стеролы. В некоторых вариантах воплощения липидная частица дополнительно включает в себя активное вещество (например, терапевтический агент). Различные примерные варианты воплощения этих липидов, липидных частиц и композиций, содержащие то же самое, и их использование для доставки терапевтических агентов и модуляции генной экспрессии белка описаны более подробно ниже.In one aspect, the present invention provides a lipid particle that includes neutral lipids, lipids capable of reducing aggregation, cationic lipids, and optionally sterols. In some embodiments, the lipid particle further includes an active agent (eg, a therapeutic agent). Various exemplary embodiments of these lipids, lipid particles, and compositions containing the same, and their use in delivering therapeutic agents and modulating protein gene expression, are described in more detail below.

Катионный липидCationic lipid

В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IXXIII. В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение одной из формул II-ХХШ. В одном из вариантов воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы I. В другом варианте воплощения, катионный липид представляет собой соединение формулы IA-1, IA-2, IB, IC или ID. Следующие раскрытия представляют различные варианты воплощения соединения формулы I.In one embodiment, the cationic lipid is a compound of formula IXXIII. In another embodiment, the cationic lipid is a compound of one of the formulas II-XXIII. In one embodiment, the cationic lipid is a compound of formula I. In another embodiment, the cationic lipid is a compound of formula IA-1, IA-2, IB, IC, or ID. The following disclosures present various embodiments of a compound of formula I.

В одном из вариантов воплощения M¹ и M², каждый независимо:In one embodiment, M ¹ and M ² are each independently:

- OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.-OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -SS-, - C(R5)=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)(NR ⁵ )-, -N (R5)C(O)-, -C(S)(NR ⁵ )-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R ⁵ )-, -OC( O)O-, -OSi(R ⁵ )2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

В другом варианте воплощения M¹ и M², каждый независимо:In another embodiment, M ¹ and M ² are each independently:

- OC(O)-, -C(O)-O-, -C(R5)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R⁵)-, -N(R5)C(O)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-,-OC(S)-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.-OC(O)-, -C(O)-O-, -C(R5)=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -C(O)N(R ⁵ )-, -N(R5)C(O)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-, -OC(S)-, -OSi(R ⁵ )2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

В еще одном варианте воплощения M¹ и M², каждый независимо:In yet another embodiment, M ¹ and M ² are each independently:

- C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -C(R5)=N-O-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R⁵)-, -C(O)S-, -C(S)O-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.-C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -C(R5)=NO-, -OC(O)O-, -C(O)N(R ⁵ )-, -C(O)S-, -C(S)O-, -OSi(R ⁵ )2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC( O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

- 6 039892- 6 039892

В другом варианте воплощения M¹ и M², каждый, -C(O)O-.In another embodiment, M ¹ and M ² are each -C(O)O-.

В одном варианте воплощения R¹ и R², каждый в отдельности, опционально замещенный алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил или гетероцикл. В одном варианте воплощения R¹ представляет собой алкил, R² представляет собой алкил, циклоалкил или циклоалкилалкил. В одном варианте воплощения R¹ и R², каждый в отдельности представляет собой алкил (например, С1-С₄-алкил, такой как метил, этил или изопропил). В одном варианте воплощения R¹ и R² оба представляют собой метил. В другом варианте воплощения R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют опционально замещенное гетероциклическое кольцо (например, N-метилпиперазинил). В другом варианте воплощения, один из R¹ и R² представляет собой илиIn one embodiment, R ¹ and R ² are each optionally substituted alkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, or heterocycle. In one embodiment, R ¹ is alkyl, R ² is alkyl, cycloalkyl, or cycloalkylalkyl. In one embodiment, R ¹ and R ² are each alkyl (eg, C 1 -C ₄ alkyl such as methyl, ethyl, or isopropyl). In one embodiment, R ¹ and R ² are both methyl. In another embodiment, R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form an optionally substituted heterocyclic ring (eg N-methylpiperazinyl). In another embodiment, one of R ¹ and R ² is or

(например, R¹ является одной из двух вышеупомянутых групп и R² представляет собой водород).(for example, R ¹ is one of the two groups mentioned above and R ² is hydrogen).

В одном варианте воплощения R' представляет собой водород или алкил. В другом варианте воплощения R' представляет собой водород или метил. В одном варианте воплощения R' отсутствует. В одном варианте воплощения R' отсутствует или метил.In one embodiment, R' is hydrogen or alkyl. In another embodiment, R' is hydrogen or methyl. In one embodiment, R' is absent. In one embodiment, R' is absent or methyl.

Для соединений, в которых R' не отсутствует, атом азота, к которому R' присоединяется, несет на себе положительный заряд, а соединение также содержит отрицательно заряженные противоионы. Противоионом может быть любой анион, такой как органический или неорганический анион. Подходящие примеры анионов включают, но не ограничиваются, тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, а-кетоглутарат, а-глицерофосфат, галогенид (например, хлорид), сульфат, нитрат, бикарбонат и карбонат. В одном варианте воплощения противоион является галогенидом (например, Cl).For compounds in which R' is not absent, the nitrogen atom to which R' is attached carries a positive charge, and the compound also contains negatively charged counterions. The counterion can be any anion, such as an organic or inorganic anion. Suitable examples of anions include, but are not limited to, tosylate, methanesulfonate, acetate, citrate, malonate, tartrate, succinate, benzoate, ascorbate, α-ketoglutarate, α-glycerophosphate, halide (eg chloride), sulfate, nitrate, bicarbonate, and carbonate. In one embodiment, the counterion is a halide (eg, Cl).

В одном варианте воплощения каждый R является, независимо, - (CR³R⁴) -, где R³ и R⁴, каждый независимо, - водород или алкил (например, C1-C4-алкил). Например, в одном варианте воплощения каждый R является, независимо, - (CHR⁴)-, где каждый R⁴ является, независимо, H или алкил (например, C1-C₄-алкил). В другом варианте воплощения каждый R является, независимо, -CH2-, -C(CH₃)₂илиIn one embodiment, each R is, independently, -(CR ³ R ⁴ )-, where R ³ and R ⁴ are each independently hydrogen or alkyl (eg, C1-C4 alkyl). For example, in one embodiment, each R is independently -(CHR ⁴ )-, where each R ⁴ is independently H or alkyl (eg, C1- _C4 alkyl). In another embodiment, each R is, independently, -CH2-, -C(CH ₃ ) ₂ or

-CH(iPr)- (где iPr - изопропил). В другом варианте воплощения каждый R представляет собой -CH₂-.-CH(iPr)- (where iPr is isopropyl). In another embodiment, each R is -CH ₂ -.

В другом варианте воплощения R⁵ представляет собой, в каждом случае, водород или метил. Например, R⁵ может быть, в каждом случае, водородом.In another embodiment, R ⁵ is, in each occurrence, hydrogen or methyl. For example, R ⁵ may be, in each case, hydrogen.

В одном из вариантов воплощения Q отсутствует, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R⁴)-, -N(R⁵)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -C(R⁵)=N-O-, -OC(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R⁵)=N-O-C(O)-. В одном из вариантов воплощения Q представляет собой -C(O)O-.In one embodiment, Q is absent, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R ⁴ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -SS- , -OC(O)O-, -C(R ⁵ )=NO-, -OC(O)N(R ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -N (R ⁵ )C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- or -C(R ⁵ )=NOC(O)-. In one embodiment, Q is -C(O)O-.

В одном варианте воплощения Q¹ и Q², каждый независимо, отсутствует или -O-. Например, в одном варианте воплощения Q¹ и Q²,каждый, отсутствует. В другом варианте воплощения, Q¹ и Q², каждый, -O-.In one embodiment, Q ¹ and Q ² are each independently absent or -O-. For example, in one embodiment, Q ¹ and Q ² are each absent. In another embodiment, Q ¹ and Q ² are each -O-.

В одном из вариантов воплощения пунктирная линия к Q отсутствует, b равен 0, а R'R¹R²N-(R)_aQ- и третичный углерод, прилегающий к нему (C *), образуют следующую группу:In one embodiment, there is no dotted line to Q, b is 0, and R'R ¹ R ² N-(R) _a Q- and the tertiary carbon adjacent to it (C*) form the following group:

где n= от 1 до 4 (например, n=2).where n= 1 to 4 (e.g. n=2).

В одном из вариантов воплощения пунктирная линия к Q отсутствует, b равен 0, а R'R¹R²N-(R)_aQ- и третичный углерод, прилегающий к нему, образуют следующую группу:In one embodiment, there is no dashed line to Q, b is 0, and R'R ¹ R ² N-(R) _a Q- and the tertiary carbon adjacent to it form the following group:

R¹ ^R1

R'-----N r/ NrV где n= от 1 до 4 (например, n=2), и R¹, R², R, a и b такие, как определено по формуле (I). В одномR'-----N r/ NrV where n= 1 to 4 (eg n=2), and R ¹ , R ² , R, a and b are as defined by formula (I). In one

- 7 039892 варианте воплощения a=3.- 7 039892 embodiment a=3.

где n= от 1 до 4 (например, n=2), и R¹, R², R, a и b такие, как определено по формуле (I). В одном варианте воплощения a=0. Например, группа может быть:where n= 1 to 4 (for example, n=2), and R ¹ , R ² , R, a and b are as defined by formula (I). In one embodiment, a=0. For example, a group might be:

В одном варианте воплощения b=0. В другом варианте воплощения a=2, 3 или 4 и b=0. Например, в одном варианте воплощения a=3 и b=0. В другом варианте воплощения a=3, b=0, и Q представляет собой -C(O)O-.In one embodiment, b=0. In another embodiment, a=2, 3 or 4 and b=0. For example, in one embodiment, a=3 and b=0. In another embodiment, a=3, b=0, and Q is -C(O)O-.

В одном варианте воплощения соединение формулы (I) имеет подформулу:In one embodiment, a compound of formula (I) has the subformula:

Формула (IF), где R, R', R¹, R², A¹, A², A³, A⁴, Q¹, Q², Q³, Q⁴, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q и r такие, как определено в любом из вариантов воплощения, описанных здесь.Formula (IF) where R, R', R ¹ , R ² , A ¹ , A ² , A ³ , A ⁴ , Q ¹ , Q ² , Q ³ , Q ⁴ , c, d, e, f, g , h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, and r are as defined in any of the embodiments described herein.

В дополнительных вариантах воплощения соединение формулы (IF) отвечает одному или нескольким из следующих условий:In additional embodiments, a compound of formula (IF) meets one or more of the following conditions:

(i) Q¹ и Q² отсутствуют;(i) Q ¹ and Q ² are absent;

(ii) M¹ и M² являются -C(O)O-;(ii) M ¹ and M ² are -C(O)O-;

(iii) g и h оба равны 1;(iii) g and h are both 1;

(iv) g и h оба равны 0;(iv) g and h are both 0;

(v) c и e всего 7;(v) c and e total 7;

(vi) d и f всего 7;(vi) d and f total 7;

(vii) c, e, и i всего 7;(vii) c, e, and i total 7;

(viii) d, f и j всего 7;(viii) d, f and j total 7;

(ix) i и j каждый 7;(ix) i and j each 7;

(x) k и l оба равны 1;(x) k and l are both 1;

(xi) m и n оба равны 0;(xi) m and n are both 0;

(xii) m и q всего 1 или m и q всего 2;(xii) m and q total 1 or m and q total 2;

(xiii) m и l всего 6;(xiii) m and l total 6;

(xiv) r и n всего 6;(xiv) r and n total 6;

(xv) p и o оба равны 0;(xv) p and o are both 0;

(xvi) n и r всего 2 или n и r всего 1; и (xvii) Q³ является H.(xvi) n and r total 2 or n and r total 1; and (xvii) Q ³ is H.

В некоторых вариантах воплощения биоразлагаемые группы, которые присутствуют в катионном липиде, выбирают из эфирных (например, -C(O)O- или -OC(O)-), дисульфидных (-SS-), оксимных (например, -C(H)=N-O- или -O-N=C(H)-), -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R⁵), -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, (NR⁵)C(S)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-, -OC(S)-, -OSi(R⁵)₂O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.In some embodiments, the biodegradable groups that are present on the cationic lipid are selected from ether (e.g. -C(O)O- or -OC(O)-), disulfide (-SS-), oxime (e.g. -C(H )=NO- or -ON=C(H)-), -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )- , -C(R ⁵ )=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -C(O)N(R ⁵ ), -N(R ⁵ )C(O) -, -C(S)(NR ⁵ )-, (NR ⁵ )C(S)-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -C(O)S-, -SC (O)-, -C(S)O-, -OC(S)-, -OSi(R ⁵ ) ₂ O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC (O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

В одном варианте воплощения алифатическая группа в одном или обоих гидрофобных хвостах катионного липида включает в себя по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь.In one embodiment, the aliphatic group in one or both of the hydrophobic tails of the cationic lipid includes at least one carbon-carbon double bond.

Подходящий фрагмент холестерина для катионных липидов настоящего изобретения (в том числе соединений формулы (I), IA-2, ID, IE и IF) имеет формулу:A suitable cholesterol moiety for the cationic lipids of the present invention (including compounds of formula (I), IA-2, ID, IE and IF) has the formula:

- 8 039892- 8 039892

Дополнительные варианты воплощения включают катионный липид, имеющий головную группу, один или более гидрофобный хвост и линкер между головной группой и одним или несколькими хвостами. Головная группы может включать в себя амины, например амин, имеющий желаемые рК_а. рК_а, может зависеть от структуры липида, в частности, характера головной группы, например, наличия, отсутствия и расположения функциональных групп, таких как анионные функциональные группы, водородная связь донора функциональных групп, водородная связь акцепторных групп, гидрофобные группы (например, алифатические группы), гидрофильные группы (например, гидроксильные или метокси) или арил группы. Амин головной группы может быть катионным амином, первичным, вторичным и третичным амином, головная группы может включать в себя одну аминогруппу (моноамин), две аминогруппы (диамин), три аминогруппы (триамин), или большее число аминогрупп, как и в олигоамине или полиамине. Головная группа может включать в себя функциональную группу, которая слабее, чем основные амины, такие как, например, имидазол, пиридин или группа гуанидиния. Головная группа может быть цвиттерионной. Другие головные группы также являются подходящими.Additional embodiments include a cationic lipid having a head group, one or more hydrophobic tails, and a linker between the head group and one or more tails. The head group may include amines, for example an amine having _the desired pKa. pKa may depend on _the structure of the lipid, in particular the nature of the head group, e.g. the presence, absence and location of functional groups such as anionic functional groups, functional group donor hydrogen bond, acceptor hydrogen bond, hydrophobic groups (e.g. aliphatic groups ), hydrophilic groups (eg hydroxyl or methoxy), or aryl groups. The head group amine can be a cationic amine, primary, secondary and tertiary amine, the head group can include one amino group (monoamine), two amino groups (diamine), three amino groups (triamine), or more amino groups, as in oligoamine or polyamine . The head group may include a functional group that is weaker than basic amines such as, for example, imidazole, pyridine, or a guanidinium group. The head group may be zwitterionic. Other headgroups are also suitable.

Один или более гидрофобный хвост может включать в себя две гидрофобные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными. Хвосты могут быть алифатическими, например, они могут состоять из углерода и водорода, либо насыщенными или ненасыщенными, но без ароматических колец. Хвосты могут быть хвостами жирных кислот. Некоторые из таких групп включают в себя октанил, нонанил, децил, лаурил, миристил, пальмитил, стеарил, α-линолеил, стеаридонил, линолеил, у-линоленил, арахадонил и олеил. Другие гидрофобные хвосты также являются подходящими.One or more hydrophobic tails may include two hydrophobic chains, which may be the same or different. The tails may be aliphatic, for example, they may be composed of carbon and hydrogen, or saturated or unsaturated, but without aromatic rings. The tails may be fatty acid tails. Some of these groups include octanyl, nonanyl, decyl, lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, α-linoleyl, stearidonyl, linoleyl, y-linoleyl, arachadonyl, and oleyl. Other hydrophobic tails are also suitable.

Линкер может включать в себя, например, глицеридный линкер, ациклических глицеридов аналоговый линкер или циклический линкер (в том числе линкер спиро, бициклический линкер и полициклический линкер). Линкер может включать в себя функциональные группы, такие как простые эфирные, сложноэфирные, фосфатные, фосфонатные, фосфоротиоатные, сульфонатные, дисульфидные, ацетальные, кетальные, иминные, гидразонные или оксимные. Другие линкеры и функциональные группы также являются подходящими.The linker may include, for example, a glyceride linker, an acyclic glyceride analog linker, or a cyclic linker (including a spiro linker, a bicyclic linker, and a polycyclic linker). The linker may include functional groups such as ether, ester, phosphate, phosphonate, phosphorothioate, sulfonate, disulfide, acetal, ketal, imine, hydrazone or oxime. Other linkers and functional groups are also suitable.

В одном варианте воплощения катионный липид является рацемической смесью. В другом варианте воплощения, катионный липид обогащен одним диастереомером, например, катионный липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% диастереомера в избытке. В еще одном варианте воплощения, катионный липид обогащен одним энантиомером, например, липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере 70% энантиомера в избытке. В еще одном варианте воплощения катионный липид хирально чистый, например, является отдельным оптическим изомером. В еще одном варианте воплощения катионный липид обогащен одним оптическим изомером.In one embodiment, the cationic lipid is a racemic mixture. In another embodiment, the cationic lipid is enriched in one diastereomer, for example, the cationic lipid has at least 95%, at least 90%, at least 80%, or at least 70% of the diastereomer in excess. In yet another embodiment, the cationic lipid is enriched in one enantiomer, for example, the lipid has at least 95%, at least 90%, at least 80%, or at least 70% of an enantiomer in excess. In yet another embodiment, the cationic lipid is chirally pure, for example, is a single optical isomer. In yet another embodiment, the cationic lipid is enriched in one optical isomer.

В случае если двойная связь присутствует (например, углерод-углеродная двойная связь или углерод-азот двойная связь), может быть изомерия в конфигурации двойной связи (т.е. цис/транс или E/Z изомерия). Там, где конфигурация двойной связи показана в химической структуре, следует понимать, что соответствующий изомер может также присутствовать. Сумма присутствующих изомеров может варьироваться, в зависимости от относительной устойчивости изомеров и энергии, необходимой для перехода между изомерами. Соответственно, некоторые двойные связи, для практических целей, присутствуют только в одной конфигурации, тогда как другие (например, когда относительная стабильность похожа и энергия перехода низкая) могут присутствовать в качестве неотъемлемой равновесной смеси конфигураций.In case a double bond is present (eg, carbon-carbon double bond or carbon-nitrogen double bond), there may be isomerism in the double bond configuration (ie, cis/trans or E/Z isomerism). Where a double bond configuration is shown in a chemical structure, it is to be understood that the corresponding isomer may also be present. The sum of isomers present may vary, depending on the relative stability of the isomers and the energy required to transition between isomers. Accordingly, some double bonds, for practical purposes, are present in only one configuration, while others (eg, when the relative stability is similar and the transition energy is low) may be present as an inherent equilibrium mixture of configurations.

В некоторых случаях ненасыщенная двойная связь может быть заменена на циклические ненасыщенные. Циклические ненасыщенные могут быть циклоалифатическими ненасыщенными, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил группы. В некоторых случаях, циклическая группа может быть полициклической группой, например, бициклической группой или трициклической группой. Бициклическая группа может быть мостиковой, смешанной или иметь спиро структуру.In some cases, an unsaturated double bond may be replaced by cyclic unsaturated ones. Cyclic unsaturated can be cycloaliphatic unsaturated, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl groups. In some cases, the cyclic group may be a polycyclic group, such as a bicyclic group or a tricyclic group. The bicyclic group may be bridged, mixed, or have a spiro structure.

В некоторых случаях фрагмент двойной связи может быть заменен фрагментом циклопропила,In some cases, the double bond moiety may be replaced by a cyclopropyl moiety,

-9039892-9039892

может быть замененcan be replaced

например,For example,

Например, фрагмент, показанный ниже, имеет две двойных углерод-углеродных связей, каждая из которых может самостоятельно заменить циклический фрагмент, например, циклопропил фрагмент. Таким образом, заместители дляFor example, the fragment shown below has two carbon-carbon double bonds, each of which can independently replace a cyclic fragment, for example, a cyclopropyl fragment. Thus, substitutes for

включаютinclude

Для следующего примера заместители дляFor the following example, substituents for

JWVJWV

I включаютI include

включаютinclude

Для следующего примера заместители для включаютFor the following example, substituents for include

COOEtCOOEt

Катионный липид включает в себя одну или более биоразлагаемых групп. Биоразлагаемая(е) группа(ы) включают одну или более связь, которые могут подвергаться реакции разрыва связей в биологической среде, например, в организме, органе, ткани, клетке или органелле. Функциональные группы, которые содержат биоразлагаемые связи, включают, например, сложные эфиры, дитиолы и оксимы. Биодеградация может быть фактором, который влияет на выведение соединения из организма при введении субъекту. Биодеградация может быть измерена в клетке на основе анализа, когда композиция, включающая катионный липид, вводится в клетки и образцы берутся в различные моменты времени. Липидные фракции могут быть извлечены из клеток и разделены и проанализированы LC-MS. По LCMS данным скорость биодеградации (например, как t_1/2 значение) может быть измерена. Например, соединениеThe cationic lipid includes one or more biodegradable groups. The biodegradable(e) group(s) include one or more bonds that can undergo a cleavage reaction in a biological environment, for example, in an organism, organ, tissue, cell, or organelle. Functional groups that contain biodegradable linkages include, for example, esters, dithiols, and oximes. Biodegradation can be a factor that affects the excretion of a compound from the body when administered to a subject. Biodegradation can be measured in a cell based assay when a composition comprising a cationic lipid is injected into the cells and samples are taken at different time points. Lipid fractions can be extracted from cells and separated and analyzed by LC-MS. From LCMS data, the rate of biodegradation (eg as a t _1/2 value) can be measured. For example, connection

ОO

Соединение 1 включает в себя эфирную связь в каждой алифатической цепи, которые могут подвергнуться гидролизу в биологической среде, например, при воздействии, например, липазы или эстеразы. СтруктураCompound 1 includes an ester bond in each aliphatic chain, which can undergo hydrolysis in a biological environment, for example, when exposed to, for example, lipase or esterase. Structure

- 10 039892 соединения, конечно, влияет на скорость, с которой соединение подвергается биодеградации. Таким образом, связанные соединения, такие как- 10 039892 compounds, of course, affects the rate at which the compound undergoes biodegradation. Thus related compounds such as

можно было бы ожидать, что будут обладать различной скоростью биодеградации. Большого влияния на этот показатель можно было бы ожидать от изменений в структуре соединения в месте гидролиза. Одной из модификаций, которая может влиять на скорость гидролиза, и тем самым влиять на скорость биодеградации и выведение из тела субъекта, является уходящая группа реакции гидролиза первичная спиртовая группа легче, чем вторичная.one would expect to have different rates of biodegradation. A great influence on this indicator could be expected from changes in the structure of the compound at the site of hydrolysis. One of the modifications that can affect the rate of hydrolysis, and thereby affect the rate of biodegradation and excretion from the body of the subject, is the leaving group of the hydrolysis reaction, the primary alcohol group is lighter than the secondary.

Например, не желая быть связанными теорией, соединения 1 и 2, показанные выше, могут быть метаболизированы, как показано на фиг. 2.For example, without wishing to be bound by theory, compounds 1 and 2 shown above can be metabolized as shown in FIG. 2.

В одном варианте воплощения катионный липид любого из описанных здесь вариантов имеет in vivo период полураспада (t_1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем примерно 3 ч, например, менее чем около 2,5 ч, менее чем около 2 ч, менее чем около 1,5 ч, менее чем около 1 ч, менее чем около 0,5 ч или менее около 0,25 ч.In one embodiment, the cationic lipid of any of the embodiments described herein has an in vivo half-life (t _1/2 ) (e.g., in liver, spleen, or plasma) of less than about 3 hours, e.g., less than about 2.5 hours, less than about 2 hours, less than about 1.5 hours, less than about 1 hour, less than about 0.5 hours, or less than about 0.25 hours.

В другом варианте воплощения катионный липид любого из описанных здесь вариантов воплощения, содержащий биоразлагаемую группу или группы, которые имеют in vivo период полураспада (t₁/₂) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем примерно 10% (например, менее чем около 7,5%, менее чем около 5%, менее чем около 2,5%), чем тот же катионный липид без биоразлагаемой группы или групп.In another embodiment, a cationic lipid of any of the embodiments described herein, containing a biodegradable group or groups that have an in vivo half-life (t ₁ / ₂ ) (for example, in the liver, spleen or plasma) of less than about 10% (for example, less than than about 7.5%, less than about 5%, less than about 2.5%) than the same cationic lipid without the biodegradable group or groups.

Некоторые катионные липиды могут быть удобно представлены в виде гидрофобных групп в сочетании с головной группой. Так, например, соединениеSome cationic lipids may conveniently be presented as hydrophobic groups in combination with a head group. So, for example, the connection

ОO

Соединение 1 можно рассматривать как сочетание головной группы и гидрофобной группы следующим образом: ОCompound 1 can be considered as a combination of a head group and a hydrophobic group as follows: O

Головная группа Гидрофобная группаHead group Hydrophobic group

Таким образом, некоторые подходящие головные группы включают приведенные в табл. 1.Thus, some suitable head groups include those listed in Table. one.

Таблица 1Table 1

1 о one about 1 ο 1 ο 1 / ^Ν ο1 / ^Ν ο о 1 ^Z about ^1Z 1 Η 1 H ο 1 ^ζ ο 1 ^ζ 1 ίι 1 pi Ο 1 ^ζ Ο 1 ^ζ 1 ° 1° 1 ⁰ х^_о^\1 ⁰ x^ _o ^\ 0 1 0 one 1 ⁰ 1 ⁰ 1 9 _хоА -Ν___^_Ρ₄ \1 9 _x oA -Ν___^_Ρ ₄ \ Τ' Ο Ο xCL °''ο ζ— / Τ' Ο Ο xCL °''ο z— / << о о xCL °' О —Z \ << o o xCL °' o -Z\ ι ч χοΑ Η °Α ι h χοΑ Η °Α / —ζ -χθ Τ’ / \ Ο Ο Α-Ά- / -ζ-χθ Τ' / \ Ο Ο Α-Ά- ι ч χθΑ й °А ι h χθΑ th °A

- 11 039892- 11 039892

! V о ,n^A_o_|! V o ,n^A _o _| о Cn^A_o.|o Cn^A _o .| % о 1 % about one О rA N About rAN о c/⁴ about c/ ⁴ 1 ° /N^-_nAn-| Η Η ^ξ 1 ° /N^- _n An-| Η Η ^ξ 1 one 1 one \ ΛΛ / VV^ o-y \ΛΛ /VV^o-y , V о , V o О О— O O- о Ст % к___N about St % to ___N О N O N о ^o-v ^o -v 1 ° / N N—\ ^{H H} X1 ° / NN—\ ^HH X ^O ' / ^O '/ H %Νχ 1 \ °~l / H %Νχ 1 \ °~l / ^VNC^^=N_Xo_ । ^V NC^^=N _Xo _ । v Λ-ι N \ v Λ-ι N \ / ^=N^_Q_ | —N \/ ^=N^ _Q _ | -N\ y)=^NM —N \y)= ^N M -N \ —N \ -N \ / | —N \ / | -N \ _ZN^ /=^Ν-_Ο-1 _Z N^ /= ^Ν - _Ο -1 >=hk A' / >=hk A' / H )=N₄\ _/—^{/ O}”V /H )=N ₄ \ _/— ^{/ O} ”V / z / z / P z ^z^ Pz ^z^ —N \ -N \ y>^N'°-y —N \y> ^N '°-y -N \

- 12 039892- 12 039892

(углерод со звездочкой третичный углерод катионного липида и не является частью головной(asterisked carbon is a tertiary carbon of a cationic lipid and is not part of the head

(углерод со звездочкой третичный углерод катионного липида и не является частью головной группы) группы)(the carbon with an asterisk is a tertiary carbon of a cationic lipid and is not part of the head group) group)

R = Н, алкил (например, метил) X = галоген (например, С1)R = H, alkyl (e.g. methyl) X = halogen (e.g. C1)

R = Н, алкил (например, метил)R = H, alkyl (e.g. methyl)

X = галоген (например, С1)X = halogen (e.g. C1)

Некоторые подходящие группы гидрофобного хвоста включают те, что приведены в табл. 2.Some suitable hydrophobic tail groups include those shown in Table 1. 2.

Таблица 2table 2

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения соединения любой из формул I-XXIII. Подходящие образцовые синтетические способы проиллюстрированы на схемах A-G ниже. Переменные в схемах ниже, такие же, как эти переменные в той же позиции в формулах I-XXIII выше.In another aspect, the present invention relates to a process for preparing a compound of any of formulas I-XXIII. Suitable exemplary synthetic methods are illustrated in Schemes A-G below. The variables in the diagrams below are the same as those variables in the same position in formulas I-XXIII above.

- 13 039892- 13 039892

Схема AScheme A

TBDPSCITBDPSCI

Е1.Ж) МАРСИО,E1.G) MARCIO,

(I) CsOjiNMOft-BuCH/ ТГФ/Н₂О (ii) МаО^диоксан/НгО(I) CsOjiNMOft-BuCH/THF/H2O ( _ii ) MaO^dioxane/HgO

Длина цепи липида и длина линкера в схеме A может быть изменена. Кроме того, группа R в функциональном эфире и заместители у атома азота могут быть модифицированы.The lipid chain length and linker length in Scheme A can be changed. In addition, the R group on the ether functional and the substituents on the nitrogen atom may be modified.

Схема BScheme B

Как показано на схеме B, медно-опосредованная связь дает ди-ин содержащие цепи липидов с концевыми функциональными группами R, которые могут быть уменьшены для создания ди-ен содержащих липидных цепочек. Длина цепи линкера и липида может быть изменена и функциональные группы заместителей (R, R1, R2) могут быть модифицированы.As shown in Scheme B, copper-mediated bonding produces di-yne containing lipid chains with R-terminal functional groups, which can be reduced to create di-ene containing lipid chains. The chain length of the linker and lipid can be changed and the functional groups of the substituents (R, R1, R2) can be modified.

- 14 039892- 14 039892

Схема CScheme C

где Rx представляет собой алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил и головную группу, как определено в табл. 1.where Rx is alkyl, substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, or substituted aryl, and a head group as defined in Table 1. one.

Головная группа в схеме C может быть любой головной группой, описанной здесь (см., например, табл. 1).The head group in Scheme C can be any of the head groups described here (see, for example, Table 1).

НОГАлисЬатическая) О ВпNogalistic) O Vp

Схема DScheme D

HNMe₂ HNMe ₂

CICI

NaOH гранулыNaOH granules

Cat. N(Bu₄)Br оCat. N(Bu ₄ )Br o

О(Али(Ьатическая)ОВп IPAO(Ali(batic)OVp IPA

Toluene, 90 ₀СToluene, 90 ₀ C

ОГАлисЬатическаяЮГОЮКхOGALISmaticheskayaYUGOYUKh

Me₂NMe ₂ N

О(Алифатическая)С(О)ОКхO(Aliphatic)C(O)OKx

- 15 039892- 15 039892

Схема EScheme E

Схема FScheme F

- 16 039892- 16 039892

Схема GScheme G

Примеры катионных липидов настоящего изобретения включают те, что приведены в табл. 3-13 ниже и их соли (в том числе фармацевтически приемлемые соли).Examples of cationic lipids of the present invention include those shown in table. 3-13 below and their salts (including pharmaceutically acceptable salts).

Таблица 3Table 3

- 17 039892- 17 039892

Таблица 4Table 4

- 18 039892- 18 039892

- 19 039892- 19 039892

- 20 039892- 20 039892

- 21 039892- 21 039892

- 22 039892- 22 039892

- 23 039892- 23 039892

- 24 039892- 24 039892

- 25 039892- 25 039892

- 26 039892- 26 039892

- 27 039892- 27 039892

- 28 039892- 28 039892

m = 1-6; η = 0-3m = 1-6; η = 0-3

R-, = R₂ = Me, Et, |РгИт.д.R-, \u003d R ₂ \u003d Me, Et, | RgIt.d.

⁰⁰ X/ \Z - X/ X/ X/ \Z - X/ X/ z^/^COOMe ^^x^COOMe z^/^COOMe ^^x^COOMe ⁴N^Z ^4NZ ^_ x^^^/COOMe x^^^/COOMe ^{П 0}n = 0-2 (n = 1; ALNY-322 ^{P 0} n = 0-2 (n = 1; ALNY-322 ^^^.COOMe ^^^.COOMe ^^/^^COOEt ^^/^^COOEt ^{П 0} XXXX^ n = 0-2 ^{P 0} XXXX^ n = 0-2 ^/^/==^/^/⁴ ^/^/==^/^/ ⁴ •^/^^COQEt •^/^^COQEt ⁴N^Z ^4NZ ^_ ^/4/=4/4^ ^/4/=4/4^ x\/x^COOBn x\/x^COOBn ⁿ о n = 0-2 ⁿ about n = 0-2 ^^^^COOBn ^^^^COOBn V V /x^^^COO'Bu /x^^^COO'Bu ⁿ 0 Lxx n = 0-2 ⁿ 0 Lxx n = 0-2 ^^^COO'Bu ^^^COO'Bu ^N' ^N' ^^x/^x/^^^x/^x ^^x/^x/^^^x/^x I I ⁿ о LJxxn = 0-2 ⁿ o LJxxn = 0-2 ^^^.COOH ^^^.COOH ^{1 n} о n = 0-2 ^{1 n} about n \u003d 0-2 /^/^/^=^/^4 /^/^/^=^/^4 ^^COOMe ^^COOMe ^^COOMe ^^COOMe x<rr^ ¹ о n = 0-2x<rr^ ¹ o n = 0-2 ^^^^COOH ^^COOH ^^^^COOH ^^COOH

- 29 039892- 29 039892

- 30 039892- 30 039892

- 31 039892- 31 039892

- 32 039892- 32 039892

- 33 039892- 33 039892

- 34 039892- 34 039892

- 35 039892- 35 039892

о O=( Ρ ο 41 about O=( Ρο 41 , J , J m m η η Ρ P q q m m η η Ρ P q q 1 one 12 12 1 one 12 12 12 12 1 one 12 12 1 one 2 2 11 eleven 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 3 3 10 ten 10 ten 3 3 10 ten 3 3 4 4 9 nine 4 4 9 nine 9 nine 4 4 9 nine 4 4 5 5 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 5 5 6 6 7 7 6 6 7 7 7 7 6 6 7 7 6 6 7 7 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7 6 6 7 7 8 eight 5 5 8 eight 5 5 5 5 8 eight 5 5 8 eight 9 nine 4 4 9 nine 4 4 4 4 9 nine 4 4 9 nine 10 ten 3 3 10 ten 3 3 3 3 10 ten 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 2 2 11 eleven 12 12 1 one 12 12 1 one 1 one 12 12 1 one 12 12 1 one 12 12 2 2 11 eleven 12 12 1 one 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 10 ten 3 3 3 3 10 ten 4 4 9 nine 10 ten 3 3 9 nine 4 4 4 4 9 nine 5 5 8 eight 9 nine 4 4 8 eight 5 5 5 5 8 eight 6 6 7 7 8 eight 5 5 7 7 6 6 6 6 7 7 7 7 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7 7 7 6 6 8 eight 5 5 6 6 7 7 5 5 8 eight 8 eight 5 5 9 nine 4 4 5 5 8 eight 4 4 9 nine 9 nine 4 4 10 ten 3 3 4 4 9 nine 3 3 10 ten 10 ten 3 3 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 12 12 1 one 2 2 11 eleven 1 one 12 12 12 12 1 one 1 one 12 12 1 one 12 12 12 12 1 one 1 one 12 12 3 3 10 ten 12 12 1 one 10 ten 3 3 2 2 11 eleven 4 4 9 nine 11 eleven 2 2 9 nine 4 4 3 3 10 ten 5 5 8 eight 10 ten 3 3 8 eight 5 5 4 4 9 nine 6 6 7 7 9 nine 4 4 7 7 6 6 5 5 8 eight 7 7 6 6 8 eight 5 5 6 6 7 7 6 6 7 7 8 eight 5 5 7 7 6 6 5 5 8 eight 7 7 6 6 9 nine 4 4 6 6 7 7 4 4 9 nine 8 eight 5 5 10 ten 3 3 5 5 8 eight 3 3 10 ten

- 36 039892- 36 039892

9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten 11 12 2 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 eleven 12 2 4 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight 2 1 11 9 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 2 one eleven nine nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 7 6 5 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten eleven eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten eleven 12 7 6 5 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 6 7 8 eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 2 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 2 one 6 7 eight 4 4 9 nine 9 nine 4 4 9 nine 4 4 4 4 9 nine 5 5 8 eight 10 ten 3 3 8 eight 5 5 3 3 10 ten 6 6 7 7 11 eleven 2 2 7 7 6 6 2 2 11 eleven 7 7 6 6 12 12 1 one 6 6 7 7 1 one 12 12 8 eight 5 5 2 2 11 eleven 5 5 8 eight 11 eleven 2 2

- 37 039892- 37 039892

9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 3 4 5 6 7 8 9 8 9 10 11 3 4 5 6 7 eight nine eight nine ten eleven 10 9 8 7 6 5 4 5 4 3 2 ten nine eight 7 6 5 4 5 4 3 2 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 10 11 12 1 6 5 4 3 2 1 11 ten eleven 12 one 6 5 4 3 2 one eleven 3 2 1 12 7 8 9 10 11 12 2 3 2 one 12 7 eight nine ten eleven 12 2 8 eight 5 5 12 12 1 one 5 5 8 eight 10 ten 3 3 9 nine 4 4 2 2 11 eleven 4 4 9 nine 11 eleven 2 2 10 ten 3 3 3 3 10 ten 3 3 10 ten 12 12 1 one 11 eleven 2 2 4 4 9 nine 2 2 11 eleven 1 one 12 12 12 12 1 one 5 5 8 eight 1 one 12 12 2 2 11 eleven

Таблица 6Table 6

^р 0 ^p 0 1 ο >'^m 0 % 01 ο >' ^m 0 % 0 m m η η Ρ P q q m m η η Ρ P q q 1 one 12 12 1 one 12 12 12 12 1 one 12 12 1 one 2 2 11 eleven 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 3 3 10 ten 10 ten 3 3 10 ten 3 3 4 4 9 nine 4 4 9 nine 9 nine 4 4 9 nine 4 4 5 5 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 5 5 6 6 7 7 6 6 7 7 7 7 6 6 7 7 6 6 7 7 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7 6 6 7 7 8 eight 5 5 8 eight 5 5 5 5 8 eight 5 5 8 eight 9 nine 4 4 9 nine 4 4 4 4 9 nine 4 4 9 nine 10 ten 3 3 10 ten 3 3 3 3 10 ten 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 2 2 11 eleven 12 12 1 one 12 12 1 one 1 one 12 12 1 one 12 12 1 one 12 12 2 2 11 eleven 12 12 1 one 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 10 ten 3 3

- 38 039892- 38 039892

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 4 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 9 9 8 7 6 5 4 3 2 1 nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven nine nine eight 7 6 5 4 3 2 one 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 10 ten 3 3 2 2 11 eleven 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 2 2 11 eleven 10 ten 3 3 12 12 1 one 4 4 9 nine 1 one 12 12 11 eleven 2 2 1 one 12 12 5 5 8 eight 12 12 1 one 8 eight 5 5 2 2 11 eleven 6 6 7 7 11 eleven 2 2 7 7 6 6

- 39 039892- 39 039892

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 8 9 10 11 7 eight nine ten eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 4 5 6 7 eight nine eight nine ten eleven 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 5 4 3 2 6 5 4 3 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one eleven ten nine eight 7 6 5 4 5 4 3 2 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 7 6 5 4 3 2 1 11 10 11 12 1 6 5 4 3 2 1 11 6 5 4 3 2 one eleven ten eleven 12 7 6 5 4 3 2 one eleven ten eleven 12 one 6 5 4 3 2 one eleven 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 6 7 8 9 10 11 12 2 3 2 1 12 7 8 9 10 11 12 2 7 eight nine ten eleven 12 2 3 2 one 6 7 eight nine ten eleven 12 2 3 2 one 12 7 eight nine ten eleven 12 2 8 eight 5 5 12 12 1 one 5 5 8 eight 10 ten 3 3 9 nine 4 4 2 2 11 eleven 4 4 9 nine 11 eleven 2 2 10 ten 3 3 3 3 10 ten 3 3 10 ten 12 12 1 one 11 eleven 2 2 4 4 9 nine 2 2 11 eleven 1 one 12 12 12 12 1 one 5 5 8 eight 1 one 12 12 2 2 11 eleven

- 40 039892- 40 039892

Таблица 7Table 7

0 АоУ \ 1 ''η I О ¹ II Kim / /у p о0 AoU \ 1 ''η I O ¹ II Kim / /u p o о ⁰ \ 1 lb 0 о ^q o ⁰ \ 1 lb 0 o ^q m m η η P P q q m m n n P P q q 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 2 2 12 12 2 2 12 12 2 2 12 12 2 2 12 12 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 4 4 10 ten 4 4 10 ten 4 4 10 ten 4 4 10 ten 5 5 9 nine 5 5 9 nine 5 5 9 nine 5 5 9 nine 6 6 8 eight 6 6 8 eight 6 6 8 eight 6 6 8 eight 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 eight 6 6 8 eight 6 6 8 eight 6 6 8 eight 6 6 9 nine 5 5 9 nine 5 5 9 nine 5 5 9 nine 5 5 10 ten 4 4 10 ten 4 4 10 ten 4 4 10 ten 4 4 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 12 12 2 2 12 12 2 2 12 12 2 2 12 12 2 2 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 1 one 13 thirteen 2 2 12 12 1 one 13 thirteen 2 2 12 12 2 2 12 12 3 3 11 eleven 2 2 12 12 3 3 11 eleven 3 3 11 eleven 4 4 10 ten 3 3 11 eleven 4 4 10 ten 4 4 10 ten 5 5 9 nine 4 4 10 ten 5 5 9 nine 5 5 9 nine 6 6 8 eight 5 5 9 nine 6 6 8 eight 6 6 8 eight 7 7 7 7 6 6 8 eight 7 7 7 7 7 7 7 7 8 eight 6 6 7 7 7 7 8 eight 6 6 8 eight 6 6 9 nine 5 5 8 eight 6 6 9 nine 5 5 9 nine 5 5 10 ten 4 4 9 nine 5 5 10 ten 4 4 10 ten 4 4 11 eleven 3 3 10 ten 4 4 11 eleven 3 3 11 eleven 3 3 12 12 2 2 11 eleven 3 3 12 12 2 2 12 12 2 2 13 thirteen 1 one 12 12 2 2 13 thirteen 1 one 13 thirteen 1 one 1 one 13 thirteen 13 thirteen 1 one 1 one 13 thirteen 1 one 13 thirteen 3 3 11 eleven 1 one 13 thirteen 3 3 11 eleven 2 2 12 12 4 4 10 ten 2 2 12 12 4 4 10 ten 3 3 11 eleven 5 5 9 nine 3 3 11 eleven 5 5 9 nine 4 4 10 ten 6 6 8 eight 4 4 10 ten 6 6 8 eight

-41 039892-41 039892

5 5 9 nine 7 7 7 7 5 5 9 nine 7 7 7 7 6 6 8 eight 8 eight 6 6 6 6 8 eight 8 eight 6 6 7 7 7 7 9 nine 5 5 7 7 7 7 9 nine 5 5 8 eight 6 6 10 ten 4 4 8 eight 6 6 10 ten 4 4 9 nine 5 5 11 eleven 3 3 9 nine 5 5 11 eleven 3 3 10 ten 4 4 12 12 2 2 10 ten 4 4 12 12 2 2 11 eleven 3 3 13 thirteen 1 one 11 eleven 3 3 13 thirteen 1 one 12 12 2 2 1 one 13 thirteen 12 12 2 2 1 one 13 thirteen 13 thirteen 1 one 2 2 12 12 13 thirteen 1 one 2 2 14 fourteen

Таблица 8Table 8

О'°^⁼41~^н РO'°^ ⁼ 41~ ⁿ P , _о Vp, _about Vp ш w η η Р R m m η η Р R 1 one 12 12 18 eighteen 12 12 1 one 18 eighteen 2 2 11 eleven 18 eighteen 11 eleven 2 2 18 eighteen 3 3 10 ten 18 eighteen 10 ten 3 3 18 eighteen 4 4 9 nine 18 eighteen 9 nine 4 4 18 eighteen 5 5 8 eight 18 eighteen 8 eight 5 5 18 eighteen 6 6 7 7 18 eighteen 7 7 6 6 18 eighteen 7 7 6 6 18 eighteen 6 6 7 7 18 eighteen 8 eight 5 5 18 eighteen 5 5 8 eight 18 eighteen 9 nine 4 4 18 eighteen 4 4 9 nine 18 eighteen 10 ten 3 3 18 eighteen 3 3 10 ten 18 eighteen И And 2 2 18 eighteen 2 2 11 eleven 18 eighteen 12 12 1 one 18 eighteen 1 one 12 12 18 eighteen 1 one 12 12 17 17 12 12 1 one 17 17 2 2 11 eleven 17 17 11 eleven 2 2 17 17 3 3 10 ten 17 17 10 ten 3 3 17 17 4 4 9 nine 17 17 9 nine 4 4 17 17 5 5 8 eight 17 17 8 eight 5 5 17 17 6 6 7 7 17 17 7 7 6 6 17 17 7 7 6 6 17 17 6 6 7 7 17 17 8 eight 5 5 17 17 5 5 8 eight 17 17 9 nine 4 4 17 17 4 4 9 nine 17 17

- 42 039892- 42 039892

10 ten 3 3 17 17 3 3 10 ten 17 17 и and 2 2 17 17 2 2 11 eleven 17 17 12 12 1 one 17 17 1 one 12 12 17 17 1 one 12 12 16 sixteen 12 12 1 one 16 sixteen 2 2 11 eleven 16 sixteen 11 eleven 2 2 16 sixteen 3 3 10 ten 16 sixteen 10 ten 3 3 16 sixteen 4 4 9 nine 16 sixteen 9 nine 4 4 16 sixteen 5 5 8 eight 16 sixteen 8 eight 5 5 16 sixteen 6 6 7 7 16 sixteen 7 7 6 6 16 sixteen 7 7 6 6 16 sixteen 6 6 7 7 16 sixteen 8 eight 5 5 16 sixteen 5 5 8 eight 16 sixteen 9 nine 4 4 16 sixteen 4 4 9 nine 16 sixteen 10 ten 3 3 16 sixteen 3 3 10 ten 16 sixteen И And 2 2 16 sixteen 2 2 11 eleven 16 sixteen 12 12 1 one 16 sixteen 1 one 12 12 16 sixteen 1 one 12 12 15 fifteen 12 12 1 one 15 fifteen 2 2 11 eleven 15 fifteen 11 eleven 2 2 15 fifteen 3 3 10 ten 15 fifteen 10 ten 3 3 15 fifteen 4 4 9 nine 15 fifteen 9 nine 4 4 15 fifteen 5 5 8 eight 15 fifteen 8 eight 5 5 15 fifteen 6 6 7 7 15 fifteen 7 7 6 6 15 fifteen 7 7 6 6 15 fifteen 6 6 7 7 15 fifteen 8 eight 5 5 15 fifteen 5 5 8 eight 15 fifteen 9 nine 4 4 15 fifteen 4 4 9 nine 15 fifteen 10 ten 3 3 15 fifteen 3 3 10 ten 15 fifteen И And 2 2 15 fifteen 2 2 11 eleven 15 fifteen 12 12 1 one 15 fifteen 1 one 12 12 15 fifteen 1 one 12 12 14 fourteen 12 12 1 one 14 fourteen 2 2 11 eleven 14 fourteen 11 eleven 2 2 14 fourteen 3 3 10 ten 14 fourteen 10 ten 3 3 14 fourteen 4 4 9 nine 14 fourteen 9 nine 4 4 14 fourteen 5 5 8 eight 14 fourteen 8 eight 5 5 14 fourteen 6 6 7 7 14 fourteen 7 7 6 6 14 fourteen 7 7 6 6 14 fourteen 6 6 7 7 14 fourteen 8 eight 5 5 14 fourteen 5 5 8 eight 14 fourteen 9 nine 4 4 14 fourteen 4 4 9 nine 14 fourteen

-43 039892-43 039892

10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 fourteen fourteen fourteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 eleven eleven eleven eleven 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 fourteen fourteen fourteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 eleven eleven eleven eleven 5 5 8 eight 11 eleven 8 eight 5 5 11 eleven 6 6 7 7 11 eleven 7 7 6 6 11 eleven 7 7 6 6 11 eleven 6 6 7 7 11 eleven 8 eight 5 5 11 eleven 5 5 8 eight 11 eleven 9 nine 4 4 11 eleven 4 4 9 nine 11 eleven

- 44 039892- 44 039892

10 11 12 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ten eleven 12 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine 3 2 1 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 one one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 eleven eleven eleven ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine eight eight eight eight eight eight eight eight eight — — 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten 11 11 11 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 eleven eleven eleven ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine eight eight eight eight eight eight eight eight eight 10 ten 3 3 8 eight 2 2 11 eleven 8 eight И And 2 2 8 eight 1 one 12 12 8 eight 12 12 1 one 8 eight 12 12 1 one 8 eight

- 45 039892- 45 039892

Таблица 9Table 9

Р R , ₀ Wp Uq, ₀ Wp Uq m m η η Р R q q m m η η P P q q 1 one 12 12 8 eight 8 eight 12 12 1 one 8 eight 8 eight 2 2 11 eleven 8 eight 8 eight 11 eleven 2 2 8 eight 8 eight 3 3 10 ten 8 eight 8 eight 10 ten 3 3 8 eight 8 eight 4 4 9 nine 8 eight 8 eight 9 nine 4 4 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 6 6 7 7 8 eight 8 eight 7 7 6 6 8 eight 8 eight 7 7 6 6 8 eight 8 eight 6 6 7 7 8 eight 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 8 eight 9 nine 4 4 8 eight 8 eight 4 4 9 nine 8 eight 8 eight 10 ten 3 3 8 eight 8 eight 3 3 10 ten 8 eight 8 eight 11 eleven 2 2 8 eight 8 eight 2 2 11 eleven 8 eight 8 eight 12 12 1 one 8 eight 8 eight 1 one 12 12 8 eight 8 eight 1 one 12 12 9 nine 7 7 12 12 1 one 9 nine 7 7 2 2 11 eleven 9 nine 7 7 11 eleven 2 2 9 nine 7 7 3 3 10 ten 9 nine 7 7 10 ten 3 3 9 nine 7 7 4 4 9 nine 9 nine 7 7 9 nine 4 4 9 nine 7 7 5 5 8 eight 9 nine 7 7 8 eight 5 5 9 nine 7 7 6 6 7 7 9 nine 7 7 7 7 6 6 9 nine 7 7 7 7 6 6 9 nine 7 7 6 6 7 7 9 nine 7 7 8 eight 5 5 9 nine 7 7 5 5 8 eight 9 nine 7 7 9 nine 4 4 9 nine 7 7 4 4 9 nine 9 nine 7 7 10 ten 3 3 9 nine 7 7 3 3 10 ten 9 nine 7 7 11 eleven 2 2 9 nine 7 7 2 2 11 eleven 9 nine 7 7 12 12 1 one 9 nine 7 7 1 one 12 12 9 nine 7 7 1 one 12 12 10 ten 6 6 12 12 1 one 10 ten 6 6 2 2 11 eleven 10 ten 6 6 11 eleven 2 2 10 ten 6 6

- 46 039892- 46 039892

3 3 10 ten 10 ten 6 6 10 ten 3 3 10 ten 6 6 4 4 9 nine 10 ten 6 6 9 nine 4 4 10 ten 6 6 5 5 8 eight 10 ten 6 6 8 eight 5 5 10 ten 6 6 6 6 7 7 10 ten 6 6 7 7 6 6 10 ten 6 6 7 7 6 6 10 ten 6 6 6 6 7 7 10 ten 6 6 8 eight 5 5 10 ten 6 6 5 5 8 eight 10 ten 6 6 9 nine 4 4 10 ten 6 6 4 4 9 nine 10 ten 6 6 10 ten 3 3 10 ten 6 6 3 3 10 ten 10 ten 6 6 11 eleven 2 2 10 ten 6 6 2 2 11 eleven 10 ten 6 6 12 12 1 one 10 ten 6 6 1 one 12 12 10 ten 6 6 1 one 12 12 11 eleven 5 5 12 12 1 one 11 eleven 5 5 2 2 11 eleven 11 eleven 5 5 11 eleven 2 2 11 eleven 5 5 3 3 10 ten 11 eleven 5 5 10 ten 3 3 11 eleven 5 5 4 4 9 nine 11 eleven 5 5 9 nine 4 4 11 eleven 5 5 5 5 8 eight 11 eleven 5 5 8 eight 5 5 11 eleven 5 5 6 6 7 7 11 eleven 5 5 7 7 6 6 11 eleven 5 5 7 7 6 6 11 eleven 5 5 6 6 7 7 11 eleven 5 5 8 eight 5 5 11 eleven 5 5 5 5 8 eight 11 eleven 5 5 9 nine 4 4 11 eleven 5 5 4 4 9 nine 11 eleven 5 5 10 ten 3 3 11 eleven 5 5 3 3 10 ten 11 eleven 5 5 11 eleven 2 2 11 eleven 5 5 2 2 11 eleven 11 eleven 5 5 12 12 1 one 11 eleven 5 5 1 one 12 12 11 eleven 5 5 1 one 12 12 12 12 4 4 12 12 1 one 12 12 4 4 2 2 11 eleven 12 12 4 4 11 eleven 2 2 12 12 4 4 3 3 10 ten 12 12 4 4 10 ten 3 3 12 12 4 4 4 4 9 nine 12 12 4 4 9 nine 4 4 12 12 4 4 5 5 8 eight 12 12 4 4 8 eight 5 5 12 12 4 4 6 6 7 7 12 12 4 4 7 7 6 6 12 12 4 4 7 7 6 6 12 12 4 4 6 6 7 7 12 12 4 4 8 eight 5 5 12 12 4 4 5 5 8 eight 12 12 4 4 9 nine 4 4 12 12 4 4 4 4 9 nine 12 12 4 4 10 ten 3 3 12 12 4 4 3 3 10 ten 12 12 4 4 11 eleven 2 2 12 12 4 4 2 2 11 eleven 12 12 4 4 12 12 1 one 12 12 4 4 1 one 12 12 12 12 4 4 1 one 12 12 13 thirteen 3 3 12 12 1 one 13 thirteen 3 3 2 2 11 eleven 13 thirteen 3 3 11 eleven 2 2 13 thirteen 3 3

-47039892-47039892

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 7 7 7 7 7 7 7 7 7 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 nine nine nine nine nine nine nine nine nine 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 7 7 7 7 7 7 7 7 7 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen fourteen 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 nine nine nine nine nine nine nine nine nine 10 ten 3 3 7 7 9 nine 3 3 10 ten 7 7 9 nine 11 eleven 2 2 7 7 9 nine 2 2 11 eleven 7 7 9 nine 12 12 1 one 7 7 9 nine 1 one 12 12 7 7 9 nine 12 12 1 one 6 6 10 ten 12 12 1 one 6 6 10 ten 1 one 12 12 6 6 10 ten 11 eleven 2 2 6 6 10 ten

- 48 039892- 48 039892

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 И 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten eleven eleven And eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 И 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten ten eleven eleven And eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 8 eight 5 5 4 4 12 12 4 4 9 nine 4 4 12 12 9 nine 4 4 4 4 12 12 3 3 10 ten 4 4 12 12 10 ten 3 3 4 4 12 12 2 2 11 eleven 4 4 12 12 11 eleven 2 2 4 4 12 12 1 one 12 12 4 4 12 12 12 12 1 one 4 4 12 12 12 12 1 one 4 4 12 12

- 49 039892- 49 039892

Таблица 10Table 10

Р R о about m m η η Р R m m η η Р R 1 one 12 12 18 eighteen 12 12 1 one 18 eighteen 2 2 11 eleven 18 eighteen 11 eleven 2 2 18 eighteen 3 3 10 ten 18 eighteen 10 ten 3 3 18 eighteen 4 4 9 nine 18 eighteen 9 nine 4 4 18 eighteen 5 5 8 eight 18 eighteen 8 eight 5 5 18 eighteen 6 6 7 7 18 eighteen 7 7 6 6 18 eighteen 7 7 6 6 18 eighteen 6 6 7 7 18 eighteen 8 eight 5 5 18 eighteen 5 5 8 eight 18 eighteen 9 nine 4 4 18 eighteen 4 4 9 nine 18 eighteen 10 ten 3 3 18 eighteen 3 3 10 ten 18 eighteen И And 2 2 18 eighteen 2 2 И And 18 eighteen 12 12 1 one 18 eighteen 1 one 12 12 18 eighteen 1 one 12 12 17 17 12 12 1 one 17 17 2 2 11 eleven 17 17 11 eleven 2 2 17 17 3 3 10 ten 17 17 10 ten 3 3 17 17 4 4 9 nine 17 17 9 nine 4 4 17 17 5 5 8 eight 17 17 8 eight 5 5 17 17 6 6 7 7 17 17 7 7 6 6 17 17 7 7 6 6 17 17 6 6 7 7 17 17 8 eight 5 5 17 17 5 5 8 eight 17 17 9 nine 4 4 17 17 4 4 9 nine 17 17 10 ten 3 3 17 17 3 3 10 ten 17 17 11 eleven 2 2 17 17 2 2 11 eleven 17 17 12 12 1 one 17 17 1 one 12 12 17 17 1 one 12 12 16 sixteen 12 12 1 one 16 sixteen 2 2 11 eleven 16 sixteen 11 eleven 2 2 16 sixteen 3 3 10 ten 16 sixteen 10 ten 3 3 16 sixteen 4 4 9 nine 16 sixteen 9 nine 4 4 16 sixteen 5 5 8 eight 16 sixteen 8 eight 5 5 16 sixteen 6 6 7 7 16 sixteen 7 7 6 6 16 sixteen

-50039892-50039892

7 7 6 6 16 sixteen 6 6 7 7 16 sixteen 8 eight 5 5 16 sixteen 5 5 8 eight 16 sixteen 9 nine 4 4 16 sixteen 4 4 9 nine 16 sixteen 10 ten 3 3 16 sixteen 3 3 10 ten 16 sixteen И And 2 2 16 sixteen 2 2 11 eleven 16 sixteen 12 12 1 one 16 sixteen 1 one 12 12 16 sixteen 1 one 12 12 15 fifteen 12 12 1 one 15 fifteen 2 2 11 eleven 15 fifteen 11 eleven 2 2 15 fifteen 3 3 10 ten 15 fifteen 10 ten 3 3 15 fifteen 4 4 9 nine 15 fifteen 9 nine 4 4 15 fifteen 5 5 8 eight 15 fifteen 8 eight 5 5 15 fifteen 6 6 7 7 15 fifteen 7 7 6 6 15 fifteen 7 7 6 6 15 fifteen 6 6 7 7 15 fifteen 8 eight 5 5 15 fifteen 5 5 8 eight 15 fifteen 9 nine 4 4 15 fifteen 4 4 9 nine 15 fifteen 10 ten 3 3 15 fifteen 3 3 10 ten 15 fifteen И And 2 2 15 fifteen 2 2 11 eleven 15 fifteen 12 12 1 one 15 fifteen 1 one 12 12 15 fifteen 1 one 12 12 14 fourteen 12 12 1 one 14 fourteen 2 2 11 eleven 14 fourteen 11 eleven 2 2 14 fourteen 3 3 10 ten 14 fourteen 10 ten 3 3 14 fourteen 4 4 9 nine 14 fourteen 9 nine 4 4 14 fourteen 5 5 8 eight 14 fourteen 8 eight 5 5 14 fourteen 6 6 7 7 14 fourteen 7 7 6 6 14 fourteen 7 7 6 6 14 fourteen 6 6 7 7 14 fourteen 8 eight 5 5 14 fourteen 5 5 8 eight 14 fourteen 9 nine 4 4 14 fourteen 4 4 9 nine 14 fourteen 10 ten 3 3 14 fourteen 3 3 10 ten 14 fourteen И And 2 2 14 fourteen 2 2 11 eleven 14 fourteen 12 12 1 one 14 fourteen 1 one 12 12 14 fourteen 1 one 12 12 13 thirteen 12 12 1 one 13 thirteen 2 2 11 eleven 13 thirteen 11 eleven 2 2 13 thirteen 3 3 10 ten 13 thirteen 10 ten 3 3 13 thirteen 4 4 9 nine 13 thirteen 9 nine 4 4 13 thirteen 5 5 8 eight 13 thirteen 8 eight 5 5 13 thirteen 6 6 7 7 13 thirteen 7 7 6 6 13 thirteen

-51 039892-51 039892

7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 12 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one one 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven ten 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven ten 1 one 12 12 10 ten 11 eleven 2 2 10 ten 2 2 11 eleven 10 ten 10 ten 3 3 10 ten 3 3 10 ten 10 ten 9 nine 4 4 10 ten 4 4 9 nine 10 ten 8 eight 5 5 10 ten 5 5 8 eight 10 ten 7 7 6 6 10 ten

- 52 039892- 52 039892

6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 ten ten ten ten ten ten ten nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine eight eight eight eight eight eight 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 8 ten ten ten ten ten ten ten nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine eight eight eight eight eight eight 7 7 6 6 8 eight 5 5 8 eight 8 eight 8 eight 5 5 8 eight 4 4 9 nine 8 eight 9 nine 4 4 8 eight 3 3 10 ten 8 eight 10 ten 3 3 8 eight 2 2 11 eleven 8 eight 11 eleven 2 2 8 eight 1 one 12 12 8 eight 12 12 1 one 8 eight 12 12 1 one 8 eight

Таблица 11Table 11

^zp ^zp 1 0 0 % \/q 100 %\/q

- 53 039892- 53 039892

m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 m one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 η 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 η 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 Ρ 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 P 8 eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine ten ten ten ten ten ten q 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 q eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 m 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 m 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 η 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 η one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 Ρ 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 P 8 eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine nine ten ten ten ten ten ten q 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 q eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight eight 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 7 7 6 6 10 ten 6 6 6 6 7 7 10 ten 6 6 8 eight 5 5 10 ten 6 6 5 5 8 eight 10 ten 6 6 9 nine 4 4 10 ten 6 6 4 4 9 nine 10 ten 6 6 10 ten 3 3 10 ten 6 6 3 3 10 ten 10 ten 6 6 11 eleven 2 2 10 ten 6 6 2 2 11 eleven 10 ten 6 6

- 54 039892- 54 039892

12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 ten eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 ten eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen thirteen 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 7 7 6 6 13 thirteen 3 3 6 6 7 7 13 thirteen 3 3 8 eight 5 5 13 thirteen 3 3 5 5 8 eight 13 thirteen 3 3 9 nine 4 4 13 thirteen 3 3 4 4 9 nine 13 thirteen 3 3 10 ten 3 3 13 thirteen 3 3 3 3 10 ten 13 thirteen 3 3 11 eleven 2 2 13 thirteen 3 3 2 2 11 eleven 13 thirteen 3 3

- 55 039892- 55 039892

12 12 1 one 13 thirteen 3 3 1 one 12 12 13 thirteen 3 3 1 one 12 12 14 fourteen 2 2 12 12 1 one 14 fourteen 2 2 2 2 11 eleven 14 fourteen 2 2 11 eleven 2 2 14 fourteen 2 2 3 3 10 ten 14 fourteen 2 2 10 ten 3 3 14 fourteen 2 2 4 4 9 nine 14 fourteen 2 2 9 nine 4 4 14 fourteen 2 2 5 5 8 eight 14 fourteen 2 2 8 eight 5 5 14 fourteen 2 2 6 6 7 7 14 fourteen 2 2 7 7 6 6 14 fourteen 2 2 7 7 6 6 14 fourteen 2 2 6 6 7 7 14 fourteen 2 2 8 eight 5 5 14 fourteen 2 2 5 5 8 eight 14 fourteen 2 2 9 nine 4 4 14 fourteen 2 2 4 4 9 nine 14 fourteen 2 2 10 ten 3 3 14 fourteen 2 2 3 3 10 ten 14 fourteen 2 2 11 eleven 2 2 14 fourteen 2 2 2 2 11 eleven 14 fourteen 2 2 12 12 1 one 14 fourteen 2 2 1 one 12 12 14 fourteen 2 2 1 one 12 12 7 7 9 nine 12 12 1 one 7 7 9 nine 2 2 11 eleven 7 7 9 nine 11 eleven 2 2 7 7 9 nine 3 3 10 ten 7 7 9 nine 10 ten 3 3 7 7 9 nine 4 4 9 nine 7 7 9 nine 9 nine 4 4 7 7 9 nine 5 5 8 eight 7 7 9 nine 8 eight 5 5 7 7 9 nine 6 6 7 7 7 7 9 nine 7 7 6 6 7 7 9 nine 7 7 6 6 7 7 9 nine 6 6 7 7 7 7 9 nine 8 eight 5 5 7 7 9 nine 5 5 8 eight 7 7 9 nine 9 nine 4 4 7 7 9 nine 4 4 9 nine 7 7 9 nine 10 ten 3 3 7 7 9 nine 3 3 10 ten 7 7 9 nine 11 eleven 2 2 7 7 9 nine 2 2 11 eleven 7 7 9 nine 12 12 1 one 7 7 9 nine 1 one 12 12 7 7 9 nine 12 12 1 one 6 6 10 ten 12 12 1 one 6 6 10 ten 1 one 12 12 6 6 10 ten 11 eleven 2 2 6 6 10 ten 2 2 11 eleven 6 6 10 ten 10 ten 3 3 6 6 10 ten 3 3 10 ten 6 6 10 ten 9 nine 4 4 6 6 10 ten 4 4 9 nine 6 6 10 ten 8 eight 5 5 6 6 10 ten 5 5 8 eight 6 6 10 ten 7 7 6 6 6 6 10 ten 6 6 7 7 6 6 10 ten 6 6 7 7 6 6 10 ten 7 7 6 6 6 6 10 ten 5 5 8 eight 6 6 10 ten 8 eight 5 5 6 6 10 ten 4 4 9 nine 6 6 10 ten 9 nine 4 4 6 6 10 ten 3 3 10 ten 6 6 10 ten 10 ten 3 3 6 6 10 ten 2 2 11 eleven 6 6 10 ten

-56039892-56039892

11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 ten ten eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 11 10 9 8 7 6 5 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 4 3 2 one 12 eleven ten nine eight 7 6 5 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 12 one 2 3 4 5 6 7 eight nine ten eleven 12 one 2 3 4 5 6 7 eight 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 10 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 ten ten eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven eleven 12 12 12 12 12 12 12 8 eight 5 5 4 4 12 12 4 4 9 nine 4 4 12 12 9 nine 4 4 4 4 12 12 3 3 10 ten 4 4 12 12 10 ten 3 3 4 4 12 12 2 2 11 eleven 4 4 12 12 11 eleven 2 2 4 4 12 12 1 one 12 12 4 4 12 12 12 12 1 one 4 4 12 12 12 12 1 one 4 4 12 12

Таблица 12Table 12

\ ⁰ N YY J/ Vim ° Am ^н \ ⁰ N YY J/ Vim ° Am ⁿ о about ш w η η m m η η 1 one 12 12 12 12 1 one 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 10 ten 3 3 4 4 9 nine 9 nine 4 4

- 57 039892- 57 039892

- 58 039892- 58 039892

Таблица 13Table 13

⁰ ₀ ¢¢^0¾ rTW JCA А X J ⁰ ₀ ¢¢^0¾ rTW JCA A XJ \ 0 Ξ 1 I 0 1 \J^ __0А ι N Yim Vr?¹⁴ ГрД °—Q 1 1 1/ Ч/'⁴'—\ 0 Ξ 1 I 0 1 \J^ __0А ι N Yim Vr? ¹⁴ GrD °—Q 1 1 1/ H/' ⁴ '— m m η η m m n n 1 one 12 12 12 12 1 one 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 10 ten 3 3 4 4 9 nine 9 nine 4 4 5 5 8 eight 8 eight 5 5 6 6 7 7 7 7 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7 8 eight 5 5 5 5 8 eight 9 nine 4 4 4 4 9 nine 10 ten 3 3 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 12 12 1 one 1 one 12 12 I 0 У 0 А„А A X 3 I 0 Y 0 A „A A X 3 ιν-н Y\Jⁿ I \ ⁰ Λ = 1 । 9 X X X^^^ ^0—\ IA XX --0*^/4/ιν-н Y\J ⁿ I \ ⁰ Λ = 1 । 9 XXX^^^ ^0— \ IA XX --0*^/4/ 1 one 12 12 12 12 1 one 2 2 11 eleven 11 eleven 2 2 3 3 10 ten 10 ten 3 3 4 4 9 nine 9 nine 4 4 5 5 8 eight 8 eight 5 5 6 6 7 7 7 7 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7 8 eight 5 5 5 5 8 eight 9 nine 4 4 4 4 9 nine 10 ten 3 3 3 3 10 ten 11 eleven 2 2 2 2 11 eleven 12 12 1 one 1 one 12 12

Следующие соединения могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов в синтезе катионных липидов в соответствии с настоящим изобретением.The following compounds can be used as intermediates in the synthesis of cationic lipids in accordance with the present invention.

-59039892-59039892

Таблица 14Table 14

В одном варианте воплощения катионный липид настоящего изобретения выбран из следующих соединений и их солей (в том числе фармацевтически приемлемых солей):In one embodiment, the cationic lipid of the present invention is selected from the following compounds and their salts (including pharmaceutically acceptable salts):

ОO

Соединение 1Compound 1

Соединение 3Compound 3

Катионные липиды включают те, которые имеют альтернативные группы жирных кислот и другие диалкиламино группы, в том числе те, в которых алкильные заместители различны (например, N-этилN-метиламино-, N-пропил-N-этиламино- и т.п.). Для тех вариантов воплощения, в которых R¹ и R² являются длинными цепями алкил, алкенил, алкинил или циклоалкилалкил групп, они могут быть одинаковыми или разными. В общем, липиды (например, катионный липид), имеющие менее насыщенные ацильные цепи меньшего размера, особенно когда комплексы размером меньше примерно 0,3 мкм, для целей фильтровой стерилизации. Катионные липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от Сю до C₂₀, являются типичными. Другие структурные компо- 60 039892 ненты также могут быть использованы для разделения аминокислотной группы (например, аминогруппы катионных липидов) и жирные кислоты или жирные алкильные части катионных липидов. Подходящие структуры известны специалистам в данной области.Cationic lipids include those having alternative fatty acid groups and other dialkylamino groups, including those in which the alkyl substituents are different (e.g., N-ethylN-methylamino-, N-propyl-N-ethylamino, etc.) . For those embodiments in which R ¹ and R ² are long chain alkyl, alkenyl, alkynyl, or cycloalkylalkyl groups, they may be the same or different. In general, lipids (eg, a cationic lipid) having smaller, less saturated acyl chains, especially when the complexes are less than about 0.3 microns, for filter sterilization purposes. Cationic lipids containing unsaturated fatty acids with a carbon chain length in the range from Cu to C ₂₀ are typical. Other structural components can also be used to separate the amino acid group (eg, the amino group of cationic lipids) and the fatty acids or fatty alkyl moieties of cationic lipids. Suitable structures are known to those skilled in the art.

В некоторых вариантах воплощения катионные липиды имеют по меньшей мере одну протонированную или депротонированную группу, такие, что липид положительно заряжен при pH на уровне или ниже физиологического pH (например, pH 7,4), и нейтральный при втором pH, предпочтительно на уровне или выше физиологических значения pH. Такие липиды также называют катионными липидами. Конечно, следует понимать, что добавление или удаление протонов в зависимости от pH равновесного процесса и что ссылка на заряженные или нейтральные липиды относится к характеру преобладающего вида и не требует, чтобы все липиды находились в заряженной или нейтральной форме. Липид может иметь более одной протонированной или депротонированной группы или может быть цвиттерионом.In some embodiments, cationic lipids have at least one protonated or deprotonated group, such that the lipid is positively charged at or below physiological pH (e.g., pH 7.4), and neutral at a second pH, preferably at or above physiological pH values. Such lipids are also referred to as cationic lipids. Of course, it should be understood that the addition or removal of protons is dependent on the pH of the equilibrium process and that reference to charged or neutral lipids refers to the nature of the predominant species and does not require all lipids to be in charged or neutral form. The lipid may have more than one protonated or deprotonated group, or may be a zwitterion.

В некоторых вариантах воплощения протонированные липиды (например, катионные липиды) имеют рК_а протонированной группы в диапазоне от 4 до 11. Как правило, липиды будет иметь рК_апримерно от 4 до 7, например, между 5 и 7, например, между примерно 5,5 и 6,8, при введении в липидные частицы. Такие липиды будут катионными при более низких значениях pH, в то время как частицы будут в значительной степени (хотя и не полностью) поверхностно нейтрализованы при физиологическом pH около pH 7,4. Одним из преимуществ рК_а в диапазоне между 4 и 7 является то, что по меньшей мере некоторые нуклеиновые кислоты, связанные с внешней поверхностью частиц, будут терять свое электростатическое взаимодействие при физиологическом pH и будут удалены простым диализом, таким образом значительно уменьшая восприимчивость частиц к выведению. Измерение рК_алипидов в липидных частицах может быть выполнено, например, с помощью флуоресцентного зонда 2(p-толуuдино)-6-нафталин сульфокислоты (TNS), с использованием способов, описанных в Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40, 127-144, который включен в качестве ссылки в полном объеме.In some embodiments, protonated lipids (e.g., cationic lipids) have a pKa of _the protonated group in the range of 4 to 11. Typically, lipids will have _a pKa of about 4 to 7, such as between 5 and 7, such as between about 5 .5 and 6.8 when introduced into lipid particles. Such lipids will be cationic at lower pH values, while the particles will be largely (though not completely) surface-neutralized at physiological pH around pH 7.4. One advantage of _a pKa in the range between 4 and 7 is that at least some of the nucleic acids bound to the outer surface of the particles will lose their electrostatic interaction at physiological pH and be removed by simple dialysis, thus greatly reducing the susceptibility of the particles to excretion. . Measurement of _the pKa of lipids in lipid particles can be performed, for example, with a fluorescent probe 2(p-toluudino)-6-naphthalene sulfonic acid (TNS), using the methods described in Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40 , 127-144, which is incorporated by reference in its entirety.

В конкретных вариантах воплощения липиды являются заряженными липидами. Как здесь используется, термин заряженный липид означает включение этих липидов, имеющих одну или две жирные ацильные или жирные алкильные цепи и четвертичные аминоголовные группы. Четвертичные амины обеспечивают постоянный положительный заряд. Головная группа может по желанию включать ионизируемые группы, такие как первичный, вторичный или третичный амин, которые могут быть протонированы при физиологическом значении pH. Наличие четвертичных аминов может изменить рК_аионизируемые группы по отношению к рК_а группы в структурно подобных соединениях, где не хватает четвертичных аминов (например, четвертичный амин заменен на третичный амин). В некоторых вариантах воплощения заряженный липид называют амино липидом. См., например, предварительную заявку на патент США 61/267 419, поданную 7 декабря 2009 года, которая включена в качестве ссылки в полном объеме.In specific embodiments, the lipids are charged lipids. As used herein, the term charged lipid means the inclusion of those lipids having one or two fatty acyl or fatty alkyl chains and quaternary amino head groups. Quaternary amines provide a permanent positive charge. The head group may optionally include ionizable groups such as a primary, secondary or tertiary amine, which can be protonated at physiological pH. The presence of quaternary amines can change _the pKa of ionizable groups relative to _the pKa of groups in structurally similar compounds where quaternary amines are deficient (eg a quaternary amine is replaced by a tertiary amine). In some embodiments, the charged lipid is referred to as an amino lipid. See, for example, US Provisional Application 61/267,419, filed December 7, 2009, which is incorporated by reference in its entirety.

Один или несколько дополнительных катионных липидов, которые несут в себе положительный заряд примерно в физиологическом значении pH, в дополнение к тем, которые описаны выше, могут быть также включены в липидные частицы и композиции, описанные здесь. Такие катионные липиды включают, но не ограничиваются этим, N,N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид (DODAC); N-(2,3диолеилокси)пропил-N,N-N-триэтиламмонuя хлорид (DOTMA), N,N-дистеарил-N,N-диметиламмоний бромид (DDAB), N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTAP); 1,2диолеилокси-3-триметиламинопропан хлорида соль (DOTAP.Cl); 3β-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин (DC-Chol), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-2-(сперминекарбоксамидо)этил-N,N-диметиламмоний трифторацетат (DOSPA), диоктадециламидоглицил карбоксиспермин (DOGS), 1,2-дuолеоил-sn-3 фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA) и N-(1,2-димиристилоксипроп-3ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтил бромид (DMRTE). Кроме того, ряд коммерческих препаратов катионных липидов могут быть использованы, такие как, например, LIPOFECTIN (в том числе DOTMA и DOPE, доступные от GIBCO/BRL) и LIPOFECTAMINE (включая DOSPA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL). В конкретных вариантах воплощений катионный липид является аминолипидом.One or more additional cationic lipids that carry a positive charge at about physiological pH, in addition to those described above, may also be included in the lipid particles and compositions described herein. Such cationic lipids include, but are not limited to, N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC); N-(2,3dioleyloxy)propyl-N,N-N-triethylammonium chloride (DOTMA), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N ,N-trimethylammonium chloride (DOTAP); 1,2dioleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt (DOTAP.Cl); 3β-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol (DC-Chol), N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N-2-(sperminecarboxamido)ethyl-N,N -dimethylammonium trifluoroacetate (DOSPA), dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine (DOGS), 1,2-duoleoyl-sn-3 phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane (DODAP), N,N-dimethyl-2,3 -dioleyloxy)propylamine (DODMA); and N-(1,2-dimyristyloxyprop-3yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl bromide (DMRTE). In addition, a number of commercial cationic lipid preparations can be used, such as, for example, LIPOFECTIN (including DOTMA and DOPE available from GIBCO/BRL) and LIPOFECTAMINE (including DOSPA and DOPE available from GIBCO/BRL). In specific embodiments, the cationic lipid is an amino lipid.

Нейтральный липидNeutral lipid

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут также включать один или больше нейтральных липидов. Нейтральные липиды, когда они присутствуют, могут быть любыми из ряда видов липидов, которые существуют либо в незаряженной или нейтральной цвиттерионной формах при физиологическом значении pH. Такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, керамиды, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, цефалин и цереброзиды. При выборе нейтральных липидов для использования в частицах, описанных здесь, как правило, руководствуются путем рассмотрения, например, размера липосомы и стабильности липосом в кровотоке. Предпочтительно, нейтральный липидный компонент представляет собой липид с двумя ацильными группами (т.е. диацилфосфатидилхолин и диацилфосфатидилэтаноламин). Липиды, имеющие различные ацильные группы с цепями разной длины и степени насыщенности имеются или могут быть выделены или синтезированы известными методами. В одной группе вариантов воплощения липиды, содержащие насыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от C₁₀ до C₂₀, являютсяThe lipid particles and compositions described herein may also include one or more neutral lipids. Neutral lipids, when present, can be any of a number of lipid species that exist in either uncharged or neutral zwitterionic forms at physiological pH. Such lipids include, for example, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, ceramides, sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, cephalin, and cerebrosides. The selection of neutral lipids for use in the particles described herein is generally guided by consideration of, for example, the size of the liposome and the stability of the liposomes in the circulation. Preferably, the neutral lipid component is a lipid with two acyl groups (ie, diacylphosphatidylcholine and diacylphosphatidylethanolamine). Lipids having different acyl groups with different chain lengths and degrees of saturation exist or can be isolated or synthesized by known methods. In one group of embodiments, lipids containing saturated fatty acids with a carbon chain length in the range of C ₁₀ to C ₂₀ are

- 61 039892 предпочтительными. В другой группе вариантов воплощения липиды с моно или диненасыщенными жирными кислотами с длиной углеродной цепи в диапазоне от Сю до C₂₀ используются. Кроме того, липиды, имеющих смесь цепей насыщенных и ненасыщенных жирных кислот могут быть использованы. Предпочтительно, нейтральными липидами, которые используются, являются DOPE, DSPC, POPC, DPPC или любые связанные с фосфатидилхолином. Нейтральные липиды также могут состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипиды с другими головными группами, такими как серин и инозит.- 61 039892 preferred. In another group of embodiments, lipids with mono or diunsaturated fatty acids with a carbon chain length in the range of Cu to C ₂₀ are used. In addition, lipids having a mixture of saturated and unsaturated fatty acid chains can be used. Preferably, the neutral lipids that are used are DOPE, DSPC, POPC, DPPC, or any associated with phosphatidylcholine. Neutral lipids can also be composed of sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, or phospholipids with other head groups such as serine and inositol.

Липиды, способные уменьшить агрегациюLipids capable of reducing aggregation

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут также включать один или больше липидов, способных уменьшить агрегацию. Примеры липидов, которые снижают агрегацию частиц при формировании, включают полиэтиленгликоль (PEG)-модифицированные жиры, моносиалоганглиозид Gm1 и олигомеры полиамида (PAO), такие как (описано в патенте США № 6320017, который включен в качестве ссылки в полном объеме). Другие соединения с незаряженными, гидрофильными, стерическими фрагментами барьеров, которые препятствуют агрегации во время подбора состава, как PEG, Gm1 или ATTA, также могут быть связаны с липидами. ATTA липиды описаны, например, в патенте США № 6320017, и конъюгаты PEG липидов, описаны, например, в патентах США № 5820873, № 5534499 и № 5885613, каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме. Как правило, концентрация липидного компонента, выбранного для уменьшения агрегации, составляет от около 1 до 15% (по мольным процентам липидов).The lipid particles and compositions described herein may also include one or more lipids capable of reducing aggregation. Examples of lipids that reduce particle aggregation upon formation include polyethylene glycol (PEG)-modified fats, Gm1 monosialoganglioside, and polyamide (PAO) oligomers such as (described in US Pat. No. 6,320,017, which is incorporated by reference in its entirety). Other compounds with uncharged, hydrophilic, steric barrier moieties that prevent aggregation during formulation, such as PEG, Gm1 or ATTA, may also be associated with lipids. ATTA lipids are described in, for example, US Pat. No. 6,320,017, and PEG lipid conjugates are described in, for example, US Pat. Typically, the concentration of the lipid component selected to reduce aggregation is from about 1% to 15% (mole percent lipid).

Конкретные примеры PEG модифицированных липидов (или липидных конъюгатов полиоксиэтилена), которые могут иметь различные якорные липидные части, чтобы обеспечить PEG части на поверхности липидных везикул, включают PEG модифицированный фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, керамиды PEG конъюгатов (например, PEG-CerC14 или PEG-CerC20), которые описаны в патенте США № 5820873, который включен сюда в качестве ссылки, PEG модифицированные диалкиламины и PEG модифицированные 1,2-диацилоксипропан-3-амины. Особенно предпочтительными являются PEG модификации диацилглицеринов и диалкилглицеринов.Specific examples of PEG modified lipids (or polyoxyethylene lipid conjugates) that can have different lipid anchor moieties to provide PEG moieties on the surface of lipid vesicles include PEG modified phosphatidylethanolamine and phosphatidic acid, PEG conjugate ceramides (e.g. PEG-CerC14 or PEG-CerC20 ), which are described in US Pat. Particularly preferred are PEG modifications of diacylglycerols and dialkylglycerols.

В вариантах воплощения, где пространственно большой фрагмент, такой как PEG или ATTA, сопряжены с липидным якорем, выбор липидного якоря зависит от того, какой тип ассоциации конъюгат должен иметь с липидной частицей. Хорошо известно, что mPEG (mw2000)диастиароилфосфатидилэтаноламин (PEG-DSPE) останется связанным с липосомами, пока частицы экскретируются, возможно, несколько дней. Другие конъюгаты, такие как PEG-CerC20 имеют аналогичное время устойчивости. PEG CerC14, однако, быстро обменивается из созданного состава при воздействии сыворотки, с T_1/2 менее чем 60 мин в некоторых анализах. Как показано в патенте США № 5820873, по меньшей мере, три характеристики влияют на скорость обмена: длина ацильной цепи, насыщенность ацильной цепи и размер стерически-барьерной головной группы. Соединения, имеющие подходящие варианты этих функций, могут быть полезными. Для некоторых терапевтических применений могут быть предпочтительными PEG модифицированные липиды, которые быстро выводятся из частицы липидов с нуклеиновыми кислотами in vivo и, следовательно, модифицированные липиды будут обладать относительно коротким липидным якорем. В других терапевтических применениях может быть предпочтительным для частиц липидов с нуклеиновыми кислотами проявление более длительного срока службы в плазменном кровообращении и, следовательно, PEG модифицированные липиды будут обладать относительно более длинными липидными якорями.In embodiments where a sterically large moiety, such as PEG or ATTA, is coupled to a lipid anchor, the choice of lipid anchor depends on what type of association the conjugate is to have with the lipid particle. It is well known that mPEG (mw2000)diastyaroylphosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) will remain bound to liposomes as long as the particles are excreted, possibly for several days. Other conjugates such as PEG-CerC20 have similar stability times. PEG CerC14, however, is rapidly exchanged from the formulated formulation upon serum exposure, with a T _1/2 of less than 60 min in some assays. As shown in US Pat. No. 5,820,873, at least three characteristics affect the exchange rate: acyl chain length, acyl chain saturation, and steric barrier head group size. Compounds having suitable variants of these functions may be useful. For some therapeutic applications, PEG-modified lipids that are rapidly cleared from the nucleic acid lipid particle in vivo may be preferred, and therefore the modified lipids will have a relatively short lipid anchor. In other therapeutic applications, it may be preferable for nucleic acid lipid particles to exhibit a longer lifespan in the plasma circulation and hence PEG-modified lipids will have relatively longer lipid anchors.

Следует отметить, что предотвращение агрегации соединений не требует от липидов конъюгации функционировать должным образом. Свободный PEG или свободный ATTA в растворе может быть достаточным условием для предотвращения агрегации. Если частицы стабильны после введения в состав, PEG или ATTA может быть подвергнут диализу до введения субъекту.It should be noted that preventing compound aggregation does not require lipid conjugation to function properly. Free PEG or free ATTA in solution may be sufficient to prevent aggregation. If the particles are stable after formulation, the PEG or ATTA may be dialyzed prior to administration to the subject.

Липидные частицыlipid particles

В другом аспекте настоящее изобретение относится к липидным частицам, которые включают в себя один или более катионных липидов, описанных здесь. В одном варианте воплощения липидная частица включает в себя одно или более соединение формулы I-XXIII. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя одно или более соединения формулы II-ХХШ. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя одну или несколько соединений формулы I. В другом варианте воплощения липидная частица включает в себя соединение формулы IA-1, IA-2, IB, IC, ID или IE.In another aspect, the present invention provides lipid particles that include one or more of the cationic lipids described herein. In one embodiment, the lipid particle includes one or more compounds of formula I-XXIII. In another embodiment, the lipid particle includes one or more compounds of formula II-XXIII. In another embodiment, the lipid particle includes one or more compounds of formula I. In another embodiment, the lipid particle includes a compound of formula IA-1, IA-2, IB, IC, ID, or IE.

Липидные частицы включают, но не ограничиваются этим, липосомы. Как здесь используется, липосома является структурой, имеющей липиды-содержащие мембраны, вмещающие водное содержимое. Липосомы могут иметь одну или несколько липидных мембран. Липосомы могут иметь один слой, называемые однослойными, или много слоев, называемые многослойными. Когда в комплексе есть нуклеиновые кислоты, липидные частицы также могут быть липоплексными, которые состоят из бислоев катионных липидов, зажатых между слоями ДНК.Lipid particles include, but are not limited to, liposomes. As used here, a liposome is a structure having lipid-containing membranes containing aqueous contents. Liposomes may have one or more lipid membranes. Liposomes can have one layer, called unilamellar, or many layers, called multilayer. When there are nucleic acids in the complex, the lipid particles can also be lipoplexic, which consist of bilayers of cationic lipids sandwiched between layers of DNA.

Липидные частицы могут дополнительно содержать один или более дополнительный липид и/или другие компоненты, такие как холестерин. Другие липиды могут быть включены в липосомные композиции для различных целей, например, для предотвращения окисления липидов или прикрепления ли- 62 039892 гандов на поверхности липосомы. Любой из числа липидов может присутствовать в липосомах, в том числе амфипатический, нейтральный, катионный и анионный липид. Такие липиды могут быть использованы отдельно или в комбинации.The lipid particles may further comprise one or more additional lipid and/or other components such as cholesterol. Other lipids may be included in the liposome compositions for various purposes, such as preventing lipid oxidation or ligand attachment to the surface of the liposome. Any of a number of lipids may be present in liposomes, including amphipathic, neutral, cationic and anionic lipid. Such lipids may be used alone or in combination.

Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в липидном бислое частицы включают стабилизирующие компоненты, такие как полиамид олигомеров (см., например, патент США № 6320017, который включен в качестве ссылки в полном объеме), пептиды, белки, детергенты, липидные производные, такие как PEG, связанный с фосфатидилэтаноламином, и PEG, конъюгированный с керамидами (см., патент США № 5885613, который включен в качестве ссылки в полном объеме).Additional components that may be present in the lipid bilayer of the particle include stabilizing components such as polyamide oligomers (see, for example, US Pat. No. 6,320,017, which is incorporated by reference in its entirety), peptides, proteins, detergents, lipid derivatives such as PEG linked to phosphatidylethanolamine and PEG conjugated to ceramides (see US Pat. No. 5,885,613, which is incorporated by reference in its entirety).

В одном варианте воплощения липидные частицы включают в себя один или несколько вторичных аминолипидов или катионных липидов, нейтральных липидов, стеролов и липидов, выбранных для уменьшения агрегации липидных частиц в процессе формирования, которая может возникнуть в результате пространственной стабилизации частиц, которая предотвращает заряд-индуцированную агрегацию в процессе формирования.In one embodiment, the lipid particles include one or more secondary amino lipids or cationic lipids, neutral lipids, sterols, and lipids selected to reduce lipid particle aggregation during formation, which may result from steric stabilization of the particles, which prevents charge-induced aggregation. in the process of formation.

Липидные частицы могут включать в себя два или более катионных липида. Липиды могут быть выбраны по вносимому вкладу в различные полезные свойства. Например, катионные липиды, которые отличаются по свойствам, таким как аминная рК_а, химическая стабильность, период полураспада в обращении, период полураспада в тканях, чистое накопление в тканях или токсичности, могут быть использованы в липидных частицах. В частности, катионные липиды могут быть выбраны так, что свойства смешанных липидных частиц будут более желательными, чем свойства однолипидных частиц индивидуальных липидов.The lipid particles may include two or more cationic lipids. Lipids can be selected for their contribution to various beneficial properties. For example, cationic lipids that differ in properties such as amine pK _a , chemical stability, circulating half-life, tissue half-life, net tissue accumulation or toxicity can be used in lipid particles. In particular, the cationic lipids can be chosen such that the properties of the mixed lipid particles are more desirable than those of the single lipid particles of the individual lipids.

Чистое накопление в ткани и долгосрочная токсичность (если таковые имеются) катионных липидов могут быть модулированными выгодным способом путем выбора смесей катионных липидов вместо выбора одного катионного липида в данном составе. Такие смеси могут также обеспечить лучшую инкапсуляцию и/или высвобождение препарата. Сочетание катионных липидов также может повлиять на системную стабильность по сравнению с единым целым в составе.Net tissue accumulation and long term toxicity (if any) of cationic lipids can be modulated in an advantageous manner by selecting mixtures of cationic lipids instead of selecting a single cationic lipid in a given formulation. Such mixtures may also provide better encapsulation and/or drug release. The combination of cationic lipids can also affect systemic stability when compared to a single formulation.

В одном примере серии структурно подобных соединений могут иметь различные величины рК_а, которые охватывают диапазон, например, менее чем 1 рК_а единицы, от 1 до 2 рК_а единиц или диапазон более чем 2 единицы рК_а. В рамках серии может быть обнаружено, что рК_а в середине диапазона связано с усилением полезных свойств (повышение эффективности) или уменьшением невыгодных свойств (например, пониженной токсичностью), по сравнению с соединениями, имеющими рК_а значения ближе к концу диапазона. В таком случае два (или более) различных соединения, имеющих рК_а на противоположных концах спектра, могут быть выбраны для совместного использования в липидных частицах. Таким образом, чистые свойства липидной частицы (например, заряд в зависимости от местных pH) может быть ближе к частице в том числе одного липида из середины диапазона. Катионные липиды, которые структурно разнородны (например, не входят в ряд структурно подобных соединений, упомянутых выше) также могут быть использованы в смешанных липидных частицах.In one example, a series of structurally similar compounds may have different pKa values that span _a range of, for example, less _than 1 pKa unit, 1 to 2 pKa units, _or a range of greater _than 2 pKa units. Within a series, it can be found that pKa in _the middle of the range is associated with an increase in beneficial properties (increased efficiency) or a decrease in disadvantageous properties (for example, reduced toxicity), compared with compounds _having pKa values towards the end of the range. In such a case, two (or more) different compounds _having pKa at opposite ends of the spectrum can be selected for joint use in the lipid particles. Thus, the net properties of the lipid particle (eg, charge versus local pH) may be closer to the particle including a single lipid from the mid-range. Cationic lipids that are structurally heterogeneous (eg, not included in the range of structurally similar compounds mentioned above) can also be used in mixed lipid particles.

В некоторых случаях два или более различных катионных липида могут иметь весьма различные величины рК_а, например, различающиеся на 3 или более единиц рК_а. В этом случае свойства смешанной липидной частицы не обязательно имитируют свойства однолипидной частицы, имеющей промежуточные значения рК_а. Скорее, чистые свойства могут быть такими же, как и у частицы с двумя различными протонированными (или депротонированными, в случае необходимости) сайтами с различными значениями рК_а. В случае одного липида, доля протонированных сайтов, которые на самом деле являются протонированными, резко меняется, когда pH движется от нижнего рКа к высшему рКа (когда pH равен значению рК_а, 50% сайтов протонированы). Когда два или более различных катионных липида, возможно, имеют весьма различные величины рКа (например, различающихся на 3 или более единиц рКа), объединены в липидные частицы, липидные частицы могут показать более постепенный переход от непротонированного к протонированному состоянию, когда значения pH разнообразны.In some cases, two or more different cationic lipids may have very different pKa values, for example, differing by 3 _or _more pKa units. In this case, the properties of the mixed lipid particle do not necessarily mimic those of a single lipid particle _having intermediate pKa values. Rather, the net properties may be the same as a particle with two different protonated (or deprotonated, if necessary) sites _with different pKa values. In the case of a single lipid, the proportion of protonated sites that are actually protonated changes dramatically as the pH moves from a lower pKa to a higher pKa (when the pH is equal to _the pKa value, 50% of the sites are protonated). When two or more different cationic lipids, possibly having very different pKa values (e.g., differing by 3 or more pKa units), are combined into lipid particles, the lipid particles may show a more gradual transition from an unprotonated to a protonated state when the pH values are varied.

В других примерах два или более липида могут быть выбраны на основе других соображений. Например, если один липид сам по себе является весьма эффективным, но умеренно токсичным, он может быть объединен с липидом, который является менее эффективным, но не токсичным. В некоторых случаях комбинация может оставаться весьма эффективной, но иметь значительно сниженную токсичность, даже там, где она может быть предсказана, так что комбинация была бы лишь умеренно эффективной и лишь немного менее токсичной.In other examples, two or more lipids may be selected based on other considerations. For example, if one lipid on its own is highly effective but moderately toxic, it can be combined with a lipid that is less effective but not toxic. In some cases, the combination may remain highly effective, but have greatly reduced toxicity, even where it can be predicted, such that the combination would be only moderately effective and only slightly less toxic.

При выборе можно руководствоваться измеренными значениями экспериментально определяемых характеристик, например, характерными могут быть назначены числовые значения из результатов эксперимента. Экспериментально определяемые характеристики могут включать в себя меры безопасности, меры эффективности, меры взаимодействия с заданной биомолекулой или рКа.When choosing, one can be guided by the measured values of the experimentally determined characteristics, for example, numerical values from the results of the experiment can be assigned as characteristic ones. Experimentally determined characteristics may include measures of safety, measures of effectiveness, measures of interaction with a given biomolecule or pKa.

Меры безопасности могут включать в себя выживаемость, LD₅₀ или уровень биомаркеров (например, сывороточных биомаркеров), связанных с повреждением тканей (например, печеночных ферментов печени; CPK для мышц; ионный баланс для почек). Мерой эффективности может быть любое измерение, которое указывает, производит ли терапевтический агент эффект, в частности, того и/или до какой степени он производит желаемый эффект, например, лечения, профилактики, улучшения илиSafety measures may include survival, LD ₅₀ , or levels of biomarkers (eg, serum biomarkers) associated with tissue damage (eg, liver enzymes; CPK for muscle; ion balance for kidney). A measure of effectiveness can be any measurement that indicates whether a therapeutic agent produces an effect, in particular whether and/or to what extent it produces the desired effect, e.g. treatment, prevention, improvement, or

- 63 039892 иным образом улучшающий заболевания, расстройства или другие клинические состояния. Мерой эффективности может быть косвенный показатель, например, если терапевтическое средство предназначено для получения определенного эффекта на клеточном уровне, измерение этого эффекта на клеточных культурах может быть мерой эффективности. Меры взаимодействия с заданными биомолекулами могут включать в себя Kd для связывания конкретного белка или меру характера, степени или степень взаимодействия с другими липидами, в том числе клеточной подструктуры, такой как клеточные мембраны, мембраны эндосом, ядерной мембраны и т.п.- 63 039892 otherwise improving diseases, disorders or other clinical conditions. A measure of efficacy may be a proxy, for example, if a therapeutic agent is intended to produce a particular effect at the cellular level, measuring that effect in cell cultures may be a measure of efficacy. Measures of interaction with target biomolecules may include Kd for specific protein binding, or a measure of the nature, degree, or degree of interaction with other lipids, including cellular substructure such as cell membranes, endosome membranes, nuclear membranes, and the like.

Катионные липиды могут быть выбраны на основе механизма действия, например, следует ли, при каких условиях и в какой степени липиды взаимодействуют с заданными биомолекулами. Например, первый катионный липид может быть выбран, в частности, потому, что он связан с ApoEзависимым механизмом, второй катионный липид может быть выбран, в частности, потому, что он связан с ApoE-независимым механизмом.Cationic lipids can be selected based on the mechanism of action, such as whether, under what conditions, and to what extent lipids interact with given biomolecules. For example, the first cationic lipid may be selected in particular because it is associated with an ApoE dependent mechanism, the second cationic lipid may be selected in particular because it is associated with an ApoE independent mechanism.

Например, липидная частица также может включать в себя смесь катионных липидов, как описано, например, в WO 2009/086558 и предварительной заявке на патент США № 61/104 219, поданной 9 октября 2008 года (каждый из которых включен в качестве ссылки полностью), и их эфирные аналоги. В другом примере липидная частица может включать в себя смесь липидов, например, липидов A, описанных в PCT/US10/22614, поданной 29 января 2010 года, и липидов, например, липидной формулы V или формулы VI, описанных в предварительной заявке США 61/175 770, поданной 5 мая 2009 года.For example, the lipid particle may also include a mixture of cationic lipids as described, for example, in WO 2009/086558 and U.S. Provisional Application No. 61/104,219, filed October 9, 2008 (each of which is incorporated by reference in its entirety) , and their ethereal counterparts. In another example, the lipid particle may include a mixture of lipids, such as Lipids A as described in PCT/US10/22614, filed January 29, 2010, and lipids, such as Lipid Formula V or Formula VI, as described in Provisional Application US 61/ 175,770, filed May 5, 2009.

В некоторых вариантах воплощения он является желательно нацеленным на липидные частицы с помощью таргетинга фрагментов, относящихся к типу клеток или тканей. Таргетинг липидных частиц, используя различные ориентации фрагментов, таких как лиганды, рецепторы клеточной поверхности, гликопротеины, витамины (например, рибофлавин) и моноклональные антитела, был описан ранее (см., например, патенты США № № 4957773 и 4603044, каждый из который включен в качестве ссылки в полном объеме). Целевые остатки могут содержать весь белок или его фрагменты. Таргетинг механизмы обычно требуют, чтобы агенты таргетинга были расположены на поверхности липидных частиц таким образом, что целевой фрагмент доступен для взаимодействия с мишенью, например, рецептором клеточной поверхности. Различные агенты таргетинга и способы известны и доступны в данной области, в том числе описаны, например, в Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); и Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002).In some embodiments, it is desirably targeted to lipid particles by targeting fragments related to a cell or tissue type. Targeting lipid particles using various fragment orientations such as ligands, cell surface receptors, glycoproteins, vitamins (e.g., riboflavin) and monoclonal antibodies has been previously described (see, for example, US Pat. Nos. 4,957,773 and 4,603,044, each of which is included as reference in full). Target residues may contain the entire protein or fragments thereof. Targeting mechanisms generally require that the targeting agents be located on the surface of the lipid particles in such a way that the target fragment is available for interaction with the target, such as a cell surface receptor. Various targeting agents and methods are known and available in the art, including those described, for example, in Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); and Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002).

Использование липидных частиц, т.е. липосом, с поверхностью, покрытой гидрофильными полимерными цепями, такими как полиэтиленгликоля (PEG) цепи, для таргетинга было предложено (Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); U.S. Patent No. 5,013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995). В одном подходе лиганды, такие как антитела, для таргетинга липидных частиц связаны с полярными направляющими группами липидов для формирования липидных частиц. При другом подходе таргетинг лиганд присоединен к дистальным концам PEG цепочек, образующим гидрофильные полимерные покрытия (Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).The use of lipid particles, ie. liposomes, with a surface coated with hydrophilic polymer chains, such as polyethylene glycol (PEG) chains, have been proposed for targeting (Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992) ; U.S. Patent No. 5.013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995) In one approach, ligands such as antibodies for targeting lipid particles are linked to polar guide groups of lipids to form lipid particles.In another approach, the targeting ligand is attached to the distal ends of PEG chains forming hydrophilic polymer coatings ( Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpoti n et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).

Стандартные способы для связывания агентов таргетинга могут быть использованы. Например, фосфатидилэтаноламин, который может быть активирован для присоединения агентов таргетинга, или производные липофильных соединений, таких как липидные производные блеомицина, могут быть использованы. Антитела целевых липосом могут быть построены с использованием, например, липосом, которые включают белок (см. Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) и Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990). Другие примеры антител сопряжения раскрыты в патенте США № 6027726, учения которых включены здесь в качестве ссылки. Примеры таргетинг фрагментов могут также включать другие белки, характерные для клеточных компонентов, в том числе антигены, связанные с новообразованиями или опухолями. Белки, используемые в качестве таргетинг фрагментов, могут быть присоединены к липосоме с помощью ковалентных связей (см. Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). Другие методы таргетинга включают в себя биотин-авидин системы.Standard methods for linking targeting agents can be used. For example, phosphatidylethanolamine, which can be activated to attach targeting agents, or derivatives of lipophilic compounds such as lipid derivatives of bleomycin, can be used. Antibodies of target liposomes can be constructed using, for example, liposomes that include protein (see Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) and Leonetti, et al., Proc. Natl Acad Sci (USA) 87:2448-2451 (1990) Other examples of coupling antibodies are disclosed in US Pat. No. 6,027,726, the teachings of which are incorporated herein by reference. , including antigens associated with neoplasms or tumors Proteins used as targeting fragments can be attached to the liposome via covalent bonds (see Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987) Other targeting methods include the biotin-avidin system.

В некоторых вариантах воплощения липидная частица включает в себя смесь катионного липида и липида, способствующего слиянию. Липидная частица может дополнительно включать в себя нейтральный липид, стерол, PEG -модифицированный липид или комбинацию из них. Например, липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид (например, DPPC) и нейтральный липид, но не стерол или PEG -модифицированный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид и нейтральный липид, но не стерол или PEG -модифицированный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид и PEG -модифицированный липид, но не стерол или нейтральный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол и нейтральный липид, но не PEG-модифицированный липид. Липидная частица может включатьIn some embodiments, the lipid particle includes a mixture of a cationic lipid and a fusion-promoting lipid. The lipid particle may further include a neutral lipid, a sterol, a PEG-modified lipid, or a combination of these. For example, the lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid (eg, DPPC) and a neutral lipid, but not a sterol or PEG-modified lipid. The lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid and a neutral lipid, but not a sterol or PEG-modified lipid. The lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid and a PEG-modified lipid, but not a sterol or neutral lipid. The lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid, a sterol, and a neutral lipid, but not a PEG-modified lipid. The lipid particle may include

- 64 039892 в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол и PEG-модифицированный липид, но не нейтральный липид. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, нейтральный липид и PEG-модифицированный липид, но не стерол. Липидная частица может включать в себя катионный липид, способствующий слиянию липид, стерол, нейтральный липид и PEG-модифицированный липид.- 64 039892 includes a cationic lipid, a fusion-promoting lipid, a sterol and a PEG-modified lipid, but not a neutral lipid. The lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid, a neutral lipid, and a PEG-modified lipid, but not a sterol. The lipid particle may include a cationic lipid, a fusion-promoting lipid, a sterol, a neutral lipid, and a PEG-modified lipid.

В одном примере варианта воплощения, липидная частица представляет собой смесь катионных липидов, способствующих слиянию липидов, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стеринов (например, холестерина) и PEG-модифицированных липидов (например, PEG DMG или PEG DMA). В некоторых вариантах воплощения смесь липидов состоит или состоит по существу из катионных липидов, способствующих слиянию липидов, нейтральных липидов, холестерина и PEGмодифицированных липидов. В других предпочтительных вариантах воплощения липидные частицы включают в себя вышеописанные смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионный липид:0,1-50% способствующих слиянию липидов:5-45% нейтральных липидов:20-55% холестерина:0,5-15% PEG-модифицированных липидов. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%. В некоторых вариантах воплощения слиянию способствующие липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 10-50%, 20-50% или 30-50%. В некоторых вариантах воплощения способствующие слиянию липиды могут присутствовать в молярном соотношении 0,1-50%, 0.5-45%, 1-40%, 1%35%, 1%-30% или 1%-20%.In one exemplary embodiment, the lipid particle is a mixture of cationic fusion-promoting lipids, neutral lipids (other than cationic lipids), sterols (eg, cholesterol), and PEG-modified lipids (eg, PEG DMG or PEG DMA). In some embodiments, the lipid mixture consists or consists essentially of cationic fusion lipids, neutral lipids, cholesterol, and PEG-modified lipids. In other preferred embodiments, the lipid particles comprise the lipid mixtures described above in a molar ratio of about 20-70% cationic lipid: 0.1-50% fusion lipids: 5-45% neutral lipids: 20-55% cholesterol: 0.5 -15% PEG-modified lipids. In some embodiments, fusion-promoting lipids may be present in a molar ratio of 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40%, or 15%-35%. In some embodiments, fusion promoting lipids may be present in a molar ratio of 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40%, or 15%-35%. In some embodiments, fusion-promoting lipids may be present in a molar ratio of 0.1-50%, 10-50%, 20-50%, or 30-50%. In some embodiments, fusion-promoting lipids may be present in a molar ratio of 0.1-50%, 0.5-45%, 1-40%, 1%35%, 1%-30%, or 1%-20%.

В других предпочтительных вариантах воплощения липидная частица состоит или состоит по существу из указанной выше смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионный липид:0,1-50% способствующий слиянию липид:5-45% нейтральный липид:20-55% холестерин:0,5-15% PEG-модифицированный липид.In other preferred embodiments, the lipid particle consists or consists essentially of the above mixture of lipids in a molar ratio of about 20-70% cationic lipid: 0.1-50% fusion lipid: 5-45% neutral lipid: 20-55% cholesterol : 0.5-15% PEG-modified lipid.

В конкретных вариантах воплощения молярное соотношение липидов, в соотношении мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA составляет примерно 40/10/40/10, 35/15/40/10 или 52/13/30 /5; эту смесь дополнительно комбинируют со способствующим слиянию липидом в молярном соотношении 0,1-50%, 0,1-50%, 0,5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% или 15%-35%, другими словами, когда 40/10/40/10 смесь липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA в сочетании со способствующим слиянию липидом в молярном соотношении 50%, полученные частицы липидов могут иметь общее молярное отношение (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEGDMA/способствующий слиянию липид) 20/5/20/5/50. В другой группе вариантов воплощения нейтральные липиды, DSPC в этих композициях заменяются POPC, DPPC, DOPE или SM.In specific embodiments, the molar ratio of lipids, in the mole % ratio of cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA is about 40/10/40/10, 35/15/40/10, or 52/13/30 /5; this mixture is further combined with a fusion promoting lipid in a molar ratio of 0.1-50%, 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40% or 15 %-35%, in other words, when a 40/10/40/10 lipid/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA blend is combined with a fusion-promoting lipid in a molar ratio of 50%, the resulting lipid particles can have a total molar ratio (mole % cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEGDMA/facilitating lipid) 20/5/20/5/50. In another group of embodiments, the neutral lipids, DSPCs in these compositions are replaced by POPC, DPPC, DOPE, or SM.

Липидные частицы, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя один или несколько терапевтических агентов. Таким образом, композиции, которые включают частицы липидов и активный агент, где активный агент связан с липидной частицей, обеспечены. В конкретных вариантах воплощения активный агент является терапевтическим агентом. В конкретных вариантах воплощения активный агент инкапсулирован в водном интерьере липидной частицы. В других вариантах воплощения активный агент присутствует в одном или нескольких липидных слоях липидных частиц. В других вариантах воплощения активный агент связан с внешней или внутренней липидной поверхностью липидных частиц.The lipid particles described herein may further include one or more therapeutic agents. Thus, compositions that include lipid particles and an active agent, wherein the active agent is associated with a lipid particle, are provided. In specific embodiments, the active agent is a therapeutic agent. In specific embodiments, the active agent is encapsulated in the aqueous interior of the lipid particle. In other embodiments, the active agent is present in one or more lipid layers of the lipid particles. In other embodiments, the active agent is associated with the outer or inner lipid surface of the lipid particles.

Полностью инкапсулированный, используемый здесь, означает, что нуклеиновые кислоты в частицах не сильно деградировали после воздействия сывороткой или анализа нуклеазы, которые существенно разрушают свободные нуклеиновые кислоты. В полностью инкапсулированной системе предпочтительно менее 25% частиц нуклеиновой кислоты разлагается в лечении, которые обычно ухудшают 100% свободной нуклеиновой кислоты, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от нуклеиновой кислоты частиц деградировали. Кроме того, полная инкапсуляция может быть определена анализом Oligreen®. Oligreen® является ультрачувствительным флуоресцентным окрашиванием нуклеиновой кислоты для количественного определения олигонуклеотидов и одноцепочечной ДНК в растворе (доступен Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Полностью инкапсулированный также предполагает, что частицы сыворотки стабильны, то есть что они не разлагаются быстро на составные части при введении in vivo.Fully encapsulated, as used herein, means that the nucleic acids in the particles are not severely degraded following serum exposure or nuclease assay, which substantially degrade free nucleic acids. In a fully encapsulated system, preferably less than 25% of the nucleic acid particles are degraded in treatments that typically degrade 100% of the free nucleic acid, more preferably less than 10% and most preferably less than 5% of the nucleic acid particles are degraded. In addition, complete encapsulation can be determined by the Oligreen® assay. Oligreen® is an ultrasensitive fluorescent nucleic acid stain for the quantification of oligonucleotides and single-stranded DNA in solution (available from Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Fully encapsulated also implies that the serum particles are stable, ie that they do not break down rapidly into their constituent parts when administered in vivo.

В одном варианте воплощения липидные частицы содержат катионный липид настоящего изобретения, нейтральный липид, стерол и PEG-модифицированный липид. В одном варианте воплощения липидные частицы включают от примерно 25% до примерно 75% на молярной основе катионных липидов, например, от около 35 до около 65%, от около 45 до около 65%, около 60%, около 57,5%, около 57,1%, около 50% или около 40% на молярной основе. В одном варианте воплощения липидные частицы включают от около 0% до около 15% на молярной основе нейтральных липидов, например, от примерно 3 до примерно 12%, от примерно от 5 до примерно 10%, около 15%, около 10%, около 7,5%, около 7,1% или около 0% на молярной основе. В одном из вариантов воплощения нейтральный липид является DPPC. В одном из вариантов воплощения нейтральный липид является DSPC. В одном вари- 65 039892 анте воплощения состав включает в себя от примерно 5% до примерно 50% на молярной основе стерола, например, около 15 до около 45%, около 20 до около 40%, около 48%, около 40%, около 38,5%, около 35%, около 34,4%, около 31,5% или около 31% на молярной основе. В одном варианте воплощения стеролом является холестерин.In one embodiment, the lipid particles comprise a cationic lipid of the present invention, a neutral lipid, a sterol, and a PEG-modified lipid. In one embodiment, the lipid particles comprise about 25% to about 75% on a molar basis of cationic lipids, e.g., about 35% to about 65%, about 45% to about 65%, about 60%, about 57.5%, about 57.1%, about 50% or about 40% on a molar basis. In one embodiment, the lipid particles comprise from about 0% to about 15% on a molar basis of neutral lipids, for example, from about 3 to about 12%, from about 5 to about 10%, about 15%, about 10%, about 7 .5%, about 7.1% or about 0% on a molar basis. In one embodiment, the neutral lipid is DPPC. In one embodiment, the neutral lipid is DSPC. In one embodiment, the composition comprises from about 5% to about 50% on a sterol molar basis, for example, about 15% to about 45%, about 20% to about 40%, about 48%, about 40%, about 38.5%, about 35%, about 34.4%, about 31.5% or about 31% on a molar basis. In one embodiment, the sterol is cholesterol.

В одном варианте воплощения липидные частицы включают от примерно 0,1% до примерно 20% на молярной основе PEG -модифицированных липидов, например, от примерно 0,5 до примерно 10%, от примерно 0,5 до примерно 5%, около 10%, около 5%, около 3,5%, 1,5%, 0,5% или около 0,3% на молярной основе. В одном варианте воплощения PEG-модифицированный липид является PEG-DMG. В одном варианте воплощения PEG модифицированный липид является PEG-c-DMA. В одном варианте воплощения липидные частицы включают 25-75% катионных липидов, 0,5-15% нейтральных липидов, 5-50% стеринов и 0,5-20% PEG -модифицированных липидов на молярной основе.In one embodiment, the lipid particles comprise from about 0.1% to about 20% on a molar basis of PEG-modified lipids, e.g., from about 0.5% to about 10%, from about 0.5% to about 5%, about 10% , about 5%, about 3.5%, 1.5%, 0.5%, or about 0.3% on a molar basis. In one embodiment, the PEG-modified lipid is PEG-DMG. In one embodiment, the PEG modified lipid is PEG-c-DMA. In one embodiment, the lipid particles comprise 25-75% cationic lipids, 0.5-15% neutral lipids, 5-50% sterols, and 0.5-20% PEG-modified lipids on a molar basis.

В одном варианте воплощения липидные частицы включают 35-65% катионных липидов, 3-12% нейтральных липидов, 15-45% стеролов, 0.5-10% PEG-модифицированных липидов на молярной основе. В одном варианте воплощения липидные частицы включают 45-65% катионных липидов, 5-10% нейтральных липидов, 25-40% стерола и 0,5-5% PEG -модифицированных липидов на молярной основе. В одном варианте воплощения PEG-модифицированные липиды содержат PEG молекулы со средней молекулярной массой 2000 Да. В одном варианте воплощения PEG-модифицированные липиды являются PEG-дистирил глицерином (PEG-DSG).In one embodiment, the lipid particles comprise 35-65% cationic lipids, 3-12% neutral lipids, 15-45% sterols, 0.5-10% PEG-modified lipids on a molar basis. In one embodiment, the lipid particles comprise 45-65% cationic lipids, 5-10% neutral lipids, 25-40% sterol, and 0.5-5% PEG-modified lipids on a molar basis. In one embodiment, the PEG-modified lipids contain PEG molecules with an average molecular weight of 2000 Da. In one embodiment, the PEG-modified lipids are PEG-distyryl glycerol (PEG-DSG).

В одном варианте воплощения соотношение липидов:миРНК составляет по меньшей мере, примерно 0,5:1, по меньшей мере, примерно 1:1, по меньшей мере, примерно 2:1, по меньшей мере, примерно 3:1, по меньшей мере, примерно 4:1, по меньшей мере около 5:1, по меньшей мере, примерно 6:1, по меньшей мере, примерно 7:1, по меньшей мере, примерно 11:1 или, по меньшей мере, примерно 33:1. В одном варианте воплощения соотношение липидов: миРНК соотношение составляет примерно от 1:1 до примерно 35:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 15:1 или от примерно 5:1 до примерно 13:1. В одном варианте воплощения соотношение липидов:миРНК соотношение составляет между от примерно 0,5:1 до примерно 12:1.In one embodiment, the lipid:siRNA ratio is at least about 0.5:1, at least about 1:1, at least about 2:1, at least about 3:1, at least , about 4:1, at least about 5:1, at least about 6:1, at least about 7:1, at least about 11:1, or at least about 33:1 . In one embodiment, the lipid:siRNA ratio is about 1:1 to about 35:1, about 3:1 to about 15:1, about 4:1 to about 15:1, or about 5:1 to about 13:1. In one embodiment, the lipid:siRNA ratio is between about 0.5:1 to about 12:1.

В одном варианте воплощения липидные частицы являются наночастицами. В дополнительных вариантах воплощения липидные частицы имеют средний размер диаметром от примерно 50 нм до примерно 300 нм, например, от примерно 50 нм до примерно 250 нм, например, от примерно 50 нм до примерно 200 нм.In one embodiment, the lipid particles are nanoparticles. In additional embodiments, the lipid particles have an average diameter size of from about 50 nm to about 300 nm, for example, from about 50 nm to about 250 nm, for example, from about 50 nm to about 200 nm.

В одном варианте воплощения липидная частица, содержащая катионный липид по любому из описанных здесь вариантов воплощения имеет in vivo период полураспада (t_1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем около 3 ч, такой как меньше чем около 2,5 ч, менее чем около 2 ч, менее чем около 1,5 ч, менее чем около 1 ч, менее чем примерно 0,5 ч или менее 0,25 ч.In one embodiment, the lipid particle comprising the cationic lipid of any of the embodiments described herein has an in vivo half-life (t _1/2 ) (e.g., in liver, spleen, or plasma) of less than about 3 hours, such as less than about 2 .5 hours, less than about 2 hours, less than about 1.5 hours, less than about 1 hour, less than about 0.5 hours, or less than 0.25 hours.

В другом варианте воплощения липидная частица, содержащая катионный липид по любому из описанных здесь вариантов воплощения, имеет in vivo период полураспада (t_1/2) (например, в печени, селезенке или плазме) менее чем около 10% (например, менее чем около 7,5%, меньше, чем около 5%, менее чем около 2,5%), что тот же катионный липид без биоразрушаемой группы или групп.In another embodiment, the lipid particle comprising the cationic lipid of any of the embodiments described herein has an in vivo half-life (t _1/2 ) (e.g., in liver, spleen, or plasma) of less than about 10% (e.g., less than about 7.5%, less than about 5%, less than about 2.5%), which is the same cationic lipid without the biodegradable group or groups.

Дополнительные компонентыAdditional components

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя аполипопротеин. Как здесь используется, термин аполипопротеин или липопротеин относится к аполипопротеинам, известным специалистам в данной области, и вариантам и их фрагментам и аполипопротеина агонистам, аналогам или их фрагментам, описанным ниже.The lipid particles and compositions described herein may further include an apolipoprotein. As used herein, the term apolipoprotein or lipoprotein refers to apolipoproteins known to those skilled in the art and variants and fragments thereof and apolipoprotein agonists, analogs or fragments thereof, described below.

Подходящие аполипопротеины включают, но не ограничиваются этим, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V и ApoE и активные полиморфные формы, изоформы, варианты и мутанты, а также фрагменты или усеченные формы. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин является тиолсодержащим аполипопротеином. Тиолсодержащий аполипопротеин относится к аполипопротеину, варианту, фрагменту или изоформе, которая содержит по меньшей мере один остаток цистеина. Наиболее распространенными тиолсодержащими аполипопротеинами являются ApoA-I Milano (ApoA-I_M) и ApoA-I Paris (ApoA-I_P), которые содержат один остаток цистеина (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 и ApoE3 также являются тиолсодержащими аполипопротеинами. Изолированные ApoE и/или активные фрагменты полипептида и их аналоги, в том числе их рекомбинантные формы, описаны в патентах США №№ 5672685, 5525472, 5473039, 5182364, 5177189, 5168045, 5116739, описания которых включены здесь в качестве ссылки. ApoE3 раскрыта в Weisgraber, et al., Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms, J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; и Rall, et al., Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects, Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700. См. также инвентарный номер GenBank K00396.Suitable apolipoproteins include, but are not limited to, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V and ApoE and active polymorphs, isoforms, variants and mutants, as well as fragments or truncated forms. In some embodiments, the apolipoprotein is a thiol-containing apolipoprotein. A thiol-containing apolipoprotein refers to an apolipoprotein, variant, fragment, or isoform that contains at least one cysteine residue. The most common thiol-containing apolipoproteins are ApoA-I Milano (ApoA-I _M ) and ApoA-I Paris (ApoA-I _P ), which contain a single cysteine residue (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 and ApoE3 are also thiol-containing apolipoproteins. Isolated ApoE and/or active polypeptide fragments and their analogs, including their recombinant forms, are described in US Pat. Nos. 5,672,685; 5,525,472; 5,473,039; ApoE3 is disclosed in Weisgraber, et al., Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms, J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; and Rall, et al., Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects, Proc. Nat. Acad. sci. (1982) 79: 4696-4700. See also GenBank stock number K00396.

В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин может быть в своей зрелой форме, в своей препроаполипопротеиновой форме или в форме проаполипопротеина. Гомо- и гетеродимеры (где это возможно) про- и зрелые ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29), ApoA-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)167-987; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:In some embodiments, the apolipoprotein may be in its mature form, in its preproapolipoprotein form, or in its proapolipoprotein form. Homo- and heterodimers (where possible) pro- and mature ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29), ApoA-I Milano (Klon et al. ., 2000, Biophys. J. 79:(3)167-987; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:

- 66 039892- 66 039892

1632-35), ApoA-I Paris (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol.1632-35), ApoA-I Paris (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol.

Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al.,Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al.,

1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83) и ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000) также могут быть использованы.1991 Euro. J Biochem. 201(2):373-83) and ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000) can also be used.

В некоторых вариантах воплощения аполипопротеином может быть фрагмент, вариант или изоформа аполипопротеина. Термин фрагмент относится к любому аполипопротеину, имеющему аминокислотную последовательность короче, чем у природного аполипопротеина, и у которого фрагмент сохраняет активность природного аполипопротеина, в том числе липид-связывающие свойства. Под вариантом подразумевается замена или изменения в аминокислотной последовательности гена аполипопротеина, которая путем замены или изменений, например, добавления и удаления аминокислотных остатков, не отменяют активности природного аполипопротеина, в том числе липид-связывающих свойств. Таким образом, вариант может содержать белок или пептид, имеющий по существу идентичную аминокислотную последовательность природному аполипопротеину, здесь предоставленному, в которых один или более аминокислотных остатков были консервативно замещены химически подобными аминокислотами. Примеры консервативных замен включают замену по меньшей мере одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, метионин или другого. Точно так же, например, возможна замена по меньшей мере одного гидрофильного остатка, такого как, например, между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, а также между глицином и серином (см. патенты США. №№ 6004925, 6037323 и 6046166), которые являются консервативными заменами. Термин изоформы относится к белку, имеющему те же, большие или частичные функции и аналогичную, идентичную или частичную последовательность, и может или не может быть продуктом одного и того же гена и, как правило, тканеспецифический (см. Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8): 1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3): 181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(l-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23): 14888-93 и патент США № 6372886).In some embodiments, the apolipoprotein may be a fragment, variant, or isoform of an apolipoprotein. The term fragment refers to any apolipoprotein having an amino acid sequence shorter than the natural apolipoprotein and in which the fragment retains the activity of the natural apolipoprotein, including lipid-binding properties. By variant is meant a substitution or alteration in the amino acid sequence of an apolipoprotein gene which, by substitution or alteration, such as the addition and deletion of amino acid residues, does not abolish the activity of the native apolipoprotein, including its lipid-binding properties. Thus, a variant may comprise a protein or peptide having a substantially identical amino acid sequence to the natural apolipoprotein provided herein, in which one or more amino acid residues have been conservatively substituted with chemically similar amino acids. Examples of conservative substitutions include substitution of at least one hydrophobic residue such as isoleucine, valine, leucine, methionine, or other. In the same way, for example, it is possible to replace at least one hydrophilic residue, such as, for example, between arginine and lysine, between glutamine and asparagine, and also between glycine and serine (see US patents Nos. 6004925, 6037323 and 6046166) , which are conservative substitutions. The term isoform refers to a protein having the same, major or partial functions and a similar, identical, or partial sequence, and may or may not be the product of the same gene and is generally tissue specific (see Weisgraber 1990, J. Lipid Res 31(8):1503-11, Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35, Lackner et al., 1985, J. Biol Chem 260(2):703-6 ; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101 (8): 1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42 ; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8, Sacre et al., 2003, FEBS Lett.540(1-3):181-7, Weers, et al., 2003, Bi ophys. Chem. 100(l-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23): 14888-93 and US Pat. No. 6,372,886).

В некоторых вариантах воплощения липидные частицы и композиции, описанные здесь, включают химерные конструкции аполипопротеина. Например, химерные конструкции аполипопротеина могут содержать домен аполипопротеина с высокой связывающей способностью липидов, связанных с доменом аполипопротеина, содержащего защитные свойства по отношению к реперфузионной ишемии. Химерной конструкцией аполипопротеина может быть конструкция, которая включает в себя отдельные регионы внутри аполипопротеина (т.е. гомологичные конструкции), или химерной конструкцией может быть конструкция, которая включает в себя отдельные регионы между разными аполипопротеинами (т.е. гетерологичные конструкции). Композиции, содержащие химерные конструкции, могут также включать сегменты, в которых аполипопротеина варианты или сегменты имеют специфический характер (например, липидное связывание, связывание с рецепторами, ферментативные, ферментактивирующие, антиоксидантные свойства или уменьшение окисления) (см. Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10): 1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84).In some embodiments, the lipid particles and compositions described herein include chimeric apolipoprotein constructs. For example, chimeric apolipoprotein constructs may comprise a highly lipid-binding apolipoprotein domain linked to an apolipoprotein domain containing reperfusion ischemia protective properties. A chimeric apolipoprotein construct may be a construct that includes distinct regions within an apolipoprotein (ie, homologous constructs), or a chimeric construct may be a construct that includes distinct regions between different apolipoproteins (ie, heterologous constructs). Compositions containing chimeric constructs may also include segments in which apolipoprotein variants or segments are of a specific nature (e.g., lipid binding, receptor binding, enzymatic, enzyme-activating, antioxidant properties, or oxidation reduction) (see Weisgraber 1990, J. Lipid Res 31(8):1503-11, Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35, Lackner et al., 1985, J. Biol Chem 260(2):703-6 ; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10): 1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101 (8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42 ; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; on et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84).

В качестве аполипопротеинов использованы также рекомбинантные, синтетические, полусинтетические или очищенные аполипопротеины. Способы получения аполипопротеинов или их эквивалентов хорошо известны в данной области. Например, аполипопротеин может быть отделен от плазмы или натуральных продуктов, например, центрифугированием в градиенте плотности или иммуноаффинной хроматографией, или производятся синтетически, полусинтетически или с помощью технологий рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области (см., например, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2):83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; патенты США №№ 5059528, 5834596, 5876968 и 5721114; и PCT публикации WO 86/04920 и WO 87/02062).Also used as apolipoproteins are recombinant, synthetic, semi-synthetic or purified apolipoproteins. Methods for preparing apolipoproteins or their equivalents are well known in the art. For example, apolipoprotein can be separated from plasma or natural products, for example, by density gradient centrifugation or immunoaffinity chromatography, or produced synthetically, semi-synthetically, or using recombinant DNA technologies known to those skilled in the art (see, for example, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr., 798(1-2):83-90, Chung et al., 1980, J. Lipid Res., 21(3):284-91, Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; US Pat. 02062).

Аполипопротеины могут дополнительно включать в себя аполипопротеина агонисты, такие как пептиды и пептидные аналоги, которые имитируют активность ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-I_M), ApoA-I Paris (ApoA-I_P), ApoA-II, ApoA-IV и ApoE. Например, аполипопротеином может быть любой изApolipoproteins may further include apolipoprotein agonists such as peptides and peptide analogs that mimic the activity of ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-I _M ), ApoA-I Paris (ApoA-I _P ), ApoA-II, ApoA -IV and ApoE. For example, an apolipoprotein can be any of

- 67 039892 тех, которые описаны в патентах США №№ 6004925, 6037323, 6046166 и 5840688, содержание которых включено здесь в качестве ссылки во всей их полноте.- 67 039892 those described in US patent No. 6004925, 6037323, 6046166 and 5840688, the contents of which are included here by reference in their entirety.

Аполипопротеина агониста пептиды или пептидные аналоги могут быть синтезированы или изготовлены с использованием любой технологии для синтеза пептидов, известной в данной области, включая, например, методы, описанные в патентах США №№ 6004925, 6037323 и 6046166. Например, пептиды могут быть получены с использованием твердофазного синтеза, методика изначально описывается Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2154). Другие методы синтеза пептида могут быть найдены в Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976), и другие ссылки доступны специалистам в данной области. Обзоры методов синтеза полипептида можно найти в Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984). Пептиды также могут быть синтезированы способами в растворе, как описано The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976). Соответствующие защитные группы для использования в различных синтезах пептидов описаны в вышеупомянутых текстах, а также в McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973). Пептиды могут быть также получены путем химического или ферментативного расщепления из крупных частей, например, аполипопротеина A-I.Apolipoprotein agonist peptides or peptide analogs can be synthesized or made using any technology for the synthesis of peptides known in the art, including, for example, the methods described in US patent Nos. 6004925, 6037323 and 6046166. solid phase synthesis, a procedure originally described by Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 2154). Other peptide synthesis methods can be found in Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) and other references are available to those skilled in the art. Reviews of methods for synthesizing the polypeptide can be found in Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984). Peptides can also be synthesized by solution methods as described in The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976). Appropriate protecting groups for use in various peptide synthesis are described in the above texts, as well as in McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973). Peptides can also be prepared by chemical or enzymatic cleavage from large portions, such as apolipoprotein A-I.

В некоторых вариантах воплощения аполипопротеин может быть смесью аполипопротеинов. В одном из вариантов воплощения аполипопротеин может быть гомогенной смесью, то есть одним типом аполипопротеина. В другом варианте воплощения аполипопротеин может быть гетерогенной смесью аполипопротеинов, то есть смесью двух или более различных аполипопротеинов. Варианты воплощения гетерогенной смеси аполипопротеинов могут содержать, например, смесь аполипопротеина из животных источников и аполипопротеина из полусинтетических источников. В некоторых вариантах воплощения гетерогенная смесь может содержать, например, смесь ApoA-I и ApoA-I Milano. В некоторых вариантах воплощения гетерогенная смесь может содержать, например, смесь ApoA-I Milano и ApoA-I Paris. Подходящие смеси для использования в способах и композициях описаны здесь и будут очевидны для специалиста в данной области.In some embodiments, the apolipoprotein may be a mixture of apolipoproteins. In one embodiment, the apolipoprotein may be a homogeneous mixture, ie one type of apolipoprotein. In another embodiment, the apolipoprotein may be a heterogeneous mixture of apolipoproteins, ie a mixture of two or more different apolipoproteins. Embodiments of the heterogeneous mixture of apolipoproteins may comprise, for example, a mixture of apolipoprotein from animal sources and apolipoprotein from semi-synthetic sources. In some embodiments, the heterogeneous mixture may contain, for example, a mixture of ApoA-I and ApoA-I Milano. In some embodiments, the heterogeneous mixture may comprise, for example, a mixture of ApoA-I Milano and ApoA-I Paris. Suitable mixtures for use in the methods and compositions are described herein and will be apparent to those skilled in the art.

Если аполипопротеин получают из природных источников, он может быть получен из растительного или животного источников. Если аполипопротеин получается из животного источника, аполипопротеин может быть из любого вида. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеины могут быть получены из животных источников. В некоторых вариантах воплощения аполипопротеины могут быть получены из человеческого источника. В предпочтительных вариантах воплощения аполипопротеин происходит от того же вида, в который аполипопротеин вводят.If the apolipoprotein is obtained from natural sources, it may be obtained from plant or animal sources. If the apolipoprotein is derived from an animal source, the apolipoprotein may be from any species. In some embodiments, the apolipoproteins may be obtained from animal sources. In some embodiments, the apolipoproteins may be obtained from a human source. In preferred embodiments, the apolipoprotein is from the same species into which the apolipoprotein is administered.

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно содержать стериновые компоненты смеси липидов. Если они присутствуют, стерины могут быть любыми из тех стеринов, которые обычно используются в области липосом, липидных везикул или подготовки липидных частиц. В одном варианте воплощения стерин является холестерином.The lipid particles and compositions described herein may additionally contain sterol components of the lipid mixture. If present, the sterols may be any of those sterols commonly used in the field of liposomes, lipid vesicles, or lipid particle preparation. In one embodiment, the sterol is cholesterol.

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя анионный липид. Анионные липиды, пригодные для использования в липидных частицах, включают, но не ограничиваются этим, фосфатидилглицерин, кардиолипин, диацилфосфатидилстерин, диацилфосфатидиловую кислоту, N-додеканоил фосфатидилэтаноламин, N-сукцинил фосфатидилэтаноламин, Nглутарил фосфатидилэтаноламин, лизилфосфатидилглицерин и другие анионные модифицированные группы, присоединенные к нейтральным липидам.The lipid particles and compositions described herein may further include an anionic lipid. Anionic lipids suitable for use in lipid particles include, but are not limited to, phosphatidylglycerol, cardiolipin, diacylphosphatidylsterol, diacylphosphatidylic acid, N-dodecanoyl phosphatidylethanolamine, N-succinyl phosphatidylethanolamine, N-glutaryl phosphatidylethanolamine, lysylphosphatidylglycerol, and other anionic modified groups attached to neutral lipids. .

В дополнительных вариантах воплощения амфипатические липиды также включены в липидные частицы и композиции, описанные здесь. К амфипатическим липидам относится любой подходящий материал, в котором гидрофобная часть липидного материала ориентируется к гидрофобной фазе, в то время как гидрофильные части ориентируется в сторону водной фазы. Такие соединения включают, но не ограничиваются этим, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Представленные фосфолипиды включают сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, пальмитоилолеил фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или дилинолеоилфосфатидилхолин. Другие фосфороподобные соединения, такие как сфинголипиды, гликосфинголипидные семейства, диацилглицерины и β-ацилоксикислоты, также могут быть использованы. Кроме того, такие амфипатические липиды могут быть легко смешаны с другими липидами, такими как триглицериды и стерины.In further embodiments, amphipathic lipids are also included in the lipid particles and compositions described herein. Amphipathic lipids include any suitable material in which the hydrophobic portion of the lipid material is oriented toward the hydrophobic phase while the hydrophilic portions are oriented toward the aqueous phase. Such compounds include, but are not limited to, phospholipids, aminolipids, and sphingolipids. Representative phospholipids include sphingomyelin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, palmitoyloleyl phosphatidylcholine, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dioleylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, or dilinoleoylphosphatidylcholine. Other phosphorus-like compounds such as sphingolipids, glycosphingolipid families, diacylglycerols and β-acyloxy acids may also be used. In addition, such amphipathic lipids can be readily mixed with other lipids such as triglycerides and sterols.

Также подходящими для включения в липидные частицы и композиции, описанные здесь, являются программируемые липиды слияния или слиянию способствующие липиды. Такие липидные частицы имеют небольшую тенденцию сливаться с клеточными мембранами и доставлять их содержимое до данного сигнального события. Это позволяет липидным частицам более равномерно распределяться после инъекции в организме или сайта болезни до их начала слияния с клетками. Сигнальным событием может быть, например, изменение pH, температуры, ионной окружающей среды или времени. Слиянию способствующие липиды могут быть, например, соединениями формулы (I), как описано выше. В некоторых случаях сигнальное событие может быть изменением pH, например, таким как разница в pHAlso suitable for inclusion in the lipid particles and compositions described herein are programmable fusion lipids or fusion-promoting lipids. Such lipid particles have little tendency to fuse with cell membranes and deliver their contents prior to a given signaling event. This allows the lipid particles to be more evenly distributed after injection into the body or disease site before they begin to fuse with cells. The signal event can be, for example, a change in pH, temperature, ionic environment, or time. Fusion promoting lipids can be, for example, compounds of formula (I) as described above. In some cases, the alarm event may be a change in pH, such as a difference in pH.

- 68 039892 между экстрацеллюлярной окружающей средой и внутриклеточной средой или между внутриклеточной средой и эндосомной окружающей средой.- 68 039892 between the extracellular environment and the intracellular environment or between the intracellular environment and the endosomal environment.

Когда время является сигнальным событием, задерживающие слияние или компоненты маскировки, такие как ATTA-липидные конъюгаты или PEG-липидные конъюгаты, могут просто обменяться с мембраной липидной частицы с течением времени. К тому времени, когда липидные частицы соответствующим образом распределяться в организме, они потеряют достаточную часть агента маскировки, чтобы быть способными к слиянию. С другими сигнальными событиями может быть желательно выбрать сигнал, который связан с сайтом заболевания или клеткой-мишенью, такими как повышенная температура в месте воспаления.When time is a signaling event, fusion-delaying or masking components, such as ATTA lipid conjugates or PEG lipid conjugates, may simply be exchanged with the membrane of the lipid particle over time. By the time the lipid particles are properly distributed in the body, they will have lost enough of the masking agent to be able to fuse. With other signaling events, it may be desirable to select a signal that is associated with the disease site or target cell, such as elevated temperature at the site of inflammation.

Активные (терапевтические) агентыActive (therapeutic) agents

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут дополнительно включать в себя один или более активных агентов (например, терапевтических агентов). Активные агенты, используемые здесь, включают любые молекулы или соединения, способные оказывать желаемое воздействие на клетки, ткани, органы или субъект. Такие эффекты могут быть, например, биологические, физиологические или косметические. Липидные частицы и композиции могут быть использованы для доставки любого из множества активных агентов. Активный агент может быть нуклеиновой кислотой, пептидом, полипептидом (например, антителом), цитокином, фактором роста, фактором апоптоза, фактором, вызывающим дифференциацию, клеточной поверхности рецепторами и их лигандами, гормонами и малыми молекулами. Подходящие терапевтические агенты также включают противовоспалительные соединения, антидепрессанты, стимуляторы, анальгетики, антибиотики, лекарства контроля над рождаемостью, жаропонижающие средства, сосудорасширяющие средства, антиангиогенные, цитоваскулярные агенты, ингибиторы передачи сигнала, сердечно-сосудистые препараты, например, антиаритмические агенты, вазоконстрикторы, гормоны и стероиды. Липидные частицы по настоящему изобретению могут также доставлять аптамеры.The lipid particles and compositions described herein may further include one or more active agents (eg, therapeutic agents). Active agents used herein include any molecules or compounds capable of exerting a desired effect on a cell, tissue, organ, or subject. Such effects may be, for example, biological, physiological or cosmetic. Lipid particles and compositions can be used to deliver any of a variety of active agents. The active agent can be a nucleic acid, a peptide, a polypeptide (eg, an antibody), a cytokine, a growth factor, an apoptosis factor, a differentiation inducing factor, cell surface receptors and their ligands, hormones, and small molecules. Suitable therapeutic agents also include anti-inflammatory compounds, antidepressants, stimulants, analgesics, antibiotics, birth control drugs, antipyretics, vasodilators, antiangiogenic agents, cytovascular agents, signal transduction inhibitors, cardiovascular drugs, e.g., antiarrhythmic agents, vasoconstrictors, hormones, and steroids. The lipid particles of the present invention can also deliver aptamers.

В некоторых вариантах воплощения терапевтический агент является онкологическим препаратом, который также может быть отнесен к противоопухолевым лекарствам, противораковым лекарствам, опухолевым лекарствам, противоопухолевым агентам и тому подобное. Примеры онкологических препаратов, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, адриамицин, алкеран, аллопуринол, альтретамин, амифостин, анастрозол, araC, триоксид мышьяка, азатиоприн, бексаротен, biCNU, блеомицин, бусульфан внутривенный, пероральный бусульфан, капецитабин (Xeloda), карбоплатин, кармустин, CCNU, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклоспорин A, цитарабин, цитозинарабинозид, даунорубицин, цитоксан, даунорубицин, дексаметазон, дексразоксан, додетаксел, доксорубицин, доксорубицин, DTIC, эпирубицин, эстрамустин, этопозида фосфат, этопозид и VP-16, экземестан, FK506, флударабин, фторурацил, 5-FU, гемцитабин (гемзар), гемтузумаб озогамицин, гозерелина ацетат, гидреа, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, мезилат иматиниба, интерферон, иринотекан (Camptostar, CPT 111), летрозол, лейковорин, лейстатин, лейпролид, левамизол, литретиноин, мегастрол, мелфалан, L-PAM, месны, метотрексат, метоксален, митрамицин, митомицин, митоксантрон, азотистый иприт, паклитаксел, памидронат, Pegademase, пентостатин, порфимир натрия, преднизолон, ритуксан, стрептозоцин, STI-571, тамоксифен, таксотер, тимозоламид, тенипозид, VM-26, топотекан (Hycamtin), торемифен, третиноин, ATRA, валрубицин, велбан, винбластин, винкристин, VP16 и винорелбин. Другими примерами онкологических препаратов, которые могут быть использованы, являются эллиптицин и эллиптицина аналоги или производные, эпотилон, внутриклеточные ингибиторы киназы и камптотецинов.In some embodiments, the therapeutic agent is an oncology drug, which can also be referred to as anticancer drugs, anticancer drugs, tumor drugs, antitumor agents, and the like. Examples of oncology drugs that can be used include, but are not limited to, adriamycin, alkeran, allopurinol, altretamine, amifostine, anastrozole, araC, arsenic trioxide, azathioprine, bexarotene, biCNU, bleomycin, intravenous busulfan, oral busulfan, capecitabine (Xeloda ), carboplatin, carmustine, CCNU, celecoxib, chlorambucil, cisplatin, cladribine, cyclosporin A, cytarabine, cytosine arabinoside, daunorubicin, cytoxan, daunorubicin, dexamethasone, dexrazoxane, dodetaxel, doxorubicin, doxorubicin, DTIC, epirubicin, estramustine, etoposide phosphate, etoposide and VP-16, exemestane, FK506, fludarabine, fluorouracil, 5-FU, gemcitabine (Gemzar), gemtuzumab ozogamicin, goserelin acetate, hydrea, hydroxyurea, idarubicin, ifosfamide, imatinib mesylate, interferon, irinotecan (Camptostar, CPT 111), letrozole, leucovorin, leistatin, leuprolide, levamisole, litretinoin, megastrol, melphalan, L-PAM, mesna, methotrexate, methoxsalen, mithramycin, mitomycin, mitoxantrone, nitrogen Pure Mustard, Paclitaxel, Pamidronate, Pegademase, Pentostatin, Sodium Porfimir, Prednisolone, Rituxan, Streptozocin, STI-571, Tamoxifen, Taxotere, Thymozolamide, Teniposide, VM-26, Topotecan (Hycamtin), Toremifene, Tretinoin, ATRA, Valrubicin, Velban , vinblastine, vincristine, VP16 and vinorelbine. Other examples of oncology drugs that can be used are ellipticin and ellipticin analogs or derivatives, epothilone, intracellular kinase inhibitors, and camptothecins.

В предпочтительном варианте воплощения активный агент представляет собой нуклеиновые кислоты, такие как миРНК. Например, активный агент может быть нуклеиновой кислотой кодирующей представляющий интерес продукт, включая, но не ограничиваясь этим, РНК, антисмысловой олигонуклеотид, антагомир, ДНК, плазмиды, рибосомальную РНК (рРНК), микро-РНК (микроРНК) (например, микроРНК которая является одноцепочечной и 17-25 нуклеотидов в длину), транспортные РНК (тРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК), малые ядерные РНК (мяРНК), антигены, их фрагменты, белки, пептиды, вакцины и малые молекулы или их смеси. В еще одном предпочтительном варианте воплощения нуклеиновая кислота является олигонуклеотидом (например, 15-50 нуклеотидов в длину (или 15-30 или 20-30 нуклеотидов в длину)). МиРНК может иметь, например, дуплекс регион, который состоит из 16-30 нуклеотидов. В другом варианте воплощения нуклеиновая кислота является иммуностимулирующим олигонуклеотидом, олигонуклеотидной приманкой, супермиром, имитирующей микроРНК или ингибитором микроРНК. Супермир относится к одноцепочечному, двухцепочечному или частично двухцепочечному олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или обеим, или их модификации, которая имеет нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична микроРНК и которая является антисмысловой по отношению к своей цели. Имитирующие микроРНК представляют собой класс молекул, которые могут быть использованы для имитации способности генов из одного или нескольких микроРНК. Таким образом, термин микроРНК имитирующие относится к синтетическим, не кодирующим РНК (т.е. микроРНК не получена путем очистки от источника эндогенного микроРНК), которые способны проникатьIn a preferred embodiment, the active agent is nucleic acids such as siRNA. For example, the active agent may be a nucleic acid encoding a product of interest, including, but not limited to, RNA, an antisense oligonucleotide, an antagonist, DNA, plasmids, ribosomal RNA (rRNA), microRNA (miRNA) (e.g., a microRNA that is single-stranded and 17-25 nucleotides in length), transfer RNAs (tRNAs), small interfering RNAs (siRNAs), small nuclear RNAs (snRNAs), antigens, fragments thereof, proteins, peptides, vaccines, and small molecules, or mixtures thereof. In another preferred embodiment, the nucleic acid is an oligonucleotide (eg, 15-50 nucleotides in length (or 15-30 or 20-30 nucleotides in length)). An miRNA may have, for example, a duplex region that consists of 16-30 nucleotides. In another embodiment, the nucleic acid is an immunostimulatory oligonucleotide, a decoy oligonucleotide, a miRNA mimic superworld, or a miRNA inhibitor. Superworld refers to a single-stranded, double-stranded, or partially double-stranded oligomer or polymer of ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA), or both, or a modification thereof, that has a nucleotide sequence that is substantially identical to microRNA and that is antisense to its purpose. Mimic microRNAs are a class of molecules that can be used to mimic the ability of genes from one or more microRNAs. Thus, the term mimic miRNA refers to synthetic, non-coding RNAs (i.e. miRNAs not obtained by purification from an endogenous miRNA source) that are able to enter

- 69 039892 путем РНК-интерференции и регуляции экспрессии генов.- 69 039892 by RNA interference and regulation of gene expression.

Нуклеиновая кислота, которая присутствует в липид-нуклеиновая кислота частице может быть в любой форме. Нуклеиновая кислота может быть, например, одноцепочечной ДНК или РНК, или двухцепочечной ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибридом. Не ограничивающие примеры двухцепочечной РНК включают миРНК. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК и триплекс формирующие олигонуклеотиды. Липидные частицы по настоящему изобретению могут также доставлять нуклеиновые кислоты, которые сопряжены с одним или несколькими лигандами.The nucleic acid that is present in the lipid nucleic acid particle may be in any form. The nucleic acid may be, for example, single-stranded DNA or RNA, or double-stranded DNA or RNA, or DNA-RNA hybridoma. Non-limiting examples of double-stranded RNA include siRNA. Single stranded nucleic acids include, for example, antisense oligonucleotides, ribozymes, microRNAs, and triplex forming oligonucleotides. The lipid particles of the present invention can also deliver nucleic acids that are coupled to one or more ligands.

Фармацевтические композицииPharmaceutical compositions

Липидные частицы, особенно в сочетании с терапевтическим агентом, могут быть образованы в виде фармацевтической композиции, например, такой, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, выбранный в соответствии с маршрутом введения и стандартной фармацевтической практикой.The lipid particles, especially when combined with a therapeutic agent, may be formulated into a pharmaceutical composition, such as one that further comprises a pharmaceutically acceptable diluent, excipient, or carrier such as saline or a phosphate buffer, selected according to the route of administration and the standard pharmaceutical formulation. practice.

В некоторых вариантах воплощения композиции для доставки молекул миРНК описаны. Эти составы эффективны в понижающем регулировании уровня белка и/или мРНК белков-мишеней. На активность этих композиций может влиять присутствие катионных липидов и молярное соотношения катионного липида в составе.In some embodiments, compositions for delivering siRNA molecules are described. These formulations are effective in down-regulating the protein and/or mRNA levels of target proteins. The activity of these compositions can be affected by the presence of cationic lipids and the molar ratio of cationic lipid in the composition.

В конкретных вариантах воплощения фармацевтические композиции, содержащие липидные частицы нуклеиновых кислот, получают в соответствии со стандартными методами, и дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Как правило, физиологический раствор будет использоваться в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители включают в себя, например, воду, буферный раствор, 0,9% солевой раствор, 0,3% глицин и т.п., в том числе гликопротеины для повышенной стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. В композициях, содержащих физиологический раствор или другие соли, содержащие носители, носитель предпочтительно добавляется после формирования липидных частиц. Таким образом, после того как липидная композиция нуклеиновой кислоты образуется, композиции могут быть разведены в фармацевтически приемлемых носителях, таких как физиологический раствор.In specific embodiments, pharmaceutical compositions containing nucleic acid lipid particles are prepared according to standard methods and further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Typically, saline will be used as a pharmaceutically acceptable carrier. Other suitable carriers include, for example, water, buffer solution, 0.9% saline, 0.3% glycine, and the like, including glycoproteins for increased stability such as albumin, lipoprotein, globulin, etc. d. In compositions containing saline or other salts containing carriers, the carrier is preferably added after formation of the lipid particles. Thus, once the nucleic acid lipid composition is formed, the compositions can be reconstituted in pharmaceutically acceptable vehicles such as saline.

В результате фармацевтические препараты могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными методами стерилизации. Водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как pH корректоры и буферные агенты, агенты тонусрегулирующие и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д. Кроме того, липидная суспензия может включать в себя липидные защитные агенты, которые защищают липиды от свободных радикалов и повреждений перекисными липидами при хранении. Липофильные свободно-радикальные ловушки, такие как α-токоферол и водорастворимые железоспецифические хелатирующие агенты, такие как ферриоксамин, являются подходящими.As a result, pharmaceutical preparations can be sterilized by conventional, well-known sterilization methods. Aqueous solutions can be packaged for use or aseptically filtered and lyophilized, the lyophilized preparation is combined with a sterile aqueous solution prior to administration. The compositions may contain pharmaceutically acceptable excipients necessary to approach physiological conditions, such as pH correctors and buffering agents, tone regulating agents, and the like, for example, sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, etc. d. In addition, the lipid suspension may include lipid protective agents that protect lipids from free radicals and lipid peroxide damage during storage. Lipophilic free radical scavengers such as α-tocopherol and water-soluble iron-specific chelating agents such as ferrioxamine are suitable.

Концентрация липидной частицы или липид- нуклеиновая кислота частицы в фармацевтических препаратах может широко варьироваться, т.е. от менее чем около 0,01%, как правило, или по меньшей мере около 0,05-5%, до целых 10 до 30% по весу и будет выбрана прежде всего от объема жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть увеличена, чтобы снизить нагрузку жидкостью, связанную с лечением. Это может быть особенно желательным у больных с атеросклерозом, связанным с застойной сердечной недостаточностью или тяжелой артериальной гипертензией. Кроме того, комплексы, состоящие из раздражающих липидов, могут быть разведены до низких концентраций, чтобы уменьшить воспаление в месте введения. В одной группе вариантов воплощения нуклеиновые кислоты будут иметь прилагаемые этикетки и будут использоваться для диагностики (с указанием наличия дополнительных нуклеиновых кислот). В этом случае количество комплексов введения будет зависеть от конкретной используемой этикетки, болезненного состояния, диагностируемого по мнению врача, но обычно составляет от около 0,01 до около 50 мг на килограмм веса тела, предпочтительно от около 0,1 до около 5 мг/кг массы тела.The concentration of the lipid particle or lipid nucleic acid particle in pharmaceutical preparations can vary widely, i. e. from less than about 0.01%, typically, or at least about 0.05-5%, up to as much as 10 to 30% by weight, and will be selected primarily on fluid volume, viscosity, and the like, according to with the specific route of administration chosen. For example, the concentration may be increased to reduce the fluid load associated with the treatment. This may be especially desirable in patients with atherosclerosis associated with congestive heart failure or severe hypertension. In addition, complexes composed of irritating lipids can be diluted to low concentrations to reduce inflammation at the injection site. In one group of embodiments, the nucleic acids will be labeled and used for diagnostics (indicating the presence of additional nucleic acids). In this case, the amount of administration complexes will depend on the particular label used, the medical condition being diagnosed by the physician, but is typically about 0.01 to about 50 mg per kilogram of body weight, preferably about 0.1 to about 5 mg/kg body weight.

Как отмечалось выше, липид- терапевтический агент (например, нуклеиновые кислоты) частицы могут включать в себя полиэтиленгликоль (PEG), модифицированные фосфолипиды, PEG керамиды, или ганглиозид GMl-модифицированный липид, или другие липиды, эффективные для предотвращения или ограничения агрегации. Добавление таких компонентов не только предотвращает сложные агрегации. Скорее, оно может также служить средством для увеличения времени циркуляции и повышения доставки липид-нуклеиновая кислота композиции в ткани-мишени.As noted above, the lipid therapeutic agent (eg, nucleic acid) particles may include polyethylene glycol (PEG), modified phospholipids, PEG ceramides, or ganglioside GMl-modified lipid, or other lipids effective to prevent or limit aggregation. Adding such components not only prevents complex aggregations. Rather, it may also serve as a means to increase circulation time and enhance delivery of the lipid-nucleic acid composition to target tissues.

Липид-терапевтический агент композиции также могут быть представлены в виде набора. Комплект, как правило, будет состоять из контейнера, который делится на ячейки для хранения различных элементов комплекта. Комплект будет содержать частицы или фармацевтические композиции, предпочтительно в обезвоженном или концентрированном виде, с инструкциями по их регидратации илиThe lipid therapeutic agent compositions may also be presented as a kit. The kit will usually consist of a container that is divided into compartments to store the various elements of the kit. The kit will contain particles or pharmaceutical compositions, preferably in dehydrated or concentrated form, with instructions for rehydration or

- 70 039892 разбавлению и введению. В некоторых вариантах воплощения частицы содержат активное вещество, в то время как в других вариантах воплощения они его не содержат.- 70 039892 dilution and administration. In some embodiments, the particles contain an active agent, while in other embodiments they do not.

Способы производстваProduction methods

Способы изготовления катионных липидов, липидных частиц, содержащих их, и фармацевтических композиций, содержащих катионные липиды и/или липидные частицы описаны, например, в международных публикациях №№ WO 2010/054406, WO 2010/054401, WO 2010/054405, и WO 2010/054384, WO 2010/042877, WO 2010/129709, WO 2009/086558 и WO 2008/042973, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме.Methods for the manufacture of cationic lipids, lipid particles containing them, and pharmaceutical compositions containing cationic lipids and/or lipid particles are described, for example, in international publications No. WO 2010/054406, WO 2010/054401, WO 2010/054405, and WO 2010 /054384, WO 2010/042877, WO 2010/129709, WO 2009/086558 and WO 2008/042973, each of which is incorporated by reference in its entirety.

Способы получения липидных частиц и фармацевтических композиций, содержащих липидные частицы также описаны, например, в публикациях США №№ 2004/0142025, 2006/0051405 и 2007/0042031, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме. В дополнение, способы получения липидных частиц, в том числе связанных с терапевтическим агентом, например, нуклеиновыми кислотами, описаны. В описанных здесь способах смесь липидов является сочетанием с буфером водного раствора нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновые кислоты, инкапсулированные в липидные частицы. В одном из вариантов воплощения инкапсулированные нуклеиновые кислоты, присутствуют в смеси нуклеиновая кислота/липид в соотношении от примерно 3 мас.% до примерно 25 мас.%, предпочтительно от 5 до 15 мас.%. Промежуточная смесь может быть опционального размера для получения частицы липидов с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, в которой липидные порции однослойной везикулы, предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от около 40 до 90 нм. pH затем поднимают, чтобы нейтрализовать хотя бы часть поверхностных зарядов на липид-нуклеиновые кислоты частицах, обеспечивая тем самым хотя бы частичную нейтрализацию поверхности липид- инкапсулированные нуклеиновые кислоты композиции.Methods for preparing lipid particles and pharmaceutical compositions containing lipid particles are also described, for example, in US Publications Nos. 2004/0142025, 2006/0051405 and 2007/0042031, each of which is incorporated by reference in its entirety. In addition, methods for producing lipid particles, including those associated with a therapeutic agent, such as nucleic acids, are described. In the methods described herein, the lipid mixture is combined with an aqueous nucleic acid buffer to form an intermediate mixture containing nucleic acids encapsulated in lipid particles. In one embodiment, the encapsulated nucleic acids are present in the nucleic acid/lipid mixture in a ratio of about 3 wt% to about 25 wt%, preferably 5 to 15 wt%. The intermediate mixture may be of an optional size to provide a nucleic acid-encapsulated lipid particle in which the lipid portions of a single-lamellar vesicle are preferably 30 to 150 nm in diameter, more preferably about 40 to 90 nm in diameter. The pH is then raised to neutralize at least some of the surface charges on the lipid-nucleic acid particles, thereby ensuring that the surface of the lipid-encapsulated nucleic acid composition is at least partially neutralized.

Например, в одном из вариантов воплощения раствор одного или нескольких липидов (в том числе катионного липида любого из описанных здесь вариантов воплощения) в органическом растворе (например, этаноле) подготовлен. Кроме того, раствор одного или более активных (терапевтических) агентов (таких, как, например, молекулы миРНК или 1: 1 молярная смесь двух молекул миРНК) в водном буферном (например, цитрат буфер) растворе приготовлен. Эти два раствора смешивают и разбавляют с образованием коллоидной суспензии частиц миРНК липидов. В одном варианте воплощения частицы миРНК липидов имеют средний размер частиц около 80-90 нм. В других вариантах воплощения дисперсию фильтруют через 0,45/2 мкм фильтры, концентрируют и диафильтруют посредством тангенциальной фильтрации. В еще одном варианте воплощения концентрацию полученного продукта доводят до примерно 2 мг/мл. В еще одном варианте воплощения продукт фильтруют, асептически фильтруют и упаковывают. Как описано выше, некоторые из этих катионных липидов являются аминокислотными липидами, которые имеют заряженные при pH ниже рК_а аминогруппы и по существу нейтральны при pH выше рК_а. Эти катионные липиды называют титруемыми катионными липидами и они могут быть использованы в композициях с использованием двух этапов. Во-первых, липидные пузырьки могут быть сформированы при низком pH с титруемым катионным липидом и другими компонентами везикул в присутствии нуклеиновых кислот. Таким образом, пузырьки будут инкапсулированы и вовлекут нуклеиновые кислоты. Во-вторых, поверхностный заряд вновь образованных пузырьков может быть нейтрализован увеличением pH среды до уровня выше рК_а настоящего титруемого катионного липида, т.е. к физиологическому pH или выше. Особенно преимущественные аспекты этого процесса включают в себя поверхностное удаление с любой поверхности адсорбированных нуклеиновых кислот, в результате нуклеиновые кислоты доставляются средствами, которые имеют нейтральную поверхность. Липосомы, или липидные частицы, имеющие нейтральную поверхность, как ожидается, будут избегать быстрого выведения из обращения и избегать определенной токсичности, которая связана с катионными липосомами препаратов. Дополнительные подробности, касающиеся этих видов использования таких титруемых катионных липидов в получении нуклеиновые кислоты- липиды частиц, приведены в патенте США 6287591 и патенте США 6858225, которые включены сюда в качестве ссылки.For example, in one embodiment, a solution of one or more lipids (including a cationic lipid of any of the embodiments described herein) in an organic solution (eg, ethanol) is prepared. In addition, a solution of one or more active (therapeutic) agents (such as, for example, siRNA molecules or a 1:1 molar mixture of two siRNA molecules) in an aqueous buffer (eg, citrate buffer) solution is prepared. These two solutions are mixed and diluted to form a colloidal suspension of lipid siRNA particles. In one embodiment, the lipid siRNA particles have an average particle size of about 80-90 nm. In other embodiments, the dispersion is filtered through 0.45/2 µm filters, concentrated and diafiltered by tangential filtration. In yet another embodiment, the concentration of the resulting product is adjusted to about 2 mg/mL. In yet another embodiment, the product is filtered, aseptically filtered and packaged. As described above, some of these cationic lipids are amino acid lipids that have charged amino groups at pH below pKa _and are substantially neutral at pH above _pKa . These cationic lipids are referred to as titratable cationic lipids and can be used in compositions using two steps. First, lipid vesicles can be formed at low pH with titratable cationic lipid and other vesicle components in the presence of nucleic acids. Thus, the vesicles will be encapsulated and entrain the nucleic acids. Secondly, the surface charge of the newly formed bubbles can be neutralized by increasing the pH of the medium to a level above the pKa of _the present titratable cationic lipid, i.e. to physiological pH or higher. Particularly advantageous aspects of this process include surface removal from any surface of adsorbed nucleic acids, whereby the nucleic acids are delivered by means that have a neutral surface. Liposomes, or lipid particles having a neutral surface, are expected to avoid rapid withdrawal from circulation and avoid certain toxicity that is associated with cationic liposome drugs. Additional details regarding these uses of such titratable cationic lipids in the production of nucleic acid lipid particles are provided in US Pat. No. 6,287,591 and US Pat. No. 6,858,225, which are incorporated herein by reference.

Надо также отметить, что пузырьки, которые образуются таким образом, обеспечивают образование одинакового размера пузырька с высоким содержанием нуклеиновых кислот. Кроме того, пузырьки могут иметь размер от примерно 30 до примерно 150 нм, более предпочтительно от около 30 до около 90 нм.It should also be noted that the vesicles that are formed in this way ensure the formation of a uniform sized vesicle with a high content of nucleic acids. In addition, the bubbles may have a size of from about 30 to about 150 nm, more preferably from about 30 to about 90 nm.

Не желая быть связанным с какой-либо конкретной теорией, считается, что самая высокая эффективность инкапсуляции нуклеиновых кислот является результатом электростатического взаимодействия при низких значениях pH. При pH кислом (например, pH 4,0) поверхность пузырьков заряжена и связывает части нуклеиновых кислот посредством электростатических взаимодействий. Когда внешний кислый буфер заменяют более нейтральным буфером (например, pH 7,5),на поверхности липидной частицы или липосомы нейтрализуются, что позволяет любой внешней нуклеиновой кислоте быть удаленной. Более подробная информацию о процессе получения приводится в различных изданиях (например, патент США 6287591 и патент США 6858225).Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that the highest efficiency of encapsulation of nucleic acids is the result of electrostatic interaction at low pH values. At an acidic pH (eg pH 4.0) the surface of the vesicles is charged and binds nucleic acid moieties via electrostatic interactions. When the external acidic buffer is replaced with a more neutral buffer (eg pH 7.5), the surface lipid particles or liposomes are neutralized, allowing any external nucleic acid to be removed. More detailed information about the preparation process is given in various publications (for example, US patent 6287591 and US patent 6858225).

В связи с вышеизложенным, способы получения липиды/нуклеиновые кислоты составов описаны.In connection with the foregoing, methods for preparing lipid/nucleic acid formulations are described.

- 71 039892- 71 039892

В описанных здесь способах смесь липидов в сочетании с буфером водного раствора нуклеиновой кислоты для получения промежуточных смесей, содержащих нуклеиновые кислоты, инкапсулированные в липидные частицы, например, где инкапсулированные нуклеиновые кислоты, присутствующие в нуклеиновая кислота/липид отношении примерно от 10 мас.% до примерно 20 мас.%. Промежуточная смесь может быть опционального размера для получения частицы липидов с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, в которой липидные порции представляют собой однослойные везикулы, предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от 40 до 90 нм. pH затем поднимают, чтобы нейтрализовать хотя бы часть поверхностных зарядов на липид-нуклеиновые кислоты частицах, обеспечивая тем самым хотя бы частичную нейтрализацию поверхности липидинкапсулированные нуклеиновые кислоты композиции.In the methods described herein, a mixture of lipids is combined with an aqueous nucleic acid buffer to produce intermediate mixtures containing nucleic acids encapsulated in lipid particles, for example, wherein the encapsulated nucleic acids are present in a nucleic acid/lipid ratio of from about 10% by weight to about 20 wt%. The intermediate mixture can be of an optional size to produce a nucleic acid-encapsulated lipid particle in which the lipid portions are single-layered vesicles, preferably with a diameter of 30 to 150 nm, more preferably 40 to 90 nm. The pH is then raised to neutralize at least some of the surface charges on the lipid-encapsulated nucleic acid particles, thereby providing at least partial surface neutralization of the lipid-encapsulated nucleic acid composition.

В некоторых вариантах воплощения смесь липидов включает, по меньшей мере, два липидных компонента: первый компонент - липиды, которые выбирают из липидов, которые имеют рК_а, как катионные липиды при pH ниже рК_а и нейтральные при pH выше рК_а, и второй компонент - липиды, которые выбирают из липидов, которые препятствуют агрегации частиц во время формирование липид нуклеиновая кислота частиц. В конкретных вариантах воплощения аминолипиды являются катионными липидами.In some embodiments, the lipid mixture includes at least two lipid components: the first component is lipids that are selected from lipids that have pKa _as cationic lipids at a pH below pKa _and neutral at a pH above pKa , _and the second component - lipids, which are selected from lipids that prevent particle aggregation during the formation of the lipid nucleic acid particles. In specific embodiments, the aminolipids are cationic lipids.

При приготовлении нуклеиновые кислоты-липид частиц, смесь липидов, как правило, является раствором липидов в органическом растворителе. Эта смесь липидов может быть высушена с образованием тонкой пленки или лиофилизирована с получением порошка, прежде чем гидратирована с водным буфером для формирования липосом. Кроме того, в предпочтительном способе, смеси липидов могут быть растворены в воде, смешанной со спиртом, таким как этанол, и этот спиртовой раствор добавляют к водному буферу, в результате происходит спонтанное образование липосом. В большинстве вариантов воплощения спирт используется в том виде, в котором он имеется в продаже. Например, этанол может использоваться в качестве абсолютного этанола (100%), или 95% этанола, остальное вода. Этот способ более подробно описан в патенте США № 5976567).When preparing nucleic acid-lipid particles, the lipid mixture is typically a solution of the lipid in an organic solvent. This lipid mixture may be dried to form a thin film or lyophilized to form a powder before being hydrated with an aqueous buffer to form liposomes. Further, in a preferred method, mixtures of lipids can be dissolved in water mixed with an alcohol such as ethanol and this alcohol solution added to an aqueous buffer, resulting in spontaneous formation of liposomes. In most embodiments, the alcohol is used as it is commercially available. For example, ethanol can be used as absolute ethanol (100%), or 95% ethanol, the rest water. This method is described in more detail in US patent No. 5976567).

В одном варианте воплощения смесь липидов представляет собой смесь катионных липидов, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стеринов (например, холестерин) и PEGмодифицированных липидов (например, PEG-DMG или PEG-DMA) в спиртовом растворителе. В предпочтительных вариантах воплощения смесь липидов состоит в основном из катионных липидов, нейтральных липидов, холестерина и PEG-модифицированных липидов в спирте, более предпочтительно этаноле. В других предпочтительных вариантах воплощения первый раствор состоит из указанной выше смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионного липида:5-45% нейтральных липидов:20-55% холестерина:0,5-15% PEG-модифицированных липидов. В еще более предпочтительном варианте воплощения, первый раствор состоит в основном из смеси катионных липидов, выбранных из липидов, описанных в табл. 1-5, DSPC, Chol и PEG-DMG или PEG-DMA, более предпочтительно в молярном соотношении примерно 20-60% катионного липида:5-25% DSPC:25-55% Chol:0,5-15% PEG-DMG или PEG-DMA. В конкретных вариантах воплощения молярное липидное отношение составляет примерно 40/10/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA), 35/15/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA) или 52/13/30/5 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA). В другой группе предпочтительных вариантов воплощения нейтральные липиды в этих композициях заменяются POPC, DPPC, DOPE или SM.In one embodiment, the lipid mixture is a mixture of cationic lipids, neutral lipids (other than cationic lipids), sterols (eg, cholesterol), and PEG-modified lipids (eg, PEG-DMG or PEG-DMA) in an alcoholic solvent. In preferred embodiments, the lipid mixture consists primarily of cationic lipids, neutral lipids, cholesterol and PEG-modified lipids in alcohol, more preferably ethanol. In other preferred embodiments, the first solution consists of the above mixture of lipids in a molar ratio of about 20-70% cationic lipid: 5-45% neutral lipids: 20-55% cholesterol: 0.5-15% PEG-modified lipids. In an even more preferred embodiment, the first solution consists essentially of a mixture of cationic lipids selected from the lipids described in Table 1. 1-5, DSPC, Chol and PEG-DMG or PEG-DMA, more preferably in a molar ratio of about 20-60% cationic lipid: 5-25% DSPC: 25-55% Chol: 0.5-15% PEG-DMG or PEG-DMA. In specific embodiments, the molar lipid ratio is about 40/10/40/10 (mol % cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA), 35/15/40/10 (mol % cationic lipids/ DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA) or 52/13/30/5 (mol % cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA). In another group of preferred embodiments, the neutral lipids in these compositions are replaced by POPC, DPPC, DOPE or SM.

Липидная смесь является сочетанием с буферным водным раствором, который может содержать нуклеиновые кислоты. Буферный водный раствор, как правило, раствор, в котором буфер имеет pH меньше, чем рКа протонированных липидов в смеси липидов. Примеры подходящих буферов включают цитрат, фосфат, ацетат, MES. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительные буферы будут находиться в диапазоне 1-1000 мМ по аниону, в зависимости от химии нуклеиновых кислот инкапсуляции, и оптимизации концентрации буфера могут быть существенными для достижения высоких уровней загрузки (см., например, патент США 6287591 и патент США 6858225, каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме). Кроме того, чистую воду подкисляют до pH 5-6 с хлоридом, сульфатом и т.п., которые могут быть полезны. В этом случае он может быть подходящим, чтобы добавить 5% раствор глюкозы или другое неионное растворенное вещество, которое будет балансировать осмотический потенциал через мембраны частицы, когда частицы диализуются для удаления этанола, увеличения pH или смешиваются с фармацевтически приемлемым носителем, таким как обычный физиологический раствор. Количество нуклеиновых кислот в буфере может варьироваться, но обычно составляет от около 0,01 мг/мл до около 200 мг/мл, более предпочтительно от около 0,5 мг/мл до около 50 мг/мл.The lipid mixture is combined with a buffered aqueous solution which may contain nucleic acids. A buffered aqueous solution is typically a solution in which the buffer has a pH less than the pKa of the protonated lipids in the lipid mixture. Examples of suitable buffers include citrate, phosphate, acetate, MES. A particularly preferred buffer is citrate buffer. Preferred buffers will be in the anionic range of 1-1000 mM, depending on the encapsulation nucleic acid chemistry, and optimization of buffer concentration may be essential to achieve high loading levels (see, for example, US Patent 6,287,591 and US Patent 6,858,225, each of which incorporated by reference in its entirety). In addition, pure water is acidified to pH 5-6 with chloride, sulfate, etc., which may be useful. In this case, it may be appropriate to add a 5% glucose solution or other non-ionic solute that will balance the osmotic potential across the particle membranes when the particles are dialyzed to remove ethanol, increase pH, or mixed with a pharmaceutically acceptable carrier such as normal saline. . The amount of nucleic acids in the buffer may vary, but is typically from about 0.01 mg/mL to about 200 mg/mL, more preferably from about 0.5 mg/mL to about 50 mg/mL.

Смесь липидов и буферного водного раствора терапевтических нуклеиновых кислот объединяют, чтобы обеспечить промежуточные смеси. Промежуточные смеси, как правило, являются смесью липидных частиц, имеющих инкапсулированные нуклеиновые кислоты. Кроме того, промежуточная смесь может также содержать некоторую часть нуклеиновых кислот, которые крепятся к поверхности липидной частицы (липосомы или липидных пузырьков) за счет ионного притяжения отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и положительно заряженных липидов на поверхности липидных часA mixture of lipids and a buffered aqueous solution of therapeutic nucleic acids are combined to provide intermediate mixtures. Intermediate mixtures are typically a mixture of lipid particles having encapsulated nucleic acids. In addition, the intermediate mixture may also contain some of the nucleic acids that are attached to the surface of the lipid particle (liposomes or lipid vesicles) due to the ionic attraction of negatively charged nucleic acids and positively charged lipids on the surface of lipid cells.

- 72 039892 тиц (аминолипидов или других липидов, составляющих протонированный первый компонент липидов, положительно заряженных в буфере с pH меньше, чем рК_апротонированной группы липидов). В одной группе предпочтительных вариантов воплощения смесь липидов является спиртовым раствором липидов и объемы каждого из растворов регулируется таким образом, что после комбинации, в результате содержание алкоголя составляет от примерно 20% по объему до около 45% по объему. Способ объединения смесей может включать в себя любые из множества процессов, часто в зависимости от масштабов производства смеси. Например, при общем объеме, который составляет около 10-20 мл или менее, растворы могут быть объединены в пробирке и перемешаны вместе с помощью вихревого смесителя. Крупномасштабные процессы могут быть осуществлены в соответствующей посуде серийного производства.- 72 039892 particles (aminolipids or other lipids constituting the protonated first component of lipids positively charged in a buffer with a pH less than the pKa of _the protonated group of lipids). In one group of preferred embodiments, the lipid mixture is an alcoholic solution of lipids and the volumes of each of the solutions are adjusted such that after combination, the resulting alcohol content is from about 20% by volume to about 45% by volume. The method of combining mixtures may include any of a variety of processes, often depending on the scale of production of the mixture. For example, for a total volume that is about 10-20 ml or less, the solutions can be pooled in a tube and mixed together using a vortex mixer. Large-scale processes can be carried out in appropriate batch production vessels.

Опционально, липид-инкапсулированный терапевтический агент (например, нуклеиновые кислоты) комплексы, которые получают путем объединения смеси липидов и буферного водного раствора терапевтического агента (нуклеиновые кислоты), может быть рассчитан для достижения желаемого диапазона размеров с относительно узким распределением размеров липидных частиц. Предпочтительно, композиции, представленные здесь, будут такого размера, чтобы средний диаметр составлял от около 70 до около 200 нм, более предпочтительно от около 90 до около 130 нм. Некоторые методы доступны для определения размера липосом нужного размера. Один способ калибровки описан в патенте США № 4737323, который включен сюда в качестве ссылки. Ультразвуковое облучение суспензии липосом либо с помощью ванны либо ультразвуковым зондом производит постепенное уменьшение размеров вплоть до мелких однослойных везикул (SUV) менее 0,05 мкм в размере. Гомогенизация является другим способом, который опирается на сдвиг энергии фрагментов больших липосом на более мелкие. В обычной процедуре гомогенизации многослойные пузырьки циркулируют через стандартный эмульсионный гомогенизатор до выбранного размера липосомы, как правило, примерно от 0,1 до 0,5 мкм. В обоих способах распределение частиц по размерам можно контролировать с помощью обычного лазерного пучка определения размера частиц. Для некоторых способов здесь используется экструзия для получения одинакового размера пузырька.Optionally, lipid-encapsulated therapeutic agent (e.g., nucleic acids) complexes that are prepared by combining a mixture of lipids and a buffered aqueous solution of therapeutic agent (nucleic acids) can be designed to achieve the desired size range with a relatively narrow size distribution of lipid particles. Preferably, the compositions provided herein will be sized to have an average diameter of from about 70 to about 200 nm, more preferably from about 90 to about 130 nm. Several methods are available to size liposomes of the desired size. One calibration method is described in US Pat. No. 4,737,323, which is incorporated herein by reference. Ultrasonic irradiation of the suspension of liposomes either by bath or by an ultrasonic probe produces a gradual reduction in size down to small unilamellar vesicles (SUV) less than 0.05 μm in size. Homogenization is another method that relies on shifting the energy of large liposome fragments to smaller ones. In a typical homogenization procedure, the multilamellar vesicles are circulated through a standard emulsion homogenizer to a selected liposome size, typically about 0.1 to 0.5 microns. In both methods, the particle size distribution can be controlled using a conventional particle size laser beam. For some methods, extrusion is used here to obtain a uniform bubble size.

Экструзия липосом композиции через поликарбонатную мембрану с небольшими порами или асимметричную керамическую мембрану дает в результате относительно четко определенное распределение по размерам. Как правило, суспензия пропускается циклически через мембрану один или несколько раз, пока не достигается желаемое сложное распределение размера липосом. Липосомы могут последовательно выдавливаться через мембраны с меньшими порами, чтобы достичь постепенного сокращения размера липосом. В некоторых случаях липид-нуклеиновая кислота композиции, которые образуются, могут быть использованы без калибровки.Extrusion of the liposome composition through a small pore polycarbonate membrane or an asymmetric ceramic membrane results in a relatively well-defined size distribution. Typically, the suspension is cycled through the membrane one or more times until the desired complex liposome size distribution is achieved. Liposomes can be sequentially extruded through smaller pore membranes to achieve a gradual reduction in liposome size. In some cases, the lipid-nucleic acid compositions that are formed can be used without calibration.

В конкретных вариантах воплощения способы дополнительно включают стадию нейтрализации, по меньшей мере, некоторых из поверхностных зарядов на липидной части липид - нуклеиновая кислота композиции. По меньшей мере, частично нейтрализуя поверхностные заряды, разинкапсулированная нуклеиновая кислота, освобождается с поверхности липидных частиц и может быть удалена из состава при использовании обычных методов. Предпочтительно, разинкапсулированые и поверхностноадсорбированные нуклеиновые кислоты удаляют из полученной композиции путем обмена буферных растворов. Например, замена цитрат буфера (pH около 4,0, используемый для формирования составов) на HEPES буферный солевой (HBS pH около 7,5) раствор приводит к нейтрализации поверхности липосомы, и нуклеиновые кислоты высвобождаются с поверхности. Высвобожденные нуклеиновые кислоты могут быть удалены с помощью хроматографии с использованием стандартных способов, а затем переведены в буфер с pH выше рК_а использованных липидов.In specific embodiments, the methods further comprise the step of neutralizing at least some of the surface charges on the lipid portion of the lipid-nucleic acid composition. By at least partially neutralizing surface charges, the de-encapsulated nucleic acid is released from the surface of the lipid particles and can be removed from the formulation using conventional methods. Preferably, the de-encapsulated and surface-adsorbed nucleic acids are removed from the resulting composition by buffer exchange. For example, replacing citrate buffer (pH about 4.0, used to formulate formulations) with HEPES buffered saline (HBS pH about 7.5) results in neutralization of the liposome surface and nucleic acids are released from the surface. The released nucleic acids can be removed by chromatography using standard methods and then buffered at a pH above the pKa of _the lipids used.

Опционально липидные пузырьки (т.е. липидные частицы) могут быть сформированы путем гидратации в водном буфере и формирования с использованием любого из способов, описанных выше, до введения в их состав нуклеиновых кислот. Как описано выше, водный буфер должен иметь pH ниже рК_а аминолипидов. Раствор нуклеиновых кислот могут быть добавлен в эти предварительно сформированные пузырьки. Для обеспечения инкапсуляции нуклеиновых кислот в такие предварительно сформированные пузырьки смесь должна содержать алкоголь, такой как этанол. В случае этанола, он должен присутствовать в концентрации от около 20% (м/м) до около 45% (м/м). Кроме того, может быть необходимо нагреть смесь предварительно сформированных пузырьков и нуклеиновых кислот в водной смеси этанольного буфера до температуры от около 25°C до около 50°C в зависимости от состава липидных везикул и характера нуклеиновой кислоты. Это будет очевидно для специалиста в данной области, что оптимизация процесса инкапсуляции для достижения желаемого уровня нуклеиновых кислот в липидных везикулах потребует манипуляции переменными, такими как концентрация этанола и температура. Примеры подходящих условий для инкапсуляции нуклеиновых кислот приведены в примерах. После того, как нуклеиновые кислоты заключены в предварительно сформированные пузырьки, внешний pH может быть увеличен для, по меньшей мере частичной, нейтрализации заряда поверхности. Разинкапсулированые и поверхностно адсорбированные нуклеиновые кислоты могут быть удалены как описано выше.Optionally, lipid vesicles (ie, lipid particles) may be formed by hydration in an aqueous buffer and formation using any of the methods described above prior to incorporation of nucleic acids. As described above, the aqueous buffer should have a pH below the pKa of _the aminolipids. Nucleic acid solution can be added to these preformed vesicles. In order to encapsulate the nucleic acids in such preformed vesicles, the mixture must contain an alcohol such as ethanol. In the case of ethanol, it should be present at a concentration of from about 20% (m/m) to about 45% (m/m). In addition, it may be necessary to heat the mixture of preformed vesicles and nucleic acids in an aqueous mixture of ethanol buffer to a temperature of from about 25°C to about 50°C, depending on the composition of the lipid vesicles and the nature of the nucleic acid. It will be apparent to one of skill in the art that optimizing the encapsulation process to achieve the desired level of nucleic acids in lipid vesicles will require the manipulation of variables such as ethanol concentration and temperature. Examples of suitable conditions for the encapsulation of nucleic acids are given in the examples. After the nucleic acids are enclosed in preformed vesicles, the external pH can be increased to at least partially neutralize the surface charge. Unencapsulated and surface adsorbed nucleic acids can be removed as described above.

- 73 039892- 73 039892

Способы леченияMethods of treatment

Липидные частицы и композиции, описанные здесь, могут быть использованы для различных целей, в том числе доставки связанных или инкапсулированных терапевтических агентов к клеткам, как in vitro, так и in vivo. Соответственно, способы лечения заболеваний или нарушений у субъекта, нуждающегося в этом, могут включать в себя контакт субъекта с липидной частицей, связанной с подходящим терапевтическим средством.The lipid particles and compositions described herein can be used for a variety of purposes, including the delivery of bound or encapsulated therapeutic agents to cells, both in vitro and in vivo. Accordingly, methods of treating diseases or disorders in a subject in need thereof may include contacting the subject with a lipid particle associated with a suitable therapeutic agent.

Как описано здесь, липидные частицы особенно полезны для доставки нуклеиновых кислот, в том числе, например, молекул миРНК и плазмид. Таким образом, липидные частицы и композиции могут быть использованы для модуляции экспрессии целевых генов и белков, как in vitro, так и in vivo, путем контакта с клетками липидных частиц, связанных с нуклеиновой кислотой, которая снижает экспрессию генов мишеней (например, миРНК) или нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для увеличения экспрессии нужного белка (например, плазмиды, кодирующей нужный белок).As described here, lipid particles are particularly useful for the delivery of nucleic acids, including, for example, siRNA molecules and plasmids. Thus, lipid particles and compositions can be used to modulate the expression of target genes and proteins, both in vitro and in vivo, by contacting cells with lipid particles associated with a nucleic acid that reduces the expression of target genes (e.g., siRNA) or nucleic acids that can be used to increase the expression of the desired protein (for example, a plasmid encoding the desired protein).

Липидные частицы могут быть использованы для доставки терапевтических агентов в клетку, in vitro или in vivo. В конкретных вариантах воплощения терапевтический агент представляет собой нуклеиновые кислоты, которые поступают в клетку с помощью нуклеиновых кислот - липидных частиц. В то время как следующее описание различных способов применения липидных частиц и связанных с ними фармацевтических композиций является примером описания связанных с нуклеиновой кислотой липидных частиц, следует понимать, что эти способы и композиции могут быть легко приспособлены для доставки любого терапевтического средства для лечения любого заболевания или расстройства, которые выиграют от такого лечения.Lipid particles can be used to deliver therapeutic agents into a cell, in vitro or in vivo. In specific embodiments, the therapeutic agent is nucleic acids that enter the cell via nucleic acids - lipid particles. While the following description of various methods of using lipid particles and associated pharmaceutical compositions is exemplary of describing nucleic acid-associated lipid particles, it should be understood that these methods and compositions can be readily adapted to deliver any therapeutic agent for the treatment of any disease or disorder. who would benefit from such treatment.

В некоторых вариантах воплощения способы введения нуклеиновых кислот в клетку описаны. Предпочтительные нуклеиновые кислоты для введения в клетки - миРНК, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые и рибозимы. Эти способы могут быть выполнены при контакте частиц или композиций с клетками в течение периода времени, достаточного для внутриклеточной доставки.In some embodiments, methods for introducing nucleic acids into a cell are described. Preferred nucleic acids for introduction into cells are siRNAs, immunostimulatory oligonucleotides, plasmids, antisense, and ribozymes. These methods can be performed by contacting particles or compositions with cells for a period of time sufficient for intracellular delivery.

Композиции могут адсорбироваться практически в любой тип клеток. После адсорбирования, нуклеиновые кислоты - липидные частицы могут быть либо эндоцитированы частично клетками, путем обмена липидов с клеточными мембранами, или сливаются с клетками. Передача или включения в состав нуклеиновокислотной части комплекса может осуществляться с помощью любого из этих путей. Не желая быть ограниченными, можно считать, что в случае частиц, поступивших в клетку путем эндоцитоза, частицы затем взаимодействуют с эндосомной мембраной, что приводит к дестабилизации мембраны эндосом, возможно, с образованием небислойной фазы, в результате чего происходит введение инкапсулированных нуклеиновых кислот в цитоплазму клетки. Точно так же в случае прямого слияния частиц с клеточной плазматической мембраной, когда происходит слияние, липосомальная мембрана интегрирована в клеточные мембраны, и содержимое липосомы комбинируется с внутриклеточной жидкостью. Контакты между клетками и липид-нуклеиновые кислоты композициями, когда проводятся in vitro, происходят в биологически совместимой среде. Концентрация композиции может варьироваться в зависимости от конкретного применения, но обычно составляет от около 1 мкмоль и до около 10 ммоль. В некоторых вариантах воплощения обработка клеток липидной композицией нуклеиновых кислот, как правило, будет осуществляться при физиологической температуре (около 37°C) в течение периода времени от 1 до 24 ч, предпочтительно от 2 до 8 ч. При применении in vitro, доставка нуклеиновых кислот может быть в любую клетку, выращенную в культуре, будь то растительного или животного происхождения, позвоночных и беспозвоночных, а также любые ткани или типы. В предпочтительных вариантах воплощения клетки будут клетками животных, более предпочтительно - клетками млекопитающих, наиболее предпочтительно - клетками человека.The compositions can be adsorbed to virtually any cell type. After adsorption, nucleic acid-lipid particles can either be partially endocytosed by cells, by lipid exchange with cell membranes, or fused with cells. Transfer or incorporation into the nucleic acid part of the complex can be carried out using any of these ways. Without wishing to be limited, it can be assumed that in the case of particles entering the cell by endocytosis, the particles then interact with the endosomal membrane, which leads to destabilization of the endosome membrane, possibly with the formation of a non-bilayer phase, resulting in the introduction of encapsulated nucleic acids into the cytoplasm cells. Similarly, in the case of direct fusion of particles with the cell plasma membrane, when the fusion occurs, the liposomal membrane is integrated into the cell membranes and the content of the liposome is combined with the intracellular fluid. Contacts between cells and lipid-nucleic acid compositions, when carried out in vitro, take place in a biologically compatible environment. The concentration of the composition may vary depending on the particular application, but is usually from about 1 µmol to about 10 mmol. In some embodiments, treatment of cells with a lipid composition of nucleic acids will typically be performed at physiological temperature (about 37° C.) for a period of 1 to 24 hours, preferably 2 to 8 hours. When used in vitro, delivery of nucleic acids can be in any cell grown in culture, whether of vegetable or animal origin, vertebrates and invertebrates, and any tissues or types. In preferred embodiments, the cells will be animal cells, more preferably mammalian cells, most preferably human cells.

В одной группе вариантов воплощения липид-нуклеиновых кислот суспензия частиц добавляется к 60-80% вырожденному покрытию клеток, имеющему плотность клеток от примерно 10³ до примерно 105 клеток/мл, более предпочтительно около 2х10⁴ клеток/мл. Концентрация суспензии, добавляемой к клеткам, предпочтительно равна примерно от 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно примерно 1 мкг/мл.In one group of lipid nucleic acid embodiments, the particle suspension is added to a 60-80% confluent cell coating having a cell density ^of about 103 to about 105 cells/mL, more preferably about ² x 104 cells/mL. The concentration of the suspension added to the cells is preferably about 0.01 to 20 µg/ml, more preferably about 1 µg/ml.

В другом варианте воплощения липидные частицы могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в клетки или клеточные линии (например, линии опухолевых клеток). Неограничивающие примеры таких клеточных линий включают в себя:In another embodiment, lipid particles can be used to deliver nucleic acids to cells or cell lines (eg, tumor cell lines). Non-limiting examples of such cell lines include:

HELA (АТСС CatN: CCL-2), КВ (АТСС CatN: CCL-17), НЕРЗВ (АТСС CatN:HELA (ATCC CatN: CCL-2), HF (ATCC CatN: CCL-17), NERZV (ATCC CatN:

НВ-8064), SKOV-3 (АТСС CatN: НТВ-77), НСТ-116 (АТСС CatN: CCL-247), НТ-29 (АТСС CatN: НТВ-38), РС-3 (АТСС CatN: CRL-1435), А549 (АТСС CatN: CCL-185), MDA-MB-231 (АТСС CatN: НТВ-26).HB-8064), SKOV-3 (ATCC CatN: NTV-77), HCT-116 (ATCC CatN: CCL-247), NT-29 (ATCC CatN: NTV-38), RS-3 (ATCC CatN: CRL- 1435), A549 (ATCC CatN: CCL-185), MDA-MB-231 (ATCC CatN: NTV-26).

Типичные области применения включают использование хорошо известных процедур для обеспечения внутриклеточной доставки миРНК, чтобы подавить или отключить специфические клеточные мишени. Альтернативные применения включают в себя доставку ДНК или мРНК последовательности, кодирующие терапевтически полезные полипептиды. Таким образом, терапия предназначена для гене- 74 039892 тического заболевания путем подачи недостаточных или отсутствующих генных продуктов (т.е. при дистрофии Дюшенна, см. Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989), а также для муковисцидоза, см. Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)). Другие применения композиции включают введение антисмысловых олигонуклеотидов в клетки (см., Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)).Typical applications include the use of well known procedures for intracellular delivery of siRNA to inhibit or disable specific cellular targets. Alternative uses include the delivery of DNA or mRNA sequences encoding therapeutically useful polypeptides. Thus, therapy is intended for a genetic disease by supplying deficient or missing gene products (i.e., in Duchenne dystrophy, see Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989) and also for cystic fibrosis, see Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)). Other uses of the composition include the introduction of antisense oligonucleotides into cells (see, Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)).

Кроме того, композиции могут быть также использованы для доставки нуклеиновых кислот в клетки in vivo, используя способы, которые известны специалистам в данной области. Что касается доставки ДНК или мРНК последовательности, Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993), включено здесь в качестве ссылки, описывает внутривенное введения цитомегаловируса (CMV) плазмиды для экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) с использованием комплексов DOTMA-DOPE.In addition, the compositions may also be used to deliver nucleic acids to cells in vivo using methods known to those skilled in the art. Regarding delivery of a DNA or mRNA sequence, Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993), incorporated herein by reference, describes the intravenous administration of a cytomegalovirus (CMV) plasmid for chloramphenicol acetyltransferase (CAT) expression using DOTMA-DOPE complexes .

Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993), включено здесь в качестве ссылки, описывает доставку муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) генов в эпителии дыхательных путей и альвеол легких мышей, с использованием липосом. Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989), включено здесь в качестве ссылки, описывает in vivo трансфекцию легких мышей с функционированием прокариотических генов, кодирующих внутриклеточный фермент, хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). Таким образом, композиции могут быть использованы в лечении инфекционных заболеваний.Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993), incorporated herein by reference, describes the delivery of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) genes to mouse airway and lung epithelium using liposomes. Brigham, et al., Am. J. Med. sci. 298:278-281 (1989), incorporated herein by reference, describes in vivo transfection of mouse lungs with functioning prokaryotic genes encoding the intracellular enzyme, chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Thus, the compositions can be used in the treatment of infectious diseases.

Для введения in vivo, фармацевтические композиции предпочтительно вводят парентерально, т. е. интраартикулярно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. В конкретных вариантах воплощения фармацевтические композиции вводят внутривенно или внутрибрюшинно при болюсной инъекции. Для примера, см. Stadler, et al., патент США № 5286634, который включен здесь в качестве ссылки. Внутриклеточная доставка нуклеиновых кислот также обсуждалась в Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), и Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993). Тем не менее другие способы терапии и введения на липидной основе описаны, например, Ruhman et al., патент США № 3993754;. Sears, патент США № 4145410; Papahadjopoulos et al., патент США № 4235871;. Schneider, патент США № 4224179;. Lenk et al., патент США № 4522803, а также Fountain et al., патент США № 4588578.For in vivo administration, the pharmaceutical compositions are preferably administered parenterally, ie intra-articularly, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously or intramuscularly. In specific embodiments, the pharmaceutical compositions are administered intravenously or intraperitoneally by bolus injection. For an example, see Stadler, et al., US patent No. 5286634, which is incorporated here by reference. Intracellular delivery of nucleic acids has also been discussed in Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), and Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993). However, other lipid-based therapies and administrations are described, for example, Ruhman et al., US Pat. No. 3,993,754;. Sears, US Pat. No. 4,145,410; Papahadjopoulos et al., US Pat. No. 4,235,871;. Schneider, US patent No. 4224179;. Lenk et al., US Pat. No. 4,522,803; and Fountain et al., US Pat. No. 4,588,578.

В других способах, фармацевтические препараты могут контактировать с тканью-мишенью путем прямого применения препарата в ткани. Применение может быть сделано топикально, открытой или закрытой процедурами. Топикально - это означает прямое применение фармацевтических препаратов в ткани, которая подвергается воздействию окружающей среды, таких как кожа, ротоглотка, наружный слуховой проход и тому подобное. Открытые процедуры - те процедуры, которые включают надрезание кожи пациента и непосредственно визуализацию основной ткани, к которой подаются фармацевтические препараты. Это обычно достигается путем хирургического вмешательства, такого как торакотомия для доступа к легким, брюшная лапаротомия для доступа к брюшной полости, или другого прямого хирургического подхода к ткани-мишени. Закрытые процедуры являются инвазивными процедурами, в которых внутренние ткани-мишени непосредственно не визуализируется, но доступны через вставку инструментов через небольшие раны на коже. Например, препараты могут быть введены в брюшину хирургической иглой. Кроме того, фармацевтические препараты могут быть введены в мозговые оболочки и спинной мозг путем инфузии во время спинномозговой пункции вслед за соответствующим позиционированием пациента, как обычно практикуется для спинальной анестезии или метразамидной визуализации спинного мозга. Кроме того, препараты могут быть введены через эндоскопические устройства.In other methods, pharmaceuticals may be contacted with the target tissue by direct application of the drug to the tissue. Application can be done topically, by open or closed procedures. Topically - this means the direct application of pharmaceuticals to tissue that is exposed to the environment, such as the skin, oropharynx, external auditory canal, and the like. Open procedures are those procedures that involve incision of the patient's skin and direct visualization of the underlying tissue to which the pharmaceuticals are delivered. This is usually achieved by a surgical intervention such as a thoracotomy to access the lungs, an abdominal laparotomy to access the abdomen, or another direct surgical approach to the target tissue. Closed procedures are invasive procedures in which internal target tissues are not directly visualized but are accessible through the insertion of instruments through small wounds in the skin. For example, drugs may be injected into the peritoneum with a surgical needle. In addition, pharmaceuticals may be administered to the meninges and spinal cord by infusion at the time of lumbar puncture following appropriate positioning of the patient, as is commonly practiced for spinal anesthesia or metrazamide imaging of the spinal cord. In addition, drugs can be administered through endoscopic devices.

Липид-нуклеиновые кислоты композиции также могут быть введены в виде аэрозоля, который попадает в легкие (см., Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)) либо по прямым впрыскиванием в место заболевания (Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994)).The lipid-nucleic acid compositions can also be administered as an aerosol that enters the lungs (see, Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)) or by direct injection into site of disease (Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71 (1994)).

Дозы для липид-терапевтических агентов частиц будут зависеть от соотношения терапевтического агента к липиду и мнения лечащего врача в зависимости от возраста, веса и состояния пациента.Doses for particulate lipid therapeutic agents will depend on the ratio of therapeutic agent to lipid and the judgment of the attending physician, depending on the age, weight and condition of the patient.

В одном из вариантов воплощения способ модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида описаны. Эти способы обычно включают контактирование клетки с липидной частицей, связанной с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Как здесь используется, термин модулирующей относится к изменению экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. В разных вариантах воплощения модуляция может означать увеличение или расширение, или это может означать уменьшение или сокращение. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны в области науки и включают, например, способы, использующие обратной транскрипции полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимические методы. В конкретных вариантах воплощения уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида увеличивается или уменьшается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50% по сравнению с соответствующим контрольным значением.In one embodiment, a method for modulating the expression of a target polynucleotide or polypeptide is described. These methods typically involve contacting the cell with a lipid particle associated with a nucleic acid capable of modulating expression of the target polynucleotide or polypeptide. As used here, the term modulating refers to a change in the expression of a target polynucleotide or polypeptide. In various embodiments, modulation may mean an increase or expansion, or it may mean a decrease or reduction. Methods for measuring the level of expression of a target polynucleotide or polypeptide are known and available in the art and include, for example, methods using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods. In specific embodiments, the expression level of the target polynucleotide or polypeptide increases or decreases by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, or more than 50% compared to the corresponding control value.

Например, если повышенная экспрессия полипептида желательна, нуклеиновая кислота можетFor example, if increased expression of a polypeptide is desired, the nucleic acid can

- 75 039892 быть вектором экспрессии, который включает в себя полинуклеотид, который кодирует желаемый полипептид. С другой стороны, если уменьшить экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида, то нуклеиновыми кислотами могут быть, например, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК или микроРНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется к полинуклеотиду, который кодирует целевой полипептид, тем самым нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть плазмидой, которая экспрессирует такой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или микроРНК.- 75 039892 be an expression vector that includes a polynucleotide that encodes the desired polypeptide. On the other hand, if the expression of the target polynucleotide or polypeptide is reduced, the nucleic acids may be, for example, antisense oligonucleotides, siRNA or miRNA, which contains a polynucleotide sequence that specifically hybridizes to a polynucleotide that encodes the target polypeptide, thereby disrupting the expression of the target polynucleotide or polypeptide. In addition, the nucleic acids may be a plasmid that expresses such an antisense oligonucleotide, siRNA or microRNA.

В конкретных вариантах воплощения терапевтический агент выбран из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмыслового олигонуклеотида, и где миРНК, микроРНК, или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или ему комплементарный, так что экспрессия полипептида уменьшается.In specific embodiments, the therapeutic agent is selected from an siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, and a plasmid capable of expressing the siRNA, miRNA, or antisense oligonucleotide, and wherein the siRNA, microRNA, or antisense RNA contains a polynucleotide that specifically binds to a polynucleotide that encodes for, or complementary to, a polypeptide. so that expression of the polypeptide is reduced.

В других вариантах воплощения нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или функциональный вариант или его фрагмент, такой, что экспрессия полипептида или функционального варианта или фрагмента увеличивается.In other embodiments, the nucleic acid is a plasmid that encodes a polypeptide or functional variant or fragment, such that expression of the polypeptide or functional variant or fragment is increased.

В соответствующих вариантах воплощения способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося избыточной экспрессией полипептида в субъекте, включает в себя предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтический агент выбран из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способных экспрессировать миРНК, микроРНК, или антисмыслового олигонуклеотида, и где миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или комплементарный ему.In appropriate embodiments, a method of treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject comprises providing the subject with a pharmaceutical composition wherein the therapeutic agent is selected from an siRNA, a microRNA, an antisense oligonucleotide, and a plasmid capable of expressing the siRNA, microRNA, or antisense oligonucleotide, and wherein the siRNA, microRNA, or antisense RNA comprises a polynucleotide that specifically binds to a polynucleotide that encodes or is complementary to a polypeptide.

В одном варианте воплощения фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит или состоит по существу из смеси катионных липидов, выбранных из липидов, описанных в табл. 1-5, DSPC, Chol и PEG-DMG или PEG-DMA, например, в молярном соотношении примерно 2060% катионного липида: 5 -25% DSPC: 25- 55% Chol:0,5- 15% PEG- DMG или PEG-DMA, в котором липидная частица ассоциирована с терапевтической нуклеиновой кислотой. В конкретных вариантах воплощения молярное липидное отношение составляет примерно 40/10/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEG-DMA), 35/15/40/10 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEGDMG или PEG-DMA) или 52/13/30/5 (мол.% катионных липидов/DSPC/Chol/PEG-DMG или PEGDMA). В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменяют на POPC, DPPC, DOPE или SM.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a lipid particle that consists or consists essentially of a mixture of cationic lipids selected from the lipids described in table. 1-5, DSPC, Chol and PEG-DMG or PEG-DMA, for example, in a molar ratio of about 2060% cationic lipid: 5-25% DSPC: 25-55% Chol: 0.5-15% PEG-DMG or PEG -DMA, in which the lipid particle is associated with a therapeutic nucleic acid. In specific embodiments, the molar lipid ratio is about 40/10/40/10 (mol % cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEG-DMA), 35/15/40/10 (mol % cationic lipids/ DSPC/Chol/PEGDMG or PEG-DMA) or 52/13/30/5 (mol % cationic lipids/DSPC/Chol/PEG-DMG or PEGDMA). In another group of embodiments, the neutral lipid in these compositions is replaced with POPC, DPPC, DOPE, or SM.

В другом родственном варианте воплощения способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида в субъекте, включает в себя предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтический агент представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.In another related embodiment, a method of treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject comprises providing the subject with a pharmaceutical composition wherein the therapeutic agent is a plasmid that encodes a polypeptide or a functional variant or fragment thereof.

Способ индукции иммунного ответа у субъекта может включать предоставление субъекту фармацевтической композиции, в которой терапевтическим средством является иммуностимулирующий олигонуклеотид. В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ является гуморальным или мукозальным иммунным ответом.A method for inducing an immune response in a subject may include providing the subject with a pharmaceutical composition wherein the therapeutic agent is an immunostimulatory oligonucleotide. In some embodiments, the immune response is a humoral or mucosal immune response.

В других вариантах воплощения фармацевтическая композиция предоставляется субъекту в сочетании с вакциной или антигеном. Таким образом, вакцины могут включать липидную частицу, которая включает в себя иммуностимулирующий олигонуклеотид, а также связанный антиген, с которым иммунный ответ является лучшим. В конкретных вариантах воплощения антиген является антигеном опухоли или связан с инфекционным агентом, таким как, например, вирусы, бактерии или паразиты.In other embodiments, the pharmaceutical composition is provided to the subject in combination with a vaccine or antigen. Thus, vaccines may include a lipid particle that includes an immunostimulatory oligonucleotide as well as an associated antigen with which the immune response is best. In specific embodiments, the antigen is a tumor antigen or is associated with an infectious agent such as, for example, viruses, bacteria, or parasites.

Различные опухолевые антигены, антигены инфекционных агентов, и антигены, связанные с другими заболеваниями, хорошо известны в данной области, и примеры из них описаны в цитируемых здесь источниках. Примеры подходящих антигенов включают, но не ограничиваются этим, полипептидные антигены и ДНК-антигены. Конкретными примерами антигена являются антигены гепатита A, гепатита B, оспы, полиомиелита, сибирской язвы, гриппа, сыпного тифа, столбняка, кори, ротавируса, дифтерии, коклюша, туберкулеза и краснухи. В предпочтительном варианте воплощения антиген гепатита B является рекомбинантным антигеном. В других аспектах антиген гепатита является рекомбинантным антигеном. В другом аспекте антиген является антигеном опухоли. Примерами таких антигенов опухолей являются MUC-1, EBV антигены и антигены, связанные с лимфомой Беркитта. В еще одном аспекте антиген является антигеном тирозиназ-связанного белка опухолевого рекомбинантного антигена. Специалистам в данной области известны другие антигены, пригодные для использования.Various tumor antigens, antigens of infectious agents, and antigens associated with other diseases are well known in this field, and examples of them are described in the sources cited here. Examples of suitable antigens include, but are not limited to, polypeptide antigens and DNA antigens. Specific examples of the antigen are antigens of hepatitis A, hepatitis B, smallpox, polio, anthrax, influenza, typhus, tetanus, measles, rotavirus, diphtheria, whooping cough, tuberculosis and rubella. In a preferred embodiment, the hepatitis B antigen is a recombinant antigen. In other aspects, the hepatitis antigen is a recombinant antigen. In another aspect, the antigen is a tumor antigen. Examples of such tumor antigens are MUC-1, EBV antigens, and antigens associated with Burkitt's lymphoma. In yet another aspect, the antigen is a tyrosinase-associated protein antigen of a tumor recombinant antigen. Those skilled in the art are aware of other antigens suitable for use.

Опухолевые антигены, пригодные для использования, включают в себя как мутированные, так и немутированные молекулы, которые могут указывать на один тип опухоли, распределяются между несколькими типами опухолей, и/или исключительно экспрессируются или избыточно экспрессируются в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. В дополнение к белкам и гликопротеинам, опухоль-специфические формы экспрессируют углеводы, ганглиозиды, гликолипиды и муцин также были документированы. Примерами антигенов опухолей для использования в субъекте являютсяUseful tumor antigens include both mutated and non-mutated molecules that may be indicative of a single tumor type, are distributed among multiple tumor types, and/or are exclusively or overexpressed in tumor cells relative to normal cells. In addition to proteins and glycoproteins, tumor-specific forms express carbohydrates, gangliosides, glycolipids, and mucin have also been documented. Examples of tumor antigens for use in a subject are

- 76 039892 вакцины рака, которые включают белковые продукты онкогенов, генов-супрессоров опухолей и других генов с мутациями или перестановками, уникальными для опухолевых клеток, активизируемых эмбриональных генных продуктов, онкофетальных антигенов, тканьспецифических (но не опухольспецифические) антигенов дифференциации, рецепторов факторов роста, клеточной поверхности углеводных остатков, иностранных вирусных белков и ряда других собственных белков.- 76 039892 cancer vaccines, which include protein products of oncogenes, tumor suppressor genes and other genes with mutations or permutations unique to tumor cells, activated embryonic gene products, oncofetal antigens, tissue-specific (but not tumor-specific) differentiation antigens, growth factor receptors, cell surface of carbohydrate residues, foreign viral proteins and a number of other own proteins.

Конкретные варианты воплощения опухолевых антигенов включают, например, мутировавшие антигены, такие как белковые продукты Ras p21 протоонкогенов, супрессоры опухолей p53 и BCR-abl онкогенов, а также CDK4, MUM1, каспазы 8 и beta-катенин; сверхэкспрессированные антигены, такие как галектин 4, галектин 9, карбоангидразы, альдолаза A, PRAME, Her2/neu, ErbB 2 и КСА, онкофетальные антигены, такие как альфа-фетопротеин (AFP), хорионического гонадотропина человека (hCG); собственные антигены, такие как раковоэмбриональный антиген (CEA) и антигены дифференциации меланоцитов, такие как Mart 1/Melan A, gp100, gp75, тирозиназы, TRP1 и TRP2; антигены простаты, таких как PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 и PSM-P2; реактивированные эмбриональные генные продукты, таких как MAGE I, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE и другие антигены рака яичка, такие как NY-ESO1, SSX2 и SCP1; муцины, такие как Muc-1 и Muc-2; ганглиозиды, такие как GM2, GD2 и GD3, нейтральные гликолипиды и гликопротеины, такие как Lewis (y) и globo-H; и гликопротеины, такие как Tn, Томпсона-Фрейденрейха антиген (TF) и sTn. Также включают как опухольассоциированные антигены здесь - целые клетки и клеточные лизаты опухолей, а также иммуногенных их частей, а также иммуноглобулины идиотипов, экспрессированные на моноклональных пролиферирующих лимфоцитах B для использования против B клеточной лимфомы.Specific embodiments of tumor antigens include, for example, mutated antigens such as protein products of Ras p21 proto-oncogenes, tumor suppressors p53 and BCR-abl oncogenes, as well as CDK4, MUM1, caspase 8 and beta-catenin; overexpressed antigens such as galectin 4, galectin 9, carbonic anhydrases, aldolase A, PRAME, Her2/neu, ErbB 2 and KCA; oncofetal antigens such as alpha-fetoprotein (AFP), human chorionic gonadotropin (hCG); self antigens such as cancer embryonic antigen (CEA) and melanocyte differentiation antigens such as Mart 1/Melan A, gp100, gp75, tyrosinase, TRP1 and TRP2; prostate antigens such as PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 and PSM-P2; reactivated embryonic gene products such as MAGE I, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE and other testicular cancer antigens such as NY-ESO1, SSX2 and SCP1; mucins such as Muc-1 and Muc-2; gangliosides such as GM2, GD2 and GD3, neutral glycolipids and glycoproteins such as Lewis (y) and globo-H; and glycoproteins such as Tn, Thompson-Freudenreich antigen (TF) and sTn. Also included as tumor-associated antigens are whole cells and cell lysates of tumors, as well as immunogenic portions thereof, as well as idiotype immunoglobulins expressed on monoclonal proliferating B lymphocytes for use against B cell lymphoma.

Патогены включают, но не ограничиваются ими, инфекционные агенты, например, вирусы, которые заражают млекопитающих и, в частности, людей. Примеры инфекционных вирусов включают, но не ограничиваются этим: Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ 1 (также известный как HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или ВИЧ-III, а также другие штаммы, такие как ВИЧ LP; Picornaviridae (например, вирусы полиомиелита, вирус гепатита A, энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Togaviridae (например, лошадиного вирусного энцефалита, вирусы краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronoviridae (например, коронавирус); Rhabdoviradae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Coronaviridae (например, коронавирус); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, лихорадки Эбола вирус); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, Хантаан вирусы, вирусы Bunga, плебовирусы и Nairo вирусы); Arena viridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита B); Parvovirida (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae простого герпеса вирус (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса; Poxviridae (натуральной оспы вирусы, вирусы коровьей оспы, вирусы оспы), и Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней) и неклассифицированные вирусы (например, возбудители губчатой энцефалопатии, агент дельта-гепатита (считается дефектным спутником вируса гепатита B), агенты не-A, не-B гепатита (класс 1 = передается внутренне; класс 2 = передается парентерально (например, гепатит C); Norwalk и связанные вирусы и астровирусы).Pathogens include, but are not limited to, infectious agents, such as viruses, that infect mammals and in particular humans. Examples of infectious viruses include, but are not limited to: Retroviridae (e.g. human immunodeficiency viruses such as HIV 1 (also known as HTLV-III, LAV or HTLV-III/LAV, or HIV-III) and other strains such as HIV LP; Picornaviridae (eg, polioviruses, hepatitis A virus, enteroviruses, human coxsackieviruses, rhinoviruses, echoviruses); Calciviridae (eg, strains that cause gastroenteritis); Togaviridae (eg, equine viral encephalitis, rubella viruses); Flaviridae (eg. , dengue viruses, encephalitis viruses, yellow fever viruses); Coronoviridae (eg, coronavirus); Rhabdoviradae (eg, vesicular stomatitis viruses, rabies viruses); Coronaviridae (eg, coronavirus); Rhabdoviridae (eg, vesicular stomatitis viruses, rabies viruses); Filoviridae (eg, Ebola virus); Paramyxoviridae (eg, parainfluenza viruses, mumps virus, measles virus, respiratory syncytial virus); Orthomyxovir idae (eg influenza viruses); Bungaviridae (eg Hantaan viruses, Bunga viruses, pleboviruses and Nairo viruses); Arena viridae (hemorrhagic fever viruses); Reoviridae (eg reoviruses, orbiviruses and rotaviruses); Birnaviridae; Hepadnaviridae (hepatitis B virus); Parvovirida (parvoviruses); Papovaviridae (papilloma viruses, polyoma viruses); Adenoviridae (most adenoviruses); Herpesviridae herpes simplex virus (HSV) 1 and 2, varicella zoster virus, cytomegalovirus (CMV), herpes virus; Poxviridae (variola viruses, vaccinia viruses, smallpox viruses), and Iridoviridae (eg, African swine fever virus) and unclassified viruses (eg, causative agents of spongiform encephalopathy, delta hepatitis agent (considered to be a defective companion of hepatitis B virus), agents of non- A, non-B hepatitis (class 1 = internally transmitted; class 2 = parenterally transmitted (eg, hepatitis C); Norwalk and related viruses and astroviruses).

Кроме того, грамотрицательные и грамположительные бактерии служит в качестве антигенов у позвоночных животных. Такие грамположительные бактерии, включают, но не ограничиваются этим, Pasteurella species, Staphylococci species и Streptococcus species. Грамотрицательные бактерии, включают, но не ограничиваются этим, Escherichia coli, Pseudomonas species и Salmonella species. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, но не ограничиваются этим: Helicobacterpyloris, Borelia Burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (например, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Group В Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.In addition, Gram-negative and Gram-positive bacteria serve as antigens in vertebrates. Such Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Pasteurella species, Staphylococci species, and Streptococcus species. Gram-negative bacteria include, but are not limited to, Escherichia coli, Pseudomonas species, and Salmonella species. Specific examples of infectious bacteria include, but are not limited to: Helicobacterpyloris, Borelia Burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (e.g., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae , Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue , Leptospira, Rickettsia and Actino myces israelli.

Дополнительные примеры патогенов включают, но не ограничиваются ими, инфекционные грибы, которые заражают млекопитающих и, в частности, людей.Additional examples of pathogens include, but are not limited to, infectious fungi that infect mammals and in particular humans.

Примеры инфекционных грибов включают, но не ограничиваются этим: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Примеры инфекционных паразитов включают такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale и Plasmodium vivax. Другие инфекционные организмы (например, простей- 77 039892 шие) включают Toxoplasma gondii.Examples of infectious fungi include, but are not limited to: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Examples of infectious parasites include Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale and Plasmodium vivax. Other infectious organisms (eg, protozoans) include Toxoplasma gondii.

В одном из вариантов воплощения композиции могут быть использованы, чтобы заставить утихнуть или модулировать гены-мишени, такие как, но не ограничиваясь этим, FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin A ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(K1P1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, гены опухолевых супрессоров, p53 опухолевого супрессора ген, p53 семейства член DN-p63, pRb опухолевого супрессора ген, APC1 опухолевого супрессора ген, BRCA1 опухолевого супрессора ген, PTEN опухолевого супрессора ген, mLL слияния ген, BCR/ABL слияния ген, TEL/AML1 слияния ген, EWS/FLI1 слияния ген, TLS/FUS1 слияния ген, PAX3/FKHR слияния ген, AML1/ETO слияния ген, alpha v-интегрин ген, Flt-1 рецептора ген, тубулина ген, вируса человеческой папилломы ген, ген, необходимый для репликации вируса человеческой папилломы, ген вируса иммунодефицита человека, ген, необходимый для репликации вируса иммунодефицита человека, ген вируса гепатита A, ген, необходимый для репликации вируса гепатита A, вируса гепатита B ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита B, вируса гепатита C ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита C, вируса гепатита D ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита D, вируса гепатита E ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита E, вируса гепатита F ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита F, вируса гепатита G ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита G, вируса гепатита H ген, ген, необходимый для репликации вируса гепатита H, респираторного синцитиального вируса ген, ген, необходимый для репликации респираторного синцитиального вируса, Herpes Simplex Virus ген, ген, необходимый для репликации Herpes Simplex Virus, герпес Cytomegalovirus ген, ген, необходимый для репликации герпес Cytomegalovirus, герпес Epstein Barr Virus ген, ген, необходимый для репликации герпес Epstein Barr Virus, Kaposi's Sarcoma-ассоциированный Herpes Virus ген, ген, необходимый для репликации Kaposi's Sarcoma-ассоциированный Herpes Virus, JC Virus ген, человеческий ген, необходимый для репликации JC Virus, миксовируса гена, ген, необходимый для репликации миксовируса, риновируса ген, ген, необходимый для репликации риновируса, коронавирус ген, ген, необходимый для репликации коронавируса, West Nile Virus ген, ген, необходимый для репликации West Nile Virus, St. Louis Encephalitis ген, ген, необходимый для репликации St. Louis Encephalitis, Tick-borne encephalitis virus ген, ген, необходимый для репликации Tick-borne encephalitis virus, Murray Valley encephalitis virus ген, ген, необходимый для репликации Murray Valley encephalitis virus, dengue virus ген, ген, необходимый для репликации dengue virus, Simian Virus 40 ген, ген, необходимый для репликации Simian Virus 40, Human T Cell Lymphotropic Virus ген, ген, необходимый для репликации Human T Cell Lymphotropic Virus, Moloney-Murine Leukemia Virus ген, ген, необходимый для репликации Moloney-Murine Leukemia Virus, энцефаломиокардита вирус ген, ген, необходимый для репликации энцефаломиокардита вируса, measles virus ген, ген, необходимый для репликации measles virus, Vericella zoster virus ген, ген, необходимый для репликации Vericella zoster virus, аденовирус ген, ген, необходимый для репликации аденовируса, вирус желтой лихорадки ген, ген, необходимый для репликации вируса желтой лихорадки, полиовирус ген, ген, необходимый для репликации полиовируса, поксвирус ген, ген, необходимый для репликации поксвируса, плазмодий ген, ген, необходимый для репликации плазмодия, Mycobacterium ulcerans ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae ген, ген, необходимый для репликации Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus ген, ген, необходимый для репликации Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes ген, ген, необходимый для репликации Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae ген, ген, необходимый для репликации Mycoplasma pneumoniae, интегрин ген, селектин ген, comple системы комплемента ген, хемокина ген, хемокина рецептора ген, GCSF ген, Gro1 ген, Gro2 ген, Gro3 ген, PF4 ген, MIG ген, ProPlatelet Basic Protein ген, MIP-1I ген, MIP-1J ген, RANTES ген, MCP-1 ген, MCP-2 ген, MCP-3 ген, CMBKR1 ген, CMBKR2 ген, CMBKR3 ген, CMBKR5v, AIF-1 ген, I-309 ген, ген компонента ионного канала, ген нейротрансмиттерного рецептора, а ген нейротрансмиттерного лиганда, амилоидного семейства ген, пресенилин ген, HD ген, DRPLA ген, SCA1 ген, SCA2 ген, MJD1 ген, CACNL1A4 ген, SCA7 ген, SCA8 ген, аллельный ген находящийся в LOH клетках, или один аллельный ген полиморфного гена.In one embodiment, the compositions can be used to silence or modulate target genes such as, but not limited to, FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta gene, Erb-B gene, Src gene, CRK gene, GRB2 gene, RAS gene, MEKK gene, JNK gene, RAF gene, Erk1/2 gene, PCNA(p21) gene, MYB gene, JUN gene, FOS gene, BCL-2 gene, Cyclin D gene, VEGF gene, EGFR gene, Cyclin A gene, Cyclin E gene, WNT-1 gene, beta-catenin gene, c-MET gene, PKC gene, NFKB gene, STAT3 gene, survivin gene, Her2/Neu gene, SORT1 gene , XBP1 gene, topoisomerase I gene, topoisomerase II alpha gene, p73 gene, p21(WAF1/CIP1) gene, p27(K1P1) gene, PPM1D gene, RAS gene, caveolin I gene, MIB I gene, MTAI gene, M68 gene, tumor suppressor genes, p53 tumor suppressor gene, p53 family member DN-p63, pRb tumor suppressor gene, APC1 tumor suppressor gene, BRCA1 tumor suppressor gene, PTEN tumor suppressor gene, mLL gene fusion, BCR/ABL gene fusion, TEL/AML1 fusion gene, EWS/FLI1 fusion ge n, TLS/FUS1 fusion gene, PAX3/FKHR fusion gene, AML1/ETO fusion gene, alpha v-integrin gene, Flt-1 receptor gene, tubulin gene, human papillomavirus gene, gene required for human papillomavirus replication, gene human immunodeficiency virus, gene required for human immunodeficiency virus replication, hepatitis A virus gene, gene required for hepatitis A virus replication, hepatitis B virus gene, gene required for hepatitis B virus replication, hepatitis C virus gene, gene required for replication of hepatitis C virus, hepatitis D virus gene, gene required for the replication of hepatitis D virus, hepatitis E virus gene, gene required for the replication of hepatitis E virus, hepatitis F virus gene, gene required for the replication of hepatitis F virus, hepatitis G virus gene, gene required for hepatitis G virus replication, hepatitis H virus gene, gene required for hepatitis H virus replication, respiratory syncytial virus gene, gene required for respiratory replication Herpes Simplex Virus gene, gene required for replication Herpes Simplex Virus, herpes Cytomegalovirus gene, gene required for replication Herpes Cytomegalovirus, herpes Epstein Barr Virus gene, gene required for replication Herpes Epstein Barr Virus, Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus gene, gene required for replication Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus, JC Virus gene, human gene required for replication JC Virus, myxovirus gene, gene required for myxovirus replication, rhinovirus gene, gene required for rhinovirus replication, coronavirus gene, gene required for coronavirus replication, West Nile Virus gene, gene required for West Nile Virus replication, St. Louis Encephalitis gene, a gene required for replication of St. Louis Encephalitis, Tick-borne encephalitis virus gene, gene required for replication Tick-borne encephalitis virus, Murray Valley encephalitis virus gene, gene required for replication Murray Valley encephalitis virus, dengue virus gene, gene required for replication dengue virus, Simian Virus 40 gene, gene required for replication Simian Virus 40, Human T Cell Lymphotropic Virus gene, gene required for replication Human T Cell Lymphotropic Virus, Moloney-Murine Leukemia Virus gene, gene required for replication Moloney-Murine Leukemia Virus, encephalomyocarditis virus gene, gene necessary for the replication of encephalomyocarditis virus, measles virus gene, gene necessary for the replication of measles virus, Vericella zoster virus gene, gene necessary for the replication of Vericella zoster virus, adenovirus gene, gene necessary for the replication of adenovirus, yellow fever virus gene, gene required for replication of yellow fever virus, poliovirus gene, gene required for replication of poliovirus , poxvirus gene, gene required for poxvirus replication, plasmodium gene, gene required for plasmodium replication, Mycobacterium ulcerans gene, gene required for replication Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis gene, gene required for replication Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae gene, gene , required for the replication of Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus gene, gene required for the replication of Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae gene, gene required for the replication of Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes gene, gene required for the replication of Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae gene, gene required for replication of Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae gene, gene required for Mycoplasma pneumoniae replication, integrin gene, selectin gene, comple complement system gene, chemokine gene, chemokine receptor gene, GCSF gene, Gro1 gene, Gro2 gene, Gro3 gene, PF4 gene, MIG gene, ProPlatelet Basic Protein gene, MIP-1I gene, MIP-1J gene , RANTES gene, MCP-1 gene, MCP-2 gene, MCP-3 gene, CMBKR1 gene, CMBKR2 gene, CMBKR3 gene, CMBKR5v, AIF-1 gene, I-309 gene, ion channel component gene, neurotransmitter receptor gene, a neurotransmitter ligand gene, amyloid family gene, presenilin gene, HD gene, DRPLA gene, SCA1 gene, SCA2 gene, MJD1 gene, CACNL1A4 gene, SCA7 gene, SCA8 gene, an allelic gene found in LOH cells, or one allelic gene of a polymorphic gene.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу доставки молекулы нуклеиновой кислоты, включающему введение нуклеиновых липидных частиц, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и катионных липидов, катионных липидов, имеющих (i) центральный атом углерода, (ii) головную группу, непосредственно связанную с центральным атомом, и (iii) два гидрофобных хвоста, непосредственно связанные с центральным атомом углерода, кажIn another embodiment, the present invention relates to a method for delivering a nucleic acid molecule, comprising the introduction of nucleic lipid particles containing the nucleic acid molecule, and cationic lipids, cationic lipids having (i) a central carbon atom, (ii) a head group directly linked to the central atom, and (iii) two hydrophobic tails directly attached to the central carbon atom, each

- 78 039892 дый гидрофобный хвост, содержащий Си или более алифатическую группу, присоединенную к центральному атому, где алифатическая группа (a) разрываемая биоразлагаемая группа, такая, что имеет цепь по меньшей мере из четырех атомов углерода между биоразлагаемой группой и центральным атомом углерода, или (b) включает в себя биоразлагаемую группу на терминальном конце гидрофобного хвоста, такую, что катионный липид остается нетронутым до доставки молекулы нуклеиновой кислоты, после чего расщепление гидрофобного хвоста происходит in vivo.- 78 039892 a single hydrophobic tail containing a Cu or more aliphatic group attached to the central atom, where the aliphatic group (a) is a breakable biodegradable group such that it has a chain of at least four carbon atoms between the biodegradable group and the central carbon atom, or (b) includes a biodegradable group at the terminal end of the hydrophobic tail such that the cationic lipid remains intact until delivery of the nucleic acid molecule, after which cleavage of the hydrophobic tail occurs in vivo.

ОпределенияDefinitions

Как здесь используется, термин катионный липид включает все те липиды, имеющие одну или две жирные кислоты или жирные алифатические цепи и головную аминогруппу (в том числе алкиламино или диалкиламино группу), которая может быть протонирована с образованием катионных липидов при физиологическом значении pH. В некоторых вариантах воплощенияя катионный липид называют амино липидом.As used herein, the term cationic lipid includes all those lipids having one or two fatty acids or aliphatic fatty chains and an amino head group (including an alkylamino or dialkylamino group) that can be protonated to form cationic lipids at physiological pH. In some embodiments, the cationic lipid is referred to as an amino lipid.

Субъект или пациент, у которого введение комплекса является эффективной схемой лечения болезни или расстройства - предпочтительно человек, но может быть любое животное, в том числе лабораторное животное в условиях клинических испытаний или скрининга или активного эксперимента. Таким образом, можно легко понять любому из специалистов в данной области техники, что способы, соединения и композиции настоящего изобретения особенно подходят для введения любым животных, особенно млекопитающим, и в том числе, но отнюдь не ограничиваясь ими, людям, домашним животным, таким как кошачий или собачий субъекты, сельскохозяйственным животным, таким как, но не ограничиваясь ими, коровы, лошади, козы, овцы, свиньи, диким животным (будь то в дикой природе или в зоологическом саду), исследовательским животным, таких как мыши, крысы, кролики, козы, овцы, свиньи, собаки и кошки, птицы, такие как куры, индейки и певчие птицы, т.е. для ветеринарного использования.The subject or patient in whom the administration of the complex is an effective treatment regimen for the disease or disorder is preferably a human, but may be any animal, including a laboratory animal in a clinical trial or screening or active experiment setting. Thus, it can be readily understood by any one of skill in the art that the methods, compounds, and compositions of the present invention are particularly suitable for administration to any animal, especially mammals, including, but by no means limited to, humans, pets such as feline or canine subjects, farm animals such as, but not limited to, cows, horses, goats, sheep, pigs, wild animals (whether in the wild or in a zoo), research animals such as mice, rats, rabbits , goats, sheep, pigs, dogs and cats, birds such as chickens, turkeys and songbirds, i.e. for veterinary use.

Многие из химических групп перечисляются в дженерических формулах выше и написаны в определенном порядке (например, -OC(O)-). Предполагается, что химические группы должны быть включены в общую формулу в представленном порядке, если не указано иное. Например, общая формула вида -(R)i-(M¹)k-(R)m-, где M¹ является -C(O)O- и k=1 относится к -(R)j-C(O)O-(R)m-, если не указано иное. Следует понимать, что если химическая группа написана в определенном порядке, обратный порядок также предполагается, если не указано иное. Например, в общей формуле -(R)i-(M¹)k-(R)m-, где M¹ определяется как C(O)NH- (т.е. -(R)1-C(O)-NH-(R)_m-), соединение, где M¹ является -NHC(O)- (т.е. -(R)i-NHC(O)-(R)_m-) также предполагается, если не указано иное.Many of the chemical groups are listed in the generic formulas above and are written in a specific order (eg -OC(O)-). The chemical groups are intended to be included in the general formula in the order presented, unless otherwise noted. For example, a general formula of the form -(R)i-(M ¹ )k-(R)m-, where M ¹ is -C(O)O- and k=1 refers to -(R)jC(O)O- (R)m- unless otherwise noted. It should be understood that if a chemical group is written in a particular order, the reverse order is also assumed unless otherwise noted. For example, in the general formula -(R)i-(M ¹ )k-(R)m-, where M ¹ is defined as C(O)NH- (i.e. -(R)1-C(O)- NH-(R) _m -), a compound where M ¹ is -NHC(O)- (i.e. -(R)i-NHC(O)-(R) _m -) is also assumed, unless otherwise indicated .

Как здесь используется, термин биоразлагаемая группа относится к группе, которая включает одну или несколько связей, которые могут подвергаться реакции разрыва связей в биологической среде, например, в организме, органе, ткани, клетке или органелле. Например, биоразлагаемая группа может быть метаболизирована в теле млекопитающих, таких как человек (например, путем гидролиза). Некоторые группы, которые содержат биоразлагаемые связи, включают, например, но не ограничиваясь этим, эфиры, дитиолы и оксимы. Неограничивающие примеры из биоразлагаемых групп: -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.As used herein, the term biodegradable group refers to a group that includes one or more bonds that can undergo a cleavage reaction in a biological environment, such as an organism, organ, tissue, cell, or organelle. For example, the biodegradable group can be metabolized in the body of a mammal, such as a human (eg, by hydrolysis). Some groups that contain biodegradable bonds include, for example, but not limited to, esters, dithiols, and oximes. Non-limiting examples from biodegradable groups: -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O- , -SS-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R5)=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)( NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -C(S)(NR ⁵ )-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N( R ⁵ )-, -OC(O)O-, -OSi(R ⁵ )2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

Как здесь используется, алифатическая группа является неароматической группой, в которой атомы углерода соединены в цепочки, либо насыщенные, либо ненасыщенные.As used here, an aliphatic group is a non-aromatic group in which the carbon atoms are connected in chains, either saturated or unsaturated.

Термины алкил и алкилен относятся к прямой или разветвленной цепи, насыщенному углеводородному фрагменту. В одном варианте воплощения алкильной группой является прямая цепь насыщенных углеводородов. Если не указано иное, алкил или алкилен группа содержит от 1 до 24 атомов углерода. Представители насыщенных прямых групп алкильной цепи включают метил, этил, нпропил, н-бутил, н-пентил и н-гексил. Представители насыщенных разветвленных алкильных групп включают изопропил, вторбутил, изобутил, третбутил и изопентил.The terms alkyl and alkylene refer to a straight or branched chain, saturated hydrocarbon moiety. In one embodiment, the alkyl group is a straight chain saturated hydrocarbon. Unless otherwise indicated, an alkyl or alkylene group contains from 1 to 24 carbon atoms. Representative saturated straight chain alkyl groups include methyl, ethyl, npropyl, n-butyl, n-pentyl and n-hexyl. Representative saturated branched alkyl groups include isopropyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl and isopentyl.

Термин алкенил относится к прямой или разветвленной части углеводородной цепи, имеющей одну или более двойных углерод-углеродных связей. В одном варианте воплощения алкенил содержит 1, 2 или 3 двойные связи и иные насыщенные. Если не указано иное, алкенил группа содержит от 2 до 24 атомов углерода. Алкенильные группы включают в себя как цис-, так и транс-изомеры. Представители прямых и разветвленных алкенильных групп включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил и 2,3-диметил2-бутенил.The term alkenyl refers to a straight or branched portion of a hydrocarbon chain having one or more carbon-carbon double bonds. In one embodiment, the alkenyl contains 1, 2, or 3 double bonds and other saturated ones. Unless otherwise indicated, an alkenyl group contains from 2 to 24 carbon atoms. Alkenyl groups include both cis and trans isomers. Representative straight and branched alkenyl groups include ethyleneyl, propylene, 1-butenyl, 2butenyl, isobutylenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl, 2-methyl-2-butenyl and 2,3-dimethyl2-butenyl .

Термин алкинил относится к прямой или разветвленной цепи углеводородного фрагмента, имеющей один или несколько углерод-углеродных тройных связей. Если не указано иное, алкинил группа содержит от 2 до 24 атомов углерода. Представители прямых и разветвленных алкинильных групп включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил и 3-метил-1-бутинил.The term alkynyl refers to a straight or branched chain hydrocarbon moiety having one or more carbon-carbon triple bonds. Unless otherwise indicated, the alkynyl group contains from 2 to 24 carbon atoms. Representative straight and branched alkynyl groups include acetylenyl, propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, and 3-methyl-1-butynyl.

Термин ацил относится к карбонильной группе, замещенной водородом, алкилом, частично насыщенный или полностью насыщенный циклоалкил, частично насыщенный или полностью насыщенный гетероцикл, арил или гетероарил. Например, ацильные группы включают группы, такие как (C₁ The term acyl refers to a carbonyl group substituted with hydrogen, alkyl, partially saturated or fully saturated cycloalkyl, partially saturated or fully saturated heterocycle, aryl or heteroaryl. For example, acyl groups include groups such as (C ₁

- 79 039892- 79 039892

С2о)алканоил (например, формил, ацетил, пропионил, бутирил, валерил, капроил и третбутилацетил), (С3-С20)циклоалкилкарбонил (например, циклопропилкарбонил, циклобутилкарбонил, циклопентилкарбонил и циклогексилкарбонил), гетероциклический карбонил (например, пирролидинилкарбонил, пирролид-2-он-5-карбонил, пиперидинилкарбонил, пиперазинилкарбонил и тетрагидрофуранилкарбонил), ароил (например, бензоил) и гетероароил (например, тиофенил-2-карбонил, тиофенил-3карбонил, фуранил-2-карбонил, фуранил-3-карбонил, 1H-пирроил-2-карбонил, 1H-пирроил-3-карбонил и бензо[b]тиофенил-2-карбонил).C2o)alkanoyl (e.g. formyl, acetyl, propionyl, butyryl, valeryl, caproyl and t-butylacetyl), (C3-C20)cycloalkylcarbonyl (e.g. cyclopropylcarbonyl, cyclobutylcarbonyl, cyclopentylcarbonyl and cyclohexylcarbonyl), heterocyclic carbonyl (e.g. pyrrolidinylcarbonyl, pyrrolide-2- he-5-carbonyl, piperidinylcarbonyl, piperazinylcarbonyl and tetrahydrofuranylcarbonyl), aroyl (e.g. benzoyl) and heteroaroyl (e.g. thiophenyl-2-carbonyl, thiophenyl-3-carbonyl, furanyl-2-carbonyl, furanyl-3-carbonyl, 1H-pyrroyl- 2-carbonyl, 1H-pyrroyl-3-carbonyl and benzo[b]thiophenyl-2-carbonyl).

Термин арил относится к ароматическим моноциклическим, бициклическим или трициклическим кольцевым системам углеводородов. Если не указано иное, арил группа содержит от 6 до 14 атомов углерода. Примеры арильных остатков включают, но не ограничиваются ими, фенил, нафтил, антраценил и пиренил.The term aryl refers to aromatic monocyclic, bicyclic or tricyclic hydrocarbon ring systems. Unless otherwise indicated, an aryl group contains 6 to 14 carbon atoms. Examples of aryl residues include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, anthracenyl, and pyrenyl.

Термины циклоалкил и циклоалкилен относятся к насыщенному моноциклическому или бициклическому фрагменту углеводородов, таких как циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Если не указано иное, циклоалкил или циклоалкиленовая группа содержит от 3 до 10 атомов углерода.The terms cycloalkyl and cycloalkylene refer to a saturated monocyclic or bicyclic moiety of hydrocarbons such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl. Unless otherwise indicated, a cycloalkyl or cycloalkylene group contains from 3 to 10 carbon atoms.

Термин циклоалкилалкил относится к циклоалкильной группе, связанной с алкильной группой, где алкильные группы связаны с остальной частью молекулы.The term cycloalkylalkyl refers to a cycloalkyl group linked to an alkyl group, where the alkyl groups are linked to the rest of the molecule.

Термин гетероцикл (или гетероциклил) относится к неароматической от 5 до 8 членной моноциклической, или от 7 до 12 членной бициклической, или от 11 до 14 членной трициклической кольцевой системе, которая либо насыщенна либо ненасыщенна, и которая содержит от 1 до 3 гетероатомов, если моноциклическая, 1-6 гетероатомов, если бициклическая, или 1-9 гетероатомов, если трициклическая, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и в которой гетероатомы азота и серы могут быть опционально окислены, а гетероатом азота может быть опционально кватернизован. Например, гетероцикл может быть циклоалкокси группой. Гетероцикл может быть присоединен к остальной части молекулы через любой гетероатом или атом углерода в гетероцикле. Гетероциклы включают, но не ограничиваются этим, морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил и тетрагидротиопиранил.The term heterocycle (or heterocyclyl) refers to a non-aromatic 5 to 8 membered monocyclic or 7 to 12 membered bicyclic or 11 to 14 membered tricyclic ring system which is either saturated or unsaturated and which contains 1 to 3 heteroatoms if monocyclic, 1-6 heteroatoms if bicyclic, or 1-9 heteroatoms if tricyclic, independently selected from nitrogen, oxygen and sulfur, and in which the nitrogen and sulfur heteroatoms can be optionally oxidized and the nitrogen heteroatom can be optionally quaternized. For example, the heterocycle may be a cycloalkoxy group. The heterocycle can be attached to the rest of the molecule through any heteroatom or carbon atom in the heterocycle. Heterocycles include, but are not limited to, morpholinyl, pyrrolidinonyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperisinyl, hydantoinyl, valerolactamyl, oxiranyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridinyl, tetrahydroprimidinyl, tetrahydrothiophenyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydropyrimidinyl, tetrahydrothiophenyl, and tetrahydrothiophenyl.

Термин гетероарил относится к ароматической 5-8 членной моноциклической, 7-12 членной бициклической или 11-14 членной трициклической кольцевой системе, имеющей 1-3 гетероатома, если моноциклическая, 1-6 гетероатомов, если бициклическая, или 1-9 гетероатомов, если трициклическая, где гетероатомы выбранных из O, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов N, O или S если моноциклическая, бициклическая или трициклическая, соответственно). Гетероарильные группы, описанные здесь, могут также содержать конденсированных кольца, которые разделяют общие связи углерод-углерод.The term heteroaryl refers to an aromatic 5-8 membered monocyclic, 7-12 membered bicyclic, or 11-14 membered tricyclic ring system having 1-3 heteroatoms if monocyclic, 1-6 heteroatoms if bicyclic, or 1-9 heteroatoms if tricyclic where the heteroatoms are selected from O, N, or S (eg, carbon atoms and 1-3, 1-6, or 1-9 N, O, or S heteroatoms if monocyclic, bicyclic, or tricyclic, respectively). The heteroaryl groups described herein may also contain fused rings that share common carbon-carbon bonds.

Термин замещенный, если не указано иное, относится к замене одного или нескольких радикалов водорода в данной структуре радикалом указанного заместителя, включая, но не ограничиваясь ими: галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил тиол, алкилтио, оксо, тиокси, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галогеналкил, амино, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоновые кислоты, сульфокислоты, сульфонил, фосфоновая кислота, арил, гетероарил, гетероциклические и алифатические группы. Понятно, что заместитель может быть замещен. Примеры заместителей включают амино, алкиламино, диалкиламино и циклические аминосоединения.The term substituted, unless otherwise indicated, refers to the replacement of one or more hydrogen radicals in a given structure by a radical of a specified substituent, including, but not limited to: halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heterocyclyl thiol, alkylthio, oxo, thioxy, arylthio , alkylthioalkyl, arylthioalkyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonylalkyl, arylsulfonylalkyl, alkoxy, aryloxy, aralkoxy, aminocarbonyl, alkylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, haloalkyl, amino, trifluoromethyl, cyano, nitro, alkylamino, arylamino, hydroxyalkylamino, alloxyalkyl , carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, aminocarbonylalkyl, acyl, aralkoxycarbonyl, carboxylic acids, sulfonic acids, sulfonyl, phosphonic acid, aryl, heteroaryl, heterocyclic and aliphatic groups. It is understood that a substituent may be substituted. Examples of substituents include amino, alkylamino, dialkylamino and cyclic amino compounds.

Термин галоген или гало относится к фтору, хлору, брому и йоду.The term halogen or halo refers to fluorine, chlorine, bromine and iodine.

Термины алкиламин и диалкиламин относятся к -NH(алкил) и -N(алкил)₂ радикалам соответственно.The terms alkylamine and dialkylamine refer to -NH(alkyl) and -N(alkyl) ₂ radicals, respectively.

Термин алкилфосфат относится к -O-P(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q, каждый независимо, O, S, N(R)₂, опционально замещенный алкил или алкокси, и R представляет собой опционально замещенный алкил, ω-аминоалкил или ω-(замещенный)аминоалкил.The term alkyl phosphate refers to -OP(Q')(Q)-OR where Q' and Q are each independently O, S, N(R) ₂ , optionally substituted alkyl or alkoxy, and R is optionally substituted alkyl, ω -aminoalkyl or ω-(substituted)aminoalkyl.

Термин алкилфосфоротиоат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере одна из Q' или Q является S.The term alkyl phosphorothioate refers to an alkyl phosphate in which at least one of Q' or Q is S.

Термин алкилфосфонат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере одна из Q' или Q представляет собой алкил.The term alkyl phosphonate refers to an alkyl phosphate in which at least one of Q' or Q is alkyl.

Термин гидроксиалкил относится к -O-алкильному радикалу.The term hydroxyalkyl refers to an -O-alkyl radical.

Термин алкилгетероцикл относится к алкилу, где по меньшей мере один метилен был заменен гетероцикломThe term alkyl heterocycle refers to alkyl where at least one methylene has been replaced by a heterocycle

Термин ω-аминоалкил относится к -алкил-NH₂-радикалу.The term ω-aminoalkyl refers to an alkyl-NH ₂ radical.

- 80 039892- 80 039892

А термин ω-(замещенный)аминоалкил относится к ω-аминоалкилу, где по меньшей мере, один из H на N был заменен на алкил.And the term ω-(substituted)aminoalkyl refers to ω-aminoalkyl, where at least one of the H to N has been replaced by alkyl.

Термин ω-фосфоалкил относится к -алкил-O-Р(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q, каждый независимо, является O или S и R опционально замещенный алкил.The term ω-phosphoalkyl refers to -alkyl-O-P(Q')(Q)-O-R, where Q' and Q are each independently O or S and R is optionally substituted alkyl.

Термин ω-тиофосфоалкил относится к ω-фосфоалкилу, где по меньшей мере, один из Q' или Q является S.The term ω-thiophosphoalkyl refers to ω-phosphoalkyl where at least one of Q' or Q is S.

Следующие сокращения, которые используются в этом приложении: DSPC: дистеароилфосфатидилхолин; DPPC: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин; POPC: 1 - пальмитоил-2-олеоил-snфосфатидилхолин; DOPE: 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламин; PEG-DMG как правило, относится к 1,2-димиристоил-sn-глицерин-метокси полиэтиленгликолю (например, PEG 2000); TBDPSCl: третбутилхлородифенилсилан; DMAP: диметиламинопиридин; NMO: N-метилморфолин-N-оксид; LiHDMS: литий бис(триметилсилил)амид; HMPA: гексаметилфосфорамид; EDC: 1-этил-3-(3диметиламинопропил) карбодиимид; DIPEA: диизопропилэтиламин; DCM: дихлорметан; TEA: триэтиламин; TBAF: тетрабутиламмонийфторид.The following abbreviations are used in this application: DSPC: distearoylphosphatidylcholine; DPPC: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; POPC: 1 - palmitoyl-2-oleoyl-snphosphatidylcholine; DOPE: 1,2-dioleoyl-sn-3-phosphoethanolamine; PEG-DMG generally refers to 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol-methoxy polyethylene glycol (eg PEG 2000); TBDPSCl: tert-butylchlorodiphenylsilane; DMAP: dimethylaminopyridine; NMO: N-methylmorpholine-N-oxide; LiHDMS: lithium bis(trimethylsilyl)amide; HMPA: hexamethylphosphoramide; EDC: 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide; DIPEA: diisopropylethylamine; DCM: dichloromethane; TEA: triethylamine; TBAF: tetrabutylammonium fluoride.

В некоторых вариантах воплощения способ может потребовать использование защитных групп. Методологии защитных групп хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Короче говоря, защитной группой является любая группа, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональных групп. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе, чтобы замаскировать ее реактивность в определенной реакции и затем удаляется, чтобы показать оригинальную функциональную группу. В некоторых вариантах воплощения спирт защитная группа используется. Спирт защитная группа означает любую группу, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональных групп спирта. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с помощью методов, хорошо известных в данной области.In some embodiments, the method may require the use of protecting groups. Protecting group methodologies are well known to those skilled in the art (see, for example, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). In short, a protecting group is any group that reduces or eliminates undesirable reactivity of functional groups. A protecting group can be added to a functional group to mask its reactivity in a particular reaction and then removed to reveal the original functional group. In some embodiments, an alcohol protecting group is used. An alcohol protecting group means any group that reduces or eliminates the undesirable reactivity of alcohol functional groups. Protecting groups can be added and removed using techniques well known in the art.

Соединения могут быть получены по меньшей мере, одним из методов, описанным здесь, или известным из органического синтеза.Compounds can be obtained by at least one of the methods described here, or known from organic synthesis.

- 81 039892- 81 039892

ПримерыExamples

Соединение 2. К раствору соединения 1 (10,0 г, 18,8 ммоль, см. международную публикацию WO 2010/054406), в CH₂Cl₂ (80 мл) добавляли триэтиламин (7,86 мл, 56,4 ммоль), DMAP (459 мг, 3,76 ммоль) и трет-бутил(хлор)дифенилсилан (9,62 мл, 37,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч. Затем смесь разбавляли CH₂Cl₂ и промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃. Органический слой отделяли и сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% EtOAc в гексане), получая 2 (12,4 г, 16,1 ммоль, 86%, Rf=0,24 с гексаном). 1H ЯМР (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.42 (m, 6H), 5.305.39 (m, 4H), 3.67-3.72 (m, 1H), 1.97-2.04 (m, 8H), 1.07-1.42 (m, 52H), 1.05 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).Compound 2 To a solution of compound 1 (10.0 g, 18.8 mmol, see international publication WO 2010/054406), in CH ₂ Cl ₂ (80 ml) was added triethylamine (7.86 ml, 56.4 mmol) , DMAP (459 mg, 3.76 mmol) and tert-butyl(chloro)diphenylsilane (9.62 ml, 37.6 mmol). The reaction mixture was stirred for 24 hours. The mixture was then diluted with CH ₂ Cl ₂ and washed with saturated aqueous NaHCO ₃ . The organic layer was separated and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . After filtration and concentration, the crude product was purified by silica gel column chromatography (0-5% EtOAc in hexane) to give 2 (12.4 g, 16.1 mmol, 86%, Rf=0.24 with hexane). 1H NMR (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.42 (m, 6H), 5.305.39 (m, 4H), 3.67-3.72 (m, 1H), 1.97-2.04 (m , 8H), 1.07-1.42 (m, 52H), 1.05 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).

Соединение 3. К раствору 2 (12,4 г, 16,1 ммоль) в трет-бутаноле (100 мл), ТГФ (30 мл) и H2O (10 мл) добавляли 4-метилморфолин N-оксид (4,15 г, 35,4 ммоль) и осмия тетроксид (41 мг, 0,161 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч, затем гасили путем добавления бисульфита натрия. После удаления растворителя путем выпаривания, остаток экстрагировали Et₂O (500 мл) и H2O (300 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрации и концентрации, сырец очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=1:1, Rf=0,49) с получением 3 (12,7 г, 15,1 ммоль, 94%). 1H ЯМР (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.43 (m, 6H), 3.67-3.73 (m, 1H), 3.57-3.62 (m, 4H), 1.82 (t, J=5.0 Hz, 4H), 1.10-1.51 (m, 60H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).Compound 3 To a solution of 2 (12.4 g, 16.1 mmol) in tert-butanol (100 mL), THF (30 mL) and H2O (10 mL) was added 4-methylmorpholine N-oxide (4.15 g, 35.4 mmol) and osmium tetroxide (41 mg, 0.161 mg). The reaction mixture was stirred for 16 hours then quenched by adding sodium bisulfite. After removing the solvent by evaporation, the residue was extracted with Et ₂ O (500 ml) and H 2 O (300 ml). The organic layer was separated and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . After filtration and concentration, the crude was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=1:1, Rf=0.49) to give 3 (12.7 g, 15.1 mmol, 94%). 1H NMR (400 MHz, CDQ3) δ 7.66-7.68 (m, 4H), 7.33-7.43 (m, 6H), 3.67-3.73 (m, 1H), 3.57-3.62 (m, 4H), 1.82 (t, J =5.0 Hz, 4H), 1.10-1.51 (m, 60H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H).

Соединение 4. К раствору 3 (12,6 г, 15,0 ммоль) в 1,4-диоксане (220 мл), CH₂Cl₂ (70 мл), MeOH (55 мл) и H2O (55 мл) добавляли NaIO₄ (7,70 г, 36,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Смесь экстрагировали Et₂O (500 мл) и H2O (300 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрации и концентрации, сырец очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,30), получая 4 (7,98 г, 14,5 ммоль, 97%). Молекулярный вес для C₃₅H₅₄NaO₃Si (M+Na)+ Расч. 573,3740, Найденный 573,3.Compound ₄ _NaIO ₄ (7.70 g, 36.0 mmol). The reaction mixture was stirred for 16 hours at room temperature. The mixture was extracted with Et ₂ O (500 ml) and H 2 O (300 ml). The organic layer was separated and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . After filtration and concentration, the crude was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=9:1, Rf=0.30) to give 4 (7.98 g, 14.5 mmol, 97%). Molecular Weight for C ₃₅ H ₅₄ NaO ₃ Si (M+Na)+ Calc. 573.3740, Found 573.3.

Соединение 7. К раствору 5 (см. Tetrahedron, 63, 1140-1145, 2006; 1,09 г, 2,18 ммоль) в ТГФ (20 мл) иCompound 7 To a solution of 5 (see Tetrahedron, 63, 1140-1145, 2006; 1.09 g, 2.18 mmol) in THF (20 ml) and

- 82 039892- 82 039892

HMPA (4 мл), LiHMDS (1 M раствор в ТГФ, 4,36 мл, 4,36 ммоль) был добавлен при -20°C. Полученную смесь перемешивали в течение 20 мин при той же температуре, затем охлаждали до -78°C. Раствор 4 (500 мг, 0,908 ммоль) в ТГФ (4 мл) был добавлен. Смесь перемешали и дали нагреться до комнатной температуры в течение ночи. MS анализ показал формирование ди-кислоты (6; C₅₃H₈₅O₅Si (M-H)расч. 829,6166, наблюдаемая 829,5). К смеси, NaHCO₃ (1,10 г, 13,1 ммоль) и диметилсульфат (1,24 мл, 13,1 ммоль) были добавлены и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением насыщенного водного раствора NH₄Cl (50 мл), затем экстрагировали Et₂O (2x100 мл). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,35), получая 7 (270 мг, 0,314 ммоль, 35%). Молекулярный вес для C₅₅H₉₀NaO₅Si (M+Na)+ Расч. 881,6455, Найденный 881,6484.HMPA (4 ml), LiHMDS (1 M solution in THF, 4.36 ml, 4.36 mmol) was added at -20°C. The resulting mixture was stirred for 20 min at the same temperature, then cooled to -78°C. A solution of 4 (500 mg, 0.908 mmol) in THF (4 mL) was added. The mixture was stirred and allowed to warm to room temperature overnight. MS analysis showed the formation of a di-acid (6; C₅₃H₈₅O₅Si (M-H)calc. 829.6166, observed 829.5). To the mixture, NaHCO₃ (1.10 g, 13.1 mmol) and dimethyl sulfate (1.24 ml, 13.1 mmol) were added and stirred for 2 hours at room temperature. The reaction was stopped by adding a saturated aqueous solution of NH₄Cl (50 ml) then extracted with Et₂O (2x100 ml). The organic layer was separated and dried over anhydrous Na₂SO₄. After filtration and concentration, the crude product was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=9:1, Rf=0.35) to give 7 (270 mg, 0.314 mmol, 35%). Molecular weight for C₅₅H₉₀NaO₅Si(M+Na)+ Calc. 881.6455, Found 881.6484.

Соединение 8. К раствору 7 (265 мг, 0,308 ммоль) в ТГФ (2,5 мл), н-TBAF (1 М раствор в ТГФ, 0,555 мл, 0,555 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч при 45°C. После концентрации смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=3:1, Rf=0,52), получая 8 (155 мг, 0,250 ммоль, 81%). Молекулярный вес для C₃₉H₇₂NaO₅ (M+Na)⁺Расч. 643,5277, найденный 643,5273.Compound 8 To a solution of 7 (265 mg, 0.308 mmol) in THF (2.5 ml), n-TBAF (1 M solution in THF, 0.555 ml, 0.555 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for 14 h at 45°C. After concentration, the mixture was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=3:1, Rf=0.52) to give 8 (155 mg, 0.250 mmol, 81%). Molecular Weight for C ₃₉ H ₇₂ NaO ₅ (M+Na) ⁺ Calc. 643.5277 found 643.5273.

Соединение 9. К раствору соединения 8 (150 мг, 0,242 ммоль) и 4 - (диметиламино) масляной кислоты гидрохлорида (49 мг, 0,290 ммоль) в CH₂Cl₂ (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,126 мл, 0,726 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид (56 мг, 0,290 ммоль) и DMAP (6 мг, 0,0484 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов. Затем реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO3 (50 мл). Органический слой сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH₂Cl₂) с получением соединения 9 (121 мг, 0,165 ммоль, 68%, Rf=0,25 получен с 5% MeOH в CH₂Cl₂). Молекулярный вес для C₄₅H₈₄NO₆ (M+H)⁺ Расч. 734,6299, найденный 734,5.Compound 9 _{Diisopropylethylamine} ( _0.126 ml, 0.726 mmol), N -(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (56 mg, 0.290 mmol) and DMAP (6 mg, 0.0484 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 14 hours. Then the reaction mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml) and washed with saturated aq. NaHCO3 (50 ml). The organic layer was dried over MgSO ₄ , filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (0-5% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ) to give compound 9 (121 mg, 0.165 mmol, 68%, Rf=0.25 obtained with 5% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ). Molecular weight for C ₄₅ H ₈₄ NO ₆ (M+H) ⁺ Calc. 734.6299, found 734.5.

Соединение 10. Получение соединения 9 с CH₃Cl в CH3CN и CHCl₃ может предоставить соединение 10.Compound 10 Preparation of compound 9 with CH ₃ Cl in CH3 CN and CHCl ₃ can provide compound 10.

- 83 039892- 83 039892

Пример 2. Схема 2.Example 2. Scheme 2.

Схема 2Scheme 2

ЕОС1.ДМАПEOS1.DMAP

СН₂С1_гДИПЭАCH ₂ C1 _g DIPEA

: ch₃ci/ch₃cn/chci₃♦: ch ₃ ci/ch ₃ cn/chci ₃ ♦

ΘΘ

ClCl

МеООС — NC \ J о 'Meoos - NC\J o'

Соединение 12. К раствору 11 (см., J. Med Chem, 38, 636-46, 1995; 1,25 г, 2,58 ммоль) в ТГФ (20 мл) и HMPA (4 мл), LiHMDS (1 М ТГФ раствор, 2,58 мл, 2,58 ммоль) был добавлен при -20°C. Смесь перемешивали в течение 20 мин при той же температуре, затем охлаждали до -78°C. Раствор 4 (500 мг, 0,908 ммоль) в ТГФ (9 мл) и HMPA (0,9 мл) был добавлен. Смесь перемешивали и дали нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Реакцию останавливали путем добавления H₂O (40 мл) и экстрагировали Et₂O (150 млх3). Органический слой отделяли и сушили над безводным Na₂SO₄. После фильтрации и концентрации, сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=9:1, Rf=0,35), получая 12 (136 мг, 0,169 ммоль, 19%). Молекулярный вес для C₅₁H₈₂NaO₅Si (M+Na)⁺.Расч. 825,5829, найденный 825,5.Compound 12 To a solution of 11 (see, J. Med Chem, 38, 636-46, 1995; 1.25 g, 2.58 mmol) in THF (20 ml) and HMPA (4 ml), LiHMDS (1 M THF solution, 2.58 ml, 2.58 mmol) was added at -20°C. The mixture was stirred for 20 min at the same temperature, then cooled to -78°C. A solution of 4 (500 mg, 0.908 mmol) in THF (9 ml) and HMPA (0.9 ml) was added. The mixture was stirred and allowed to warm to room temperature overnight. The reaction was stopped by adding H ₂ O (40 ml) and was extracted with Et ₂ O (150 mlx3). The organic layer was separated and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . After filtration and concentration, the crude product was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=9:1, Rf=0.35) to give 12 (136 mg, 0.169 mmol, 19%). Molecular weight for C ₅₁ H ₈₂ NaO ₅ Si (M+Na) ⁺ .Calc. 825.5829, found 825.5.

Использование 13 в место 5, по методике, описанной для соединения 7, последовало, с получением соединения 12 (135 мг, 0,168 ммоль, 46%).Use of 13 in place of 5, following the procedure described for compound 7, followed to give compound 12 (135 mg, 0.168 mmol, 46%).

Соединение 15/соединение 16. К раствору 12 (800 мг, 0,996 ммоль) в ТГФ (5 мл), н-TBAF (1 М раствор в ТГФ, 5 мл, 5,00 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при 45°C. После концентрации смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением 15 (гексан: EtOAc= 3:1, Rf=0,46, 372 мг, 0,659 ммоль, 66%) и 16 (CH₂Cl₂: MeOH=95:5, Rf=0,36, 135 мг, 0,251 ммоль, 25%). Молекулярный вес 15; C₃₅H₆4NaO5 (M+Na)+ Расч. 587,4651, найденный 587,4652. Молекулярный вес 16; C₃₃H₆₁O5 (M+H)⁺Расч. 537,4519, найденный 537,5.Compound 15/Compound 16 To a solution of 12 (800 mg, 0.996 mmol) in THF (5 ml), n-TBAF (1 M solution in THF, 5 ml, 5.00 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for 16 h at 45°C. After concentration, the mixture was purified by silica gel column chromatography to give 15 (hexane: EtOAc=3:1, Rf=0.46, 372 mg, 0.659 mmol, 66%) and 16 (CH ₂ Cl ₂ : MeOH=95:5 , Rf=0.36, 135 mg, 0.251 mmol, 25%). Molecular weight 15; C ₃₅ H ₆ 4NaO5 (M+Na)+ Calc. 587.4651 found 587.4652. Molecular weight 16; C ₃₃ H ₆₁ O5 (M+H) ⁺ Calc. 537.4519, found 537.5.

Соединение 17. К раствору соединения 15 (164 мг, 0,290 ммоль) и 4-(диметиламино)масляной кислоты гидрохлорида (58 мг, 0,348 ммоль) в CH2Cl2 (5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,152 мл,Compound 17 To a solution of compound 15 (164 mg, 0.290 mmol) and 4-(dimethylamino)butyric acid hydrochloride (58 mg, 0.348 mmol) in CH2Cl2 (5 ml) was added diisopropylethylamine (0.152 ml,

- 84 039892- 84 039892

0,870 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида хлорид (67 мг, 0,348 ммоль) и DMAP (7 мг, 0,058 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO₃ (50 мл). Органический слой сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH₂Cl₂) с получением соединения 17 (158 мг, 0,233 ммоль, 80%, Rf=0,24 получен с 5% MeOH в CH₂Cl₂). Молекулярный вес для C₄₅H₈₄NO₆(м+H)⁺.Расч. 734,6299, найденный 734,5.0.870 mmol), N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide chloride (67 mg, 0.348 mmol) and DMAP (7 mg, 0.058 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 14 hours. The reaction mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml) and washed with saturated aq. NaHCO ₃ (50 ml). The organic layer was dried over MgSO ₄ , filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (0-5% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ) to give compound 17 (158 mg, 0.233 mmol, 80%, Rf=0.24 obtained with 5% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ). Molecular weight for C ₄₅ H ₈₄ NO ₆ (m+H) ⁺ .Calc. 734.6299, found 734.5.

Соединение 18. Обработка соединения 17 с CH₃Cl в CH3CN и CHCl₃ может привести к получению соединения 18.Compound 18 Treatment of compound 17 with CH ₃ Cl in CH 3 CN and CHCl ₃ may give compound 18.

Соединение 19. К раствору 16 (130 мг, 0,242 ммоль) в ТГФ (2 мл) и MeOH (2 мл), триметилсилилдиазометан (2 М раствор в Et₂O, 0,158 мл, 0,315 ммоль) был добавлен. Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч. После выпаривания остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан: EtOAc=3:1, Rf= 0,50), получая 19 (99 мг, 0,180 ммоль, 74%). ¹H ЯМР (400 MHz, CDCl₃) δ 5.29-5.40 (m, 4H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.55-3.59 (m, 1H), 2.30 (dd, J=14.7, 7.2 Hz, 4H), 1.98-2.07 (m, 8H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.43 (m, 37H).Compound 19 To a solution of 16 (130 mg, 0.242 mmol) in THF (2 ml) and MeOH (2 ml), trimethylsilyldiazomethane (2 M solution in Et ₂ O, 0.158 ml, 0.315 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for 14 hours. After evaporation, the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc=3:1, Rf=0.50) to give 19 (99 mg, 0.180 mmol, 74%). ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 5.29-5.40 (m, 4H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.55-3.59 (m, 1H), 2.30 ( dd, J=14.7, 7.2 Hz, 4H), 1.98-2.07 (m, 8H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.43 (m, 37H).

Соединение 20. К раствору соединения 19 (95 мг, 0,168 ммоль) и 4-(диметиламино)масляной кислоты гидрохлорида (42 мг, 0,252 ммоль) в CH₂Cl₂ (3 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,088 мл, 0,504 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид (48 мг, 0,504 ммоль) и DMAP (4 мг, 0,034 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ (100 мл) и промывали насыщенным водн. NaHCO₃ (50 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% MeOH в CH₂Cl₂) с получением соединения 20 (103 мг, 0,155 ммоль, 92%, Rf=0,19 получен с 5% MeOH в CHiCli). ¹H ЯМР (400 MHz, CDCl₃) δ 5.295.40 (m, 4H), 4.83-4.89 (m, 1H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.28-2.34 (m, 8H), 2.23 (s, 6H), 1.982.07 (m, 8H), 1.76-1.83 (m, 2H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.51 (m, 35H).Compound 20 To a solution of compound 19 (95 mg, 0.168 mmol) and 4-(dimethylamino)butyric acid hydrochloride (42 mg, 0.252 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (3 ml) was added diisopropylethylamine (0.088 ml, 0.504 mmol), N -(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (48 mg, 0.504 mmol) and DMAP (4 mg, 0.034 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 14 hours. The reaction mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml) and washed with saturated aq. NaHCO ₃ (50 ml). The organic layer was dried over MgSO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (0-5% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ) to give compound 20 (103 mg, 0.155 mmol, 92%, Rf=0.19 obtained with 5% MeOH in CHiCli). ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 5.295.40 (m, 4H), 4.83-4.89 (m, 1H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.28- 2.34 (m, 8H), 2.23 (s, 6H), 1.982.07 (m, 8H), 1.76-1.83 (m, 2H), 1.60-1.68 (m, 4H), 1.23-1.51 (m, 35H).

Соединение 21. Обработка соединения 20 с CH₃Cl в CH₃CN и CHCl₃ может привести к получению соединения 21.Compound 21 Treatment of compound 20 with CH ₃ Cl in CH ₃ CN and CHCl ₃ may give compound 21.

Пример 3. Альтернативный синтез для ди-альдегида промежуточного соединения 4. Схема 3.Example 3 Alternative synthesis for the di-aldehyde of intermediate 4. Scheme 3.

Схема 3Scheme 3

Ди-альдегид 4 может быть синтезирован как показано на схеме 3, используя 1-бром-9-децен. Диальдегид, содержащий головную группу 27, может быть полезным для синтеза терминальных эфирзамещенных липидов, используя, например, реакцию Виттига. Озонолиз может привести к получению ди-альдегида 4 и 27.Di-aldehyde 4 can be synthesized as shown in Scheme 3 using 1-bromo-9-decene. A dialdehyde containing head group 27 may be useful for the synthesis of terminal ester-substituted lipids using, for example, the Wittig reaction. Ozonolysis can lead to di-aldehydes 4 and 27.

- 85 039892- 85 039892

Пример 4. Альтернативные синтезы для соединения 8. Схема 4.Example 4 Alternative Syntheses for Compound 8 Scheme 4

Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 4.Compound 8 can be synthesized as shown in Scheme 4.

Соединение 29. К перемешанной суспензии NaH (60% в масле, 82 г, 1,7096 моль) в 500 мл безводного ДМФ, раствор соединения 28 (250 г, 1,7096 моль) в 1,5 л ДМФ медленно, используя капельную воронку, был добавлен при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, затем бензилбромид (208,86 мл, 1,7096 моль) медленно добавляли в атмосфере азота. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 ч. Затем смесь охлаждали колотым льдом (~2 кг) и экстрагировали этилацетатом (2x1 л). Органический слой промывали водой (1л), чтобы удалить нежелательный ДМФ, сушили над Na₂SO₄ и упаривали досуха в вакууме. Неочищенное соединение очищали на 60-120 силикагеле, элюент 0-5% MeOH в DCM с получением соединения 29 (220 г, 54%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).Compound 29 To a stirred suspension of NaH (60% in oil, 82 g, 1.7096 mol) in 500 ml anhydrous DMF, a solution of compound 28 (250 g, 1.7096 mol) in 1.5 L DMF slowly using an addition funnel , was added at 0°C. The reaction mixture was stirred for 30 minutes, then benzyl bromide (208.86 ml, 1.7096 mol) was added slowly under nitrogen. The reaction mixture was then warmed to room temperature and stirred for 10 h. The mixture was then cooled with crushed ice (~2 kg) and extracted with ethyl acetate (2x1 L). The organic layer was washed with water (1L) to remove unwanted DMF, dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated to dryness in vacuo. The crude compound was purified on 60-120 silica gel eluting with 0-5% MeOH in DCM to give compound 29 (220 g, 54%) as a pale yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 ( m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).

Соединение 30. Соединение 29 (133 г, 0,5635 моль) растворяли в 1,5 л DCM, CBr₄ (280,35 г, 0,8456 моль) добавляли при перемешивании раствора и реакционную смесь охлаждали до 0°C в атмосфере инертного газа. PPh₃ (251,03 г, 0,9571 моль), затем добавляли порциями, поддерживая температуру ниже 20°C. После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции твердый (PPh3O), который осаждали из реакционной смеси, удаляли фильтрацией и фильтрат разбавляли с колотым льдом (~1,5 кг) и экстрагировали DCM (3x750 мл). Органический слой отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄ и перегоняли в вакууме. Полученное сырое соединение хроматографировали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-5% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 30 (150 г, 89%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).Compound 30 Compound 29 (133 g, 0.5635 mol) was dissolved in 1.5 L of DCM, CBr ₄ (280.35 g, 0.8456 mol) was added while stirring the solution and the reaction mixture was cooled to 0°C under an inert atmosphere gas. PPh ₃ (251.03 g, 0.9571 mol) was then added in portions keeping the temperature below 20°C. After completion of the addition, the reaction mixture was stirred for 3 hours at room temperature. After completion of the reaction, the solid (PPh3O) that precipitated from the reaction mixture was removed by filtration and the filtrate was diluted with crushed ice (~1.5 kg) and extracted with DCM (3x750 ml). The organic layer was separated, dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and distilled in vacuo. The resulting crude compound was chromatographed on a 60-120 mesh silica gel column using 0-5% ethyl acetate in hexane as the system eluent to give compound 30 (150 g, 89%) as a pale yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 ( m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).

Соединение 31. К свежеактивированной Mg стружке (24,08 г, 1,003 моль) добавляют 200 мл безводного ТГФ, с последующим добавлением щепотки йода в смесь в инертной атмосфере. Раствор соединения 30 (150 г, 0,5016 моль) в 1 л сухого ТГФ медленно, контролируя экзотермическую реакцию, был добавлен. Затем реакционную смесь кипятили в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. Метилформиат (60,24 г, 1,0033 моль) затем медленно добавляли и реакция продолжалась в течениеCompound 31 To a freshly activated Mg turning (24.08 g, 1.003 mol) was added 200 ml of anhydrous THF, followed by a pinch of iodine to the mixture under an inert atmosphere. A solution of compound 30 (150 g, 0.5016 mol) in 1 L of dry THF was added slowly, controlling the exothermic reaction. The reaction mixture was then refluxed for 1 h, then cooled to room temperature. Methyl formate (60.24 g, 1.0033 mol) was then slowly added and the reaction continued for

- 86 039892- 86 039892

ч. После завершения реакцию остановили медленным добавлением 10% HCl, а затем водой (1 л) и экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органический слой был делюирован в 5-литровый стакан, разбавлен 500 мл метанола и охлажден до 0°C. К этому раствору избыток NaBH₄ (~5eq) был добавлен частями для обеспечения гидролиза эфиров муравьиной кислоты, которые не расщепляются при добавлении HCl. Полученный раствор перемешивали в течение часа, а затем летучий компонент удаляли под вакуумом. Остаток промывали в воде (1 л) и подкисляли 10% раствором HCl (pH 4). Затем продукт экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органическую фазу затем сушили и концентрировали на роторном испарителе с получением желаемого соединения 31 (57 г, 24%) в виде твердого вещества. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m, 4H), 1.44-1.34 (m, 28H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCI3): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.hours After completion, the reaction was stopped by slow addition of 10% HCl, and then water (1 l) and was extracted with ethyl acetate (3x1 l). The organic layer was diluted into a 5 liter beaker, diluted with 500 ml methanol and cooled to 0°C. To this solution, an excess of NaBH ₄ (~5eq) was added in portions to ensure the hydrolysis of the formic acid esters, which are not cleaved by the addition of HCl. The resulting solution was stirred for an hour, and then the volatile component was removed under vacuum. The residue was washed in water (1 L) and acidified with 10% HCl solution (pH 4). The product was then extracted with ethyl acetate (3x1 L). The organic phase was then dried and concentrated on a rotary evaporator to give the desired compound 31 (57 g, 24%) as a solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m, 4H), 1.44-1.34 (m, 28H). ¹³ C NMR (100 MHz, CDCI3): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.

Соединение 32. Соединение 31 (56 г, 0,1196 моль) растворяли в 700 мл сухого ТГФ и охлаждали до 0°C. TBSCl (36,06 г, 0,2396 моль) медленно добавляли, с последующим добавлением имидазола (32,55 г, 0,4786 моль) в инертной атмосфере. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. После завершения реакцию останавливали льдом (~1 кг) и экстрагировали этилацетатом (3x500 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaHCO₃для удаления кислотных примесей, сушили над Na₂SO₄ и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения, которое очищали на силикагеле (60-120 меш) и элюировали 0-10% этилацетата в гексане, получая (60 г, 82%) соединения 32 в виде желтоватого масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.411.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 32 Compound 31 (56 g, 0.1196 mol) was dissolved in 700 ml dry THF and cooled to 0°C. TBSCl (36.06 g, 0.2396 mol) was added slowly, followed by imidazole (32.55 g, 0.4786 mol) under an inert atmosphere. Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours. After completion, the reaction was stopped with ice (~1 kg) and was extracted with ethyl acetate (3x500 ml). The organic layer was separated, washed with saturated NaHCO ₃ solution to remove acid impurities, dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated under reduced pressure to give the crude compound, which was purified on silica gel (60-120 mesh) and eluted with 0-10% ethyl acetate in hexane, yielding (60 g, 82%) compound 32 as a yellowish oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m , 4H), 1.411.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Соединение 33. Соединение 32 (60 г, 0,1030 моль) растворяли в 500 мл этилацетата и дегазировали с N2 в течение 20 мин. Добавляли (10% по массе) Pd на угле (12 г) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 18 ч. После завершения смесь фильтровали через слой целита и промывали этилацетатом. Фильтрат упаривают в вакууме, получая соединение 33 (19 г, 46%), которое было достаточно чистым для использования в следующей синтетической последовательности. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 33 Compound 32 (60 g, 0.1030 mol) was dissolved in 500 ml of ethyl acetate and degassed with N2 for 20 min. Pd on charcoal (10% by weight) (12 g) was added and the reaction mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 18 hours. After completion, the mixture was filtered through a pad of celite and washed with ethyl acetate. The filtrate was evaporated in vacuo to give compound 33 (19 g, 46%) which was pure enough to be used in the next synthetic sequence. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H ), 0.02 (s, 6H).

Соединение 34. Соединение 33 (8,2 г, 0,0199 моль) растворяли в 100 мл сухого DCM и охлаждали до 0°C. TEA (22,14 мл, 0,1592 моль) добавляли в инертной атмосфере. После перемешивания смеси в течение 5 мин, мезилхлорид (4,6 мл, 0,059 моль) по каплям добавляли и реакционную смесь, перемешивали еще в течение 3 ч. После завершения реакции смесь останавливали льдом (~200 г) и экстрагировали DCM (3x75 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали, получая сырое соединение, которое очищали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-30% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 34 (8,2 г, 73%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=4.22-4.19 (m, 4H), 3.60-3.58 (m, 1H), 2.99 (s, 6H), 1.75-1.69 (m, 4H), 1.38-1.28 (m, 28H), 0.86 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 34 Compound 33 (8.2 g, 0.0199 mol) was dissolved in 100 ml dry DCM and cooled to 0°C. TEA (22.14 ml, 0.1592 mol) was added under an inert atmosphere. After stirring the mixture for 5 min, mesyl chloride (4.6 ml, 0.059 mol) was added dropwise and the reaction mixture was stirred for an additional 3 h. After completion of the reaction, the mixture was stopped with ice (~200 g) and extracted with DCM (3x75 ml) . The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to give crude compound which was purified on a 60-120 mesh silica gel column using 0-30% ethyl acetate in hexane as system eluent to give compound 34 (8.2 g, 73%) as a pale yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=4.22-4.19 (m, 4H), 3.60-3.58 (m, 1H), 2.99 (s, 6H), 1.75-1.69 (m, 4H), 1.38-1.28 ( m, 28H), 0.86 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Соединение 35. К раствору соединения 34 (8,2 г, 0,0146 моль) в 400 мл сухого эфира добавляли MgBr₂-Et₂O (22,74 г, 0,08817 моль) порциями при 0°C в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь кипятили в течение 28 ч. После завершения реакции неорганический материал, образованный в реакции, удаляли путем фильтрации. Фильтрат выпаривали и полученное сырое соединение очищали на 60-120 меш колонке с силикагелем с использованием 0-3% этилацетата в гексане в качестве элюента системы с получением соединения 35 (6,6 г, 85%) в виде бесцветной жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.61-3.58 (m, 1H), 3.41-3.37 (t, 4 H, J=6.8 Hz), 1.87-1.80 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.012 (s, 6H).Compound 35 To a solution of compound 34 (8.2 g, 0.0146 mol) in 400 ml of dry ether was added MgBr ₂ -Et ₂ O (22.74 g, 0.08817 mol) in portions at 0°C under nitrogen atmosphere. After completion of the addition, the reaction mixture was refluxed for 28 hours. After completion of the reaction, the inorganic material formed in the reaction was removed by filtration. The filtrate was evaporated and the resulting crude compound was purified on a 60-120 mesh silica gel column using 0-3% ethyl acetate in hexane as system eluent to give compound 35 (6.6 g, 85%) as a colorless liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=3.61-3.58 (m, 1H), 3.41-3.37 (t, 4H, J=6.8 Hz), 1.87-1.80 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.012 (s, 6H).

Соединение 36. Раствор этинил триметил силана (5,3 мл, 0,0378 моль) в 60 мл сухого ТГФ охлаждали до -78°C и 1,4 М н-BuLi (23 мл, 0,03405 моль) в гексане медленно добавляли в инертной атмосфере. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, затем HMPA (2,3 г, 0,01324 моль) добавляли и полученную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°C, затем охлаждали до -78°C. К этому раствору добавляли медленно соединение 35 (5 г, 0,0094 моль) в 60 мл сухого ТГФ и после полного добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и выдерживали в течение 18 ч. Реакционный прогресс контролировался 1H ЯМР. После завершения реакции смесь охлаждали до 0°C и останавливали осторожным добавлением насыщенного раствора NH4C1 (50 мл), затем воды (200 мл). Водную фазу экстрагировали гексаном (3x250 мл). Органический слой сушили и растворитель удаляли в вакууме с получением соединения 36 (5 г, 94%), которое использовали без дальнейшей очистки. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.62-3.56 (m, 1H), 2.21-2.17 (m, 4H), 1.49-1.47 (m, 4H), 1.37-1.26 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.13 (s, 18H), 0.021 (s, 6H).Compound 36 A solution of ethynyl trimethyl silane (5.3 ml, 0.0378 mol) in 60 ml dry THF was cooled to -78°C and 1.4 M n-BuLi (23 ml, 0.03405 mol) in hexane was slowly added in an inert atmosphere. The reaction mixture was stirred for 10 min, then HMPA (2.3 g, 0.01324 mol) was added and the resulting mixture was stirred for 2 h at 0°C, then cooled to -78°C. Compound 35 (5 g, 0.0094 mol) in 60 ml dry THF was added slowly to this solution, and after complete addition, the reaction mixture was warmed to room temperature and kept for 18 hours. The reaction progress was monitored by 1H NMR. After completion of the reaction, the mixture was cooled to 0°C and stopped by careful addition of a saturated solution of NH4C1 (50 ml) followed by water (200 ml). The aqueous phase was extracted with hexane (3x250 ml). The organic layer was dried and the solvent was removed in vacuo to give compound 36 (5 g, 94%) which was used without further purification. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=3.62-3.56 (m, 1H), 2.21-2.17 (m, 4H), 1.49-1.47 (m, 4H), 1.37-1.26 (m, 24H), 0.87 (s , 9H), 0.13 (s, 18H), 0.021 (s, 6H).

Соединение 37. К раствору соединения 36 (5 г, 0,0088 моль) в 50 мл метанола, добавляли K2CO3 (6,1 г, 0,044 моль) в одной порции и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Летучую часть удаляли на роторном испарителе и неочищенную смесь разбавляли 100 мл воды и экстрагировали гексаном (3x100 мл). Органический слой сушили над Na2SO4 и упаривалиCompound 37 To a solution of compound 36 (5 g, 0.0088 mol) in 50 ml of methanol was added K2CO3 (6.1 g, 0.044 mol) in one portion and the resulting mixture was stirred for 18 h at room temperature. The volatile part was removed on a rotary evaporator and the crude mixture was diluted with 100 ml of water and extracted with hexane (3x100 ml). The organic layer was dried over Na2SO4 and evaporated

- 87 039892 в вакууме с получением соединения 37 (3,5 г, 97%), которое использовали без дополнительной очистки. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=3.60-3.58 (m, 1H), 2.19-2.14 (m, 4H), 1.93-1.92 (m, 2H), 1.54-1.49 (m,- 87 039892 in vacuo to give compound 37 (3.5 g, 97%) which was used without further purification. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=3.60-3.58 (m, 1H), 2.19-2.14 (m, 4H), 1.93-1.92 (m, 2H), 1.54-1.49 (m,

4H), 1.37-1.27 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).4H), 1.37–1.27 (m, 24H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Соединение 39. Соединение 37 (2,5 г, 0,00598 моль) растворяли в 25 мл сухого ТГФ и охлаждали до -40°C. н-BuLi (1,4 М в гексане 12,9 мл, 0,01794 моль) медленно добавляли, затем, после 10минутного интервала, путем медленного добавления HMPA (25 мл). Полученную смесь выдерживали в течение 30 минут при -40°C в атмосфере азота. Раствор соединения 38 (3,5 г, 1,01196 моль) в 25 мл сухого ТГФ добавляли по каплям к охлажденной реакционной смеси. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры в течение 2 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем смесь останавливали добавлением насыщенного раствора NI ЦО (~50 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Растворитель удаляли на роторном испарителе и полученный сырой продукт очищали на колонке силикагеля (100-200 меш), используя 0-3% этилацетата в дихлорметане в качестве элюента системы с получением соединения 39 (0,9 г, 18%) в виде желтого масла. 1Н ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=4.56-4.55 (m, 2H), 3.87-3.83 (m, 2H), 3.74-3.68 (m, 2H), 3.59-3.57 (m, 1H), 3.49-3.46 (m, 2H), 3.39-3.33 (m, 2H), 2.13-2.10 (m, 8H), 1.87-1.75 (m, 2H), 1.74-1.66 (m, 2H), 1.57-1.42 (m, 20H), 1.401.19 (m, 40H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 39 Compound 37 (2.5 g, 0.00598 mol) was dissolved in 25 ml dry THF and cooled to -40°C. n-BuLi (1.4 M in 12.9 ml hexane, 0.01794 mol) was added slowly, then after a 10 minute interval by slowly adding HMPA (25 ml). The resulting mixture was kept for 30 minutes at -40°C in a nitrogen atmosphere. A solution of compound 38 (3.5 g, 1.01196 mol) in 25 ml of dry THF was added dropwise to the cooled reaction mixture. The resulting mixture was warmed to room temperature for 2 h, then stirred at room temperature for 18 h. The mixture was then stopped by adding a saturated solution of NI CO (~50 ml) and the product was extracted with ethyl acetate (3x50 ml). The solvent was removed on a rotary evaporator and the resulting crude product was purified on a silica gel column (100-200 mesh) using 0-3% ethyl acetate in dichloromethane as system eluent to give compound 39 (0.9 g, 18%) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=4.56-4.55 (m, 2H), 3.87-3.83 (m, 2H), 3.74-3.68 (m, 2H), 3.59-3.57 (m, 1H), 3.49-3.46 (m, 2H), 3.39-3.33 (m, 2H), 2.13-2.10 (m, 8H), 1.87-1.75 (m, 2H), 1.74-1.66 (m, 2H), 1.57-1.42 (m, 20H) , 1.401.19 (m, 40H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Соединение 40. К раствору соединения 39 (504 мг, 0,598 ммоль) в 10 мл сухого эфира добавляли MgBr₂-Et₂O (926 мг, 3,59 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч, затем останавливали добавлением насыщенного водного раствора NaHCO₃. Продукт экстрагировали CH₂Cl₂. Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением соединения 40 (307 мг, 0,455 ммоль, 76%, Rf=0,36 получен с гексаном: EtOAc=2:1). 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3) δ 3.59-3.66 (m, 5H), 2.14 (t, J=6.6 Hz, 8H), 1.21-1.59 (m, 52H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).Compound 40 To a solution of compound 39 (504 mg, 0.598 mmol) in 10 ml of dry ether was added MgBr ₂ -Et ₂ O (926 mg, 3.59 mmol). The reaction mixture was stirred for 14 h, then stopped by adding saturated aqueous NaHCO ₃ . The product was extracted with CH ₂ Cl ₂ . The organic layer was dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 40 (307 mg, 0.455 mmol, 76%, Rf=0.36 obtained with hexane: EtOAc=2:1). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 3.59-3.66 (m, 5H), 2.14 (t, J=6.6 Hz, 8H), 1.21-1.59 (m, 52H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).

Соединение 41. К раствору 40 (180 мг, 0,267 ммоль) в безводном ДМФ (5 мл) добавляли пиридина дихромат (603 мг, 1,60 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 ч. После разбавления водой (20 мл), смесь экстрагировали Et₂O (3x40 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением соединения 41 (53 мг, 0,075 ммоль, 28%, Rf=0,25 получен с CH₂Cl₂:MeOH:уксусная кислота=95:4,5:0,5). Молекулярный вес для C₄₃H₇₇O₅Si (М-H)^- Расч. 701,5540, Найденный 701,5. Это соединение может быть синтезировано посредством TEMPO окисления.Compound 41 To a solution of 40 (180 mg, 0.267 mmol) in anhydrous DMF (5 ml) was added pyridine dichromate (603 mg, 1.60 mmol). The reaction mixture was stirred for 48 hours After dilution with water (20 ml), the mixture was extracted with Et ₂ O (3x40 ml). The organic layer was dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 41 (53 mg, 0.075 mmol, 28%, Rf=0.25 obtained with CH ₂ Cl ₂ :MeOH:acetic acid=95:4.5:0.5) . Molecular Weight for C ₄₃ H ₇₇ O ₅ Si (M-H) ^- Calc. 701.5540, Found 701.5. This compound can be synthesized via TEMPO oxidation.

Соединение 42. Процедура, аналогичная описанной для соединения 19, дает соединение 42 (23 мг 0,032 ммоль, 21% из соединения 40). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃) δ 3.67 (s, 6H), 3.59-3.62 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.13 (t, J=6.8 Hz, 8H), 1.27-1.64 (m, 48H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).Compound 42 A procedure similar to that described for compound 19 gives compound 42 (23 mg 0.032 mmol, 21% from compound 40). 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.67 (s, 6H), 3.59-3.62 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.13 (t, J=6.8 Hz, 8H), 1.27-1.64 (m, 48H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H).

Ограниченное использование условий P-2 никеля может дать соединение 43 и последующее снятие защиты посредством TBAF может привести к получению соединения 8.Limited use of nickel P-2 conditions may give compound 43 and subsequent deprotection with TBAF may result in compound 8.

Пример 5. Альтернативные синтезы для соединения 8.Example 5 Alternative Syntheses for Compound 8

Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 5. Бромид 51 может быть преобразован в этот реактив Гриньяра и в сочетании с этилформиатом даст соединение 52. Последующая обработка кислотой, окисление и восстановление может дать соединение 8.Compound 8 can be synthesized as shown in Scheme 5. Bromide 51 can be converted to this Grignard reagent and combined with ethyl formate will give compound 52. Subsequent acid treatment, oxidation and reduction can give compound 8.

- 88 039892- 88 039892

Соединение 8 может быть синтезировано, как показано на схеме 6. Бромиды эфиров соединений 58, 60 или 62 могут взаимодействовать с этилформиатом для создания терминально-функциональной ди-олефинной цепи. Соединение 8 может быть получено из ди-олефинной цепи соединений с использованием стандартных химических реакций.Compound 8 can be synthesized as shown in Scheme 6. The ester bromides of compounds 58, 60, or 62 can be reacted with ethyl formate to create a terminally functional di-olefin chain. Compound 8 can be obtained from the di-olefin chain of compounds using standard chemical reactions.

Пример 7.Example 7

Схема 7 /Χ^χΧ^-χ^χ,ΟΗ ^ВП~^ВГ _г /~х^~χχ-χ/-χ .ОВП ^но NaH, ТГ *^но рри, дам ^г Scheme 7 /Χ^ ^χΧ ^ ^-χ ^χ,ΟΗ ^VP ~ ^VG _g /~x^~χχ-χ/-χ ^.

2 32 3

Синтез 8-бензилокси-октан-1-ола (2).Synthesis of 8-benzyloxy-octan-1-ol (2).

К перемешанной суспензии NaH (60% в масле, 82 г, 1,7096 моль) в 500 мл безводного ДМФ доTo a stirred suspension of NaH (60% in oil, 82 g, 1.7096 mol) in 500 ml anhydrous DMF to

- 89 039892 бавляли раствор соединения 1 (250 г, 1,7096 моль) в 1,5 л ДМФ медленно, используя капельную воронку при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, затем бензилбромид (208,86 мл, 1,7096 моль) медленно добавляли в атмосфере азота. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 ч. После завершения реакции смесь останавливали с колотым льдом (~2 кг) и экстрагировали этилацетатом (2x1 л). Органический слой промывают водой (1л), чтобы удалить нежелательный ДМФ, сушили над Na₂SO₄ и упаривали досуха в вакууме. Неочищенное соединение очищали на 60-120 силикагеле, элюент 0-5% MeOH в DCM с получением соединения 2 (220 г, 54%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).- 89 039892 a solution of compound 1 (250 g, 1.7096 mol) in 1.5 L of DMF was added slowly using an addition funnel at 0°C. The reaction mixture was stirred for 30 minutes, then benzyl bromide (208.86 ml, 1.7096 mol) was added slowly under nitrogen. The reaction mixture was then warmed to room temperature and stirred for 10 hours. After completion of the reaction, the mixture was stopped with crushed ice (~2 kg) and extracted with ethyl acetate (2x1 L). The organic layer was washed with water (1L) to remove unwanted DMF, dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated to dryness in vacuo. The crude compound was purified on 60-120 silica gel eluting with 0-5% MeOH in DCM to give compound 2 (220 g, 54%) as a pale yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 ( m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).

Синтез (8-бром-октилоксиметил)-бензола (3).Synthesis of (8-bromo-octyloxymethyl)-benzene (3).

Соединение 2 (133 г, 0,5635 моль) растворяли в 1,5 л DCM, CBr₄ (280,35 г, 0,8456 моль) добавляли к нему при перемешивании раствора и реакционную смесь охлаждали до 0°C в атмосфере инертного газа. PPh₃ (251,03 г, 0,9571 моль) затем добавляли порциями, поддерживая температуру ниже 20°C и после завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции твердое вещество (PPh3O), выпавшее в осадок из реакционной смеси, было выделено фильтрацией, при этом фильтрат разбавляли с колотым льдом (~1,5 кг) и экстрагировали DCM (3x750 мл). Органический слой отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄ и перегоняли в вакууме. Полученное сырое соединение хроматографировали на 60-120 меш на колонке с силикагелем с использованием 0-5% этилацетата в гексане в качестве системы элюента с получением соединения 3 (150 г, 89%) в виде бледно-желтой жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).Compound 2 (133 g, 0.5635 mol) was dissolved in 1.5 L of DCM, CBr ₄ (280.35 g, 0.8456 mol) was added thereto while stirring the solution and the reaction mixture was cooled to 0° C. under an inert gas atmosphere . PPh ₃ (251.03 g, 0.9571 mol) was then added in portions keeping the temperature below 20° C. and after the addition was complete the reaction mixture was stirred for 3 hours at room temperature. After completion of the reaction, the solid (PPh3O) precipitated from the reaction mixture was isolated by filtration, the filtrate was diluted with crushed ice (~1.5 kg) and extracted with DCM (3x750 ml). The organic layer was separated, dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and distilled in vacuo. The resulting crude compound was chromatographed on a 60-120 mesh silica gel column using 0-5% ethyl acetate in hexane as the eluent system to give Compound 3 (150 g, 89%) as a pale yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 ( m, 4H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).

Синтез 1, 17-бис-бензилокси-гептадекан-9-ола (4).Synthesis of 1, 17-bis-benzyloxy-heptadecan-9-ol (4).

К свежеактивированной стружке Mg (24,08 г, 1,003 моль) добавляли 200 мл безводного ТГФ, с последующим добавлением щепотки йода к смеси в инертной атмосфере. После начала формирования реактива Гриньяра раствор соединения 3 (150 г, 0,5016 моль) в 1 л сухого ТГФ медленно добавляли для контроля экзотермической реакции. После завершения добавления реакционную смесь кипятили в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. Метилформиат (60,24 г, 1,0033 моль) затем добавляли медленно и реакция продолжалась в течение 2 ч. После завершения реакцию останавливали медленным добавлением 10% HCl, а затем воды (1 л) и экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органический слой был декантирован в 5-литровый стакан, его разбавляли 500 мл метанола и охлаждали до 0°C. К этому раствору добавляли избыток NaBH₄ (~5eq) для обеспечения гидролиза эфира муравьиной кислоты, который не расщепляется при добавлении HCl. Полученный раствор перемешивали в течение часа, а затем летучую часть удаляли под вакуумом. Остаток промывали в воде (1 л) и подкисляли 10% раствором HCl (pH 4). Затем продукт экстрагировали этилацетатом (3x1 л). Органическую фазу затем сушили и концентрировали на роторном испарителе с получением соединения 4 (57 г, 24%) в виде твердого вещества. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m,4H), 1.44-1.34 (m,28H). ¹³C NMR(100 MHz, CDCl·,): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.To a freshly activated Mg chip (24.08 g, 1.003 mol) was added 200 ml of anhydrous THF, followed by adding a pinch of iodine to the mixture under an inert atmosphere. After the beginning of the formation of the Grignard reagent, a solution of compound 3 (150 g, 0.5016 mol) in 1 L of dry THF was slowly added to control the exothermic reaction. After completion of the addition, the reaction mixture was refluxed for 1 h, then cooled to room temperature. Methyl formate (60.24 g, 1.0033 mol) was then added slowly and the reaction continued for 2 hours. After completion, the reaction was stopped by slow addition of 10% HCl followed by water (1 L) and extracted with ethyl acetate (3x1 L). The organic layer was decanted into a 5 liter beaker, diluted with 500 ml methanol and cooled to 0°C. To this solution was added an excess of NaBH ₄ (~5eq) to ensure the hydrolysis of the formic ester, which is not cleaved by the addition of HCl. The resulting solution was stirred for an hour, and then the volatile part was removed under vacuum. The residue was washed in water (1 L) and acidified with 10% HCl solution (pH 4). The product was then extracted with ethyl acetate (3x1 L). The organic phase was then dried and concentrated on a rotary evaporator to give compound 4 (57 g, 24%) as a solid. 1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ=7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H ), 1.63-1.56 (m, 4H), 1.44-1.34 (m, 28H). ¹³ C NMR(100 MHz, CDCl ,): δ=138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.

Синтез [9-бензилокси-1-(8-бензилокси-октил)нонилокси]трет-бутил-диметил-силана (5).Synthesis of [9-benzyloxy-1-(8-benzyloxy-octyl)nonyloxy]tert-butyl-dimethylsilane (5).

Соединение 4 (56 г, 0,1196 моль) растворяли в 700 мл безводного ТГФ и охлаждали до 0°C. TBMS-Cl (36,06 г, 0,2396 моль) медленно добавляли с последующим добавлением имидазола (32,55 г, 0,4786 моль) в инертной атмосфере. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч, затем останавливали со льдом (~1 кг). Продукт экстрагировали этилацетатом (3x500 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaHCO₃ для удаления кислых примесей, сушили над Na₂SO₄ и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения, которое очищали на силикагеле (60-120 меш) и элюировали 0-10% этилацетатом в гексане, получая (60 г, 82%) соединение 5 в виде желтоватого масла. ¹H ЯМР (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.41-1.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 4 (56 g, 0.1196 mol) was dissolved in 700 ml of anhydrous THF and cooled to 0°C. TBMS-Cl (36.06 g, 0.2396 mol) was added slowly followed by imidazole (32.55 g, 0.4786 mol) under an inert atmosphere. Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 18 h, then stopped with ice (~1 kg). The product was extracted with ethyl acetate (3x500 ml). The organic layer was separated, washed with saturated NaHCO ₃ solution to remove acidic impurities, dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated under reduced pressure to give the crude compound, which was purified on silica gel (60-120 mesh) and eluted with 0-10% ethyl acetate in hexane, obtaining (60 g, 82%) compound 5 as a yellowish oil. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 ( m, 4H), 1.41–1.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Синтез 9-(трет-бутил-диметил-силанилокси)гептадекан-1,17-диола (6).Synthesis of 9-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)heptadecan-1,17-diol (6).

Соединение 5 (60 г, 0,1030 моль) растворяли в 500 мл этилацетата и дегазировали N2 в течение 20 мин. Добавляли (10% по массе) Pd на угле (12 г) и реакционную смесь перемешивавали в атмосфере водорода в течение 18 ч. После завершения смесь фильтровали через слой целита и промывали этилацетатом. Фильтрат выпаривали в вакууме. Соединение 6 (19 г, 46%), полученное таким образом, было достаточно чистым для проведения последующей реакции. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).Compound 5 (60 g, 0.1030 mol) was dissolved in 500 ml of ethyl acetate and degassed with N2 for 20 min. Pd on charcoal (10% by weight) (12 g) was added and the reaction mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 18 hours. Upon completion, the mixture was filtered through a pad of celite and washed with ethyl acetate. The filtrate was evaporated in vacuo. Compound 6 (19 g, 46%) thus obtained was pure enough to carry out the subsequent reaction. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ=3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).

Синтез 9-(трет-бутил-диметил-силанилокси)гептадекандиоивой кислоты (7).Synthesis of 9-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)heptadecandioic acid (7).

К раствору 6 (2 г, 0,0049 моль) в безводном ДМФ (40 мл) добавляли пиридин бихромат (2,7 г, 0,0074 моль) при 0°C в атмосфере инертного газа. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры в течение 10-15 мин и продолжали реакцию в течение 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли водой (100 мл). Водную фазу экстрагировали DCM (3x40 мл). Органическую фазу промывалиTo a solution of 6 (2 g, 0.0049 mol) in anhydrous DMF (40 ml) was added pyridine dichromate (2.7 g, 0.0074 mol) at 0°C under an inert gas atmosphere. The reaction mixture was then warmed to room temperature over 10-15 min and the reaction continued for 24 h. The reaction mixture was then diluted with water (100 ml). The aqueous phase was extracted with DCM (3x40 ml). The organic phase was washed

- 90 039892 рассолом (1x25 мл) и концентрируровали в вакууме с получением неочищенной кислоты, которую затем очищали (100-200 меш) на колонке с силикагелем, используя систему 0-30% этилацетата в гексане.- 90 039892 brine (1x25 ml) and concentrated in vacuo to give the crude acid, which was then purified (100-200 mesh) on a silica gel column using a system of 0-30% ethyl acetate in hexane.

Чистый продукт (7) был получен (0,7 г, 33%) в виде бледно-желтого масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃):Pure product (7) was obtained (0.7 g, 33%) as a pale yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ):

δ=3.61-3.56 (m, 1H), 2.35-2.32 (m, 4H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.40-1.19 (m, 24H), 0.86 (s, 9H), 0.017 (s, 6H);δ=3.61-3.56 (m, 1H), 2.35-2.32 (m, 4H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.40-1.19 (m, 24H), 0.86 (s, 9H), 0.017 (s, 6H );

LC-MS [M+H] - 431.00; HPLC (ELSD) purity -96.94%LC-MS [M+H] - 431.00; HPLC (ELSD) purity -96.94%

Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((трет-бутилдиметилсилил)окси)гептадекандиоата (8).Synthesis of di((Z)-non-2-en-1-yl)9-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)heptadecanedioate (8).

Дикислоту 7 (0,42 г, 0,97 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и к нему добавляли цис-2нонен-1-ол (0,35 г, 2,44 ммоль) с последующим добавлением основания Хюнига (0,68 г, 4,9 ммоль) и DMAP (12 мг). К этой смеси добавляли EDCI (0,47 г, 2,44 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ (40 мл) и промывали насыщенным NaHCO₃ (50 мл), водой (60 мл) и рассолом (60 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄ и растворитель удаляли в вакууме. Сырой, полученный таким образом продукт очищали с помощью Combiflash Rf системы очистки (40 г силикагеля, 0-10% MeOH в CH₂Cl₂) с получением чистого продукта 8 (0,35 г, 53%) в виде бесцветного масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl₃): δ ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.58 - 5.43 (m, 2H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 3.71 - 3.48 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.6 Hz, 4H), 2.20 - 1.98(m, 4H), 1.71 - 1.53 (m,4H), 1.31 (ddd, J=8.3, 7.0, 3.7 Hz, 34H), 1.07-0.68 (m, 14H), 0.02 (s, 5H). ¹³C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 178.18, 139.81, 127.78, 81.73, 81.42, 81.10, 76.72, 64.59, 41.52, 41.32, 38.76, 36.09, 34.10, 33.93, 33.80, 33.70, 33.59, 33.55, 33.26, 31.95, 30.34, 29.69, 29.58, 29.39, 27.01, 22.56, 18.48, 0.01.Diacid 7 (0.42 g, 0.97 mmol) was dissolved in 20 mL of dichloromethane and cis-2nonen-1-ol (0.35 g, 2.44 mmol) was added thereto, followed by Hunig's base (0.68 g , 4.9 mmol) and DMAP (12 mg). To this mixture was added EDCI (0.47 g, 2.44 mmol) and the reaction mixture was stirred at room temperature overnight. Then the reaction mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (40 ml) and washed with saturated NaHCO ₃ (50 ml), water (60 ml) and brine (60 ml). The combined organic layers were dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and the solvent was removed in vacuo. The crude product thus obtained was purified using a Combiflash Rf purification system (40 g silica gel, 0-10% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ) to give pure product 8 (0.35 g, 53%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ ¹ H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.58 - 5.43 (m, 2H), 4.61 (d, J= 6.8 Hz, 4H), 3.71 - 3.48 (m, 1H), 2.30 (t, J=7.6 Hz, 4H), 2.20 - 1.98(m, 4H), 1.71 - 1.53 (m, 4H), 1.31 (ddd, J =8.3, 7.0, 3.7 Hz, 34H), 1.07-0.68 (m, 14H), 0.02 (s, 5H). ¹³ C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 178.18, 139.81, 127.78, 81.73, 81.42, 81.10, 76.72, 64.59, 41.52, 41.32, 38.76, 36.09, 34.10, 33.93, 33.80, 33.70, 33.59, 33.55, 33.26, 31.95, 30.34, 29.69, 29.58, 29.39, 27.01, 22.56, 18.48, 0.01.

Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-гидроксигептадекандиоата (9).Synthesis of di((Z)-non-2-en-1-yl)9-hydroxyheptadecanedioate (9).

Силильный защищенный диэфир 8 (0,3 г, 0,44 ммоль) растворяли в 1 М растворе TBAF в ТГФ (6 мл) и раствор выдерживали при 40°C в течение двух дней. Реакционную смесь разбавляли водой (60 мл) и экстрагировали эфиром (2x50 мл). Объединенные органические слои концентрировали и полученный таким образом сырой продукт очищали с помощью колоночной хроматографии, чтобы выделить чистый продукт (0,097 г, 39%). 1H ЯМР (400 MHz, CDCl·,) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.52 (dt, J=11.0, 6.8 Hz, 2H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 3.57 (s, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.09 (q, J=7.1 Hz, 4H), 1.75 - 1.53 (m, 4H), 1.53 - 1.06 (m, 36H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 6H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCI3) δ 173.98, 135.64, 123.57, 77.54, 77.22, 76.91, 72.14, 60.41, 37.69, 34.54, 31.89, 29.70, 29.60, 29.44, 29.29, 29.07, 27.76, 25.80, 25.15, 22.82, 14.29.The silyl protected diester 8 (0.3 g, 0.44 mmol) was dissolved in a 1 M solution of TBAF in THF (6 ml) and the solution was kept at 40° C. for two days. The reaction mixture was diluted with water (60 ml) and extracted with ether (2x50 ml). The combined organic layers were concentrated and the crude product thus obtained was purified by column chromatography to isolate the pure product (0.097 g, 39%). 1H NMR (400 MHz, CDCl ,) δ 5.64 (dt, J=10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.52 (dt, J=11.0, 6.8 Hz, 2H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H) , 3.57 (s, 1H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 4H), 2.09 (q, J=7.1 Hz, 4H), 1.75 - 1.53 (m, 4H), 1.53 - 1.06 (m, 36H), 0.88 (t, J=6.8Hz, 6H). ¹³ c nmr (101 mhz, cdci3) δ 173.98, 135.64, 123.57, 77.54, 77.22, 76.91, 72.14, 60.41, 37.69, 34.54, 31.89, 29.70, 29.60, 29.44, 29.29, 29.07.07, 27.76, 25.8.22, 25.22, 25.22, 25.82, 25.22, 25.82, 25.82, 25.22.82, 25.22.82, 25.22.82, 25.22.82. 14.29.

Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1 -ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата.Synthesis of di((Z)-non-2-en-1-yl)9-((4-(dimethylamino)butanoyl)oxy)heptadecanedioate.

Спирт 9 (0,083 г, 0,147 ммоль) растворяли в 20 мл дихлорметана и к нему добавляли диметиламиномасляной кислоты гидрохлорид (0,030 г, 0,176 ммоль) с последующим добавлением основания Хюнига (0,045 г, 0,44 ммоль) и DMAP (2 мг). К этой смеси добавляли EDCI (0,034 г, 0,176 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и TLC (силикагель, 10% MeOH в CH2Cl2) показал полное исчезновение исходного спирта. Реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 (40 мл) и промывали насыщенным NaHCO3 (50 мл), водой (60 мл) и рассолом (60 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Na₂SO₄ и растворитель удаляли в вакууме. Сырой, полученный таким образом продукт очищали с помощью Combiflash Rf системы очистки (40 г силикагеля, 0-10% MeOH в CH₂Cl₂), чтобы изолировать чистый продукт (0,062 г, 62%) в виде бесцветного масла. 1H ЯМР (400 MHz, CDCI3) δ 5.74 - 5.58 (m, 2H), 5.51 (dtt, J=9.7, 6.8, 1.3 Hz, 2H), 4.95-4.75 (m, 1H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 2.35 -2.24 (m, 8H), 2.22 (d, J=7.9 Hz, 6H), 2.09 (q, J=6.9 Hz, 4H), 1.83 - 1.72 (m, 2H), 1.60 (dd, J =14.4, 7.2 Hz, 4H), 1.49 (d, J=5.7 Hz, 4H), 1.41-1.13 (m, 30H), 0.88 (t, J=6.9 Hz, 6H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCI3) δ 173.72, 173.36, 135.40, 123.35, 74.12, 60.18, 58.95, 45.46, 34.30, 34.11, 32.45, 31.67, 29.38, 29.35, 29.17, 29.07, 28.84, 27.53, 25.28, 24.93, 23.16, 22.59, 14.06. MW расч. для C₄₁H₇₅NO₆ (MH): 678,04, найд: 678,5.Alcohol 9 (0.083 g, 0.147 mmol) was dissolved in 20 mL of dichloromethane and dimethylaminobutyric acid hydrochloride (0.030 g, 0.176 mmol) was added thereto, followed by Hunig's base (0.045 g, 0.44 mmol) and DMAP (2 mg). To this mixture was added EDCI (0.034 g, 0.176 mmol) and the reaction mixture was stirred at room temperature overnight and TLC (silica gel, 10% MeOH in CH2Cl2) showed complete disappearance of the starting alcohol. The reaction mixture was diluted with CH2Cl2 (40 ml) and washed with saturated NaHCO3 (50 ml), water (60 ml) and brine (60 ml). The combined organic layers were dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and the solvent was removed in vacuo. The crude product thus obtained was purified using a Combiflash Rf purification system (40 g silica gel, 0-10% MeOH in CH ₂ Cl ₂ ) to isolate the pure product (0.062 g, 62%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 5.74 - 5.58 (m, 2H), 5.51 (dtt, J=9.7, 6.8, 1.3 Hz, 2H), 4.95-4.75 (m, 1H), 4.61 (d, J=6.8 Hz, 4H), 2.35 - 2.24 (m, 8H), 2.22 (d, J=7.9 Hz, 6H), 2.09 (q, J=6.9 Hz, 4H), 1.83 - 1.72 (m, 2H), 1.60 (dd , J =14.4, 7.2 Hz, 4H), 1.49 (d, J=5.7 Hz, 4H), 1.41-1.13 (m, 30H), 0.88 (t, J=6.9 Hz, 6H). ¹³ c nmr (101 mhz, cdci3) δ 173.72, 173.36, 135.40, 123.35, 74.12, 60.18, 58.95, 45.46, 34.30, 34.11, 32.45, 31.67, 29.38, 29.35, 29.17, 29.07, 28.84, 27.53.28, 24.93, 24.93, 24.93 23.16, 22.59, 14.06. MW calc. for C ₄₁ H ₇₅ NO ₆ (MH): 678.04, found: 678.5.

Пример 8.Example 8

Следующий короткий маршрут может быть использован для синтеза соединения 1 настоящего изобретения. Коммерческий 9-бромонон-1-ен 10, обработанный с магнием с образованием соответствующего реагента Гриньяра, который взаимодействует с этилформиатом с получением соответствующего аддукта 11, который при взаимодействии с бромобутирил хлоридом обеспечивает бромэфир 12. Бромэфир 12 при взаимодействии с RuO₄ дает дикислоту 13. Бромодикислота 13 при взаимодействии с диметиламином дает аминодикислоту 14. Аминодикислота 14 при связывании со спиртом 15 дает продукт с хорошими выходами.The following short route can be used to synthesize Compound 1 of the present invention. Commercial 9-bromonon-1-ene 10, treated with magnesium to form the corresponding Grignard reagent, which reacts with ethyl formate to give the corresponding adduct 11, which, when reacted with bromobutyryl chloride, provides bromoester 12. Bromoether 12, when reacted with RuO ₄ , gives diacid 13. Bromodic acid 13, when reacted with dimethylamine, gives amino acid 14. Amino acid 14, when combined with alcohol 15, gives the product in good yields.

- 91 039892- 91 039892

Схема 8 оScheme 8 about

1. RuO₄ 1. RuO ₄

2. О₃/Н₂О2. O ₃ / H ₂ O

3. КМпО₄ 3. KMPO ₄

Синтез нонадека-1,18-диен-10-ола (11).Synthesis of nonadec-1,18-dien-10-ol (11).

На открытом пламени сушат 500 мл RB колбу, свежеактивированную Mg стружку (9 г) помещают в колбу, снабженную магнитной мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником. Эта установка была дегазирована и промыта аргоном и 100 мл безводного эфира добавили в колбу с помощью шприца. Бромид 3 (51,3 г, 250 ммоль) растворили в безводном эфире (100 мл) и добавили в капельную воронку. Около 5 мл этого эфирного раствора добавили к Mg стружке при интенсивном перемешивании. Экзотермическая реакция была замечена (для подтверждения/ускорения формирования реагента Гриньяра, 5 мг йода было добавлено и немедленное обесцвечивание наблюдалось, подтверждающее формирование реактива Гриньяра) и эфир начали дефлегмировать. Остальной раствор бромида добавляли по каплям при сохранении реакции при легком дефлегмировании при охлаждении колбы в воде. После завершения добавления реакционную смесь выдерживали при 35°C в течение 1 ч, а затем охлаждали в ледяной бане. Этилформиат (9 г, 121 ммоль) растворяли в безводном эфире (100 мл), переносили в капельную воронку и добавляли по каплям к реакционной смеси при перемешивании. Экзотермическая реакция наблюдалась и реакционную смесь начали дефлегмировать. После начала реакции остальной эфирный раствор формиата быстро добавили в виде потока и реакционную смесь перемешивали в течение еще 1 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 10 мл ацетона по каплям следом за ледяной водой (60 мл). Реакционную смесь обрабатывали водной H2SO4 (10% по объему, 300 мл), пока раствор не стал однородным и слои разделили. Водную фазу экстрагировали эфиром (2x200 мл). Объединенные эфирные слои сушили (Na₂SO₄) и концентрируровали, получая сырой продукт, который очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 0-10% эфира в гексане). Полученные фракции выпаривали до получения чистого продукта 11 в виде белого твердого вещества (30,6 г, 90%). ¹H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 5.81 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 8H), 5.04 - 4.88 (m, 16H), 3.57 (dd, J=7.6, 3.3 Hz, 4H), 2.04 (q, J=6.9 Hz, 16H), 1.59 (s, 1H), 1.45 (d, J=7.5 Hz, 8H), 1.43-1.12 (m, 94H), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 2H). ¹³C ЯМР (101 MHz, cdcl3) δ 139.40, 114.33, 77.54, 77.22, 76.90, 72.21, 37.70, 34.00, 29.86, 29.67, 29.29, 29.12, 25.85.A 500 ml RB flask is dried on an open flame, freshly activated Mg shavings (9 g) are placed in a flask equipped with a magnetic stirrer, addition funnel and reflux condenser. This setup was degassed and flushed with argon and 100 ml of anhydrous ether was added to the flask with a syringe. Bromide 3 (51.3 g, 250 mmol) was dissolved in anhydrous ether (100 ml) and added to an addition funnel. About 5 ml of this ether solution was added to the Mg shavings with vigorous stirring. An exothermic reaction was noticed (to confirm/accelerate Grignard formation, 5 mg of iodine was added and an immediate discoloration was observed, confirming Grignard formation) and the ether began to reflux. The rest of the bromide solution was added dropwise while maintaining the reaction under slight reflux while cooling the flask in water. After completion of the addition, the reaction mixture was kept at 35°C for 1 h and then cooled in an ice bath. Ethyl formate (9 g, 121 mmol) was dissolved in anhydrous ether (100 ml), transferred to an addition funnel and added dropwise to the reaction mixture with stirring. An exothermic reaction was observed and the reaction mixture began to reflux. After the start of the reaction, the rest of the ethereal formate solution was quickly added as a stream and the reaction mixture was stirred for another 1 hour at room temperature. The reaction was stopped by adding 10 ml of acetone dropwise followed by ice water (60 ml). The reaction mixture was treated with aqueous H2SO4 (10% v/v, 300 ml) until the solution became homogeneous and the layers were separated. The aqueous phase was extracted with ether (2x200 ml). The combined ether layers were dried (Na ₂ SO ₄ ) and concentrated to give the crude product, which was purified using column chromatography (silica gel, 0-10% ether in hexane). The resulting fractions were evaporated to give pure product 11 as a white solid (30.6 g, 90%). ¹ H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 5.81 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 8H), 5.04 - 4.88 (m, 16H), 3.57 (dd, J=7.6, 3.3 Hz, 4H), 2.04 (q, J=6.9 Hz, 16H), 1.59 (s, 1H), 1.45 (d, J=7.5 Hz, 8H), 1.43-1.12 (m, 94H), 0.88 (t, J=6.8Hz, 2H). ¹³ C NMR (101 MHz, cdcl3) δ 139.40, 114.33, 77.54, 77.22, 76.90, 72.21, 37.70, 34.00, 29.86, 29.67, 29.29, 29.12, 25.85.

Синтез нонадека-1,18-диен-10-ил 4-бромбутаноата (12).Synthesis of nonadec-1,18-dien-10-yl 4-bromobutanoate (12).

К раствору спирта 11 (5,6 г, 20 ммоль) в безводном DCM (300 мл) медленно и осторожно добавляли бромобутирил хлорид (20 ммоль) при 0°C в инертной атмосфере. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 20 ч и контролировали с помощью TLC (силикагель, 10% этилацетат в гексане). После завершения реакции смесь разбавляли водой (400 мл) и органический слой отделяли. Органическую фазу промывали раствором NaHCO₃ (1x400 мл), затем рассолом (1x100 мл) и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали на силикагелевой (100-200 меш) колонке, элюировали 2-3% этилацетата в гексане, получая 6 г (90%) желаемого продукта 12 в виде бесцветной жидкости. 1H ЯМР (400 MHz, CDCl3) δ 5.80 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.05 - 4.81 (m, 5H), 3.46 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.48 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.17 (p, J=6.8Hz, 2H), 2.11-1.93 (m, 4H), 1.65 - 1.44 (m, 4H), 1.43 - 1.17 (m,To a solution of alcohol 11 (5.6 g, 20 mmol) in anhydrous DCM (300 ml) was slowly and carefully added bromobutyryl chloride (20 mmol) at 0°C in an inert atmosphere. The reaction mixture was warmed to room temperature, stirred for 20 h and monitored with TLC (silica gel, 10% ethyl acetate in hexane). After completion of the reaction, the mixture was diluted with water (400 ml) and the organic layer was separated. The organic phase was washed with NaHCO ₃ solution (1x400 ml) then brine (1x100 ml) and concentrated in vacuo. The crude product was purified on a silica gel (100-200 mesh) column, eluted with 2-3% ethyl acetate in hexane to give 6 g (90%) of the desired product 12 as a colorless liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.80 (ddt, J=16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.05 - 4.81 (m, 5H), 3.46 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.48 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.17 (p, J=6.8Hz, 2H), 2.11-1.93 (m, 4H), 1.65 - 1.44 (m, 4H), 1.43 - 1.17 (m,

- 92 039892- 92 039892

19H). ¹³C ЯМР (101 MHz, cdcl₃) δ 172.51, 139.37, 114.35, 77.54, 77.23, 76.91, 74.86, 34.31, 33.99, 33.01,19H). ¹³ C NMR (101 MHz, cdcl ₃ ) δ 172.51, 139.37, 114.35, 77.54, 77.23, 76.91, 74.86, 34.31, 33.99, 33.01,

32.96, 29.65, 29.56, 29.24, 29.09, 28.11, 25.52.32.96, 29.65, 29.56, 29.24, 29.09, 28.11, 25.52.

Синтез 9-((4-бромобутаноил)окси)гептадекандиоевой кислоты (13).Synthesis of 9-((4-bromobutanoyl)oxy)heptadecanedioic acid (13).

К раствору бромэфира 12 (12,1 г, 28,2 ммоль) в дихлорметане (300 мл) и ацетонитриле (300 мл), добавляли RuCl₃ (1,16 г, 5 мол%), и смесь охлаждали до 10°C и метапериодат натрия (60 г) в воде (400 мл) добавляли по каплям. Эту смесь перемешивали при 10°C в течение 20 ч. Реакционную смесь разбавляли водой, слои разделяли и органический слой был добавлен насыщенным солевым раствором при перемешивании, затем добавили по каплям 3% раствор сульфида натрия до обесцвечивания (от темнозеленого до бледно-желтого цвета). Слои разделяли, органический слой сушили над сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении с получением чистого продукта. MB рассчитан для С2оН₃5Вг0₇ 467,39; найдено 465,4 (М-2И).To a solution of bromoether 12 (12.1 g, 28.2 mmol) in dichloromethane (300 ml) and acetonitrile (300 ml) was added RuCl ₃ (1.16 g, 5 mol%) and the mixture was cooled to 10°C and sodium metaperiodate (60 g) in water (400 ml) was added dropwise. This mixture was stirred at 10°C for 20 hours. The reaction mixture was diluted with water, the layers were separated and the organic layer was added with brine with stirring, then 3% sodium sulfide solution was added dropwise until discoloration (from dark green to pale yellow) . The layers were separated, the organic layer was dried over sodium sulfate and evaporated under reduced pressure to obtain a pure product. MB calculated for С2оН ₃ _5Br0 7467.39; found 465.4 (M-2I).

Синтез 9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоевой кислоты (14).Synthesis of 9-((4-(dimethylamino)butanoyl)oxy)heptadecandioic acid (14).

Бромокислоту 13 (2 ммоль) растворяли в 2М раствора диметиламина в ТГФ (20 мл) и к нему добавляли 1 г безводного K₂CO₃ и смесь нагревали в сосуде под давлением при 50°C в течение ночи. TLC показала завершение реакции. Реакционную смесь подкисляли уксусной кислотой и разбавляли водой (100 мл) и экстрагировали дихлорметаном (2x60 мл). Объединенные органические слои концентрировали, сушили и использовали без дополнительной очистки в следующей реакции. MB рассчитан для C2₃H4₃NOe 429,59; найден 430,6 (MH)+.Bromoacid 13 (2 mmol) was dissolved in a 2M solution of dimethylamine in THF (20 ml), and 1 g of anhydrous K ₂ CO ₃ was added thereto, and the mixture was heated in a pressure vessel at 50° C. overnight. TLC indicated completion of the reaction. The reaction mixture was acidified with acetic acid and diluted with water (100 ml) and extracted with dichloromethane (2x60 ml). The combined organic layers were concentrated, dried and used without further purification in the next reaction. MB calculated for C2 ₃ H4 ₃ NOe 429.59; found 430.6 (MH)+.

Синтез ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата.Synthesis of di((Z)-non-2-en-1-yl)9-((4-(dimethylamino)butanoyl)oxy)heptadecanedioate.

Дикислота 14 преобразуется в соответствующий диэфир как описано для синтеза 8 и аналитические и спектральные данные согласуются с этим продуктом.The diacid 14 is converted to the corresponding diester as described for synthesis 8 and the analytical and spectral data are consistent with this product.

Пример 9.Example 9

В другом подходе следующий синтетический подход используется для синтеза соединения 1 настоящего изобретения.In another approach, the following synthetic approach is used to synthesize compound 1 of the present invention.

Схема 9Scheme 9

1.Ag₂O/BnBr 1) Mg, МеОСНО1.Ag ₂ O/BnBr 1) Mg, MeOSNO

2. Бензилтрифторацетамид/ 1θ2. Benzyltrifluoroacetamide/ 1θ

Трифлатная кислота (кат)Triflatic acid (cat)

Пример 10. FVII в оценке in vivo использования катионных липидов полученных липосом.Example 10 FVII in the in vivo evaluation of the use of cationic lipids of obtained liposomes.

C57BL/6 мыши (Charles River Labs, MA) получают либо с физиологическим раствором либо миРНК в желаемых составах через хвост инъекции в вену в объеме 0,01 мл/г. В разные точки времени после введения животные анестезировались изофлуорановой ингаляцией и кровь собиралась в сывороточные разделяющие пробирки при ретро-орбитальном кровотечении из забитого животного. Сывороточные уровни белка Фактора VII определяли в образцах с использованием хромогенного анализа (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH) в зависимости от протоколов производителя. Стандартная кривая генерировалась с использованием сыворотки, собранной из подопытных животных. В опытах, где уровни мРНК печени оценивались в различное время после введения, животных скарифицировали и печень собирали и замораживали в жидком азоте. Заморожен- 93 039892 ные ткани печени измельчали в порошок. Лизаты ткани готовили и уровни мРНК Фактора VII и apoB в печени определяли с использованием разветвленного анализа ДНК (QuantiGene Assay, Panomics, CA).Mouse C57BL/6 (Charles River Labs, MA) is prepared either with saline or siRNA in the desired formulations via tail vein injection at a volume of 0.01 ml/g. At various time points after administration, animals were anesthetized with isofluorane inhalation and blood was collected in serum separating tubes at retro-orbital bleeding from the slaughtered animal. Serum levels of Factor VII protein were determined in samples using a chromogenic assay (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH) depending on the manufacturer's protocols. The standard curve was generated using serum collected from experimental animals. In experiments where liver mRNA levels were assessed at various times after administration, animals were scarified and livers were harvested and frozen in liquid nitrogen. Frozen liver tissues were crushed into powder. Tissue lysates were prepared and Factor VII and apoB mRNA levels in the liver were determined using branched DNA analysis (QuantiGene Assay, Panomics, CA).

Пример 11. Определение эффективности липидных частиц препаратов, содержащих различные катионные липиды с использованием In Vivo сайлесинга фактора VII модели грызунов.Example 11 Determination of the effectiveness of lipid particles of formulations containing various cationic lipids using an In Vivo factor VII silencing rodent model.

Фактор VII (FVII), известный белок в каскаде коагуляции, синтезируется в печени (гепатоцитах) и выделяется в плазму. FVII в плазме крови можно определить с помощью простого планшетного колориметрического анализа. Таким образом, FVII представляет собой удобную модель для определения миРНК опосредованного подавления продукции белков гепатоцитами, также как мониторинга концентрации в плазме и тканях распределения нуклеиновая кислота - липид частиц и миРНК, таких как миРНК, показано в табл. 19.Factor VII (FVII), a known protein in the coagulation cascade, is synthesized in the liver (hepatocytes) and released into plasma. FVII in plasma can be determined using a simple colorimetric plate assay. Thus, FVII provides a convenient model for determining siRNA-mediated inhibition of protein production by hepatocytes, as well as monitoring plasma and tissue concentrations. The distribution of nucleic acid-lipid particles and siRNAs such as siRNAs is shown in Table nineteen.

Таблица 19Table 19

Дуплекс Duplex Последовательность 5'-3' Sequence 5'-3' SEQ ID NO: SEQ ID NO: Цель Target AD-1661 AD-1661 GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCdTsdT GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCdTsdT FVII FVII GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdTsdT GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdTsdT

Нижний случай 2'OMe модификации и Nf является 2'F модификацией нуклеооснований, dT является дезокситимидином, s является фосфотиоатом.The bottom case is 2'OMe modification and Nf is 2'F nucleobase modification, dT is deoxythymidine, s is phosphothioatom.

Катионные липиды, описанные здесь, используются для образования липосом, содержащих AD1661duplex при использовании в соответствии с методом смешивания в линию, как описано в международной публикации WO 2010/088537, которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Липидные частицы, сформированные с помощью следующего молярного соотношения: 50% катионных липидов/10% дистеароилфосфатидилхолина (DSPC)/38,5% холестерина/1,5% PEG-DMG (1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин, со средней молекулярной массой PEG 2000).The cationic lipids described here are used to form AD1661 duplex containing liposomes when used according to the in-line mixing method as described in WO 2010/088537, which is incorporated by reference in its entirety. Lipid particles formed with the following molar ratio: 50% cationic lipids/10% distearoylphosphatidylcholine (DSPC)/38.5% cholesterol/1.5% PEG-DMG molecular weight PEG 2000).

C57BL/6 мыши (Charles River Labs, MA) получают либо с физиологическим раствором либо миРНК в желаемых составах через при помощи инъекции в хвостовую вену. В разные точки времени после введения образцы сыворотки собирали путем ретроорбитального кровотечения. Сывороточные уровни белка фактора VII определяли в образцах с использованием хромогенного анализа (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH). Чтобы определить уровень фактора VII мРНК печени, животных скарифицировали и печень собирали и замораживали в жидком азоте. Лизаты ткани готовили из замороженных тканей и уровень фактора VII мРНК печени количественно определяли с использованием разветвленного ДНК-анализа (QuantiGene Assay, Panomics, CA).C57BL/6 mice (Charles River Labs, MA) are obtained either with saline or siRNA in desired formulations via tail vein injection. At various time points after administration, serum samples were collected by retroorbital bleeding. Serum levels of factor VII protein were determined in samples using a chromogenic assay (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH). To determine liver factor VII mRNA levels, animals were scarified and livers were harvested and frozen in liquid nitrogen. Tissue lysates were prepared from frozen tissues and liver factor VII mRNA levels were quantified using branched DNA analysis (QuantiGene Assay, Panomics, CA).

FVII активность оценивалась в FVII миРНК подопытных животных в течение 48 ч после внутривенного (болюсного) введения в C57BL/6 мышей. FVII измеряется с использованием коммерчески доступного набора для определения уровня белка в сыворотке или ткани, следуя инструкциям производителя микропланшет. FVII уменьшение определяется в отношении необработанных контрольных мышей, а результаты выражаются как % остаточного FVII. Два уровня доз (0,05 и 0,005 мг/кг FVII миРНК) используются для скрининга каждой новой липосомальной композиции.FVII activity was assessed in FVII siRNA of experimental animals within 48 hours after intravenous (bolus) administration in C57BL/6 mice. FVII is measured using a commercially available serum or tissue protein kit following the microplate manufacturer's instructions. FVII reduction is determined in relation to untreated control mice, and the results are expressed as % residual FVII. Two dose levels (0.05 and 0.005 mg/kg FVII siRNA) are used to screen each new liposomal formulation.

Пример 12. миРНК состав с использованием готовых везикул.Example 12 siRNA composition using prepared vesicles.

Катионный липид, содержащий частицы, производят с использованием способа предварительного пузырька. Катионный липид, DSPC, холестерин и PEG-липид растворяли в этаноле при молярном соотношении 40/10/40/10, соответственно. Липидную смесь добавляли в водный буфер (50 мМ цитрат, pH 4) при перемешивании до конечной концентрации этанола и липидов на 30% (об./об.) и 6,1 мг/мл соответственно, и оставляли для уравновешивания при комнатной температуре в течение 2 мин перед экструзией. Гидратированные липиды экструдировали через два стека с порами размером 80 нм фильтрами (Nuclepore) при 22°С, с использованием Lipex Extruder (Northern Lipids, Vancouver, BC), пока пузырек диаметром 70-90 нм, как определено анализом Nicomp, получается. Как правило, это требует 1-3 проходов. Для некоторых смесей катионных липидов, которые не образуют мелкие пузырьки, увлажнение липидной смеси буфером с более низким pH (50 мМ цитрат, pH 3) для протонирования фосфатной группы на DSPC головной группы помогает формировать стабильные пузырьки 70-90 нм.The cationic lipid containing particles is produced using the pre-bubble method. Cationic lipid, DSPC, cholesterol and PEG lipid were dissolved in ethanol at a molar ratio of 40/10/40/10, respectively. The lipid mixture was added to an aqueous buffer (50 mM citrate, pH 4) with stirring to a final concentration of ethanol and lipids of 30% (v/v) and 6.1 mg/ml, respectively, and left to equilibrate at room temperature for 2 min before extrusion. Hydrated lipids were extruded through two stacks of 80 nm filters (Nuclepore) at 22° C. using a Lipex Extruder (Northern Lipids, Vancouver, BC) until a 70-90 nm bubble, as determined by Nicomp analysis, was obtained. Typically, this requires 1-3 passes. For some cationic lipid mixtures that do not form fine vesicles, moistening the lipid mixture with a lower pH buffer (50 mM citrate, pH 3) to protonate the phosphate group on the head group DSPC helps form stable 70-90 nm vesicles.

МиРНК FVII (растворяют в 50 мМ цитрате, pH 4 водным раствором, содержащим 30% этанола) добавляли в пузырьки, предварительно уравновешенные до 35°С, при скорости ~5 мл/мин при перемешивании. После того, как конечная цель отношения миРНК/липид 0,06 (вес./вес.) достигается, смесь выдерживают в течение еще 30 мин при 35°C, чтобы пузырек образовался повторно и произошла инкапсуляция миРНК FVII. Этанол затем удаляли и внешний буфер заменили на PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na₂HPO, 1 мМ KH₂PO₄, pH 7,5), либо диализом или диафильтрацией тангенциального потока. Окончательное отношение инкапсулированной миРНК в липиде определяется после удаления разинкапсулированной миРНК с использованием гель-эксклюзионной колоночной или ионообменной колоночной хроматографии.FVII siRNA (dissolved in 50 mM citrate, pH 4 aqueous solution containing 30% ethanol) was added to vials pre-equilibrated to 35° C. at ~5 ml/min with stirring. After the end goal of a siRNA/lipid ratio of 0.06 (w/w) is reached, the mixture is held for another 30 minutes at 35° C. to allow the bubble to re-form and encapsulate the FVII siRNA. The ethanol was then removed and the external buffer was replaced with PBS (155 mM NaCl, 3 mM Na ₂ HPO, 1 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.5) either by dialysis or tangential flow diafiltration. The final ratio of encapsulated siRNA to lipid is determined after removal of the unencapsulated siRNA using gel size exclusion or ion exchange column chromatography.

- 94 039892- 94 039892

Пример 13. In Vivo определение эффективности липидных составов.Example 13 In Vivo Determination of the Efficacy of Lipid Formulations.

Тест составов первоначально оценивается по их FVII нокдауну на самках возрастом 7-9 недель, 15-25 г, самках мышей C57Bl/6 при 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг/кг с 3 мышами в группе лечения. Все исследования включают в себя животных, получавших либо фосфатный буферный раствор (PBS, контрольная группа), или эталонный состав. Препараты разводят до соответствующей концентрации в PBS непосредственно перед тестированием. Мышей взвешивали и соответствующие объемы дозирования рассчитывали (10 мкл/г веса тела). Испытания и тесты составов, а также PBS (по контролю за животными) вводили внутривенно через латеральную хвостовую вену. Животных анестезировали через 24 ч после внутрибрюшинного введения кетамина/ксилазина и 500-700 мкл крови собирали путем сердечной пункции в сывороточные разделительные пробирки (BD Microtainer). Кровь центрифугировали при 2000х g в течение 10 мин при 15°C и сыворотку собирали и хранили при температуре -70°C до анализа. Образцы сыворотки оттаивали при 37°C в течение 30 мин, разбавляли в PBS и аликвоты вносили в 96луночные планшеты для анализа. Уровень фактора VII оценивали с использованием хромогенного анализа (Biophen FVII kit, Hyphen BioMed) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, и поглощение измеряли в планшетном сканере, оснащенным фильтром с длиной волны 405 нм. Плазменные FVII уровни количественно определяли и ED₅₀s (доза в результате которой наблюдается 50% снижение в плазме уровня FVII по сравнению с контрольными животными) рассчитывали по стандартной кривой, полученной от совокупной выборки из сыворотки от контрольных животных. Эти представляющие интерес составы показывают высокие уровни нокдауна FVII (ED₅₀<<0,1 мг/кг) и проходят испытания в независимых исследованиях при более низких дозах, чтобы подтвердить эффективность и установить ED₅₀ уровень.The formulation test was initially assessed by their FVII knockdown in 7-9 week old female, 15-25 g female C57Bl/6 mice at 0.1, 0.3, 1.0 and 5.0 mg/kg with 3 mice per group treatment. All studies include animals treated with either phosphate buffered saline (PBS, control group) or a reference formulation. The preparations are diluted to the appropriate concentration in PBS just prior to testing. Mice were weighed and the corresponding dosing volumes were calculated (10 μl/g body weight). Trials and formulation tests as well as PBS (Animal Control) were administered intravenously via the lateral tail vein. Animals were anesthetized 24 hours after intraperitoneal administration of ketamine/xylazine and 500-700 μl of blood was collected by cardiac puncture into serum separation tubes (BD Microtainer). Blood was centrifuged at 2000xg for 10 min at 15°C and serum was collected and stored at -70°C until analysis. Serum samples were thawed at 37°C for 30 min, diluted in PBS and aliquoted into 96 well assay plates. Factor VII level was assessed using a chromogenic assay (Biophen FVII kit, Hyphen BioMed) according to the manufacturer's instructions, and absorbance was measured in a flatbed scanner equipped with a 405 nm filter. Plasma FVII levels were quantified and ED ₅₀ s (the dose resulting in a 50% reduction in plasma FVII levels compared to controls) was calculated from a standard curve derived from a pooled sample of serum from control animals. These formulations of interest show high levels of FVII knockdown (ED ₅₀ <<0.1 mg/kg) and are being tested in independent studies at lower doses to confirm efficacy and establish an ED ₅₀ level.

Пример 14. Исследования для определения липидного профиля и клиренса в тканях у мышей.Example 14 Lipid Profile and Tissue Clearance Studies in Mice.

Было проведено исследование для определения липидного профиля и тканевого клиренса у мышей для катионных липидов в соответствии с настоящим изобретением.A study was conducted to determine the lipid profile and tissue clearance in mice for cationic lipids in accordance with the present invention.

Самцы мышей (C57BL, 20-30 г) были разделены на четыре группы и им вводили (внутривенно) одно из соединений 1, 2 или 3 настоящего изобретения или референсный липид, как показано ниже в табл. 20.Male mice (C57BL, 20-30 g) were divided into four groups and injected (intravenously) with one of the compounds 1, 2 or 3 of the present invention or a reference lipid as shown in Table 1 below. 20.

Таблица 20Table 20

Мышей не кормили. Кровь, печень и селезенка были взяты на образцы (два образца в момент времени в группе) на 0,17, 8, 24, 72, 168, 336 и 672 часы после введения дозы.The mice were not fed. Blood, liver and spleen were sampled (two samples per group time) at 0.17, 8, 24, 72, 168, 336 and 672 hours post-dose.

На фиг. 1 показана концентрация липидов печени в течение долгого времени для мышей, в каж- 95 039892 дой из групп I-IV. Фармакокинетические данные печени представлены в табл. 21 ниже.In FIG. 1 shows the concentration of liver lipids over time for mice in each of groups I-IV. Pharmacokinetic data of the liver are presented in table. 21 below.

Таблица 21Table 21

Липид Lipid Стах (нг/мл) Stax (ng/ml) AUC (ч. нг/мл) AUC (h.ng/ml) MRTo-t (ч) MRTo-t (h) Референсный Липид Reference Lipid 22,400 22,400 6,954,787 6,954,787 221 221 Соединение 1 Compound 1 1,136 1.136 4,594 4,594 NC NC Соединение 2 Compound 2 118 118 436 436 NC NC Соединение 3 Compound 3 208 208 NC NC NC NC

MRT выступает за среднее время пребывания. NC означает не рассчитываемое.MRT stands for Mean Time of Stay. NC means not calculated.

Ожидаемый метаболический путь для соединений 1 и 3 показан на фиг. 2. Концентрацию этих метаболитов измеряли в печени. Результаты представлены в табл. 22 ниже. Все измерения, проводимые через 24 ч (в том числе полученные на 72, 168, 336 и 672 часы после введения), были ниже количественного уровня (BLQ).The expected metabolic pathway for compounds 1 and 3 is shown in FIG. 2. The concentration of these metabolites was measured in the liver. The results are presented in table. 22 below. All measurements taken after 24 hours (including those obtained at 72, 168, 336 and 672 hours after administration) were below the quantitative level (BLQ).

Таблица 22Table 22

Время (ч) Time (h) Соединение 1 Compound 1 Соединение 2 Compound 2 Соединение 3 Compound 3 Моно- Mono- Ди- Di- Моно - Mono - Ди- Di- Моно - Mono - Ди- Di- кислота acid кислота acid кислота acid кислота acid кислота acid кислота acid 0.17 0.17 126.00 126.00 125.50 125.50 10.62 10.62 14.75 14.75 20.15 20.15 23.95 23.95 8 eight 1.25 1.25 1.31 1.31 0.40 0.40 0.56 0.56 BLQ BLQ BLQ BLQ 24 24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ

На фиг. 3 показана концентрация липидов селезенки с течением времени для мышей в каждой из групп I-IV. Селезеночные фармакокинетические данные представлены в табл. 23 ниже. ____________________________________Таблица 23In FIG. 3 shows spleen lipid concentration over time for mice in each of groups I-IV. Splenic pharmacokinetic data are presented in table. 23 below. ____________________________________Table 23

Липид Lipid Стах (нг/мл) Stax (ng/ml) AUC (ч.нг/мл) AUC (h.ng/ml) MRTo-t (ч) MRTo-t (h) Референсный Липид Reference Lipid 9,152 9.152 3,426,038 3,426,038 229.7 229.7 Соединение 1 Compound 1 7,460 7,460 41,967 41.967 2.8 2.8 Соединение 2 Compound 2 13,640 13,640 238,044 238.044 11.1 11.1 Соединение 3 Compound 3 4368 4368 18,686 18.686 0.7 0.7

Концентрация метаболита соединений 1-3 в селезенке была измерена и результаты представлены в табл. 24 ниже.The concentration of the metabolite of compounds 1-3 in the spleen was measured and the results are presented in table. 24 below.

- 96 039892- 96 039892

дой из групп I-IV. Плазмовые фармакокинетические данные представлены в табл. 25 ниже.Doy from groups I-IV. Plasma pharmacokinetic data are presented in table. 25 below.

Таблица 25Table 25

Липид Lipid Стах (нг/мл) Stax (ng/ml) AUC (ч. нг/мл) AUC (h.ng/ml) MRTo-t (ч) MRTo-t (h) Референсный Липид Reference Lipid 2,110 2.110 63,775 63.775 201 201 Соединение 1 Compound 1 38,750 38,750 155,012 155.012 0.0006 0.0006 Соединение 2 Compound 2 28,800 28,800 115,612 115.612 0.0285 0.0285 Соединение 3 Compound 3 30,600 30,600 122,412 122.412 0.0008 0.0008

Концентрацию метаболита соединений 1-3 в плазме измерили, и результаты представлены в табл. 26 ниже. Все измерения через 24 ч (в том числе полученные на 72, 168, 336 и 672 часы после введения) были ниже количественного уровня (BLQ).The plasma concentration of the metabolite of compounds 1-3 was measured, and the results are presented in table. 26 below. All measurements after 24 hours (including those obtained at 72, 168, 336 and 672 hours after administration) were below the quantitative level (BLQ).

_______________________________________________________________________Таблица 26___________________________________________________________________________ Table 26

Время (ч) Time (h) Соединение 1 Compound 1 Соединение 2 Compound 2 Соединение 3 Compound 3 Моно- кислота Mono- acid Дикислота Diacid Моно кислота Mono acid Дикислота Diacid Монокислота Monoacid Дикислота Diacid 0.17 0.17 181.43 181.43 1186.40 1186.40 1355.56 1355.56 605.56 605.56 1037.63 1037.63 871.64 871.64 8 eight BLQ BLQ BLQ BLQ 2.66 2.66 3.53 3.53 BLQ BLQ 21.18 21.18 24 24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 2.45 2.45

Как видно из фиг. 1, 3, 4 и табл. 22, 24 и 26, соединения 1, 2 и 3 настоящей презентации изобретения демонстрируют значительное улучшение клиренса тканей и активности по сравнению с референсным липидом.As can be seen from FIG. 1, 3, 4 and tab. 22, 24 and 26, compounds 1, 2 and 3 of the present presentation of the invention demonstrate a significant improvement in tissue clearance and activity compared to the reference lipid.

Эти и другие изменения могут быть внесены в варианты воплощения в свете вышеизложенного подробного описания. В общем, в следующей формуле изобретения, используемые термины не должны рассматриваться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами воплощения, раскрытыми в описании и формуле изобретения, но должны быть истолкованы так, чтобы включить все возможные варианты воплощения вместе с полным объемом эквивалентов, в которых такая формула изобретения имеет право. Соответственно, формула изобретения не ограничивается данным раскрытием.These and other changes may be made to the embodiments in light of the foregoing detailed description. In general, in the following claims, the terms used are not to be construed as limiting the claims to the specific embodiments disclosed in the specification and claims, but are to be construed to include all possible embodiments, together with the full scope of equivalents in which such claims invention is entitled. Accordingly, the claims are not limited to this disclosure.

- 97 039892- 97 039892

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Соединение формулы IA-11. Compound of formula IA-1

или его соль, гдеor its salt, where

R¹ и R² каждый независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил, C₂-C₂₄-алкенил, C₂-C₂₄-алкинил, C₃-C₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил(C₁-C₂₄)алкил, C₅-C₈ моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; илиR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₂ -C ₂₄ alkenyl, C ₂ -C ₂₄ alkynyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl(C ₁ -C ₂₄ )alkyl, C ₅ -C ₈ monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C₅-C₈ гетероциклическое кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form a C ₅ -C ₈ heterocyclic ring containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized a nitrogen atom;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси, -NH2, C₁-C₂₄-алкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;in each occurrence R ³ and R ⁴ are independently H, OH, C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₁ -C ₂₄ alkoxy, -NH2, C ₁ -C ₂₄ alkylamino, or di(C ₁ -C ₂₄ ) alkylamino;

в каждом случае R⁵ представляет собой независимо H или C₁-C₂₄-алкил;in each case R ⁵ is independently H or C ₁ -C ₂₄ -alkyl;

a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6;

b равно 0, 1, 2 или 3;b is 0, 1, 2, or 3;

каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо представляет собой C₁₂-C₂₄-алкил, C₁₂-C₂₄-алкенил или C₁₂-C₂₄-алкокси, имеющий одну или более биоразлагаемую группу; каждая биоразлагаемая группа независимо прерывает C₁₂-C₂₄-алкил, C₁₂-C₂₄-алкенил или C₁₂-C₂₄-алкоксигруппу или представляет собой заместитель на конце C₁₂-C₂₄-алкила, C₁₂-C₂₄-алкенила или C₁₂-C₂₄-алкоксигруппы; причем (i) соединение не содержит следующий фрагмент:each of R ⁹ and R ¹⁰ is independently C ₁₂ -C ₂₄ alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ alkenyl, or C ₁₂ -C ₂₄ alkoxy having one or more biodegradable groups; each biodegradable group independently interrupts C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ -alkenyl or C ₁₂ -C ₂₄ -alkoxy group or is a substituent at the end of C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl, C ₁₂ -C ₂₄ -alkenyl or C ₁₂ -C ₂₄ alkoxy groups; where (i) the connection does not contain the following fragment:

где----является опциональной связью; и (ii) концы R⁹ и R¹⁰ отделены от третичного атома углерода, отмеченного звездочкой (*), цепочкой из 8 или более атомов, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)₂O-, -C(O)(CR³R4)C(O)O- или -OC(O)(CR³R4)C(O)-.where ---- is an optional link; and (ii) the ends of R ⁹ and R ¹⁰ are separated from the tertiary carbon atom, marked with an asterisk (*), by a chain of 8 or more atoms, and the biodegradable group is -OC(O)-, -C(O)O-, - SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -SS-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R ⁵ )=NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -C(S )(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -OSi(R ⁵ ) ₂ O-, -C(O)(CR ³ R4)C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R4)C(O)-.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что в каждом случае R³ и R⁴ представляют собой независимо H или C₁-C₄-алкил и R' представляет собой C₁-C₄-алкил.2. The compound according to claim 1, characterized in that in each case R ³ and R ⁴ are independently H or C ₁ -C ₄ alkyl and R' is C ₁ -C ₄ alkyl.

3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Q отсутствует или R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)_b-группа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.3. The compound according to claim 1, characterized in that Q is absent or R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R) _b -group is (CH3)2N-(CH2)3-C( O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- or (CH3)2N-(CH2) 3-C(CH3)=NO-.

4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу IB4. The compound according to claim 1, characterized in that it has the formula IB

- 98 039892- 98 039892

R¹ ^R1

(IB) где(IB) where

R¹ и R² каждый независимо представляет собой С₁-С₂₄-алкил, С₂-С24—алкенил, С₂-С₂₄-алкинил, С₃-С₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил(C₁-C₂₄)алкил или C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; илиR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₂ -C 24 alkenyl, C ₂ -C ₂₄ alkynyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl(C ₁ -C ₂₄ )alkyl or C5-C8 monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота;R ¹ and R ² together with the nitrogen atom to which they are attached form a C5-C8 monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom ;

в каждом случае R независимо представляет собой -(CR3R⁴)-;at each occurrence, R is independently -(CR3R ⁴ )-;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси, -NH₂, C₁-C₂₄-αлкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;in each occurrence, R ³ and R ⁴ are independently H, OH, C ₁ -C ₂₄ -alkyl, C ₁ -C ₂₄ -alkoxy, -NH ₂ , C ₁ -C ₂₄ -αkylamino or di(C ₁ -C ₂₄ )alkylamino;

Q отсутствует или представляет собой -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R⁴)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R⁵)-, -N(R5)C(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- или -C(R⁵)=N-O-C(O)-;Q is absent or is -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R ⁴ )-, -N(R5)C (O)-, -SS-, -OC(O)O-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(R5)=NO-, -OC(O)N(R ⁵ )-, -N (R5)C(O)N(R ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- or -C(R ⁵ )= NOC(O)-;

в каждом случае R⁵ представляет собой, независимо, H или C₁-C₂₄-алкил;in each case, R ⁵ represents, independently, H or C ₁ -C ₂₄ -alkyl;

a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6;

b равно 0, 1, 2 или 3;b is 0, 1, 2, or 3;

M¹ и M² каждый независимо представляет собой биоразлагаемую группу;M ¹ and M ² are each independently a biodegradable group;

каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо представляет собой C1-C24-αлкилен или C2-C24-алкенилен, и каждый из R¹¹ и R¹² независимо представляет собой C1-C₂₄-алкил или C₂-C₂₄-алкенил, возможно заканчивающийся COOR¹³, где каждый R¹³ независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил;each of R ⁹ and R ¹⁰ is independently C1-C24- _αkylene or C2-C24-alkenylene, and each _of R ¹¹ and R ¹² is independently C1-C24 alkyl or C2- _C24 alkenyl, optionally ending COOR ¹³ where each R ¹³ independently represents C ₁ -C ₂₄ -alkyl;

при условии, что:provided that:

R⁹, M¹ и R¹¹ вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину; иR ⁹ , M ¹ and R ¹¹ together have at least 8 carbon atoms in length; and

R¹⁰, M² и R¹² вместе имеют по меньшей мере 8 атомов углерода в длину, причем биоразлагаемая группа представляет собой -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)(NR⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)2O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O- или -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-.R ¹⁰ , M ² and R ¹² together have at least 8 carbon atoms in length, and the biodegradable group is -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O )S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -SS-, -C(R ⁵ )=N-, -N=C(R ⁵ )-, -C(R ⁵ )= NO-, -ON=C(R ⁵ )-, -C(O)(NR ⁵ )-, -N(R ⁵ )C(O)-, -C(S)(NR ⁵ )-, -N( R ⁵ )C(O)-, -N(R ⁵ )C(O)N(R ⁵ )-, -OC(O)O-, -OSi(R ⁵ )2O-, -C(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)O- or -OC(O)(CR ³ R ⁴ )C(O)-.

5. Соединение по п.4, отличающееся тем, что R⁹ и R¹⁰ независимо друг от друга представляют собой C4-C12-алкилен или C4-C12-алкенuлен, M¹ и M² представляют собой -C(O)O-, и R¹¹ и R¹² представляют собой C4-C₁₂-алкилен или C₄-C₁₂-алкенилен.5. The compound according to claim 4, characterized in that R ⁹ and R ¹⁰ independently of each other represent C4-C12-alkylene or C4-C12-alkenulene, M ¹ and M ² represent -C(O)O-, and R ¹¹ and R ¹² are C4-C ₁₂ alkylene or C ₄ -C ₁₂ alkenylene.

6. Соединение по п.4 или 5, отличающееся тем, что R⁹, M¹ и R¹¹ вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.6. A compound according to claim 4 or 5, characterized in that R ⁹ , M ¹ and R ¹¹ together are from 12 to 24 carbon atoms in length.

7. Соединение по п.4 или 5, отличающееся тем, R¹⁰, M² и R¹² вместе составляют от 12 до 24 атомов углерода в длину.7. A compound according to claim 4 or 5, characterized in that R ¹⁰ , M ² and R ¹² together are from 12 to 24 carbon atoms in length.

8. Соединение по любому из пп.4-7, отличающееся тем, что группа R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)_b- представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.8. The compound according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the group R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R) _b - is (CH3)2N-(CH2)3-C (O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- or (CH3)2N-(CH2 )3-C(CH3)=NO-.

9. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу IC9. The compound according to claim 1, characterized in that it has the formula IC

R¹ ^R1

в которойwherein

R¹ и R² каждый независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил, C₂-C₂₄-алкенил, C₂-C₂₄-алкинил, C₃-C₁₀-циклоалкил, C₃-C₁₀-циклоалкил(C₁-C₂₄)алкил, или C5-C8 моноциклический гетероцикл, содержащий от 1 до 3 гетероатомов, при этом гетероатомы независимо выбраны из атома кислорода, возможно окисленного атома серы и возможно окисленного или возможно кватернированного атома азота; илиR ¹ and R ² are each independently C ₁ -C ₂₄ alkyl, C ₂ -C ₂₄ alkenyl, C ₂ -C ₂₄ alkynyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl(C ₁ -C ₂₄ )alkyl, or C5-C8 monocyclic heterocycle containing from 1 to 3 heteroatoms, the heteroatoms being independently selected from an oxygen atom, an optionally oxidized sulfur atom, and an optionally oxidized or optionally quaternized nitrogen atom; or

- 99 039892 в каждом случае R независимо представляет собой -(CR³R⁴)-;- 99 039892 in each case R is independently -(CR ³ R ⁴ )-;

в каждом случае R³ и R⁴ независимо представляют собой H, OH, C₁-C₂₄-алкил, C₁-C₂₄-алкокси,in each case, R ³ and R ⁴ independently represent H, OH, C ₁ -C ₂₄ -alkyl, C ₁ -C ₂₄ -alkoxy,

-NH₂, C₁-C₂₄-алкиламино или ди(C₁-C₂₄)алкиламино;-NH ₂ , C ₁ -C ₂₄ -alkylamino or di(C ₁ -C ₂₄ )alkylamino;

или R³ и R⁴ вместе с атомом углерода, к которому они непосредственно присоединены, образуютor R ³ and R ⁴ together with the carbon atom to which they are directly attached form

C₃-C₁₀-циклоалкильную группу;C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl group;

a равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;a is 1, 2, 3, 4, 5, or 6;

b равно 0, 1, 2 или 3;b is 0, 1, 2, or 3;

R' отсутствует или представляет собой водород или C₁-C₂₄-αлкил;R' is absent or is hydrogen or C ₁ -C ₂₄ -αkyl;

каждый из R⁹ и R¹⁰ независимо друг от друга представляют собой C₁₂-C₂₄-алкил или C₂-C₂₄-αлкенил, замещенный на его конце биоразлагаемой группой, причем биоразлагаемая группа представляет собой COOR¹³, где каждый R¹³ независимо представляет собой C₁-C₂₄-алкил.each of R ⁹ and R ¹⁰ is independently C ₁₂ -C ₂₄ -alkyl or C ₂ -C ₂₄ -alkenyl substituted at its end with a biodegradable group, the biodegradable group being COOR ¹³ , where each R ¹³ is independently is C ₁ -C ₂₄ -alkyl.

10. Соединение по 9, отличающееся тем, что R'R¹R²N-(R)_a-Q-(R)_b-группа представляет собой (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- или (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-.10. The compound according to 9, characterized in that R'R ¹ R ² N-(R) _a -Q-(R) _b -group is (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- or (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3 )=NO-.

11. Соединение по п.1, выбранное из соединений формул II-VII:11. The compound according to claim 1, selected from the compounds of formulas II-VII:

и их соли, причем m, n, o и p, каждый в отдельности, равен 1-25, при условии, что в формулах (II), (IV), (VI) и (VII) m и p больше или равны 4.and their salts, and m, n, o and p, each separately, is equal to 1-25, provided that in formulas (II), (IV), (VI) and (VII) m and p is greater than or equal to 4 .

12. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что соединение представлено в форме фармацевтически приемлемой соли.12. A compound according to any of the preceding claims, characterized in that the compound is in the form of a pharmaceutically acceptable salt.

13. Липидная частица для доставки активных агентов, содержащая нейтральный липид, липид, способный снизить агрегацию, и катионный липид по любому из предыдущих пунктов.13. A lipid particle for delivering active agents, comprising a neutral lipid, a lipid capable of reducing aggregation, and a cationic lipid according to any one of the preceding claims.

14. Липидная частица по п.13, отличающаяся тем, что нейтральный липид выбран из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1-пальмитоил-2олеоил-sn-фосфатидилхолина (POPC), 1,2-диолеоил-8и-3-фосфоэтаноламина (DOPE) или сфингомиелина (SM); липид, способный уменьшить агрегацию, является PEG-липидом, и липидная частица дополнительно содержит стерол.14. Lipid particle according to claim 13, characterized in that the neutral lipid is selected from distearoylphosphatidylcholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-phosphatidylcholine (POPC ), 1,2-dioleoyl-8u-3-phosphoethanolamine (DOPE) or sphingomyelin (SM); the lipid capable of reducing aggregation is a PEG lipid, and the lipid particle further contains a sterol.

15. Липидная частица по п.14, отличающаяся тем, что катионный липид присутствует в количестве от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%; нейтральный липид присутствует в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.%; стерол присутствует в количестве от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%; и PEG-липид представляет собой PEG-DMA, PEG-DMG, или их сочетание, и присутствует в количестве от примерно 0,5 мол.% до примерно 15 мол.%.15. The lipid particle according to claim 14, characterized in that the cationic lipid is present in an amount of from about 20 mol.% to about 60 mol.%; neutral lipid is present in an amount of from about 5 mol.% to about 25 mol.%; the sterol is present in an amount of from about 25 mol.% to about 55 mol.%; and the PEG lipid is PEG-DMA, PEG-DMG, or a combination thereof, and is present in an amount of from about 0.5 mol% to about 15 mol%.

16. Липидная частица по любому из пп.13-15, дополнительно содержащая активный агент.16. Lipid particle according to any one of claims 13-15, additionally containing an active agent.

17. Липидная частица по п.16, отличающаяся тем, что активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из плазмиды, иммуностимулирующих олигонуклеотидов, миРНК, антисмыслового олигонуклеотида, микроРНК, антагомира, аптамера и рибозима.17. A lipid particle according to claim 16, wherein the active agent is a nucleic acid selected from a plasmid, immunostimulatory oligonucleotides, miRNA, antisense oligonucleotide, miRNA, antagonist, aptamer, and ribozyme.

18. Липидная частица по любому из пп.13-15, отличающаяся тем, что липидная частица in vivo имеет период полураспада (t_1/2) менее чем 3 ч.18. A lipid particle according to any one of claims 13 to 15, characterized in that the lipid particle in vivo has a half-life (t _1/2 ) of less than 3 hours.

- 100 039892- 100 039892

19. Липидная частица по любому из пп.13-15, отличающаяся тем, что липидная частица in vivo имеет период полураспада (t_1/2), который составляет менее 10%, чем для липидной частицы, содержащей тот же катионный липид без биоразлагаемой группы.19. A lipid particle according to any one of claims 13 to 15, characterized in that the lipid particle in vivo has a half-life (t _1/2 ) that is less than 10% than for a lipid particle containing the same cationic lipid without a biodegradable group .

20. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте или индукции иммунного ответа у субъекта, содержащая липидную частицу по любому из пп.16 или 17 и фармацевтически приемлемый носитель.20. A pharmaceutical composition for treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject or induction of an immune response in a subject, comprising a lipid particle according to any one of claims 16 or 17 and a pharmaceutically acceptable carrier.

21. Способ модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающий предоставление в клетку липидной частицы по любому из пп.16 или 17.21. A method for modulating expression of a target gene in a cell, comprising providing a lipid particle according to any one of claims 16 or 17 to the cell.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из: Factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, Cyclin А ген, Cyclin E ген, WNT-1 ген, beta-катенин ген, c-MET ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP1 ген, топоизомеразы I ген, топоизомеразы II alpha ген, p73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, p27(KIP1) ген, PPM1D ген, RAS ген, кавеолин I ген, MIB I ген, MTAI ген, M68 ген, опухолевый супрессорный ген и p53 опухолевый супрессорный ген.22. The method according to claim 21, characterized in that the target gene is selected from the group consisting of: Factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta gene, Erb-B gene, Src gene , CRK gene, GRB2 gene, RAS gene, MEKK gene, JNK gene, RAF gene, Erk1/2 gene, PCNA(p21) gene, MYB gene, JUN gene, FOS gene, BCL-2 gene, Cyclin D gene, VEGF gene , EGFR gene, Cyclin A gene, Cyclin E gene, WNT-1 gene, beta-catenin gene, c-MET gene, PKC gene, NFKB gene, STAT3 gene, survivin gene, Her2/Neu gene, SORT1 gene, XBP1 gene, topoisomerase I gene, topoisomerase II alpha gene, p73 gene, p21(WAF1/CIP1) gene, p27(KIP1) gene, PPM1D gene, RAS gene, caveolin I gene, MIB I gene, MTAI gene, M68 gene, tumor suppressor gene and p53 tumor suppressor gene.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что ген-мишень содержит одну или несколько мутаций.23. The method according to claim 22, characterized in that the target gene contains one or more mutations.

24. Способ лечения заболевания или расстройства, для которого характерна избыточная экспрессия полипептида в субъекте, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, микроРНК и антисмыслового олигонуклеотида, и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид включает в себя полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид или комплементарен ему.24. A method of treating a disease or disorder characterized by overexpression of a polypeptide in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the active agent is a nucleic acid selected from the group consisting of siRNA, microRNA, and an antisense oligonucleotide, and in wherein the siRNA, microRNA or antisense oligonucleotide comprises a polynucleotide that specifically binds to a polynucleotide that encodes or is complementary to said polypeptide.

25. Способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенной экспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активное вещество представляет собой плазмиду, которая кодирует указанный полипептид или функциональный вариант или его фрагмент.25. A method of treating a disease or disorder characterized by increased expression of a polypeptide in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the active substance is a plasmid that encodes said polypeptide or functional variant or fragment thereof.

26. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.20, причем активный агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом.26. A method of inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the active agent is an immunostimulatory oligonucleotide.

27. Способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку или ткань субъекта, включающий введение субъекту нуклеиновой липидной частицы, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и катионный липид по любому из пп.1-12.27. A method for delivering a nucleic acid molecule to a cell or tissue of a subject, comprising administering to the subject a nucleic acid particle containing a nucleic acid molecule and a cationic lipid according to any one of claims 1-12.