JPH0723800A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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- JPH0723800A JPH0723800A JP5168895A JP16889593A JPH0723800A JP H0723800 A JPH0723800 A JP H0723800A JP 5168895 A JP5168895 A JP 5168895A JP 16889593 A JP16889593 A JP 16889593A JP H0723800 A JPH0723800 A JP H0723800A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】〔Ａ〕１）一本鎖標的核酸、２）該標的核酸と
その相補鎖に各々相補的な核酸プライマー及び３）該核
酸プライマーよりも標的核酸の下流（３’側）にハイブ
リダイズし、かつ核酸合成酵素による伸長反応を受けな
い蛍光標識核酸プローブと、４）二本鎖核酸に特異的な
エキソヌクレアーゼ活性を持つ核酸合成酵素とをこの酵
素の基質（４種のヌクレオシド三リン酸）存在下で接触
させてプライマー鎖を伸長させるとともに、標的核酸と
ハイブリダイズしたプローブのみを分解する工程、
〔Ｂ〕工程Ａのプライマー鎖伸長産物を一本鎖に変性さ
せる工程、〔Ｃ〕工程Ａ〜Ｂを繰り返して標的核酸を増
幅する工程、並びに〔Ｄ〕上記プローブの分解に伴う蛍
光偏光の変位を測定する工程からなる核酸の検出方法。 【効果】 従来法に較べて標的核酸を簡便に感度よく検
出でき、かつ検出の信頼性が高い。更に、本発明方法
は、ＰＣＲ反応により増幅した核酸成分による拡散・汚
染のおそれがなく、コンタミネーションによる偽陽性を
防ぐことができる。
その相補鎖に各々相補的な核酸プライマー及び３）該核
酸プライマーよりも標的核酸の下流（３’側）にハイブ
リダイズし、かつ核酸合成酵素による伸長反応を受けな
い蛍光標識核酸プローブと、４）二本鎖核酸に特異的な
エキソヌクレアーゼ活性を持つ核酸合成酵素とをこの酵
素の基質（４種のヌクレオシド三リン酸）存在下で接触
させてプライマー鎖を伸長させるとともに、標的核酸と
ハイブリダイズしたプローブのみを分解する工程、
〔Ｂ〕工程Ａのプライマー鎖伸長産物を一本鎖に変性さ
せる工程、〔Ｃ〕工程Ａ〜Ｂを繰り返して標的核酸を増
幅する工程、並びに〔Ｄ〕上記プローブの分解に伴う蛍
光偏光の変位を測定する工程からなる核酸の検出方法。 【効果】 従来法に較べて標的核酸を簡便に感度よく検
出でき、かつ検出の信頼性が高い。更に、本発明方法
は、ＰＣＲ反応により増幅した核酸成分による拡散・汚
染のおそれがなく、コンタミネーションによる偽陽性を
防ぐことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細菌やウィルス等の微
生物による感染症診断等に有用な核酸成分の検出方法に
関する。
生物による感染症診断等に有用な核酸成分の検出方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝病等の遺伝子の変化、或いは外因性
遺伝子に起因する疾患の診断に際しては、臨床所見、生
化学的検査法或いは培養検査等以外に、遺伝子変異又は
外来遺伝子を直接検出することが有力な診断手段となり
うる。最近では、比較的再現性のよい遺伝子操作技術が
確立され、また種々の核酸プローブの開発によって特定
の塩基配列のＤＮＡ或いはＲＮＡを直接検出することが
可能となり、ＤＮＡ診断の臨床検査への応用が検討され
ている。
遺伝子に起因する疾患の診断に際しては、臨床所見、生
化学的検査法或いは培養検査等以外に、遺伝子変異又は
外来遺伝子を直接検出することが有力な診断手段となり
うる。最近では、比較的再現性のよい遺伝子操作技術が
確立され、また種々の核酸プローブの開発によって特定
の塩基配列のＤＮＡ或いはＲＮＡを直接検出することが
可能となり、ＤＮＡ診断の臨床検査への応用が検討され
ている。
【０００３】従来、ある検体中に特定の塩基配列を有す
る遺伝子（核酸成分）が存在するか否かを調べる場合、
抽出した核酸成分を水酸化ナトリウムの如きアルカリ或
いは加熱により一本鎖に変性させた後、ニトロセルロー
ス膜等に固定化し、これに放射性同位元素（ＲＩ）やビ
オチン等のマーカーで標識した核酸プローブをハイブリ
ダイズさせて検出するドットブロッティング法が用いら
れてきた。しかしながら、当該方法では、核酸成分の固
定化及びハイブリダイゼーションに標識プローブの除去
（Ｂ／Ｆ分離）等の煩雑な操作が必要となり、多数の検
体を処理することは困難である。
る遺伝子（核酸成分）が存在するか否かを調べる場合、
抽出した核酸成分を水酸化ナトリウムの如きアルカリ或
いは加熱により一本鎖に変性させた後、ニトロセルロー
ス膜等に固定化し、これに放射性同位元素（ＲＩ）やビ
オチン等のマーカーで標識した核酸プローブをハイブリ
ダイズさせて検出するドットブロッティング法が用いら
れてきた。しかしながら、当該方法では、核酸成分の固
定化及びハイブリダイゼーションに標識プローブの除去
（Ｂ／Ｆ分離）等の煩雑な操作が必要となり、多数の検
体を処理することは困難である。
【０００４】最近、上記の如き問題点を改善した方法と
して、蛍光標識ＤＮＡプローブを標的ＤＮＡにハイブリ
ダイズさせ、見かけの分子量の増加にともなう蛍光偏光
の変位（蛍光異方性比の増加）を測定することにより検
出する方法（特開平２−７５９５８）、或いは蛍光標識
ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとで形成された二本鎖中の
標識プローブのみをλエキソヌクレアーゼで分解し、標
識プローブの低分子化に伴う蛍光偏光の変位を測定する
方法（国際特許出願公開；ＷＯ９１／１７２６４）等が
提案されている。しかしながら、これらの方法は検出感
度が充分ではなく、しばしば偽陰性が生じるため、信頼
性に問題がある。
して、蛍光標識ＤＮＡプローブを標的ＤＮＡにハイブリ
ダイズさせ、見かけの分子量の増加にともなう蛍光偏光
の変位（蛍光異方性比の増加）を測定することにより検
出する方法（特開平２−７５９５８）、或いは蛍光標識
ＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとで形成された二本鎖中の
標識プローブのみをλエキソヌクレアーゼで分解し、標
識プローブの低分子化に伴う蛍光偏光の変位を測定する
方法（国際特許出願公開；ＷＯ９１／１７２６４）等が
提案されている。しかしながら、これらの方法は検出感
度が充分ではなく、しばしば偽陰性が生じるため、信頼
性に問題がある。
【０００５】上記のような感度不足による偽陰性を防ぐ
ためには、検体中の目的遺伝子をポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション（Polymelase chain reaction ，ＰＣ
Ｒ）法等により増幅することが考えられる。このＰＣＲ
法はイン・ビトロにおける核酸増幅のための一般的方法
として知られているが、目的遺伝子とは異なる塩基配列
の核酸が増幅されることが少なくないという難点があ
る。従って、目的遺伝子が増幅されたか否かを、反応液
の一部を取り出してあらためて核酸プローブ等を用いた
ハイブリダイゼーション法によって確認する必要があ
り、増幅遺伝子の固定化等の煩雑な操作が必要となる。
また、増幅された核酸成分が拡散することによりコンタ
ミネーションが起きやすいことから、偽陽性が度々出現
する等の難点がある。この点は、多数の検体を同時に処
理する場合には特に重大な問題となるため、ＰＣＲ法を
利用した核酸検出法も臨床現場では広く実用化されるま
でには至っていない。
ためには、検体中の目的遺伝子をポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション（Polymelase chain reaction ，ＰＣ
Ｒ）法等により増幅することが考えられる。このＰＣＲ
法はイン・ビトロにおける核酸増幅のための一般的方法
として知られているが、目的遺伝子とは異なる塩基配列
の核酸が増幅されることが少なくないという難点があ
る。従って、目的遺伝子が増幅されたか否かを、反応液
の一部を取り出してあらためて核酸プローブ等を用いた
ハイブリダイゼーション法によって確認する必要があ
り、増幅遺伝子の固定化等の煩雑な操作が必要となる。
また、増幅された核酸成分が拡散することによりコンタ
ミネーションが起きやすいことから、偽陽性が度々出現
する等の難点がある。この点は、多数の検体を同時に処
理する場合には特に重大な問題となるため、ＰＣＲ法を
利用した核酸検出法も臨床現場では広く実用化されるま
でには至っていない。
【０００６】
【解決すべき課題】現在、上記の如き課題を解決した簡
便、高感度かつ信頼性良く目的とする塩基配列を有する
核酸成分を検出できる方法の開発が望まれている。
便、高感度かつ信頼性良く目的とする塩基配列を有する
核酸成分を検出できる方法の開発が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、二本鎖核酸に特異的なエ
キソヌクレアーゼ活性を併せ持つ核酸合成酵素を用いた
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を、
該核酸合成酵素による塩基の伸長反応を受けないよう
３’末端を化学修飾した蛍光標識核酸プローブの共存下
で実施すれば、標的核酸が増幅された場合にのみ、上記
プローブが同酵素で分解され、この分解生成物を含む試
料の蛍光偏光の変位（蛍光異方性比の減少）を測定する
ことにより、標的核酸を直接、簡便に、しかもＰＣＲ反
応液を反応容器から取り出すことなく検出できることを
見い出し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意研究の結果、二本鎖核酸に特異的なエ
キソヌクレアーゼ活性を併せ持つ核酸合成酵素を用いた
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を、
該核酸合成酵素による塩基の伸長反応を受けないよう
３’末端を化学修飾した蛍光標識核酸プローブの共存下
で実施すれば、標的核酸が増幅された場合にのみ、上記
プローブが同酵素で分解され、この分解生成物を含む試
料の蛍光偏光の変位（蛍光異方性比の減少）を測定する
ことにより、標的核酸を直接、簡便に、しかもＰＣＲ反
応液を反応容器から取り出すことなく検出できることを
見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、〔Ａ〕１）一本鎖の標的
核酸、２）該標的核酸とその相補鎖にそれぞれ相補的な
塩基配列をもつ核酸プライマー及び３）該核酸プライマ
ーよりも標的核酸の下流（３’側）にハイブリダイズす
るよう設計された塩基配列を有し、かつ核酸合成酵素に
よる伸長反応を受けないよう３’末端が修飾された蛍光
標識核酸プローブと、４）二本鎖核酸に特異的なエキソ
ヌクレアーゼ活性を併せ持つ核酸合成酵素とを該酵素の
基質である４種のヌクレオシド三リン酸の存在下で接触
させることにより、上記核酸プライマー鎖を伸長させる
とともに、標的核酸とハイブリダイズした蛍光標識核酸
プローブのみを上記核酸合成酵素中のエキソヌクレアー
ゼ活性領域の作用により分解する工程、 〔Ｂ〕前記工程により得られるプライマー鎖伸長産物を
変性させて一本鎖核酸とする工程、 〔Ｃ〕工程Ａ〜Ｂを所望の回数繰り返して標的核酸を増
幅する工程、並びに 〔Ｄ〕上記蛍光標識核酸プローブの分解に伴う蛍光偏光
の変位を測定する工程からなることを特徴とする核酸の
検出方法。
核酸、２）該標的核酸とその相補鎖にそれぞれ相補的な
塩基配列をもつ核酸プライマー及び３）該核酸プライマ
ーよりも標的核酸の下流（３’側）にハイブリダイズす
るよう設計された塩基配列を有し、かつ核酸合成酵素に
よる伸長反応を受けないよう３’末端が修飾された蛍光
標識核酸プローブと、４）二本鎖核酸に特異的なエキソ
ヌクレアーゼ活性を併せ持つ核酸合成酵素とを該酵素の
基質である４種のヌクレオシド三リン酸の存在下で接触
させることにより、上記核酸プライマー鎖を伸長させる
とともに、標的核酸とハイブリダイズした蛍光標識核酸
プローブのみを上記核酸合成酵素中のエキソヌクレアー
ゼ活性領域の作用により分解する工程、 〔Ｂ〕前記工程により得られるプライマー鎖伸長産物を
変性させて一本鎖核酸とする工程、 〔Ｃ〕工程Ａ〜Ｂを所望の回数繰り返して標的核酸を増
幅する工程、並びに 〔Ｄ〕上記蛍光標識核酸プローブの分解に伴う蛍光偏光
の変位を測定する工程からなることを特徴とする核酸の
検出方法。
【０００９】本発明を適用できる標的核酸は、その塩基
配列が判明しているものであれば特に限定されるもので
はなく、またＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ま
た。当該標的核酸は、その由来によって制限されるもの
ではなく、真核生物、原核生物、ウィルス由来の核酸に
適用することができる。また、検出目的とする核酸がＲ
ＮＡである場合には、必要に応じ、逆転写酵素を用いて
当該ＲＮＡをｃＤＮＡに誘導したものを標的核酸とする
こともできる。
配列が判明しているものであれば特に限定されるもので
はなく、またＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ま
た。当該標的核酸は、その由来によって制限されるもの
ではなく、真核生物、原核生物、ウィルス由来の核酸に
適用することができる。また、検出目的とする核酸がＲ
ＮＡである場合には、必要に応じ、逆転写酵素を用いて
当該ＲＮＡをｃＤＮＡに誘導したものを標的核酸とする
こともできる。
【００１０】本発明に係る核酸プライマー及び核酸プロ
ーブは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよいが、標的核
酸及びその相補鎖の種類（塩基配列）に応じ、当該標的
核酸等を特異的に認識して安定な二本鎖を形成（ハイブ
リダイズ）しうる塩基配列を有するものを好適に使用す
ることができる。また、その塩基配列の長さは、ハイブ
リダイゼーションにおける特異性を考慮すれば、核酸プ
ライマーとしては１５量体以上、とりわけ２０〜３０量
体の長さのものが好ましく、核酸プローブとしては１５
量体以上、とりわけ２０〜３０量体のものが好ましい。
また、このような塩基配列を有する核酸プライマー及び
核酸プローブであれば公知のものに限られず、新たに設
計された塩基配列を有する核酸プローブも本発明に使用
することができる。更に、核酸プローブについては、上
記核酸プライマーよりも標的核酸の下流（３’末端側）
にハイブリダイズし、かつ３’末端を核酸合成酵素によ
る伸長反応を受けないよう化学修飾したものを使用する
ことができ、また、非特異的な分解を受けにくいもので
あれば特に好ましい。核酸プローブの３’末端の修飾は
３’ＯＨ基のリン酸化或いは標的核酸にハイブリダイズ
しない（ミスマッチの）塩基を２個程度付加することに
より実施することができる。
ーブは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよいが、標的核
酸及びその相補鎖の種類（塩基配列）に応じ、当該標的
核酸等を特異的に認識して安定な二本鎖を形成（ハイブ
リダイズ）しうる塩基配列を有するものを好適に使用す
ることができる。また、その塩基配列の長さは、ハイブ
リダイゼーションにおける特異性を考慮すれば、核酸プ
ライマーとしては１５量体以上、とりわけ２０〜３０量
体の長さのものが好ましく、核酸プローブとしては１５
量体以上、とりわけ２０〜３０量体のものが好ましい。
また、このような塩基配列を有する核酸プライマー及び
核酸プローブであれば公知のものに限られず、新たに設
計された塩基配列を有する核酸プローブも本発明に使用
することができる。更に、核酸プローブについては、上
記核酸プライマーよりも標的核酸の下流（３’末端側）
にハイブリダイズし、かつ３’末端を核酸合成酵素によ
る伸長反応を受けないよう化学修飾したものを使用する
ことができ、また、非特異的な分解を受けにくいもので
あれば特に好ましい。核酸プローブの３’末端の修飾は
３’ＯＨ基のリン酸化或いは標的核酸にハイブリダイズ
しない（ミスマッチの）塩基を２個程度付加することに
より実施することができる。
【００１１】上記核酸プライマー及び核酸プローブは、
本技術分野の周知の方法、例えば化学合成、制限酵素を
用いて実際のゲノムから所望の塩基配列を有する領域
（オリゴヌクレオチド）を切り出す等して調製すること
ができる。また、蛍光標識核酸プローブは、上記の如く
調製したオリゴヌクレオチドを常法により蛍光剤で標識
することにより調製することができる。標識のための蛍
光剤としては、例えばフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン誘導体、ローダミン
イソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、イオシンイソ
チオシアネート（ＥＩＴＣ）等を挙げることができ、と
りわけＦＩＴＣが好ましい。
本技術分野の周知の方法、例えば化学合成、制限酵素を
用いて実際のゲノムから所望の塩基配列を有する領域
（オリゴヌクレオチド）を切り出す等して調製すること
ができる。また、蛍光標識核酸プローブは、上記の如く
調製したオリゴヌクレオチドを常法により蛍光剤で標識
することにより調製することができる。標識のための蛍
光剤としては、例えばフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン誘導体、ローダミン
イソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、イオシンイソ
チオシアネート（ＥＩＴＣ）等を挙げることができ、と
りわけＦＩＴＣが好ましい。
【００１２】蛍光剤の核酸プローブへの標識方法として
は、例えば、アミノ基導入試薬〔２−（４−モノメトキ
シトリチルアミノ）エチル−（２−シアノエチル）−
（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト
等〕、或いはチオール基導入試薬〔（Ｓ−トリチル−２
−メルカプトエチル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト、（Ｓ−ト
リチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイ
ト等〕等を用いて核酸塩基に直接標識する方法、核酸中
の蛍光剤標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホ
ン酸結合に置き換え（いわゆるリンカーの導入）、この
官能基を利用して蛍光剤を結合させる方法（特開昭６１
−４４３５３）等が挙げられる。
は、例えば、アミノ基導入試薬〔２−（４−モノメトキ
シトリチルアミノ）エチル−（２−シアノエチル）−
（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト
等〕、或いはチオール基導入試薬〔（Ｓ−トリチル−２
−メルカプトエチル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト、（Ｓ−ト
リチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイ
ト等〕等を用いて核酸塩基に直接標識する方法、核酸中
の蛍光剤標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホ
ン酸結合に置き換え（いわゆるリンカーの導入）、この
官能基を利用して蛍光剤を結合させる方法（特開昭６１
−４４３５３）等が挙げられる。
【００１３】本発明にかかる核酸合成酵素は、二本鎖核
酸に特異的なエキソヌクレアーゼ活性を併せ持つものを
使用することができ、例えば、このような核酸合成酵素
として、サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の TaqＤＮＡポリメラーゼ、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ等が挙げられ、とりわけ、高温に安定
な耐熱性ポリメラーゼである TaqＤＮＡポリメラーゼが
好ましい。
酸に特異的なエキソヌクレアーゼ活性を併せ持つものを
使用することができ、例えば、このような核酸合成酵素
として、サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の TaqＤＮＡポリメラーゼ、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ等が挙げられ、とりわけ、高温に安定
な耐熱性ポリメラーゼである TaqＤＮＡポリメラーゼが
好ましい。
【００１４】上記核酸合成酵素の基質である４種のヌク
レオシド三リン酸としては、ＤＮＡ構成成分であるデオ
キシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノ
シン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸
（ｄＣＴＰ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴ
Ｐ）があげられる。
レオシド三リン酸としては、ＤＮＡ構成成分であるデオ
キシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノ
シン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸
（ｄＣＴＰ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴ
Ｐ）があげられる。
【００１５】（工程Ａ）本工程は、（ｉ）標的核酸及び
その相補鎖と核酸プライマー及び核酸プローブとのハイ
ブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ii）核
酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブ
の分解反応からなりこれら反応（ｉ）及び（ii）は、例
えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中
で実施することができる。このハイブリダイゼーション
反応および酵素反応は、５５〜７５℃で実施することが
できる。
その相補鎖と核酸プライマー及び核酸プローブとのハイ
ブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ii）核
酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブ
の分解反応からなりこれら反応（ｉ）及び（ii）は、例
えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中
で実施することができる。このハイブリダイゼーション
反応および酵素反応は、５５〜７５℃で実施することが
できる。
【００１６】（工程Ｂ）プライマー伸長産物の変性は、
上記Ａで得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、
例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理する等し
て実施することができる。
上記Ａで得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、
例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理する等し
て実施することができる。
【００１７】（工程Ｃ）標的核酸の増幅は、当該標的核
酸が所望の量になるまで、工程Ａ〜Ｂを上記と同様の条
件下で複数回繰り返せばよく、工程Ａ〜Ｂをｎ回行え
ば、理論的には標的核酸量は当初の２n-1 倍に増幅され
ることとなる。
酸が所望の量になるまで、工程Ａ〜Ｂを上記と同様の条
件下で複数回繰り返せばよく、工程Ａ〜Ｂをｎ回行え
ば、理論的には標的核酸量は当初の２n-1 倍に増幅され
ることとなる。
【００１８】なお、上記工程Ａ〜Ｃは、市販のＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）用装置を用
いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）用装置を用
いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【００１９】（工程Ｄ）蛍光標識核酸プローブの分解に
伴う蛍光偏光の変位は、上記Ａ〜Ｃの工程を経て得られ
る試料溶液、および標的核酸を含まない溶液（コントロ
ール溶液）の各々の蛍光偏光を、例えばアナリティカ・
キミカ・アクタ、第２４４巻、第２０７〜２１３頁（１
９９１））に記載の方法に準じ、蛍光偏光装置を装着し
た蛍光分光光度計により測定し、この測定値から下式
（Ｉ）に基づいて算出した蛍光異方性比を比較すること
により求めることができる。
伴う蛍光偏光の変位は、上記Ａ〜Ｃの工程を経て得られ
る試料溶液、および標的核酸を含まない溶液（コントロ
ール溶液）の各々の蛍光偏光を、例えばアナリティカ・
キミカ・アクタ、第２４４巻、第２０７〜２１３頁（１
９９１））に記載の方法に準じ、蛍光偏光装置を装着し
た蛍光分光光度計により測定し、この測定値から下式
（Ｉ）に基づいて算出した蛍光異方性比を比較すること
により求めることができる。
【００２０】また、上記のようにコントロールを用いず
とも、標的遺伝子を増幅する工程Ｃの段階で適当な時間
間隔で各試料溶液の蛍光偏光を上記と同様に測定するこ
とにより、経時的に蛍光偏光の変位を観察することもで
きる。
とも、標的遺伝子を増幅する工程Ｃの段階で適当な時間
間隔で各試料溶液の蛍光偏光を上記と同様に測定するこ
とにより、経時的に蛍光偏光の変位を観察することもで
きる。
【００２１】ここで、上記試料溶液の蛍光偏光の測定の
際の励起波長及び検出波長は、使用した蛍光標識の種類
に応じて適宜選択（例えば、フルオレセインイソチオシ
アネートを蛍光標識とした場合は、励起波長及び検出波
長は各々４９０ｎｍ，５２０ｎｍ）すればよい。
際の励起波長及び検出波長は、使用した蛍光標識の種類
に応じて適宜選択（例えば、フルオレセインイソチオシ
アネートを蛍光標識とした場合は、励起波長及び検出波
長は各々４９０ｎｍ，５２０ｎｍ）すればよい。
【００２２】なお、上記測定工程は、特に必要のない限
り、試料溶液を反応容器から取り出すことや、試料溶液
を希釈する等の操作を行うことなく実施できる。
り、試料溶液を反応容器から取り出すことや、試料溶液
を希釈する等の操作を行うことなく実施できる。
【００２３】
【数１】
【００２４】
【作用】本発明は、目的とする塩基配列を有する核酸成
分を特異的に検出できるため、各種感染症の診断のため
の微生物核酸の検出等に適用することができる。例えば
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウィルス
（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）、
ヘルペスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）等
のウィルス、大腸菌、結核菌、チフス菌、サルモネラ菌
もしくは腸炎ビブリオ菌等の細菌或いはマイコプラズマ
等の微生物に由来するＤＮＡ又はＲＮＡ中に特異的に存
在する塩基配列を認識するよう設計された核酸プライマ
ー及び核酸プローブを用いることにより、これら微生物
の感染症の診断を行うことができる。
分を特異的に検出できるため、各種感染症の診断のため
の微生物核酸の検出等に適用することができる。例えば
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウィルス
（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）、
ヘルペスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）等
のウィルス、大腸菌、結核菌、チフス菌、サルモネラ菌
もしくは腸炎ビブリオ菌等の細菌或いはマイコプラズマ
等の微生物に由来するＤＮＡ又はＲＮＡ中に特異的に存
在する塩基配列を認識するよう設計された核酸プライマ
ー及び核酸プローブを用いることにより、これら微生物
の感染症の診断を行うことができる。
【００２５】上記の如き微生物核酸検出用の核酸プライ
マー又は核酸プローブについては、多くのものが知られ
ているが、その具体例をあげれば、ＨＣＶ検出用核酸プ
ローブとしては特開平３−１０３１８０記載のもの、Ｅ
ＢＶ検出用核酸プローブとしては特開平５−３８００記
載のもの、腸炎ビブリオ菌検出用核酸核酸プライマー及
び核酸プローブとしては特開平４−２０２９９記載のも
の、マイコプラズマ検出用核酸プライマー及び核酸プロ
ーブとしては特開平５−８８記載のもの等があげられる
が、これらのものに限られるものではない。
マー又は核酸プローブについては、多くのものが知られ
ているが、その具体例をあげれば、ＨＣＶ検出用核酸プ
ローブとしては特開平３−１０３１８０記載のもの、Ｅ
ＢＶ検出用核酸プローブとしては特開平５−３８００記
載のもの、腸炎ビブリオ菌検出用核酸核酸プライマー及
び核酸プローブとしては特開平４−２０２９９記載のも
の、マイコプラズマ検出用核酸プライマー及び核酸プロ
ーブとしては特開平５−８８記載のもの等があげられる
が、これらのものに限られるものではない。
【００２６】なお、本明細書中、特にことわりのない限
り、ＤＮＡはデオキシリボ核酸、ＲＮＡはリボ核酸、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ン、Ｕはウラシルを意味する。
り、ＤＮＡはデオキシリボ核酸、ＲＮＡはリボ核酸、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ン、Ｕはウラシルを意味する。
【００２７】
実施例１ 〔実験方法〕 （１）〔蛍光標識核酸プローブの調製〕 標的ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ１８ファージＤＮＡ（文献
名：ジーン、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８
５））の塩基番号５５０８〜５５３７の領域に相補的な
配列を持つ３０量体のオリゴＤＮＡ（５’ＴＧＣＧＣＧ
ＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡ
ｐ；ｐは３’リン酸基を表す。）をＤＮＡ合成装置（ア
プライド・バイオシステムズ社製３８１型）により合成
した。この合成の際、オリゴヌクレオチドの５’末端の
塩基部分（Ｔ）には、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ−
ｄＴ（５’−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフ
ルオロアセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミ
ド〕−２’−デオキシウリジン−３’−〔（２−シアノ
エチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホルア
ミダイト；グレンリサーチ社製）を用いて、蛍光剤（フ
ルオレセインイソチオシアネート：以下ＦＩＴＣと略）
を結合させるためのリンカーを導入した。また、上記オ
リゴＤＮＡの３’末端の水酸基は２−〔２−（４，４’
−ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル〕エチ
ル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）−ホスホルアミダイト；グレンリサーチ社製）を用
いてリン酸化した。このオリゴＤＮＡをヌクレイックア
シッド・リサーチ、第１９巻、第４０９７〜４１０２頁
（１９９１年））記載の方法に準じ、以下の如くＦＩＴ
Ｃ標識した。
名：ジーン、第３３巻、第１０３〜１１９頁（１９８
５））の塩基番号５５０８〜５５３７の領域に相補的な
配列を持つ３０量体のオリゴＤＮＡ（５’ＴＧＣＧＣＧ
ＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡ
ｐ；ｐは３’リン酸基を表す。）をＤＮＡ合成装置（ア
プライド・バイオシステムズ社製３８１型）により合成
した。この合成の際、オリゴヌクレオチドの５’末端の
塩基部分（Ｔ）には、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ−
ｄＴ（５’−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフ
ルオロアセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミ
ド〕−２’−デオキシウリジン−３’−〔（２−シアノ
エチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホルア
ミダイト；グレンリサーチ社製）を用いて、蛍光剤（フ
ルオレセインイソチオシアネート：以下ＦＩＴＣと略）
を結合させるためのリンカーを導入した。また、上記オ
リゴＤＮＡの３’末端の水酸基は２−〔２−（４，４’
−ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル〕エチ
ル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）−ホスホルアミダイト；グレンリサーチ社製）を用
いてリン酸化した。このオリゴＤＮＡをヌクレイックア
シッド・リサーチ、第１９巻、第４０９７〜４１０２頁
（１９９１年））記載の方法に準じ、以下の如くＦＩＴ
Ｃ標識した。
【００２８】上記のリンカー導入済オリゴＤＮＡ２０ｎ
ｍｏｌを乾燥した後、０．１ｍｌの２０ｍｍｏｌのＦＩ
ＴＣ溶液（２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）とジメチル
ホルムアミドとを６：４で混合した溶液）に溶解し、２
５℃で４８時間反応させた。
ｍｏｌを乾燥した後、０．１ｍｌの２０ｍｍｏｌのＦＩ
ＴＣ溶液（２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）とジメチル
ホルムアミドとを６：４で混合した溶液）に溶解し、２
５℃で４８時間反応させた。
【００２９】反応終了後、反応液からＦＩＴＣ標識ＤＮ
Ａプローブを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（２５０×６．０
ｍｍ）、ワイエムシー社製）により精製した。この際、
得られる各フラクションの紫外可視吸収スペクトル（２
４０〜６００ｎｍ）を測定することにより、目的のＦＩ
ＴＣ標識ＤＮＡプローブの確認を行った。
Ａプローブを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（２５０×６．０
ｍｍ）、ワイエムシー社製）により精製した。この際、
得られる各フラクションの紫外可視吸収スペクトル（２
４０〜６００ｎｍ）を測定することにより、目的のＦＩ
ＴＣ標識ＤＮＡプローブの確認を行った。
【００３０】（２）〔標的核酸の検出〕 上記（１）の蛍光標識核酸プローブを用い、以下の手順
で標的核酸の検出を行った。
で標的核酸の検出を行った。
【００３１】５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス−
塩酸溶液（ｐＨ８．３）、２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレ
オチドプライマー（５’ＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴ
ＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣ ３’及び５’ＧＡＡＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧ
Ｃ ３’；配列番号２及び３）、２００μＭの各ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、３
ｍＭ塩化マグネシウム、２．５ユニットの耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ampli Taq ＤＮＡポリメラーゼ；パーキ
ンエルマー・シータス社製）、２０ｐｍｏｌの蛍光標識
核酸プローブ、並びに標的ＤＮＡ（一本鎖のＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡ、１０6 分子）を含む試料溶液２００μｌを
調製した。このうち、１００μｌをＥＤＴＡ（２０ｍ
Ｍ）含有１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈
して４００μｌとし、偏光測定装置を装着した蛍光分光
光度計（島津ＲＦ−５０００）を用いて２５℃で該試料
溶液の蛍光偏光を測定して、前記式（Ｉ）に従い蛍光異
方性比（ｒ1 ）を求めた。
塩酸溶液（ｐＨ８．３）、２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレ
オチドプライマー（５’ＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴ
ＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣ ３’及び５’ＧＡＡＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧ
Ｃ ３’；配列番号２及び３）、２００μＭの各ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、３
ｍＭ塩化マグネシウム、２．５ユニットの耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ampli Taq ＤＮＡポリメラーゼ；パーキ
ンエルマー・シータス社製）、２０ｐｍｏｌの蛍光標識
核酸プローブ、並びに標的ＤＮＡ（一本鎖のＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡ、１０6 分子）を含む試料溶液２００μｌを
調製した。このうち、１００μｌをＥＤＴＡ（２０ｍ
Ｍ）含有１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈
して４００μｌとし、偏光測定装置を装着した蛍光分光
光度計（島津ＲＦ−５０００）を用いて２５℃で該試料
溶液の蛍光偏光を測定して、前記式（Ｉ）に従い蛍光異
方性比（ｒ1 ）を求めた。
【００３２】次いで、残りの該試料溶液（１００μｌ）
に蒸発防止用のワックス（Ａｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ
Ｇｅｍ；パーキンエルマー・シータス社製）を１ペレ
ット重層した後、ＰＣＲ装置（アステック社製のＰＣ−
７００型）を用いて、熱変性（９５℃、１分）とアニー
リング及びプライマー伸長（６０℃、１分）のサイクル
を４０回行った後、６０℃で１０分間伸長反応を行っ
た。反応液をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）含有０．１Ｍトリス
−塩酸溶液（ｐＨ８．０）で希釈して４００μｌとし、
上記と同様に蛍光偏光を測定して、蛍光異方性比
（ｒ2 ）を求めた。
に蒸発防止用のワックス（Ａｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ
Ｇｅｍ；パーキンエルマー・シータス社製）を１ペレ
ット重層した後、ＰＣＲ装置（アステック社製のＰＣ−
７００型）を用いて、熱変性（９５℃、１分）とアニー
リング及びプライマー伸長（６０℃、１分）のサイクル
を４０回行った後、６０℃で１０分間伸長反応を行っ
た。反応液をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）含有０．１Ｍトリス
−塩酸溶液（ｐＨ８．０）で希釈して４００μｌとし、
上記と同様に蛍光偏光を測定して、蛍光異方性比
（ｒ2 ）を求めた。
【００３３】また、対照として、標的ＤＮＡを含まない
試料溶液（対照１）、並びに標的ＤＮＡ及びオリゴヌク
レオチドプライマーをそれぞれλＤＮＡ及び配列番号４
及び５のＤＮＡ（λＤＮＡと相補的な塩基配列を有する
ＤＮＡ）に代えた試料溶液（対照２）についても上記と
同様に処理して蛍光異方性比（ｒ1 及びｒ2 ）を求め
た。
試料溶液（対照１）、並びに標的ＤＮＡ及びオリゴヌク
レオチドプライマーをそれぞれλＤＮＡ及び配列番号４
及び５のＤＮＡ（λＤＮＡと相補的な塩基配列を有する
ＤＮＡ）に代えた試料溶液（対照２）についても上記と
同様に処理して蛍光異方性比（ｒ1 及びｒ2 ）を求め
た。
【００３４】〔結果〕結果は下記第１表に示す通りであ
る。
る。
【００３５】
【表１】
【００３６】〔考察〕上記の結果から、蛍光標識核酸プ
ローブの存在下でＰＣＲを実施することにより、目的と
する標的ＤＮＡが増幅したときのみ、蛍光標識核酸プロ
ーブの分解・低分子化が起こり、蛍光異方性比（ｒ）が
低下することが確認できた。このことから、標的ＤＮＡ
に相補的な塩基配列をもつ蛍光標識核酸プローブの存在
下でＰＣＲを行い、蛍光異方性比を測定することによ
り、標的ＤＮＡを特異的に検出できることがわかる。
ローブの存在下でＰＣＲを実施することにより、目的と
する標的ＤＮＡが増幅したときのみ、蛍光標識核酸プロ
ーブの分解・低分子化が起こり、蛍光異方性比（ｒ）が
低下することが確認できた。このことから、標的ＤＮＡ
に相補的な塩基配列をもつ蛍光標識核酸プローブの存在
下でＰＣＲを行い、蛍光異方性比を測定することによ
り、標的ＤＮＡを特異的に検出できることがわかる。
【００３７】なお、上記のＰＣＲ反応液を２％アガロー
スを用いた電気泳動で分析した結果、ＰＣＲにおける鋳
型ＤＮＡとなる標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ）を
含む試料の場合、標的ＤＮＡと相補的な塩基配列をもつ
蛍光標識核酸プローブの存在の如何にかかわらず、２種
のプライマーに挟まれた領域（３５０ｂｐ）が同等程度
に増幅されていることを確認した。このことから、蛍光
標識核酸プローブはプライマーとして作用せず、かつＰ
ＣＲを阻害しないことが明らかである。
スを用いた電気泳動で分析した結果、ＰＣＲにおける鋳
型ＤＮＡとなる標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ）を
含む試料の場合、標的ＤＮＡと相補的な塩基配列をもつ
蛍光標識核酸プローブの存在の如何にかかわらず、２種
のプライマーに挟まれた領域（３５０ｂｐ）が同等程度
に増幅されていることを確認した。このことから、蛍光
標識核酸プローブはプライマーとして作用せず、かつＰ
ＣＲを阻害しないことが明らかである。
【００３８】また、蛍光標識核酸プローブと相補的でな
いＤＮＡ（λＤＮＡ）が増幅される系（対照２）でも、
配列番号４及び５記載の２つのプライマーの間の５００
ｂｐのＤＮＡが増幅されたことからも、この蛍光標識核
酸プローブはＰＣＲを阻害しないことが明らかである。
なお、蛍光標識核酸プローブを含み、標的ＤＮＡ（鋳型
ＤＮＡ）を含まない反応系（対照１）では、ＤＮＡの増
幅は観察されなかった。
いＤＮＡ（λＤＮＡ）が増幅される系（対照２）でも、
配列番号４及び５記載の２つのプライマーの間の５００
ｂｐのＤＮＡが増幅されたことからも、この蛍光標識核
酸プローブはＰＣＲを阻害しないことが明らかである。
なお、蛍光標識核酸プローブを含み、標的ＤＮＡ（鋳型
ＤＮＡ）を含まない反応系（対照１）では、ＤＮＡの増
幅は観察されなかった。
【００３９】更に、上記本発明の方法、対照１及び２で
得られたＰＣＲ反応液を逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにて分析（励起波長＝４９０ｎｍ及び検出波長＝５２
０ｎｍで蛍光検出）したところ、蛍光標識核酸プローブ
と相補的な塩基配列を有する標的ＤＮＡが存在する系
（本発明の方法）でのみ、蛍光標識核酸プローブ由来の
分解生成物を検出した。即ち、目的とする塩基配列を有
するＤＮＡが増幅されるときのみ、蛍光標識核酸プロー
ブが分解されることが明らかである。
得られたＰＣＲ反応液を逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにて分析（励起波長＝４９０ｎｍ及び検出波長＝５２
０ｎｍで蛍光検出）したところ、蛍光標識核酸プローブ
と相補的な塩基配列を有する標的ＤＮＡが存在する系
（本発明の方法）でのみ、蛍光標識核酸プローブ由来の
分解生成物を検出した。即ち、目的とする塩基配列を有
するＤＮＡが増幅されるときのみ、蛍光標識核酸プロー
ブが分解されることが明らかである。
【００４０】実施例２ 〔実験方法〕各種濃度の標的ＤＮＡ（一本鎖のＭ１３ｍ
ｐ１８ＤＮＡ）を含む試料溶液を調製し、実施例１と同
様に処理して、ＰＣＲ反応液の蛍光偏光を測定し、蛍光
異方性比を求めた。
ｐ１８ＤＮＡ）を含む試料溶液を調製し、実施例１と同
様に処理して、ＰＣＲ反応液の蛍光偏光を測定し、蛍光
異方性比を求めた。
【００４１】〔結果〕結果は下記第２表に示す通りであ
る。
る。
【００４２】
【表２】
【００４３】〔考察〕上記の結果から、本発明方法によ
り、標的ＤＮＡを簡便かつ高感度で検出できることがわ
かる。
り、標的ＤＮＡを簡便かつ高感度で検出できることがわ
かる。
【００４４】
【発明の効果】本発明は、従来法、例えば蛍光標識ＤＮ
Ａプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイズによる標識
プローブの見かけの分子量増加に伴う蛍光偏光の変化
（蛍光異方性比の増加）を測定する方法（特開平２−７
５９５８）や蛍光標識核酸プローブをλエキソヌクレア
ーゼで分解し、当該プローブの低分子化に伴う蛍光偏光
の変化を測定する方法（ＷＯ９１／１７２６４）に較
べ、標的核酸を感度よく検出でき、偽陰性を防ぐことが
できるという優れた特長を有する。また、ＰＣＲ単独で
は、目的とする塩基配列以外の核酸の増幅による偽陽性
の出現が少なくないという難点があるが、本発明によれ
ば、増幅した核酸のうち目的とする塩基配列を有する標
的核酸のみを特異的に検出できるため、偽陽性の出現を
防ぐことができ、検出の信頼性が高いという特長をも有
する。
Ａプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイズによる標識
プローブの見かけの分子量増加に伴う蛍光偏光の変化
（蛍光異方性比の増加）を測定する方法（特開平２−７
５９５８）や蛍光標識核酸プローブをλエキソヌクレア
ーゼで分解し、当該プローブの低分子化に伴う蛍光偏光
の変化を測定する方法（ＷＯ９１／１７２６４）に較
べ、標的核酸を感度よく検出でき、偽陰性を防ぐことが
できるという優れた特長を有する。また、ＰＣＲ単独で
は、目的とする塩基配列以外の核酸の増幅による偽陽性
の出現が少なくないという難点があるが、本発明によれ
ば、増幅した核酸のうち目的とする塩基配列を有する標
的核酸のみを特異的に検出できるため、偽陽性の出現を
防ぐことができ、検出の信頼性が高いという特長をも有
する。
【００４５】更に、本発明は、ＰＣＲ反応液を反応容器
から取出すことなく標的核酸を検出することもできるた
め、増幅した核酸成分の拡散・汚染のおそれがなく、コ
ンタミネーションによる偽陽性の出現を防ぐこともでき
るという特長をも有する。
から取出すことなく標的核酸を検出することもできるた
め、増幅した核酸成分の拡散・汚染のおそれがなく、コ
ンタミネーションによる偽陽性の出現を防ぐこともでき
るという特長をも有する。
【００４６】
配列番号 ：１ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプローブ 配列の起源：ファージＭ１３ｍｐ１８ 配列 ：ＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ
ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡ 配列番号 ：２ 配列の長さ：２８ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：ファージＭ１３ｍｐ１８ 配列 ：ＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣ
ＴＡＣＴＣＡＧＧＣ 配列番号 ：３ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：ファージＭ１３ｍｐ１８ 配列 ：ＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧ
ＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣ 配列番号 ：４ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：λファージ 配列 ：ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣ
ＡＡＣＴＧＧ 配列番号 ：５ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：λファージ 配列 ：ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ
ＡＧＣＧＣＣ
ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡ 配列番号 ：２ 配列の長さ：２８ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：ファージＭ１３ｍｐ１８ 配列 ：ＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣ
ＴＡＣＴＣＡＧＧＣ 配列番号 ：３ 配列の長さ：３０ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：ファージＭ１３ｍｐ１８ 配列 ：ＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧ
ＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣ 配列番号 ：４ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：λファージ 配列 ：ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣ
ＡＡＣＴＧＧ 配列番号 ：５ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 １鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列の起源：λファージ 配列 ：ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ
ＡＧＣＧＣＣ
Claims (7)
- 【請求項１】〔Ａ〕１）一本鎖の標的核酸、２）該標的
核酸とその相補鎖にそれぞれ相補的な塩基配列をもつ核
酸プライマー及び３）該核酸プライマーよりも標的核酸
の下流（３’側）にハイブリダイズする塩基配列を有
し、かつ核酸合成酵素による伸長反応を受けないよう
３’末端が修飾された蛍光標識核酸プローブと、４）二
本鎖核酸に特異的なエキソヌクレアーゼ活性を併せ持つ
核酸合成酵素とを該酵素の基質である４種のヌクレオシ
ド三リン酸の存在下で接触させることにより、上記核酸
プライマー鎖を伸長させるとともに、標的核酸とハイブ
リダイズした蛍光標識核酸プローブのみを上記核酸合成
酵素中のエキソヌクレアーゼ活性領域の作用により分解
する工程、 〔Ｂ〕前記工程により得られるプライマー鎖伸長産物を
変性させて一本鎖の標的核酸を生成せしめる工程、 〔Ｃ〕工程Ａ〜Ｂを所望回数繰り返して標的核酸を増幅
する工程、並びに 〔Ｄ〕上記蛍光標識核酸プローブの分解に伴う蛍光偏光
の変位を測定する工程からなることを特徴とする核酸の
検出方法。 - 【請求項２】 標的核酸がＤＮＡであり、蛍光標識核
酸プローブの核酸部分がＤＮＡである請求項１記載の検
出方法。 - 【請求項３】 標的核酸が逆転写酵素によりＲＮＡか
ら誘導されたｃＤＮＡであり、蛍光標識核酸プローブの
核酸部分がＤＮＡである請求項１記載の検出方法。 - 【請求項４】 蛍光標識核酸プローブがフルオレセイ
ン誘導体で標識されたＤＮＡプローブである請求項１記
載の検出法。 - 【請求項５】 フルオレセイン誘導体がフルオレセイ
ンイソチオシアネートである請求項４記載の検出方法。 - 【請求項６】 核酸合成酵素がＤＮＡポリメラーゼで
ある請求項１記載の検出方法。 - 【請求項７】 ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アク
アチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来
のＤＮＡポリメラーゼである請求項７記載の検出方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5168895A JPH0723800A (ja) | 1993-07-08 | 1993-07-08 | 核酸の検出方法 |
| EP94110526A EP0639647A3 (en) | 1993-07-08 | 1994-07-06 | Method for the detection of nucleic acid sequences. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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