EA034530B1 - Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния - Google Patents

Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния Download PDF

Info

Publication number
EA034530B1
EA034530B1 EA201691558A EA201691558A EA034530B1 EA 034530 B1 EA034530 B1 EA 034530B1 EA 201691558 A EA201691558 A EA 201691558A EA 201691558 A EA201691558 A EA 201691558A EA 034530 B1 EA034530 B1 EA 034530B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
var
serine protease
composition
sio
factor
Prior art date
Application number
EA201691558A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691558A1 (ru
Inventor
Вольфганг Тешнер
Ханс-Петер Шварц
Рут Мадленер
Соня Сфатос
Азра Плевляковиц
Альфред Вебер
Original Assignee
Баксалта Инкорпорейтид
Баксалта Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42727304&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA034530(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US12/842,944 external-priority patent/US8304524B2/en
Application filed by Баксалта Инкорпорейтид, Баксалта Гмбх filed Critical Баксалта Инкорпорейтид
Publication of EA201691558A1 publication Critical patent/EA201691558A1/ru
Publication of EA034530B1 publication Critical patent/EA034530B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
    • A61K39/39525—Purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0026—Blood substitute; Oxygen transporting formulations; Plasma extender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Изобретение обеспечивает новые способы снижения содержания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в композиции белка плазмы. Кроме того, представлены способы производства композиций белков плазмы с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы. Среди других аспектов изобретение представляет водные и лиофилизированные композиции белков плазмы с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы. Другие аспекты включают способы лечения, управления ходом и/или предотвращения заболевания, включающие введение композиции белка плазмы с пониженным содержанием сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет патентной заявки Австралии № 2010202125, поданной 26 мая 2010 г. и опубликованной в качестве австралийского патента № 2010202125, патентной заявки США № 12/789365, поданной 27 мая 2010 г., и заявки на патент США № 12/842944, поданной 23 июля 2010 г., описание которых полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки для любых целей.
Уровень техники
Препараты крови на основе плазмы используются для лечения не только различных болезней крови, но и заболеваний иного происхождения. Например, иммуноглобулиновые (IgG) продукты, полученные из плазмы человека, впервые были использованы в 1952 году для лечения иммунодефицита. С тех пор препараты IgG нашли широкое применение по меньшей мере при трех основных категориях заболеваний: (1) иммунодефицитах, например, Х-сцепленной агаммаглобулинемии, гипогаммаглобулинемии (первичных иммунодефицитах) и приобретенных нарушениях иммунитета (вторичных иммунодефицитах), отличающихся низким уровнем антител; (2) воспалительных и аутоиммунных заболеваниях и (3) острых инфекциях.
Аналогично, фактор Н используется в качестве потенциального терапевтического средства для лечения ряда болезненных состояний человека, в том числе возрастной макулодистрофии (ВМД), гемолитического уремического синдрома (aHUS) и мезангиопролиферативного гломерулонефрита (MPGN).
Конкретнее, описана причинно-следственная связь между однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) в модуле 7 белка контроля комплемента (ССР) фактора Н и возрастной макулодистрофией (ВМД).
Исследования показали корреляцию между пониженными уровнями белков-ингибиторов интеральфа-трипсина (IaIp) в плазме и смертностью у пациентов с тяжелым сепсисом (Lim et al., J. Infect Dis. (2003) Sep 15; 188(6):919-26 and Opal et al., Crit Care Med. (2007) Feb; 35(2):387-92). Кроме того, некоторые исследования показали, что введение IaIp снижает смертность, связанную с сепсисом и септическим шоком (Jourdain et al., Am. J. Respir Crit Care Med. (1997) Dec; 156(6):1825-33; Yang et al., Crit Care Med. (2002) Mar; 30(3):617-22; Lim et al., J. Infect Dis. (2003) Sep 15; 188(6):919-26; и Wu et al., Crit Care Med. (2004) Aug; 32(8):1747-52; описания этих работ полностью включены в настоящий документ посредством ссылки для всех целей).
При производстве и разработке биотерапевтических средств на основе плазмы необходимо принимать во внимание различные меры предосторожности. К ним относятся способы удаления и/или инактивации гемоконтактных патогенов (например, вирусных и бактериальных патогенов), антикомплементной активности и других нежелательных примесей, вытекающих из использования донорской плазмы. Исследования показали, что введение высоких уровней веществ, обладающих амидолитической активностью, может привести к тромбоэмболическим осложнениям (Wolberg A.S. et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am. J. Hematol 2000; 65:30-34 и Alving B.M. et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties. J. Lab Clin. Med. 1980; 96:334-346; описания этих работ полностью включены в настоящий документ посредством ссылки для всех целей). Эти опасения подчеркиваются недавним добровольным изъятием из продажи средства octagam® (Octapharma) в США и приостановкой действия разрешения на реализацию octagam® и octagam 10% Европейской комиссией после увеличения количества сообщений о тромбоэмболических осложнениях. Вероятно, возрастание количества тромбозов было вызвано высоким уровнем амидолитической активности, вызванным примесями сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз, например фактора XI, фактора XIa, фактора XII и фактора XIIa (уведомление FDA: добровольный уход с рынка - 23 сентября 2010 г., 5% жидкий препарат Octagam [иммуноглобулин (человека) для внутривенного применения]; Octagam 50 мг/мл, раствор для вливаний - Octapharma France - Mise en quarantaine de tous les lots, опубликован онлайн 9 сентября 2010 г. Французским агентством по санитарной безопасности лекарственных средств (AFSSAPS); и Вопросы и ответы о приостановке действия разрешения на реализацию Octagam (нормального иммуноглобулина человека 5 и 10%), опубликованные онлайн 23 сентября 2010 г. Европейским агентством лекарственных средств).
Специализированные сериновые протеазы, обобщенно известные как факторы свертывания крови, являются неотъемлемыми компонентами как внутреннего, так и внешнего пути активации каскада свертывания. Под действием факторов свертывания проферменты сериновых протеаз, являющиеся неактивными предшественниками ферментов, становятся активированными протеазами, катализирующими активацию следующего протеазного профермента, что приводит к активации каскада. Каскад свертывания завершается активацией тромбина (фактор IIa) и фактора XIIIa, которые преобразуют фибриноген (фактор I) в фибрин (фактор Ia) и перекрестно связывают фибрин, формируя фибриновый тромб соответственно.
Внутренний путь активации, также известный как путь контактной активации, начинается с активации каллиреина и фактора XIIa (FXIIa) из прекалликреина и фактора XII соответственно. Активированная сериновая протеаза FXIIa расщепляет фактор XI (FXI), преобразуя этот профермент в фактор XIa (FXIa), активную сериновую протеазу, участвующую в последующей активации фактора Ха (FXa).
- 1 034530
Ввиду роста обеспокоенности по поводу присутствия сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз в композициях белков плазмы в данной области техники сохраняется потребность в способах снижения уровней этих загрязняющих веществ, особенно FXI, FXIa, FXII и FXIIa. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие потребности, предоставляя такие способы и композиции белков плазмы с пониженными уровнями сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз.
Сущность изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение основано на неожиданных экспериментальных данных о том, что сериновые протеазы и проферменты сериновых протеаз, конкретнее FXI, FXIa, FXII и FXIIa, можно удалить из композиций белков плазмы путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы снижения активности сериновых протеаз, содержания сериновых протеаз и содержания проферментов сериновых протеаз в композициях белка плазмы. Кроме того, представлены композиции белка плазмы, обладающие пониженными активностью сериновых протеаз, содержанием сериновых протеаз и содержанием проферментов сериновых протеаз, а также способы лечения или предотвращения заболевания за счет их введения.
В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляют собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) или фактор XII (FXII).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанный способ также включает первый этап обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения первый этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В еще одном варианте воплощения первый этап обогащения белка-мишени представляет собой этап ультрафильтрации/диафильтрации.
В других вариантах воплощения вышеописанных способов данный способ также включает второй этап обогащения белка-мишени перед контактом обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В еще одном варианте воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап ультрафильтрации/диафильтрации. В еще одном варианте воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап хроматографического обогащения.
В других вариантах воплощения вышеописанных способов данный способ также включает третий этап обогащения белка-мишени после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения третий этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В еще одном варианте воплощения третий этап обогащения белкамишени представляет собой этап ультрафильтрации/ диафильтрации. В еще одном варианте воплощения третий этап обогащения белка-мишени представляет собой этап хроматографического обогащения.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания белка-мишени плазмы; и (2) элюирование белка-мишени плазмы с хроматографической смолы.
В конкретном варианте воплощения примесь не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1). В еще одном конкретном варианте воплощения примесь связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1), но не элюируется с хроматографической смолы на подэтапе (2).
В некоторых других вариантах воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной из примесей; и (2) отделение смолы от композиции белка плазмы, причем белок-мишень плазмы не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных способов, включающих этап хроматографического обогащения, хроматографическая смола выбрана из группы, состоящей из анионообменной смолы, катионообменной смолы, смолы с гидрофобным взаимодействием, смолы со смешанным механизмом действия, гидроксиапатитной смолы, лиганд-аффинной смолы, иммуноаффинной смолы и смолы для эксклюзионной хроматографии.
- 2 034530
В некоторых других вариантах воплощения вышеописанных способов, включающих этап хроматографического обогащения, этап хроматографического обогащения включает отделение по меньшей мере одной из примесей от белка-мишени по размеру и/или форме с помощью эксклюзионной хроматографии.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных способов белок-мишень плазмы выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, белка системы комплемента и ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI). В конкретном варианте воплощения белок системы комплемента выбран из группы, состоящей из фактора Н (FH), фактора D, белка комплемента С3 и С4-связывающего белка.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов композиция белка плазмы является промежуточным продуктом производства.
Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2 при параметрах раствора, при которых фактор Н остается связанным; и (г) элюирование фактора Н с SiO2.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает рН выше 6,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает рН выше 6,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает рН выше 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает рН, равный по меньшей мере 7,5.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов указанный параметр раствора включает рН не выше 11,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 10,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 9,0.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает электрическую проводимость выше приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, a фактор Н остается связанным, включает электрическую проводимость выше приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 50 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а фактор Н остается связанным, включает электрическую проводимость между приблизительно 20 и приблизительно 50 мСм/см.
В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2 при условиях, когда сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным с SiO2.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает рН выше 6,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает рН выше 6,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает рН выше 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюиру- 3 034530 ется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает рН, равный по меньшей мере 7,5.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов указанный параметр раствора включает рН не выше 11,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 10,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 9,0.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает электрическую проводимость менее приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, a сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает электрическую проводимость менее приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанным, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 10 мСм/см.
В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н, но ни одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает рН выше 6,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает рН выше 6,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает рН выше 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает рН, равный по меньшей мере 7,5.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов указанный параметр раствора включает рН не выше 11,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 10,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 9,0.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость выше приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость выше приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 50 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 20 и приблизительно 50 мСм/см.
В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не фактора Н; и (б) отделение SiO2 от композиции.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается,
- 4 034530 включает рН выше 6,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает рН выше 6,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает рН выше 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает рН, равный по меньшей мере 7,5.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов указанный параметр раствора включает рН не выше 11,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 10,0. В еще одном варианте воплощения указанный параметр раствора включает рН не выше 9,0.
В определенном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает электрическую проводимость менее приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает электрическую проводимость менее приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а фактор Н не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 10 мСм/см.
В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI) с пониженной активностью сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы с SiO2 при условиях, когда IaI остается связанным; и (г) элюирование IaI с SiO2.
В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интеральфа-трипсина (IaI) с пониженной активностью сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2 при условиях, когда сериновая протеаза остается связанной с SiO2.
В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интеральфа-трипсина (IaI) с пониженной активностью сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI, но ни одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2.
В девятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интеральфа-трипсина (IaI) с пониженной активностью сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего ингибитор интер-альфа-трипсина (IaI) и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания сериновой протеазы, но не ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI); и (б) отделение SiO2 от композиции.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных аспектов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации, равной по меньшей мере 1 г SiO2Y белка. В еще одном варианте воплощения вышеописанных аспектов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации, равной по меньшей мере 2 г SiO2Y белка. В еще одном варианте воплощения вышеописанных аспектов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации, равной по меньшей мере 2,5 г SiO2Y белка.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных аспектов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XI. В еще одном варианте воплощения вышеописанных аспектов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa. В еще одном варианте воплощения вышеописанных аспектов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XII. В еще одном варианте воплощения вышеописанных аспектов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIIa.
- 5 034530
В десятом аспекте настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготавливаемую с использованием способа снижения активности сериновой протеазы согласно любому из вышеописанных аспектов. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для введения в организм субъекта. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В одном варианте воплощения композиция является водной. В еще одном варианте воплощения композиция является лиофилизованной.
В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания, связанного с аномальной активностью белка плазмы в организме субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение композиции белка плазмы согласно вышеописанному аспекту. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, белка системы комплемента и ингибитора интер-альфатрипсина (IaI).
В двенадцатом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н, включающий этапы:
(а) контактирование суспендированной фракции осадка плазмы, содержащей фактор Н, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2); (б) промывка SiO2 буфером для промывки, характеризующимся низким рН и низкой электрической проводимостью; и (в) элюирование фактора Н с SiO2 элюирующим буфером, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью, равной по меньшей мере 10 мСм/см.
В конкретных вариантах воплощения фракция преципитата плазмы, содержащая фактор Н, представляет собой преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну или преципитат В по Кистлеру-Нитшманну. В некоторых вариантах воплощения способы также включают один или несколько дополнительных этапов, выбранных из:
(г) осаждение и удаление по меньшей мере одной из примесей от элюированного раствора фактора Н;
(д) осаждение и восстановления фактора Н из обогащенной композиции;
(е) дальнейшее обогащение фактора Н анионообменной хроматографией;
(ж) дальнейшее обогащение фактора Н аффинной хроматографией с гепарином;
(з) специализированный этап инактивации вирусов и (и) концентрирование обогащенной композиции фактора Н путем ультрафильтрации/диафильтрации.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы, причем по меньшей мере одна сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) или фактор XII (FXII).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает первый этап обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения первый этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В еще одном конкретном варианте воплощения первый этап обогащения белка-мишени представляет собой этап ультрафильтрации/диафильтрации.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает второй этап обогащения белка-мишени перед контактом обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В одном из вариантов воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап ультрафильтрации/диафильтрации. В одном из вариантов воплощения второй этап обогащения белка-мишени представляет собой этап хроматографического обогащения.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает третий этап обогащения белка-мишени перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В одном из вариантов воплощения третий этап обогащения белка-мишени представляет собой этап осаждения белка. В конкретном варианте воплощения этап осаждения белка представляет собой этап фракционирования спиртом. В одном из вариантов воплощения третий этап обогащения белка-мишени представляет собой этап ультрафильтрации/ диафильтрации. В одном из вариантов воплощения третий этап обогащения белка-мишени представляет собой этап хроматографического обогащения.
- 6 034530
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания белка-мишени плазмы; и (2) элюирование белка-мишени плазмы с хроматографической смолы.
В одном из конкретных вариантов воплощения по меньшей мере одна примесь не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1). В еще одном конкретном варианте воплощения по меньшей мере одна примесь связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1), но не элюируется с хроматографической смолы на подэтапе (2).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной из примесей; и (2) отделение смолы от композиции белка плазмы, причем белок-мишень плазмы не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов хроматографическая смола выбрана из группы, состоящей из анионообменной смолы, катионообменной смолы, смолы с гидрофобным взаимодействием, смолы со смешанным механизмом действия, гидроксиапатитной смолы, лиганд-аффинной смолы, иммуноаффинной смолы и смолы для эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой анионообменную смолу. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой катионообменную смолу. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой смолу с гидрофобным взаимодействием. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой смолу со смешанным механизмом действия. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой гидроксиапатитную смолу. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой лиганд-аффинную смолу. В одном из вариантов воплощения хроматографическая смола представляет собой иммуноаффинную смолу. В одном из вариантов воплощения этап хроматографического обогащения включает отделение по меньшей мере одной из примесей от белка-мишени по размеру и/или форме с помощью эксклюзионной хроматографии.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов белок-мишень плазмы выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, белка системы комплемента и ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI). В одном из вариантов воплощения белок плазмы является иммуноглобулином (Ig). В одном из вариантов воплощения белок плазмы является альбумином. В одном из вариантов воплощения белок плазмы является альфа-1-антитрипсином. В одном из вариантов воплощения белок плазмы является бутирилхолинэстеразой. В одном из вариантов воплощения белок плазмы является белком системы комплемента. В одном из вариантов воплощения белок системы комплемента выбран из группы, состоящей из фактора Н (FH), фактора D, белка комплемента С3- и С4-связывающего белка. В одном из вариантов воплощения белок плазмы является ингибитором интеральфа-трипсина.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов композиция белка плазмы является промежуточным продуктом производства.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2 при параметрах раствора, при которых значительная часть фактора Н остается связанной; и (г) элюирование фактора Н с SiO2.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н и по меньшей мере одна сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, включает рН ниже 7,0 и электрическую проводимость менее 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н и по меньшей мере одна сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, включает рН между 4,5 и 6,5 и электрическую проводимость менее 6 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н и по меньшей мере одна сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, включает рН между 4,5 и 6,5 и электрическую проводимость между 0,5 и 5 мСм/см.
- 7 034530
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора
Н остается связанной, включает рН ниже 7,0 и электрическую проводимость менее 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН между 4,5 и 6,5 и электрическую проводимость менее 6 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН между 5,0 и 6,5 и электрическую проводимость между 0,5 и 5 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, включает ионную силу, равную по меньшей мере 6 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, включает ионную силу, равную по меньшей мере 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, включает рН между 5,0 и 7,0.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, включает рН между 7,0 и 8,0 и ионную силу между 4 и 7 мСм/см.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2 при условиях, когда значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н и по меньшей мере одна сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, включает рН ниже 7,0 и электрическую проводимость менее 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН между 4,5 и 6,5 и электрическую проводимость менее 6 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, подходящий для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включает рН между 5,0 и 6,0 и электрическую проводимость между 0,5 и 5 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН между 5,0 и 7,0 и электрическую проводимость, равную по меньшей мере 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН между 7,0 и 8,0 и электрическую проводимость между 2 и 10 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость составляет от 4 до 7 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость составляет от 5 до 6 мСм/см.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н, но не существенной части по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается с SiO2, включает рН между 5,0 и 7,0 и электрическую проводимость не более 14 мСм/см.
- 8 034530
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость составляет от 9 до 14 мСм/см.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не существенной части фактора Н; и (б) отделение SiO2 от композиции.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, a значительная часть фактора Н не связывается с SiO2, включает рН между 5,0 и 7,0 и электрическую проводимость, равную по меньшей мере 11 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, a значительная часть фактора Н не связывается с SiO2, включает рН между 7,0 и 8,0 и электрическую проводимость между 2 и 10 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость раствора составляет от 4 до 7 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость раствора составляет от 5 до 6 мСм/см.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н, включающий этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н;
(б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см; и (в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов раствор, используемый для промывки SiO2, характеризуется рН между 5,5 и 6,5.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов раствор, используемый для промывки SiO2, характеризуется рН 6,0±0,2.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов раствор, используемый для элюирования фактора Н, характеризуется электрической проводимостью, равной по меньшей мере 20 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов раствор, используемый для элюирования фактора Н, характеризуется электрической проводимостью между 25 и 40 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов исходная композиция, содержащая фактор Н, является суспендированным преципитатом фракции II+III по Кону или эквивалентной ему фракцией.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов исходная композиция, содержащая фактор Н, является суспендированным преципитатом А по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентной ему фракцией.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов исходная композиция, содержащая фактор Н, является суспендированным преципитатом В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентной ему фракцией.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап осаждения по меньшей мере одной из примесей из раствора восстановленного фактора Н, причем фактор Н не осаждается.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап осаждения представляет собой ПЭГ -осаждение.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов ПЭГ-осаждение включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов конечная концентрация ПЭГ 4000 составляет 5±0,5%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап осаждения фактора Н из раствора восстановленного фактора Н.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап осаждения представляет собой ПЭГ-осаждение.
- 9 034530
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов ПЭГ-осаждение включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 10 до 15%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов конечная концентрация ПЭГ 4000 составляет 12±0,5%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап обогащения фактора Н с помощью хроматографии.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает анионообменную хроматографию.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает аффинную хроматографию с гепарином.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает анионообменную хроматографию с последующей аффинной хроматографией с гепарином.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает по меньшей мере один специализированный этап удаления или инактивации вирусов.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ включает этап нанофильтрации.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап концентрирования композиции фактора Н, включающий ультрафильтрацию/диафильтрацию.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2 при условиях, когда значительная часть IaI остается связанным; и (г) элюирование IaI с SiO2.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2 при условиях, когда значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI, но не существенной части по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) контактирование раствора, содержащего ингибитор интер-альфа-трипсина (IaI) и по меньшей мере одну сериновую протеазу, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не ингибитора интеральфа-трипсина (IaI); и (б) отделение SiO2 от композиции.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции иммуноглобулина G (IgG) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) осаждение криосупернатантной фракции плазмы на первом этапе осаждения в присутствии между приблизительно 6 и приблизительно 10% спирта при рН между примерно 7,0 и примерно 7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта;
(б) осаждение IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения в присутствии между приблизительно 20% и приблизительно 25% спирта при рН между примерно 6,7 и примерно 7,3 с получени- 10 034530 ем второго осадка;
(в) ресуспендирование второго осадка с образованием суспензии;
(г) контактирование суспензии с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при параметрах раствора, подходящих для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (д) отделение SiO2 от суспензии с образованием осветленной суспензии.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этапы: (е) осаждение IgG из осветленной суспензии, образованной на этапе (д), на третьем этапе осаждения в присутствии между приблизительно 22% и приблизительно 28% спирта при рН между около 6,7 и около 7,3 с образованием третьего осадка; (ж) ресуспендирование третьего осадка с образованием суспензии, и (з) отделение растворимой фракции от суспензии, полученной на этапе (д), тем самым образуя обогащенную композицию IgG.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап обогащения с помощью анионообменной хроматографии.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает этап обогащения с помощью катионообменной хроматографии.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ также включает по меньшей мере один специализированный этап инактивации или удаления вирусов.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ включает этап инактивации вирусов с помощью растворителя/детергента (S/D).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ включает этап нанофильтрации.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов данный способ включает этап инкубирования при низком рН.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап (б) включает коррекцию концентрации этанола в первом супернатанте, образованном на этапе (а), до приблизительно 25% (об./об.) при температуре между приблизительно -7 и приблизительно -9°C.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов температура составляет приблизительно -9°C.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап (в) включает ресуспендирование осадка, полученного на этапе (б), с буфером, содержащим фосфат и ацетат, причем рН буфера корректируют с помощью ледяной уксусной кислоты в количестве от 300 до 700 мл кислоты на 1000 л буфера.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап (г) включает добавление SiO2 до конечной концентрации между приблизительно 0,02 г/г осадка, образованного на этапе (б), и приблизительно 0,06 г/г осадка, образованного на этапе (б).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, подходящий для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включает рН между 4,5 и 6,0 и электрическую проводимость между 0,1 и 3 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов рН составляет величину между 4,9 и 5,3.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов электрическая проводимость составляет от 0,5 до 2 мСм/см.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап (д) включает подэтапы: (1) промывка фильтр-пресса буфером, содержащим фосфат и ацетат, в количестве по меньшей мере 3 мертвых объема фильтр-пресса, причем рН буфера корректируют с помощью ледяной уксусной кислоты в количестве между 50 и 200 мл на 1000 л буфера, тем самым формируя раствор для промывки, и (2) объединение фильтрата, полученного на этапе (е), с раствором для промывки, полученным на этапе (ж), тем самым формируя раствор.
В конкретный вариант воплощения вышеописанных способов также входит подэтап: (3) обработка раствора детергентом.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов этап (з) также включает обработку обогащенной композиции IgG растворителем и детергентом (S/D).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов обогащенная композиция IgG, полученная на этапе (з), содержит по меньшей мере 85% от содержания IgG во фракции криосупернатантной плазмы, используемой на этапе (а).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов обогащенная композиция IgG, полученная на этапе (з), содержит по меньшей мере 90% от содержания IgG во фракции криосупернатантной плазмы, используемой на этапе (а).
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов количество сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижено по меньшей мере на 90%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов количество сериновой протеазы или
- 11 034530 профермента сериновой протеазы снижено по меньшей мере на 95%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов количество сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижено по меньшей мере на 98%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов количество сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижено по меньшей мере на 99%.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой FXIa.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации по меньшей мере 1 г SiO2/p белка.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации по меньшей мере 2 г SiO2Y белка.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов композиция контактирует с SiO2 в конечной концентрации по меньшей мере 2,5 г SiOVf белка.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XI.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XII.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIIa.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготавливаемую с использованием способа снижения активности сериновой протеазы согласно любому из предыдущих пунктов формулы изобретения.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных композиций композиция составлена для введения в организм субъекта.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных композиций композиция составлена для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных композиций композиция является водной.
В конкретном варианте воплощения вышеописанных композиций композиция является лиофилизованной.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания, связанного с аномальной активностью белка плазмы в организме субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение композиции белка плазмы согласно любому из пп.124-128. В одном из вариантов воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, белка системы комплемента и ингибитора интеральфа-трипсина (IaI).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Обзор типичной схемы фракционирования плазмы.
Фиг. 2. Содержание фактора Н в выбранных фракциях при промышленном фракционировании белков плазмы, измеренное с помощью твердофазного ИФА
Фиг. 3. Иллюстрация фактора Н и амидолитической активности (измеренных с помощью субстрата CS2166), элюированных с SiO2 при параметрах раствора с переменной электрической проводимостью при рН 7,5.
Подробное описание изобретения
I. Введение.
С учетом широкого применения терапевтических композиций белков плазмы крови, например композиций иммуноглобулинов, факторов свертывания крови, ингибиторов фактора свертывания и белков системы комплемента, обеспечение безопасности этих композиций имеет первостепенное значение. Недавние опасения по поводу содержания амидолитических соединений в этих композициях в сочетании с появлением тромбоэмболических осложнений у пациентов, подвергающихся введению композиции белков плазмы, подчеркивают необходимость, существующую в данной области техники, в способах уменьшения содержания сериновых протеаз (например, FXIa и FXIIa) и проферментов сериновых протеаз (например, FXI и FXII) во время производства этих биопрепаратов. Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что оно, по меньшей мере, частично основано на неожиданных экспериментальных данных о том, что тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) можно использовать для связывания сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз, присутствующих в композициях белков плазмы. В силу этого здесь представлены способы снижения концентрации сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз в процессе производства композиций белков плазмы.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы производства, основанные на неожиданных экспериментальных данных о том, что тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) можно использовать для удаления значительного количества сериновой протеазы (например, FXIa и FXIIa) и
- 12 034530 профермента сериновой протеазы (например, FXI и FXII) из растворов белков плазмы. В силу этого, способы, приведенные здесь, можно легко интегрировать в существующие производственные процедуры, например фракционирование пулов образцов плазмы, предпочтительно образцов плазмы человека, с помощью этанола при низкой температуре (обзор в Schultze И.Е., Heremans J.F.; Molecular Biology of Human Proteins. Vol. I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317). В то же время способы, приведенные здесь, никоим образом не ограничивают их использование для способов производства, включая фракционирование этанолом. Другие методологии очистки белков плазмы также совместимы со способами, представленными здесь, например фракционированием полимерами (например, ПЭГ) и хроматографическими методологиями (например, анионной и/или катионообменной хроматографией, аффинной хроматографией, иммуноаффинной хроматографией, эксклюзионной хроматографией, хроматографией с гидрофобными взаимодействиями, хроматографией смешанного действия и т.п.).
Кроме того, в отличие от других биопрепаратов, производимых с помощью рекомбинантной экспрессии ДНК-векторов в линиях клеток-хозяев, белки плазмы фракционируют из донорской крови и плазмы человека. Таким образом, поставку этих продуктов нельзя увеличить за счет простого увеличения объема производства. Напротив, уровень доступных для приобретения препаратов крови ограничен доступными запасами донорской крови и плазмы. Эта динамика приводит к недостаточной доступности сырой плазмы человека для производства новых факторов плазмы крови с менее установившимися коммерческими рынками, включая фактор комплемента Н (CFH) и белки-ингибиторы интер-альфа-трипсина (IaIp).
Из-за недостатка плазмы для производства новых продуктов плазмы их производство необходимо интегрировать в существующие рамки налаженных производств продуктов плазмы, например иммуноглобулинов и альбумина. Фактор Н, используемый в качестве потенциального терапевтического средства для ВМД, aHUS и MPGN, в числе прочего, является одним из таких продуктов плазмы крови, привлекающих внимание врачей. Однако за счет ресурсов, выделяемых, например, для производства гаммаглобулина IgG, необходимы способы производства фактора Н, которые можно внедрить в существующие схемы производства. Предложено несколько способов для достижения этих целей, однако многие из этих предложенных решений требуют модификации существующей схемы производства укоренившихся на рынке продуктов. Такие изменения потребуют нового одобрения регулирующих органов для укоренившихся продуктов и даже может привести к изменениям характеристик укоренившихся продуктов.
Например, в WO 2007/066017 описаны способы получения препаратов фактора Н из супернатанта криопреципитата.
Описанный способ состоит из получения супернатанта криопреципитата, анионнообменной хроматографии супернатанта (АЕС), аффинной хроматографии с гепарином (НАС) потока от АЕС, катионообменной хроматографии сильных катионов (СЕС) элюата от НАС, анионообменной хроматографии сильных анионов (sAEC) элюата от СЕС и элюирования фактора Н с sAEC. Недостаток этого подхода состоит в том, что супернатанты криопреципитатов являются распространенными промежуточными фракциями при производстве многих коммерчески важных продуктов плазмы крови, включая гамма-глобулин IgG (IVIG и подкожного введения) и альбумин. Поэтапная хроматографическая обработка этой фракции модифицирует супернатант криопреципитата и потребует адаптации производства укоренившихся препаратов крови неизвестным образом. Помимо необходимости полного повторного восстановления действия и возможного переконструирования этого производства, необходимо повторное одобрение производственных процедур основными контролирующими органами.
Аналогичным образом, в WO 2008/113589 описаны способы получения препаратов фактора Н препаратов из плазмы человека. В частности, в этой публикации описана очистка фактора Н от трех известных фракций плазмы, а именно супернатанта фракции I по Кону-Онкли, преципитата фракции III по Кону-Онкли и преципитата В Кистлера-Ништманна. По отношению к первому способу в WO 2008/113589 описано, что фактор Н можно удалить из супернатанта фракции I по Кону-Онкли путем добавления этапа аффинной хроматографии с гепарином. Недостаток этого подхода состоит в том, что супернатант фракции I по Кону-Онкли является распространенной промежуточной фракцией при производстве многих коммерчески важных продуктов плазмы крови, включая гамма-глобулин IgG (IVIG и подкожного введения) и альбумин. Аналогичным образом, способы производства многих иммуноглобулинов (например, IgG, IVIG и т.д.), например Gammagard® Liquid and Kiovig (Baxter International Inc.), не основаны на этапах осаждения фракции III по Кону-Онкли или получения преципитата В Кистлера-Ништманна. Недостатком внедрения дополнительных шагов, например этапов аффинной хроматографии с гепарином, осаждения фракции III или получения преципитата В, в схемы производства укоренившихся препаратов крови, как указывалось выше, является необходимость повторного восстановления действия процедуры производства, повторное одобрение производственных процедур основными контролирующими органами и возможность дальнейших непредвиденных последствий для выхода и/или чистоты укоренившегося продукта.
В связи с этим сохраняется потребность в способах производства фактора Н, не требующих допол
- 13 034530 нительных затрат плазмы или переконструирования и повторного одобрения контролирующими органами существующих процедур производства коммерчески значимых препаратов плазмы крови, например, альбумина и гамма-глобулинов IgG для внутривенного (IVIG) или подкожного введения. Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что оно, по меньшей мере, частично основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что фактор Н, сериновые протеазы и проферменты сериновых протеаз могут одновременно связываться с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), за счет чего возможно отделение сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз от несвязанного первого интересующего исследователя белка (например, IgG), а затем отделение фактора Н, сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз путем дифференциального элюирования с SiO2. Аналогичным образом, настоящее изобретение, по меньшей мере, частично основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что IaIp, сериновые протеазы и проферменты сериновых протеаз могут одновременно связываться с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и затем разделяться за счет дифференциального элюирования IaIp и сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз с SiO2.
II. Определения.
При использовании здесь фактор Н относится к белку-компоненту альтернативного пути комплемента, кодируемому геном фактора Н комплемента (например, CFH; NM000186; GeneID:3075; UniProt ID P08603; Ripoche et al., Biochem. J. 249:593-602(1988)). Фактор Н транслируется в виде 1213аминокислотного полипептида-предшественника, подвергающегося процессингу путем удаления 18аминокислотного сигнального пептида, что приводит к образованию зрелого белка фактора Н (аминокислоты 19-1231). При использовании в настоящем изобретении, определение фактора Н охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые могут находиться в образце плазмы, например, в образце плазмы человека. Примеры мутаций фактора Н, найденных в популяции людей, включают, без ограничения, Y402H; V62I; R78G; R127L; Д224; Q400K; C431S; T493R; C536R; I551T; R567G; C630W; C673S; C673Y; E850K; S890I; H893R; C915S; E936D; Q950H; Y951H; Т956М; C959Y; W978C; N997T; V1007I; V1007L; А1010Т; T1017I; Y1021F; C1043R; N1050Y; I1059T; Q1076R; R1078S; D1119G; V1134G; Y1142D; Q1143E; W1157R; C1163W; W1183L; W1183R; T1184R; L1189R; S1191L; G1194D; V1197A; Е1198А; F1199S; R1210C; R1215G; R1215Q; YPTCAKR122 5:12 31FQS и P1226S. Обнаружено, что многие из этих мутаций ассоциируются с различными заболеваниями и расстройствами, в том числе, атипичным гемолитическим уремическим синдромом (aHUS), возрастной макулодистрофией (ВМД), мезангиопролиферативным гломерулонефритом типа II (MPGNII), недостаточностью CFH и базальными пластинчатыми друзами. Фактор Н также включает белки, содержащие посттрансляционные модификации. Например, считается, что фактор Н модифицируется N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) по остаткам 529, 718, 802, 822, 882, 911, 1029 и 1095.
При использовании здесь термин белки-ингибиторы интер-альфа-трипсина или IaIp относится к семейству ингибиторов протеаз плазмы, включающему полипептиды, кодируемые одним или более из гена предшественника альфа-1-микроглобулина/бикунина (АМВР; UniGene ID:231948, полипептид бикунин), гена ингибитора интер-альфа (глобулина) H1 (ITIH1; UniGene ID:224173, полипептид H1), гена ингибитора интер-альфа (глобулина) Н2 (ITIH2; Unigene ID:139782, полипептид Н2), гена ингибитора интер-альфа (глобулина) Н3 (ITIH3; UniGene ID:140017, полипептид Н3) или гена ингибитора интеральфа (глобулина) Н4 (гликопротеин, чувствительный к калликреину плазмы, полипептид Н4) (ITIH4; UniGene ID:3321613). Типичные IaIp-ингибиторы протеаз включают, без ограничения, IaI (бикунин, полипептиды H1 и Н2); PaI (бикунин и полипептид Н3), IaLI (бикунин и полипептид Н2), IaIH4P (полипептид Н4) и бикунин (Salier, J., et al., supra).
При использовании здесь криосупернатантная плазма относится к супернатанту, полученному после удаления криопреципитата, образованного путем оттаивания плазмы или пула плазмы при температурах около замораживания, например при температурах ниже приблизительно 10 °C, желательно при температуре не выше приблизительно 6°C. В контексте настоящего изобретения плазма может на равных основаниях называться восстановленной плазмой (т.е. плазмой, отделенной от цельной крови ex vivo) или свежезамороженной плазмой (т.е. плазмой, собранной путем плазмафереза). Криопреципитацию обычно осуществляют, например, путем оттаивания ранее замороженного пула плазмы, уже проанализированного из соображений безопасности и качества, хотя также можно использовать свежую плазму. После полного оттаивания замороженной плазмы при низкой температуре выполняют отделение твердого криопреципитата от жидкого супернатанта при низкой температуре (например, <6°C) путем центрифугирования или фильтрации.
При использовании здесь пул Кона относится к исходному материалу, используемому для фракционирования образца плазмы или пула образцов плазмы. Пулы Кона включают цельную плазму, образцы криосупернатантной плазмы и пулы образцов криосупернатантной плазмы, которые можно подвергать или не подвергать этапу предобработки. В некоторых вариантах воплощения пул Кона представляет собой образец криосупернатантной плазмы, из которого на этапе предобработки, например, за счет адсорбции на твердой фазе (например, гидроксиде алюминия, тонкоизмельченном диоксиде кремния и т.д.) или на этапе хроматографии (например, ионообменной или аффинной хроматографии с гепарином) уда- 14 034530 лен один или более фактор крови. С целью формирования пула Кона из криосупернатантной плазмы можно выделить различные факторы крови, включая агент обхода ингибитора восьмого фактора (ФЕЙБА), комплекс фактора IX, концентрат фактора VII или комплекс антитромбина III, но не ограничиваясь ими.
При использовании здесь фильтровальный осадок фракции II+III относится к твердой фазе, выделяемой после фильтрации или центрифугирования суспензии фракции II+III по Кону-Онкли или эквивалентной ей фракции. В предпочтительном варианте воплощения суспензию фракции II+III обрабатывают адсорбирующим материалом, например, тонкоизмельченным диоксидом кремния, для удаления примесей, например липидов, фибриногена, амидолитической активности, активности прекалликреинов и липопротеинов. В другом предпочтительном варианте воплощения к суспензии фракции II+III до центрифугирования или фильтрации можно добавить вспомогательный фильтрующий материал. В наиболее предпочтительным варианте воплощения суспензию фракции II+III до центрифугирования или фильтрации обрабатывают как адсорбирующим, так и вспомогательным фильтрующим материалом. После отделения осветленного супернатанта суспензии фракции II+III выделенный твердофазный материал называют фильтровальным осадком фракции II+III.
При использовании здесь тонкоизмельченный диоксид кремния или тонкоизмельченный кремнезем относится к оксиду кремния формулы SiO2, изготовленному в виде, дающем возможность адсорбции фактора Н на его поверхности. Типичные формы тонкоизмельченного диоксида кремния, пригодные для использования в способах настоящего изобретения, включают, без ограничения, высокодисперсный кремнезем, пирогенный кремнезем, Aerosil®, Cab-O-Sil™, коллоидный кремнезем, диатомит и т.п. В предпочтительном варианте воплощения в способах, представленных здесь, используют коммерческий продукт - гидрофильный пирогенный кремнезем. Неограничивающие примеры этих продуктов включают продукты, продаваемые Evonik Industries под торговым названием Aerosil® (например, Aerosil 90, Aerosil 130, Aerosil 150, Aerosil 200, Aerosil 300, Aerosil 380, Aerosil OX 50, Aerosil EG 50, Aerosil TT 600, Aerosil 200 SP, Aerosil 300 SP и Aerosil 300/30).
При использовании здесь заболевание или расстройство, ассоциированное с дисфункцией фактора Н относится к любому заболеванию, расстройству или состоянию субъекта, вызванному, характеризующемуся или приводящему к снижению уровня активности фактора Н в организме субъекта. Согласно целям настоящего изобретения активность фактора Н может относиться к способности фактора Н связывать белок или лиганд, например C3b, C3bBb, C3b2Bb, csbC3b, фактор комплемента В (CFB), Среактивный белок, эндотелиальные клетки, гликозаминогликаны (GAG), или в качестве альтернативы может относиться к его активности кофактора фактора I или его способности ускорять необратимую диссоциацию C3bBb и C3b2Bb. В одном из вариантов воплощения заболевание или расстройство, ассоциированные с дисфункцией фактора Н, приводят к недостаточности С3 и восприимчивости к бактериальным инфекциям. В некоторых случаях заболевания или расстройства, ассоциированные с дисфункцией фактора Н, включают состояния, вызванные или связанные с мутациями и полиморфизмом гена CFH, кодирующего фактор Н (см. обзор Barlow et al., Adv. Exp. Med. Biol. 2008; 632:117-42, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей). Заболевания, связанные с мутациями или полиморфизмами гена CFH, включают, без ограничения, недостаточность фактора Н, атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS), возрастную макулодистрофию (ВМД), мезангиопролиферативный гломерулонефрит типа II (MPGNII; de Cordoba and de Jorge, Clinical and Experimental Immunology, 151, 1-13 (2008)), инфаркт миокарда (Kardys et al., Journal of the American College of Cardiology, 47, 1568-1575 (2006); Mooijaart et al., Experimental Gerontology 42, 1116-1122 (2007); Nicaud et al., Journal of Molecular Medicine 85, 771-775 (2007); Pai et al., European Heart Journal 28, 1297-1303 (2007); Stark et al., Clinical Science (Lond), 113, 213-218 (2007)), коронарную недостаточность (CAD/CHD; (Meng et al., BMC Medical Genetics, 8, 62 (2007); Pulido et al., Mayo Clinic Proceedings 82, 301-307 (2007); Topol et al., Human Molecular Genetics 15 Spec No. 2, R117-R123 (2006)) и болезнь Альцгеймера (Hamilton et al., Neuromolecular Medicine 9, 331-334 (2007); Zetterberg et al., American Journal of Ophthalmology 143, 10591060 (2007)). Описания вышеприведенных источников, раскрывающие связи между мутациями и полиморфизмами в гене CFH и заболеваниями, ассоциированными с дисфункцией фактора Н, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для всех целей.
При использовании здесь заболевание или расстройство, связанное с аномальной активностью альтернативного пути активации комплемента относится к заболеванию, расстройству или состоянию, приводящему к неконтролируемой или аномальной активации альтернативного пути комплемента. Как правило, неконтролируемая или аномальная активация альтернативного пути комплемента может привести к повреждению клеток и тканей хозяина фоновыми факторами, а также к исчерпанию С3 и соответственно восприимчивости к патогенным инфекциям (например, грибковым, бактериальным, вирусным и инфекциям, вызванным простейшими). Примеры заболеваний и расстройств, связанных с аномальной активностью альтернативного пути комплемента, включают, без ограничения, различные аутоиммунные заболевания (например, ревматоидный артрит, IgA-нефропатию, астму, системную красную волчанку, рассеянный склероз, антифосфолипидный синдром, ANCA-ассоциированный васкулит, пу- 15 034530 зырчатку, увеит, миастению гравис, тиреоидит Хашимото), заболевания почек (например, IgAнефропатию, гемолитический уремический синдром, мезангиопролиферативный гломерулонефрит), другие заболевания, например астму, болезнь Альцгеймера, возрастную макулодистрофию, проксимальную ночную гемоглобинурию, аневризму брюшной аорты, ишемию и сепсис.
При использовании здесь термин ультрафильтрации (UF) охватывает различные способы мембранной фильтрации, в которых силы гидростатического давления продавливают жидкость через полупроницаемую мембрану. Взвешенные твердые частицы и высокомолекулярные растворенные вещества задерживаются, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через мембрану. Этот процесс разделения часто используется для очищения и концентрирования растворов высокомолекулярных соединений (103-106 Да), особенно растворов белков. Доступен ряд ультрафильтрационных мембран, в зависимости от размера удерживаемых ими молекул.
Ультрафильтрация обычно характеризуется размером пор мембраны между 1 и 1000 кДа и рабочим давлением от 0,01 до 10 бар.
При использовании здесь диафильтрацию осуществляют с помощью тех же, что используются при ультрафильтрации, или аналогичных мембран и обычно проводят в режиме тангенциальной поточной фильтрации. Во время диафильтрации буфер вносят в рециркуляционный резервуар, в то время как фильтрат удаляют однократно. Если продукт находится в концентрате (например, фактор Н), диафильтрация особенно полезна для отделения белков от низкомолекулярных соединений, например сахаров и солей. В некоторых случаях диафильтрацию можно использовать для замены раствора, буфера или отдельных компонентов буферной системы.
При использовании здесь термин смешивание описывает действие, вызывающее равное распределение двух или более отдельных соединений или веществ в растворе или суспензии за счет любой формы перемешивания. Полностью равномерное распределение всех ингредиентов в растворе или суспензии не является обязательным результатом смешивания, как этот термин используется в настоящем описании.
При использовании здесь термин растворитель охватывает любые жидкие вещества, способные растворять или диспергировать одно или несколько других веществ. Растворитель может быть неорганическим, например вода, или может являться органической жидкостью, например этанолом, ацетоном, метилацетатом, этилацетатом, гексаном, петролейным эфиром и т.д. При использовании в термине обработка растворителем и детергентом растворитель означает органический растворитель (например, три-Х-бутилфосфат), являющийся частью смеси растворитель-детергент, используемой для инактивации вирусов с липидной оболочкой в растворе.
При использовании здесь термин детергент в настоящем описании используется взаимозаменяемо с термином ПАВ или поверхностно-активный агент. ПАВ обычно представляют собой органические соединения, являющиеся амфифильными, т.е. содержащие как гидрофобные группы (хвосты), так и гидрофильные группы (головки), что делает ПАВ растворимыми как в органических растворителях, так и в воде. ПАВ можно классифицировать по наличию заряженных групп в составе головки. Головки неионогенных ПАВ не содержат заряженных групп, тогда как головки ионных ПАВ несут суммарный заряд. Цвиттерионные ПАВ содержат головки с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры распространенных ПАВ включают анионные (на основе сульфатных, сульфонатных или карбоксилатных анионов): перфтороктаноат (PFOA или PFO), перфтороктансульфонат (ПФОС), додецилсульфат натрия (ДСн), лаурилсульфат аммония и другие алкилсульфаты, лауретсульфат натрия (также известный как сульфат лаурилового эфира натрия или SLES), алкилбензолсульфонат;
катионные (на основе четвертичных катионов аммония): цетилтриметиламмоний-бромид (СТАВ), также известный, как гексадецилтриметиламмоний-бромид, и другие соли алкилтриметиламмония, цетилпиридиний-хлорид (СРС), полиэтоксилированный талловамин (РОЕА), бензалконий-хлорид (ВАС), бензэтоний-хлорид (BZT);
длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: включая каприлат, каприловую кислоту, гексаноат, капроновую кислоту, энантовую кислоту, пеларгоновую кислоту, каприновую кислоту и т.п.;
цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин, кокамидопропилбетаин, кокоамфоглицинат;
неионогенные: алкилполи(этиленоксид), алкилфенолполи(этиленоксид), сополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида) (известные под торговыми названиями Poloxamer или Poloxamine), алкилполиглюкозиды, включая октилглюкозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамидмоноэтаноламин, кокамиддиэтаноламин, полисорбаты (Tween 20, Tween 80 и т.д.), детергенты Triton и додецилдиметиламиноксид.
При использовании здесь термин терапевтически эффективное количество или доза или достаточное/эффективное количество или доза относится к дозе, которая производит действие, для которого ее вводят. Точная доза зависит от цели лечения и определяется специалистом в данной области с использованием известных методик (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott,
- 16 034530
Williams & Wilkins; описания которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для всех целей).
При использовании в настоящем описании термин распыление относится к средствам доставки жидкого вещества в систему, например, во время этапа осаждения спиртом, например этапа фракционирования I или осаждения II+III по Кону, в виде капель или аэрозоля жидкого вещества. Распыление можно осуществлять путем любого устройства с избыточным давлением, например контейнера (например, аэрозольного баллончика), имеющего распылительную головку или форсунку и работающего вручную или автоматически, создавая тонкодисперсный аэрозоль из жидкости. Как правило, распыление осуществляют, когда система, получающая жидкое вещество, непрерывно перемешивается или смешивается иным образом, для обеспечения быстрого и равномерного распределения жидкости в системе.
При использовании здесь термин приблизительно означает приблизительный диапазон ±10% от указанного значения. Например, выражение приблизительно 20% охватывает диапазон 18-22%. Как используется здесь, приблизительно также включает точное количество. Таким образом, приблизительно 20% означает приблизительно 20%, а также 20%. Как используется здесь, приблизительно относится к диапазону в области или вблизи заданного значения.
Термины доза и дозировка используются здесь взаимозаменяемо. Доза относится к количеству активного ингредиента, получаемого особью при каждом введении. Доза меняется в зависимости от ряда факторов, включая частоту введения, размер и переносимость особи; тяжесть состояния; риск развития побочных эффектов, а также путь введения. Для специалиста в данной области техники понятно, что дозу можно изменять в зависимости от вышеперечисленных факторов или основываясь на ходе лечения. Термин дозированная лекарственная форма относится к определенному формату фармацевтического средства и зависит от пути введения. Например, дозировка может содержаться в жидкости, например физиологическом растворе для инъекций.
При использовании здесь термин предотвращение относится к уменьшению вероятности или пониженной частоте симптомов, возникающих в результате состояния, ассоциированного с недостаточностью функции или дисфункцией белка крови.
При использовании здесь термины терапия, лечение и улучшение относятся к любому снижению тяжести симптомов, возникающих в результате состояния, ассоциированного с недостаточностью функции или дисфункцией белка крови. Как используется здесь, термины лечить и предотвращать не являются абсолютными терминами. Лечение может относиться к любой задержке начала, облегчению симптомов, улучшению выживаемости пациентов, увеличению продолжительности жизни или процента выживших и т.д. Действие лечения можно сравнить с особью или пулом особей, не получающих лечения.
При использовании здесь термин значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества определенного белка в композиции. Например, когда речь идет о значительной части сериновой протеазы в композиции, значительная часть сериновой протеазы соответствует по меньшей мере 10% от количества сериновой протеазы, присутствующей в композиции. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества определенного белка в композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества определенного белка в композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества определенного белка в композиции. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества определенного белка в композиции, или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества определенного белка в композиции.
III. Снижение содержания сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы.
В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции белка плазмы путем связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и отделения SiO2 от композиции.
В одном из вариантов воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) И/или фактор XII (FXII).
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества фактора XI в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора XI; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанного фактора XI.
- 17 034530
В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества фактора
XIa в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора XIa; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанного фактора XIa.
В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества фактора XII в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора XII; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанного фактора XII.
В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества фактора XIIa в композиции белка плазмы, включающий этапы:
(а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора XIIa; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанного фактора XIIa.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанный способ также включает первый этап обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем частичного осаждения белка в исходном материале, полученном из пула плазмы;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В одном из вариантов воплощения частичное осаждение осуществляют с помощью спирта. В предпочтительном варианте воплощения спирт представляет собой этанол. В еще одном предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) И/или фактор XII (FXII).
В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем ультрафильтрации и/или диафильтрации исходного материала, полученного из пула плазмы;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем контактирования исходного материала, полученного из пула плазмы, с хроматографической смолой;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В некоторых вариантах воплощения хроматографическая смола выбрана из анионообменной смолы, катионообменной смолы, смолы с гидрофобным взаимодействием, смолы со смешанным механизмом действия, гидроксиапатитной смолы, лиганд-аффинной смолы, иммуноаффинной смолы и смолы для эксклюзионной хроматографии. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор Xia (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают второй этап обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обога- 18 034530 щения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
Таблица 1
Типичные варианты воплощения комбинации первого и второго этапов обогащения
Первый этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Второй этап обогащения Ppt Вар. 1 Вар. И Вар. 21 Вар. 31 Вар. 41 Вар. 51 Вар. 61 Вар. 71 Вар. 81 Вар. 91
UF/DF Вар 2 Вар 12 Вар 22 Вар. 32 Вар. 42 Вар. 52 Вар. 62 Вар. 72 Вар. 82 Вар 92
АЕС Вар. 3 Вар. 13 Вар. 23 Вар. 33 Вар. 43 Вар 53 Вар. 63 Вар. 73 Вар 83 Вар. 93
СЕС Вар. 4 Вар. 14 Вар. 24 Вар. 34 Вар. 44 Вар 54 Вар. 64 Вар. 74 Вар 84 Вар. 94
HIC Вар. 5 Вар. 15 Вар. 25 Вар. 35 Вар. 45 Вар. 55 Вар. 65 Вар. 75 Вар 85 Вар. 95
НАС Вар. 6 Вар. 16 Вар. 26 Вар. 36 Вар. 46 Вар 56 Вар. 66 Вар. 76 Вар 86 Вар. 96
ММС Вар. 7 Вар. 17 Вар. 27 Вар. 37 Вар. 47 Вар 57 Вар. 67 Вар. 77 Вар 87 Вар. 97
LAC Вар. 8 Вар. 18 Вар. 28 Вар. 38 Вар. 48 Вар. 58 Вар. 68 Вар. 78 Вар. 88 Вар. 98
IAC Вар 9 Вар 19 Вар 29 Вар. 39 Вар. 49 Вар. 59 Вар. 69 Вар. 79 Вар. 89 Вар 99
SEC Вар 10 Вар 20 Вар 30 Вар. 40 Вар. 50 Вар. 60 Вар. 70 Вар. 80 Вар. 90 Вар 100
* Ppt: осаждение.
UF/DF: ультрафильтрация/диафильтрация.
АЕС: анионообменная хроматография.
СЕС: катионообменная хроматография.
HIC: хроматография с гидрофобным взаимодействием.
НАС: хроматография на гидроксиапатите.
ММС: хроматография со смешанным режимом.
LAC: лиганд-аффинная хроматография.
IAC: иммуноаффинная хроматография. SEC: эксклюзионная хроматография.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения белка-мишени после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка плазмы;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профер- 19 034530 мента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (г) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка плазмы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
Аналогичным образом, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в белке плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(б) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (д) выполнение третьего этапа обогащения белка-мишени с образованием третьей обогащенной композиции белка плазмы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-11.
Таблица 2
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа обогащения осаждением, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС ню НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 101 Вар. 111 Вар. 121 Вар. 131 Вар. 141 Вар. 151 Вар. 161 Вар. 171 Вар. 181 Вар. 191
UF/D F Вар. 102 Вар. 112 Вар. 122 Вар. 132 Вар. 142 Вар. 152 Вар. 162 Вар. 172 Вар. 182 Вар. 192
АЕС Вар. 103 Вар. 113 Вар. 123 Вар. 133 Вар 143 Вар. 153 Вар 163 Вар. 173 Вар 183 Вар. 193
СЕС Вар. 104 Вар. 114 Вар. 124 Вар. 134 Вар. 144 Вар. 154 Вар. 164 Вар. 174 Вар. 184 Вар. 194
тс Вар. 105 Вар. 115 Вар. 125 Вар. 135 Вар 145 Вар. 155 Вар 165 Вар. 175 Вар 185 Вар. 195
НАС Вар. 106 Вар. 116 Вар. 126 Вар. 136 Вар. 146 Вар. 156 Вар. 166 Вар. 176 Вар. 186 Вар. 196
ммс Вар. 107 Вар. 117 Вар. 127 Вар. 137 Вар. 147 Вар. 157 Вар. 167 Вар. 177 Вар. 187 Вар. 197
LAC Вар. 108 Вар. 118 Вар. 128 Вар. 138 Вар. 148 Вар. 158 Вар. 168 Вар. 178 Вар. 188 Вар. 198
IAC Вар. 109 Вар. 119 Вар. 129 Вар. 139 Вар. 149 Вар. 159 Вар. 169 Вар. 179 Вар. 189 Вар. 199
SEC Вар. ПО Вар. 120 Вар. 130 Вар. 140 Вар. 150 Вар. 160 Вар. 170 Вар. 180 Вар. 190 Вар. 200
* В соответствии с табл. 1.
- 20 034530
Таблица 3
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа ультрафильтрации/диафильтрации, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС Hie НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 201 Вар. 211 Вар. 221 Вар. 231 Вар. 241 Вар. 251 Вар. 261 Вар. 271 Вар. 281 Вар. 291
UF/ DF Вар. 202 Вар. 212 Вар 222 Вар. 232 Вар 242 Вар. 252 Вар. 262 Вар. 272 Вар. 282 Вар. 292
АЕ С Вар. 203 Вар. 213 Вар 223 Вар. 233 Вар 243 Вар. 253 Вар. 263 Вар. 273 Вар. 283 Вар. 293
СЕ С Вар. 204 Вар. 214 Вар 224 Вар. 234 Вар 244 Вар. 254 Вар. 264 Вар. 274 Вар. 284 Вар. 294
HIC Вар. 205 Вар. 215 Вар 225 Вар. 235 Вар 245 Вар. 255 Вар. 265 Вар. 275 Вар. 285 Вар. 295
НА С Вар. 206 Вар. 216 Вар 226 Вар. 236 Вар 246 Вар. 256 Вар. 266 Вар. 276 Вар. 286 Вар. 296
ММ с Вар. 207 Вар. 217 Вар 227 Вар. 237 Вар 247 Вар. 257 Вар. 267 Вар. 277 Вар. 287 Вар. 297
LA С Вар. 208 Вар. 218 Вар. 228 Вар. 238 Вар. 248 Вар 258 Вар 268 Вар 278 Вар. 288 Вар 298
IAC Вар. 209 Вар. 219 Вар. 229 Вар. 239 Вар. 249 Вар 259 Вар 269 Вар 279 Вар. 289 Вар 299
SEC Вар. 210 Вар. 220 Вар. 230 Вар. 240 Вар. 250 Вар 260 Вар 270 Вар 280 Вар. 290 Вар 300
* В соответствии с табл. 1.
Таблица 4
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа анионной хроматографии, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар 301 Вар. 311 Вар. 321 Вар 331 Вар. 341 Вар. 351 Вар. 361 Вар. 371 Вар. 381 Вар. 391
UF/DF Вар 302 Вар. 312 Вар. 322 Вар 332 Вар. 342 Вар. 352 Вар. 362 Вар. 372 Вар. 382 Вар. 392
АЕС Вар 303 Вар. 313 Вар. 323 Вар 333 Вар. 343 Вар. 353 Вар. 363 Вар. 373 Вар. 383 Вар. 393
СЕС Вар 304 Вар. 314 Вар. 324 Вар 334 Вар. 344 Вар. 354 Вар. 364 Вар. 374 Вар. 384 Вар. 394
HIC Вар. 305 Вар 315 Вар. 325 Вар. 335 Вар. 345 Вар. 355 Вар. 365 Вар. 375 Вар. 385 Вар. 395
НАС Вар. 306 Вар 316 Вар. 326 Вар. 336 Вар. 346 Вар. 356 Вар. 366 Вар. 376 Вар. 386 Вар. 396
ММС Вар. 307 Вар 317 Вар. 327 Вар. 337 Вар. 347 Вар. 357 Вар. 367 Вар. 377 Вар. 387 Вар. 397
LAC Вар. 308 Вар 318 Вар. 328 Вар. 338 Вар. 348 Вар. 358 Вар. 368 Вар. 378 Вар. 388 Вар. 398
IAC Вар. 309 Вар. 319 Вар. 329 Вар. 339 Вар. 349 Вар. 359 Вар. 369 Вар. 379 Вар. 389 Вар. 399
SEC Вар. 310 Вар. 320 Вар. 330 Вар. 340 Вар. 350 Вар. 360 Вар. 370 Вар. 380 Вар. 390 Вар. 400
* В соответствии с табл. 1.
- 21 034530
Таблица 5
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа катионной хроматографии, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС Hie НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 401 Вар. 411 Вар. 421 Вар 431 Вар. 441 Вар 451 Вар. 461 Вар 471 Вар 481 Вар. 491
UF/DF Вар. 402 Вар. 412 Вар. 422 Вар 432 Вар. 442 Вар 452 Вар. 462 Вар 472 Вар 482 Вар. 492
АЕС Вар. 403 Вар. 413 Вар. 423 Вар 433 Вар. 443 Вар 453 Вар. 463 Вар 473 Вар 483 Вар. 493
СЕС Вар. 404 Вар. 414 Вар. 424 Вар 434 Вар. 444 Вар 454 Вар. 464 Вар 474 Вар 484 Вар. 494
Hie Вар. 405 Вар. 415 Вар. 425 Вар 435 Вар. 445 Вар 455 Вар. 465 Вар 475 Вар 485 Вар. 495
НАС Вар. 406 Вар. 416 Вар. 426 Вар 436 Вар. 446 Вар 456 Вар. 466 Вар 476 Вар 486 Вар. 496
ММС Вар. 407 Вар. 417 Вар. 427 Вар. 437 Вар 447 Вар. 457 Вар. 467 Вар. 477 Вар. 487 Вар. 497
LAC Вар. 408 Вар. 418 Вар. 428 Вар. 438 Вар 448 Вар. 458 Вар. 468 Вар. 478 Вар. 488 Вар. 498
IAC Вар. 409 Вар. 419 Вар. 429 Вар. 439 Вар 449 Вар. 459 Вар. 469 Вар. 479 Вар. 489 Вар. 499
SEC Вар. 410 Вар. 420 Вар. 430 Вар. 440 Вар 450 Вар. 460 Вар. 470 Вар. 480 Вар. 490 Вар. 500
* В соответствии с табл. 1.
Таблица 6
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа хроматографии с гидрофобным взаимодействием, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар 501 Вар. 511 Вар. 521 Вар. 531 Вар. 541 Вар. 551 Вар. 561 Вар. 571 Вар. 581 Вар. 591
UF/DF Вар. 502 Вар. 512 Вар. 522 Вар. 532 Вар. 542 Вар. 552 Вар. 562 Вар. 572 Вар. 582 Вар. 592
АЕС Вар. 503 Вар. 513 Вар. 523 Вар 533 Вар 543 Вар. 553 Вар 563 Вар 573 Вар. 583 Вар. 593
СЕС Вар. 504 Вар. 514 Вар. 524 Вар. 534 Вар. 544 Вар. 554 Вар. 564 Вар. 574 Вар. 584 Вар. 594
HIC Вар. 505 Вар. 515 Вар. 525 Вар. 535 Вар. 545 Вар. 555 Вар. 565 Вар. 575 Вар. 585 Вар. 595
НАС Вар. 506 Вар. 516 Вар. 526 Вар 536 Вар 546 Вар. 556 Вар 566 Вар 576 Вар. 586 Вар 596
ММС Вар 507 Вар. 517 Вар. 527 Вар. 537 Вар. 547 Вар. 557 Вар. 567 Вар. 577 Вар. 587 Вар. 597
LAC Вар 508 Вар. 518 Вар. 528 Вар. 538 Вар. 548 Вар. 558 Вар. 568 Вар. 578 Вар. 588 Вар. 598
IAC Вар 509 Вар. 519 Вар. 529 Вар. 539 Вар. 549 Вар. 559 Вар. 569 Вар. 579 Вар. 589 Вар. 599
SEC Вар 510 Вар. 520 Вар. 530 Вар. 540 Вар. 550 Вар. 560 Вар. 570 Вар. 580 Вар. 590 Вар. 600
* В соответствии с табл. 1.
- 22 034530
Таблица 7
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа хроматографии на гидроксиапатите, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС МЫС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 601 Вар. 611 Вар. 621 Вар. 631 Вар. 641 Вар. 651 Вар. 661 Вар. 671 Вар. 681 Вар. 691
UF/DF Вар. 602 Вар. 612 Вар. 622 Вар. 632 Вар. 642 Вар. 652 Вар. 662 Вар. 672 Вар. 682 Вар. 692
АЕС Вар. 603 Вар. 613 Вар. 623 Вар. 633 Вар. 643 Вар. 653 Вар. 663 Вар. 673 Вар. 683 Вар. 693
СЕС Вар. 604 Вар. 614 Вар. 624 Вар. 634 Вар. 644 Вар. 654 Вар. 664 Вар. 674 Вар. 684 Вар. 694
HIC Вар 605 Вар. 615 Вар. 625 Вар. 635 Вар. 645 Вар. 655 Вар. 665 Вар. 675 Вар 685 Вар 695
НАС Вар 606 Вар. 616 Вар. 626 Вар. 636 Вар. 646 Вар. 656 Вар. 666 Вар. 676 Вар 686 Вар 696
ММС Вар 607 Вар. 617 Вар. 627 Вар. 637 Вар. 647 Вар. 657 Вар. 667 Вар. 677 Вар 687 Вар. 697
LAC Вар 608 Вар. 618 Вар. 628 Вар. 638 Вар. 648 Вар. 658 Вар. 668 Вар. 678 Вар 688 Вар. 698
IAC Вар. 609 Вар. 619 Вар 629 Вар 639 Вар. 649 Вар. 659 Вар. 669 Вар 679 Вар. 689 Вар. 699
SEC Вар. 610 Вар. 620 Вар 630 Вар 640 Вар. 650 Вар. 660 Вар. 670 Вар 680 Вар. 690 Вар. 700
* В соответствии с табл. 1.
Таблица 8
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа хроматографии со смешанным режимом, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 701 Вар. 711 Вар. 721 Вар. 731 Вар. 741 Вар. 751 Вар. 761 Вар. 771 Вар. 781 Вар. 791
UF/DF Вар. 702 Вар. 712 Вар. 722 Вар. 732 Вар. 742 Вар. 752 Вар. 762 Вар. 772 Вар. 782 Вар. 792
АЕС Вар. 703 Вар 713 Вар. 723 Вар. 733 Вар. 743 Вар. 753 Вар. 763 Вар. 773 Вар. 783 Вар. 793
СЕС Вар. 704 Вар 714 Вар. 724 Вар. 734 Вар. 744 Вар. 754 Вар. 764 Вар. 774 Вар. 784 Вар. 794
HIC Вар. 705 Вар 715 Вар. 725 Вар. 735 Вар. 745 Вар. 755 Вар. 765 Вар. 775 Вар. 785 Вар. 795
НАС Вар. 706 Вар. 716 Вар. 726 Вар. 736 Вар. 746 Вар. 756 Вар. 766 Вар. 776 Вар. 786 Вар. 796
ММС Вар 707 Вар. 717 Вар. 727 Вар. 737 Вар. 747 Вар. 757 Вар 767 Вар. 777 Вар 787 Вар. 797
LAC Вар. 708 Вар. 718 Вар. 728 Вар. 738 Вар. 748 Вар. 758 Вар. 768 Вар. 778 Вар. 788 Вар. 798
IAC Вар. 709 Вар. 719 Вар. 729 Вар. 739 Вар. 749 Вар. 759 Вар. 769 Вар. 779 Вар. 789 Вар. 799
SEC Вар. 710 Вар. 720 Вар. 730 Вар. 740 Вар. 750 Вар. 760 Вар. 770 Вар. 780 Вар. 790 Вар. 800
* В соответствии с табл. 1.
- 23 034530
Таблица 9
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа лиганд-аффинной хроматографии, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар. 801 Вар. 811 Вар. 821 Вар. 831 Вар. 841 Вар. 851 Вар. 861 Вар. 871 Вар. 881 Вар. 891
UF/DF Вар. 802 Вар. 812 Вар. 822 Вар. 832 Вар. 842 Вар. 852 Вар. 862 Вар. 872 Вар. 882 Вар. 892
АЕС Вар. 803 Вар. 813 Вар 823 Вар. 833 Вар. 843 Вар 853 Вар. 863 Вар. 873 Вар 883 Вар. 893
СЕС Вар. 804 Вар. 814 Вар. 824 Вар. 834 Вар. 844 Вар. 854 Вар. 864 Вар. 874 Вар. 884 Вар. 894
HIC Вар. 805 Вар. 815 Вар. 825 Вар. 835 Вар. 845 Вар. 855 Вар. 865 Вар. 875 Вар. 885 Вар. 895
НАС Вар. 806 Вар. 816 Вар. 826 Вар. 836 Вар. 846 Вар. 856 Вар. 866 Вар. 876 Вар. 886 Вар. 896
ММС Вар. 807 Вар. 817 Вар. 827 Вар. 837 Вар. 847 Вар. 857 Вар. 867 Вар. 877 Вар. 887 Вар. 897
LAC Вар. 808 Вар. 818 Вар. 828 Вар. 838 Вар. 848 Вар. 858 Вар. 868 Вар. 878 Вар. 88S Вар. 898
IAC Вар. 809 Вар. 819 Вар. 829 Вар. 839 Вар. 849 Вар. 859 Вар. 869 Вар. 879 Вар. 889 Вар. 899
SEC Вар. 810 Вар. 820 Вар. 830 Вар. 840 Вар. 850 Вар. 860 Вар. 870 Вар. 880 Вар. 890 Вар. 900
* В соответствии с табл. 1.
Таблица 10
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа иммуноаффинной хроматографии, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ММС LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар 901 Вар. 911 Вар 921 Вар. 931 Вар. 941 Вар 951 Вар. 961 Вар. 971 Вар 981 Вар. 991
UF/DF Вар. 902 Вар. 912 Вар. 922 Вар. 932 Вар. 942 Вар. 952 Вар. 962 Вар. 972 Вар. 982 Вар. 992
АЕС Вар 903 Вар. 913 Вар 923 Вар. 933 Вар. 943 Вар 953 Вар. 963 Вар. 973 Вар 983 Вар. 993
СЕС Вар 904 Вар. 914 Вар 924 Вар. 934 Вар. 944 Вар 954 Вар. 964 Вар. 974 Вар 984 Вар. 994
HIC Вар 905 Вар. 915 Вар. 925 Вар. 935 Вар. 945 Вар. 955 Вар. 965 Вар. 975 Вар. 985 Вар. 995
НАС Вар 906 Вар. 916 Вар. 926 Вар. 936 Вар. 946 Вар. 956 Вар. 966 Вар. 976 Вар. 986 Вар. 996
ММС Вар 907 Вар. 917 Вар. 927 Вар. 937 Вар. 947 Вар. 957 Вар. 967 Вар. 977 Вар. 987 Вар. 997
LAC Вар 908 Вар. 918 Вар. 928 Вар. 938 Вар. 948 Вар. 958 Вар. 968 Вар. 978 Вар. 988 Вар. 998
IAC Вар. 909 Вар. 919 Вар. 929 Вар 939 Вар 949 Вар. 959 Вар 969 Вар. 979 Вар. 989 Вар 999
SEC Вар. 910 Вар. 920 Вар. 930 Вар 940 Вар 950 Вар. 960 Вар 970 Вар. 980 Вар. 990 Вар 1000
* В соответствии с табл. 1.
- 24 034530
Таблица 11
Типичные варианты воплощения комбинации первого этапа эксклюзионной хроматографии, второго и третьего этапов обогащения
Второй этап обогащения*
Ppt UF/DF АЕС СЕС HIC НАС ммс LAC IAC SEC
Третий этап обогащения Ppt Вар 1001 Вар. 1011 Вар 1021 Вар. 1031 Вар. 1041 Вар 1051 Вар. 1061 Вар. 1071 Вар 1081 Вар. 1091
UF/DF Вар. 1002 Вар. 1012 Вар 1022 Вар. 1032 Вар. 1042 Вар 1052 Вар. 1062 Вар. 1072 Вар 1082 Вар. 1092
АЕС Вар. 1003 Вар. 1013 Вар. 1023 Вар. 1033 Вар. 1043 Вар. 1053 Вар. 1063 Вар. 1073 Вар. 1083 Вар. 1093
СЕС Вар. 1004 Вар. 1014 Вар. 1024 Вар. 1034 Вар. 1044 Вар. 1054 Вар. 1064 Вар. 1074 Вар. 1084 Вар. 1094
HIC Вар 1005 Вар. 1015 Вар 1025 Вар. 1035 Вар. 1045 Вар 1055 Вар. 1065 Вар. 1075 Вар 1085 Вар. 1095
НАС Вар. 1006 Вар 1016 Вар. 1026 Вар 1036 Вар. 1046 Вар. 1056 Вар. 1066 Вар. 1076 Вар. 1086 Вар. 1096
ммс Вар. 1007 Вар 1017 Вар. 1027 Вар 1037 Вар. 1047 Вар. 1057 Вар. 1067 Вар. 1077 Вар. 1087 Вар. 1097
LAC Вар. 1008 Вар 1018 Вар. 1028 Вар 1038 Вар. 1048 Вар. 1058 Вар. 1068 Вар. 1078 Вар. 1088 Вар. 1098
IAC Вар. 1009 Вар 1019 Вар. 1029 Вар 1039 Вар. 1049 Вар. 1059 Вар. 1069 Вар. 1079 Вар. 1089 Вар. 1099
SEC Вар. 1010 Вар 1020 Вар. 1030 Вар 1040 Вар. 1050 Вар. 1060 Вар. 1070 Вар. 1080 Вар. 1090 Вар. 1100
* В соответствии с табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания белка-мишени плазмы; и (2) элюирование белка-мишени плазмы с хроматографической смолы.
В одном из конкретных вариантов воплощения примесь не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1). В еще одном конкретном варианте воплощения примесь связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1), но не элюируется с хроматографической смолы на подэтапе (2).
В некоторых других вариантах воплощения вышеописанных способов этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной из примесей; и (2) отделение смолы от композиции белка плазмы, причем белок-мишень плазмы не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных способов белок-мишень плазмы выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, белка системы комплемента (например, фактора Н) и ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI). В конкретном варианте воплощения белок системы комплемента выбран из группы, состоящей из фактора Н (FH), фактора D, белка комплемента С3 и С4-связывающего белка. В предпочтительном варианте воплощения композиция белка представляет собой промежуточный продукт производства.
В некоторых вариантах воплощения способов, представленных здесь, количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 10%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 25%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 50%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 75%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 90%. В других вариантах воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 5, или по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, или до уровня ниже предела обнаружения тест-системы.
- 25 034530
Как правило, количество тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2), необходимое для способов, описанных здесь, изменяется в зависимости от ряда факторов, включая, без ограничения, общее количество белка, присутствующее в композиции, концентрацию сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы (например, FXI, FXIa, FXII и FXIIa) в композиции, белок-мишень и параметры раствора (например, рН, электрическую проводимость и т.д.). Например, SiO2 можно вносить в композициюмишень в концентрации между приблизительно 0,01 г/г белка и приблизительно 10 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 можно вносить в композицию-мишень в концентрации между приблизительно 1 г/г белка и приблизительно 5 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 можно вносить в композицию-мишень в концентрации между приблизительно 2 и приблизительно 4 г/г белка. В одном варианте воплощения SiO2 вносят в конечной концентрации, равной по меньшей мере 1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2,5 г/г общего белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 можно вносить в композицию-мишень в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 5 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 можно вносить в композициюмишень в концентрации между приблизительно 0,02 г/г белка и приблизительно 4 г/г белка. В одном варианте воплощения SiO2 вносят в конечной концентрации, равной по меньшей мере 0,1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,25 г/г общего белка. В других конкретных вариантах воплощения тонкоизмельченный диоксид кремния вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,01 г/г общего белка или по меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 г/г общего белка или более.
В некоторых вариантах воплощения, в которых белок-мишень извлекают из суспендированной фракции преципитата плазмы, после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации вносят вспомогательный фильтрующий материал, например, Celpure C300 (Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals). Вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 1,0 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,8 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,7 кг/кг преципитата. В других вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 0,07 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,06 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,05 кг/кг преципитата. В некоторых вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал вносят в конечной концентрации приблизительно 0,01 кг/кг преципитата или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг преципитата.
А. Иммуноглобулины.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции иммуноглобулина (Ig) плазмы. В одном из конкретных вариантов воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции Ig с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции Ig для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В одном варианте воплощения композиция Ig является композицией IgG. В других вариантах воплощения композиция Ig представляет собой композицию IgA, IgM, IgG или их смешанную композицию.
В одном из вариантов воплощения способ также включает первый этап обогащения белка Ig с образованием первой обогащенной композиции Ig перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка Ig выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии. В одном варианте воплощения композиция Ig является композицией IgG. В других вариантах воплощения композиция Ig представляет собой композицию IgA, IgM, IgG или их смешанную композицию.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают второй этап обогащения белка Ig с образованием второй обогащенной композиции Ig перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка Ig выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции Ig плазмы, включаю- 26 034530 щий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения Ig с образованием первой обогащенной композиции Ig плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения Ig с образованием второй обогащенной композиции
Ig плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения Ig после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения Ig выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции Ig плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения Ig с образованием первой обогащенной композиции Ig плазмы; (б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (г) выполнение второго этапа обогащения Ig с образованием второй обогащенной композиции Ig плазмы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
Аналогичным образом, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции Ig плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения Ig с образованием первой обогащенной композиции Ig плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения Ig с образованием второй обогащенной композиции Ig плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (д) выполнение третьего этапа обогащения Ig с образованием третьей обогащенной композиции Ig плазмы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-10 или 11.
В конкретном варианте воплощения композиция Ig представляет собой промежуточный продукт производства. Например, в некоторых вариантах воплощения композиция Ig представляет собой промежуточный продукт производства IgG, полученный при процедуре фракционирования по Кону (J. Am. Chem. Soc, 1946, 68(3):459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), процедуре фракционирования по Онкли (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550), процедуре очистки по Deutsch (J. Biol. Chem. 164:109118), процедуре очистки по Норре (Munch Med Wochenschr, 1967, (34):1749-1752), процедуре очистки по Falksveden (патент Швеции № 348942), процедуре очистки по Falksveden и Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980), процедуре очистки по Lebing (Vox Sang 2003 (84):193-201), процедуре очистки по Tanaka (Braz J. Med. Biol. Res. 2000, (33)37-30)), процедуре очистки по Teschner (Vox Sang, 2007, (92):42-55), процедуре фракционирования по Нитшманну (Helv. Chim. Acta, 37:866-873), процедуре фракционирования по Кистлеру-Ништманну (Vox Sang. 7:414-424 (1962)), процедуре очистки по Barundern (Vox Sang. 7:157-74 (1962)), процедуре очистки по Koblet (Vox Sang. 13:93-102 (1967)), процедуре очистки, описанной в патентах США № 5122373 или 5177194, модифицированных аналогах этих процедур и аналогичных, или эквивалентных процедурах, известных в данной области техники.
- 27 034530
В одном из конкретных вариантов воплощения композиция IgG представляет собой пул криосупернатанта по Кону. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является супернатантом фракции I по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является ресуспендированным преципитатом фракции III по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является ресуспендированным преципитатом фракции II+III по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является ресуспендированным преципитатом фракции I+II+III по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является ресуспендированным преципитатом G или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция IgG является ресуспендированным преципитатом В по Кистлеру-Ништманну или эквивалентной ему фракцией.
В конкретном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в ресуспендированном преципитате IgG фракции II+III. Обнаруженное преимущество состояло в том, что уровни фактора XI, фактора XII, фактора XIa и/или фактора XIIa в ресуспендированном преципитате IgG фракции II+III можно значительно уменьшить путем добавления этапа предобработки перед фильтрацией/центрифугированием. В одном из вариантов воплощения этот этап предобработки включает внесение частиц тонкоизмельченного диоксида кремния (например, пирогенного кремнезема Aerosil®) с последующим инкубационным периодом продолжительностью от 40 до 80 мин, в течение которого суспензия постоянно перемешивается. В некоторых вариантах воплощения инкубационный период составляет величину между приблизительно 50 и приблизительно 70 мин или приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более. Как правило, обработку осуществляют при температуре между приблизительно 0 и приблизительно 10°C или между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В некоторых вариантах воплощения обработку можно осуществлять при температуре приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C. В конкретном варианте воплощения обработку осуществляют при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 10°C.
Действие обработки пирогенным кремнеземом подтверждается на примере результатов, полученных в примерах 3, 6 и 7. В этих примерах преципитаты фракции II+III ресуспендировали и обрабатывали различными количествами тонкоизмельченного диоксида кремния. Как можно видеть в табл. 22, 27-29, активность сериновых протеаз фактора XI и XII и содержание профермента можно снизить по меньшей мере на 90% путем обработки суспензии SiO2.
В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации между приблизительно 20 и приблизительно 100 г/кг пасты II+III (т.е. для преципитата модифицированной фракции II+III, экстрагированного в соотношении 1:15, следует внести пирогенный кремнезем в концентрации между приблизительно 20 и приблизительно 100 г/16 кг суспензии II+III или в конечной концентрации между приблизительно 0,125 и приблизительно 0,625% (мас./мас.)). В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем можно внести в концентрации приблизительно 20 или приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг пасты II+III. В одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем (например, Aerosil 380 или эквивалент) вносят в суспензию модифицированной фракции II+III до конечной концентрации приблизительно 40 г/16 кг II+III. Смешивание происходит приблизительно при 2-8°C в течение по меньшей мере 50-70 мин.
В некоторых вариантах воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 10 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 5 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,02 и приблизительно 4 г/г белка. В одном варианте воплощения SiO2 вносят в конечной концентрации, равной по меньшей мере 0,1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,25 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2,5 г/г общего белка. В других конкретных вариантах воплощения тонкоизмельченный диоксид кремния вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,01 г/г общего белка или по меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 г/г общего белка или более.
В некоторых вариантах воплощения после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации вносят вспомогательный фильтрующий материал, например, Celpure C300 (Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals).
- 28 034530
Вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 1,0 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,8 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,7 кг/кг пасты II+III. В других вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,05 кг/кг пасты II+III. В некоторых вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал вносят в конечной концентрации приблизительно 0,01 кг/кг пасты II+III, или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг пасты II+III.
В одном из вариантов воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом до осветления суспензии фракции II+III фильтрацией или центрифугированием. В некоторых вариантах воплощения обработка пирогенным кремнеземом включает внесение между приблизительно 0,01 и приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,05 кг/кг пасты II+III, или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,1 кг/кг пасты II+III; смесь инкубируют в течение между приблизительно 50 и приблизительно 70 мин или приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В еще одном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом, снижающей уровни остаточного фибриногена, амидолитическую активность и/или активность активатора прекалликреина. В конкретном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом, снижающей уровни FXI, FXIa, FXII и FXIIa в препарате иммуноглобулина.
Как правило, удаление сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции иммуноглобулина можно осуществить путем обработки иммуноглобулин-содержащего раствора, тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при рН и электрической проводимости раствора, при которых сериновая протеаза и/или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2. Как показано в примерах, подходящие условия включают низкий рН и низкую электрическую проводимость.
Соответственно, в одном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции иммуноглобулина плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 7,0 для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и удаление SiO2 из композиции. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 5,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 7,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 7,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,6 и приблизительно 5,6. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,7 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,8 и приблизительно 5,4. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,9 и приблизительно 5,3. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,2. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН приблизительно 5,1. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН приблизительно 4,0 или приблизительно 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 или не более 7,0. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН не более 4,0 или не более 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9,
- 29 034530
5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 или не более 7,0.
В одном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции иммуноглобулина плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 3,0 мСм/см для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и удаление SiO2 из композиции. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,5 и приблизительно 2,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 1,3 и приблизительно 1,7 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,8 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,7 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,4 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,3 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,2 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,1 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,8 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,2 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,4 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,5 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,6 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,7 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе приблизительно 0,8 мСм/см.
В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе приблизительно 0,1 или не более 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мСм/см.
В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе не более 0,1 или не более 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 мСм/ см или 3,0 мСм/ см.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции иммуноглобулина плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при низком рН и низкой ионной силе для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и удаление SiO2 из композиции. В конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,8 и приблизительно 5,4 и при ионной силе между приблизительно 0,6 и приблизительно 1,0 мСм/см. В более конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,9 и приблизительно 5,3 и при ионной силе между приблизительно 0,7 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще более конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,2 и при ионной силе приблизительно 0,8 мСм/см. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН и ионной силе согласно любому из вариантов (Вар. 1222-3041), как представлено в табл. 12-15.
- 30 034530
Таблица 12
Типичные варианты воплощения параметров раствора для связывания сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiG2
pH
4.0-7.0 4.5-5.0 4,5-5,0 4.5-5.0 4,5-5,0 4,5-5,0 4.5-5.0 4,5-5,0 4,5-5,0
Ионная сила (мСм/см) 0Д- 2.0 Вар. 1222 Вар. 1638 Вар. 1638 Вар. 1638 Вар 1638 Вар. 1638 Вар. 1638 Вар 1638 Вар. 1638
од- 1.9 Вар. 1223 Вар. 1639 Вар. 1639 Вар. 1639 Вар 1639 Вар. 1639 Вар. 1639 Вар 1639 Вар. 1639
ОД- 1.8 Вар. 1224 Вар. 1640 Вар. 1640 Вар. 1640 Вар 1640 Вар. 1640 Вар. 1640 Вар 1640 Вар. 1640
од- 17 Вар. 1225 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641 Вар. 1641
од- 1,6 Вар. 1226 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642 Вар. 1642
ОД- 1.5 Вар. 1227 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643 Вар. 1643
ОД- 1.4 Вар. 1228 Вар. 1644 Вар. 1644 Вар. 1644 Вар 1644 Вар. 1644 Вар. 1644 Вар 1644 Вар. 1644
ОД- 13 Вар. 1229 Вар. 1645 Вар. 1645 Вар. 1645 Вар 1645 Вар. 1645 Вар. 1645 Вар 1645 Вар. 1645
ОД- 1.2 Вар. 1230 Вар. 1646 Вар. 1646 Вар. 1646 Вар 1646 Вар. 1646 Вар. 1646 Вар 1646 Вар. 1646
од- 1.1 Вар. 1231 Вар. 1647 Вар. 1647 Вар. 1647 Вар 1647 Вар. 1647 Вар. 1647 Вар 1647 Вар. 1647
- 31 034530
0,1- 1,0 Вар. 1232 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648 Вар. 1648
0, Ι- Ο, 9 Вар. 1233 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649 Вар. 1649
0, Ι- Ο, 8 Вар. 1234 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650 Вар. 1650
0.2- 2,0 Вар. 1235 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651 Вар. 1651
0,2- 1,5 Вар. 1236 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652 Вар. 1652
0.2- 1.0 Вар. 1237 Вар. 1653 Вар 1653 Вар. 1653 Вар. 1653 Вар 1653 Вар. 1653 Вар. 1653 Вар. 1653
0.2- 0.9 Вар. 1238 Вар. 1654 Вар 1654 Вар. 1654 Вар. 1654 Вар 1654 Вар. 1654 Вар. 1654 Вар. 1654
0.2- 0.8 Вар. 1239 Вар. 1655 Вар 1655 Вар. 1655 Вар. 1655 Вар 1655 Вар. 1655 Вар. 1655 Вар. 1655
0.3- 1,0 Вар. 1240 Вар. 1656 Вар 1656 Вар. 1656 Вар. 1656 Вар 1656 Вар. 1656 Вар. 1656 Вар. 1656
0,3- 0,9 Вар. 1241 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657 Вар. 1657
0,3- 0,8 Вар. 1242 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658 Вар. 1658
0,4- 1,0 Вар. 1243 Вар. 1659 Вар. 1659 Вар. 1659 Вар 1659 Вар. 1659 Вар. 1659 Вар 1659 Вар. 1659
0,4- 0,9 Вар. 1244 Вар. 1660 Вар. 1660 Вар. 1660 Вар 1660 Вар, 1660 Вар, 1660 Вар 1660 Вар. 1660
0,4- 0,8 Вар. 1245 Вар. 1661 Вар. 1661 Вар. 1661 Вар 1661 Вар, 1661 Вар, 1661 Вар 1661 Вар. 1661
0,5- 1.0 Вар. 1246 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662 Вар. 1662
0.5- 0.9 Вар. 1247 Вар. 1663 Вар 1663 Вар. 1663 Вар. 1663 Вар 1663 Вар. 1663 Вар. 1663 Вар. 1663
0.5- 0.8 Вар. 1248 Вар. 1664 Вар 1664 Вар. 1664 Вар. 1664 Вар 1664 Вар. 1664 Вар. 1664 Вар. 1664
Ο,ό- 1.0 Вар. 1249 Вар. 1665 Вар 1665 Вар. 1665 Вар. 1665 Вар 1665 Вар. 1665 Вар. 1665 Вар. 1665
0.6- 0,9 Вар. 1250 Вар. 1666 Вар 1666 Вар. 1666 Вар. 1666 Вар. 1666 Вар. 1666 Вар. 1666 Вар. 1666
0,6- 0,8 Вар 1251 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667 Вар. 1667
0,7- Вар Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
- 32 034530
го 1252 1668 1668 1668 1668 1668 1668 1668 1668
0.7- 0.9 Вар. 1253 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669 Вар. 1669
од Вар. 1254 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670 Вар. 1670
0.2 Вар, 1255 Вар. 1671 Вар. 1671 Вар. 1671 Вар 1671 Вар. 1671 Вар. 1671 Вар 1671 Вар. 1671
0,3 Вар. 1256 Вар. 1672 Вар 1672 Вар. 1672 Вар. 1672 Вар. 1672 Вар. 1672 Вар. 1672 Вар 1672
ОД Вар. 1257 Вар. 1673 Вар 1673 Вар. 1673 Вар. 1673 Вар. 1673 Вар. 1673 Вар. 1673 Вар 1673
0,5 Вар. 1258 Вар. 1674 Вар 1674 Вар. 1674 Вар. 1674 Вар. 1674 Вар. 1674 Вар. 1674 Вар 1674
0,6 Вар. 1259 Вар. 1675 Вар 1675 Вар. 1675 Вар. 1675 Вар. 1675 Вар. 1675 Вар. 1675 Вар 1675
0,7 Вар. 1260 Вар. 1676 Вар 1676 Вар. 1676 Вар. 1676 Вар. 1676 Вар. 1676 Вар. 1676 Вар 1676
0,8 Вар. 1261 Вар. 1677 Вар 1677 Вар. 1677 Вар. 1677 Вар. 1677 Вар. 1677 Вар. 1677 Вар 1677
0.9 Вар. 1262 Вар. 1678 Вар. 1678 Вар. 1678 Вар 1678 Вар. 1678 Вар. 1678 Вар 1678 Вар. 1678
1 Вар. 1263 Вар. 1679 Вар. 1679 Вар. 1679 Вар 1679 Вар. 1679 Вар. 1679 Вар 1679 Вар. 1679
1Д Вар. 1264 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680 Вар. 1680
L2 Вар. 1265 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681 Вар. 1681
1.3 Вар. 1266 Вар. 1682 Вар. 1682 Вар. 1682 Вар 1682 Вар. 1682 Вар. 1682 Вар 1682 Вар. 1682
1,4 Вар. 1267 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683 Вар. 1683
1,5 Вар. 1268 Вар. 1684 Вар 1684 Вар. 1684 Вар. 1684 Вар. 1684 Вар. 1684 Вар. 1684 Вар 1684
1,6 Вар. 1269 Вар. 1685 Вар 1685 Вар. 1685 Вар. 1685 Вар. 1685 Вар. 1685 Вар. 1685 Вар 1685
1,7 Вар. 1270 Вар. 1686 Вар 1686 Вар. 1686 Вар. 1686 Вар. 1686 Вар 1686 Вар. 1686 Вар 1686
1,8 Вар. 1271 Вар. 1687 Вар 1687 Вар. 1687 Вар. 1687 Вар. 1687 Вар. 1687 Вар. 1687 Вар 1687
1,9 Вар. 1272 Вар. 1688 Вар 1688 Вар. 1688 Вар. 1688 Вар. 1688 Вар. 1688 Вар. 1688 Вар 1688
2 Вар 1273 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689 Вар. 1689
- 33 034530
Таблица 13
Типичные варианты воплощения параметров раствора для связывания сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiG2
pH
5.0-7.0 5,0-6,5 5,0-6.0 5,0-5,5 4.6-5.6 4,7-5,5 4.8-5.4 4,9-5,3 5,0-5.2
g s о £ ϊ ί X о S 0,1- 2,0 Вар. 1690 Вар. 1742 Вар 1794 Вар. 1846 Вар 1898 Вар. 1950 Вар. 2002 Вар 2054 Вар. 2106
од- 1.9 Вар 1691 Вар. 1743 Вар. 1795 Вар 1847 Вар. 1899 Вар 1951 Вар. 2003 Вар. 2055 Вар 2107
од- 1.8 Вар. 1692 Вар. 1744 Вар. 1796 Вар 1848 Вар. 1900 Вар 1952 Вар. 2004 Вар. 2056 Вар 2108
0.1- 1.7 Вар 1693 Вар. 1745 Вар. 1797 Вар 1849 Вар. 1901 Вар 1953 Вар. 2005 Вар. 2057 Вар 2109
0,1- 1,6 Вар. 1694 Вар 1746 Вар. 1798 Вар. 1850 Вар. 1902 Вар. 1954 Вар. 2006 Вар 2058 Вар. 2110
0,1- 1,5 Вар. 1695 Вар, 1747 Вар. 1799 Вар. 1851 Вар. 1903 Вар. 1955 Вар. 2007 Вар 2059 Вар. 2111
0,1- 1,4 Вар. 1696 Вар 1748 Вар. 1800 Вар. 1852 Вар. 1904 Вар. 1956 Вар. 2008 Вар. 2060 Вар. 2112
0,1- 1,3 Вар. 1697 Вар 1749 Вар 1801 Вар. 1853 Вар 1905 Вар. 1957 Вар. 2009 Вар 2061 Вар. 2113
0,1- 1,2 Вар. 1698 Вар, 1750 Вар. 1802 Вар. 1854 Вар. 1906 Вар. 1958 Вар. 2010 Вар 2062 Вар. 2114
0,1- 1.1 Вар. 1699 Вар, 1751 Вар. 1803 Вар. 1855 Вар. 1907 Вар. 1959 Вар. 2011 Вар. 2063 Вар. 2115
од- 1.0 Вар 1700 Вар. 1752 Вар. 1804 Вар 1856 Вар. 1908 Вар 1960 Вар. 2012 Вар. 2064 Вар 2116
од- 0.9 Вар. 1701 Вар. 1753 Вар. 1805 Вар 1857 Вар. 1909 Вар 1961 Вар. 2013 Вар. 2065 Вар 2117
0.1- 0.8 Вар 1702 Вар. 1754 Вар. 1806 Вар, 1858 Вар. 1910 Вар 1962 Вар. 2014 Вар. 2066 Вар 2118
0.2- 2.0 Вар 1703 Вар. 1755 Вар. 1807 Вар 1859 Вар. 1911 Вар 1963 Вар. 2015 Вар. 2067 Вар 2119
0.2- 1,5 Вар 1704 Вар. 1756 Вар. 1808 Вар I860 Вар. 1912 Вар 1964 Вар. 2016 Вар. 2068 Вар 2120
0,2- 1,0 Вар. 1705 Вар. 1757 Вар. 1809 Вар. 1861 Вар. 1913 Вар. 1965 Вар. 2017 Вар. 2069 Вар. 2121
0,2- Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
- 34 034530
0.9 1706 1758 1810 1862 1914 1966 2018 2070 2122
0.2- 0.8 Вар. 1707 Вар. 1759 Вар. 1811 Вар. 1863 Вар. 1915 Вар 1967 Вар. 2019 Вар. 2071 Вар. 2123
0.3- 1.0 Вар. 1708 Вар. 1760 Вар. 1812 Вар. 1864 Вар. 1916 Вар 1968 Вар. 2020 Вар. 2072 Вар. 2124
0.3- 0.9 Вар. 1709 Вар. 1761 Вар. 1813 Вар. 1865 Вар. 1917 Вар 1969 Вар. 2021 Вар. 2073 Вар. 2125
0,3- 0,8 Вар. 1710 Вар. 1762 Вар. 1814 Вар. 1866 Вар. 1918 Вар. 1970 Вар. 2022 Вар. 2074 Вар. 2126
0,4- 1.0 Вар. 1711 Вар. 1763 Вар 1815 Вар. 1867 Вар. 1919 Вар. 1971 Вар. 2023 Вар 2075 Вар. 2127
0,4- 0.9 Вар 1712 Вар. 1764 Вар. 1816 Вар 1868 Вар. 1920 Вар 1972 Вар 2024 Вар. 2076 Вар 2128
0.4- 0,8 Вар 1713 Вар. 1765 Вар. 1817 Вар. 1869 Вар. 1921 Вар. 1973 Вар. 2025 Вар. 2077 Вар. 2129
0.5- 1,0 Вар 1714 Вар. 1766 Вар. 1818 Вар. 1870 Вар. 1922 Вар. 1974 Вар. 2026 Вар. 2078 Вар. 2130
0,5- 0,9 Вар 1715 Вар. 1767 Вар. 1819 Вар 1871 Вар. 1923 Вар 1975 Вар 2027 Вар. 2079 Вар 2131
0,5- 0,8 Вар. 1716 Вар. 1768 Вар 1820 Вар. 1872 Вар. 1924 Вар. 1976 Вар. 2028 Вар. 2080 Вар. 2132
0,6- 1,0 Вар. 1717 Вар. 1769 Вар. 1821 Вар. 1873 Вар. 1925 Вар. 1977 Вар. 2029 Вар. 2081 Вар. 2133
0,6- 0,9 Вар. 1718 Вар. 1770 Вар. 1822 Вар. 1874 Вар. 1926 Вар. 1978 Вар. 2030 Вар. 2082 Вар. 2134
0,6- 0,8 Вар. 1719 Вар. 1771 Вар 1823 Вар. 1875 Вар. 1927 Вар. 1979 Вар. 2031 Вар. 2083 Вар. 2135
0,7- 1,0 Вар. 1720 Вар. 1772 Вар 1824 Вар. 1876 Вар. 1928 Вар. 1980 Вар. 2032 Вар. 2084 Вар. 2136
0,7- 0,9 Вар. 1721 Вар 1773 Вар 1825 Вар. 1877 Вар. 1929 Вар. 1981 Вар. 2033 Вар. 2085 Вар. 2137
0.1 Вар. 1722 Вар. 1774 Вар. 1826 Вар. 1878 Вар. 1930 Вар 1982 Вар 2034 Вар. 2086 Вар. 2138
0.2 Вар. 1723 Вар. 1775 Вар. 1827 Вар. 1879 Вар. 1931 Вар 1983 Вар 2035 Вар. 2087 Вар. 2139
0.3 Вар. 1724 Вар. 1776 Вар. 1828 Вар 1880 Вар. 1932 Вар 1984 Вар 2036 Вар. 2088 Вар 2140
0,4 Вар. 1725 Вар. 1777 Вар. 1829 Вар 1881 Вар. 1933 Вар 1985 Вар 2037 Вар. 2089 Вар 2141
0,5 Вар. 1726 Вар. 1778 Вар 1830 Вар. 1882 Вар 1934 Вар. 1986 Вар. 2038 Вар 2090 Вар. 2142
- 35 034530
0.6 Вар. 1727 Вар. 1779 Вар. 1831 Вар. 1883 Вар. 1935 Вар. 1987 Вар. 2039 Вар. 2091 Вар. 2143
0,7 Вар. 1728 Вар. 1780 Вар. 1832 Вар. 1884 Вар. 1936 Вар. 1988 Вар 2040 Вар. 2092 Вар. 2144
0.8 Вар. 1729 Вар. 1781 Вар. 1833 Вар. 1885 Вар. 1937 Вар 1989 Вар 2041 Вар. 2093 Вар 2145
0,9 Вар. 1730 Вар. 1782 Вар. 1834 Вар. 1886 Вар. 1938 Вар 1990 Вар 2042 Вар. 2094 Вар 2146
1 Вар. 1731 Вар. 1783 Вар 1835 Вар. 1887 Вар. 1939 Вар. 1991 Вар. 2043 Вар. 2095 Вар. 2147
1.1 Вар. 1732 Вар. 1784 Вар. 1836 Вар. 1888 Вар. 1940 Вар. 1992 Вар. 2044 Вар. 2096 Вар. 2148
1.2 Вар 1733 Вар. 1785 Вар. 1837 Вар. 1889 Вар. 1941 Вар. 1993 Вар. 2045 Вар. 2097 Вар 2149
1,3 Вар 1734 Вар. 1786 Вар. 1838 Вар. 1890 Вар. 1942 Вар. 1994 Вар. 2046 Вар. 2098 Вар 2150
1.4 Вар 1735 Вар. 1787 Вар. 1839 Вар. 1891 Вар. 1943 Вар. 1995 Вар. 2047 Вар. 2099 Вар 2151
1,5 Вар. 1736 Вар. 1788 Вар. 1840 Вар. 1892 Вар 1944 Вар. 1996 Вар. 2048 Вар 2100 Вар. 2152
1,6 Вар. 1737 Вар. 1789 Вар. 1841 Вар. 1893 Вар. 1945 Вар. 1997 Вар. 2049 Вар 2101 Вар. 2153
1,7 Вар. 1738 Вар. 1790 Вар. 1842 Вар. 1894 Вар. 1946 Вар. 1998 Вар. 2050 Вар 2102 Вар. 2154
1,8 Вар. 1739 Вар. 1791 Вар. 1843 Вар. 1895 Вар. 1947 Вар. 1999 Вар. 2051 Вар 2103 Вар. 2155
1,9 Вар. 1740 Вар 1792 Вар. 1844 Вар. 1896 Вар. 1948 Вар. 2000 Вар. 2052 Вар 2104 Вар. 2156
2 Вар. 1741 Вар. 1793 Вар. 1845 Вар. 1897 Вар. 1949 Вар. 2001 Вар. 2053 Вар. 2105 Вар. 2157
- 36 034530
Таблица 14
Типичные варианты воплощения параметров раствора для связывания сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiG2
pH
5Д НБ 4,0 НБ 4.2 НБ4.4 НБ 4.6 НБ 4,8 НБ 5.0 НБ5.2 НБ 5.4
ί S' и i £ 0.1- 2,0 Вар. 2158 Вар. 2210 Вар. 2262 Вар. 2314 Вар. 2366 Вар. 2418 Вар. 2470 Вар 2522 Вар. 2574
0,1- 1,9 Вар. 2159 Вар. 2211 Вар. 2263 Вар. 2315 Вар. 2367 Вар. 2419 Вар. 2471 Вар. 2523 Вар. 2575
0,1- Вар. Вар Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1,8 2160 2212 2264 2316 2368 2420 2472 2524 2576
0,1- 1,7 Вар. 2161 Вар 2213 Вар. 2265 Вар 2317 Вар. 2369 Вар 2421 Вар. 2473 Вар 2525 Вар. 2577
0,1- 1,6 Вар. 2162 Вар. 2214 Вар. 2266 Вар 2318 Вар. 2370 Вар. 2422 Вар. 2474 Вар. 2526 Вар. 2578
0,1- 1,5 Вар. 2163 Вар. 2215 Вар. 2267 Вар 2319 Вар. 2371 Вар 2423 Вар. 2475 Вар 2527 Вар. 2579
0,1- 1,4 Вар. 2164 Вар. 2216 Вар. 2268 Вар. 2320 Вар. 2372 Вар. 2424 Вар. 2476 Вар. 2528 Вар. 2580
0.1- 1.3 Вар. 2165 Вар. 2217 Вар. 2269 Вар. 2321 Вар. 2373 Вар. 2425 Вар. 2477 Вар. 2529 Вар. 2581
о,1- 1,2 Вар. 2166 Вар. 2218 Вар. 2270 Вар. 2322 Вар. 2374 Вар. 2426 Вар. 2478 Вар. 2530 Вар. 2582
0,1- 1,1 Вар. 2167 Вар 2219 Вар. 2271 Вар 2323 Вар. 2375 Вар 2427 Вар. 2479 Вар 2531 Вар. 2583
0,1- 1,0 Вар. 2168 Вар. 2220 Вар. 2272 Вар 2324 Вар. 2376 Вар. 2428 Вар. 2480 Вар. 2532 Вар. 2584
0,1- 0.9 Вар 2169 Вар. 2221 Вар. 2273 Вар 2325 Вар. 2377 Вар 2429 Вар. 2481 Вар 2533 Вар. 2585
0,1- 0,8 Вар. 2170 Вар. 2222 Вар. 2274 Вар. 2326 Вар. 2378 Вар. 2430 Вар. 2482 Вар. 2534 Вар. 2586
0.2- 2.0 Вар. 2171 Вар. 2223 Вар. 2275 Вар. 2327 Вар. 2379 Вар. 2431 Вар. 2483 Вар. 2535 Вар. 2587
0,2- 1,5 Вар. 2172 Вар. 2224 Вар 2276 Вар. 2328 Вар 2380 Вар. 2432 Вар 2484 Вар. 2536 Вар 2588
ОД- НО Вар. 2173 Вар. 2225 Вар. 2277 Вар. 2329 Вар. 2381 Вар. 2433 Вар. 2485 Вар. 2537 Вар. 2589
0,2- 0,9 Вар. 2174 Вар. 2226 Вар. 2278 Вар. 2330 Вар. 2382 Вар. 2434 Вар. 2486 Вар. 2538 Вар. 2590
0,2- 0,8 Вар. 2175 Вар. 2227 Вар. 2279 Вар. 2331 Вар. 2383 Вар. 2435 Вар. 2487 Вар. 2539 Вар. 2591
0,3- 1,0 Вар 2176 Вар. 2228 Вар. 2280 Вар 2332 Вар. 2384 Вар 2436 Вар. 2488 Вар 2540 Вар. 2592
0,3- 0,9 Вар. 2177 Вар. 2229 Вар. 2281 Вар 2333 Вар. 2385 Вар. 2437 Вар. 2489 Вар. 2541 Вар. 2593
0,3- 0,8 Вар. 2178 Вар. 2230 Вар. 2282 Вар 2334 Вар. 2386 Вар 2438 Вар. 2490 Вар 2542 Вар. 2594
0,4- ι,θ Вар. 2179 Вар. 2231 Вар. 2283 Вар 2335 Вар. 2387 Вар. 2439 Вар. 2491 Вар. 2543 Вар. 2595
0,4- Вар Вар. Вар. Вар Вар. Вар Вар. Вар Вар.
- 37 034530
0,9 2180 2232 2284 2336 2388 2440 2492 2544 2596
0,4- 0,8 Вар, 2181 Вар 2233 Вар. 2285 Вар. 2337 Вар. 2389 Вар, 2441 Вар. 2493 Вар. 2545 Вар. 2597
0,5- 1,0 Вар, 2182 Вар 2234 Вар. 2286 Вар. 2338 Вар. 2390 Вар, 2442 Вар. 2494 Вар. 2546 Вар. 2598
0,5- 0,9 Вар, 2183 Вар. 2235 Вар. 2287 Вар. 2339 Вар. 2391 Вар, 2443 Вар. 2495 Вар. 2547 Вар. 2599
0,5- 0,8 Вар. 2184 Вар. 2236 Вар. 2288 Вар. 2340 Вар. 2392 Вар. 2444 Вар. 2496 Вар. 2548 Вар. 2600
0.6- 1.0 Вар. 2185 Вар. 2237 Вар. 2289 Вар. 2341 Вар. 2393 Вар. 2445 Вар. 2497 Вар. 2549 Вар. 2601
0,6- 0,9 Вар. 2186 Вар. 2238 Вар 2290 Вар. 2342 Вар 2394 Вар. 2446 Вар 2498 Вар. 2550 Вар 2602
0,6- 0,8 Вар. 2187 Вар. 2239 Вар. 2291 Вар. 2343 Вар. 2395 Вар. 2447 Вар. 2499 Вар. 2551 Вар. 2603
0.7- 1.0 Вар. 2188 Вар. 2240 Вар. 2292 Вар. 2344 Вар. 2396 Вар. 2448 Вар. 2500 Вар. 2552 Вар. 2604
0,7- 0,9 Вар. 2189 Вар. 2241 Вар 2293 Вар. 2345 Вар 2397 Вар. 2449 Вар 2501 Вар. 2553 Вар 2605
ОД Вар, 2190 Вар. 2242 Вар. 2294 Вар. 2346 Вар. 2398 Вар, 2450 Вар. 2502 Вар. 2554 Вар. 2606
0,2 Вар, 2191 Вар 2243 Вар. 2295 Вар. 2347 Вар. 2399 Вар, 2451 Вар. 2503 Вар. 2555 Вар. 2607
0,3 Вар, 2192 Вар 2244 Вар. 2296 Вар. 2348 Вар. 2400 Вар, 2452 Вар. 2504 Вар. 2556 Вар. 2608
0,4 Вар. 2193 Вар. 2245 Вар. 2297 Вар. 2349 Вар. 2401 Вар, 2453 Вар. 2505 Вар. 2557 Вар. 2609
0,5 Вар, 2194 Вар. 2246 Вар. 2298 Вар. 2350 Вар. 2402 Вар, 2454 Вар. 2506 Вар. 2558 Вар. 2610
0,6 Вар, 2195 Вар 2247 Вар. 2299 Вар. 2351 Вар. 2403 Вар, 2455 Вар. 2507 Вар. 2559 Вар. 2611
0,7 Вар. 2196 Вар. 2248 Вар. 2300 Вар. 2352 Вар. 2404 Вар. 2456 Вар. 2508 Вар. 2560 Вар. 2612
0,8 Вар. 2197 Вар. 2249 Вар 2301 Вар. 2353 Вар 2405 Вар. 2457 Вар 2509 Вар. 2561 Вар 2613
0,9 Вар. 2198 Вар. 2250 Вар 2302 Вар. 2354 Вар 2406 Вар. 2458 Вар 2510 Вар. 2562 Вар 2614
1 Вар. 2199 Вар. 2251 Вар. 2303 Вар. 2355 Вар. 2407 Вар. 2459 Вар. 2511 Вар. 2563 Вар. 2615
1,1 Вар. 2200 Вар. 2252 Вар 2304 Вар. 2356 Вар 2408 Вар. 2460 Вар 2512 Вар. 2564 Вар 2616
- 38 034530
1.2 Вар. 2201 Вар. 2253 Вар. 2305 Вар. 2357 Вар. 2409 Вар. 2461 Вар. 2513 Вар. 2565 Вар. 2617
1,3 Вар. 2202 Вар. 2254 Вар 2306 Вар. 2358 Вар 2410 Вар. 2462 Вар 2514 Вар. 2566 Вар. 2618
1,4 Вар. 2203 Вар. 2255 Вар. 2307 Вар. 2359 Вар. 2411 Вар. 2463 Вар. 2515 Вар. 2567 Вар. 2619
1.5 Вар. 2204 Вар. 2256 Вар 2308 Вар. 2360 Вар 2412 Вар. 2464 Вар 2516 Вар. 2568 Вар 2620
1.6 Вар. 2205 Вар. 2257 Вар. 2309 Вар. 2361 Вар. 2413 Вар. 2465 Вар. 2517 Вар. 2569 Вар. 2621
1,7 Вар. 2206 Вар. 2258 Вар, 2310 Вар. 2362 Вар. 2414 Вар. 2466 Вар, 2518 Вар. 2570 Вар. 2622
1,8 Вар. 2207 Вар. 2259 Вар. 2311 Вар. 2363 Вар. 2415 Вар. 2467 Вар. 2519 Вар. 2571 Вар 2623
1,9 Вар 2208 Вар 2260 Вар 2312 Вар. 2364 Вар 2416 Вар. 2468 Вар 2520 Вар. 2572 Вар 2624
2 Вар. 2209 Вар. 2261 Вар. 2313 Вар. 2365 Вар. 2417 Вар. 2469 Вар. 2521 Вар. 2573 Вар 2625
НБ = не более.
Таблица 15
Типичные варианты воплощения параметров раствора для связывания сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiG2
pH
НБ 5,6 НБ 5.8 НБ6.0 НБ 6.2 НБ 6.4 НБ 6,6 НБ 6,8 НБ 7.0
Ионная сила (мСм/см) 0,1- 2.0 Вар 2626 Вар. 2678 Вар. 2730 Вар. 2782 Вар. 2834 Вар. 2886 Вар 2938 Вар 2990
0,1- 1.9 Вар 2627 Вар. 2679 Вар. 2731 Вар. 2783 Вар. 2835 Вар 2887 Вар 2939 Вар 2991
ОД- 1,8 Вар, 2628 Вар. 2680 Вар. 2732 Вар. 2784 Вар. 2836 Вар. 2888 Вар. 2940 Вар. 2992
ОД- 1,7 Вар. 2629 Вар. 2681 Вар 2733 Вар. 2785 Вар. 2837 Вар. 2889 Вар. 2941 Вар. 2993
ОД- 1,6 Вар. 2630 Вар. 2682 Вар 2734 Вар. 2786 Вар. 2838 Вар. 2890 Вар. 2942 Вар. 2994
ОД- 1,5 Вар. 2631 Вар 2683 Вар 2735 Вар. 2787 Вар. 2839 Вар. 2891 Вар. 2943 Вар. 2995
ОД- 1.4 Вар. 2632 Вар 2684 Вар 2736 Вар. 2788 Вар. 2840 Вар. 2892 Вар. 2944 Вар. 2996
ОД- 1.3 Вар 2633 Вар. 2685 Вар. 2737 Вар. 2789 Вар. 2841 Вар 2893 Вар. 2945 Вар. 2997
- 39 034530
ОД- 1.2 Вар 2634 Вар. 2686 Вар. 2738 Вар. 2790 Вар. 2842 Вар. 2894 Вар. 2946 Вар. 2998
од- ι.ι Вар. 2635 Вар. 2687 Вар. 2739 Вар. 2791 Вар. 2843 Вар. 2895 Вар 2947 Вар 2999
од- 1,0 Вар. 2636 Вар 2688 Вар. 2740 Вар. 2792 Вар. 2844 Вар. 2896 Вар. 2948 Вар. 3000
0.1- 0.9 Вар. 2637 Вар, 2689 Вар. 2741 Вар. 2793 Вар. 2845 Вар. 2897 Вар. 2949 Вар. 3001
ОД- 0.8 Вар. 2638 Вар. 2690 Вар. 2742 Вар. 2794 Вар. 2846 Вар 2898 Вар. 2950 Вар. 3002
0,2- 2.0 Вар. 2639 Вар+ 2691 Вар. 2743 Вар 2795 Вар. 2847 Вар 2899 Вар. 2951 Вар. 3003
0,2- 1.5 Вар. 2640 Вар. 2692 Вар. 2744 Вар. 2796 Вар. 2848 Вар 2900 Вар. 2952 Вар. 3004
0,2- 1.0 Вар. 2641 Вар+ 2693 Вар. 2745 Вар 2797 Вар. 2849 Вар 2901 Вар. 2953 Вар. 3005
0,2- 0,9 Вар. 2642 Вар. 2694 Вар. 2746 Вар. 2798 Вар. 2850 Вар 2902 Вар. 2954 Вар. 3006
0,2- 0.8 Вар. 2643 Вар. 2695 Вар 2747 Вар. 2799 Вар. 2851 Вар 2903 Вар 2955 Вар 3007
0,3- 1,0 Вар. 2644 Вар. 2696 Вар 2748 Вар. 2800 Вар. 2852 Вар. 2904 Вар 2956 Вар 3008
0,3- 0.9 Вар. 2645 Вар. 2697 Вар 2749 Вар. 2801 Вар. 2853 Вар. 2905 Вар. 2957 Вар. 3009
0,3- 0,8 Вар. 2646 Вар. 2698 Вар 2750 Вар. 2802 Вар. 2854 Вар. 2906 Вар 2958 Вар ЗОЮ
0,4- 1.0 Вар. 2647 Вар. 2699 Вар 2751 Вар. 2803 Вар. 2855 Вар. 2907 Вар. 2959 Вар. ЗОИ
0,4- 0,9 Вар. 2648 Вар. 2700 Вар 2752 Вар. 2804 Вар. 2856 Вар. 2908 Вар 2960 Вар 3012
0.4- 0.8 Вар. 2649 Вар 2701 Вар. 2753 Вар. 2805 Вар. 2857 Вар. 2909 Вар. 2961 Вар. 3013
0,5- 1.0 Вар. 2650 Вар. 2702 Вар. 2754 Вар 2806 Вар. 2858 Вар. 2910 Вар. 2962 Вар. 3014
0,5- 0.9 Вар. 2651 Вар. 2703 Вар. 2755 Вар. 2807 Вар. 2859 Вар. 2911 Вар. 2963 Вар. 3015
0,5- 0.8 Вар. 2652 Вар. 2704 Вар. 2756 Вар 2808 Вар. 2860 Вар. 2912 Вар. 2964 Вар. 3016
0,6- 1.0 Вар. 2653 Вар. 2705 Вар. 2757 Вар. 2809 Вар. 2861 Вар. 2913 Вар. 2965 Вар. 3017
- 40 034530
0,6- 0,9 Вар. 2654 Вар. 2706 Вар. 2758 Вар 2810 Вар. 2862 Вар. 2914 Вар. 2966 Вар. 3018
0,6- 0,8 Вар. 2655 Вар 2707 Вар. 2759 Вар. 2811 Вар 2863 Вар. 2915 Вар. 2967 Вар. 3019
0,7- L0 Вар 2656 Вар. 2708 Вар 2760 Вар. 2812 Вар. 2864 Вар. 2916 Вар. 2968 Вар. 3020
0,7- 0?9 Вар. 2657 Вар. 2709 Вар. 2761 Вар. 2813 Вар. 2865 Вар. 2917 Вар. 2969 Вар. 3021
0,1 Вар- 2658 Вар. 2710 Вар. 2762 Вар. 2814 Вар. 2866 Вар. 2918 Вар. 2970 Вар. 3022
од Вар. 2659 Вар. 2711 Вар. 2763 Вар. 2815 Вар. 2867 Вар. 2919 Вар. 2971 Вар. 3023
од Вар. 2660 Вар. 2712 Вар. 2764 Вар. 2816 Вар. 2868 Вар. 2920 Вар. 2972 Вар. 3024
0?4 Вар. 2661 Вар 2713 Вар. 2765 Вар. 2817 Вар 2869 Вар. 2921 Вар. 2973 Вар. 3025
0.5 Вар. 2662 Вар 2714 Вар. 2766 Вар. 2818 Вар. 2870 Вар. 2922 Вар. 2974 Вар. 3026
0,6 Вар. 2663 Вар 2715 Вар. 2767 Вар. 2819 Вар 2871 Вар. 2923 Вар. 2975 Вар. 3027
0,7 Вар. 2664 Вар 2716 Вар. 2768 Вар. 2820 Вар 2872 Вар. 2924 Вар. 2976 Вар. 3028
0,8 Вар. 2665 Вар 2717 Вар. 2769 Вар. 2821 Вар 2873 Вар. 2925 Вар. 2977 Вар. 3029
0,9 Вар. 2666 Вар 2718 Вар. 2770 Вар. 2822 Вар 2874 Вар. 2926 Вар. 2978 Вар. 3030
1 Вар. 2667 Вар 2719 Вар. 2771 Вар. 2823 Вар 2875 Вар. 2927 Вар. 2979 Вар. 3031
1,1 Вар. 2668 Вар 2720 Вар. 2772 Вар. 2824 Вар 2876 Вар. 2928 Вар. 2980 Вар. 3032
1,2 Вар. 2669 Вар. 2721 Вар. 2773 Вар. 2825 Вар. 2877 Вар. 2929 Вар. 2981 Вар. 3033
1,3 Вар. 2670 Вар 2722 Вар. 2774 Вар. 2826 Вар 2878 Вар. 2930 Вар. 2982 Вар. 3034
1,4 Вар. 2671 Вар 2723 Вар. 2775 Вар. 2827 Вар. 2879 Вар. 2931 Вар. 2983 Вар. 3035
1,5 Вар. 2672 Вар. 2724 Вар. 2776 Вар. 2828 Вар. 2880 Вар. 2932 Вар. 2984 Вар. 3036
1,6 Вар. 2673 Вар. 2725 Вар. 2777 Вар. 2829 Вар. 2881 Вар. 2933 Вар. 2985 Вар. 3037
1,7 Вар 2674 Вар. 2726 Вар 2778 Вар. 2830 Вар. 2882 Вар. 2934 Вар. 2986 Вар. 3038
1.8 Вар 2675 Вар. 2727 Вар 2779 Вар. 2831 Вар. 2883 Вар. 2935 Вар. 2987 Вар. 3039
1,9 Вар 2676 Вар. 2728 Вар 2780 Вар. 2832 Вар. 2884 Вар. 2936 Вар. 2988 Вар. 3040
2 Вар 2677 Вар. 2729 Вар 2781 Вар. 2833 Вар. 2885 Вар. 2937 Вар. 2989 Вар. 3041
НБ = не более.
А. Модифицированные способы фракционирования за счет осаждения спиртом/ионообменной хроматографии.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает усовершенствованные способы производства композиций IgG, пригодных для использования при IVIG-терапии. В общем случае эти способы обеспечивают препараты IgG, обладающие повышенным выходом и сопоставимой, если не более высокой, чис- 41 034530 тотой по сравнению со способами, используемыми в настоящее время для производства коммерческих продуктов IVIG.
В одном конкретном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции концентрированного IgG из плазмы, например 10% IVIG, включающий выполнение по меньшей мере одного этапа осаждения спиртом и по меньшей мере одного этапа ионообменной хроматографии. В частности, несколько этапов усовершенствованного способа отличаются от более ранних способов, например использование 25% этанола при более низких температурах, внесение этанола путем распыления, коррекция уровня рН путем распыления и использование тонкоизмельченных частиц кремнезема.
В некоторых вариантах воплощения способ включает этапы: (а) осаждение фракции криосупернатантной плазмы на первом этапе осаждения с использованием приблизительно 6-10% спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением супернатанта, обогащенного IgG, (б) осаждение IgG из супернатанта с использованием приблизительно 20-30% спирта при пониженной температуре и рН приблизительно 6,7-7,3 с образованием первого преципитата, (в) ресуспендирование первого преципитата, образованного на этапе (б) с образованием суспензии;
(г) обработка суспензии, образованной на этапе (в), детергентом;
(д) осаждение IgG из суспензии с использованием приблизительно 20-30% спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с образованием второго преципитата;
(е) ресуспендирование второго преципитата, образованного на этапе (д), с образованием суспензии;
(ж) обработка суспензии, образованной на этапе (е), растворителем и/или детергентом и (з) выполнение по меньшей мере одного фракционирования ионообменной хроматографией, за счет чего получают композицию концентрированного IgG.
В одном из вариантов воплощения этот способ включает обработку суспензии, образованной на этапе (в), тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и фильтрование раствора перед этапом (г).
В одном варианте воплощения представлен способ изготовления композиции концентрированного IgG из плазмы, включающий этапы (а) коррекция рН фракции криосупернатантной плазмы до приблизительно 7,0, (б) коррекция концентрации этанола во фракции криосупернатантной плазмы этапа (а) до или приблизительно до 25% (об./об.) при температуре между приблизительно -5 и приблизительно -9°C, за счет чего образуется смесь, в которой концентрацию этанола можно корректировать путем распыления, (в) отделение жидкости и преципитата от смеси этапа (б);
(г) ресуспендирование преципитата этапа (в) в буфере, содержащем фосфат и ацетат, причем рН буфера корректируют ледяной уксусной кислотой в количестве приблизительно 400-700 мл кислоты на 1000 л буфера, за счет чего образуется суспензия;
(д) смешивание тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией этапа (г) по меньшей мере в течение 30 мин;
(е) фильтрование суспензии через фильтр-пресс, за счет чего образуется фильтрат;
(ж) промывка фильтр-пресса буфером, содержащим фосфат и ацетат в объеме, равном по меньшей мере 3 мертвым объемам фильтр-пресса, причем рН буфера корректируют приблизительно 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, за счет чего образуется раствор для промывки;
(з) объединение фильтрата этапа (е) с раствором для промывки этапа (ж), за счет чего образуется раствор, и обработки раствора детергентом;
(и) коррекция рН раствора этапа (з) до приблизительно 7,0 и внесения этанола до конечной концентрации, равной или приблизительно равной 25%, за счет чего образуется преципитат, причем концентрацию этанола и/или рН можно корректировать путем распыления;
(к) отделение жидкости и преципитата от смеси этапа (и);
(л) растворение преципитата в водном растворе, включающем растворитель или детергент и поддерживания раствора в течение по меньшей мере 60 мин;
(м) пропускание раствора после этапа (л) через колонку для катионообменной хроматографии и элюирования белков, абсорбировавшихся на колонке, в элюат;
(н) пропускание элюата этапа (м) через колонку для анионообменной хроматографии с получением стока (т.е. пропущенного через колонку);
(о) пропускание стока этапа (н) через нанофильтр с получением нанофильтрата;
(п) пропускание нанофильтрата этапа (о) через мембрану для ультрафильтрации с получением ультрафильтрации и (р) диафильтрация ультрафильтрата этапа (п) против буфера для диафильтрации с получением диафильтрата с концентрацией белка между приблизительно 8 и приблизительно 22% (мас./об.), за счет чего получают композицию концентрированного IgG.
В одном варианте воплощения температура этапа (б) составляет или приблизительно составляет 7°C. В некоторых вариантах воплощения буфер суспензии на этапе (г) корректируют приблизительно 600 мл ледяной уксусной кислоты.
В некоторых вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет приблизительно 8-12%, например приблизительно 8 или приблизительно 9, 10, 11 или 12%. В предпочтительном вари- 42 034530 анте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 10%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 11%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 12%. В других вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет приблизительно 13-17%, например приблизительно 13 или приблизительно 14, 15, 16 или 17%. В других вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет приблизительно 18-22%, например приблизительно 18 или приблизительно 19, 20, 21 или 22%. В предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 20%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 21%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет или приблизительно составляет 22%.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способы, представленные здесь, могут включать усовершенствования двух или более вышеописанных этапов способа фракционирования. Например, варианты воплощения могут включать усовершенствования на первом этапе осаждения, этапе осаждения модифицированной фракции II+III, этапе растворения модифицированной фракции II+III и/или этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В одном из вариантов воплощения усовершенствование, сделанное на первом этапе осаждения, представляет собой внесение спирта путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на первом этапе осаждения, представляет собой внесение агента, модифицирующего рН, путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на первом этапе осаждения, представляет собой коррекцию рН раствора после внесения спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на первом этапе осаждения, представляет собой поддержание рН во время внесения спирта. В еще одном родственном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на первом этапе осаждения, представляет собой поддержание рН во время инкубирования при осаждении путем непрерывной коррекции рН раствора. В некоторых вариантах воплощения первый этап осаждения можно усовершенствовать путем реализации более чем одного из этих усовершенствований. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на этом этапе, будут очевидны из раздела, приведенного ниже обсуждения первого этапа осаждения - модифицированного фракционирования I. При осуществлении одного или нескольких вышеописанных усовершенствований на первом этапе осаждения во фракции преципитата теряется пониженное количество IgG и/или во время этапа осаждения необратимо денатурируется меньшая часть IgG.
В одном из вариантов воплощения усовершенствование, сделанное на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, представляет собой внесение спирта путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, представляет собой внесение агента, модифицирующего рН, путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, представляет собой коррекцию рН раствора после внесения спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, представляет собой поддержание рН во время внесения спирта. В еще одном родственном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, представляет собой поддержание рН во время инкубирования при осаждении путем непрерывной коррекции рН раствора. В еще одном аспекте этап осаждения модифицированной фракции II+III усовершенствован путем повышения концентрации спирта до или до приблизительно 25%. В еще одном варианте воплощения этап осаждения модифицированной фракции II+III усовершенствован путем снижения температуры инкубирования до величины между приблизительно -7 и -9°C. В некоторых вариантах воплощения этап осаждения модифицированной фракции II+III можно усовершенствовать путем реализации более чем одного из этих усовершенствований. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на этом этапе, будут очевидны из раздела, приведенного ниже обсуждения второго этапа осаждения - модифицированного фракционирования II+III. При осуществлении одного или нескольких вышеописанных усовершенствований на этапе осаждения модифицированной фракции II+III во фракции супернатанта теряется пониженное количество IgG и/или во время этапа осаждения необратимо денатурируется меньшая часть IgG.
В одном из вариантов воплощения усовершенствование, сделанное на этапе растворения модифицированной фракции II+III, осуществляют путем повышения содержания ледяной уксусной кислоты в растворяющем буфере до приблизительно 0,06%. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе растворения модифицированной фракции II+III, осуществляют за счет поддержания рН раствора во время инкубирования при растворении путем непрерывной коррекции рН раствора. В еще одном варианте воплощения усовершенствование, сделанное на этапе растворения модифицированной фракции II+III, осуществляют за счет смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией фракции II+III перед фильтрацией. В некоторых вариантах воплощения этап растворения модифицированной фракции II+III можно усовершенствовать путем реализации более чем одного
- 43 034530 из этих усовершенствований. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на этом этапе, будут очевидны из раздела, приведенного ниже обсуждения этапа растворения модифицированной фракции II+III - экстракции преципитата модифицированной фракции II+III. При осуществлении одного или нескольких вышеописанных усовершенствований в суспензии фракции II+III восстанавливается повышенное количество IgG и/или в суспензии фракции II+III снижается количество примесей.
Типичное усовершенствование, сделанное на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III, осуществляют путем промывки фильтра по меньшей мере приблизительно 3,6 мертвыми объемами растворяющего буфера, содержащего или приблизительно содержащего 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на этом этапе, будут очевидны из раздела, приведенного ниже обсуждения этапа фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III - предобработки и фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III. При осуществлении одного или нескольких вышеописанных усовершенствований на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III теряется пониженное количество IgG.
В одном из вариантов воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения и на этапе осаждения модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения и на этапе растворения модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на этапе осаждения модифицированной фракции II+III и на этапе растворения модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на этапе осаждения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на этапе растворения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения, на этапе осаждения модифицированной фракции II+III и на этапе растворения модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения, на этапе осаждения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения, на этапе растворения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, на этапе растворения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения способ может включать усовершенствование на первом этапе осаждения, на этапе осаждения модифицированной фракции II+III, на этапе растворения модифицированной фракции II+III и на этапе фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III.
В некоторых вариантах воплощения одно из усовершенствований способов очистки IgG, приведенных здесь, включает распылительное внесение одного или нескольких растворов, которые в противном случае вносят во фракцию плазмы путем добавления в поток. Например, в некоторых вариантах воплощения усовершенствование способа включает внесение спирта (например, этанола) во фракцию плазмы с целью осаждения одного или более видов белков путем распыления. В других вариантах воплощения растворы, которые можно вносить во фракцию плазмы путем распыления, включают, без ограничения, раствор для изменения рН, раствор растворителя, раствор детергента, буфер для разбавления, раствор для изменения электрической проводимости и т.п. В предпочтительном варианте воплощения один или более этапов осаждения спиртом выполняют путем внесения спирта во фракцию плазмы путем распыления. Во втором предпочтительном варианте воплощения один или более этапов коррекции рН выполняют путем внесения раствора для изменения рН во фракцию плазмы путем распыления.
В некоторых вариантах воплощения еще одно усовершенствование способа, которое можно комбинировать с любым другим усовершенствованием способа, включает коррекцию рН осаждаемой фракции плазмы, осуществляемую после внесения осаждающего агента (например, спирта или полиэтиленгликоля) и/или сочетаемую с ним. В некоторых вариантах воплощения представлено усовершенствование способа, при котором рН активно осаждаемой фракции плазмы поддерживают на протяжении всего времени инкубирования при осаждении или этапа стабилизации за счет непрерывного мониторинга и коррекции рН. В предпочтительном варианте воплощения коррекцию рН выполняют путем распылительного внесения раствора для изменения рН.
- 44 034530
В других вариантах воплощения еще одно усовершенствование способа, которое можно комбинировать с любым другим усовершенствованием способа, включает использование этапа обработки тонкоизмельченным кремнеземом для удаления примесей.
1. Получение криосурфактантной плазмы.
Исходный материал, используемый для изготовления композиций концентрированного IgG, обычно состоит либо из восстановленной плазмы (т.е. плазмы, отделенной от цельной крови ex vivo), либо из свежезамороженной плазмы (т.е. плазмы, собранной путем плазмафереза). Процесс очистки обычно начинают с оттаивания ранее замороженного пула плазмы, уже проанализированного из соображений безопасности и качества. Оттаивание обычно осуществляют при температуре не выше 6°C. После полного оттаивания замороженной плазмы при низкой температуре выполняют центрифугирование при низкой температуре (например, <6°C) для отделения твердых криопреципитатов от жидкого супернатанта. В качестве альтернативы, этап разделения можно выполнить путем фильтрации, а не центрифугирования. Жидкий супернатант (также называемый криосупернатантной плазмой после удаления белков, нерастворимых при низкой температуре, путем центрифугирования свежеоттаявшей плазмы) затем обрабатывают на следующем этапе. В данный момент можно осуществлять различные дополнительные этапы для выделения агента обхода ингибитора восьмого фактора (ФЕЙБА), комплекса фактора IX, концентрата фактора VII или комплекса антитромбина III.
2. Событие первого осаждения - модифицированное фракционирование I.
На этом этапе обычно охлаждают криосупернатантную плазму до температуры приблизительно 0±1°C и корректируют рН до значений между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5, предпочтительно между приблизительно 7,1 и приблизительно 7,3, наиболее предпочтительно приблизительно 7,2. В одном из вариантов воплощения рН криосупернатантной плазмы корректируют до или до приблизительно 7,2. Затем в перемешиваемую плазму вносят заранее охлажденный этанол до конечной концентрации этанола, равной или приблизительно равной 8% (об./об.). В то же время температуру снижают до значений между приблизительно -4 и приблизительно 0°C. В предпочтительном варианте воплощения температуру снижают до значения, равного или приблизительно равного -2°C, для осаждения таких примесей, как а2-макроглобулин, β1Α- и β-κ-глобулин. фибриноген и фактор VIII. Обычно событие осаждения включает время стабилизации, составляющее по меньшей мере приблизительно 1 ч, хотя можно использовать и меньшую или большую продолжительность времени стабилизации. После этого супернатант (супернатант I), в идеале полностью содержащий количество IgG, присутствующее в криосупернатантной плазме, собирают центрифугированием, фильтрацией или другим подходящим способом.
По сравнению с общепринятыми способами, используемыми в качестве первого этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Conn et al., supra; Oncley et al., supra), настоящее изобретение в нескольких вариантах воплощения обеспечивает способы, приводящие к повышенному выходу IgG в супернатанте фракции I. В одном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается путем внесения спирта путем распыления. В еще одном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается путем внесения агента для изменения рН путем распыления. В еще одном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается путем коррекции рН раствора после внесения спирта. В родственном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается путем коррекции рН раствора во время внесения спирта.
В одном конкретном аспекте усовершенствование относится к способу, при котором на первом этапе осаждения в преципитате фракции теряется сниженное количество IgG. Например, в некоторых вариантах воплощения, на первом этапе осаждения в преципитате фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с количеством IgG, теряющимся на первом этапе осаждения согласно протоколу методики б Кона.
В некоторых вариантах воплощения усовершенствование способа осуществляют путем коррекции рН раствора до значений между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5 после внесения осаждающего спирта. В других вариантах воплощения рН раствора корректируют до значений между приблизительно
7.1 и приблизительно 7,3 после внесения осаждающего спирта. В других вариантах воплощения рН раствора корректируют до приблизительно 7,0 или приблизительно 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 после внесения осаждающего спирта. В конкретном варианте воплощения рН раствора корректируют до приблизительно
7.2 после внесения осаждающего спирта. В связи с этим, в некоторых вариантах воплощения на первом этапе осаждения в преципитате фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируют до, но не после внесения осаждающего спирта. В одном варианте воплощения рН поддерживают на желаемом уровне во время стабилизации или инкубирования при осаждении путем непрерывной коррекции рН раствора. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
В некоторых других вариантах воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения осаждающего спирта и/или раствора для изменения рН путем распыления, а не добавления в поток. В связи с этим, в некоторых вариантах воплощения на первом этапе осаждения в преципитате фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором
- 45 034530 спирт и/или раствор для коррекции рН вносят путем добавления в поток.
В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
В некоторых других вариантах воплощения усовершенствование осуществляют путем коррекции рН раствора до значений между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора корректируют до значений между приблизительно 7,1 и приблизительно 7,3. В других вариантах воплощения рН раствора корректируют до или приблизительно до 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 после внесения осаждающего спирта и за счет внесения осаждающего спирта и/или раствора для коррекции рН путем распыления, а не добавления в поток. В конкретном варианте воплощения рН раствора корректируют до или приблизительно до 7,2 после внесения осаждающего спирта и за счет внесения осаждающего спирта и/или раствора для коррекции рН путем распыления, а не добавления в поток. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
3. Событие второго осаждения - модифицированное фракционирование II+III.
Для обеспечения дальнейшего обогащения содержания IgG и чистоты фракционирования супернатант I подвергают второму этапу осаждения, который представляет собой модифицированное фракционирование фракции Кона-Онкли II+III. Как правило, рН раствора корректируют до значений между приблизительно 6,6 и приблизительно 6,8. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора корректируют до значения, равного или приблизительно равного 6,7. Затем в перемешиваемый раствор вносят спирт, предпочтительно этанол, до конечной концентрации между приблизительно 20 и приблизительно 25% (об./об.) для осаждения IgG фракции. В предпочтительном варианте воплощения спирт вносят до конечной концентрации, равной или приблизительно равной 25% (об./об.) для осаждения IgG фракции. Как правило, такие примеси, как а1-липопротеин, а1-антитрипсин, Gc-глобулины, «.^-гликопротеин, гаптоглобин, церулоплазмин, трансферрин, гемопексин, фракция кристмас-фактора, тироксинсвязывающий глобулин, холинэстераза, ангиотензиноген и альбумин, не осаждаются при этих условиях.
До или одновременно с внесением спирта раствор охлаждают до температур между приблизительно -7 и приблизительно -9°C. В предпочтительном варианте воплощения раствор охлаждают до температуры, равной или приблизительно равной -7°C. После завершения внесения спирта рН раствора немедленно корректируют до значений между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,0. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора корректируют до значения, равного или приблизительно равного 6,9. Обычно событие осаждения включает время стабилизации, составляющее по меньшей мере приблизительно 10 ч, хотя можно использовать и меньшую или большую продолжительность времени стабилизации. После этого преципитат (модифицированной фракции II+III), в идеале полностью содержащий по меньшей мере приблизительно 85%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% от количества IgG, присутствующего в криосупернатантной плазме, отделяют от супернатанта центрифугированием, фильтрацией или другим подходящим способом и собирают. По сравнению с общепринятыми способами, используемыми в качестве второго этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Conn et al., supra; Oncley et al., supra), настоящее изобретение в нескольких вариантах воплощения обеспечивает способы, приводящие к повышенному выходу IgG в преципитате модифицированной фракции II+III. В родственном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способы, приводящие к сокращению потерь IgG в модифицированном супернатанте II+III.
По сравнению с общепринятыми способами, используемыми в качестве второго этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Conn et al., supra; Oncley et al., supra), настоящее изобретение в нескольких вариантах воплощения обеспечивает способы, приводящие к повышенному выходу IgG в преципитате модифицированной фракции II+III. В одном из вариантов воплощения усовершенствование осуществляют путем внесения спирта путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем внесения агента для изменения рН путем распыления. В еще одном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем коррекции рН раствора после внесения спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем коррекции рН раствора во время внесения спирта. В еще одном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем увеличения концентрации спирта (например, этанола) до приблизительно 25% (об./об.). В еще одном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем понижения температуры на этапе осаждения до значений между приблизительно -7 и -9°C. В предпочтительном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем увеличения концентрации спирта (например, этанола) до приблизительно 25% (об./об.) и понижения температуры до значений между приблизительно -7 и -9°C. В отличие от этого, как Conn et al., так и Oncley et al. выполняли осаждение при -5°C, и Oncley et al. использовали 20% спирт для снижения уровня примесей в преципитате. Преимуществом способов, представленных здесь, является то, что они обеспечивают максимальный выход IgG без высокого уровня примесей в конечном продукте.
Обнаружено, что при коррекции рН раствора до рН приблизительно 6,9 до внесения осаждающего спирта рН раствора смещается с 6,9 до значений между приблизительно 7,4 и приблизительно 7,7, частично вследствие осаждения белка (см. фиг. 8). Поскольку рН раствора смещается с 6,9, условия для
- 46 034530 осаждения IgG становятся менее благоприятными, а для осаждения некоторых примесей - более благоприятными. Преимущество настоящего изобретения обеспечивается установленным авторами изобретения фактом, что за счет коррекции рН раствора после внесения осаждающего спирта в преципитате фракции II+III восстанавливается более высокий процент IgG.
Соответственно, в одном из аспектов усовершенствование относится к способу, при котором на этапе осаждения модифицированной фракции II+III в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG. Другими словами, в преципитате фракции II+III присутствует повышенное процентное содержание исходного IgG. В некоторых вариантах воплощения усовершенствование способа осуществляют путем коррекции рН раствора до значений между приблизительно 6,7 и приблизительно 7,1 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем непрерывного поддержания рН раствора между приблизительно 6,7 и приблизительно 7,1 во время периода инкубирования при осаждении. В других вариантах воплощения рН раствора корректируют до значений между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,0 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта, или до значений рН приблизительно 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 или 7,1 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В конкретном варианте воплощения рН раствора корректируют до приблизительно 6,9 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В некоторых вариантах воплощения рН раствора непрерывно поддерживают между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,0 во время периода инкубирования при осаждении или при рН приблизительно 6,9 во время периода инкубирования при осаждении. В связи с этим в некоторых вариантах воплощения на втором этапе осаждения в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируют до, но не после внесения осаждающего спирта, или с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора не поддерживают во время всего периода инкубирования при осаждении. В одном варианте воплощения рН поддерживают на желаемом уровне во время стабилизации или инкубирования при осаждении путем непрерывной коррекции рН раствора. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения осаждающего спирта и/или раствора для изменения рН путем распыления, а не добавления в поток. В связи с этим в некоторых вариантах воплощения на втором этапе осаждения в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором спирт и/или раствор для коррекции рН вносят путем добавления в поток. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем выполнения этапа осаждения при температуре между приблизительно -7 и приблизительно -9°C. В одном из вариантов воплощения этап осаждения осуществляют при температуре, равной или приблизительно равной -7°C. В еще одном варианте воплощения этап осаждения осуществляют при температуре, равной или приблизительно равной -8°C. В еще одном варианте воплощения этап осаждения осуществляют при температуре, равной или приблизительно равной -9°C. В некоторых вариантах воплощения концентрация спирта на этапе осаждения составляет величину между приблизительно 23 и приблизительно 27%. В предпочтительном варианте воплощения концентрация спирта составляет величину между приблизительно 24 и приблизительно 26%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация спирта составляет или приблизительно составляет 25%. В других вариантах воплощения концентрация спирта может составлять или приблизительно составлять 23, 24, 25, 26 или 27%. В конкретном варианте воплощения второй этап осаждения осуществляют при температуре, равной или приблизительно равной -7°C и концентрации спирта, равной или приблизительно равной 25%. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
Действие увеличения концентрации спирта при втором осаждении с 20%, как используется в работе Oncley et al., supra, до 25% и понижение температуры инкубирования с -5°C, как используется в методиках Кона и Онкли, до температуры, равной или приблизительно равной -7°C, обеспечивает 5-6% увеличение содержания IgG в преципитате модифицированной фракции II+III.
В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем коррекции рН раствора до значений между приблизительно 6,7 и приблизительно 7,1, предпочтительно до значения, равного или приблизительно равного 6,9, непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта, путем поддержания рН раствора между приблизительно 6,7 и приблизительно 7,1, предпочтительно при рН, равном или приблизительно равном 6,9 за счет непрерывной коррекции рН во время периода инкубирования при осаждении, и путем внесения осаждающего спирта и/или раствора для коррекции рН путем распыления, а не внесения в поток. В еще одном конкретном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем выполнения этапа осаждения при температуре между приблизительно -7 и приблизительно -9°C, предпочтительно равной или приблизительно равной -7°C, и путем осаждения IgG при концентрации спирта между приблизительно 23 и приблизительно 27%, предпочтительно равной или приблизительно равной 25%. В еще одном конкретном варианте воплощения
- 47 034530 усовершенствование способа осуществляют путем включения всех вышеприведенных усовершенствований модифицированной фракции II+III. В предпочтительном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем осаждения IgG при температуре, равной или приблизительно равной -7°C, и концентрации этанола, равной или приблизительно равной 25%, внесенной путем распыления, с последующей коррекцией рН раствора до значения, равного или приблизительно равного 6,9, после внесения осаждающего спирта. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значении, равном или приблизительно равном 6,9, во время всего инкубирования при осаждении или периода стабилизации.
4. Экстракция преципитата модифицированной фракции II+III.
Для солюбилизации IgG, содержащегося в преципитате модифицированной фракции II+III, преципитат фракционирования II+III ресуспендируют в холодном буфере для экстракции при типичном соотношении 1 часть преципитата на 15 частей буфера для экстракции. Можно использовать другие подходящие для ресуспендирования соотношения, например, от приблизительно 1:8 до приблизительно 1:30, или от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:20, или от приблизительно 1:12 до приблизительно 1:18, или от приблизительно 1: 13 до приблизительно 1:17, или от приблизительно 1:14 до приблизительно 1:16. В некоторых вариантах воплощения соотношение при ресуспендировании может составлять приблизительно 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 или выше.
Подходящие растворы для экстракции преципитата модифицированной фракции II+III, как правило, имеют рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 5,5. В некоторых вариантах воплощения раствор имеет рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,0, в других вариантах воплощения раствор для экстракции имеет рН приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В предпочтительном варианте воплощения рН буфера для экстракции составляет или приблизительно составляет 4,5. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН буфера для экстракции составляет или приблизительно составляет 4,7. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН буфера для экстракции составляет или приблизительно составляет 4,9. Как правило, эти требования к рН можно удовлетворить, используя буферный агент, выбранный из, например, ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двуосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящий диапазон концентраций буфера обычно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 50 мМ, или приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ буферного агента.
Буфер для экстракции предпочтительно имеет электрическую проводимость от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0 мСм/см. Например, в некоторых вариантах воплощения электрическая проводимость буфера для экстракции составляет приблизительно 0,5 или 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или приблизительно 2,0 мСм/см. Специалисту в данной области техники известно, как получить буферы для экстракции с соответствующей проводимостью.
В одном конкретном варианте воплощения типичный буфер для экстракции может содержать или приблизительно содержать 5 мМ моноосновного фосфата натрия и 5 или приблизительно 5 мМ ацетата при рН, равном или приблизительно равном 4,5±0,2, и электрической проводимости, равной или приблизительно равной от 0,7 до 0,9 мСм/см.
Как правило, экстракцию осуществляют при температуре между приблизительно 0 и приблизительно 10°C, или между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В некоторых вариантах воплощения экстракцию можно осуществлять приблизительно при 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C. В конкретном варианте воплощения экстракцию осуществляют при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 10°C. Как правило, экстракция продолжается в течение периода времени между приблизительно 60 и приблизительно 300 мин, или между приблизительно 120 и 240 мин, или между приблизительно 150 и 210 мин при непрерывном перемешивании суспензии. В некоторых вариантах воплощения экстракция продолжается в течение приблизительно 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или приблизительно 300 мин. В предпочтительном варианте воплощения экстракция продолжается по меньшей мере в течение 160 мин при непрерывном перемешивании.
Установлено, что при использовании буфера для экстракции, содержащего 5 мМ моноосновного фосфата натрия, 5 мМ ацетата и 0,051-0,06% ледяной уксусной кислоты (об./об.), можно получить существенное увеличение выхода конечной композиции IgG без ущерба для чистоты конечного продукта. Корреляция количества уксусной кислоты и рН буфера для экстракции показана на фиг. 9. В предпочтительном варианте воплощения преципитат фракции II+III экстрагируют при соотношении пасты к буферу, равном или приблизительно равном 1:15, при рН, равном или приблизительно равном 4,5±0,2.
Установлено, что преимущество настоящего изобретения по сравнению с применяемым в настоящее время способом производства GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare), при котором используют буфер для экстракции, содержащий 5 мМ моноосновный фосфат натрия, 5 мМ ацетат и 0,051% (об./об.) ледяную уксусную кислоту, состоит в увеличении содержания ледяной уксусной кислоты на
- 48 034530 величину, равную или приблизительно равную 0,06% (об./об.), за счет чего можно получить существенное увеличение выхода конечной композиции IgG. По сравнению с ранее использовавшимися способами экстракции преципитата, образованного на втором этапе осаждения (GAMMAGARD® LIQUID), настоящее изобретение в нескольких вариантах воплощения обеспечивает способы, позволяющие получить повышенный выход IgG в суспензии модифицированной фракции II+III.
В одном из аспектов усовершенствование относится к способу, при котором в несолюбилизированной фракции преципитата модифицированной фракции II+III теряется сниженное количество IgG. В одном из вариантов воплощения усовершенствование способа осуществляют путем экстракции преципитата модифицированной фракции II+III в соотношении 1:15 (преципитат к буферу) раствором, содержащим 5 мМ моноосновный фосфат натрия, 5 мМ ацетат и 0,06% (об./об.) ледяную уксусную кислоту. В еще одном варианте воплощения усовершенствование осуществляют путем поддержания рН раствора во время экстракции. В одном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значениях между приблизительно 4,1 и приблизительно 4,9 в течение всего процесса экстракции. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значениях между приблизительно 4,2 и приблизительно 4,8 в течение всего процесса экстракции. В более предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значениях между приблизительно 4,3 и приблизительно 4,7 в течение всего процесса экстракции. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значениях между приблизительно 4,4 и приблизительно 4,6 в течение всего процесса экстракции. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживают при значении, равном или приблизительно равном 4,5, в течение всего процесса экстракции.
В одном из аспектов усовершенствование относится к способу, при котором на этапе растворения фракции II+III из преципитата фракции II+III солюбилизируется повышенное количество IgG. В одном из вариантов воплощения усовершенствование способа осуществляют путем солюбилизации преципитата фракции II+III растворяющим буфером, содержащим 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. В еще одном варианте воплощения усовершенствование относится к способу, при котором после солюбилизации IgG из преципитата фракции II+III снижается количество примесей. В одном из вариантов воплощения усовершенствование способа осуществляют путем смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией фракции II+III в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин.
5. Предобработка и фильтрация суспензии модифицированной фракции II+III.
Для удаления несолюбилизированной фракции преципитата модифицированной фракции II+III (т.е. фильтровального осадка модифицированной фракции II+III) суспензию фильтруют, обычно с помощью глубинной фильтрации. Глубинные фильтры, которые можно использовать в приведенных здесь способах, включают металлические, стеклянные, керамические, органические (например, диатомитные) глубинные фильтры и т.п. Примеры подходящих фильтров включают, без ограничения, фильтры Cuno 50SA, Cuno 90SA и Cuno VR06 (Cuno). В качестве альтернативы этап разделения можно выполнить путем центрифугирования, а не фильтрации.
Хотя вышеописанные усовершенствования способа производства минимизируют потери IgG на начальных этапах очистки, критические примеси, включая PKA-активность, амидолитическую активность и содержание фибриногена, составляют намного большую величину, когда, например, пасту II+III экстрагируют при рН 4,5 или 4,6, по сравнению с экстракцией при рН приблизительно от 4,9 до 5,0 (см. примеры 2-5).
В рамках противодействия примесям, экстрагируемым при приведенных здесь способах, в настоящее время установлено, что чистоту композиции IgG можно значительно повысить путем добавления этапа предобработки до фильтрации/центрифугирования. В одном из вариантов воплощения этот этап предобработки включает внесение частиц тонкоизмельченного диоксида кремния (например, пирогенного кремнезема Aerosil®) с последующим инкубационным периодом продолжительностью от 40 до 80 мин, в течение которого суспензия постоянно перемешивается. В некоторых вариантах воплощения инкубационный период составляет величину между приблизительно 50 и приблизительно 70 мин или приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более. Как правило, обработку осуществляют при температуре между приблизительно 0 и приблизительно 10°C или между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В некоторых вариантах воплощения обработку можно осуществлять при температуре приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C. В конкретном варианте воплощения обработку осуществляют при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 10°C.
Действие обработки пирогенным кремнеземом подтверждается на примере результатов, полученных в примере 17. В этом примере преципитат фракции II+III суспендировали и разделяли на два образца, один из которых осветляли только с помощью вспомогательного фильтрующего материала перед фильтрацией (фиг. 7А), а другой обрабатывали пирогенным кремнеземом перед внесением вспомогательного фильтрующего материала и фильтрацией (фиг. 7В). Как видно из хроматограмм и количественных данных, образцы фильтрата, предварительно обработанные пирогенным кремнеземом, обладали намного более высокой чистотой IgG, чем образцы, обработанные только вспомогательным фильтрующим материалом (68,8% по сравнению с 55,7%; табл. 17 и 18 соответственно).
- 49 034530
В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации между приблизительно 2 0 и приблизительно 100 г/кг пасты II+III (т.е. для преципитата модифицированной фракции II+III, экстрагированного в соотношении 1:15, следует внести пирогенный кремнезем в концентрации между приблизительно 20 и приблизительно 100 г/16 кг суспензии II+III или в конечной концентрации между приблизительно 0,125и приблизительно 0,625% (мас./мас.)). В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем можно внести в концентрации приблизительно 20 или приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг пасты II+III. В одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем (например, Aerosil 380 или эквивалент) вносят в суспензию модифицированной фракции II+III до конечной концентрации приблизительно 40 г/16 кг II+III. Смешивание происходит приблизительно при 2-8°C в течение по меньшей мере 50-70 мин.
В некоторых вариантах воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 10 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 5 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию IgG в концентрации между приблизительно 0,02 и приблизительно 4 г/г белка. В одном варианте воплощения SiO2 вносят в конечной концентрации, равной по меньшей мере 0,1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,25 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2,5 г/г общего белка. В других конкретных вариантах воплощения тонкоизмельченный диоксид кремния вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,01 или по меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 г/г общего белка или более.
В некоторых вариантах воплощения после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации вносят вспомогательный фильтрующий материал, например Celpure C300 (Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals).
Вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 1,0 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,8 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,7 кг/кг пасты II+III. В других вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,05 кг/кг пасты II+III. В некоторых вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал вносят в конечной концентрации приблизительно 0,01 или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг пасты II+III.
При производстве GAMMAGARD® LIQUID значительная часть IgG терялась на этапе фильтрации. Установлено, что применяемые в настоящее время способы постфильтрационной промывки, использующие буфер суспензии в количестве 1,8 мертвого объема для очистки рамы и линии фильтр-пресса, являлись недостаточными для максимального восстановления IgG на данном этапе. Как ни странно, обнаружено, что для эффективного восстановления общего IgG осветленной суспензии модифицированной фракции II+III требовалось по меньшей мере 3,0 мертвых объема, предпочтительно 3,6 мертвых объема буфера суспензии (см. пример 12 и фиг. 1). В некоторых воплощений фильтр-пресс можно промывать любым подходящим буфером суспензии. В конкретном варианте воплощения буфер для промывки включает, например, 5 мМ моноосновный фосфат натрия, 5 мМ ацетат и 0,015% (об./об.) ледяную уксусную кислоту.
В одном аспекте усовершенствование относится к способу, при котором на этапе фильтрации суспензии фракции II+III теряется сниженное количество IgG. В одном из вариантов воплощения усовершенствование способа осуществляют путем промывки фильтра после фильтрации по меньшей мере 3,6 мертвыми объемами растворяющего буфера, содержащего 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. Корреляция между количеством ледяной уксусной кислоты и рН буфера для промывки показана на фиг. 10. В одном из вариантов воплощения рН буфера для промывки после экстракции составляет величину между приблизительно 4,6 и приблизительно 5,3. В предпочтительном варианте воплощения рН буфера для промывки составляет величину между приблизительно 4,7 и приблизительно 5,2. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН буфера для промывки составляет величину между приблизительно 4,8 и приблизительно 5,1. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН буфера для промывки составляет величину между приблизительно 4,9 и приблизительно 5,0.
По сравнению с ранее использовавшимися способами осветления суспензии, образованной на втором этапе осаждения (GAMMAGARD® LIQUID), настоящее изобретение в нескольких вариантах во- 50 034530 площения обеспечивает способы, позволяющие обеспечить повышенный выход IgG и чистоту суспензии модифицированной фракции II+III. В одном аспекте усовершенствование относится к способу, при котором в фильтровальном осадке модифицированной фракции II+III теряется сниженное количество IgG. В другом аспекте усовершенствование относится к способу, при котором в осветленной суспензии фракции II+III находится сниженное количество примесей.
В одном из вариантов воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом до осветления суспензии фракции II+III фильтрацией или центрифугированием. В некоторых вариантах воплощения обработка пирогенным кремнеземом включает внесение между приблизительно 0,01 и приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,05 кг/кг пасты II+III, или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,1 кг/кг пасты II+III; смесь инкубируют в течение между приблизительно 50 и приблизительно 70 мин или приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В еще одном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом, снижающей уровни остаточного фибриногена, амидолитическую активность и/или активность активатора прекалликреина. В конкретном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом, снижающей уровни FXI, FXIa, FXII и FXIIa в препарате иммуноглобулина.
В еще одном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем промывки глубинного фильтра приблизительно 3-5 мертвыми объемами фильтра после завершения этапа фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III. В некоторых вариантах воплощения фильтр промывают приблизительно 3,5-4,5 объемами или по меньшей мере приблизительно 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 мертвыми объемами фильтра. В конкретном варианте воплощения фильтр-пресс промывают по меньшей мере приблизительно 3,6 мертвыми объемами буфера суспензии.
6. Обработка детергентом.
Для удаления дополнительных примесей из фильтрата модифицированной фракции II+III образец далее подвергают обработке детергентом. Способы обработки фракций плазмы детергентом хорошо известны в данной области техники. Как правило, в сочетании с приведенными здесь способами можно использовать любую стандартную обработку неионногенным детергентом. Например, типичный протокол для обработки детергентом представлен ниже.
Вкратце, полисорбат-80 вносят к фильтрату модифицированной фракции II+III в конечной концентрации приблизительно 0,2% (мас./об.) при перемешивании и инкубируют образец по меньшей мере в течение 30 мин при температуре приблизительно 2-8°C. Затем с раствором смешивают безводный цитрат натрия в конечной концентрации около 8 г/л и инкубируют образец в течение дополнительных 30 мин при непрерывном перемешивании и температуре приблизительно 2-8°C.
В некоторых вариантах воплощения можно использовать любой подходящий неионогенный детергент. Примеры подходящих неионогенных детергентов включают, без ограничения, октилглюкозид, дигитонин, С12Е8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet Р-40, Tween-20 (т.е. полисорбат-20), Tween-80 (т.е. полисорбат-80), алкилполи(этиленоксид), детергент Brij, алкилфенолполи(этиленоксид), полоксамер, октилглюкозид, децилмальтозид и т.п.
В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения детергента (например, полисорбата-80 и безводного цитрата натрия) путем распыления, а не добавления в поток. В других вариантах воплощения детергенты можно вносить в фильтрат модифицированной фракции II+III в виде твердых веществ при перемешивании образца для обеспечения быстрого распределения добавок. В некоторых вариантах воплощения предпочтительно вносить твердые реагенты путем их распыления над делокализованной площадью поверхности фильтрата таким образом, что не возникает локальной избыточной концентрации, как бывает при добавлении в поток.
7. Событие третьего осаждения - образование преципитата G.
Для удаления нескольких остаточных малых белков, например альбумина и трансферрина, выполняют третье осаждение при концентрации спирта 25%. Вкратце, рН фильтрата II+III, обработанного детергентом, корректируют до величины между приблизительно 6,8 и 7,2, предпочтительно между приблизительно 6,9 и приблизительно 7,1, наиболее предпочтительно приблизительно 7,0, подходящим раствором для изменения рН (например, 1 М гидроксидом натрия или 1 М уксусной кислотой). Затем в раствор вносят охлажденный спирт в конечной концентрации приблизительно 25% (об./об.) и инкубируют смесь при перемешивании при температуре между приблизительно -6 и приблизительно -10°C по меньшей мере в течение 1 ч, в результате чего образуется третий преципитат (т.е. преципитат G). В одном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере в течение 2 ч или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ч или более. В предпочтительном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере в течение 2 ч. В более предпочтительном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере в течение 4 ч. В еще более предпочтительном варианте воплощения
- 51 034530 смесь инкубируют по меньшей мере в течение 8 ч.
В одном аспекте усовершенствование относится к способу, при котором на третьем этапе осаждения в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG. В некоторых вариантах воплощения усовершенствование способа осуществляют путем коррекции рН раствора до значений между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,2 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем непрерывного поддержания рН раствора между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,2 во время периода инкубирования при осаждении. В других вариантах воплощения рН раствора корректируют до значений между приблизительно 6,9 и приблизительно 7,1 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта или до значений рН приблизительно 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 или 7,2 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В конкретном варианте воплощения рН раствора корректируют до приблизительно 7,0 непосредственно после или во время внесения осаждающего спирта. В некоторых вариантах воплощения рН раствора непрерывно поддерживают между приблизительно 6,9 и приблизительно 7,1 во время периода инкубирования при осаждении, или при рН приблизительно 7,0 во время периода инкубирования при осаждении. В связи с этим в некоторых вариантах воплощения на третьем этапе осаждения в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируют до, но не после внесения осаждающего спирта, или с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора не поддерживают во время всего периода инкубирования при осаждении. В одном варианте воплощения рН поддерживают на желаемом уровне во время стабилизации или инкубирования при осаждении путем непрерывной коррекции рН раствора. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
В еще одном варианте воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения осаждающего спирта и/или раствора для изменения рН путем распыления, а не добавления в поток. В связи с этим в некоторых вариантах воплощения на третьем этапе осаждения в супернатанте фракции теряется сниженное количество IgG по сравнению с аналогичным этапом осаждения, при котором спирт и/или раствор для коррекции рН вносят путем добавления в поток. В одном из вариантов воплощения спирт представляет собой этанол.
8. Суспендирование и фильтрация преципитата G (PptG).
Для солюбилизации IgG, содержащегося в преципитате G, и ресуспендирования PptG используют охлажденный буфер для экстракции. Вкратце, преципитат G растворяют в соотношении 1 к 3,5 в воде для инъекций (WFI) при температуре между приблизительно 0 и приблизительно 8°C до достижения значения AU280-320, равного приблизительно 40-95. Окончательный рН раствора, перемешиваемого в течение по меньшей мере 2 ч, затем корректируют до значения, равного или приблизительно равного 5,2±0,2. В одном из вариантов воплощения эту коррекцию рН осуществляют с помощью 1 М уксусной кислоты. Для увеличения растворимости IgG увеличивают электрическую проводимость суспензии до значений между приблизительно 2,5 и приблизительно 6,0 мСм/см. В одном из вариантов воплощения электрическую проводимость увеличивают путем внесения хлорида натрия. Затем суспендированный раствор PptG фильтруют с подходящим глубинным фильтром с номинальным размером пор между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,4 мкм для удаления нерастворенных частиц. В одном из вариантов воплощения номинальный размер пор глубинного фильтра составляет приблизительно 0,2 мкм (например, Cuno VR06 или эквивалентный фильтр) для получения осветленного фильтрата. В еще одном варианте воплощения суспендированный раствор PptG центрифугируют для получения осветленного супернатанта. Постпромывку фильтра осуществляют с помощью раствора хлорида натрия при электрической проводимости между приблизительно 2,5 и приблизительно 6,0 мСм/см. Как правило, подходящие растворы для экстракции преципитата G включают WFI и буферы с низкой электрической проводимостью. В одном из вариантов воплощения буфер с низкой проводимостью имеет электрическую проводимость менее 10 мСм/см. В предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет электрическую проводимость менее приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет электрическую проводимость менее 6 мСм/см.
В еще одном предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет электрическую проводимость менее 4 мСм/см. В еще одном предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет электрическую проводимость менее 2 мСм/см.
9. Обработка растворителем/детергентом
Для инактивации различных вирусных примесей, которые могут присутствовать в препаратах плазмы, осветленный фильтрат PptG далее подвергают обработке растворителем/детергентом (S/D). Способы обработки фракций плазмы детергентом хорошо известны в данной области техники (см. обзор Pelletier J.P. et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19(1):205-42). Как правило, в сочетании с приведенными здесь способами можно использовать любую стандартную S/D-обработку. Например, типичный протокол для S/D-обработки представлен ниже.
- 52 034530
Вкратце, Triton X-100, Tween-20, и три(н-бутил)фосфат (TNBP) добавляют к осветленному фильтрату PptG в конечных концентрациях приблизительно 1,0, 0,3 и 0,3% соответственно. Затем смесь перемешивают при температуре между приблизительно 18°и приблизительно 25°C по меньшей мере приблизительно в течение 1 ч.
В одном из вариантов воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения S/D-реагентов (например, Triton X-100, Tween-20 и TNBP) путем распыления, а не добавления в поток. В других вариантах воплощения детергенты можно вносить в осветленный фильтрат PptG в виде твердых веществ при перемешивании образца для обеспечения быстрого распределения S/D-компонентов. В некоторых вариантах воплощения предпочтительно вносить твердые реагенты путем их распыления над делокализованной площадью поверхности фильтрата таким образом, что не возникает локальной избыточной концентрации, как бывает при добавлении в поток.
10. Ионообменная хроматография.
Для дальнейшей очистки и концентрирования IgG из S/D-обработанного фильтрата PptG можно использовать катионообменную и/или анионообменную хроматографию. Способы очистки и концентрирования IgG с использованием ионообменной хроматографии хорошо известны в данной области. Например, в патенте США № 5886154 описан способ, в котором преципитат фракции II+III осадок экстрагируют при низком рН (между приблизительно 3,8 и 4,5), с последующим осаждением IgG с использованием каприловой кислоты и, наконец, использованием двух этапов анионообменной хроматографии. В патенте США № 6069236 описана схема хроматографической очистки IgG, не основанная на осаждении спиртом. В публикации РСТ WO 2005/073252 описан способ очистки IgG, использующий экстракцию преципитата фракции II+III, обработку каприловой кислотой, обработку ПЭГ и один этап анионообменной хроматографии. В патенте США № 718 6410 описан способ очистки IgG, использующий экстракцию либо фракции I+II+III, либо преципитата фракции II с последующим единственным этапом анионообменной хроматографии, выполняемым в щелочной среде. В патенте США № 7553938 описан способ, использующий экстракцию либо фракции I+II+III, либо преципитата фракции II+III, обработку каприлатом и один или два этапа анионообменной хроматографии. В патенте США № 6093324 описан способ очистки, включающий использование макропористого анионита, работающего при рН между приблизительно 6,0 и приблизительно 6,6. В патенте США № 6835379 описан способ очистки, основанный на катионообменной хроматографии при отсутствии фракционирования спиртом. Описания вышеупомянутых публикаций полностью включены в настоящую заявку посредством ссылок для любых целей В одном из вариантов воплощения способов настоящего изобретения S/D-обработанный фильтрат PptG можно подвергнуть как катионообменной, так и анионообменной хроматографии. Например, в одном из вариантов воплощения S/D-обработанный фильтрат PptG пропускают через катионообменную колонку, которая связывает IgG в растворе. Затем S/D-реагенты удаляют промывкой от абсорбированного IgG, который затем элюируют с колонки щелочным буфером для элюирования, имеющим рН между приблизительно 8,0 и 9,0. Таким образом, этап катионообменной хроматографии можно использовать для удаления S/Dреагентов из препарата, для концентрирования раствора, содержащего IgG, или для этих обеих целей. В некоторых вариантах воплощения буфер для элюирования может иметь рН между приблизительно 8,2 и приблизительно 8,8, или между приблизительно 8,4 и приблизительно 8,6, или приблизительно 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В предпочтительном варианте воплощения рН буфера для элюирования составляет приблизительно 8,5±0,1.
В некоторых вариантах воплощения элюат из катионообменной колонки можно титровать до более низкого рН, например, между приблизительно 5,5 и приблизительно 6,5, и разбавить соответствующим буфером, снижая электрическую проводимость раствора. В некоторых вариантах воплощения рН элюата после катионообменной хроматографии можно скорректировать до рН между приблизительно 5,7 и приблизительно 6,3, или между приблизительно 5,9 и приблизительно 6,1, или приблизительно 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. В предпочтительном варианте воплощения рН элюата корректируют до рН приблизительно 6,0±0,1. Затем элюат наносят на анионообменную колонку, которая связывает некоторые примеси, содержащиеся в препарате. Сток колонки, содержащий фракции IgG, собирают при загрузке и промывке колонки. В некоторых вариантах воплощения этапы ионообменной хроматографии настоящего изобретения можно выполнить в колоночном режиме, периодическом режиме или их комбинации.
В некоторых вариантах воплощения усовершенствование способа осуществляют путем внесения раствора для изменения рН путем распыления, а не добавления в поток.
11. Нанофильтрация и ультра/диафильтрация.
Для дальнейшего снижения вирусной нагрузки композиции IgG, представленной здесь, сток анионообменной колонки можно подвергать нанофильтрации с помощью подходящего устройства для нанофильтрации. В некоторых вариантах воплощения устройство для нанофильтрации будет иметь средний размер пор между приблизительно 15 и приблизительно 200 нм. Примеры нанофильтров, подходящих для этой цели, включают, без ограничения, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, и 75N (Planova). В конкретном варианте воплощения нанофильтр мо- 53 034530 жет иметь средний размер пор между приблизительно 15 и приблизительно 72 нм, или между приблизительно 19 и приблизительно 35 нм, или приблизительно 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте воплощения нанофильтр имеет средний размер пор приблизительно 35 нм, например фильтр Asahi
Planova 35N или его эквивалент.
В необязательном случае для дальнейшего концентрирования нанофильтрата можно выполнять ультрафильтрацию/диафильтрацию. В одном из вариантов воплощения ближе к концу производственного процесса используют мембрану с открытым потоком в сочетании со специально разработанными постпромывкой и составлением препарата, что приблизительно удваивает концентрацию белка (200 мг/мл) в полученных композициях IgG, по сравнению с современными IVIG (например, GAMMAGARD® LIQUID), без ущерба для выхода и стабильности при хранении. При использовании большинства доступных для приобретения мембран ультрафильтрации концентрация IgG 200 мг/мл является недостижимой без больших потерь белка. Эти мембраны быстро блокируются, и, следовательно, адекватная постпромывка является трудноосуществимой. Поэтому надлежит использовать мембраны с открытым потоком. Даже при использовании мембран с открытым потоком для получения требуемой концентрации без значительной потери белка (менее 2%) приходится использовать специально разработанную процедуру постпромывки. Еще более удивительным является тот факт, что высокая концентрация белка 200 мг/мл не влияет на инактивацию вирусов на этапе хранения при низких значениях рН.
После нанофильтрации фильтрат можно дополнительно концентрировать ультрафильтрацией/диафильтрацией. В одном варианте воплощения нанофильтрат можно концентрировать ультрафильтрацией до концентрации белка между приблизительно 2 и приблизительно 10% (мас./об.). В некоторых вариантах воплощения ультрафильтрацию осуществляют в кассете с открытым экраном, а мембрана для ультрафильтрации имеет номинальную границу отсечки по молекулярной массе (NMWCO) менее приблизительно 100 или менее приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 кДа или менее. В предпочтительном варианте воплощения мембрана для ультрафильтрации имеет NMWCO не более 50 кДа.
По завершении этапа ультрафильтрации концентрат можно дополнительно концентрировать с помощью диафильтрации против раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых вариантах воплощения раствор для диафильтрации может содержать стабилизирующий и/или буферный агент. В предпочтительном варианте воплощения стабилизирующий и буферный агент представляет собой глицин в соответствующей концентрации, например, между приблизительно 0,20 и приблизительно 0,30 М, или между приблизительно 0,22 и приблизительно 0,28 М, или между приблизительно 0,24 и приблизительно 0,26 мМ, или в концентрации приблизительно 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 М. В предпочтительном варианте воплощения буфер для диафильтрации содержит или содержит приблизительно 0,25 М глицина.
Как правило, минимальный объем обмена по меньшей мере в 3 раза превышает первоначальный объем концентрата или по меньшей мере в 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более раз превышает первоначальный объем концентрата. Раствор IgG можно концентрировать до конечной концентрации белка между приблизительно 5 и приблизительно 25% (мас./об.), или между приблизительно 6 и приблизительно 18% (мас./об.), или между приблизительно 7 и приблизительно 16% (мас./об.), или между приблизительно 8 и приблизительно 14% (мас./об.), или между приблизительно 9% и приблизительно 12%, или до конечной концентрации приблизительно 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% (мас./об.) или более. В одном из вариантов воплощения достигается конечная концентрация белка по меньшей мере приблизительно 23% без добавления постпромывной фракции к концентрированному раствору. В еще одном варианте воплощения достигается конечная концентрация белка по меньшей мере приблизительно 24% без добавления постпромывной фракции к концентрированному раствору. Достигается конечная концентрация белка по меньшей мере приблизительно 25% без добавления постпромывной фракции к концентрированному раствору. Как правило, в конце концентрирования рН раствора составляет величину между приблизительно 4,6 и 5,1.
В типичном варианте воплощения рН композиции IgG корректируют до приблизительно 4,5 перед ультрафильтрацией. Раствор концентрируют путем ультрафильтрации до концентрации белка 5±2% (мас./об.). UF-мембрана имеет номинальную границу отсечки по молекулярной массе (NMWCO) 50000 дальтон или менее (полиэфирсульфоновая мембрана Millipore Pellicon). Концентрат подвергают диафильтрации против десяти объемов 0,25 М раствора глицина, рН 4,5±0,2. На протяжении операции ультра-диафильтрации раствор поддерживают при температуре между приблизительно 2°C и приблизительно 8°C. После диафильтрации раствор концентрируют до концентрации белка по меньшей мере 11% (мас./об.).
12. Составление препарата.
После завершения этапа диафильтрации концентрацию белка в растворе доводят буфером для диафильтрации до конечной концентрации между приблизительно 5 и приблизительно 20% (мас./об.), или между приблизительно 6 и приблизительно 18% (мас./об.), или между приблизительно 7 и приблизительно 16% (мас./об.), или между приблизительно 8 и приблизительно 14% (мас./об.), или между приблизительно 9 и приблизительно 12%, или до конечной концентрации приблизительно 5 или 6, 7, 8, 9, 10%,
- 54 034530
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% (мас./об.). В предпочтительном варианте воплощения конечная концентрация белка в растворе составляет величину между приблизительно 9 и приблизительно 11%, более предпочтительно приблизительно 10%.
Затем полученный нерасфасованный раствор стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр с абсолютным размером пор не более 0,22 мкм, например, приблизительно 0,2 мкм. Затем, раствор асептически разливают в контейнеры готовых лекарственных форм для надлежащей герметизации, причем отбирают образцы для тестирования.
В одном из вариантов воплощения композицию IgG в дальнейшем доводят до концентрации приблизительно 10,2±0,2% (мас./об.) буфером для диафильтрации. При необходимости корректируют рН до величины приблизительно 4,4-4,9. Наконец, раствор стерильно фильтруют и инкубируют в течение трех недель при температуре, равной или приблизительно равной 30°C.
В. Фактор Н.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции фактора Н плазмы. В одном из конкретных вариантов воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции фактора Н с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции фактора Н для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
В одном из вариантов воплощения способ также включает первый этап обогащения белка фактора Н с образованием первой обогащенной композиции фактора Н перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка фактора Н выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают второй этап обогащения белка фактора Н с образованием второй обогащенной композиции фактора Н перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка фактора Н выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции фактора Н плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения фактора Н с образованием первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции фактора Н плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения фактора Н после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения фактора Н выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции фактора Н плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения фактора Н с образованием первой обогащенной композиции фактора Н плазмы; (б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (г) выполнение второго этапа обогащения фактора Н с образованием второй обогащенной композиции фактора Н плазмы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
- 55 034530
Аналогичным образом, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции фактора Н плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения фактора Н с образованием первой обогащенной композиции фактора Н плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения фактора Н с образованием второй обогащенной композиции фактора Н плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (д) выполнение третьего этапа обогащения фактора Н с образованием третьей обогащенной композиции фактора Н плазмы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-10 или 11.
1. Способы производства фактора Н плазмы.
Что касается производства, то заявленные способы, исходным сырьем для которых является плазма человека, должны основываться на суб-фракционировании типичных промежуточных продуктов производства, полученных, например, путем фракционного осаждения этанолом при низкой температуре (обзор в Schultze H.E., Heremans J.F.; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317). Предпочтительным вариантом воплощения такой очистки является очистка функционального фактора Н из побочных фракций промышленного фракционирования плазмы, не затрагивающая установленные и лицензированные способы производства препаратов плазмы, например, иммуноглобулинов, контролируемые фармацевтическими регулирующими органами. Например, фильтровальный осадок, получаемый при фильтрации суспензии пасты фракции II+III (Teschner W. et al., Vox Sang. 2007 Jan; 92(1):42-55), преципитат фракции I (Cohn et al., (1946) supra), преципитат III (Schultze H.E., Heremans J.F.; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317 at p. 253) и преципитат В (способ по Кистлеру и Нитшманну; supra at p. 253) являются примерами такого промышленного сырья для получения фактора Н. При использовании этих побочных фракций в качестве сырья для очистки фактора Н можно использовать процедуры очистки, известные в данной области. Они могут быть основаны на осаждении полиэтиленгликолем (Nagasawa S., Stroud R.M.; Mol. Immunol. 1980; 17:1365-72), аффинной хроматографии с помощью иммобилизованного гепарина (цитата приведена выше), ионообменной хроматографии (Crossley L.G., Porter R.R.; Biochem J. 1980; 191:173-82) и хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (Ripoche J., Al Salihi A., Rousseaux J., Fontaine M.; Biochem J. 1984; 221, 89-96).
В одном варианте воплощения исходный материал для изобретения получают, используя фракции по Кону. Это фракционирование является хорошо известным фракционированием, используемым для изготовления препаратов иммуноглобулинов, получаемых из донорской сыворотки или моноклональных или рекомбинантных иммуноглобулинов. В типичном примере кровь собирают от здоровых доноров. Как правило, кровь собирают от того же вида животных, к которому принадлежит субъект, которому будут вводить препарат иммуноглобулина (обычно называемый гомологичным иммуноглобулином). Иммуноглобулины выделяют из крови с помощью подходящих процедур, например, фракционирования по Кону, ультрацентрифугирования, электрофореза, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, иммуноаффинной хроматографии, фракционирования полиэтиленгликолем или т.п. процедур. (См., например, Conn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); патенты США № 5122373 и 5177194, описания которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для всех целей.) В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение использует фракции, отбракованные при изготовлении иммуноглобулинов. В конкретном варианте воплощения настоящее изобретение использует фракцию, находящуюся в фильтровальном осадке SiO2 после фильтрации экстракта фракции II+III.
Как правило, препараты фактора Н в соответствии с настоящим изобретением можно изготовить из любых подходящих исходных материалов, например, восстановленной плазмы или свежезамороженной плазмы. В типичном примере кровь или плазму собирают от здоровых доноров. Как правило, кровь собирают от того же вида животных, к которому принадлежит субъект, которому будут вводить препарат фактора Н (обычно называемый гомологичным фактором Н). Фактор Н выделяют из крови или плазмы с помощью подходящих процедур, например, осаждения (фракционирования спиртом или фракционирования полиэтиленгликолем), хроматографических методик (ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, иммуноаффинной хроматографии и т.д.), ультрацентрифугирования, электрофореза и т.п. (См., например, Conn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Deutsch et al., J. Biol. Chem. 164:109- 56 034530
118; Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950); Cohn et al., Blood Cells and Plasma Proteins: Their State in Nature (J.L. Tullis, ed), p. 1-58, Academic Press, NewYork and London (1953); Nitschmann et al., Helv. Chim. Acta 37:866-873; Kistler and Nitschmann, Vox Sang. 7:414-424 (1962); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); патенты США № 5122373 и 5177194, описания которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для всех целей).
В некоторых вариантах воплощения фактор Н получают из материала, в ином случае отбраковываемого в процессе производства других коммерчески важных препаратов крови путем фракционирования плазмы. Например, в типичном варианте воплощения, фактор Н экстрагируют из преципитата фракции I и/или из фильтровального осадка, образующегося после центрифугирования или фильтрации ресуспендированной пасты фракции II+III. Преимущество представленных здесь способов состоит в том, что получение фактора Н в промышленных масштабах не требует дополнительных затрат плазмы или переконструирования и повторного одобрения контролирующими органами существующих процедур производства других коммерчески значимых препаратов плазмы крови, например, гамма-глобулинов IgG для внутривенного (IVIG) или подкожного введения.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения обогащенной композиции фактора Н с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из плазмы путем экстракции фактора Н из фракции плазмы и снижения содержания FXI, FXIa, FXII и/или FXIIa с помощью способа обработки SiO2, представленного здесь.
В одном варианте воплощения представлен способ получения обогащенной композиции фактора Н из плазмы, включающий следующие этапы: (а) осаждение белков из криосупернатантной фракции плазмы на первом этапе осаждения в присутствии между приблизительно 6% и приблизительно 10% спирта при рН между примерно 7,0 и примерно 7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта, (б) осаждение фактора Н из первого супернатанта на втором этапе осаждения в присутствии между приблизительно 20% и приблизительно 3 0% спирта при рН между примерно 6,7 и примерно 7,2 с получением второго осадка;
(в) ресуспендирование второго осадка с образованием суспензии;
(г) смешивание тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией этапа (в); (д) отделение суспензии с образованием фильтровального осадка и супернатанта и (е) экстрагирование фактора Н из фильтровального осадка SiO2 при параметрах раствора, снижающих уровень сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в конечной композиции. В предпочтительном варианте воплощения фильтровальный осадок отделяют от супернатанта путем фильтрации суспензии через фильтр-пресс, содержащий соответствующий фильтр. В одном варианте воплощения фактор Н можно экстрагировать путем рециркуляции буфера для экстракции через фильтр-пресс, содержащий фильтровальный осадок.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения обогащенной композиции фактора Н с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из плазмы путем экстракции фактора Н из преципитата фракции I.
В предпочтительном варианте воплощения представлен способ получения обогащенной композиции фактора Н из плазмы, включающий следующие этапы: (а) осаждение белков из фракции криосупернатантной плазмы на первом этапе осаждения с помощью концентрации спирта между приблизительно 6% и приблизительно 10% при рН между приблизительно 7,0 и приблизительно 7,5 с получением первого преципитата и первого супернатанта; (б) экстрагирование фактора Н из преципитата буфером для экстракции фактора Н и (в) снижение уровня сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы путем обработки композиции SiO2 с использованием подходящего способа, представленного здесь.
В одном аспекте представлен способ получения обогащенной композиции фактора Н из плазмы путем экстрагирования фактора Н из пула двух или более побочных фракций продуктов производства, образующихся в ходе способа, предназначенного для получения другого белка крови, например, гаммаглобулинов IgG. В одном варианте воплощения способ включает объединение преципитата фракции I и фильтровального осадка фракции II+III, образованного при производстве гамма-глобулинов IgG (например, IVIG) и экстрагирование фактора Н из объединенных фракций.
В некоторых вариантах воплощения обогащенную композицию фактора Н с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы можно дополнительно очистить после экстракции из преципитата фракции I и/или фильтровального осадка фракции II+III. Доступны различные способы дальнейшей очистки фактора Н, включающие, без ограничений, дополнительные этапы осаждения или фракционирование, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобными взаимодействиями, эксклюзионную хроматографию, обработку растворителем/детергентом (S/D), нанофильтрацию, ультрафильтрацию, диафильтрацию и т.п.
В одном варианте воплощения способ дополнительно включает осаждение примесей из обогащенной композиции фактора Н. В некоторых вариантах воплощения этот этап включает осаждение по меньшей мере одной примеси, например липида или белка, из композиции с дальнейшим отделением преципитата от супернатанта, содержащего фактор Н. В необязательном случае фактор Н можно осадить из супернатанта в ходе отдельного этапа осаждения.
- 57 034530
В конкретном варианте воплощения композицию фактора Н, экстрагированную из фракции плазмы (например, преципитата фракции I, преципитата фракции II+III, преципитата В и т.д.), дополнительно обогащают путем осаждения по меньшей мере одной примеси из раствора с помощью ПЭГ в конечной концентрации между приблизительно 2,5 и приблизительно 7,5%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации между приблизительно 3 и приблизительно 7%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации между приблизительно 4 и приблизительно 6%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации приблизительно 5%.
В еще одном конкретном варианте воплощения композицию фактора Н, экстрагированную из фракции плазмы (например, преципитата фракции I, преципитата фракции II+III, преципитата В и т.д.), дополнительно обогащают путем осаждения фактора Н из раствора с помощью ПЭГ в конечной концентрации между приблизительно 9 и приблизительно 15%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации между приблизительно 10 и приблизительно 14%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации между приблизительно 11 и приблизительно 13%. В еще одном варианте воплощения ПЭГ используют в конечной концентрации приблизительно 12%.
В еще одном конкретном варианте воплощения композицию фактора Н, экстрагированную из фракции плазмы (например, преципитата фракции I, преципитата фракции II+III, преципитата В и т.д.), дополнительно обогащают путем (а) осаждение по меньшей мере одной примеси из раствора; (б) осаждение фактора Н из раствора, и (в) восстановление преципитата, содержащего фактор Н. В некоторых вариантах воплощения этапы осаждения осуществляют с помощью спирта (например, метанола или этанола), ПЭГ или их комбинации. В конкретном варианте воплощения этапы осаждения осуществляют с помощью ПЭГ. В некоторых вариантах воплощения концентрация ПЭГ на первом этапе осаждения составляет величину между приблизительно 2,5 и приблизительно 7,5%, а концентрация ПЭГ на втором этапе осаждения составляет величину между приблизительно 9 и приблизительно 15%. В конкретном варианте воплощения концентрация ПЭГ на первом этапе составляет величину между приблизительно 4 и приблизительно 6%, а концентрация ПЭГ на втором этапе составляет величину между приблизительно 11 и приблизительно 13%. В более конкретном варианте воплощения концентрация ПЭГ на первом этапе осаждения составляет приблизительно 5%, а концентрация ПЭГ на втором этапе осаждения составляет приблизительно 12%. В других вариантах воплощения концентрацию ПЭГ на первом и втором этапах осаждения выбирают из вариантов (Вар. 1101-Вар. 1221), перечисленных в табл. 16.
Таблица 16
Концентрации ПЭГ для обогащения композиций фактора Н
Концентрация ПЭГ - первое осаждение
2,5% 3.0% 3,5% 4,0% 4,5% 5,0% 5.5% 6.0% 6.5% 7,0% 7,5%
Концентрация ПЭГ - второе осаждение 2,5% Вар. 1101 Вар 1112 Вар. 1123 Вар. 1134 Вар. 1145 Вар. 1156 Вар. 1167 Вар. 1178 Вар 1189 Вар. 1200 Вар. 1211
3,0% Вар. 1102 Вар 1113 Вар. 1124 Вар. 1135 Вар. 1146 Вар. 1157 Вар. 1168 Вар. 1179 Вар 1190 Вар. 1201 Вар. 1212
3.5% Вар. 1103 Вар. 1114 Вар. 1125 Вар. 1136 Вар. 1147 Вар. 1158 Вар. 1169 Вар. 1180 Вар 1191 Вар. 1202 Вар. 1213
4,0% Вар. 1104 Вар. 1115 Вар. 1126 Вар. 1137 Вар. 1148 Вар. 1159 Вар. 1170 Вар. 1181 Вар 1192 Вар. 1203 Вар. 1214
4,5% Вар. 1105 Вар 1116 Вар. 1127 Вар. 1138 Вар. 1149 Вар. 1160 Вар. 1171 Вар. 1182 Вар 1193 Вар. 1204 Вар. 1215
5,0% Вар. 1106 Вар. 1117 Вар. 1128 Вар. 1139 Вар. 1150 Вар. 1161 Вар. 1172 Вар. 1183 Вар. 1194 Вар. 1205 Вар. 1216
5,5% Вар 1107 Вар. 1118 Вар. 1129 Вар 1140 Вар 1151 Вар 1162 Вар. 1173 Вар. 1184 Вар. 1195 Вар 1206 Вар 1217
6,0% Вар. 1108 Вар. 1119 Вар. ИЗО Вар. 1141 Вар 1152 Вар 1163 Вар. 1174 Вар. 1185 Вар. 1196 Вар 1207 Вар 1218
6,5% Вар. 1109 Вар. 1120 Вар. 1131 Вар. 1142 Вар. 1153 Вар. 1164 Вар. 1175 Вар. 1186 Вар. 1197 Вар. 1208 Вар. 1219
7,0% Вар 1110 Вар. 1121 Вар. 1132 Вар 1143 Вар 1154 Вар 1165 Вар. 1176 Вар. 1187 Вар. 1198 Вар 1209 Вар 1220
7,5% Вар. 1111 Вар. 1122 Вар. 1133 Вар 1144 Вар 1155 Вар 1166 Вар. 1177 Вар. 1188 Вар. 1199 Вар 1210 Вар 1221
- 58 034530
В некоторых вариантах воплощения способ получения обогащенной композиции фактора Н дополнительно включает по меньшей мере один, предпочтительно два хроматографических этапа для дальнейшего повышения чистоты композиции. В целом, любую подходящую хроматографическую методику можно использовать для дальнейшего обогащения композиции фактора Н, например, экстрагированной из преципитата фракции I или фильтровального осадка фракции II+III. В некоторых вариантах воплощения экстрагированную композицию фактора Н до хроматографического обогащения подвергают одному или нескольким дополнительным этапам осаждения, как описано выше, для уменьшения количества примесей, присутствующих в композиции, снижения загружаемого объема на хроматографическом этапе и/или замены буфера композиции.
В некоторых вариантах воплощения композицию фактора Н можно дополнительно обогащать на хроматографическом этапе, включающем анионообменную хроматографию (АЕС), катионообменную хроматографию (СЕС), аффинную хроматографию с гепарином, гидрофобную обменную хроматографию (HIC), хроматографию на гидроксиапатите (НАР), иммуноаффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию (т.е. гель-фильтрацию), или другом подходящем хроматографическом этапе. Хроматографические этапы можно выполнять в периодическом или колоночном режиме.
В предпочтительном варианте воплощения способ включает использование анионообменной хроматографии и аффинной хроматографии с гепарином.
В некоторых вариантах воплощения представленные здесь способы получения обогащенной композиции фактора Н дополнительно включают по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, наиболее предпочтительно по меньшей мере три этапа инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры этапов инактивации или удаления вирусов, которые можно использовать с представленными здесь способами включают обработку растворителем/детергентом (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis, 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 и Kreil et al., Transfusion, 2003 (43):1023-1028; обе эти работы в явной форме полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для любых целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang, 1989 (56)230-236 и Yuasa et al., J. Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)): 2021-2024; обе эти работы в явной форме полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для любых целей), инкубирование при низких значениях рН и высокой температуре (Kempf et al., Transfusion, 1991, (31):423-427 и Louie et al., Biologicals, 1994, (22):13-19) и термическую обработку лиофилизированных композиций фактора Н (Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15; 47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989; (56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar; 114(3):335-40).
В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ получения вирусологически безопасной обогащенной композиции фактора Н с пониженным содержанием сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы, включающий (1) экстрагирование фактора Н из фильтровального осадка фракции II+III с использованием SiO2, (2) выполнение первого этапа осаждения для осаждения по меньшей мере одной из примесей из композиции фактора Н, (3) выполнение второго этапа осаждения для осаждения фактора Н из композиции и (4) выполнение по меньшей мере одного этапа инактивации или удаления вирусов, за счет чего получают вирусологически безопасную обогащенную композицию фактора Н. В одном из вариантов воплощения этапы осаждения включают осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения концентрацию ПЭГ на первом и втором этапах осаждения выбирают из вариантов Вар. 1101 и Вар. 1221, перечисленных в табл. 16.
2. Совместное связывание и дифференциальное элюирование.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий совместное экстрагирование фактора Н и сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции, происходящей из пула плазмы, путем связывания белков тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), элюирования сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы с SiO2 при первом параметре раствора с последующим элюированием фактора Н с SiO2 при втором параметре раствора. В предпочтительном варианте воплощения исходная композиция представляет собой ресуспендированный преципитат фракции II+III или эквивалент этого преципитата.
В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2 при параметрах раствора, при которых фактор Н остается связанным; и (г) элюирование фактора Н с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором фактор Н остается связанным, относится к параметру, при котором преимущественно элюируется сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы, в то время как значительная часть фактора Н остается связанной с SiO2. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества фактора Н,
- 59 034530 связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества фактора Н, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества фактора Н, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества фактора Н, связанного с SiO2. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества фактора Н, связанного с SiO2 или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или более от количества фактора Н, связанного с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения дифференциальное элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и фактора Н достигается путем последовательного контактирования (т.е. поэтапного элюирования) SiO2 с первым параметром раствора (например, первым буфером для элюирования), пригодным для элюирования большей части сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не значительной части связанного фактора Н, и вторым параметром раствора (например, вторым буфером для элюирования), пригодным для элюирования значительной части связанного фактора Н с SiO2.
В других вариантах воплощения дифференциальное элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и фактора Н достигается путем постепенного изменения параметров раствора (т.е. с помощью градиентного элюирования) с первого параметра раствора, пригодного для элюирования большей части сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не значительной части связанного фактора Н, до второго параметра раствора, пригодного для элюирования значительной части связанного фактора Н с SiO2. Таким образом, фракции сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и фактора Н, элюированные с SiO2, могут частично перекрываться. Путем фракционирования элюирования и оценки характеристик отдельных фракций можно создать пул фактора Н из фракций с высоким содержанием фактора Н и низким содержанием сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
Параметры раствора из вышеописанного способа, которые можно изменять для достижения желаемого результата, включают, без ограничения, рН раствора, электрическую проводимость раствора, температуру раствора, концентрацию фактора Н в композиции и концентрацию SiO2, используемого в способе. Как правило, подходящий диапазон рН для способов снижения содержания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в обогащенной композиции фактора Н составляет от приблизительно 3 до приблизительно 11. Подходящие значения электрической проводимости для вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мСм/см. Подходящие температуры для выполнения вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно -10 до приблизительно 90°C. Тонкоизмельченный диоксид кремния можно использовать в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 г/г белка. Наконец, концентрация фактора Н в композиции может варьировать от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/мл.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 11,0. В еще одном варианте воплощения рН находится между приблизительно 6,0 и приблизительно 1,0. В еще одном варианте воплощения рН находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 9,0. В еще одном варианте воплощения рН находится между приблизительно 7,5 и приблизительно 8,5. В еще одном варианте воплощения рН находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 8,0.
В конкретном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН, равный приблизительно 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения рН составляет приблизительно 7,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН составляет приблизительно 3,0 или приблизительно 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2,
6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8,
8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11,0.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН, равный по меньшей мере 6,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 6,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,5. В других вариантах воплощения рН раствора составляет по меньшей мере 3,0 или по меньшей мере 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5 или выше.
В еще одном варианте воплощения любого из вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, a значительная часть фактора Н остается связанной, включает рН не выше приблизительно 11,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 10,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 9,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизи- 60 034530 тельно 8,0. В других вариантах воплощения рН раствора составляет не выше приблизительно 11,0 или
10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5 или ниже.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В других вариантах воплощения электрическая проводимость раствора составляет по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мСм/см или более.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 100 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 10 и приблизительно 50 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 100 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 50 мСм/см.
Как показано в примере 5 и проиллюстрировано на фиг. 3, установлено, что использование параметров раствора, включающих рН выше 6,0 (например, 7,5) и повышенную электрическую проводимость (например, более 6,0 мСм/см), приводит к повышенному элюированию сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiO2 и пониженному элюированию фактора Н с SiO2. Эти данные можно использовать для обеспечения способов снижения уровня сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы, присутствующих в композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере приблизительно 10 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 10 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 20 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 20 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,5.
3. Совместное связывание и преимущественное элюирование фактора Н.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий совместное экстрагирование фактора Н и сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции, происходящей из пула плазмы, путем связывания белков тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и элюирования фактора Н с SiO2 при условиях, когда значительная часть связанной сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2. В предпочтительном варианте воплощения исходная композиция представляет собой ресуспендированный преципитат фракции II+III или эквивалент этого преципитата.
В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2 при параметрах раствора, когда сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанной.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанной, относится к параметру, при котором преимущественно элюируется фактор Н, в то время как значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2 или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2.
- 61 034530 еще еще еще еще одном одном одном одном варианте варианте варианте варианте воплощения воплощения воплощения воплощения рН рН рН рН
Параметры раствора из вышеописанного способа, которые можно изменять для достижения желаемого результата, включают, без ограничения, рН раствора, электрическую проводимость раствора, температуру раствора, концентрацию фактора Н в композиции и концентрацию SiO2, используемого в способе. Как правило, подходящий диапазон рН для способов снижения содержания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в обогащенной композиции фактора Н составляет от приблизительно 3 до приблизительно 11. Подходящие значения электрической проводимости для вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мСм/см. Подходящие температуры для выполнения вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно -10 до приблизительно 90°C. Тонкоизмельченный диоксид кремния можно использовать в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 г/г белка. Наконец, концентрация фактора Н в композиции может варьировать от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/мл.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 11,0. В находится между приблизительно 6,0 и приблизительно 1,0. находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 9,0. находится между приблизительно 7,5 и приблизительно 8,5. находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 8,0.
В конкретном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН приблизительно 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения рН составляет приблизительно 7,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН составляет приблизительно 3,0 или приблизительно 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,
4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5,
6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1,
9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11,0.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН, равный по меньшей мере 6,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 6,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,5. В других вариантах воплощения рН раствора составляет по меньшей мере 3,0 или по меньшей мере 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5 или выше.
В еще одном варианте воплощения любого из вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает рН не выше приблизительно 11,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 10,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 9,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН раствора составляет не выше приблизительно 11,0 или
10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5 или ниже.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает электрическую проводимость, составляющую не более приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет не более приблизительно 10 мСм/см. В других вариантах воплощения проводимость раствора составляет не более приблизительно 20 или не более приблизительно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 мСм/см или менее.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы элюируется с SiO2, а значительная часть фактора Н остается связанной, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 2 и приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 6 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 10 и приблизительно 6 мСм/см.
Как показано в примере 5 и проиллюстрировано на фиг. 3, установлено, что использование параметров раствора, включающих рН выше 6,0 (например, 7,5) и пониженную электрическую проводимость (например, менее 20 мСм/см), приводит к повышенному элюированию фактора Н с SiO2 и пониженному элюированию сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз с SiO2. Эти данные можно использовать для обеспечения способов снижения уровня сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы, присутствующих в композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н элюируется с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной, включает электрическую прово- 62 034530 димость не более приблизительно 20 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость не более приблизительно 10 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 2 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 2 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,5.
4. Преимущественное связывание фактора Н.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий (а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н, но ни одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование фактора Н с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается с SiO2, относится к параметру, который дает преимущественную возможность связывания фактора Н с SiO2, в то время как значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается в растворе в несвязанном состоянии. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или более от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции.
Параметры раствора из вышеописанного способа, которые можно изменять для достижения желаемого результата, включают, без ограничения, рН раствора, электрическую проводимость раствора, температуру раствора, концентрацию фактора Н в композиции и концентрацию SiO2, используемого в способе. Как правило, подходящий диапазон рН для способов снижения содержания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в обогащенной композиции фактора Н составляет от приблизительно 3 до приблизительно 11. Подходящие значения электрической проводимости для вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мСм/см. Подходящие температуры для выполнения вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно -10 до приблизительно 90°C.
Тонкоизмельченный диоксид кремния можно использовать в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 г/г белка. Наконец, концентрация фактора Н в композиции может варьировать от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/мл.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 11,0. рН находится между приблизительно 6,0 и приблизительно рН находится между приблизительно 7,0 и приблизительно рН находится между приблизительно 7,5 и приблизительно рН находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 8,0.
В конкретном варианте воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает рН, равный приблизительно 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения рН составляет приблизительно 7,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН составляет приблизительно 3,0 или приблизительно 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11,0.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает рН, равный по меньшей мере 6,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 6,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,5. В других вариантах воплощения рН раствора составляет по
В еще одном варианте 1,0. В еще одном варианте 9,0. В еще одном варианте 8,5. В еще одном варианте воплощения воплощения воплощения воплощения
- 63 034530 меньшей мере 3,0 или по меньшей мере 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5 или выше.
В еще одном варианте воплощения любого из вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает рН не выше приблизительно 11,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 10,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 9,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН раствора составляет не выше приблизительно 11,0 или 10,5, 10,0,
9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5 или ниже.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В других вариантах воплощения электрическая проводимость раствора составляет по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мСм/см или более.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, а значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 100 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 10 и приблизительно 50 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 100 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 50 мСм/см.
Как показано в примере 5 и проиллюстрировано на фиг. 3, установлено, что использование параметров раствора, включающих рН выше 6,0 (например, 7,5) и повышенную электрическую проводимость (например, более 6,0 мСм/см), приводит к пониженному сродству сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз к SiO2 и повышенному сродству фактора Н к SiO2. Эти данные можно использовать для обеспечения способов снижения уровня сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы, присутствующих в композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором фактор Н связывается с SiO2, a значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы не связывается, включает электрическую проводимость по меньшей мере приблизительно 10 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 10 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 20 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость, равную по меньшей мере 20 мСм/см, и рН, равный по меньшей мере 7,5.
5. Преимущественное связывание сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий (а) контактирование композиции, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы, но не фактора Н; и (б) отделение SiO2 от композиции.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором фактор Н не связывается с SiO2, относится к параметру, который дает преимущественную возможность связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2, в то время как значительная часть фактора Н остается в растворе в несвязанном состоянии. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества фактора Н в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества фактора Н в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества фактора Н в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества фактора Н в исходной композиции. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества фактора Н в исходной композиции или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества фактора Н в исходной композиции.
Параметры раствора из вышеописанного способа, которые можно изменять для достижения желаемого результата, включают, без ограничения, рН раствора, электрическую проводимость раствора, температуру раствора, концентрацию фактора Н в композиции и концентрацию SiO2, используемого в способе. Как правило, подходящий диапазон рН для способов снижения содержания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в обогащенной композиции фактора Н составляет от приблизи- 64 034530 тельно 3 до приблизительно 11. Подходящие значения электрической проводимости для вышеописанных способов находятся в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мСм/см.
Подходящие температуры для выполнения вышеописанных способов находятся в диапазоне от еще еще еще еще одном одном одном одном варианте варианте варианте варианте воплощения воплощения воплощения воплощения рН рН рН рН приблизительно -10 до приблизительно 90°C. Тонкоизмельченный диоксид кремния можно использовать в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 г/г белка. Наконец, концентрация фактора Н в композиции может варьировать от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/мл.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 11,0. В находится между приблизительно 6,0 и приблизительно 1,0. находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 9,0. находится между приблизительно 7,5 и приблизительно 8,5. находится между приблизительно 7,0 и приблизительно 8,0.
В конкретном варианте воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает рН, равный приблизительно 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения рН составляет приблизительно 7,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН составляет приблизительно 3,0 или приблизительно 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3,
6.4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11,0.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает рН, равный по меньшей мере 6,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 6,5. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет по меньшей мере 7,5. В других вариантах воплощения рН раствора составляет по меньшей мере 3,0 или по меньшей мере 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5 или выше.
В еще одном варианте воплощения любого из вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает рН не выше приблизительно 11,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 10,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 9,0. В еще одном варианте воплощения рН составляет не выше приблизительно 8,0. В других вариантах воплощения рН раствора составляет не выше приблизительно 11,0 или 10,5, 10,0,
9.5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5 или ниже.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает электрическую проводимость не более приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет не более приблизительно 10 мСм/см. В других вариантах воплощения проводимость раствора составляет не более приблизительно 20 или не более приблизительно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 мС/см, 7, 6, 5, 4, 3, 2 мСм/см или менее.
В одном из вариантов воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает электрическую проводимость между приблизительно 2 и приблизительно 20 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 2 и приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 20 и приблизительно 6 мСм/см. В еще одном варианте воплощения электрическая проводимость составляет величину между приблизительно 10 и приблизительно 6 мСм/см.
Как показано в примере 5 и проиллюстрировано на фиг. 3, установлено, что использование параметров раствора, включающих рН выше 6,0 (например, 7,5) и пониженную электрическую проводимость (например, менее 20 мСм/см), приводит к повышенному сродству фактора Н к SiO2 и пониженному сродству сериновых протеаз и/или проферментов сериновых протеаз к SiO2. Эти данные можно использовать для обеспечения способов снижения уровня сериновой протеазы и профермента сериновой протеазы, присутствующих в композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения вышеописанных способов параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2, а значительная часть фактора Н не связывается, включает электрическую проводимость не более приблизительно 20 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном конкретном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость не более приблизительно 10 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,5. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 2 мСм/см и рН, равный по меньшей мере 7,0. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает электрическую проводимость между приблизительно 10 и приблизительно 2 мСм/см и рН, равный по меньшей
- 65 034530 мере 7,5.
6. Способ экстракции фактора Н из преципитата плазмы.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции фактора Н, включающий этапы:
(а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н;
(б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см; и (в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 мСм/см и 40 мСм/см.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанный способ также включает этап обогащения, включающий осаждение по меньшей мере одной из примесей из обогащенной композиции фактора Н, причем фактор Н не соосаждается. В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н; (б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см, и (г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н, причем фактор Н не соосаждается, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения, включающий осаждение фактора Н из обогащенной композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н; (б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см;
(г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н с образованием супернатанта, содержащего фактор Н и (д) осаждение фактора Н из супернатанта, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и
- 66 034530
6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки 81О2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4 000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%. В одном из вариантов воплощения этап осаждения фактора Н представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение фактора Н включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 10 до 15%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения фактора Н составляет 12±0,5%.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения, включающий выполнение анионообменной хроматографии обогащенной композиции фактора Н.
В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н; (б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см;
(г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н с образованием супернатанта, содержащего фактор Н; (д) осаждение фактора Н из супернатанта; (е) ресуспендирование преципитата, содержащего фактор Н; (ж) связывание фактора Н, присутствующего в ресуспендированном преципитате, с анионообменной смолой; и (з) элюирование фактора Н с анионообменной смолы, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 мСм/см и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГосаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%. В одном из вариантов воплощения этап осаждения фактора Н представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение фактора Н включает осаждение с помощью ПЭГ 4 000 в конечной концентрации от 10 до 15%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения фактора Н составляет 12±0,5%.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения, включающий выполнение аффинной хроматографии с гепарином обогащенной композиции фактора Н. В конкретном варианте воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н; (б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см;
(г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н с образованием супернатанта, содержащего фактор Н;
(д) осаждение фактора Н из супернатанта;
(е) ресуспендирование преципитата, содержащего фактор Н;
(ж) связывание фактора Н, присутствующего в ресуспендированном преципитате, с анионообменной смолой;
(з) элюирование фактора Н с анионообменной смолы;
(и) связывание фактора Н, присутствующего в элюате анионообменной смолы, с гепаринсодержащей аффинной смолой и
- 67 034530 (к) элюирование фактора Н с гепаринсодержащей аффинной смолы, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%. В одном из вариантов воплощения этап осаждения фактора Н представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение фактора Н включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 10 до 15%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения фактора Н составляет 12±0,5%.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают подвергание композиции фактора Н специализированному этапу удаления и/или инактивации вирусов. В конкретном варианте воплощения способ включает этапы:
(а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н;
(б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см;
(г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н с образованием супернатанта, содержащего фактор Н;
(д) осаждение фактора Н из супернатанта;
(е) ресуспендирование преципитата, содержащего фактор Н;
(ж) связывание фактора Н, присутствующего в ресуспендированном преципитате, с анионообменной смолой;
(з) элюирование фактора Н с анионообменной смолы;
(и) связывание фактора Н, присутствующего в элюате анионообменной смолы, с гепаринсодержащей аффинной смолой;
(к) элюирование фактора Н с гепаринсодержащей аффинной смолы и (л) выполнение специализированного этапа удаления и/или инактивации вирусов, выбранного из нанофильтрации, обработки растворителем/детергентом (S/D), термической обработки и инкубирования при низких рН, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%. В одном из вариантов воплощения этап осаждения фактора Н представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение фактора Н включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 10 до 15%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения фактора Н составляет 12±0,5%.
- 68 034530
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап концентрирования обогащенной композиции фактора Н путем ультрафильтрации/диафильтрации. В конкретном варианте воплощения способ включает этапы:
(а) контактирование композиции суспендированного преципитата плазмы, содержащей фактор Н и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания фактора Н;
(б) промывка SiO2 раствором, характеризующимся рН между 5,0 и 7,0 и электрической проводимостью менее 4 мСм/см;
(в) элюирование фактора Н с SiO2 раствором, характеризующимся рН между 7,0 и 8,0 и электрической проводимостью более 10 мСм/см;
(г) осаждение по меньшей мере одной из примесей из продукта элюирования фактора Н с образованием супернатанта, содержащего фактор Н;
(д) осаждение фактора Н из супернатанта;
(е) ресуспендирование преципитата, содержащего фактор Н;
(ж) связывание фактора Н, присутствующего в ресуспендированном преципитате, с анионообменной смолой;
(з) элюирование фактора Н с анионообменной смолы;
(и) связывание фактора Н, присутствующего в элюате анионообменной смолы, с гепаринсодержащей аффинной смолой;
(к) элюирование фактора Н с гепаринсодержащей аффинной смолы;
(л) выполнение специализированного этапа удаления и/или инактивации вирусов, выбранного из нанофильтрации, обработки растворителем/детергентом (S/D), термической обработки и инкубирования при низких рН и (м) концентрирование фактора Н путем ультрафильтрации/диафильтрации, тем самым обеспечивая обогащенную композицию фактора Н.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой один или более из FXI, FXIa, FXII и FXIIa. В некоторых вариантах воплощения преципитат плазмы представляет собой преципитат фракции I по Кону, преципитат фракции II+III по Кону, преципитат фракции I+II+III по Кону, преципитат А по Кистлеру-Нитшманну, преципитат В по Кистлеру-Нитшманну или эквивалентную им фракцию. В одном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет величину между 5,5 и 6,5. В конкретном варианте воплощения рН раствора, используемого для промывки SiO2, составляет 6,0±0,2. В одном из вариантов воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте воплощения электрическая проводимость раствора, используемого для элюирования фактора Н, составляет величину между 25 мСм/см и 40 мСм/см. В одном из вариантов воплощения этап осаждения примеси представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение примеси включает осаждение с помощью ПЭГ 4000 в конечной концентрации от 3 до 7%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения примеси составляет 5±0,5%. В одном из вариантов воплощения этап осаждения фактора Н представляет собой осаждение с помощью ПЭГ. В конкретном варианте воплощения ПЭГ-осаждение фактора Н включает осаждение с помощью ПЭГ 4 000 в конечной концентрации от 10 до 15%. В более конкретном варианте воплощения конечная концентрация PEG 4000 на этапе осаждения фактора Н составляет 12±0,5%.
С. Ингибитор интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции IaI плазмы. В одном из конкретных вариантов воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции IaI с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции IaI для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
В одном из вариантов воплощения способ также включает первый этап обогащения белка IaI с образованием первой обогащенной композиции IaI перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка IaI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают второй этап обогащения белка IaI с образованием второй обогащенной композиции IaI перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка IaI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа
- 69 034530 ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции IaI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения IaI с образованием первой обогащенной композиции IaI плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения IaI с образованием второй обогащенной композиции IaI плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения IaI после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения IaI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции IaI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения IaI с образованием первой обогащенной композиции IaI плазмы;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (г) выполнение второго этапа обогащения IaI с образованием второй обогащенной композиции IaI плазмы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
Аналогичным образом, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции IaI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения IaI с образованием первой обогащенной композиции IaI плазмы;
(б) выполнение второго этапа обогащения IaI с образованием второй обогащенной композиции IaI плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (д) выполнение третьего этапа обогащения IaI с образованием третьей обогащенной композиции IaI плазмы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-10 или 11.
1. Совместное связывание и дифференциальное элюирование.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции IaI плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий совместное экстрагирование IaI и сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции, происходящей из пула плазмы, путем связывания белков тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2), элюирования сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы с SiO2 при первом параметре раствора с последующим элюированием IaI с SiO2 при втором параметре раствора. В предпоч- 70 034530 тительном варианте воплощения исходная композиция представляет собой ресуспендированный преципитат фракции II+III или эквивалент этого преципитата.
В конкретном варианте воплощения способ включает этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции;
(в) элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2 при параметрах раствора, при которых IaI остается связанным; и (г) элюирование IaI с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором IaI остается связанным, относится к параметру, при котором преимущественно элюируется сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы, в то время как значительная часть IaI остается связанной с SiO2. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества IaI, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества IaI, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества IaI, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества IaI, связанного с SiO2. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества IaI, связанного с SiO2 или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества IaI, связанного с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения дифференциальное элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и IaI достигается путем последовательного контактирования (т.е. поэтапного элюирования) SiO2 с первым параметром раствора (например, первым буфером для элюирования), пригодным для элюирования большей части сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не значительной части связанного IaI, и вторым параметром раствора (например, вторым буфером для элюирования), пригодным для элюирования значительной части связанного IaI с SiO2.
В других вариантах воплощения дифференциальное элюирование сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и IaI достигается путем постепенного изменения параметров раствора (т.е. с помощью градиентного элюирования) с первого параметра раствора, пригодного для элюирования большей части сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, но не значительной части связанного IaI, до второго параметра раствора, пригодного для элюирования значительной части связанного IaI с SiO2. Таким образом, фракции сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и IaI, элюированные с SiO2, могут частично перекрываться. Путем фракционирования элюирования и оценки характеристик отдельных фракций можно создать пул IaI из фракций с высоким содержанием IaI и низким содержанием сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
2. Совместное связывание и преимущественное элюирование IaI.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции IaI плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий совместное экстрагирование IaI и сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции, происходящей из пула плазмы, путем связывания белков тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и элюирования IaI с SiO2 при условиях, когда значительная часть связанной сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2. В предпочтительном варианте воплощения исходная композиция представляет собой ресуспендированный преципитат фракции II+III или эквивалент этого преципитата.
В конкретном варианте воплощения способ включает этапы:
(а) контактирование композиции, содержащей IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI и по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2 при параметрах раствора, когда сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанной.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы остается связанной, относится к параметру, при котором преимущественно элюируется IaI, в то время как значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от
- 71 034530 количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2 или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, связанного с SiO2.
3. Преимущественное связывание IaI.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции IaI плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий (а) контактирование композиции, содержащей IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания IaI, но ни одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; (б) отделение SiO2 от композиции и (в) элюирование IaI с SiO2.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы не связывается с SiO2, относится к параметру, который дает преимущественную возможность связывания IaI с SiO2, в то время как значительная часть сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы остается в растворе в несвязанном состоянии. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в исходной композиции.
4. Преимущественное связывание сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления композиции IaI плазмы с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий (а) контактирование композиции, содержащей IaI и по меньшей мере одну сериновую протеазу или профермент сериновой протеазы, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы, но не IaI; и (б) отделение SiO2 от композиции.
В некоторых вариантах воплощения параметр раствора, при котором IaI не связывается с SiO2, относится к параметру, который дает преимущественную возможность связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы с SiO2, в то время как значительная часть IaI остается в растворе в несвязанном состоянии. В одном из вариантов воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества IaI в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 25% от количества IaI в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 50% от количества IaI в исходной композиции. В еще одном варианте воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 75% от количества IaI в исходной композиции. В других вариантах воплощения значительная часть относится по меньшей мере к 10% от количества IaI в исходной композиции или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более от количества IaI в исходной композиции.
D. Альфа-1-антитрипсин (A1PI).
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции альфа-1-антитрипсина (A1PI) плазмы. В одном из конкретных вариантов воплощения способ включает этапы: (а) контактирование композиции A1PI с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции A1PI для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII).
- 72 034530
В одном из вариантов воплощения способ также включает первый этап обогащения белка A1PI с образованием первой обогащенной композиции A1PI перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка A1PI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают второй этап обогащения белка A1PI с образованием второй обогащенной композиции A1PI перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка A1PI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения A1PI с образованием первой обогащенной композиции A1PI плазмы; (б) выполнение второго этапа обогащения A1PI с образованием второй обогащенной композиции A1PI плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные способы также включают этап обогащения A1PI после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения A1PI выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
Соответственно, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения A1PI с образованием первой обогащенной композиции A1PI плазмы; (б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) выполнение второго этапа обогащения A1PI с образованием второй обогащенной композиции A1PI плазмы. В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1.
Аналогичным образом, в одном из вариантов воплощения изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения A1PI с образованием первой обогащенной композиции A1PI плазмы;
(б) выполнение второго этапа обогащения A1PI с образованием второй обогащенной композиции A1PI плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы и (д) выполнение третьего этапа обогащения A1PI с образованием третьей обогащенной композиции A1PI плазмы.
В предпочтительном варианте воплощения сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa (FXIa), фактор XIIa (FXIIa), фактор XI (FXI) и/или фактор XII (FXII). В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-10 или 11.
- 73 034530
В конкретном варианте воплощения композиция A1PI представляет собой промежуточный продукт производства. Например, в некоторых вариантах воплощения композиция A1PI представляет собой промежуточный продукт производства, полученный при процедуре фракционирования по Кону (J. Am. Chem. Soc, 1946, 68(3):459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), процедуре фракционирования по Онкли (J. Am. Chem. Soc, 1949, 71(2):541-550), процедуре фракционирования по Кистлеру/Нитшманну (Vox Sang. 7:414-424 (1962)), процедуре очистки, описанной в патентах США № 6974792 или 7807435, их модификациях и аналогичных или эквивалентных процедурах очистки, известных в данной области техники. Вышеупомянутые ссылки полностью включены в настоящую заявку посредством ссылок для всех целей.
Например, известен ряд способов производства A1PI, включающих фракционированное осаждение плазмы с полиэтиленгликолем 4000, а также обработку различных фракций плазмы (преципитата фракции IV-1 по Кону или супернатанта А или А+1 по Кистлеру и Нитшманну) (Feldman and Winkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Wiley-Liss, Inc., p. 341-383). При более сложных вариантах очистки соответствующие фракции крови очищают с помощью ДЭАЭ-целлюлозы, например Basis et al. (Vopr. Med. Khim. 33 (1) (1987), 54-59), обработанной аффинными хроматографическими материалами или катионообменными хроматографическими материалами (ЕР 0698615 А1). В патенте США № 6974792 описан способ очистки, позволяющий получить A1PI с высокой удельной активностью, используя преципитат фракции V по Кону. В патенте США № 7807435 описан способ очистки, позволяющий получить A1PI с повышенным выходом, используя преципитат фракции IV-1 и/или фракцию IV-4 по Кону.
В одном из конкретных вариантов воплощения композиция A1PI представляет собой пул криосупернатанта по Кону. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция A1PI является ресуспендированным преципитатом фракции V по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция A1PI является ресуспендированным преципитатом фракции IV-1 по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция A1PI является ресуспендированным преципитатом фракции IV-4 по Кону или эквивалентной ему фракцией. В еще одном конкретном варианте воплощения композиция A1PI является супернатантом А по Кистлеру-Ништманну или эквивалентной ему фракцией.
Как правило, удаление сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы из композиции A1PI можно осуществить путем обработки AFPI-содержащей композиции тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при рН и электрической проводимости раствора, при которых сериновая протеаза и/или профермент сериновой протеазы связывается с SiO2.
В одном из вариантов воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом до осветления преципитата плазмы, содержащего A1PI, фильтрацией или центрифугированием. В одном из вариантов воплощения этап обработки SiO2 включает внесение частиц тонкоизмельченного диоксида кремния (например, пирогенного кремнезема Aerosil®) с последующим инкубационным периодом продолжительностью от 40 мин до 16 ч, в течение которого суспензия постоянно перемешивается. В некоторых вариантах воплощения инкубационный период составляет величину между приблизительно 50 мин и приблизительно 70 мин, или приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более. В других вариантах воплощения инкубационный период составляет по меньшей мере 1 или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ч или более. В конкретном варианте воплощения инкубационный период составляет по меньшей мере 15 ч. Как правило, обработку осуществляют при температуре между приблизительно 0 и приблизительно 25 °C или между приблизительно 2 и приблизительно 8°C. В некоторых вариантах воплощения обработку можно осуществлять при температуре приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25°C. В конкретном варианте воплощения обработку осуществляют при температуре между приблизительно 2 и приблизительно 25°C. В конкретном варианте воплощения вносят усовершенствования способа путем включения обработки пирогенным кремнеземом, снижающей уровни FXI, FXIa, FXII и FXIIa в препарате иммуноглобулина.
В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации между приблизительно 20 и приблизительно 100 г/кг преципитата. В некоторых вариантах воплощения пирогенный кремнезем можно внести в концентрации приблизительно 20 или приблизительно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг преципитата. В одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем (например, Aerosil 380 или эквивалент) вносят в ресуспендированный преципитат до конечной концентрации приблизительно 40 г/кг преципитата.
В некоторых вариантах воплощения SiO2 вносят в композицию A1PI в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 10 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию A1PI в концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 5 г/г белка. В еще одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию A1PI в концентрации между приблизительно 0,02 и приблизительно 4 г/г белка. В одном варианте воплощения SiO2 вносят в композицию A1PI в конечной концентрации, равной по меньшей мере 0,1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения
- 74 034530 пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,25 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 1 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2 г/г общего белка. В еще одном конкретном варианте воплощения пирогенный кремнезем вносят в концентрации, равной по меньшей мере 2,5 г/г общего белка. В других конкретных вариантах воплощения тонкоизмельченный диоксид кремния вносят в концентрации, равной по меньшей мере 0,01 или по меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 г, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 г/г общего белка или более.
В некоторых вариантах воплощения после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации вносят вспомогательный фильтрующий материал, например, Celpure C300 (Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals).
Вспомогательный фильтрующий материал можно вносить в конечной концентрации между приблизительно 0,01 и приблизительно 1,0 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,02 и приблизительно 0,8 кг/кг преципитата, или между приблизительно 0,03 и приблизительно 0,7 кг/кг преципитата. В некоторых вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал вносят в конечной концентрации, равной по меньшей мере 0,01 или по меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг преципитата. В некоторых вариантах воплощения вспомогательный фильтрующий материал вносят в конечной концентрации, равной приблизительно 0,01 или приблизительно 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг преципитата.
Соответственно, в одном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 7,0 для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,0 и приблизительно 5,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 7,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 7,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,0. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,6 и приблизительно 5,6. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,7 и приблизительно 5,5. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,8 и приблизительно 5,4. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,9 и приблизительно 5,3. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,2. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН приблизительно 5,1. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН приблизительно 4,0 или приблизительно 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 или не более 7,0. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН не более 4,0 или не более 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 или не более 7,0.
В одном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 2,0 мСм/см для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В еще одном варианте во
- 75 034530 площения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,8 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,7 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,4 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,3 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,2 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,1 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,8 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,2 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,4 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,5 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,6 и приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе между приблизительно 0,7 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще одном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе приблизительно 0,8 мСм/см. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе приблизительно 0,1 или не более 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мСм/см. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при ионной силе не более 0,1 или не более 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мСм/см.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы в композиции A1PI плазмы, включающий контактирование композиции с SiO2 при низком рН и низкой ионной силе для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,8 и приблизительно 5,4 и при ионной силе между приблизительно 0,6 и приблизительно 1,0 мСм/см. В более конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 4,9 и приблизительно 5,3 и при ионной силе между приблизительно 0,7 и приблизительно 0,9 мСм/см. В еще более конкретном варианте воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,2 и при ионной силе приблизительно 0,8 мСм/см. В других вариантах воплощения способ включает контактирование композиции с SiO2 при рН и ионной силе согласно любому из вариантов (Вар. 1222-3041), как представлено в табл. 12-15.
1. Связывание и элюирование сериновых протеаз или проферментов сериновых протеаз.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в ресуспендированном преципитате плазмы, содержащем A1PI. Как правило, преципитат может представлять собой любой преципитат, осажденный во время фракционирования пула плазмы, предпочтительно плазмы человека. В одном из вариантов воплощения способ включает контактирование ресуспендированного преципитата плазмы, содержащего A1PI в нерастворимом состоянии, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при первом параметре раствора с низким рН для связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы и поддержания A1PI в нерастворимом состоянии, разделение растворимой и нерастворимой частей суспензии, элюирование сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы с SiO2 при втором параметре раствора с низким рН, подходящем для поддержания значительной части A1PI в нерастворимом состоянии, разделение растворимой и нерастворимой частей суспензии и экстрагирование A1PI из нерастворимой части. В одном из вариантов воплощения SiO2 предварительно перемешивают до или во время реакции осаждения и восстанавливают вместе с преципитатом. В конкретном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции IV-1 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является
- 76 034530 преципитатом фракции IV-4 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции V по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом IV по
Кистлеру-Ништманну. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом С по Кистлеру-Ништманну.
В одном варианте воплощения вышеописанных способов первый параметр раствора с низким рН включает рН между 4,0 и 7,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 7,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 6,0±0,2 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов первый параметр раствора с низким рН включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 2,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 0,5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 2,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 0,5 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметры раствора включают рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 6,0±0,2, и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В других вариантах воплощения первый параметр раствора с низким рН включает рН и ионную силу согласно любому из вариантов (Вар. 1222-3041), как представлено в табл. 12-15.
В одном варианте воплощения вышеописанных способов второй раствор с низким рН характеризуется рН между 4,0 и 7,0 и ионной силой более приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 7,0 и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и б,0 и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметры раствора включают рН, равный 6,0±0,2, и ионную силу более приблизительно 5,0 мСм/см.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов второй раствор с низким рН характеризуется рН между 5,0 и 6,5 и ионной силой более приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу более приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу более приблизительно 6,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу более приблизительно 7,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу более приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 6,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 7,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу более приблизительно 10 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметры раствора включают рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу более приблизительно 10 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 6,0±0,2, и ионную силу более приблизительно 10 мСм/см.
- 77 034530
В одном конкретном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы в ресуспендированном преципитате плазмы, содержащем A1PI, включающий этапы контактирования ресуспендированного преципитата плазмы, содержащего A1PI в нерастворимом состоянии, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при первом параметре раствора с низким рН, включающем рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5 и ионную силу менее 5,0 мСм для связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы и поддержания A1PI в нерастворимом состоянии, разделения растворимой и нерастворимой частей суспензии, элюирования сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы с (SiO2) при втором параметре раствора с низким рН, включающем рН между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5 и ионную силу более 5,0 мСм для поддержания значительной части A1PI в нерастворимом состоянии, разделения растворимой и нерастворимой частей суспензии и экстрагирование A1PI из нерастворимой части. В одном из вариантов воплощения SiO2 предварительно перемешивают до или во время реакции осаждения и восстанавливают вместе с преципитатом. В конкретном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции IV-1 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции IV-4 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции V по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом IV по Кистлеру-Ништманну. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом С по Кистлеру-Ништманну.
2. Связывание сериновых протеаз или проферментов сериновых протеаз и экстракция A1PI.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ снижения количества сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы в ресуспендированном преципитате плазмы, содержащем A1PI. Как правило, преципитат может представлять собой любой преципитат, осажденный во время фракционирования пула плазмы, предпочтительно плазмы человека. В одном из вариантов воплощения способ включает контактирование ресуспендированного преципитата плазмы, содержащего A1PI в нерастворимом состоянии, с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при первом параметре раствора, включающем низкий рН, для связывания сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы и поддержания A1PI в нерастворимом состоянии, разделение растворимой и нерастворимой частей суспензии, экстрагирование A1PI из нерастворимой части при втором параметре раствора, включающем высокий рН, и отделения растворимой части от нерастворимой части, причем значительная часть сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы остается связанной с SiO2 во время экстракции A1PI из нерастворимой части. В одном из вариантов воплощения SiO2 предварительно перемешивают до или во время реакции осаждения и восстанавливают вместе с преципитатом. В конкретном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции IV-1 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции IV-4 по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом фракции V по Кону. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом IV по Кистлеру-Ништманну. В еще одном варианте воплощения преципитат является преципитатом С по Кистлеру-Ништманну.
В одном варианте воплощения вышеописанных способов первый параметр раствора включает рН между 4,0 и 7,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 7,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 6,0±0,2 и ионную силу менее приблизительно 5,0 мСм/см.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов первый параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 2,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и
6,5 и ионную силу менее приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,0 и 6,5 и ионную силу менее приблизительно 0,5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 2,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 1,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 5,5 и 6,0 и ионную силу менее приблизительно 0,5 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметры раствора
- 78 034530 включают рН, равный 5,5±0,2, и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 6,0±0,2, и ионную силу менее приблизительно
3,0 мСм/см. В других вариантах воплощения первый параметр раствора с низким рН включает рН и ионную силу согласно любому из вариантов (Вар. 1222-3041), как представлено в табл. 12-15.
В одном варианте воплощения вышеописанных способов второй параметр раствора включает рН между 7,0 и 10,0 и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 9,0 и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между
7.5 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 7,5±0,2, и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 8,0±0,2, и ионную силу менее приблизительно 10,0 мСм/см.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов второй параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 9,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 8,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 7,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и
8.5 и ионную силу менее приблизительно 6,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу менее приблизительно 2 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,0 и 8,5 и ионную силу между 2 и 10 мСм/см.
В еще одном варианте воплощения вышеописанных способов второй параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 9,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 8,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 7,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 6,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 5 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 4,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 3,0 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,0 и ионную силу менее приблизительно 2 мСм/см. В еще одном варианте воплощения параметр раствора включает рН между 7,5 и 8,5 и ионную силу между 2 и 10 мСм/см. В конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 7,5±0,2, и ионную силу между 2 и 10 мСм/см. В еще одном конкретном варианте воплощения параметр раствора включает рН, равный 8,0±0,2, и ионную силу между 2 и 10 мСм/см.
IV. Фармацевтические композиции.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет композиции белков плазмы с пониженными уровнями сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы, изготовленные в соответствии с любым из описанных здесь способов. В некоторых вариантах воплощения эти композиции составлены для фармацевтического применения (т.е. фармацевтические композиции). Как правило, композиции белка плазмы крови, изготовленные в соответствии с представленными здесь способами, обладают пониженной амидолитической активностью и обеспечивают лучшие профили безопасности, чем существующие биопрепараты плазмы, доступные в настоящее время. В предпочтительном варианте воплощения композиции, представленные здесь, обладают пониженным содержанием фактора XI, фактора XIa, фактора XII или фактора XIIa.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы: (а) контактирование композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (б) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы,
- 79 034530 выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные композиции изготовлены согласно способу, также включающему первый этап обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы: (а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем частичного осаждения белка в исходном материале, полученном из пула плазмы; (б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В одном из вариантов воплощения частичное осаждение осуществляют с помощью спирта. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы: (а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем ультрафильтрации и/или диафильтрации исходного материала, полученного из пула плазмы; (б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы. В одном из вариантов воплощения частичное осаждение осуществляют с помощью спирта. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы:
(а) формирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы путем контактирования исходного материала, полученного из пула плазмы, с хроматографической смолой;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В одном из вариантов воплощения частичное осаждение осуществляют с помощью спирта. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфатрипсина (IaI).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные композиции изготовлены согласно способу, также включающему второй этап обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции перед контактом композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения первый этап обогащения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
- 80 034530
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(б) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы.
В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанные композиции изготовлены согласно способу, также включающему этап обогащения белка-мишени после контакта композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). В некоторых вариантах воплощения этап обогащения белка-мишени выбран из этапа осаждения белка (например, этапа фракционирования спиртом), этапа ультрафильтрации/диафильтрации и этапа хроматографии.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка плазмы;
(б) контактирование первой обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(в) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы; и (г) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка плазмы.
В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 1-Вар. 100), находящихся в табл. 1. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном аспекте настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы с пониженными уровнями сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы для использования при лечении состояния, ассоциированного с недостаточностью или дисфункцией белка крови. В некоторых вариантах воплощения белок плазмы выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфатрипсина (IaI).
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет композицию белка плазмы, изготовленную согласно способу, включающему этапы:
(а) выполнение первого этапа обогащения белка-мишени с образованием первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(б) выполнение второго этапа обогащения белка-мишени с образованием второй обогащенной композиции белка-мишени плазмы;
(в) контактирование второй обогащенной композиции с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(г) отделение SiO2 от композиции для удаления связанной сериновой протеазы или профермента
- 81 034530 сериновой протеазы; и (д) выполнение третьего этапа обогащения белка-мишени с образованием третьей обогащенной композиции белка плазмы.
В некоторых вариантах воплощения комбинация первого и второго этапов обогащения выбрана из любого из вариантов (Вар. 101-Вар. 1100), находящихся в табл. 2-10 или 11. В одном из вариантов воплощения композицию составляют для фармацевтического применения. В конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутривенного введения. В еще одном конкретном варианте воплощения композицию составляют для внутримышечного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для подкожного введения. В еще одном варианте воплощения композицию составляют для внутриглазного введения. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В некоторых вариантах воплощения вышеописанных композиций этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания белка-мишени плазмы; и (2) элюирование белка-мишени плазмы с хроматографической смолы.
В одном из конкретных вариантов воплощения примесь не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1). В еще одном конкретном варианте воплощения примесь связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1), но не элюируется с хроматографической смолы на подэтапе (2).
В некоторых других вариантах воплощения вышеописанных композиций этап хроматографического обогащения включает подэтапы:
(1) контактирование первой обогащенной композиции белка-мишени плазмы с хроматографической смолой в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере одной из примесей; и (2) отделение смолы от композиции белка плазмы, причем белок-мишень плазмы не связывается с хроматографической смолой на подэтапе (1).
В некоторых вариантах воплощения композиций, представленных здесь, количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 10%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 25%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 50%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 75%. В еще одном варианте воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 90%. В других вариантах воплощения количество определенной сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы снижается по меньшей мере на 5 или по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 , 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из вариантов воплощения снижение содержания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы относится к снижению, достигнутому в ходе отдельного этапа обработки SiO2. В другом варианте воплощения снижение содержания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы относится к уровню примеси в конечной композиции по сравнению с композицией, изготовленной аналогичным образом, за исключением этапа обработки SiO2.
В одном из вариантов воплощения фармацевтические композиции, представленные здесь, изготавливают путем составления композиции белка плазмы, выделенного с помощью представленного здесь способа. Как правило, составленную композицию подвергают по меньшей мере одному, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем этапам инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры этапов инактивации или удаления вирусов, которые можно использовать с представленными здесь способами включают обработку растворителем/детергентом (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis, 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 и Kreil et al., Transfusion, 2003 (43):1023-1028; обе эти работы в явной форме полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для любых целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang, 1989 (56)230236 и Yuasa et al., J. Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024; обе эти работы в явной форме полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для любых целей) и инкубирование при низких значениях рН и высокой температуре (Kempf et al., Transfusion, 1991 (31)423-427 и Louie et al., Biologicals, 1994 (22):13-19). В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном из вариантов воплощения фармацевтические композиции, представленные здесь, включают один или более буферных агентов или стабилизаторов рН, подходящих для внутривенного, подкожного, внутримышечного или внутриглазного введения. Неограничивающие примеры буферных агентов, подходящие для составления композиции белка плазмы, представленной здесь, включают глицин, цит- 82 034530 рат, фосфат, ацетат, глутамат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, пропионат, карбонат или любую комюинацию вышеприведенного, доведенную до соответствующего рН. Как правило, буферный агент является достаточным средством для поддержания подходящего рН состава в течение длительного времени. В предпочтительном варианте воплощения буферный агент представляет собой глицин. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфатрипсина (IaI).
IB некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции, представленные здесь, могут необязательно включать агент для корректировки осмолярности композиции.
Неограничивающие примеры агентов, регулирующих осмолярность, включают маннит, сорбит, глицерин, сахарозу, глюкозу, декстрозу, левулезу, фруктозу, лактозу, полиэтиленгликоли, фосфаты, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, глюконат кальция, глюкогептонат, диметилсульфон и т.п.
Как правило, составы, представленные здесь, обладают осмолярностью, сравнимой с физиологической осмолярностью, приблизительно 285-295 мосмоль/кг (Lacy et al., Drug Information Handbook Lexi-Comp 1999:1254. В некоторых вариантах воплощения осмолярность составов находится между приблизительно 200 и приблизительно 350 мосмоль/кг, предпочтительно между приблизительно 240 и приблизительно 300 мосмоль/кг. В конкретных вариантах воплощения осмолярность составов равна приблизительно 200 или 210, 220, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310 мосмоль/кг, 320, 330, 340, 340 или 350 мосмоль/кг.
Препараты плазмы, представленные здесь, обычно стабильны в жидком виде в течение длительного времени. В некоторых вариантах воплощения составы являются стабильными по меньшей мере в течение приблизительно 3 месяцев при комнатной температуре или по меньшей мере приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 месяцев при комнатной температуре. Составы также являются стабильными в течение 6 или по меньшей мере приблизительно 18 месяцев при охлаждении (обычно между приблизительно 2 и приблизительно 8 °C) или по меньшей мере приблизительно 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев при охлаждении.
V. Способы лечения.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с недостаточностью или дисфункцией белка крови, у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения терапевтически эффективной дозы композиции белка плазмы с пониженным уровнем сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы, изготовленной в соответствии с представленным здесь способом. В некоторых вариантах воплощения композиция включает белок плазмы, выбранный из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает использование композиции белка плазмы с пониженными уровнями сериновой протеазы и/или профермента сериновой протеазы для производства медикамента для использования при лечении состояния, ассоциированного с недостаточностью или дисфункцией белка крови. В некоторых вариантах воплощения белок плазмы выбран из иммуноглобулина (Ig), альбумина, альфа-1-антитрипсина (A1PI), бутирилхолинэстеразы, фактора Н, белка системы комплемента и белка-ингибитора интер-альфа-трипсина (IaI).
А. Иммуноглобулины.
В соответствии с повседневной практикой, применяемой в современной медицине, стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно IgG) используются для лечения медицинских состояний, принадлежащих к трем основным классам: иммунодефициту, воспалительным и аутоиммунным заболеваниям и острым инфекциям. Эти IgG препараты также можно использовать для лечения рассеянного склероза (особенно рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза, или RRMS), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Препараты очищенного IgG, по настоящему изобретению, подходят для этих целей, наряду с другими препаратами IgG для клинического применения.
FDA одобрило использование IVIG для лечения различных показаний, в том числе аллогенного трансплантата костного мозга, хронического лимфоцитарного лейкоза, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), ВИЧ детского возраста, первичных иммунодефицитов, болезни Кавасаки, хронических воспалительных демиелинизирующих полиневропатий (ХВДП) и трансплантации почки реципиенту с высоким титром антител или от АВО-несовместимого донора. В некоторых вариантах воплощения композиции IVIG, представленные здесь, можно использовать для лечения этих заболеваний и состояний.
Кроме того, вне зарегистрированных показаний IVIG обычно предоставляют пациентам для лечения различных показаний, например, синдрома хронической усталости, псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile, дерматомиозита и полимиозита, эндокринной офтальмопатии, синдрома Гийена-Барре, мышечной дистрофии, миозита с включенными тельцами, синдрома Ламберта-Итона, системной красной волчанки, мультифокальной моторной нейропатии, рассеянного склероза (PC), миасте
- 83 034530 нии гравис, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, инфекции парвовируса В19, пузырчатки, постгемотрансфузионной пурпуры, отторжения трансплантата почки, спонтанного аборта/выкидыша, синдрома скованного человека, опсо-миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока у взрослых в критическом состоянии, токсического эпидермального некролиза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, Х-сцепленной агаммаглобулинемии и гипогаммаглобулинемии. В некоторых вариантах воплощения композиции IVIG, представленные здесь, можно использовать для лечения этих заболеваний и состояний.
Наконец, предложено экспериментальное использование IVIG для лечения заболеваний, включающих первичный иммунодефицит, RRMS, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (публикация патентной заявки США № US 2009/0148463, полностью включенная в настоящий документ посредством ссылки для всех целей). В некоторых вариантах воплощения композиции IVIG, представленные здесь, можно использовать для лечения первичного иммунодефицита, RRMS, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона. В некоторых вариантах воплощения, включающих ежедневное введение, эффективное количество для введения субъекту может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, тяжести заболевания, пути введения (например, внутривенно или подкожно) и реакции на лечение. В некоторых вариантах воплощения препарат иммуноглобулина по изобретению можно вводить пациенту в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах воплощения препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах, составляющих по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах воплощения препарат иммуноглобулина можно вводить субъекту в дозах до приблизительно 100, до приблизительно 150, до приблизительно 200, до приблизительно 250, до приблизительно 300, до приблизительно 400 мг/кг ежедневно. В других вариантах воплощения дозы препарата иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Кроме того, препараты иммуноглобулина можно вводить в одной или более доз в сутки. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, для лечения которых используют препараты IgG, могут определить соответствующую дозу для пациента согласно критериям, известным в данной области техники.
В соответствии с настоящим изобретением, время, необходимое для завершения курса лечения, определяется врачом и может варьироваться от одного дня до более месяца. В некоторых вариантах воплощения курс лечения может продолжаться от 1 до 6 месяцев.
Эффективное количество препарата IVIG вводят субъекту внутривенно. Термин эффективное количество относится к количеству препарата IVIG, приводящему к улучшению или излечению заболевания или состояния у субъекта. Эффективное количество для введения субъекту может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, заболевания или состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания и реакции на лечение. В некоторых вариантах воплощения препарат IVIG можно вводить субъекту в дозе от приблизительно 5 до приблизительно 2000 мг/кг за одно введение. В некоторых вариантах воплощения доза может составлять по меньшей мере приблизительно 5, или по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, или по меньшей мере приблизительно 2000 мг/кг.
Доза и частота лечения IVIG зависит, среди прочих факторов, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента. Как правило, для первичной иммунной дисфункции вводят дозу между приблизительно 100 и приблизительно 400 мг/кг массы тела приблизительно каждые 3-4 недели. Для неврологических и аутоиммунных заболеваний используют дозы вплоть до 2 г/кг массы тела в течение трех-шести месяцев в виде пятидневных ежемесячных курсов. Как правило, это дополняется поддерживающей терапией, включающей введение доз между приблизительно 100 и приблизительно 400 мг/кг массы тела приблизительно раз в 3-4 недели. Как правило, пациент получает дозы или лечение приблизительно раз в 14-35 суток или приблизительно 21-28 суток. Частота лечения зависит, среди прочих факторов, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента.
В предпочтительном варианте воплощения представлен способ лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом, включающий введение фармацевтической композиции IVIG по настоящему изобретению. В родственном варианте воплощения настоящее изобретение представляет композиции IVIG, произведенные согласно представленному здесь способу, для лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом.
В некоторых вариантах воплощения иммунодефицит, аутоиммунное заболевание или острая инфекция выбраны из аллогенного трансплантата костного мозга, хронического лимфоцитарного лейкоза, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), ВИЧ детского возраста, первичных иммунодефицитов, болезни Кавасаки, хронических воспалительных демиелинизирующих полиневропатий (ХВДП), трансплантации почки реципиенту с высоким титром антител или от АВО-несовместимого донора, синдрома хронической усталости, псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile, дерматомиозита и полимиозита, эндокринной офтальмопатии, синдрома Гийена-Барре, мышечной дис
- 84 034530 трофии, миозита с включенными тельцами, синдрома Ламберта-Итона, системной красной волчанки, мультифокальной моторной нейропатии, рассеянного склероза (PC), миастении гравис, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, инфекции парвовируса В19, пузырчатки, постгемотрансфузионной пурпуры, отторжения трансплантата почки, спонтанного аборта/выкидыша, синдрома скованного человека, опсо-миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока у взрослых в критическом состоянии, токсического эпидермального некролиза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, Х-сцепленной агаммаглобулинемии, гипогаммаглобулинемии, первичного иммунодефицита, RRMS, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
В. Фактор Н.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с дисфункцией фактора Н или аномальной активностью альтернативного пути активации комплемента, у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения терапевтически эффективной дозы композиции фактора Н, изготовленной в соответствии с представленным здесь способом. В одном из вариантов воплощения композицию фактора Н изготавливают путем экстрагирования фактора Н из преципитата фракции I. В еще одном варианте воплощения композицию фактора Н изготавливают путем экстрагирования фактора Н из фильтровального осадка фракции II+III.
В некоторых вариантах воплощения заболевание или расстройство, связанное с дисфункцией фактора Н, выбрано из атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), возрастной макулодистрофии (ВМД), мезангиопролиферативного гломерулонефрита типа II (MPGNII), инфаркта миокарда, коронарной недостаточности (CAD/CHD) и болезни Альцгеймера. В одном из конкретных вариантов воплощения заболевание представляет собой атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS). В еще одном конкретном варианте воплощения заболевание представляет собой возрастную макулодистрофию (ВМД). В еще одном конкретном варианте воплощения заболевание представляет собой мезангиопролиферативный гломерулонефрит типа II (MPGNII).
В некоторых вариантах воплощения представлен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с аномальной активностью альтернативного пути активации комплемента, у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения субъекту терапевтически эффективной дозы представленной здесь композиции фактора Н. В одном из вариантов воплощения композицию фактора Н изготавливают путем экстрагирования фактора Н из преципитата фракции I. В еще одном варианте воплощения композицию фактора Н изготавливают путем экстрагирования фактора Н из фильтровального осадка фракции II+III.
В некоторых вариантах воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное с аномальной активностью альтернативного пути активации комплемента, выбрано из аутоиммунного заболевания (например, ревматоидного артрита, IgA-нефропатии, астмы, системной красной волчанки, рассеянного склероза, антифосфолипидного синдрома, ANCA-ассоциированного васкулита, пузырчатки, увеита, миастении гравис, тиреоидита Хашимото), заболевания почек (например, IgA-нефропатии, гемолитического уремического синдрома, мезангиопролиферативного гломерулонефрита), астмы, болезни Альцгеймера, возрастной макулодистрофии, проксимальной ночной гемоглобинурии, аневризмы брюшной аорты, ишемически-реперфузионного повреждения и сепсиса.
Фармацевтические композиции, представленные изобретением, можно вводить поодиночке или в комбинации с другими терапевтическими агентами. Эти агенты могут входить в состав одного и того же фармацевтического препарата.
1. Введение лекарственных препаратов пациенту.
В соответствии с настоящим изобретением, время, необходимое для завершения курса лечения, определяется врачом и может варьироваться от одного дня до более месяца. В некоторых вариантах воплощения курс лечения может продолжаться от 1 до 6 месяцев.
Эффективное количество препарата фактора Н вводят субъекту любым способом, подходящим для лечения заболевания или расстройства. Например, в некоторых вариантах воплощения фактор Н можно вводить внутривенным, внутриглазным, подкожным и/или внутримышечным путем. В предпочтительном варианте воплощения представлен способ лечения возрастной макулодистрофии у субъекта, нуждающегося в этом, включающий внутриглазное введение композиции фактора Н пациенту.
В некоторых вариантах воплощения композиции фактора Н, представленные здесь, можно вводить системно или местно.
Системное введение включает: пероральное, трансдермальное, субдермальное, внутрибрюшинное, подкожное, трансназальное, подъязычное или ректальное введение. Наиболее предпочтительным системным путем введения является пероральный. Местное применение для офтальмологического введения включает: наружное, интравитреальное, периокулярное, транссклеральное, ретробульбарное, околосклеральное, субтеноновое введение или введение через внутриглазное устройство. Предпочтительные способы местного применения включают транссклеральную доставку в желтое пятно путем введения в заднее околосклеральное пространство; интравитреальную инъекцию; или введение через катетер, например, описанное в патенте США № 6413245, описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей. В качестве альтернативы, ингибиторы можно доставлять с по- 85 034530 мощью устройства непрерывной доставки, имплантированного интравитреально или транссклерально;
или с помощью других известных средств местного офтальмологического введения.
В некоторых вариантах воплощения термин эффективное количество относится к количеству препарата фактора Н, приводящему к улучшению или излечению заболевания или состояния у субъекта. Эффективное количество для введения субъекту может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, заболевания или состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания и реакции на лечение. В некоторых вариантах воплощения препарат фактора Н можно вводить субъекту в дозе, составляющей или приблизительно составляющей от 5 до 2000 мг/кг за одно введение. В некоторых вариантах воплощения доза может составлять, по меньшей мере или приблизительно 5, или по меньшей мере или приблизительно, 10, или по меньшей мере или приблизительно, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 мг/кг. Доза и частота лечения фактором Н зависит, среди прочих факторов, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента.
2. Возрастная макулодистрофия (ВМД).
В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение обеспечивает способ лечения возрастной макулодистрофии у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения субъекту терапевтически эффективной дозы приведенной здесь композиции фактора Н.
Возрастная макулодистрофия (ВМД) является причиной номер один слепоты у пожилых людей старше 60 лет. В настоящее время, по оценкам, 35-40% лиц старше 75 лет имеют некоторую степень ВМД. По оценкам, около 50 млн человек в мире страдают ВМД, причем 10 млн - только в США. В настоящее время каждый год ставится приблизительно 155000 новых диагнозов ВМД. В связи с увеличивающейся продолжительностью жизни мирового населения ожидается утроение ежегодного количества диагнозов к 2020 году. ВМД представляет собой тяжелое заболевание, разрушающее центральное зрение больных, лишая их возможности выполнения повседневной деятельности, например чтения и вождения.
ВМД является медленным прогрессирующим заболеванием, вовлекающим клетки внешних слоев сетчатки (включая фоторецепторы и клетки пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), поддерживающие фоторецепторы), а также клетки в прилегающем слое сосудов глаза, известном как сосудистая оболочка. Макулодистрофия характеризуется разрушением желтого пятна, небольшой части центральной сетчатки (около 2 мм в диаметре), отвечающей за высокую остроту зрения.
Макулодистрофия с поздним началом (т.е. ВМД) обычно определяется как сухая или влажная. Влажная (экссудативная) неоваскулярная форма ВМД поражает приблизительно 10% больных и характеризуется аномальными кровеносными сосудами, прорастающими из хориокапилляра через ПЭС, что обычно приводит к кровоизлиянию, выделению экссудата, образованию рубцов и/или серозной отслойке сетчатки. Приблизительно 90% больных ВМД страдают ненеоваскулярной или сухой формой заболевания, которая характеризуется атрофией ПЭС и потерей фоторецепторов желтого пятна.
ВМД характеризуется наличием отложений фрагментоподобного материала, называемых друзами, которые накапливаются на мембране Бруха, многослойном комплексе компонентов внеклеточного матрикса, отделяющем ПЭС (внешний слой сетчатки) от находящейся под ним сосудистой оболочки. Друзы можно наблюдать при обследовании глазного дна. Эти отложения были хорошо охарактеризованы в ходе микроскопических исследований донорских глаз у пациентов с ВМД. Отложения, наблюдаемые в живом глазе при клиническом обследовании, классифицируются как мягкие друзы или твердые друзы, в соответствии с рядом критериев, включающих относительный размер, относительное количество и форму отложений. Гистохимические и иммуноцитохимические исследования показали, что друзы содержат различные липиды, полисахариды, гликозаминогликаны и белки.
В настоящее время способы лечения ВМД неизвестны, хотя показано, что некоторые виды лечения были эффективны при управлении ходом заболевания. При влажной форме заболевания стандартным способом лечения является лазерная фотокоагуляция аномальных сосудов. Эта процедура ограничена тем, что таким образом можно лечить только хорошо очерченные неоваскулярные поражения, и, что 50% пациентов страдают повторными кровотечениями из этих сосудов Fine et al., 2000). Из-за высокой энергии лазерного излучения, необходимой для этого лечения, фоторецепторы в обработанной области также гибнут, и у пациентов также часто развивается центральная слепота непосредственно после лечения. В конечном итоге развиваются новые неоваскулярные поражения, требующие повторного лечения. Другие мероприятия включают изменение образа жизни путем отказа от курения и терапию антиоксидантами. Кроме того, предлагается антиангиогенное лечение с помощью ингибиторов ФРЭС, например интравитральные инъекции ранибизумаба или бевацизумаба.
Недавно обнаружено, что около 35% лиц подвержены риску однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в одной или обеих копиях гена фактора Н. У гомозиготных лиц риск развития возрастной макулодистрофии повышен приблизительно в семь раз, в то время как вероятность развития этого заболевания у гетерозигот повышена в два-три раза. Показано, что этот SNP, локализующийся в модуле 7 ССР фактора Н, влияет на взаимодействие фактора Н с С-реактивным белком и гепарином, что указывает на причинно-следственную связь между SNP и заболеванием. Данный полиморфизм представляет собой полимор- 86 034530 физм Y420H.
В одном из вариантов воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД), у субъекта не проявляются симптомы ВМД.
В еще одном варианте воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД), у субъекта образуются друзы.
В еще одном варианте воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД), субъект имеет повышенный риск развития ВМД.
В еще одном варианте воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД) у субъекта, введение осуществляют внутривенно.
В еще одном из вариантов воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД) у субъекта, способ также включает лечение субъекта, у которого имеются признаки и/или симптомы ВМД.
В еще одном варианте воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД), у субъекта диагностирована ВМД.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения субъекта-человека, относимого к группе риска развития возрастной макулодистрофии, включающий этап введения субъекту профилактически или терапевтически эффективного количества препарата фактора Н, представленного здесь, а также периодически повторяющееся указанное введение.
В одном из вариантов воплощения способа лечения субъекта-человека, относимого к группе риска развития возрастной макулодистрофии, введение повторяют в течение времени, эффективного для задержки прогрессирования или начала развития макулодистрофии у указанного субъекта.
В одном из вариантов воплощения способа лечения субъекта-человека, относимого к группе риска развития возрастной макулодистрофии, субъекта-человека относят к группе риска развития возрастной макулодистрофии на основании присутствия одного или более генетических маркеров, ассоциированных с развитием возрастной макулодистрофии.
В еще одном варианте воплощения способа лечения субъекта-человека, относимого к группе риска развития возрастной макулодистрофии, генетический маркер представляет собой полиморфизм.
В еще одном варианте воплощения способа ограничения активации комплемента, приводящего к задержке прогрессирования или начала развития возрастной макулодистрофии (ВМД), у субъекта не диагностирована ВМД.
С. Ингибитор интер-альфа-трипсина (IaI).
В других аспектах целью изобретения является обеспечение способов лечения расстройств и заболеваний, ассоциированных с пониженной функцией IaIp или дисфункцией IaIp, путем введения терапевтически эффективного количества представленной здесь композиции IaIp. В одном из вариантов воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное со сниженной функцией IaIp или дисфункцией IaIp, представляет собой сепсис.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет терапевтически эффективные дозы композиции IaIp, полученной способом, описанным здесь, для использования в способе лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со сниженной функцией IaIp или дисфункцией IaIp у субъекта, нуждающегося в этом. В одном из вариантов воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное со сниженной функцией IaIp или дисфункцией IaIp, представляет собой сепсис.
В еще одном аспекте целью изобретения является обеспечение способов лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с повышенной активностью сериновых протеаз плазмы, путем введения терапевтически эффективного количества представленной здесь композиции IaIp. В одном из вариантов воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное с повышенной активностью сериновых протеаз плазмы, выбрано из сепсиса, септического шока, эндотоксического шока, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, накопления фибриллярных белков, интоксикации при сибирской язве, метастазов рака, повреждения тканей во время операции, заболевания почек, заболевания сосудов, свертывания, сахарного диабета и системного воспаления.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет терапевтически эффективные дозы композиции IaIp, полученной способом, описанным здесь, для использования в способе лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с повышенной активностью сериновых протеаз плазмы у субъекта, нуждающегося в этом. В одном из вариантов воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное с повышенной активностью сериновых протеаз плазмы, выбрано из сепсиса, септического шока, эндотоксического шока, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, накопления фибриллярных белков, интоксикации при сибирской язве, метастазов рака, повреждения тканей во время операции, заболевания почек, заболевания сосудов, свертывания, сахарного диабета и
- 87 034530 системного воспаления.
А. Введение лекарственных препаратов пациенту.
В соответствии с настоящим изобретением, время, необходимое для завершения курса лечения, определяется врачом и может варьироваться от одного дня до более месяца. В некоторых вариантах воплощения курс лечения может продолжаться от 1 до 6 месяцев.
Эффективное количество препарата IaIp вводят субъекту любым способом, подходящим для лечения заболевания или расстройства. Например, в некоторых вариантах воплощения IaIp можно вводить внутривенным, подкожным и/или внутримышечным путем. В предпочтительном варианте воплощения представлен способ лечения сепсиса у субъекта, нуждающегося в этом, включающий внутривенное (в/в) введение композиции IaIp пациенту.
В некоторых вариантах воплощения композиции IaIp, представленные здесь, можно вводить системно или местно. Системное введение включает: пероральное, субдермальное, внутрибрюшинное, подкожное, трансназальное, подъязычное или ректальное введение. Местное применение включает: наружное, подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное введение.
В некоторых вариантах воплощения термин эффективное количество относится к количеству препарата IaIp, приводящему к улучшению или излечению заболевания или состояния у субъекта. Эффективное количество для введения субъекту может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, заболевания или состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания и реакции на лечение. В некоторых вариантах воплощения препарат IaIp можно вводить субъекту в дозе от приблизительно до приблизительно 2000 мг/кг за одно введение. В некоторых вариантах воплощения доза может составлять по меньшей мере приблизительно 5, или по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, или по меньшей мере приблизительно 2000 мг/кг. Доза и частота лечения IaIp зависит, среди прочих факторов, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента.
Примеры
Пример 1.
Для определения остаточного содержания и активности сериновых протеаз, присутствующих в композициях белка плазмы, определяли профиль амидолитической активности двух доступных для приобретения препаратов IgG, произведенных без использования обработки SiO2: OCTAGAM® (5% иммуноглобулин для внутривенного введения; Octapharma) и Subcuvia (16% иммуноглобулин для подкожного введения; Baxter); двух партий доступного для приобретения препарата IgG, произведенного с использованием обработки SiO2: Gammagard Liquid (10% иммуноглобулин для внутривенного введения; Baxter), и разрабатываемого в настоящее время способа очистки фактора Н. Примечательно, что композицию фактора Н очищали, как описано выше, путем связывания и последующего элюирования фактора Н из тонкоизмельченного SiO2.
Вкратце, профиль амидолитической активности каждой композиции белка плазмы определяли путем анализа со следующими хромогенными субстратами с различной специфичностью фермента: PL-1 (широкого спектра), S-2288 (широкого спектра), S-2266 (FXIa, калликреины желез), S-2222 (FXa, трипсин), S-2251 (плазмин) и S-2302 (калликреин, FXIa и FXIIa). Кроме того, определяли активность активатора прекалликреина (PKKA) и количество единиц фактора XIa. Как показано в табл. 17, композиции IgG плазмы, произведенные без использования этапа SiO2-адсорбции, характеризовались значительными уровнями амидолитической активности и содержания FXIa. В противоположность этому, обе протестированные партиях Gammagard Liquid характеризовались минимальными амидолитической активностью и содержанием FXIa. Согласуясь с этими результатами, композиция фактора Н, изготовленная путем связывания и элюирования с тонкоизмельченного SiO2, характеризовалась чрезвычайно высоким уровнем амидолитической активности и содержания FXIa.
- 88 034530
Таблица 17
Gammagard Liquid 10% партия 1 (Baxter) #LE12G142AD
Gammagard Liquid
10% партия 2 (Baxter) #LE12HE76
Амидолитическая активность различных композиций белка плазмы
Фактор Н
Доступные для приобретения препараты IGIV
Специфичность
Хромогенный субстрат
Образец FH012 FC стерильный
Octagam 5% (Octapharma) &В842А8432
Subcuvia 16% (Baxter) #VNG1HO2O
Скорость гидролиза [нмоль/млхмин]
Широкого спектра
Широкого спектра
FXIa, калликреины желез
FXa, трипсин
Плазмин
Калликреин, FXIa,
FXIIa
РККА
F-XIa
мЕд/мл
Пример 2.
Для определения экономически выгодной схемы производства фактора Н из образца плазмы, дающей возможность выделения дополнительных факторов крови из этого же образца плазмы, партию объединенной плазмы человека подвергали фракционированию согласно схеме, изложенной на структурной диаграмме, показанной на фиг. 1. Как показано на фиг. 2, большая часть фактора Н (приблизительно 90%), присутствующего в пуле криосупернатанта плазмы человека по Кону, находилась в преципитате фракции II+III. Меньшее, но значительное, количество фактора Н (приблизительно 10%) также находилось в преципитате фракции I. Это согласуется с результатами, показанными в публикации РСТ WO 2011/011753, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки для любых целей.
Фактор Н экстрагировали из фильтровального осадка тонкоизмельченного SiO2 после фильтрации побочного продукта, образованного в результате фильтрации композиции Aerosil Treatment композиции непосредственно перед композицией 6, фильтратом фракции II+III, за счет рециркуляции буфера для экстракции фактора Н через фильтр-пресс. Соли и различные примеси удаляли из экстракта фильтровального осадка на первом этапе осаждения, выполнявшемся при рН 8,0 путем внесения этанола до конечной концентрации 15% и инкубирования при -6°C в течение минимум 4 ч. рН реакционной смеси при осаждении корректировали до 8,0 после 1 ч инкубирования. Затем центрифугированием удаляли преципитат из супернатанта. Фактор Н подвергали дальнейшему обогащению на втором этапе осаждения, выполнявшегося при рН 6,0 путем внесения этанола до конечной концентрации 25% и инкубирования при -10°C в течение минимум 8 ч. Затем центрифугированием выделяли преципитат, содержавший фактор Н.
Преципитат, образованный на втором этапе осаждения, растворяли в соотношении 1:9 в растворяющем буфере с низкой ионной силой и обрабатывали S/D для инактивации вирусов с липидной оболочкой. Затем обогащали фактор Н анионообменной хроматографией, используя смолу DEAE-Sepharose FF. Вкратце, фактор Н связывали со смолой на основе ДЭАЭ-сефарозы при низкой ионной силе и элюировали путем увеличения ионной силы раствора. Затем понижали электрическую проводимость элюата с ДЭАЭ-сефарозы и обогащали фактор Н аффинной хроматографией с гепарином. Вкратце, фактор Н связывали со смолой Heparin-Sepharose FF при низкой ионной силе и элюировали путем увеличения ионной силы раствора. Как показано в табл. 18, большая часть фактора Н связывалась со смолами на основе ДЭАЭ и гепарина.
Таблица 18
Связывание фактора Н с хроматографическими смолами
1.DEAE-Sepharose FF 2. Heparin- Sepharose FF
Партия FH006 FH012 FH006 FH012
Загрузка (белок) 30,6 мг/мл 28,0 мг/мл 3,3 мг/мл 2,1 мг/мл
связывание FH со смолой 87,4% 96,3% 100% 99,4%
Фактор Н элюировали со смолы с гепарином, затем подвергали ультрафильтрации/диафильтрации в соответствии со стандартными процедурами, а затем - эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200. Фактор Н, выделенный эксклюзионной хроматографией, затем концентрировали ультра- 89 034530 фильтрацией, стерильно фильтровали и составляли в виде препарата с конечной концентрацией белка мг/мл в PBS-буфере.
Затем оценивали однородность, примеси и амидолитическую активность конечной композиции фактора Н (FH012). Монодисперсность композиции фактора Н характеризовали эксклюзионной хроматографией. Как показано в табл. 19, большая часть белка, присутствующего в окончательной композиции фактора Н, перемещалась в колонке HP-SEC с рассчитанным размером 400 кДа.
Таблица 19
Распределение конечной композиции FH012 по размеру молекул согласно HP-SEC
образец Пик 1 >450 к Да Пик 2 400 кДа Пик 3 160 кДа
% площади
FC FH012 0,3 97,6 2,1
В конечной композиции фактора Н определяли уровень эндотоксинов, рН, внешний вид и конечную концентрацию белка. Как показано в табл. 20, композиция характеризовалась низким уровнем эндотоксинов (<0,5 EU/мл), согласно анализу с лизатом амебоцитов Limulus (LAL).
Таблица 20 LAL, рН, внешний вид и содержание белка в конечной композиции FH012
LAL <0,5 EU/мл (апирогенная)
pH 7,1
Внешний вид Бесцветная, не содержит видимых частиц
Концентрация белка 4,54%
Затем определяли уровень различных белковых примесей в конечной композиции фактора Н. Как показано в табл. 21, белки комплемента и иммуноглобулины IgG составляют менее 1% от конечной концентрации белка в композиции фактора Н.
Таблица 21
Примеси конечной композиции FH012
Примесь Концентрация Процентное содержание Общий белок
IgG 51 мкг/мл 0,11%
сз 321,5 мкг/мл 0,71%
СЗа 17,5 мкг/мл 0,04%
С5а 3,7 нг/мл <0,01%
С4 1,94 мкг/мл <0,01%
ЭДТА 72 мкг/мл
Наконец, определяли уровень амидолитической активности и содержание протеаз, как сообщалось в примере 1. Как показано в табл. 17, фактор Н плазмы, очищенный согласно схеме, изложенной в данном примере, характеризовался высоким уровнем амидолитической активности и содержания FXIa.
Пример 3.
Для демонстрации возможности удаления амидолитической активности из композиции белка плазмы ресуспендированный преципитат фракции II+III по Кону обрабатывали тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2). Вкратце, объединенную криосупернатантную плазму человека фракционировали согласно схеме очистки IgG, описанной здесь, получая преципитат фракции II+III. Преципитат фракции II+III ресуспендировали в буфере для экстракции с низкой электрической проводимостью (рН 5,1±0,2; ~0,8 мСм/см) при температуре, поддерживаемой в диапазоне между 0 и 8°C. Aerosil® 380 (Evonik Industries AG) вносили в конечной концентрации от 40 до 60 г/кг преципитата II+III. После внесения вспомогательного фильтрующего материала CELPURE® C300 (Advanced Minerals Corporation) до конечной концентрации 0,5 кг/кг преципитата II+III суспензию фильтровали, используя глубинный фильтр. Затем тестировали содержание профермента FXI в композиции иммуноглобулина. Как показано в табл. 22, обработка суспензии фракции II+III тонкоизмельченным SiO2 приводила почти к 90%-ному снижению содержания профермента фактора XI в композиции.
- 90 034530
Таблица 22
Примеси конечной композиции FH012
Ресуспендированная фракция П+Ш Cuno-фильтрат экстракта фракции П+Ш
Партия Паста фракци и П+Ш (кг) Растворенная фракция П+Ш (л) Профермент F-ΧΙ (Ед/мл) Профермент F-XI (тыс Ед) Профермен tF-XI (%) Объем фильтрата фракции П+Ш (л) Профермент F-X1 (Ед/мл) Профермент F-ΧΙ (тыс. Ед) Профермент F-XI (% от ресуспендир ованной фракции П+Ш) % удаления
1 117 469 5,25 2460 100 2250 0,11 247 10,1% 89,9%
2 118 475 5,13 2435 100 2290 0,11 251 10,3% 89,7%
3 119 479 4,51 2162 100 2300 0,12 276 12,8% 87,2%
Пример 4.
С целью оценки элюирования сериновых протеаз из фильтровального осадка тонкоизмельченного SiO2, полученного в примере 3, для элюирования белков из SiO2 использовали буферы для элюирования, содержащие различные концентрации фосфатного буфера (100, 50, 25 и 5 мМ) при двух различных значениях рН (6,0, 7,5). Вкратце, фильтровальный осадок растворяли в соотношении 1:5 в соответствующей буферной системе и фильтровали через глубинные фильтры (Cuno 50 SA). Затем определяли амидолитическую активность и композицию фактора Н каждого элюата (табл. 23 и 24). Как показано в табл. 23, при более низкой электрической проводимости и рН (т.е. 6,0) элюирование амидолитической активности согласно измерению с субстратом CS2166 (FXIa, активированный белок С) было снижено.
В условиях элюирования при рН 7,5 (табл. 24) элюирование фактора Н снижалось с увеличением проводимости, в то время элюирование сериновых протеаз возрастало с увеличением проводимости. Как ни странно, при очень низкой электрической проводимости (5 мМ фосфат; 0,882 мСм/см) элюирование сериновой протеазы существенно возросло, в то время как элюирование фактора Н снизилось. Данные, полученные для элюирования при рН 7,5, графически показаны на фиг. 3.
Таблица 23
Элюирование фактора Н и активности сериновых протеаз с тонкоизмельченного SiO2 при рН 6,0
Субстрат: CS2166 Фактор Н Белок
Буферная система: рН=6,0 Образец всего нмоль* мин [г/л плазмы] [нмоль/г]
100 мМ фосфатный буфер; пров. 11,88 мСм/см Фильтрат 72745 0,27 61944
50 мМ фосфатный буфер; пров. 6,55 мСм/см Фильтрат 65055 0,19 64600
25 мМ фосфатный буфер; пров. 3,48 мСм/см Фильтрат 28591 0,05 63694
5 мМ фосфатный буфер: Фильтрат 4816 0,0003 57331
пров. 0,882 мСм/см
- 91 034530
Таблица 24
Элюирование фактора Н и активности сериновых протеаз с тонкоизмельченного SiO2 при рН 7,5
Субстрат: CS2166 Фактор Н Белок
Буферная система: pH = 7,5 Образец всего нмоль* мин [г/л плазмы] [нмоль/г]
100 мМ фосфатный буфер; пров. 18,81 мСм/см Фильтрат 236456 0,21 156718
50 мМ фосфатный буфер, пров. 10,91 мСм/см Фильтрат 147829 0,29 109228
25 мМ фосфатный буфер, пров. 6,08 мСм/см Фильтрат 84622 0,39 57892
5 мМ фосфатный буфер: пров 1,524 мСм/см Фильтрат 176685 0,33 134051
Пример 5.
Для демонстрации возможности дифференциального элюирования сериновых протеаз и фактора Н, совместно связанных с SiO2 разработали двухэтапную процедуру элюирования. Вкратце, получали фильтровальный осадок фракции II+III, образующийся после обработки SiO2, как описано ранее. Затем фильтровальный осадок подвергали первому элюированию при параметре раствора, включавших ионную силу между 0,882 и 11,88 мСм/см при рН 6,0. Как продемонстрировано в примере 4, обработка связанного SiO2 при низком рН (рН 6,0) и низкой ионной силе (менее 6,5 мСм/см) приводила к элюированию сериновой протеазы (например, FXIa), в то время как значительная часть фактора Н оставалась связанной. Последующая обработка при высоких значениях рН (рН 7,5) и высокой ионной силе приводила к элюированию фактора Н с SiO2 (табл. 25). Кроме того, согласуясь с результатами, представленными в примере 4, начальная обработка SiO2 при высоких значениях рН (7,5) приводила к элюированию фактора Н (табл. 26). Как показано, начальное элюирование при низкой электрической проводимости и рН 6,0 можно использовать для частичного снижения амидолитической активности фильтровального осадка, а затем можно элюировать фактор Н при 100 мМ концентрации фосфата, 150 мМ NaCl, pH 7,6. Эта процедура привела к получению фильтрата со сниженной амидолитической активностью (CS2166) при выходе фактора Н 0,31 г/л плазмы, для дальнейшей обработки.
Таблица 25
Двухэтапное дифференциальное элюирование сериновой протеазы и фактора Н с SiO2 при рН 6,0/7,6
Буферная система для первого элюирования, pH 6,0 Буфер для второго элюирования Образец Фактор Н [г/л плазмы]
100 мМ фосфатный буфер; пров. 11,88 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCl, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,06
50 мМ фосфатный буфер; пров. 6,55 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCl, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования о,п
25 мМ фосфатный буфер, пров. 3,48 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCl, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,25
5 мМ фосфатный буфер: пров. 0,882 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCl, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,31
- 92 034530
Таблица 26
Двухэтапное дифференциальное элюирование сериновой протеазы и фактора Н с SiO2 при рН 7,5/7,6
Буферная система для первого элюирования. pH 7,5 Буфер для второго элюирования Образец Фактор Н [г/л плазмы]
100 мМ фосфатный буфер; пров. 11,88 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCI, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,05
50 мМ фосфатный буфер; пров. 6,55 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCI, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,06
25 мМ фосфатный буфер; пров. 3,48 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCI, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,06
5 мМ фосфатный буфер: пров. 0,882 мСм/см 100 мМ фосфатный буфер + 150 мМ NaCI, pH 7,6 Фильтрат второго элюирования 0,07
Пример 6.
Для определения количества тонкоизмельченного SiO2, необходимого для эффективного удаления сериновых протеаз и проферментов сериновых протеаз из композиций белков плазмы преципитат фракции II+III осадок (т.е. фильтровальный осадок II+III) растворяли, фильтровали, обрабатывали SiO2, смешивали с вспомогательным фильтрующим материалом и подвергали второй фильтрации. Вкратце, фильтровальный осадок фракции II+III сначала растворяли в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 150 мМ хлорид натрия (рН 7,5, 30 мСм/см). Затем эту суспензию фильтровали через фильтр Cuno 50 SA и собирали фильтрат. Aerosil 380 смешивали с фильтратом в конечной концентрации 1,0 или 2,5 г/г белка, а затем инкубировали в течение по меньшей мере 50 мин. Вносили вспомогательный фильтрующий материал CELPURE и выполняли фильтрацию с помощью фильтра Cuno 50 SA. Затем оценивали амидолитическую активность полученного фильтрата, как показано в табл. 27. Примечательно, что, согласно результатам, добавление Aerosil в конечной концентрации 2,5 г/г белка снижало амидолитическую активность калликреина, FXIa и FXIIa в композиции более чем на 90% по сравнению с образцом, обработанным Aerosil в конечной концентрации 1,0 г/г белка.
Таблица 27
Амидолитическая активность, присутствующая в ресуспендированном преципитате фракции II+III после обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния
Калликреин, FXIa, FXIIa Субстрат: S-2302 Снижение за счет возрастающего добавления Aerosil
образец всего: нмоль*мин [%]
FH027 фильтрат Cuno после внесения 1 г Aerosil на г белка 83347 -
FH027 фильтрат Cuno после внесения 1 г Aerosil на г белка 6227 92,5
Пример 7.
Для оценки эффективности обработки SiO2 в отношении удаления профермента фактора XI во время промышленного производства композиции белка плазмы оценивали содержание профермента FXI в шести производственных партиях. В табл. 28 и 29 показано среднее содержание профермента FXI на каждом предыдущем этапе при трех очистках, выполненных на одном и том же производственном участке. Данные в табл. 28 и 29 продемонстрировали, что обработка SiO2 при очистке в промышленных масштабах может снизить содержание профермента FXI в композиции по меньшей мере на 90%. Примечательно, что на производственном участке 1 вносили Aerosil в конечной концентрации 50 г/кг преципитата II+III, в то время как на участке 2 использовали Aerosil в конечной концентрации 40 г/кг преципитата II+III. Как ни странно, это небольшое различие в используемом количестве Aerosil привело к значительному различию в содержании профермента фактора XI в фильтрате после обработки Aerosil (8,1% в исходном пуле по Кону для участка 2 по сравнению с 2,8% в исходном пуле по Кону для участка 1).
- 93 034530
Таблица 28
Среднее значение содержания профермента фактора XI в каждой фракции трех крупных производственных партий, обработанных на участке 1
Образец Объем Профермент F-XI
(Ед/мл) (Ед) (% От пула по Кону)
Пул по Кону 3379 1,25 4233923 100,0
Супернатант I 3632 1,01 3669081 87,2
Супернатант II+II 3927 0,21 812077 19,1
Паста ΙΙ+ΙΠ* 2302 1,31 3026261 71,6
Фильтрат после Aerosil 2993 0,04 119107 2,8
Растворенный Ppt G 248 0,31 77300 1,8
Таблица 29
Среднее значение содержания профермента фактора XI в каждой фракции трех крупных производственных партий, обработанных на участке 2
Образец Объем Профермент F-XI
(Ед/мл) (Ед) (% от пула по Кону)
Пул по Кону 2885 1,11 3193460 100,0
Супернатант I 3076 1,04 3208517 100,5
Супернатант II+II 3376 0,29 968120 30,2
Паста II+III* 474,3 4,96 2352714 74,0
Фильтрат после Aerosil 2280 0,11 258466,7 8,1
Растворенный Ppt G 238,1 1,07 253912,33 8,0
Понятно, что примеры и варианты воплощения, описанные здесь, предназначены только для иллюстративных целей, и в их свете специалисты в данной области техники могут предложить различные модификации или изменения, которые должны быть включены в рамки настоящего документа и прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые здесь, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для любых целей.

Claims (22)

1. Способ получения композиции иммуноглобулина G (IgG) с пониженным количеством сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы, включающий этапы:
(а) осаждение фракции криосупернатантной плазмы на первом этапе осаждения с использованием от 6 до 10% спирта при рН от 7,0 до 7,5 с получением первого преципитата и первого супернатанта;
(б) осаждение IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения с использованием от 20 до 30% спирта при рН от 6,7 до 7,3 с получением второго преципитата;
(в) ресуспендирование второго преципитата с образованием суспензии;
(г) контактирование суспензии с тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) при рН от 4,5 до 6,0 и и электрической проводимости от 0,1 до 3 мСм/см для связывания сериновой протеазы или профермента сериновой протеазы;
(д) отделение SiO2 от суспензии с образованием осветленной суспензии.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает этапы:
(е) осаждение IgG из осветленной суспензии, образованной на этапе (д), на третьем этапе осаждения с использованием конечной концентрации спирта от 22 до 28% спирта при рН от 6,7 до 7,3 с получением третьего преципитата;
(ж) ресуспендирование третьего преципитата с образованием второй суспензии;
(з) отделение растворимой фракции от второй суспензии, образованной на этапе (д), тем самым образуя обогащенную композицию IgG.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно включает этап обогащения с помо-
- 94 034530 щью анионообменной хроматографии.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что дополнительно включает этап обогащения с помощью катионообменной хроматографии.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что дополнительно включает по меньшей мере один этап инактивации или удаления вирусов.
6. Способ по любому из пп.1-5, где этап (b) проводят с использованием 23-27% спирта.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что этап (б) включает коррекцию концентрации этанола в первом супернатанте, образованном на этапе (а), до 25% (об./об.) при температуре от -7 до -9°C.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что этап (в) включает ресуспендирование второго осадка, полученного на этапе (б), с буфером для ресуспендирования, содержащим фосфат и ацетат, причем рН буфера корректируют с помощью ледяной уксусной кислоты в количестве от 300 до 700 мл кислоты на 1000 л буфера для ресуспендирования.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что этап (г) включает добавление SiO2 до конечной концентрации от 0,02 г/г осадка, образованного на этапе (б), до 0,06 г/г осадка, образованного на этапе (б).
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что рН параметра раствора, пригодного для связывания сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы, составляет от 4,9 до 5,3.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что электрическая проводимость параметра раствора, пригодного для связывания сериновой протеазы или зимогена сериновой протеазы, составляет от 0,5 до 2 мСм/см.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что этап (д) включает подэтапы:
(1) отделение SiO2 от суспензии путем фильтрования суспензии через фильтр-пресс с образованием осветленной суспензии;
(ii) промывка фильтр-пресса буфером для промывки, имеющим рН от 4,6 до 5,3, в количестве по меньшей мере 3 мертвых объема фильтр-пресса, тем самым формируя раствор для промывки; и (2) объединение осветленной суспензии, полученной на подэтапе (i), с раствором для промывки, полученным на подэтапе (i), тем самым получая обогащенную композицию IgG.
13. Способ по любому из пп.1-12, где концентрация спирта на первом этапе осаждения (а) достигается путем добавления распылением спирта в криосупернатантную плазму.
14. Способ по любому из пп.1-13, где концентрация спирта на втором этапе осаждения (б) достигается путем добавления распылением спирта в первый супернатант.
15. Способ по любому из пп.2-14, где концентрация спирта на третьем этапе осаждения (е) достигается путем добавления распылением спирта в осветленную суспензию.
16. Способ по любому из пп.1-15, где рН на первом этапе осаждения (а) поддерживается на первом этапе осаждения путем непрерывного мониторинга и коррекции рН.
17. Способ по любому из пп.1-16, где рН на втором этапе осаждения (б) поддерживается на втором этапе осаждения путем непрерывного мониторинга и коррекции рН.
18. Способ по любому из пп.2-17, где рН на третьем этапе осаждения (е) поддерживается на втором этапе осаждения путем непрерывного мониторинга и коррекции рН.
19. Способ по любому из пп.1-18, где этап (б) включает доведение концентрации этанола первого супернатанта, полученного на этапе (а), до 24-26%.
20. Способ по любому из пп.1-19, где этап (б) выполняют при температуре от -7 до -9°C.
21. Способ по любому из пп.1-20, где тонкоизмельченный диоксид кремния (SiO2) представляет собой высокодисперсный кремнезем.
22. Способ по любому из пп.1-21, где сериновая протеаза или профермент сериновой протеазы представляет собой фактор XIa.
EA201691558A 2010-05-26 2011-05-26 Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния EA034530B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2010202125A AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-05-26 A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US12/789,365 US8993734B2 (en) 2010-05-26 2010-05-27 Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US12/842,944 US8304524B2 (en) 2009-07-23 2010-07-23 Manufacture of factor H (FH) and FH-derivatives from plasma

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691558A1 EA201691558A1 (ru) 2017-05-31
EA034530B1 true EA034530B1 (ru) 2020-02-18

Family

ID=42727304

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500848A EA034602B1 (ru) 2010-05-26 2010-05-27 Способ получения обогащенной igg-композиции из криосупернатантной плазмы
EA201291355A EA023446B1 (ru) 2010-05-26 2010-05-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОЙ IgG-КОМПОЗИЦИИ ИЗ ПЛАЗМЫ
EA201691558A EA034530B1 (ru) 2010-05-26 2011-05-26 Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния
EA201291367A EA025826B1 (ru) 2010-05-26 2011-05-26 Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500848A EA034602B1 (ru) 2010-05-26 2010-05-27 Способ получения обогащенной igg-композиции из криосупернатантной плазмы
EA201291355A EA023446B1 (ru) 2010-05-26 2010-05-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОЙ IgG-КОМПОЗИЦИИ ИЗ ПЛАЗМЫ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291367A EA025826B1 (ru) 2010-05-26 2011-05-26 Удаление сериновых протеаз путем обработки тонкоизмельченным диоксидом кремния

Country Status (25)

Country Link
US (6) US8993734B2 (ru)
EP (6) EP2445482B1 (ru)
JP (6) JP5876474B2 (ru)
KR (3) KR101593265B1 (ru)
CN (5) CN102970975B (ru)
AR (4) AR076800A1 (ru)
AU (7) AU2010202125B1 (ru)
BR (2) BR112012029893B1 (ru)
CA (2) CA2800155A1 (ru)
CL (3) CL2012003291A1 (ru)
CO (2) CO6660438A2 (ru)
DK (3) DK2554160T3 (ru)
EA (4) EA034602B1 (ru)
ES (4) ES2959234T3 (ru)
HK (6) HK1170168A1 (ru)
HR (3) HRP20140944T1 (ru)
HU (1) HUE064400T2 (ru)
IL (2) IL223150A0 (ru)
MX (4) MX364252B (ru)
MY (3) MY173299A (ru)
PL (4) PL2554160T3 (ru)
PT (3) PT2445482E (ru)
SG (3) SG185724A1 (ru)
TW (3) TWI531577B (ru)
WO (1) WO2011149472A1 (ru)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI532498B (zh) 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
AU2010296017C1 (en) * 2009-09-17 2013-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2010202125B1 (en) * 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
US8841248B2 (en) * 2010-07-23 2014-09-23 Baxter International Inc. Manufacture of inter-alpha-inhibitor (IaIp) from plasma
HUE029232T2 (en) * 2011-04-08 2017-02-28 Univ Costa Rica A method for preparing injectable formulations of protein derived from blood, and materials obtained using said method
PL2791675T3 (pl) 2011-12-13 2018-10-31 Baxalta GmbH Pomiar autoprzeciwciał w warunkach niskiej przewodności
TWI629283B (zh) * 2012-02-23 2018-07-11 巴克斯歐塔公司 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱
RU2487725C1 (ru) * 2012-03-15 2013-07-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГУП "НПО "Микроген" Минздрава России) Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения
CN103197053B (zh) * 2013-03-15 2015-02-18 上海市血液中心 一种抗IgA抗体检测试剂盒
AU2013203043B2 (en) * 2013-03-15 2016-10-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs
CN104072601A (zh) * 2014-07-03 2014-10-01 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fii沉淀的制备方法
CN104086646B (zh) * 2014-07-03 2018-10-09 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fv沉淀的制备方法
CN104086642A (zh) * 2014-07-03 2014-10-08 成都蓉生药业有限责任公司 血液制品中fi+iii上清的制备方法
GB201413227D0 (en) * 2014-07-25 2014-09-10 Bioproducts Lab Ltd Process
WO2016064955A1 (en) 2014-10-21 2016-04-28 The General Hospital Corporation Methods of diagnosis and treatment of tuberculosis and infection
CN204424090U (zh) 2014-11-28 2015-06-24 比亚迪股份有限公司 薄膜电容器
US20160289301A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang Process of cloning and further purification to make a recombinant intravenous immunoglobulin
WO2016161422A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang A method of manufacturing and purifiying prothrombin complex concentrate from fraction iii for intraveneous injection and a method of curing and preventing hemophilia a with inhibitors or hempophilia b patients infected with hiv-1 and hiv-2
US20160289300A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Kieu Hoang Method of manufacturing intravenous immunoglobulin from fraction iii
US20170233458A1 (en) * 2015-09-29 2017-08-17 Kieu Hoang Method of manufacturing intravenous immunoglobulin from fraction iii
US20170232079A1 (en) * 2015-10-06 2017-08-17 Kieu Hoang Method of manufacturing prothrombin complex concentrate from fraction iii and non-prothrombin complex concentrate from fraction iv
CN106800583A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 上海洲跃生物科技有限公司 一种速溶无析出的冻干人纤维蛋白原制备工艺
EP3275897A1 (en) 2016-07-27 2018-01-31 Biotest AG Process for preparing immunoglobulin compositions
WO2018050873A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Leukocare Ag A novel method for producing low viscous and highly concentrated biopharmaceutical drug products in liquid formulation
RU2744630C2 (ru) * 2016-09-16 2021-03-12 Льюкокэар Аг Новый способ стабилизации биофармацевтического лекарственного продукта при производстве
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
JP7275044B2 (ja) * 2017-04-21 2023-05-17 ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト 慢性炎症性脱髄性多発神経炎の治療における使用のための免疫グロブリン製品
AU2018390797A1 (en) * 2017-12-19 2020-07-02 CSL Behring Lengnau AG Protein purification and virus inactivation with alkyl glycosides
MX2020010724A (es) * 2018-04-12 2020-11-06 Amgen Inc Metodos para preparar composiciones proteicas estables.
CN108733099B (zh) * 2018-05-31 2020-08-11 上海药明生物技术有限公司 低pH孵育和中和的自动调节***及方法
JP2022551566A (ja) * 2019-10-11 2022-12-12 武田薬品工業株式会社 第ＸＩａ因子のヘパリン非感受性アッセイ
AU2020378245A1 (en) * 2019-11-04 2022-04-07 Alkahest, Inc. Blood plasma fractions for use in muscle regeneration
KR20230024885A (ko) 2020-04-10 2023-02-21 플라즈마 테크놀로지스, 엘엘씨 간소화된 고효율 단백질 단리를 위한 조성물 및 방법 (compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins)
CN111961130B (zh) * 2020-08-31 2021-09-10 华兰生物工程重庆有限公司 一种从血浆中提取并分离IgM和IgG的方法
KR20230078629A (ko) * 2020-10-01 2023-06-02 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 분무-건조 인간 혈장을 활용하는 혈장 분획 공정
CA3203540A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Eugene ZURLO Systems and methods for process scale isolation of immunoglobulin g
CN112574296B (zh) * 2020-12-30 2023-05-19 中国医学科学院输血研究所 一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法
AU2022317368A1 (en) 2021-07-29 2024-02-22 Csl Behring Ag Method of purifying immunoglobulin g and uses thereof
KR20230121373A (ko) * 2022-02-11 2023-08-18 주식회사 녹십자 인자 xiii의 정제방법
WO2023170553A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Affinity chromatographic production of clinical human igg products
WO2023170680A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system
WO2023215722A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of preparing cohn pool concentrate from blood plasma through ultrafiltration
WO2023247736A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Ageronix SA Alpha1-antitrypsin for use in the treatment of diseases or disorders of the nervous system such as chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007085626A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Octapharma Ag Purification and use of a factor for supporting wound healing
US20090203580A1 (en) * 2005-06-07 2009-08-13 Dinarello Charles A Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2390074A (en) * 1942-02-09 1945-12-04 Research Corp Protein product and process
SE348942B (ru) 1970-06-02 1972-09-18 Statens Bakteriologiska Labor
US4056614A (en) 1972-09-22 1977-11-01 Marc Bonneau Immunity depressant medicine
US3998946A (en) * 1975-04-23 1976-12-21 The Regents Of The University Of Minnesota Fibrinogen-free plasminogen-plasmin-free plasma and method of preparing and using same
DE2801123C2 (de) * 1977-01-26 1986-01-02 Armour Pharma GmbH & Co KG, 3440 Eschwege Verfahren zur Herstellung eines intravenös applizierbaren Serumeiweiß-Präparates
US4296027A (en) * 1977-08-31 1981-10-20 The Regents Of The University Of Minnesota Pure intravenous human and animal gamma globulins
US4136094A (en) 1977-08-31 1979-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin
US4357272A (en) * 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
US4550019A (en) * 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
DE2901822A1 (de) * 1979-01-18 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung einer fuer die intravenoese applikation geeigneten immunglobulinloesung, die igm in ankonzentrierter form enthaelt
DE2902158A1 (de) 1979-01-20 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung von fibrinogen, einem die gerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x enthaltenden prothrombinkomplex, antithrombin iii und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen
US4228154A (en) 1979-02-26 1980-10-14 Armour Pharmaceutical Company Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
US4378346A (en) * 1979-08-15 1983-03-29 Tankersley Donald L Intravenously injectable solution of plasma protein fraction free from bradykinin, kininogen and prekallikrein activators and processes for its production
US4499073A (en) * 1981-08-24 1985-02-12 Cutter Laboratories, Inc. Intravenously injectable immune serum globulin
JPS5855432A (ja) 1981-09-29 1983-04-01 Fujirebio Inc 静脈注射用免疫グロブリンの製法
US4439358A (en) 1982-06-17 1984-03-27 Miles Laboratories, Inc. Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor
US4624780A (en) 1982-06-28 1986-11-25 Alpha Therapeutic Corporation Fractionation of blood plasma
DE3247150A1 (de) 1982-12-21 1984-06-28 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Gerinnungsaktive plasmaproteinloesung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur behandlung von stoerungen des haemostasesystems
DK166763B1 (da) 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
US5061237A (en) 1985-07-02 1991-10-29 Cytomed Medizintechnik Gmbh Method of purifying whole blood
DE3523615A1 (de) 1985-07-02 1987-01-15 Cytomed Medizintechnik Medizinisches geraet, insbesondere kanuele, katheter oder implantat
JPH0742235B2 (ja) 1985-11-08 1995-05-10 三共株式会社 自己免疫性疾病の予防・治療剤
US5136094A (en) 1988-03-10 1992-08-04 Air Products And Chemicals, Inc. Process for the synthesis of secondary formamides
US5055447A (en) 1988-07-28 1991-10-08 Genentech, Inc. Method and compositions for the treatment and prevention of septic shock
JP2871709B2 (ja) 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
EP0440509A3 (en) * 1990-02-02 1991-12-18 Common Services Agency Novel cell growth medium components and process for producing same
DE59009020D1 (de) * 1990-03-22 1995-06-08 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen Immunglobulin-G-Präparates.
US5130451A (en) * 1991-03-28 1992-07-14 Amoco Corporation Process for preparing carboxyaryl phosphates
US5324425A (en) * 1992-08-26 1994-06-28 Ellison Billy L Method and apparatus for removing solids from aqueous wash solutions
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
FR2711371B1 (fr) 1993-10-18 1995-12-29 Aetsrn Procédé de préparation d'un concentré d'inter-alpha-trypsine inhibiteur à usage thérapeutique et concentré obtenu.
US5610285A (en) 1994-08-24 1997-03-11 Bayer Corporation Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions
DE4435485C1 (de) 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
AUPN858596A0 (en) * 1996-03-08 1996-04-04 Csl Limited Filtration of plasma precipitates using cellulose filter aid
TW491855B (en) 1996-08-07 2002-06-21 Csl Ltd Purification of immunoglobulins
US5783640A (en) * 1997-03-04 1998-07-21 The Goodyear Tire & Rubber Company Rubber compositions containing a disodium salt of 2, 2'-dithiosalicyclic acid
CA2232420A1 (en) 1997-03-19 1998-09-19 The Green Cross Corporation Immunoglobulin preparation and preparation process thereof
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
AT407114B (de) 1997-06-10 2000-12-27 Immuno Ag Alpha 1-antitrypsin-präparation sowie verfahren zu deren herstellung
US5886154A (en) 1997-06-20 1999-03-23 Lebing; Wytold R. Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
CN1149100C (zh) 1997-10-23 2004-05-12 三菱制药株式会社 可室温贮存的免疫球蛋白静脉注射制剂
US20020114802A1 (en) 1998-02-10 2002-08-22 Tjellstrom Bo Arthur Einar Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease
AT406873B (de) 1998-02-25 2000-10-25 Immuno Ag Verfahren zur abreicherung von pathogenen aus proteinhaltigen lösungen
DE19932782A1 (de) * 1999-07-14 2001-01-18 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung
AU775149B2 (en) 1999-10-21 2004-07-22 Alcon Inc. Sub-tenon drug delivery
DE10008519C1 (de) 2000-02-21 2001-07-12 Dica Technologies Ag Verfahren und Kommunikationseinrichtungen zum Aufbau von gesicherten E-Mail-Verkehr zwischen Mail-Domains des Internet
DE10008619A1 (de) * 2000-02-24 2001-09-06 Immuno Vet As Lynge Mikroorganismenfreies IgG-Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in der Tieraufzucht und in der Tiermast
SE0001128D0 (sv) 2000-03-30 2000-03-30 Amersham Pharm Biotech Ab A method of producing IgG
US20020098182A1 (en) 2000-09-28 2002-07-25 Richard Weisbart Treatment of immune-mediated diseases by oral administration of plasma fractions enriched in immunoglobulin G
US20030190732A1 (en) 2000-10-13 2003-10-09 Djuro Josic Plasma fraction containing bikunin, method for the production thereof and use of the same
FR2824568B1 (fr) 2001-05-11 2004-04-09 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique
MXPA04003156A (es) 2001-10-04 2005-01-25 Protein Therapeutics Inc El uso de gammaglobulina para el tratamiento de enfermedades mediadas inmunes .
US6893639B2 (en) 2001-10-19 2005-05-17 Hemacare Corporation Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates
US7777006B2 (en) * 2002-12-31 2010-08-17 Csl Behring L.L.C. Method for purification of alpha-1-antitrypsin
RU2364609C2 (ru) * 2003-05-23 2009-08-20 Ново Нордиск Хелт Кэр Аг Стабилизация белка в растворе
WO2005012354A1 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Zlb Behring Gmbh Method for extending the half-life of fviii
US20050054003A1 (en) 2003-09-10 2005-03-10 Stenland Christopher J. Prion clearance using particulate metal oxides
CA2544816A1 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Prothera Biologics, Llc Preparation and composition of inter-alpha inhibitor proteins from human plasma for therapeutic use
BRPI0507298A (pt) 2004-01-30 2007-07-03 Suomen Punainen Risti Veripalv processo para a produção de imunoglobulina segura a vìrus
BRPI0508096B8 (pt) 2004-02-27 2021-05-25 Octapharma Ag método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado
NZ595305A (en) 2005-02-14 2013-06-28 Univ Iowa Res Found Methods and reagents for treatment and diagnosis of age-related macular degeneration
US7807435B2 (en) 2005-08-11 2010-10-05 Baxter International Inc. Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI)
EP1928483B1 (en) 2005-09-19 2016-12-28 CSL Behring GmbH Factor h for the treatment of tubulointerstitial fibrosis and progressive renal failure
FR2894145B1 (fr) 2005-12-07 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de facteur h du complement a titre de medicament
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1852443A1 (en) * 2006-05-05 2007-11-07 Leukocare AG Biocompatible three dimensional matrix for the immobilization of biological substances
DE102007001521A1 (de) * 2007-01-10 2008-07-17 Matthias, Torsten, Dr. Verwendung von Cohn-Oncley-Fraktionen II und II/III zur Behandlung des systemischen Lupus erythematodes
ES2595059T3 (es) * 2007-03-20 2016-12-27 Csl Behring Gmbh Métodos para la producción a escala industrial de preparados terapéuticos del Factor H del complemento a partir de plasma humano
DE202007004346U1 (de) 2007-03-21 2007-10-31 Rehau Ag + Co Rohranordnung
AU2008270951A1 (en) * 2007-04-20 2009-01-08 Regents Of The University Of Colorado Alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
DK2167117T3 (da) 2007-06-13 2012-11-19 Csl Behring Gmbh Anvendelse af VWF-stabiliserede FVIII-præparater til ekstravaskulær administration til terapeutisk og profylaktisk behandling af blødningsforstyrrelser
ES2477294T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
US8466265B2 (en) * 2007-10-02 2013-06-18 Csl Limited Therapeutic antibody purification method and method of use
CN105816858A (zh) 2007-12-28 2016-08-03 巴克斯特国际公司 重组vwf配方
CN101249265B (zh) * 2008-04-11 2010-10-27 三九集团湛江开发区双林药业有限公司 静脉注射用人乙肝免疫球蛋白及其制备方法
BRPI0913949A2 (pt) 2008-05-28 2015-10-20 Pro Thera Biolog Llc preparação e composição de proteínas inibidoras inter-alfa a partir de sangue
KR101648734B1 (ko) 2008-06-24 2016-08-18 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
CN201169579Y (zh) * 2008-06-30 2008-12-24 山东泰邦生物制品有限公司 一种人血白蛋白分离用乙醇雾化扩散装置
AU2009307648C1 (en) 2008-10-21 2016-12-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Lyophilized recombinant VWF formulations
WO2010056909A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Baxter International Inc. Purification of butyrylcholinesterase using membrane adsorption
EA023382B1 (ru) 2009-05-27 2016-05-31 Бакстер Интернэшнл Инк. Способ получения высококонцентрированного препарата иммуноглобулина для подкожного применения
AT516600B1 (de) 2009-07-23 2016-07-15 Baxter Int Herstellung von faktor h (fh) und fh-derivaten aus plasma
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
JP5953502B2 (ja) 2010-07-08 2016-07-20 バクスアルタ ゲーエムベーハー 細胞培養による組換え型高分子量ｖＷＦ産生方法
US8841248B2 (en) * 2010-07-23 2014-09-23 Baxter International Inc. Manufacture of inter-alpha-inhibitor (IaIp) from plasma

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090203580A1 (en) * 2005-06-07 2009-08-13 Dinarello Charles A Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
WO2007085626A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Octapharma Ag Purification and use of a factor for supporting wound healing

Also Published As

Publication number Publication date
HUE064400T2 (hu) 2024-03-28
JP2018080207A (ja) 2018-05-24
ES2505465T3 (es) 2014-10-10
EP2445482B1 (en) 2014-08-27
CN103068365B (zh) 2015-07-08
PL2554160T3 (pl) 2015-07-31
MX2019004482A (es) 2019-08-30
TW201141879A (en) 2011-12-01
AR121861A2 (es) 2022-07-20
EA201291367A1 (ru) 2013-09-30
KR101647617B1 (ko) 2016-08-10
EA201500848A1 (ru) 2016-06-30
MY161617A (en) 2017-04-28
EP2803349C0 (en) 2023-09-27
BR112012029893B1 (pt) 2022-09-06
CN109180776B (zh) 2022-12-13
TW201542584A (zh) 2015-11-16
CN103068365A (zh) 2013-04-24
AU2020200373A1 (en) 2020-02-13
AU2016202973A1 (en) 2016-05-26
CO6660439A2 (es) 2013-04-30
IL223149A (en) 2017-02-28
CO6660438A2 (es) 2013-04-30
AR082093A1 (es) 2012-11-14
EA025826B1 (ru) 2017-02-28
CN104958761B (zh) 2021-01-01
HK1213790A1 (zh) 2016-07-15
TWI531577B (zh) 2016-05-01
HRP20150484T1 (hr) 2015-08-14
SG10201505161SA (en) 2015-08-28
ES2536093T3 (es) 2015-05-20
ES2525492T3 (es) 2014-12-23
AU2011258111A1 (en) 2012-12-13
JP2016155798A (ja) 2016-09-01
KR20130080450A (ko) 2013-07-12
CA2800155A1 (en) 2011-12-01
CN104840946A (zh) 2015-08-19
CL2014003430A1 (es) 2015-05-04
HK1203838A1 (en) 2015-11-06
BR112012029893A2 (pt) 2019-05-28
CN109180776A (zh) 2019-01-11
KR101716534B1 (ko) 2017-03-14
BR112012029897A2 (pt) 2016-08-16
US20240117009A1 (en) 2024-04-11
AU2010224461B2 (en) 2011-08-04
CN102970975B (zh) 2015-05-06
EP2575762B1 (en) 2014-07-09
CA2800272A1 (en) 2011-12-01
KR20160014119A (ko) 2016-02-05
AR076800A1 (es) 2011-07-06
HRP20141109T1 (hr) 2014-12-19
PT2445482E (pt) 2014-11-03
PT2554160E (pt) 2015-06-11
DK2575762T3 (da) 2014-10-13
SG185724A1 (en) 2013-01-30
HK1215931A1 (zh) 2016-09-30
JP2016053016A (ja) 2016-04-14
JP6363676B2 (ja) 2018-07-25
AU2021286395A1 (en) 2022-01-20
EA201691558A1 (ru) 2017-05-31
PL2445482T3 (pl) 2015-01-30
EP2796128A1 (en) 2014-10-29
AU2016202973B2 (en) 2017-12-07
TWI504607B (zh) 2015-10-21
EP2445482A1 (en) 2012-05-02
JP2017014297A (ja) 2017-01-19
AU2011258111B2 (en) 2016-02-11
AU2018201371A1 (en) 2018-03-22
DK2445482T3 (da) 2014-09-22
EA023446B1 (ru) 2016-06-30
HRP20140944T1 (hr) 2014-12-05
EP2575762A2 (en) 2013-04-10
IL223150A0 (en) 2013-02-03
CN104958761A (zh) 2015-10-07
US20130101579A1 (en) 2013-04-25
AU2021286395B2 (en) 2024-04-11
TWI543989B (zh) 2016-08-01
KR101593265B1 (ko) 2016-02-11
JP6592120B2 (ja) 2019-10-16
JP2013527201A (ja) 2013-06-27
HK1183449A1 (en) 2013-12-27
JP2013528183A (ja) 2013-07-08
EA201291355A1 (ru) 2013-04-30
KR20130109016A (ko) 2013-10-07
AU2010202125B1 (en) 2010-09-02
HK1181682A1 (en) 2013-11-15
PT2575762E (pt) 2014-07-28
AU2010224461A1 (en) 2010-10-21
MX364252B (es) 2019-04-17
CN102970975A (zh) 2013-03-13
US11136350B2 (en) 2021-10-05
EP2554160A1 (en) 2013-02-06
JP5876474B2 (ja) 2016-03-02
AU2020200373B2 (en) 2022-01-13
EP2554160B1 (en) 2015-02-25
DK2554160T3 (da) 2015-04-27
EA034602B1 (ru) 2020-02-25
WO2011149472A1 (en) 2011-12-01
AR114228A2 (es) 2020-08-05
US20180118782A1 (en) 2018-05-03
CL2012003290A1 (es) 2013-10-18
ES2959234T3 (es) 2024-02-22
EP2803349B1 (en) 2023-09-27
PL2575762T3 (pl) 2015-01-30
US20210403504A1 (en) 2021-12-30
US20110293638A1 (en) 2011-12-01
JP5866345B2 (ja) 2016-02-17
EP2803349A1 (en) 2014-11-19
HK1170168A1 (en) 2013-02-22
IL223149A0 (en) 2013-02-03
MY173299A (en) 2020-01-14
US8993734B2 (en) 2015-03-31
MX349815B (es) 2017-08-09
MX2012013682A (es) 2013-01-28
TW201202263A (en) 2012-01-16
MX2012013689A (es) 2013-01-28
MY160551A (en) 2017-03-15
US20150133644A1 (en) 2015-05-14
SG185725A1 (en) 2012-12-28
AU2018201371B2 (en) 2019-10-31
EP4039249A1 (en) 2022-08-10
US8940877B2 (en) 2015-01-27
MX337028B (es) 2016-02-09
PL2803349T3 (pl) 2024-02-26
CL2012003291A1 (es) 2013-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021286395B2 (en) Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
US11891431B2 (en) Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment