EA033653B1 - Антисмысловые олигонуклеотиды для лечения врожденного амавроза лебера - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам с пропуском экзона для лечения врожденного амавроза Лебера и вирусным векторам, экспрессирующим заявленные антисмысловые олигонуклеотиды, а также фармацевтическим композициям, содержащим указанные антисмысловые олигонуклеотиды или вирусные векторы. Изобретение также относится к применению заявленных антисмысловых олигонуклеотидов, вирусных векторов и композиций для лечения врожденного амавроза Лебера и соответствующему способу. Кроме того, изобретение относится к способу блокировки аберрантного сплайсинга CEP290 в клетке с помощью заявленных антисмысловых олигонуклеотидов.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к областям медицины и иммунологии. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам, которые можно использовать для лечения, профилактики и/или замедления врожденного амавроза Лебера.

Уровень техники изобретения

Врожденный амавроз Лебера (LCA) представляет собой наиболее тяжелую форму наследственной дистрофии сетчатки с наступлением симптомов заболевания в течение первых лет жизни (Leber, Т., 1869), причем примерная частота встречаемости заболевания в мире составляет 1 из 50000 (Koenekoop et al, 2007; Stone, 2007). Генетически LCA представляет собой гетерогенное заболевание, которое вызывают мутации в идентифицированных на настоящий момент пятнадцати генах (den Hollander et al, 2008; Estrada-Cuzcano et al, 2011). Наиболее часто мутирующим геном LCA является CEP290, который участвует в ~15% всех случаев (Stone, 2007; den Hollander, 2008; den Hollander, 2006; Perrault et al, 2007). Описано, что серьезные мутации в СЕР2 90 вызывают спектр системных заболеваний, которые, помимо дистрофии сетчатки, характеризуются дефектами головного мозга, пороками развития почек, полидактилией и/или ожирением (Baal et al, 2007; den Hollander et al, 2008; Helou et al, 2007; Valente et al, 2006) . Ярко выраженные генотип-фенотипические корреляции между мутациями CEP290 и связанными с ними фенотипами отсутствуют, однако пациенты с LCA и ранней дистрофией сетчатки очень часто несут гипоморфные аллели (Stone, 2007; den Hollander et al, 2006; Perrault et al, 2007; Coppieters et al, 2010; Liitink et al 2010). Несомненно наиболее часто встречающейся гипоморфной мутацией СЕР2 90, особенно в странах Европы и в США, является изменение в интроне 26 CEP290 (с.2991+1655A>G) (Stone, 2007; den Hollander et al, 2006; Perrault et al, 2007; Liitink et al, 2010). Даная мутация создает скрытый донорный участок сплайсинга в интроне 26, который приводит к включению аберрантного экзона размером 128 п.о. в мутантную мРНК CEP290 и к вставке преждевременного стоп-кодона (р.С998Х) (см. фиг. 1А и 1В) . Помимо мутантной мРНК CEP290 также образуется транскрипт дикого типа, который не содержит аберрантный экзон, что свидетельствует о гипоморфной природе данной мутации (Estrada-Cuzcano et al, 2011).

LCA, а также другие виды дистрофии сетчатки, в течение длительного времени считались неизлечимыми заболеваниями. Однако первая фаза I/II клинических испытаний с использованием аугментационной генной терапии дает многообещающие результаты в отдельной группе взрослых пациентов с LCA/RP, содержащих мутации в гене RPE65 (Bainbridge et al, 2008; Cideciyan et al, 2008; Hauswirth et al, 2008; Maguire et al, 2008) . Показано, что односторонние субретинальные инъекции аденоассоциированных вирусных частиц, несущих конструкции, кодирующие кДНК RPE65 дикого типа, являются безопасными и обладают умеренной эффективностью у некоторых пациентов, не вызывая какихлибо побочных эффектов. В последующем исследовании, в котором принимают участие взрослые и дети, улучшения зрения являются более устойчивыми, особенно у детей, которые приобретают временное зрение (Maguire et al, 2009). Вместе указанные исследования продемонстрировали возможность лечения LCA и значительно ускорили разработку стратегий лечения других генетических подтипов дистрофии сетчатки (den Hollander et al, 2010) . Однако вследствие огромного разнообразия размеров генов и технических ограничений средств, используемых для доставки терапевтических конструкций, генную аугментационную терапию можно применять не ко всем генам. Например, размер кДНК RPE65 составляет лишь 1,6 т.о., а размер кДНК CEP290 составляет примерно 7,4 т.о., что превышает величину нагрузки многих доступных векторов, включающих в себя используемые в настоящее время аденоассоциированные векторы (AAV). Кроме того, с помощью генной заместительной терапии трудно контролировать уровень экспрессии терапевтического гена, который в случае некоторых генов должен строго регулироваться. Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка удобной терапевтической стратегии для профилактики, лечения или замедления развития врожденного амавроза Лебера, вызываемого мутацией в интроне CEP290.

Подробное описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что специфические антисмысловые олигонуклеотиды (AON) способны блокировать аберрантный сплайсинг СЕР290, вызываемый интронной мутацией LCA.

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение предлагает антисмысловой олигонуклеотид с пропуском экзона для лечения врожденного амавроза Лебера, который способен индуцировать пропуск аберрантного экзона размером 128 нуклеотидов из пре-мРНК СЕР290 человека, причем указанный олигонуклеотид комплементарен SEQ ID NO: 8 и содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.

В проедпочтительном варианте осуществления антисмысловой олигонуклеотид по изобретению включает 2'-О-алкилфосфоротиоатный моносахарид, такой как 2'-O-метилмодифицированную рибозу (РНК), 2'-O-этилмодифицированную рибозу, 2'Ю-пропил модифицированную рибозу, и/или замещенные производные указанных модифицированных моносахаридов, такие как галогенированные производные.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к вирусному вектору, экспрессирующему антисмысловой олигонуклеотид.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения

- 1 033653 врожденного амавроза Лебера, содержащая антисмысловой олигонуклеотид по изобретению или вирусный вектор по изобретению, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антисмыслового олигонуклеотида по изобретению для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению вектора по изобретению для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по изобретению для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.

Настоящее изобретение относится также к способу блокировки аберрантного сплайсинга CEP290 в клетке, согласно которому указанную клетку приводят в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения врожденного амавроза Лебера у субъекта, нуждающегося в этом, согласно которому указанному субъекту вводят антисмысловой олигонуклеотид по изобретению.

Во всех воплощениях настоящего изобретения термины модуляция сплайсинга и пропуск экзона являются синонимами. В применении к СЕР290 термины модуляция сплайссинга или пропуск экзона можно истолковывать как исключение аберрантного экзона размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4) из мРНК CEP290 (см. фиг. 1А и 1В) . Термин пропуск экзона определяют здесь как индукцию в клетке зрелой мРНК, которая не содержит конкретного экзона, присутствующего в зрелой мРНК, не содержащей пропуск экзона. Пропуск экзона можно осуществить путем введения в клетку, экспрессирующую пре-мРНК указанной зрелой мРНК, молекулы, способной интерферировать с такими последовательностями, как, например, (скрытая) донорная последовательность сплайсинга, или (скрытая) акцепторная последовательность сплайсинга, которые необходимы для обеспечения ферментного процесса сплайсинга, или молекулы, способной интерферировать с сигналом включения экзона, необходимым для распознавания цепочки нуклеотидов и обеспечивающим включение экзона в зрелую мРНК; такие молекулы в данном описании называют молекулами, обеспечивающими пропуск экзона. Термин пре-мРНК относится к предшественнику мРНК, не подвергавшемуся процессингу, или частично подвергавшемуся процессингу, который синтезируется на матрице ДНК в ядре клетки в результате транскрипции.

Термин антисмысловой олигонуклеотид относится к нуклеотидной последовательности, по существу комплементарной целевой нуклеотидной последовательности, входящей в состав молекулы премРНК, hrPHK (гетерогенной ядерной РНК) или мРНК. Степень комплементарности (или практической комплементарности) антисмысловой последовательности предпочтительно является такой, что молекула, содержащая антисмысловую последовательность, может в физиологических условиях образовывать стабильный гибрид с целевой нуклеотидной последовательностью, входящей в состав молекулы РНК.

Термины антисмысловой олигонуклеотид и олигонуклеотид используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к олигонуклеотиду, содержащему антисмысловую последовательность.

В одном воплощении молекула, обеспечивающая пропуск экзона, в соответствии с приведенным здесь определением, может представлять собой молекулу, которая связывается с конкретной последовательностью, и/или является комплементарной конкретной последовательности, или молекулу белка, такого как РНК-связывающий белок или неприродный белок цинковые пальцы, который модифицируют так, чтобы придать ему способность связываться с указанной нуклеотидной последовательностью, входящей в состав молекулы РНК. Способы скрининга молекул соединения, способных связываться с конкретными нуклеотидными последовательностями, описаны, например, в PCT/NL01/00697 и патенте США 6875736, которые включены в данный документ в качестве ссылки. Способы конструирования РНК-связывающих белков цинковые пальцы, способных связываться с конкретными нуклеотидными последовательностями, описаны в документе Friesen and Darby, Nature Structural Biology 5: 543-546 (1998), включенном в данное описание в качестве ссылки. Связывание с одной из последовательностей, описанных в SEQ ID NO: 6, 7 или 8, предпочтительно, находящейся в составе аберрантного экзона CEP290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4), можно оценить с помощью методов, известных специалистам в данной области. Предпочтительным методом является анализ сдвига подвижности в геле, описанный в ЕР 1619249. В предпочтительном воплощении считается, что молекула с пропуском экзона связывается с одной из конкретных последовательностей, если связывание указанной молекулы с меченной последовательностью SEQ ID NO: 6, 7 или 8 можно детектировать с помощью анализа сдвига подвижности в геле.

Во всех воплощениях данного изобретения молекула с пропуском экзона предпочтительно представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно, олигонуклеотид. Предпочтительно, молекула с пропуском экзона настоящего изобретения представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно олигонуклеотид, которая является комплементарной или по существу комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, предпочтительно в SEQ ID NO: 7, более предпочтительно в SEQ ID NO: 8, или ее части, как указано ниже.

Термин по существу комплементарный в контексте настоящего изобретения означает, что в анти- 2 033653 смысловой последовательности допускаются некоторые несовпадения при условии сохранения приемлемой функциональности, т.е. способности индуцировать пропуск аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4). Предпочтительно степень комплементарности составляет от 90% до 100%. Как правило, это означает присутствие 1 или 2 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 20 нуклеотидов, или 1, 2, 3 или 4 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 40 нуклеотидов, или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 60 нуклеотидов, и т.д.

Настоящее изобретение предлагает способ конструирования молекулы с пропуском экзона, предпочтительно олигонуклеотида, способного индуцировать пропуск аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4). Сначала выбирают такой олигонуклеотид, способный связываться с одной из последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 или 8, или ее частью, как указано ниже. Затем конструируют или улучшают указанную молекулу с учетом одного из нижеследующих аспектов.

Молекула с пропуском экзона предпочтительно не содержит CpG или участка CpG.

Молекула с пропуском экзона способна связываться с РНК, причем такое связывание характеризуется приемлемой кинетикой и/или приемлемыми термодинамическими свойствами.

Присутствие CpG или участка CpG в олигонуклеотиде обычно связано с повышенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn and Kippenberger, 2008). Повышенная иммуногенность является нежелательной, поскольку она может вызвать повреждение ткани, подлежащей лечению, т.е. глаза. Иммуногенность можно оценить на животной модели путем анализа присутствия клеток CD4+ и/или CD8+, и/или воспалительной инфильтрации моноцитов. Иммуногенность также можно количественно определить в крови животного или человека, получающего олигонуклеотид данного изобретения, путем детекции присутствия нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с помощью стандартного иммуноанализа, известного специалисту в данной области.

Повышение иммуногенности можно оценить путем детекции присутствия или увеличения количества нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с помощью стандартного иммуноанализа.

Изобретение позволяет сконструировать олигонуклеотид, обладающий приемлемой кинетикой и/или приемлемыми термодинамическими характеристиками связывания РНК. Кинетика и/или термодинамические характеристики связывания РНК, по меньшей мере отчасти, определяются температурой плавления олигонуклеотида (Тпл; ее рассчитывают с помощью программы для расчета свойств олигонуклеотидов (www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Тпл и ближайшей соседней модели), и/или свободной энергией комплекса AON-целевой экзон (с использованием структуры РНК версии 4.5) . Если Тпл является слишком высокой, олигонуклеотид может быть менее специфичным. Величина приемлемых значений Тпл и свободной энергии зависит от последовательности олигонуклеотида. Следовательно, трудно определить предпочтительные диапазоны для каждого из указанных параметров. Приемлемое значение Тпл может находиться в диапазоне от 35 до 70°С, а приемлемое значение свободной энергии может находиться в диапазоне от 15 до 45 ккал/моль.

Таким образом, опытный специалист вначале может выбрать в качестве потенциального терапевтического соединения олигонуклеотид, связывающийся и/или комплементарный последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, или ее части, как указано ниже. Специалист также может проверить способность выбранного олигонуклеотида связываться с указанными последовательностями, как указано ранее. Необязательно, на второй стадии специалист может использовать изобретение для дополнительной оптимизации указанного олигонуклеотида путем проверки отсутствия CpG, и/или оптимизации его Тпл и/или свободной энергии комплекса AON-мишень. Он может попытаться сконструировать олигонуклеотид, в котором CpG предпочтительно отсутствует, и/или который характеризуется более приемлемыми значениями Тпл и/или свободной энергии, путем выбора определенной последовательности CEP290 (включающей в себя SEQ ID NO: 6, 7 или 8), которой комплементарен олигонуклеотид. Альтернативно, если олигонуклеотид, комплементарный конкретному участку последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, содержит CpG, и/или характеризуется не приемлемыми значениями Тпл и/или свободной энергии, специалист может улучшить указанные параметры путем уменьшения длины олигонуклеотида, и/или путем выбора другого участка в последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, к которому комплементарен олигонуклеотид, и/или путем изменения химии олигонуклеотида.

На любой стадии способа олигонуклеотид настоящего изобретения предпочтительно представляет собой олигонуклеотид, который еще способен проявлять приемлемый уровень функциональной активности. Функциональная активность указанного олигонуклеотида предпочтительно включает в себя определенный уровень индуцирования пропуска аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4) с достижением у субъекта продукции белка и/или мРНК функционального СЕР290, и/или по меньшей мере частичного уменьшения продукции белка и/или мРНК аберрантного CEP290. В предпочтительном воплощении считается, что олигонуклеотид индуцирует пропуск аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4), если процент пропуска аберрантного экзона CEP290 размером 128 нуклеотидов (SEQ ID NO: 4), измеренный методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60%,

- 3 033653 или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере

80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или 100%.

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, предпочтительно представляющая собой олигонуклеотид, который содержит последовательность, комплементарную или по существу комплементарную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, предпочтительно в SEQ ID NO: 7, более предпочтительно в SEQ ID NO: 8, или ее части, входящей в состав CEP290, представляет собой молекулу, (по существу) комплементарная часть которой составляет по меньшей мере 50% от длины олигонуклеотида настоящего изобретения, более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, или еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, или еще более предпочтительно 98%, или еще более предпочтительно по меньшей мере 99%, или еще более предпочтительно 100%. Предпочтительно олигонуклеотид настоящего изобретения содержит или включает в себя последовательность, комплементарную части SEQ ID NO: 6, 7 или 8. В качестве примера, олигонуклеотид может содержать последовательность, комплементарную части SEQ ID NO: 6, 7 или 8, и дополнительные фланкирующие последовательности. В более предпочтительном воплощении длина указанной комплементарной части указанного олигонуклеотида составляет по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов. Дополнительные фланкирующие последовательности можно использовать для модификации связывания белка с олигонуклеотидом, или для модификации термодинамических свойств олигонуклеотида, более предпочтительно для модификации сродства связывания с целевой РНК.

Нет безусловной необходимости в том, чтобы все основания в участке комплементарности были способны спариваться с основаниями противоположной цепи. Например, при конструировании олигонуклеотида при желании в его состав можно включить остаток, который не образует пару с основанием комплементарной цепи. Допускается некоторая степень несовпадений, если в присутствующих в клетке условиях последовательность нуклеотидов в достаточной степени способна гибридизоваться с комплементарной частью. В данном контексте термин достаточный предпочтительно означает, что с помощью анализа сдвига подвижности в геле, описанного в примере 1 ЕР1619249, можно детектировать связывание олигонуклеотида. Необязательно указанный олигонуклеотид можно дополнительно тестировать путем трансфекции в клетки сетчатки пациентов. Пропуск целевого экзона можно оценить методом ОТПЦР (как описано в ЕР1619249). Комплементарные участки предпочтительно конструируют так, чтобы при объединении они были специфичными к экзону, присутствующему в пре-мРНК. Такой специфичности можно достичь с использованием комплементарных участков разной длины, поскольку она зависит от последовательностей, присутствующих в других молекулах (пре-)мРНК данной системы. Риск того, что олигонуклеотид также будет гибридизоваться с одной или несколькими другими молекулами премРНК уменьшается по мере увеличения размера олигонуклеотида. Следует понимать, что олигонуклеотиды, содержащие несовпадения в участке комплементарности, но сохраняющие способность гибридизоваться и/или связываться с целевым участком (участками) пре-мРНК, можно использовать в настоящем изобретении. Однако предпочтительно, по меньшей мере, комплементарные участки не содержат таких несовпадений, поскольку при этом они, как правило, обладают более высокой эффективностью и более высокой специфичностью, чем олигонуклеотиды, содержащие такие несовпадения в одном или нескольких комплементарных участках. Полагают, что повышенная прочность гибридизации (т.е. увеличение числа взаимодействий с противоположной цепью) оказывает благоприятное действие, повышая эффективность процесса препятствования механизму сплайсинга в данной системе. Предпочтительно комплементарность составляет от 90% до 100%. Как правило, это соответствует присутствию 1 или 2 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 20 нуклеотидов, или 1, 2, 3 или 4 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 40 нуклеотидов, или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 несовпадений в олигонуклеотиде, содержащем 60 нуклеотидов, и т.д.

Молекула с пропуском экзона настоящего изобретения предпочтительно представляет собой выделенную молекулу.

Молекула с пропуском экзона настоящего изобретения предпочтительно представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или молекулу, содержащую нуклеотиды, предпочтительно она представляет собой (антисмысловой) олигонуклеотид, комплементарный последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6, 7 и 8.

Предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую антисмысловой олигонуклеотид, длина которого составляет примерно от 8 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 8 до 60, более предпочтительно примерно от 10 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 12 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 14 до 28 нуклеотидов, нуклеотидов, наиболее предпочтительно примерно 20 нуклеотидов, например, 15 нуклеотидов, 16 нуклеотидов, 17 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотидов, 22 нуклеотидов, 23 нуклеотидов, 24 нуклеотидов или 25 нуклео- 4 033653 тидов.

Предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения представляет антисмысловой олигонуклеотид, содержащий или включающий в себя от 8 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 14 до 20 нуклеотидов, или предпочтительно она представляет собой олигонуклеотид, содержащий или включающий в себя 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях изобретение предлагает молекулу с пропуском экзона, содержащую или предпочтительно содержащую антисмысловой олигонуклеотид, выбранный из группы, включающей в себя: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.

В более предпочтительном воплощении изобретение предлагает молекулу с пропуском экзона, содержащую или предпочтительно содержащую антисмысловой олигонуклеотид SEQ ID NO: 10. Обнаружено, что такая молекула обладает высокой эффективностью в отношении модуляции сплайсинга аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов. Указанная предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения, содержащая SEQ ID NO: 10, предпочтительно содержит от 8 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 до 20 нуклеотидов, более предпочтительно от 14 до 18, или предпочтительно она представляет собой олигонуклеотид, содержащий или включающий в себя 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов.

В другом более предпочтительном воплощении изобретение предлагает молекулу с пропуском экзона, содержащую или предпочтительно содержащую антисмысловой олигонуклеотид SEQ ID NO: 11. Обнаружено, что такая молекула обладает высокой эффективностью в отношении модуляции сплайсинга аберрантного экзона СЕР290 размером 12 8 нуклеотидов. Указанная предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения, содержащая SEQ ID NO: 11, предпочтительно содержит от 8 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 до 20 нуклеотидов, более предпочтительно от 14 до 18, или предпочтительно она представляет собой олигонуклеотид, содержащий или включающий в себя 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов.

В другом более предпочтительном воплощении изобретение предлагает молекулу с пропуском экзона, содержащую или предпочтительно содержащую антисмысловой олигонуклеотид SEQ ID NO: 12. Обнаружено, что такая молекула обладает высокой эффективностью в отношении модуляции сплайсинга аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов. Указанная предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения, содержащая SEQ ID NO: 12, предпочтительно содержит от 8 до 143 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 до 20 нуклеотидов, более предпочтительно от 14 до 18, или предпочтительно она представляет собой олигонуклеотид, содержащий или включающий в себя 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 или 143 нуклеотидов.

Молекула с пропуском экзона настоящего изобретения может содержать один или несколько остатков РНК, или один или несколько остатков ДНК, и/или один или несколько аналогов или эквивалентов нуклеотидов, как более подробно описано ниже.

Предпочтительно молекула с пропуском экзона настоящего изобретения содержит один или несколько остатков, модифицированных с целью повышения устойчивости к нуклеазе, и/или повышения сродства антисмыслового олигонуклеотида к целевой последовательности. Следовательно, в предпочтительном воплощении антисмысловая нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог или эквивалент, где нуклеотидный аналог или эквивалент ожжет содержать остаток, включающий в себя модифицированное основание, и/или модифицированный скелет, и/или не природную межнуклеозидную связь, или сочетание указанных модификаций.

В предпочтительном воплощении нуклеотидный аналог или эквивалент содержит модифицированный скелет. Примеры таких скелетов включают в себя морфолиновые скелеты, карбаматные скелеты, силоксановые скелеты, сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты, формацетильные и тиоформацетильные скелеты, метиленформацетильные скелеты, рибоацетильные скелеты, алкенсодержащие скелеты, сульфаматные, сульфонатные и сульфонамидные скелеты, метилениминовые и метиленгидразиновые скелеты, и амидные скелеты. Фосфорамидатморфолиновые олигомеры представляют собой олигонуклеотиды с модифицированным скелетом, которые ранее подвергались исследованиям в качестве антисмысловых средств. Морфолиновые олигонуклеотиды имеют незаряженный скелет, в

- 5 033653 котором сахар дезоксирибозу, присутствующий в ДНК, заменен на шестичленный цикл, а фосфодиэфирная связь заменена фосфорамидатной связью. Морфолиновые олигонуклеотиды являются устойчивыми к ферментативному разрушению и их действие в качестве антисмысловых средств обусловлено скорее прекращением трансляции или препятствованием сплайсингу пре-мРНК, чем активацией РНКазы Н. Морфолиновые олигонуклеотиды успешно доставляют в клетки тканевой культуры с помощью способов, включающих в себя физическое разрушение клеточной мембраны, причем одно исследование, в котором сравнивают некоторые из таких способов, показывает, что наиболее эффективным способом доставки является введение при соскабливании; однако, поскольку морфолиновый скелет является незаряженным, катионные липиды не являются эффективными медиаторами поглощения морфолиновых олигонуклеотидов клетками. Проведенные в последнее время исследования демонстрируют, что морфолиновый олигонуклеотид образует триплекс, а поскольку его скелет является неионным, можно сделать вывод, что морфолиновый олигонуклеотид способен образовывать триплекс в отсутствии магния.

Также предпочтительно, если связь между остатками, образующая скелет, не содержит атом фосфора, примером такой связи могут служить межнуклеозидные связи, образованные короткоцепочечным алкилом или циклоалкилом, смешанные межнуклеозидные связи, содержащие гетероатом и образованные короткоцепочечным алкилом или циклоалкилом, или одна или несколько из короткоцепочечных, гетероатомных или гетероциклических межнуклеозидных связей.

Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент включает в себя пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), содержащую модифицированный полиамидный скелет (Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500). PNA-содержащие молекулы фактически имитируют молекулы ДНК с точки зрения распознавания пар оснований. Скелет PNA состоит из №(2-аминоэтил)глициновых элементов, соединенных пептидными связями, а азотистые основания соединены со скелетом метиленкарбонильными связями.

Альтернативный скелет содержит пирролидиновый мономер PNA, удлиненный на один атом углерода (Govindaraju and Kumar (2 005) Chem. Commun, 495-497). Поскольку скелет молекулы PNA не содержит заряженные фосфатные группы, гибриды PNA-PHK, как правило, являются более стабильными, чем гибриды РНК-РНК или РНК-ДНК, соответственно (Egholm et al (1993) Nature 365, 566-568).

Другой предпочтительный скелет образован морфолино-содержащим нуклеотидным аналогом или эквивалентом, в котором сахар рибоза или дезоксирибоза заменен 6-членным морфолиновым циклом. Наиболее предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент включает в себя фосфорамидатморфолиновый олигомер (РМО), в котором сахар рибоза или дезоксирибоза заменен 6-членным морфолиновым циклом, а анионная фосфодиэфирная связь между соседними морфолиновыми циклами заменена на неионную фосфорамидатную связь.

В следующем воплощении нуклеотидный аналог или эквивалент настоящего изобретения содержит замену одного из немостиковых атомов кислорода в фосфодиэфирной связи. Такая модификация немного дестабилизирует образованные пары оснований, но значительно увеличивает устойчивость к разрушению под действием нуклеазы. Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит фосфоротиоат, хиральный фософротиоат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, Н-фосфонат, метилфосфонат и другие алкилфосфонаты, включающие в себя 3'-алкиленфосфонат, 5'алкиленфосфонат и хиральный фосфонат, фосфинат, фосфорамидат, такой как 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, тионофосфорамидат, тионоалкилфосфонат, тионоалкилфосфотриэфир, селенофосфат или боранофосфат.

Другой предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент настоящего изобретения содержит один или несколько фрагментов Сахаров, которые являются моно- или дизамещенными по положениям 2', 3' и/или 5', таким заместителем, как -ОН; -F; замещенный или незамещенный, линейный или разветвленный низший (С₁-С₁₀) алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аллил или аралкил, который может содержать один или несколько гетероатомов; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; O-, S-, или N- аллил; О-алкил-О-алкил, -метокси, -аминопропокси; метоксиэтокси; диметиламинооксиэтокси; и -диметиламиноэтоксиэтокси. Сахарный фрагмент может представлять собой пиранозу или ее производное, или дезоксипиранозу или ее производное, предпочтительно рибозу или ее производное, или дезоксирибозу или ее производное. Предпочтительный дериватизированный сахарный фрагмент входит в состав закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), в которой 2'-атом углерода связан с 3'- или 4'-атомом углерода сахарного цикла, образуя бициклический сахарный фрагмент. Предпочтительная LNA представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую мостик 2'-О,4'-С-этилен (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242) . Указанные замены придают нуклеотидному аналогу или эквиваленту устойчивость к РНКазе Н и нуклеазе и повышают сродство к целевой РНК.

В другом воплощении нуклеотидный аналог или эквивалент настоящего изобретения содержит одну или несколько модификаций или замен оснований. Модифицированные основания включают в себя синтетические и природные основания, такие как инозин, ксантин, гипоксантин и другие аза-, деаза-, гидрокси-, галоген-, тио-, тиол-, алкил-, алкенил-, алкинил-, тиоалкил-производные пиримидиновых и пуриновых оснований, которые известны или могут стать известными в данной области.

Для специалиста в данной области очевидно, что нет необходимости единообразно модифицировать антисмысловой олигонуклеотид по всем положениям. Кроме того, в один антисмысловой олигонук- 6 033653 леотид, или даже в одно положение антисмыслового олигонуклеотида можно вставить несколько вышеуказанных аналогов или эквивалентов. В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, два разных типа аналогов или эквивалентов.

Предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения содержит 2'-Оалкилфосфоротиоатный антисмысловой олигонуклеотид, например, включающий в себя 2'-С-метилмодифицированную рибозу (RNA), 2'-О-этил-модифицированную рибозу, 2'-О-пропил-модифицированную рибозу, и/или замещенные производные указанных модификаций, такие как галогенированные производные.

Эффективный антисмысловой олигонуклеотид настоящего изобретения содержит 2'-О-метилрибозу и фосфоротиоатный скелет.

Для специалиста в данной области также очевидно, что для достижения эффективного пропуска аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов можно объединить разные антисмысловые олигонуклеотиды. В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения можно использовать сочетание, включающее в себя, по меньшей мере, два разных антисмысловых олигонуклеотида, три разных антисмысловых олигонуклеотида, четыре разных антисмысловых олигонуклеотидов, или пять разных антисмысловых олигонуклеотидов.

Антисмысловой олигонуклеотид может быть связан с фрагментом, который повышает поглощение антисмыслового олигонуклеотида клетками, предпочтительно клетками сетчатки. Примерами таких фрагментов являются холестерины, углеводы, витамины, биотин, липиды, фосфолипиды, способные проникать в клетку пептиды, включающие в себя, без ограничения, антеннапедию, ТАТ, транспортан и положительно заряженные пептиды, такие как олигоаргинин, полиаргинин, олиголизин или полилизин, антигенсвязывающие домены, такие как домены антител, Fab-фрагмент антитела, или одноцепочечный антигенсвязывающий домен, такой как камелоидный одноцепочечный антигенсвязывающий домен.

Молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения можно непосредственно вводить с помощью подходящих известных в данной области средств. Если молекула с пропуском экзона представляет собой олигонуклеотид, ее можно ввести субъекту, или в клетку, ткань или орган указанного субъекта, в виде вектора экспрессии, где вектор экспрессии кодирует транскрипт, содержащий указанный олигонуклеотид. Вектор экспрессии предпочтительно вводят в клетку, ткань, орган или субъекту с помощью средства доставки генов. В предпочтительном воплощении предлагается вирусный вектор экспрессии, содержащий экспрессионную кассету или транскрипционную кассету, которая управляет экспрессией или транскрипцией молекулы с пропуском экзона, как указано в данном документе. Соответственно, настоящее изобретение предлагает вирусный вектор, обеспечивающий экспрессию молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения при помещении в условия, способствующие экспрессии молекулы с пропуском экзона. Молекулу с пропуском экзона, способную интерферировать с эссенциальными последовательностями, обеспечивающими высоко эффективный пропуск аберрантного экзона CEP290 размером 128 нуклеотидов, можно ввести в клетку путем плазмидаопосредованной экспрессии антисмыслового олигонуклеотида или экспрессии, опосредованной векторами на основе аденовирусов или адено-ассоциированных вирусов. Экспрессию можно регулировать с помощью промотора полимеразы III, такого как РНКпромотор U1, U6 или U7. Предпочтительным средством доставки является вирусный вектор, такой как вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п. Кроме того, для доставки олигонуклеотида в клетки, как указано в данном документе, можно использовать плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, используемые для направленной гомологичной рекомбинации и интеграции в человеческий геном. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными являются векторы, которые обеспечивают транскрипцию под управлением промоторов PolIII, и/или которые экспрессируют транскрипты в виде гибридов с транскриптами U1 или U7, дающие хорошие результаты в случае доставки маленьких транскриптов. Конструирование подходящих транскриптов входит в сферу компетенции специалистов в данной области. Предпочтительными являются транскрипты, управляемые PolIII. Предпочтительно они находятся в виде гибрида с транскриптом U1 или U7. Такие гибриды можно получить с помощью описанных способов (Gorman L et al, 1998 или Suter D et al, 1999).

Молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, предпочтительно представляющую собой антисмысловой олигонуклеотид, можно доставлять как таковую. Однако молекула с пропуском экзона также может кодироваться вирусным вектором. Как правило, она находится в виде РНК-транскрипта, часть которого составляет последовательность олигонуклеотида настоящего изобретения.

Одна из предпочтительных систем экспрессии антисмыслового олигонуклеотида представляет собой вектор на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV). Разработаны одноцепочечные и двухцепочечные векторы на основе AAV, которые можно использовать для пролонгированной экспрессии маленьких антисмысловых нуклеотидных последовательностей, обеспечивающих высоко эффективный пропуск аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов.

Предпочтительный вектор на основе AAV содержит, например, экспрессионную кассету, которая управляется промотором полимеразы III (Pol III) . Предпочтительный промотор Pol III представляет собой, например, РНК-промотор U1, U6 или U7.

- 7 033653

Следовательно, изобретение также предлагает вирусный вектор, содержащий промотор Pol III, который управляет экспрессионной кассетой, обеспечивая экспрессию антисмыслового олигонуклеотида настоящего изобретения, индуцирующего пропуск аберрантного экзона СЕР290 размером 128 нуклеотидов.

Прогресс, достигнутый к настоящему времени, позволяет ожидать усовершенствования средств доставки молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения субъекту, или в клетку, ткань, орган указанного субъекта. Разумеется, такие будущие усовершенствования, могут внести вклад в достижение упомянутого эффекта на рестуктуризацию мРНК с помощью способа настоящего изобретения. Молекула с пропуском экзона настоящего изобретения ожжет быть доставлена как есть субъекту, в клетку, ткань или орган указанного субъекта. При введении молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения предпочтительно, чтобы эта молекула была растворена в растворе, совместимом со способом доставки. Плазмиду, обеспечивающую экспрессию антисмыслового олигонуклеотида, можно вводить в клетки сетчатки в водном растворе. Альтернативно плазмиду можно ввести методом трансфекции с использованием известных средств трансфекции. В случае внутривенного, подкожного, внутримышечного, интратекального и/или внутрижелудочкового введения раствор предпочтительно представляет собой физиологический солевой раствор. Особенно предпочтительным в данном документе является применение наполнителей или средств трансфекции, которые обеспечивают доставку всех компонентов, указанных в данном документе, к клетке и/или в клетку, которая предпочтительно представляет собой клетку сетчатки. Предпочтительными являются наполнители или средства трансфекции, способные образовывать комплексы, наночастицы, мицеллы, везикулы и/или липосомы, которые доставляют каждый из указанных здесь компонентов в виде комплекса, или внутри везикулы или липосомы, через клеточную мембрану. Многие из указанных наполнителей известны в данной области. Подходящие наполнители или средства трансфекции включают в себя полиэтиленимин (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) или их производные, или подобные катионные полимеры, в том числе сополимеры и производные полипропиленимина или полиэтиленимина (РЕС), синтетические амфифильные соединения (SAINT-18), lipofectin™, DOTAP и/или вирусные капсидные белки, способные к самосборке в частицы, которые могут доставлять каждый из указанных здесь компонентов к клетке, которая предпочтительно представляет собой клетку сетчатки. Показано, что такие наполнители эффективно доставляют олигонуклеотид, такой как антисмысловая нуклеиновая кислота, в широкий ряд культивируемых клеток, включающих в себя клетки сетчатки. Их высокий трансфекционный потенциал сочетается с токсичностью от исключительно низкой до средней с точки зрения общего выживания клеток. Простота структурной модификации позволяет проводить дополнительные модификации и анализировать другие (in vivo) характеристики переноса нуклеиновых кислот и токсичность.

Липофектин является примером липосомального средства трансфекции. Он состоит из двух липидных компонентов, катионного липида №[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-УУ№триметиламмония хлорид (DOTMA) (в отличие от него DOTAP представляет собой соль метилсульфат) и нейтрального липида диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Нейтральный компонент опосредует внутриклеточное высвобождение. Другая группа систем доставки включает в себя полимерные наночастицы.

Поликатионы, такие как диэтиламиноэтиламиноэтил (DEAE)-декстран, хорошо известные как средства трансфекции ДНК, можно объединять с бутилцианоакрилатом (РВСА) и гексилцианоакрилатом (РНСА) с получением катионных наночастиц, которые могут доставлять все указанные здесь компоненты, предпочтительно олигонуклеотид, в клетки через клеточные мембраны.

Помимо указанных веществ, традиционно используемых для получения наночастиц, в альтернативном способе для получения композиции олигонуклеотида, содержащей коллоидные вещества, используют катионный пептид протамин. Такая коллоидная система, содержащая наночастицы, может формировать так называемые proticles, образующиеся в результате простого процесса самосборки, которые могут упаковывать олигонуклеотид и опосредовать его внутриклеточное высвобождение. Специалист в данной области может выбрать и применить любой из вышеуказанных или других коммерчески доступных альтернативных наполнителей и систем доставки для упаковки и доставки молекулы с пропуском экзона в соответствии с настоящим изобретением с целью профилактики, лечения или замедления развития заболевания или состояния, опосредованного CEP290. Термин профилактика, лечение или замедление развития заболевания или состояния, опосредованного СЕР290 в данном описании предпочтительно определяют как предотвращение, остановку, прекращение развития, или обратный ход частичных или полных ухудшения зрения или слепоты, вызываемых дефектом гена CEP290.

Кроме того, молекула с пропуском экзона настоящего изобретения может быть ковалентно или нековалентно связана с направляющим лигандом, специально сконструированным для обеспечения поглощения клеткой, цитоплазмой и/или ее ядром. Такой лиганд может включать в себя (i) соединение (включающее в себя, без ограничения, пептидные (пептидоподобные) структуры), распознающее специфические элементы клетки, ткани или органа, обеспечивающие клеточное поглощение, и/или (ii) химическое соединение, способное обеспечить поглощение клетками и/или внутриклеточное высвобождение олигонуклеотида из везикул, таких как эндосомы или лизосомы.

- 8 033653

Следовательно, в предпочтительном воплощении молекула с пропуском экзона настоящего изобретения входит в состав композиции или лекарственного средства, которые также содержат, по меньшей мере, наполнитель, и/или направляющий лиганд, обеспечивающий доставку, и/или устройство для доставки указанной молекулы к клетке, и/или средство, повышающее внутриклеточное высвобождение.

Следует понимать, что, если композиция содержит дополнительный компонент, такой как вспомогательное соединение, описанное ниже, все компоненты композиции не обязательно входят в состав одного сочетания, или одной композиции, или одного препарата. В зависимости от их природы, опытный специалист может выбрать тип композиции, наиболее подходящий для каждого описанного здесь компонента. В предпочтительном воплощении изобретение предлагает композицию или препарат, которые находятся в виде набора компонентов, содержащего молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения и другое вспомогательное соединение, описанное ниже.

При необходимости молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения или вектор, предпочтительно вирусный вектор, экспрессирующий молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, можно использовать в составе фармацевтически активной смеси, которую получают путем добавления фармацевтически приемлемого носителя.

Соответственно, изобретение также предлагает композицию, предпочтительно фармацевтическую композицию, содержащую молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусный вектор настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Такая композиция может содержать одну молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, или она может содержать несколько разных молекул с пропуском экзона настоящего изобретения. Такая фармацевтическая композиция может содержать любой фармацевтически приемлемый наполнитель, в том числе носитель, наполнитель, консервант, вспомогательное средство, солюбилизатор и/или разбавитель. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей, консервантов, вспомогательных средств, солюбилизаторов и/или разбавителей можно найти, например, в Remington, 2000. Все характеристики указанной композиции описаны в данном документе выше.

Если используют несколько разных молекул с пропуском экзона настоящего изобретения, указанная здесь концентрация или доза может относиться к суммарной концентрации или дозе всех используемых олигонуклеотидов, или к концентрации или дозе каждой используемой или добавляемой молекулы с пропуском экзона. Следовательно, в одном воплощении изобретение предлагает композицию, где количество каждой вводимой молекулы с пропуском экзона, или количество всех молекул с пропуском экзона в соответствии с настоящим изобретением находится в диапазоне от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 20 мг/кг.

Предпочтительная молекула с пропуском экзона настоящего изобретения предназначена для лечения CEP290-опосредованного заболевания или состояния субъекта. Подразумевается, что во всех воплощениях настоящего изобретения термин лечение включает в себя предотвращение и/или замедление развития СЕР290-опосредованного заболевания или состояния. У субъекта, которого можно лечить с помощью молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения, также можно диагностировать CEP290-опосредованное заболевание или состояние. Альтернативно у субъекта, которого можно лечить с помощью молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения, еще может быть не диагностировано СЕР290-опосредованное заболевание или состояние, однако указанный субъект может иметь повышенный риск развития СЕР290-опосредованного заболевания или состояния в будущем, установленный на основе его или ее генетического фона. Предпочтительным субъектом является человек. В предпочтительном воплощении СЕР290-опосредованное заболевание или состояние представляет собой врожденный амавроз Лебера.

Соответственно, настоящее изобретение также предлагает молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусный вектор настоящего изобретения, или композицию настоящего изобретения для применения в качестве лекарственного средства для лечения CEP290-опосредованного заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга СЕР290, а также для применения в качестве лекарственного средства для профилактики, лечения или замедления развития СЕР290-опосредованного заболевания или состояния. Предпочтительное CEP290-опосредованное заболевание или состояние представляет собой врожденный амавроз Лебера. Все характерные особенности указанного применения описаны в данном документе выше.

Кроме того, изобретение предлагает применение молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусного вектора настоящего изобретения, или композиции настоящего изобретения для лечения CEP290-опосредованного заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга CEP290. В предпочтительном воплощении СЕР290-опосредованное заболевание или состояние представляет собой врожденный амавроз Лебера.

Настоящее изобретение также предлагает применение молекулы с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусного вектора настоящего изобретения, или композиции настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения СЕР290-опосредованного заболевания или состояния, требующего модуляции сплайсинга СЕР290, а также для получения лекарственного средства для профилактики, лечения или замедления развития СЕР290-опосредованного заболевания или состояния.

- 9 033653

Предпочтительное СЕР290-опосредованное заболевание или состояние представляет собой врожденный амавроз Лебера. Следовательно, в следующем аспекте изобретение предлагает применение молекулы с пропуском экзона, вирусного вектора или композиции, описанных в данном документе, для получения лекарственного средства для лечения состояния, требующего модуляции сплайсинга СЕР290, а также для получения лекарственного средства для профилактики, лечения или замедления развития СЕР290опосредованного заболевания или состояния. Предпочтительное СЕР290-опосредованное заболевание или состояние представляет собой врожденный амавроз Лебера. Все характерные особенности указанного применения описаны в данном документе выше.

Лечение в соответствии с применением или способом настоящего изобретения длится, по меньшей мере, одну неделю по меньшей мере один месяц, по меньшей мере несколько месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 лет или более. Все молекулы с пропуском экзона, или олигонуклеотиды, обеспечивающие пропуск экзона, или их эквиваленты, описанные в данном документе, предназначенные для применения в настоящем изобретении, можно использовать для непосредственного введения in vivo в клетку, ткань и/или орган субъекта, уже страдающего от СЕР290-опосредованного заболевания или состояния, или имеющего риск развития такого заболевания или состояния, причем их можно вводить непосредственно in vivo, ex vivo или in vitro. Частота введения олигонуклеотида, композиции, соединения или вспомогательного соединения настоящего изобретения может зависеть от нескольких параметров, таких как возраст пациента, присутствие мутации у пациента, число молекул с пропуском экзона (т.е. доза), состав композиции указанной молекулы. Частота может варьировать и может составлять, по меньшей мере, один раз в две недели, или в три недели, или в четыре недели, или в пять недель, или в более продолжительный промежуток времени.

Диапазоны доз молекулы с пропуском экзона, предпочтительно представляющей собой олигонуклеотид настоящего изобретения, предпочтительно выбирают на основе исследований, проводимых с повышением дозы в рамках клинических испытаний (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. Молекулу с пропуском экзона или олигонуклеотид, описанные в данном документе, можно использовать в дозе, которая варьирует от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 20 мг/кг.

В предпочтительном воплощении описанный здесь олигонуклеотид используют в концентрации, которая варьирует от 0,1 нМ до 1 мкМ. Предпочтительно указанный диапазон используют in vitro для клеточной модели, такой как клетки сетчатки или ткань сетчатки. Более предпочтительно используемая концентрация варьирует от 1 до 400 нМ, еще более предпочтительно от 10 до 200 нМ, еще более предпочтительно от 50 до 100 нМ. Если используют несколько олигонуклеотидов, указанная концентрация или доза может относиться к общей концентрации или дозе олигонуклеотидов или к концентрации или дозе каждого из добавляемых олигонуклеотидов.

В предпочтительном воплощении вирусный вектор, предпочтительно описанный выше вектор AAV, используемый в качестве средства доставки молекулы настоящего изобретения, вводят в дозе, варьирующей в диапазоне 1x10⁹-1x10¹⁷ вирусных частиц на инъекцию, более предпочтительно в диапазоне 1xl0¹⁰-1x 10¹² вирусных частиц на инъекцию.

Указанные выше диапазоны концентрации или дозы олигонуклеотида (олигонуклеотидов) включают в себя предпочтительные концентрации или дозы для применения in vitro или ex vivo. Специалисту в данной области известно, что концентрация или доза используемого олигонуклеотида (олигонуклеотидов) может дополнительно варьировать в зависимости от вида используемого олигонуклеотида (олигонуклеотидов), клетки-мишени, подлежащей обработке, гена-мишени и уровня его экспрессии, используемой среды и условий трансфекции и инкубации, и может потребовать оптимизации в дальнейшем.

Молекула с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусный вектор настоящего изобретения, или композиция настоящего изобретения, предназначенные для применения в настоящем изобретении, можно использовать для непосредственного введения in vivo в клетку, ткань и/или орган субъекта, уже страдающего от СЕР290-опосредованного заболевания или состояния, или имеющего риск развития такого заболевания или состояния, причем их можно вводить непосредственно in vivo, ex vivo или in vitro. Указанные молекулу с пропуском экзона настоящего изобретения, или вирусный вектор настоящего изобретения, или композицию настоящего изобретения можно вводить непосредственно или косвенно in vivo в клетку, ткань и/или орган субъекта, уже страдающего от СЕР290-опосредованного заболевания или состояния, или имеющего риск развития такого заболевания или состояния, причем их можно вводить непосредственно или косвенно in vivo, ex vivo или in vitro. Поскольку врожденный амавроз Лебера характеризуется выраженным фенотипом в клетках сетчатки, указанные клетки предпочтительно представляют собой клетки сетчатки, указанная ткань предпочтительно представляет собой сетчатку, а указанный орган предпочтительно включает в себя или представляет собой глаз.

Изобретение также предлагает способ модуляции сплайсинга CEP290 в клетке, включающий в себя приведение клетки, предпочтительно клетки сетчатки, в контакт с молекулой, содержащей пропуск экзона, настоящего изобретения, или с вирусным вектором настоящего изобретения, или с композицией настоящего изобретения. Характерные признаки данного аспекта предпочтительно представляют собой

- 10 033653 признаки, описанные выше. Приведение клетки в контакт с молекулой, содержащей пропуск экзона, настоящего изобретения, или с вирусным вектором настоящего изобретения, или с композицией настоящего изобретения, можно осуществить с помощью любого способа, известного специалисту в данной области. В объем изобретения входит применение способов доставки описанных здесь молекул с пропуском экзона, вирусных векторов и композиций. Приведение в контакт можно осуществлять непосредственно или косвенно in vivo, ex vivo или in vitro.

Изобретение также предлагает способ лечения CEP290-опосредованного заболевания или состояния, требующий модуляции сплайсинга СЕР290, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает в себя приведение клетки указанного субъекта, предпочтительно клетки сетчатки, в контакт с молекулой, содержащей пропуск экзона, настоящего изобретения, или с вирусным вектором настоящего изобретения, или с композицией настоящего изобретения. Характерные признаки данного аспекта предпочтительно представляют собой признаки, описанные выше. Приведение клетки в контакт с молекулой, содержащей пропуск экзона, настоящего изобретения, или с вирусным вектором настоящего изобретения, или с композицией настоящего изобретения, можно осуществить с помощью любого способа, известного специалисту в данной области. В объем изобретения входит применение способов доставки описанных здесь молекул с пропуском экзона, вирусных векторов и композиций. Приведение в контакт можно осуществлять непосредственно или косвенно in vivo, ex vivo или in vitro. Предпочтительным СЕР290-опосредованным заболеванием или состоянием является врожденный амавроз Лебера.

Если не указано иначе, каждое описанное здесь воплощение можно объединять с другими описанными здесь воплощениями.

Как показано в экспериментальном разделе настоящего описания на уровне РНК, добавление разных AON, направленных на аберрантный экзон СЕР290, фактически приводит к превращению аберрантно сплайсированной мРНК СЕР290 в правильно сплайсированную мРНК CEP290. Данное превращение согласуется с повышенным синтезом белка СЕР290 дикого типа.

В фибробластах (которые могут образовываться из клеток кожи) наблюдается обильная экспрессия CEP290. Следовательно, можно ожидать, что добавление AON к культивируемым фибробластам пациентов с LCA приведет к повышению количества белка СЕР290 дикого типа, детектируемого методом вестерн-блоттинга, который может продемонстрировать, что терапия на основе AON не только перенаправляет сплайсинг мРНК СЕР290 на нормальный, но и приводит к восстановлению функции белка CEP290. Такой эксперимент проводится в настоящее время.

В данном документе и в формуле изобретения глагол включает в себя и его спряжения используется в неограничивающем смысле и означает включение элементов, указанных вслед за этим глаголом, но не исключение конкретно не указанных элементов. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности присутствия нескольких таких элементов, если контекст однозначно не указывает на то, что присутствует один и только один из таких элементов. Следовательно, применение единственного числа, как правило, соответствует значению по меньшей мере один. Слово примерно или приблизительно в применении к численному значению (например, примерно 10) предпочтительно означает, что значение может составлять более или менее 0,1% от заданного значения (10).

Приведенная здесь информация о последовательности не должна истолковываться так узко, чтобы потребовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Квалифицированный специалист способен распознать ошибочно идентифицированные основания и исправить такие ошибки. В случае ошибок в последовательности, должна преобладать последовательность полипептида, образующегося в результате экспрессии гена, описанного в SEQ ID NO: 1, где приведена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид.

Все цитирующиеся в настоящем описании патентные и литературные ссылки полностью включены в данный документ.

Подписи к чертежам

Фиг. 1 - сплайсинг СЕР290 и действие AON.

A) Нормальный сплайсинг экзонов 26 и 27 мРНК СЕР290, приводящий к синтезу белка СЕР290 дикого типа.

B) Наиболее часто встречающейся LCA-индуцирующей мутацией является замена А на G (подчеркнуто и указано звездочкой) в интроне 26 СЕР290. Данная мутация создает донорный участок сплайсинга, который обуславливает включение аберрантного экзона в ~50% мРНК СЕР290 и последующую преждевременную терминацию синтеза белка CEP290.

C) После связывания с последовательность-специфичными AON, факторы, участвующие в сплайсинге, не распознают донорный участок аберрантного сплайсинга в интроне 26, что приводит к восстановлению нормального сплайсинга СЕР290 и синтезу правильного белка CEP290.

Фиг. 2 - AON-based rescue of аберрантный CEP290 splicing.

A) Результаты анализа методом ОТ-ПЦР мРНК СЕР290, выделенной из лимфобластоидных клеток одного контрольного субъекта и двух субъектов, страдающих от LCA, которые культивируют в отсутствии или присутствии выбранного AON (AON-3), направленного против аберрантного экзона CEP290 в конечной концентрации 1,0 мкМ. Верхняя полоса соответствует продукту аберрантного сплайсинга

- 11 033653

СЕР290, тогда как нижняя полоса соответствует продукту сплайсинга CEP290 CEP290 дикого типа. М:

маркер, содержащий 100 п.о. MQ: отрицательный водный контроль.

B) Специфичность спасения с использованием AON. Как и в пункте А), клетки трансфицируют AON-3 или смысловым олигонуклеотидом, направленным на тот же целевой участок (SON-3) . Левая панель: Результаты реакции ОТ-ПЦР с использованием праймеров, расположенных в экзоне 26 и в экзоне 27. Правая панель: Результаты реакции ОТ-ПЦР с использованием праймеров, расположенных в экзоне 26 и в экзоне 31.

C) Дозо-зависимое спасение сплайсинга мРНК CEP290. Как и в пункте А) , клетки трансфицируют выбранным AON в разных концентрациях, варьирующих от 0,01 до 1,0 мкМ.

Фиг. 3 Специфичность к последовательности при спасении сплайсинга аберрантного СЕР290 с использованием AON.

A) Схематическое изображение аберрантного экзона СЕР290 и относительные положения выбранных AON. 5'-конец аберрантного экзона является частью Alu-повтора.

B) Анализ методом ОТ-ПЦР мРНК CEP290, выделенной из лимфобластных клеток пациентов с LCA, которые культивируют в отсутствии или присутствии разных AON, направленных против аберрантного экзона CEP290 (AON 1-5), или одного смыслового олигонуклеотида (SON-3). AON и SON трансфицируют в конечной концентрации 0,1 мкМ. Верхняя полоса соответствует продукту аберрантного сплайсинга СЕР290, а нижняя полоса соответствует продукту сплайсинга СЕР290 дикого типа. М: маркер, содержащий 100 п.о.

Последовательности

Все приведенные последовательности изображены в направлении 5'^3'.

Таблица 1. Последовательности, описанные в разделе Список последовательностей

SEQ ID NO:	Тип последователь- ности	Описание
1	Геномная ДНК	СЕР290
2	кДНК	СЕР290
3	Белок	Белок СЕР290
4	ДНК	Аберрантный экзон СЕР290, содержащий 128 нуклеотидов
5	Белок	Аберрантный белок СЕР290
6	Полинуклеотид	мотив, содержащий 143 нуклеотида
7	Полинуклеотид	мотив, содержащий 42 нуклеотида
8	Полинуклеотид	мотив, содержащий 24 нуклеотида
9	A0N-1	taatcccagcactttaggag
10	A0N-2	gggccaggtgcggtgg
11	A0N-3	aactggggccaggtgcg
12	A0N-4	tacaactggggccaggtg
13	A0N-5	actcacaattacaactgggg
14	SON-3	cgcacctggccccagtt
15	Праймер ПЦР	tgctaagtacagggacatcttgc
16	Праймер ПЦР	agactccacttgttcttttaaggag

Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на нижеследующие примеры, которые не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Если не указано иначе, для осуществления настоящего изобретения используют стандартные традиционные методы молекулярной биологии, вирусологии, микробиологии или биохимии. Такие методы описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2<nd> edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; in Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).

- 12 033653

Примеры

Материалы и методы.

Получение антисмысловых олигонуклеотидов.

Последовательность аберрантного экзона CEP290 размером 128 п.о., входящую в состав мутантной мРНК СЕР290, анализируют на присутствие энхансерных мотивов сплайсинга экзонов с использованием программы ESE finder 3.0 (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home). Антисмысловые олигонуклеотиды РНК получают от Eurogentec, конструируют так, чтобы достичь Тпл 58°С, модифицируют 2'-О-метильной группой по сахарной цепи и фосфоротиоатному скелету и растворяют в физиологическом растворе, забуференным фосфатом.

Клеточная культура.

Человеческие В-лимфобластные клетки пациентов с LCA, гомозиготно несущие интронную мутацию в СЕР290, иммортализуют путем трансформации вирусом Эпштейна-Барра, как описано выше. (Wall FE, 1995). Клетки культивируют в среде RPMI1640 (Gibco), содержащей 10% (об/об) фетальной телячьей сыворотки (Sigma), 1% 10 ед./мкл пенициллина и 10 мкг/мкл стрептомицина (Gibco), и 1% GlutaMAX (Gibco), с плотностью 0,5х 10⁶ клеток/мл. Клетки пересевают два раза в неделю.

Трансфекция AON.

За день до трансфекции 1,0х10⁶ клеток высевают в каждую лунку 6-луночного планшета в общем объеме полной среды 2 мл. Смеси для трансфекции получают путем объединения 2,5 мкл AON в желательной концентрации или дистиллированной воды, 5 мкл реагента для трансфекции (ExGen in vitro 500, Fermentas) и 92,5 мкл 150 мМ NaCl, после чего смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут и добавляют к клеткам. Через шесть часов после трансфекции добавляют 8 мл среды с низким содержанием сыворотки (полная среда, содержащая только 1% фетальной телячьей сыворотки). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки собирают, промывают 1x PBS и затем сразу выделяют РНК.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР.

Общую РНК выделяют из трансфицированных лимфобластных клеток, используя набор для выделения РНК Nucleospin RNA II (Machery Nagel) в соответствии с инструкцией производителя. Затем 1 мкг общей РНК используют для синтеза кДНК с помощью набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). В каждой реакции ПЦР используют пять процентов кДНК. Часть кДНК СЕР290 амплифицируют в стандартных условиях ПЦР с добавлением 5% Q-раствора (Qiagen) и с использованием обратного праймера tgctaagtacagggacatcttgc (SEQ ID NO: 15) и прямого праймера agactccacttgttcttttaaggag (SEQ ID NO: 16), расположенных в экзоне 26 и в экзоне 27 человеческого гена CEP290, соответственно. Продукты ПЦР разделяют на 1,5% агарозном геле. Полосы, предположительно содержащие правильно и аберрантно сплайсированный СЕР290, вырезают из геля, очищают с использованием набора для выделения Nucleospin Extract II и секвенируют обе цепи, используя набор ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing V2.0 Ready Reaction и ДНК-анализатор ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems).

Введение.

Здесь авторы описывают применение AON для восстановления нормального сплайсинга СЕР290 в лимфобластных клетках пациента и демонстрируют последовательность-специфичное и дозо-зависимое уменьшение уровня аберрантно сплайсированного СЕР290, что свидетельствует о возможности применения AON для лечения СЕР290-ассоциированного LCA.

Результаты.

Интронная мутация CEP290 (с.2991+1655A>G) создает скрытый донорный участок сплайсинга, что приводит к включению аберрантного экзона в мРНК CEP290 (фиг. 1А и -В). Добавление AON, направленных против аберрантного экзона, предотвращает вставку данного экзона путем препятствования связывания факторов, необходимых для сплайсинга, таких как комплексы U1- и U2snRNP, а также серинаргинин-обогащенные белки, и тем самым восстанавливает нормальный сплайсинг и синтез белка СЕР290 (фиг. 1С). AON могут быть направлены на участки сплайсинга или на последовательности экзонов, хотя в конкретном случае гена мышечной дистрофии Дюшенна DMD, AON, направленные на участки экзона, имеют тенденцию превосходить по характеристикам AON, направленные на участки сплайсинга (Aartsma-Rus et al, 2010) . Кроме того, предыдущие исследования позволяют предположить наличие положительной корреляции между способностью AON индуцировать пропуск экзона и присутствием предполагаемых участков связывания фактора сплайсинга SC35 в целевой последовательности (AartsmaRus et al, 2008). Чтобы сконструировать AON, обладающий высокой активностью в отношении пропуска экзона, последовательность аберрантного экзона CEP290 (128 нуклеотидов последовательности экзона плюс 15 нуклеотидов последовательностей интронов с каждой стороны) тщательно анализируют с помощью программы ESE finder 3.0 (Smith et al, 2006) на наличие мотивов, связывающих энхансер сплайсинга экзонов. Результаты анализа свидетельствуют о теоретической возможности присутствия на 3'конце аберрантного экзона двух SC35-связывающих мотивов (данные не показаны). Следовательно, первый AON конструируют так, чтобы он охватывал два указанных мотива (его обозначают AON-3, SEQ ID NO: 11) и был комплементарен мРНК CEP290.

- 13 033653

Чтобы определить, действительно ли AON-3 способен индуцировать пропуск экзона in vitro, иммортализованные лимфобластные клетки двух неродственных субъектов с LCA, гомозиготно несущие приобретенную мутацию в интроне СЕР290 с.2991+1655A>G, а также одного контрольного субъекта культивируют в отсутствии или присутствии 1 мкМ AON-3. Как и ожидалось, у контрольного субъекта наблюдается только одна полоса, соответствующая правильно сплайсированному СЕР290, тогда как у обоих пораженных болезнью субъектов присутствуют два продукта, один из которых представляет собой правильно сплайсированную, а другой - аберрантно сплайсированную мРНК CEP290. После добавления AON-3 наблюдается сильное уменьшение аберрантно сплайсированного СЕР290 у обоих субъектов с LCA (фиг. 2А). Затем оценивают специфичность AON-3 путем трансфекции смыслового олигонуклеотида, направленного на тот же целевой участок (SON-3, SEQ ID NO: 14). Анализ методом ОТ-ПЦР демонстрирует, что в клетках, трансфицированных SON-3, остаются молекулы и аберрантно сплайсированной, и правильно сплайсированной мРНК CEP290 (фиг. 2В, левая панель), свидетельствуя о специфичности антисмысловой последовательности. С использованием другой пары праймеров, которая обеспечивает амплификацию более крупных продуктов, получают подобные результаты (фиг. 2В, правая панель). Интересно, что уменьшение аберрантно сплайсированного СЕР290 сопровождается повышением интенсивности полосы, которая содержит продукт, соответствующий правильно сплайсированной мРНК CEP290. Полученные результаты показывают, что аберрантный продукт не разрушается, и что трансфекция AON фактически индуцирует пропуск экзона, приводящий к синтезу более корректно сплайсированной мРНК СЕР290 дикого типа. Чтобы определить эффективную дозу AON-3, клетки трансфицируют разными концентрациями AON-3, варьирующими от 0,01 до 1,0 мкМ. Даже при самой низкой концентрации, составляющей 0,01 мкМ, наблюдается значительное снижение аберрантно сплайсированного CEP290. Максимальное количество молекул с пропуском экзона наблюдается при концентрации AON от 0,05 до 0,1 мкМ, свидетельствуя о том, что указанные концентрации являются достаточными для превращения почти всех аберрантно сплайсированных молекул CEP290 (фиг. 2С).

Полагают, что эффективность AON при модуляции сплайсинга зависит лишь от доступности целевой молекулы мРНК и, следовательно, значения эффективности в отношении к соседним последовательностям могут сильно различаться. Чтобы определить, действительно ли данная специфичность последовательности также применима к СЕР290, конструируют несколько AON, направленных на аберрантный экзон СЕР290 (табл. 1). Данный экзон содержит 128 пар оснований, основную часть которых составляет Alu-повтор, один из наиболее часто повторяющихся элементов в геноме человека (Schmidt et al, 1982), охватывающий весь 5'-конец аберрантного экзона (фиг. 3А) . Следовательно, большую часть AON конструируют так, чтобы они были комплементарны 3'-концу аберрантного экзона или донорному участку сплайсинга (фиг. 3А) . Всего пять AON используют для трансфекции в конечной концентрации 0,1 мкМ, которая, как показано, является оптимальной для AON-3. Интересно, что помимо AON-3, высокий уровень пропуска экзона вызывают также AON-2 (SEQ ID NO: 10) и AON-4 (SEQ ID NO: 12). И наоборот, AON-1 (SEQ ID NO: 9), направленный на участок Alu-повтора, и AON-5 (SEQ ID NO: 13), направленный на донорный участок сплайсинга, демонстрируют низкую способность индуцировать пропуск экзона (фиг. 3В). Полученные результаты демонстрируют специфичность к последовательности при индуцировании пропуска экзона СЕР290 с помощью AON и позволяют выделить небольшой участок аберрантного экзона CEP290 в качестве потенциальной терапевтической мишени.

Обсуждение.

В данном исследовании авторы анализируют возможность терапевтического применения AON с целью коррекции дефекта сплайсинга, вызванного мутацией в интроне CEP290. Трансфекция некоторых, хотя и не всех, AON в иммортализованные лимфобластные клетки пациентов с LCA, гомозиготно несущих в интроне СЕР290 мутацию с.2991+1655A>G, приводит к пропуску аберрантного экзона и, как следствие, к почти полному восстановлению нормального сплайсинга CEP290.

Более десяти лет AON являются предметом терапевтических исследований, направленных на разработку стратегий лечения ряда генетических заболеваний (Hammond et al, 2011). Указанные стратегии включают в себя применение AON для блокировки распознавания участков аберрантного сплайсинга, для изменения соотношения между двумя природными сплайсинговыми изоформами, для индуцирования пропуска экзонов, которые содержат мутации, приводящие к укорачиванию белка, или для индуцирования пропуска экзонов с целью восстановления рамки считывания гена, разрушенной в результате геномной делеции, и последующего синтеза (частично) функционального белка (Hammond et al, 2011) . Последний способ уже проходит фазу I/II клинических испытаний по лечению пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна, показывая многообещающие результаты (Kinali et al, 2009; van Deutekom et al, 2007).

Интронная мутация СЕР290 представляет собой идеальную мишень для терапии на основе AON, поскольку данная мутация приводит к включению аберрантного экзона в мРНК СЕР290 с получением мРНК, которая в норме не транскрибируется. Пропуск такого аберрантного экзона под действием AON приводит к полному восстановлению синтеза нормальной мРНК СЕР290, обеспечивающей нормальный уровень синтезируемого белка CEP290. Второе главное преимущество состоит в том, что, хотя описанный способ, основанный на применении AON, представляет собой мутация-специфичную терапевтиче

- 14 033653 скую стратегию, интронная мутация СЕР290, безусловно, является наиболее часто встречающейся мутацией, вызывающей LCA.⁴ Исходя из примерной частоты случаев LCA (1:50000) и наблюдаемой частоты интронной мутации CEP290 в Северной Европе (26%) (Coppieters et al, 2010) и США (10%) (Stone, 2007), можно сделать вывод, что по меньшей мере одна тысяча, а в зависимости от частоты мутации в других популяциях, возможно и гораздо больше субъектов по всему миру заболевают LCA в результате данной мутации. И наконец, хотя фенотип LCA, связанный с мутациями СЕР290, соответствует тяжелому заболеванию, обнаружено, что целостность фоторецепторов, особенно в макуле, а также анатомическая структура зрительных связей с мозгом являются относительно неповрежденными у LCA-пациентов с мутациями СЕР290, что создает окно возможностей для терапевтического вмешательства (Cideciyan et al, 2007).

Описанное здесь исследование предлагает проверку и подтверждение механизма действия терапии, основанной на применении AON и предназначенной для лечения СЕР290-опосредованного LCA in vitro, с использованием иммортализованных лимфобластных клеток пациента. Чтобы определить фактический терапевтический потенциал данного метода в отношении лечения LCA, требуются дополнительные исследования, которые включают в себя разработку терапевтических векторов и оценку эффективности и безопасности на животных моделях. AON, оголенные или конъюгированные с пептидами, способными проникать в клетки, можно доставлять к сетчатке путем внутриглазных инъекций, причем ограниченная стабильность AON требует введения нескольких инъекций одному субъекту. И наоборот, при использовании вирусных векторов достаточно одной субретинальной инъекции, чтобы обеспечить длительную экспрессию терапевтической конструкции. Ранее другие исследователи использовали векторы на основе рекомбинантных адено-ассоциированных вирусов (rAAV), несущие конструкции U1- или модифицированные U7snPHK, для эффективной доставки последовательностей AON mdx мышиной модели DMD, или в миобласты пациентов с DMD, соответственно (Geib et al, 2009; Goyenhalle et al, 2004). AON, направленные на аберрантный экзон СЕР290, можно клонировать в линии, содержащей такие конструкции, с последующей доставкой в сетчатку путем субретинальных инъекций серотипов rAAV-5 или -8, способных эффективно трансфицировать фоторецепторные клетки, в которых экспрессируется эндогенный ген CEP290 (Alloca et al, 2007; Lebherz et al, 2008). Субретинальные инъекции векторов rAAV-2 не вызывают длительного иммунного ответа у пациентов, содержащих мутации RPE65 (Simonella et al, 2009), при использовании векторов rAAV-5 и rAAV-8 иммунные ответы также отсутствуют или являются ограниченными, по меньшей мере, животнеых моделей (Li et al, 2009; Vandenberghe et al, 2011). Финальный аспект исследования безопасности касается специфичности последовательности, которую используют для блокировки сплайсинга аберрантного экзона CEP290. Как указано выше, большую часть указанного экзона составляет Alu-повтор, а AON, направленные против данного повтора, по всей вероятности будут связываться с несколькими участками человеческого генома, повышая вероятность индукции нецелевых эффектов. AON, эффективность которых продемонстрирована в данном исследовании, не полностью направлены на последовательность Alu-повтора, а также они не являются полностью уникальными для человеческого генома. Однако при сравнении с базой данных EST точные совпадения отсутствуют, свидетельствуя о том, что на уровне экспрессированных генов исследуемые последовательности вряд ли способны индуцировать нецелевые эффекты и нарушать регуляцию нормального сплайсинга других генов. Чтобы дополнительно исследовать эффективность и безопасность терапии на основе AON в применении к CEP290-опосредованному LCA in vivo, авторы получают трансгенную мышиную нокин-модель, которая несет человеческий ген CEP290, часть которого (от экзона 26 до экзона 27, в присутствии и в отсутствии интронной мутации) заменена на мышиный аналог. Терапия на основе AON имеет ряд преимуществ по сравнению с аугментационной генной терапией. Во-первых, в аугментационной генной терапии используют общераспространенный или тканеспецифичный промотор для управления экспрессией кДНК дикого типа, кодирующей белок, который у некоторых пациентов является мутантным. Например, в одном клиническом испытании генной терапии RPE65 используют промотор куриного бетаактина (Maguire et al, 2008). С использованием указанных промоторов, а также фрагментов эндогенных промоторов, трудно контролировать уровень экспрессии терапевтического гена. В некоторых случаях, например, в случае белка RPE65, обладающего ферментативной активностью, уровень экспрессии, превышающий эндогенный уровень экспрессии гена, может не оказывать вредного действия на сетчатку. Однако в случае других генов, включающих в себя гены, которые кодируют структурные белки, такие как СЕР290, строго регулируемые уровни экспрессии могут иметь важное значение для выживания клеток, причем сверхэкспрессия терапевтического белка может оказывать токсическое действие. При применении AON терапевтическое вмешательство осуществляется на уровне пре-мРНК и, следовательно, не влияет на эндогенный уровень экспрессии целевого гена. Второй проблемой является применение вирусного вектора. Среди ряда разных рекомбинантных вирусных векторов rAAV считаются наиболее подходящими для лечения дистрофии сетчатки, поскольку они обладают способностью трансфицировать клетки сетчатки с относительно высокой эффективностью и характеризуются ограниченной иммуногенностью. Основным недостатком rAAV является ограниченный размер нагрузки, составляющий 4,8 т.о. Опять же, в случае некоторых генов, таких как RPE65, это не является проблемой. Однако величина полноразмерных кДНК многих других генов сетчатки, таких как СЕР290 (размер открытой рамки считыва

- 15 033653 ния составляет 7,4 т.о.), а также АВСА4 и USH2A, превышает размер нагрузки существующего в настоящее время пула rAAV. Один из способов преодоления данной проблемы включает в себя получение кДНК, которые экспрессируют только фрагменты белков с остаточной активностью, например, в случае СЕР290 предлагают экспрессировать N-концевой участок CEP290 у модели данио (Вауе et al, 2011). Другие вирусные векторы, такие как лентивирус или аденовирус, характеризуются более высоким объемом нагрузки, чем rAAV (~8 т.о.), однако они являются менее эффективными при трансфекции клеток сетчатки, кроме того, аденовирусы обладают более высоким иммуногенным потенциалом (den Hollander et al, 2010). В случае терапии на основе AON ограничения по размеру, присущие AAV, не являются проблемой, поскольку небольшой размер AON и сопутствующих конструкций позволяет легко встраивать их в доступные AAV.

В заключение необходимо отметить, что данное исследование демонстрирует, что введение AON в культивируемые клетки пациента почти полностью корректирует дефект сплайсинга, вызываемый часто встречающейся интронной мутацией СЕР290, которая индуцирует развитие LCA. Полученные результаты служат основанием для дальнейших исследований с целью определения терапевтического потенциала терапии на основе AON в отношении СЕР290-опосредованного LCA, приводящей к замедлению или прекращению развития этой изнуряющей и ослепляющей болезни.

- 16 033653

Список ссылок

1. Leber, Т. (1869). Uber Retinitis Pigmentosa und angeborene Amaurose. von Graefe's Archives Ophthalmology 15, 125.

2. Koenekoop, R.K., Lopez, I., den Hollander, A.I ., Allikmets, R., and Cremers, F.P. (2007). Genetic testing for retinal dystrophies and dysfunctions: benefits, dilemmas and solutions. Clin Experiment Ophthalmol 35, 473-485.

3. Stone, E.M. (2007) . Leber congenital amaurosis - a model for efficient genetic testing of heterogeneous disorders: LXIV Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol 144, 791-811.

4. den Hollander, A.I., Roepman, R., Koenekoop, R.K., and Cremers, F.P.M. (2008). Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Prog Retin Eye Res 27, 391-419.

5. Estrada-Cuzcano, A., Koenekoop, R.K., Coppieters, F., Kohl, S., Lopez, I., Collin, R.W.J., De Baere, E.B., Roeleveld, D., Marek, J., Bernd, A. et al (2011) . IQCB1 mutations in patients with leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci 52, 834-839.

6. den Hollander, A.I., Koenekoop, R.K., Yzer, S., Lopez, I., Arends, M.L., Voesenek, K.E., Zonneveld, M.N., Strom, T.M., Meitinger, T., Brunner, H.G. et al (2006). Mutations in the CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am J Hum Genet 79, 556-561.

7. Perrault, I., Delphin, N., Hanein, S., Gerber, S., Dufier, J.L., Roche, 0., foort-Dhellemmes, S., Dollfus, H., Fazzi, E., Munnich, A. et al (2007). Spectrum of NPHP6/CEP290 mutations in Leber congenital amaurosis and delineation of the associated phenotype. Hum Mutat 28, 416.

8. Baala, L., Audollent, S., Martinovic, J., Ozilou, C., Babron, M.C., Sivanandamoorthy, S., Saunier, S., Salomon, R., Gonzales, M., Rattenberry, E. et al (2007). Pleiotropic effects of CEP290 (NPHP6) mutations extend to Meckel syndrome. Am J Hum Genet 81, 170-179.

9. Frank, V., den Hollander, A. I., Bruchle, N.O., Zonneveld, M.N., Nurnberg, G., Becker, C., Du, B.G., Kendziorra, H., Roosing, S., Senderek, J. et al (2008). Mutations of the CEP290 gene encoding a centrosomal protein cause Meckel-Gruber syndrome. Hum Mutat 29, 45-52.

10. Helou, J., Otto, E.A., Attanasio, M., Allen, S.J., Parisi, M.A., Glass, I., Utsch, B., Hashmi, S., Fazzi, E., Omran, H. et al (2007) . Mutation analysis of NPHP6/CEP290 in patients with Joubert syndrome and Senior-Loken syndrome. J Med Genet 44, 657-663.

11. Valente, E.M., Silhavy, J.L., Brancati, F., Barrano, G., Krishnaswami, S.R., Castori, M., Lancaster, M.A., Boltshauser, E., Boccone, L., Al-Gazali, L. et al (2006) .

- 17 033653

Mutations in CEP290, which encodes a centrosomal protein, cause pleiotropic forms of Joubert syndrome. Nat Genet 38, 623-625.

12. Coppieters, F., Casteels, I., Meire, F., De Jaegere S., Hooghe, S., van Regemorter N., Van Esch H., Matuleviciene, A., Nunes, L., Meersschaut, V. et al (2010) . Genetic screening of LCA in Belgium: predominance of CEP290 and identification of potential modifier alleles in AHI1 of CEP290-related phenotypes. Hum Mutat 31, E1709-E1766.

13. Littink, K.W., Pott, J.W., Collin, R.W.J., Kroes, H.Y.,

Verheij, J. В .	, Blokland, E.A.,	de	Castro Miro	M. ,	Hoyng,	C.B. ,
Klaver, C . C . ,	Koenekoop, R.K.	et	al (2010).	A novel nonsense
mutation in	CEP290 induces	exon	skipping	and	leads	to a

relatively mild retinal phenotype. Invest Ophthalmol Vis Sci 51, 3646-3652 .

14. Bainbridge, J.W., Smith, A.J., Barker, S.S., Robbie, S., Henderson, R., Balaggan, K., Viswanathan, A., Holder, G.E., Stockman, A., Tyler, N. et al (2008). Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2231-2239.

15. Cideciyan, A.V., Aleman, T.S., Boye, S.L., Schwartz,

S. B., Kaushal, S., Roman, A.J., Pang, J.J., Sumaroka, A., Windsor, E.A., Wilson, J.M. et al (2008). Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc Natl Acad Sci USA 105, 1511215117 .

16. Hauswirth, W. , Aleman, T.S., Kaushal, S., Cideciyan,

A.V., Schwartz, S.B., Wang, L., Conlon, T., Boye, S.L., Flotte,

T. R., Byrne, B. et al (2008). Phase I Trial of Leber Congenital Amaurosis due to Estrada- Mutations by Ocular Subretinal Injection of Adeno-Associated Virus Gene Vector: Short-Term Results. Hum Gene Ther

17. Maguire, A.M., Simonelli, F., Pierce, E.A., Pugh, E.N., Jr., Mingozzi, F., Bennicelli, J., Banfi, S., Marshall, K.A., Testa, F., Surace, E.M. et al (2008) . Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2240-2248 .

- 18 033653

18. Maguire, A.M., High, К.A., Auricchio, A., Wright, J.F., Pierce, E.A., Testa, F., Mingozzi, F., Bennicelli, J.L., Ying,

G.S., Rossi, S. et al (2009) . Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 doseescalation trial. Lancet 374, 1597-1605.

19. den Hollander, A. I., Black, A., Bennett, J., and Cremers, F.P.M. (2010). Lighting a candle in the dark: advances in genetics and gene therapy of recessive retinal dystrophies. J Clin Invest 120, 3042-3053.

20. Aartsma-Rus, A., Houlleberghs, H., van Deutekom, J.C., van Ommen, G.J., and 't Hoen, P.A. (2010). Exonic sequences provide better targets for antisense oligonucleotides than splice site sequences in the modulation of Duchenne muscular dystrophy splicing. Oligonucleotides 20, 69-77.

21. Aartsma-Rus, A., van, V.L., Hirschi, M., Janson, A.A. , Heemskerk, H., de Winter, C.L., de, K.S., van Deutekom, J.C., 't Hoen, P.A., and van Ommen, G.J. (2008) . Guidelines for Antisense Oligonucleotide Design and Insight Into Splice-modulating Mechanisms. Mol Ther

22. Smith, P.J., Zhang, C., Wang, J., Chew, S.L., Zhang, M.Q., and Krainer, A.R. (2006) . An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers. Hum Mol Genet 15, 2490-2508.

23. Schmid, C.W. and Jelinek, W.R. (1982) . The Alu family of dispersed repetitive sequences. Science 216, 1065-1070.

24. Hammond, S.M. and Wood, M.J. (2011). Genetic therapies for RNA mis-splicing diseases. Trends Genet 27, 196-205.

25. Kinali, M., rechavala-Gomeza, V., Feng, L., Cirak, S., Hunt, D., Adkin, C., Guglieri, M., Ashton, E., Abbs, S., Nihoyannopoulos, P. et al (2009) . Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, doseescalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 8, 918-928.

26. van Deutekom, J.C., Janson, A.A., Ginjaar, I.B., Frankhuizen, W.S., Aartsma-Rus, A., Bremmer-Bout, M., Den Dunnen, J.T., Koop, K., van der Kooi, A.J., Goemans, N.M. et al (2007).

- 19 033653

Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 357, 2677-2686.

27. Coppieters, F., Lefever, S., Leroy, B.P., and De, B.E. (2010) . CEP290, a gene with many faces: mutation overview and presentation of CEP290base. Hum Mutat 31, 1097-1108.

28. Cideciyan, A.V., Aleman, T.S., Jacobson, S.G., Khanna,

H., Sumaroka, A., Aguirre, G.K., Schwartz, S.B., Windsor, E.A., He, S., Chang, B. et al (2007) . Centrosomal-ciliary gene CEP290/NPHP6 mutations result in blindness with unexpected sparing of photoreceptors and visual brain: implications for therapy of Leber congenital amaurosis. Hum Mutat 28, 1074-1083.

29. Gelb, T. and Hertel, K.J. (2009). Restoration of fulllength SMN promoted by adenoviral vectors expressing RNA antisense oligonucleotides embedded in U7 snRNAs. PLoS One 4, e8204.

30. Goyenvalle, A., Vulin, A., Fougerousse, F., Leturcq, F., Kaplan, J.C., Garcia, L., and Danos, 0. (2004). Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 306, 1796-1799.

31. Allocca, M., Mussolino, C., Garcia-Hoyos, M., Sanges, D., lodice, C., Petrillo, M., Vandenberghe, L.H., Wilson, J.M., Marigo, V., Surace, E.M. et al (2007). Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol 81, 11372-11380.

32. Lebherz, C., Maguire, A., Tang, W., Bennett, J., and Wilson, J.M. (2008) . Novel AAV serotypes for improved ocular gene transfer. J Gene Med 10, 375-382.

33. Simonelli, F., Maguire, A.M., Testa, F., Pierce, E.A., Mingozzi, F., Bennicelli, J.L., Rossi, S., Marshall, K., Banfi, S., Surace, E.M. et al (2009). Gene Therapy for Leber's Congenital Amaurosis is Safe and Effective Through 1.5 Years After Vector Administration. Mol Ther

34. Li, W., Kong, F., Li, X., Dai, X., Liu, X., Zheng, Q., Wu, R., Zhou, X., Lu, F., Chang, B. et al (2009). Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner

- 20 033653 eye. Mol Vis 15, 267-275.

35. Vandenberghe, L.H., Bell, P., Maguire, A.M., Cearley,

C. N., Xiao, R., Calcedo, R., Wang, L., Castle, M.J., Maguire,

A.C., Grant, R. et al (2011) . Dosage Thresholds for AAV2 and AAV8 Photoreceptor Gene Therapy in Monkey. Sci Transl Med 3, 88ra54.

36. Baye, L.M., Patrinostro, X., Swaminathan, S., Beck, J.S., Zhang, Y., Stone, E.M., Sheffield, V.C., and Slusarski,

D. C. (2011) . The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Hum Mol Genet 20, 1467-1477.

37 .	Dorn and	Kippenberger,	Curr Opin Mol Ther 2008 10	(1)
10-20
38 .	Nielsen,	et	al. (1991)	Science 254, 1497-1500
39.	Govindaraj u	and Kumar (	2005) Chem. Commun, 495-497
40 .	Egholm et	al	(1993) Nature 365, 566-568
41 .	Morita et	al	. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No.	1:
241-242
42 .	Gorman L,	et	al, Stable	alteration of pre-mRNA splicing

patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci U

S A 1998; 95 (9) :4929-34

43. Suter D, et al, Double-target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations. Hum Mol Genet 1999;8 (13) :2415-23

44. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th

Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антисмысловой олигонуклеотид с пропуском экзона для лечения врожденного амавроза Лебера, который способен индуцировать пропуск аберрантного экзона размером 128 нуклеотидов из пре-мРНК СЕР290 человека, причем указанный олигонуклеотид комплементарен SEQ ID NO: 8 и содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
2. 2. Антисмысловой олигонуклеотид по п.1, включающий 2'-O-алкилфосфоротиоатный моносахарид, такой как 2'-O-метилмодифицированная рибоза (РНК), 2'-O-этилмодифицированная рибоза, 2'-Oпропилмодифицированная рибоза и/или замещенные производные указанных модифицированных моносахаридов, такие как галогенированные производные.
3. 3. Вирусный вектор, экспрессирующий антисмысловой олигонуклеотид по п.1.
4. 4. Фармацевтическая композиция для лечения врожденного амавроза Лебера, содержащая антисмысловой олигонуклеотид по п.1 или 2 или вирусный вектор по п.3 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
5. 5. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.
6. 6. Применение вектора по п.3 для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.
7. 7. Применение композиции по п.4 для получения лекарственного средства для лечения врожденного амавроза Лебера.
8. 8. Способ блокировки аберрантного сплайсинга CEP290 в клетке, согласно которому указанную клетку приводят в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом по п.1 или 2.
9. 9. Способ лечения врожденного амавроза Лебера у субъекта, нуждающегося в этом, согласно которому указанному субъекту вводят антисмысловой олигонуклеотид по п.1 или 2.