EA032769B1 - Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени - Google Patents

Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени Download PDF

Info

Publication number
EA032769B1
EA032769B1 EA201491064A EA201491064A EA032769B1 EA 032769 B1 EA032769 B1 EA 032769B1 EA 201491064 A EA201491064 A EA 201491064A EA 201491064 A EA201491064 A EA 201491064A EA 032769 B1 EA032769 B1 EA 032769B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
nucleic acid
probe
atoms
base
Prior art date
Application number
EA201491064A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491064A1 (ru
Inventor
Йосихиде Хайясизаки
Такеси Ханами
Такахиро Сома
Ясумаса Кимура
Хадзиме Канамори
Ясумаса Митани
Original Assignee
КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ filed Critical КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ
Publication of EA201491064A1 publication Critical patent/EA201491064A1/ru
Publication of EA032769B1 publication Critical patent/EA032769B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В изобретении предлагается способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, с помощью которого можно добиться высокой чувствительности обнаружения и высокой специфичности в обнаружении мутации, обнаружения участка ошибочного спаривания оснований и т.д. с помощью метода ПЦР, при этом молекула нуклеиновой кислоты содержит множество флуоресцентных групп атомов, которые проявляют экситонный эффект. В изобретении также предлагается способ обнаружения последовательности-мишени с использованием зонда на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с последовательностью-мишенью, где зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой зонд, полученный указанным способом конструирования, и где последовательность-мишень имеет участок ошибочного спаривания оснований.

Description

Настоящее изобретение относится к зонду на основе нуклеиновой кислоты, способу конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты и к способу обнаружения последовательности-мишени.
Уровень техники
При анализе биологических явлений на клеточном уровне и при диагностировании заболевания на молекулярном уровне необходимо обнаружить конкретный белок или конкретную последовательность нуклеиновой кислоты, и для указанного обнаружения широко используется флуоресценция. В частности, известен способ, в котором используют флуоресцентное вещество, интенсивность флуоресценции которого возрастает в ответ на связывание с белком-мишенью и увеличение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Отдельные примеры включают флуоресцентное вещество, применяемое в методе резонансного переноса энергии Ферстера (FRET), и вещество, которое встраивается в структуру двойной спирали и дает флуоресценцию при облучении светом возбуждения.
Однако существует возможность того, что обычное флуоресцентное вещество может флуоресцировать, даже если оно не связано, например, с исследуемым веществом. Для того чтобы тушить флуоресценцию только последовательностей антитела или нуклеиновой кислоты, содержащей метку флуоресцентного вещества, эффективен способ с использованием FRET (см., в частности, непатентные документы 1-4). Тем не менее, использование FRET требует, например, введения двух типов флуоресцентных красителей и уникальной последовательности, а также точного выбора положения, с которым связан каждый из флуоресцентных красителей, что создает проблему, связанную, например, с ограничением последовательности, и увеличивает производственные расходы.
Для решения вышеуказанных проблем была предложена система обнаружения с помощью флуоресценции, в которой используется лишь один тип красителя, и одним из них является комплексное вещество-метка, особенность химической структуры которого заключается в том, что в его химической структуре имеются по меньшей мере две молекулы красителей, при этом указанные по меньшей мере две молекулы красителей не испускают флуоресцентное излучение вследствие возникновения экситонного эффекта, который наблюдается в том случае, когда красители агрегированы параллельно друг другу, однако дают флуоресцентное излучение в том случае, когда их агрегатное состояние расщепляется вследствие интеркалирования молекул в молекулу нуклеиновой кислоты или вследствие связывания молекул по бороздкам молекулы ДНК (патентный документ 1). Раскрыто использование вещества-метки подобного типа в качестве праймера или зонда (в частности, экситонного олигомера), который получают путем введения вещества-метки в олигонуклеотид, с целью, например, амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени (патентный документ 2). Следует отметить, что далее в данном описании зонд может обозначаться как экситонный зонд и Е-зонд. Указанный экситонный олигомер и т.п. позволяет осуществить переключение флуоресценции до и после гибридизации с помощью одного красителя; а поскольку он дает специфичный для последовательности люминесцентный сигнал, то в том случае, когда экситонный олигомер и т.п. используют для мониторинга реакций амплификации в режиме реального времени, можно преодолеть обычную проблему, заключающуюся в том, что неспецифическая амплификация также детектируется, если используют, например, краситель SYBR Green I. Более того, поскольку флуорофор можно ввести в dT или dC, то практически можно избежать ограничения последовательности.
Лист цитирования.
Патентные документы.
Патентный документ 1: патент Японии № 4761086.
Патентный документ 2: патент Японии № 4370385.
Непатентные документы.
Непатентный документ 1: Tyagi, S., Kramer, F.R. (1996), Nat. Biotechnol., 14, 303-308.
Непатентный документ 2: Nazarenko, I.A., Bhatnagar, S.K., Hohman, R.J. (1997), Nucleic Acids Res., 25, 2516-2521.
Непатентный документ 3: Gelmini, S., Orlando, C., Sestini, R., Vona, G., Pinzani, P., Ruocco, L., Pazzagli, M. (1997), Clin. Chem., 43, 752-758.
Непатентный документ 4: Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S.P., Brown, Т., Little, S. (1999), Nat. Biotechnol., 17, 804-807.
Сущность изобретения
Проблемы, которые должно решить настоящее изобретение
Для подтверждения, например, продукта амплификации ПЦР с использованием экситонного зонда (Е-зонда) необходимо предварительно добавить зонд (Е-зонд), который не вызывает реакцию удлинения от 3'-конца, до реагента амплификации, и провести обнаружение единичного нуклеотидного полиморфизма (SNP) или мутации(й) путем мониторинга ПЦР в режиме реального времени или построения кривой плавления после амплификации. Таким образом, необходима оптимизация, например, условий проведения реакции ПЦР и метода построения конструкции, в частности взаимного расположения меченного экситоном участка подобного зонда и участка SNP-мишени.
В случае, например, онкологического заболевания, когда мутация происходит постепенно в хроно
- 1 032769 логическом порядке по мере прогрессирования заболевания, сосуществует некоторое количество матричной ДНК нормального типа и небольшое количество ДНК мутантного типа. При обнаружении подобной мутации повышение чувствительности обнаружения достигается за счет подавления амплификации последовательностей ДНК нормального типа, которые присутствуют в большом количестве, и одновременного интенсивного усиления последовательностей ДНК мутантного типа. В одном случае для того, чтобы подавить амплификацию последовательностей ДНК нормального типа, сращенный зонд использовали отдельно от детекторного зонда. Например, в том случае, когда в качестве детекторного зонда использовали зонд TaqMan (зарегистрированный торговый знак), то в качестве сращенного зонда применяли пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), которая легко образует комплементарную цепь с ДНК. Следовательно, в указанном случае требуются зонды двух типов. Таким образом, в области амплификации необходим участок, с которым гибридизуются указанные зонды двух типов, а это естественным образом приводит к ограничению длины области амплификации и конструкции участка.
Известно, что Е-зонд сильно взаимодействует с ДНК типа PNA, поскольку краситель, введенный в Е-зонд, является катионным. Таким образом, если применение Е-зонда, который обеспечивает гибридизацию с полным совпадением нуклеотидов, для нормального типа, способствует амплификации мутанта при одновременном подавлении амплификации нормального типа в реакции амплификации и в то же время позволяет подтвердить присутствие мутанта в области ошибочного спаривания оснований при анализе кривой плавления, то указанное применение в значительной степени способствует улучшению методов обнаружения.
С учетом сказанного, объектом настоящего изобретения является способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты, который способен обеспечить высокую чувствительность и специфичность при обнаружении мутаций, при обнаружении ошибочно спаренных оснований и т.д. методом ПЦР, подобного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени.
Средства для решения проблемы
Для достижения поставленной выше цели в настоящем изобретении предлагается способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, для обнаружения последовательности-мишени, содержащей участок ошибочного спаривания оснований, где зонд на основе нуклеиновой кислоты конструируют таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты включает множество групп флуоресцентного красителя, которые проявляют экситонный эффект;
по меньшей мере две из групп флуоресцентного красителя, которые проявляют экситонный эффект, связывают с одним и тем же основанием или с двумя смежными основаниями в молекуле нуклеиновой кислоты, при этом каждая группа флуоресцентного красителя связана с помощью линкера (связывающего атома или связывающей группы атомов);
конец молекулы указанной нуклеиновой кислоты со стороны удлинения химически состоит из группы атомов, имеющей скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную из одной из них, и конец со стороны удлинения химически модифицирован путем замены атома водорода 3'концевой гидроксильной группы (ОН) в указанной группе атомов на заместитель, который не вызывает реакцию удлинения, где заместитель, которым замещен атом водорода в З'-концевой гидроксильной группе (ОН), представляет собой любой из следующих заместителей (А)-(С):
(A) заместитель, представленный следующей химической формулой (1001):
*-L1000-X ( 1001 ), где в химической формуле (1001) X означает гидроксильную группу (OH), аминогруппу (NH2) или группу, которую получают заменой по меньшей мере одного атома водорода в ней на заместитель;
L1000 представляет собой линейную или разветвленную алкиленовую группу с числом атомов углеродов от 1 до 20;
отметка * указывает на положение, в котором заместитель связан с атомом кислорода 3'-концевой гидроксильной группы (ОН);
(B) дидезоксинуклеотидная группа, которая не имеет 3'-концевую ОН (гидроксильную группу) и тем самым предотвращает реакцию удлинения, вызываемую полимеразой; и (C) диэфирная группа тиофосфорной кислоты;
зонд на основе нуклеиновой кислоты удовлетворяет следующим условиям (1) и (2), а также удовлетворяет следующим условиям (3) или (4):
(1) содержащее метку основание, к которому присоединены группы флуоресцентного красителя, проявляющие экситонный эффект, является основанием, отличным от первого основания на каждом конце зонда на основе нуклеиновой кислоты;
(2) последовательность-мишень, с которой зонд на основе нуклеиновой кислоты гибридизуется, представляет собой последовательность, которая содержит мутацию (участок ошибочного спаривания оснований), при этом участок ошибочного спаривания оснований представляет собой основание, отличное от первого и второго оснований каждого конца последовательности-мишени;
(3) содержащее метку основание находится в положении, отстоящем по меньшей мере на четыре
- 2 032769 основания от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, так что интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая имеет мутацию (участок ошибочного спаривания оснований) в последовательности-мишени, не ниже, чем интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая не имеет мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), при этом интенсивности флуоресценции пика обнаружения обеих последовательностей измеряются в одинаковых условиях; и (4) содержащее метку основание находится в положении, отстоящем на три или меньшее количество оснований от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, так что интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая имеет мутацию (участок ошибочного спаривания оснований) в последовательности-мишени, является более низкой, чем интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая не имеет мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), при этом интенсивности флуоресценции пика обнаружения обеих последовательностей измеряются в одинаковых условиях, молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну из структур, представленных сле-
где в формулах (16), (17), (16b) и (17b) В означает группу атомов, имеющую скелет природного нуклеинового основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или скелет искусственного
- 3 032769 нуклеинового основания;
Е означает:
(i) группу атомов, имеющую скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или имеющую структуру, полученную из любой из них, или (ii) группу атомов, имеющую пептидную структуру или пептоидную структуру;
каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу, полученную из любого из тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина и их производных, и они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 означает линкерную группу (связывающий атом или связывающую группу атомов), при этом длина их основной цепи (количество атомов в основной цепи) произвольна, и каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи любой из атомов С, N, О, S, Р и Si, 1 2 3 каждый из L , L и L может содержать, а может не содержать в основной цепи простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, иминогруппу, простую эфирную связь, сложную тиоэфирную связь, и L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
D означает CR, N, Р, Р=О, В или SiR, где R представляет собой атом водорода или алкильную группу с числом атомов углерода от 1 до 4; и b означает простую связь, двойную связь или тройную связь; или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 означает линкер, L3, D и b могут отсутствовать, a L1 и L2 могут быть присоединены непосредственно к В; при условии, что в формулах (16) и (17) Е означает группу атомов, описанную выше в n.(i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S;
в формулах (16b) и (17b) E означает группу атомов, описанную в п.(п); и в формулах (17) и (17b) соответствующие В могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, а соответствующие Е могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
В одном из вариантов осуществления изобретения в формулах (16), (17), (16b) и (17b) длина основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 означает целое число, равное 2 или больше.
В следующем варианте осуществления изобретения каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул (7)-(9):
где в формулах (7)-(9) X1 и X2 означают S, О или Se;
n'' означает 0 или положительное целое число;
10 13 21 заместители R -R и R -R , каждый независимо, означают атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу;
один из заместителей R11 и R12 представляет собой связывающую группу, которая соединена с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), а другой означает атом водорода или низшую алкильную группу;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R15, то они могут быть одинаковыми
- 4 032769 или отличными друг от друга;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R16, то они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга; и
X1, X2 и R1-R21 В Z11 и X1, X2 и R1-R21 в Z12 соответственно могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; 1 21 в формулах (7)-(9) в заместителях R1-R21 низшая алкильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, а низшая алкоксильная группа, представляет собой линейную или разветвленную алкоксильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, в частности;
в формулах (7)-(9) в заместителях R11 и R12 связывающая группа представляет собой полиметиленовую карбонильную группу, содержащую 2 или больше атомов углерода и присоединенную к L1 или L2 в формулах (16), (16b), (17) и (17b) во фрагменте карбонильной группы, в предпочтительном варианте осуществления изобретения каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную формулой (7) или (8); и
Z11 и Z12, представленные формулой (7) или (8), означают группу, представленную следующей формулой (19) или (20):
где в формулах (19) и (20) значения X1, R1-R10, R13 и R14 и R11 и R12 идентичны тем, которые указаны в формулах (7)-(9);
в более предпочтительном варианте осуществления каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (19), где в формуле (19) X1 означает S;
R1-R10 означают атомы водорода, а один из R11 и R12 означает связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), a другой означает метильную группу, или каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (19), 1 где в формуле (19) X1 означает S;
R1, R4, R5, R6, R7, R9 и R10 означают атомы водорода;
R2, R3 и R12 означают метильные группы;
R8 означает атом галогена и
R11 представляет собой связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b).
В следующем варианте осуществления изобретения каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (7), где в формуле (7) X1 означает S;
n равно 1;
R1-R10, R15, R16 и R17 означают атомы водорода;
R11 представляет собой связующую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b); и
R12 означает метильную группу.
- 5 032769
В еще одном варианте осуществления изобретения каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул:
где в каждой из указанных выше химических формул n означает положительное целое число, в предпочтительном варианте осуществления изобретения в формулах (16), (17), (16b) и (17b);
В представляет собой группу атомов, включающую скелет природного нуклеинового основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила), или в формулах (16), (17), (16b) и (17b);
В означает группу атомов, имеющую скелет искусственного нуклеинового основания, при этом искусственное нуклеиновое основание представляет собой 2-амино-6-(^№диметиламино)пуринпиридин2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)b] пиридин, 5-иод-2-оксо(1Н) пиридин, 2-оксо(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2тиенил)имидазо[4,5-Ь] пиридин, бромтимин, азааденин или азагуанин, или в формулах (16), (17), (16b) и (17b);
- 6 032769
В означает группу атомов, имеющую скелет искусственного нуклеинового основания, при этом искусственное нуклеиновое основание представляет собой Ру, Ру der., Pu или Pu der, где
Ру означает группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 1-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 5-положении 6-членного цикла, представленного следующей формулой (11):
(1 1)
Ру der. означает группу атомов, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного цикла Ру замещен атомом N, С, S или О,
Pu означает группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 9-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 8-положении конденсированного цикла, представленного следующей формулой (12):
6
(1 2) a Pu der. означает группу атомов, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного цикла Pu замещен атомом N, С, S или О.
В следующем варианте осуществления изобретения структура, представленная формулой (16), означает структуру, представленную следующей формулой (16-1) или (16-2), структура, представленная формулой (16b), означает структуру, представленную следующей формулой (16b-1) или (16b-2), структура, представленная формулой (17), означает структуру, представленную следующей формулой (17-1), и структура, представленная формулой (17b) означает структуру, представленную следующей формулой (17b-1):
- 7 032769
NH
(1 6 b - 1)
Η I В m H
(1 6 b - 2)
где в формулах (16-1), (16-2), (16b-1), (16b-2), (17-1) и (17b-1);
l, m и n' означают положительные целые числа, при этом l, m и n' могут быть одинаковыми или отличными друг от друга, каждый из l, m и n' может содержать или может не содержать в своей основной цепи любой из атомов С, N, О, S, Р и Si, и каждый из l, m и n' может содержать или может не содержать в основной цепи любую из простой связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, простой эфирной связи, простой тиоэфирной связи и сложной тиоэфирной связи, значения В, Е, Z11, Z12 и b идентичны тем, которые указаны в формулах (16), (16b), (17) и (17b), и в формулах (16-1), (16-2) и (17-1) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S, в предпочтительном варианте осуществления изобретения в формулах (16-1), (16-2), (16b-1), (16b-2), (17-1) и (17b-1), каждый из l, m и n' означает целое число, равное 2 или больше.
- 8 032769
В еще одном варианте осуществления способа зонд на основе нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну из структур нуклеотидов, представленных следующими химическими формулами
- 9 032769
где в химических формулах 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2 n означает положительное целое число, в предпочтительном варианте осуществления изобретения длина линкера n находится в диапазоне от 2 до 6.
- 10 032769
В еще одном варианте осуществления способа зонд на основе нуклеиновой кислоты сконструирован таким образом, что участок, составленный из содержащего метку основания, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, и два основания непосредственно выше от содержащего метку основания, и два основания непосредственно ниже от содержащего метку основания, не способны к самогибридизации с любым другим участком в зонде на основе нуклеиновой кислоты.
В следующем варианте осуществления способа зонд на основе нуклеиновой кислоты предназначен для обнаружения последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте, и в указанном способе конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты зонд на основе нуклеиновой кислоты сконструирован таким образом, что зонд на основе нуклеиновой кислоты включает последовательность, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, и последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью, и содержащее метку основание, к которому присоединены группы флуоресцентного красителя, проявляющие экситонный эффект, включено в последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью.
В настоящем изобретении предлагается также способ обнаружения последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте с использованием зонда на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с последовательностью-мишенью, где зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой зонд на основе нуклеиновой кислоты, сконструированный способом конструирования по изобретению, где последовательность-мишень имеет участок ошибочного спаривания оснований.
В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность-мишень содержит несколько участков ошибочного спаривания оснований.
В следующем варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, содержащая последовательность-мишень, представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту.
Полезность изобретения
В соответствии с настоящего изобретением можно разработать способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты, который способен обеспечить высокую чувствительность и специфичность при обнаружении мутаций, при обнаружении ошибочно спаренных оснований и т.д. методом ПЦР, а также можно разработать способ обнаружения последовательности-мишени.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой диаграмму, на которой схематически показан один пример особенности использования зонда на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонда) по настоящему изобретению.
На фиг. 2 приведены графики, поясняющие влияние на анализ кривой плавления различий в модификации З'-конца по примеру.
На фиг. 3 приведены кривые плавления (А, С) для Е-зонда и комплементарной ему последовательности и первичные дифференциальные кривые (В, D) для кривой плавления по примеру.
На фиг. 4 приведены графики, поясняющие зависимость между положением красителя и реально измеренным значением - прогнозируемым значением свободной энергии связывания по примеру.
На фиг. 5 приведены графики, поясняющие различие в анализе кривой плавления между случаями, когда местоположения красителя различны в одной и той же последовательности по примеру.
На фиг. 6 приведен график, поясняющий зависимость между расстоянием (количеством оснований) от красителя и ошибочно спаренными основаниями и высотой пика на кривой плавления по примеру.
На фиг. 7 приведены графики, поясняющие результат анализа кривой плавления для подтверждения эффекта сращивания в примере.
На фиг. 8 приведены другие графики, поясняющие результат анализа кривой плавления для подтверждения эффекта сращивания в примере.
На фиг. 9 приведен другой график, поясняющий результат анализа кривой плавления для подтверждения эффекта сращивания в примере.
На фиг. 10 приведен график, поясняющий тип классификации (идентификации) мутантной нуклеиновой кислоты с помощью Е-зонда дикого типа по примеру.
На фиг. 11 приведен график, поясняющий результат анализа кривой плавления для подтверждения обнаружения последовательности-мишени в двухцепочечной нуклеиновой кислоте с помощью Е-зонда по примеру.
На фиг. 12 представлен график, показывающий флуоресцентное излучение вследствие образования вторичной структуры в примере.
Предпочтительный вариант осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на иллюстративные примеры. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается приведенным ниже описанием.
Зонд на основе нуклеиновой кислоты.
Е-зонд представляет собой ДНК-зонд, в который введены два фрагмента флуоресцентных красителей (в частности, тиазоловый оранжевый и аналогичное ему соединение). Е-зонд обладает тем свойством, что дает слабую флуоресценцию вследствие экситонного эффекта, который достигается в том случае, когда два фрагмента флуоресцентных красителей образуют возбужденный комплекс с переносом
- 11 032769 заряда в случае одиночной цепочки, однако обладает свойством давать сильную флуоресценцию в том случае, если экситонный эффект пропадает, когда два фрагмента красителей отдаляются друг от друга при гибридизации с ДНК-мишенью. При обнаружении нуклеиновой кислоты-мишени с помощью реакции ПЦР, с целью повышения чувствительности обнаружения путем анализа кривых плавления с использованием подобного Е-зонда, необходимо преодолеть следующие проблемы.
(1) Существует возможность возникновения нежелательной реакции удлинения, возникающей от 3'конца Е-зонда, который гибридизовался с нуклеиновой кислотой-мишенью.
(2) На стабильность гибридизации и эффективность обнаружения большое влияние оказывает расположение меченного экситоном участка в Е-зонде, расположение соответствующего мутантного участка (участка с ошибочно спаренными основаниями) или взаимное расположение вышеуказанных положений.
(3) Существует ограничение для конструирования зонда, заключающееся в том, что в случае, когда в образце сосуществует не являющаяся мишенью последовательность, то для подавления амплификации не являющейся мишенью последовательности необходимо добавление агента сращивания, который гибридизуется с не являющейся мишенью последовательностью.
(4) Возможен случай, когда, в зависимости от последовательности оснований, составляющих Езонд, невозможно получить достаточный экситонный эффект.
В результате обширных исследований, проведенных с целью повысить чувствительность обнаружения ошибочного спаривания оснований с помощью Е-зонда, авторы настоящего изобретения обнаружили несколько элементов, позволяющих преодолеть различные проблемы, и, применив указанные элементы, авторы настоящего изобретения добились повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Следует отметить, что, несмотря на то, что Е probe и Eprobe являются торговыми названиями продуктов компании Kabushiki Kaisha DNAFORM (Eprobe является зарегистрированным товарным знаком), термин Е-зонд в настоящем изобретении может быть идентичен или отличен от продукта с торговым названием Е probe и Eprobe.
Для решения указанных выше проблем авторы настоящего изобретения разработали (1) способ подавления нежелательной реакции удлинения от 3'-конца Е-зонда, который гибридизовался с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, авторы настоящего изобретения также разработали (2) способ повышения стабильности гибридизации и эффективности обнаружения путем конструирования меченного экситоном участка в Е-зонде, путем расположения соответствующего мутантного участка (участка с ошибочно спаренными основаниями) или путем взаимного расположения вышеуказанных положений. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что (3) когда в образец добавляют зонд с совершенным сочетанием пар, то зонд способен выполнять две функции - сращивания и обнаружения. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что (4) когда экситонный эффект разрушается, например, в непосредственной близости от меченного экситоном основания в Е-зонде, то присутствует последовательность, способная образовывать двойную цепь в молекуле Е-зонда.
Таким образом, Е-зонд по настоящему изобретению отличается тем, что его 3'-конец химически модифицирован линкерной OH-группой. Другим аспектом настоящего изобретения является способ подавления, когда Е-зонд гибридизовался с последовательностью-мишенью, реакции удлинения от 3'-конца Е-зонда с последовательностью-мишенью в качестве матрицы. Способ отличается тем, что 3'-конец Езонда химически модифицирован линкерной ОН-группой.
Е-зонд по настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы он удовлетворял, например, следующему условию (1). В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагается, например, способ конструирования Е-зонда, который удовлетворяет условию (1).
(1) Содержащее метку основание, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, представляет собой основание, отличное от первого основания у каждого конца зонда на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонда) (основание расположено по меньшей мере на два основания внутрь от каждого конца Е-зонда), более предпочтительно представляет собой основание, отличное от первого и второго основания у каждого конца Е-зонда (основание расположено по меньшей мере на три основания внутрь от каждого конца Е-зонда), и еще более предпочтительно представляет собой основание, отличное от первого до третьего оснований у каждого конца Е-зонда (основание расположено по меньшей мере на четыре основания внутрь от каждого конца Е-зонда).
Е-зонд по настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы он, например, удовлетворял также следующему условию (2). В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагается способ конструирования Е-зонда, который удовлетворяет обоим условиям (1) и (2).
(2) Последовательность-мишень, с которой гибридизуется зонд на основе нуклеиновой кислоты, представляет собой последовательность, которая содержит мутацию (участок ошибочного спаривания оснований), и указанный участок ошибочного спаривания оснований представляет собой основание, отличное от первого и второго оснований у каждого из концов последовательности-мишени (область, с которой гибридизируется Е-зонд) (участок ошибочного спаривания оснований расположен по меньшей мере на три основания внутрь от каждого из концов последовательности-мишени), более предпочтитель
- 12 032769 но представляет собой основание, отличное от первого до третьего оснований на каждом из концов последовательности-мишени (участок ошибочного спаривания оснований расположен по меньшей мере на четыре основания внутрь от каждого из концов последовательности-мишени).
Е-зонд по настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы он, помимо условия (1) (и необязательно условия (2)), удовлетворял, например, также следующему условию (3) или следующему условию (4). В частности, если необходимо различие в обнаружении пика интенсивности между последовательностью, не содержащей мутацию в последовательности-мишени (полное совпадением нуклеотидов), и последовательностью, содержащей мутацию в последовательности-мишени (ошибочное спаривание оснований) с помощью меченого положения в Е-зонде, то Е-зонд может быть сконструирован таким образом, чтобы он удовлетворял условию (3), а когда указанное различие не требуется, то Е-зонд может быть сконструирован таким образом, чтобы он удовлетворял условию (4). В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагается, например, способ конструирования Езонда, который, помимо условия (1) (и необязательно условия (2)), удовлетворяет также условию (3) или условию (4).
(3) Содержащее метку основание располагается в положении, отстоящем по меньшей мере на четыре основания, более предпочтительно на пять оснований от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, так что нет различия в обнаружении пика интенсивности между последовательностью, не содержащей мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), и последовательностью, которая содержит мутацию в последовательности-мишени (ошибочное спаривание оснований).
(4) Содержащее метку основание располагается в положении, отстоящем на три или менее количество оснований от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, более предпочтительно располагается в положении, отстоящем на два или менее количество оснований от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, и еще более предпочтительно располагается в положении, идентичном с основанием, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований (содержащее метку основание является основанием, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований), так что имеется различие в обнаружении пика интенсивности между последовательностью, не содержащей мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), и последовательностью, которая содержит мутацию в последовательности-мишени (ошибочное спаривание оснований).
В зонде на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонде) по настоящему изобретению, например, содержащее метку основание, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, необязательно может гибридизоваться с последовательностью-мишенью. Это вызвано тем, что содержащее метку основание дает флуоресцентное излучение даже в том случае, когда оно не гибридизуется с последовательностью-мишенью. Более того, Е-зонд по настоящему изобретению представляет собой зонд на основе нуклеиновой кислоты, используемый для обнаружения последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте, и он может быть сконфигурирован таким образом, чтобы он включал последовательность, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, и последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью, а содержащее метку основание, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, включено в последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью. В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагается способ конструирования Е-зонда, который удовлетворяет указанным выше условиям. В указанной конфигурации даже для последовательности-мишени, для которой обычно трудно сконструировать подходящий зонд, обнаружение флуоресценции становится возможным с помощью разработки простой конструкции зонда путем размещения содержащего метку основания в положение, которое находится вне последовательности-мишени (положение, не включенное в последовательность, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью). Количество оснований, имеющихся между содержащим метку основанием, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, и последовательностью, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, может быть равно 0 или представлять собой положительное целое число. Количество оснований предпочтительно составляет 100 или менее, более предпочтительно равно 60 или менее, еще более предпочтительно равно 30 или менее, еще более предпочтительно равно 25 или менее, еще более предпочтительно равно 20 или менее, еще более предпочтительно равно 15 или менее, еще более предпочтительно равно 10 или менее и наиболее предпочтительно равно 5 или менее.
Несмотря на то что причина (механизм) того, почему содержащее метку основание может давать флуоресценцию даже тогда, когда оно не гибридизуется с последовательностью-мишенью, неизвестна, можно предложить, например, следующее объяснение. Вначале возникает состояние, где содержащее метку основание, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, располагается вблизи двойной цепи, образованной последовательностью-мишенью и последовательностью, которая с ней гибридизуется. В том состоянии, когда последовательность, которая образует Е-зонд, вновь складывается (поворачивается на 180°), содержащее метку основание и флуоресцентные группы атомов (красители) приближаются к двойной цепи, и флуоресцентные группы атомов входят в
- 13 032769 двойную цепь и генерируют флуоресцентное излучение.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением в способе обнаружения продукта амплификации, содержащего участок ошибочного спаривания оснований в последовательности-мишени, Е-зонд по настоящему изобретению, который полностью совпадает с последовательностью-мишенью, вводят, например, в реакцию амплификации нуклеиновой кислоты по методу ПЦР. При этом Е-зонд с полным совпадением пар нуклеотидов гибридизуется с областью-мишенью матричной последовательности и может быть достигнут эффект сращивания, подавляющий амплификацию последовательности, содержащей указанную область. В это же время, например, по отношению к матрице (матрице нуклеиновой кислоты), имеющей участок ошибочного спаривания оснований по отношению к Е-зонду, эффект сращивания не наблюдается вследствие слабой гибридизации. Тем самым облегчается, например, обнаружение последовательностей мутантного типа, которые присутствуют в небольшом количестве, за счет их обогащения путем реакции амплификации с использованием зонда дикого типа (Е-зонда с полным совпадением пар нуклеотидов). Е-зонд с полным совпадением пар нуклеотидов предпочтительно конструируют таким образом, что последовательность, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, конкурирует с последовательностью-мишенью, с которой гибридизуется Е-зонд с полным совпадением пар нуклеотидов. Поскольку сказанное приводит к тому, что в этом случае реакция удлинения от праймера либо протекает с трудом, либо вообще не наблюдается, то эффект обогащения может быть дополнительно улучшен за счет сращивания. Для того чтобы вызвать конкуренцию между последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательностью-мишенью, Е-зонд конструируют, например, таким образом, чтобы последовательность, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательность-мишень оказались близко друг от друга. В частности, Е-зонд с полным совпадением пар нуклеотидов конструируют таким образом, чтобы количество оснований в нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность-мишень, которое имеется между последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательностью-мишенью, было равно, например, 7 или менее, предпочтительно было равно 6 или менее, более предпочтительно было равно 5 или менее и, еще более предпочтительно было равно 4 или менее. Количество оснований, имеющихся между последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательностью-мишенью, может быть равно, например, 0 (т.е. последовательность-мишень может быть расположена непосредственно рядом с последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР). Кроме того, благодаря конкуренции между последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательностью-мишенью, например, может располагаться по меньшей мере одно перекрывающееся основание между последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательностью-мишенью (т.е. одно или несколько оснований последовательности-мишени может перекрываться с последовательностью, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР). Последовательность, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательность-мишень конструируют таким образом, чтобы было дуплицировано (перекрывалось) как можно больше оснований, и количество дуплицированных (перекрывающихся) оснований предпочтительно было равно 2 или более, более предпочтительно было равно 3 или более и еще более предпочтительно было равно 4 или более. Последовательность, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, и последовательность-мишень предпочтительно частично перекрываются по 5'-концу, более предпочтительно частично перекрываются по З'-концу и наиболее предпочтительно полностью перекрываются.
В соответствии с настоящим изобретением в способе обнаружения продукта амплификации, содержащего участок ошибочного спаривания оснований в последовательности-мишени, последовательностьмишень может, например, содержать несколько участков ошибочного спаривания оснований. Е-зонд по настоящему изобретению показывает Tm (температуру плавления), которая слегка изменяется в зависимости от последовательности, с которой зонд не совпадает, и использование указанного свойства позволяет идентифицировать несовпадающую последовательность-мишень. Обычно для идентификации (классификации типа) множества несовпадающих последовательностей требуется детекторные зонды, соответствующие несовпадающим последовательностям. Тем не менее, Е-зонд по настоящему изобретению способен проводить идентификацию (классификацию) множества последовательностей оснований мутантного типа с помощью Е-зонда, который имеет лишь один тип (например, дикий тип) последовательности, путем использования разницы в величине Tm.
В способе обнаружения последовательностей-мишеней по настоящему изобретению нуклеиновая кислота, содержащая последовательность-мишень, может быть двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Например, известно, что трехцепочечная нуклеиновая кислота образуется при добавлении к двухцепочечной нуклеиновой кислоте (например, ДНК или РНК) нуклеиновой кислоты, имеющей ту же самую последовательность, что и любая из цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Можно также образовать трехцепочечную нуклеиновую кислоту с Е-зондом по настоящему изобретению путем конструирования Е-зонда, который комплементарен части цепи или полной цепи любой из цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, двухцепочечной ДНК или двухцепочечной РНК), и путем гибридиза
- 14 032769 ции Е-зонда с двухцепочечной нуклеиновой кислотой Подобным образом можно обнаружить последовательность-мишень указанной двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, поскольку Е-зонд по настоящему изобретению показывает высокое значение Tm, по сравнению с нормальной одноцепочечной олигонуклеиновой кислотой, он может сильнее гибридизоваться с указанной последовательностьюмишенью. В частности, например, Е-зонд по настоящему изобретению может гибридизоваться с последовательностью-мишенью таким образом, что Е-зонд входит внутрь цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Кроме того, Е-зонд может быть сконструирован таким образом, что рекомбинация двойной цепи вызывается гибридизацией Е-зонда по настоящему изобретению с последовательностью-мишенью. В способе обнаружения последовательности-мишени по настоящему изобретению в целях повышения эффективности гибридизации путем рекомбинации, например, может быть добавлен рекомбинантный белок, такой как белок RecA, или может использоваться комбинированный способ, с целью повышения эффективности рекомбинации гомологичной последовательности. Кроме того, для регулирования эффективности гибридизации Е-зонда по настоящему изобретению с последовательностью-мишенью двухцепочечной нуклеиновой кислоты может быть добавлен любой регулятор. Например, с целью регулирования условий реакции, для большего эффекта в качестве регулятора может быть добавлен денатурирующий агент, такой как бетаин, ДМСО или т.п.
Зонд на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонд) по настоящему изобретению предпочтительно сконструирован таким образом, что любое основание, которое формирует последовательность, способную образовать двойную цепь (далее в данном описании означают как последовательность, образующая двойную цепь), в молекуле Е-зонда не содержится в области, включающей в общей сложности 5 оснований, а именно содержащее экситонную метку основание, 2 основания непосредственно в обратном направлении от содержащего экситонную метку основания и 2 основания непосредственно в прямом направлении от содержащего экситонную метку основания (далее в данном описании означают как область, соседствующая с экситонной меткой). Становится возможным предотвратить снижение чувствительности и специфичности обнаружения последовательности-мишени благодаря флуоресценции, которая испускается при самогибридизации экситонной метки (части, содержащей метку флуоресцентных групп атомов, которые проявляют экситонной эффект) с самой молекулой зонда на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонда). Следует отметить, что область, соседствующая с экситонной меткой более предпочтительно представляет собой область, состоящую в общей сложности из 7 оснований, а именно меченное экситоном основание, 3 основания непосредственно в обратном направлении от меченного экситоном основания и 3 основания непосредственно в прямом направлении от меченного экситоном основания, а еще более предпочтительно представляет собой область, состоящую в общей сложности из 9 оснований, а именно меченное экситоном основание, 4 основания непосредственно в обратном направлении от меченного экситоном основания и 4 основания непосредственно в прямом направлении от меченного экситоном основания. Последовательность, образующая двойную цепь, например, представляет собой последовательность, в которой количество оснований в одной цепи равно 7 или более, предпочтительно последовательность, в которой количество оснований в одной цепи равно 5 или более, и более предпочтительно последовательность, в которой количество оснований в одной цепи равно 3 или более. Последовательность, образующая двойную цепь, может быть палиндромной последовательностью, или между образующими двойную цепь последовательностями может содержаться любая последовательность оснований. Для предотвращения испускания неспецифической флуоресценции, вызванной образованием димера Е-зонда, как указано выше, желательно, чтобы гомология между областью, соседствующей с экситонной меткой, и комплементарной последовательностью любой области, отличной от области, соседствующей с экситонной меткой, составляла 90% или менее, предпочтительно 70% или менее, более предпочтительно 50% или менее, а еще более предпочтительно 30% или менее. Кроме того, более предпочтительно использовать Е-зонд в приведенных ниже вариантах осуществления настоящего изобретения.
Когда Е-зонд гибридизуется с последовательностью-мишенью, подавляются реакции удлинения от З'-конца Е-зонда с последовательностью-мишенью в качестве матрицы.
Его используют в реакциях, включая реакцию амплификации нуклеиновой кислоты (более предпочтительно реакции ПЦР) в присутствии полимеразы и реакции гибридизации Е-зонда с последовательностью-мишенью.
В вышеуказанных вариантах осуществления настоящего изобретения реакцию амплификации нуклеиновой кислоты (более предпочтительно реакции ПЦР) в присутствии полимеразы и реакцию гибридизации Е-зонда с последовательностью-мишенью проводят как серию реакций или проводят одновременно.
В соответствии с настоящим изобретением, например, могут быть достигнуты следующие эффекты. Тем не менее, указанные эффекты приводятся просто как иллюстративные и не ограничивают настоящее изобретение.
Во-первых, в соответствии с настоящим изобретением, используя Е-зонд в методе ПЦР можно улучшить чувствительность обнаружения участка ошибочного спаривания оснований.
Например, путем надлежащей конструкции, содержащей метку экситона положения в Е-зонде, по
- 15 032769 ложения соответствующего участка мутации (участка ошибочного спаривания оснований) или относительного взаимного расположения вышеуказанных положений можно улучшить стабильность гибридизации, эффективность обнаружения и т.п.
Более конкретно, например, точный контроль указанных условий конструирования позволяет вызывать появление или исчезновения пика ошибочного спаривания даже с той же самой последовательностью путем изменения положения меченного экситоном положения. Поскольку можно вызывать появление пика ошибочного спаривания, то можно, например, разработать последовательность зонда, который различает тип с полным совпадением нуклеотидов и тип ошибочного спаривания оснований, с помощью одного зонда. Кроме того, поскольку можно вызывать исчезновение пика ошибочного спаривания, например, даже когда сосуществует множество зондов, соответствующих подходящей последовательности-мишени, сужая пик распознавания последовательности-мишени до одного для каждой последовательности-мишени и вызывая исчезновение пика ошибочного спаривания оснований для них, то перекрывание (с другими мишенями) благодаря пику ошибочного спаривания оснований можно избежать и улучшить специфичность обнаружения пика полного совпадения нуклеотидов. Указанную функцию невозможно получить с помощью зонда, содержащего метку флуоресцентного красителя на З'-конце или 5'-конце. Кроме того, за счет добавления в реакцию амплификации зондов с полным совпадением нуклеотидов указанный зонд функционирует как совершенно новый зонд, который выполняет две функции сращивания и обнаружения, и это облегчает конструирование зонда.
Кроме того, когда Е-зонд по настоящему изобретению используют, например, в качестве детекторного зонда для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени с помощью метода ПЦР в сравнении с зондом TaqMan (зарегистрированный товарный знак), то могут быть достигнуты следующие преимущества.
В том случае, когда обнаружение проводят с реакцией удлинения при температуре приблизительно 70°C, то для зонда требуется определенная длина, чтобы он мог гибридизоваться при данной температуре, а Е-зонд функционирует, например, с длиной, равной 10 пар оснований, поскольку высока аффинность связывания с последовательностью-мишенью.
Могут быть получены данные для кривой плавления в зависимости от последовательности зонда.
Конструируя несколько зондов, каждый из которых имеет различные температуры плавления (например, каждый из которых имеет разную длину) в одной области амплификации, можно осуществить одновременное обнаружение нескольких мишеней, используя кривые плавления.
Можно осуществить обнаружение, используя кривые плавления даже в том случае, когда продукт амплификации имеет большую длину.
Даже в том случае, когда активность экзонуклеазы ослаблена, она функционирует, пока протекает реакция ПЦР.
При использовании короткого Е-зонда можно разработать детекторный зонд, который вообще не гибридизуется в процессе реакции ПЦР (например, при температуре 65°C или выше).
Используя его эффекты, Е-зонд по настоящему изобретение можно, например, применять в следующих приложениях (А)-(Э).
Однако указанные эффекты и приложения приведены в основном как иллюстративные, и они ни в коем случае не ограничивают настоящее изобретение.
(А) Выделение, обнаружение и т. п. нуклеиновой кислоты Е-зонд по настоящему изобретению может быть использован для выделения, обнаружения и т. п. нуклеиновой кислоты, как указано ниже, например, за счет использования эффектов, которые достигаются благодаря высокой величине его Tm (сильная гибридизация с последовательностью-мишенью). Как известно из области техники, выделение нуклеиновой кислоты-мишени из образца, очистка, концентрирование и т. п. требует проведения сложных операций, при этом возникают различные проблемы, связанные, например, с удалением нежелательных веществ при промывке. В настоящем изобретении нуклеиновую кислоту-мишень выделяют за счет специфической гибридизации Е-зонда по настоящему изобретению с нуклеиновой кислотоймишенью, которую высвобождают из образца, не подвергаемого обработке, или гибридизации с образцом, содержащим нуклеиновую кислоту-мишень после денатурации под действием тепла, кислоты или щелочи или при смешивании с моющим средством и т.п. Сказанное позволяет эффективно выделить или обнаружить нуклеиновую кислоту-мишень, используя то преимущество Е-зонда по настоящему изобретению, что его гибридизация с последовательностью-мишенью из нуклеиновой кислоты-мишени является сильной, по сравнению с гибридизацией с обычными олигонуклеотидами. В частности, из области техники известен, например, способ выделения или обнаружения окончания полиаделиновой кислоты в экспрессированной мРНК путем гибридизации с олигооснованием политимидиновой кислоты. В указанном способе, если вместо обычно применяемого олигооснования политимидиновой кислоты используют Е-зонд по настоящему изобретению, то скорость выделения или обнаружения возрастает, а эффективность выхода и т.п. увеличивается. Е-зонд по настоящему изобретению имеет большую величину Tm, например, даже тогда, когда количество оснований (длина цепи) мало. Таким образом, можно эффективно осуществить выделение даже в том случае, когда нуклеиновая кислота и т. п., содержащая окончание полиаделиновой кислоты, слишком коротка, чтобы ее можно было, например, выделить или обнаружить известными из области техники обычными методами, или когда нуклеиновая кислота имеет более корот
- 16 032769 кую область-мишень.
(B) Прямое обнаружение с помощью Е-зонда.
Обычно культуру (например, селективную культуру с использованием фармацевтических композиций) и т.п. используют для обнаружения грибов в образцах, полученных из продовольственных продуктов, из экологических образцов, клинических образцов и т.д., или используют для идентификации свойств образца, таких как лекарственная устойчивость и т.п. Однако в традиционном способе трудоемкая культура, требующая для своего приготовления от нескольких часов до нескольких дней или более чем несколько недель, приводит к связанному с затратами времени тестированию, а потому возникают, например, проблемы, связанные с задержкой диагностики лечения, и проблемы, связанные с распределением и сохранением свежести продуктов питания и т.п. В настоящем изобретении обнаружение нуклеиновой кислоты-мишени за счет взаимодействия Е-зонда по настоящему изобретению с образцом осуществляют таким образом, что происходит гибридизация с конкретной областью, и измерение сигнала флуоресценции позволяет провести быстрое обнаружение (тестирование). Кроме того, например, сочетание высокочувствительного устройства обнаружения флуоресценции, регулирования температуры реакции, условий в реакционном растворе, условий считывания флуоресценции и т. п. позволяет провести более точное обнаружение. Кроме того, для дальнейшего повышения чувствительности обнаружения, обнаружение с помощью Е-зонда по настоящему изобретению может быть проведено, например, после амплификации области-мишени (последовательности-мишени) методом ПЦР или после получения определенных культур грибов, вирусов, клеток и т. д. обычными методами культивирования. В частности, в том случае, когда тип классификации (идентификации) грибов, вирусов, клеток и т. д. затруднен (например, в случае идентификации устойчивых к лекарствам грибов или в том случае, когда свойства грибов, вирусов, клеток и т. п. различаются в зависимости от разницы в несколько оснований в последовательности оснований), то можно провести измерение и простое тестирование аналогичным образом за счет эффективной идентификации области нуклеиновой кислоты-мишени, используя Е-зонд по настоящему изобретению.
(C) Метод обнаружения путем амплификации с использованием Е-зонда, который не ингибирует амплификацию нуклеиновой кислоты.
Известны обычные методы обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени, в которых зонд, например зонд TaqMan, вырождается в процессе амплификации, а потому генерирует сигнал. Тем не менее, в указанных методах, поскольку нуклеиновые кислоты, отличные от праймера, связываются с матрицей, которая должна быть удлинена, то возможно ингибирование амплификации вызываемой праймером реакции удлинения (препятствующее реакции удлинения), что может привести к снижению эффективности амплификации. Снижение эффективности амплификации может вызвать, например, снижение минимальной чувствительность обнаружения, снижение воспроизводимости обнаружения при низком числе копий и уменьшение точности количественного анализа. Напротив, Е-зонд по настоящему изобретению способен обнаруживать последовательность-мишень только путем гибридизации с последовательностью-мишенью, а потому не требуется, чтобы зонд вырождался, как в случае зонда TaqMan. Таким образом, при амплификации нуклеиновой кислоты с помощью ПЦР и т.п., путем регулирования длины, условий реакции и т. п. Е-зонда по настоящему изобретению, можно провести регулирование таким образом, чтобы не вызвать снижение эффективности амплификации.
(D) Идентификация последовательности или последовательности, в которой много полиморфизмов (например, SNP).
Поскольку Е-зонд по настоящему изобретению имеет большие значения Tm по сравнению с обычным HybProbe oligo (олигонуклеотидом, который служит зондом для обнаружения последовательностимишени с помощью гибридизации), то зонд можно сконструировать более коротким, чем обычный HybProbe oligo. Как и в случае, например, с HLA, когда множество полиморфизмов последовательно возникает в соседних областях, возможен случай, когда вблизи SPN, который распознается зондом одного типа, присутствует другой SPN. В этом случае точная идентификация лишь одной SPN-мишени не может быть осуществлена обычным зондом. С другой стороны, Е-зонд по настоящему изобретению, имеющий большие значения Tm, позволяет в строгих условиях осуществить гибридизацию даже в том случае, если он короток, и провести точное обнаружение лишь SPN-мишени.
В соответствии с другим аспектом использование зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению позволяет добиться, например, следующих эффектов (1)-(13). Тем не менее, указанные ниже эффекты (1)-(13) также приведены лишь в иллюстративных целях, и ни в коем случае не ограничивают настоящее изобретение.
(1) Высокая специфичность для последовательности оснований.
(2) Высокая чувствительность, поскольку фоновый шум низок.
(3) Поскольку 3'-конец модифицирован с помощью 3'-SpacerC3 и реакция удлинения не возникает, то он позволяет осуществить высокоспецифичную реакцию в качестве зонда ПЦР.
(4) Поскольку Е-зонд стабилизирует образование димеров ДНК, то можно сконструировать короткий зонд.
(5) Способ с использованием Е-зонда не требует активности экзонуклеазы и его можно использо- 17 032769 вать с ферментом, не обладающим активностью экзонуклеазы.
(6) Даже если в образце произошла фрагментация нуклеиновой кислоты, она не приводит к ложным результатам.
(7) Количественный анализ и точность определения концентрации образца высоки.
(8) Детектирование по методу ПЦР в режиме реального времени и анализ кривой плавления можно провести в одной пробирке.
(9) Благодаря высокому сродству, можно надежно установить разницу между анализами кривой плавления (например, разницу между диким типом и мутантным типом).
(10) С помощью различных значения Tm и различных флуоресцентных красителей множество объектов можно обнаруживать одновременно путем конструирования множества Е-зондов.
(11) Можно осуществить высокочувствительный и высокоспецифичный анализ SNP.
(12) Поскольку можно сконструировать короткий зонд, то на него практически не влияет соседняя область, отличная от области-мишени.
(13) Он также функционирует в ПЦР как сращенный зонд и позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать мутации.
Зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть использован, например, следующим образом. Следует однако отметить, что данное описание также является иллюстративным и не ограничивает настоящее изобретение. Так, если экситонный зонд (Е-зонд), который представляет собой зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, иммобилизован, например, на иммуночипе, то нет необходимости помечать измеряемый образец, такой как РНК, ДНК и т.п. (нуклеиновая кислота, содержащая последовательность-мишень) и обнаружение можно провести непосредственно на иммуночипе. В отличие от системы измерения в жидкой фазе, подобная измерительная система позволяет провести измерение множества образцов на одном иммуночипе, провести измерение различных участков в одном гене или одновременное измерение нескольких генов за счет изменения длины волны красителей во многих образцах. При этом при проведении каждой реакции можно поместить внутренний контроль, так что соблюдаются важные условия для набора реагентов, применяемого для проведения клинических испытаний. В частности, микропанель, использующая экситонный зонд (Езонд), позволяет провести обнаружение гибридизации без необходимости размещения флуоресцентной метки для детектируемой мишени, такой как продукт амплификации ПЦР. Кроме того, на микропанель после того, как ее промывают от предыдущего образца, можно поместить другой образец. Это создает дополнительные преимущества, связанные с повторным использованием микропанели без необходимости применения специальной маркировки или цветной реакции. Кроме того, с точки зрения современных требований охраны окружающей среды, спрос на многоразовые микропанели с использованием экситонного зонда (Е-зонда) весьма велик.
На фиг. 1 схематично показан один пример особенности использования зонда на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонда) по настоящему изобретению. Как видно из фиг. 1, наличие или отсутствие представляющего интерес продукта или наличие или отсутствие мутации можно определить путем гибридизации Е-зонда с анализируемым образцом, иммобилизованным на твердофазной микропанели, и обнаружить флуоресцентный сигнал. Кроме того, после промывки микропанели подобное обнаружение можно осуществить, используя ту же самую микропанель, так что указанная микропанель может быть такой микропанелью, которую можно использовать повторно без необходимости модифицирования образца и без необходимости проведения специальной колориметрической ферментативной реакции после гибридизации.
Следует отметить, что в данном описании экситонный эффект (экситонное взаимодействие) представляет собой эффект, при котором, например, несколько красителей агрегируются параллельно с образованием Н-агрегата и тем самым практически не дают флуоресцентного излучения. Предположительно указанный эффект возникает следующим образом. Как полагают, возбужденное состояние красителя приводит к расщеплению на два энергетических уровня за счет Давыдовского расщепления, затем происходит возбуждение до более высокого энергетического уровня с последующей внутренней конверсией на низкий энергетический уровень, при этом эмиссия термодинамически запрещена. Тем не менее, приведенное описание никоим образом не ограничивает настоящее изобретение. Возможные случаи возникновения экситонного эффекта могут быть подтверждены появлением полосы поглощения красителя, образовавшего Н-агрегат, с более короткой длиной волны, по сравнению с полосой поглощения одиночного красителя. Примеры красителей, которые проявляют подобный эффект, включают тиазоловый оранжевый и его производные, оксазоловый желтый и его производные, цианин и его производные, гемицианин и его производные и метиловый красный и его производные, а также группу красителей, которые обычно называют цианиновыми красителями и азокрасителями. В соответствии с экситонным эффектом, например, в том случае, когда флуоресцентный краситель по настоящему изобретению связывается с нуклеиновой кислотой, интенсивность флуоресценции в одноцепочечном состоянии подавляется, позволяя тем самым более эффективно обнаружить структуру с двойной спиралью.
В зонде на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонде) по настоящему изобретению флуоресцентными группами атомов, которые проявляют экситонный эффект, являются любые из следующих:
- 18 032769 (i) флуоресцентная группа атомов, которая дает флуоресценцию, с двумя планарными химическими структурами, содержащимися в одной молекуле, которые не существуют в одной плоскости, а образуют между собой определенный угол, при этом они располагаются таким образом, что оказываются в одной плоскости, когда молекула интеркалирует в нуклеиновую кислоту или связывается по бороздкам молекулы нуклеиновой кислоты, (ii) флуоресцентная группа атомов, образованная по меньшей мере двумя группами молекул красителей, которые не дают флуоресцентный свет вследствие экситонного эффекта, возникающего в том случае, когда по меньшей мере две молекулы красителей агрегируются параллельно друг другу, однако дают флуоресцентный свет, если агрегированное состояние вырождается, когда молекулы интеркалирует в молекулу-мишень или связываются по бороздкам с молекулой-мишенью, в частности с нуклеиновой кислотой, (iii) флуоресцентная группа атомов, отличающаяся тем, что она имеет химическую структуру, содержащую по меньшей мере две молекулы красителей в одной молекуле, при этом по меньшей мере две молекулы красителей не дают флуоресцентный свет вследствие экситонного эффекта, возникающего в том случае, когда они агрегируются параллельно друг другу, однако дают флуоресцентный свет, если агрегированное состояние вырождается, когда молекулы интеркалируют в молекулу-мишень или связываются по бороздкам с молекулой-мишенью, в частности с нуклеиновой кислотой. В случае (ii) или (iii) молекула красителя предпочтительно представляет собой молекулу, описанную в п.(|).
Как указано выше, в зонде на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонде) по настоящему изобретению конец молекулы указанной молекулы нуклеиновой кислоты химически модифицирован, чем предотвращается реакция удлинения молекулы нуклеиновой кислоты. Например, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть сконфигурирован таким образом, чтобы конец молекулы указанной молекулы нуклеиновой кислоты был образован группой атомов, имеющей скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или имеющей структуру, полученную из любой из них, а конец молекулы указанной молекулы нуклеиновой кислоты был модифицирован путем замены на заместитель атома водорода в гидроксильной группе (ОН), расположенной на З'-конце группы атомов.
Заместители, которыми может быть замещен атом водорода в 3'-концевой гидроксильной группе (ОН), специально не ограничиваются и предпочтительно являются любыми из следующих заместителей (А)-(С):
(A) заместитель, представленный следующей химической формулой (1001):
*-L1000-X ( 1001 ), где X означает гидроксильную группу (ОН), аминогруппу (NH2) или группу, которую получают заменой в ней по меньшей мере одного атома водорода на заместитель;
L1000 представляет собой линкерную группу атомов, отметка * указывает на положение, в котором заместитель связан с атомом водорода 3'-концевой гидроксильной группы (ОН);
(B) дидезоксинуклеотидная группа, которая не имеет 3'-концевую ОН (гидроксильную группу) и тем самым предотвращает реакцию удлинения, вызываемую полимеразой; и (C) диэфирная группа тиофосфорной кислоты.
В химической формуле (1001) L1000 предпочтительно означает алифатическую углеводородную группу или ароматическую углеводородную группу. Алифатическая углеводородная группа может быть линейной, разветвленной или циклической и, например, часть ее может быть линейной или разветвленной, в то время как другая ее часть может быть циклической. Алифатический углеводород может быть насыщенным или ненасыщенным. Алифатическая углеводородная группа может представлять собой алифатическую углеводородную группу, которая дополнительно замещена ароматической углеводородной группой (например, фенилметильной группой = бензильной группой). Ароматическая углеводородная группа может быть, например, группой, которая дополнительно замещена алифатической углеводородной группой (например, метилфенильной группой = толильной группой). Общее количество атомов углерода алифатической углеводородной группы и ароматической углеводородной группы специально не ограничивается и составляет, например, от 1 до 100. Кроме того, заместитель X специально не ограничивается, и его примеры включают носители, такие как носитель GPG и носитель на основе стирольного полимера.
В химической формуле (1001) L1000 предпочтительно представляет собой линейную или разветвленную алкиленовую группу. Длина линейной или разветвленной алкиленовой группы обозначена количеством атомов углерода в ней, специально не ограничивается и составляет, например, от 1 до 100.
В зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению структура молекулы нуклеиновой кислоты не ограничивается группой атомов, имеющей скелет дезоксирибозы, рибозы или имеющей структуру, образованную одной из них, и может быть использован любой скелет. Например, как описано ниже, может использоваться PNA и т.п. Например, в случае использования PNA, поскольку реакция удлинения под действием полимеразы маловероятна, ее можно использовать в качестве зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению без какой-либо химической модификации концевой части.
- 19 032769
Структура молекулы нуклеиновой кислоты.
В зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению молекула нуклеиновой кислоты может иметь структуру, которая раскрыта, например, в патенте Японии № 4370385, или иметь структуру, которая, например, описана ниже.
В зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению структура молекулы нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, содержащую метку нуклеиновую кислоту, которая включает по меньшей мере одну структуру, представленную следующими формулами (16), (16b), (17), (17b) или (18) и (18b). В настоящем изобретении содержащая метку нуклеиновая кислота охватывает также таутомеры и стереоизомеры указанных структур, а также соли указанных структур, таутомеров и стереоизомеров. Далее в данном описании каждая из структур, представленных приведенными ниже соответствующими формулами и имеющих группы атомов Z11 и Z12, которые способны испускать флуоресценцию, может быть обозначена как меченая структура. Содержащую метку нуклеиновую кислоту, включающую меченую структуру, можно обозначить как меченый зонд.
В настоящем изобретении термин последовательность-мишень нуклеиновой кислоты относится не только к последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована, но и охватывает комплементарную ей последовательность.
- 20 032769
В формулах (16), (16b), (17), (17b), (18) и (18b) В означает группу атомов, имеющую скелет натурального нуклеинового основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или скелет искусственного нуклеинового основания,
Е означает:
(i) группу атомов, имеющую скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную из любой из них, или (ii) группу атомов, имеющую пептидную структуру или пептоидную структуру;
каждый из Z11 и Z12 означает группу атомов, которая дает флуоресцентный свет, и они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 означает линкерную группу (связывающий атом или связывающую группу атомов), при этом длина их основной цепи (количество атомов в основной цепи) произвольна, и каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи любой из атомов С, N, О, S, Р и Si;
каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, иминогруппу, простую эфирную связь, простую тиоэфирную связь, сложную тиоэфирную связь, и L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными;
D означает CR, N, Р, Р^, В или SiR, где R представляет собой атом водорода, алкильную группу или произвольный заместитель; и b означает простую связь, двойную связь или тройную связь, или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 означает линкерную группу, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть присоединены непосредственно к В, при условии, что в формулах (16), (17) и (18) Е означает группу атомов, описанную выше в (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S;
в формулах (16b), (17b) и (18b) E означает группу атомов, описанную выше в п.(п); и в формулах (17) и (17b) соответствующие В могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, а соответствующие Е могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
В формулах (16), (17), (16b), (17b), (18) и (18b) длина основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 преимущественно равна целому числу 2 или более. Верхний предел специально не ограничивается и составляет, например, 100 или менее, более предпочтительно 30 или менее и наиболее предпочтительно 10 или менее.
Z11 и Z12 представляют собой группы атомов, которые проявляют экситонный эффект. Для данной конфигурации значительное усиление флуоресценции наблюдается в том случае, когда образуется, например, структура с двойной спиралью. Это позволяет обнаружить структуру с двойной спиралью с еще большей эффективностью.
Z11 и Z12 специально не ограничиваются, при условии, что они представляют собой флуоресцентные группы атомов, которые проявляют экситонный эффект. Более конкретно, каждый из Z11 и Z12, например, независимо означает группу, полученную из любого из тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей и их производных. Кроме того, в случае необходимости, может быть также использована группа, полученная из любого другого известного красителя. Известны многие флуоресцентные красители, которые изменяют интенсивность флуоресценции при связывании с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК. В типичном примере было показано, что бромид этидия дает интенсивную флуоресценцию при интеркалировании в структуру двойной спирали ДНК, и его часто используют для обнаружения ДНК. Кроме того, из
- 21 032769 вестны также флуоресцентные красители, такие как пиренкарбоксиамид и продан, интенсивность флуоресценции которых можно контролировать за счет микроскопической полярности. Тиазоловый оранжевый является флуоресцентным красителем с бензотиазольным циклом и хинолиновым циклом, которые связаны друг с другом метиновой группой. Он обычно обладает слабой флуоресценцией, но дает сильное флуоресцентное излучение при интеркалировании в ДНК, имеющую структуру с двойной спиралью. Другие примеры включают такие красители, как флуоресцеин и Cy3.
Более предпочтительно каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул (7)-(9):
В формулах (7)-(9) X1 и X2 означают S, Se или О; n'' означает 0 или положительное целое число;
10 13 21 заместители R -R и R -R , каждый независимо, означают атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу;
один из заместителей R11 и R12 представляет собой связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b), (17b), (18) и (18b), а другой означает атом водорода или низшую алкиль ную группу;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R15, то они могут быть одинаковыми или различными;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R16, то они могут быть одинаковыми или различными; и
X1, X2 и R1-R21 В Z11 и X1, X2 и R1-R21 в Z12 соответственно могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
Более предпочтительно в формулах (7)-(9) в заместителях R1-R21 низшая алкильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, а низшая алкоксильная группа, представляет собой линейную или разветвленную алкоксильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода.
Более предпочтительно в формулах (7)-(9) в заместителях R11 и R12 линкерная группа представляет собой полиметиленкарбонильную группу, содержащую по меньшей мере 2 атома углерода и присоединенную к L1 или L2 в формулах (16), (16b), (17), (17b), (18) и (18b) во фрагменте карбонильной группы. Верхний предел числа атомов углерода полиметиленкарбонильная группы специально не ограничивается, и число атомов углерода составляет, например, 100 или менее, предпочтительно 50 или менее, более предпочтительно 30 или менее и наиболее предпочтительно 10 или менее.
Когда каждый из Z11 и Z12 представлен любой из формул (7)-(9), то более предпочтительно они не- 22 032769 зависимо означают, например, группу, представленную следующими формулами (19) или (20):
В формулах (19) и (20) X1 означает -S- или -О-. Каждый из заместителей R1-R10 и R13 и R14 независимо означает атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу. Один из R11 и R12 означает линкерную группу, которая соединена с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b), (17b), (18) и (18b), а другой означает атом водорода или низшую алкильную группу.
Наиболее предпочтительно каждый из Z11 и Z12 означает группу атомов, представленную любой из следующих химических формул.
- 23 032769
В каждой из вышеуказанных химических формул наиболее предпочтительно n означает целое положительное число и принимает значение в диапазоне от 2 до 6.
В формулах (16), (17), (16b), (17b), (18) и (18b) В может иметь скелет натурального нуклеинового основания и, как указано выше, может иметь скелет синтетического нуклеинового основания. Например, В предпочтительно имеет структуру, представленную группами Ру (пиримидиновый цикл), Ру der., Pu (пуриновый цикл) или Pu der. Ру представляет собой группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 1-положении и ковалентную связь со связующим фрагментом в 5-положении 6-членного цикла, представленного ниже формулой (11). Ру der. представляет собой группу атомов, в которой по меньшей мере один из атомов 6-членного цикла в Ру замещен атомом N, С, S или О, при этом атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель. Pu представляет собой группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 9-положении и ковалентную связь со связующим фрагментом в 8-положении конденсированного цикла, представленного ниже формулой (12). Pu der. представляет собой группу атомов, в которой по меньшей мере один из атомов 5-членного цикла в Pu замещен атомом N, С, S или О, при этом атом N, С, S или О необязательно имеет электрический заряд, атом водорода или заместитель.
Молекула нуклеиновой кислоты в зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может включать по меньшей мере одну из структур нуклеотидов, представленных следующими химическими формулами 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и стереоизомерами и их солями.
- 24 032769
- 25 032769
В химических формулах 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2 длина связывающей группы n равна положительному целому числу и принимает значение в диапазоне от 2 до 6.
Количество содержащих метку структур, которые включены в зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, специально не ограничивается и составляет, например, от 1 до приблизительно 100, предпочтительно от 1 до приблизительно 20. Кроме того, в содержащем метку зонде участок, в который включена содержащая метку структура, также специально не ограничивается.
В зонде на основе нуклеиновой кислоты (содержащей метку нуклеиновой кислоте) по настоящему изобретению основной скелет каждой нуклеиновой кислоты специально не ограничивается. Его примеры включают олигонуклеотиды, модифицированные олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, модифицированные олигонуклеозиды, полинуклеотиды, модифицированные полинуклеотиды, полинуклеозиды, модифицированные полинуклеозиды, ДНК, модифицированные ДНК, РНК, модифицированные РНК, LNA, PNA (пептидные нуклеиновые кислоты), их химерные молекулы и другие структуры. Кроме того, основной скелет каждой нуклеиновой кислоты может быть натуральным или искусственно синтезированным. В случае зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению нуклеиновая кислота специально не ограничивается, при условии, что она способна, например, поддерживать образование пар оснований. В случае образца нуклеиновой кислоты или последовательности-мишени нуклеиновой кислоты нуклеиновая кислота специально не ограничивается, при условии, что она служит матрицей для синтеза
- 26 032769 комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота может представлять собой производное соединение нуклеотида, которое частично или полностью образовано, например, искусственной структурой. Примеры искусственных оснований, которые составляют нуклеиновую кислоту, включают, однако этим не ограничиваясь, 2-амино-6-(Ы,М-диметиламино)пуринпиридин-2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)-Ь]пиридин, 5-иод-2оксо(1Н)пиридин, 2-оксо(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин и 7-(2-тиенил)имидазо[4,5Ь]пиридин. В зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению основной скелет преимущественно представляет собой олигонуклеотид, полинуклеотид, ДНК или их модифицированные продукты. В настоящем изобретении нуклеотидом может быть, например, либо дезоксинуклеотид, либо рибонуклеотид, а каждый из олигонуклеотида и полинуклеотида может состоять либо из дезоксинуклеотида, либо из рибонуклеотида или может включать и дезоксинуклеотид, и рибонуклеотид. В настоящем изобретении количество оснований, которые составляют нуклеиновую кислоту, специально не ограничивается. В общем случае термин нуклеиновая кислота является синонимом термина полинуклеотид. В общем случае термин олигонуклеотид используют в качестве термина, обозначающего полинуклеотид, который составлен из конкретного небольшого количества оснований. В общем случае полинуклеотид, например, содержащий от 2 до 100 оснований, а в более общем случае, содержащий от 2 до 50 оснований, называют олигонуклеотидом, однако он не ограничивается указанными числовыми значениями. Следует понимать, что в настоящем изобретении термин полинуклеотид также охватывает, например, термины полинуклеотид и олигонуклеотид, а также искусственно синтезированные нуклеиновые кислоты, такие как пептидная нуклеиновая кислота, морфолинонуклеиновая кислот, метилфосфонатная нуклеиновая кислота и S-олигонуклеиновая кислота.
В общем случае пептидная нуклеиновая кислота (PNA) имеет структуру, в которой основная цепь дезоксирибозы олигонуклеотида замещена основной цепью пептида. Примеры основной цепи пептида включают повторяющееся звено №(2-аминоэтил)глицина, присоединенного амидной связью. Примеры оснований, которые должны связываться с основной пептидной цепью PNA, включают, однако этим не ограничиваясь, натуральные основания, такие как тимин, цитозин, аденин, гуанин, инозин, урацил, 5метилцитозин тиоурацил и 2, 6-диаминопурин; и искусственные основания, такие как бромтимин, азааденин и азагуанин.
В общем случае LNA представляет собой нуклеиновую кислоту, включающую две кольцевые структуры, в которых в скелете остатка сахара, этерифицированного фосфорной кислотой, атом кислорода во 2'-положении и атом углерода в 4'-положении рибозы связаны друг с другом с помощью метиленового мостика. В том случае, когда содержащийся в LNA олигонуклеотид соединяется с комплементарной цепью с образованием ДНК, конформация двойной спирали изменяется, при этом термическая стабильность возрастает. LNA обладает большим сродством связывания с нуклеиновой кислотой, чем обычный олигонуклеотид. Таким образом, в зависимости от условий конструирования олигонуклеотида может быть достигнута более сильная гибридизация.
Зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает по меньшей мере одну содержащую метку структуру с вышеуказанными флуоресцентными группами атомов. Благодаря подобной конфигурации, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению обладает большей специфичностью по отношению к мишени и сильнее гибридизуется с мишенью, по сравнению, например, с не содержащей метку нуклеиновой кислотой, которая не содержит флуоресцентные группы атомов. Так, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет более высокую температуру плавления (величину Tm), чем не содержащая метку нуклеиновая кислота, которая имеет базовый скелет с той же самой последовательностью оснований и ту же самую длину фрагментов нуклеиновой кислоты. Таким образом, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению способен гибридизоваться с мишенью прочнее, чем не содержащая метку нуклеиновая кислота. Следовательно, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению позволяет, например, провести эффективное обнаружение с высокой специфичностью.
Поскольку зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также обладает вышеуказанными свойствами, то его можно применять в качестве способа улучшения специфичности амплификации путем повышения величины Tm, аналогично, например, обычным PNA или LNA. Более того, когда PNA или LNA используют для основного скелета зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, то значение Tm можно дополнительно повысить, по сравнению с не содержащей метку PNA или LNA, так что эффективность гибридизации можно дополнительно увеличить. В частности, когда необходимо различить мутацию одного из нескольких оснований или когда необходимо обнаружить вставку или делецию, как будет указано ниже, применение несущей метку нуклеиновой кислоты (включая, например, несущую метку PNA или несущую метку LNA) позволяет провести это эффективно и с высокой специфичностью. В том случае, когда применяют зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, то большая разница в величине Tm и разница в эффективности гибридизации наблюдается между случаем, когда зонд полностью совпадает или полностью не совпадает с последовательностью-мишенью. Таким образом, можно легко провести обнаружение мутации, такое как различение одного основания. Кроме того, поскольку имеющий метку зонд по настоящему изобретению имеет
- 27 032769 большую величину Tm, по сравнению с не содержащей метку нуклеиновой кислотой, то его можно применять, например, в методе сращивания ПЦР, методе сращивания ПЦР PNA, методе сращивания ПЦР LNA и методе сращивания ПЦР PNA-LNA, где он сильнее связывается со специфической областью, маскирует область и не служит в качестве матрицы для амплификации.
Количество оснований, содержащихся в зонде на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, специально не ограничивается, и оно может составлять, например, от приблизительно 3 до приблизительно 100, предпочтительно от 6 до 50 и более предпочтительно от 6 до 25.
Последовательность зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению специально не ограничивается, и она может быть выбрана соответствующим образом, например, в зависимости от амплифицируемой последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, от информации о последовательности, находящейся рядом с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, например, в ДНК или РНК и от типа реакции амплификации нуклеиновой кислоты (метода амплификации нуклеиновой кислоты), в которой используют зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Последовательность зонда на основе нуклеиновой кислоты может быть установлена обычным известным способом. Как правило, последовательность зонда на основе нуклеиновой кислоты можно конструировать таким образом, что последовательность-мишень нуклеиновой кислоты в нуклеиновой кислоте, такой как ДНК или РНК, гибридизуется с нуклеиновой кислотой в строгих условиях, так что последовательность-мишень нуклеиновой кислоты содержится в продукте амплификации. Строгие условия можно установить в зависимости, например, от температуры плавления Tm (°C) двойной цепи, образованной зондом на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и комплементарной ему цепью, и концентрации соли в растворе, где проводится гибридизация. Конкретные примеры можно найти в такой ссылке, как J. Sambrook, E.F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Например, когда гибридизацию проводят при температуре несколько ниже температуры плавления зонда на основе нуклеиновой кислоты, то зонд на основе нуклеиновой кислоты способен специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты-мишени. Указанный выше зонд на основе нуклеиновой кислоты может быть сконструирован с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для конструирования праймеров, такого как, например, Primer 3 (разработчик Whitehead Institute for Biomedical Research).
Исходные вещества для зонда на основе нуклеиновой кислоты.
Исходные вещества для зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению специально не ограничиваются и могут представлять собой, например, соединение, нуклеиновую кислоту или вещество-маркер, которое будет рассмотрено выше.
Соединение представляет собой соединение, имеющее структуру, полученную из мононуклеозида или мононуклеотида, и структура представляет собой соединение, обозначенное формулами (1), (1b) или (1с), его таутомер или стереоизомер, или его соль.
В формулах (1), (1b) и (1с) В означает группу атомов, имеющую скелет натурального нуклеинового основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил) или скелет искусственного нуклеинового основания;
Е означает:
(i) группу атомов, имеющую скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную из любой из них, или (ii) группу атомов, имеющую пептидную структуру или пептоидную структуру;
каждый из Z и Z означает атом водорода, защитную группу или группу атомов, которая дает флуоресцентный свет, и они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
Q означает О, когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(Ц, или NH, когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(п);
X означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы, которую можно удалить с помощью кислоты, фосфатную группу (монофосфатную группу), дифосфатную группу или трифосфатную группу, когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(Ц, или атом водорода, защитную группу аминогруппы, когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(п);
Y означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы или фосфорамидитную группу,
- 28 032769 когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(1), или атом водорода или защитную группу, когда Е представляет собой группу атомов, указанную в п.(и);
каждый из L1, L2 и L3 означает линкер (связывающий атом или связывающую группу атомов), при этом длина их основной цепи (количество атомов в основной цепи) произвольна, и каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать любой из атомов С, N, О, S, Р и Si в основной цепи, каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи ординарную связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, иминогруппу, простую эфирную связь, сложную тиоэфирную связь и L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными;
D означает CR, N, Р, Р=С, В или SiR, где R представляет собой атом водорода, алкильную группу или произвольный заместитель; и b означает простую связь, двойную связь или тройную связь;
или, альтернативно, в формуле (1) каждый из L1 и L2 означает линкерную группу, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть присоединены непосредственно к В; и в формуле (1b) Т означает связывающую группу фосфорной кислоты (PO4-), в которой по меньшей мере один атом кислорода (О) может быть замещен атомом серы (S), когда Е означает группу атомов, указанную в п.Д), или NH, когда Е означает группу атомов, указанную в п.(и).
В формулах (1), (1b) и (1c) E предпочтительно означает группу атомов, имеющую основную структуру цепи, например ДНК, модифицированной ДНК, РНК, модифицированной РНК, LNA или PNA (пептидной нуклеиновой кислоты).
В формулах (1) и (1с) предпочтительно группа атомов, представленная формулой —в
означает группу атомов, представленную любой из следующих формул (2)-(4):
а в формуле (1b) предпочтительно группа атомов, представленная формулой
- 29 032769
В формулах (2)-(4) и (2b)-(4b) А означает атом водорода, гидроксильную группу, алкильную группу, алкоксильную группу или электроноакцепторную группу;
М и J, каждый, означают СН2, NH, О или S и они могут быть одинаковыми или различаться друг от друга, значения В, X и Y совпадают с соответствующими значениями, приведенными в формулах (1), (1b) или (1с); и в формулах (2), (3), (2b) и (3b) по меньшей мере один атом О, содержащийся в связывающей группе фосфорной кислоты, может быть замещен атомом S.
Е означает группу атомов предпочтительно с точки зрения простоты синтеза, имеющую основную структуру цепи, например ДНК, модифицированной ДНК, РНК или модифицированной РНК. Тем не менее, Е может быть группой атомов, имеющей основную структуру цепи LNA или PNA (пептидной нуклеиновой кислоты).
В заместителе А в формулах (2) и (2b) предпочтительно алкильная группа представляет собой метильную группу, алкоксильная группа представляет собой метоксильную группу, а электроноакцепторная группа представляет собой, например, атом галогена.
В формулах (1), (1b) или (1с) длина основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 преимущественно является целым числом, равным 2 или более. Верхний предел основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 специально не ограничивается, как указано выше, и составляет, например, 100 или менее.
Соединение предпочтительно является соединением, представленным следующими формулами (5),
В формулах (5), (6), (6b) и (6c) значения l, m и n' являются произвольными, при этом l, m и n' могут быть одинаковыми или различными, каждый из l, m и n' может содержать, а может не содержать в своей основной цепи атомы С, N, О, S, Р и Si и каждый из l, m и n' может содержать и может не содержат в основной цепи простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, иминогруппу, простую эфирную, простую тиоэфирную связь и сложную тиоэфирную связь. Значения В, Е, Z11, Z12, b, X, Y и Т идентичны значениям, приведенным в формулах (1) и (1b) соответственно. В формулах (5), (6), (6b) и (6c) каждый из l, m и n' предпочтительно представляет собой целое число, равное 2 или более. Верхний предел для l, m и n' специально не ограничивается и составляет, например, 100 или менее, более предпочтительно 30 или менее и наиболее предпочтительно 10 или менее.
В указанном соединении преимущественно Z11 и Z12 представляют собой группы атомов, которые
- 30 032769 проявляют экситонный эффект. Это позволяет значительно усилить флуоресценцию, когда, например, образуется структура с двойной спиралью, так что структуру с двойной спиралью можно обнаружить с еще большей эффективностью. Однако в указанном соединении можно эффективно обнаружить структуру с двойной спиралью даже в том случае, когда Z и Z не являются группами атомов, проявляющими экситонный эффект, или даже в том случае, когда в молекулу введена лишь одна группа атомов (краситель), которая дает флуоресценцию.
Преимущественно Z11 и Z12 представляют собой, например, группы атомов, которые дают флуоресценцию, как указано выше. Указанные группы атомов, которые дают флуоресценцию, специально не ограничиваются. Более конкретно, каждый из Z11 и Z12, например, независимо означает группу, полученную из любого из тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей и их производных. Кроме того, в случае необходимости, может быть также использован фрагмент, полученный из любого другого известного красителя. Известны многие флуоресцентные красители, которые изменяют интенсивность флуоресценции при связывании с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК. В типичном примере было показано, что бромид этидия излучает интенсивный флуоресцентный свет при интеркалировании в структуру двойной спирали ДНК, и его часто используют для обнаружения ДНК. Кроме того, известны также флуоресцентные красители, такие как пиренкарбоксиамид и продан, интенсивность флуоресценции которых можно контролировать за счет микроскопической полярности. Тиазоловый оранжевый является флуоресцентным красителем с бензотиазольным циклом и хинолиновым циклом, которые связаны друг с другом метиновой группой. Он обычно обладает слабой флуоресценцией, но дает сильную флуоресценцию при интеркалировании в ДНК, имеющую структуру с двойной спиралью. Другие примеры включают такие красители, как флуоресцеин и Cy3.
Более предпочтительно каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул (7)-(9):
В формулах (7)-(9) X1 означает S, О или Se;
n'' означает 0 или положительное целое число, заместители с R1 по R10 и R13 с R21, каждый независимо, означают атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу;
один из заместителей R11 и R12 представляет собой линкерную группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (1), (1b) или (1с), или представляет собой NH в формулах (5), (6), (6b) и (6c), а другой означает атом водорода или низшую алкильную группу;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R15, то они могут быть одинаковыми или различными;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует несколько групп R16, то они могут быть одинаковыми
- 31 032769 или различными; и
X1 и R^R21 в Z11 и X1 и R^R21 в Z12 соответственно могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
Более предпочтительно в формулах (7)-(9) в заместителях R^R21 низшая алкильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, а низшая алкоксильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкоксильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода.
Более предпочтительно в формулах (7)-(9) в заместителях R11 и R12 линкерная группа представляет собой полиметиленкарбонильную группу, содержащую по меньшей мере 2 атома углерода и присоединенную к L1 или L2 в формулах (1), (1b) или (1 с), или NH в формулах (5), (6), (6b) или (6c) во фрагменте карбонильной группы. Верхний предел числа атомов углерода полиметиленкарбонильной группы специально не ограничивается и составляет, например, 100 или менее.
Когда каждый из Z11 и Z12 представлен любой из формул (7)-(9), то более предпочтительно они не-
В формулах (19) и (20) X1 означает -S- или -О-. Каждый из заместителей R1-R10 и R13 и R14 независимо означает атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу. Один из R11 и R12 означает линкерную группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (1), (1b) и (1 с), или NH в формулах (5), (6), (6b) или (6c), а другой означает атом водорода или низшую алкильную группу.
Соединение может быть, например, соединением, имеющим структуру, представленную следую-
В формуле (10) значения Е, Z11, Z12, Q, X и Y идентичны соответственно тем, которые приведены в формуле (1).
В формулах (1), (1b) и (1c) В может иметь скелет натурального нуклеинового основания и, как указано выше, может иметь скелет синтетического нуклеинового основания. Например, В предпочтительно имеет структуру, представленную группами Ру (пиримидиновый цикл), Ру der., Pu (пуриновый цикл) или Pu der. Ру представляет собой группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 1-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 5-положении 6-членного цикла, представленного ниже формулой (11). Ру der. представляет собой группу атомов, в которой по меньшей мере один из атомов 6членного цикла в Ру замещен атомом N, С, S или О, при этом атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель. Pu представляет собой группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 9-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 8- 32 032769 положении конденсированного цикла, представленного ниже формулой (12). Pu der. представляет собой группу атомов, в которой по меньшей мере один из атомов 5-членного цикла в Pu замещен атомом N, С, S или О, при этом атом N, С, S или О необязательно имеет электрический заряд, атом водорода или заместитель.
Соединение может быть, например, соединением, представленным следующими формулами (13)
В формулах (13) и (14) значения Е, Z11, Z12, Q, X и Y идентичны соответственно тем, которые приведены в формуле (1), а значения Ру, Ру der., Pu и Pu der. определены выше.
Если соединение содержит фосфорамидитную группу, то предпочтительно фосфорамидитная группа представлена, например, следующей формулой (15):
-Р (OR22) N (R23) (R24) (15).
В формуле (15) R22 представляет собой защитную группу фосфатной группы, а каждый из R23 и R24 означает алкильную или арильную группу.
В формуле (15) более предпочтительно R22 означает цианоэтильную группу и в R23 и R24 алкильная группа представляет собой изопропильную группу, а арильная группа представляет собой фенильную группу.
В указанном соединении, например, соединение, представленное формулой (1), может быть соединением, представленным следующей формулой (21):
В формуле (21) А означает атом водорода или гидроксильную группу. Предпочтительно А представляет собой атом водорода. В означает остаток аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила. Например, аденин и гуанин связаны с двойной связью в 8-положении, а цитозин, тимин или урацил связаны с двойной связью в 5-положении. Каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, которая дает флуоресценцию, атом водорода или аминозащитную группу. В частности, каждая из них предпочтительно означает остаток производного соединения тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого. X означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы, которую можно удалить
- 33 032769 кислотой, монофосфатную группу, дифосфатную группу или трифосфатную группу. Y означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы или фосфорамидитную группу.
Еще более предпочтительно соединения формулы (21) представлено следующей формулой (22):
В формуле (22) А означает атом водорода или гидроксильную группу. Каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, которая дает флуоресценцию, атом водорода или аминозащитную группу и предпочтительно означает остаток производного тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого. X означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы, которую можно удалить кислотой, монофосфатную группу, дифосфатную группу или трифосфатную группу. Y означает атом водорода, защитную группу гидроксильной группы или фосфорамидитную группу.
В соединении (21) или (22), когда каждый из Z11 и Z12 означает атом водорода или защитную группу аминогруппы, то в одной молекуле содержатся две аминогруппы (или защищенные аминогруппы). Таким образом, с помощью указанных аминогрупп в одну молекулу можно ввести две содержащие метку молекулы. Например, когда получают содержащую метку нуклеиновую кислоту, к которой присоединено флуоресцентное вещество или хемилюминесцентное вещество, то можно улучшить чувствительность обнаружения нуклеиновой кислоты. Кроме того, как и в случае, когда каждый из Z11 и Z12 означает группу атомов, которая дает флуоресценцию, внесение метки в нуклеиновую кислоту с помощью конкретного флуоресцентного вещества позволяет легко ее обнаружить.
Более того, соединение формулы (21) или (22), в котором каждый из Z11 и Z12 означает группу атомов, излучающую флуоресцентный свет, представляет собой нуклеозид или нуклеотид, модифицированный двумя флуоресцентными молекулами, каждая из которых является производным триазолового оранжевого или производным оксазолового желтого. В том случае, когда зонд, составленный из одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей подобное соединение, используют сам по себе, он дает очень слабую флуоресценцию вследствие гашения, вызываемого экситонным сопряжением. Однако указанный зонд дает сильную флуоресценцию, когда он гибридизуется с ДНК или РНК. Таким образом, например, флуоресценция производного соединения тиазолового оранжевого или производного оксазолового желтого сильно подавляется вследствие искаженной структуры, но когда производное тиазолового оранжевого или производное оксазолового желтого связывается с ДНК, структурное искажение устраняется и исправляется, позволяя тем самым проявиться сильной флуоресценции. Флуоресценцию можно обнаружить, например, при возбуждении Ar-лазером с длиной волны 488 или 514 нм, однако способ обнаружения этим не ограничивается.
Соединение, представленное формулами (1), (1b) или (1с), может быть использовано для синтеза, например, содержащего метку зонда (содержащей метку нуклеиновой кислоты) по настоящему изобретению. Т.е. указанное соединение может быть использовано в качестве соединения-метки на основе нуклеиновой кислоты (реагента, который вносит метку в нуклеиновую кислоту). Например, используя соединение, представленное формулами (1), (1b) или (1 с), в качестве нуклеотидного субстрата и проводя реакцию синтеза нуклеиновой кислоты, взяв в качестве матрицы одноцепочечную нуклеиновую кислоту, или осуществляя химический синтез одноцепочечной нуклеиновой кислоты (например, с использованием такого метода химического синтеза, как фосфорамидитный метод, который осуществляют с помощью автоматического синтезатора нуклеиновых кислот) с использованием соединения, представленного формулами (1), (1b) или (1 с), можно получить нуклеиновую кислоту, содержащую в одной молекуле по 11 12 меньшеи мере одну молекулу указанного соединения. В этом случае каждая из групп атомов Z и Z может представлять собой группу атомов, которая дает флуоресценцию, однако может также обозначать 11 12 атом водорода или защитную группу. В том случае, когда каждая из групп атомов Z и Z представляет собой группу атомов, излучающую флуоресцентный свет, может быть получен содержащий метку зонд по настоящему изобретению. В том случае, когда каждая из групп атомов Z11 и Z12 представляет собой атом водорода или защитную группу, содержащий метку зонд по настоящему изобретению можно получить путем дальнейшего замещения атома или группы с помощью группы атомов, которая дает флуоресценцию.
Количество соединений (1), (1b) или (1 с), которые включаются в содержащий метку зонд по на
- 34 032769 стоящему изобретению, специально не ограничивается. Оно может, например, быть равно от приблизительно 1 до приблизительно 100, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 20.
Соединение или нуклеиновая кислота (содержащий метку зонд по настоящему изобретению) может иметь структуру, представленную, например, одной из следующих формул (23)-(25). В такой конфигурации его можно успешно использовать в качестве флуоресцентного зонда, содержащего введенный в него краситель. Тем не менее, соединение, которое подходит в качестве флуоресцентного зонда, этим не ограничивается.
В формуле (23) два красителя (Fluo) связаны с основанием В. Место, по которому основание В связывается с линкером, специально не ограничивается. Например, основание В связано с линкером в одном положении, выбранном из 4-положения, 5-положения и 6-положения пиримидина и 2-положения, 3положения, 6-положения, 7-положения и 8-положения пурина. Линкер имеет одно место присоединения основания. Линкер имеет по меньшей мере две ветви, и красители прикреплены на концах. Способ, который используют для связывания красителя с основанием, может представлять собой не только связь, которая образована по катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с замыканием цикла, реакции присоединения Михаэля и т.п. к двойной связи или тройной связи, но и может представлять собой амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь или связь, образованную по реакции образования имина и т.п. Что касается линкера, то его длина (l, m, n) произвольна и он может содержать простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, амин, имин, простую эфирную связь, простую тиоэфирную связь или сложную тиоэфирную связь и т.п. Кроме того, предпочтительно линкер не должен препятствовать экситонному эффекту, вызванному димеризацией. Место разветвления (X) может быть занято любым из атомов углерода, кремния, азота, фосфора и бора, и указанный атом также может быть протонирован (например, NH ) или окислен (например, Р^). Краситель предпочтительно представляет собой краситель, который демонстрирует экситонный эффект при димеризации, и место, по которому краситель присоединен к линкеру, может быть в любой его части. В формуле (23) указан дезоксирибонуклеотид, который представляет собой часть структуры ДНК. Тем не менее, вместо дезоксирибонуклеотида скелет нуклеиновой кислоты может быть составлен рибонуклеотидом (РНК), а также модифицированной сахаром нуклеиновой кислотой, такой как 2'-О-метил РНК или 2'-фтор ДНК, нуклеиновой кислотой, модифицированной фосфорной кислотой, такой как фосфоротиоат-нуклеиновая кислота, или функциональной нуклеиновой кислотой, такой как PNA или LNA (BNA).
В формуле (24) два красителя (Fluo) связаны с основанием В. Положения, по которым основание В связывается с линкером, специально не ограничиваются. Например, основание В связано с линкером в двух положениях, выбранных из 4-положения, 5-положения и 6-положения пиримидина и 2-положения,
3-положения, 6-положения, 7-положения и 8-положения пурина. Каждый из двух линкеров имеет одно место присоединения основания и прикреплен к красителю другим своим концом. Способ, который используют для связывания линкера с основанием и красителем, может представлять собой не только формирование связи, которая образована по катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с замыканием цикла, реакции присоединения Михаэля и т.п. к двойной связи или тройной связи, но и может представлять собой образование амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи или связи, образованной по реакции образования имина и т.п. Что касается линкеров, то их длина (l, m, n) произвольна и они могут содержать простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, амин, имин, простую эфирную связь, простую тиоэфирную связь, сложную тиоэфирную связь и т.п. Кроме того, предпочтительно линкеры не должны препятствовать экситонному эффекту, вызванному димеризацией. Краситель предпочтительно представляет собой краситель, который демонстрирует экситонный эффект при димеризации, и положение, в котором краситель присоединен к линкеру, может быть в любой его части. В формуле (24) указан дезоксирибонуклеотид, который представляет собой часть структуры ДНК. Тем не менее, вместо дезоксирибонуклеотида скелет
- 35 032769 нуклеиновой кислоты может быть составлен рибонуклеотидом (РНК), а также может представлять собой модифицированную сахаром нуклеиновую кислоту, такую как 2'-О-метил РНК или 2'-фтор ДНК, нуклеиновую кислоту, модифицированную фосфорной кислотой, такую как фосфоротиоат-нуклеиновая кислота, или функциональную нуклеиновую кислоту, такую как PNA или LNA (BNA).
В формуле (25) один краситель (Fluo) связан с каждым основанием (В1, В2) смежных нуклеотидов. Положение, в котором каждое из оснований связывается с линкером, специально не ограничивается. Например, каждое основание связано с линкером в одном положении, выбранном из 4-положения, 5положения и 6-положения пиримидина и 2-положения, 3-положения, 6-положения, 7-положения и 8положения пурина. Каждый из двух линкеров имеет одно место присоединения основания и прикреплен к красителю другим своим концом. Способ, который используют для связывания линкеров с основанием и красителем, может представлять собой не только формирование связи, которая образована по катализируемой металлом реакции, реакции конденсации с замыканием цикла, реакции присоединения Михаэля и т.п. к двойной связи или тройной связи, но и может представлять собой формирование амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи или связи, образованной по реакции образования имина и т.п. Что касается линкеров, то их длина (l, m, n) произвольна и они могут содержать простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, амин, имин, простую эфирную связь, простую тиоэфирную связь, сложную тиоэфирную связь и т.п. Кроме того, предпочтительно линкеры не должны препятствовать экситонному эффекту, вызванному димеризацией. Краситель предпочтительно представляет собой краситель, который демонстрирует экситонный эффект при димеризации, и положение, в котором краситель присоединен к линкеру, может быть в любой его части. В формуле (25) указан дезоксирибонуклеотид, который представляет собой часть структуры ДНК. Тем не менее, вместо дезоксирибонуклеотида скелет нуклеиновой кислоты может быть составлен рибонуклеотидом (РНК), а также может быть сформирован модифицированной сахаром нуклеиновой кислотой, такой как 2'-О-метил РНК или 2'-фтор ДНК, нуклеиновой кислотой, модифицированной фосфорной кислотой, такой как фосфоротиоат-нуклеиновая кислота, или функциональной нуклеиновой кислотой, такой как PNA или LNA (BNA).
Если соединение или нуклеиновая кислота (например, содержащая метку нуклеиновая кислота по настоящему изобретению) имеет изомер, такой как таутомер или стереоизомер (например, геометрический изомер, конформационный изомер и оптический изомер), то в настоящем изобретении может быть использован любой из изомеров. Соль указанного соединения или нуклеиновой кислоты может быть кислотно-аддитивной солью, но может быть и основно-аддитивной солью. Кроме того, кислота, которая образует кислотно-аддитивную соль, может быть неорганической кислотой или органической кислотой, а основание, которое образует основно-аддитивную соль, может быть неорганическим основанием или органическим основанием. Неорганическая кислота специально не ограничивается, и ее примеры включают серную кислоту, фосфорную кислоту, фтористоводородную кислоту, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, иодистоводородную кислоту, гипофтористую кислоту, гипохлористую кислоту, гипобромистую кислоту, гипоиодистую кислоту, фторную кислоту, хлорную кислоту, бромную кислоту, иодную кислоту, перфторную кислоту, перхлорную кислоту, пербромную кислоту и периодную кислоту. Органическая кислота также специально не ограничивается, и ее примеры включают птолуолсульфоновую кислоту, метансульфоновую кислоту, щавелевую кислоту, п-бромбензолсульфоновую кислоту, угольную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту и уксусную кислоту. Неорганическое основание специально не ограничивается, и его примеры включают гидроксид аммония, гидроксиды щелочных металлов, гидроксиды щелочноземельных металлов, карбонаты и гидрокарбонаты. Более конкретные их примеры включают гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат калия, карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, гидрокарбонат калия, гидроксид кальция и карбонат кальция. Органическое основание также специально не ограничивается, и его примеры включают этаноламин, триэтиламин и трис-(гидроксиметил)аминометан. Способ получения их солей также специально не ограничивается. Их можно получить, например, известным способом, в котором указанные выше кислоты или основания добавляют к подходящей электронодонорной/акцепторной связывающей молекуле. Кроме того, когда заместитель и т.п. имеет изомер, то может использоваться любой изомер. Например, в случае нафтильной группы, она может представлять собой 1-нафтильную группу или 2нафтильную группу. Кроме того, в настоящем изобретении алкильная группа специально не огранивает
- 36 032769 ся. Ее примеры включают метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, изобутильную группу, втор-бутильную группу и трет-бутильную группу. То же самое относится к группам, содержащим алкильные группы в своих структурах (например, алкиламиногруппе и алкоксильной группе). Кроме того, перфторалкильная группа специально не ограничивается. Ее примеры включают перфторалкильные группы, полученные из метильной группы, этильной группы, н-пропильной группы, изопропильной группы, н-бутильной группы, изобутильной группы, втор-бутильной группы и трет-бутильной группы. То же самое относится к группам, содержащим пефторалкильные группы в своих структурах (например, перфторалкилсульфонильной группе и перфторацильной группе). В настоящем изобретении ацильная группа специально не ограничивается. Ее примеры включают формильную группу, ацетильную группу, пропионильную группу, изобутирильную группу, валерильную группу, изовалерильную группу, пивалоильную группу, гексаноильную группу, циклогексаноильную группу, бензоильную группу и этоксикарбонильную группу. То же самое относится к группам, содержащим ацильные группы в своих структурах (например, ацилоксигруппе и алканоилокси группе). В настоящем изобретении количество атомов углерода в ацильной группе включает атом углерода ацильной группы. Например, алканоильная группа (ацильная группа), имеющая число атомов углерода 1, означает формильную группу. Кроме того, в настоящем изобретении термин атом галогена относится к произвольному галогену, и его примеры включают атом фтора, хлора, брома и иода. Кроме того, в настоящем изобретении защитная группа аминогруппы специально не ограничивается. Ее примеры включают трифторацетильную группу, формильную группу, С1-6-алкилкарбонильную группу (например, ацетильную и этилкарбонильную), С1-6-алкилсульфонильную группу, трет-бутилоксикарбонильную группу (далее означают также как Boc), бензилоксикарбонильную группу, аллилоксикарбонильную группу, флуоренилметилоксикарбонильную группу, арилкарбонильную группу (например, фенилкарбонильную и нафтилкарбонильную группу), арилсульфонильную группу (например, фенилсульфонильную и нафтилсульфонильную группу), С1-6-алкилоксикарбонильную группу (например, метоксикарбонильную и этоксикарбонильную группу), С7-10-аралкилкарбонильную группу, (например, бензилкарбонильную группу), метильную группу и аралкильную группу (например, бензильную, дифенилметильную и тритильную группу). Указанные группы могут содержать в качестве заместителей, например, от одного до трех атомов галогена (например, атомов фтора, хлора или брома) или от одной до трех нитрогрупп. Конкретные их примеры включают п-нитробензилоксикарбонильную группу, п-хлорбензилоксикарбонильную группу, м-хлорбензилоксикарбонильную группу и п-метоксибензилоксикарбонильную группу. В настоящем изобретении защитная группа гидроксильной группы (в том числе группа, которая может быть удалена с помощью кислоты) специально не ограничена. Ее примеры включают диметокситритильную группу, монометокситритильную группу и пиксильную группу.
Способ получения зонда на основе нуклеиновой кислоты.
Способ получения зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению специально не ограничивается. Например, зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть получен в соответствии с подходящим известным способом синтеза (способом получения). В частности, можно сослаться, например, на способ, раскрытый в патенте Японии № 4370385.
В качестве одного иллюстративного примера соединение, представленное вышеуказанной формулой (21), может быть получено с помощью способа, включающего следующие стадии: взаимодействие трис-(2-аминоэтил)амина с соединением, представленным следующей формулой (26), после того как активирована имеющаяся в соединении карбоксильная группа; защита аминогруппы и проведение реакции с целью защиты гидроксильной группы, присутствующей в полученном выше соединении, с защитной группой и реакции с введением группы фосфорной кислоты или фосфорамидитной группы в гидроксильную группу, присутствующую в полученном выше соединении.
(2 6)
В формуле (26) А означает атом водорода или гидроксильную группу. В означает остаток аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила.
Например, следующий способ получения (метод синтеза) может быть использован для приготовления зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Он представляет собой простой способ введения метки в ДНК, а именно широко используемый способ, в котором активная аминогруппа, содержащаяся в ДНК, и активированная карбоксильная группа в агенте для введения метки взаимодействуют друг с другом в буферном растворе. Указанный способ может быть использован для получения как соединения, так и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и он может быть использован, в частности, для введения линкерной группы или красителя. Примеры способа введения аминогруппы включают способ с использованием модификатора амина, фосфорамидита, который коммерчески досту
- 37 032769 пен от компании Glen Research.
Каждая из групп атомов Z11 и Z12 может быть преобразована, например, из защитной группы в атом водорода (то есть, защитную группу удаляют), а затем атом водорода может быть замещен группой атомов (красителем), которая дает флуоресценцию. Способ удаления защитной группы специально не ограничивается, и может быть использован подходящий известный способ. Способ замещения группой атомов (красителем), излучающей флуоресценцию, также специально не ограничивается. Например, соединение или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, в котором каждый из Z11 и Z12 означает атом водорода, может реагировать с подходящей флуоресцентной молекулой (красителем). Например, предпочтительно по меньшей мере один из Z11 и Z12 представляет собой активную аминогруппу, поскольку она позволяет соединению или нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению легче вступать во взаимодействие с флуоресцентной молекулой (красителем). Более предпочтительно, когда оба Z11 и Z12 представляют собой активные аминогруппы. Флуоресцентная молекула (краситель) также специально не ограничивается, и она может быть, например, соединением, представленным любой из формул (7)-(9) (где оба R11 и R12 означают атомы водорода или низшие алкильные группы, или карбоксиполиметиленовые группы). Кроме того, в случае нуклеиновой кислоты (полинуклеотида, полинуклеозида, олигонуклеотида или олигонуклеозида), стадию удаления защитной группы и стадию замещения группой атомов (красителем), которая дает флуоресцентное излучение, можно проводить до или после полимеризации (синтеза нуклеиновой кислоты). Например, с точки зрения предотвращения повреждения группу атомов в процессе синтеза, предпочтительно группу атомов (краситель), излучающую флуоресцентный свет, вводят после полимеризации (синтеза нуклеиновой кислоты).
Как указано выше, краситель специально не ограничивается, и могут быть использованы любые красители. Например, они предпочтительно представляют собой цианиновый краситель и наиболее предпочтительно тиазоловый оранжевый. Цианиновый краситель имеет химическую структуру, в которой, например, гетероатомы двух гетероциклов связаны друг с другом метиновой линкерной группой. Можно синтезировать флуоресцентные красители с различными длинами волн возбуждения/излучения, например, путем изменения типа гетероциклов или длины метиновой линкерной группы или путем введения заместителя в гетероциклы. Кроме того, введение линкерной группы, с целью введения ДНК, также осуществляется относительно легко. Несмотря на то что тиазоловый оранжевый дает слабое флуоресцентное излучение в воде, он дает интенсивную флуоресценцию при взаимодействии с ДНК или РНК. Авторы настоящего изобретения полагают, что вследствие взаимодействия с нуклеиновой кислотой, взаимодействие между молекулами красителей нарушается и вращение вокруг метиновой линкерной группы, расположенной между двумя гетероциклами молекул красителей, становится невозможным, что приводит к возрастанию интенсивности флуоресцентного излучения. Способ с использованием красителя тиазолового оранжевого хорошо известен. В качестве примера его использования можно сослаться, например, на H.S. Rye, M.A. Quesada, K. Peck, R.A. Mathies and A.N. Glazer, High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner using ethidium homodimer and thiazole orange, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 327-33 и L.G. Lee, C.H. Chen and L.A. Chiu, Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis, Cytometry, 1986, 7, 508-17.
В настоящем изобретении, как указано выше, основной скелет зонда на основе нуклеиновой кислоты специально не ограничивается. Он может быть, например, любым из олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов, модифицированных олигонуклеозидов, полинуклеотидов, модифицированных полинуклеотидов, полинуклеозидов, модифицированных полинуклеозидов, ДНК, модифицированных ДНК, РНК, модифицированных РНК, LNA, PNA (пептидных нуклеиновых кислот) и другими структурами. Основной каркас предпочтительно составляет ДНК, модифицированная ДНК, РНК или модифицированная РНК, поскольку зонд на основе нуклеиновой кислоты может быть легко синтезирован и также поскольку, например, легко может быть осуществлено замещение красителем (введение молекулы красителя). Способ введения молекулы красителя в LNA или PNA специально не ограничивается, и может быть использован известный подходящий способ. В частности, можно сослаться, например, на Analytical Biochemistry 2000, 281, 26-35. Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M (2000) Anal Biochem. 281, 26-35; Hrdlicka, P.J., Babu, B.R., Sorensen, M.D., Harrit, N., Wengel, J. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127, 13293-13299.
Способ синтеза нуклеиновой кислоты, имеющей в качестве основного скелета олигонуклеотид, модифицированный олигонуклеотид, олигонуклеозид, модифицированный олигонуклеозид, полинуклеотид, модифицированный полинуклеотид, полинуклеозид, модифицированный полинуклеозид, ДНК, модифицированную ДНК, РНК или модифицированную РНК, хорошо известен. Например, она может быть синтезирована по так называемому фосфорамидитному методу. Фосфорамидитный реагент, который служит в качестве исходного вещества, также можно легко синтезировать известным способом. Когда нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению является ДНК, в частности короткая олиго-ДНК, ее можно легко синтезировать, например, с помощью автоматического синтезатора ДНК и т. п. Кроме того, можно также синтезировать нуклеиновую кислоту (ДНК) с длинной цепью, например, методом ПЦР. Как указано выше, положение, по которому ДНК и молекула красителя соединены друг с другом, специально не ограничивается, и наиболее предпочтительной является, например, 5-положение тимидина. Известно,
- 38 032769 что введение трифосфорной кислоты в производное соединение нуклеотида с различными заместителями в 5-положении тимидина с относительно высокой эффективность может быть осуществлено с помощью ДНК-полимеразы. Таким образом, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть легко синтезированы, например, не только тогда, когда они представляют собой короткую олиго-ДНК, но и когда они представляют собой ДНК с длинной цепью.
В частности, флуоресцентный зонд (содержащая метку нуклеиновая кислота) по настоящему изобретению, который представляет собой одноцепочечную ДНК с используемым в ней, например, тиазоловым оранжевым, предоставляет следующие преимущества: (1) его можно легко синтезировать, поскольку зонд можно получить в буферном растворе путем простого введения красителя в ДНК, которую синтезируют в автоматическом ДНК-синтезаторе; и (2) можно также получить флуоресцентный зонд с длинной цепью путем взаимодействия красителя с длинноцепочечной ДНК, которую получают ферментативно. Кроме того, его можно возбудить светом с относительно большой длиной волны, например 500 нм.
В настоящем изобретении могут быть использованы, например, два или более типов зондов для нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, которые отличаются друг от друга длиной волны детектирования флуоресцентных групп атомов. Когда зонды для нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, содержащие различные флуоресцентные группы атомов, используют в комбинации в качестве зондов для нуклеиновых кислот, с целью амплифицирования двух или нескольких видов последовательностей нуклеиновой кислоты-мишени соответственно, то реакцию амплификации можно провести в том же самом реакционном растворе, а будут или нет амплифицированы соответствующие последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте, может быть обнаружено на длинах волн, пригодных для обнаружения соответствующих флуоресцентных групп атомов.
Химическую модификацию конца со стороны удлинения (например, З'-конца группы атомов, имеющей скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную от любой из них) зонда на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонда) по настоящему изобретению можно осуществить, например, следующими методами. Химическую модификацию можно осуществить, например, с помощью обычного фосфорамидитного способа с использованием обычного автоматического синтезатора нуклеиновых кислот (автоматического синтезатора ДНК). Удаление защитной группы (например, носителя, такого как носитель CPG или стирольного полимера), которое затем должно быть выполнено, также можно проводить, например, обычным способом в фосфорамидитном методе с использованием обычного автоматического синтезатора нуклеиновых кислот.
(1) 3'-конец Е-зонда химически модифицирован с помощью алкильной линкерной группы ОН, чтобы маскировать 3'-концевой ОН, при этом реакция удлинения под действием полимеразы подавляется. Химическую модификацию можно осуществить по хорошо известной методике с использованием, например, 3'-Spacer C3 CPG (торговое наименование продукта компании Glen Research).
(2) 3'-конец Е-зонда химически модифицирован с помощью алкильной линкерной группы NH2, чтобы маскировать 3'-концевой ОН, при этом реакция удлинения под действием полимеразы подавляется. Химическую модификацию можно осуществить по хорошо известной методике с использованием, например, 3'-РТ Amino-Modifier C3 CPG (торговое наименование продукта компании Glen Research).
(3) В 3'-конец Е-зонда вводят дидезоксинуклеотид, который не имеет ОН на 3-конце и тем самым не вызывает реакцию удлинения под действием полимеразы. Дидезоксинуклеотид можно ввести по хорошо известной методике с использованием, например, 3'-2'3'ddC-CPG (торговое название продукта компании Glen Research).
(4) Фосфодиэфирная связь преобразуется в связь диэфира тиофосфорной кислоты, в результате чего блокируется реакции расщепления, которая вызывается экзонуклеазой и приводит к образованию концевой гидроксильной группы. В результате реакция удлинения под действием полимеразы подавляется.
Примеры
Примеры приведены ниже. Следует однако отметить, что настоящее изобретение ни в коем случае не ограничивается приведенными примерами.
Молекулу нуклеиновой кислоты синтезируют следующим образом. Синтез молекулы нуклеиновой кислоты проводят таким же образом, что и метод синтеза, описанный в примерах Японского патента № 4370385, за исключением того, что 3'-конец нуклеиновой кислоты химически модифицирован.
Синтез промежуточных соединений примеров 1-3.
В соответствии со следующей схемой 1 синтезируют (получают) соединения 102 и 103, содержащие две активные аминогруппы, каждая из которых защищена трифторацетильной группой, а затем синтезируют фосфорамидит 104.
- 39 032769
Используемые в реакции реагенты и условия проведения реакции:
(a) (i) N-гидроксисукцинимид, EDC/DMF;
(ii) трис-(2-аминоэтил)амин/CH3CN, (iii) CF3COOEt, Et3N;
(b) DMTrCl/пиридин;
(c) 2-цианоэтил-\,\,\',\'-тетраизопропил фосфорамидит, 1H-тетразол/CH3CN.
Схема 1 описывается ниже более подробно.
Синтез промежуточного соединения примера 1. Синтез 2-|2-|\,\-бис-(2-трифторацета\1идоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина (соединение 102).
Исходное вещество (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'-дезоксиуридин (соединение 101) синтезируют в соответствии с Tetrahedron 1987, 43, 20, 4601-4607. А именно вначале 71 мл 1,4-диоксана добавляют к 430 мг ацетата палладия(11) (FW 224,51) и 1,05 г трифенилфосфина (FW 262,29), а затем к полученной смеси добавляют 7,1 мл триэтиламина (FW 101,19, d=0,726). Полученную смесь нагревают и перемешивают при температуре 70°C. После того как цвет реакционного раствора изменяется с красновато-коричневого до черно-коричневого цвета, добавляют 14,2 г 2'-дезокси-5-иодуридина (FW 354,10) и 7,0 мл метилакрилата (FW 86,09, d=0,956) в виде суспензии в 1,4-диоксане. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником при температуре 125°C в течение 1 ч. Затем реакционную смесь фильтруют в горячем состоянии, остаток промывают метанолом, а затем фильтрат подвергают дальнейшей обработке. После того как растворитель выпаривают из фильтрата при пониженном давлении, полученный продукт очищают на колонке с силикагелем (5-10% метанол/дихлорметан). Растворитель из собранной фракции выпаривают при пониженном давлении и остаток в виде твердого вещества белого цвета сушат при пониженном давлении. К высушенному твердому веществу добавляют приблизительно 100 мл ультрачистой воды, а затем добавляют 3,21 г гидроксида натрия (FW 40,00). Смесь оставляют перемешиваться на ночь при температуре 25°C. После этого к раствору добавляют концентрированный раствор хлористоводородной кислоты, чтобы подкислить реакционную смесь. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ультрачистой водой и затем сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают 8,10 г (выход: 68%) требуемого соединения (соединение 101) в виде белого порошка. Подтверждают, что белый порошок представляет собой требуемое соединение 101, поскольку значение, полученное методом 1Н ЯМР, соответствует эталонному значению. Спектр 13С ЯМР приведен ниже.
- 40 032769 (Е)-5-(2-Карбоксивинил)-2'-дезоксиуридин (соединение 101): 13С ЯМР (ДМСО-dg): δ 168,1; 161,8; 149,3; 143,5; 137,5; 117,8; 108,4; 87,6; 84,8; 69,7; 60,8; 40,1.
Затем 1,20 г (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'-дезоксиуридина 101 (с молекулярной массой 298,25), 925 мг N-гидроксисукцинимида (с молекулярной массой 115,09) и 1,54 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (с молекулярной массой 191,70) помещают в колбу с мешалкой и к раствору добавляют 20 мл ДМФА, а затем перемешивают при 25°C в течение 16 ч. Добавляют приблизительно 1 мл уксусной кислоты, 300 мл метиленхлорида и 100 мл ультрачистой воды и затем смесь энергично перемешивают. Водный слой удаляют и добавляют еще 100 мл ультрачистой воды, а затем еще дважды промывают таким же образом. Полученный указанным образом осадок отфильтровывают, промывают метиленхлоридом, а затем сушат при пониженном давлении. Растворитель из фильтрата выпаривают, к полученному осадку добавляют метиленхлорид, а затем осадок выделяют таким же образом, как указано выше. Выделенный осадок собирают и затем суспендируют в 80 мл ацетонитрила. Полученную смесь энергично перемешивают. Затем в один прием добавляют 3,0 мл трис-(2-аминоэтил)амина (с молекулярной массой 146,23, d=0,976) и дополнительно перемешивают при 25°C в течение 10 мин. После этого добавляют 4,8 мл этил трифторацетата (с молекулярной массой 142,08, d=1,194), а затем 5,6 мл триэтиламина (с молекулярной массой 101,19, d=0,726). Смесь перемешивают при 25°C в течение 3 ч. Растворитель упаривают, а полученный продукт очищают на колонке с силикагелем (5-10% МеОН/CH2Cl2). Растворитель упаривают, полученный продукт растворяют в небольшом количестве ацетона и к полученному раствору добавляют эфир. В результате получают осадок белого цвета. Смесь фильтруют и затем промывают эфиром. Затем смесь сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают 884 мг (33,5%) требуемого вещества (соединение 102).
Проводят тот же синтез, как указано выше, за исключением небольших изменений, например в количествах используемых исходных веществ и растворителей, времени реакции и проводимых стадий. В результате выход улучшают до 37%. В частности, 597 мг (2,0 ммоль) (Е)-5-(2-карбоксивинил)-2'дезоксиуридина 101 (с молекулярной массой 298,25), 460 мг (4,0 ммоль) N-гидроксисукцинимида (с молекулярной массой 115,09) и 767 мг (4,0 ммоль) гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (с молекулярной массой 191,70) помещают в колбу с мешалкой. Затем добавляют 5,0 мл диметилформамида и перемешивают при 25°C в течение 3 ч. Добавляют приблизительно 0,5 мл уксусной кислоты, а затем добавляют 100 мл метиленхлорида и 100 мл ультрачистой воды. Полученную смесь энергично перемешивают. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат при пониженном давлении в течение ночи. Полученный остаток белого цвета суспендируют в 50 мл ацетонитрила и энергично перемешивают. Затем в один прием добавляют 3,0 мл (20 ммоль) трис-(2аминоэтил)амина (с молекулярной массой 146,23, d=0,976) и дополнительно перемешивают при 25°C в течение 10 мин. После этого добавляют 4,8 мл этил трифторацетата (с молекулярной массой 142,08, d=1,194), а затем 5,6 мл (40 ммоль) триэтиламина (с молекулярной массой 101,19, d=0,726) и полученную смесь перемешивают при 25°C в течение 16 ч. Растворитель упаривают, а полученный продукт очищают на колонке с силикагелем (5-10% MeOH/CH2Cl2). Растворитель упаривают, полученный продукт растворяют в небольшом количестве ацетона, а затем добавляют эфир. В результате образуется белый осадок. Полученную смесь фильтруют, а затем промывают эфиром и сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают 453 мг (37%) требуемого вещества (соединение 102) в виде белого порошка. Полученные с помощью аналитических приборов величины для соединения 102 приведены ниже.
2-[2-[ЛХ-бис-(2-Трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридин (соединение 102):
1H ЯМР (CD3OD): δ 8,35 (с, 1Н), 7,22 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 7,04 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,26 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,44-4,41 (м, 1Н), 3,96-3,94 (м, 1Н), 3,84 (дд, J=12,2, 2,9 Гц, 1Н), 3,76 (дд, J=12,2, 3,4 Гц, 1Н), 3,373,30 (м, 6Н), 2,72-2,66 (м, 6Н), 2,38-2,23 (м, 2Н);
13С ЯМР (CD3OD): δ 169,3, 163,7, 159,1 (кв, J=36,4 Гц), 151,2, 143,8, 134,3, 122,0, 117,5 (кв, J=286 Гц), 110,9, 89,1, 87,0, 71,9, 62,5, 54,4, 53,9, 41,7, 38,9, 38,7.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C22H29F6N6O8 ([M+H]+) 619,1951, найдено 619,1943.
Синтез промежуточного соединения примера 2. Синтез 5'-О-диметокситритил-(2-|2-|КН-бис-(2трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина (5'-О-ОМТг-(2-|2-|КН-бис(2-трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина, соединение 103).
5'-гидроксильную группу соединения 102 защищают с помощью группы DMTr. Указанным образом получают соединение 103. А именно вначале 618 мг соединения 102 (с молекулярной массой 618,48) и 373 мг 4,4'-диметокситритилхлорида (с молекулярной массой 338,83) помещают в колбу, снабженную мешалкой. Затем к реакционной смеси добавляют 10 мл пиридина и перемешивают при 25°C в течение 16 ч. Добавляют небольшое количество воды, растворитель выпаривают и полученный в результате продукт очищают на колонке с силикагелем (2-4% МеОН, 1% Et3N/CH2Cl2). Растворитель из фракции, содержащей требуемое соединение 103, выпаривают. Указанным образом получают 735,2 мг (79,8%) требуемого вещества (соединение 103). Полученные с помощью аналитических приборов величины для со
- 41 032769 единения 103 приведены ниже.
5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-бис-(2-Трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридин (соединение 103):
1H ЯМР (CD3OD): δ 7,91 (с, 1Н), 7,39-7,11 (м, 9Н), 7,02 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,93 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,80-6,78 (м, 4Н), 6,17 (т, J=6,6 Гц, 1н), 4,38-4,35 (м, 1Н), 4,06-4,04 (м, 1Н), 3,68 (с, 6Н), 3,32-3,22 (м, 8Н), 2,66-2,55 (м, 6Н), 2,40 (ддд, J=13,7, 5,9, 2,9 Гц, 1Н), 2,33-2,26 (м, 1Н);
13С ЯМР (CD3OD): δ 168,9, 163,7, 160,1, 159,1 (кв, J=36,9 Гц), 151,0, 146,1, 143,0, 137,0, 136,9, 134,1, 131,24, 131,16, 129,2, 128,9, 128,0, 122,5, 117,5 (кв, J=286,7 Гц), 114,2, 110,9, 88,1, 87,9, 87,6, 72,6, 65,0,
55,7, 54,2, 53,9, 41,7, 38,9, 38,6.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C43H47F6N6O10 ([M+H]+) 921,3258, найдено 921,3265.
Синтез промежуточного соединения примера 3. Синтез 5'-О-ди\1етокситритив1-(2-|2-|\,\-бис-(2трифторацетамидоэтил)]аминоэтил]карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридина, 3'-[(2-цианоэтил)-(\,\диизопропил)]фосфорамидита, (5'-O-D\!Ti42-|2-|\,\-бис-(2-трифтора11ета\1идоэти.1)|а\1иноэти.1|карбамоил-(Е)-винил)-2'-дезоксиуридин, 3'-[(2-цианоэтил)-(\,\-диизопропил)]фосфорамидит, соединение 104).
Вначале 188 мг (0,20 ммоль) соединения 103 (с молекулярной массой 920,85) дают образовать азеотропную смесь с CH3CN, а затем добавляют 28,6 мг (0,40 ммоль) 1Н-тетразола (с молекулярной массой 70,05). Полученную смесь оставляют на ночь сушиться в вакууме с помощью вакуумного насоса. Затем к смеси добавляют 5,1 мл CH3CN для растворения реагента и перемешивают. После этого добавляют в один прием 194 мкл (0,60 ммоль) 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфорамидита (с молекулярной массой 301,41, d=0,949) и перемешивают при температуре 25°C в течение 2 ч. После этого добавляют смесь 50 мл этилацетата и 50 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и жидкости разделяют. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над сульфатом магния. Сульфат магния удаляют фильтрованием, а затем растворитель упаривают. Сырому продукту, полученному после разделения жидких фаз, дают образовать азеотропную смесь с CH3CN. Затем, предполагая, что продукт (соединение 104) получают с выходом 100%, из него готовят 0,1 М раствор в CH3CN и используют для синтеза ДНК. Факт получения соединения 104 подтверждают методами 31Р ЯМР (CDCl3) и масс-спектрометрии высокого разрешения (ESI) для сырого продукта. Соответствующие значения приведены ниже.
Соединение 104: 31Р ЯМР (CDCl3) δ 149,686; 149,430; масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI) рассчитано для C52H64F6N8O11P ([M+H]+) 1121,4336; найдено 1121,4342.
Синтез промежуточного соединения примера 4: синтез олигомера ДНК.
Синтез олиго-ДНК в автоматическом синтезаторе ДНК с использованием соединения 104 проводят обычным фосфорамидитным способом (DMTr OFF) в микромольном масштабе. Указанным образом синтезируют каждый из олигомеров ДНК с последовательностями, представленными в описанных ниже примерах. Удаление защитной группы проводят концентрированным водным раствором аммиака (28% масс.) при температуре 55°C в течение 16 ч. Аммиак испаряют в вакууме и полученный продукт фильтруют через фильтр 0,45 мкм. После этого олигомер ДНК вырезают и анализируют методом ВЭЖХ с обращенной фазой, а пик, который появляется примерно через 10,5 мин, очищают (CHEMCOBOND 5-ODSH (торговое название), 10x150 мм, 3 мл/мин, 5-30% CH3CN/50 мМ ТЕАА буфера, рН 7 (20 мин), обнаружение при 260 нм). Молекулярную массу очищенного указанным образом продукта измеряют с помощью масс-спектрометра MALDI TOF в негативном режиме регистрации. В результате подтверждают, что продукт включает требуемую последовательность.
С целью определения концентрации каждой из синтезированных указанным образом ДНК, каждую очищенную ДНК полностью расщепляют при 25°C в течение 16 ч с помощью кишечной щелочной фосфатазы теленка (50 Ед./мл), фосфодиэстеразы змеиного яда (0,15 Ед./мл) и Р1-нуклеазы (50 Ед./мл). Полученные после ферментации жидкости анализируют методом ВЭЖХ на колонке CHEMCOBOND 5ODS-H (торговое название) (4,6x150 мм). При проведение данного анализа в качестве проявителя используют 0,1 М ТЕАА (рН 7,0), а скорость потока выбирают равной 1,0 мл/мин. Концентрацию синтезированной ДНК определяют на основе сравнения с площадью пика стандартного раствора, содержащего
- 42 032769 dA, dC, dG и dT, концентрация каждого из которых равна 0,1 мМ. Кроме того, синтезированную ДНК идентифицируют с помощью масс-спектра MALDI TOF.
Пример синтеза молекулы нуклеиновой кислоты: синтез молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей в двух местах одной молекулы структуры, полученные из тиазолового оранжевого.
Как показано на схеме 4, синтезируют олигомер ДНК (олигонуклеотид) 110, который содержит в двух местах одной молекулы структуры, полученные из тиазолового оранжевого. Более подробное его описание приведено ниже.
Производное соединение тиазолового оранжевого 107 синтезируют, как указано ниже на схеме 5, со ссылкой на Organic Letters 2000, 6, 517-519.
(1) Синтез иодида N-метилхинолиния (соединение 111).
Вначале синтезируют иодид N-метилхинолиния (соединение 111) в соответствии с описанием, приведенным в вышеуказанной ссылке. В частности, 2,4 мл хинолина и 4 мл метилиодида добавляют к 42 мл безводного диоксана и перемешивают при температуре 150°С в течение 1 ч. После этого реакционную смесь фильтруют и выделяют осадок. Затем осадок промывают эфиром и петролейным эфиром и сушат. Указанным образом получают иодид N-метилхинолиния (соединение 111).
(2) Синтез бромида 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолия (соединение 112).
мл 2-метилбензотиазола (FW 149,21, d= 1,173) и 9,4 г 5-бромвалериановой кислоты (5бромпентановой кислоты) (FW 181,03) перемешивают при температуре 110°С в течение 16 ч. Сырой продукт охлаждают до комнатной температуры и полученное твердое вещество суспендируют в 20 мл метанола, а затем к нему добавляют 40 мл эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают и затем промывают диоксаном до тех, пока не исчезнет запах 2-метилбензотиазола. Дополнительно промывают эфиром и сушат при пониженном давлении. Получают 9,8 г белого порошка. Затем регистрируют спектр 1H ЯМР полученного белого порошка. В результате обнаруживают, что он представляет собой смесь бромида 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолия (соединение 112), являющегося требуемым продуктом, где 2-положение алкилировано, и бромид 3-(4-карбоксибутил)бензотиазолия, где 2-положение не алкилировано. Пик отношения протона неалкилированный: алкилированный = 10:3. Указанный неочищенный продукт используют для проведения следующей реакции без дальнейшей обработки.
(3) Синтез бромида 1-метил-4-[{3-(4-карбоксибутил)-2(3H)-бензотиазолилиден}метил]хинолиния (соединение 107).
2,18 г сырого продукта, содержащего бромид 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолия (соедине
- 43 032769 ние 112), полученного выше на стадии (2), и 700 мг иодида N-метилхинолиния (соединение 111) (FW 271,10) перемешивают в 10 мл метиленхлорида при 25°С в течение 2 ч в присутствии 3,6 мл триэтиламина (FW 101,19, d=0,726). Затем к реакционной смеси добавляют 50 мл эфира и образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат при пониженном давлении. Осадок суспендируют в 50 мл ультрачистой воды, отфильтруют, промывают ультрачистой водой и затем сушат при пониженном давлении. Затем осадок суспендируют в 50 мл ацетонитрила, фильтруют, промывают ацетонитрилом и сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают 307,5 мг порошка красного цвета (выход: 25,3%). Путем сравнения 1H ЯМР спектра указанного красного порошка с эталоном подтверждают, что он является требуемым веществом (соединение 107).
Кроме того, можно также синтезировать бромид 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолия (соединение 112) и бромид 1-метил-4-[{3-(4-карбоксибутил)-2(3H)-бензотиазолилиден}метил]хинолиния (соединение 107) следующим образом. В частности, вначале 11,7 мл (92 ммоль) 2-метилбензотиазола (FW 149,21, d=1,173) и 13,7 г (76 ммоль) 5-бромвалериановой кислоты (5-бромпентановой кислоты) (FW 181,03) перемешивают при температуре 150°С в течение 1 ч. Сырой продукт охлаждают до комнатной температуры и образовавшееся твердое вещество суспендируют в 50 мл метанола. Затем к раствору добавляют 200 мл эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают 19,2 г порошка светло-розового цвета. Указанный порошок представляет собой смесь требуемого соединения 112 (бромида 3-(4-карбоксибутил)-2метилбензотиазолия) и бромида 2-метилбензотиазолия. Полученную смесь анализируют методом 1Н ЯМР (в ДМСО-de) и расчетным путем из соотношения площадей пика при 8,5 м.д. (сигнал от требуемого соединения 112) и пика при 8,0 м.д. (сигнал от бромида 2-метилбензотиазолия) устанавливают, что выход требуемого соединения 112 составляет 9,82 г (14 ммоль, 32%). Указанную смесь (сырой продукт) используют для проведения следующей реакции без дальнейшей обработки. Таким же образом, как указано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановую кислоту (5-бромпентановую кислоту) заменяют на 4-броммасляную кислоту (4-бромбутановую кислоту), с выходом 4% синтезируют бромид 3-(4карбоксипропил)-2-метилбензотиазолия с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 3. Кроме того, таким же образом, как указано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановую кислоту (5-бромпентановую кислоту) заменяют на 6-бромгексановую кислоту, с выходом 35% синтезируют бромид 3-(4-карбоксипентил)-2метилбензотиазолия с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 5. Более того, таким же образом, как указано выше, за исключением того, что 5-бромвалериановую кислоту (5-бромпентановую кислоту) заменяют на 7бромгептановую кислоту, с выходом 22% синтезируют бромид 3-(4-карбоксипропил)-2метилбензотиазолия с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 6.
Затем 1,36 г (5,0 ммоль) иодида N-метилхинолиния (соединение 111) (FW 271,10), 7,0 мл (50 ммоль) триэтиламина (FW 101,19, d=0,726) и 100 мл метиленхлорида добавляют к 3,24 г смеси (сырого продукта), содержащего соединение 112 (бромид 3-(4-карбоксибутил)-2-метилбензотиазолия) и бромид 2метилбензотиазолия. В результате получают прозрачный раствор. Полученный раствор перемешивают при температуре 25°С в течение 16 ч. После этого растворитель упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют ацетон (200 мл) и образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. Полученный остаток высушивают при пониженном давлении, а остаток красного цвета, полученный после сушки, промывают дистиллированной водой (50 мл). Затем фильтруют, промывают дистиллированной водой и сушат при пониженном давлении. Указанным образом получают требуемое вещество (соединение 107) в виде порошка красного цвета (654 мг, 1,39 ммоль, 28%). Сравнивая спектр 1Н ЯМР с эталонным значением, подтверждают, что красный порошок является требуемым веществом (соединение 107). Значения для пиков 13С ЯМР и 1Н ЯМР (ДМСОЛ6) и измеренные величины масс-спектрометрии высокого разрешения (ESI) приведены ниже.
Соединение 107:
1Н ЯМР (ДМСОЛ6): δ 8,74 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,51 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 7,94-7,89 (м, 3H), 7,74-7,70 (м, 1Н), 7,65 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,55-7,51 (м, 1Н), 7,36-7,32 (м, 1Н), 7,21 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 6,83 (с, 1Н), 4,47 (т, J=7,1 Гц, 2Н), 4,07 (с, 3H), 2,22 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 1,77-1,63 (м, 4Н);
13С ЯМР (ДМСО-d,·,. 60°С) δ 174,6, 158,8, 148,4, 144,5, 139,5, 137,6, 132,7, 127,9, 126,8, 125,5, 124,1,
123,7, 123,6, 122,4, 117,5, 112,6, 107,6, 87,4, 45,6, 42,0, 35,5, 26,2, 22,3;
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C23H23N2O2S ([M.Br]+) 391,1480, найдено 391,1475.
Бромид 4-((3-(3-карбоксипропил)бензоЩтиазол-2(3Н)илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 3, синтезируют с выходом 43% из смеси бромида 3-(4-карбоксипропил)-2метилбензотиазолия и бромида 2-метилбензотиазолия по той же самой методике, которую применяют для соединения 107.
- 44 032769
Полученные с помощью аналитических приборов величины приведены ниже.
Бромид 4-((3-(3 -карбоксипропил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния:
Ή ЯМР (ДМСО-dy δ 8,85 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,59 (д, J=7,3 Гц, 1Н), 8,02,7,93 (м, 3H), 7,78,7,70 (м, 2Н), 7,61,7,57 (м, 1Н), 7,42,7,38 (м, 1Н), 7,31 (д, J=6, 8 Гц, 1Н), 7,04 (с, 1Н), 4,47 (т, J=8,1 Гц, 2Н), 4,13 (с, 3H), 2,52,2,48 (м, 2Н), 1,99,1,92 (м, 2Н);
13С ЯМР (ДМСО-d,·,. 60°С): δ 174,3, 158,9, 148,6, 144,5, 139,5, 137,7, 132,7, 127,9, 126,7, 125,6, 124,1, 124,0, 123,7, 122.5, 117,5, 112,5, 107,6, 87,7, 45,6, 42,0, 31,6, 22,4.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C22H2iN2O2S ([M.Br]+) 377,1324, найдено 377,1316.
Кроме того, бромид 4-((3-(3-карбоксипентил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 5, синтезируют с выходом 26% из смеси бромида 3-(4карбоксипентил)-2-метилбензотиазолия и бромида 2-метилбензотиазолия по той же методике, которую используют для получения соединения 107. Полученные с помощью аналитических приборов величины приведены ниже.
Бромид 4-((3-(3 -карбоксипентил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния:
Ή ЯМР (ДМСО-dy δ 8,70 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,61 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 8,05, 8,00 (м, 3H), 7,80, 7,73 (м, 2Н), 7,60, 7,56 (м, 1Н), 7,41,7,35 (м, 2Н), 6,89 (с, 1Н), 4,59 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 4,16 (с, 3H), 2,19 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 1,82, 1,75 (м, 2Н), 1,62, 1,43 (м, 4Н);
13С ЯМР (ДМСО-06, 60°С): δ 174,5, 159,0, 148,6, 144,7, 139,7, 137,8, 132,9, 127,9, 126,9, 125,2, 124,2,
123,8, 123,6, 122,6, 117,8, 112,6, 107,7, 87,4, 45,6, 42,1, 36,0, 26,3, 25,9, 24,9.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C24H25N2O2S ([M.Br]+) 405,1637, найдено 405,1632.
Кроме того, бромид 4-((3-(3-карбоксигексил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью, соединенной с карбоксильной группой), число атомов углерода n в которой равно 6, синтезируют с выходом 22% из смеси бромида 3-(4карбоксигексил)-2-метилбензотиазолия и бромида 2-метилбензотиазолия той же методике, которую используют для получения соединения 107. Полученные с помощью аналитических приборов величины приведены ниже.
Бромид 4-((3-(3 -карбоксигексил)бензо [d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния:
Ή ЯМР (ДМСО-dy δ 8,72 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 8,62 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 8,07, 8,01 (м, 3H), 7,81, 7,75 (м, 2Н), 7,62, 7,58 (м, 1Н), 7,42, 7,38 (м, 2Н), 6,92 (с, 1Н), 4,61 (т, J=7,3 Гц, 2Н), 4,17 (с, 3H), 2,18 (т, J=7,3 Гц, 1Н), 1,82, 1,75 (м, 2Н), 1, 51, 1, 32 (м, 6Н);
13С ЯМР (ДМСОЛ6. 60°С): δ 174,0, 159,1, 148,6, 144,7, 139,8, 137,8, 132,9, 127,9, 126,8, 125,0, 124,2,
123,8, 123,6, 122,6, 118,0, 112,7, 107,8, 87,4, 45,5, 42,1, 33,4, 27,9, 26,4, 25,5, 24,1.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (ESI): рассчитано для C25H27N2O2S ([M.Br]+) 419,1793, найдено 419,1788.
(4) Синтез N-гидроксисукцинимидильного эфира 109 9,4 мг (20 мкмоль) бромида 1-метил-4-[{3-(4карбоксибутилЩ^Щ-бензотиазолилидеЩметилЕинолиния (соединение 107) (FW 471,41), 4,6 мг (40 мкмоль) N-гидроксисукцинимида (соединение 108) (FW 115,09) и 7,6 мг (40 мкмоль) EDC (гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида) (FW 191,70) перемешивают в 1 мл ДМФА при температуре 25°С в течение 16 ч. Указанным образом получают N-гидроксисукцинимидильный эфир (соединение 109), в котором активирована карбоксильная группа красителя (соединение 107). Продукт указанной реакции не очищают и реакционный раствор (20 мМ красителя) используют для реакции с олигомерной ДНК (олигонуклеотидом) 105 без дальнейшей обработки.
Кроме того, бромид 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксобутил)бензо[d]тиазол-2(3H)-илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью), число атомов углерода n в которой равно 3, синтезируют тем же способом, который используют для соединения 109, за исключением того, что соединение с линкерной группой (полиметиленовой цепью), имеющей различное число атомов углерода, используют в качестве исходного вещества вместо соединения 107. Кроме того, аналогичным образом синтезируют бромид 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксогексил)бензо[d]тиазол-2(3H)илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью), число атомов углерода n в которой равно 5, и бромид 4-((3-(4-(сукцинимидилокси)-4-оксогептил)бензо[d]тиазол-2(3H)илиден)метил)-1-метилхинолиния с линкерной группой (полиметиленовой цепью), число атомов углерода n в которой равно 6.
(5) Синтез олигомера ДНК (олигонуклеотида) 110, модифицированного двумя молекулами тиазолового оранжевого.
Олигомер ДНК (олигонуклеотид) 105, имеющий две активные аминогруппы, синтезируют обычным способом с использованием автоматического синтезатора ДНК так же, как в примере синтеза промежуточного соединения 4. Далее данный олигомер ДНК (олигонуклеотид) 105 вводят во взаимодействие с N-гидроксисукцинимидильным эфиром (соединение 109), при этом получают олигомер ДНК (оли
- 45 032769 гонуклеотид) 110, который представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, имеющей в двух местах одной молекулы структуры, полученные из тиазолового оранжевого. В частности, вначале смешивают вместе 30 мкл олигомера ДНК 105 (с концентрацией цепи 320 мкМ), 10 мкл буферного раствора Na2CO3/NaHCO3 (1 M, рН 9,0) и 60 мкл Н2О. Затем добавляют раствор (20 мМ) N-гидроксисукцинимидильного эфира (соединение 109) в 100 мкл ДМФА и хорошо перемешивают. Раствор оставляют на 16 час при температуре 25°С. Затем добавляют 800 мкл H2O, пропускают через фильтр с размером пор 0,45 мкм и очищают методом ВЭЖХ с обращенной фазой (CHEMCOBOND 5-ODS-H 10x150 мм, 3 мл/мин, 5-30% CH3CN/50 мМ, ТЕАА буфер (20 мин), проводят детектирование при 260 нм).
Пример 1.
3'-конец олигомера ДНК 110 (Е-зонда), который представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, синтезированную в приведенном выше примере синтеза молекулы нуклеиновой кислоты, химически модифицирован фосфатной группой или C3-линкерной группой ОН (3-гидроксипропильной группой), чтобы предотвратить реакцию удлинения. Указанным образом синтезируют зонды на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонды) по настоящему изобретению. Химическую модификацию с C3-линкерной ОН группой осуществляют с помощью 3'-Spacer C3 CPG (торговая марка продукта компании Glen Research). Химическую модификацию и удаление защитной группы (CPG-носителя) проводят в тех же самых условиях, что и в обычном фосфорамидитном способе с использованием автоматического синтезатора ДНК. Химически модифицированные олигомеры ДНК подвергают реакции ПЦР. В результате, олигомер ДНК, химически модифицированный фосфатной группой, слегка удлиняется в реакции ПЦР, в то время как удлинение практически не наблюдается в олигомере ДНК, химически модифицированном C3-линкерной группой ОН (см. фиг. 2).
Реакцию ПЦР осуществляют с помощью системы проведения ПЦР в реальном режиме времени CFX96 (Bio-Rad) с использованием реагента AmpliTaqGold Master Mix (Life Technologies) указанным далее образом (образец, содержащий матричную ДНК: 5 мкл, растворы праймеров (10 мкМ): 2,5 мкл каждый, раствор Е-зонда (2 мкМ): 2,5 мкл, общий объем реакционного раствора: 25 мкл). В качестве последовательностей праймеров используют 5'-CCTCACAGCAGGGTCTTCTC-3' (SEQ ID NO: 1) и 5'CCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3' (SEQ ID NO: 2). В качестве матрицы используют плазмидную ДНК (SEQ ID NO: 3), которая кодирует последовательность EGFR Exon21. В качестве мутанта используют мутант L858R (SEQ ID NO: 4).
5' TGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGG
GTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGC
AGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAA ACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTA GGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACT-3' (SEQ ID NO: 3)
5' AGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCT
CACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCG
CGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGG GCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAG GTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGT ATTGTTTAACACATGCAGGGGAGGATGCTCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 4)
В качестве Е-зонда для обнаружения используют 5'-AGATTTTGGGCZGGCCAAACTG-X-3' (SEQ ID NO: 5) (Z означает dT, в который введены метки красителя, проявляющего экситонный эффект, а X означает фосфатную группу или C3-линкерную ОН группу). Условия проведения ПЦР следующие. Вначале проводят термическую денатурацию при 95°С в течение 10 мин, а затем цикл термической денатурации при температуре 95°С в течение 12 с, отжига при 56°С в течение 30 с и реакции удлинения при 72°С в течение 12 с повторяют в общей сложности в течение 50 циклов. Анализ кривой плавления продукта амплификации по отношению к интенсивности флуоресценции проводят с использованием программного продукта CFX Manager Software версии 1.6. Анализ кривой плавления проводят в диапазоне температур от 30°С до 95°С со скоростью повышения температуры 0,1°С/с.
На фиг. 2 приведены графики, иллюстрирующие влияние на анализ кривой плавления разницы в модификации 3'-конца в вышеуказанном измерении. На фиг. 2 горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает -dF/dT, т.е. дифференциал от величины флуоресценции (численное значение, полученное путем дифференцирования величины флуоресценции по отношению к температуре). На верхнем графике показан анализ кривой плавления в случае химической модификации фосфорной кислотой, и приблизительно при 80°С наблюдается пик, который, как считают, является результатом удлинения, вызванной удалением фосфорной кислоты. На нижнем графике показан анализ кривой плав
- 46 032769 ления в случае химической модификации линкерной группой ОН, а пик приблизительно при 80°С не наблюдается. На кривых представлены, сверху, результаты, полученные в тех случаях, когда образец, включающий матричную ДНК, содержит: 100% ДНК дикого типа; 50% ДНК дикого типа и 50% ДНК мутантного типа; и 100% ДНК мутантного типа.
Пример 2.
3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты (олигомера ДНК 110) химически модифицирован таким же образом, как и в примере 1, чтобы синтезировать каждый зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонд). В качестве контроля также используют зонд на основе нуклеиновой кислоты (Е-зонд), в котором 3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты (олигомера ДНК 110) не был химически модифицирован. Эффективность обнаружения проверяют, меняя положения, содержащие экситонную метку в каждом Е-зонде, и положения мутантного участка относительно положения метки. В результате показано, что чувствительность обнаружения была улучшена за счет конструирования Езонда таким образом, чтобы он удовлетворял следующим условиям.
(1) В Е-зонде метку вводят в основание, которое находится в положении, отстоящем по меньшей мере на три основания внутрь от каждого конца Е-зонда (см. фиг. 3 и 4).
(2) В последовательности-мишени, включающей мутацию (участок ошибочного спаривания оснований), участок ошибочного спаривания оснований находится в положении, отстоящем по меньшей мере на четыре основания внутрь от каждого конца области, с которой гибридизуется Е-зонд.
(3) В том случае, когда требуется получить различие в обнаружении интенсивности пика между последовательностью, которая не имеет мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), и последовательностью, которая имеет мутацию в последовательности-мишени (ошибочное спаривание оснований), за счет содержащего метку положения в Е-зонде, мутантный участок находится в положении, отстоящем по меньшей мере на четыре основания от основания, которое должно спариваться с содержащим метку основанием в Е-зонде, а когда не требуется получить различие, то мутантный участок находится в положении, отстоящем на три или менее оснований от основания, которое должно спариваться с содержащим метку основанием в Е-зонде (см. фиг. 5 и 6).
В экспериментах, показанных на фиг. 3, 4 и 6, используют следующие последовательности. Каждый из десяти Е-зондов конструируют путем введения метки красителя в основание последовательности, содержащей 20 пар оснований. В полученных таким образом десяти Е-зондах положение содержащего метку основания соответствует ближайшему основанию (Z означает dT, в который введена метка красителя, проявляющего экситонный эффект).
NO:
NO:
NO:
NO:
NO:
NO:
NO:
NO:
NO:
20 nap оснований ЕХ2 0 5’ '-ZGTGTATCTTTCTCTTTCTC-3’ (SEQ
6)
20 nap оснований ЕХ18 5’ '-TGZGTATCTTTCTCTTTCTC-3’ (SEQ
! ) 20 Q \ nap оснований ЕХ16 5’ '-TGTGZATCTTTCTCTTTCTC-3’ (SEQ
o ) 20 nap оснований ЕХ14 5’ '-TGTGTAZCTTTCTCTTTCTC-3’ (SEQ
У ) 20 nap оснований ЕХ12 5’ '-TGTGTATCZTTCTCTTTCTC-3’ (SEQ
10)
20 nap оснований ЕХ10 5’ '-TGTGTATCTTZCTCTTTCTC-3’ (SEQ
11)
20 nap оснований ЕХ8 5’ -TGTGTATCTTTCZCTTTCTC-3 ’ (SEQ
12)
20 nap оснований ЕХ6 5’ -TGTGTATCTTTCTCZTTCTC-3’ (SEQ
13)
20 nap оснований ЕХ4 5’ -TGTGTATCTTTCTCTTZCTC-3’ (SEQ
14)
20 nap оснований ЕХ2 5’ -TGTGTATCTTTCTCTTTCZC-3’ (SEQ
ID
ID
ID
ID
ID
ID
ID
ID
ID
ID
В качестве последовательностей ДНК, комплементарных Е-зонду, конструируют последовательность с полным совпадением нуклеотидов и последовательности, в каждой из которых имеется ошибочно спаривание в 4 основании, 9 основании, 11 основании или 16 основании от 5'-конца.
Полное совпадение нуклеотидов
EX_TM.rdm_885. full 5 ’ -GAGAAAGAGAAAGATАСАСА-3 ’ (SEQ ID NO:
16)
- 47 032769
Ошибочное спаривание оснований
4-е основание: С, G, Т
ЕХ ТМ . rdm 885.m4 с 5' -GAGcAAGAGAAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
17)
ЕХ ТМ. rdm 885.m4 _g 5' -GAGgAAGAGAAAGATACACA-3 ’ (SEQ ID NO
18)
ЕХ ТМ. rdm 885.m4 _t 5' -GAGtAAGAGAAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
19)
9-е основание: С, А, Т
EX TM.rdm 885.m9 a 5’-GAGAAAGAaAAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
20) EX TM.rdm 885.m9 c 5’-GAGAAAGAcAAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
21) EX_TM.rdm_8 8 5.m9_t 5’-GAGAAAGAtAAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
22) 10-е основание: C, G, T EX TM.rdm 8 8 5. ml 0 c 5'-GAGAAAGAGcAAGATACACA-3 ' (SEQ ID NO
23) EX_TM.rdm_8 8 5.ml0_g 5’-GAGAAAGAGgAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
24) EX_TM.rdm_8 8 5.ml0_t 5’-GAGAAAGAGtAAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
25) 11-е основание: C, G, T EX_TM.rdm_8 8 5.mll_c 5’-GAGAAAGAGAcAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
26) EX_TM.rdm_8 8 5.mll_g 5’-GAGAAAGAGAgAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
27) EX TM.rdm 885.mil t 5’-GAGAAAGAGAtAGATACACA-3’ (SEQ ID NO
28)
16-е основание: С, G, Т
EX_ TM.rdm _885.ml6_ c 5’ -GAGAAAGAGAAAGATcCACA-3’ (SEQ ID NO
29)
EX TM.rdm 885.ml6 5’ -GAGAAAGAGAAAGATgCACA-3’ (SEQ ID NO
30)
EX TM.rdm 885.m!6 t 5’ -GAGAAAGAGAAAGATtCACA-3’ (SEQ ID NO
31)
Приведенные на фиг. 3, 4, 6 и 11 эксперименты с кривой плавления осуществляют в следующих условиях. Интенсивность флуоресценции и кривые плавления двойных цепей нуклеиновых кислот анализируют с использованием прибора Bio-Rad Laboratories CFX96. На фиг. 3, 4 и 6 по 1 мМ каждого Е-зонда и ДНК, комплементарной Е-зонду, растворяют в буферном растворе, содержащем 980 мМ NaCl, 10 мМ Na2HPO4 и 0,1 мМ Na2EDTA. На фиг. 11 1 мМ Е-зонда растворяют в буферном растворе. Указанным образом получают каждый из образцов для проведения измерений. Образец нагревают до 95°С, выдерживают при указанной температуре в течение 5 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры. Анализ кривой плавления проводят, измеряя испускаемый свет при 530 нм с использованием возбуждающего света 510 нм, при этом образец выдерживают при температуре 4°С в течение 30 с, а затем нагревают от температуры 4 до 95°С со скоростью 0,1°С/с. После проведения измерений берут логарифмы полученных значений флуоресценции и анализируют каждую кривую плавления. В данной реакции реакция удлинения ДНК не наблюдается, поскольку ДНК-полимеразу не используют при проведении реакции. В связи с этим 3'-конец каждого Е-зонда, который используют в указанных экспериментах, не модифицируют химически фосфатной группой или C3-линкерной группы ОН. Кроме того, в том случае, когда используют Е-зонды, 3'-концы которых химически модифицированы фосфатной группой или C3
- 48 032769 линкерной группой ОН, получают те же самые результаты.
Условия реакции, приведенные на фиг. 5, следующие. Реакцию ПЦР осуществляют с помощью системы проведения ПЦР в реальном режиме времени LightCycler system (Roche Diagnostics) с использованием реагента AmpliTaqGold Master Mix (Life Technologies) указанным далее образом (образец, содержащий матричную ДНК: 5 мкл, растворы праймеров (10 мкМ): 2,5 мкл каждый, раствор Е-зонда (2 мкМ): 2,5 мкл, общий объем реакционного раствора: 25 мкл). В качестве последовательностей праймеров используют последовательности 5'-TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 33), а в качестве матрицы используют плазмидную ДНК (SEQ ID NO: 34), которая кодирует последовательность Kras. В качестве мутанта используют мутант G12D (SEQ ID NO: 35), имеющий мутацию в кодоне 12 (в дальнейшем означают как мутант Codon 12 G12D).
5' CAAACTTACAGGGGCTCGACGAGCTAGGTTCCCGGACACGACAAAGGCGGCCGCGGGAATTGC
G Т Т G GAG GAG Τ T T G ΤAAATAAAG ΤACAG T T CAT TAC GATACAC G T С T G CAG T СAAC T G GAAT T
ΤTCATGATTGAATΤΤTGTAAGGTATΤΤTGAAATAATΤΤΤTCATATAAAGGTGAGΤΤTGTATTA
AAAG GTACTGGTG GAG TATTTGATAGTGTAT TAAC CTTATGTGT GACAT GTTCTAATATAGTC
ACAT Τ Τ T CAT TAT Τ Τ T TAT TATAAGGCС T GC T GAAAAT GAC T GAATATAAAC Τ T GT GGTAGΤ T
GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGAC GAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCAT T C Τ Τ T GATACAGATAAAG GTTTCTCT GAC CAT Τ Τ T CAT GAG TAC Τ TAT TACAAGATAAT TAT G С T GAAAG Τ TAAG Τ TAT С T GAAAT GTACCTTGGGTTT CAAG Τ TATAT G TAAC CATTAATATGGG AACTTTACTTTCCTTGGGAGTATGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCAT ATGGGAGAGCTCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCT TGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACATTTCCACACA CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCTCAATGAGTGAGCTAACTCACATT ATTGCGTTGCGCTCACTGCC-3' (SEQ ID NO: 34)
5' TACCTCTAGGGACGCCGAATCACGCGGTATCCCGGCCGCCATAGAGACGGCCGCGGGAATTCG
AT T G GAG GAG Τ Τ T G TAAATAAAG TACAG Τ T CAT TAC GATACAC G T С T G CAG T C AAC T G GAATT
ΤTCATGATTGAATΤΤTGTAAGGTATΤΤTGAAATAATΤΤΤTCATATAAAGGTGAGΤΤTGTATTA
AAAG GTACTGGTG GAG TATTTGATAGTGTAT TAAC CTTATGTGT GACAT GTTCTAATATAGTC
ACAT Τ Τ T CAT TAT Τ Τ T TAT TATAAGGCС T GC T GAAAAT GAC T GAATATAAAC Τ T GT GGTAGΤ T
GGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGAC GAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCAT T C Τ Τ T GAT AC AGAT AAAG GTTTCTCT GAC CAT Τ Τ T CAT GAG TAC Τ TAT TACAAGATAAT TAT G С T GAAAG Τ TAAG Τ TAT С T GAAAT GTACCTTGGGTTT CAAG Τ TATAT G T AAC CATTAATATGGG AACTTTACTTTCCTTGGGAGTATGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCAT ATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGC TTGGGCGTAATCATGGTCATAGC-3' (SEQ ID NO: 35)
В качестве Е-зонда используют 5’-AGCTGGTGGCGZAG-3' (SEQ ID NO: 36) в системе, где также должна быть обнаружена мутация, а 5 ’-AGCTGGZGGCGTAG-3 ’ (SEQ ID NO: 37) используют в системе, в которой обнаружение мутации должно быть подавлено (Z означает dT, в которую введена метка красителя, проявляющего экситонный эффект, a G означает место мутации). Условия ПЦР следующие.
Проводят начальную термическую денатурацию при температуре 95°С в течение 10 мин, а затем цикл термической денатурации при 95°С в течение 12 с, отжига при 56°С в течение 30 с и реакции удлинения при 72°С в течение 12 с повторяют в общей сложности в течение 50 циклов. Интенсивность флуоресценции и кривые плавления продуктов амплификации анализируют с помощью программного продукта LightCycler Software версии 1.2.0.169. Анализ кривой плавления проводят, повышая температуру от 37 до 95°С со скоростью 0,1°С/с.
На фиг. 3 показаны кривые плавления (А, С) для Е-зонда и комплементарной ему последовательности и первичные дифференциальные кривые (В, D) кривых плавления, полученных в вышеуказанных измерениях. В том случае, когда метка присутствует на 5'-конце (А, В), кривые плавления не могут быть получены на основании флуоресценции, и, таким образом, маркировка в конце не пригодна. В том случае, когда метка присутствует в третьем основании от 5'-конца (С, D), кривые плавления можно получить на основе флуоресценции. На фиг. 3A и 3C горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикаль- 49 032769 ная ось означает величину интенсивности флуоресценции. На фиг. 3B и 3D на горизонтальной оси показана температура (°С), а вертикальная ось означает величину, полученную путем дифференцирования интенсивности флуоресценции по отношению к температуре.
На фиг. 4 приведены графики, иллюстрирующие соотношение между положением красителя и фактически измеренным значением свободной энергии связывания - прогнозируемым значением при проведении вышеуказанного измерения. В анализе используют последовательность с полным совпадением пар оснований или последовательность с ошибочным спариванием оснований в положении, отстоящем по меньшей мере на три основания от положения красителя. Прогнозируемое значение рассчитывают по методу ближайшего соседа с помощью параметров (в приведенной ниже табл. 1), которые определяют с использованием содержащей 11 пар оснований последовательности, в центре которой имеется краситель. На фиг. 4 горизонтальная ось указывает на расстояние (количество оснований) от 3'-конца до основания, к которому присоединены красители (флуоресцентные группы атомов), а вертикальная ось показывает фактически измеренное значение свободной энергии связывания - прогнозируемое значение. Как показано на фиг. 4, в случае, когда красители присутствуют во втором основании от 3'-конца, измеренная стабильность двойной спирали ниже, чем прогнозируемое значение.
Таблица 1
Параметры, используемые для прогноза по методу ближайшего соседа
Ближайший сосед (от 5’ до З’/от 3’ до 5’) ΔΔΗ° (ккал/моль) ДДЭ0 (кал/моль*К) ΔΔΘ°37 (ккал/моль) ΔΔΘ°θο (ккал/моль)
полное совпадение нуклеотидов
ате/ат -1.8 ± 1.7 -1.2 ±3.0 -1.4 ±0.4 -1.3 ±0.2
cte/ag 1.4 ± 1.3 8.4 ± 2.2 -1.2 ± 0.4 -1.6 ± 0.3
gte/ac 10.6 ± 1.3 34.6 ± 2.3 -0.5 ± 0.4 -1.4 ± 0.2
тте/аа -0.1 ± 1.4 3.9 ± 2.3 -1.3 ±0.4 -1.4 ± 0.2
теа/та -5.4 ± 1.6 -11.0 ±2.7 -1.8 ±0.4 -1.5 ± 0.2
tec/ga 6.7 ±1.5 24.4 ± 2.5 -0.9 ± 0.4 -1.3 ±0.3
teg/ca 8.3 ± 1.3 29.0 ± 2.2 -0.8 ± 0.4 -1.2 ±0.2
тет/аа 0.4 ±1.3 3.4 ± 2.3 -0.9 ± 0.4 -1.7 ±0.2
ошибочное спаривание оснований ТЕ*С
ате/ст 5.4 ± 1.3 19.1 ±2.3 -0.7 ± 0.2 -0.9 ± 0.2
cte/cg -8.1 ± 1.3 -21.2 ±2.2 -1.4 ±0.5 -1.2 ± 0.2
gte/cc -4.5 ± 2.0 -9.7 ± 3.5 -1.3 ± 0.3 -1.3 ± 0.3
тте/са -4.4 ± 1.6 -8.3 ± 2.9 -1.9 ±0.4 -1.7 ± 0.3
теа/тс -1.3 ± 1.3 -0.3 ± 2.1 -1.5 ± 0.3 -1.4 ± 0.3
teg/cc 6.7 ±1.6 25.0 ± 2.9 -1.0 ±0.4 -1.7 ± 0.3
tec/gc -10.3 ± 1.4 -28.5 ± 2.6 -1.3 ± 0.3 -1.0 ± 0.2
тет/ас -6.6 ± 1.9 -16.3 ±3.3 -1.6 ±0.3 -1.0 ± 0.4
ошибочное спаривание оснований T^*G
ATe/GT 2.4 ±1.0 9.4 ± 1.8 -0.6 ± 0.3 -0.7 ± 0.2
CTe/GG -2.5 ± 1.4 -3.1 ± 2.4 -1.5 ±0.5 -1.5 ± 0.3
GTe/GC 1.2 ± 1.3 6.8 ± 2.3 -1.4 ± 0.2 -0.8 ± 0.3
tte/ga -5.0 ± 1.6 -11.3 ±2.7 -1.2 ± 0.4 -1.5 ± 0.3
tea/tg 8.3 ± 1.1 29.9 ± 1.8 -1.0 ± 0.2 -1.6 ± 0.2
tec/gg -12.4 ± 1.3 -35.3 ± 2.3 -1.5 ±0.4 -0.9 ± 0.2
teg/cg 6.1 ± 1.6 22.7 ± 2.7 -0.7 ± 0.5 -0.8 ± 0.2
tet/ag -6.0 ± 1.3 -15.6 ± 2.2 -1.5 ±0.4 -1.1 ± 0.3
ошибочное спаривание оснований τΕ·τ
ate/tt 0.7 ± 1.2 7.1 ±2.1 -1.4 ± 0.3 -1.5 ± 0.2
cte/tg -0.7 ± 1.3 3.6 ±2.3 -1.7 ± 0.3 -1.6 ± 0.2
gte/tc 6.5 ± 1.6 23.1 ±2.8 -0.8 ± 0.3 -1.5 ± 0.3
tte/ta -6.7 ± 1.6 -16.0 ± 2.8 -2.2 ± 0.3 -1.8 ± 0.2
tea/tt 4.3 ± 1.6 18.6 ± 2.8 -1.9 ± 0.4 -2.0 ± 0.3
tec/gt -2.9 ± 1.3 -3.6 ± 2.3 -1.6 ± 0.3 -1.5 ± 0.3
teg/ct 2.6 ± 1.5 11.5 ±2.7 -1.0 ±0.4 -1.4 ± 0.2
tet/at -4.2 ± 1.2 -8.8 ± 2.1 -1.6 ± 0.3 -1.5 ± 0.2
На фиг. 5 приведены графики, иллюстрирующие анализ кривой плавления в том случае, когда положение красителя отличается между теми же самыми последовательностями в вышеуказанном измерении. Верхний график показывает результат, полученный по отношению к 5 '-AGCTGGTGGCGZAG-3 ' (SEQ ID N0: 38) , а нижний график показывает результат, полу- 50 032769 ченный по отношению к 5 ’ -AGCTGGZGGCGTAG-3 ' (SEQ ID NO: 39) означает положение красителя, G означает положение, которое должно спариваться с мутантным участком). На верхнем графике Z и G отстоят по меньшей мере на четыре основания друг от друга. На нижнем графике Z и G отстоят на три или менее оснований друг от друга.
На фиг. 5 горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает -dF/dT, т.е. дифференциальное значение величины флуоресценции (численное значение, полученное путем дифференцирования значения флуоресценции по отношению к температуре).
На фиг. 6 показан график, иллюстрирующий зависимость между расстоянием (числом оснований) между красителем и участком ошибочного спаривания оснований и высотой пика кривой плавления в вышеуказанном измерении. На фиг. 6 горизонтальная ось означает расстояние (число оснований) между красителем и участком ошибочного спаривания оснований, а вертикальная ось означает высоту пика на кривой плавления. Как показано на фиг. 6, установлено, что высота пика низкая в том случае, когда расстояние между красителем и участком ошибочного спаривания оснований составляет два основания или менее.
Пример 3.
3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты (олигомер ДНК 110) химически модифицирован таким же образом, как и в примере 1, чтобы синтезировать каждый зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонд). В данном примере показано, что, когда в реакционную систему ПЦР добавляют Е-зонд с полным совпадением нуклеотидов, то Е-зонд гибридизуется с областью-мишенью матричной последовательности, в результате чего достигается эффект сращивания, подавляющий амплификацию последовательности, которая включает указанную область. В то же время с матрицей, имеющей несоответствие в спаривании оснований с Е-зондом, Е-зонд слабо гибридизуется, так что эффект сращивания не наблюдается. Таким образом, показано, что последовательность мутантного типа, которая присутствует в небольшом количестве, может быть легко обнаружена путем осуществления обогащения последовательности мутантного типа за счет реакции амплификации с использованием Е-зонда дикого типа. Реакцию проводят следующим образом. Во-первых, ПЦР осуществляют с помощью системы CFX96 (Bio-Rad) проведения ПЦР в реальном времени с использованием реагента AmpliTaqGold Master Mix (Life Technologies) указанным далее образом (образец, содержащий матричную ДНК: 5 мкл, растворы праймеров (10 мкМ): 2,5 мкл каждый, раствор Е-зонда (2 мкМ): 2,5 мкл, общий объем реакционного раствора: 25 мкл). Условия ПЦР следующие. Проводят начальную термическую денатурацию при температуре 95°С в течение 10 мин, а затем цикл термической денатурации при 95°С в течение 12 с, отжига при 56°С в течение 30 с и реакции удлинения при 72°С в течение 12 с повторяют в общей сложности в течение 50 циклов. В качестве последовательности праймеров используют 5'TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 33), а в качестве матрицы используют плазмидную ДНК, которая кодирует последовательность Kras. В качестве мутанта используют мутант Codon 12 G12D. В качестве Е-зонда для обнаружения используют 5'-GTZGGAGCTGGTGG-3' (SEQ ID NO: 40). Z означает dT, в который введены метки красителей, проявляющих экситонный эффект. Интенсивность флуоресценции и кривые плавления продуктов амплификации анализируют с помощью программного продукта CFX Manager Software версии 1.6. Анализ кривой плавления проводят, повышая температуру от 30°С до 95°С со скоростью 0,1°С/с. В качестве контроля проводят анализ кривой плавления в системе, в которой Е-зонд не добавлен, таким же образом, как указано выше, сразу же после добавления 2,5 мкл раствора Е-зонда (2 мкМ).
На фиг. 7 показан результат анализа кривой плавления для подтверждения эффекта сращивания в вышеуказанном измерении.
Правый график показывает кривые плавления, полученные, когда Е-зонд заранее добавляют в реакционную систему ПЦР, чтобы проверить эффект сращивания. Левый график показывает кривые плавления, полученные, когда Е-зонд добавляют после реакции ПЦР. И на правом графике, и на левом графике, которые приведены на фиг. 7, горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает значение, полученное путем дифференцирования интенсивности флуоресценции от температуры. Как показано на фиг. 7, если добавлять Е-зонд заранее, то пик мутации явно возрастает.
Пример 4.
3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты (олигомер ДНК 110) химически модифицирован таким же образом, как и в примере 1, чтобы синтезировать каждый зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонд). В данном примере, как и в примере 3, показано, что, когда в реакционную систему ПЦР добавляют Е-зонд с полным совпадением нуклеотидов, то Е-зонд гибридизуется с областью-мишенью матричной последовательности, в результате чего достигается эффект сращивания, подавляющий амплификацию последовательности, которая включает указанную область. Как и в примере 3, с матрицей, имеющей несоответствие в спаривании оснований с Е-зондом, Е-зонд слабо гибридизуется, так что эффект сращивания не наблюдается. Таким образом, показано, что последовательность мутантного типа, которая присутствует в небольшом количестве, можно легко обнаружить, осуществляя обогащение последовательности мутантного типа за счет реакции амплификации с использованием Е
- 51 032769 зонда дикого типа. Кроме того, в настоящем примере подтверждают эффект, который получают путем конструирования Е-зонда с полным совпадением нуклеотидов так, что последовательность, с которой гибридизуется праймер, используемый в методе ПЦР, конкурирует (является близкой или совпадает) с последовательностью-мишенью, с которой гибридизируется Е-зонд с полным совпадением нуклеотидов. Таким образом, путем разработки Е-зонда с полным совпадением нуклеотидов, с целью вызвать вышеуказанную конкуренцию, реакция удлинения от праймера протекает с трудом или вовсе не происходит, так что эффект обогащения, вызванный эффектом сращивания, может быть дополнительно усилен.
Реакцию по настоящему примеру проводят следующим образом. Вначале осуществляют ПЦР с помощью системы проведения ПЦР в реальном времени RotorGeneQ (торговое название продукта компании Qiagen) с использованием реагента Genotyping Master Mix (торговое название продукта компании Roche) указанным далее образом (образец, содержащий матричную ДНК: 5 мкл, растворы праймеров (100 мкМ): 0,2 мкл (обращенный) и 1 мкл (прямой), раствор Е-зонда (2 мкМ): 2 мкл, общий объем реакционного раствора: 20 мкл). Условия ПЦР следующие. Проводят начальную термическую денатурацию при температуре 95°С в течение 10 мин, а затем цикл термической денатурации при 95°С в течение 12 с, отжига при 63°С в течение 15 с и реакции удлинения при 72°С в течение 12 с повторяют в общей сложности в течение 50 циклов. В качестве последовательностей праймеров используют 5'TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 33), а в качестве матрицы используют плазмидную ДНК, которая кодирует последовательность Kras. В качестве мутанта используют мутант Codon 12 G12D. В качестве Е-зондов для обнаружения используют 5'-TTGGAGCTGGTGGCGZAGGCAA-C3-3' (SEQ ID NO: 41) (общий Е-зонд) и 5'-CTCZTGCCTACGCCACCAG-C3-3' (SEQ ID NO: 42) (конкурентный Е-зонд). Z означает dT, в который введены флуоресцентные группы атомов (метки красителей), проявляющие экситонный эффект. Общий Е-зонд не конкурирует с последовательностью праймера, поскольку общий Е-зонд находится в положении, где не возникают конкурентные отношения с последовательности праймера, а значение Tm общего Е-зонда ниже, чем у последовательности праймера. Напротив, конкурентный Е-зонд конкурирует с последовательностью праймера, поскольку конкурентный Езонд находится в положении, где возникают конкурентные отношения с последовательностью праймера, а значение Tm конкурентного Е-зонда выше, чем у последовательности праймера. Анализ интенсивности флуоресценции и плавления с высоким разрешением продукта амплификации проводят с помощью программного продукта RotorGene QSoftware, версия 2.0.2 (Build 4). Плавление с высоким разрешением осуществляют, повышая температуру от 40 до 95°С со скоростью 0,5°С/4 с. В качестве контроля анализ плавления с высоким разрешением в системе, в которую не добавляют Е-зонд, проводят таким же образом, как указано выше, сразу же после добавления 2 мкл раствора Е-зонда (2 мкМ).
На фиг. 8 приведены графики, иллюстрирующие результаты анализа кривой плавления с высоким разрешением при использовании общего Е-зонда. На левом графике фиг. 8 приведен результат в том случае, когда Е-зонд не добавляют в реакционную систему ПЦР и когда Е-зонд добавляют после проведения реакции ПЦР, а на правом графике показан результат в случае, когда Е-зонд добавляют в реакционную систему ПЦР. На каждом из графиков вертикальная ось означает разность относительных значений флуоресценции, при этом чем меньше числовое значение на вертикальной оси, тем больше степень амплификации (обогащения) последовательности нуклеиновой кислоты. На графиках цифра 1 означает результат реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с WT: 12GAT = 100:0 (мутация отсутствует, 100% дикий тип). Цифра 2 означает результат реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с WT: 12GAT = 95:5 (5% мутанта Godon 12 G12D). Цифра 3 означает результат реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с WT: 12GAT = 90:10 (10% мутанта Godon 12 G12D). Цифра 4 означает результат реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с WT: 12GAT = 50:50 (50% мутанта Godon 12 G12D). Каждый из результатов, обозначенных цифрами с 1 по 4, получают, проводя три раза реакцию и анализ в тех же условиях для одних и тех же матриц. В таблице, которая приведена ниже графиков, доверительность в вес. (%) означает статистическую достоверность определения в качестве дикого типа, и когда эта величина мала, то можно определить, что присутствие мутанта статистически значимо. Как показано на фиг. 8, данные, касающиеся плавления с высоким разрешением, явно указывают на то, что мутантная последовательность нуклеиновой кислоты обогащается в том случае, когда Е-зонд добавляют в реакционную систему ПЦР (правый график), по сравнению с тем случаем, когда Е-зонд не добавлен в реакционную систему ПЦР (левый график).
На фиг. 9 показан график, иллюстрирующий результаты анализа плавления с высоким разрешением в том случае, когда в реакционную систему ПЦР добавлен конкурентный Е-зонд. На фиг. 9 вертикальная ось означает разность относительных значений флуоресценции, при этом, чем меньше числовое значение на вертикальной оси, тем больше степень амплификации (обогащения) последовательности нуклеиновой кислоты. На графике кривые, обозначенные незакрашенными треугольниками (Л), показывают результаты (результаты анализа плавления с высоким разрешением) реакции с использованием матрицы WT (плазмидной ДНК) (мутация отсутствует, 100% дикий тип). Кривые, обозначенные незакрашенными ромбами (0), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 0,05% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные незакрашенными кружками (о), показывают результаты
- 52 032769 реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 0,10% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные незакрашенными квадратами (□), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 0,20% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные крестиками (х), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 0,50% мутанта Codon 12 G12D. Кривые без обозначений показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 1,00% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные закрашенными треугольниками (а) , показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 2,50% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные закрашенными ромбами (♦), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 5% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные закрашенными кружками (·), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 10% мутанта Codon 12 G12D. Кривые, обозначенные закрашенными квадратами (), показывают результаты реакции с использованием матриц (плазмидных ДНК) с 50% мутанта Codon 12 G12D. Для одних и тех же матриц реакцию и анализ проводят по три раза в тех же самых условиях. В таблице в нижней части графика доверительный интервал означает статистическую достоверность определения в качестве дикого типа, при этом, когда указанная величина мала, то может быть определено, что мутант присутствует статистически значимо. Как показано на фиг. 8, конкурентный Е-зонд вызывает более эффективное подавление амплификации последовательности дикого типа за счет конкурентного эффекта с последовательностью праймера, по сравнению с общим Е-зондом.
Пример 5.
3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты (олигомер ДНК 110) химически модифицирован таким же образом, как и в примере 1, чтобы синтезировать каждый зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонд). В данном примере классификацию (идентификацию) мутации проводят с помощью Е-зонда дикого типа, используя анализ кривой плавления. В частности, значения Tm Езондов, используемых в данном примере, немного отличаются друг от друга в зависимости от последовательности, у которой с зондом есть несовпадения нуклеотидов. Показано, что с помощью этой разницы могут быть идентифицированы последовательности-мишени, содержащие участки ошибочного спаривания оснований. Как указано выше, из области техники известно, что для классификации (идентификации) необходимы детекторные зонды, соответствующие обнаруживаемым мутациям. Тем не менее, показано, что в соответствии с Е-зондом по настоящему изобретению, классификация (идентификация) последовательности оснований мутантного типа может быть осуществлена с использованием последовательности дикого типа.
Реакцию по настоящему примеру проводят следующим образом. Вначале осуществляют ПЦР с помощью системы проведения ПЦР в реальном времени RotorGeneQ (торговое название продукта компании Qiagen) с использованием реагента Genotyping Master Mix (торговое название продукта компании Roche) указанным далее образом (образец, содержащий матричную ДНК: 2,5 мкл, растворы праймеров (100 мкМ): 0,02 мкл (обращенный) и 0,1 мкл (прямой), раствор Е-зонда (4 мкМ): 1 мкл, общий объем реакционного раствора: 10 мкл). Условия ПЦР следующие. Проводят начальную термическую денатурацию при температуре 95°С в течение 10 мин, а затем цикл термической денатурации при 95°С в течение 12 с, отжига при 63°С в течение 15 с и реакции удлинения при 72°С в течение 12 с повторяют в общей сложности в течение 50 циклов. В качестве последовательностей праймеров используют 5'TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 33), а в качестве матрицы используют плазмидную ДНК, которая кодирует последовательность Kras. В качестве мутанта используют мутант G12S, содержащий мутацию в кодоне 12 (далее означают как мутант Codon 12 G12S) и мутант G13D. В качестве Е-зонда для обнаружения используют 5'-CTCZTGCCTACGCCACCAG-C3-3' (SEQ ID NO: 42) (конкурентный Е-зонд). Z означает dT, в который введены метки красителей, проявляющих экситонный эффект. Анализ интенсивности флуоресценции и анализ плавления с высоким разрешением продукта амплификации проводят с помощью программного продукта RotorGene QSoftware, версия 2.0.2 (Build 4). Плавление с высоким разрешением осуществляют, повышая температуру от 40 до 95°С со скоростью 0,5°С/4 с.
Результаты измерений показаны на графике, представленном на фиг. 10. На фиг. 10 горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает -dF/dT, т.е. дифференциальное значение величины флуоресценции (численное значение, полученное путем дифференцирования величины флуоресценции по отношению к температуре). Для одних и тех же матриц реакцию и анализ проводят по три раза в тех же самых условиях. В данном примере, как показано на фиг. 10, G12S (Tm: 57,5°С) и G13D (Tm: 54,8°С) могут быть точно классифицированы (идентифицированы) с использованием Е-зонда дикого типа на основе разницы в значении Tm, по сравнению с Е-зондом дикого типа, благодаря имеющимся участкам ошибочного спаривания оснований.
Пример 6.
В данном примере последовательность-мишень, которая содержится в двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, обнаруживают с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонда).
- 53 032769
Вначале синтезируют Е-зонд (HCV_1b.Cf. 188-13. E6), имеющий последовательность 5 ’-TCTTGGAZ.CAACC-3 ' (SEQ ID N0: 43) , с ПОМОщЬЮ автоматического синтезатора ДНК в тех же условиях, что и в обычном фосфорамидитном способе (Z означает dT, в который введена метка красителя, проявляющего экситонный эффект). В качестве матрицы смысловой цепи ДНК ((смысловой) ДНК) используют HCV_1b.Of.209-48 (SEQ ID NO: 44), а в качестве матрицы антисмысловой цепи ДНК ((антисмысловой) ДНК) используют комплементарную ей последовательность HCV_1b.Or. 162-48 (SEQ ID NO: 45). В приведенной ниже последовательности SEQ ID NO: 44 ((антисмысловая) ДНК) подчеркнутый участок означает последовательность-мишень, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты Е-зонда (SEQ ID NO: 43). В приведенной ниже последовательности SEQ ID NO: 45 ((смысловая) ДНК) подчеркнутый участок означает последовательность (ту же самую последовательность, что и в Езонде), комплементарную последовательности-мишени.
5'-ACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTG-3' (SEQ ID N0: 44)
5'-CAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGT-3' (SEQ ID NO: 45)
0,5 мкМ Е-зонда (SEQ ID NO: 43), 0,5 мкМ (смысловая) ДНК (SEQ ID NO: 44) и 0,5 мкМ (антисмысловая) ДНК (SEQ ID NO: 45) растворяют в буферном растворе (50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ TrisHCl, pH 8,3). Указанным образом получают образец для измерений. Указанный образец для измерения нагревают до 95°С и выдерживают при указанной температуре в течение 1 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры. Затем измеряют свет, испускаемый при 530 нм, используя возбуждающий свет 510 нм, при этом образец выдерживают при температуре 25°С в течение 30 с, а затем нагревают его от 25 до 95°С. Рассчитывают дифференциальные значения величины флуоресценции по отношению к температуре и анализируют каждую кривую плавления. Интенсивность флуоресценции и кривые плавления трехцепочечной нуклеиновой кислоты анализируют с использованием прибора Agilent Technologies MX3000. В качестве контроля образец, не содержащий матричную нуклеиновую кислоту и содержащий только Е-зонд, подвергают анализу кривой плавления таким же образом, как указано выше.
Результаты анализа кривой плавления показаны на графике, приведенном на фиг. 11. На фиг. 11 горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает -dF/dT, т.е. дифференциальное значение величины флуоресценции (численное значение, полученное путем дифференцирования величины флуоресценции по отношению к температуре). На фиг. 11 графики в верхней части (закрашенные кружки (·)) показывают результаты анализа кривой плавления для образца, содержащего матричную ДНК с двойной цепью и Е-зонд. Графики в нижней части (закрашенные квадраты ()) показывают результаты анализа кривой плавления для образца, содержащего только Е-зонд и не содержащего матричную нуклеиновую кислоту. Для одного и того же образца реакцию и анализ проводят по три раза в одних и тех же условиях. Как видно из графиков в верхней части фиг. 11 (двухцепочечная матричная ДНК + Езонд), Е-зонд дает сильную флуоресценцию, даже когда матричная нуклеиновая кислота имеет две цепи. Напротив, на графиках в нижней части (только Е-зонд) флуоресценция вообще не возникает. Таким образом, показано, что Е-зонд по настоящему изобретению может с высокой чувствительностью обнаружить последовательность-мишень, даже если матричная нуклеиновая кислота имеет две цепи.
Пример 7.
В данном примере показано, что зонд на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (Е-зонд) дает флуоресценцию даже тогда, когда содержащее метку основание, с которой связаны флуоресцентные группы атомов (красители), проявляющих экситонный эффект, не гибридизуются с последовательностью-мишенью.
Вначале синтезируют Е-зонд (ТЕ_ТМ_25Р.Of.1-25.Е23), имеющий последовательность 5'TTZCCTACCCACTTTTCTCCCATTT-3' (SEQ ID NO: 46), с помощью автоматического синтезатора ДНК в тех же самых условиях, что в обычном фосфорамидитном способе (Z означают dT, в который введены метки красителей, проявляющих экситонный эффект). В качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту (комплементарную цепь ДНК, содержащей последовательность, комплементарную частичной последовательности Е-зонда), ТЕ_ext_25P.Or.1-15 (SEQ ID NO: 47), которая содержит последовательность 5'-AAATGGGAGAAAAGT-3'. Последовательность оснований матричной нуклеиновой кислоты (15 оснований) комплементарна 15 основаниям в 3'-концевой части Е-зонда. В Е-зонде Z (dT, в который введены метки красителей, проявляющих экситонный эффект) отстоит на 8 оснований от последовательности, комплементарной матричной нуклеиновой кислоте.
1,0 мкМ Е-зонда (SEQ ID NO: 46) и 1,0 мкМ матричной нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 47) растворяют в буферном растворе (1,4 мМ dNTP, 20 мМ Tris-HCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 8 мМ MgSO4, 0,1% Tween-20, 10 мМ KCl). Указанным образом получают образец для измерений. Анализ кривой плавления проводят с использованием CFX96 (Bio-Rad Laboratories). В частности, вначале измеряют свет, излучаемый при 530 нм, используя возбуждающий свет 510 нм, при этом образец нагревают от 4 до 95°С. После измерения рассчитывают дифференциальные значения полученных величин флуоресценции по отношению к температуре и анализируют каждую кривую плавления. В данной реакции реакция удлинения
- 54 032769
ДНК не протекает, поскольку в реакции не используются никакие ДНК-полимеразы. По этой причине 3'конец каждого Е-зонда, который используют в указанных экспериментах, не модифицируют химически с помощью фосфатной группы или С3-линкерной ОН группы. Кроме того, в том случае, когда используют Е-зонды, 3'-концы которых химически модифицированы фосфатной группой или С3-мостиковой ОН группой, то получают же самые результаты. Образец, который получают таким же способом, как указано выше, за исключением того, что Е-зонд (SEQ ID NO: 46) растворяют в буферном растворе без добавления матричной нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 47), анализируют по методу кривой плавления таким же образом, как указано выше.
Результаты анализа кривой плавления показаны на графике, приведенном на фиг. 12. На фиг. 12 горизонтальная ось означает температуру (°С), а вертикальная ось означает -dF/dT, т.е. дифференциальное значение величины флуоресценции (численное значение, полученное путем дифференцирования величины флуоресценции по отношению к температуре). Кривые, обозначенные закрашенными квадратами (), показывают результаты анализа для образца, содержащего Е-зонд (SEQ ID NO: 46) и матричную нуклеиновую кислоту (комплементарную цепь ДНК, SEQ ID NO: 47).
Кривые, обозначенные закрашенными треугольниками (а), показывают результаты анализа для образца, содержащего только Е-зонд (SEQ ID NO: 46) и не содержащего матричную нуклеиновую кислоту (SEQ ID NO: 47). Для одного и того же образца реакцию и анализ проводят по три раза в тех же самых условиях. Как видно из кривых, обозначенных закрашенными квадратами (), установлено, что даже если Е-зонд имеет основание, содержащее метку из флуоресцентных групп атомов (красителей) в положение, которое не гибридизуется с последовательностью-мишенью, Е-зонд может давать сильную флуоресценцию и может быть получено большое значение Tm. Хотя механизм не известен, можно предположить, что он протекает, например, следующим образом: последовательность оснований, которая формирует Е-зонд, вновь складывается (поворачивается на 180°), при этом содержащее метку основание и флуоресцентные группы атомов (красители) приближаются к двойной цепи, образованной при гибридизации между Е-зондом и последовательностью-мишенью, и флуоресцентные группы атомов затем входят в двойную цепь и дают флуоресценцию. Напротив, как видно из кривых, обозначенных закрашенными треугольниками (а), в случае образца, не содержащего матричную нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 47 (содержащего лишь Е-зонд с последовательностью SEQ ID NO: 46), нежелательная флуоресценция, которую можно спутать с флуоресценцией, полученной из матричной нуклеиновой кислоты, не наблюдается. Используя это явление, даже для последовательности-мишени, для которой обычно трудно разработать соответствующий зонд, обнаружение флуоресценции становится возможным с помощью простой конструкции зонда путем размещения содержащего метку основания в положение, которое находится вне последовательности-мишени (положение, которое не включено в последовательность, гибридизующуюся с последовательностью-мишенью).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Kabushiki Kaisha ДНКЕОКМ
<120> ЗОНД НА ОСНОВЕ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЗОНДА НА ОСНОВЕ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-МИШЕНИ
<130> TF13024WO
<150> JP2012-158229
<151> 2012-07-16
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 1
cctcacagca gggtcttctc
- 55 032769 <210> 2 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400>2 cctggtgtca ggaaaatgct <210>3 <211>300 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Плазмидная ДНК <400> 3
tgaacatgac cctgaattcg gatgcagagc ttcttcccat gatgatctgt ccctcacagc 60
agggtcttct ctgtttcagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga 120
cctggcagcc aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg 180
gctggccaaa ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtaag 240
gaggtggctt taggtcagcc agcattttcc tgacaccagg gaccaggctg ccttcccact 300
<210> 4 <211> 350 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант L858R <400> 4
agcctggcat gaacatgacc ctgaattcgg atgcagagct tcttcccatg atgatctgtc 60
cctcacagca gggtcttctc tgtttcaggg catgaactac ttggaggacc gtcgcttggt 120
gcaccgcgac ctggcagcca ggaacgtact ggtgaaaaca ccgcagcatg tcaagatcac 180
agattttggg cgggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa gaataccatg cagaaggagg 240
caaagtaagg aggtggcttt aggtcagcca gcattttcct gacaccaggg accaggctgc 300
cttcccacta gctgtattgt ttaacacatg caggggagga tgctctccag 350
<210> 5 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
- 56 032769 <220>
<221>
Различные свойства <222> (12)..(12) <223>
n означает введенную в тимин метку экситонным эффектом красителя, обладающую <400> 5 agattttggg cnggccaaac tg <210> 6 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (1)..(1)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 6
ngtgtatctt tctctttctc 20
<210> <211> <212> <213> 7 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е <220>
<221> Различные свойства <222> (3)..(3) <223>
n означает введенную в тимин метку экситонным эффектом красителя, обладающую <400> 7 tgngtatctt tctctttctc
<210> <211> <212> <213> 8 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е <221> Различные свойства <222>
<223>
(5)..(5) n означает введенную в тимин метку красителя, экситонным эффектом обладающую <220>
- 57 032769 <400> 8 tgtgnatctt tctctttctc
<210> <211> <212> <213> 9 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (7)..(7)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 9
tgtgtanctt tctctttctc 20
<210> <211> <212> <213> 10 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (9)..(9)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 10
tgtgtatcnt tctctttctc 20
<210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (11)..(11)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 11
tgtgtatctt nctctttctc 20
<210> 12 <211> 20
- 58 032769 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (13)..(13)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 12
tgtgtatctt tcnctttctc 20
<210> <211> <212> <213> 13 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (15)..(15)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 13
tgtgtatctt tctcnttctc 20
<210> <211> <212> <213> 14 20 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (17)..(17)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 14
tgtgtatctt tctcttnctc 20
<210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
- 59 032769
<220> <221> <222> <223> Различные свойства (19)..(19) n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую экситонным эффектом
<400> 15
tgtgtatctt tctctttcnc 20
<210> <211> <212> <213> 16 20 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Комплементарная последовательность
<400> 16
gagaaagaga aagatacaca 20
<210> <211> <212> <213> 17 20 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Комплементарная последовательность
<400> 17
gagcaagaga aagatacaca 20
<210> <211> <212> <213> 18 20 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Комплементарная последовательность
<400> 18
gaggaagaga aagatacaca 20
<210> <211> <212> <213> 19 20 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Комплементарная последовательность
<400> 19
gagtaagaga aagatacaca 20
<210> <211> <212> <213> 20 20 ДНК Искусственная последовательность
- 60 032769 <220>
<223> Комплементарная последовательность <400> 20 gagaaagaaa aagatacaca
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 21
gagaaagaca aagatacaca 20
<210> 22
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 22
gagaaagata aagatacaca 20
<210> 23
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 23
gagaaagagc aagatacaca 20
<210> 24
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 24
gagaaagagg aagatacaca 20
<210> 25 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Комплементарная последовательность
- 61 032769 <400> 25 gagaaagagt aagatacaca
<210> 26
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 26
gagaaagaga cagatacaca 20
<210> 27
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 27
gagaaagaga gagatacaca 20
<210> 28
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 28
gagaaagaga tagatacaca 20
<210> 29
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Комплементарная последовательность
<400> 29
gagaaagaga aagatccaca 20
<210> 30 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Комплементарная последовательность <400> 30 gagaaagaga aagatgcaca 20
- 62 032769 <210> 31 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Комплементарная последовательность <400>31 gagaaagaga aagattcaca
<210> 32
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 32
ttataaggcc tgctgaaaat gactgaa 27
<210> 33
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 33
tgaattagct gtatcgtcaa ggcact 26
<210>34 <211>839 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Плазмидная ДНК <400> 34
caaacttaca ggggctcgac gagctaggtt cccggacacg acaaaggcgg ccgcgggaat 60
tgcgttggag gagtttgtaa ataaagtaca gttcattacg atacacgtct gcagtcaact 120
ggaattttca tgattgaatt ttgtaaggta ttttgaaata atttttcata taaaggtgag 180
tttgtattaa aaggtactgg tggagtattt gatagtgtat taaccttatg tgtgacatgt 240
tctaatatag tcacattttc attattttta ttataaggcc tgctgaaaat gactgaatat 300
aaacttgtgg tagttggagc tggtggcgta ggcaagagtg ccttgacgat acagctaatt 360
cagaatcatt ttgtggacga atatgatcca acaatagagg taaatcttgt tttaatatgc 420
atattactgg tgcaggacca ttctttgata cagataaagg tttctctgac cattttcatg 480
agtacttatt acaagataat tatgctgaaa gttaagttat ctgaaatgta ccttgggttt 540
- 63 032769
caagttatat gtaaccatta atatgggaac tttactttcc ttgggagtat gaatcactag 600
tgaattcgcg gccgcctgca ggtcgaccat atgggagagc tccaacgcgt tggatgcata 660
gcttgagtat tctatagtgt cacctaaata gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 720
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacatttc cacacacata cgagccggaa gcataaagtg 780
taaagcctgg ggtgctcaat gagtgagcta actcacatta ttgcgttgcg ctcactgcc 839
<210> 35 <211> 716 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант G12D <400> 35
tacctctagg gacgccgaat cacgcggtat cccggccgcc atagagacgg ccgcgggaat 60
tcgattggag gagtttgtaa ataaagtaca gttcattacg atacacgtct gcagtcaact 120
ggaattttca tgattgaatt ttgtaaggta ttttgaaata atttttcata taaaggtgag 180
tttgtattaa aaggtactgg tggagtattt gatagtgtat taaccttatg tgtgacatgt 240
tctaatatag tcacattttc attattttta ttataaggcc tgctgaaaat gactgaatat 300
aaacttgtgg tagttggagc tgatggcgta ggcaagagtg ccttgacgat acagctaatt 360
cagaatcatt ttgtggacga atatgatcca acaatagagg taaatcttgt tttaatatgc 420
atattactgg tgcaggacca ttctttgata cagataaagg tttctctgac cattttcatg 480
agtacttatt acaagataat tatgctgaaa gttaagttat ctgaaatgta ccttgggttt 540
caagttatat gtaaccatta atatgggaac tttactttcc ttgggagtat gaatcactag 600
tgaattcgcg gccgcctgca ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat 660
agcttgagta ttctatagtg tcacctaaat agcttgggcg taatcatggt catagc 716
<210> 36
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (12)..(12)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 36
agctggtggc gnag 14
- 64 032769 <210> 37 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е <220>
<221> Различные свойства <222> (7)..(7)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую экситонным эффектом
<400> 37 agctggnggc gtag 14
<210> 38 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (12)..(12)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 38
agctggtggc gnag 14
<210> 39 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (7)..(7)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 39
agctggnggc gtag 14
<210> <211> <212> <213> 40 14 ДНК Искусственная последовательность
- 65 032769 <220>
<223> Зонд Е <220>
<221> Различные свойства <222> (3)..(3)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую экситонным эффектом
<400> 40 gtnggagctg gtgg 14
<210> <211> <212> <213> 41 22 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е <220>
<221> Различные свойства <222> (16)..(16) <223>
n означает введенную в тимин метку экситонным эффектом красителя, обладающую <400>41 ttggagctgg tggcgnaggc aa <210>42 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд Е
<220>
<221> Различные свойства
<222> (4)..(4)
<223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую
экситонным эффектом
<400> 42
ctcntgccta cgccaccag 19
<210> <211> <212> <213> 43 13 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Зонд Е
<220> <221> Различные свойства
- 66 032769
<222> <223> (8)..(8) n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую экситонным эффектом
<400> 43
tcttgganca acc 13
<210> 44
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Смысловая ДНК
<400> 44
acgaccgggt cctttcttgg atcaacccgc tcaatgcctg gagatttg 48
<210> <211> <212> <213> 45 48 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Антисмысловая ДНК
<400> 45
caaatctcca ggcattgagc gggttgatcc aagaaaggac ccggtcgt 48
<210> <211> <212> <213> 46 25 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Зонд Е <220>
<221> Различные свойства <222> (3)..(3) <223> n означает введенную в тимин метку красителя, обладающую экситонным эффектом <400>46 ttncctaccc acttttctcc cattt <210>47 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Матрица нуклеиновой кислоты <400> 47 aaatgggaga aaagt 15

Claims (21)

1 2 1 21 11 1 2 1 21 12
X, Хи R-R в Z и X, Хи R-R в Z соответственно могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, 1 21 в формулах (7)-(9) в заместителях R1-R21 низшая алкильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, а низшая алкоксильная группа представляет собой линейную или разветвленную алкоксильную группу, имеющую от 1 до 6 ато мов углерода.
(1) содержащее метку основание, к которому присоединены группы флуоресцентного красителя, проявляющие экситонный эффект, является основанием, отличным от первого основания на каждом конце зонда на основе нуклеиновой кислоты;
1. Способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, для обнаружения последовательности-мишени, содержащей участок ошибочного спаривания оснований, где зонд на основе нуклеиновой кислоты конструируют таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты включает множество групп флуоресцентного красителя, которые проявляют экситонный эффект;
по меньшей мере две из групп флуоресцентного красителя, которые проявляют экситонный эффект, связывают с одним и тем же основанием или с двумя смежными основаниями в молекуле нуклеиновой кислоты, при этом каждая группа флуоресцентного красителя связана с помощью линкера (связывающего атома или связывающей группы атомов);
конец молекулы указанной нуклеиновой кислоты со стороны удлинения химически состоит из группы атомов, имеющей скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную из одной из них, и конец со стороны удлинения химически модифицирован путем замены атома водорода 3'концевой гидроксильной группы (ОН) в указанной группе атомов на заместитель, который не вызывает реакцию удлинения, где заместитель, которым замещен атом водорода в 3'-концевой гидроксильной группе (ОН), представляет собой любой из следующих заместителей (А)-(С):
(A) заместитель, представленный следующей химической формулой (1001):
*-L1000-X ( 1001 ), где X означает гидроксильную группу (ОН), аминогруппу (NH2) или группу, которую получают заменой по меньшей мере одного атома водорода в ней на заместитель;
L1000 представляет собой линейную или разветвленную алкиленовую группу с числом атомов углеродов от 1 до 20;
отметка * указывает на положение, в котором заместитель связан с атомом кислорода 3'-концевой гидроксильной группы (ОН);
(B) дидезоксинуклеотидная группа, которая не имеет 3'-концевую ОН (гидроксильную группу) и тем самым предотвращает реакцию удлинения, вызываемую полимеразой; и (C) диэфирная группа тиофосфорной кислоты; и зонд на основе нуклеиновой кислоты удовлетворяет следующим условиям (1) и (2), а также удовлетворяет следующим условиям (3) или (4):
2. Способ конструирования по п.1, в котором в формулах (16), (17), (16b) и (17b) длина основной цепи (количество атомов в основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 означает целое число, равное 2 или больше.
(2) последовательность-мишень, с которой зонд на основе нуклеиновой кислоты гибридизуется, представляет собой последовательность, которая содержит мутацию (участок ошибочного спаривания оснований), при этом участок ошибочного спаривания оснований представляет собой основание, отличное от первого и второго оснований каждого конца последовательности-мишени;
3. Способ конструирования по п.1 или 2, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул (7)-(9):
где X1 и X2 означают S, О или Se;
n'' означает 0 или положительное целое число;
заместители R1-R10 и R13-R21, каждый независимо, означают атом водорода, атом галогена, низшую алкильную группу, низшую алкоксильную группу, нитрогруппу или аминогруппу;
один из заместителей R11 и R12 представляет собой связывающую группу, которая соединена с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), а другой означает атом водорода или низшую алкильную группу;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует множество групп R15, то они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
если в формулах (7), (8) или (9) присутствует множество групп R16, то они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга; и
(3) содержащее метку основание находится в положении, отстоящем по меньшей мере на четыре основания от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, так что интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая имеет мутацию (участок ошибочного спаривания оснований) в последовательности-мишени, не ниже, чем интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая не имеет мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), при этом интенсивности флуоресценции пика обнаружения обеих последовательностей измеряются в одинаковых условиях; и (4) содержащее метку основание находится в положении, отстоящем на три или меньшее количество оснований от основания, которое должно спариваться с участком ошибочного спаривания оснований, так что интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая имеет мутацию (участок ошибочного спаривания оснований) в последовательности-мишени, является более низкой, чем интенсивность флуоресценции пика обнаружения последовательности, которая не имеет мутацию в последовательности-мишени (полное совпадение нуклеотидов), при этом интенсивности флуоресценции пика обнаружения обеих последовательностей измеряются в одинаковых условиях;
молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну из структур, представленных следующими формулами (16), (16b), (17) и (17b):
- 68 032769 где В означает группу атомов, имеющую скелет природного нуклеинового основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или скелет искусственного нуклеинового основания;
Е означает:
(i) группу атомов, имеющую скелет дезоксирибозы, скелет рибозы или структуру, полученную из любой из них, или (ii) группу атомов, имеющую пептидную структуру или пептоидную структуру;
каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу, полученную из любого из тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина и их производных, и они могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
каждый из L1, L2 и L3 означает линкерную группу (связывающий атом или связывающую группу атомов), при этом длина их основной цепи (количество атомов в основной цепи) произвольна, и каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи любой из атомов С, N, О, S, Р и Si;
каждый из L1, L2 и L3 может содержать, а может не содержать в основной цепи простую связь, двойную связь, тройную связь, амидную связь, сложноэфирную связь, дисульфидную связь, иминогруппу, простую эфирную связь, сложную тиоэфирную связь и L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или отличными друг от друга;
D означает CR, N, Р, Р=О, В или SiR, где R представляет собой атом водорода или алкильную группу с числом атомов углерода от 1 до 4; и b означает простую связь, двойную связь или тройную связь, или, альтернативно, в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 означает линкер, L3, D и b могут отсутствовать, a L1 и L2
- 69 032769 могут быть присоединены непосредственно к В при условии, что в формулах (16) и (17) Е означает группу атомов, описанную выше в п.ф, и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S;
в формулах (16b) и (17b) E означает группу атомов, описанную в п.(п); и в формулах (17) и (17b) соответствующие В могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, а соответствующие Е могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
4. Способ конструирования по п.3, в котором в формулах (7)-(9) в заместителях R11 и R12 связывающая группа представляет собой полиметиленовую карбонильную группу, содержащую 2 или больше атома углерода и присоединенную к L1 или L2 в формулах (16), (16b), (17) и (17b) во фрагменте карбонильной группы.
5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)Ь]пиридин, 5-йод-2-оксо(1Н)пиридин, 2-оксо(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2-тие- нил^мидазо^^-^пиридин, бромтимин, азааденин или азагуанин.
5. Способ конструирования по п.3 или 4, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную формулой (7) или (8), и Z11 и Z12, представленные формулой (7) или (8), означают группу, представленную следующей формулой (19) или (20):
- 70 032769 где X1, R1-R10, R13 и R14 и R11 и R12 идентичны тем, которые указаны в формулах (7)-(9).
6. Способ конструирования по п.5, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (19), где
X1 означает S;
R1-R10 означают атомы водорода; а один из R11 и R12 означает связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b), a другой означает метильную группу.
7. Способ конструирования по п.5, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (19), где
X1 означает S;
R1, R4, R5, R6, R7, R9 и R10 означают атомы водорода;
R2, R3 и R12 означают метильные группы;
R8 означает атом галогена и
R11 представляет собой связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b).
8. Способ конструирования по п.3, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную вышеуказанной формулой (7), где
X1 означает S; n равно 1;
R1-R10, R15, R16 и R17 означают атомы водорода;
R11 представляет собой связывающую группу, которая связана с L1 или L2 в формулах (16), (17), (16b) и (17b); и
R12 означает метильную группу.
9. Способ конструирования по п.3, в котором каждый из Z11 и Z12 независимо означает группу атомов, представленную любой из следующих формул:
- 71 032769 \
сн3 где в каждой из указанных выше химических формул n означает положительное целое число.
10. Способ конструирования по любому из пп.1-9, в котором в формулах (16), (17), (16b) и (17b) В представляет собой группу атомов, включающую скелет природного нуклеинового основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила).
11. Способ конструирования по любому из пп.1-9, в котором в формулах (16), (17), (16b) и (17b) В означает группу атомов, имеющую скелет искусственного нуклеинового основания, при этом искусственное нуклеиновое основание представляет собой 2-амино-6-(Н^диметиламино)пуринпиридин-2-он,
12. Способ конструирования по любому из пп.1-9, в котором в формулах (16), (17), (16b) и (17b) В означает группу атомов, имеющую скелет искусственного нуклеинового основания, при этом искусственное нуклеиновое основание представляет собой Ру, Ру der., Pu или Pu der., где
Ру означает группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 1-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 5-положении 6-членного цикла, представленного следующей формулой (11):
(I 1)
Py der. означает группу атомов, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного цикла Ру замещен атомом N, С, S или О;
Pu означает группу атомов, имеющую ковалентную связь с Е в 9-положении и ковалентную связь с линкерным фрагментом в 8-положении конденсированного цикла, представленного следующей формулой (12):
- 72 032769 a Pu der. означает группу атомов, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного цикла Pu замещен атомом N, С, S или О.
13. Способ конструирования по любому из пп.1-12, в котором структура, представленная формулой (16), означает структуру, представленную следующей формулой (16-1) или (16-2);
структура, представленная формулой (16b), означает структуру, представленную следующей формулой (16b-1) или (16b-2);
структура, представленная формулой (17), означает структуру, представленную следующей формулой (17-1); и структура, представленная формулой (17b) означает структуру, представленную следующей формулой (17b-1):
- 73 032769 где l, m и n' означают положительные целые числа, при этом l, m и n' могут быть одинаковыми или отличными друг от друга, каждый из l, m и n' может содержать или может не содержать в своей основной цепи любой из атомов С, N, О, S, Р и Si и каждый из l, m и n' может содержать или может не содержать в основной цепи любую из простой связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, простой эфирной связи, простой тиоэфирной связи и сложной тиоэфирной связи;
значения В, Е, Z11, Z12 и b идентичны тем, которые указаны в формулах (16), (16b), (17) и (17b); и в формулах (16-1), (16-2) и (17-1) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S.
14. Способ конструирования по п.13, в котором в формулах (16-1), (16-2), (16b-1), (16b-2), (17-1) и (17b-1) каждый из l, m и n' означает целое число, равное 2 или больше.
15. Способ конструирования по п.1, в котором зонд на основе нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну из структур нуклеотидов, представленных следующими химическими формулами 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124, 114-2, их геометрические изомеры и стереоизомеры и их соли:
- 74 032769
- 75 032769 где в каждой из указанных выше химических формул n означает положительное целое число.
16. Способ конструирования по п.10 или 15, в котором длина линкера n находится в диапазоне от 2 до 6.
17. Способ конструирования по любому из пп.1-16, в котором зонд на основе нуклеиновой кислоты сконструирован таким образом, что участок, составленный из содержащего метку основания, к которому присоединены флуоресцентные группы атомов, проявляющие экситонный эффект, два основания непосредственно выше от содержащего метку основания и два основания непосредственно ниже от содержащего метку основания, не способен к самогибридизации с любым другим участком в зонде на основе нуклеиновой кислоты.
18. Способ конструирования по любому из пп.1-17, в котором зонд на основе нуклеиновой кислоты предназначен для обнаружения последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте, в указанном способе конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты зонд на основе нуклеиновой кислоты сконструирован таким образом, что зонд на основе нуклеиновой кислоты включает последовательность, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью, и последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью, и содержащее метку основание, к которому присоединены группы флуоресцентного красителя, проявляющие экситонный эффект, включено в последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью-мишенью.
19. Способ обнаружения последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте с использованием зонда на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с последовательностью-мишенью, где зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой зонд на основе нуклеиновой кислоты, сконструированный способом конструирования по любому из пп.1-18, и последовательность-мишень имеет участок ошибочного спаривания оснований.
- 76 032769
20. Способ обнаружения по п.19, в котором последовательность-мишень содержит множество участков ошибочного спаривания оснований.
21. Способ обнаружения по п.19 или 20, в котором нуклеиновая кислота, содержащая последовательность-мишень, представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту.
отрицательный В: отрицательный С: положительный
Фиг. 1
Немеченый продукт может быть детектирован повторно, используя тот же чип добавления какого-πι конкретного реагента
EA201491064A 2012-07-16 2013-07-12 Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени EA032769B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012158229 2012-07-16
PCT/JP2013/069213 WO2014013954A1 (ja) 2012-07-16 2013-07-12 核酸プローブ、核酸プローブの設計方法、およびターゲット配列の検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491064A1 EA201491064A1 (ru) 2014-11-28
EA032769B1 true EA032769B1 (ru) 2019-07-31

Family

ID=49948783

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692118A EA201692118A1 (ru) 2012-07-16 2013-07-12 Зонд на основе нуклеиновой кислоты, способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени
EA201491064A EA032769B1 (ru) 2012-07-16 2013-07-12 Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692118A EA201692118A1 (ru) 2012-07-16 2013-07-12 Зонд на основе нуклеиновой кислоты, способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9862989B2 (ru)
EP (2) EP2873731B1 (ru)
JP (2) JP5618436B2 (ru)
CA (1) CA2873370C (ru)
EA (2) EA201692118A1 (ru)
WO (1) WO2014013954A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201692118A1 (ru) * 2012-07-16 2017-05-31 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Зонд на основе нуклеиновой кислоты, способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени
EP2891714B1 (en) * 2012-08-30 2018-07-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for analyzing target nucleic acid, kit, and analyzer
WO2017038682A1 (ja) * 2015-08-28 2017-03-09 国立研究開発法人理化学研究所 鋳型核酸の分析方法、標的物質の分析方法、鋳型核酸または標的物質の分析用キット、および鋳型核酸または標的物質の分析用装置
CN106008486B (zh) * 2016-05-31 2018-05-18 安徽大学 一种靶向细胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶盐生物荧光探针及其合成方法
WO2018008435A1 (ja) * 2016-07-04 2018-01-11 株式会社ダナフォーム 核酸分析方法
CN116024320A (zh) * 2022-07-13 2023-04-28 上海翔琼生物技术有限公司 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法
WO2024069938A1 (ja) * 2022-09-30 2024-04-04 株式会社Mirai Genomics 核酸増幅用反応槽、カートリッジ及び核酸検出方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH093800A (ja) * 1995-06-19 1997-01-07 Dainippon Printing Co Ltd 抗菌用紙及びその製造方法
JP2009171935A (ja) * 2007-03-09 2009-08-06 Institute Of Physical & Chemical Research プライマー、プライマーセット、それを用いた核酸増幅方法および変異検出方法
JP2011519570A (ja) * 2008-05-06 2011-07-14 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 反応における複数の核酸配列の同時検出

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0723800A (ja) 1993-07-08 1995-01-27 Tanabe Seiyaku Co Ltd 核酸の検出方法
IT1303767B1 (it) * 1998-11-17 2001-02-23 San Raffaele Centro Fond Metodo di quantificazione di acidi nucleici.
AUPR050700A0 (en) 2000-10-03 2000-10-26 Id+Plus Ltd Detection method
CA2622649C (en) * 2007-03-09 2018-04-24 Riken Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect
JP4761086B2 (ja) 2007-03-09 2011-08-31 独立行政法人理化学研究所 核酸、標識物質、核酸検出方法およびキット
WO2012091091A1 (ja) 2010-12-28 2012-07-05 独立行政法人理化学研究所 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット
EA201692118A1 (ru) * 2012-07-16 2017-05-31 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Зонд на основе нуклеиновой кислоты, способ конструирования зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени
EP2891714B1 (en) * 2012-08-30 2018-07-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for analyzing target nucleic acid, kit, and analyzer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH093800A (ja) * 1995-06-19 1997-01-07 Dainippon Printing Co Ltd 抗菌用紙及びその製造方法
JP2009171935A (ja) * 2007-03-09 2009-08-06 Institute Of Physical & Chemical Research プライマー、プライマーセット、それを用いた核酸増幅方法および変異検出方法
JP2011519570A (ja) * 2008-05-06 2011-07-14 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 反応における複数の核酸配列の同時検出

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2008 PRICE LIST, p. 18, [online], issued by Eurogentec, 2008, [retrieval date 12 August 2013 (12.08.2013)], Internet <URL:http://www.eurogentec.com/EGT/files/Glen-Research/GLENRES-PRICELIST.pdf> *
A. Okamoto, ECHO probes: a concept of fluorescence control for practical nucleicacid sensing, Chem. Soc. Rev., 2011, Vol. 40, p. 5815-5828 *
Akimitsu OKAMOTO, "Kagaku Sekkei Keiko Kakusan ni yoru Seisaibo-nai mRNA Imaging", Experimental Medicine, 2008, Vol. 26, No. 17 (special extra issue), p. 2850-2856 *
K.W. Cradic, et al., Substitution of 3'-Phosphate Cap with a Carbon-Based Blocker Reduces the Possibility of Fluorescence Resonance Energy Transfer Probe Failure in Real-Time PCR Assays, Clinical Chemistry, 2004.06, Vol. 50, No. 6, p. 1080-1082 *
S. Ikeda, et al., Sequence dependence of fluorescence emission and quenching of doubly thiazole orange labeled DNA: effective design of a hybridization-sensitive probe, Bioconjugate Chemistry, 2008, Vol. 19, No. 8, p. 1719-1725 *
Shinki Keiko Hybridization Probe (Exciton Probe) Custom Gosei Service, [online], issued by Kabushiki Kaisha Dnaform, 22 March 2012 (22.03.2012), [retrieval date 12 August 2013 (12.08.2013)], Internet <URL: http://dnaform.jp/pdf/ExcitonProbe.pdf> *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150203902A1 (en) 2015-07-23
CA2873370A1 (en) 2014-01-23
EP2873731A1 (en) 2015-05-20
JP5618436B2 (ja) 2014-11-05
EA201491064A1 (ru) 2014-11-28
WO2014013954A1 (ja) 2014-01-23
EP3401407A1 (en) 2018-11-14
EP2873731A4 (en) 2016-04-27
US9862989B2 (en) 2018-01-09
EP2873731B1 (en) 2018-08-29
CA2873370C (en) 2021-06-08
JPWO2014013954A1 (ja) 2016-06-30
EA201692118A1 (ru) 2017-05-31
EP3401407B1 (en) 2020-04-22
JP2015012868A (ja) 2015-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2130835B1 (en) Compound having structure derived from mononucleoside or mononucleotide, nucleic acid, labeling substance, and method and kit for detection of nucleic acid
KR102053108B1 (ko) 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
EA032769B1 (ru) Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени
US8067162B2 (en) Primer, primer set, and nucleic acid amplification method and mutation detection method using the same
KR102036430B1 (ko) 긴 스토크스 이동을 갖는 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
EP2891714B1 (en) Method for analyzing target nucleic acid, kit, and analyzer
JP4370385B2 (ja) プライマー、プライマーセット、それを用いた核酸増幅方法および変異検出方法
CN108299275A (zh) 多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途
CN106459001B (zh) 多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途
EA037029B1 (ru) Флуоресцентно меченная одноцепочечная нуклеиновая кислота и ее применение
CN111801340A (zh) 新型淬灭剂和报告基因染料组合
JP2015104329A (ja) 核酸プライマー又は核酸プローブの設計方法、およびターゲット配列の検出方法
KR20230056685A (ko) 염료를 사용한 생물학적 분석을 위한 조성물, 시스템 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM