EA033677B1 - Cd3-связывающие молекулы, способные к связыванию с cd3 человека и cd3, не являющимся человеческим - Google Patents

Cd3-связывающие молекулы, способные к связыванию с cd3 человека и cd3, не являющимся человеческим Download PDF

Info

Publication number
EA033677B1
EA033677B1 EA201391735A EA201391735A EA033677B1 EA 033677 B1 EA033677 B1 EA 033677B1 EA 201391735 A EA201391735 A EA 201391735A EA 201391735 A EA201391735 A EA 201391735A EA 033677 B1 EA033677 B1 EA 033677B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mab2
binding
seq
domain
antibody
Prior art date
Application number
EA201391735A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391735A1 (ru
Inventor
Ling Huang
Leslie S Johnson
Original Assignee
Macrogenics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Macrogenics Inc filed Critical Macrogenics Inc
Publication of EA201391735A1 publication Critical patent/EA201391735A1/ru
Publication of EA033677B1 publication Critical patent/EA033677B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
    • C03C17/34—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions
    • C03C17/36—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions at least one coating being a metal
    • C03C17/38—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions at least one coating being a metal at least one coating being a coating of an organic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
    • C03C17/34—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions
    • C03C17/42—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions at least one coating of an organic material and at least one non-metal coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/08—Mirrors
    • G02B5/0808—Mirrors having a single reflecting layer
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01L—SEMICONDUCTOR DEVICES NOT COVERED BY CLASS H10
    • H01L31/00—Semiconductor devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation and specially adapted either for the conversion of the energy of such radiation into electrical energy or for the control of electrical energy by such radiation; Processes or apparatus specially adapted for the manufacture or treatment thereof or of parts thereof; Details thereof
    • H01L31/04—Semiconductor devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation and specially adapted either for the conversion of the energy of such radiation into electrical energy or for the control of electrical energy by such radiation; Processes or apparatus specially adapted for the manufacture or treatment thereof or of parts thereof; Details thereof adapted as photovoltaic [PV] conversion devices
    • H01L31/054—Optical elements directly associated or integrated with the PV cell, e.g. light-reflecting means or light-concentrating means
    • H01L31/0547—Optical elements directly associated or integrated with the PV cell, e.g. light-reflecting means or light-concentrating means comprising light concentrating means of the reflecting type, e.g. parabolic mirrors, concentrators using total internal reflection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2217/00—Coatings on glass
    • C03C2217/40—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer
    • C03C2217/43—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase
    • C03C2217/44—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase characterized by the composition of the continuous phase
    • C03C2217/445—Organic continuous phases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2217/00—Coatings on glass
    • C03C2217/40—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer
    • C03C2217/43—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase
    • C03C2217/46—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase characterized by the dispersed phase
    • C03C2217/465—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase characterized by the dispersed phase having a specific shape
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2217/00—Coatings on glass
    • C03C2217/40—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer
    • C03C2217/43—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase
    • C03C2217/46—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase characterized by the dispersed phase
    • C03C2217/47—Coatings comprising at least one inhomogeneous layer consisting of a dispersed phase in a continuous phase characterized by the dispersed phase consisting of a specific material
    • C03C2217/475—Inorganic materials
    • C03C2217/479—Metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
    • Y02E10/50—Photovoltaic [PV] energy
    • Y02E10/52—PV systems with concentrators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к CD3-связывающим молекулам, способным связываться с эпитопом CD3 человека и эпитопом CD3 млекопитающего, не являющегося человеком. Изобретение также относится к диателам DART™, содержащим две полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь включает домен (A), включающий указанный CD3-специфический VL-домен; домен (B), включающий VH2 второго иммуноглобулина; и домен (C); вторая полипептидная цепь включает домен (D), включающий VL2 второго иммуноглобулина; домен (E), включающий CD3-специфический VH-домен; и домен (F); причем домены (A) и (E) ассоциируются с образованием указанного антигенсвязывающего домена, который способен к иммуноспецифическому связыванию CD3; домены (B) и (D) ассоциируются с образованием сайта связывания, который иммуноспецифически связывается со вторым эпитопом, при этом указанный второй эпитоп отличен от эпитопа CD3; и домены (C) и (F) ковалентно связаны вместе. Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такие молекулы и их антигенсвязывающие фрагменты, и находит применение для лечения злокачественного новообразования, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США № 61/488716 (поданной 21 мая 2011 г.; находящейся на рассмотрении) и заявки на патент США № 61/530353 (поданной 1 сентября
2011 г.; находящейся на рассмотрении), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Ссылка на список последовательностей
Заявка включает один или более списков последовательностей в соответствии в § 1.821 и далее раздела 37 Свода федеральных правил, которые представлены как на бумажном носителе, так и на машиночитаемом носителе, и эти представления на бумажном и машиночитаемом носителях включены в настоящее описание в качестве ссылки в их полном объеме.
Предпосылки создания изобретения Область техники
Настоящее изобретение относится к CD3-связывающим молекулам, способным связываться с CD3 человека и CD3, не являющимся человеческим, и, в частности, к таким молекулам, которые обладают перекрестной реактивностью с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака). Настоящее изобретение также относится к применению таких антител и антигенсвязывающих фрагментов для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний и других состояний.
Описание области техники
Иммунная система организма служит защитой ряда состояний, в том числе, например, повреждения, инфекции и неоплазии, и ее медиаторами являются две отдельные, но взаимосвязанные системы: клеточная и гуморальная иммунные системы. В общем, медиаторами гуморальной системы являются растворимые продукты (антитела или иммуноглобулины), которые обладают способностью к объединению с продуктами, распознаваемыми этой системой как чужеродные для организма, и к их нейтрализации. Напротив, клеточная иммунная система включает активацию определенных клеток, названных Тклетками, которые исполняют ряд терапевтических ролей. Т-клетки представляют собой лимфоциты, которые происходят из вилочковой железы и циркулируют между тканями, лимфатической системой и сердечно-сосудистой системой. Они действуют против, или в ответ на ряд(а) чужеродных структур (антигенов). Во многих случаях эти чужеродные антигены представлены на клетках-хозяевах в результате неоплазии или инфекции. Хотя сами Т-клетки не секретируют антитела, они обычно требуются для секреции антител вторым классом лимфоцитов, В-клетками (которые происходят из костного мозга). Немаловажно, что Т-клетки проявляют исключительную иммунологическую специфичность, чтобы быть способными отличить один антиген от другого.
Не подвергнутая воздействию Т-клетка, например Т-клетка, которая еще не столкнулась со специфическим для нее антигеном, активируется, когда она впервые сталкивается с комплексом специфический пептид:MHC на антигенпрезентирующей клетке. Антигенпрезентирующей клеткой может быть Вклетка, макрофаг или дендритная клетка. Когда не подвергнутая воздействию Т-клетка сталкивается с комплексом специфический пептид:MHC на антигенпрезентирующей клетке, через Т-клеточный рецептор доставляется сигнал, который приводит к изменению конформации молекул, связанных с функционированием лимфоцитов - Т-клеток антигенов (LFA), и увеличивает их сродство к молекулам межклеточной адгезии (ICAM), присутствующим на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Сигнал, порождаемый при взаимодействии Т-клетки с антигенпрезентирующей клеткой, является необходимым, но недостаточным, для активации не подвергнутой воздействию Т-клетки. Необходим второй костимулирующий сигнал. Не подвергнутую воздействию Т-клетку может активировать только антигенпрезентирующая клетка, несущая как комплекс специфический пептид:MHC, так и костимулирующую молекулу на своей поверхности. Распознавание антигена не подвергнутой воздействию Т-клеткой в отсутствие костимуляции приводит к тому, что Т-клетка становится анергической. Необходимость двух сигналов для активации Т-клеток и В-клеток, так что они достигают адаптивных иммунных ответов, может обеспечить механизм избегания реакций на аутоантигены, которые могут присутствовать на антигенпрезентирующей клетке в местах в системе, в которых она может быть распознана Т-клеткой. Если контактирование Т-клетки с антигенпрезентирующей клеткой приводит к порождению лишь одного из двух необходимых сигналов, Т-клетка не становится активированной, и адаптивный иммунный ответ не имеет место.
Эффективность, с которой у людей и других млекопитающих развивается иммунологическая реакция на патогены и чужеродные вещества, зависит от двух характеристик: высокой специфичности иммунной реакции в отношении распознавания антигена и иммунологической памяти, которая создает возможность для более быстрых и более сильных ответов после повторной активации с помощью того же антигена (Portoles, P. et al. (2009) The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination, Current Pharmaceutical Design 15: 3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR: CD3 Complex, Immunol Rev. 232(1): 7-21). Специфичность реакции Т-клеток опосредуется распознаванием антигена (представленного на антигенпрезентирующих клетках (АРС)) молекулярным комплексом, включающим Т-клеточный рецептор (TCR) и лиганд рецептора клеточной поверхно- 1 033677 сти, CD3. TCR представляет собой ковалентно связанный гетеродимер из α- и β-цепей (Τί','Κ,αβ). Эти цепи являются мембранными полипептидами класса I длиной 259 (α) и 296 (β) аминокислот. Молекула CD3 представляет собой комплекс, содержащий γ-цепь CD3, δ-цепь CD3 и две ε-цепи CD3, связанных в виде трех димеров (εγ, εδ, ζζ,) (Guy, C.S. et al. (2009) Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, Immunol Rev. 232(1): 7-21; Call, M.E. et al. (2007) Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors, Nat. Rev. Immunol. 7: 841-850; Weiss, A. (1993) T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases, Cell 73: 209-212). Комплекс TCR и CD3, наряду с дзета-цепью - ζ-цепью CD3 (также известной как дзета-цепь Тклеточного рецептора Т3 или CD247), включает TCR-комплекс (van der Merwe, P.A. etc. (epub Dec. 3, 2010) Mechanisms For T Cell Receptor Triggering, Nat. Rev. Immunol. 11: 47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). Этот комплекс особенно важен, поскольку он содержит большое число (десять) иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов (ITAM).
В случае зрелых Т-клеток активация TCR/CD3 с помощью чужеродных антигенных пептидов, связанных с молекулами собственного MHC, является первой стадией, необходимой для размножения антигенспецифических Т-клеток и их дифференциации в эффекторные Т-лимфоциты или Т-клетки памяти. Эти процессы включают фосфорилирование иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов (ITAM) TCR-комплекса. Поскольку TCR-комплекс содержит такое большое число ITAM (всего 10), и эти ITAM расположены последовательно один за другим (благодаря димеризации являющихся составными частями цепей), фосфорилирование соответствующих остатков тирозина в результате лигирования TCR создает спаренные места присоединения белков, которые содержат домены, гомологичные участкам Srcбелка 2 (SH2), таких как связанный с ζ-цепью белок с М.м. 70 кДа (ZAP-70), и тем самым инициирует усилительный каскад передачи сигналов, который приводит к активации Т-клеток и их дифференциации (Guy, C.S. et al. (2009) Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, Immunol Rev. 232 (1):7-21).
Результат этих процессов регулируется интенсивностью и качеством антигенного стимула, а также природой сопроводительных сигналов, передаваемых корецептором и костимулирующими поверхностными молекулами, или рецепторами цитокинов (Portoles, P. et al. (2009) The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination, Current Pharmaceutical Design 15: 3290-3300; Riha, P. et al. (2010) CD28 Co-Signaling In The Adaptive Immune Response, Self/Nonself 1(3): 231-240). Хотя стимуляция TCR является необходимым условиям для активации Т-клеток, общепризнано, что вхождение в контакт с костимулирующими молекулами, такими как CD28, необходимо для полной активации Т-клеток и их дифференциации (Guy, C.S. et al. (2009) Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, Immunol Rev. 232 (1):7-21).
Вследствие фундаментальности CD3 в инициации ответов на антигены были предложены моноклональные антитела против этого рецептора, которые способны к блокированию или, по крайней мере, модулированию иммунного процесса, и, таким образом, в качестве средств для лечения воспалительного и/или аутоиммунного заболевания. В самом деле, антитела против CD3 были первым антителом, разрешенным для лечения людей (St. Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657). Антитело против CD3 (продаваемое Janssen-Cilag как ORTHOCLONE™ ОКТ3™) вводили для уменьшения острого отторжения у пациентов с трансплантатами органов и в качестве лечения лимфобластного лейкоза (Cosimi, А.В. et al. (1981) Use Of Monoclonal Antibodies To T-Cell Subsets For Immunologic Monitoring And Treatment In Recipients Of Renal Allografts, N. Engl. J. Med. 305: 308-314; Rung, P. et al. (1979) Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens, Science 206: 347-349; Vigeral, P. et al. (1986) Prophylactic Use Of OKT3 Monoclonal Antibody In Cadaver Kidney Recipients. Utilization Of OKT3 As The Sole Immunosuppressive Agent, Transplantation 41: 730-733; Midtvedt, K. et al. (2003) Individualized T Cell Monitored Administration Of ATG Versus OKT3 In SteroidResistant Kidney Graft Rejection, Clin. Transplant. 17(1): 69-74; Gramatzki, M. et al. (1995) Therapy With OKT3 Monoclonal Antibody In Refractory T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Induces Interleukin-2 Responsiveness, Leukemia 9(3): 382-390; Herold, K.C. et al. (2002) Anti-CD3 Monoclonal Antibody In NewOnset Type I Diabetes Mellitus, N. Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Cole, M.S. et al. (1997) Human IgG2 Variants Of Chimeric Anti-CD3 Are Nonmitogenic to T cells, J. Immunol. 159(7): 3613-3621; Cole, M.S. et al. (1999) Hum291, A Humanized Anti-CD3 Antibody, Is Immunosuppressive To T Cells While Exhibiting Reduced Mitogenicity in vitro, Transplantation 68: 563-571; патенты США №№ 6491916, 5585097 и 6706265).
Однако лечение такими антителами против CD3 не было признано в достаточной степени специфическим во избежание побочных эффектов (Ludvigsson, J. (2009) The Role of Immunomodulation Therapy in Autoimmune Diabetes, J. Diabetes Sci. Technol. 3(2): 320-330). Многократное ежедневное введение ОКТ3 приводит к сильной иммуносупрессии и обеспечивает эффективное лечение отторжения после трансплантации почки. In vivo введение ОКТ3 приводит как к активации Т-клеток, так и к подавлению иммунных ответов. Однако применению ОКТ3 препятствовал синдром реакции на первую токсическую
- 2 033677 дозу, который связан с событиями первоначальной активации Т-клеток и с обеспечением выброса цитокинов, который имеет место до иммуносупресии Т-клеточных реакций. Описанные в литературе побочные эффекты, которые следует за первой, а иногда второй инъекцией этого мышиного моноклонального антитела, включают гриппоподобный синдром, состоящий из высокой температуры, озноба, головной боли и желудочно-кишечных симптомов (рвоты и диареи), а в тяжелых случаях отмечается отек легких в пределах часов лечения (Thistlethwaite, J.R. Jr. et al. (1988) Complications and Monitoring of OKT3 Therapy, Am. J. Kidney Dis. 11:112-119). Этот синдром, как полагают, служит отражением ОКТ3опосредуемого перекрестного сшивания комплекса TCR/CD3 на поверхности Т-клеток и результирующего выброса цитокинов (например, фактора альфа некроза опухолей (TNFa), интерферона-γ, интерлейкинов IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Masharani, U.B. et al. (2010) Teplizumab Therapy For Type I Diabetes, Expert Opin. Biol. Ther. 10(3): 459465; Abramowicz, D. et al. (1989) Release Of Tumor Necrosis Factor, Interleukin-2, And Gamma-Interferon In Serum After Injection Of OKT3 Monoclonal Antibody In Kidney Transplant Recipients, Transplantation 47: 606-608; Ferran, C. et al. (1990) Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody: Further Evidence For Transient In Vivo T Cell Activation, Eur. J. Immunol. 20: 509-515; Hirsch, R. et al. (12989) Effects Of In Vivo Administration Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody On T Cell Function In Mice. II. In Vivo Activation Of T Cells, J. Immunol. 142: 737-743)). Применение антител против CD3 описано в патентах США №№ 7883703, 7728114, 7635472, 7575923 и 7381903 и в публикациях заявок на патенты США №№ 2010/0150918, 2010/0209437, 2010/0183554, 2010/0015142, 2008/0095766, 2007/0077246 и публикации PCT-заявки № WO2008/119567.
Особым недостатком прежних антител является их специфичность в отношении только CD3 человека. Этот недостаток является значительной помехой в разработке таких антител, как терапевтические средства для лечения заболеваний у человека. Для получения разрешения на сбыт любое новое лекарственное средство-кандидат должно пройти тщательную проверку. Эту проверку можно подразделить на преклиническую и клиническую фазы. Тогда как клиническую проверку, дополнительно подразделяемую на общеизвестные клинические фазы I, II и III, выполняют на являющихся людьми пациентах, преклиническую проверку выполняют на животных. Целью преклинической проверки является подтверждение того, что лекарственное средство-кандидат обладает желаемой активностью и, самое важное, является безопасным. Только в случае установления при преклинической проверке безопасности для животных и возможной эффективности лекарственного средства-кандидата соответствующим регулирующим органом будет разрешена клиническая проверка на людях этого лекарственного средствакандидата. Безопасность лекарственных средств-кандидатов может быть проверена на животных тремя следующими путями: (i) на релевантном виде, т.е. виде, в котором лекарственные средства-кандидаты могут распознать ортологичные антигены, (ii) на трансгенном животном, содержащем антигены человека, и (iii) посредством использования заменителя лекарственного средства-кандидата, который может связываться с ортологичными антигенами, присутствующими у животного. Недостатками трансгенных животных является то, что эта технология типично приурочена к грызунам. Однако грызуны и люди имеют значительные различия в физиологии, которые могут затруднять экстраполяцию полученных на грызунах данных, относящихся к безопасности, для предсказания безопасности для людей. Недостатками заменителя лекарственного средства-кандидата является отличное химическое соединение по сравнению с фактическим лекарственным средством-кандидатом, и часто используемыми животными являются грызуны с обсуждавшимися выше недостатками. Следовательно, преклинические данные, полученные на грызунах, обладают ограниченной прогнозирующей способностью, что касается лекарственного средства-кандидата.
Предпочтительным подходом к проверке безопасности является использование релевантного вида, предпочтительно низшего примата. Теперь недостатком CD3-связывающих молекул, подходящих для терапевтического воздействия на человека, описанных в данной области техники, является то, что релевантными видами являются высшие приматы, в частности яванские макаки. Соответственно в высокой степени желательным является антитело против CD3, способное связываться как с CD3 человека, так и CD3 примата. Такие антитела описаны в публикации заявки на патент США с № 20100150918 и в публикации PCT-заявки с № WO2008/119567.
Несмотря на такие успехи, сохраняется потребность в антителах против CD3 человека и их антигенсвязывающих фрагментах, которые способны перекрестно реагировать с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака). Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и потребность в улучшенных терапевтических средствах от злокачественного новообразования, аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к CD3-связывающим молекулам, способным к связыванию с CD3 человека и CD3, не являющимся человеческим, и, в частности, к таким молекулам, которые обладают перекрестной реактивностью с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака). Настоящее изобретение также имеет отношение к применениям таких антител и антигенсвязывающих фрагментов для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных и/или воспа
- 3 033677 лительных заболеваний и других состояний.
Подробно, настоящим изобретением обеспечивается CD3-связывающая молекула, включающая антигенсвязывающий фрагмент антитела, причем антигенсвязывающий фрагмент включает CD3специфический VL-домен антитела и CD3-специфический VH-домен антитела, причем CD3специфический VL-домен и CD3-специфический VH-домен образуют антигенсвязывающий домен, способный к иммуноспецифическому связыванию как с эпитопом CD3 человека, так и с эпитопом CD3 млекопитающего, не являющегося человеком, причем:
(I) CD3-специфический VL-домен выбирают из группы, состоящей из VL-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 22), VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26), VL-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 28), VL-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 30), VL-9 hmab2 (SEQ ID NO: 32) и VL-10 h-mab2 (SEQ ID NO: 34), а указанный CD3-специфический VH-домен выбирают из группы, состоящей из VH-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 36), VH-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 38), VH-3 h-mab2 (SEQ ID NO: 40), VH-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 42), VH-5 h-mab2 (SEQ ID NO: 44), VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46), VH-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 48), VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50).
Настоящее изобретение, в частности, имеет отношение к варианту осуществления описанной выше CD3-связывающей молекулы, в котором CD3-специфическим VL-доменом является VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26).
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанной выше CD3-связывающей молекулы, в котором CD3-специфическим VH-доменом является VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50) или VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46).
Настоящее изобретение, в частности, имеет отношение к варианту осуществления описанной выше CD3-связывающей молекулы, в котором молекулой является антитело и, в частности, в котором в антителе отсутствует Fc-область, или оно включает Fc-область, которая:
(A) испытывает недостаток эффекторной функции либо обладает уменьшенной эффекторной функцией или (B) подвергнута модифицированию, которое ослабляет способность Fc-области антитела к связыванию с Fc-рецептором; причем уменьшение эффекторной функции и ослабление связывающей способности имеет место относительно таковой Fc-области дикого типа.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул, в котором молекулой является CD3-связывающее диатело, которое включает первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом цепи ковалентно связаны друг с другом, причем:
I. первая полипептидная цепь включает амино-конец и карбоксильный конец и от N-конца к Сконцу:
(i) домен (А), включающий CD3-специфический VL-домен;
(ii) домен (В), включающий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2); и (iii) домен (С);
причем домены (А) и (В) не ассоциируются друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта; и (II) вторая полипептидная цепь включает амино-конец и карбоксильный конец и от N-конца к Сконцу:
(i) домен (D), включающий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2);
(ii) домен (Е), включающий CD3-специфический VH-домен; и (iii) домен (F);
причем домены (D) и (Е) не ассоциируются друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта;
причем:
(1) домены (А) и (Е) ассоциируются с образованием антигенсвязывающего домена, который способен к иммуноспецифическому связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком;
(2) домены (В) и (D) ассоциируются с образованием сайта связывания, который иммуноспецифически связывается со вторым эпитопом, при этом второй эпитоп отличен от эпитопа CD3, с которым связывается антигенсвязывающий домен, образованный вследствие ассоциации доменов (А) и (Е); и (3) домены (С) и (F) ковалентно связаны вместе. Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул, в котором вторым эпитопом не является эпитоп CD3.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул, в котором вторым эпитопом является эпитоп CD3, который отличен от эпитопа CD3, с которым связывается антигенсвязывающий домен, образованный вследствие ассоциации доменов (А) и (Е).
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше
- 4 033677
СП3-связывающих молекул или антител или диател, в котором такая молекула является гуманизированной.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул или антител или диател, в котором такая молекула способна к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и флуоресцеином.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул или диател, в котором такая молекула способна к иммуноспецифическому связыванию как с (i) CD3, так и с (ii) (а) опухолеспецифическим антигеном, или (ii)(b) антигеном клеточной поверхности, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул или диател, в котором молекула или диатело способны к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и опухолеспецифическим антигеном, представленным на опухолевой клетке, причем опухолевой клеткой является клетка злокачественного новообразования, выбираемого из группы, состоящей из рака молочной железы, рака предстательной железы, рака желудка, рака легкого, рака желудка, рака ободочной кишки, рака прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака ротовой полости, рака глотки, рака пищевода, рака гортани, рака кости, рака кожи, меланомы, рака матки, рака яичек, рака мочевого пузыря, рака почки, рака головного мозга, глиобластомы, рака щитовидной железы, лимфомы, миеломы и лейкоза.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул или диател, в котором молекула или диатело способны к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и антигеном клеточной поверхности, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности, причем антигеном клеточной поверхности, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности является HER2/neu, E7-H3, CD20, PSMA, IGF-1R, Ер-САМ, или является молекула, которая вовлечена в ассоциацию Т-клетки с В-клеткой, которая приводит к активации Т-клетки или В-клетки в ходе адаптивного иммунного ответа.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к варианту осуществления описанных выше CD3-связывающих молекул или диател, в котором молекула или диатело способны к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и с молекулой, которая вовлечена в ассоциацию Т-клетки с В-клеткой, и молекулу, которая вовлечена в ассоциацию Т-клетки с В-клеткой, выбирают из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD32B, CD38, CD40, CD79a, CD79b, CD80, CD86, LFA-I, LFA-3 и CFA-I.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к фармацевтической композиции, включающей любую из описанных выше ОО3-связывающих молекул, антител или диател и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к описанной выше фармацевтической композиции для применения для лечения злокачественного новообразования или аутоиммунного или воспалительного заболевания.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к описанной выше фармацевтической композиции для применения для лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания, выбираемого из группы, состоящей из инсулинозависимого диабета типа I, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, злокачественной миастении, глютеновой болезни, синдрома Гужеро-Шегрена, болезни Грейвса, болезни Крона, аутоиммунного гепатита, псориаза, псориатического артрита, астмы, аллергического ринита, эффектов вследствие трансплантации органа или гомологичной болезни (GVHD). Настоящее изобретение, в частности, имеет отношение к описанной выше фармацевтической композиции для применения для лечения инсулинозависимого диабета типа I.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А-1В представлены результаты ELISA с захватом, в случае которого способность антитела против CD3 mAB1 (фиг. 1А) или химерного производного антитела mAB1 (ch-mAb1) (фиг. 1B) оценивали, используя растворимый CD3 человека (shCD3).
На фиг. 2А-2В представлены результаты ELISA с захватом, в случае которого способность антитела против CD3 mAB2 (фиг. 2А) или химерного производного антитела mAB2 (ch-mAb2) (фиг. 2В) оценивали, используя растворимый CD3 человека (shCD3) или растворимый CD3 яванского макака (scCD3).
На фиг. 3 представлены результаты анализов для определения эффекта вариаций пронумерованных согласно Kabat остатков 41-46 каркасных областей легкой цепи mAB2.
На фиг. 4 представлены результаты анализов для определения эффекта вариаций пронумерованных согласно Kabat остатков 36, 38, 44 и 46 каркасных областей легкой цепи mAB2.
На фиг. 5 представлены результаты анализов для определения эффекта вариаций пронумерованных согласно Kabat остатков 36, 38 и 46 каркасных областей легкой цепи mAB2.
На фиг. 6 представлены результаты анализов для определения эффекта вариаций пронумерованных согласно Kabat остатков 30, 49 и 93 каркасных областей тяжелой цепи mAB2.
На фиг. 7 представлены результаты дополнительных анализов, проведенных для определения эффекта вариаций пронумерованных согласно Kabat остатков 30, 49 и 93 каркасных областей тяжелой цепи
- 5 033677 mAB2.
На фиг. 8А-8В представлены результаты анализов, проведенных для определения способности химерного и гуманизированного mAB2 к связыванию с CD3, не являющимся человеческим.
На фиг. 9A-9D представлены записи сенсограмм анализов BIACORE™, выполненных для определения кинетики связывания ch-mAB2 или h-mAb2 с scCD3 или scCD3.
На фиг. 10A-10D представлены результаты ELISA с захватом выполненных на диателах DART™, содержащих способный к связыванию с CD3 первый эпитопсвязывающий сайт и второй эпитопсвязывающий сайт, который связывается с или Her2/neu, или CD19, или EGFR, или В7-И3.
На фиг. 11А-11В показана способность B7H3xCD3-биспецифических диател DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих B7H3.
На фиг. 12А-12Е показана способность A33xCD3-биспецифических диател DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих A33.
На фиг. 13А и 13В представлены результаты сравнения способности диатела DART™ CD19-hmAb2 и CD19xCD3-биспецифического диатела к вызову перенаправленного, опосредованного Тклетками уничтожения. Диатело DART™ CD19-h-mAB2 проявляет специфичность в отношении CD3 человека, а также CD3, не являющимся человеческим; CD19xCD3-биспецифическое диатело DART проявляет специфичность в отношении только CD3 человека. Фиг. 13А: перенаправленное уничтожение клеток В-клеточной лимфомы человека Raji; фиг. 13В: перенаправленное уничтожение клеток лимфомы из клеток ткани JeRo-1.
На фиг. 14А и 14В показано, что диатело DART™ CD19-h-mAb2 по настоящему изобретению было способно к опосредованию цитолиза в присутствии Т-клеток-эффекторов или человека, или яванского макака.
На фиг. 15А и 15В показана способность диатела DART™ ERBITUX™-h-mAb2 по настоящему изобретению или (ERBITUX™-T-клеточный рецептор)-биспецифического диатела DART™ к опосредованию увеличения MFI CD69 после инкубации с CD4+ или CD8+ Т-клетками. Контрольное диатело ERBITUX™-CD3 FN18 DART™ (способное к связыванию с EGFR и с CD3 яванского макака) не вызывало увеличение MFI CD69.
На фиг. 16A-16D представлены результаты исследований в отношении связывания или диатела DART™ ERBITUX™-h-mAb2, диатела DART™ ERBITUX™-m-mAb2, или диатела DART™ 4420-h-mAb2 (в качестве отрицательно контроля) или контрольного второго антитела с клетками А498 или А431 (фиг. 16А и 16С соответственно) и в отношении опосредования перенаправленного уничтожения таких клеток (фиг. 16В и 16D соответственно).
Подробное описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам против CD3 человека и их антигенсвязывающим фрагментам и, в частности, к таким антителам, которые обладают перекрестной реактивностью с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака). Настоящее изобретение также имеет отношение к применениям таких антител и антигенсвязывающих фрагментов для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний и других состояний.
I. Определения.
Используемый здесь термин CD3-связывающая молекула означает молекулу, способную к иммуноспецифическому связыванию как CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком, благодаря по крайней мере одному сайту распознавания антигена (например, антигенсвязывающему домену антитела), находящемуся в вариабельной области молекулы. Как здесь используется, такая способность к иммуноспецифическому связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком, как предполагается, не означает способность одного антигенсвязывающего домена к одновременному связыванию обеих таких молекул CD3, а точнее означает, что такой антигенсвязывающий домен проявляет перекрестную реактивность, так что он будет иммуноспецифически связываться с CD3 человека при инкубации в присутствии CD3 человека и будет иммуноспецифически связываться с CD3 не являющегося человеком млекопитающего при инкубации в присутствии такого CD3 не являющегося человеком млекопитающего.
Используемый здесь термин CD3-связывающая молекула охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2Fv), одиночную цепь (ScFv), их мутанты, встречающиеся в природе варианты, слитые белки, включающие часть белка с сайтом распознавания антигена требуемой специфичности, гуманизированные антитела, химерные антитела, BiTE®, молекулы диател DART™ и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности. Термин BiTE (биспецифические рекрутеры Т-клеток) относится к одноцепочечной полипептидной молекуле, которая имеет два антигенсвязывающих домена, один из которых связывается с Тклеточным антигеном, а второй из которых связывается с антигеном, присутствующим на поверхности мишени (WO 05/061547; Baeuerle, P. et al. (2008) BiTE®: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells,
- 6 033677
Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody Science 321: 974-977).
Термин диатело DART™ (перенаправляющий реагент с двумя аффинностями) относится к молекуле иммуноглобулина, которая включает по крайней мере две полипептидные цепи, которые ассоциируются (главным образом посредством ковалентной взаимосвязи) с образованием по крайней мере двух эпитопсвязывающих сайтов, которые могут распознавать один и тот же эпитоп или отличные эпитопы. Каждая из полипептидных цепей диатела DART™ включает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, но эти области не взаимодействуют с образованием эпитопсвязывающего сайта. Точнее, вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина одной (например, первой) из полипептидных цепей диатела DART™ взаимодействует с вариабельной областью легкой цепи иммуноглобулина отличной (например, второй) полипептидной цепи DART™ с образованием эпитопсвязывающего сайта. Аналогично, вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина одной (например, первой) из полипептидных цепей диатела DART™ взаимодействует с вариабельной областью тяжелой цепи иммуноглобулина отличной (например, второй) полипептидной цепи DART™ с образованием эпитопсвязывающего сайта. Диатела DART™ могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими и т.д., таким образом, обладая способностью к одновременному связыванию одного, двух, трех или более различных эпитопов (которые могут быть из одинаковых или различных антигенов). Диатела DART™ могут быть, кроме того, одновалентными, двухвалентными, трехвалентными, четырехвалентными, пятивалентными, шестивалентными и т.д., таким образом, обладая способностью к одновременному связыванию одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или более молекул. Эти две характеристики диател DART™ (т.е. степень специфичности и валентности) могут быть объединены, например, с получением биспецифических антител (т.е. способных к связыванию двух эпитопов), которые являются четырехвалентными (т.е. способными к связыванию четырех рядов эпитопов), и т.д. Молекулы диател DART™ описаны в публикациях PCT-заявок №№ WO 2006/113665, WO 2008/157379 и WO 2010/080538.
Биспецифические (или триспецифические, или полиспецифические) молекулы по настоящему изобретению будут способны к связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака), а также со вторым (или дополнительным) и отличным антигеном(ами) и эпитопом(ами). Вторым антигеном или эпитопом предпочтительно является опухолеспецифический антиген, представленный на опухолевой клетке. Такие опухолевые клетки могут быть из злокачественных новообразований, например рака молочной железы, рака предстательной железы, рака желудка, рака легкого, рака ободочной кишки, рака прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака ротовой полости, рака глотки, рака пищевода, рака гортани, рака кости, рака кожи, меланомы, рака матки, рака яичек, рака мочевого пузыря, рака почки, рака головного мозга, глиобластомы, рака щитовидной железы, лимфомы, миеломы или лейкоза. Дополнительными антигенами или эпитопами предпочтительно являются опухолеспецифические антигены или эпитопы на клеточной поверхности (такие как 17-1А, A33, основной антиген I эндодермального происхождения на эритроцитах взрослого человека, альфа-фетопротеин, антиген оболочки РНК-вируса опухоли, онкоэмбриональный антиген, специфический для опухоли мочевого пузыря, В7-Н1, В7-Н2, В7-И3, В7-Н4, В7-Н5, В7-И6, специфический для лимфомы Беркитта антиген-38.13, СА125, CD18, CD19, специфический для В-клеточной лимфомы человека антиген-CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, СЕА, СО17-1А, СТА-1, CTLA-4, рецептор эпидермального фактора роста, Ep-CAM, EphA2, антиген I на эритроцитах новорожденного, антиген фибросаркомы, ганглиозид GD2, ганглиозид GD3, ганглиозид GM2, ганглиозид GM3, GICA 19-9, gp IIIb/IIIa, gp72, HER1, HER-2/neu, HER3, HER4, специфический для меланомы антиген с большой молекулярной массой, антиген HLA-DR, специфический для лейкоза человека Т-клеточный антиген-Gp37, специфический для карциномы легкого человека антиген L20, специфический для карциномы легкого человека антиген L6, антиген в виде глобулярной частицы молочного жира человека, IgE, специфический для карциномы KS 1/4 pan антиген, LEA, специфический для аденокарциномы антиген F3, специфический для злокачественных лимфоцитов человека антиген-АРО-1, специфический для меланомы антиген gp75, связанный с меланомой антиген р97, неогликопротеин, nuC242, специфический для полиморфного эпителия антиген муцинового типа, специфический для предстательной железы антиген, специфический для предстательной железы мембранный антиген, специфический для предстательной железы кислый фосфат, антиген SK-1, TAG-72, Т-антиген, опухолеспецифический антиген СА125, опухолеспецифический антиген MUC1, опухолеспецифический трансплантационный антиген клеточной поверхности, фактор роста сосудистого эндотелия, рецептор фактора роста сосудистого эндотелия и αγβ3). Альтернативно, такие дополнительные антигены или эпитопы могут быть связаны с патогеном, таким как вирус гепатита типа А, вирус гепатита типа В, вирус гепатита типа С, вирус гриппа, вирус ветряной оспы, аденовирус, вирус простого герпеса типа I (HSV-I), вирус простого герпеса типа II (HSV-II), возбудитель чумы рогатого скота, риновирус, ЕСНО-вирус, ротавирус, респираторно-синцитиальный вирус, папилломавирус, паповавирус, цитомегаловирус, эхиновирус, арбовирус, хантавирус, коксаки-вирус, вирус эпидемического паротита, вирус кори, вирус краснухи, полиовирус, возбудитель натуральной оспы, вирус Эпштейна- 7 033677
Барра, вирус иммунодефицита человека типа I (HIV-I), вирус иммунодефицита человека типа II (HIV-II), возбудитель вирусного менингита, возбудитель вирусного энцефалита, возбудитель денге, возбудитель натуральной оспы; микобактерии, рикеттсии, микоплазма, нейссерии, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi, Bacillus anthracis, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, возбудитель столбняка, возбудитель коклюша, возбудитель холеры, возбудитель чумы, возбудитель дифтерии, хламидии и легионеллы; лейшмания, возбудитель кокцидиоза, трипаносома или возбудитель малярии; хламидии и рикеттсии.
Термин моноклональное антитело относится к гомогенной совокупности антител, причем моноклональное антитело состоит из аминокислот (встречающихся в природе и не встречающихся в природе), которые участвуют в избирательном связывании антигена. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфическими, будучи направленными против одной области детерминанты. Термин моноклональное антитело охватывает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2Fv), одиночную цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности и со способностью связываться с антигеном. Оно, как предполагается, не ограничивается источником антитела или способом, которым его получают (например, с использованием гибридомы, отбора фагов, экспрессии рекомбинантных молекул, трансгенных животных и т.д.). Термин включает полные иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше при определении антитела.
Термин гуманизированное антитело относится к химерной молекуле, обычно приготовленной, используя методы с использованием рекомбинантных ДНК, имеющей антигенсвязывающий сайт, происходящий из иммуноглобулина не являющегося человеком вида, а остальная структура молекулы иммуноглобулина основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Антигенсвязывающий сайт может включать или целые вариабельные домены, вставленные в константные домены, или лишь определяющие комплементарность участки (CDR), пересаженные в соответствующие каркасные области вариабельных доменов. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или быть модифицированными в результате одной или более аминокислотных замен. Это исключает функционирование константной области в качестве иммуногена у являющихся людьми индивидуумов, но сохраняется возможность иммунного ответа на чужеродную вариабельную область (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224). Другой подход сосредоточен не только на обеспечении происходящих от человека константных областей, но также на модификации вариабельных областей, чтобы придать им новую форму, по возможности близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей содержат три определяющих комплементарность участка (CDR), которые варьируют в ответ на соответствующие антигены и определяют способность к связыванию, фланкированных четырьмя каркасными областями (FR), которые являются относительно консервативными у конкретного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При приготовлении нечеловеческих антител к конкретному антигену вариабельным областям можно придать новую форму или подвергнуть их гуманизации посредством пересадки CDR, происходящих из нечеловеческого антитела, в FR, присутствующие в антителе человека, которые модифицируют. О применении этого подхода к различным антителам было сообщено в Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53: 851-856; Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239: 1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2: 124-134; Gorman, S.D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 41814185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9: 266-271; Co, M.S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4285-4289; и Со, M.S. et al. (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148: 1149-1154.
В некоторых вариантах осуществления в гуманизированных антителах сохранены все последовательности CDR (например, в гуманизированном мышином антителе, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В других вариантах осуществления гуманизированные антитела содержат один или более CDR (один, два, три, четыре, пять, шесть), которые изменены относительно исходного антитела, которые также называют одним или более CDR, происходящих от одного или более CDR исходного антитела. Как описано ниже, предпочтительные антитела по настоящему изобретению содержат специфические идентифицированные CDR. В настоящем изобретении, однако, предусматриваются эквивалентные антитела, содержащие измененные CDR.
Говорят, что антитело или полипептид, как здесь используется, иммуноспецифически или, что эк
- 8 033677 вивалентно, специфически связывается с участком другой молекулы (т.е. эпитопом), если оно реагирует или ассоциируются более часто, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с этим эпитопом, чем с альтернативными эпитопами. Например, антителом, которое специфически связывается с эпитопом CD3, является антитело, которое связывается с этим эпитопом CD3 с большей аффинностью, авидностью, быстрее и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами CD3 или не относящимися к CD3 эпитопами. Под интерпретацией этого определения также подразумевается, что, например, антитело (или составляющая или эпитоп), которое иммуноспецифически связывается с первой мишенью, может связываться или может не связываться специфически или предпочтительно со второй мишенью. По существу, иммуноспецифическое связывание не подразумевает обязательно (хотя оно может включать) исключительное связывание. Как правило, но необязательно, ссылка на связывание означает иммуноспецифическое связывание.
Используемый здесь термин иммунологически активный в отношении эпитопа, являющегося или остающегося иммунологически активным, относится к способности антитела (например, антитела против CD3) к связыванию с эпитопом в различных условиях, например после подвергания эпитопа воздействию восстанавливающих и денатурирующих условий. Например, если антитело больше не способно связываться с денатурированным эпитопом, говорят, что этот эпитоп сделался иммунологически неактивным.
Различные биологические функции связаны с антителами против CD3 по настоящему изобретению, и такие антитела могут проявлять любое или все из следующих характерных свойств, или могут испытывать недостаток одного, двух, трех или более таких характерных свойств: способность к специфическому связыванию с CD3 человека, который эндогенно представлен на поверхности нормальной Т-клетки человека; способность к специфическому связыванию с CD3 человека, который эндогенно представлен на поверхности лейкозной Т-клетки человека; способность к специфическому связыванию с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака), который эндогенно представлен на поверхности нормальной Т-клетки не являющегося человеком млекопитающего; способность к специфическому связыванию с CD3, не являющимся человеческим, который эндогенно представлен на поверхности нормальной нечеловеческой Т-клетки; способность к специфическому связыванию с CD3, не являющимся человеческим, который эндогенно представлен на поверхности нечеловеческой лейкозной Т-клетки; способность нейтрализовать (т.е. блокировать или препятствовать связыванию) образование комплекса с CD3; способность нейтрализовать образование комплекса с TCR; способность к модулированию (или антагонистически, или агонистически) передачи сигнала TCR-комплексом; способность к связыванию с Fc-рецептором; способность к конкурентному ингибированию предпочтительного связывания известного антитела против CD3 с CD3, включая способность к предпочтительному связыванию с тем же эпитопом CD3, с которым предпочтительно связывается исходное антитело; способность к связыванию с частью CD3, которая представлена на поверхности живой клетки in vitro или in vivo; способность к связыванию с частью CD3, которая представлена на поверхности живой раковой клетки; способность к доставке химиотерапевтического средства в раковую Т-клетку; и/или способность к доставке терапевтического средства, токсина или выявляемого маркера в Т-клетку. Как здесь обсуждалось, полипептиды (в том числе антитела) по настоящему изобретению могут обладать любым одним или более из этих характерных свойств.
Используемый здесь термин средство (агент) относится к биологическому, фармацевтическому или химическому соединению. Неограничивающие примеры включают простую или сложную органическую или неорганическую молекулу, пептид, белок, олигонуклеотид, антитело, производное антитела, фрагмент антитела, производное витамина, углевод, токсин или химиотерапевтическое соединение. Можно синтезировать различные соединения, например небольшие молекулы и олигомеры (например, олигопептиды и олигонуклеотиды), и синтетические органические соединения, основанные на различных базовых структурах. Кроме того, различные природные источники, такие как экстракты из растений или животных и т.п., могут предоставить соединения для отбора. Агенты, используемые в способах по этому изобретению, могут быть отобраны случайно или отобраны рационально или сконструированы. Говорят, что агент, как здесь используется, отобран случайно, если агент выбран без предварительного рассмотрения специфических аминокислотных или других химических составляющих, участвующих в ассоциации молекулы с ее природным партнером(ами) по связыванию или известными антителами, или без знания о них. Примером случайно отобранного агента является агент, который идентифицирован благодаря использованию химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки или ее скринингу. Говорят, что агент, как здесь используется, отобран рационально или сконструирован, если агент выбран на неслучайной основе, учитывающей последовательность центра мишени и/или его конформацию в связи с действием этого агента. Агент можно отобрать рационально или сконструировать рационально посредством использования пептидных последовательностей, которые образуют места контактов в комплексе рецептор/лиганд и/или CD3/антитело против CD3. Например, рационально отобранным агентом в виде пептида может быть пептид, аминокислотная последовательность которого идентична эпитопу, появляющемуся в CD3, когда он выставлен на поверхности живой клетки в ее природном окружении. Такой агент будет уменьшать или блокировать ассоциацию антитела против CD3 с CD3, или
- 9 033677 ассоциацию CD3 с его природным лигандом, по желанию, при связывании с антителом против CD3 или с его природным лигандом.
Используемый здесь термин меченое, что касается антитела, как предполагается, охватывает прямое мечение антитела посредством соединения (т.е. физической связи) выявляемого вещества, такого как радиоактивный агент или флуорофор (например, фикоэритрин (РЕ) или флуоресцеин изотиоцианат (также известный как фторизотиоцианат или FITC) с антителом, а также непрямое мечение зонда или антитела в результате реактивности с выявляемым веществом.
Используемый здесь термин ассоциация, что касается антитела, включает ковалентное или нековалентное присоединение или связывание агента (например, химиотерапевтического средства) к (с) антителу(ом). Ассоциацию антитела с агентом (например, химиотерапевтическим средством) можно осуществить посредством прямого связывания или непрямого связывания через присоединение к общей платформе, так что антитело определяет локализацию агента в раковой клетке, с которой связывается антитело, и причем антитело и агент не подвергаются в значительной степени диссоциации при физиологических условиях, так что агент не направлен на ту же раковую клетку, с которой связывается антитело, или так что эффективность агента не уменьшается.
Термин биологический образец охватывает множество типов образцов, которые получают от индивидуума и могут использоваться в исследовании с целью диагностики или контроля. Определение охватывает слюну, кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы тканей, такие как биопсийный образец, или культуры тканей или клетки, происходящие из них, и их потомство, например клетки, полученные из образца ткани, взятого у индивидуума с подозрением на наличие у него рака, в предпочтительных вариантах осуществления ткани яичника, легкого, предстательной железы, поджелудочной железы, ободочной кишки и молочной железы. Определение также включает образцы, которыми манипулировали после их получения любым образом, например посредством обработки реагентами, солюбилизации или обогащения в отношении определенных компонентов, таких как белки или полинуклеотиды, или заделки в полутвердую или твердую матрицу с целью изготовления срезов. Термин биологический образец охватывает клинический образец, а также включает клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы тканей.
Термин клетка-хозяин включает отдельную клетку или культуру клеток, которая может быть или была реципиентом вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и это потомство может необязательно быть полностью идентичным (по морфологии или набору геномных ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или неслучайной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) по этому изобретению.
Как здесь используется, эффективное количество фармацевтической композиции в одном варианте осуществления является количеством, достаточным для обеспечения благотворных или желательных результатов, включающих, но без ограничения, клинические результаты, такие как уменьшение размера или скорости роста опухоли, отсрочка или ослабление воспалительной реакции, улучшение качества жизни тех, кто страдает заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения такого заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства, например, посредством направленной доставки и/или интернализации, отсрочка прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности жизни индивидуумов. Такое эффективное количество может вводиться при одном или более введений. Применительно к целям этого изобретения, эффективным количеством лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции является количество, достаточное для улучшения клинического наблюдаемого состояния.
В некоторых вариантах осуществления эффективного количества лекарственного средства соединения или фармацевтической композиции можно достичь или можно не достичь вместе с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, эффективное количество может рассматриваться в рамках введения одного или более дополнительных средств, и можно считать, что одно средство назначено в эффективном количестве, если, вместе с одним или более других средств, может быть достигнут или достигается желаемый результат. Хотя индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого соединения является частью профессиональных знаний данной области техники. Типичная доза, вводимая пациенту, обычно составляет от 0,0001 до 100 мг/кг веса тела пациента. Предпочтительно вводимая пациенту доза находится между 0,0001 и 20 мг/кг, 0,0001 и 10 мг/кг, 0,0001 и 5 мг/кг, 0,0001 и 2 мг/кг, 0,0001 и 1 мг/кг, 0,0001 и 0,75 мг/кг, 0,0001 и 0,5 мг/кг, 0,0001 и 0,25 мг/кг, 0,0001 и 0,15 мг/кг, 0,0001 и 0,10 мг/кг, 0,001 и 0,5 мг/кг, 0,01 и 0,25 мг/кг или 0,01 и 0,10 мг/кг веса тела пациента. Дозу и частоту введения молекул по настоящему изобретению можно уменьшить или изменить с помощью увеличения поглощения и проникновения в ткани молекул по настоящему изобретению посредством модификаций, таких как, например, липидизация.
Говорят, что молекула нуклеиновой кислоты или агент, антитело, композиция или клетка и т.д., как здесь используется, является выделенной, если эта молекула нуклеиновой кислоты, агент, антитело,
- 10 033677 композиция или клетка и т.д. отделена в значительной степени от примесных молекул нуклеиновых кислот, антител, агентов, композиций или клеток и т.д., которые присутствуют в природе в ее первоначальном источнике.
Термин индивидуум относится к позвоночному животному, предпочтительно млекопитающему. Млекопитающие включают, но без ограничения, людей, сельскохозяйственных животных, животных для спортивных мероприятий, любимых домашних животных, приматов, мышей и крыс. В наиболее предпочтительном варианте осуществления термин индивидуум означает человека.
Термины полипептид, олигопептид, пептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на полимеры из аминокислот любой длины. Полимер может быть неразветвленным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться не аминокислотами. Термины также охватывают полимер из аминокислот, который был модифицирован в природе или в результате вмешательства, например образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с компонентом-меткой. В это определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Понятно, что, поскольку полипептиды по этому изобретению основаны на антителе, могут встречаться полипептиды в виде одиночных цепей или в виде соединенных цепей.
Используемый здесь термин в значительной степени чистый относится к материалу по крайней мере с 50% степенью чистоты (т.е. без примесей), более предпочтительно по крайней мере с 90% степенью чистоты, более предпочтительно по крайней мере с 95% степенью чистоты, более предпочтительно по крайней мере с 98% степенью чистоты, более предпочтительно по крайней мере с 99% степенью чистоты и наиболее предпочтительно с превышающей 99% степенью чистоты.
Используемый здесь термин токсин относится к любому веществу, которое обеспечивает отрицательную реакцию в клетке. Например, токсин, направленный на раковую клетку, будет оказывать отрицательное, иногда вредное воздействие на раковую клетку. Примеры токсинов включают, но без ограничения, таксан, майтансиноид, ауристатин (например, монометилауристатин (ММАЕ), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин Е (АЕ) и т.д.) (например, те, которые описаны в патентах США №№ 5208020, 5416064, 6333410, 6340701, 6372738, 6436931, 6441163, 6596757, 7276497, 7585857 или 7851432), калихеамицин, антрациклин (например, доксорубицин), аналог СС-1065, доцетаксел, катепсин В или Е, рицин, гелонин, Pseudomonas экзотоксин, дифтерийный токсин и РНКазу; меченные радиоактивными изотопами антитела (например, конъюгированные с тиуксетаном или меченные токсичным радиоизотопом (например, 90Y; 13I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac и т.д.)).
Используемый здесь термин лечение означает способ получения благотворного или желаемого результата, в том числе и предпочтительно благотворного или желаемого клинического результата. Такие благотворные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничения, одно или более из следующего: уменьшение воспаления или аутоиммунной реакции, уменьшение пролиферации (или уничтожение) раковых клеток или других нездоровых клеток, уменьшение метастазирования раковых клеток, обнаруживаемого при злокачественных новообразованиях, сокращение размера опухоли, ослабление симптомов, являющихся следствием заболевания, улучшение качества жизни тех, кто страдает этим заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения этого заболевания, отсрочку прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности жизни индивидуумов.
II. Способы создания антител и полипептидов по настоящему изобретению.
Способы создания моноклональных антител известны в данной области техники. Одним способом, который может использоваться, является способ Kohler, G. и др. ((1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256: 495-497) или его модификация. Типично моноклональные антитела создают в не являющихся людьми видах, таких как мыши. Обычно мышь или крысу используют для иммунизации, но могут также использоваться другие животные. Антитела вырабатываются при иммунизации мышей иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат CD3 человека. Иммуногеном могут быть, но без ограничения, эмбриональные клетки, линии культивируемых клеток, раковые клетки, нуклеиновые кислоты или ткань.
В одном варианте осуществления моноклональные антитела, которые связываются с CD3, получают, используя клетки-хозяева, которые сверхэкспрессируют CD3, в качестве иммуногена. Такие клетки включают, в качестве примера, а не ограничения, Т-клетки человека.
Для контролирования образования антител небольшой биологический образец (например, кровь) может быть получен от животного и проверен в отношении титра антител против иммуногена. Селезенка и/или несколько больших лимфатических узлов могут быть извлечены и подвергнуты диссоциации до отдельных клеток. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически присоединенных клеток) посредством внесения клеточной суспензии в планшет или лунку, покрытый(ую) антигеном. В-клетки, экспрессирующие связанный с мембраной иммуноглобулин, специфический в отношении антигена, будут связываться с планшетом и не смываются вместе с осталь- 11 033677 ной частью суспензии. Получаемые в результате В-клетки, или все диссоциированные клетки селезенки, можно затем слить с миеломными клетками (например, X63-Ag8.653 и клетками из Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA). Полиэтиленгликоль (ПЭГ) может использоваться для слияния клеток селезенки или лимфоцитов с миеломными клетками для образования гибридомы. Затем гибридому подвергают культивированию в селективной среде (например, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин среде, по-другому известной как среда HAT). Получающиеся гибридомы затем высевают методом серийных разведений и исследуют в отношении продукции антител, которые специфически связываются с иммуногеном, используя, например, FACS (клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции) или отбор с использованием иммуногистохимического исследования (IHC). Отобранные гибридомы, секретирующие моноклональные антитела, затем культивируют или in vitro (например, в матрасах для культур тканей или половолоконных реакторах), или in vivo (например, в виде асцитических жидкостей у мышей).
В качестве другой альтернативы методу слияния клеток могут использоваться В-клетки, иммортализованные с помощью вируса Эпштейна-Барр (EBV), для продукции моноклональных антител по рассматриваемому изобретению. Гибридомы наращивают и субклонируют, если желательно, и супернатанты исследуют в отношении антииммуногенной активности с помощью обычных процедур исследования (например, FACS, IHC, радиоиммуноанализа, иммуноферментного анализа, флуоресцентного иммуноанализа и т.д.).
В случае другой альтернативы моноклональное антитело против CD3 или любые другие эквивалентные антитела можно секвенировать и продуцировать рекомбинантно с помощью любого способа, известного в данной области техники (например, гуманизации, использования трансгенных мышей для продуцирования полностью человеческих антител, технологии фагового дисплея и т.д.). В одном варианте осуществления моноклональное антитело против CD3 секвенируют, а затем полинуклеотидную последовательность клонируют в вектор для экспрессии или наращивания. Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело, может сохраняться в векторе в клетке-хозяине, и клетку-хозяина можно затем нарастить и заморозить для дальнейшего использования.
Полинуклеотидная последовательность моноклонального антитела против CD3 и любых других эквивалентных антител может использоваться для генетической манипуляции с целью создания гуманизированного антитела, увеличения аффинности или улучшения других характеристик антитела. Общий принцип при гуманизации антитела включает в себя сохранение основной последовательности антигенсвязывающей части антитела, при замене нечеловеческой оставшейся части антитела последовательностями антитела человека. Существуют четыре общих стадии с целью гуманизации моноклонального антитела. Этими стадиями являются: (1) определение нуклеотидной и предсказываемой аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей исходного антитела; (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. решение, какую каркасную область антитела использовать во время процесса гуманизации; (3) методологии/методы фактической гуманизации; и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела; смотрите, например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692 и 6331415.
Был описан ряд молекул гуманизированных антител, включающих антигенсвязывающий сайт, происходящий из нечеловеческого иммуноглобулина, в том числе химерные антитела, содержащие происходящие от грызунов или модифицированные, происходящие от грызунов V-области и связанные с ними определяющие комплементарность участки (CDR), слитые с константными доменами человека (смотрите, например, Winter et al. (1991) Man-made Antibodies, Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol. 138: 4534-4538, и Brown et al. (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res. 47: 3577-3583). В других ссылочных документах описываются происходящие от грызунов CDR, пересаженные в человеческую поддерживающую каркасную область (FR) до слияния с соответствующим константным доменом антитела человека (смотрите, например, Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239: 1534-1536; и Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321: 522525). В другом ссылочном документе описываются происходящие от грызунов CDR, поддерживаемые рекомбинантно венированными каркасными областями, происходящими от грызунов; смотрите, например, публикацию Европейского патента № 519596. Эти гуманизированные молекулы разработаны для минимизации нежелательной иммунологической реакции по отношению к молекулам античеловеческих антител грызунов, которая ограничивает продолжительность и эффективность терапевтических применений этих составляющих у являющихся людьми реципиентов. Другие способы гуманизации антител, которые также могут использоваться, описаны в Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 и в патентах США №№
- 12 033677
6180377,6054297, 5997867 и 5866692.
Настоящим изобретением также охватываются одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv) антител по этому изобретению, такие как мышиный анти-CD3. Одноцепочечные Fv-фрагменты создают посредством связывания вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи, используя короткий пептид-линкер. Bird и др. ((1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242: 423-426) приводят пример пептидов-линкеров, которые образуют перемычку размером приблизительно 3,5 нм между карбоксильным концом одной вариабельной области и аминоконцом другой вариабельной области. Были разработаны и использовались линкеры с другими последовательностями (Bird et al. (1988) Single-Chain AntigenBinding Proteins, Science 242: 423-426). Линкеры могут быть, в свою очередь, модифицированы ради дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или присоединение к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно продуцировать или рекомбинантно, или синтетически. Для синтетического получения scFv может использоваться автоматический синтезатор. Для рекомбинантной продукции scFv подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, который кодирует scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, или эукариотическую, такую как дрожжи, клетки растений, насекомых или млекопитающих, или прокариотическую, такую как Е. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно создать с помощью обычных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Результирующий scFv можно выделить, используя стандартные методы очистки белков, известные в данной области техники.
Настоящее изобретение включает модификации по отношению к антителам против CD3 и их связывающим фрагментам. Модифицирование полипептидов является обычной практической деятельностью в данной области техники, и его подробное описание здесь не требуется. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или более делеций или добавлений аминокислот, которые не приводят в значительной степени к вредным изменениям функциональной активности, или использованием химическим аналогов. Аминокислотные остатки, которые могут быть консервативно заменены один другим, включают, но без ограничения: глицин/аланин; валин/изолейцин/лейцин; аспарагин/глютамин; аспарагиновую кислоту/глютаминовую кислоту; серин/треонин; лизин/аргинин и фенилаланин/тирозин. Эти полипептиды также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование с использованием различных Сахаров, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно, если бы аминокислотные замены были консервативными, т.е. замененная аминокислота обладала бы химическими свойствами, схожими с таковыми исходной аминокислоты. Такие консервативные замены известны в данной области техники, и выше представлены примеры. Аминокислотные модификации могут простираться от изменения или модификации одной или более аминокислот до полной реконструкции области, такой как вариабельная область. Изменения вариабельной области могут привести к изменению аффинности и/или специфичности. Другие способы модифицирования включают использование методов соединения, известных в данной области техники, включающих, но без ограничения, ферментативный способ, окислительное замещение и хелатирование. Модификации могут использоваться, например, для присоединения меток в случае иммуноанализа, например присоединения радиоактивных составляющих в случае радиоиммуноанализа. Модифицированные полипептиды создают, используя процедуры, широко известные в данной области техники, и могут быть подвергнуты скринингу, используя стандартные исследования, известные в данной области техники.
То обстоятельство, что изменение одного аминокислотного остатка в CDR может привести к утрате функционального связывания (Rudikoff, S. etc. (1982) Single Amino Acid Substitution Altering AntigenBinding Specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6): 1979-1983), обеспечивает способ методичной идентификации альтернативных функциональных последовательностей CDR. В одном предпочтительном способе получения таких вариантов CDR полинуклеотид, кодирующий CDR, мутируют (например, посредством неспецифического мутагенеза или метода сайт-специфического мутагенеза (например, амплификации с использованием полимеразной цепной реакции, используя праймеры, которые кодируют мутированный локус)) для получения CDR, содержащего замещенный аминокислотный остаток. Посредством сравнения идентификатора соответствующего остатка в исходной (функциональной) последовательности CDR с идентификатором варианта последовательности CDR с заменой (нефункциональной, можно определить бальную оценку этой замены BLOSUM62.iij. Система BLOSUM обеспечивает матрицу аминокислотных замен, созданную в результате анализа базы данных, касающихся последовательностей, ради надежных совмещений (Eddy, S.R. (2004) Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?, Nature Biotech. 22(8): 1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2264-2268; Altschul, S.F. (1991) Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective, J. Mol. Biol. 219, 555-565). В настоящее время самой развитой базой данных BLOSUM является база данных BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). В табл. 1 представлены бальные оценки замен BLOSUM62.iij (чем выше бальная оценка, тем более консервативной является замена, и соответст
- 13 033677 венно более вероятно, что замена не будет оказывать влияние на функцию).
Если антигенсвязывающий фрагмент, включающий результирующий CDR, не связывается с CD3, то считают, что бальная оценка замены BLOSUM62.iij является недостаточно консервативной, и выбирают и осуществляют новую возможную замену, имеющую более высокую бальную оценку. Таким образом, например, если исходным остатком был глютамат (Е), а нефункциональным замещающим остатком был гистидин (Н), то бальная оценка замены BLOSUM62.iij будет равна 0, и предпочтительными являются более консервативные замены (например, на аспартат, аспарагин, глютамин или лизин).
Таблица 1
A R N D c Q E G H I L к M F P s T w Y v
A /I/ -1 9 9 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 +1 0 -3 -2 0
R -1 /1:: 0 _9 +1 0 _9 0 -3 -2 +2 -1 -3 _9 -1 -1 -3 2 -3
N 2 0 :/061 +1 -3 0 0 0 +1 -3 -3 0 -2 -3 -2 +1 0 -4 -2 -3
D -2 _9 +1 +6 -3 0 +2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3
C 0 -3 +9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 9 -1 -1 9 9 -1
Q -1 +1 0 0 -3 <<+5/ +2 9 0 -3 -2 +1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 9
E -1 0 0 +2 -4 +2 ::1/ _9 0 -3 -3 +1 _9 -3 -1 0 -1 -3 -2 _9
G 0 _9 0 -1 -3 _9 _9 +6 2 -4 -4 _9 -3 -3 -2 0 _9 _9 -3 -3
H -2 0 +1 -1 -3 0 0 9 +8 -3 -3 -1 9 -1 -2 -1 9 9 +2 -3
I -1 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 /Г4/ +2 -3 +1 0 -3 9 -1 -3 -1 +3
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -4 -3 +2 :+4/ _9 +2 0 -3 _9 -1 -2 -1 +1
К -1 +2 0 -1 -3 +1 +1 -2 -1 -3 2 15/ -1 -3 -1 0 -1 -3 2 -2
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -3 _9 +1 +2 -1 0 _9 -1 -1 -1 -1 +1
F -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 +6 -4 +1 +3 -1
P -1 -2 -2 -1 -1 -1 9 -2 -3 -3 -1 9 -4 ::1:: -1 -1 -4 -3 9
s +1 -1 +1 0 -1 0 0 0 -1 _9 -2 0 -1 _9 -1 3-4 +1 -3 2 _9
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 2 -1 -1 -1 -1 _9 -1 +1 +5 2 0
w -3 -3 -4 -4 -2 9 -3 -2 9 9 -3 -1 +1 -4 -3 +11 +2
Y 9 -2 -2 -3 9 -1 _9 -3 +2 -1 -1 -2 -1 +3 -3 +2 +7 -1
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 2 -3 -3 +3 +1 -2 +1 -1 2 2 0 -3 -1 ::+4/:
Таким образом, в настоящем изобретении предусматривается использование неспецифического мутагенеза для идентификации улучшенных CDR. Альтернативно, для увеличения (или уменьшения) аффинности CDR может использоваться технология фагового дисплея. В случае этой технологии, называемой созреванием аффинности, используется мутагенез или прогулка по CDR, а при повторном отборе используется антиген-мишень или его антигенный фрагмент для идентификации антител, содержащих CDR, которые связываются с большей (или меньшей) аффинностью с антигеном, чем исходное или родительское антитело (смотрите, например, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149: 3903). Мутирование целых кодонов, а не отдельных нуклеотидов приводит к получению полуслучайного набора мутаций аминокислот. Можно создать библиотеки, состоящие из совокупности вариантов клонов, каждый из которых отличается изменением одной аминокислоты в одном CDR, и содержащие варианты, отражающие каждую возможную аминокислотную замену для каждого остатка CDR. Мутанты с увеличенной (или уменьшенной) аффинностью к антигену можно отобрать посредством приведения подвергнутых иммобилизации мутантов в контакт с меченым антигеном. Любой способ скрининга, известный в данной области техники, может использоваться для идентификации мутантных антител с увеличенной или уменьшенной аффинностью к антигену (например, ELISA) (смотрите Wu et al. 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95: 6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155: 1994). Можно использовать прогулку по CDR, в случае которой случайный характер придается легкой цепи (смотрите Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263: 551).
Способы осуществления такого созревания аффинности описаны, например, в Krause, J.C. et al. (2011) An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody, MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) AffinityMatured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas, Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes, J. Mol. Biol. 401(1): 84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41, MAbs 1(5): 462-474; Gustchina, E. et al. (2009) Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth, Virology 393(1): 112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions, J. Mol. Biol. 388(3): 541-558; Bostrom, J. et al. (2009) Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development, Methods Mol. Biol. 525: 353-376; Steidl, S. et al. (2008) In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification, Mol. Immunol. 46(1): 135-144 и Barderas, R. et al. (2008) Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26): 9029-9034. В предпочтительном варианте осуществления многолуночные планшеты можно покрыть выбранным антителом против CD3 (например, 100 нг/лунку в карбонатном буфере при комнатной температуре в течение 2 ч) и впоследствии инкубировать с растворимым CD3, добавляемым в разведении 1/10, и инкубировать при комнатной температуре в течение 16 ч, или развести до концентрации 50 нг/мл в PBS-T-BSA (0,05 мл добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре).
- 14 033677
Затем планшет промывают и разведения рекомбинантных антител, начиная с 0,5 мкг/мл в PBS-T-BSA, затем добавляют и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Связывание рекомбинантных антител с захваченным антигеном затем измеряют, используя, например, конъюгат античеловеческий IgG-HRP и субстрат ТМВ. После остановки развития окраски, используя разбавленную серную кислоту, планшет считывают при 450 нм и идентифицируют антитела с большей аффинностью (смотрите, например, патент США № 7351803).
Настоящее изобретение включает полипептиды, включающие аминокислотную последовательность антител по этому изобретению. Полипептиды по этому изобретению можно создать с помощью процедур, известных в данной области техники. Полипептиды можно получить посредством протеолитического или иного расщепления антител, с помощью способов с использованием рекомбинантных молекул (т.е. отдельные или слитые полипептиды), как описано выше, или с помощью химического синтеза. С помощью химического синтеза без труда создают полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды вплоть до приблизительно 50 аминокислот. Способы химического синтеза известны в данной области техники и имеются на рынке. Например, полипептид против CD3 можно было получить с помощью автоматического синтезатора полипептидов, используя твердофазный метод.
Настоящее изобретение также включает слитые белки, включающие один или более фрагментов или районов из полипептидов и антител по этому изобретению. В одном варианте осуществления обеспечивается слитый полипептид, включающий по крайней мере 10 следующих друг за другом аминокислот вариабельной области легкой цепи и по крайней мере 10 аминокислот вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит гетерологичную константную область иммуноглобулина. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи антитела, продуцируемого депонированной с открытым использованием гибридомой. Применительно к целям этого изобретения являющийся антителом слитый белок содержит один или более полипептидных доменов, которые специфически связываются с CD3, и другую аминокислотную последовательность, к которой он не присоединен в природной молекуле, например гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другого района.
Анти-CD3 полипептиды и другие агонисты, антагонисты и модуляторы CD3 можно создать с помощью способов, известных в данной области техники, например синтетически или рекомбинантно. Один способ получения таких молекул включает химический синтез полипептида с последующей обработкой в условиях окисления, подходящих для получения природной конформации, т.е. соответствующих соединений с помощью дисульфидных связей. Это можно осуществить, используя методологии, хорошо известные квалифицированным в данной области техники специалистам (смотрите, например, Kelley, R.F. et al. (1990) In: Genetic engineering principles and methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M. et al. (1984) Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; смотрите также патенты США №№ 4105603, 3972859, 3842067 и 3862925).
Полипептиды по настоящему изобретению можно без труда приготовить, используя твердофазный синтез пептидов (Merrifield, В. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748): 341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1): 3-10).
Тем не менее, в другом варианте полностью человеческие антитела можно получить посредством использования имеющихся в продаже мышей, которые были созданы для экспрессии белков специфических иммуноглобулинов человека. Трансгенных животных, которых создают для вызова более желательного (например, образования полностью человеческих антител) или более сильного иммунного ответа, можно также использовать для выработки гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) и HUMAB-MOUSE(R) и ТС MOUSE™ (обе от Medarex, Inc., Princeton, NJ).
В варианте антитела можно создать рекомбинатно и экспрессировать, используя любой способ, известный в данной области техники. Антитела можно создать рекомбинантно посредством сначала выделения выработанных антител из животных-хозяев, получения последовательности гена и использования последовательности гена для экспрессии антитела рекомбинантно в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другим способом, который может использоваться, является экспрессия последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Подходящие способы экспрессии антител рекомбинантно в растениях или молоке были описаны (смотрите, например, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13: 65-93; и Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231: 147-157). Подходящие способы получения производных антител, например гуманизированных, одноцепочечных и т.д., известны в данной области техники. В другом варианте антитела можно создать рекомбинантно с помощью
- 15 033677 технологии фагового дисплея (смотрите, например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743,
6265150 и Winter, G. et al. (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu. Rev. Immunol.
12: 433-455).
Представляющие интерес антитела или белок можно подвергнуть секвенированию посредством расщепления белков по Эдману, которое хорошо известно квалифицированным в данной области техники специалистам. Информацию о пептидах, полученную от масс-спектрометрии или расщепления белков по Эдману, можно использовать для конструирования зондов или праймеров, которые используются для клонирования представляющего интерес белка.
Альтернативный способ клонирования представляющего интерес белка осуществляют с помощью пэннинга, используя очищенный CD3 или его части для клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело или белок. Процедуру пэннинга можно проводить посредством получения библиотеки кДНК на основе тканей или клеток, которые экспрессируют CD3, сверхэкспрессии кДНК во втором типе клеток и скрининга трансфицированных клеток второго типа клеток в отношении специфического связывания с CD3. Подробные описания способов, используемых при клонировании генов млекопитающих, кодирующих белки клеточной поверхности, с помощью пэннинга, можно найти в данной области техники (смотрите, например, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A HighEfficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 8573-8577 и Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol. 140: 5841-5854).
кДНК, кодирующие антитела против CD3 и другие пептидные агонисты, антагонисты и модуляторы CD3, можно получить посредством обратного транскрибирования мРНК из конкретного типа клеток в соответствии со стандартными способами в данной области техники. В частности, мРНК можно выделить, используя различные литические ферменты или химические растворы в соответствии с процедурами, изложенными, например, в MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), или экстрагировать, используя имеющиеся в продаже связывающие нуклеиновые кислоты смолы, следуя сопроводительным инструкциям, предоставляемым производителями (например, Qiagen, Invitrogen, Promega). Синтезированные кДНК можно затем встроить в экспрессионный вектор для продукции представляющего интерес антитела или белка в клетках второго типа. Предполагается, что экспрессионный вектор должен быть реплицируемым в клетках-хозяевах или в виде эписомы, или в виде интегральной части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессионные векторы включают, но без ограничения, плазмиды, вирусные векторы, в том числе аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и космиды.
Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, можно ввести в клетку-хозяина с помощью любого из ряда соответствующих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию и инфицирование (например, если вектором является инфекционный агент, такой как вирус коровьей оспы). Выбор введения векторов или полинуклеотидов будет часто зависеть от особенностей клетки-хозяина.
Любые клетки-хозяева, способные к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК, можно использовать с целью выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок. Неограничивающие примеры подходящих клеток млекопитающих-хозяев включают, но без ограничения, клетки COS, HeLa и СНО. Предпочтительно, когда клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне, который выше приблизительно в 5 раз, более предпочтительно выше в 10 раз, даже более предпочтительно выше в 20 раз такового соответствующего эндогенного антитела или белка, представляющего интерес, в случае его наличия, в клетках-хозяевах. Скрининг клеток-хозяев в отношении специфического связывания с CD3 осуществляют с помощью иммуноанализа или FACS. Клетку, сверхэкспрессирующую представляющее интерес антитело или белок, можно идентифицировать.
III. Способы скрининга полипептидов и моноклональных антител.
Несколько способов могут использоваться для скрининга полипептидов и моноклональных антител, которые связываются с CD3. Понятно, что связывание относится к биологически или иммунологически соответствующему специфическому связыванию и не относится к неспецифическому связыванию, которое может иметь место, например, при использовании иммуноглобулина в очень высокой концентрации против неспецифической мишени. В одном варианте осуществления моноклональные антитела подвергают скринингу на предмет связывания с CD3, используя стандартные методы скрининга. Таким образом можно получить моноклональное антитело против CD3. Предпочтительными гибридомами по настоящему изобретению являются те, которые продуцируют антитела mAb1 и mAB2, или их химерные или гуманизированные производные. Однако можно идентифицировать дополнительные моноклональные антитела, которые связываются с CD3. С этой целью моноклональные антитела подвергают скринингу на предмет их дифференциальной способности к связыванию с CD3 человека, а также CD3 примата.
Любую из нескольких различных систем детектирования можно использовать для обнаружения связывания антител со срезом ткани. Типично иммуногистохимическое исследование включает связыва- 16 033677 ние первого антитела с тканью, а затем второго антитела, направленного против вида, от которого первое антитело было получено, и конъюгированного с обнаруживаемым маркером (например, пероксидазой хрена (HRP) или диаминобензидином (DAB)). Одним альтернативным способом, который может использоваться, являются поликлональные, являющиеся зеркальным отображением антигенной структуры антитела или polyMICA™ (поликлональные Mirror Image Complementary Antibodies; The Binding Site Limited, Birmingham, UK; Mangham, D.C. et al. (1999) A Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies (MICA), Histopathology 35(2): 129-33). Способ PolyMICA™ может использоваться для проверки связывания первых антител (например, антител против CD3) с нормальной и раковой тканью. В продаже имеется несколько видов наборов для детектирования polyMICA™: продукт № HK004.D является набором для детектирования polyMICA™, в котором используется хромоген DAB; продукт № HK004.A является набором для детектирования polyMICA™, в котором используется хромоген АЕС. Альтернативно, первое антитело можно непосредственно пометить обнаруживаемым маркером.
IV. Способы получения характеристик антител против CD3.
Любой из нескольких способов может использоваться для получения характеристик антител против CD3. Одним способом является идентификация эпитопа, с которым оно связывается. Картирование эпитопов имеется на рынке от различных поставщиков, например Pepscan Systems (Lelystad, Нидерланды). Картирование эпитопов может использоваться для определения последовательности, с которой связывается антитело против CD3. Эпитоп может быть линейным эпитопом, т.е. содержащимся в одном фрагменте аминокислот, или конформационным эпитопом, образованным в результате пространственного взаимодействия аминокислот, которые могут необязательно содержаться в одном фрагменте.
Пептиды различных длин (например, предпочтительно длиной по крайней мере 4-6 аминокислот) можно выделить или синтезировать (например, рекомбинантно) и использовать для анализов связывания с антителом против CD3. Эпитоп, с которым связывается антитело против CD3, можно определить при методичном скрининге, используя перекрывающиеся пептиды, происходящие из экстраклеточной последовательности и определяя связывание антителом против CD3.
Тем не менее, другим способом, который может использоваться для получения характеристик антитела против CD3, является использование анализов конкуренции с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же антигеном, т.е. CD3, для определения того, связываются ли антитела против CD3 с тем же эпитопом, что и другие антитела. Примеры имеющихся в продаже антител против CD3 могут иметься в распоряжении и могут быть идентифицированы, используя анализы связывания, изложенные здесь. Анализы конкуренции хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам, и такие процедуры и пояснительные данные детализированы далее в разделе Примеры. Антитела против CD3 можно, кроме того, охарактеризовать в соответствии с тканями, типом рака или типом опухоли, с которым они связываются.
V. Предпочтительные композиции по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением охватываются композиции, в том числе фармацевтические композиции, включающие антитела против CD3, полипептиды, происходящие из антител против CD3, полинуклеотиды, включающие последовательность, кодирующую антитела против CD3, и другие агенты, описываемые здесь. В настоящем изобретении, кроме того, предусматриваются конъюгаты любого пептидного агониста, антагониста или модулятора CD3 и дополнительных химических структур, которые реализуют предполагаемую функцию или функции конкретного пептидного агониста, антагониста или модулятора CD3. Эти конъюгаты включают пептидный агонист, антагонист или модулятор CD3, ковалентно связанный с макромолекулой, такой как любая нерастворимая, являющаяся твердой подложкой матрица, используемая в способах диагностирования, скрининга или очистки, обсуждаемых здесь. Подходящие материалы матрицы включают любое вещество, которое является химически инертным, характеризуется высокой степенью пористости и имеет большое число функциональных групп, способных к образованию ковалентных связей с пептидными лигандами. Примеры материалов матриц и способов приготовления конъюгатов матрица-лиганд приведены в Dean et al. (Eds) AFFINITY CHROMATOGRAPHY: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1985); Lowe, An Introduction to Affinity Chromatography, in Work et al. (eds) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 7, Part II, NorthHolland (1979); Porath et al., Biospecific Affinity Chromatography, in Neurath, H. et al. (eds), THE PROTEINS, 3rd ed., Vol. 1, p. 95-178 (1975) и Schott, H. AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Macel Dekker, Inc. NY (1984).
Здесь также обеспечиваются конъюгаты пептидного агониста, антагониста или модулятора CD3 и любой репортерной составляющей, используемой в диагностических процедурах, описываемых здесь. Являющиеся пептидными агонистами, антагонистами или модуляторами CD3 агенты, полипептиды и белки по этому изобретению, в том числе антитела против CD3, кроме того, идентифицируют и характеризуют в соответствии с любым (одним или более) из следующих критериев:
(1) способность к специфическому связыванию с CD3 человека, который эндогенно представлен на поверхности нормальной Т-клетки человека;
- 17 033677 (2) способность к специфическому связыванию с CD3 человека, который эндогенно представлен на поверхности лейкозной Т-клетки человека;
(3) способность к специфическому связыванию с CD3, не являющимся человеческим (например, CD3 яванского макака), который эндогенно представлен на поверхности нормальной нечеловеческой Тклетки;
(4) способность к специфическому связыванию с CD3, не являющимся человеческим, который эндогенно представлен на поверхности нечеловеческой лейкозной Т-клетки;
(5) способность нейтрализовать (т.е. блокировать или препятствовать связыванию) образование комплекса с CD3; способность нейтрализовать образование комплекса с TCR;
(6) способность к модулированию (или антагонистически, или агонистически) передачи сигнала TCR-комплексом;
(7) способность к связыванию с Fc-рецептором;
(8) способность к конкурентному ингибированию предпочтительного связывания известного антитела против CD3 с CD3, включая способность к предпочтительному связыванию с тем же эпитопом CD3, с которым предпочтительно связывается исходное антитело;
(9) способность к связыванию с частью CD3, которая представлена на поверхности живой клетки in vitro или in vivo; способностью к связыванию с частью CD3, которая представлена на поверхности живой раковой клетки;
(10) способность к доставке химиотерапевтического средства в раковую Т-клетку и/или (11) способность к доставке терапевтического средства, токсина или выявляемого маркера в Тклетку.
Предпочтительное антитело по настоящему изобретению будет демонстрировать дифференциальное IHC окрашивание опухолевой ткани по отношению к нормальной, нераковой ткани и будет, кроме того, способно к проверке в моделях на примате (и особенно яванском макаке) эффективности антитела. Предпочтительные антитела по настоящему изобретению будут, кроме того, проявлять желаемые уровни аффинности и антигенной специфичности. Предпочтительные антитела по настоящему изобретению будут, кроме того, проявлять желаемые уровни иммуномодулирующей активности и интернализации в клетки.
В некоторых вариантах осуществления антителом по настоящему изобретению является антитело, которое продуцирует гибридома mAB2, которая экспрессирует мышиное антитело mAB2, или ее потомство. Настоящим изобретением также охватываются различные препараты антител, продуцируемых этими гибридомами, и эквивалентные антитела или полипептидные фрагменты (например, Fab, Fab', F(ab')2Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, одиночная цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, гуманизированные антитела и любая другая модифицированная конфигурация любого из этих или эквивалентных антител, которая включает сайт распознавания антигена (CD3) требуемой специфичности. Настоящим изобретением также обеспечиваются антитела человека, демонстрирующие одну или более из биологических характеристик члена анти-CD3 семейства. Эквивалентные антитела анти-CD3 семейства (в том числе гуманизированные антитела и антитела человека), полипептидные фрагменты и полипептиды, включающие любой из этих фрагментов, идентифицируют и характеризуют в соответствии с любым (одним или более) из описанных выше критериев.
Предпочтительными антителами против CD3 по настоящему изобретению является mAB2 и их гуманизированные или химерные производные и антигенсвязывающие фрагменты, которые реагируют с молекулой CD3 человека и яванского макака. Ниже представлены аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи мышиных антител mAb1 и mAB2 и кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Последовательности CDR приводимых в качестве примера антител (mAb1 и mAB2) начертаны полужирно и подчеркнуты.
А. Последовательности вариабельных областей мышиного моноклонального антитела mAb1.
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела mAb1 (SEQ ID NO: 1):
QWLTQSPAI MSAFPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDS SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMETE DAATYYCQQW SRNPPTFGGG TKLQITR
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела mAb1 (SEQ ID NO: 2):
caggtggtgc tgacccagtc ccccgccatc atgtccgcct tccccggcga gaaagtgaca atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaagtccggc acctccccca agcggtggat ctacgactcc tccaagctgg cctccggcgt gcccgccaga ttctctggct ccggctccgg caccagctac tccctgacca tctcctccat ggaaaccgag gacgccgcca cctactactg ccagcagtgg tcccggaacc cccctacctt cggcggaggc accaagctgc agatcaccag a
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb1 (SEQ ID NO: 3):
- 18 033677
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RSTMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSSAYTNY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCASPQ VHYDYNGFPY WGQGTLVTVS S
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb1 (SEQ ID NO: 4):
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctggccagac ctggcgcctc cgtgaagatg tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc cggtccacca tgcactgggt gaaacagcgg cctggacagg gcctggaatg gatcggctac atcaacccct ccagcgccta caccaactac aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accgccgaca agtcctccag caccgcctac atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc ctccccccag gtgcactacg actacaacgg cttcccctac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc tcc
B. Последовательности вариабельных областей мышиного моноклонального антитела mAb2
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 5):
QAVVTQESAL TTSPGETVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQE KPDHLFTGLI GGTNKRAPGV PARFSGSLIG DKAALTITGA QTEDEAIYFC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 6):
caggccgtgg tgacacagga gtcagctctg accacatccc caggcgaaac agtgactctg acctgcagat ccagcactgg agcagtgact acctctaact acgctaattg ggtgcaggag aagcccgacc acctgttcac tgggctgatc ggcggaacca acaaaagggc acccggtgtg cctgcccggt tttctggcag tctgatcgga gacaaggccg ctctgacaat tactggcgcc cagacagagg atgaagctat ttacttctgt gcactgtggt atagcaatct gtgggtgttt gggggtggca ccaaactgac agtgctggga
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 7):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTl· VTVSA
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 8):
gaggtgaagc tgctggaaag cggcggagga ctggtgcagc caaagggatc actgaaactg tcctgcgccg cctccggctt cacctttaac acatacgcta tgaattgggt gcgacaggca cctggcaagg gcctggagtg ggtggcaagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actctgtgaa ggatagattc acaatcagtc gcgacgattc ccagagcatt ctgtatctgc agatgaacaa tctgaaaact gaagacaccg ccatgtacta ttgtgtgcgg cacggtaact tcggcaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggaca ggggacactg gtgactgtgt cttcc
Положение 40 тяжелой цепи является положением якорного остатка связывающего пептида с высокой аффинностью класса II MHC. Положения 44, 48, 54, 94, 99 и 108 тяжелой цепи являются положениями якорных остатков связывающего пептида со средней аффинностью класса II MHC. Положение 69 легкой цепи является положением якорного остатка связывающего пептида с высокой аффинностью класса II MHC. Положение 59 легкой цепи является положением якорного остатка связывающего пептида со средней аффинностью класса II MHC. Эти остатки можно заменить, используя стандартные методы молекулярной биологии, на какой-либо остаток для ослабления или исключения сайта распознавания MHC класса II.
C. Антитела против CD3 со сконструированным Fc.
При обычном функционировании иммунной системы взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит к широкому ряду реакций, распространяющихся от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как пролиферация регулирующих лимфоцитов и секреция антител. Любые из этих взаимодействий инициируются благодаря связыванию Fc-домена антител или иммунных комплексов со специализированными рецепторами клеточной поверхности гемопоэтических клеток. Разнообразие клеточных реакций, запускаемых антителами и иммунными комплексами, является следствием структурной гетерогенности трех Fc-рецепторов: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. успокаивающим иммунную систему) рецептором. Аминокислотная последовательность Fc-области IgG1 представлена ниже (как SEQ ID NO: 9, с нумерацией в соответствии с Kabat и др. (SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991), который включен в настоящее описание в словесной форме посредством ссылки, ниже называемой Kabat EU). Остатки 230-341 являются CH2-областью Fc. Остатки 342-447 являются CH3-областью Fc.
- 19 033677
PAPELLGGPS 230 VFLFPPKPKD 240 TLMISRTPEV 250 TCVWDVSHE 260 DPEVKFNWYV 270
DGVEVHNAKT 280 KPREEQYNST 290 YRVVSVLTVL 300 HQDWLNGKEY 310 KCKVSNKALP 320
APIEKTISKA 330 KGQPREPQVY 340 TLPPSREEMT 350 KNQVSLTCLV 360 KGFYPSDIAV 370
EWESNGQPEN 380 NYKTTPPVLD 390 SDGSFFLYSK 400 LTVDKSRWQQ 410 GNVFSCSVMH 420
EALHNHYTQK SLSLSPGK 430 440
Поскольку не связывающиеся с Fc-рецептором (FcR) СП3-специфические антитела являются в минимальной степени истощающими, было выдвинуто предположение, что они могут изменять сигналы от TCR так, что могла бы индуцироваться иммунологическая толерантность (St. Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657). Таким образом, такая терапия имеет потенциальное применение при лечении аутоиммунного заболевания и отторжения вследствие реакции хозяин против трансплантата. Не связывающиеся с FcR CD3-специфические антитела, как также было постулировано, индуцируют толерантность в виде ремиссии сахарного диабета типа 1 (St. Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657; Masharani, U.B. et al. (2010) Teplizumab Therapy For Type 1 Diabetes, Expert Opin. Biol. Ther. 10(3): 459-465).
Таким образом, настоящее изобретение включает специфически связывающиеся с CD3 антитела, которые включают вариант Fc-области, имеющие Fc-области, которые модифицированы (например, содержат замены, делеции, вставки в одной или более частей), чтобы быть неспособными или менее способными к связыванию с Fc-рецептором (по сравнению с антителом, содержащим те же CDR, но Fcобласть дикого типа).
В одном варианте осуществления такие антитела будут неспособны к связыванию с любым Fcрецептором. Альтернативно, Fc-область антитела будет модифицирована так, чтобы дать ей возможность связываться с такими Fc-рецепторами, как FcyRIIB, которые являются ингибиторными, но не с такими Fc-рецепторами, как FcyRIIA, FcyRIIIA или FcyRIIIB, которые стимулируют активацию иммунной системы.
Предпочтительно способности к связыванию молекул по настоящему изобретению определяют с помощью in vitro функциональных анализов для определения одной или более FcyR-опосредуемых функций клеток-эффекторов. Аффинности и способности к связыванию молекул, например антител, по настоящему изобретению к (с) FcyR можно определить, используя in vitro анализы (биохимические или иммунологические анализы), известные в данной области техники для определения взаимодействий антитело-антиген или Fc-FcyR, т.е. специфического связывания антигена с антителом или специфического связывания Fc-области с FcyR соответственно, включающие, но без ограничения, анализ ELISA, анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса, анализ методом иммунопреципитации. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления молекулы по настоящему изобретению обладают способностями к связыванию в in vivo моделях (таких как те, которые описаны и раскрыты здесь), схожими с таковыми в in vitro анализах. Однако настоящее изобретение не исключает молекулы по настоящему изобретению, которые не демонстрируют желаемый фенотип в in vitro анализах, но демонстрируют желаемый фенотип in vivo.
В некоторых вариантах осуществления молекулы по настоящему изобретению, включающие вариант Fc-области, включают по крайней мере одну модификацию аминокислоты (например, имея 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот) в CH3-домене Fc-области, который определяют как домен, расположенный от аминокислоты 342 до аминокислоты 447. В других вариантах осуществления молекулы по настоящему изобретению, включающие вариант Fc-области, включают по крайней мере одну модификацию аминокислоты (например, имея 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот) в CH2-домене Fc-области, который определяют как домен, расположенный от аминокислоты 231 до аминокислоты 341. В некоторых вариантах осуществления молекулы по настоящему изобретению включают по крайней мере две модификации аминокислот (например, имея 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификаций аминокислот), причем по крайней мере одна такая модификация находится в CH3области, и по крайней мере одна такая модификация находится в CH2-области. Настоящим изобретением, кроме того, охватывается модификация аминокислоты в шарнирной области. В отдельном варианте осуществления настоящим изобретением охватывается модификация аминокислоты в CH1-домене Fcобласти, который определяют как домен, расположенный от аминокислоты 216 до аминокислоты 230.
В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящим изобретением охватываются молекулы, включающие вариант Fc-области, причем указанный вариант придает им уменьшенную ADCC активность и/или уменьшенное связывание с FcyRIIA (CD32A) или обладает ими, как определено, используя способы, известные квалифицированному в данной области техники специалисту и приведенные здесь в качестве примера. Анализы ADCC, используемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть NK-зависимыми или макрофагозависимыми.
- 20 033677
В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящим изобретением охватываются молекулы, включающие вариант Fc-области, причем указанный вариант придает им уменьшенную ADCC активность и/или уменьшенное связывание с FcyRIIIA (CD16A) или обладает ими, как определено, используя способы, известные квалифицированному в данной области техники специалисту и приведенные здесь в качестве примера. Анализы ADCC, используемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть NK-зависимыми или макрофагозависимыми.
Варианты Fc по настоящему изобретению могут быть в комбинации с другими модификациями Fc, такие как те, которые описаны в патентах США №№ 7632497, 7521542, 7425619, 7416727, 7371826, 7355008, 7335742, 7332581, 7183387, 7122637 и 6737056; в публикациях PCT-заявок с № WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269 и WO 04/063351 и в Presta, L.G. et al. (2002) Engineering therapeutic antibodies for improved function, Biochem. Soc. Trans. 30(4): 487-490; Shields, R.L. et al. (2002) Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcgammaRIII and antibody-dependent cellular toxicity, J. Biol. Chem. 26; 277(30): 26733-26740, и Shields, R.L. et al. (2001) High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604). Настоящим изобретением охватывается комбинация варианта Fc по настоящему изобретению с другими модификациями Fc для придания модифицированному антителу аддитивных, синергетических или новых свойств.
В других вариантах осуществления настоящим изобретением охватывается использование любого варианта Fc, известного в данной области техники, такого как те, которые описаны в Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, Immunol. Lett. 82: 57-65; Presta, L.G. et al. (2002) Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, Biochem. Soc. Trans. 30: 48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement, J. Immunol. 166: 2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc, J. Immunol. 164: 4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4, J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, Eur. J. Immunol. 29: 2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) Modulation Of Fc (Gamma) R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, J. Immunol. 157: 4963-4969; Hutchins et al. (1995) Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors, FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) A Non-Activating Humanized Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo, Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII, Mol. Immunol. 29: 53-59; Lund et al. (1991) Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, J. Immunol. 147: 2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, Nature 332: 563-564; в патентах США №№ 5624821, 5885573, 6194551, 7276586 и 7317091; и публикациях PCTзаявок с № WO 00/42072 и WO 99/58572.
В некоторых вариантах осуществления антитело настоящего изобретения включает вариант Fcобласти (в том числе Fc, происходящую из любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса иммуноглобулинов человека), причем указанный вариант Fc-области включает по крайней мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с Fc-областью дикого типа, который (вариант Fc-области) демонстрирует уменьшенное или аннулированное связывание с одним или более лигандов-эффекторов, как определено с помощью стандартных исследований, известных в данной области техники и описанных здесь, относительно сравнимой молекулы, включающей Fc-область дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант Fcдомена антитела по настоящему изобретению включает модификацию аминокислоты (т.е. вставку, замену, делецию) в одном или более из положений остатков 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 270, 297, 298, 299. В конкретном варианте осуществления одной или более модификаций аминокислот, которые уменьшают или аннулируют связывание с одним или более лигандов-эффекторов, является замена фенилаланином или пролином в положении 233; замена аланином в положении 234; замена аланином или глютаминовой кислотой в положении 235; замена аланином в положении 236, замена аланином в положении 237, замена аргинином в положении 238; замена аланином или глютаминовой кислотой в положе
- 21 033677 нии 265; замена аланином или аспарагином в положении 270; замена аланином или глютамином в положении 297; замена фенилаланином, аспарагином или пролином в положении 298; замена любой аминокислотой, отличной от серина или треонина, в положении 299 или комбинация из двух или более вышеперечисленных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc-домен, содержащий замену аланином в положении 265 и в положении 297; замену аланином в положении 265 и глютамином в положении 297; замену глютаминовой кислотой в положении 265 и аланином в положении 297; или замену глютаминовой кислотой в положении 265 и глютамином в положении 297. В предпочтительных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc-домен, содержащий модификацию (например, замену, вставку, делецию) в положении 234 и в положении 235 Fc-области. В конкретном примере в соответствии с этим вариантом осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc-домен, содержащий замену аланином в положении 234 и замену глютаминовой кислотой в положении 235. Тем не менее, в более предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc, содержащий замену аланином в положении 234 и замену аланином в положении 235.
В других вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает вариант Fcобласти, который демонстрирует уменьшенное или аннулированное связывание с одним или более лигандами-эффекторами, как определено с помощью стандартных исследований, известных в данной области техники и описанных здесь, относительно сравнимой контрольной молекулы. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению имеет Fc-область, демонстрирующую уменьшенное или аннулированное связывание с одним или более лигандами-эффекторами, которая включает фенилаланин или пролин в положении 233; аланин в положении 234; аланин или глютаминовую кислоту в положении 235; аланин в положении 236, аланин в положении 237, аргинин в положении 238; аланин или глютаминовую кислоту в положении 265; аланин или аспарагин в положении 270; аланин или глютамин в положении 297; фенилаланин, аспарагин или пролин в положении 298; любую аминокислоту, отличную от серина или треонина, в положении 299 или комбинацию из двух или более вышеперечисленных замен. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc-домен, содержащий аланин в положении 265 и в положении 297; аланин в положении 265 и глютамин в положении 297; глютаминовую кислоту в положении 265 и аланин в положении 297; или глютаминовую кислоту в положении 265 и глютамин в положении 297. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc-домен, содержащий аланин в положении 234 и глютаминовую кислоту в положении 235. В предпочтительных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению включает Fc, содержащий аланин в положении 234 и аланин в положении 235.
Антитела по настоящему изобретению, которые включают Fc-домен, содержащий аланин в положениях, соответствующих 234 и 235 согласно системе нумерации по Kabat, известны как ala-ala антитела. В некоторых вариантах осуществления использование ala-ala Fc-доменов и/или других комбинаций из комбинаций аминокислот, описываемых здесь (в том числе комбинаций, включающих ala-ala Fc-домены), может аннулировать связывание Fc-домена со всеми FcyR. Связывание Fc-домена с одним или более FcyR можно определить с помощью любого способа, описанного здесь и/или известного в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления одна или более модификаций аминокислот, которые аннулируют связывание со всеми FcyR или уменьшают или аннулируют связывание с одним или более лигандами-эффекторами, включают комбинации модификаций, перечисленные здесь, или комбинации модификаций, перечисленные здесь, с любой из тех, которые могут обеспечить связывание нулевого порядка с любым FcR (например, FcyRIIIA, FcyRIIIB, FcyRIIA), как определено с помощью способов, описанных здесь или известных квалифицированному в данной области техники специалисту. Как это будет без труда понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, такие антитела по настоящему изобретению могут найти конкретное применение при лечении аутоиммунного заболевания, в случае которого антитела против CD3 и антигенсвязывающие фрагменты служат для модулирования функции иммунной системы без связанной реакции на первую дозу, характерной для антител против иммуноцитов.
В некоторых вариантах осуществления антитела против CD3 и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются уменьшенным (например, но без ограничения, меньше 50, меньше 40, меньше 30, меньше 20, меньше 10, меньше 5 или меньше 1% по сравнению со связыванием белком, включающим контрольный Fc-домен) или более предпочтительно не обнаруживаемым связыванием с одним или более из любых FcyR (например, FcyRI, FcyRII или FcyRIII) благодаря своему Fc-домену, как определено с помощью обычных в данной области техники анализов. Дополнительно или альтернативно, антитела против CD3 и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, могут характеризоваться уменьшенным (например, но без ограничения, меньше 50, меньше 40, меньше 30, меньше 20, меньше 10, меньше 5 или меньше 1% по сравнению со связыванием контрольным белком, включающим контрольный Fc-домен) или более предпочтительно не обнаруживаемым связыванием с любыми рецеп- 22 033677 торами комплемента, такими как C1q, как определено в обычно используемых анализах. В отдельных вариантах осуществления антитело является негликозилированным. В других вариантах осуществления в антителе отсутствует Fc-домен (например, оно представляет собой Fab-фрагмент, F(ab')2 или одноцепочечное антитело).
Таким образом, антитела по настоящему изобретению являются, в частности, полезными, поскольку они характеризуются уменьшенной in vivo токсичностью, причиной которой является продукция лимфокинов или выброс цитокинов, или ее отсутствием. Способы определения продукции лимфокинов и выброса цитокинов известны и являются обычными в данной области техники и включены в настоящее описание. Например, выброс цитокинов можно определить посредством измерения секреции цитокинов, включающих, но без ограничения, интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-16 (IL-16), PDGF, TGF-α, TGF-β, TNF-α, TNF-β, GCSF, GM-CSF, MCSF, IFN-α, IFN-β, TFN-γ, IGF-I, IGF-II. Например, смотрите Isaacs et al., 2001, Rheumatology, 40: 724738; Soubrane et al., 1993, Blood, 81(1): 15-19; все из которых включены сюда посредством ссылки в их полном объеме.
D. CD3-специфические диатела DART™.
Как обсуждалось выше, настоящим изобретением, кроме того, охватываются биспецифические, триспецифические и полиспецифические антитела. Особенно предпочтительный пример таких антител включает молекулы диател DART™, которые включают по крайней мере две полипептидные цепи, которые образуют по крайней мере два эпитопсвязывающих сайта, по крайней мере один из которых специфически связывается с CD3. Приводимые в качестве примера молекулы диател DART™ представлены в US20100174053, US20090060910, US20070004909, EP2158221, EP1868650, WO2010080538, WO2008157379 и WO2006113665.
В предпочтительных вариантах осуществления первая полипептидная цепь диатела DART™ включает:
(i) домен (А), включающий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфическую в отношении эпитопа (1);
(ii) домен (В), включающий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфическую в отношении эпитопа (2); и (iii) домен (С);
вторая полипептидная цепь диатела DART™ включает:
(i) домен (D), включающий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфическую в отношении эпитопа (2);
(ii) домен (Е), включающий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфическую в отношении эпитопа (1); и (iii) домен (F).
Домены (А) и (В) диатела DART™ не ассоциируются друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта. Так же домены (D) и (Е) диатела DART™ не ассоциируются друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта. Точнее, домены (А) и (Е) диатела DART™ ассоциируются с образованием связывающего сайта, который связывает эпитоп (1); указанные домены (В) и (D) диатела DART™ ассоциируются с образованием связывающего сайта, который связывает указанный эпитоп (2). Домены (С) и (F) ковалентно связаны вместе.
Каждая полипептидная цепь молекулы диатела DART™ включает VL-домен и VH-домен, которые ковалентно связаны, так что самосборка доменов затруднена. Взаимодействие двух из полипептидных цепей будет приводить к двум спариваниям VL-VH, образуя два эпитопсвязывающих сайта, т.е. двухвалентную молекулу. Ни VH-домен, ни VL-домен не ограничивается каким-либо положением в полипептидной цепи, т.е. не ограничивается амино (N) концом или карбоксильным (С) концом, также домены не ограничиваются их положениями относительно друг друга, т.е. VL-домен может быть N-концевым по отношению к VH-домену и наоборот. Единственным ограничением является то, чтобы в распоряжении имелась комплементарная полипептидная цепь для образования функциональных диател DART™ . Если VL- и VH-домены происходят из одного и того же антитела, две комплементарных полипептидных цепи могут быть идентичными. Например, если связывающие домены происходят из антитела, специфического в отношении эпитопа А (т.е. связывающий домен образован исходя из взаимодействия VLA-VHA), каждый полипептид будет включать VHA и VLA. Гомодимеризация двух полипептидных цепей антитела будет приводить к образованию двух связывающих сайтов VLA-VHA, приводя к двухвалентному моноспецифическому антителу. Если VL- и VH-домены происходят из антител, специфических в отношении различных антигенов, для образования функционального биспецифического диатела DART™ требуется взаимодействие двух различных полипептидных цепей, т.е. образование гетеродимера. Например, в случае биспецифического диатела DART™ одна полипептидная цепь будет включать VLA и VLB; гомодимеризация указанной цепи будет приводить к образованию двух связывающих сайтов VLA-VHB, или не связывающих, или непредсказуемо связывающих. В отличие от этого, если две отличающиеся полипептидные цепи могут взаимодействовать, например, в рекомбинантной экспрессионной системе, одна, вклю- 23 033677 чающая VLA и VHB, а другая, включающая VLB и VHA, будут образовываться два отличающихся связывающих сайта: VLA-VHA и VLB-VHB. В случае всех пар полипептидных цепей диател DART™ существует вероятность неправильного совмещения или неправильного связывания двух цепей, т.е. взаимодействие доменов VL-VL или VH-VH; однако легко осуществить очистку функциональных антител на основе иммуноспецифичности правильно димеризованных связывающих сайтов, используя любой аффинный способ, известный в данной области техники или приведенный здесь в качестве примера, например аффинную хроматографию.
Одна или более из полипептидных цепей диатела DART™ может необязательно включать Fc-домен или его часть (например, ОИТ-домен или ОИЗ-домен). Fc-домен или его часть может происходить из любого изотипа или аллотипа иммуноглобулинов, в том числе, но без ограничения, IgA, IgD, IgG, IgE и IgM. В предпочтительных вариантах осуществления Fc-домен (или его часть) происходит из IgG. В конкретных вариантах осуществления изотипом IgG является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или его аллотип. В одном варианте осуществления молекула диатела включает Fc-домен, включающий СП2-домен и CH3домен, которые независимо выбирают из любого изотипа иммуноглобулинов (т.е. Fc-домен, включающий СП2-домен, происходящий из IgG, и СПЗ-домен, происходящий из IgE, или СП2-домен, происходящий из IgG1, и СВЗ-домен, происходящий из IgG2, и т.д.). Fc-домен можно спроектировать в полипептидной цепи, включающей молекулу диатела по настоящему изобретению, в любом положении относительно других доменов или частей указанной полипептидной цепи (например, Fc-домен, или его часть, может быть С-концевым по отношению к обоим VL- и VH-доменам полипептидной цепи; может быть Nконцевым по отношению к обоим VL- и VH-доменам; или может быть N-концевым по отношению к одному домену и С-концевым по отношению к другому (т.е. находиться между двумя доменами полипептидной цепи)).
Fc-домены в полипептидных цепях молекул диател DART™ предпочтительно подвергаются димеризации, приводящей к образованию молекулы DART™, которая демонстрирует свойства, подобные таковым иммуноглобулинов, например взаимодействия Fc-Fcy. Fc-включающие диатела могут быть димерами, например, состоящими из двух полипептидных цепей, каждая из которых включает VH-домен, VL-домен и Fc-домен. Димеризация указанных полипептидных цепей приводит к образованию двухвалентного диатела DART™, включающего Fc-домен, хоть и со структурой, отличной от таковой не модифицированного двухвалентного антитела. Такие молекулы диател DART™ будут проявлять измененные фенотипы по сравнению с иммуноглобулином дикого типа, например измененный полупериод существования в сыворотке, способности к связыванию и т.д. В других вариантах осуществления молекулы диател DART™, включающие Fc-домены, могут быть тетрамерами. Такие тетрамеры включают две более тяжелые полипептидные цепи, т.е. полипептидную цепь, включающую VL, VH и Fc-домен, и две более легкие полипептидные цепи, т.е. полипептидную цепь, включающую VL и VH. Более легкие и более тяжелые цепи взаимодействуют с образованием мономера, и указанные мономеры взаимодействуют благодаря их неспаренным Fc-доменам с образованием Ig-подобной молекулы. Такое Ig-подобное диатело DART™ является четырехвалентным и может быть моноспецифическим, биспецифическим или тетраспецифическим.
VI. Терапевтические способы применения антител против CD3 по настоящему изобретению.
Антитела против CD3 по настоящему изобретению и их антигенсвязывающие фрагменты, в частности, применимы для лечения злокачественных новообразований, связанных с экспрессией CD3, и для лечения аутоиммунного заболевания и других воспалительных нарушений.
Эти применения могут приводить к образованию комплекса между CD3 и антителом, которое специфически связывается с CD3. Примеры таких антител включают, но без ограничения, моноклональные антитела против CD3 mAbl и mAB2 или, более предпочтительно их гуманизированные производные. Образование такого комплекса может происходить in vitro или in vivo. Без ограничения этой теорией, антитело против CD3 может связываться с CD3 благодаря экстраклеточному домену CD3 и может затем подвергаться интернализации в живую нормальную или раковую клетку.
А. Лечение рака.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с CD3, присутствующим на поверхности Т-клеток. Антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут использоваться в случае биспецифической (или триспецифической, или полиспецифической) молекулы, такой как молекула DART или BiTE, для перенаправления Т-клеток на опухолевую клетку. Тклетка может затем уничтожать опухолевую клетку. Биспецифические (или триспецифические, или полиспецифические) молекулы по настоящему изобретению способны к связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком (например, яванского макака), а также со вторым (или дополнительным) и отличным антигеном(ами) и эпитопом(ами). Вторым антигеном или эпитопом предпочтительно является опухолеспецифический антиген, представленный на опухолевой клетке. Такие опухолевые клетки могут быть из злокачественных новообразований, например рака молочной железы, рака предстательной железы, рака желудка, рака легкого, рака ободочной кишки, рака прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака ротовой полости, рака глотки, рака
- 24 033677 пищевода, рака гортани, рака кости, рака кожи, меланомы, рака матки, рака яичек, рака мочевого пузыря, рака почки, рака головного мозга, глиобластомы, рака щитовидной железы, лимфомы, миеломы и лейкоза. Такими дополнительными антигенами или эпитопами предпочтительно являются опухолеспецифические антигены или эпитопы на клеточной поверхности (такие как 17-1А, A33, основной антиген I эндодермального происхождения на эритроцитах взрослого человека, альфа-фетопротеин, антиген оболочки РНК-вируса опухоли, онкоэмбриональный антиген, специфический для опухоли мочевого пузыря, В7Н1, В7-Н2, В7-И3, В7-Н4, В7-Н5, В7-Н6, специфический для лимфомы Беркитта антиген-38.13, СА125, CD18, CD19, специфический для В-клеточной лимфомы человека антиген-CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, СЕА, СО17-1А, СТА-1, CTLA-4, рецептор эпидермального фактора роста, Ep-CAM, EphA2, антиген I на эритроцитах новорожденного, антиген фибросаркомы, ганглиозид GD2, ганглиозид GD3, ганглиозид GM2, ганглиозид GM3, GICA 19-9, gp IIIb/IIIa, gp72, HER1, HER-2/neu, HER3, HER4, специфический для меланомы антиген с большой молекулярной массой, антиген HLA-DR, специфический для лейкоза человека Т-клеточный антиген-Gp37, специфический для карциномы легкого человека антиген L20, специфический для карциномы легкого человека антиген L6, антиген в виде глобулярной частицы молочного жира человека, IgE, специфический для карциномы KS 1/4 pan антиген, LEA, специфический для аденокарциномы антиген F3, специфический для злокачественных лимфоцитов человека антигенАРО-1, специфический для меланомы антиген gp75, связанный с меланомой антиген р97, неогликопротеин, nuC242, специфический для полиморфного эпителия антиген муцинового типа, специфический для предстательной железы антиген, специфический для предстательной железы мембранный антиген, специфический для предстательной железы кислый фосфат, антиген SK-1, TAG-72, Т-антиген, опухолеспецифический антиген СА125, опухолеспецифический антиген MUC1, опухолеспецифический трансплантационный антиген клеточной поверхности, фактор роста сосудистого эндотелия, рецептор фактора роста сосудистого эндотелия и αγβ3). Альтернативно, такие дополнительные антигены или эпитопы могут быть связаны с патогеном (таким как: вирус гепатита типа А, вирус гепатита типа В, вирус гепатита типа С, вирус гриппа, вирус ветряной оспы, аденовирус, вирус простого герпеса типа I (HSV-I), вирус простого герпеса типа II (HSV-II), возбудитель чумы рогатого скота, риновирус, ЕСНО-вирус, ротавирус, респираторно-синцитиальный вирус, папилломавирус, паповавирус, цитомегаловирус, эхиновирус, арбовирус, хантавирус, коксаки-вирус, вирус эпидемического паротита, вирус кори, вирус краснухи, полиовирус, возбудитель натуральной оспы, вирус Эпштейна-Барра, вирус иммунодефицита человека типа I (HIV-I), вирус иммунодефицита человека типа II (HIV-II), возбудитель вирусного менингита, возбудитель вирусного энцефалита, возбудитель денге, возбудитель натуральной оспы; микобактерии, рикеттсии, микоплазма, нейссерии, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi, Bacillus anthracis, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, возбудитель столбняка, возбудитель коклюша, возбудитель холеры, возбудитель чумы, возбудитель дифтерии, хламидии и легионеллы; лейшмания, возбудитель кокцидиоза, трипаносома или возбудитель малярии; хламидии и рикеттсии).
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с CD3, присутствующим на поверхности Т-клеток. Используя обычные способы, такие антитела можно пометить флуоресцеином, как описано выше. При инкубации таких меченых молекул в присутствии биспецифической молекулы (такой как, например, диатело UDART™, содержащее эпитопсвязывающий домен, который связывается с Т-клеточным рецептором, и эпитопсвязывающий домен, который связывается с флуоресцеином (TCR-UDART™)), они могут связываться с меткой - флуоресцеином - и таким образом сами локализоваться на поверхности клеток, которые экспрессируют CD3, и приводить к перенаправленному уничтожению таких клеток.
В альтернативном варианте осуществления CD19 может использоваться в качестве второго эпитопа, так что биспецифическое антитело, или более предпочтительно диатело DART™, распознающее CD3 и CD19, используется для уничтожения В-клеточной лимфомы благодаря вхождению в контакт и со специфическим для В-клеток антигеном (CD19), и с комплексом Т-клеточный рецептор/CD3 на Тклетках-эффекторах. Как обсуждалось в Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 2011 blood-2010-09306449, CD3/CD19-специфическое диатело DART™ использовалось для уничтожения В-клеточной лимфомы благодаря вхождению в контакт и со специфическим для В-клеток антигеном (CD19), и с комплексом Т-клеточный рецептор/CD3 на Т-клетках-эффекторах. В результате сравнения бок о бок с одноцепочечным биспецифическим антителом, содержащим последовательности Fv антитела против CD 19 и CD3, выявлено, что DART является более эффективным в наведении на лизис В-клеток. Увеличенная активность при использовании CD19xCD3-биспецифического DART отмечалась в отношении всех CD19экспрессирующих В-клеток-мишеней при оценке, используя покоящиеся и предварительно подвергнутые стимуляции РВМС человека или очищенные популяции Т-клеток-эффекторов. В результате определения характеристик CD19xTCR-биспецифического DART выявлена эффективность, эквивалентная таковой CD19xCD3 DART, что указывает на гибкость структуры DART в поддержании ассоциаций Тклетка/В-клетка в случае применений для перенаправленного, опосредуемого Т-клетками уничтожения. Важно отметить, что увеличенный уровень уничтожения, опосредуемого молекулами DART, не сопро
- 25 033677 вождался каким-либо увеличением активации неспецифических Т-клеток или лизиса негативных по CD19 клеток. Исследования клеточных ассоциаций указывают на то, что структура DART хорошо подходит для сохранения межклеточных контактов, несомненно, вносящих вклад в высокий уровень уничтожения клеток-мишеней. Наконец, способность CD19xTCR-биспецифического DART к ингибированию В-клеточной лимфомы у мышей NOD/SCID при совместном введении с РВМС человека, кроме того, демонстрирует ценность молекул DART для лечения В-клеточных злокачественностей. Обладающие перекрестной реактивностью антитела против CD3 по настоящему изобретению могли бы использоваться таким же образом, как антитела против CD3 Moore, Г.А. и др. Таким образом, настоящим изобретением обеспечивается терапия для раков (особенно лимфом и лейкозов), включающих CD3экспрессирующие раковые клетки.
Биспецифические (или триспецифические, или полиспецифические) молекулы по настоящему изобретению предпочтительно вводят пациенту в одной или более стандартных доз, типично составляющих от 0,0001 до 100 мг/кг веса тела пациента. Предпочтительно, когда вводимая пациенту доза находится между 0,0001 и 20 мг/кг, 0,0001 и 10 мг/кг, 0,0001 и 5 мг/кг, 0,0001 и 2 мг/кг, 0,0001 и 1 мг/кг, 0,0001 и 0,75 мг/кг, 0,0001 и 0,5 мг/кг, 0,0001 и 0,25 мг/кг, 0,0001 и 0,15 мг/кг, 0,0001 и 0,10 мг/кг, 0,001 и 0,5 мг/кг, 0,01 и 0,25 мг/кг или 0,01 и 0,10 мг/кг веса тела пациента.
В. Лечение аутоиммунного заболевания и воспаления.
Настоящим изобретением также обеспечиваются способы лечения, предотвращения, замедления прогрессирования и/или уменьшение интенсивности симптомов опосредованных Т-клетками заболеваний или нарушений, включающих отторжение трансплантата, гомологичную болезнь, нежелательные реакции гиперчувствительности замедленного типа (такие как аллергические реакции замедленного типа), опосредованные Т-клетками заболевания легких и аутоиммунные заболевания. Опосредованные Тклетками заболевания легких включают саркоидоз, аллергический альвеолит, острый интерстициальный пневмонит, альвеолит, фиброз легких, идиопатический фиброз легких и другие заболевания, характеризующиеся воспалительным поражением легких. Опосредованные Т-клетками аутоиммунные заболевания включают рассеянный склероз, неврит, полимиозит, псориаз, витилиго, синдром Гужеро-Шегрена, ревматоидный артрит, диабет типа I, аутоиммунный панкреатит, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), глютеновую болезнь, гломерулонефрит, склеродермию, саркоидоз, аутоиммунные заболевания щитовидной железы (например, зоб Хасимото и болезнь Грейвса), злокачественную миастению, болезнь Аддисона, аутоиммунный увеоретинит, обыкновенную пузырчатку, первичный билиарный цирроз, злокачественную анемию и системную красную волчанку (в частности, кожную форму), эффекты вследствие трансплантации органа, гомологичную болезнь (GVHD) и т.д. В частности, способы по настоящему изобретению полезны для субъектов с заболеванием на ранней стадии для замедления или уменьшения нарушения вследствие аутоиммунитета и сохранения высокого уровня функционирования и/или уменьшения необходимости в другой терапии (например, при лечении или профилактике сахарного диабета типа I способы настоящего изобретения могут уменьшить необходимость во введении экзогенного инсулина у субъекта). Кроме того, способы по настоящему изобретению могут преимущественно уменьшить частоту или привести к отсутствию частоты случаев синдрома выброса цитокинов, ранее связанного с введением терапевтических антител и, в частности, антиТ-клеточного антитела (например, против CD3) или антигенсвязывающих фрагментов.
В некоторых вариантах осуществления курс лечения антителом против CD3 или антигенсвязывающими фрагментами в соответствии со способами по настоящему изобретению повторяют с интервалами в 2, 4, 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 24, 30 или 36 месяцев. В конкретных вариантах осуществления эффективность лечения антителом против CD3 или антигенсвязывающими фрагментами по настоящему изобретению определяют, как описано здесь или как известно в данной области техники, через 2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30 или 36 месяцев после предшествующего лечения.
В другом варианте осуществления субъекту вводят одну или более стандартных доз, составляющих приблизительно 0,5-50, приблизительно 0,5-40, приблизительно 0,5-30, приблизительно 0,5-20, приблизительно 0,5-15, приблизительно 0,5-10, приблизительно 0,5-5, приблизительно 1-5, приблизительно 110, приблизительно 20-40, приблизительно 20-30, приблизительно 22-28 или приблизительно 25-26 мкг/кг одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности. В другом варианте осуществления субъекту вводят одну или более стандартных доз, составляющих 200, 178, 180, 128, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 20, 15, 13, 10 м, 6,5, 5, 3,2, 3, 2,5, 2, 1,6, 1,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 или 0,05 мкг/кг одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности.
В одном варианте осуществления субъекту вводят одну или более доз, составляющих 200 мкг/кг или меньше, 175, 150, 128, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 2,5, 2,
1,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 или 0,05 мкг/кг или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более
- 26 033677 симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности.
В отдельных вариантах осуществления субъекту вводят одну или более доз, составляющих приблизительно 5-1200, предпочтительно 51-826 мкг/м2. В другом варианте осуществления субъекту вводят одну или более стандартных доз, составляющих 1200, 1150, 1100, 1050, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5 мкг/м2 одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения, замедления прогрессирования, отсрочки возникновения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности.
В другом варианте осуществления субъекту назначают схему лечения, включающую одну или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, причем курс лечения осуществляют в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. В одном варианте осуществления схема лечения включает введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов каждый день, через день, каждый третий день или каждый четвертый день. В некоторых вариантах осуществления схема лечения включает введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов в понедельник, вторник, среду, четверг конкретной недели и не введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов в пятницу, субботу или воскресенье той же недели, пока не будет введено 14, 13, 12, 11, 10, 9 или 8 доз. В некоторых вариантах осуществления вводимая доза является одинаковой каждый день схемы. В некоторых вариантах осуществления субъекту назначают схему лечения, включающую одну или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, причем профилактически или терапевтически эффективное количество составляет 200, 175, 150, 125, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 20, 15, 13, 10, 6,5, 5, 3,2, 3, 2,5, 2, 1,6, 1,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 или 0,05 мкг/кг/день; и/или причем профилактически или терапевтически эффективное количество составляет 1200, 1150, 1100, 1050, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5 мкг/м2/день. В другом варианте осуществления внутривенную дозу, составляющую 1200, 1150, 1100, 1050, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5 мкг/м2 или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, вводят в течение приблизительно
24, приблизительно 22, приблизительно 20, приблизительно 18, приблизительно 16, приблизительно 14, приблизительно 12, приблизительно 10, приблизительно 8, приблизительно 6, приблизительно 4, приблизительно 2, приблизительно 1,5, приблизительно 1 ч, приблизительно 50, приблизительно 40, приблизительно 30, приблизительно 20, приблизительно 10, приблизительно 5, приблизительно 2, приблизительно 1 мин, приблизительно 30 или приблизительно 10 с для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности. Суммарная доза за время реализации схемы предпочтительно составляет всего менее 9000, 8000, 7000, 6000 мкг/м2 и может составлять менее 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 мкг/м2. В конкретных вариантах осуществления суммарная доза, назначаемая в схеме, составляет 100-200, 100-500, 100-1000 или 500-1000 мкг/м2.
В предпочтительных вариантах осуществления дозу увеличивают на протяжении первых четырех, первой половины и первых 2/3 доз (например, в течение первых 2, 3, 4, 5 или 6 дней схемы введения в течение 10, 12, 14, 16, 18 или 20 дней одной дозы в день) схемы лечения до достижения суточного профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления субъекту назначают схему лечения, включающую одну или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, причем профилактически или терапевтически эффективное количество увеличивают, например, на 0,01, 0,02, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,1, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или 125 мкг/кг каждый день; или увеличивают, например, на 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или 650 мкг/м2, каждый день в ходе лечения. В некоторых вариантах осуществления субъекту назначают схему лечения, включающую одну или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, причем профилактически или терапевтически эффективное количество увеличивают в 1,25, в 1,5, в 2, в 2,25, в 2,5 или в 5 раз до достижения суточного профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов.
В конкретном варианте осуществления субъекту внутримышечно вводят одну или более доз, составляющих 200, предпочтительно 175, 150, 125, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30,
25, 20, 15, 10, 5, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 или 0,5 мкг/кг или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного
- 27 033677 или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности.
В другом варианте осуществления субъекту подкожно вводят одну или более доз, составляющих 200, предпочтительно 175, 150, 125, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 или 0,5 мкг/кг или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения.
В другом варианте осуществления субъекту внутривенно вводят одну или более доз, составляющих 100, предпочтительно 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 2 5, 20, 15, 10, 5, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 или 0,5 мкг/кг или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности. В другом варианте осуществления внутривенную дозу, составляющую 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 2 5, 2 0, 15, 10, 5, 2,5, 2,
1,5, 1, 0,5 или 0,5 мкг/кг или меньше одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, вводят в течение приблизительно 6, приблизительно 4, приблизительно 2, приблизительно
1,5, приблизительно 1 ч, приблизительно 50, приблизительно 40, приблизительно 30, приблизительно 20, приблизительно 10, приблизительно 5, приблизительно 2, приблизительно 1 мин, приблизительно 30 или приблизительно 10 с для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности одного или более симптомов аутоиммунного нарушения или Т-клеточной злокачественности.
В конкретных вариантах осуществления, в которых увеличивающиеся дозы вводят в течение первых дней схемы введения доз, доза в день 1 этой схемы составляет 5-100 мкг/м2/день и увеличивается до изложенной непосредственно выше суточной дозы к дню 3, 4, 5, 6 или 7. Например, в день 1 субъекту вводят дозу, составляющую приблизительно 51 мкг/м2/день, в день 2 - приблизительно 103 мкг/м2/день, в день 3 - приблизительно 207 мкг/м2/день, в день 4 - приблизительно 413 мкг/м2/день и в последующие дни этой схемы (например, дни 5-14) 826 мкг/м2/день.
В других вариантах осуществления первоначальная доза составляет 1/4, до 1/2, до равной суточной дозе в конце схемы, но вводится частями с интервалами в 6, 8, 10 или 12 ч. Например, составляющую 13 мкг/м2/день дозу вводят в четырех дозах, равных 3-4 мкг/кг, с интервалами в 6 ч для уменьшения уровня выброса цитокинов, причиной которого является введение антитела.
В конкретных вариантах осуществления для уменьшения вероятности выброса цитокинов и других неблагоприятных эффектов первые 1, 2, 3 или 4 дозы или все дозы в схеме вводят более медленно с помощью внутривенного введения. Например, доза, составляющая 51 мкг/м2/день, может вводиться в течение приблизительно 5, приблизительно 15, приблизительно 30, приблизительно 45 мин, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 4, приблизительно 6, приблизительно 8, приблизительно 10, приблизительно 12, приблизительно 14, приблизительно 16, приблизительно 18, приблизительно 20 и приблизительно 22 ч. В некоторых вариантах осуществления дозу вводят с помощью медленной инфузии в течение периода времени, составляющего, например, 20-24 ч. В конкретных вариантах осуществления дозу нагнетают в насос, предпочтительно увеличивая концентрацию антитела, вводимого в ходе инфузии.
В других вариантах осуществления может вводиться заданная часть схемы в увеличивающихся дозах. Например, в случае схемы введения 51-826 мкг/м2/день, описанной выше, часть может составлять 11112 3 1 /10, /4, /3, /2, /3 или /4 от суточных доз. Соответственно, когда часть будет равняться /ю, суточные дозы будут составлять 5,1 мкг/м2 в день 1, 10,3 мкг/м2 в день 2, 20,7 мкг/м2 в день 3, 41,3 мкг/м2 в день 4 и 82,6 мкг/м2 в дни 5-14. Когда часть будет равняться 1/4, дозы будут составлять 12,75 мкг/м2 в день 1, 25,5 мкг/м2 в день 2, 51 мкг/м2 в день 3, 103 мкг/м2 в день 4 и 207 мкг/м2 в дни 5-14. Когда часть будет равняться /3, дозы будут составлять 17 мкг/м в день 1, 34,3 мкг/м в день 2, 69 мкг/м в день 3, 137,6 мкг/м в день 4 и 275,3 мкг/м2 в дни 5-14. Когда часть будет равняться 1/2, дозы будут составлять 25,5 мкг/м2 в день 1, 51 мкг/м2 в день 2, 103 мкг/м2 в день 3, 207 мкг/м2 в день 4 и 413 мкг/м2 в дни 5-14. Когда часть будет равняться 2/3, дозы будут составлять 34 мкг/м2 в день 1, 69 мкг/м2 в день 2, 137,6 мкг/м2 в день 3,
275.3 мкг/м2 в день 4 и 550,1 мкг/м2 в дни 5-14. Когда часть будет равняться 3/4, дозы будут составлять
2 2 2
38.3 мкг/м в день 1, 77,3 мкг/м в день 2, 155,3 мкг/м в день 3, 309,8 мкг/м в день 4 и 620 мкг/м в дни 5-14.
В конкретных вариантах осуществления антитело против CD3 или антигенсвязывающие фрагменты не вводят с использованием ежедневных доз на протяжении ряда дней, а точнее вводят с помощью инфузии непрерывно в течение 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 30 или 36 ч. Инфузия может быть неизменной или может начинаться с более низкой дозы, вводимой в течение, например, первых 1, 2, 3, 5, 6 и 8 ч инфузии, и впоследствии увеличиваться до более высокой дозы. В ходе инфузии пациент получает дозу, равную количеству, вводимому в приводимых в качестве примера схемах, изложенных выше, например дозу, составляющую приблизительно 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 или 9000 мкг/м2. В частности, скорость и продолжительность инфузии планируют в расчете на минимизацию уровня свободного антитела против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов у субъекта после введения. В некоторых вариантах осуществления уровень свободного антитела против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов не должен превышать 200 нг/мл свободного антитела. Кроме того, ин- 28 033677 фузию планируют в расчете на достижение комбинированного покрытия и модуляции Т-клеточных рецепторов, составляющего по крайней мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 100%.
В некоторых вариантах осуществления антитело против CD3 или антигенсвязывающие фрагменты вводят для достижения определенного уровня комбинированного покрытия и модуляции Т-клеточных рецепторных комплексов на Т-клетках, определяемого с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, смотрите, например, пример 11 в публикации заявки на патент США № US 2003/0108548, которая тем самым включена в настоящее описание в качестве ссылки в ее полном объеме. В отдельных вариантах осуществления с помощью схемы введения доз достигается комбинированное покрытие и модуляция Т-клеточных рецепторов, составляющее по крайней мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 100% в отдельных вариантах осуществления с малым количеством или отсутствием выявляемого свободного антитела против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов (например, меньше 200 нг/мл лекарственного средства выявляется в крови пациента).
В предпочтительных вариантах осуществления антитело против CD3 или антигенсвязывающие фрагменты вводят парентерально, например внутривенно, внутримышечно или подкожно, или, альтернативно, вводят перорально. Антитело против CD3 или антигенсвязывающие фрагменты можно также вводить в виде препарата с замедленным высвобождением.
В отдельном варианте осуществления назначение одной или более доз или схемы введения доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов не вызывает или уменьшает по сравнению с другими иммуносупрессорами один или более из следующих нежелательных или неблагоприятных эффектов: отклонения основных показателей состояния организма (лихорадку, тахикардию, брадикардию, гипертензию, гипотензию), гематологические проявления (анемию, лимфопению, лейкопению, тромбоцитопению), головную боль, озноб, головокружение, тошноту, астению, боль в пояснице, боль в груди (сдавленность в груди), диарею, миалгию, боль, зуд, псориаз, ринит, потоотделение, реакцию в месте инъекции, расширение кровеносных сосудов, повышенный риск инфекции, вызываемой условно патогенными организмами, активацию вируса Эпштейна-Барр, апоптоз Т-клеток и повышенный риск развития некоторых типов рака. В другом отдельном варианте осуществления назначение одной или более доз профилактически или терапевтически эффективного количества одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов не вызывает или уменьшает по сравнению с другими иммуносупрессорами один или более из следующих нежелательных или неблагоприятных эффектов: отклонения основных показателей состояния организма (лихорадку, тахикардию, брадикардию, гипертензию, гипотензию), гематологические проявления (анемию, лимфопению, лейкопению, тромбоцитопению), головную боль, озноб, головокружение, тошноту, астению, боль в пояснице, боль в груди (сдавленность в груди), диарею, миалгию, боль, зуд, псориаз, ринит, потоотделение, реакцию в месте инъекции, расширение кровеносных сосудов, повышенный риск инфекции, вызываемой условно патогенными организмами, активацию вируса Эпштейна-Барр, апоптоз Т-клеток и повышенный риск развития некоторых типов рака.
В соответствии с настоящим изобретением дозу или схему введения доз, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов для лечения аутоиммунного нарушения, можно повторять через 1, 2, 4, 6, 8, 12, 15, 18 или 24 месяца или дольше после первоначальной или предыдущей дозы или схемы введения доз, включающей профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов. Повторную дозу или схему введения доз можно назначать, как правило, когда симптомы, связанные с указанным аутоиммунным нарушением, снова возникают после ослабления после первоначальной или предыдущей дозы или схемы введения доз, или когда симптомы, связанные с указанным аутоиммунным нарушением, не ослабляются после первоначальной дозы или схемы введения доз антитела против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии со способами по настоящему изобретению. Например, что касается диабета, повторную дозу или схему введения доз, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, можно назначать субъекту, когда, например, среднее суточное введение субъекту инсулина через 1, 2, 4, 6, 8, 12, 15, 18 или 24 месяца или дольше после первоначального или предыдущего лечения антителом против CD3 или антигенсвязывающими фрагментами не уменьшается по крайней мере на 5, по крайней мере 10, по крайней мере 20, по крайней мере 30, по крайней мере 40, по крайней мере 50, по крайней мере 60, по крайней мере 70, по крайней мере 80 или по крайней мере 90% по сравнению с уровнями до лечения. Альтернативно, что касается диабета, повторную дозу или схему введения доз, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, можно назначать субъекту, когда, например, уровни НА 1 или НА 1 С у субъекта через 1, 2, 4, 6, 8, 12, 15, 18 или 24 месяца или дольше после первоначального или предыдущего лечения антителом против CD3 или антигенсвязывающими фрагментами не уменьшаются на по крайней мере 5, по крайней мере 10, по крайней мере 20, по крайней мере 30, по крайней мере 40, по крайней мере 50, по крайней мере 60, по крайней мере 70, по крайней мере 80 или по крайней мере 90% по сравнению с уровнями до лечения. В другом варианте осуществления, что касается диабета, повторную дозу
- 29 033677 или схему введения доз, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более из антител против CD3 или антигенсвязывающих фрагментов, можно назначать субъекту, когда, например, ответ в виде увеличения С-пептида через 1, 2, 4, 6, 8, 12, 15, 18 или 24 месяца или дольше после первоначального или предыдущего лечения антителом против CD3 или антигенсвязывающими фрагментами уменьшается на более чем 5, более чем 10, более чем 20, более чем 30, более чем 40, более чем 50, более чем 60, более чем 70, более чем 80 или более чем 90% по сравнению с уровнями до лечения.
Аутоиммунные заболевания являются неинфекционными иммунологическими заболеваниями, вызванными иммунными ответами, направленными против нормальных компонентов клеток, тканей и органов человека. Аутоиммунные заболевания часто являются хроническими заболеваниями, которые мало-помалу разрушают являющиеся мишенями ткани и органы. Часто встречающиеся заболевания, в настоящее время отнесенные к аутоиммунным заболеваниям вследствие наличия несоответствующих аутоиммунных реакций, включают инсулинозависимый диабет типа I, ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), рассеянный склероз (MS), воспалительное заболевание кишечника (IBD), злокачественную миастению, глютеновую болезнь, синдром Гужеро-Шегрена, болезнь Грейвса, болезнь Крона, аутоиммунный гепатит, псориаз, псориатическмй артрит, астму, аллергический ринит, эффекты вследствие трансплантации органа или гомологичную болезнь (GVHD) и многочисленные другие заболевания, в которые вовлечена воспалительная иммунная реакция.
Поскольку аутоиммунные заболевания типично являются хроническими, в их случае, как правило, требуется пожизненное лечение и слежение. По этой причине традиционные терапии для аутоиммунного заболевания, главным образом, направлены на борьбу с последствиями воспаления, вызванного заболеванием, и лишь немного аутоиммунных заболеваний можно вылечить или заставить исчезнуть с помощью такого лечения. В случае некоторых аутоиммунных заболеваний введение одного из ограниченного ряда иммуносупрессоров может привести к периодам ремиссии или исчезновения активного заболевания.
Иммуносупрессоры, используемые для дополнительной терапии, включают вещества, которые подавляют продукцию цитокинов, уменьшают или подавляют экспрессию аутоантигенов или маскируют антигены главного комплекса гистосовместимости (MHC).
Иммуносупрессоры включают противовоспалительные лекарственные средства (например, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (NSAID), циклофосфамид, бромокриптин, циклоспорин А, метотрексат, стероиды, такие как глюкокортикоиды, и цитокины или антагонисты рецепторов цитокинов. Пациенты редко могут прекратить прием этих иммуносупрессоров, поскольку аутоиммунное заболевание у них обычно вновь возникает при прекращении приема лекарственного средства. Аутоиммунное заболевание может стать не поддающимся лечению при продолжении приема иммуносупрессоров в течение длительного срока и может даже нуждаться в увеличивающихся дозах иммуносупрессоров.
Терапевтические антитела, направленные против CD3, как полагают, приводят к меньшему числу длительных побочных эффектов, чем многие из иммуносупрессорных химиотерапии, доступных в настоящее время для лечения аутоиммунных заболеваний (WO 2007/117600). Однако было установлено, что прежние терапии на основе антител являются проблематичными, особенно в случае использования многократного введения. Антилимфоцитарные терапии, такие как антилимфоцитарный глобулярный белок (ALG), и моноклональные антитела, направленные против В-клеток, такие как ритуксимаб (Rituxin®) и алемтузумаб (САМРАТН®), уменьшают популяции циркулирующих и тканевых В-клеток у подвергнутых лечению субъектов. Однако эти терапии также приводят к тяжелой форме иммуносупрессии, которая является нежелательной в случае лечения в течение длительного срока хронического аутоиммунного заболевания. Основным осложнением вызывающей тяжелую форму иммуносупрессии терапии является инфекция. Системная иммуносупрессия может также сопровождаться нежелательными токсическими эффектами и снижением уровней гемопоэтических стволовых клеток. Кроме того, у пациентов, получающих терапии на основе антител, часто вырабатываются значительные уровни человеческих антимышиных антител (HAMA), человеческих антихимерных антител (НАСА) и антиидиотипические ответы, которые могут ограничить повторные лечения, когда ремиссия заканчивается.
Как обсуждалось выше, антитела, направленные против антигенов Т-клетки, таких как Т-клеточный рецепторный комплекс (TCR), были предложены в качестве возможных терапевтических средств для иммуносупрессии аутоиммунного заболевания. Антитела против CD3, как полагают, вызывают такую иммуносупрессию в результате уменьшения патогенных Т-клеток и индукции регуляторных Т-клеток (WO 2007/117600; St. Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657; Ludvigsson, J. (2009) The Role of Immunomodulation Therapy in Autoimmune Diabetes, J. Diabetes Sci. Technol. 3(2): 320-330). По этой причине антитела против Т-клеток, в том числе против CD3, использовались для оказания влияния на иммунологический статус у субъекта посредством супрессии, усиления или перенаправления Т-клеточных реакций на антиген. В частности, Теплизумаб, также известный как hOKT3y1 (Ala-Ala) (содержащий аланин в положениях 234 и 235) (MacroGenics, Inc.), явля- 30 033677 ется антителом против CD3, которое было сконструировано для изменения функции Т-лимфоцитов, которые опосредуют разрушение инсулин-продуцирующих бета-клеток панкреатических островков. Теплизумаб связывается с эпитопом s-цепи CD3, представленной на зрелых Т-клетках, и поступает таким образом.
Благодаря частично своей перекрестной реактивности с нечеловеческим CD3 (которая делает возможным более точное и гибкое дозирование), антитела против CD3 по настоящему изобретению, как считают, особенно применимы для лечения аутоиммунного заболевания, несмотря на очевидные неудачи известного уровня техники.
Такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться отдельно или вместе с другими фармакологическими средствами. В частности, в настоящем изобретении предусматриваются терапии, включающие введение таких антител или антигенсвязывающих фрагментов вместе с антителами против В-клеток (или их антигенсвязывающими фрагментами). Антитела против В-клеток известны в данной области техники (смотрите WO 2007/117600; WO 2005/000901; WO 2004/035607; патенты США №№ 5500362 и 5736137, публикации заявок на патенты США №№ 2003/0219433, 2005/0271658, 2005/0271658, 2005/0281817, 2006/024295, 2006/024300 и 2006/034835; Clark, E.A. et al. (1985) Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptide In Human B-Cell Activation, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(6): 17661770; Press, O.W. et al. (1987) Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human В Cell Lymphomas, Blood 69: 584-591). Такое совместное введение можно выполнять, используя совместное введение отдельных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, или посредством образования биспецифических антител, или более предпочтительно посредством образования диател DART™, описанных выше, обладающих способностью к связыванию как с CD3, так и с В-клеточным антигеном.
Предпочтительно используемое антитело против В-клеток или антигенсвязывающий фрагмент будет направлено против маркера поверхности В-клеток, такого как маркер, выбираемый из CD19, CD20, CD22, CD23, CD32B, CD40, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), CD79a, CD79b, CD38, CD27, связанного с функцией лимфоцитов антигена (LFA), такого как LFA-I или LFA-3, CFA-I, или другой вспомогательной молекулы, вовлеченной в ассоциацию Т-клеток, В-клеток, которая приводит к активации Т-клеток и Вклеток в ходе адаптивного иммунного ответа. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления антителом против В-клеток может быть истощающее В-клетки антитело, такое как антитело, направленное против маркера, выбираемого из CD19, CD20, CD22, CD23, CD32B, CD40, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), связанного с функцией лимфоцитов антигена (LFA), такого как LFA-I или LFA-3, CFA-I, или другой вспомогательной молекулы, вовлеченной в ассоциацию Т-клеток, В-клеток.
Альтернативно, такая комбинированная терапия может включать введение антитела против CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента в комбинации с антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), которое распознает антиген, присутствующий на антигенпрезентирующей клетке (например, В7-И3). Тем не менее, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления комбинированная терапия включает введение антитела против CD3 (или его антигенсвязывающего фрагмента) в комбинации с антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), которое распознает полипептид, участвующий в активации В-клеток (или напрямую, или опосредованно), или иммуномодулятор, такой как член семейства цитокинов TNF или интерферон (например, α-, β- или γ-интерферон). Как это будет понятно квалифицированным в данной области техники специалистам, такие интерфероны участвуют в регуляции белков, которые работают сообща при процессировании и презентации антигенов. Эти цитокины стимулируют клетки с увеличением экспрессии в них тяжелых цепей класса I HLA. В одном предпочтительном варианте осуществления комбинированная терапия включает введение субъекту, имеющему активное аутоиммунное заболевание, антитела против Т-клеточного антигена в комбинации с антителом против β-интерферона. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления комбинированная терапия включает введение субъекту антитела, направленного против Т-клеточного антигена, в комбинации с антителом, выбираемым из антител против β-интерферона AVONEX®, BETASERON® и REBIF®. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления комбинированная терапия включает введение субъекту антитела, направленного против Т-клеточного антигена, в комбинации с антителом, направленным против β-интерферона, для лечения субъекта, страдающего рассеянным склерозом.
В дополнительном варианте осуществления антитело против CD3 может быть немитогенным антителом или антителом с уменьшенной митогенностью, которое ингибирует или предотвращает активацию Т-клетки, когда Т-клетка приходит в контакт со специфическим антигеном на антигенпрезентирующей клетке, в частности антигенпрезентирующей В-клетке. Используемый здесь термин немитогенное по отношению к Т-клетке антитело означает антитело, которое сконструировано посредством изменения Fc-рецептора антитела, так что оно не запускает первоначальные события активации и последующий выброс цитокинов, которые отмечаются при активации Т-клетки. Антителом с уменьшенной митогенностью по отношению к Т-клетке, является антитело, специфическое в отношении Т-клеточного антигена, которое ослабляет первоначальные события активации и последующий выброс цитокинов, которые возникают при активации Т-клетки. Немитогенное антитело или антитело с уменьшенной митогенно- 31 033677 стью может применяться для предотвращения первоначальных побочных эффектов первой дозы, отмечаемых при введении пациенту антилимфоцитарного антитела. Немитогенным антителом или антителом с уменьшенной митогенностью может быть сконструированное антитело, содержащее модифицированный Fc-фрагмент, который предотвращает или ингибирует связывание клетками-эффекторами.
С. Способы введения.
В одном аспекте варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают являющихся людьми субъектов, подвергнутых лечению для достижения и сохранения клинической ремиссии в течение более длительных периодов времени, чем ремиссии, достигаемые у пациентов, подвергнутых лечению с использованием традиционной терапии. Например, если с помощью традиционной терапии достигается ремиссия симптомов аутоиммунного заболевания в течение 3 месяцев, композиции по настоящему изобретению могут обеспечить полную ремиссию симптомов вплоть до 6, вплоть до 12 месяцев и в некоторых случаях вплоть до одного-двух лет или дольше. Предусматривается, что в случае некоторых аутоиммунных заболеваний возможно достижение полной ремиссии, которая снова не прекращается, особенно если терапию начинают вскоре после диагностирования аутоиммунного заболевания.
Клиническая ремиссия, достигаемая с помощью комбинированной терапии, может быть полной ремиссией, или она может быть частичной ремиссией, при которой значительные ослабления симптомов заболевания сохраняются в течение продленного периода. Например, у субъекта, получающего терапию по настоящему изобретению, могут отмечаться уменьшенные аутоиммунные ответы, что определяется по уменьшению уровней обнаруживаемых аутоантител в жидкостях и тканях организма, например в спинномозговой жидкости (CSF), сыворотке, моче или в тканях организма. У субъекта, получающего комбинированную терапию по настоящему изобретению, могут также отмечаться уменьшенные Тклеточные реакции на аутоантигены, что определяется с помощью in vitro анализов пролиферации или продукции цитокинов, используя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или очищенные Т-клетки, по сравнению с субъектами, подвергнутыми лечению с использованием традиционной терапии.
Композиции по настоящему изобретению могут вводиться любым подходящим способом, в том числе с помощью парентерального, местного, подкожного, внутрибрюшинного, внутрилегочного, интраназального введения и/или введения внутрь пораженных тканей. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело можно соответственно ввести с помощью инфузии в прерывистом режиме, например, с использованием увеличивающихся доз антитела. Предпочтительно введение доз осуществляют внутривенно или подкожно, а более предпочтительно с помощью внутривенной инфузии(й). Каждое подвергание воздействию можно обеспечить, используя один и тот же или различные способы введения. В одном варианте осуществления каждое подвергание воздействию осуществляют с помощью внутривенного введения. В другом варианте осуществления каждое подвергание воздействию осуществляют с помощью подкожного введения. Тем не менее, в другом варианте осуществления подвергание воздействию осуществляют с помощью как внутривенного, так и подкожного введения.
В одном варианте осуществления терапевтические антитела вводят в виде медленной внутривенной инфузии, которая может начинаться с почасовой скоростью для доставки молекул по настоящему изобретению за приблизительно 15 мин-4 ч. Однако, если субъект демонстрирует инфузионную реакцию, скорость инфузии предпочтительно уменьшают, например, до половины скорости потока. Подвергаемые лечению субъекты могут получать профилактическое лечение ацетаминофеном/парацетамолом (например, приблизительно 1 г) и дифенгидрамина HCl (например, приблизительно 50 мг или эквивалентную дозу схожего средства), принимая их внутрь за приблизительно 30-60 мин до начала инфузии.
Лечение, обеспечиваемое комбинированными композициями по настоящему изобретению (включающими диатела DART™), может назначаться субъекту, используя первоначальную дозу первого антитела, которая меньше количества такого антитела, которое необходимо для достижения клинической эффективности терапии для аутоиммунного заболевания при введении в виде терапии, предусматривающей одно антитело. Доза терапевтического антитела против Т-клеток, которая меньше дозы, необходимой для достижения истощения Т-клеток, способных распознавать аутоантигены и реагировать на них, при терапии, предусматривающей одно антитело, может быть достаточной для обеспечения желаемой клинической эффективности. Способы определения дозы терапевтического антитела, необходимой для достижения клинической эффективности, известны квалифицированным в данной области техники специалистам. Например, клиническую эффективность у субъекта можно определить как период времени до прогрессирования заболевания, уменьшение клинических симптомов, уменьшение уровней лабораторных маркеров, уменьшение необходимости в повторном лечении или с помощью любого другого клинического средства, признанного в качестве пригодного индикатора улучшения состояния аутоиммунного заболевания.
Второе антитело комбинированной терапии может также вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении, в виде первоначальной дозы, которая меньше дозы, эффективной для достижения клинической эффективности при приведении только этого антитела. Например, дозы истощающего антитела против В-клеток, с помощью которых достигается составляющее менее чем 100% истощение В-клеток, состав- 32 033677 ляющее менее чем 50% истощение В-клеток, составляющее менее чем 30% истощение В-клеток или даже не достигается истощение В-клеток, могут вводиться вместе с первым антителом против Т-клеток для достижения клинической эффективности, предусматривающей подавление иммунного ответа против аутоантигена, которая равна клинической эффективности, достигаемой при введении количества истощающего В-клетки антитела, которое обеспечивает 100% истощение В-клеток у субъекта при введении только этого антитела, или превосходит ее.
В некоторых случаях клинической эффективностью является эффективность, которая не достигается ни при введении только первого антитела, или только второго антитела. В других случаях клиническая эффективность может быть эквивалентна таковой, достигаемой при назначении терапии, предусматривающей одно антитело, причем комбинированная терапия обуславливает меньшую иммуносупрессию иммунной системы подвергаемого лечению субъекта, чем терапия, предусматривающая одно антитело. В одном предпочтительном варианте осуществления синергетическая реакция, обуславливаемая комбинированной терапией, уменьшает или аннулирует ответы против аутоантигена у субъекта при обеспечении более низких уровней иммуносупрессии. Общая иммуносупрессия является значительной проблемой для ранее доступных терапий на основе антител.
D. Фармацевтические препараты.
Терапевтические препараты антител, используемые в вариантах осуществления настоящего изобретения, готовят для хранения, поставки и введения посредством смешивания композиции по настоящему изобретению с желаемой степенью чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, общепризнанными в фармацевтической области, в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов.
Термин фармацевтически приемлемый означает разрешенный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или приведенный в списке в Фармакопеи США или других общепризнанных фармакопеях для применения для животных и конкретнее для людей. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному)), эксципиенту или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода или масла, в том числе масла нефтяные, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей могут также использоваться солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, особенно в случае инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества смачивающих агентов или эмульгаторов, или рНбуферных веществ. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и т.п.
Композиции по настоящему изобретению включают нерасфасованные композиции лекарственных средств, применимые для производства фармацевтических композиций, (например, композиции с примесью или нестерильные композиции) и фармацевтические композиции (т.е. композиции, которые подходят для введения субъекту или пациенту), которые могут использоваться для приготовления стандартных лекарственных форм. Такие композиции включают профилактически или терапевтически эффективное количество профилактического и/или терапевтического средства, описываемого здесь, или комбинации этих средств и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно, когда композиции по настоящему изобретению включают профилактически или терапевтически эффективное количество гуманизированных антител по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Как правило, ингредиенты композиций по настоящему изобретению поставляются или порознь, или смешаны вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, указывающем на количество активного агента. Если композиция должна вводиться с помощью инфузии, ее распределение осуществляют с использованием инфузионного флакона, содержащего стерильную воду или солевой раствор фармацевтического качества. Если композиция вводится с помощью инъекции, может предоставляться ампула со стерильной водой для инъекции или солевым раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения. Фармацевтические композиции, подходящие для инъекции, включают стерильные водные растворы, в которых активные агенты являются водорастворимыми, или дисперсии или стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов для немедленного введения. Композиции для применения в комбинированной терапии можно приготовить посредством включения активного антагониста или антитела в требуемом количестве вместе с подходящими носителями, например водой, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем) и их подходящими смесями. В композицию могут быть включены агенты для придания изотоничности, такие как сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.
Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде нейтральных или соле- 33 033677 вых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают, но без ограничения, те, которые образованы анионами, такими как те, которые получаются из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и те, которые образованы катионами, такими как те, которые получаются из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Теперь после общего описания настоящего изобретения его будет легче понять благодаря ссылке на следующие примеры, которые предоставлены в качестве иллюстрации и, как предполагается, не являются ограничением настоящего изобретения, кроме особо оговоренных случаев.
Пример 1. mAb1 связывается как с CD3 человека, так и с CD3 яванского макака.
Для оценки способности mAb1 к связыванию с CD3 человека был выполнен ELISA с захватом. Планшеты покрывали 1 мкг/мл растворимого CD3 яванского макака (sCD3) и инкубировали в присутствии различных концентраций химерного варианта антитела mAb1 (ch-mAb1) (содержащего последовательности вариабельных областей mAb1 и константные области антитела человека), гуманизированного варианта (h-mAb1) и антитела, состоящего из легкой цепи химерного антитела mAb1 и тяжелой цепи гуманизированного варианта mAb1. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 1А. Этот эксперимент показывает способность mAb1 к связыванию с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком. Кроме того, было выполнено сравнение связывание химерного антитела mAb1 с таковым антитела, в состав которого входят LC-2 гуманизированного варианта mAb1 и тяжелая цепь mAb1. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 1В. Этот эксперимент показывает способность mAb1 к связыванию с CD3 человека. Таким образом, фиг. 1А и 1В показывают, что гуманизированное mAb1 было способно к связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, не являющегося человеком. Гуманизированное mAb продемонстрировало связывание с sCD3 и hCD3, схожее с таковым химерного mAb1.
Пример 2. Гуманизация mAb1.
Были приготовлены гуманизированные производные mAb1. Ниже представлены аминокислотные последовательности этих гуманизированных производных и кодирующие их полинуклеотидные последовательности. CDR начертаны полужирно и подчеркнуты.
Аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb1 (SEQ ID NO: 10):
IDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRLIYDS SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SRNPPTFGGG TKVEIK
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb1 (SEQ ID NO: 11):
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgaca atcacctgtt ccgccagctc ctccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaagcccggc aaggccccca agcggctgat ctacgactcc tccaagctgg cctccggcgt gccctccaga ttctccggct ctggctccgg caccgagttc accctgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagtgg tcccggaacc cccctacctt cggcggaggc accaaggtgg aaatcaag
Аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb1 (LC-2 mAb1) (SEQ ID NO: 12):
DWMTQSPAI MSAFPGEKVT ITCSASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDS SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SRNPPTFGGG TKVEIK
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb1 (SEQ ID NO: 13):
gacgtggtga tgacccagtc tcctgccatc atgagtgctt tcccaggcga gaaagtgacc attacatgct ctgcttccag ctctgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaagccaggg aaagcaccca agaggtggat ctacgactcc tccaagctgg cctccggcgt gccaagccgg ttctctggta gtggctcagg aaccgagttt actctgacca tttccagcct gcagcctgaa gatttcgcaa catactattg tcagcagtgg tccagaaatc cccctacatt tggcggaggg actaaagtgg aaatcaag
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb1 (SEQ ID NO: 14):
I QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RSTMHWVRQA PGQGLEWIGY INPSSAYTNY NQKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCASPQ VHYDYNGFPY WGQGTLVTVS S
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного mAb1 (SEQ ID NO: 15):
- 34 033677 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc cggtccacca tgcactgggt gcgacaggcc ccaggccagg gactggaatg gatcggctac atcaacccct ccagcgccta caccaactac aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatc accgccgaca agtccaccag caccgcctac atggaactgt ctagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ctccccccag gtgcactacg actacaacgg cttcccctac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc tcc
Пример 3. Гуманизация mAB2.
Были приготовлены гуманизированные производные mAB2. Ниже представлены аминокислотные последовательности этих гуманизированных производных и кодирующие их полинуклеотидные последовательности. CDR начертаны полужирно и подчеркнуты.
Аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-1 h-mAb2) (SEQ ID NO: 16):
I QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWFQQ KPGQAPRTLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-1 h-mAb2) (SEQ ID NO: 17):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg gttccagcag aagccaggac aggcaccaag gaccctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-2 h-mAb2) (SEQ ID NO: 18):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRTLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-2 h-mAb2) (SEQ ID NO: 19):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gaccctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-3 h-mAb2) (SEQ ID NO: 20):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWFQE KPGQAPRTLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-3 h-mAb2) (SEQ ID NO: 21):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg gttccaggag aagccaggac aggcaccaag gaccctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 4 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-4 h-mAb2) (SEQ ID NO: 22):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWFQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 4 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-4 h-mAb2) (SEQ ID NO: 23):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg gttccagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 5 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-5 h-mAb2) (SEQ ID NO: 24):
- 35 033677
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAPRTLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 5 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-5 h-mAb2) (SEQ ID NO: 25):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcaggag aagccaggac aggcaccaag gaccctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 6 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAB2 (VL-6 h-mAb2) (SEQ ID NO: 26):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 6 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-6 h-mAb2) (SEQ ID NO: 27):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 7 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-7 h-mAb2) (SEQ ID NO: 28):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWFQE KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 7 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-7 h-mAb2) (SEQ ID NO: 29):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg gttccaggag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 8 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-8 h-mAb2) (SEQ ID NO: 30):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 8 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-8 h-mAb2) (SEQ ID NO: 31):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcaggag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 9 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-9 h-mAb2) (SEQ ID NO: 32):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 9 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-9 h-mAb2) (SEQ ID NO: 33):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcaggag aagccaggac aggcattcag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 10 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-10 h-mAb2) (SEQ ID NO: 34):
- 36 033677
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWFQQ KPDHLFTGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 10 вариабельной области легкой цепи гуманизированного mAb2 (VL-10 h-mAb2) (SEQ ID NO: 35):
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcactgg agcagtgact acctctaact acgctaattg gttccagcag aagcccgacc acctgttcac tgggctgatc ggcggaacca acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga
Аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-1 h-mAb2) (SEQ ID NO: 36):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-1 h-mAb2) (SEQ ID NO: 37):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt caccttttct acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtgggcagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgcaaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-2 h-mAb2) (SEQ ID NO: 38):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-2 h-mAb2) (SEQ ID NO: 39):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt cacctttaac acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtgggcagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgcaaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-3 h-mAb2) (SEQ ID NO: 40):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-3 h-mAb2) (SEQ ID NO: 41):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt caccttttct acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtggccagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgcaaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 4 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-4 h-mAb2) (SEQ ID NO: 42):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 4 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-4 h-mAb2) (SEQ ID NO: 43):
- 37 033677 gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt caccttttct acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtgggcagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgtgaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 5 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-5 h-mAb2) (SEQ ID NO: 44):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 5 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-5 h-mAb2) (SEQ ID NO: 45):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt cacctttaac acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtggccagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgcaaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 6 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAB2 (VH-6 h-mAb2) (SEQ ID NO: 46):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 6 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-6 h-mAb2) (SEQ ID NO: 47):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt cacctttaac acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtgggcagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgtgaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 7 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-7 h-mAb2) (SEQ ID NO: 48):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 7 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-7 h-mAb2) (SEQ ID NO: 49):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caggtggcag cctgcgactg tcttgcgccg ctagtggctt caccttttct acatacgcca tgaactgggt gaggcaggct cctggaaagg ggctggagtg ggtggccagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actcagtgaa ggatagattc acaatttccc gcgacgattc taaaaacagt ctgtatctgc agatgaactc cctgaagact gaagacaccg ccgtgtacta ttgtgtgaga cacggaaact tcggcaactc ctacgtgtcc tggtttgcat attggggtca gggcacactg gtgaccgtgt ccagc
Аминокислотная последовательность варианта 8 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-8 h-mAb2) (SEQ ID NO: 50):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL· VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант 8 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-8 h-mAb2) (SEQ ID NO: 51):
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcaac acatacgcta tgaattgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttgcaagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actctgtgaa ggatagattc accatctcaa gagatgattc aaagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga cacggtaact tcggcaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggaca ggggacactg gtgactgtgt cttcc
Аминокислотная последовательность варианта QV вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-QV h-mAb2) (SEQ ID NO: 52):
- 38 033677
EVQLVESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант QV вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного mAb2 (VH-QV h-mAb2) (SEQ ID NO: 53):
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc caaagggatc actgaaactg tcctgcgccg cctccggctt cacctttaac acatacgcta tgaattgggt gcgacaggca cctggcaagg gcctggagtg ggtggcaagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc tactatgccg actctgtgaa ggatagattc acaatcagtc gcgacgattc ccagagcatt ctgtatctgc agatgaacaa tctgaaaact gaagacaccg ccatgtacta ttgtgtgcgg cacggtaact tcggcaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggaca ggggacactg gtgactgtgt cttcc
Пример 4. mAb2 связывается как с CD3 человека, так и с CD3 яванского макака.
Как обсуждалось выше, антитело mAB2 было изначально выделено на основе его способности к связыванию с CD3 человека. Для оценки способности mAB2 к связыванию с нечеловеческим CD3 был выполнен ELISA с захватом. Планшеты покрывали 1 мкг/мл CD3 (или человека, или яванского макака) и инкубировали в присутствии различных концентраций химерного варианта антитела mAB2 (ch-mAb2) (содержащего последовательности вариабельных областей mAB2 и константные области антитела человека). В качестве контроля планшеты также покрывали антителом, состоящим из легкой цепи гуманизированного mAb1 и тяжелой цепи химерного антитела. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 2А и 2В и показывают, что химерный вариант mAB2 продемонстрировал равное связывание с CD3 человека и с CD3 яванского макака.
Пример 5. Анализ связывающих свойств вариантов легкой и тяжелой цепей h-mAb2.
Анализ был проведен для определения эффекта вариаций остатков каркасных областей легкой цепи mAB2. В табл. 2 указаны исследованные замены.
Таблица 2
Легкая цепь
№ остатка по Kabat: 36 38 41 42 43 44 45 46 SEQ ID NO:
№ остатка SEQ ID NO: 5 38 40 43 44 45 46 47 48
Вариант mAb2-VL V E D H L F T G 5
h-mAb2 VL-1 F Q G Q A P R T 16
h-mAb2 VL-2 V 18
h-mAb2 VL-3 E 20
h-mAb2 VL-4 G 22
h-mAb2 VL-5 V E 24
h-mAb2 VL-6 V G 26
h-mAb2 VL-7 E G 28
h-mAb2 VL-8 V E G 30
h-mAb2 VL-9 V E F G 32
h-mAb2 VL-10 D H L F T G 34
Тяжелая цепь
№ остатка по Kabat: 30 49 52a 58 93 SEQ ID NO:
№ остатка SEQ ID NO: 7 30 49 53 61 99
Вариант mVII N A Y V 7
hVH-1 s G A 36
hVH-2 N 38
hVH-3 A 40
hVH-4 V 42
hVH-5 N A 44
hVH-6 N V 46
hVH-6L N E V 54
hVH-6M N N E V 72
hVH-7 A V 48
hVH-8 N A V 50
hVH-8L N A E V 55
hVH-8M N A N E V 74
Были образованы антитела, имеющие легкие цепи mAB2 с SEQ ID NO: 11, но содержащие замены (с использованием нумерации по Kabat) D41G, H42Q, L43A, F44P, T45R или G46T, и тяжелые цепи химерного mAb2 (CDR mAB2 с hFR1-mFR2-hFR3-4), и их связывание оценивали, используя ELISA с захватом. Планшеты покрывали 1 мкг/мл экстраклеточного домена CD3 человека (растворимого hCD3 или shCD3) и инкубировали в присутствии различных концентраций антитела. Результаты (фиг. 3) указывают на то, что замена Т в положении 46 по Kabat аннулировала способность антитела к связыванию с shCD3.
Были проведены дополнительные исследования для определения влияния вариаций в положениях легкой цепи 36, 38, 44 и 46 по Kabat. Были образованы антитела, содержащие вариабельную область легкой цепи VL-8 h-mAb2, VL-9 h-mAb2 или VL-10 h-mAb2 и тяжелую цепь химерного антитела mAB2, и их оценивали, используя описанный выше ELISA с захватом. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 4 и показывают, что связывание с shCD3 антителом, содержащим вариабельную область легкой цепи hVL-8, было схожим с таковым антитела, содержащего легкую цепь химерного mAB2.
- 39 033677
Были также образованы антитела, содержащие вариабельную область легкой цепи VL-6 h-mAb2, VL-7 h-mAB2 или VL-8 h-mAB2 и тяжелую цепь химерного антитела mAB2, и их оценивали, используя описанный выше ELISA с захватом (за исключением того, что планшеты покрывали 0,5 мкг/мл shCD3 в забуференном фосфатом солевом растворе) для определения влияния дополнительных замен в положениях 36, 38 и 46. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 5 и показывают, что замены F36V и T46G с использованием нумерации по Kabat были достаточными для получения антитела, связывание которого с shCD3 было схожим с таковым антитела, содержащего легкую цепь химерного mAB2.
Влияние замен в последовательности тяжелой цепи mAB2 оценивали посредством образования антител, содержащих легкую цепь химерного антитела mAB2 и вариабельную область тяжелой цепи VH-5 h-mAb2, VH-6 h-mAb2 или VH-7 h-mAb2, и оценки связывания, используя описанный выше ELISA с захватом (с использованием покрытия 1 мкг/мл shCD3). Результаты этих исследований представлены на фиг. 6. Кроме того, были образованы антитела, содержащие легкую цепь химерного антитела mAb2 и гуманизированный вариант вариабельной области тяжелой цепи VH-4 h-mAb2, VH-7 h-mAB2 или VH-9 h-mAB2. Связывание таких антител оценивали, используя описанный выше ELISA с захватом. Результаты этих исследований представлены на фиг. 7.
hVH-6L (и ее вариант hVH-6M) и hVH-8L (и ее вариант VH-8M) тяжелых цепей являются особенно предпочтительными для получения антител, обладающих меньшей аффинностью к CD3, чем антитела, в состав которых входят hVH-1, hVH-2, hVH-3, hVH-4, hVH-5, hVH-6, hVH-7 или hVH-8 табл. 2. В состав таких антител с уменьшенной аффинностью будет предпочтительно входить или hVH-6L тяжелой цепи, или VH-8L тяжелой цепи в комбинации с любой из VL-1 легкой цепи h-mAb2, VL-2 h-mAb2, VL-3 hmAb2, VL-4 h-mAb2, VL-5 h-mAB2, VL-6 h-mAb2, VL-7 h-mAb2, VL-8 h-mAb2, VL-9 h-mAb2 или VL-10 h-mAB2. Особенно предпочтительное деиммунизированное антитело будет состоять из hVH-6L (или ее варианта hVH-6M) тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи h-mAb2, или hVH-8L (или ее варианта hVH-8M) тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи h-mAb2. Ниже представлены последовательности таких полипептидов.
Аминокислотная последовательность hVH-6L (SEQ ID NO: 54):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRNKYNNYAT EYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Аминокислотная последовательность hVH-8L (SEQ ID NO: 55):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRNKYNNYAT EYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS hVH-6L и hVH-8L тяжелых цепей были, кроме того, модифицированы для получения вариантов, содержащих модификацию в виде замены на аспарагин в положении 52а (S52aN). Аминокислотные последовательности этих модифицированных вариабельных областей тяжелых цепей и соответствующие полинуклеотидные последовательности, кодирующие их, представлены ниже.
Аминокислотная последовательность hVH-6M (SEQ ID NO: 72):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT EYAASVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи hVH-6M (SEQ ID NO: 73):
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcaac acatacgcta tgaattgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttggaagg atcaggtcca agtacaacaa ttatgcaacc gagtatgccg actctgtgaa ggatagattc accatctcaa gagatgattc aaagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga cacggtaact tcggcaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggaca ggggacactg gtgactgtgt cttcc
Аминокислотная последовательность hVH-8M (SEQ ID NO: 74):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRNKYNNYAT EYAASVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи hVH-8M (SEQ ID NO: 75):
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcaac acatacgcta tgaattgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttgcaagg atcaggaaca agtacaacaa ttatgcaacc gagtatgccg actctgtgaa ggatagattc accatctcaa gagatgattc aaagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga cacggtaact tcggcaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggaca ggggacactg gtgactgtgt cttcc hVH-8 di-1 и hVH-8 di-2 тяжелых цепей являются особенно предпочтительными для получения антител, которые являются менее иммуногенными, чем антитела, в состав которых входят hVH-1, hVH-2,
- 40 033677 hVH-3, hVH-4, hVH-5, hVH-6, hVH7 или hVH-8 табл. 2. Такие деиммунизированные антитела будут предпочтительно состоять из или hVH-8 di-1 тяжелой цепи, или hVH-8 di-2 тяжелой цепи в комбинации с любой из VL-1 легкой цепи h-mAb2, VL-2 h-mAB2, VL-3 h-mAb2, VL-4 h-mAb2, VL-5 h-mAb2, VL-6 hmAb2, VL-7 h-mAb2, VL-8 h-mAb2, VL-9 h-mAb2 или VL-10 h-mAb2. Особенно предпочтительное деиммунизированное антитело будет состоять из hVH-8 di-1 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи h-mAb2, или hVH-8 di-2 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи h-mAb2.
Аминокислотная последовательность hXR32VH-8 di-1 (SEQ ID NO: 56):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKANSYTT YYAASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Аминокислотная последовательность hXR32VH-8 di-2 (SEQ ID NO: 57):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR TRSKANSYTT YYAASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Такие деиммунизированные антитела будут предпочтительно состоять из или hVH-8 di-1 тяжелой цепи, или hVH-8 di-2 тяжелой цепи в комбинации с любой из VL-1 легкой цепи h-mAb2, VL-2 h-mAB2, VL-3 h-mAb2, VL-4 h-mAb2, VL-5 h-mAb2, VL-6 h-mAb2, VL-7 h-mAb2, VL-8 h-mAb2, VL-9 h-mAb2 или VL-10 h-mAb2. Особенно предпочтительное деиммунизированное антитело будет состоять из hVH-8 di-1 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи h-mAb2, или hVH-8 di-2 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи hmAb2.
Были также созданы дополнительные гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 7). Аминокислотные последовательности таких вариантов представлены ниже, при этом изменения по сравнению с SEQ ID NO: 7 начертаны по лужирно и подчеркнуты.
Аминокислотная последовательность варианта a (I51T Y52cA) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 76):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
TASKANNYAT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта b (I51T N54S) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 77):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKYNSYAT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта с (I51T А56Т) вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 78):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKYNNYTT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта d (I51T Y52cA N54S) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 79):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
TRSKANSYAT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта e (I51T N54S А56Т) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 80):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKYNSYTT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта f (I51T Y52cA N54S А56Т) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 81):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
TRSKANSYTT YYADSVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта g (I51T D61A) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 82):
I EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
TRSKYNNYAT YYAASVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта h (I51T D65G) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 83):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта i (I51T Y52cA N54S D61A) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 84):
- 41 033677
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
TRSKANSYAT YYAASVKDRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта j (I51T Y52cA N54S D65G) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAb2 (SEQ ID NO: 85):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKANSYAT YYADSVKGRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта k (I51T Y52cA N54S D61A D65G) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 86):
EVKLLESGGG LVQPKGSLKL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKANSYAT YYAASVKGRF TISRDDSQSI LYLQMNNLKT EDTAMYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSA
Аминокислотная последовательность варианта 2k (I51T Y52cA N54S D61A D65G (VH8-A49G V93A)) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 87):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR TRSKANSYTT YYAASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Аминокислотная последовательность варианта 5k (I51T Y52cA N54S D61A D65G (VH8-V93A)) гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 (SEQ ID NO: 88):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR TRSKANSYTT YYAASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
Все такие дополнительные гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела mAB2 могут использоваться для образования деиммунизированных антител по настоящему изобретению. В состав таких дополнительных деиммунизированных и гуманизированных антител будет предпочтительно входить вариабельная область тяжелой цепи: a, b, с, d, e, f, g, h, i, j, k, 2k или 5k, в комбинации с любой из вариабельных областей легких цепей: VL-1 h-mAb2, VL-2 hmAb2, VL-3 h-mAb2, VL-4 h-mAB2, VL-5 h-mAb2, VL-6 h-mAb2, VL-7 h-mAb2, VL-8 h-mAb2, VL-9 hmAb2 или VL-10 h-mAb2. В состав особенно предпочтительного деиммунизированного антитела будет входить вариабельная область тяжелой цепи 2k или 5k и вариабельная область легкой цепи VL-6 hmAb2, или вариабельная область тяжелой цепи hVH-8M8L di-2 и вариабельная область легкой цепи VL-6 h-mAb2. Варианты 2k и 5k связываются с белком А в вариабельной области, что тем самым облегчает очистку молекул (таких как диатела), в которых могут отсутствовать Fc-области или другие домены, которые могут использоваться для отделения таких молекул от других молекул. Варианты hVH-8M, hVH8L, hVH-6M и hVH-6L проявляют уменьшенную иммуногенность по сравнению с соответствующими родительскими полипептидами.
Настоящее изобретение, в частности, имеет отношение к деиммунизированным и гуманизированным антителам, в состав которых входят hVH-8 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи. Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к деиммунизированным и гуманизированным антителам, в состав которых входят hVH-4 тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи. Кроме того, настоящее изобретение, в частности, имеет отношение к деиммунизированным и гуманизированным антителам, в состав которых входят hVH-2k тяжелой цепи и VL-6 легкой цепи.
Пример 6. Анализ связывающих свойств вариантов легкой и тяжелой цепей химерного и гуманизированного mAb2.
Для оценки способности химерного и гуманизированного mAB2 к связыванию с нечеловеческим CD3 был выполнен ELISA с захватом. Планшеты покрывали 1 мкл/мл экстраклеточного домена CD3 (растворимого CD3) (или человека, или яванского макака) и инкубировали в присутствии различных концентраций антитела. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 8А и 8В и показывают, что mAB2 и его гуманизированный вариант продемонстрировали равное связывание с растворимым CD3 человека и с растворимым CD3 яванского макака.
Пример 7. Количественный анализ связывания mAb2 с CD3 человека и CD3 яванского макака.
Для определения степени связывания между mAB2 и CD3 человека или яванского макака были выполнены анализы BIACORE™ В анализах BIACORE™ определяется скорость диссоциации, kd. Аффинность (KD) антитела к его мишени зависит от кинетических констант ассоциации (скорости ассоциации, ka) и диссоциации (скорости диссоциации, kd) в соответствии с уравнением KD=kd/ka. В анализах BIACORE™ используется поверхностный плазмонный резонанс для прямого определения этих кинетических параметров. Антитело против CD3 mAB2 (6,3-100 нМ) подвергали иммобилизации на подложке, используя антитела против ЕК, и инкубировали в присутствии растворимого CD3 человека (shCD3) или растворимого CD3 яванского макака (scCD3). Определяли динамику диссоциации, и выполняли приближение данных к двухвалентной природе антител. Результаты анализов BIACORE™ представлены на фиг. 9A-9D. Относящиеся к кинетике данные суммированы в табл. 3.
- 42 033677
Таблица 3
shCD3
Антитело ka k(1 KD
ch-mAb2 1.7 x 10? М+ек-1 2.5 x IO’3 сек-1 14.7 нМ
h-mAb2 1.9 x 10' M’1 сек'1 3.X x Ю’+ек 1 20.0 нМ
scCD3
Антитело ka kd Kd
ch-mAb2 1.6 x 10s M’1 сек1 2.3 x 10 J сек1 14.4 нМ
h-mAb2 1.7 x 10s M’1 сек-1 4.1 x Ю^сек1 24.1 нМ
Пример 8. Относящиеся к биспецифическому связыванию данные для диател DART™, содержащих CDR h-mAb2.
CDR гуманизированного mAB2 (h-mAb2) использовали для создания ряда диател DART™, содержащих первый эпитопсвязывающий сайт, способный к связыванию с CD3, и второй эпитопсвязывающий сайт, способный к связыванию с Her2/neu (диатело DART™ Her2-h-mAb2), или с CD19 (диатело DART™ CD19-h-mAb2), или с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) (диатело DART™ ERBITUX™-h-mAb2).
Диатело DART™ Her2/neu-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность hXR32VL-Her-2VH-E-спираль диатела DART™ Her2-h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью Her2VH и между последовательностью Her2VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 58):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
I GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQSGPELV KPGASLKLSC TASGFNIKDT YIHWVKQRPE QGLEWIGRIY PTNGYTRYDP KFQDKATITA DTSSNTAYLQ VSRLTSEDTA VYYCSRWGGD GFYAMDYWGQ GASVTVSSGG CGGGKVAALK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
Аминокислотная последовательность Her2VL-hXR32VH-K-спираль диатела DART™ Her2-h-mAb2 (линкеры между последовательностью Her2VL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью К-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 59):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGNRSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKLEIKRAG GGSGGGGEVQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASGFTFNTYA MNWVRQAPGK GLEWVARIRS KYNNYATYYA DSVKDRFTIS RDDSKNSLYL QMNSLKTEDT AVYYCVRHGN FGNSYVSWFA YWGQGTLVTV SSGGCGGGEV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
Диатело DART™ CD19-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность CD19VL-hXR32VH-E-спираль диатела DART™ CD19-hmAb2 (линкеры между последовательностью CD19VL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 60):
DIQLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYLNWY QQIPGQPPKL
LIYDASNLVS GIPPRFSGSG SGTDFTLNIH PVEKVDAATY HCQQSTEDPW
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFNT YAMNWVRQAP GKGLEWVARI RSKYNNYATY YADSVKDRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEK
Аминокислотная последовательность hXR32VL-CD19VH-K-спираль диатела DART™.
CD19-h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью CD19VH и между последовательностью CD19VH и последовательностью K-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 61):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQSGAELV RPGSSVKISC KASGYAFSSY
WMNWVKQRPG QGLEWIGQIW PGDGDTNYNG KFKGKATLTA DESSSTAYMQ
LSSLASEDSA VYFCARRETT TVGRYYYAMD YWGQGTTVTV SSGGCGGGKV
AALKEKVAAL KEKVAALKEK VAALKE
Диатело DART™ ERBITUX™-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность hXR32VL-EGFRVH-E-спираль диатела DART™ ERBITUX™h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью EGFRVH и между последовательностью EGFRVH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 62):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKQSGPGLV QPSQSLSITC TVSGFSLTNY GVHWVRQSPG KGLEWLGVIW SGGNTDYNTP FTSRLSINKD NSKSQVFFKM NSLQSNDTAI YYCARALTYY DYEFAYWGQG TLVTVSSGGC GGGEVAALEK
EVAALEKEVA ALEKEVAALE К
Аминокислотная последовательность EGFRVL-hXR32VH-K-спираль диатела DART™ ERBITUX™h-mAb2 (линкеры между последовательностью EGFRVL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью K-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 63):
- 43 033677
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA GTKLELKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFNTYAMN WVRQAPGKGL EWVARIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
Было установлено, что такие диатела DART™ способны к связыванию с CD3 яванского макака (фиг. 10А-10С).
CDR гуманизированного mAB2 (h-mAB2) использовали для создания ряда диател DART™, содержащих первый эпитопсвязывающий сайт, способный к связыванию с CD3, и второй эпитопсвязывающий сайт, способный к связыванию с В7-И3 (диатело DART™ В7-H3-1-h-mAB2 и B7-H3-2-h-mAb2).
Диатело DART™ B7-H3-1-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность hBRCA69DVL-hXR32VH-E-спираль диатела DART™ B7-H31-h-mAb2 (линкеры между последовательностью hBRCA69DVL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 64):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFNTYAM NWVRQAPGKG LEWVARIRSK YNNYATYYAD SVKDRFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SGGCGGGEVA ALEKEVAALE KEVAALEKEV AALEK
Аминокислотная последовательность hXR32VL-hBRCA69DVH-K-спираль диатела DART™ B7-H3-
1- h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью hBRCA69DVH и между последовательностью hBRCA69DVH и последовательностью К-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 65):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
Диатело DART™ B7-H3-2-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность hBRCA8 4DVL-hXR32VH-E-спираль диатела DART™ B7-H3-
2- h-mAb2 (линкеры между последовательностью hBRCA84DVL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 66):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFNTYAM NWVRQAPGKG LEWVARIRSK YNNYATYYAD SVKDRFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SGGCGGGEVA ALEKEVAALE KEVAALEKEV AALEK
Аминокислотная последовательность hXR32VL-hBRCA8 4DVH-K-спираль диатела DART™ B7-H32-h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью hBRCA84DVH и между последовательностью hBRCA84DVH и последовательностью K-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 67):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
Было установлено, что такие антитела DART™ способны к связыванию с растворимым CD3 яванского макака (фиг. 10D).
Пример 9. Диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении HER2/neu и CD3, опосредуют мощное перенаправленное, опосредуемое Т-клетками уничтожение.
Были приготовлены диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении HER2/neu и CD3. Такие диатела DART™ обладают способностью локализовать Т-клетку (в результате связывания такой Т-клетки с CD3-связывающей частью CD3-связывающего диатела DART™) в положении опухолевой клетки (в результате связывания такой раковой клетки с HER2/neu-связывающей частью диатела DART™). Локализованная Т-клетка может затем уничтожать опухолевую клетку в ходе процесса, называемого здесь перенаправленным уничтожением.
Было сконструировано диатело - перенаправляющий реагент с двумя аффинностями (DART™), специфический в отношении HER2/neu и CD3, содержащее способные к связыванию с HER2/neu вариабельные домены трастузумаба и способные к связыванию с CD3 вариабельные домены VH-8 h-mab2 и VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 58-59).
- 44 033677
Для демонстрации способности диател DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения раковых клеток, описанное выше HER2/neuxCD3-биспецифическое диатело DART™ инкубировали в различных концентрациях с опухолевыми клетками-мишенями (опухолевыми клетками SKOV-3, опухолевыми клетками SKBR-3, опухолевыми клетками А549 и опухолевыми клетками MCF-7) и покоящимися РВМС-эффекторами (отношение Е:Т=30:1), и определяли цитотоксичность (анализ LDH). Результаты этих исследований свидетельствуют о способности HER2/neuxCD3-биспецифического диатела DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения опухолевых клеток.
Пример 10. Терапия с использованием моноклонального антитела против TCR для пациентов с диабетом аутоиммунного генеза.
Пациенты.
пациентов с диабетом типа 1 привлекают для участия в соответствии со следующими критериями: возраст между 7 и 20 лет, диагностирование в пределах 6 недель в соответствии с критериями Американской ассоциации диабетологов и подтверждение наличия аутоантител против GAD65, ICA512 и/или инсулина. Пациенты остаются под наблюдением их личных врачей в ходе исследования.
Подходящих для участия в исследовании пациентов случайным образом зачисляют в контрольную группу и группу лечения гуманизированным антителом против CD3 (N297Q) (включающим VH-8 hmab2 и VL-6 h-mab2). После рандомизации отбирают образцы крови для установления исходных уровней HA1c, устанавливают ответ в виде увеличения С-пептида до лечения в ММТТ, и выполняют FPIR до лечения в IGTT. Пациентов обеих групп госпитализируют для получения ими или б-дневного курса лечения гуманизированным моноклональным антителом против CD3 (N297Q), или плацебо. Антитело вводят внутривенно в следующей дозе: 17 мкг/м2 в день 1, 34,3 мкг/м2 в день 2, 69 мкг/м2 в день 3, 137,6 мкг/м2 в день 4 и 275,3 мкг/м2 в дни 5 и 6. Альтернативно, антитело может внутривенно вводиться в следующей дозе: 1,6 мкг/кг/день в день 1; 3,2 мкг/кг/день в день 2; 6,5 мкг/кг/день в день 3; 13 мкг/кг/день в день 4 и 26 мкг/кг/день в дни 5-14. В исследованиях с использованием увеличения дозы лечение может представлять собой, например, 1,42 мкг/кг/день в день 1; 5,7 мкг/кг/день в день 2; 11 мкг/кг/день в день 3; 26 мкг/кг/день в день 4 и 45,4 мкг/кг/день в дни 5-14. В последующих исследованиях терапию меняют с увеличением дозы и/или с уменьшением периода времени лечения. Например, в последующих исследованиях пациентам может назначаться 4-дневное лечение: 6,4 мкг/кг/день в день 1; 13 мкг/кг/день в день 2 и 26 мкг/кг/день в дни 3 и 4; во время дополнительных исследований с использованием увеличения дозы лечение может представлять собой 8 мкг/кг/день в день 1; 16 мкг/кг/день в день 2 и 32 мкг/кг/день в дни 3 и 4.
Во время первоначальных исследований дозу антитела в первые три дня лечения вводят с помощью медленной внутривенной инфузии в течение 20 ч для слежения за неблагоприятными реакциями. В последующих исследованиях время введения будут уменьшать, и/или дозу будут разбивать на 2-4 равных части, которые будут вводить в виде болюсных инъекций, равномерно распределенных в течение периода, составляющего 12 ч. Пациенты контрольной группы подвергаются метаболическим и иммунологическим исследованиям, но не получают моноклональные антитела. На протяжении всего исследования осуществляют контроль в отношении иммуносупрессорных эффектов моноклонального антитела против CD3 (N297Q) у пациентов.
За пациентами следят в течение 18 месяцев после лечения. Функционирование β-клеток определяют каждые 6 месяцев в случае уменьшенной толерантности к глюкозе и каждые 12 месяцев в случае нормальной толерантности к глюкозе. Пациентам разрешают соблюдать нормальный режим питания, и они остаются под наблюдением их личных врачей на протяжении всего исследования. Иммунологические анализы повторяют с интервалами в 6 месяцев. Пациенты будут получать терапию с использованием инсулина, как предписано их личными врачами.
Функционирование β-клеток будут анализировать в соответствии с изменениями уровней Спептида, определяемых с помощью радиоиммуноанализа. После отбора образцов для установления исходных уровней С-пептида и глюкозы пациентам дают смешанную пищу. Уровни С-пептида определяют в образцах, отобранных через 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 мин. Ответ в виде увеличения Спептида в тесте толерантности к смешанной пище (ММТТ) представляют в виде общей площади под кривой ответа (AUC). Считается, что изменение ответа произошло, если ответ отличается на более чем 7,5% от ответа при вхождении в исследование. Ответы в виде увеличения С-пептида у пациентов в ММТТ постоянно проверяют через 6, 9, 12, 15 и 18 месяцев после лечения. Альтернативно, функционирование β-клеток оценивают с использованием FPIR (выброса инсулина на первой фазе) в IGTT. Уровни инсулина в сыворотке определяют с использованием модификации способа радиоиммуноанализа с использованием двух антител, используя моноиодированный тирозин А14-меченный инсулин (Amersham Pharmacia). FPIR рассчитывают как сумму уровней инсулина через 1 и 3 мин после введения глюкозы (0,5 г/кг). Уровни гликозилированного гемоглобина определяют с помощью исследования ингибирования латекс-агглютинации.
Иммунологическая проверка.
Уровень аутоантител против GAD65, IA2/ICA512 и инсулина определяют с помощью анализов ра
- 45 033677 диосвязывания, известных в данной области техники (например, Woo et al., 2000, J. Immunol Methods 244: 91-103). Генотипирование HLA-DQA и HLA-DQB выполняют с помощью прямого секвенирования полиморфизмов экзона 2 после амплификации с помощью ПЦР. Уровень цитокинов в сыворотке после введения моноклонального антитела определяют с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Продукцию антиидиотипических антител проверяют с помощью анализа ELISA, используя связанное с планшетом антитела против CD3 (N297Q), или с помощью проточной цитометрии для определения блокирования связывания анти-CD3-FITC с CD3-цепью TCR.
Статистический анализ.
Будут проводиться анализы данных, касающихся остаточной функции β-клеток, уровня аутоантител, уровня цитокинов и уровня гликозилированного гемоглобина. χ2 анализ будут проводить для проверки эффекта лечения лекарственным средством до и после введения лекарственного средства. Сравнение между контрольной группой и группой лечения будут осуществлять с помощью U-критерия МаннаУитни.
Пример 11. Диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении B7H3 и CD3, опосредуют мощное перенаправленное, опосредуемое Т-клетками уничтожение.
Были приготовлены диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении B7H3 и CD3. B7H3 был иммуногистологически обнаружен в линиях опухолевых клеток (Chapoval, A. et al. (2001) В7-П3: А Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production, Nature Immunol. 2: 269-274; Saatian, B. et al. (2004) Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation, Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287: L217-L225; Castriconi et al. (2004) Identification Of 4Ig-B7-H3 As A NeuroblastomaAssociated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al.(2002) Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes, J. Immunol. 168: 6294-6297). Несколько независимых исследований показали, что злокачественные опухолевые клетки человека демонстрируют явное увеличение экспрессии белка В7-113, и что эта увеличенная экспрессия связана с увеличением тяжести заболевания (Zang, X. et al. (2007) The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition, Clin. Cancer Res. 13: 5271-5279), что наводит на мысль о том, что В7-113 используется опухолями в качестве пути ускользания от иммунной системы (Hofmeyer, K. et al. (2008) The Contrasting Role Of B7-H3, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).
CD3-связывающая часть таких антител DART™ состояла из описанных выше вариабельных областей легкой и тяжелой цепей гуманизированного mAB2 против CD3 (VH-8 h-mAb2 и VL-6 h-mAb2). B7H3-связывающая часть таких антител DART™ состояла из легкой цепи hBRCA84D-2 и тяжелой цепи hBRCA84D-2 (SEQ ID NO: 66-67).
Такие диатела DART™ обладают способностью локализовать Т-клетку (в результате связывания такой Т-клетки с CD3-связывающей частью CD3-связывающего диатела DART™) в положении опухолевой клетки (в результате связывания такой раковой клетки с B7H3-связывающей частью диатела DART™). Локализованная Т-клетка может затем опосредовать уничтожение опухолевой клетки в ходе процесса перенаправленного уничтожения.
Для демонстрации способности таких диател DART™ к опосредованию такого перенаправленного уничтожения раковых клеток диатело DART™ инкубировали в различных концентрациях с опухолевыми клетками-мишенями (опухолевыми клетками А498, опухолевыми клетками RECA905021E) и покоящимися РВМС-эффекторами (отношение Е:Т=30:1), и определяли цитотоксичность (анализ LDH). Диатело DART™ (4420-h-mAb2), обладающее двумя специфичностями к CD3 (h-mAb2) и флуоресцеину (антитело 4420), использовали в качестве контроля.
Диатело DART™ 4420-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность 4420VL-hXR32VH-E-спираль диатела DART™ 4420-h-mAb2 (линкеры между последовательностью 4420VL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 68):
DWMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
Аминокислотная последовательность hXR32VL-4420VH-K-спираль диатела DART™ 4420-h-mAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью 4420VH и между последовательностью 4420VH и последовательностью K-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 69):
- 46 033677
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY
WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY
LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
Результаты этих исследований (фиг. 11А-11В) указывают на способность B7H3xCD3биспецифического диатела DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих B7H3.
Пример 12. Диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении A33 и CD3, опосредуют мощное перенаправленное, опосредуемое Т-клетками уничтожение.
Были приготовлены диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении A33 и CD3 (диатело DART™ A33-h-mAb2). A33 является мембранным антигеном, который эксрессируется в нормальном эпителии толстой кишки и тонкой кишки человека и в >95% раков толстой кишки человека (Heath, J.K. et al. (1997) The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 469-474).
Такие диатела DART™ обладают способностью локализовать Т-клетку (в результате связывания такой Т-клетки с CD3-связывающей частью CD3-связывающего диатела DART™) в положении опухолевой клетки (в результате связывания такой раковой клетки с A33-связывающей частью диатела DART™). Локализованная Т-клетка может затем опосредовать уничтожение опухолевой клетки в ходе процесса перенаправленного уничтожения.
CD3-связывающая часть таких диател DART™ состояла из описанных выше вариабельных областей легкой и тяжелой цепей гуманизированного mAB2 (VH-8 h-mAb2 и VL-6 h-mAb2). A33-связывающая часть таких диател DART™ состояла из антитела RECA47.
Диатело DART™ A33-h-mAb2.
Аминокислотная последовательность RECA47VL-hXR32VH-K-спираль диатела DART™ A33-hmAb2 (линкеры между последовательностью RECA47VL и последовательностью hXR32VH и между последовательностью hXR32VH и последовательностью K-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 70):
QIVLTQSPAI MSASPGERVT MTCSARSSIS FMYWYQQKPG SSPRLLIYDT SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGSG TKLELKRGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFNTYAMN WVRQAPGKGL EWVARIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
Аминокислотная последовательность hXR32VL-RECA47VH-E-спираль диатела DART™ A33-hmAb2 (линкеры между последовательностью hXR32VL и последовательностью RECA47VH и между последовательностью RECA47VH и последовательностью Е-спирали подчеркнуты) (SEQ ID NO: 71):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQSGPELV KPGASVKISC KASGYTFSGS WMNWVKQRPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDKATLTA DKSSTTAYME LSSLTSVDSA VYFCARIYGN NVYFDVWGAG TTVTVSSGGC GGGEVAALEK EVAALEKEVA ALEKEVAALE К
Для демонстрации способности таких диател DART™ к опосредованию такого перенаправленного уничтожения раковых клеток, диатело DART™ инкубировали в различных концентрациях с опухолевыми клетками-мишенями (опухолевыми клетками Со1о205, опухолевыми клетками RECA905021E) и покоящимися РВМС-эффекторами (отношение Е:Т=30:1), и определяли цитотоксичность (анализ LDH). Результаты этих исследований (фиг. 12А-12Е) свидетельствуют о способности A33xCD3биспецифических диател DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих A33.
Пример 13. Диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™), специфические в отношении CD3, приводят к перенаправленному, опосредуемому Т-клетками уничтожению, эквивалентному таковому в случае других специфических в отношении CD3 человека диател.
Для дальнейшей оценки диател - перенаправляющих реагентов с двумя аффинностями (DART™), специфических в отношении CD3 по настоящему изобретению, способность описанного выше диатела DART™ CD19-h-mAb2 к вызову перенаправленного, опосредуемого Т-клетками уничтожения сравнивали с таковой CD19xCD3-биспецифического диатела DART Moore, Р.А. и др. (2011) (Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17): 4542-4551). Диатело DART™ CD19-h-mAb2 проявляет специфичность в отношении CD3 человека, а также нечеловеческого CD3; CD19xCD3-биспецифическое диатело DART Moore, Р.А. и др. (2011) проявляет специфичность в отношении только CD3 человека.
- 47 033677
Соответственно клетки В-клеточной лимфомы человека Raji (смотрите Drexler, H.G. et al. (1998) History And Classification Of Human Leukemia-Lymphoma Cell Lines, Leuk. Lymphoma 31(3-4): 305-316; Arndt, R. (1984) Demonstration Of C3-Binding Circulating Immune Complexes Using Raji, Conglutinin And Anti-C3 Assays - A Critical Review, Immun. Infekt. 12(1): 3-11) или клетки лимфомы из клеток ткани человека JeKo-1 (Salaverria, I. et al. (2006) Mantle Cell Lymphoma: From Pathology And Molecular Pathogenesis To New Therapeutic Perspectives, Haematologica 91: 11-16; Jeon, H.J. et al. (1998) Establishment And Characterization Of A Mantle Cell Lymphoma Cell Line, Br. J. Haematol. 102(5): 1323-1326) инкубировали в присутствии диатела DART™ и покоящихся мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) (Е:Т=30:1). Результаты этого эксперимента (фиг. 13А и 13В) показывают, что диатело DART™ CD19-hmAb2 по настоящему изобретению приводит к перенаправленному, опосредуемому Т-клетками уничтожению, которое эквивалентно таковому, отмечаемому при использовании CD19xCD3-биспецифического диатела DART, специфического в отношении CD3 человека. Таким образом, расширение специфичности в отношении нечеловеческих гомологов CD3 не уменьшало способность диатела DART™ к опосредованию перенаправленного уничтожения.
Пример 14. Перенаправленный цитолиз с помощью диател перенаправляющих реагентов с двумя аффинностями (DART™), специфических в отношении CD3, обладающих перекрестной реактивностью с CD3 яванского макака.
Была исследована способность описанного выше диатела DART™ CD19-h-mAb2 DART™ к вызову перенаправленного, опосредуемого Т-клетками уничтожения в присутствии Т-клеток или человека, или яванского макака.
Клетки рака толстой кишки человека НТ-29 (Marchis-Mouren, G. et al. (1988) HT 29, A Model Cell Line: Stimulation By The Vasoactive Intestinal Peptide (VIP); VIP Receptor Structure And Metabolism, Biochimie 70(5): 663-671; Fogh, J. et al. (1975) In: J. Fogh (ed.), HUMAN TUMOR CELLS IN VITRO, New York: Plenum Press. 1975) инкубировали в присутствии Т-клеток человека или яванского макака (отношение Е:Т=30:1) и или описанного выше диатела DART™ CD19-h-mAb2, или CD19xCD3биспецифического диатела DART, иО3-связывающие последовательности которого происходят из антитела FN-18. Антитело FN-18 проявляет специфичность в отношении только CD3 яванского макака (Nooij, F.J. et al. (1986) Differentiation Antigens On Rhesus Monkey Lymphocytes. I. Identification Of T Cells Bearing CD3 And CD8, And Of A Subset Of CD8-Bearing Cells, Eur. J. Immunol. 16(8): 975-979; Meng, G. et al. (1998) The Effect Of Anti-CD3-Immunotoxin On T Lymphocyte Function in vitro, Transpl. Immunol. 6(1): 53-59). Определяли результирующей процент цитотоксичности в зависимости от концентрации диател. Результаты (фиг. 14А и 14В) показывают, что диатело DART™ CD19-h-mAb2 способно к опосредованию цитолиза в присутствии Т-клеток-эффекторов или человека, или яванского макака. В отличие от этого, диатело FN-18 было способно к опосредованию цитолиза только в присутствии Т-клеток яванского макака.
Пример 15. Диатела - перенаправляющие реагенты с двумя аффинностями (DART™) нуждаются во вхождение в контакт с клетками-мишенями.
Для демонстрации того, что наблюдаемое перенаправленное уничтожение, опосредуемое CD3специфическим диателом DART™ по настоящему изобретению, было специфическим, определяли степень уничтожения в присутствии и в отсутствие клеток-мишеней.
РМВС человека инкубировали в присутствии описанного выше диатела DART™ ERBITUX™-hmAb2, (ERBITUX™-Т-клеточный рецептор)-биспецифического диатела DART™ (способного к связыванию с EGFR (рецептором эпидермального фактора роста) и Т-клеточным рецептором) или диатела DART™ ERBITUX™-CD3 FN18 (способного к связыванию с EGFR и с CD3 яванского макака). Инкубации проводили в присутствии или в отсутствие клеток рака почки А498-мишеней (Giard, D.J. et al. (1973) In vitro Cultivation Of Human Tumors: Establishment Of Cell Lines Derived From A Series Of Solid Tumors, J. Natl. Cancer Inst. 51: 1417-1423; Fogh, J. (1978) Cultivation, Characterization, And Identification Of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney, Testis And Bladder Tumors, Natl. Cancer Inst. Monogr. 49:5-9).
Гликопротеин CD69 является ранним антигеном активации Т- и В-лимфоцитов, представленным на клетках большинства гемопоэтических линий, включая нейтрофилы, после стимуляции (Atzenia, F. et al. (2002) Induction Of CD69 Activation Molecule On Human Neutrophils by GM-CSF, IFN-γ, and IFN-α, Cellular Immunol. 220(1): 20-29). По этой причине в качестве способа оценки активации иммунной системы определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) CD69 (в зависимости от концентрации диател) (смотрите, например, Ampel, N.M. et al. (2002) In Vitro Whole-Blood Analysis of Cellular Immunity in Patients with Active Coccidioidomycosis by Using the Antigen Preparation T27K, Clinical Diagnostic Laboratory Immunology 9 (5): 1039-1043).
Результаты (фиг. 15А и 15В) показывают, что активация иммунной системы (определяемая по MFI CD69) увеличивалась, только когда CD4+ или CD8+ Т-клетки инкубировали с диателом DART™ ERBITUX™-h-mAb2 по настоящему изобретению или (ERBITUX™-Т-клеточный рецептор)-биспецифическим диателом DART™ (способным к связыванию с EGFR и с Т-клеточным рецептором). Диатело DART™
- 48 033677
ERBITUX™-CD3 FN18 (способное к связыванию с EGFR и с CD3 яванского макака) не вызывало увеличение MFI CD69.
Пример 16. Перенаправленное уничтожение с помощью гуманизированных, обладающих реактивностью с CD3 яванского макака/человека диател DART™.
Для дальнейшей демонстрации способности диател DART™ по настоящему изобретению к опосредованию перенаправленного уничтожения использовали клетки рака почки А498-мишени или клетки плоскоклеточного рака А431 (Lee, C.M. et al. (2010) The Distribution Of The Therapeutic Monoclonal Antibodies Cetuximab And Trastuzumab Within Solid Tumors BMC Cancer 10: 255; pages 1-11; Bryant, J.A. et al. (2004) EGF Activates Intracellular And Intercellular Calcium Signaling By Distinct Pathways In Tumor Cells, Cancer Biol. Ther. 3(12): 1243-1249) и определяли степень перенаправленного уничтожения, опосредуемого различными диателами DART™, в присутствии клеток РМВС-эффекторов (Е:Т=30:1).
Клетки инкубировали в присутствии или диатела DART™ ERBITUX™-h-mAb2, диатела DART™ ERBITUX™-m-mAb2 или диатела DART™ 4420-h-mAb2 (в качестве отрицательно контроля) или контрольного второго антитела. Связывание с клетками-мишенями определяли с помощью измерения MFI. Перенаправленное уничтожение определяли посредством измерения % цитотоксичности.
Результаты этого исследования представлены на фиг. 16А-16D. Было установлено, что диатела, обладающие специфичностью в отношении CD3 и EGFR, способны к связыванию с клетками А498 или А431 (фиг. 16А и 16С соответственно) и к опосредованию перенаправленного уничтожения этих клеток (фиг. 16В и 16D соответственно).
Все публикации и патенты, упомянутые в этом описании, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы было специально и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или заявка на патент включена посредством ссылки в ее полном объеме. Хотя настоящее изобретение было описано применительно к конкретным вариантам его осуществления, будет понятно, что возможны дальнейшие модификации, и что эта заявка, как предполагается, охватывает любые вариации, применения или адаптации настоящего изобретения, следующие, в общем, принципам настоящего изобретения и включающие такие отклонения от описания настоящего изобретения, которые подпадают под известную или обычную практику в области техники, к которой относится настоящее изобретение и которые могут быть применимы к существенным признакам, изложенным выше.

Claims (26)

    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
  1. (1) указанные домены (А) и (Е) связаны с образованием указанного антигенсвязывающего домена, который способен к иммуноспецифическому связыванию как с CD3 человека, так и с CD3 млекопитающего, являющегося человеком;
    1. CD3-связывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий фрагмент антитела, причем указанный антигенсвязывающий фрагмент содержит CD3-специфический VL-домен антитела и CD3специфический VH-домен антитела, причем указанный CD3-специфический VL-домен и указанный CD3-специфический VH-домен образуют антигенсвязывающий домен, способный к иммуноспецифическому связыванию как с эпитопом CD3 человека, так и с эпитопом CD3 млекопитающего, не являющегося человеком, причем:
    (I) указанный CD3-специфический VL-домен выбран из группы, состоящей из
    VL-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 22),
    VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26),
    VL-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 28),
    VL-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 30),
    VL-9 h-mab2 (SEQ ID NO: 32) и
    VL-10 h-mab2 (SEQ ID NO: 34); и (II) указанный CD3-специфический VH-домен выбран из группы, состоящей из
    VH-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 36),
    VH-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 38),
    VH-3 h-mab2 (SEQ ID NO: 40),
    VH-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 42),
    VH-5 h-mab2 (SEQ ID NO: 44),
    VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46),
    VH-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 48) и
    VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50).
  2. (2) указанные домены (В) и (D) связаны с образованием сайта связывания, который иммуноспецифически связывается со вторым эпитопом, указанный второй эпитоп отличается от эпитопа CD3, с которым связывается антигенсвязывающий домен, образованный вследствие указанного связывания указанных доменов (А) и (Е); и (3) указанные домены (С) и (F) ковалентно связаны вместе.
    2. CD3-связывающая молекула по п.1, в которой указанным CD3-специфическим VL-доменом является VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26).
  3. 3. CD3-связывающая молекула по п.1 или 2, в которой указанным CD3-специфическим VHдоменом является VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50) или VH-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 42).
  4. 4. CD3-связывающая молекула по любому из пп.1-3, которая является антителом.
  5. 5. CD3-связывающая молекула по п.4, причем указанное антитело не содержит Fc-области.
  6. 6. CD3-связывающая молекула по п.4, причем указанное антитело содержит Fc-область, которая:
    (i) лишена эффекторной функции; или (ii) обладает пониженной эффекторной функцией; или
    - 49 033677 (iii) у него ограничена способность Fc-области антитела связываться с Fc-рецептором, причем указанное отсутствие эффекторной функции, указанная пониженная эффекторная функция и указанная ограниченная связывающая способность сравнивается с функцией Fc-рецептора дикого типа.
  7. 7. CD3-связывающая молекула, содержащая CD3-специфический VL-домен антитела и CD3специфический VH-домен антитела, причем указанная молекула представляет собой CD3-связывающее диатело, которое содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, указанные цепи ковалентно связаны друг с другом, причем:
    (I) указанная первая полипептидная цепь содержит амино (N-) конец и карбокси (С-) конец и расположена от N-конца к С-концу:
    (i) домен (А), содержащий указанный CD3-специфический VL-домен, причем указанный CD3специфический VL-домен выбран из группы, состоящей из
    VL-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 22),
    VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26),
    VL-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 28),
    VL-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 30),
    VL-9 h-mab2 (SEQ ID NO: 32) и
    VL-10 h-mab2 (SEQ ID NO: 34);
    (ii) домен (В), содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2); и (iii) домен (С), причем указанные домены (А) и (В) не связываются друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта; и (II) указанная вторая полипептидная цепь содержит амино (N-) конец и карбокси (С-) конец и находится от N-конца к С-концу:
    (i) домен (D), содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи указанного второго иммуноглобулина (VL2);
    (ii) домен (Е), содержащий указанный CD3-специфический VH-домен, причем указанный CD3специфический VH-домен выбран из группы, состоящей из
    VH-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 36),
    VH-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 38),
    VH-3 h-mab2 (SEQ ID NO: 40),
    VH-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 42),
    VH-5 h-mab2 (SEQ ID NO: 44),
    VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46),
    VH-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 48) и
    VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50); и (iii) домен (F);
    причем указанные домены (D) и (Е) не связаны друг с другом с образованием эпитопсвязывающего сайта, причем:
  8. 8. CD3-связывающая молекула по п.7, в которой указанный второй эпитоп не является эпитопом CD3.
  9. 9. CD3-связывающая молекула по п.7, в которой указанным вторым эпитопом является эпитоп CD3, который отличается от эпитопа CD3, с которым связывается антигенсвязывающий домен, образованный вследствие указанного связывания указанных доменов (А) и (Е).
  10. 10. CD3-связывающая молекула по любому из пп.1-9, которая гуманизирована.
  11. 11. CD3-связывающая молекула по любому из пп.1-3 или 7-10, которая способна к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и флуоресцеином.
  12. 12. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-10, которая способна к иммуноспецифическому связыванию и с (i) CD3, и с (ii) (а) опухолеспецифическим антигеном или (ii) (b) антигеном клеточной поверхности, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности.
  13. 13. CD3-связывающая молекула по п.12, которая способна к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и с опухолеспецифическим антигеном, экспрессированным на опухолевой клетке, причем указанной опухолевой клеткой является клетка злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из
    - 50 033677 рака молочной железы, рака предстательной железы, рака желудка, рака легкого, рака ободочной кишки, рака прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичника, рака ротовой полости, рака глотки, рака пищевода, рака гортани, рака кости, рака кожи, меланомы, рака матки, рака яичек, рака мочевого пузыря, рака почки, рака головного мозга, глиобластомы, рака щитовидной железы, лимфомы, миеломы и лейкоза.
  14. 14. CDS-связывающая молекула по п.12, которая способна к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и с антигеном, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности, причем указанным антигеном, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности является HER2/neu, B7-H3, CD20, PSMA, IGF-1R или Ep-CAM.
  15. 15. CDS-связывающая молекула по п.12, которая способна к иммуноспецифическому связыванию с CD3 и с антигеном, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности, причем указанным антигеном, рецептором или лигандом рецептора клеточной поверхности является молекула, которая вовлечена в указанное связывание Т-клетки с В-клеткой, указанная молекула, которая вовлечена в указанное связывание Т-клетки с В-клеткой, выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD32B, CD38, CD40, CD79a, CD79b, CD80, CD86, LFA-I, LFA-3 и CFA-I.
  16. 16. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-10 и 12-14, причем указанный второй эпитопсвязывающий сайт способен связываться с В7-Н3.
  17. 17. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-16, в которой CD3-специфический VL-домен представляет собой h-mab2 VL-6 (SEQ ID NO: 26).
  18. 18. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-17, в которой CD3-специфический VH-домен представляет собой h-mab2 VH-8 (SEQ ID NO: 50) или h-mab2 VH-4 (SEQ ID NO: 42).
  19. 19. CD3-связывающая молекула по п.18, в которой:
    (A) CD3-специфический VL-домен представляет собой h-mab2 VL-6 (SEQ ID NO: 26) и (B) CD3-специфический VH-домен представляет собой h-mab2 VH-4 (SEQ ID NO: 42).
  20. 20. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-19, в которой CD3-связывающее диатело содержит Fc-домен или его часть.
  21. 21. CD3-связывающая молекула по любому из пп.7-20, в которой:
    (A) указанный первый полипептид содержит последовательность Е-спирали и указанный второй полипептид содержит последовательность K-спирали или (B) указанный первый полипептид содержит последовательность K-спирали и указанный второй полипептид содержит последовательность Е-спирали.
  22. 22. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, аутоиммунного или воспалительного заболевания, которая содержит CD3-связывающую молекулу по любому из пп.1-21 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
  23. 23. Применение CD3-связывающей молекулы по любому из пп.1-21 для получения лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования, аутоиммунного или воспалительного заболевания.
  24. 24. Применение фармацевтической композиции по п.22 для получения лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования, аутоиммунного или воспалительного заболевания.
  25. 25. Применение по п.23 или 24, причем аутоиммунное или воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из инсулинозависимого диабета типа I, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, миастении гравис, целиакии, синдрома Шегрена, болезни Грейвса, болезни Крона, аутоиммунного гепатита, псориаза, псориатического артрита, астмы, аллергического ринита, эффектов вследствие трансплантации органа или болезни трансплантат против хозяина (GVHD).
  26. 26. Применение по п.25, причем указанное аутоиммунное или воспалительное заболевание представляет собой инсулинозависимый диабет типа I.
EA201391735A 2011-05-21 2012-05-16 Cd3-связывающие молекулы, способные к связыванию с cd3 человека и cd3, не являющимся человеческим EA033677B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161488716P 2011-05-21 2011-05-21
US201161530353P 2011-09-01 2011-09-01
PCT/US2012/038219 WO2012162067A2 (en) 2011-05-21 2012-05-16 Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391735A1 EA201391735A1 (ru) 2014-03-31
EA033677B1 true EA033677B1 (ru) 2019-11-15

Family

ID=47217980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391735A EA033677B1 (ru) 2011-05-21 2012-05-16 Cd3-связывающие молекулы, способные к связыванию с cd3 человека и cd3, не являющимся человеческим

Country Status (32)

Country Link
US (4) US9587021B2 (ru)
EP (2) EP2714733B1 (ru)
JP (4) JP6141831B2 (ru)
KR (2) KR102060389B1 (ru)
CN (3) CN107827985A (ru)
AU (3) AU2012259161B2 (ru)
BR (2) BR112013029893A2 (ru)
CA (1) CA2836857C (ru)
CL (3) CL2013003329A1 (ru)
CO (1) CO6970560A2 (ru)
CY (1) CY1122020T1 (ru)
DK (1) DK2714733T3 (ru)
EA (1) EA033677B1 (ru)
EC (1) ECSP13013101A (ru)
ES (1) ES2732213T3 (ru)
HR (1) HRP20190756T1 (ru)
HU (1) HUE044209T2 (ru)
IL (3) IL229575B (ru)
LT (1) LT2714733T (ru)
MA (1) MA35174B1 (ru)
ME (1) ME03440B (ru)
MX (1) MX369220B (ru)
MY (1) MY173899A (ru)
NZ (1) NZ703939A (ru)
PL (1) PL2714733T4 (ru)
PT (1) PT2714733T (ru)
RS (1) RS58765B1 (ru)
SG (3) SG195072A1 (ru)
SI (1) SI2714733T1 (ru)
UA (3) UA115402C2 (ru)
WO (1) WO2012162067A2 (ru)
ZA (1) ZA201308602B (ru)

Families Citing this family (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN103052649B (zh) 2010-07-29 2015-12-16 Xencor公司 具有修改的等电点的抗体
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
WO2012145714A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Emergent Product Development Seattle, Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
SI2714733T1 (sl) * 2011-05-21 2019-06-28 Macrogenics, Inc. CD3-vezavne molekule sposobne vezave na humani ali ne-humani CD3
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CN104395344B (zh) 2012-05-07 2019-08-13 达特茅斯大学理事会 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
EP2869845B1 (en) 2012-07-06 2019-08-28 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
BR112015007120A2 (pt) 2012-10-08 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso, célula hospedeira e método de produção de um anticorpo
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
KR102391731B1 (ko) 2013-01-14 2022-04-27 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP3620468A1 (en) 2013-02-05 2020-03-11 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
KR101833602B1 (ko) 2013-02-26 2018-02-28 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US9487587B2 (en) * 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
WO2014159940A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2906927C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
KR20230073341A (ko) 2013-07-05 2023-05-25 젠맵 에이/에스 인간화 또는 키메라 cd3 항체
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
TWI652279B (zh) * 2013-11-11 2019-03-01 中外製藥股份有限公司 含改變的抗體可變區之抗原結合分子
SG10201800250XA (en) * 2013-12-17 2018-02-27 Genentech Inc Anti-cd3 antibodies and methods of use
KR20230022270A (ko) 2014-03-28 2023-02-14 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
CA2942453A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to human and cynomolgus cd3 epsilon
SG10201913680PA (en) * 2014-05-29 2020-03-30 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
WO2016001810A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
AU2015292406B2 (en) 2014-07-25 2021-03-11 Cytomx Therapeutics, Inc Anti-CD3 antibodies, activatable anti-CD3 antibodies, multispecific anti-CD3 antibodies, multispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
NZ766556A (en) 2014-08-04 2024-02-23 Hoffmann La Roche Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2982693A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-10 Affimed Therapeutics AG CD3 binding domain
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
MX2017003022A (es) 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados.
CU20170041A7 (es) * 2014-09-26 2017-09-06 Macrogenics Inc Diacuerpos monovalentes biespecíficos que son capaces de unir cd19 y cd3
US10717778B2 (en) * 2014-09-29 2020-07-21 Duke University Bispecific molecules comprising an HIV-1 envelope targeting arm
WO2016076345A1 (ja) 2014-11-11 2016-05-19 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
AU2015353409B2 (en) 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
TN2017000222A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
HUE045216T2 (hu) 2014-12-05 2019-12-30 Hoffmann La Roche Anti-CD79B antitestek és alkalmazási eljárások
WO2016089610A1 (en) * 2014-12-06 2016-06-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Bispecific antibody for cancer immunotherapy
TW201809008A (zh) 2014-12-19 2018-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MX2017008875A (es) * 2015-01-08 2017-09-27 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cd3 y cd20.
BR112017014805A2 (pt) 2015-01-23 2018-01-09 Sanofi anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd123 e anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a cd3 e/ou cd123
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
AU2016232693B2 (en) 2015-03-19 2021-08-12 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
US11071783B2 (en) 2015-03-19 2021-07-27 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
US10450368B2 (en) 2015-03-19 2019-10-22 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof (CD4bs antibodies)
WO2016149698A2 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof (v3 antibodies)
EP3288981A1 (en) * 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
US10844122B2 (en) * 2015-05-06 2020-11-24 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (PSMA) bispecific binding agents and uses thereof
CN108289949B (zh) 2015-05-29 2022-04-12 安普希韦纳治疗公司 双特异性cd33和cd3结合蛋白质的使用方法
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
WO2016205200A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and methods of use
HRP20231134T1 (hr) 2015-06-16 2024-01-05 F. Hoffmann - La Roche Ag Humanizirana i afinitetno zrela protutijela na fcrh5 i postupci za uporabu
JP2018526972A (ja) 2015-06-16 2018-09-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ３抗体及び使用方法
AU2016293073B2 (en) 2015-07-15 2022-12-22 Genmab A/S Humanized or chimeric CD3 antibodies
GEP20227438B (en) 2015-07-30 2022-11-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
EP3337507A4 (en) * 2015-08-17 2019-04-24 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC MONOVALENT DIANTIBERS CAPABLE OF BINDING TO B7-H3 AND CD3 AND USES THEREOF
CN108367004B (zh) * 2015-09-21 2022-09-13 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016329111A1 (en) 2015-10-02 2018-02-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CEAXCD3 T cell activating antigen binding molecules
WO2017079272A2 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Ambrx, Inc. Anti-cd3-folate conjugates and their uses
TW201720458A (zh) * 2015-12-04 2017-06-16 宏觀基因股份有限公司 能夠結合cd19 和cd3 的雙特異性單價雙抗體以及其用途
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
CA2997406A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
EP3389714A4 (en) 2015-12-14 2019-11-13 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC MOLECULES HAVING IMMUNOREACTIVITY TO PD-1 AND CTLA-4 AND METHODS OF USE
PL3400246T3 (pl) 2016-01-08 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworów z dodatnim markerem cea z wykorzystaniem antagonistów wiążących oś pd-1 oraz przeciwciał dwuswoistych anty-cea/anty-cd3
TW201734049A (zh) 2016-01-22 2017-10-01 健生生物科技公司 抗－ｒｏｒ１抗體、ｒｏｒ１ ｘ ｃｄ３雙特異性抗體及使用其之方法
KR20180104157A (ko) * 2016-02-04 2018-09-19 더 캘리포니아 인스티튜트 포 바이오메디칼 리써치 인간화 항-cd3 항체, 접합체 및 이의 용도
AR108034A1 (es) 2016-02-17 2018-07-11 Macrogenics Inc Moléculas de unión a ror1, y métodos de uso de las mismas
TW202302631A (zh) * 2016-03-08 2023-01-16 日商武田藥品工業股份有限公司 可誘導性結合蛋白和使用方法
PL3433280T3 (pl) 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki limfocytów T aktywowane przez proteazy
JP7002467B2 (ja) 2016-04-15 2022-01-20 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 新規のｂ７‐ｈ３結合分子、その抗体薬物コンジュゲート、及びその使用方法
EP3464365A1 (en) * 2016-06-01 2019-04-10 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
CA3059010A1 (en) 2016-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
AU2017278325A1 (en) * 2016-06-07 2019-01-24 Macrogenics, Inc. Combination therapy
MX2018015592A (es) 2016-06-14 2019-04-24 Xencor Inc Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos.
BR112018076260A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a hpd-l1, anticorpo biespecífico ou proteína de fusão, uso de um anticorpo ou fragmento, método, composição farmacêutica, método de modulação, método de inibição, método de tratamento, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e imunocitocina
EP3471773A4 (en) * 2016-06-21 2020-07-08 Teneobio, Inc. ANTIBODIES BINDING CD3
JP7021127B2 (ja) 2016-06-28 2022-02-16 ゼンコア インコーポレイテッド ソマトスタチン受容体２に結合するヘテロ二量体抗体
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
AU2017342560B2 (en) 2016-10-14 2022-03-17 Xencor, Inc. IL15/IL15Ralpha heterodimeric Fc-fusion proteins
US11466094B2 (en) 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
CA3044526A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3561057A4 (en) 2016-12-22 2020-09-16 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-CD3 ANTIBODY AND MOLECULE CONTAINING LEDIT ANTIBODY
EP3558368A4 (en) 2016-12-23 2020-12-30 MacroGenics, Inc. ADAM9 BINDING MOLECULES AND THEIR METHODS FOR USE
IL268836B2 (en) 2017-02-24 2024-04-01 Macrogenics Inc Bispecific molecules that bind CD137 and cancer antigens and their uses
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
BR112019017241A2 (pt) 2017-04-13 2020-04-14 Agenus Inc anticorpos anti-cd137 e métodos de uso dos mesmos
DK3618863T3 (da) 2017-05-01 2023-08-21 Agenus Inc Anti-tigit-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN111406068A (zh) 2017-05-16 2020-07-10 约翰霍普金斯大学 MANAbody及使用方法
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
EP3645122A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and antigen binding domains
EP3668898B1 (en) 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
WO2019045856A1 (en) * 2017-08-28 2019-03-07 Systimmune, Inc. ANTI-CD ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THEM
IL302613A (en) 2017-09-08 2023-07-01 Maverick Therapeutics Inc Binding proteins are activated under limited conditions
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
WO2019111871A1 (en) 2017-12-05 2019-06-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding cd3 and cd137
SG11202005557TA (en) 2017-12-12 2020-07-29 Macrogenics Inc Bispecific cd 16-binding molecules and their use in the treatment of disease
KR20200100098A (ko) 2017-12-19 2020-08-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
CN109939232A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤膀胱癌细胞pumc-91的应用
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
WO2019160904A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Macrogenics, Inc. Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
BR112020023508A2 (pt) 2018-05-24 2021-03-30 Janssen Biotech, Inc. Anticorpos anti-cd3 e usos dos mesmos
JP2021527103A (ja) * 2018-06-14 2021-10-11 バイオアトラ インコーポレイテッド 多重特異性抗体構造体
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
US11590223B2 (en) 2018-08-31 2023-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for therapeutic antibodies
MX2021003765A (es) 2018-10-03 2021-07-15 Xencor Inc Proteínas il-12 de fusión a fc heterodimérico.
CN113166261A (zh) * 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
JP2022512709A (ja) * 2018-10-31 2022-02-07 ティジアーナ ライフ サイエンシズ パブリック リミティド カンパニー 炎症性疾患及び自己免疫疾患を処置する組成物及び方法
EP3883636A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
EP3891181A4 (en) * 2018-12-04 2022-08-17 Novartis AG BINDING MOLECULES AGAINST CD3 AND USES THEREOF
WO2020168555A1 (zh) * 2019-02-22 2020-08-27 武汉友芝友生物制药有限公司 Cd3抗原结合片段及其应用
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
WO2020181140A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Maverick Therapeutics, Inc. Constrained conditionally activated binding proteins
JOP20210298A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Provention Bio Inc طرق وتركيبات للوقاية من مرض السكري من النوع الأول
EP3973000A4 (en) * 2019-06-07 2023-09-06 Adimab, LLC HIGH AFFINITY ANTI-CD3 ANTIBODIES AND METHODS OF GENERATION AND USE THEREOF
CN111454357B (zh) * 2019-08-14 2022-03-15 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用
PE20221151A1 (es) 2019-08-30 2022-07-18 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd96 y sus metodos de uso
TW202128756A (zh) * 2019-10-02 2021-08-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白
MX2022007158A (es) 2019-12-13 2022-07-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y metodos de uso.
EP4309722A2 (en) 2019-12-13 2024-01-24 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2023512454A (ja) 2020-01-13 2023-03-27 アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー タンパク質治療のための製剤
CA3164420A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Jonathan Clapper Methods and compositions for preventing adsorption of therapeutic proteins to drug delivery system components
JP7085666B2 (ja) 2020-03-31 2022-06-16 中外製薬株式会社 Ｄｌｌ３標的多重特異性抗原結合分子およびその使用
WO2021224913A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Immunorizon Ltd. Precursor tri-specific antibody constructs and methods of use thereof
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
MX2022015872A (es) * 2020-06-11 2023-05-16 Provention Bio Inc Metodos y composiciones para prevenir diabetes tipo 1.
IL298402A (en) 2020-06-19 2023-01-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to CD3 and CD19
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
MX2023002544A (es) 2020-09-10 2023-03-14 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y cumulo de diferenciacion 20 (cd20) en terapia de combinacion para tratar linfoma folicular.
BR112023004321A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um sujeito humano
MX2023002542A (es) 2020-09-10 2023-03-15 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra cumulo de difirenciacion 3 (cd3) y cumulo de difirenciacion 20 (cd20) en terapia combinada para el tratamiento del linfoma difuso de celulas b grandes.
CN116507363A (zh) 2020-09-10 2023-07-28 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
MX2023002546A (es) 2020-09-10 2023-03-14 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y contra cumulo de diferenciacion 20 (cd20) para tratar leucemia linfocitica cronica.
CA3195590A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Vahe Bedian Compositions and methods for treatment of thyroid eye disease
CN114573703A (zh) * 2020-12-02 2022-06-03 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种t细胞衔接器治疗剂的开发和应用
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
KR20240005722A (ko) 2021-04-30 2024-01-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체를 사용한 치료를 위한 투약
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
EP4341291A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Aptevo Research and Development LLC Dosing regimens for protein therapeutics
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023180353A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
JP2024517042A (ja) 2022-04-13 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の薬学的組成物及び使用方法
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2023230476A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing or delaying type 1 diabetes
CN117603351A (zh) * 2022-08-22 2024-02-27 英脉德医疗科技(广东)有限公司 肿瘤微环境特异激活的Her2-CD3双特异性抗体
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024047114A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Universität Zürich Adenoviral-based in situ delivery of bispecific t cell engagers
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
CN116239700A (zh) * 2022-12-20 2023-06-09 浙江大学 一种肿瘤双靶向的三特异性t细胞衔接器及其应用
CN116063526A (zh) * 2022-12-31 2023-05-05 合肥天港免疫药物有限公司 抗pdl1的抗体及其用途
CN116284448A (zh) * 2023-02-14 2023-06-23 浙江大学 一种超抗原参与的三功能t细胞衔接器及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090252683A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Micromet Ag Composition Comprising Cross-Species-Sepecific Antibodies and uses Thereof
US20100150918A1 (en) * 2007-04-03 2010-06-17 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (ru) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6129914A (en) * 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
JPH08500826A (ja) 1992-08-21 1996-01-30 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ｌｆａ−１仲介疾患を処置する方法
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
DE69522216T2 (de) 1994-05-13 2002-05-02 Biovation Ltd Zielzellen-bindende chimäre Peptide
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5834597A (en) * 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US7112324B1 (en) 1998-04-21 2006-09-26 Micromet Ag CD 19×CD3 specific polypeptides and uses thereof
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2359067C (en) 1999-01-15 2017-03-14 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2388063C (en) 1999-11-24 2010-06-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
AU2002337885B1 (en) 2001-10-16 2003-04-28 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human ummunodeficiency virus selected by Env-CD4-co-receptor complexes
CN101914158A (zh) 2002-02-14 2010-12-15 免疫医疗公司 抗cd 20抗体及其融合蛋白和使用方法
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
ATE483472T1 (de) 2002-05-30 2010-10-15 Macrogenics Inc Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten
US20050260213A1 (en) 2004-04-16 2005-11-24 Scott Koenig Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof
AU2003262650B2 (en) 2002-08-14 2009-10-29 Macrogenics, Inc. FcgammaRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
PT3284753T (pt) 2002-10-17 2020-05-04 Genmab As Anticorpos monoclonais humanos contra cd20 para utilização no tratamento da esclerose múltipla
US20050058661A1 (en) 2002-10-18 2005-03-17 Sykes Kathryn F. Methods and compositions for vaccination comprising nucleic acid and/or polypeptide sequences of the genus Borrelia
EP3263596A1 (en) 2002-12-16 2018-01-03 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP5416338B2 (ja) 2003-05-09 2014-02-12 デューク ユニバーシティ Ｃｄ２０特異的抗体およびその使用方法
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
CN100509850C (zh) 2003-05-31 2009-07-08 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
BRPI0410338A (pt) 2003-05-31 2006-05-30 Micromet Ag composição farmacêutica compreendendo um constructo de anticorpo biespecìfico para epcam, processo para sua produção, uso de um constructo biespecìfico, kit contendo o mesmo e método para a prevenção, tratamento ou alìvio de uma doença tumoral
US20050176028A1 (en) * 2003-10-16 2005-08-11 Robert Hofmeister Deimmunized binding molecules to CD3
DK1687066T3 (da) 2003-11-14 2012-11-26 Brigham & Womens Hospital Fremgangsmåder til immunmodulering
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
SG175659A1 (en) 2004-05-05 2011-11-28 Genentech Inc Preventing autoimmune disease by using an anti-cd20 antibody
WO2005110474A2 (en) 2004-05-10 2005-11-24 Macrogenics, Inc. HUMANIZED FcϜRIIB SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
EA010350B1 (ru) 2004-06-03 2008-08-29 Новиммун С.А. Антитела против cd3 и способы их применения
DOP2005000108A (es) 2004-06-04 2007-06-15 Genentech Inc Method for treating lupus
JP4463645B2 (ja) 2004-08-27 2010-05-19 日本メクトロン株式会社 プリント基板およびその検査方法
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP5838021B2 (ja) 2005-04-15 2015-12-24 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディとその使用
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
AU2006267090B2 (en) 2005-07-11 2013-03-07 Provention Bio, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
PT1919503E (pt) 2005-08-10 2015-01-05 Macrogenics Inc Identificação e manipulação de anticorpos com a regiões de fc variantes e métodos de utilização dos mesmos
EP2354162A1 (en) 2005-09-12 2011-08-10 Novimmune SA Anti-CD3 antibody formulations
SG170110A1 (en) 2006-03-10 2011-04-29 Macrogenics Inc Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
WO2007117600A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Macrogenics, Inc. Combination therapy for treating autoimmune diseases
EP2021029B1 (en) 2006-05-26 2014-06-11 MacroGenics, Inc. Humanized fc gamma riib-specific antibodies and methods of use thereof
BRPI0713426A2 (pt) 2006-06-14 2012-10-09 Macrogenics Inc métodos de tratar, diminuir a progressão, ou melhorar um ou mais sintomas de um distúrbio, e de prevenir ou retardar o inìcio de um distúrbio
CA2656224C (en) 2006-06-26 2018-01-09 Macrogenics, Inc. Combination of fc.gamma.riib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
EP2094302A4 (en) 2006-12-21 2010-12-08 Macrogenics Inc METHODS FOR THE TREATMENT OF LADA-LIKE DIABETES AND OTHER AUTOIMMUNE DIABETES OF THE ADULT USING IMMUNOSUPPRESSANT MONOCLONAL ANTIBODIES HAVING REDUCED TOXICITY
AU2008207945A1 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Macrogenics West, Inc. Human cancer stem cells
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
SI2155783T1 (sl) 2007-04-03 2013-10-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Medvrstno specifiäśna cd3-epsilon vezavna domena
ES2390243T3 (es) * 2007-04-03 2012-11-07 Amgen Research (Munich) Gmbh Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas
ES2702087T3 (es) 2007-06-21 2019-02-27 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
AU2009288354A1 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
US20110217302A1 (en) 2008-10-10 2011-09-08 Emergent Product Development Seattle, Llc TCR Complex Immunotherapeutics
SG10201407908VA (en) 2008-12-19 2015-01-29 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
SI2714733T1 (sl) * 2011-05-21 2019-06-28 Macrogenics, Inc. CD3-vezavne molekule sposobne vezave na humani ali ne-humani CD3
JP6926834B2 (ja) * 2017-08-30 2021-08-25 いすゞ自動車株式会社 ステアリング装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090252683A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Micromet Ag Composition Comprising Cross-Species-Sepecific Antibodies and uses Thereof
US20100150918A1 (en) * 2007-04-03 2010-06-17 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain

Also Published As

Publication number Publication date
CA2836857A1 (en) 2012-11-29
WO2012162067A2 (en) 2012-11-29
JP2019142866A (ja) 2019-08-29
SG10201509588TA (en) 2015-12-30
IL229575B (en) 2018-05-31
JP2017206505A (ja) 2017-11-24
EP3492494A1 (en) 2019-06-05
IL259187B (en) 2019-02-28
CN103703024B (zh) 2017-11-14
EA201391735A1 (ru) 2014-03-31
US11111299B2 (en) 2021-09-07
CL2016001254A1 (es) 2016-12-02
HRP20190756T1 (hr) 2019-06-14
ZA201308602B (en) 2014-07-30
KR102060389B1 (ko) 2019-12-31
CN107722124A (zh) 2018-02-23
US10150812B2 (en) 2018-12-11
NZ703939A (en) 2016-01-29
RS58765B1 (sr) 2019-06-28
US9587021B2 (en) 2017-03-07
JP2014517844A (ja) 2014-07-24
JP7302990B2 (ja) 2023-07-04
MY173899A (en) 2020-02-26
UA115402C2 (uk) 2017-10-25
US20140099318A1 (en) 2014-04-10
SG195072A1 (en) 2013-12-30
JP6141831B2 (ja) 2017-06-07
JP2022001580A (ja) 2022-01-06
PL2714733T3 (pl) 2019-08-30
MX2013013584A (es) 2014-09-22
SI2714733T1 (sl) 2019-06-28
CL2013003329A1 (es) 2014-07-04
US20190040135A1 (en) 2019-02-07
IL259187A (en) 2018-07-31
LT2714733T (lt) 2019-06-10
ES2732213T3 (es) 2019-11-21
CA2836857C (en) 2019-12-03
AU2019200159A1 (en) 2019-01-31
IL229575A0 (en) 2014-01-30
CN107827985A (zh) 2018-03-23
CO6970560A2 (es) 2014-06-13
UA115122C2 (uk) 2017-09-25
US20220056131A1 (en) 2022-02-24
EP2714733B1 (en) 2019-01-23
AU2019200159B2 (en) 2020-03-12
KR20140033107A (ko) 2014-03-17
ME03440B (me) 2020-01-20
EP2714733A4 (en) 2015-10-14
MX369220B (es) 2019-10-31
BR122016016837A2 (pt) 2019-08-27
IL264293A (en) 2019-02-28
ECSP13013101A (es) 2014-01-31
PT2714733T (pt) 2019-05-23
EP2714733A2 (en) 2014-04-09
CL2020000830A1 (es) 2020-08-07
AU2012259161A1 (en) 2013-12-12
HUE044209T2 (hu) 2019-10-28
KR20190105112A (ko) 2019-09-11
PL2714733T4 (pl) 2019-08-30
CY1122020T1 (el) 2020-10-14
SG10201703425RA (en) 2017-05-30
MA35174B1 (fr) 2014-06-02
AU2012259161B2 (en) 2017-04-06
US20170137519A1 (en) 2017-05-18
UA117072C2 (uk) 2018-06-11
NZ618021A (en) 2015-02-27
AU2017204545A1 (en) 2017-07-20
IL264293B (en) 2020-09-30
BR112013029893A2 (pt) 2017-05-30
DK2714733T3 (da) 2019-05-06
AU2017204545B2 (en) 2018-11-15
JP6496349B2 (ja) 2019-04-03
WO2012162067A3 (en) 2013-01-31
CN103703024A (zh) 2014-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019200159B2 (en) CD-3 binding molecules capable of binding to human and non-human CD3
DK2699590T3 (en) ENDOGLIN POLYPEPTIDES AND APPLICATIONS THEREOF
US20230151105A1 (en) Anti-ox40 antibody and uses thereof
EA045070B1 (ru) Cd3-связывающие молекулы, способные связаться с cd3 человека и cd3, не являющимся человеческим
NZ618021B2 (en) Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM