EA034639B1 - Вакцины против вируса гриппа и их применения - Google Patents
Вакцины против вируса гриппа и их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA034639B1 EA034639B1 EA201592306A EA201592306A EA034639B1 EA 034639 B1 EA034639 B1 EA 034639B1 EA 201592306 A EA201592306 A EA 201592306A EA 201592306 A EA201592306 A EA 201592306A EA 034639 B1 EA034639 B1 EA 034639B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- polypeptides
- polypeptide
- influenza virus
- Prior art date
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims description 135
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 343
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 329
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 328
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims abstract description 182
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 157
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 48
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 51
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- CLYSZQBIUYRLNX-UHFFFAOYSA-N Botryodiplodin Chemical compound CC1C(O)OCC1C(C)=O CLYSZQBIUYRLNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 164
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 164
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 75
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 73
- 102100035824 Unconventional myosin-Ig Human genes 0.000 description 55
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 28
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 20
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 17
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 10
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 10
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 9
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 4
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 4
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 His Chemical compound 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 108010061514 sialic acid receptor Proteins 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182820 D-proline Natural products 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000702620 H-1 parvovirus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100028758 Influenza A virus (strain A/Swine/Wisconsin/1/1967 H1N1) PB1-F2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N N-(1-aminoethenyl)-1-[4-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[hydroxy-[[3-[hydroxy-[[3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-[[[2-[[[2-[[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-2-[[[5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-2-[[hydroxy-[2-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-2-yl]-5-methylimidazole-4-carboxamide Chemical compound CC1=C(C(=O)NC(N)=C)N=CN1C1OC(COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)C(OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O)C1 GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 101150103639 PB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930184655 PT Toxin Natural products 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124641 pain reliever Drugs 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к полипептидам стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, содержащим: (a) домен HA1 гемагглютинина гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, содержащий аминокислоты от положения 1 по положение x, предпочтительно от положения p по положение x домена HA1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных остатков с C-концевым стеблевым сегментом HA1, содержащим аминокислоты от положения y до C-концевой аминокислоты, включительно, из домена HA1, и (b) домен HA2 гемагглютинина гриппа, где полипептид стеблевого домена гемагглютинина гриппа устойчив к расщеплению протеазой на стыке между HA1 и HA2 и где одна или несколько аминокислот из аминокислот в положениях 337, 340, 352, 353, 402, 406, 409, 413 и/или 416 были мутированы по сравнению с соответствующими положениями в HA вируса гриппа дикого типа.
Description
Изобретение относится к области медицины. Изобретение относится к полипептидам стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, способам получения полипептидов стеблевого домена гемагглютинина, содержащим их композициям, содержащим их вакцинам и способам их применения, в частности для детекции, профилактики и/или лечения гриппа.
Предпосылки
Вирусы гриппа являются основными патогенами человека, вызывая респираторное заболевание (обычно называемое грипп), которое колеблется по тяжести от субклинической инфекции до первичной вирусной пневмонии, которая может привести к смерти. Клинические эффекты инфекции варьируют в зависимости от вирулентности штамма гриппа и внешнего воздействия, истории болезни, возраста и иммунного статуса хозяина. По оценкам, ежегодно приблизительно 1 млрд человек во всем мире подвергается инфицированию вирусом гриппа, что вызывает тяжелое заболевание в 3-5 миллионах случаев и ориентировочно от 300000 до 500000 смертей, связанных с гриппом. Большую часть этих инфекций можно отнести к вирусам гриппа А, несущим подтипы гемагглютинина H1 или H3, с меньшим вкладом вирусов гриппа В и, следовательно, представителей всех трех включают в сезонную вакцину. Современная практика иммунизации основана на ранней идентификации циркулирующих вирусов гриппа, чтобы обеспечить своевременное получение эффективной сезонной противогриппозной вакцины. Помимо неизбежных трудностей в прогнозировании штаммов, которые будут преобладать во время следующего сезона, в неспособности современных вакцин предупредить заболеваемость и смертность также играют роль противовирусная устойчивость и ускользание от иммунного ответа. В дополнение к этому возможность пандемии, вызванной высоковирулентным вирусным штаммом, происходящим от животныхносителей и рекомбинированным с увеличением распространения от человека к человеку, представляет собой значительную и реальную угрозу для глобального здравоохранения.
Вирусы гриппа А широко распространены в природе и могут инфицировать множество птиц и млекопитающих. Вирусы гриппа представляют собой оболочечные РНК-вирусы, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Их геномы состоят из восьми одноцепочечных РНК-сегментов, которые кодируют 11 различных белков, один нуклеопротеин (NP), три полимеразных белка (PA, PB1 и РВ2), два матричных белка (M1 и М2), три неструктурных белка (NS1, NS2 и PB1-F2) и два внешних гликопротеина: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA). Вирусы классифицируют на основании различий в антигенной структуре белков НА и NA с их различными комбинациями, представляющими уникальные подтипы вируса, которые дополнительно классифицируют на конкретные штаммы вируса гриппа. Хотя все известные подтипы можно обнаружить у птиц, циркулирующими в настоящее время подтипами человеческого гриппа А являются H1N1 и H3N2. Филогенетический анализ продемонстрировал подразделение гемагглютининов на две основные группы: inter alia подтипы H1, Н2, Н5 и Н9 в филогенетической группе 1 и inter alia подтипы H3, Н4 и Н7 в филогенетической группе 2.
Штаммы вируса гриппа типа В являются исключительно человеческими. Антигенная изменчивость НА в штаммах вируса гриппа типа В меньше, чем наблюдаемая в штаммах типа А. Две генетически и антигенно различные линии вируса гриппа В, циркулирующие у людей, представлены линиями B/Yamagata/16/88 (также называемая B/Yamagata) и B/Victoria/2/87 (B/Victoria) (Ferguson et al., 2003). Хотя спектр заболеваний, вызываемых вирусами гриппа В, как правило, представлен более легкими формами, чем заболевания, вызываемые вирусами гриппа А, все же часто при инфицировании гриппом В наблюдается тяжелая болезнь, требующая госпитализации.
Известно, что антитела, которые нейтрализуют вирус гриппа, в первую очередь направлены к гемагглютинину (НА). Гемагглютинин или НА представляет собой трехмерный гликопротеин, который прикреплен к вирусной оболочке и имеет двойную функцию: он отвечает за связывание с сиаловой кислотой рецептора на клеточной поверхности, а после поглощения он опосредует слияние вирусной и эндосомальной мембраны, что приводит к высвобождению вирусной РНК в цитозоль клетки. НА содержит крупный головной домен и меньший стеблевой домен. Прикрепление к вирусной мембране опосредуется С-концевой якорной последовательностью, соединенной со стеблевым доменом. Белок посттрансляционно расщепляется в определенной петле с получением двух полипептидов, HA1 и HA2 (полную последовательность называют НА0). Дистальный мембранный головной участок в основном образован из HA1, а проксимальный мембранный стеблевой участок прежде всего из HA2 (фиг. 1).
Причиной, по которой сезонная противогриппозная вакцина должна обновляться каждый год, является значительная изменчивость вируса. В молекуле гемагглютинина эта изменчивость особенно проявляется в головном домене, где антигенный дрейф и сдвиг привели к большому количеству различных вариантов. Поскольку он также представляет собой область, которая является иммунодоминантной, большинство нейтрализующих антител направлены против данного домена и действуют путем препятствования связыванию с рецептором. Сочетанием иммунодоминантности и значительной изменчивости головного домена также объясняется то, что инфицирование определенным штаммом не вызывает иммунитет к другим штаммам: антитела, выработанные в результате первого инфицирования, распознают ограниченное число штаммов, близкородственных вирусу первичной инфекции.
В последнее время полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, не имеющие всего или фактически всего головного глобулярного домена гемагглютинина вируса гриппа, были опи
- 1 034639 саны и использованы для генерирования иммунного ответа на один или несколько консервативных эпитопов полипептида стеблевого домена. Считается, что эпитопы полипептида стеблевого домена являются менее иммуногенными, чем высокоиммуногенные участки глобулярного головного домена, таким образом, отсутствие глобулярного головного домена в полипептиде стеблевого домена может позволить развить иммунный ответ против одного или нескольких эпитопов полипептида стеблевого домена (Steel et al., 2010). Steel et al., таким образом, создали новую молекулу путем удаления аминокислотного остатка с 53 по 276 в HA1 штаммов A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) и A/Hong Kong/1968 (H3N2) из первичной последовательности НА, и замещением их короткой гибкой сшивающей последовательностью GGGG. Вакцинация мышей конструкцией H3 HK68 не вызвала выработку антисывороток, которые бы перекрестно реагировали с НА группы 1. Кроме того, как показано в РСТ/ЕР2012/073706, полипептиды стеблевого домена были очень нестабильными и не принимали правильную конформацию, что доказано отсутствием связывания антител, которые, как было показано, связываются с консервативными эпитопами в стеблевом участке.
Кроме того, Bommakanti et al. (2010) описали полипептид на основе HA2, содержащий аминокислотные остатки 1-172 из HA2, 7-аминокислотный линкер (GSAGSAG), аминокислотные остатки 7-46 из HA1, 6-аминокислотный линкер GSAGSA с последующими остатками 290-321 из HA1, с мутациями V297T, I300E, Y302T и С305Т в НА1. Конструкция была основана на последовательности НА H3 (A/Hong Kong/1968). Полипептид обеспечивал перекрестную защиту только против другого штамма вируса гриппа в пределах подтипа H3 (A/Phil/2/82), но не против подтипа H1 (A/PR/8/34). В более ранней статье Bommakanti et al. (2012) описана последовательность стеблевого домена на основе НА из H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (H1HA0HA6). В этом полипептиде были удалены эквиваленты остатков с 55 по 302 и выполнены мутации I311T, V314T, I316N, C319S, F406D, F409T и L416D. Полипептиды на основе как H3, так и НА, экспрессировали в ЕхцН и, следовательно, в них отсутствовали гликаны, которые являются частью природных белков НА. При экспрессии в Е.той полипептид извлекают в основном в виде высокомолекулярных агрегатов и незначительной мономерной фракции. Полипептид связывает CR6261 с двумя выраженными константами диссоциации 9 и 0,2 мкМ. Авторы показали, что мыши могут выжить при контрольном заражении в дозе 1 LD90 гомологичным вирусом H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 после иммунизации (дважды с интервалом 4 недели) с 20 мкг белка, усиленного 100 мкг CpG7909. Авторы также описывают полипептиды с круговой перестановкой, сравнимые с описанными выше для полипептидов, полученных из A/Hong Kong/1/1968. Эти полипептиды получены из НА из H1N1 A/Puerto Rico/8/1934, H1N1 A/North Carolina/20/99 или H1N1 A/California/07/2009 и могут обеспечивать частичную защиту на модели умеренного контрольного заражения (1LD90) мышей с H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (т.е. в пределах одного и того же подтипа). Сыворотки крови морских свинок, иммунизированных этими полипептидами, не продемонстрировали обнаруживаемых уровней нейтрализации при испытании в пробе на нейтрализацию.
Таким образом, все еще существует потребность в безопасной и эффективной универсальной вакцине, которая стимулирует выработку надежного ответа нейтрализующих антител широкого спектра и предлагает надежную защиту против широкого набора циркулирующих и будущих штаммов вируса гриппа (как сезонного, так и пандемического), в частности, обеспечивая защиту против одного или нескольких подтипов вируса гриппа А в пределах филогенетической группы 1 и/или группы 2 для эффективной профилактики и терапии гриппа.
Краткое описание
Изобретение относится к полипептидам стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, способам получения полипептидов стеблевого домена, содержащим их композициям, содержащим их вакцинам и способам их применения.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к новым иммуногенным полипептидам, содержащим стеблевой домен гемагглютинина вируса гриппа и не имеющим глобулярной головки, названным полипептидами стеблевого домена гемагглютинина (НА) гриппа. Полипептиды способны индуцировать иммунный ответ при введении пациенту, в частности пациенту-человеку. Полипептиды по настоящему изобретению представляют консервативные эпитопы проксимального мембранного стеблевого домена молекулы НА иммунной системе в отсутствие доминантных эпитопов, которые представлены в дистальном мембранном головном домене. С этой целью часть первичной последовательности белка НА0, составляющую головной домен, удаляют и оставшуюся аминокислотную последовательность заново соединяют, либо непосредственно, либо, в некоторых вариантах осуществления, посредством введения короткой гибкой сшивающей последовательности (линкера) с восстановлением непрерывности аминокислотной цепи. Полученную последовательность дополнительно модифицируют путем введения специфических мутаций, которые стабилизируют нативную 3-мерную структуру оставшейся части молекулы НА0. Иммуногенные полипептиды не содержат полноразмерный HA1 и/или HA2 вируса гриппа.
Согласно настоящему изобретению полипептиды основаны на НА вирусов гриппа А подтипа H1.
Настоящее изобретение относится к полипептидам стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, содержащим (а) домен HA1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных
- 2 034639 остатков с С-концевым стеблевым сегментом HA1, и (b) домен HA2 гемагглютинина вируса гриппа, где полипептиды стеблевого домена гемагглютинина устойчивы к расщеплению протеазой на стыке между HA1 и HA2, и где одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности, соединяющей А-спираль и спираль CD в HA2, были мутированы по сравнению с доменом HA2 гриппа дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат одну или несколько мутаций в положении 337, 340, 352 или 353 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентных положениях в других вирусах гриппа подтипа H1. Мутация означает, что аминокислота в конкретном положении была заменена другой аминокислотой, которая не представлена в соответствующем положении в НА гриппа дикого типа, т.е. НА вируса гриппа, на котором основан стеблевой полипептид.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению дополнительно содержат одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности HA2, соединяющей Сконцевой остаток спирали А с N-концевым остатком спирали CD, как показано на фиг. 1.
В некоторых вариантах осуществления N-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит 1-х аминокислоты HA1 и С-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит y-конец аминокислоты (т.е. С-концевую аминокислоту НА1) НА1. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления делеция в сегменте HA1 включает аминокислотную последовательность от аминокислоты в положении x+1 вплоть до аминокислоты в положении y-1. В некоторых вариантах осуществления полипептиды не содержат сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления N-концевой сегмент HA1 содержит, таким образом, аминокислоту р-х HA1, где p представляет собой первую аминокислоту зрелой молекулы НА (например, р=18 в случае SEQ ID NO: 1). Специалист в данной области сможет подготовить полипептиды, описанные в настоящем документе, без сигнальных пептидов (например, аминокислот 1-17 SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат внутриклеточные последовательности НА и трансмембранный домен. В других вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению не содержат внутриклеточные последовательности НА и трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная и трансмембранная последовательность, например аминокислотная последовательность от положения (или эквивалентного ему) 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 домена HA2 до С-конца домена HA2 была удалена.
Полипептиды по настоящему изобретению не содержат полноразмерный НА1.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды гликозилированы.
В некоторых вариантах осуществления иммуногенные полипептиды являются существенно меньшими, чем НА0, предпочтительно в них отсутствует вся или фактически вся глобулярная головка НА. Предпочтительно, иммуногенные полипептиды составляют не более чем 360, предпочтительно не более чем 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 или 270 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные полипептиды составляют от приблизительно 250 до приблизительно 350, предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 340, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330 аминокислот в длину.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды дополнительно содержат одну или несколько дополнительных мутаций в домене HA1 и/или HA2 по сравнению с аминокислотной последовательностью НА, на которой основаны домены HA1 и НА2.
Полипептиды по настоящему изобретению содержат консервативные эпитопы стеблевого домена группы 1 перекрестно-нейтрализующего антитела CR6261 (описанного в WO 2008/028946) и/или антитела CR9114 (описанного в WO 2013/007770), антитела, способного к связыванию и нейтрализации одновременно вирусов гриппа А группы 1 и 2, а также вирусов гриппа В. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении полипептидов стеблевого домена НА, где указанные полипептиды стабильно представляют эпитопы антитела CR6261 и/или CR9114, как показано посредством связывания указанного антитела или антител с указанными полипептидами. В одном варианте осуществления полипептиды не связываются с CR8020 и CR8057 (описанными в WO 2010/130636), которые являются моноклональными антителами, связывающимися только с вирусами гриппа H3. Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, которые предусмотрены в настоящем документе, приемлемы для применения в иммуногенных композициях (например, вакцинах), способных генерировать иммунные ответы против множества вирусов гриппа штаммов А и/или В. В одном варианте осуществления полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа способны генерировать иммунные ответы против штаммов вируса гриппа А филогенетической группы 1 и/или группы 2, в частности против штаммов вируса гриппа как филогенетической группы 1, так и группы 2. В одном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ против гомологичных штаммов вируса гриппа. В одном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ против гетерологичных штаммов вируса гриппа одного и того же и/или разных подтипов. В дополнительном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ в отношении штаммов вируса гриппа как филогенетической группы 1, так и группы 2, и штаммов вируса гриппа В.
- 3 034639
Полипептиды согласно настоящему изобретению можно использовать, например, в самостоятельной терапии, и/или профилактике, и/или диагностике заболевания или состояния, вызванного вирусом гриппа, в частности, вирусом гриппа А филогенетической группы 1 или 2 и/или вирусом гриппа В, или в сочетании с другими профилактическими и/или терапевтическими методами лечения, такими как (существующие или будущие) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.
В дополнительном аспекте изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды стеблевого домена НА вируса гриппа. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногенные полипептиды.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа у пациента, включающим введение пациенту полипептида и/или молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим полипептид и/или молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Иммуногенные композиции по изобретению могут находиться в любой форме, которая позволяет вводить композиции пациенту, например мышам, хорькам или людям. В конкретном варианте осуществления иммуногенные композиции приемлемы для введения человеку. Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот и композиции можно использовать в способах профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа и/или для диагностических целей. Композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, содержат или вводятся в комбинации с адъювантом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям для применения в качестве вакцины. Настоящее изобретение, в частности, относится к иммуногенным полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям для применения в качестве вакцины для профилактики и/или лечения заболевания или состояния, вызванного вирусом гриппа подтипа А филогенетической группы 1 и/или 2 и/или вирусом гриппа В.
Различные варианты осуществления и применения полипептидов согласно настоящему изобретению станут очевидными из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - показана модель мономера HA в состоянии перед слиянием, как представлено в нативном тримере. HA1 показан светло-серым, HA2 показан темно-серым. Спираль А (важная часть эпитопа CR6261) и спираль CD (часть поверхности тримера) указаны, как и петля, соединяющая эти элементы вторичной структуры. С-конец HA1 и N-конец HA2 также указаны. Гибридный пептид расположен на Nконце НА2;
фиг. 2 - связывание растворимых полипептидов по настоящему изобретению с моноклональными антителами CR6261 и CR9114 с использованием интерферометрии биослоя. Верхние панели показывают индивидуальные кривые связывания для иммобилизованных моноклональных антител под воздействием различных концентраций растворимых полипептидов по настоящему изобретению, нижние панели показывают анализ в равновесном состоянии, используемый для оценки Kd. A: s127H1 SEQ ID NO: 66. В: s86B4 SEQ ID NO: 67. С: s74H9 SEQ ID NO: 65. D: s6E12 SEQ ID NO: 69. E: s55G7 SEQ ID NO: 68;
фиг. 3 - эксклюзионные хроматограммы растворимых полипептидов по настоящему изобретению при отсутствии и в присутствии Fab-фрагментов CR8020, CR6261 и CR9114. Для всех растворимых полипептидов по настоящему изобретению наблюдали образование комплекса с Fab-фрагментами CR6261 и CR9114, но не с Fab-фрагментами CR8020. A: s127H1 SEQ ID NO: 66. В: s86B4 SEQ ID NO: 67. C: s74H9 SEQ ID NO: 65. D: s6E12 SEQ ID NO: 69. E: s55G7 SEQ ID NO: 68;
фиг. 4 - оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению s74H9 SEQ ID NO: 65 и s86B4 SEQ ID NO: 67 на модели летального контрольного заражения гриппом H1N1 A/NL/602/09. А: Верхний ряд: Выживаемость, среднее изменение массы тела и среднее значение клинического показателя для групп отрицательного (PBS) и положительного (CR6261) контроля. Нижний ряд: Выживаемость, среднее изменение массы тела и среднее значение клинического показателя для экспериментальных групп, иммунизированных s74H9 или s86B4. Для сравнения также показана группа отрицательного контроля PBS. В: Иммуногенность s74H9 (SEQ ID NO: 65) и s86B4 (SEQ ID NO: 67). Верхний ряд: левая и средняя панель: иммунизация индуцирует антитела, способные к распознаванию когнатного антигена (s74H9 - левая, s86B4 средняя панель), а также полноразмерного НА из H1N1 A/Brisbane/59/07 (правая панель), как определено с помощью ELISA. Нижний ряд: Индуцированные антитела способны конкурировать с CR9114 за связывание с полноразмерным НА из H1N1 A/Brisbane/59/07 в конкурентном ELISA (левая панель). Для сравнения уровни конкуренции с немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающим моноклональным антителом CR8020, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике;
фиг. 5 - оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению s127H1 (SEQ ID NO: 66) на модели летального контрольного заражения гриппом H1N1 A/Puerto Rico/8/1934. А: Верхний ряд: выживаемость, среднее изменение массы тела и среднее значение клинического показателя для групп отрицательного (PBS) и положительного (CR6261) контроля. Нижний ряд:
- 4 034639 выживаемость, среднее изменение массы тела и среднее значение клинического показателя для экспериментальной группы, иммунизированной s127H1 (SEQ ID NO: 35). Для сравнения также показана группа отрицательного контроля PBS. В: Иммуногенность s127H1 (SEQ ID NO: 35). Верхний ряд: иммунизация индуцирует антитела, способные к распознаванию когнатного антигена s127H1 (SEQ ID NO: 35) (левая панель), а также полноразмерного НА из H1N1 A/Brisbane/59/07 (правая панель), как определено с помощью ELISA. Нижний ряд: индуцированные антитела способны конкурировать с CR9114 за связывание с полноразмерным НА из H1N1 A/Brisbane/59/07 в конкурентном ELISA (левая панель). Для сравнения уровни конкуренции с немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающим моноклональным антителом CR8020, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике;
фиг. 6 - наблюдаемая и ожидаемая частота встречаемости аминокислоты в указанном положении в последовательностях набора 1, которые показывают улучшенное связывание с CR6261. Значения выражены в процентах от общего числа последовательностей набора 1, которые показывают улучшенное связывание CR6261. Ожидаемые значения рассчитаны как 100%, деленные на число вариабельных аминокислот в каждом положении, включенном в набор;
фиг. 7 - частота встречаемости комбинаций аминокислот в улучшенных связывающих веществах для CR6261 из набора 1. Последовательности с улучшенным связыванием с CR6261 сгруппировали согласно присутствию аминокислот в положениях, указанных слева, и частоту каждой комбинации рассчитали как процент от общего числа последовательностей набора 1, которые показали улучшенное связывание CR6261. Комбинации, которые более распространены, обведены рамкой. А. Анализ комбинационных последовательностей в области гибридного пептида. В. Анализ области В-петли;
фиг. 8 - наблюдаемая и ожидаемая частота встречаемости аминокислоты в указанном положении в последовательностях набора 2, которые показывают улучшенное связывание с CR6261. Значения выражены в процентах от общего числа последовательностей набора 2, которые показывают улучшенное связывание CR6261. Ожидаемые значения рассчитаны как 100%, деленные на число вариабельных аминокислот в каждом положении, включенном в набор;
фиг. 9 - частота встречаемости комбинаций аминокислот в улучшенных связывающих веществах для CR6261 из набора 2. Последовательности с улучшенным связыванием с CR6261 сгруппировали согласно присутствию аминокислот в положениях, указанных слева, и частоту каждой комбинации рассчитали как процент от общего числа последовательностей набора 2, которые показали улучшенное связывание CR6261. Комбинации, которые более распространены, обведены рамкой. Изменение в положении 402 не было включено в анализ, так как все улучшенные связывающие последовательности содержат Met в этом положении, в то время как для положения 352 учли только последовательности, содержащие либо Phe, либо Tyr. А. Анализ комбинационных последовательностей в области гибридного пептида. В. Анализ области В-петли.
Определения
Определения терминов, применяемых в настоящем изобретении, даны ниже.
Аминокислота согласно настоящему изобретению может быть любой из двадцати природных (или стандартных аминокислот) или их вариантами, такими как, например, D-пролин (D-энантиомер пролина), или любыми вариантами, которые не обнаружены в природе в белках, такими как, например, норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают особыми свойствами, например цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими остатками цистеина, пролин, который образует цикл с полипептидным каркасом, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В табл. 2 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.
Выражение идентичность аминокислотной последовательности относится к степени идентичности или сходства между парой выравненных аминокислотных последовательностей, как правило, выраженной в процентах. Процент идентичности представляет собой процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными (т.е. аминокислотные остатки в данном положении в выравнивании представляют собой такой же остаток) или сходными (т.е. аминокислотная замена в данном положении в выравнивании представляет собой консервативную замену, как описано ниже) с соответствующим аминокислотным остатком в пептиде после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента гомологии последовательности. Гомологию последовательности, в том числе процентные доли идентичности и сходства последовательностей, определяют с использованием методов выравнивания последовательностей, хорошо известных в данной области техники, например, путем визуального осмотра и математических расчетов, или более предпочтительно, сравнение осуществляют путем сравнивания информации о последовательности с использованием компьютерной программы. В качестве примера, предпочтительной компьютерной программой является разработанная Genetics Computer Group (GCG; Мэдисон, Висконсин) программа GAP версии 10.0 пакета Wisconsin (Devereux et al. (1984)).
- 5 034639
Консервативная замена относится к замене аминокислоты одного класса другой аминокислотой того же класса. В конкретных вариантах осуществления консервативная замена не изменяет структуру или функцию, или и то и другое, полипептида. Классы аминокислот для консервативной замены включают гидрофобные (например, Met, Ala, Val, Leu), нейтральные гидрофильные (например, Cys, Ser, Thr), кислые (например, Asp, Glu), основные (например, Asn, Gln, His, Lys, Arg), разрушители конформации (например, Gly, Pro) и ароматические (например, Trp, Tyr, Phe).
Применяемые в настоящем документе термины заболевание и нарушение используют взаимозаменяемо по отношению к состоянию пациента. В некоторых вариантах осуществления состояние представляет собой вирусную инфекцию, в частности инфекцию вируса гриппа. В конкретных вариантах осуществления термин заболевание относится к патологическому состоянию в результате присутствия вируса в клетке или пациенте, или инвазии вируса в клетку или пациента. В некоторых вариантах осуществления состояние представляет собой заболевание у пациента, тяжесть которого уменьшают путем индуцирования иммунного ответа у пациента посредством введения иммуногенной композиции.
Применяемый в настоящем документе термин эффективное количество в контексте введения терапевтического средства пациенту относится к количеству терапевтического средства, которое имеет профилактический и/или терапевтический эффект(ы). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество в контексте введения терапевтического средства пациенту относится к количеству терапевтического средства, которое является достаточным для достижения снижения или облегчения тяжести инфекции вируса гриппа, заболевания или симптома, связанного с ней, такого как, но без ограничения, снижение продолжительности инфекции вируса гриппа, заболевания или симптома, связанного с ней, предупреждение прогрессирования инфекции вируса гриппа, заболевания или симптома, связанного с ней, предупреждение развития или наступления или рецидива инфекции вируса гриппа, заболевания или симптома, связанного с ней, предупреждение или снижение распространения вируса гриппа от одного пациента к другому пациенту, сокращение случаев госпитализации пациента и/или длительности госпитализации, увеличение выживаемости пациента с инфекцией вируса гриппа или заболеванием, связанным с ней, устранение инфекции вируса гриппа или заболевания, связанного с ней, ингибирование или снижение репликации вируса гриппа, снижение титра вируса гриппа и/или усиление и/или улучшение профилактического или терапевтического эффекта (эффектов) другой терапии. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество не приводит к полной защите от заболевания вирусом гриппа, но приводит к более низкому титру или сниженному количеству вирусов гриппа по сравнению с необработанным пациентом. Преимущества снижения титра, количества или общей нагрузки вирусом гриппа включают, но без ограничения, меньшую тяжесть симптомов инфекции, меньшее количество симптомов инфекции и снижение длительности заболевания, связанного с инфекцией.
Подразумевают, что применяемое в настоящем документе выражение хозяин относится к организму или клетке, в которую был введен вектор, такой как вектор для клонирования или вектор экспрессии. Организм или клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительно, хозяин включает выделенные клетки-хозяева, например клетки-хозяева в культуре. Выражение клеткихозяева означает лишь, что клетки модифицировали для (сверх)экспрессии полипептидов по настоящему изобретению. Следует понимать, что выражение хозяин предназначено для обозначения не только определенного организма или клетки, но также и потомства такого организма или клетки. Поскольку вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды в последующих поколениях могут происходить определенные модификации, фактически, такое потомство может не быть идентичным родительскому организму или клетке, но его все еще включают в объем выражения хозяин, применяемого в настоящем документе.
Полагают, что выражение включенный или включая, применяемое в настоящем документе, следует сопровождать словами без ограничения.
Применяемый в настоящем документе термин инфекция означает инвазию, размножение и/или присутствие вируса в клетке или пациенте. В одном варианте осуществления инфекция представляет собой активную инфекцию, т.е. такую, при которой вирус реплицируется в клетке или пациенте. Такая инфекция характеризуется распространением вируса в другие клетки, ткани и/или органы из клеток, тканей и/или органов, изначально инфицированных вирусом. Инфекция также может быть латентной инфекцией, т.е. такой, при которой вирус не реплицируется. В некоторых вариантах осуществления инфекция относится к патологическому состоянию в результате присутствия вируса в клетке или пациенте, или инвазии вируса в клетку или пациента.
Вирусы гриппа классифицируют на типы вируса гриппа: род А, В и С. Выражение подтип вируса гриппа, применяемое в настоящем документе, относится к вариантам вируса гриппа А, которые характеризуются комбинациями поверхностных вирусных белков гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Согласно настоящему изобретению подтипы вируса гриппа могут быть названы по их номеру H, такому как, например, вирус гриппа, содержащий НА подтипа H3, вирус гриппа подтипа H3 или грипп H3, или по комбинации номера Н и номера N, такой как, например, подтип H3N2 вируса гриппа или H3N2. Термин подтип специфически включает все индивидуальные штаммы в пределах каждого подтипа, которые, как правило, являются результатом мутаций и показывают различные патогенные
- 6 034639 профили, в том числе, природные изоляты, а также искусственные мутанты или реассортанты и т.п. Такие штаммы также можно называть различными изолятами вирусного подтипа. Соответственно, применяемые в настоящем документе термины штаммы и изоляты можно применять взаимозаменяемо. Современная номенклатура штаммов или изолятов вируса гриппа человека включает тип (род) вируса, т.е. А, В или С, географическое местоположение первого выделения, номер штамма и год выделения, как правило, с антигенным описанием НА и NA, данным в скобках, например A/Moscow/10/00 (H3N2). Не человеческие штаммы также включают в свою номенклатуру исходного хозяина. Подтипы вируса гриппа А можно дополнительно классифицировать, ссылаясь на их филогенетическую группу. Филогенетический анализ продемонстрировал подразделение гемагглютининов на две основные группы: inter alia подтипы H1, Н2, Н5 и Н9 в филогенетической группе 1 (вирусы гриппа группы 1) и inter alia подтипы H3, Н4, Н7 и H10 в филогенетической группе 2 (вирусы гриппа группы 2).
Применяемый в настоящем документе термин заболевание, вызванное вирусом гриппа относится к патологическому состоянию в результате присутствия вируса гриппа, например, вируса гриппа А или В, в клетке или пациенте, или инвазии вируса гриппа в клетку или пациент. В конкретных вариантах осуществления данный термин относится к респираторному заболеванию, вызванному вирусом гриппа.
Применяемый в настоящем документе термин нуклеиновая кислота предназначен для включения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекул РНК (например, мРНК) и аналогов ДНК и РНК, созданных с применением нуклеотидных аналогов. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, что будет совершенно понятно специалистам в данной области техники. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), заряженные связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), выступающие фрагменты (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелатирующие вещества, алкилирующие вещества и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Упоминание последовательности нуклеиновой кислоты охватывает комплементарную ей цепь, если не указано иное. Таким образом, упоминание молекулы нуклеиновой кислоты с конкретной последовательностью следует понимать как охватывающее комплементарную ей цепь с ее комплементарной последовательностью. Комплементарная цепь также пригодна, например, для антисмысловой терапии, гибридизационных зондов и праймеров для PCR.
Применяемая в настоящем документе в некоторых вариантах осуществления нумерация аминокислот в НА основана на нумерации аминокислот в HA0 вируса гриппа дикого типа, например нумерации аминокислот в штамме гриппа H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Применяемая в настоящем изобретении формулировка аминокислота в положении x в НА, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении x в НА0 определенного вируса гриппа дикого типа, например, A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1; где аминокислоты домена HA2 были указаны курсивом). Специалисту в данной области техники будет понятно, что эквивалентные аминокислоты в других штаммах и/или подтипах вируса гриппа можно определить путем множественного выравнивания последовательностей. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой в данной заявке, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого белка HA0 (SEQ ID NO: 1). Зрелая последовательность начинается, например, с положения 18 SEQ ID NO: 1. Специалисту в данной области техники будет понятно, что лидерная последовательность (или сигнальная последовательность), которая направляет транспорт белка в ходе продукции (например, соответствующая аминокислотам 1-17 SEQ ID NO: 1), обычно не присутствует в конечном полипептиде, который, например, применяют в вакцине. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению, таким образом, содержат аминокислотную последовательность без лидерной последовательности, т.е. эта аминокислотная последовательность основана на аминокислотной последовательности HA0 без сигнальной последовательности.
Полипептид относится к полимеру аминокислот, связанному амидными связями, как известно специалисту в данной области техники. Применяемый в настоящем документе термин может обозначать одиночную полипептидную цепь, связанную ковалентными амидными связями. Данный термин может также обозначать несколько полипептидных цепей, связанных нековалентными взаимодействиями, такими как ионные связи, водородные связи, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и гидрофобные связи. Специалистам в данной области техники будет понятно, что термин включает полипептиды, которые были модифицированы, например, путем посттрансляционного процессинга, такого как отщепление сигнального пептида, образование дисульфидных связей, гликозилирование (например, N-связанное и Освязанное гликозилирование), расщепление протеазой и липидная модификация (например, Sпальмитоилирование).
Полипептид стеблевого домена относится к полипептиду, который содержит одну или несколько полипептидных цепей, составляющих стеблевой домен природного (дикого типа) гемагглютинина (HA). Как правило, полипептид стеблевого домена представляет собой одиночную полипептидную цепь (т.е. соответствует стеблевому домену полипептида гемагглютинина НА0) или две полипептидные цепи (т.е.
- 7 034639 соответствует стеблевому домену полипептида гемагглютинина HA1 в ассоциации с полипептидом гемагглютинина НА2). Согласно настоящему изобретению полипептид стеблевого домена содержит одну или несколько мутаций по сравнению с молекулой HA дикого типа, в частности, один или несколько аминокислотных остатков HA дикого типа могут быть замещены другими аминокислотами, которые не являются природными для соответствующего положения в определенном HA дикого типа. Полипептиды стеблевого домена по настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или несколько сшивающих последовательностей, описанных ниже.
Выражение вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть вставлена вторая молекула нуклеиновой кислоты для введения хозяину, где она будет реплицироваться и в некоторых случаях экспрессироваться. Другими словами, вектор может транспортировать молекулу нуклеиновой кислоты, к которой он был присоединен. Под применяемым в данном документе термином вектор подразумеваются векторы для клонирования, а также векторы экспрессии. Векторы включают, но без ограничений, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), и дрожжевые искусственные хромосомы (YAC), и векторы, полученные из бактериофагов или вирусов растений или животных (в том числе человека). Векторы включают точку начала репликации, распознаваемую предполагаемым хозяином, и в случае векторов экспрессии хозяином могут распознаваться промоторные и другие регуляторные участки. Определенные векторы способны к автономной репликации в хозяине, в который они введены (например, векторы, имеющие бактериальное начало репликации, могут реплицироваться в бактериях). Другие векторы можно встроить в геном хозяина после введения в хозяина, и, таким образом, они могут реплицироваться наряду с геномом хозяина.
Применяемый в настоящем документе термин дикого типа в контексте вируса относится к вирусам гриппа, которые широко распространены, естественно циркулируют и производят типичные вспышки заболевания.
Подробное описание
Вирусы гриппа имеют значительное влияние на глобальное здравоохранение, вызывая миллионы случаев тяжелого заболевания каждый год, тысячи смертей и значительные экономические потери. Современные трехвалентные противогриппозные вакцины вызывают мощный ответ нейтрализующих антител к вакцинным штаммам и близкородственным изолятам, но редко распространяются на более отличающиеся штаммы в пределах подтипа или на другие подтипы. Кроме того, выбор соответствующих вакцинных штаммов представляет много сложностей и часто приводит к недостаточной защите. Более того, прогнозирование подтипа следующего пандемического вируса, в том числе, когда и где он возникнет, в настоящее время невозможно.
Гемагглютинин (HA) является основным гликопротеином оболочки вирусов гриппа А, который представляет собой главную мишень нейтрализующих антител. Гемагглютинин имеет две главные функции в процессе проникновения. Во-первых, гемагглютинин опосредует прикрепление вируса к поверхности клеток-мишеней благодаря взаимодействию с сиаловой кислотой рецепторов. Во-вторых, после эндоцитоза вируса гемагглютинин в дальнейшем инициирует слияние вирусной и эндосомальной мембран для высвобождения вирусного генома в цитоплазму клетки-мишени. HA содержит крупный эктодомен из ~ 500 аминокислот, который расщепляется ферментами хозяина с образованием 2 полипептидов, остающихся связанными дисульфидной связью. Большая часть N-концевого фрагмента (НА1, 320330 аминокислот) образует дистальный мембранный глобулярный домен, который содержит рецепторсвязывающий сайт и большинство детерминант, распознаваемых нейтрализующими вирус антителами. Меньшая С-концевая часть (НА2, ~180 аминокислот) образует стеблеподобную структуру, которая прикрепляет глобулярный домен к клеточной или вирусной мембране. Степень гомологии последовательности между подтипами меньше в полипептидах HA1 (34-59% гомологии между подтипами), чем в полипептиде HA2 (51-80% гомологии). Наиболее консервативный участок представляет собой последовательность вблизи сайта расщепления, в частности 23 N-концевые аминокислоты HA2, которая является консервативной во всех подтипах вируса гриппа A (Lorieau et al., 2010). Часть этого участка располагается в виде поверхностной петли в молекуле-предшественнице HA (HA0), но становится недоступной после расщепления HA0 на HA1 и НА2.
Большинство нейтрализующих антител связывается с петлями, которые окружают сайт связывания рецептора и мешают связыванию рецептора и прикреплению. Так как эти петли являются высоковариабельными, большинство антител, направленных на эти участки, являются штамм-специфичными, что объясняет почему современные вакцины вызывают такой ограниченный штамм-специфичный иммунитет. Недавно, однако, были созданы полные человеческие моноклональные антитела против гемагглютинина вируса гриппа с перекрестно-нейтрализующей активностью широкого спектра. Функциональный и структурный анализ показал, что эти антитела препятствуют процессу слияния мембран и направлены против высококонсервативных эпитопов в стеблевом домене белка НА вируса гриппа (Throsby et al., 2008; Ekiert et al. 2009, WO 2008/028946, WO 2010/130636, WO 2013/007770).
Полипептиды стеблевого домена, стабильно представляющие эпитопы этих антител, описаны в находящейся одновременно на рассмотрении заявке на патент РСТ/ЕР2012/073706. По меньшей мере, некоторые из полипептидов стеблевого домена, описанные в настоящем документе, стабильно представля- 8 034639 ют эпитоп CR6261 и/или CR9114 и являются иммуногенными у мышей. По меньшей мере, некоторые из полипептидов стеблевого домена, описанные в настоящем документе, стабильно представляют эпитоп CR8020 и являются иммуногенными у мышей.
По настоящему изобретению были сконструированы новые полипептиды стеблевого домена HA, представляющие эти эпитопы. Эти полипептиды могут быть использованы для создания универсальной вакцины на основе эпитопов, индуцирующей защиту против широкого круга штаммов гриппа. Как и в ранее описанных полипептидах стеблевого домена, высоковариабельную и иммунодоминантную часть, т.е. головной домен, сначала удаляют из полноразмерной молекулы HA для создания полипептида стеблевого домена, также называемого мини-HA, чтобы перенаправить иммунный ответ на стеблевой домен, где расположены эпитопы для нейтрализующих антител широкого спектра. Нейтрализующие антитела широкого спектра, упомянутые выше, использовали для проверки правильной укладки вновь созданных молекул и для подтверждения наличия нейтрализующих эпитопов.
Новые полипептиды стеблевого домена по настоящему изобретению показывают увеличенное связывание антител, в частности CR6261 и/или CR9114, по сравнению со связыванием этих антител со стеблевыми полипептидами, описанными ранее (РСТ/ЕР2012/073706).
Полипептиды стеблевого домена по настоящему изобретению способны представлять консервативные эпитопы проксимального мембранного стеблевого домена молекулы HA иммунной системе в отсутствие доминантных эпитопов, которые представлены в дистальном мембранном головном домене. С этой целью часть первичной последовательности белка HA0, составляющую головной домен, удаляют и заново соединяют, либо непосредственно, либо в некоторых вариантах осуществления посредством введения короткой гибкой сшивающей последовательности (линкера) с восстановлением непрерывности аминокислотной цепи. Полученную полипептидную последовательность дополнительно модифицируют путем введения специфических мутаций, которые стабилизируют нативную 3-мерную структуру оставшейся части молекулы НА0.
Изобретение, таким образом, предусматривает полипептиды, содержащие: (а) домен HA1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом HA1, и (b) домен HA2 гемагглютинина вируса гриппа, где полипептиды стеблевого домена гемагглютинина устойчивы к расщеплению протеазой на стыке между HA1 и HA2, и где одна или несколько аминокислот в домене HA1 и HA2 были мутированы. В полипептидах по изобретению домены HA1 и HA2, таким образом, содержат одну или несколько мутаций по сравнению с доменами HA1 и HA2 гемагглютинина вируса гриппа дикого типа, на котором основан полипептид стеблевого домена НА.
Согласно настоящему изобретению полипептиды стеблевого домена основаны на HA вируса гриппа, содержащего HA подтипа H1.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат одну или несколько мутаций в положении 337, 340, 352 или 353 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентных положениях в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 352 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 353 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 337 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 340 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности HA2, соединяющей С-концевой остаток спирали А с N-концевым остатком спирали CD, как показано на фиг. 1.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислот в положении 402, 406, 409, 413 и 416 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) или в эквивалентных положениях в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 402 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 406 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по
- 9 034639 меньшей мере одну мутацию в положении 409 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 413 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 416 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
Полипептиды по настоящему изобретению не содержат полноразмерный НА1.
В некоторых вариантах осуществления иммуногенные полипептиды являются существенно меньшими, чем HA0, предпочтительно в них отсутствует вся или фактически вся глобулярная головка HA. Предпочтительно, иммуногенные полипептиды составляют не более чем 360, предпочтительно не более чем 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 или 270 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные полипептиды составляют от приблизительно 250 до приблизительно 350, предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 340, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330 аминокислот в длину.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды дополнительно содержат одну или несколько дополнительных мутаций в домене HA1 и/или HA2, по сравнению с аминокислотной последовательностью HA, из которой получены домены HA1 и НА2. Таким образом, стабильность стеблевых полипептидов дополнительно увеличена.
Согласно настоящему изобретению N-концевой сегмент НА1 относится к полипептидному сегменту, который соответствует амино-концевому участку домена HA1 молекулы гемагглютинина (HA) гриппа. В некоторых вариантах осуществления N-концевой полипептидный сегмент HA1 содержит аминокислоты с положения 1 по положение x домена HA1, где аминокислота в положении x представляет собой аминокислотный остаток в пределах НА1. Выражение С-концевой сегмент НА1 относится к полипептидному сегменту, который соответствует карбокси-концевому участку домена HA1 гемагглютинина вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления С-концевой полипептидный сегмент HA1 содержит аминокислоты с положения y до С-концевой аминокислоты, включительно, домена HA1, где аминокислота в положении у представляет собой аминокислотный остаток в пределах НА1. Согласно настоящему изобретению у больше, чем х, таким образом сегмент домена HA1 между N-концевым сегментом HA1 и С-концевым сегментом HA1, т.е. между аминокислотой в положении х и аминокислотой в положении у HA1, был удален и в некоторых вариантах осуществления замещен сшивающей последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления N-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит аминокислоты 1-х HA1 и С-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит у-конец аминокислоты НА1. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления делеция в сегменте HA1 включает аминокислотную последовательность от аминокислоты в положении x+1 вплоть до аминокислоты в положении y-1 включительно.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды не содержат сигнальную последовательность. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления N-концевой сегмент HA1 содержит аминокислоту p-x HA1, где p представляет собой первую аминокислоту зрелой молекулы HA (например, p=18 в случае SEQ ID NO: 1). Специалист в данной области сможет подготовить полипептиды, описанные в настоящем документе, без сигнальных пептидов (например, аминокислот 1-17 SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В других вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению не содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная и трансмембранная последовательность, например, аминокислотная последовательность от положения (или эквивалентного ему) 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 домена HA2 до С-конца домена HA2 была удалена.
Согласно настоящему изобретению полипептиды стеблевого домена гемагглютинина являются устойчивыми к расщеплению протеазой на стыке между HA1 и HA2. Специалистам в данной области техники известно, что последовательность Arg (R)-Gly (G), соединяющая HA1 и HA2, представляет собой сайт распознавания для трипсина и трипсиноподобных протеаз и, как правило, расщепляется для активации гемагглютинина. Поскольку полипептиды стеблевого домена НА, описанные в настоящем документе, не должны быть активированы, полипептиды стеблевого домена гемагглютинина по настоящему изобретению являются устойчивыми к расщеплению протеазой. Согласно настоящему изобретению, таким образом, сайт для расщепления протеазой удаляют или сайт протеазы, соединяющий HA1 и HA2, мутируют до последовательности, которая является устойчивой к расщеплению протеазой.
В некоторых вариантах осуществления С-концевой аминокислотный остаток в С-концевом стеблевом сегменте HA1 представляет собой любую аминокислоту, кроме аргинина (R) или лизина (K). В некоторых вариантах осуществления С-концевая аминокислота в HA1 представляет собой глутамин (Q), се
- 10 034639 рин (S), треонин (Т), аспарагин (N), аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е). В некоторых вариантах осуществления С-концевой аминокислотный остаток в С-концевом стеблевом сегменте HA1 представляет собой глутамин (Q).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды гликозилированы.
Согласно настоящему изобретению полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа основаны на НА вирусов гриппа подтипа H1. Под выражением на основе следует понимать, что Nконцевые сегменты и/или С-концевые сегменты домена HA1 и/или домена HA2 имеют по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности аминокислотной последовательности с соответствующими N-концевыми и/или С-концевыми сегментами доменов HA1 и/или HA2 любого природного гемагглютинина вируса гриппа подтипа H1, H3 и/или Н5, известного специалистам в данной области техники или обнаруженного позже. В некоторых вариантах осуществления полипептиды стеблевого домена гемагглютинина основаны на гемагглютинине гриппа из группы 1 вируса гриппа А.
Согласно настоящему изобретению полипептиды основаны на HA H1, т.е. HA, содержащем аминокислотную последовательность вируса гриппа подтипа H1. В конкретном варианте осуществления полипептиды содержат стеблевые домены гемагглютинина из или на основе HA вируса гриппа А, включая HA из подтипа H1, например из вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1), как описано ниже. Специалисту в данной области техники будет понятно, что и другие вирусы гриппа А, содержащие HA из подтипа H1, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат стеблевые домены гемагглютинина на основе HA из вируса гриппа А H1, выбранного из табл. 3.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат N-концевой полипептидный сегмент HA1, содержащий аминокислоты с положения 1 по положение x домена HA1 H1, где x обозначает любую аминокислоту между аминокислотой в положении 46 и аминокислотой в положении 60, такую как аминокислота в положении 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 или 59, предпочтительно, где x представляет собой 52, 53, 55 или 59. Предпочтительно, полипептиды содержат N-концевой сегмент HA1 без сигнальной последовательности, т.е. N-концевой сегмент HA1, содержащий аминокислоты с положения 18 (например, для HA H1, такого как SEQ ID NO: 1) или эквивалентного положения в других штаммах вируса гриппа H1 (см., например, табл. 3), по положение x домена НА1. В некоторых вариантах осуществления N-концевой сегмент HA1, таким образом, содержит аминокислоты с положения p (где p=18 для HA H1 в SEQ ID NO: 1 или эквивалентное положение в других HA H1) по положение x домена НА1.
В некоторых вариантах осуществления С-концевой полипептидный сегмент HA1 содержит аминокислоты от положения y до С-концевой аминокислоты, включительно, домена HA1 H1, где y представляет собой любую аминокислоту между аминокислотой в положении 290 и аминокислотой в положении 325 HA1 HA, предпочтительно, где y представляет собой 291, 303, 318 или 321.
В некоторых вариантах осуществления х представляет собой 52 и y представляет собой 321.
Согласно настоящему изобретению стеблевые полипептиды содержат одну или несколько мутаций, т.е. аминокислотных замен в домене HA1 и/или домене HA2, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего HA1 и/или HA2 домена вируса гриппа дикого типа, т.е. вируса гриппа, на котором основаны стеблевые полипептиды.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков рядом с сайтом расщепления HA0 (остаток 343 в SEQ ID NO: 1) были мутированы. В некоторых вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков в положении 337, 340, 352 или 353 в SEQ ID NO: 1 или эквивалентных положениях в других вирусах гриппа были мутированы, т.е. заменены аминокислотой, которая не встречается в соответствующем положении в аминокислотной последовательности HA вируса гриппа дикого типа, на котором основан стеблевой полипептид. В табл. 7 показана природная вариабельность аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 352 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 353 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 337 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 340 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат одну или несколько мутаций, указанных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления мутированный аминокислотный остаток в положении 337 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, E, K, V, А и Т.
- 11 034639 остаток остаток остаток вводит положении положении положении
340
352
353 консенсусное
NВ некоторых вариантах осуществления мутированный аминокислотный (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y.
В некоторых вариантах осуществления мутированный аминокислотный (домен НА2) выбран из группы, состоящей из D, V, Y, A, I, N, S и Т.
В некоторых вариантах осуществления мутированный аминокислотный (домен НА2) выбран из группы, состоящей из K, R, T, E, G и V.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота гликозилирование, например N-X-T/S (где X обозначает любую природную аминокислоту, кроме P) в последовательность, как это, например, имеет место для I340N в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота представляет собой аминокислоту, которая не встречается в природе в последовательностях того же подтипа.
Необходимо снова отметить, что нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот в HA0 H1, в частности, на нумерации аминокислот в штамме гриппа H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Специалист в данной области техники сможет определить эквивалентные аминокислоты в HA из других вирусов гриппа и таким образом будет иметь возможность определить эквивалентные мутации, см., например, табл. 3 для выравнивания последовательностей различных вирусов гриппа H1.
В некоторых вариантах осуществления домен HA2 содержит одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности HA2, соединяющей С-концевой остаток спирали А с N-концевым остатком спирали CD (фиг. 1). Аминокислотная последовательность HA2 H1, соединяющая С-концевой остаток спирали А и N-концевой остаток спирали CD, содержит аминокислотную последовательность, содержащую остатки 402-418 гриппа HA (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), содержащую аминокислотную последовательность
MNTQFTAVGKEFN(Н/К)LE(K/R) (SEQ ID NO: 8).
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, соединяющая Сконцевой остаток спирали А с N-концевым остатком спирали CD, т.е. участок, содержащий аминокислотные остатки 402-418 гриппа HA серотипа H1 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), содержит амино кислотную последовательность
X1NTQX2TAX3GKEX4N (Н/К) Х5Е (K/R) (SEQ ID NO: 52).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат одну или несколько мутаций в домене НА2 H1, указанных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислот в положении 402, 406, 409, 413 и 416 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1), т.е. одна или несколько аминокислот X1, X2, Х3, Х4 и Х5 были мутированы, т.е. содержат аминокислоту, которая не встречается в этих положениях в вирусе гриппа дикого типа, на котором основан стеблевой полипептид.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота в положении 402, т.е. X1, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, Е, K, V, R и Т.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота в положении 406, т.е. Х2, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, T, H, L и Y, предпочтительно I, L или Y.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота в положении 409, т.е. Х3, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, A, G, I, R, F и S, предпочтительно А, I или F.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота в положении 413, т.е. Х4, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, Т, Y, Е, K, М и V, предпочтительно I, Y, М или V.
В некоторых вариантах осуществления мутированная аминокислота в положении 416, т.е. Х5, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, H, I, N, R, предпочтительно I.
Комбинации этих мутаций также возможны.
В некоторых вариантах осуществления N-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит аминокислотные остатки 1-52 HA1, предпочтительно аминокислотные остатки 18-52 HA1, и С-концевой стеблевой сегмент HA1 содержит аминокислотные остатки 321-343 HA1, где аминокислота в положении 343, т.е. R343, была мутирована и представляет собой любую аминокислоту кроме R, предпочтительно глутамин (Q). В некоторых вариантах осуществления N-концевой стеблевой сегмент HA1 состоит из аминокислотных остатков 1-52 НА1, предпочтительно из аминокислотных остатков 18-52 HA1, и С-концевой стеблевой сегмент HA1 состоит из аминокислотных остатков 321-343 НА1.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды селективно связываются с антителами CR6261 и/или CR9114. В одном варианте осуществления полипептид не связывается с антителом CR8057. В одном варианте осуществления CR6261 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; CR9114 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В одном варианте осуществле
- 12 034639 ния CR8057 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Как описано выше, полипептиды содержат домен HA1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом НА1. Сшивающая последовательность не встречается в природном HA или в HA дикого типа. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой пептид, который содержит один аминокислотный остаток, два или менее аминокислотных остатка, три или менее аминокислотных остатка, четыре или менее аминокислотных остатка, пять или менее аминокислотных остатков, десять или менее аминокислотных остатков, 15 или менее аминокислотных остатков, или 20 или менее аминокислотных остатков, или 30 или менее аминокислотных остатков, или 40 или менее аминокислотных остатков, или 50 или менее аминокислотных остатков. В конкретном варианте осуществления сшивающая последовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из G, GS, GGG, GSG, GSA, GSGS, GSAG, GGGG, GSAGS, GSGSG, GSAGSA, GSAGSAG и GSGSGSG.
В некоторых вариантах осуществления N-концевой сегмент HA1 непосредственно связан с Сконцевым сегментом HA1, т.е. полипептиды не содержат сшивающую последовательность.
Согласно настоящему изобретению удаления сайта расщепления между HA1 и HA2 можно достичь посредством мутации R (в небольшом ряде случаев K) на Q в положении Р1 (см., например, Sun et al., 2010 для объяснения номенклатуры сайта расщепления (положение 343 в SEQ ID NO: 1). Мутация на Q является предпочтительной, но S, T, N, D или Е являются альтернативными.
Согласно настоящему изобретению один или несколько дисульфидных мостиков вводят в полипептиды стеблевого домена, предпочтительно между аминокислотами в (или эквивалентно) положении 324 и 436 в H1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления полипептиды, таким образом, дополнительно содержат мутацию R324C в домене HA1 и Т436С в домене HA2. Специалист в данной области техники может легко определить эквивалентные положения путем выравнивания последовательностей с помощью подходящего алгоритма, такого как Clustal, Muscle и т.д. Сконструированные дисульфидные мостики создают путем мутирования по меньшей мере одного (если другой уже является цистеином), но обычно двух остатков, которые пространственно близки, в цистеин, который будет спонтанно или путем активного окисления образовывать ковалентную связь между атомами серы этих остатков.
HA гриппа в своей нативной форме существует в виде тримера на клеточной или вирусной мембране. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточную и трансмембранную последовательность удаляют, так что секретируемый (растворимый) полипептид получают после экспрессии в клетках. Способы для экспрессии и очистки секретируемых эктодоменов HA были описаны (см., например, Dopheide et al., 2009; Ekiert et al., 2009, 2011; Stevens et al., 2004, 2006; Wilson et al., 1981). Специалисту в данной области техники будет понятно, что эти способы можно также применить непосредственно к полипептидам стеблевого домена по настоящему изобретению для достижения экспрессии секретируемого (растворимого) полипептида. Таким образом, эти полипептиды также охвачены в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В других вариантах осуществления внутриклеточная и трансмембранная последовательности, например, аминокислотная последовательность от положения (или эквивалентного ему) 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 домена HA2 до С-конца домена HA2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) были удалены с получением растворимого полипептида после экспрессии в клетках.
В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид по настоящему изобретению можно создать путем делеции полипептидной последовательности от остатка (эквивалента) 514 до Сконца (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), в качестве альтернативы, дополнительные остатки можно включить в полипептид по настоящему изобретению, например, путем делеции последовательности от остатка 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523. Последовательность his-метки (НННННН (SEQ ID NO: 20) или ННННННН (SEQ ID NO: 21)) можно добавить с целью очистки, необязательно присоединенную посредством линкера. Линкер необязательно может содержать сайт протеолитического расщепления для ферментативного удаления his-метки после очистки.
В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид по настоящему изобретению можно создать путем делеции полипептидной последовательности с остатка (эквивалента) 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 или 532 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1). Последовательность his-метки (НННННН (SEQ ID NO: 20) или ННННННН (SEQ ID NO: 21)) можно добавить с целью очистки, необязательно присоединенную посредством линкера. Линкер необязательно может содержать сайт протеолитического расщепления для удаления his-метки после очистки.
Растворимые полипептиды можно дополнительно стабилизировать путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, такой как последовательность-фолдон (например, описанная в настоящем документе). Полипептиды, полученные, как описано выше, также охва
- 13 034639 чены в настоящем изобретении.
Нативный HA существует в виде тримера на клеточной поверхности. Большинство взаимодействий между отдельными мономерами, которые удерживают тример вместе, расположены в головном домене, в то время как в стеблевом домене тримеризация опосредована образованием тримерного биспирального мотива. После удаления головки третичная структура дестабилизируется и, следовательно, необходимы модификации для того, чтобы повысить стабильность белка. Путем укрепления предрасположенности к спиралеобразованию спирали CD можно создать более стабильной белок. В некоторых вариантах осуществления последовательность
MKQIEDKIEEIESKQ (SEQ ID NO: 5), полученную из GCN4 и также известную, как тримеризующая, вводят в (эквивалентное) положение 419-433.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды дополнительно стабилизируют путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е.
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID N0: 3), с С-конца НА2, необязательно присоединенной посредством линкера. Линкер может факультативно содержать сайт расщепления для последующей обработки согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки растворимой формы можно добавить последовательность метки, например, his-метки (ННННННН (SEQ ID NO: 20) или НННННН (SEQ ID NO: 21)) или FLAG-метки (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 22) или их комбинации, необязательно присоединенной посредством коротких линкеров. Линкер может факультативно содержать сайт (часть сайта) протеолитического расщепления, например, RSLVPR (SEQ ID NO: 23) (тромбин) или IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X) для последующей обработки согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Обработанные белки также охвачены в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления С-концевая часть домена HA2 с положения 520-565 была удалена (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) и замещена на
SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ
ID NO: 4).
Заявители ранее выявили нейтрализующие антитела широкого спектра, выделенные из первичных В-клеток человека от вакцинированных индивидуумов, некоторые из них были специфическими для группы 1 (например, CR6261, как описано в WO 2008/028946), а некоторые из них были специфическими для группы 2 вирусов гриппа (например, CR8020, как описано в WO 2010/130636). Детальный анализ эпитопов этих моноклональных антител показал причину отсутствия перекрестной реактивности этих специфических антител. В обоих случаях наличие гликанов в группе 1 или группе 2 молекул HA в различных положениях, по меньшей мере, частично объяснило тот факт, что антитела являются группоспецифичными. После выявления CR9114-подобных антител, которые перекрестно реагируют со многими молекулами HA группы 1 и 2, как описано ниже, стало ясно, что иммунная система человека может вызвать нейтрализующие антитела очень широкого спектра против вирусов гриппа. Однако, учитывая необходимость в схеме ежегодной вакцинации, эти антитела по-видимому отсутствуют или только в очень низкой степени возникают после заражения или вакцинации (сезонными) вирусами гриппа подтипов H1 и/или H3.
По настоящему изобретению предусмотрены полипептиды, которые имитируют специфические эпитопы CR6261 и/или CR9114, и которые могут быть использованы в качестве иммуногенных полипептидов, например, чтобы вызвать перекрестно нейтрализующие антитела при введении in vivo, либо отдельно, либо в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими методами лечения. Под перекрестно нейтрализующими антителами подразумевают антитела, которые способны нейтрализовать по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, четыре или пять различных подтипов вирусов гриппа А из филогенетической группы 1 и/или по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, четыре или пять различных подтипов вирусов гриппа А из филогенетической группы 2 и/или по меньшей мере два различных подтипа вирусов гриппа В, в частности, по меньшей мере все штаммы вируса, которые нейтрализуются с помощью CR6261 и CR9114.
Полипептиды по настоящему изобретению не содержат полноразмерный НА1. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные полипептиды являются существенно меньшими, чем НА0, предпочтительно в них отсутствует вся или фактически вся глобулярная головка HA. Предпочтительно, иммуногенные полипептиды составляют не более чем 360, предпочтительно не более чем 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 или 270 аминокислот в длину. В одном варианте осуществления иммуногенный полипептид составляет от приблизительно 250 до приблизительно 350, предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 340, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330 аминокислот в длину.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды селективно связываются с антителами CR6261 и/или CR9114. В некоторых вариантах осуществления полипептид не связывается с антителом CR8057. CR6261 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последователь
- 14 034639 ность SEQ ID NO: 9 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; CR9114 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; CR8020 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. CR8057 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Как описано выше, полипептиды содержат домен HA1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом НА1. Сшивающая последовательность, если присутствует, не встречается в природном HA или HA дикого типа. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой пептид, который содержит один аминокислотный остаток, два или менее аминокислотных остатка, три или менее аминокислотных остатка, четыре или менее аминокислотных остатка, пять или менее аминокислотных остатков, десять или менее аминокислотных остатков, 15 или менее аминокислотных остатков, или 20 или менее аминокислотных остатков, или 30 или менее аминокислотных остатков, или 40 или менее аминокислотных остатков, или 50 или менее аминокислотных остатков. В конкретном варианте осуществления сшивающая последовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из G, GS, GGG, GSG, GSA, GSGS, GSAG, GGGG, GSAGS, GSGSG, GSAGSA, GSAGSAG и GSGSGSG.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последовательность
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXaPSX
I2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5
NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK
VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDD
DKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 53), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y; Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V; Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, K, М, V, R и Т;
Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L; Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;
Х8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, Е, K, М и V; и
Х9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последовательность
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX
I2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5
NTQXsTAXvGKEXgNKXgERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 54), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y; Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V; Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, K, М, V, R и Т;
Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L; Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;
Х8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, Е, K, М и V; и
Х9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последовательность
- 15 034639
DTICIGYHTkNNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX
I2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5
NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ IEG (SEQ ID NO: 70), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y;
Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V;
Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, K, М, V, R и Т;
Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L; Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;
Х8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, Е, K, М и V; и
X9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последовательность
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX
2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQXsTAXvGKEXgNKXgERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 71), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из E, I, K, V, А и T; X2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y; X3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V; Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из E, K, М, V, R и T;
Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L; Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;
Х8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, Е, K, М и V; и
Х9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.
Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа можно получить согласно любому методу, который считается приемлемым для специалиста, включая методы, описанные ниже.
Таким образом, иммуногенные полипептиды по настоящему изобретению можно синтезировать в виде последовательностей ДНК стандартными способами, известными в данной области техники, и клонировать, а затем экспрессировать in vitro или in vivo с применением приемлемых ферментов рестрикции и способов, известных в данной области техники. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим описанные выше полипептиды. Настоящее изобретение дополнительно относится к векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению является частью вектора, например, плазмиды. Такими векторами можно легко манипулировать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и например, их можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно непосредственно или в форме выделенного из него необходимого фрагмента использовать для трансформации эукариотических клеток и интегрировать целиком или частично в геном таких клеток, получая стабильные клетки-хозяева, содержащие необходимую нуклеиновую кислоту в своем геноме. Используемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. При использовании клеток-хозяев предпочтительно, чтобы вектор представлял собой интегрирующий вектор. В качестве альтернативы, вектор может быть эписомально реплицирующимся вектором.
Специалист в данной области техники способен выбрать приемлемые векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению функциональным образом. Чтобы получить экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, специалистам в данной области техники хорошо известно, что последовательности, способные управлять экспрессией, можно функционально связать с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, с получением рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белок или поли
- 16 034639 пептид в экспрессируемом формате. В целом, промоторную последовательность помещают выше последовательностей, которые должны экспрессироваться. Многие векторы экспрессии доступны в данной области, например серии векторов pcDNA и pEF от Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно использовать для получения приемлемых промоторов и/или последовательностей терминатора транскрипции, последовательностей полиаденилирования и т.п. Если последовательность, кодирующая полипептид, представляющий интерес, вставлена правильно относительно последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию кодируемого полипептида, полученная кассета экспрессии пригодна для получения полипептида, представляющего интерес, что называется экспрессией. Последовательности, управляющие экспрессией, могут включать в себя промоторы, энхансеры и т.п., а также их комбинации. Они должны быть способными функционировать в клетке-хозяине, тем самым управляя экспрессией последовательностей нуклеиновых кислот, которые функционально связаны с ними. Специалист в данной области осведомлен о том, что разные промоторы можно использовать для обеспечения экспрессии гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе, вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или получать искусственным путем. Экспрессия нуклеиновых кислот, представляющих интерес, может быть за счет природного промотора или его производного, или за счет полностью гетерологичного промотора (Kaufman, 2000). Некоторые хорошо известные и наиболее используемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают в себя промоторы, полученные из вирусов, таких как аденовирус, например промотор Е1А, промоторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), такие как немедленный ранний (IE) промотор CMV (называемый в настоящем документе как промотор CMV) (получаемый, например, из pcDNA, Invitrogen), промоторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40) (Das et al., 1985), и т.п. Подходящие промоторы можно также получить из эукариотических клеток, такие как промоторы гена металлотионеина (МТ), промотор гена фактора элонгации 1α (EF-1a) (Gill et al., 2001), промотор гена убиквитина С или UB6 (Gill et al., 2001), промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов теплового шока и т.п. Испытание промоторной функции и силы промотора является стандартной практикой для специалиста в данной области техники и в целом может, например, включать в себя клонирование исследуемого гена, такого как lacZ, люцифераза, GFP и т.д., после промоторной последовательности и проверку экспрессии исследуемого гена. Конечно, промоторы можно изменять посредством делеции, добавления, мутации последовательностей в них и проверять на функциональность с обнаружением новых, ослабленных или улучшенных промоторных последовательностей. Согласно изобретению сильные промоторы, которые дают высокие уровни транскрипции в выбранных эукариотических клетках, являются предпочтительными.
Конструкции могут быть трансфицированы в эукариотические клетки (например, растительные, грибковые, дрожжевые или животные клетки) или приемлемые прокариотические системы экспрессии, такие как E.coli, с применением способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых случаях приемлемую последовательность метки (такой как, например, но без ограничения, his-, myc-, strep- или flag-метка) или полного белка (такого как, например, но без ограничения, мальтозу связывающий белок или глутатион^-трансфераза) можно добавить к последовательностям по настоящему изобретению для обеспечения очистки и/или идентификации полипептидов из клеток или супернатанта. Необязательно последовательность, содержащую специфический протеолитический сайт, можно включить для последующего удаления метки путем протеолитического расщепления.
Очищенные полипептиды можно анализировать с помощью спектроскопических способов, известных в данной области техники (например, спектроскопии кругового дихроизма, инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье, ЯМР-спектроскопии или рентгеновской кристаллографии) для исследования наличия необходимых структур, таких как спирали и бета-складчатости. ELISA, Octet и FACS и т.п. можно использовать для исследования связывания полипептидов по настоящему изобретению с нейтрализующими антителами широкого спектра, описанными ранее (CR6261, CR9114, CR8057). Таким образом, можно выбирать полипептиды согласно настоящему изобретению, имеющие правильную конформацию.
Настоящее изобретение дополнительно относится к иммуногенным композициям, содержащим терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из полипептидов и/или нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат полипептиды, содержащие стеблевые домены гемагглютинина из (или на основе) HA одного подтипа гриппа, например на основе HA вируса гриппа, содержащего HA, например из подтипа H1 или H3. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат полипептиды, содержащие стеблевые домены гемагглютинина на основе HA из двух или более различных подтипов гриппа, например, композиции, содержащие одновременно полипептиды, содержащие стеблевые домены гемагглютинина на основе HA из подтипа H1, и полипептиды, содержащие стеблевые домены гемагглютинина на основе HA из подтипа H3.
Иммуногенные композиции предпочтительно дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем контексте выражение фармацевтически приемлемый означает, что носитель в используемых дозах и концентрациях не вызовет нежелательных или опасных эффектов у пациентов, которым его ввели. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны
- 17 034639 из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или инертной среде, с которым вводят композицию. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно, например, использовать в качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов. Точный состав должен соответствовать способу введения. Полипептиды и/или молекулы нуклеиновых кислот предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора. Стерильные растворы получают путем стерильной фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы можно лиофилизировать или разливать по контейнерам для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне от рН 3,0 до рН 9,5, например, от рН 5,0 до рН 7,5.
Настоящее изобретение также относится к полипептидам стеблевого домена HA гриппа, молекулам нуклеиновых кислот и/или векторам, описанным выше, для применения в индуцировании иммунного ответа против белка HA гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования иммунного ответа у пациента, при этом способ включает введение пациенту молекулы полипептида, нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции, описанной выше. Пациент согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой млекопитающее, которое способно инфицироваться возбудителем инфекции, вызывающим заболевание, в частности, вирусом гриппа, или может иным образом получить пользу от индукции иммунного ответа, таким пациентом, например, может быть грызун, например мышь, хорек или домашнее или сельскохозяйственное животное, или примат, кроме человека, или человек. Предпочтительно пациент представляет собой пациента-человека. Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает способы индуцирования иммунного ответа на гемагглютинин (HA) вируса гриппа, в частности, вируса гриппа А группы 1 и/или группы 2, такого как вирус гриппа, содержащий HA из подтипа H1, Н2, H3, Н4, Н5, Н7 и/или H10, и/или вируса гриппа В, у пациента с использованием полипептидов, нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления индуцированный иммунный ответ эффективно предупреждает и/или лечит инфекцию вируса гриппа, вызванную подтипами вируса гриппа А группы 1, и/или группы 2, и/или вирусами гриппа В. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ, индуцированный полипептидами, нуклеиновыми кислотами и/или иммуногенными композициями, описанными в настоящем документе, эффективно предупреждает и/или лечит инфекцию вируса гриппа А и/или В, вызванную двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью подтипами вируса гриппа А и/или В.
Поскольку хорошо известно, что небольшие белки и/или молекулы нуклеиновых кислот не всегда эффективно индуцируют мощный иммунный ответ, может быть необходимо увеличить иммуногенность полипептидов и/или молекул нуклеиновых кислот путем добавления адъюванта. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат или вводятся в комбинации с адъювантом. Адъювант для введения в комбинации с композицией, описанной в настоящем документе, можно вводить до, одновременно с или после введения указанной композиции. Примеры приемлемых адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; масло-эмульсионные композиции (или композиции масло-вводе), в том числе эмульсии скваленвода, такие как MF59 (см., например WO 90/14837); составы сапонина, такие как, например QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, патент США № 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); бактериальные или микробные производные, примерами которых являются монофосфориллипид A (MPL), 3-O-деацетилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, АДФ-рибозилированные бактериальные токсины или их мутанты, такие как термолабильный энтеротоксин LT из B.coli, холерный токсин СТ, коклюшный токсин РТ или столбнячный анатоксин ТТ, Matrix M (Isconova). Кроме того, можно использовать известные иммуностимулирующие технологии, такие как гибридизация полипептидов по настоящему изобретению с белками, известными из уровня техники как повышающие иммунный ответ (например, столбнячный анатоксин, CRM197, rCTB, бактериальные флагеллины или другие), или включение полипептидов в виросомы, или их комбинации. Другими неограничивающими примерами, которые можно применить, являются, например, раскрытые Coffman et al. (2010).
В одном варианте осуществления полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа по настоящему изобретению включены в векторы из вирусоподобных частиц (VLP). VLP обычно содержат вирусный полипептид (полипептиды), как правило, полученный из структурного белка (белков) вируса. Предпочтительно, VLP не способны к репликации. В некоторых вариантах осуществления VLP могут не иметь полного генома вируса или могут содержать часть генома вируса. В некоторых вариантах осуществления VLP не способны инфицировать клетку. В некоторых вариантах осуществления VLP экспрессируют на своей поверхности один или несколько вирусных (например, гликопротеин вирусной поверхности) или невирусных (например, антитело или белок) направляющих фрагментов, известных специалисту в данной области техники.
В конкретном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению включен в виросому. Виросому, содержащую полипептид согласно настоящему изобретению, можно получить с помо
- 18 034639 щью методов, известных специалисту в данной области техники. Например, виросому можно получить путем разрушения очищенного вируса, извлечения генома и повторной сборки частиц с вирусными белками (например, полипептидом стеблевого домена гемагглютинина) и липидами с образованием липидных частиц, содержащих вирусные белки.
Настоящее изобретение также относится к описанным выше полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям для индуцирования иммунного ответа у пациента против гриппа HA, в частности, для применения в качестве вакцины. Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, или векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем документе, таким образом, можно использовать для того, чтобы вызывать нейтрализующие антитела против вирусов гриппа, например, против стеблевой области гемагглютинина вируса гриппа. Настоящее изобретение, в частности, относится к полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям, описанным выше, для применения в качестве вакцины для профилактики и/или лечения заболевания или состояния, вызванного вирусом гриппа А филогенетической группы 1, и/или филогенетической группы 2, и/или вирусом гриппа
В. В одном варианте осуществления вакцину можно использовать для профилактики и/или лечения заболеваний, вызванных двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более различными подтипами филогенетической группы 1 и/или 2 и/или вирусами гриппа В. Полипептиды по настоящему изобретению можно применять после синтеза in vitro или в приемлемой клеточной системе экспрессии, включая бактериальные и эукариотические клетки, или в качестве альтернативы можно экспрессировать in vivo в пациенте, нуждающемся в этом, путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенный полипептид. Такие вакцины нуклеиновых кислот могут принимать любую форму, в том числе голой ДНК, плазмид или вирусных векторов, включая аденовирусные векторы.
Введение полипептидов, молекул нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций согласно изобретению можно выполнить с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие примеры включают в себя парентеральное введение, такое как внутривенное, внутрикожное, чрескожное, внутримышечное, подкожное и т.д., или введение через слизистую оболочку, например, интраназальное, пероральное и т.п. Специалист в данной области будет способен определить различные возможности для введения полипептидов, молекул нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций согласно изобретению с целью индуцирования иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию (или вакцину) вводят более чем один раз, т.е. в так называемом режиме гомологичного прайм-буста. В некоторых вариантах осуществления, где полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию вводят более чем один раз, введение второй дозы можно выполнить через промежуток времени, например, одну неделю или более после введения первой дозы, две недели или более после введения первой дозы, три недели или более после введения первой дозы, один месяц или более после введения первой дозы, шесть недель или более после введения первой дозы, два месяца или более после введения первой дозы, 3 месяца или более после введения первой дозы, 4 месяца или более после введения первой дозы и т.д., вплоть до нескольких лет после введения первой дозы полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции. Кроме того, можно вводить вакцину более двух раз, например три раза, четыре раза и т.д., так что за первым примирующим введением следует более чем одно реиммунизирующее введение. В других вариантах осуществления полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию согласно настоящему изобретению вводят только один раз.
Полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты и/или иммуногенные композиции можно также вводить либо как начальную дозу, либо как повторную дозу в режиме гетерологичного прайм-буста.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы профилактики и/или лечения заболевания вирусом гриппа у пациента с использованием полипептидов, нуклеиновых кислот и/или композиций, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления способ профилактики и/или лечения заболевания вирусом гриппа у пациента включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции, как описано выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, нуклеиновой кислоты и/или композиции, как определено в настоящем документе, которое является эффективным для профилактики, ослабления и/или лечения заболевания или состояния, являющегося результатом инфицирования вирусом гриппа А группы 1 или 2 и/или вирусом гриппа В. Профилактика охватывает ингибирование или снижение распространения вируса гриппа или ингибирование или снижение начала, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфицированием вирусом гриппа. Применяемое в настоящем документе ослабление может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, вирусемии или других поддающихся измерению проявлений инфицирования гриппом.
Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже подвержен состоянию, являющемуся результатом инфицирования вирусом гриппа А группы 1 или группы 2, или вирусом гриппа В, а также тех, у кого инфицирование вирусом гриппа должно быть предотвращено. Полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или композиции по настоящему изобретению, таким образом, можно ввести наивному пациенту, т.е.
- 19 034639 пациенту, который не страдает заболеванием, вызванным инфекцией вируса гриппа, или не был и в настоящее время не инфицирован вирусом гриппа, или пациентам, которые уже являются и/или были инфицированы вирусом гриппа.
В одном варианте осуществления профилактика и/или лечение могут быть направлены на группы пациентов, которые восприимчивы к инфекции вируса гриппа. Такие группы пациентов включают без ограничений, например, пожилых (например, >50 лет, >60 лет и предпочтительно >65 лет), молодых (например, <5 лет, <1 года), госпитализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусным соединением, но проявили недостаточный противовирусный ответ.
В другом варианте осуществления полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или иммуногенные композиции можно вводить пациенту в комбинации с одним или несколькими другими активными средствами, такими как существующие или будущие противогриппозные вакцины, моноклональные антитела и/или противовирусные средства и/или антибактериальные и/или иммуномодулирующие средства. Одно или несколько других активных средств может быть полезным в лечении и/или профилактике заболевания вирусом гриппа или может ослабить симптом или состояние, связанное с заболеванием вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько других активных средств представляют собой обезболивающие, жаропонижающие препараты или методы лечения, которые облегчают или оказывают помощь при дыхании.
Режимы дозировки полипептидов и/или молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно скорректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Приемлемый диапазон дозировок может, например, составлять 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 1-50 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг массы тела. Точная дозировка полипептидов и/или молекул нуклеиновой кислоты, которые должны быть использованы, будет, например, зависеть от пути введения и серьезности инфекции или заболевания, вызванного ей, и должна быть выбрана в соответствии с решением врача и состоянием каждого пациента. Например, эффективные дозы варьируют в зависимости от целевого сайта, физиологического состояния пациента (в том числе возраста, массы тела, здоровья) и того, является ли обработка профилактической или терапевтической. Как правило, пациентом является человек, млекопитающие, кроме человека, в том числе трансгенные млекопитающие, также могут подвергаться лечению. Лечебные дозировки оптимально титруют для оптимизации безопасности и эффективности.
Полипептиды по настоящему изобретению также можно использовать для проверки связывания моноклональных антител, выявленных в качестве потенциальных терапевтических кандидатов.
Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностического средства, например, для проверки иммунного статуса индивидуума путем определения способности антител в сыворотке такого индивида к связыванию с полипептидом по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу диагностики in vitro для обнаружения присутствия инфекции вируса гриппа у пациента, при этом указанный способ включает следующие этапы: а) контактирование биологического образца, полученного из указанного пациента, с полипептидом согласно настоящему изобретению и b) обнаружение присутствия комплексов антиген-антитело.
Полипептиды по настоящему изобретению также можно использовать для идентификации новых связывающих молекул или улучшения существующих связывающих молекул, таких как моноклональные антитела и противовирусные средства.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами и фигурами. Примеры не предусмотрены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Примеры
Пример 1. Подготовка новых стеблевых полипептидов.
В РСТ/ЕР2012/073706 раскрыты полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, композиции и вакцины, а также способы их применения в области профилактики и/или лечения гриппа. В настоящем документе мы описываем дополнительные последовательности полипептидов стеблевого домена, полученные из полноразмерного HA из H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Новые полипептиды стеблевого домена получают путем сайт-направленной мутации в H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) и представляют нейтрализующий эпитоп гриппа широкого спектра для CR6261 (Throsby et al., 2009; Ekiert et al. 2010) и/или CR9114.
H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) получен из полноразмерного HA из H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1) посредством следующих этапов.
1) Удаление сайта расщепления в HA0. Расщепление HA дикого типа в данном сайте приводит к образованию HA1 и HA2. Удаления можно достичь посредством мутации R на Q в положении Р1 (см., например, Sun et al., 2010 для объяснения номенклатуры сайта расщепления (положение 343 в SEQ ID NO: 1).
2) Удаление головного домена путем делеции аминокислот с 53 по 320 в SEQ ID NO: 1. Оставшиеся N- и С-концевые части последовательности соединяли с помощью гибкого линкера из четырех остатков, GGGG.
- 20 034639
3) Повышение растворимости петли (между А-спиралью и спиралью CD), образованной с помощью (эквивалентных) остатков с 402 по 418 в H1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1) для того, чтобы одновременно повысить стабильность предгибридизационной конформации и дестабилизировать постгибридизационную конформацию модифицированного НА. В H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) мутации F406S, V409T, F413G и L416S (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) вводили.
4) Введение дисульфидного мостика между аминокислотами в положении 324 и 436 в H1 A/Brisbane/59/2007; этого достигают посредством введения мутаций R324C и Y436C. (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).
5) Введение полученной из GCN4 последовательности MKQIEDKIEEIESKQ (SEQ ID NO: 5), которая известна, как тримеризующая, в положение 419-433 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В других вариантах осуществления последовательность трансмембранного и внутриклеточного домена была удалена от положения (или эквивалентного ему, как определено по выравниванию последовательности) 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 или 530 из HA2 до С-конца HA2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), так что секретируемый (растворимый) полипептид получают после экспрессии в клетках. Растворимый полипептид можно дополнительно стабилизировать путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е. последовательность-фолдон AYVRKDGEWVLL (SEQ ID NO: 3), факультативно присоединенную посредством короткого линкера, как описано выше. Линкер может факультативно содержать сайт расщепления для последующей обработки согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки и обнаружения растворимой формы можно необязательно добавлять последовательность метки, например, гистидиновой метки (ННННННН (SEQ ID NO: 20) или НННННН (SEQ ID NO: 21)) или FLAG-метки (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22) или их комбинации, необязательно присоединенной посредством коротких линкеров. Линкер может факультативно содержать сайт (часть сайта) протеолитического расщепления, например, LVPRGS (SEQ ID NO: 23) (тромбин) или IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X) для последующей обработки согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Обработанные белки также охвачены в настоящем изобретении.
Примером такой С-концевой последовательности, объединяющей FLAG-метку, сайт расщепления тромбина, фолдон и последовательность His, является SEQ ID NO: 4 FLAG-тромбин-фолдон-His. Эту последовательность объединяли с растворимой формой H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) последовательности для создания исходной последовательности (SEQ ID NO: 6), которую использовали для создания новых полипептидов по настоящему изобретению путем мутагенеза. Эта последовательность не содержит лидерную последовательность, соответствующую аминокислотам 1-17 в SEQ ID NO: 1 и 2.
Полипептиды стеблевого домена создают посредством делеции части последовательности гемагглютинина, которая кодирует головной домен молекулы, и повторного соединения N- и С-концевых частей последовательности по обе стороны от делеции посредством линкера, как описано в РСТ/2012/073706 и выше. Удаление головного домена оставляет часть молекулы, которая была ранее защищена от водного растворителя, открытой, потенциально дестабилизируя структуру полипептидов по настоящему изобретению. По этой причине остатки в В-петле (в частности, аминокислотный остаток 406 (F и S в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно), 409 (V и Т), 413 (F и G) и 416 (L и S) мутировали в различных комбинациях с использованием исходной последовательности SEQ ID NO: 6 в качестве исходной точки. SEQ ID NO: 6 создавали из H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) путем удаления лидерной последовательности и замещения остатков 520-565 последовательностью Flag-тромбин-фолдон-his (SEQ ID NO: 4).
Аналогичным образом, в области вокруг гибридного пептида ряд гидрофобных остатков открывают для растворителя, что обусловлено тем фактом, что в отличие от нативного полноразмерного НА полипептиды по настоящему изобретению не могут быть расщеплены и проходят ассоциированное конформационное изменение, которое погружает гидрофобный гибридный пептид во внутреннюю часть белка. Чтобы решить эту проблему, некоторые или все из остатков 1337, 1340, F352 и 1353 в SEQ ID NO: 2 также мутировали.
Спираль А из НА представляет собой важную часть эпитопов в нейтрализующих эпитопах широкого спектра для CR6261, CR9114 и FI6.v3. Аминокислотный остаток М402 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) находится на С-конце этой спирали и для дополнительной стабилизации спиральной структуры этот остаток также стал мишенью при создании новых полипептидов по настоящему изобретению. Два различных набора мутантных полипептидов раскрыты в табл. 1.
- 21 034639
Таблица 1. Мутации, созданные в SEQ ID NO: 6. Соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 1 (полноразмерный, wt HA) и SEQ ID NO: 6 также указаны.
Набор 1 ______________________________________________________________
| Положение | остаток | ||
| SEQ ID | SEQ ID | введенные аминокислоты | |
| NO: 1 | NO: 6 | ||
| 337 | I | I | E, I, К, V |
| 340 | I | I | I, K, R, T |
| 352 | F | F | D, F, V, Y |
| 353 | I | I | I, K, R, T |
| 402 | M | M | E, K, Μ, V |
| 406 | F | s | F, I, N, T, Y, S |
| 409 | V | T | A, G, I, R, T, V |
| 413 | F | G | F, I, N, S, T, Y, G |
| 416 | L | S | Η, I, L, N, R, S |
Набор 2
| Положение | остаток | |||
| SEQ | ID | SEQ ID | введенные аминокислоты | |
| NO: | 1 | NO: 6 | ||
| 337 | I | I | A, E, I, К, T, V | |
| 340 | I | I | F, I, N, S, T, Y | |
| 352 | F | F | A, D, F, I, N, S, T, V, Y | |
| 353 | I | I | E, G, I, K, R, V | |
| 402 | M | M | M, R, T | |
| 406 | F | s | F, H, L, Y, | |
| 409 | V | T | F, I, S, T | |
| 413 | F | G | E, K, Μ, V | |
| 416 | L | S | I, L, R, S |
Пример 2. Обнаружение экспрессии и связывания полипептида с нейтрализующими антителами широкого спектра.
Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, трансформировали в Pichia pastoris или трансфицировали в клетки HEK293F с использованием протоколов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Конструкции, использованные для экспрессии в клетках млекопитающих, содержали лидерную последовательность HA (остатки 1-17 в SEQ ID NO: 1 и 2), тогда как в конструкциях, использованных для экспрессии в P.pastoris, лидерную последовательность HA заменяли лидерной последовательностью альфа-фактора дрожжей (SEQ ID NO: 7). Таким способом экспрессированный белок направляют в среду для культивирования клеток, позволяя определить связывание и экспрессию без дополнительной очистки полипептидов по настоящему изобретению. Все последовательности содержали С-концевую последовательность FLAG-фолдон-HIS (SEQ ID NO: 4).
Связывание моноклональных антител (CR6261, CR9114, CR8020) с полипептидами по настоящему изобретению определяли с помощью ELISA. Для этого планшеты для ELISA обрабатывали в течение ночи 2 мкг/мл раствора моноклонального антитела (20 мкл/лунку) при 4°C. После удаления раствора антитела оставшуюся поверхность блокировали 4% раствором порошка обезжиренного сухого молока в PBS в течение минимум 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшетов 20 мкл среды для культивирования клеток (чистой или разбавленной) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты для ELISA промывали и добавляли 20 мкл раствора антитела против FLAG-HRP (Sigma A8952, разбавленное в 2000 раз в 4% обезжиренном сухом молоке в PBS-Tween). После инкубации (1 ч при комнатной температуре) планшеты еще раз промывали и добавляли 20 мкл люминесцентного субстрата (Thermoscientific C#34078) для обнаружения сигнала. В качестве альтернативы колориметрический способ регистрации можно применять для обнаружения сигнала.
Экспрессию полипептидов по настоящему изобретению определяли в анализе гомогенной флуоресценции с временным разрешением (для общего описания см., например, Degorce et al., Curr. Chem. Genomics 2009 3: 22-32). Для этого смесь меченого тербием (Tb) моноклонального антитела против FLAG (донор) и меченого А1еха488 моноклонального антитела против His (акцептор) (раствор HTRF) готовили
- 22 034639 путем добавления 210,5 мкл антитела против FLAG-ТВ (исходный раствор 26 мкг/мл) и 1,68 мл антитела против HIS-488 (исходный раствор 50 мкг/мл) к 80 мл смеси 1 к 1 культуральной среды и 50 мМ HEPES + 0,1% BSA. 19 мкл раствора HTRF добавляли в каждую лунку планшета для ELISA и добавляли 1 мкл культуральной среды. При возбуждении и после задержки, чтобы обеспечить распад мешающих короткоживущих фоновых сигналов, возникающих из других соединений (белков, компонентов среды и т.д.), определяли отношение флуоресцентного излучения при 520 и 665 нм. Это является мерой общего содержания белка в образце и используется для нормализации сигналов связывания mAb между различными экспериментами.
Полипептиды по настоящему изобретению, перечисленные в табл. 4 и 5, экспрессировали в P.Pastoris, следуя протоколам, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Культуральную среду собирали и связывание с CR6261, связывание и экспрессию полипептидов стеблевого домена определяли, как описано выше. Поскольку ответ в анализе связывания сопоставим с концентрацией экспрессированного белка, сигнал связывания в ELISA нормализовали для экспрессии белка путем сравнения отношения сигнала связывания к сигналу в анализе HTRF для каждой экспрессированной последовательности. Все экспрессированные белки демонстрируют более высокое отношение связывания CR626 к сигналу HTRF по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO: 6.
Полипептиды по настоящему изобретению, перечисленные в табл. 6, экспрессировали в клетках HEK293F, следуя протоколам, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Культуральную среду собирали и связывание с CR6261, связывание и экспрессию полипептидов стеблевого домена определяли, как описано выше. Отношение связывания CR6261 к сигналам HTRF рассчитывали и сравнивали с отношением, рассчитанным для исходной последовательности SEQ ID NO: 6. Результаты перечислены в табл. 6; все экспрессированные белки демонстрируют более высокое отношение, указывая, что стеблевые полипептиды по изобретению показывают повышенное связывание CR6261.
Пример 3. Очистка и определение параметров полипептидов по настоящему изобретению.
Для дополнительного описания полипептидов по настоящему изобретению иммуногены 127Н1 (SEQ ID NO: 55), 86В4 (SEQ ID NO: 56), 74H9 (SEQ ID NO: 57), 6E12 (SEQ ID NO: 58) и 55G7 (SEQ ID NO: 59) культивировали и очищали до гомогенности. Для того чтобы получить высоко очищенный препарат полипептида по настоящему изобретению, клетки HEK293F трансфицировали вектором экспрессии pcDNA2004, содержащим гены, кодирующие растворимые формы 127Н1 (SEQ ID NO: 55), 86В4 (SEQ ID NO: 56), 74H9 (SEQ ID NO: 57), 6E12 (SEQ ID NO: 58) и 55G7 (SEQ ID NO: 59). Растворимые формы создавали в данном случае путем замены остатка 519-565 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) последовательностью RSLVPRGSPGHHHHHH (SEQ ID NO: 69). Специалисту в данной области техники будет понятно, что лидерная последовательность (или сигнальная последовательность), которая направляет транспорт белка в ходе производства (соответствующая аминокислотам 1-17 из SEQ ID NO: 1), не будет присутствовать в секретированном конечном полипептиде. Аминокислотные последовательности растворимых секретированных белков даны в виде SEQ ID NO: 65 до 69.
Для получения полипептидов по настоящему изобретению 1,0х106 клеток/мл высеивали путем осаждения клеток HEK293F (Invitrogen) при 300 g в течение 5 мин и ресуспендирования в 300 мл подогретой среды Freestyle™ на колбу SF1000. Эту культуру инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 10% СО2 при 110 об/мин в инкубаторе Multitron. Через 1 ч плазмидную ДНК пипетировали в 9,9 мл среды Optimem до концентрации 1,0 мкг/мл в 300 мл культурального объема. Параллельно 440 мкл 293fectin® пипетировали в 9,9 мл среды Optimem и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Через 5 мин смесь плазмидной ДНК/Optimem добавляли к смеси 293fectin®/Optimem и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубации смесь плазмидной ДНК/293fectin® добавляли по каплям к клеточной суспензии. Трансфицированную культуру инкубировали при 37°C, 10% СО2 и 110 об/мин в инкубаторе Multitron. На 7-й день клетки отделяли от культуральной среды центрифугированием (30 мин при 3000 g), в то время как супернатант, содержащий растворимые полипептиды по настоящему изобретению, фильтровали через бутылочный фильтр 0,2 мкм для дополнительной обработки.
Для очистки приблизительно 1400 мл супернатанта культуры клеток, трансфицированных генами, кодирующими растворимые формы (как описано выше) полипептидов по настоящему изобретению 127Н1 (SEQ ID NO: 55), 86В4 (SEQ ID NO: 56), 74H9 (SEQ ID NO: 57), 6E12 (SEQ ID NO: 58) или 55G7 (SEQ ID NO: 59), наносили на колонку 24 мл Ni Sepharose HP, предварительно уравновешенную в промывочном буфере (20 мМ TRIS, 500 мМ NaCl, pH 7,8). После этапа промывки с 10 мМ Imidaze в промывочном буфере связанные полипептиды по настоящему изобретению элюировали ступенчатым градиентом 300 мМ имидазола в промывочном буфере. Пики элюента собирали, буфер меняли, концентрировали и наносили на эксклюзионную колонку для дополнительной очистки (Superdex 200). Фракции собирали во время элюирования и анализировали на содержание белка с помощью SDS-PAGE и вестерн-блота (с использованием моноклонального антитела, специфичного для гистидиновых меток). Фракции, содержащие очищенные полипептиды по настоящему изобретению, собирали и использовали для дополнительного анализа. Чистоту определяли с помощью эксклюзионной хроматографии и она составляла более 90% во всех случаях. Характеристики процедур очистки перечислены в табл. 8.
- 23 034639
Для анализа реакции связывания между полипептидами по настоящему изобретению и для подтверждения присутствия конформационных эпитопов для CR6261 и CR9114 исследовали комплексообразование этих антител с очищенным белком с использованием интерферометрии в биослое (Octet Red384, Forte Bio). Для этого биотинилированные CR6261, CR9114 иммобилизовали на покрытых стрептавидином сенсорах, на которые впоследствии воздействовали сначала раствором очищенного полипептида по настоящему изобретению для измерения скорости ассоциации, а затем промывочным раствором для измерения скорости диссоциации. Оба иммобилизованных CR6261 и CR9114 распознают полипептиды по настоящему изобретению, как свидетельствуют четкие ответы после воздействия растворимой формы полипептидов по настоящему изобретению. Чтобы оценить константу диссоциации для взаимодействия связывания проводили титрование с использованием серий 2-кратного разведения. На сенсоры, содержащие иммобилизованное CR6261, воздействовали растворами, содержащими растворимые полипептиды по настоящему изобретению в концентрациях 750, 375, 163, 81, 40, 20 и 10 нМ, соответственно, кроме случая с очищенным s55G7 (SEQ ID NO: 68), где использовали диапазон концентраций 2000, 1000, 500, 250, 125, 63 и 31 нМ. Аналогичным образом, на сенсоры, содержащие иммобилизованное CR9114, воздействовали растворами, содержащими растворимые полипептиды по настоящему изобретению, в концентрациях 300, 150, 75, 38, 19, 9 и 5 нМ соответственно. Во всех случаях записывали конечный ответ через 4000 с, строили график зависимости от концентрации полипептида и выполняли аппроксимацию к модели связывания 1:1 в равновесном состоянии для расчета кажущейся константы диссоциации Kd (см. фиг. 2А-Е). Значения, определенные таким образом, перечислены в табл. 8.
Связывание между полипептидами по настоящему изобретению S127H1 (SEQ ID NO: 66), s86B4 (SEQ ID NO: 67), s74H9 (SEQ ID NO: 65), s6E12 (SEQ ID NO: 69) и s55G7 (SEQ ID NO: 68) и Fabфрагментами CR6261, CR9114 и, в качестве контроля, CR8020 исследовали с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоракурсным светорассеянием (SEC-MALS). Эта технология позволяет одновременно разделять и оценивать размер молекул для различных химических соединений и/или комплексов. Результаты показаны в фиг. 3A-E и суммированы в табл. 9. Данные указывают, что полипептиды по настоящему изобретению являются мономерными и образуют комплекс 1:1 с Fab-фрагментами CR6261 и CR9114, но не CR8020. Это согласуется со специфичностью реакций связывания Fab-фрагментов, поскольку CR6261 и CR9114 связываются с НА, полученными из группы 1, тогда как CR8020-№t.
В заключение, мы показали, что растворимые формы полипептидов по настоящему изобретению 127Н1 (SEQ ID NO: 55), 86В4 (SEQ ID NO: 56), 74H9 (SEQ ID NO: 57), 6E12 (SEQ ID NO: 581) и 55G7 (SEQ ID NO: 59) можно получить и очистить до гомогенности. Очищенные растворимые полипептиды по настоящему изобретению способны связывать нейтрализующие моноклональные антитела широкого спектра CR6261 и CR9114 с высокой аффинностью, подтверждая наличие соответствующих нейтрализующих эпитопов в этих полипептидах стеблевого домена.
Пример 4. Оценка профилактической эффективности полипептидов по настоящему изобретению на модели леталвного контролвного заражения гриппом.
Для того чтобы оценить профилактическую эффективность полипептидов по настоящему изобретению на модели летального контрольного заражения гриппом, группы из 10 самок мышей BALB/c (возрастом 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с 3-недельными интервалами с 30 мкг очищенного s86B4 (SEQ ID NO: 67) и s74H9 (SEQ ID NO: 65), усиленного 10 мкг Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.m. вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышам проводили контрольное заражение с 25xLD50 гетерологичного вируса контрольного заражения (H1N1 A/NL/602/09) и ежедневно контролировали (выживаемость, вес, клинические баллы) в течение 3 недель. Сыворотку крови до контрольного заражения проверяют в анализах ELISA на связывание с полипептидом по настоящему изобретению, использованным для иммунизации (для проверки правильности иммунизации), на связывание с растворимым полноразмерным НА из H1N1 A/Brisbane/59/07 и на конкуренцию за связывание с полноразмерным НА с нейтрализующим антителом широкого спектра - моноклональным антителом CR9114 (для определения того, связываются ли индуцированные антитела рядом с нейтрализующим эпитопом широкого спектра для CR9114). Результаты показаны в фиг. 4А и В.
Результаты показывают, что эксперимент обоснован, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибали от инфекции в или до 8-го дня после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена. В отличие от мышей, обработанных PBS, 4 из 10 мышей, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению s86B4 (SEQ ID NO: 67) или s74H9 (SEQ ID NO: 65), выжили после летального контрольного заражения. Это приводит к увеличенному времени выживаемости и сниженному клиническому показателю для групп, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению, по сравнению с контрольной группой с PBS.
Данные ELISA (см. фиг. 4В) с использованием когнатного антигена (т.е. либо s86B4, либо s74H9) или полноразмерного HA в качестве антигена указывают, что оба полипептида по настоящему изобрете
- 24 034639 нию, s74H9 и s86B4, являются иммуногенными и индуцируют антитела, которые способны распознавать полноразмерный HA.
Для дальнейшего понимания иммунологического ответа на иммунизацию выполнили ELISA с конкурентным связыванием. С этой целью планшет, связывающий полноразмерный HA, инкубируют с образцами сыворотки крови в серийном разведении, после чего добавляют бИШМ-биотин в заранее определенной концентрации. После дополнительной инкубации оценивают количество связанного CR9114биотина. Данные анализируют с использованием линейной регрессии 0D против log разведения, выраженного как наклон OD (ΔOD/10-кратное разведение). Данные показывают, что антитела, которые способны конкурировать за связывание с нейтрализующим антителом широкого спектра CR9114, индуцируют путем иммунизации полипептидами по настоящему изобретению. Для сравнения уровни конкуренции с немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающим моноклональным антителом CR8020, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике.
В заключение, эти данные показывают, что иммунизация полипептидами по настоящему изобретению s86B4 (SEQ ID NO: 67) или s74H9 (SEQ ID NO: может защищать мышей от летального инфицирования вирусом гриппа. Оба полипептида являются иммуногенными, индуцируют антитела, которые могут связываться с полноразмерным HA, и по меньшей мере часть этих антител связывается на или поблизости от нейтрализующего эпитопа широкого спектра для моноклонального антитела CR9114.
Пример 5. Оценка профилактической эффективности другого полипептида по настоящему изобретению на модели летального контрольного заражения гриппом.
Для того чтобы оценить профилактическую эффективность другого полипептида по настоящему изобретению s127H1 (SEQ ID NO: 66), на модели летального контрольного заражения гриппом группы из 10 самок мышей BALB/c (возрастом 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с 3-недельными интервалами 30 мкг очищенного s127H1, усиленного 10 мкг Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.m. вводили нейтрализующее антитело широкого спектра - моноклональное антитело CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышам проводили контрольное заражение с 25xLD50 гетерологичного вируса контрольного заражения (H1N1 A/Puerto Rico/8/34) и ежедневно контролировали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель. Сыворотку крови до контрольного заражения проверяют в анализах ELISA на связывание с полипептидом по настоящему изобретению s127H1, который использовали для иммунизации (для проверки правильности иммунизации), на связывание с растворимым полноразмерным HA из H1N1 A/Brisbane/59/07 и на конкуренцию за связывание с полноразмерным HA с нейтрализующим антителом широкого спектра - моноклональным антителом CR9114 (для определения того, связываются ли индуцированные антитела рядом с нейтрализующим эпитопом широкого спектра для CR9114). Результаты показаны в фиг. 5А и В.
Результаты показывают, что эксперимент обоснован, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибали от инфекции на 7-й день после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена. В отличие от мышей, обработанных PBS, 7 из 10 мышей, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению s127H1 (SEQ ID NO: 66), выжили после летального контрольного заражения. Это привело к увеличенной пропорции выживаемости, увеличенному времени выживаемости и сниженному клиническому показателю для групп, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению s127H1, по сравнению с контрольной группой с PBS.
Данные ELISA с использованием s127H1 или растворимого полноразмерного НА в качестве антигена указывают, что полипептид по настоящему изобретению s127H1 является иммуногенным и индуцирует антитела, которые способны распознавать полноразмерный HA (см. фиг. 5В). Для дальнейшего понимания иммунологического ответа на иммунизацию выполняли ELISA с конкурентным связыванием. С этой целью планшет, связывающий полноразмерный HA, инкубируют с образцами сыворотки крови в серийном разведении, после чего добавляют CR9114-биотин в заранее определенной титрованной концентрации. После дополнительной инкубации оценивают количество связанного CR9114-биотина с использованием конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена согласно протоколам, хорошо известным в уровне техники. Данные анализируют с использованием линейной регрессии OD против log разведения, выраженного как наклон OD (ΔOD/10-кратное разведение). Данные показывают, что антитела, которые способны конкурировать за связывание с нейтрализующим антителом широкого спектра CR9114, индуцируют путем иммунизации полипептидами по настоящему изобретению, на что указывают повышенные уровни конкуренции, наблюдаемые в фиг. 5В. Для сравнения уровни конкуренции с немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающим моноклональным антителом CR8020, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике.
В заключение, мы показали, что иммунизация полипептидом по настоящему изобретению s127H1 (SEQ ID NO: 66) может защищать мышей от летального инфицирования гриппом. Полипептид является иммуногенным, индуцирует антитела, которые могут связываться с полноразмерным HA, и по меньшей
- 25 034639 мере часть этих антител связывается на или поблизости от нейтрализующего эпитопа широкого спектра для моноклонального антитела CR9114.
Пример 6. Анализ улучшенных связывающих веществ для CR6261 из набора 1 и набора 2.
Для дальнейшего понимания того, какие последовательности могут приводить к повышенному связыванию CR6261 по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO: 6, последовательности, перечисленные в табл. 4 и 5, анализировали дополнительно. С этой целью для каждого намеченного положения рассчитывали относительную частоту каждой из вариабельных аминокислот, присутствующих в наборе улучшенных связывающих веществ, и сравнивали с ожидаемой частотой, если не было никакого предпочтения для любой из вариабельных аминокислот (см. фиг. 6 и 8 для последовательностей из набора 1 и 2, соответственно). Данные показывают, что некоторые аминокислоты более распространены в определенных положениях в последовательностях, которые показывают улучшенное связывание CR6261.
Как в наборе 1, так и 2, наблюдают высокую распространенность для Met в положении 402 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) в последовательностях с улучшенным связыванием, хотя в наборе 1 также наблюдают Val в некоторых случаях. Аналогичным образом, в положении 352 высокую распространенность ароматических аминокислот Phe и Tyr, в положении 416 повышенную распространенность Ser (хотя и не очень стабильно в наборе 1) и для положения 337 повышенную распространенность Lys наблюдают в обоих наборах. Следует отметить, что Ser в положении 416 вводит предполагаемый сайт Nгликозилирования в Asn414. Кроме того, в положении 340 Asn высоко распространен в улучшенных связывающих веществах для CR6261 в наборе 2, в то время как в наборе 1 Thr является более распространенным; обе мутации вводят предполагаемый сайт гликозилирования в положении 340: Asn приводит к появлению предполагаемого сайта N-гликозилирования, тогда как Thr приводит к появлению предполагаемого сайта O-гликозилирования. В положении 353 Thr высоко распространен в улучшенных связывающих веществах из набора 1, в то время как в улучшенных связывающих веществах из набора 2 самой распространенной аминокислотой является Val. В положениях 406 и 409 наиболее распространенными аминокислотами в улучшенных связывающих веществах для CR6261 являются гидрофобные: в положении 406 наиболее распространенными являются Ile и Phe (набор 1), а также Phe и Leu (набор 2), в положении 409 наиболее распространенными являются Не и Val (набор 1), а также Phe и Ile (набор 2). Наконец, в положении 413 Phe является наиболее распространенной аминокислотой среди улучшенных связывающих веществ для CR6261 из набора 1, в то время как Glu является наиболее распространенным среди улучшенных связывающих веществ из набора 2.
Последовательности улучшенных связывающих веществ для CR6261 дополнительно анализировали с тем, чтобы определить, были ли некоторые комбинации аминокислот более распространены среди улучшенных связывающих веществ для CR6261, чем другие. С этой целью ряд улучшенных связывающих последовательностей, содержащих определенную комбинацию аминокислот, обсчитывали и строили на графике, как показано на фиг. 7А, В (улучшенные связывающие вещества из набора 1) и фиг. 9А, В (набор 2). Данные организовывали в соответствии с различными областями, рассмотренными в мутантных наборах полипептидов, т.е. область гибридного пептида (остаток номер 337, 340, 352 и 353; фиг. 7А и 9А для улучшенных связывающих веществ из набора 1 и 2, соответственно) и В-петля (остаток номер 406, 409, 413 и 416; фиг. 7В и 9В). В связи с очень высокой распространенностью Met в положении 402, это положение не включали в анализ для выявления часто встречающихся комбинаций, так как почти все комбинации других положений с положением 402 содержат Met.
Среди улучшенных связывающих веществ для CR6261 из набора 1 комбинации либо Phe, либо Tyr в положении 352 либо с Ile, либо с Thr в положении 353 являются наиболее распространенными (области в рамке на фиг. 7А). В отношении комбинаций аминокислот в области В-петли Не в положении 406 в сочетании либо с Phe, либо с Tyr (т.е. ароматическая аминокислота) в положении 413 и Tyr в положении 406 в сочетании с N в положении 413 показывают увеличенную распространенность среди улучшенных связывающих веществ для CR6261 (области в рамке на фиг. 7В).
Для анализа последовательностей улучшенных связывающих веществ для CR6261 среди полипептидов из набора 2 с акцентом на области гибридного пептида только последовательности, содержащие либо Phe, либо Tyr в положении 352, принимали во внимание. Наибольшее распространение среди улучшенных связывающих веществ для CR6261 с Phe или Tyr в положении 352 имеют последовательности с Asn в положении 340 (см. область в рамке на фиг. 9А). Для области В-петли последовательности с Phe, Leu или Tyr в положении 406 в комбинации с Glu, Met или Val в положении 413 (области в рамке на фиг. 9В) являются наиболее распространенными среди улучшенных связывающих веществ для CR6261.
В заключение, анализ показывает, что в области гибридного пептида введение Thr в положении 353, в частности, в комбинации с ароматическим остатком (Phe или Tyr) в положении 352, может улучшать связывание CR6261 с растворимыми полипептидами по настоящему изобретению. Кроме того, Lys в положении 337 или введение предполагаемого сайта N-гликозилирования путем введения Asn в положении 340 также может вносить вклад в улучшение связывания CR6261. В области В-петли большой гидрофобный остаток (Phe, Tyr, Leu или Ile) может способствовать улучшению связывания с CR6261. В частности, Phe, Leu или Tyr в положении 406 в комбинации с Glu, Met или Val в положении 413 может
- 26 034639 улучшать связывание с CR6261. Полипептиды по настоящему изобретению, содержащие эти остатки в описанных положениях, представляют собой предпочтительные варианты осуществления изобретения.
Таблица 2. Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойства
Аминокислота
3буквенная
Аланин
Аргинин
Arg
Аспарагин
Азп
Аспарагиновая кислота
Цистеин
Суз
Глутаминовая кислота
Глутамин
Gin
Глицин
Gly
Гистидин
Изолейцин
Лейцин
Лизин
Lys
Полярность боковой цепи
Неполярная
Полярная
Полярная
Полярная
Неполярная
Полярная
Полярная
Неполярная
Полярная
Неполярная
Неполярная
Полярная
Метионин
Met
Неполярная
Фенилаланин
Phe
Неполярная
Пролин
Pro
Неполярная
Серин
Полярная
Треонин
Thr
Полярная
Триптофан
Тгр
Тирозин
Туг
Валин
Vai
Неполярная
Полярная
Неполярная
Заряд боковой цепи (pH 7,4)
Нейтральный
Положительный
Нейтральный
Отрицательный
Нейтральный
Отрицательный
Нейтральный
Нейтральный
Положительная нейтральная
Нейтральный
Нейтральный
Положительный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
Нейтральный
- 27 034639
Таблица 3. Выравнивание последовательности для последовательностей H1 согласно специфическим вариантам осуществления изобретения
| 1 . | A/Solomon Islands/6/2003 (H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 25) |
| 2 . | A/Brisbane/59/2007 (H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 1) |
| 3 . | А/New Caledonia/20/1999(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 26) |
| 4 . | A/California/07/2009 (H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 27) |
| 5. | A/swine/Hubei/Sl/2009(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 28) |
| 6. | А/swine/Haseluenne/1DT2 617/2003(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 29) |
| 7 . | A/NewYork/8/2006(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 30) |
| 8 . | A/SolomonIslands/3/2006(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 31) |
| 9. | А/NewYork/146/2000(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 32) |
| 10 . | A/NewYork/653/1996(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 33) |
| 11 . | A/Beijing/262/1995(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 34) |
| 12 . | A/Texas/36/1991(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 35) |
| 13 . | А/Singapore/6/1986(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 36) |
| 14 . | A/Chile/1/1983(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 37) |
| 15. | A/Baylor/11515/1982(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 38) |
| 16. | А/Brazil/11/1978(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 39) |
| 17 . | A/USSR/90/1977(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 40) |
| 18 . | A/NewJersey/8/1976(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 41) |
| 19. | А/Denver/1957(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 42) |
| 20 . | A/Albany/4835/1948(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 43) |
| 21 . | A/FortMonmouth/1/1947(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 44) |
- 28 034639
| 22 . | А/Cameron/1946(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 45) |
| 23. | A/Weiss/1943(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 46) |
| 24 . | A/Iowa/1943(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 47) |
| 25. | А/Bellamy/1942(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 48) |
| 26. | A/PuertoRico/8/1934(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 49) |
| 27 . | A/WSN/1933(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 50) |
| 28 . | A/SouthCarolina/1/1918(H1N1) | (SEQ | ID | NO: | 51) |
| 1. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST | DTVDTVLEKN ' | VTVTHSVNLL |
EDSHNGKLCL 60
2. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
ENSHNGKLCL 60
3. MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCL 60
4. MKAILWLLY TFATANADTL CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDKHNGKLCK 60
5. MEAKLFVLFC AFTALKADTF CVGYHANYST HTVDTILEKN VTVTHSVNLL
ENSHNGKLCS 60
6. MEAKLFVLFC AFTALKADTI CVGYHANNST DTVDTILEKN VTVTHSINLL
ENNHNGKLCS 60
7. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCL 60
8. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCL 60
9. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCR 60
10. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCR 60
11. MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCL 60
12. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCR 60
13. MKAKLLVLLC AFTATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDSHNGKLCR 60
14. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
EDNHNGKLCK 60
15. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
- 29 034639
EDSHNGKLCR 60
| 16 . MKAKLLVLLC | ALSATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 17. MKAKLLVLLC | ALSATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 18 . MKAKLLVLLC | AFTATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 19. MKAKLLILLC | ALSATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 2 0 . MKAKLLVLLC | ALSATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 21. MKAKLLILLC | ALTATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 22. MKAKLLILLC | ALSATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 23. MKARLLVLLC | ALAATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTILEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 24. MKARLLVLLC | ALAATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 25. MKARLLVLLC | AIAATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTILEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 26. MKANLLVLLC | ALAAADADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | ||||
| 27. MKAKLLVLLY | AFVATDADTI | CIGYHANNST | DTVDTIFEKN | VAVTHSVNLL |
| EDRHNGKLCK 60 | ||||
| 2 8 . MEARLLVLLC | AFAATNADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL |
| EDSHNGKLCR 60 | . . ***. ** | ******** *** | :**..*** * . * | ******* * . |
| 1 . LKGIAPLQLG | NCSVAGWILG | NPECELLISR | ESWSYIVEKP | NPENGTCYPG |
| HFADYEELRE 120 | ||||
| 2 . LKGIAPLQLG | NCSVAGWILG | NPECELLISK | ESWSYIVEKP | NPENGTCYPG |
| HFADYEELRE 120 | ||||
| 3. LKGIAPLQLG | NCSVAGWILG | NPECELLISR | ESWSYIVETP | NPENGTCYPG |
| YFADYEELRE 120 | ||||
| 4 . LRGVAPLHLG | KCNIAGWILG | NPECESLSTA | SSWSYIVETP | SSDNGTCYPG |
- 30 034639
DFIDYEELRE 120
5. LNGKIPLQLG
NCNVAGWILG
NPKCDLLLTA
NSSSYIIETS
KSKNGACYPG
EFADYEELKE 120
6. LNGKAPLQLG
NCNVAGWILG
NPECDLLLTV
DSWSYIIETS
NSKNGACYPG
EFADYEELRE 120 . LKGIAPLQLG
NCSVAGWILG
NPECELLISK
ESWSYIVETP
NPENGTCYPG
YFADYEELRE 120 . LKGIAPLQLG
NCSVAGWILG
NPECELLISR
ESWSYIVEKP
NPENGTCYPG
HFADYEELRE 120
9. LKGTAPLQLG
NCSIAGWILG
NPECESLFSK
ESWSYIAETP
NPKNGTCYPG
YFADYEELRE 120
10. LKGTAPLQLG
NCSVAGWILG
NPECESLFSK
ESWSYIAETP
NPENGTCYPG
YFADYEELRE 120
11. LKGIAPLQLG
NCSVAGWILG
NPECESLISK
ESWSYIVETP
NPENGTCYPG
YFADYEELRE 120
12. LKGIAPLQLG
NCSVAGWILG
NPKCESLFSK
ESWSYIAETP
NPENGTCYPG
YFADYEELRE 120
13. LKGIAPLQLG
NCSIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
14. LKGIAPLQLG
KCSIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
15. LKGIAPLQLG
KCSIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
16. LKGIAPLQLG
KCSIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
17. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
18. LKGIAPLQLG
NCSIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
19. LKGKAPLQLG
NCNIAGWVLG
NPECESLLSN
RSWSYIAETP
NSENGTCYPG
DFADYEELRE 120
20. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLFSK
KSWSYIAETP
NSENGTCYPG
YFADYEELRE 120
21. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLLSK
RSWSYIAETP
NSENGACYPG
DFADYEELRE 120 .
LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG NPECESLLSK RSWSYIAETP
NSENGACYPG
- 31 034639
DFADYEELRE 120
23. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLLSE
RSWSYIVEIP
NSENGTCYPG
DFTDYEELRE 120
24. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLLSE
RSWSYIVETP
NSENGTCYPG
DFIDYEELRE 120
25. LKGIAPLQLG
KCNIAGWILG
NPECESLLSE
RSWSYIVETP
NSENGTCYPG
DFIDYEELRE 120
26. LKGIAPLQLG
KCNIAGWLLG
NPECDPLLPV
RSWSYIVETP
NSENGICYPG
DFIDYEELRE 120
27. LKGIAPLQLG
KCNITGWLLG
NPECDSLLPA
RSWSYIVETP
NSENGACYPG
DFIDYEELRE 120
28. LKGIAPLQLG
KCNIAGWLLG
NPECDLLLTA
SSWSYIVETS
NSENGTCYPG
DFIDYEELRE 120
1. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTTT-GVS
ASCSHNGESS
FYKNLLWLTG
KNGLYPNLSK 179
2. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVT-GVS
ASCSHNGESS
FYRNLLWLTG
KNGLYPNLSK 179
3. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVT-GVS
ASCSHNGKSS
FYRNLLWLTG
KNGLYPNLSK 179
4. QLSSVSSFER
FEIFPKTSSW
PNHDSNKGVT
AACPHAGAKS
FYKNLIWLVK
KGNSYPKLSK 180
5. QLSTVSSFER
FEIFPKAISW
PDHDATRGTT
VACSHSGVNS
FYRNLLSTVK
KGNSYPKLSK 180
6. QLSTVSSFER
FEIFPKATSW
PNHDTTRGTT
ISCSHSGANS
FYRNLLWIVK
KGNSYPKLSK 180
7. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVT-GVS
ASCSHNGKSS
FYRNLLWLTG
KNGLYPNLSK 179
8. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTTT-GVS
ASCSHNGESS
FYKNLLWLTG
KNGLYPNLSK 179
9. QLSSVSSFER
FEIFPKDSSW
PNHTVTKGVT
ASCSHNGKSS
FYKNLLWLTE
KNGLYPNLSK 180
10. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVTKGVT
ASCSHNGKSS
FYKNLLWLTE
KNGLYPNLSK 180
11. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVT-GVT
ASCSHNGKSS
FYRNLLWLTE
- 32 034639
KNGLYPNLSN 179
12. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVTKGVT
TSCSHNGKSS
FYRNLLWLTK
KNGLYPNVSK 180
13. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVTKGVT
ASCSHKGRSS
FYRNLLWLTK
KNGSYPNLSK 180
14. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PKHNVTKGVT
AACSHKGKSS
FYRNLLWLTE
KNGSYPNLSK 180
15. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PKHSVTRGVT
ASCSHKGKSS
FYRNLLWLTE
KNGSYPNLSK 180
16. QLSSVSSFER
FEIFPKERSW
PKHNITRGVT
ASCSHKGKSS
FYRNLLWLTE
KNGSYPNLSK 180
17. QLSSVSSFER
FEIFPKERSW
PKHNVTRGVT
ASCSHKGKSS
FYRNLLWLTE
KNGSYPNLSK 180
18. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHTVTKGVT
ASCSHKGRSS
FYRNLLWLTK
KNGSYPNLSK 180
19. QLSSVSSFER
FEIFPKERSW
PNHTTR-GVT
AACPHARKSS
FYKNLVWLTE
ANGSYPNLSR 179
20. QLSSVSSFER
FEIFPKERSW
PKHNITRGVT
AACSHKGKSS
FYRNLLWLTE
KNGSYPNLNK 180
21. QLSSVSSFER
FEIFPKERSW
PKHNITRGVT
AACSHAGKSS
FYKNLLWLTE
TDGSYPKLSK 180
22. QLSSVSSFER
FEIFPKGRSW
PEHNIDIGVT
FYKNLLWLTE
KDGSYPNLNK 180
23. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PKHNTARGVT
AACSHAGKSS
FYRNLLWLTE
KDGSYPNLKN 180
24. QLSSVSSFER
FEIFSKESSW
PKHTTG-GVT
AACSHAGKSS
FYRNLLWLTE
KDGSYPNLNN 179
25. QLSSVTSFER
FEIFPKETSW
PKHNTTKGVT
AACSHAGKCS
FYRNLLWLTE
KDGSYPNLNN 180
26. QLSSVSSFER
FEIFPKESSW
PNHNTN-GVT
AACSHEGKSS
FYRNLLWLTE
KEGSYPKLKN 179
27. QLSSVSSLER
FEIFPKESSW
PNHTFN-GVT
VSCSHRGKSS
FYRNLLWLTK
KGDSYPKLTN 179
28. QLSSVSSFEK
FEIFPKTSSW
PNHETTKGVT
AACSYAGASS
FYRNLLWLTK
KGSSYPKLSK 180
- 33 034639
| 1 . SYANNKEKEV | LVLWGVHHPP | NIGDQRALYH | KENAYVSWS | SHYSRKFTPE |
| IAKRPKVRDQ 239 | ||||
| 2 . SYANNKEKEV | LVLWGVHHPP | NIGNQKALYH | TENAYVSWS | SHYSRKFTPE |
| IAKRPKVRDQ 239 | ||||
| 3. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPP | NIGNQRALYH | TENAYVSWS | SHYSRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 239 | ||||
| 4 . SYINDKGKEV | LVLWGIHHPS | TSADQQSLYQ | NADAYVFVGS | SRYSKKFKPE |
| IAIRPKVRXX 240 | ||||
| 5. SYTNNKGKEV | LVIWGVHHPP | TDSVQQTLYQ | NKHTYVSVGS | SKYYKRFTPE |
| IVARPKVRGQ 240 | ||||
| 6. SYTNNKGKEV | LVIWGVHHPP | TDSDQQTLYQ | NNHTYVSVGS | SKYYQRFTPE |
| IVTRPKVRGQ 240 | ||||
| 7 . SYANNKEKEV | LVLWGVHHPP | NIGDQRALYH | TENAYVSWS | SHYSRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 239 | ||||
| 8 . SYANNKEKEV | LVLWGVHHPP | NIGDQRALYH | KENAYVSWS | SHYSRKFTPE |
| IAKRPKVRDQ 239 | ||||
| 9. SYVNKKGKEV | LVLWGVHHPS | NMGDQRAIYH | KENAYVSVLS | SHYSRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 240 | ||||
| 10. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIGDQRAIYH | TENAYVSWS | SHYSRRFTPE |
| ITKRPKVRDQ 240 | ||||
| 11. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIRDQRAIYH | TENAYVSWS | SHYSRRFTPE |
| IAKRPKVRGQ 239 | ||||
| 12. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIGDQRAIYH | TENAYVSWS | SHYSRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 240 | ||||
| 13. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIGDQRAIYH | TENAYVSWS | SHYNRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 240 | ||||
| 14. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIEDQKTIYR | KENAYVSWS | SHYNRRFTPE |
| IAKRPKVRNQ 240 | ||||
| 15. SYVNDKEKEV | LVLWGVHHPS | NIEDQKTIYR | KENAYVSWS | SHYNRRFTPE |
| IAKRPKVRDQ 240 | ||||
| 16. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIEDQKTIYR | KENAYVSWS | SNYNRRFTPE |
| IAKRPKVRGQ 240 | ||||
| 17. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIEDQKTIYR | KENAYVSWS | SNYNRRFTPE |
| IAERPKVRGQ 240 | ||||
| 18. SYVNNKEKEV | LVLWGVHHPS | NIGDQRAIYH | TENAYVSWS | SHYNRRFTPE |
IAKRPKVRDQ 240
- 34 034639
19. SYVNNQEKEV
LVLWGVHHPS
NIEEQRALYR
KDNAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAKRPKVRDQ 239
20.
SYVNNKEKEV
LVLWGVHHPS
NIEDQKTLYR
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRGQ 240 .
SYVNNKEKEV
LVLWGVHHPS
NIEDQKTLYR
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRGQ 240 .
SYVNKKEKEV
LILWGVHHPP
NIENQKTLYR
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRGQ 240
23. SYVNKKGKEV
LVLWGVHHPS
SIKEQQTLYQ
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRDQ 240
24. SYVNKKGKEV
LVLWGVHHPS
NIKDQQTLYQ
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRGQ 239
25. SYVNKKGKEV
LVLWGVHHPS
NIKDQQTLYQ
KENAYVSWS
SNYNRRFTPE
IAERPKVRGQ 240
26.
SYVNKKGKEV
LVLWGIHHPP
NSKEQQNLYQ
NENAYVSWT
SNYNRRFTPE
IAERPKVRDQ 239 .
SYVNNKGKEV
LVLWGVHHPS
SSDEQQSLYS
NGNAYVSVAS
SNYNRRFTPE
IAARPKVKDQ 239 .
SYVNNKGKEV
LVLWGVHHPP
TGTDQQSLYQ
NADAYVSVGS
SKYNRRFTPE
IAARPKVRDQ 240 . EGRINYYWTL
LEPGDTIIFE
ANGNLIAPRY
AFALSRGFGS
GIINSNAPMD
ECDAKCQTPQ 299 . EGRINYYWTL
LEPGDTIIFE
ANGNLIAPRY
AFALSRGFGS
GIINSNAPMD
KCDAKCQTPQ 299
3. EGRINYYWTL
LEPGDTIIFE
ANGNLIAPWY
AFALSRGFGS
GIITSNAPMD
ECDAKCQTPQ 299 . EGRMNYYWTL
VEPGDKITFE
ATGNLVVPRY
AFAMERNAGS
GIIISDTPVH
DCNTTCQTPK 300
5.
AGRMNYYWTL
FDQGDTITFE
ATGNLIAPWH
AFALKKGSSS
GIMLSDAQVH
NCTTKCQTPH 300
6. AGRMNYYWTL
LDQGDTITFE
ATGNLIAPWH
AFALNKGPSS
GIMISDAHVH
NCTTKCQTPH 300 . EGRINYYWTL
LEPGDTIIFE
ANGNLIAPRF
AFALSRGFGS
GIITSNAPMD
ECDAKCQTPQ 299
- 35 034639
8. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPRY AFALSRGFGS GIINSNAPMD
ECDAKCQTPQ 299
9. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIIISNASMG
| ECDAKCQTPQ 300 | ||||
| 10. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMG |
| ECDAKCQTPQ 300 11. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNAPMN |
| ECDAKCQTPQ 299 12. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDAKCQTPQ 300 13. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDAKCQTPQ 300 14. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDAKCQTPQ 300 15. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNVSMD |
| ECDAKCQTPQ 300 16. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDTKCQTPQ 300 17. AGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWH | AFALNRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDTKCQTPQ 300 18. EGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDAKCQTPQ 300 19. SGRMNYYWTL | LEPGDTIIFE | ATGNLIAPWY | AFALSRGPGS | GIITSNAPLD |
| ECDTKCQTPQ 299 20. AGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWH | AFALSRGFGS | GIITSNASMD |
| ECDTKCQTPQ 300 21. AGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRDFGS | GIITSNASMD |
| ECDTKCQTPQ 300 22. AGRINYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALNRGIGS | GIITSNASMD |
| ECDTKCQTPQ 300 23. AGRMNYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMH |
| ECDTKCQTPQ 300 24. AGRINYYWTL | LKPGDTIMFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMH |
| ECDTKCQTPQ 299 25. AGRMNYYWTL | LEPGDTIIFE | ANGNLIAPWY | AFALSRGFGS | GIITSNASMH |
ECNTKCQTPQ 300
- 36 034639
26. AGRMNYYWTL
LKPGDTIIFE
ANGNLIAPMY
AFALRRGFGS
GIITSNASMH
ECNTKCQTPL 299 .
HGRMNYYWTL
LEPGDTIIFE
ATGNLIAPWY
AFALSRGFES
GIITSNASMH
ECNTKCQTPQ 299 .
AGRMNYYWTL
LEPGDTITFE
ATGNLIAPWY
AFALNRGSGS
GIITSDAPVH
DCNTKCQTPH 300
GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
3. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
GAINTSLPFQ
NIHPITIGKC
PKYVKSTKLR
LATGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
5.
GALKNNLPLQ
NVHLFTIGEC
PKYVKSTQLR
MATGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGRTG 360
6.
GALKSNLPFQ
NVHPSTIGEC
PKYVKSTQLR
MATGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
7. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
9.
GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNVPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
10. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
11. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
12. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
13. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
14. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
- 37 034639
15. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
16. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
17. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
18. GAINSSLPFQ
NVHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
19. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
VQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
20. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
21. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
22. GAINSSLPFQ
NIHPFTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWDG 360
23. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
24. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
25. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360
26. GAINSSLPYQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSAKLR
MVTGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
27. GSINSNLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MVTGLRNIPS
IQYRGLFGAI
AGFIEGGWTG 359
28. GAINSSLPFQ
NIHPVTIGEC
PKYVRSTKLR
MATGLRNIPS
IQSRGLFGAI
AGFIEGGWTG 360 . MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419
MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419
3. MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419
- 38 034639 . MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DLKSTQNAID
EITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNHLEKR 420
5. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQIAID
GINNKANSVI
GKMNIQLTSV
GREENSLEKR 420
6. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQIAID
GINNKVNSII
EKMNTQFTSV
GKEFNDLEKR 420 . MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419 . MVDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419
9. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSII
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
10. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAID
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
MMDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419 .
MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
13. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
14. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSII
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
15. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
16. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
17. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
18. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
19. MMDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 419
20. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
21. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
WITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLERR 420
- 39 034639
22. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLEKR 420
23.
MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNNLEKR 420 .
MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNNLEKR 419
25.
MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNNLEKR 420
26. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNKLEKR 419 .
MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAIN
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNNLEKR 419
28. MIDGWYGYHH
QNEQGSGYAA
DQKSTQNAID
GITNKVNSVI
EKMNTQFTAV
GKEFNNLERR 420 . MENLNKKVDD
GFIDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
MENLNKKVDD
GFIDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
3.
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
IENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDYHDSNVK
NLYEKVRSQL
KNNAKEIGNG 480
5.
KENLNKTVDD
RFLDVWTFNA
ELLVLLENQR
TLEFHDLNIK
SLYEKVKSHL
RNNDKEIGNG 480
6.
IENLNKKVDD
GFLDVWTYNA
ELLILLENER
TLDFHDFNVK
NLYEKVKSQL
RNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
MENLNKKVDD
GFIDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
9.
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDLNVK
NLYEKVKNQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKTQL
KNNAKEIGNG 480
- 40 034639
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479
12. MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENGR
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480
16.
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 .
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFMDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKNQL
RNNAKELGNG 479
0 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKNQL
RNNAKEIGNG 480
22. MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKNQL
RNNAKEIGNG 480
3 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLILLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
RNNAKEIGNG 480
4 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKNQL
RNNAKEIGNG 479
5 . MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
RNNAKEIGNG 480
6 . MENLNNKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479 .
MENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDLNVK
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 479 .
IENLNKKVDD
GFLDIWTYNA
ELLVLLENER
TLDFHDSNVR
NLYEKVKSQL
KNNAKEIGNG 480
- 41 034639
1. CFEFYHKCND
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 53 9
CFEFYHKCND
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 53 9
3. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 53 9
4. CFEFYHKCDN
TCMESVKNGT
YDYPKYSEEA
KLNREEIDGV
KLESTRIYQI
LAIYSTVASS 540
5.
CFEFYHKRDN
ECLECVKNGT
YNYPKYSEES
KFNREEIVGV
KLESMGIHQI
LAIYSTVASS 54 0
6. CFEFYHKCDN
ECMESVKNGT
YNYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVHQI
LAI YSTVASS 54 0
7. CFEFYHKCND
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNRERIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 53 9
8. CFEFYHKCND
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 53 9
9.
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSKES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
10. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
11. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 53 9 .
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNRGKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
13. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
14. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
15.
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
16.
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0 .
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
- 42 034639
18. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
19.
CFEFYHKCDN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYRI
LAI YSTVASS 53 9
20.
CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
21. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
22. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKFSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 54 0
23. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
24. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTAASS 539
25. CFEFYHKCNN
ECMESVKNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
26. CFEFYHKCDN
ECMESVRNGT
YDYPKYSEES
KLNREKVDGV
KLESMGIYQI
LAIYSTVASS 539
27. CFEFYHKCDN
ECMESVRNGT
YDYPKYSEES
KLNREKIDGV
KLESMGVYQI
LAI YSTVASS 53 9
28. CFEFYHKCDD
ACMESVRNGT
YDYPKYSEES
KLNREEIDGV
KLESMGVYQI
LAIYSTVASS 540
| 1 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 2 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 3. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 4 . | LVLWSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 5. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRVCI | 566 |
| 6. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 7 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 8 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 9. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 10 | . LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSI | . QCRICI | 566 |
| 11 | . LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSI | . QCRICI | 565 |
| 12 | . LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL QCRICI | 566 |
- 43 034639
| 13 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 14 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 15. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 16. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 17 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 18 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 19. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 20. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 21 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 22 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 23. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 24 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 25. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
| 26. | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 27 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 565 |
| 28 . | LVLLVSLGAI | SFWMCSNGSL | QCRICI | 566 |
- 44 034639
Таблица 4. Полипептиды, экспрессированные в P.pastoris. Экспрессию и связывание CR6261 определяли, как описано, и рассчитывали отношение сигналов связывания и экспрессии
| Набор 1 | Область гибридного пептида | В-петля | |||||||||||
| 337 | 340 | 352 | 353 | 402 | 406 | 409 | 413 | 416 | |||||
| Клон | Сигнал связывания CR6261 | Сигнал HTRF | Отношение | Кратность увеличения уровня по сравнению с исходной Н1 mini-HA | Е, I, К, V | I, К, R, Т | D, F, V, Y | I, к, R, Т | Е, К, М, V | F, I, N, S, Т, Y | A, G, I, R, Т, V | F, I, N, S, Т, Y | Η, I, L, N, R, S |
| 239Е11 | 1076944 | 1492 | 721,81 | 121,52 | К | I | Y | Т | М | F | I | N | R |
| 127Н1 | 800024 | 6572 | 121,73 | 20,49 | К | К | F | Т | М | Y | I | Y | S |
| 171Е5 | 879704 | 11508 | 76,44 | 12,87 | К | Т | F | Т | М | I | А | F | S |
| 239D2 | 570424 | 9279 | 61,47 | 10,35 | К | К | F | Т | М | I | V | F | N |
| 247В2 | 414984 | 7583 | 54,73 | 9,21 | К | I | Y | Т | V | Y | I | F | S |
| 253D4 | 395824 | 7546 | 52,45 | 8,83 | К | Т | F | Т | М | Y | А | Y | Н |
| 252F5 | 421824 | 8621 | 48,93 | 8,24 | V | К | Y | Т | М | Y | V | Y | N |
| 220С9 | 1086064 | 22606 | 48,04 | 8,09 | К | Т | F | Т | М | F | Т | Y | L |
| 125D3 | 139824 | 2937 | 47,61 | 8,02 | К | К | F | Т | М | Y | G | т | Н |
| 137С11 | 416504 | 9167 | 45,44 | 7,65 | V | К | F | Т | М | Y | I | N | Н |
| 131В5 | 844344 | 20419 | 41,35 | 6,96 | К | т | F | Т | М | I | V | Y | Н |
| 233F11 | 583024 | 14389 | 40,52 | 6,82 | К | к | Y | Т | М | т | I | G | S |
| 234С5 | 377864 | 9465 | 39,92 | 6,72 | I | I | Y | Т | М | F | т | N | L |
| 115А1 | 1176904 | 30389 | 38,73 | 6,52 | К | к | Y | Т | М | I | V | Y | I |
| 185G7 | 505864 | 13560 | 37,31 | 6,28 | К | к | Y | Т | м | I | V | I | S |
| 275D4 | 327344 | 9030 | 36,25 | 6,10 | к | к | Y | Т | м | Т | т | S | S |
| 244В 8 | 273744 | 7757 | 35,29 | 5,94 | I | т | Y | т | м | Y | А | I | S |
| 252В8 | 284984 | 8252 | 34,54 | 5,81 | к | I | Y | т | м | S | I | N | L |
| 213С11 | 667024 | 20624 | 32,34 | 5,44 | V | к | Y | т | м | I | V | F | Н |
| 174G3 | 491184 | 15320 | 32,06 | 5,40 | к | т | Y | к | V | S | G | Y | L |
| 125D10 | 133904 | 4241 | 31,57 | 5,31 | к | I | Y | т | м | Y | V | N | R |
| 127А7 | 233064 | 7498 | 31,08 | 5,23 | Е | т | Y | т | м | I | I | I | L |
| 304G11 | 110504 | 3588 | 30,8 | 5,19 | К | к | Y | к | м | F | т | F | S |
| 162А11 | 364024 | 11939 | 30,49 | 5,13 | V | к | Y | т | м | F | А | F | I |
| 271F10 | 315304 | 10348 | 30,47 | 5,13 | I | к | Y | т | м | I | А | I | L |
| 218G11 | 958504 | 33710 | 28,43 | 4,79 | I | т | Y | I | м | I | I | I | N |
| 251С8 | 269544 | 9634 | 27,98 | 4,71 | к | т | Y | к | м | Y | I | N | L |
| 258А6 | 165624 | 6004 | 27,59 | 4,64 | I | т | Y | т | м | Y | т | F | Н |
| 134А4 | 456304 | 17366 | 26,28 | 4,42 | к | I | Y | I | м | I | А | Y | N |
| 214С11 | 317904 | 12120 | 26,23 | 4,42 | Е | I | Y | т | м | Y | V | S | S |
| 182G8 | 399864 | 15262 | 26,2 | 4,41 | К | к | Y | т | м | т | V | I | I |
| 113Е7 | 966064 | 38018 | 25,41 | 4,28 | К | к | F | т | м | Y | Т | I | н |
| 230G9 | 854584 | 34093 | 25,07 | 4,22 | К | к | Y | т | м | Y | Т | F | R |
| 222G4 | 419064 | 16996 | 24,66 | 4,15 | К | т | F | I | V | I | I | Y | L |
| 182D7 | 418944 | 17096 | 24,51 | 4,13 | I | т | Y | т | м | I | I | F | N |
| 272Н2 | 263264 | 10844 | 24,28 | 4,09 | к | т | Y | т | м | S | А | N | Н |
| 191С8 | 309064 | 12753 | 24,23 | 4,08 | I | т | Y | т | V | I | А | F | I |
| 123С10 | 237824 | 9843 | 24,16 | 4,07 | к | I | Y | к | м | F | А | Т | L |
| 2 84В 9 | 1663504 | 70812 | 23,49 | 3,95 | к | т | Y | R | м | I | R | т | L |
| 134 АЗ | 531784 | 23414 | 22,71 | 3,82 | к | к | F | I | м | I | I | N | S |
| 188F4 | 287384 | 12888 | 22,3 | 3,75 | к | к | Y | т | м | S | V | Т | Н |
| 189В 7 | 336344 | 15207 | 22,12 | 3,72 | Е | т | F | т | м | Y | V | F | N |
| 148D5 | 329144 | 14994 | 21,95 | 3,70 | Е | т | Y | I | м | F | G | S | Н |
| 194С8 | 242304 | 11113 | 21,8 | 3,67 | I | т | F | т | м | F | V | F | I |
| 188А8 | 279144 | 13001 | 21,47 | 3,61 | К | т | Y | к | м | F | V | S | I |
| 162ВЗ | 279584 | 13159 | 21,25 | 3,58 | V | т | Y | т | м | Y | Т | N | N |
| 204С5 | 832784 | 39330 | 21,17 | 3,56 | V | к | F | т | V | I | I | Y | L |
| 216Е5 | 334904 | 15873 | 21,1 | 3,55 | V | т | F | т | м | F | R | Y | R |
| 129С2 | 199464 | 9486 | 21,03 | 3,54 | V | R | Y | I | м | I | I | Y | S |
| 286Е8 | 158704 | 7662 | 20,71 | 3,49 | Е | I | F | т | м | F | I | Y | S |
| 264 G4 | 180504 | 8751 | 20,63 | 3,47 | К | R | Y | т | V | I | V | F | S |
| 214С4 | 302264 | 14709 | 20,55 | 3,46 | I | I | F | т | V | F | А | S | S |
| 125А8 | 212224 | 10327 | 20,55 | 3,46 | К | I | F | т | V | I | V | Y | I |
- 45 034639
| 123G2 | 498584 | 24442 | 20,4 | 3,43 | I | т | Y | I | м | Y | Т | F | L |
| 187С6 | 345464 | 16932 | 20,4 | 3,43 | Е | к | Y | К | м | F | I | I | Н |
| 134Н10 | 591704 | 29253 | 20,23 | 3,41 | К | т | Y | Т | V | I | Т | F | I |
| 187Н10 | 299224 | 15289 | 19,57 | 3,29 | К | т | Y | I | м | I | G | F | L |
| 101D4 | 336584 | 17243 | 19,52 | 3,29 | I | к | Y | I | м | I | I | S | N |
| 193В6 | 206904 | 10650 | 19,43 | 3,27 | К | к | Y | R | м | F | I | S | N |
| 137С5 | 295944 | 15406 | 19,21 | 3,23 | I | R | F | Т | V | I | I | N | N |
| 112F3 | 449824 | 24169 | 18,61 | 3,13 | V | R | F | I | м | I | I | Y | S |
| 176А5 | 193104 | 10476 | 18,43 | 3,10 | I | Т | F | Т | V | F | I | F | I |
| 213В2 | 131704 | 7178 | 18,35 | 3,09 | к | К | Y | Т | м | т | V | F | L |
| 307А10 | 114984 | 6348 | 18,11 | 3,05 | I | К | F | Т | м | Y | G | Y | Н |
| 126СЗ | 219944 | 12413 | 17,72 | 2,98 | Е | т | F | I | м | F | G | Т | I |
| 263В6 | 151184 | 8800 | 17,18 | 2,89 | I | т | Y | I | м | S | Т | Y | I |
| 138F11 | 147864 | 8788 | 16,83 | 2,83 | Е | R | Y | R | м | F | V | F | L |
| 134D3 | 303504 | 18129 | 16,74 | 2,82 | Е | R | F | I | м | Y | Т | F | S |
| 131D5 | 344504 | 20857 | 16,52 | 2,78 | V | Т | Y | I | V | I | А | F | S |
| 138F8 | 347704 | 21081 | 16,49 | 2,78 | К | Т | Y | I | м | Y | А | F | Н |
| 301F11 | 116904 | 7108 | 16,45 | 2,77 | V | Т | F | Т | V | Y | I | S | Н |
| 112G6 | 543944 | 33149 | 16,41 | 2,76 | V | R | Y | I | м | F | I | S | I |
| 245С9 | 180024 | 10980 | 16,4 | 2,76 | V | R | F | т | V | F | V | Т | L |
| 123Е2 | 477064 | 29184 | 16,35 | 2,75 | V | Т | Y | т | V | F | V | F | S |
| 266А11 | 90584 | 5696 | 15,9 | 2,68 | V | Т | Y | т | м | Y | I | Т | R |
| 104С4 | 521224 | 34458 | 15,13 | 2,55 | V | К | Y | I | м | F | G | F | N |
| 194Е4 | 408584 | 27424 | 14,9 | 2,51 | Е | К | F | т | м | I | Т | F | I |
| 206В11 | 358744 | 24697 | 14,53 | 2,45 | V | R | Y | т | м | F | Т | I | L |
| 192С4 | 343184 | 23932 | 14,34 | 2,41 | К | Т | Y | к | м | I | V | Т | N |
| 125НЗ | 317384 | 22785 | 13,93 | 2,35 | I | Т | F | т | м | I | А | Y | R |
| 145С9 | 182344 | 13108 | 13,91 | 2,34 | I | Т | F | I | V | Y | I | S | N |
| 243D6 | 132144 | 9596 | 13,77 | 2,32 | I | R | F | т | м | N | V | Y | R |
| 182D3 | 142664 | 10487 | 13,6 | 2,29 | I | Т | Y | R | м | F | А | G | S |
| 181Н9 | 310504 | 23153 | 13,41 | 2,26 | V | К | F | I | м | F | V | F | N |
| 163E3 | 183544 | 14033 | 13,08 | 2,20 | Е | К | Y | к | м | I | V | I | L |
| 145Е7 | 132224 | 10312 | 12,82 | 2,16 | I | Т | F | к | V | I | I | F | S |
| 275 G3 | 115104 | 9180 | 12,54 | 2,11 | V | Т | Y | I | м | т | А | S | S |
| 191D5 | 123824 | 10048 | 12,32 | 2,07 | I | R | F | т | м | т | G | F | S |
| 188G10 | 142504 | 11593 | 12,29 | 2,07 | V | Т | Y | I | V | I | А | F | S |
| 171F6 | 140464 | 11555 | 12,16 | 2,05 | к | Т | Y | т | м | S | Т | Y | L |
| 125С2 | 83624 | 7009 | 11,93 | 2,01 | I | I | F | т | V | I | Т | S | S |
| 206В 8 | 285824 | 24166 | 11,83 | 1,99 | V | I | Y | т | м | I | Т | F | Н |
| 145F2 | 498504 | 42457 | 11,74 | 1,98 | I | К | F | т | м | F | R | F | S |
| 199F3 | 328504 | 29850 | 11,01 | 1,85 | к | Т | Y | т | м | N | G | S | S |
| 181Н11 | 186664 | 17205 | 10,85 | 1,83 | V | Т | Y | т | м | I | I | N | R |
| 188С8 | 113344 | 10520 | 10,77 | 1,81 | I | К | Y | т | м | S | Т | Y | L |
| 189Е10 | 188864 | 18252 | 10,35 | 1,74 | к | Т | Y | т | м | S | G | S | S |
| 146G7 | 533864 | 52422 | 10,18 | 1,71 | V | т | Y | I | м | Y | Т | т | I |
| 182Н2 | 109624 | 10976 | 9,99 | 1,68 | к | I | F | т | V | I | I | т | L |
| 262В 9 | 94744 | 9584 | 9,89 | 1,66 | I | к | Y | т | м | F | R | F | R |
| 145Е8 | 211504 | 21732 | 9,73 | 1,64 | Е | к | F | к | V | I | V | F | I |
| 249В11 | 145184 | 14995 | 9,68 | 1,63 | к | к | F | т | м | S | т | G | Н |
| 182С6 | 92944 | 9939 | 9,35 | 1,57 | к | R | D | I | м | F | I | N | N |
| SEQIDNO: 6 AV + 2SD | 9.28 | 1.56 | |||||||||||
| SEQID NO: 6 AV | 238077 | 40100 | 5,94 | 1,00 |
- 46 034639
Таблица 5. Полипептиды, экспрессированные в P.pastoris. Экспрессию и связывание CR6261 определяли, как описано, и рассчитывали отношение сигналов связывания и экспрессии
| Набор 2 | Область гибридного пептида | В-петля | |||||||||||
| 337 | 340 | 352 | 353 | 402 | 406 | 409 | 413 | 416 | |||||
| Клон | Сигнал связью ания CR6261 | Сигнал HTRF | Отношение | Кратность увеличения уровня по сравнению с исходной SEQ ID NO: 6 | А, Е, I, К, Т, V | F, I, N, S, Т, Y | A, D, F, I, N, S, Т, V, Y | Е, G, I, К, R, V | М, R, Т | F, Н, L, Y | F, I, S, Т | Е, К, М, V | I, L, R, S |
| 86В4 | 1077144 | 13862 | ΊΊ,Ί | 13,08 | К | N | Y | К | М | F | I | М | I |
| 7А7 | 987824 | 13452 | 73,43 | 12,36 | Т | N | Y | V | м | Y | F | Е | R |
| 55G7 | 616184 | 8767 | 70,28 | 11,83 | К | N | Y | V | м | Y | I | М | L |
| 71Н2 | 1109984 | 16750 | 66,27 | 11,16 | К | N | F | к | м | L | I | V | S |
| 86ВЗ | 900904 | 14448 | 62,35 | 10,50 | К | N | Y | к | м | L | I | V | R |
| 71А4 | 1064144 | 17597 | 60,47 | 10,18 | Т | N | Y | V | м | Y | F | Е | R |
| 51G3 | 460304 | 7773 | 59,22 | 9,97 | Т | I | F | V | м | L | F | Е | S |
| 84В 8 | 582144 | 10091 | 57,69 | 9,71 | К | N | Y | I | м | F | F | М | S |
| 79С2 | 364184 | 7116 | 51,18 | 8,62 | Т | N | Y | R | м | F | Т | V | S |
| 69 G8 | 481344 | 9479 | 50,78 | 8,55 | I | N | F | R | м | L | I | V | L |
| 79D5 | 702584 | 13981 | 50,25 | 8,46 | А | N | F | К | м | L | F | V | L |
| 54Н4 | 291744 | 5857 | 49,81 | 8,39 | К | I | Y | К | м | L | I | Е | L |
| 11Н6 | 427384 | 9146 | 46,73 | 7,87 | К | N | Y | Е | м | F | Т | Е | S |
| 90 А9 | 413664 | 9025 | 45,84 | 7,72 | К | S | Y | V | м | Y | Т | V | S |
| 75 G5 | 1011384 | 26695 | 37,89 | 6,38 | Е | S | Y | V | м | L | F | Е | R |
| 8А10 | 360104 | 9630 | 37,39 | 6,29 | К | N | Y | V | м | L | I | V | R |
| 72D4 | 329944 | 8881 | 37,15 | 6,25 | V | N | F | R | м | F | S | М | S |
| 74Н9 | 1283144 | 35494 | 36,15 | 6,09 | К | N | F | К | м | Y | F | М | S |
| 88С5 | 471424 | 13355 | 35,3 | 5,94 | К | N | Y | R | м | L | I | V | R |
| 61А9 | 383064 | 10864 | 35,26 | 5,94 | Т | N | F | R | м | F | F | Е | L |
| 86Н9 | 457344 | 13340 | 34,28 | 5,77 | К | N | F | G | м | F | Т | V | S |
| 71D3 | 1573024 | 46711 | 33,68 | 5,67 | I | S | Y | V | м | F | I | V | L |
| 9С6 | 270984 | 8235 | 32,91 | 5,54 | К | т | Y | V | м | Y | Т | К | I |
| 81F11 | 317824 | 9964 | 31,9 | 5,37 | К | I | F | V | м | F | F | V | S |
| 84Е10 | 255064 | 7996 | 31,9 | 5,37 | I | N | F | R | м | F | S | V | S |
| 71С4 | 1350144 | 44339 | 30,45 | 5,13 | К | N | F | G | м | F | I | V | S |
| 84D3 | 84424 | 2920 | 28,91 | 4,87 | Е | N | F | К | м | L | I | Е | S |
| 96Н8 | 205904 | 7224 | 28,5 | 4,80 | К | Y | Y | К | м | F | I | М | S |
| 85 А7 | 235704 | 8416 | 28,01 | 4,72 | К | N | Y | Е | м | L | F | V | R |
| 50G10 | 264144 | 9470 | 27,89 | 4,70 | Т | N | F | Е | м | F | F | V | S |
| 6А1 | 299824 | 10912 | 27,48 | 4,63 | А | N | F | R | м | F | F | М | S |
| 91С4 | 1157424 | 44837 | 25,81 | 4,35 | К | N | F | G | м | L | I | М | R |
| 204 | 258264 | 10139 | 25,47 | 4,29 | I | N | F | V | м | F | I | V | L |
| 63C3 | 188184 | 7625 | 24,68 | 4,15 | Е | Т | Y | К | м | L | F | V | L |
| 850 | 196024 | 8115 | 24,16 | 4,07 | К | N | V | G | м | F | F | V | I |
| 67С10 | 306104 | 12907 | 23,72 | 3,99 | Е | Т | F | V | м | F | F | м | L |
| 10F9 | 165984 | 7113 | 23,34 | 3,93 | I | I | Y | V | м | Y | F | Е | R |
| 4С1 | 385504 | 16548 | 23,3 | 3,92 | К | N | S | V | м | F | I | Е | I |
| 86 G3 | 183944 | 7995 | 23,01 | 3,87 | Т | S | Y | V | м | F | Т | V | L |
| 51G10 | 215264 | 9727 | 22,13 | 3,73 | А | N | Y | R | м | F | I | К | S |
| 58А5 | 90744 | 4142 | 21,91 | 3,69 | V | Т | F | R | м | L | I | м | S |
| 56F8 | 235344 | 10823 | 21,74 | 3,66 | I | N | F | Е | м | F | Т | Е | L |
| 67С11 | 209184 | 9856 | 21,22 | 3,57 | К | Y | Y | I | м | F | F | Е | I |
| 91С8 | 333584 | 16012 | 20,83 | 3,51 | К | N | F | G | м | L | I | К | S |
| 48В11 | 302864 | 14946 | 20,26 | 3,41 | I | N | А | G | м | L | I | Е | S |
| 78F11 | 84104 | 4155 | 20,24 | 3,41 | I | I | F | R | м | Y | F | Е | I |
- 47 034639
| 76А10 | 136984 | 6841 | 20,02 | 3,37 | I | Y | F | V | М | Y | F | Е | I |
| 55Н2 | 58104 | 2984 | 19,47 | 3,28 | I | I | Y | V | М | F | F | V | S |
| 74D7 | 358784 | 18453 | 19,44 | 3,27 | К | N | А | G | М | F | I | М | S |
| 11В4 | 166464 | 8679 | 19,18 | 3,23 | T | S | F | V | М | Y | т | V | S |
| 56F4 | 185984 | 9740 | 19,09 | 3,21 | T | Т | F | Е | М | F | S | М | S |
| 71Е7 | 202704 | 10688 | 18,97 | 3,19 | К | N | S | R | М | Y | I | Е | S |
| 48В10 | 102904 | 5480 | 18,78 | 3,16 | I | F | F | К | М | L | F | М | S |
| 48D11 | 120584 | 6807 | 17,71 | 2,98 | E | Y | Y | V | М | F | т | V | S |
| 35H3 | 106224 | 6092 | 17,44 | 2,94 | V | S | F | V | М | L | S | М | R |
| 53G10 | 107784 | 6188 | 17,42 | 2,93 | T | N | F | V | М | L | т | V | S |
| 86F1 | 158624 | 9145 | 17,35 | 2,92 | I | I | F | V | М | Y | I | V | I |
| 9С10 | 114144 | 6595 | 17,31 | 2,91 | I | I | Y | V | М | Н | S | V | S |
| 6Е12 | 372504 | 22044 | 16,9 | 2,85 | E | N | F | I | М | L | F | V | L |
| 2D9 | 316024 | 19245 | 16,42 | 2,76 | К | N | N | I | М | Y | F | Е | L |
| 27В10 | 187344 | 11465 | 16,34 | 2,75 | К | N | N | V | м | L | F | Е | S |
| 79F8 | 185264 | 11801 | 15,7 | 2,64 | I | N | V | I | м | F | Т | Е | S |
| 11F4 | 150824 | 9996 | 15,09 | 2,54 | I | Y | F | V | м | Y | F | V | L |
| 60 А2 | 92664 | 6166 | 15,03 | 2,53 | E | N | γ | V | м | F | S | Е | L |
| 58С8 | 277144 | 18603 | 14,9 | 2,51 | A | S | Y | I | м | L | S | Е | L |
| 12С6 | 289184 | 20023 | 14,44 | 2,43 | I | N | S | V | м | L | I | Е | L |
| 89F11 | 84824 | 5908 | 14,36 | 2,42 | T | I | Y | I | м | L | S | V | S |
| 96 G5 | 108264 | 7589 | 14,27 | 2,40 | V | N | F | I | м | Y | F | М | S |
| 29С2 | 177904 | 12921 | 13,77 | 2,32 | К | N | F | G | м | Y | F | М | R |
| 56D2 | 145624 | 10658 | 13,66 | 2,30 | E | Т | F | I | м | F | F | К | S |
| 66С8 | 184544 | 13591 | 13,58 | 2,29 | К | N | V | I | м | L | F | V | L |
| 69D2 | 445704 | 34266 | 13,01 | 2,19 | V | F | F | V | м | Y | Т | Е | S |
| 75Е9 | 134504 | 10422 | 12,91 | 2,17 | I | I | F | G | м | F | S | Е | I |
| 97G10 | 253104 | 20061 | 12,62 | 2,12 | E | S | F | I | м | F | F | Е | I |
| 36Е4 | 196104 | 15917 | 12,32 | 2,07 | I | N | N | К | м | F | F | V | L |
| 7D9 | 77824 | 6320 | 12,31 | 2,07 | К | N | F | V | м | F | F | М | L |
| 1F2 | 148544 | 12244 | 12,13 | 2,04 | К | N | Y | V | м | F | F | М | I |
| 76D10 | 113664 | 9729 | 11,68 | 1,97 | T | N | А | к | м | L | Т | Е | S |
| 36Н2 | 171144 | 14761 | 11,59 | 1,95 | T | N | Y | к | м | Н | F | М | R |
| 86 G2 | 69704 | 6069 | 11,49 | 1,93 | Е | N | F | V | м | L | I | Е | R |
| 63D3 | 145784 | 13100 | 11,13 | 1,87 | К | N | I | G | м | F | т | Е | L |
| 96 А7 | 83304 | 7575 | 11 | 1,85 | V | I | F | V | м | F | S | V | S |
| 36D6 | 71304 | 6569 | 10,85 | 1,83 | I | N | А | G | м | F | т | Е | I |
| 91F10 | 14784 | 1394 | 10,6 | 1,78 | т | N | Y | G | м | F | I | Е | R |
| 80F10 | 90864 | 8609 | 10,55 | 1,78 | I | S | V | V | м | L | I | Е | S |
| 75Н8 | 103304 | 10074 | 10,25 | 1,73 | А | N | N | V | м | F | F | М | S |
| 57В8 | 58384 | 5800 | 10,07 | 1,70 | К | I | Y | I | м | F | F | V | I |
| 8D7 | 73424 | 7324 | 10,03 | 1,69 | К | N | F | V | м | L | F | Е | L |
| 5 8 All | 53264 | 5363 | 9,93 | 1,67 | V | Т | Y | I | м | F | Т | V | S |
| 7В6 | 60384 | 6137 | 9,84 | 1,66 | к | I | S | Е | м | F | I | М | S |
| 87Н5 | 78104 | 7994 | 9,77 | 1,64 | Е | I | F | I | м | F | F | V | S |
| 70F6 | 418624 | 43334 | 9,66 | 1,63 | К | N | I | G | м | L | Т | Е | R |
| 26Н1 | 79744 | 8268 | 9,64 | 1,62 | Е | N | F | I | м | L | S | V | I |
| 78 G2 | 56704 | 6055 | 9,36 | 1,58 | V | I | Y | G | м | L | F | Е | S |
| SEQID NO: 6 AV + 2SD | 9,28 | 1,56 | |||||||||||
| SEQID NO: 6 AV | 238077 | 40100 | 5,94 | 1,00 |
- 48 034639
Таблица 6. Полипептиды, экспрессированные в HEK293F. Экспрессию и связывание CR6261 определяли, как описано, и рассчитывали отношение сигналов связывания и экспрессии. Мутации, включенные в каждый клон, указаны в табл. 4 и 5
| Клон | Сигнал связывания CR6261 | Сигнал HTRF | Отношение | Кратность увеличения уровня по сравнению с исходной SEQ ID NO: 6 |
| 127Н1 | 24150000 | 327363 | 73,77 | 4,25 |
| 86В4 | 19970680 | 334887 | 59,63 | 3,44 |
| 171Е5 | 6625080 | 235511 | 28,13 | 1,62 |
| 7А7 | 6191080 | 242461 | 25,53 | 1,47 |
| 71Н2 | 21080360 | 336346 | 62,67 | 3,61 |
| 220С9 | 8493560 | 162872 | 52,15 | 3,00 |
| 131В5 | 5725640 | 139561 | 41,03 | 2,36 |
| 115А1 | 9557640 | 175377 | 54,50 | 3,14 |
| 74Н9 | 26144240 | 344988 | 75,78 | 4,37 |
| 71С4 | 6413600 | 214495 | 29,90 | 1,72 |
| 91С4 | 8442400 | 245138 | 34,44 | 1,98 |
| 113Е7 | 13005960 | 260748 | 49,88 | 2,87 |
| 6Е12 | 15326000 | 309443 | 49,53 | 2,85 |
| 181Н9 | 11892520 | 324690 | 36,63 | 2,11 |
| SEQ ID NO: 6 AV | 5661550 | 326077 | 17,36 | 1,00 |
Таблица 7. Вариабельность природной последовательности в указанных положениях в % от общего числа последовательностей для каждого подтипа
| положение | аминокислота | Н1 | НЗ | Н5 | Н7 |
| 337 | V | 67 | 99 | 19 | 100 |
| I | 32 | 1 | 2 | ||
| Т | 0, 8 | 3 | |||
| S | 73 | ||||
| Y | 0, 1 | ||||
| N | 0,5 | ||||
| А | 2 | ||||
| G | 0, 1 | ||||
| 340 | I | 99 | 21 | 98 | |
| V | 0, 43 | ||||
| т | 0, 03 | 0,5 | |||
| к | 97 | ||||
| R | 2 | 47 | |||
| G | 29 | ||||
| Е | 0,3 | ||||
| S | 2 | ||||
| 352 | F | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 353 | I | 99, 9 | 100 | 100 | 100 |
| L | 0, 1 |
| 402 | М | 100 | 100 | ||
| Т | 99, 8 | 100 | |||
| S | 0,02 |
- 49 034639
Таблица 8. Очистка и сила связывания mAb полипептидов по изобретению
| SEQ ID NO: | Объем супернатанта (мл) | Выход (мг/л культуры) | Чистота по HPSEC (%) | Kd app CR6261 (нМ) | Kd app CR9114 (нМ) | |
| S127H1 | 35 | 1376 | 9, 0 | 100, 0 | 130 | 10 |
| s8 6B4 | 36 | 1380 | 9, 0 | 96, 0 | 150 | 13 |
| s 5 5G7 | 37 | 1460 | 18, 1 | 100, 0 | 150 | 9 |
| s74H9 | 34 | 1335 | 11,3 | 99, 7 | 130 | 10 |
| s6E12 | 38 | 1479 | 13, 1 | 90, 8 | 390 | 34 |
Таблица 9. Молекулярный вес, определенный с помощью SEC-MALS для полипептидов по изобретению и их комплексов с Fab-фрагментами CR6261 и CR9114
| SEQ ID NO: | Мол. вес (кДа) | Мол. вес комплекса с CR6261 (кДа) | Мол. вес комплекса с CR9114 (кДа) | ||||
| Теор . | Наблюда- емый | Теор. | Наблюда- емый | Теор. | Наблюда- емый | ||
| S127H1 | 35 | 40 | 39 | 87 | 74 | 86 | 83 |
| s8 6В4 | 36 | 40 | 40 | 88 | 75 | 87 | 83 |
| s 5 5G7 | 37 | 40 | 40 | 90 | 66 | 87 | 80 |
| s74H9 | 34 | 40 | 41 | 89 | 72 | 88 | 83 |
| S6E12 | 38 | 40 | 40 | 88 | 67 | 87 | 80 |
Теоретические (теор.) значения оценивают на основании последовательности полипептида по изобретению (предполагая мономер) и дополнительного вклада приблизительно 10 кДа от присоединенных гликанов.
Значения молекулярного веса Fab-фрагментов CR6261, CR9114 и CR8020 также определяли с помощью SEC-MALS, и они составили 48, 49 и 47 кДа соответственно.
Ссылки
Bommakanti et al. (2010), PNAS 107(31): 13701-13706.
Bommakanti et al. (2012), J Virol 86: 13434
Coffman et al. (2010), Immunity 33: 492.
Devereux et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 387.
Dopheide T.A., Ward C.W. (1981) J Gen Virol. 367-370.
Ekiert et al. (2009), Science 324:246.
Ekiert et al. (2011), Science 333: 844.
Ferguson et al. (2003), Nature 422: 428-443.
| Lorieau et | al. | . 2010, | Proc. Natl. | . Acad. | Sci. USA, 107: 11341 |
| Steel et al. | (2010), | mBio 1 (1) : | 1-9. | ||
| Steven et | al | (2004) | Science 303: | : 1866 | |
| Steven et | al | (2006) | Science312: | 404 | |
| Throsby et | al. | . (2008 | ), Pios One | 12(3): | 1-15. |
| Wilson et | al | (1981) | Nature 289: | 366 |
- 50 034639
Последовательности
SEQ ID NO 1: Полноразмерный Hl (A/Brisbane/59/2007 )
| MKVKLLVLLC | TFTATYADTI | CIGYHANNST | DTVDTVLEKN | VTVTHSVNLL | 50 |
| ENSHNGKLCL | LKGIAPLQLG | NCSVAGWILG | NPECELLISK | ESWSYIVEKP | 100 |
| NPENGTCYPG | HFADYEELRE | QLSSVSSFER | FEIFPKESSW | PNHTVTGVSA | 150 |
| SCSHNGESSF | YRNLLWLTGK | NGLYPNLSKS | YANNKEKEVL | VLWGVHHPPN | 200 |
| IGDQKALYHT | ENAYVSWSS | HYSRKFTPEI | AKRPKVRDQE | GRINYYWTLL | 250 |
| EPGDTIIFEA | NGNLIAPRYA | FALSRGFGSG | IINSNAPMDK | CDAKCQTPQG | 300 |
| AINSSLPFQN | VHPVTIGECP | KYVRSAKLRM | VTGLRNIPSI | QSRGLFGAIA | 350 |
| GFIEGGWTGM | VDGWYGYHHQ | NEQGSGYAAD | QKSTQNAING | ITNKVNSVIE | 400 |
| KMNTQFTAVG | KEFNKLERRM | ENLNKKVDDG | FIDIWTYNAE | LLVLLENERT | 450 |
| LDFHDSNVKN | LYEKVKSQLK | NNAKEIGNGC | FEFYHKCNDE | CMESVKNGTY | 500 |
| DYPKYSEESK | LNREKIDGVK | LESMGVYQIL | AIYSTVASSL | VLLVSLGAIS | 550 |
FWMCSNGSLQ CRICI 565
SEQ ID NO: 2: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4
MKVKLLVLLC TFTATYA DTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL 50
ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL RNIPSIQSQG LFGAIAGFIE GGWTGMVDGW 100
YGYHHQNEQG SGYAADQKST QNAINGITNK VNSVIEKMNT QSTATGKEGN 150
KSERMKQIED KIEEIESKQI WCYNAELLVL LENERTLDFH DSNVKNLYEK 200
VKSQLKNNAK EIGNGCFEFY HKCNDECMES VKNGTYDYPK YSEESKLNRE 250
KIDGVKLESM GVYQILAIYS TVASSLVLLV SLGAISFWMC SNGSLQCRIC 300
I 301
SEQ ID NO: 3: фолдон
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 4: ЕНАС-тромбин-фолдон-Н13
SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO: 5:
MKQIEDKIEEIESKQ
SEQ ID NO: 6: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 без лидерной последовательности и с ЕНАС-тромбин-фолдон-Н13
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNIPSIQ SQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ STATGKEGNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVP RGS PGS GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS Т FLGHHHHHH
SEQ ID NO: 7:
- 51 034639
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
SEQ ID NO 8: остаток консенсусной последовательности Hl 402418 (нумерация согласно SEQ ID N0:1)
402 MNTQFTAVG KEEN(H/K)LE(K/R) 418 >3009-114 VH, БЕЛОК (SEQ ID NO: 11)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAY
AQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS >3009-114 VL, БЕЛОК (SEQ ID NO: 12)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSWP
DRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL >CR6261 VH, БЕЛОК (SEQ ID NO: 9)
| E V Q L | V E | S G A | E | : v к к | P | G | S | s | V | К | V | S | C | К | A | S | G | G | P | F | R | ||
| s | Y | A I S W | V R | Q A P | G | Q G P | E | W | M | G | G | I | I | P | I | F | G | T | T | К | Y | A | P |
| к | F | Q G R V | T I | TAD | D | FAG | T | V | Y | M | E | L | S | S | L | R | S | E | D | T | A | M | Y |
| Y | C | A К Η M | G Y | Q V R E | T M D \ | t 1Λ | I G | ; к | : g | T | T | V | T | V | S | S | |||||||
| >CR6261 | VL, | БЕЛОК | ( | SEQ ID | NO | 1 · | 10) | ||||||||||||||||
| Q S V L | T Q | P P S | 1/ | T S A A | P | G | Q | к | V | T | I | S | C | S | G | S | S | S | N | I | G | ||
| N | D | Y V S W | Y Q | Q L P | G | TAP | К | L | L | I | Y | D | N | N | К | R | P | S | G | I | P | D | R |
| F | S | G S К S | G T | SAT | L | GIT | G | L | Q | T | G | D | E | A | N | Y | Y | C | A | T | W | D | R |
RPTAYVVFGGGTKLTVLG >3008-057 VH, БЕЛОК (SEQ ID NO: 13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYA
DSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV >3008-057 VL, БЕЛОК (SEQ ID NO: 14)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGV
SDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI >3008-020 VH, БЕЛОК (SEQ ID NO: 17)
QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTRFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTYY
AQKFQARVTMTTDTSTTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDN >3008-020 VL, БЕЛОК (SEQ ID NO: 18)
EIVXTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIP
DRISGSGSGTDFTLTISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRT
SEQ ID NO: 55: 127H1
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS T DTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI
- 52 034639
NGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD
FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 56 : 86B4
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 59 : 55G7
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKL RMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGIT NKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDS NVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVK LESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 57 : 74H9
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 60 : 115A1
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DG VKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 61 : 71H2
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 62 : 181H9
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI
- 53 034639
NGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 58 : 6E12
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC SAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 63 :220C9
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC SAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 64 : 113E7
MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAI NGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLD FHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKI DGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO: 65: s74H9
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ SQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ YTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHH H
SEQ ID NO: 66: S127H1
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQ SQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ YTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHH H
SEQ ID NO: 67: s86B4
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ SQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
- 54 034639
FTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHH H
SEQ ID NO: 68: s55G7
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ
SQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
YTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHH
H
SEQ ID NO: 69: s6E12
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQ
SQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
LTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHH
H
SEQ ID NO: 72: s74H9-long
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ
SQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
YTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO: 73: sl27Hl-long
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQ
SQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
YTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO: 74: s86B4-long
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ
SQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
FTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL
KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNRE KIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO: 75: s55G7-long
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQ
SQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
YTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO: 76: s6E12-long DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQ
SQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ
LTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
Claims (8)
1. Полипептид стеблевого домена гемагглютинина (HA) вируса гриппа для индукции иммунного ответа против белка HA вируса гриппа, содержащий: (а) домен HA1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент HA1, содержащий аминокислоты от положения 1 по положение 52, предпочтительно от положения 18 по положение 52 домена HA1, в случае необходимости ковалентно связанный сшивающей последовательностью из десяти или менее аминокислотных остатков
- 55 034639 с С-концевым стеблевым сегментом HA1, содержащим аминокислоты от положения 321 до С-концевой аминокислоты, включительно, из домена HA1, и (b) домен HA2 гемагглютинина вируса гриппа, где домены HA1 и HA2 получены из штамма A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1), причем полипептид содержит аминокислотную последовательность
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX^SX 2qsqglfgaiagx3x4eggwtgmvdgwygyhhqneqgsgyaadqkstqnaingitnkvnsviekx5 ntqx6tax7gkex8nkx9ermkqiedkieeieskqiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDD DKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 53),
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX 2qsqglfgaiagx3x4eggwtgmvdgwygyhhqneqgsgyaadqkstqnaingitnkvnsviekx5 ntqx6tax7gkex8nkx9ermkqiedkieeieskqiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 54),
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX 2qsqglfgaiagx3x4eggwtgmvdgwygyhhqneqgsgyaadqkstqnaingitnkvnsviekx5 ntqx6tax7gkex8nkx9ermkqiedkieeieskqiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ IEG (SEQ ID NO: 70), или
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX 2qsqglfgaiagx3x4eggwtgmvdgwygyhhqneqgsgyaadqkstqnaingitnkvnsviekx5 ntqx6tax7gkex8nkx9ermkqiedkieeieskqiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 71), причем X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y; Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и T; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V; Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из E, K, М, V, R и T; Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L; Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;
Х8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, Е, K, М и V; и
Х9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.
2. Полипептид стеблевого домена HA вируса гриппа по п.1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55-76.
3. Полипептид стеблевого домена HA вируса гриппа по п.2, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 73.
4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из пп.1-3, для индукции иммунного ответа против белка HA вируса гриппа.
5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.4, для индукции иммунного ответа против белка HA вируса гриппа.
6. Композиция для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа, содержащая полипептид по любому из пп.1-3, и/или молекулу нуклеиновой кислоты по п.4, и/или вектор по п.5.
7. Полипептид стеблевого домена HA вируса гриппа по любому из пп.1-3, молекула нуклеиновой кислоты по п.4 и/или композиция по п.6 для применения в качестве лекарственного средства, в частности в качестве вакцины.
8. Полипептид стеблевого домена HA вируса гриппа по любому из пп.1-3 и/или молекула нуклеиновой кислоты по п.4 для применения в профилактике или лечении инфекции вируса гриппа.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13169830 | 2013-05-30 | ||
| PCT/EP2014/060997 WO2014191435A1 (en) | 2013-05-30 | 2014-05-27 | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201592306A1 EA201592306A1 (ru) | 2016-05-31 |
| EA034639B1 true EA034639B1 (ru) | 2020-03-02 |
Family
ID=48485075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201592306A EA034639B1 (ru) | 2013-05-30 | 2014-05-27 | Вакцины против вируса гриппа и их применения |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10517941B2 (ru) |
| EP (1) | EP3004142B1 (ru) |
| JP (1) | JP6643981B2 (ru) |
| KR (1) | KR102252163B1 (ru) |
| CN (1) | CN105452270B (ru) |
| AU (1) | AU2014273173B2 (ru) |
| BR (1) | BR112015029635B1 (ru) |
| CA (1) | CA2913859C (ru) |
| EA (1) | EA034639B1 (ru) |
| HK (1) | HK1223110A1 (ru) |
| IL (1) | IL242824B (ru) |
| MX (1) | MX369317B (ru) |
| MY (1) | MY190097A (ru) |
| PH (1) | PH12015502612B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201509663PA (ru) |
| WO (1) | WO2014191435A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201509229B (ru) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3566714A1 (en) | 2011-11-28 | 2019-11-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| EA034639B1 (ru) | 2013-05-30 | 2020-03-02 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцины против вируса гриппа и их применения |
| WO2015187158A1 (en) * | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Indevr, Inc. | Universal capture array for multiplexed subtype-specific quantification and stability determination of influenza proteins |
| AU2015279089B2 (en) | 2014-06-26 | 2021-01-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
| ZA201608812B (en) | 2014-06-26 | 2019-08-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
| PE20170290A1 (es) * | 2014-07-10 | 2017-03-26 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Vacunas contra virus de influenza y usos de las mismas |
| EA035375B1 (ru) | 2014-07-10 | 2020-06-03 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцины против вируса гриппа и их применения |
| KR20240042570A (ko) * | 2016-09-02 | 2024-04-02 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | 안정화된 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 영역 삼량체 및 그의 용도 |
| WO2018210804A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| JP7406377B2 (ja) | 2017-05-15 | 2023-12-27 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 安定なウイルス含有組成物 |
| EP3664839A4 (en) * | 2017-10-04 | 2021-10-20 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | HEADLESS HEMAGGLUTININ INFLUENZA Vaccine |
| HUE059545T2 (hu) | 2018-01-23 | 2022-11-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Influenzavírus-vakcinák és alkalmazásaik |
| KR20220057578A (ko) | 2019-09-05 | 2022-05-09 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 |
| WO2023154841A2 (en) * | 2022-02-11 | 2023-08-17 | The Texas A&M University System | Sars-cov-2 neutralizing synthetic proteins |
| WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010117786A1 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| WO2011123495A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-06 | Mount Sinai School Of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| WO2013079473A1 (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Crucell Holland B.V. | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| JPH0832638B2 (ja) | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| MY170607A (en) | 2006-09-07 | 2019-08-20 | Crucell Holland Bv | Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof |
| MY183517A (en) | 2009-05-11 | 2021-02-24 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h3n2 and uses thereof |
| CN103906763B (zh) | 2011-07-14 | 2016-10-12 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 能够中和***发育群1和***发育群2的a型流感病毒以及b型流感病毒的人结合分子 |
| EA034639B1 (ru) | 2013-05-30 | 2020-03-02 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцины против вируса гриппа и их применения |
| PE20170290A1 (es) | 2014-07-10 | 2017-03-26 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Vacunas contra virus de influenza y usos de las mismas |
| EA035375B1 (ru) | 2014-07-10 | 2020-06-03 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцины против вируса гриппа и их применения |
-
2014
- 2014-05-27 EA EA201592306A patent/EA034639B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-05-27 KR KR1020157036901A patent/KR102252163B1/ko active IP Right Grant
- 2014-05-27 AU AU2014273173A patent/AU2014273173B2/en active Active
- 2014-05-27 MX MX2015016382A patent/MX369317B/es active IP Right Grant
- 2014-05-27 CN CN201480030662.1A patent/CN105452270B/zh active Active
- 2014-05-27 MY MYPI2015704284A patent/MY190097A/en unknown
- 2014-05-27 EP EP14730460.4A patent/EP3004142B1/en active Active
- 2014-05-27 WO PCT/EP2014/060997 patent/WO2014191435A1/en active Application Filing
- 2014-05-27 CA CA2913859A patent/CA2913859C/en active Active
- 2014-05-27 JP JP2016516136A patent/JP6643981B2/ja active Active
- 2014-05-27 BR BR112015029635-1A patent/BR112015029635B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-05-27 SG SG11201509663PA patent/SG11201509663PA/en unknown
-
2015
- 2015-11-23 PH PH12015502612A patent/PH12015502612B1/en unknown
- 2015-11-25 US US14/952,794 patent/US10517941B2/en active Active
- 2015-11-29 IL IL242824A patent/IL242824B/en active IP Right Grant
- 2015-12-18 ZA ZA2015/09229A patent/ZA201509229B/en unknown
-
2016
- 2016-09-27 HK HK16111314.8A patent/HK1223110A1/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010117786A1 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| WO2011123495A1 (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-06 | Mount Sinai School Of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| WO2013079473A1 (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Crucell Holland B.V. | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| G. BOMMAKANTI, X. LU, M. P. CITRON, T. A. NAJAR, G. J. HEIDECKER, J. TER MEULEN, R. VARADARAJAN, X. LIANG: "Design of Escherichia coli-Expressed Stalk Domain Immunogens of H1N1 Hemagglutinin That Protect Mice from Lethal Challenge", JOURNAL OF VIROLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 86, no. 24, 15 December 2012 (2012-12-15), pages 13434 - 13444, XP055100077, ISSN: 0022538X, DOI: 10.1128/JVI.01429-12 * |
| GAYATHRI BOMMAKANTI, MICHAEL P. CITRON, ROBERT W. HEPLER, CHERYL CALLAHAN, GWENDOLYN J. HEIDECKER, TARIQ AHMAD NAJAR, XIANGHAN LU,: "Design of an HA2-based Escherichia coli expressed influenza immunogen that protects mice from pathogenic challenge.", PNAS, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 107, no. 31, 3 August 2010 (2010-08-03), pages 13701 - 13706, XP002675041, ISSN: 1091-6490, DOI: 10.1073/PNAS.1007465107 * |
| JOHN STEEL , ANICE C. LOWEN , TAIA T. WANG , MARK YONDOLA , QINSHAN GAO , KESTER HAYE , ADOLFO GARC�A-SASTRE , PETER PALESE: "Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.", MBIO, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 1, no. 1, 18 May 2010 (2010-05-18), US, pages e00018 - e00018-10-10, XP002676044, ISSN: 2150-7511, DOI: 10.1128/mbio.00018-10 * |
| SAGAWA H, OHSHIMA A, KATO I, OKUNO Y, ISEGAWA Y: "The immunological activity of a deletion mutant of influenza virus haemagglutinin lacking the globular region", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY., SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, SPENCERS WOOD., GB, vol. 77, no. 7, 1 January 1996 (1996-01-01), GB, pages 1483 - 1487, XP002675043, ISSN: 0022-1317, DOI: 10.1099/0022-1317-77-7-1483 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PH12015502612A1 (en) | 2016-02-29 |
| US10517941B2 (en) | 2019-12-31 |
| EP3004142A1 (en) | 2016-04-13 |
| NZ715583A (en) | 2021-02-26 |
| ZA201509229B (en) | 2022-03-30 |
| HK1223110A1 (zh) | 2017-07-21 |
| CA2913859A1 (en) | 2014-12-04 |
| PH12015502612B1 (en) | 2016-02-29 |
| EA201592306A1 (ru) | 2016-05-31 |
| CA2913859C (en) | 2021-11-30 |
| KR20160013205A (ko) | 2016-02-03 |
| IL242824B (en) | 2020-07-30 |
| US20160136262A1 (en) | 2016-05-19 |
| CN105452270B (zh) | 2020-12-01 |
| KR102252163B1 (ko) | 2021-05-14 |
| JP2016525889A (ja) | 2016-09-01 |
| SG11201509663PA (en) | 2015-12-30 |
| BR112015029635B1 (pt) | 2023-05-02 |
| MY190097A (en) | 2022-03-28 |
| JP6643981B2 (ja) | 2020-02-12 |
| WO2014191435A1 (en) | 2014-12-04 |
| MX2015016382A (es) | 2016-10-14 |
| BR112015029635A2 (pt) | 2017-09-26 |
| EP3004142B1 (en) | 2020-09-30 |
| CN105452270A (zh) | 2016-03-30 |
| AU2014273173A1 (en) | 2015-12-10 |
| AU2014273173B2 (en) | 2018-09-27 |
| MX369317B (es) | 2019-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10517941B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| US10328144B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| KR102463632B1 (ko) | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 | |
| AU2019212180A1 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| JP7167088B2 (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| MC et al. | international Bureau | |
| NZ715583B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM |