EA031429B1 - Сконструированные посадочные площадки для направленного воздействия на ген в растениях - Google Patents

Abstract

Способ получения трансгенного растения включает предоставление молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере два участка последовательности нуклеиновой кислоты, которые лишены гомологии последовательности с геномной ДНК растительной клетки, и по меньшей мере два сайта распознавания нуклеазы домена "цинковые пальцы", где по меньшей мере два участка последовательности нуклеиновой кислоты, которые лишены гомологии последовательности с геномной ДНК растительной клетки, фланкируют по меньшей мере два сайта распознавания нуклеазы домена "цинковые пальцы". Растительная клетка или ткань, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, стабильно интегрированную в геном растительной клетки, является трансформированной. Растение регенерируют из растительной клетки. Трансгенные растения получают с помощью способа. Семена получают с помощью трансгенных растений.

Description

Область техники

Изобретение в основном относится к композициям и способам генерирования трансгенных организмов, например, растений. В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению дает возможность инкорпорирования сконструированных посадочных площадок (engineered landing pads, ELP) в геномный сайт, облегчая, таким образом, введение следующих интересующих молекул нуклеиновых кислот в определенный геномный сайт, содержащий один или несколько ELP. В некоторых вариантах осуществления ELP может включать участки нуклеотидной последовательности, включающие, по существу, случайную последовательность, фланкирующую сайты связывания нуклеазы доменов цинковые пальцы (ZFN).

Уровень техники

Многие растения генетически трансформируются генами из других видов для введения целевых свойств, как, например, для улучшения сельскохозяйственной ценности посредством, например, улучшения качества питательной ценности, увеличения урожайности, придания устойчивости к вредителям или заболеваниям, посредством увеличения переносимости засушливого периода и внешних воздействий, посредством улучшения плодоводческих качеств, таких как пигментация и рост, и/или посредством придания устойчивости к гербицидам, т.е. это свойства, дающие возможность производства промышленно применимых соединений и/или материалов из растения и/или дающие возможность производства лекарственных средств. Введение клонированных генов в растительные клетки и получение стабильных плодоносящих трансгенных растений может использоваться для создания таких модификаций растения и позволяет создание генетически сконструированных растений (например, для улучшения культуры). В этих способах чужеродную ДНК случайным образом вводят в ядерную или в пластидную ДНК эукариотической растительной клетки с последующим выделением клеток, содержащих чужеродную ДНК, интегрированную в ДНК клетки с получением стабильно трансформированных растительных клеток.

Первые поколения трансгенных растений, как правило, были генерированы с помощью технологии трансформации, опосредованной Agrobacterium. Успех этих методов активизировал разработку других способов введения интересующей молекулы нуклеиновой кислоты в геном растения, таких как опосредованное ПЭГ поглощение ДНК в протопластах, бомбардировка микрочастицами и трансформация, опосредованная волокнами кремния.

Однако во всех этих методах трансформации трансгены, инкорпорированные в геном растения, интегрировались случайным образом и в непредсказуемом количестве копий. Часто трансгены могут быть интегрированы в форме повторов или полноразмерного трансгена или его частей. Такой комплексный профиль интеграции может влиять на уровень экспрессии трансгенов (например, с помощью нарушения транскрибируемой РНК посредством посттранскрипционного механизма сайленсинга генов или путем индуцирования метилирования введенной ДНК), осуществляя, таким образом, отрицательную регуляцию транскрипции трансгена. Кроме того, сайт интегрирования сам по себе может влиять на уровень экспрессии трансгена. Комбинация этих факторов приводит в результате к получению широкого спектра уровня экспрессии трансгенов или интересующей чужеродной ДНК среди различных трансгенных растительных клеточных линий и линий растений. Кроме того, интеграция интересующей чужеродной ДНК может обладать разрушительным действием на участок генома, где происходит интеграция и может влиять на нормальное функционирование этого участка, на который направлено воздействие, или нарушать его, приводя, таким образом, к частым нежелательным побочным эффектам.

Вышеизложенное неизбежно влечет за собой то, что во всех случаях, когда исследуют эффект введения конкретной чужеродной ДНК в растение, с целью получения значимых результатов генерируют и анализируют большое количество трансгенных линий растений. Аналогично, при генерировании трансгенных культур растений, где конкретную интересующую ДНК вводят в растения для получения трансгенного растения с целевым фенотипом, создают большую популяцию независимо созданных трансгенных линий растений, чтобы была возможность селекции линий растений с оптимальной экспрессией трансгенов и с минимальными побочными эффектами, оказываемыми на общий фенотип трансгенного растения, или с их отсутствием. Конкретно, в этой области целесообразны более управляемые способы трансгеноза, например, с точки зрения обременительных регуляторных требований и высоких затрат, связанных с повторениями полевых испытаний, требующихся для исключения нежелательных событий трансгеноза. Кроме того, очевидно, что было бы полезно иметь возможность вставки целевой ДНК в процессе укладки трансгена.

Было разработано несколько способов с целью контроля трансгенной вставки в растениях. См., например, Kumar and Fladung (2001), Trends Plant Sci. 6:155-9. Эти способы базируются на интеграции трансгена на основе гомологичной рекомбинации. Данная стратегия успешно применялась у прокариотов и низших эукариотов. Paszkowski et al. (1988), EMBO J. 7:4021-6. Однако для растений до недавнего времени главный механизм интеграции трансгена основывался на незаконной рекомбинации между ре

- 1 031429 комбинируемыми цепями ДНК. Таким образом, большая проблема в этой области связана с детектированием редких событий гомологичной рекомбинации, которые маскируются гораздо более эффективной интеграцией чужеродной ДНК посредством незаконной рекомбинации.

Специально созданные нуклеазы домена цинковые пальцы (ZFN) представляют собой белки, созданные для доставки целевых сайт-специфических двухцепочечных разрывов в ДНК с последующей рекомбинацией отщепленных концов. ZFN объединяют в себе домен неспецифичного отщепления эндонуклеазы рестрикции, такой как, например, FokI, вместе с ДНК-связывающими белковыми доменами цинковые пальцы. См., например, Huang et al. (1996), J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616-20; Kim et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1156-60; Kim et al. (1994), Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91:883-7; Kim et al. (1997b), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim et al. (1997c), Gene, 203:43-9; Kim et al. (1998), Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and aveh (1998), Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27:674-81. Индивидуальные мотивы цинковые пальцы могут быть созданы для направленного воздействия и связывания с широким спектром ДНК-сайтов. Канонические мотивы цинковых пальцев CyS₂His₂, а также не канонические CyS₃His связываются с ДНК путем вставки α-спирали в большую бороздку двойной спирали. Распознавание ДНК с помощью цинковых пальцев является модульным процессом: каждый палец контактирует сначала с тремя последовательными парами оснований в мишени, и несколько ключевых остатков в белке опосредуют распознавание. Было продемонстрировано, что эндонуклеаза рестрикции FokI должна димеризоваться посредством нуклеазного домена с целью отщепления ДНК, индуцирующего двухцепочечный разрыв.

Аналогично, ZFN также требуется димеризация нуклеазного домена с целью разрезания ДНК. Mani et al. (2005), Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28:3361-9. Димеризация ZFN облегчается двумя соседними, противоположно ориентированными сайтами связывания.

Сущность изобретения

В данном документе раскрыты способы введения молекулы нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, проявляющего низкую степень гомологичной рекомбинации, например, представляющего собой виды растений или животных. В конкретных примерах используются сконструированные посадочные площадки (ELP), где ELP могут включать участки нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидные последовательности, по существу, лишенные гомологии с геномом организмахозяина (например, случайно генерированные последовательности), фланкирующие сайты связывания для ДНК-связывающих доменов (например, белки с доменами цинковые пальцы (ZFP), мегануклеазы или лейциновые застежки). ДНК-связывающие домены, которые направленно воздействуют на сайты связывания ELP, могут в естественном состоянии включать функциональные домены ДНК-расщепления или могут быть частью химерных белков, которые дополнительно включают функциональный домен, например домен эндонуклеазного расщепления или половину домена расщепления (например, ZFN, рекомбиназа, транспозаза или эндонуклеаза направленного воздействия, содержащие модифицированный ДНК-связывающий домен). Этот класс ДНК-связывающих и расщепляющих белков коллективно обозначается в данном документе как эндонуклеазы направленного действия. В конкретных примерах также может использоваться не рандомизированная нуклеотидная последовательность из биологических источников, отличных от организма-хозяина; при этом отсутствие гомологии с геномом организма-мишени является подходящим. Таким образом, в некоторых примерах нуклеотидные последовательности могут быть сконструированы для гарантии, по существу, отсутствия гомологии с участками любых последовательностей генома растения-мишени.

В некоторых примерах ELP могут обеспечивать участки гомологии и сайты связывания для высокоактивных эндонуклеаз направленного действия (например, ZFN) для направленного воздействия на гены, связанного с гомологией. Следовательно, ELP могут уменьшать или исключать необходимость использования других нуклеотидных последовательностей, внешних или внутренних, во вставке нуклеиновой кислоты. ELP могут быть сконструированы так, чтобы они были лишены ложных открытых рамок считывания и содержали или не содержали сайты ферментов рестрикции, предпочтительные для конструкции векторов или анализа растений, трансформированных интересующей молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах ELP могут быть фланкированы неидентичными сайтами рестрикции, которые генерируют совместимые концы при гидролизе ферментом рестрикции, но гибридные лигированные сайты не расщепляются никаким из ферментов рестрикции. В этих и других примерах это дает возможность конкатенации ELP в большие конгломераты, каждый с уникальными участками гомологии и с сайтами связывания эндонуклеаз направленного воздействия (например, сайты связывания ZFN).

В некоторых примерах ELP могут быть инкорпорированы случайным образом в геном-мишень или в геномные сайты-мишени, которые, как было продемонстрировано, размещают трансгенные вставки без какого-либо вредного воздействия или с приемлемым вредным воздействием на полученные в результате трансгенные растения. Участки гомологии в геномном сайте-мишени могут быть идентичны участкам гомологии в целевой донорной молекуле нуклеиновой кислоте, облегчая, таким образом, направленную гомологичную рекомбинацию после двухцепочечного расщепления эндонуклеазами направленного воз

- 2 031429 действия (например, ZFN).

Соответственно, раскрыты способы создания и генерирования ELP для трансформации растения интересующей молекулой нуклеиновой кислоты. Также раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, применяемые по изобретению, и генетически модифицированные растения, получаемые согласно изобретению.

Все вышеописанное и другие признаки изобретения станут очевидны на основе следующего подробного описания некоторых вариантов осуществления, которые начинается со ссылок на сопровождающие их чертежи.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 включает изображение типичного вектора, содержащего ELP, pDAB 100610.

Фиг. 2 включает изображение типичного вектора, содержащего ELP, pDAB 100611.

Фиг. 3 включает изображение типичного вектора, содержащего ELP, pDAB 100640.

Фиг. 4 включает изображение типичного вектора, содержащего ELP, pDAB 100641.

Фиг. 5 включает изображение типичного вектора, содержащего донорный фрагмент, интегрированный в ELP, pDAB105955.

Фиг. 6 включает изображение типичного вектора, содержащего донорный фрагмент, интегрированный в ELP, pDAB105956.

Фиг. 7 включает изображение типичного вектора, содержащего донорный фрагмент, интегрированный в ELP, pDAB105979.

Фиг. 8 включает изображение типичного вектора, содержащего донорный фрагмент, интегрированный в ELP, pDAB105980.

Фиг. 9 представляет собой схему: a) ELP 1 в маисе; b) донорную конструкцию для переориентации ELP1; с) переориентированный локус ELP1.

Фиг. 10 включает изображение типичного вектора pDAB104132.

Фиг. 11 включает изображение типичного ДНК-фрагмента сайта множественного клонирования, который фланкирован сконструированными сайтами связывания с доменом цинковые пальцы и буферными последовательностями.

Фиг. 12 включает изображение типичного вектора pDAB104126.

Фиг. 13 включает изображение типичного вектора pDAB104136.

Фиг. 14 включает изображение типичного вектора pDAB104138. Фиг. 15 включает изображение типичного вектора pDAB104140. Фиг. 16 включает изображение типичного вектора pDAB104142. Фиг. 17 включает изображение типичного вектора pDAB104133. Фиг. 18 включает изображение типичного вектора pDAB104134. Фиг. 19 включает изображение типичного вектора pDAB104135. Фиг. 20 включает изображение типичного вектора pDAB104137. Фиг. 21 включает изображение типичного вектора pDAB104139. Фиг. 22 включает изображение типичного вектора pDAB104141. Фиг. 23 включает изображение типичного вектора pDAB104143.

Подробное описание

I. Обзор некоторых вариантов осуществления.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы для введения молекул нуклеиновых кислот, включающих сконструированные посадочные площадки (ELP), в организм-хозяин так, что облегчается интеграция последующих интересующих молекул нуклеиновых кислот в организм-хозяин. В вариантах осуществления ELP могут включать участки последовательности нуклеиновых кислот, которые не гомологичны нативным последовательностям организма-хозяина (например, по существу, случайно генерированные последовательности нуклеиновых кислот, которые могут быть затем отобраны для вставки на основе определенных целевых критериев, описанных в данном документе), и фланкирующие сайты распознавания эндонуклеаз направленного действия (например, сайты распознавания ZFN). Сайты интеграции ELP могут быть случайными, а могут определяться путем идентификации, например, структурного гена внутри генома-хозяина, который обладает целевым уровнем экспрессии интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, введенной в сайт ELP, или могут определяться с помощью идентификации локализации внутри генома-хозяина, которая не придает метаболического, функционального, агрономического (в случае растения) или другого нежелательного эффекта трансформированному организму-хозяину при введении ELP в сайт. ELP могут быть введены в геном в тандеме, так что, например, ELP присутствуют в качестве конкатамеров в организме, получаемом согласно способам по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления интеграция интересующей молекулы нуклеиновой кислоты осуществляется в сайте ELP. В вариантах осуществления интересующая молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в сайт ELP, ассоциирована с одной или несколькими эндонуклеазами направленного действия, представленными в виде полипептидов или экспрессирующимися из вводимой РНК или ДНК. Кроме того, вводимая молекула нуклеиновой кислоты может включать ELP, отличную от уже инкорпорирован

- 3 031429 ной в геном-хозяин. Специалистам в данной области понятно, что последовательность нуклеиновой кислоты, вводимая в геном-хозяин в сайт, где экспрессируется нативная последовательность нуклеиновой кислоты в организме дикого типа, будет, как ожидается, экспрессироваться аналогично нативной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, если нативная последовательность экспрессируется в организме дикого типа под контролем регуляторных элементов (например, таких что последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется тканеспецифичным образом или в зависимости от стадии развития), то ожидается, что вводимая последовательность нуклеиновой кислоты будет подвергаться воздействию такого же или подобного регуляторного контроля. Таким образом, ELP могут облегчать целевую временную и/или местную экспрессию интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, введенной по сайту ELP.

II. Сокращения.

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ,

ELP - сконструированная посадочная площадка,

ZFN - нуклеаза домена цинковые пальцы.

III. Термины.

Экспрессия гена: Процесс, с помощью которого кодируемая информация траскрипционной единицы нуклеиновой кислоты (включающая, например, геномную ДНК) превращается в действующую, не действующую или в структурную часть клетки, часто включая в себя синтез белка. На экспрессию гена могут оказывать влияние внешние сигналы; например экспонирование клетки, ткани или организма с агентом, который увеличивает или уменьшает экспрессию гена. Экспрессия гена также может регулироваться на любом уровне цепочки ДНК-РНК-белок. Регуляция экспрессии гена происходит, например, посредством контролей, воздействующих на транскрипцию, трансляцию, РНК-транспорт и процессинг, деградацию промежуточных молекул, таких как мРНК, или посредством активации, инактивации, компартментализации или деградации специфических белковых молекул после того, как они были синтезированы, или путем комбинации перечисленного. Экспрессия гена может быть измерена на уровне РНК или на уровне белка с помощью любого методов, известных в данной области, включающих, в частности, нозерн-блот, ОТ-ПЦР, вестерн-блот или анализы активности белка in vitro, in situ или in vivo.

Гибридизация: Олигонуклеотиды и их аналоги гибридизуются с помощью водородной связи, которая включает взаимодействие Уотсона-Крика, связывание по Хугстену или обратное Хугстеновское образование водородной связи между комплементарными основаниями. Как правило, молекулы нуклеиновых кислот состоят из азотистых оснований, которые представляют собой или пиримидиновые основания (цитозин (С), урацил (U), и тимидин (Т)), или пуриновые (аденин (А) и гуанин (G)). Эти азотистые основания образуют водородные связи между пиримидином и пурином, и связывание пиримидина с пурином обозначается как спаривание оснований. Более конкретно, А будет образовывать водородную связь с Т или U, и G будет связываться с С. Комплементарность обозначает спаривание оснований, которое происходит между двумя отдельными последовательностями нуклеиновых кислот или между двумя отдельными участками одной последовательности нуклеиновой кислоты.

Способны специфично гибридизоваться и специфично комплементарны это термины, которые указывают на достаточную степень комплементарности, так что происходит стабильное и специфичное связывание между олигонуклеотидом и ДНК- или РНК-мишенью. Для специфичной гибридизации олигонуклеотид необязательно должен быть на 100% комплементарен его последовательности-мишени. Олигонуклеотид способен специфично гибридизоваться, когда связывание олигонуклеотида с молекулами его ДНК- или РНК-мишеней препятствует нормальному функционированию ДНК- или РНК-мишени и имеется достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифичного связывания олигонуклеотида с последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, где целесообразно специфичное связывание, например, при физиологических условиях в случае in vivo-анализов или систем. Такое связывание обозначается как специфичная гибридизация.

Условия гибридизации, приводящие к конкретной степени жесткости, будут варьироваться в зависимости от характера выбранного способа гибридизации и от состава и длины гибридизующихся молекул нуклеиновых кислот. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (особенно концентрация Na⁺ и/или Mg²⁺) гибридизационного буфера будут способствовать жесткости гибридизации, хотя количество промывок также влияет на жесткость. Расчеты, касающиеся условий гибридизации, требуемые для достижения конкретной степени жесткости, раскрыты в Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11.

Для целей настоящего описания термин жесткие условия охватывает условия, при которых гибридизация будет происходить, если имеет место менее чем 25% несовпадений между гибридизующейся молекулой и последовательностью-мишенью. Жесткие условия могут дополнительно распределяться по конкретным уровням жесткости. Таким образом, при использовании в данном документе, условия умеренной жесткости это условия, при которых молекулы, имеющие более чем 25% несовпадений, не будут гибридизоваться. Условия средней жесткости это те, при которых молекулы, имеющие более чем 15% несовпадений, не будут гибридизоваться, и условия высокой жесткости это те, при которых по

- 4 031429 следовательность, имеющая более чем 10% несовпадений, не будет гибридизоваться. Условия очень высокой жесткости это те, при которых последовательности, имеющие более чем 6% несовпадений, не будут гибридизоваться.

В конкретных вариантах осуществления жесткие условия могут включать гибридизацию при 65°C, с последующими последовательными отмывками при 65°C с помощью 0,1х SSC/0,1% SDS в течение 40 мин.

Выделенный: Выделенный биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок), по существу, отделен от, получен независимо от или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент существует в естественном виде, т.е. от других хромосомных или внехромосомных ДНК, РНК и белков. Молекулы нуклеиновых кислот и белки, которые выделены, включают молекулы нуклеиновых кислот и белки, очищенные стандартными методами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот, белки и пептиды.

Молекула нуклеиновой кислоты: Полимерная форма нуклеотидов, которая может включать как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК и их синтетические формы и смешанные полимеры. Нуклеотид представляет собой рибонуклеотид, дезоксинуклеотид или модифицированную форму любого типа нуклеотида. При использовании в данном документе термин молекула нуклеиновой кислоты является синонимом нуклеиновой кислоты и полинуклеотида. Термин включает одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать каждый или оба типа нуклеотидов, а именно природные и модифицированные нуклеотиды, связанные вместе с помощью природных или синтетических нуклеотидных связей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать синтетические или модифицированные нуклеотидные основания, которые известны специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, введение метки, метилирование и замену одного или нескольких природных нуклеотидов на их аналоги. Другие модификации включают межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), заряженные связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), присоединенные компоненты (например, пептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы, алкилаторы и модифицированные связи (например, альфа-аномеры нуклеиновых кислот и т.д.). Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает любую топологическую конформацию, включающую одноцепочечную, двухцепочечную, частично двойную, тройную, в виде шпильки, циклическую и блокированную конформации.

Функционально связанный: Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. При рекомбинантном получении функционально связанные последовательности нуклеиновых кислот, как правило, являются сопряженными, а также там, где необходимо соединять два участка, кодирующих белок, в одной рамке считывания. Однако, для того чтобы быть функционально связанными, элементы необязательно должны быть сопряженными.

Промотор: Участок ДНК, который, как правило, локализован выше (по отношению к 5'-области гена) и необходим для транскрипции. Промоторы дают возможность корректной активации или репрессии гена, который они контролируют. Промотор содержит специфичные последовательности, которые распознаются транскрипционными факторами. Эти факторы связываются с промоторными последовательностями ДНК и приводят в результате к вовлечению РНК-полимеразы, фермента, который синтезирует РНК с кодирующего участка гена. В некоторых вариантах осуществления используются тканеспецифичные промоторы. Тканеспецифичный промотор это последовательность ДНК, которая управляет более высоким уровнем транскрипции ассоциированного гена в ткани, для которой промотор является специфичным, по отношению к другой ткани организма. Примеры тканеспецифичных промоторов включают промоторы, специфичные для тапетума; промоторы, специфичные для пыльника; промоторы, специфичные для пыльцы (см., например, патент США № 7141424, и международную публикацию РСТ № WO 99/042587); промоторы, специфичные для семязачатка; (см., например, патентную заявку США № 2001/047525 А1); промоторы, специфичные для плода (см., например, патент США № 4943674 и 5753475); и промоторы, специфичные для семени (см., например, патент США № 5420034 и 5608152). В некоторых вариантах осуществления также используются промоторы, специфичные для стадий развития, например, промотор, активный в поздней стадии развития.

Трансформированный: Вирус или вектор трансформирует или трансдуцирует клетку, когда он переносит молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Клетка является трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты, трансдуцированной в клетку, когда молекула нуклеиновой кислоты начинает стабильно реплицироваться клеткой, или путем инкорпорирования молекулы нуклеиновой кислоты в клеточный геном, или с помощью эписомной репликации. При использовании в данном документе, термин

- 5 031429 трансформация охватывает все методы, с помощью которых молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в клетку.

Примеры включают, в частности, трансфекцию вирусным векторами, трансформацию плазмидными векторами, электропорацию (Fromm et al. (1986), Nature, 319:791-3), липофекцию (Feigner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7), микроинъекцию (Mueller et al. (1978), Cell, 15:579-85), перенос, опосредованный Agrobacterium (Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-7), прямое поглощение ДНК и бомбардировку микрочастицами (Klein et al. (1987), Nature, 327:70).

Трансген: Экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления трансген представляет собой последовательность гена (например, гена устойчивости к гербициду), кодирующего промышленно или фармацевтически используемое соединение, или гена, кодирующего целевое сельскохозяйственное свойство. Еще в одном варианте осуществления трансген представляет собой антисмысловую последовательность нуклеиновой кислоты, где экспрессия антисмысловой последовательности нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Трансген может содержать регуляторные последовательности, функционально связанные с трансгеном (например, промотор). В некоторых вариантах осуществления интересующая молекула нуклеиновой кислоты, вводимая с помощью EL·P-направленной рекомбинации, является трансгеном. Однако в других вариантах осуществления интересующая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, где целесообразны дополнительные геномные копии эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, или представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая в организме хозяина находится в антисмысловой ориентации по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты-мишени.

Вектор: Молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, с получением трансформированной клетки. Вектор может включать последовательности нуклеиновой кислоты, которые дают ему возможность репликации в клетке-хозяине, такие как последовательность начала репликации. Примеры включают, в частности, плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус, которые переносят экзогенную ДНК в клетку. Вектор также может включать один или несколько генов, антисмысловых молекул и/или генов маркеров селекции и других генетических элементов, известных в данной области. Вектор может трансдуцировать, трансформировать или инфицировать клетку, вызывая, таким образом, в клетке экспрессию молекул нуклеиновой кислоты и/или белков, кодируемых вектором. Вектор необязательно включает материалы, помогающие в достижении проникновения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку (например, липосомы, кодированные белки и т.д.).

IV. Сконструированные посадочные для направленного воздействия на ген в растениях.

А. Краткое описание.

В некоторых вариантах осуществления ELP вводятся в растения, например, для облегчения введения одной или нескольких дополнительных интересующих молекул нуклеиновой кислоты. Дополнительные интересующие молекулы нуклеиновой кислоты могут включать, например, любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, экспрессирующийся в организме-хозяине. В дополнительных вариантах осуществления ELP используются для облегчения введения молекул нуклеиновой кислоты неизвестной функции для выяснения их функции на основе эктопической экспрессии гена. Участки, фланкирующие ELP, могут быть гомологичны геномной последовательности нуклеиновой кислоты растения-хозяина, так что ELP интегрируются в геном растения-хозяина сайт-специфическим образом. ELP могут использоваться для инкорпорирования молекул нуклеиновых кислот различных размеров.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, направленная к трансгенной ELP-мишени, может содержать вторую ELP для возможности продолжения добавления генов в целевой сайт. Одна или несколько эндонуклеаз направленного действия (например, ZFN) могут в данном процессе использоваться последовательно или одновременно. Если целесообразно, то один или несколько сайтов связывания с эндонуклеазой направленного действия (например, сайт связывания с ZFN) могут дополнительно добавляться к участкам ELP, которые гомологичны геномной последовательности нуклеиновой кислоты растения-хозяина. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания эндонуклеаз направленного действия могут быть добавлены так, чтобы они фланкировали ELP. В данном последнем и в следующих вариантах осуществления экспрессия эндонуклеаз направленного действия (например, ZFN), которые расщепляют в добавленных сайтах связывания, приводит к вырезанию ELP из генома растения.

В некоторых вариантах осуществления участки, гомологичные геномной последовательности нуклеиновой кислоты растения-хозяина, также могут использоваться в комбинации с другими фланкирующими ДНК, чтобы была возможность вставки молекул нуклеиновой кислоты по соседству с интересующей молекулой нуклеиновой кислоты, введенной по сайту-мишени ELP, таких как, например, элемент экспрессии интересующего гена или интересующий ген. ДНК-расщепление может использоваться для усиления гомологичной рекомбинации по этому сайту. В некоторых вариантах осуществления участки гомологии в ELP, которые гомологичны геномной последовательности нуклеиновой кислоты, также могут использоваться для направленной вставки молекул нуклеиновых кислот, которая облегчается с по

- 6 031429 мощью ферментов, которые расщепляют ДНК, таких как ZFN, мегануклеазы или эндонуклеазы направленного действия.

В некоторых вариантах осуществления ELP могут быть инкорпорированы в модифицированные хромосомные участки, такие которые могут быть генерированы с помощью процессов ДНКамплификации, или в минихромосомы. В некоторых вариантах осуществления участки гомологии и соответствующе расположенные эндонуклеазы направленного действия (например, ZFN) используются для облегчения модификации последовательностей, внутренних по отношению к фланкирующим участкам, гомологичным геномной последовательности нуклеиновой кислоты растения-хозяина.

В. Дизайн ELP.

В некоторых вариантах осуществления ELP могут быть сконструированы для облегчения гомологичной рекомбинации в хромосомных локализациях растения. ELP могут обладать нейтральным влиянием на окружающие их гены или последовательности ДНК. ELP могут характеризовать уникальные последовательности, способные в геноме растения подвергаться направленному воздействию. В некоторых вариантах осуществления размер (например, 1 т.п.н.) для каждого 5'- и З'-участка гомологии с целевой хромосомной локализацией выбирают так, чтобы он соответствовал минимальному размеру, который предположительно целесообразен для облегчения направленной гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления размер для каждого 5'- и З'-участка гомологии составляет примерно 50; 100; 200; 400; 600; 700; 750; 800 п.н.; 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2 или 3 т.п.н. Нет необходимости, чтобы в конкретных вариантах осуществления 5'- и 3'-участки гомологии имели одинаковый размер. ELP-последовательности могут быть получены, например, с использованием компьютерной программы для генерации случайных чисел. ELP-последовательности, полученные, например, с помощью генерация случайных последовательностей, затем могут быть отобраны для использования в качестве ELP на основе целевых характеристик, включающих, в частности, последовательности, по существу или полностью лишенные гомологии с нативными геномными последовательностями организма-мишени. Отобранные ELP также могут быть модифицированными, как описано подробно ниже.

В некоторых вариантах осуществления критерии для конструирования ELP и/или модификации отобранных ELP могут включать один или несколько из следующих: удаление сайтов рестрикции, обычно используемых для клонирования; уменьшение количества потенциальных сайтов метилирования (например, CG и CNG); и отсутствие любой открытой рамки считывания более чем 300 п.н. Кроме того, во время конструирования ELP, могут быть удалены другие сайты в последовательностях нуклеиновых кислот, включающие, например, соединения экзон:интрон (5'- или 3'-); сигналы добавления poly А; сигналы терминации РНК-полимеразы и высокостабильные внутрицепочечные вторичные структуры.

Последовательности также могут быть проанализированы и модифицированы для уменьшения частоты пар ТА или CG. Блоки последовательности, которые содержат более чем примерно шесть последовательных остатков [G+C] или [А+Т], также могут быть удалены из последовательности во время конструирования ELP.

В вариантах осуществления ELP могут включать, например, нуклеотидные последовательности формулы X₁-Y-X₂, где Y представляет собой по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия (например, сайт связывания ZEN), где X1 представляет собой отобранную нуклеотидную последовательность, лишенную гомологии с геномом организма-хозяина и расположенную в 5'области по отношению к Y, и где Х₂ представляет собой отобранную нуклеотидную последовательность, лишенную гомологии с геномом организма-хозяина, и которая отлична от X1.

Типичные нуклеотидные последовательности X1 и Х2 независимо могут быть выбраны из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Дополнительные модификации, делеции или добавления к этим последовательностям (например, удаление или добавление сайтов рестрикции) могут быть сделаны в некоторых вариантах осуществления для обеспечения дополненной или отличной функциональности. Например, в некоторых вариантах осуществления: SEQ ID NO: 1 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 3 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 2 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 4 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 5 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 6 может быть модифицирована с получением SEQ ID NO: 18.

В конкретных вариантах осуществления типичные ELP включают, в частности, следующие последовательности: SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 19.

Сайты ферментов рестрикции (например, сайты фермента FseI) могут быть введены, фланкируя ELP с возможностью клонирования ELP в соответствующий вектор. Также могут вводиться такие сайты ферментов рестрикции, фланкируя ELP, которые производят совместимые концы при гидролизе ферментами рестрикции (например, сайты BglII и BamHI), чтобы была возможность сцепления ELP вместе, например, в виде конкатамера, в геноме растения-хозяина. Также сайты ферментов рестрикции могут вводиться для возможности анализа интересующих последовательностей нуклеиновых кислот в растениихозяине, которые затем направляются к ELP с помощью рекомбинации. Два или более сайтов рестрик

- 7 031429 ции могут быть введены по флангам одной ELP. Например, сайты BglII и BamHI могут быть включены на внутреннем участке по отношению к сайтам FseI. Также сайты ферментов рестрикции могут вводиться для возможности анализа интересующих последовательностей нуклеиновых кислот в растениихозяине, которые направляются к ELP для вставки с помощью рекомбинации. Например, сайты PmeI могут быть введены по флангам по отношению к сайту вставки.

С. Доставка молекул нуклеиновых кислот в растительные клетки, содержащие ELP.

Для возможности интеграции, опосредованной эндонуклеазами направленного действия, интересующей молекулы нуклеиновой кислоты (например, ELP и/или экзогенных молекул нуклеиновых кислот, направленных к ранее интегрированным ELP) в геном растения посредством направленной интеграции, необходима доставка эндонуклеаз направленного действия или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих эндонуклеазы направленного действия, с последующей экспрессией функционального белка эндонуклеазы направленного действия в геноме растения-хозяина. Интересующая молекула нуклеиновой кислоты также должна присутствовать в растительной клетке в тот момент, когда туда доставлена или когда там экспрессируется эндонуклеаза направленного действия, так что функциональный белок эндонуклеазы направленного действия может индуцировать двухцепочечные разрывы в сайтах-мишенях, которые затем подвергаются репарации посредством направленной гомологичной интеграции интересующей молекулы нуклеиновой кислоты в целевой локус. Специалист в данной области может представить, что экспрессия функционального белка эндонуклеазы направленного действия может быть достигнута несколькими методами, включающими, в частности, трансгеноз конструкции, кодирующей эндонуклеазу направленного действия, или транзиторную экспрессию конструкции, кодирующей эндонуклеазу направленного действия. В обоих случаях, экспрессия функционального белка эндонуклеазы направленного действия и доставка донорной ДНК в растительную клетку могут достигаться одновременно с целью управления направленной интеграцией.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления эндонуклеазы направленного действия (например, ZFN) экспрессируются из молекул нуклеиновых кислот в трансформированных растениях для введения двухцепочечных разрывов в геноме трансформированных растений, например, в одном или в нескольких ELP, ранее введенных в растение. Могут использоваться такие эндонуклеазы направленного действия, которые нацелены на одну или несколько последовательностей распознавания, которые, согласно конструкции, присутствуют в ELP. Дизайн и выбор способов для конструирования ELP по изобретению могут, таким образом, начинаться с определения одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот, которые распознаются эндонуклеазами направленного действия, используемыми впоследствии для введения интересующей молекулы нуклеиновой кислоты в ELP. Гибкость и специфичность систем ZFN обеспечивает уровень контроля, ранее не достижимый с помощью известных стратегий вырезания генов, опосредованных рекомбиназой.

В качестве примера, ZFN легко могут быть сконструированы, например, для распознавания специфичных последовательностей нуклеиновых кислот (например, ELP). Wu et al. (2007), Cell. Mol. Life Sci. 64: 2933-44. Рандомизация кодонов для остатков распознавания цинковых пальцев дает возможность селекции новых цинковых пальцев, которые обладают высокой аффинностью к произвольно выбранным последовательностям ДНК. Кроме того, цинковые пальцы представляют собой природные ДНКсвязывающие молекулы, и сконструированные цинковые пальцы, как было продемонстрировано, воздействуют на их сконструированные мишени в живых клетках. Таким образом, нуклеазы на основе цинковых пальцев способны направляться к специфичным, но произвольным сайтам.

Требование димеризации доменов расщепления химерных нуклеаз доменов цинковые пальцы обеспечивает высокий уровень специфичности последовательности. Так как каждый набор из трех цинковых пальцев связывается с девятью последовательными парами оснований, то две химерные нуклеазы эффективно справляются с мишенью 18 п.н., если каждый домен цинковый палец обладает идеальной специфичностью. Прогнозируется, что любая данная последовательность данного размера является уникальной в единственном геноме (предполагается приблизительно 10⁹ п.н.). Bibikova et al. (2001), Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97; Wu et al. (2007) (выше). Кроме того, дополнительные цинковые пальцы обеспечивают повышенную специфичность, Beerli et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14628-33; Kim and Pabo (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2812-7; Liu et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5525-30, так что количество цинковых пальцев в каждом ДНК-связывающем домене может быть увеличено с получением дополнительной специфичности. Например, специфичность может быть дополнительно увеличена путем использования 4-пальцевых ZFN, которые распознают последовательность 24 п. н. Urnov et al. (2005), Nature, 435:646-51. Таким образом, ZFN могут использоваться так, чтобы последовательность распознавания в ELP, вводимой в геном растения-хозяина, была уникальной в геноме.

Интересующая молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят с помощью направленной рекомбинации в ELP, может быть функционально связана с одним или несколькими растительными промоторами, управляющими экспрессией гена, в количестве, достаточном для придания целевого свойства или фенотипа. Промоторы, подходящие для данного и для других применений, хорошо известны в данной области. Неограничивающие примеры, описывающие такие промоторы, включают патенты США № 6437217 (маисовый RS81-промотор); 5641876 (рисовый промотор актина); 6426446 (маисовый RS324

- 8 031429 промотор); 6429362 (маисовый PR-1-промотор); 6232526 (маисовый А3-промотор); 6177611 (конститутивные промоторы маиса); 5322938, 5352605, 5359142, и 5530196 (35Б-промотор); 6433252 (маисовый промотор L3 олеосина); 6429357 (рисовый промотор актина 2, и рисовый интрон актина 2); 5837848 (промотор, специфичный для корней); 6294714 (индуцируемые светом промоторы); 6140078 (индуцируемые солью промоторы); 6252138 (индуцируемые патогеном промоторы); 6175060 (промоторы, индуцируемые дефицитом фосфора); 6388170 (двунаправленные промоторы); 6635806 (промотор гаммакоиксина); и патентная заявка США с порядковым номером № 09/757089 (маисовый промотор адолазы хлоропластов). Дополнительные промоторы включают промотор нопалин-синтазы (NOS) (Ebert et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(16):5745-9); промотор октопин-синтазы (OCS) (который переносится на опухолеиндуцирующих плазмидах Agrobacterim tumefaciens); колимовирусные промоторы, такие как 19S-промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Lawton et al. (1987), Plant Mol. Biol. 9:31524); промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985), Nature, 313:810-2; 35S-промотор вируса мозаики норичника (Walker et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(19):6624-8); промотор синтазы сахарозы (Yang and Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-8); комплексный промотор гена R (Chandler et al. (1989), Plant Cell, 1:1175-83); промотор гена, кодирующего белок, связывающий хлорофилл a/b; CaMV35S (патенты США № 5322938, 5352605, 5359142 и 5530196); FMV35S (патенты США № 6051753 и 5378619); PdSV-промотор (патент США № 5850019); SCP1-промотор (патент США № 6677503) и промоторы AGRtu.nos (регистрационный номер GenBank No. V00087; Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983), Nature, 304:184-7) и т.д.

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующей молекулой нуклеиновой кислоты, включают последовательности, кодирующие транзитные пептиды. Например, инкорпорирование подходящего транзитного пептида хлоропластов, такого как А. thaliana EPSPS CTP (Klee et al. (1987), Mol. Gen. Genet. 210:437-42) и Petunia hybrida EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6873-7), как было продемонстрировано, направляет гетерологичные последовательности белка EPSPS к хлоропластам в трансгенных растениях. Монооксигеназа Dicamba (DMO) также может направляться к хлоропластам, как описано в международной публикации РСТ № WO 2008/105890.

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующей молекулой нуклеиновой кислоты, также включают 5'UTR, расположенные между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, которая функционирует в качестве лидерной последовательности трансляции. Лидерная последовательность трансляции присутствует в полностью процессированной мРНК в 5'-области по отношению к последовательности старта трансляции. Лидерная последовательность трансляции может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК, на стабильность мРНК и/или на эффективность трансляции. Примеры лидерных последовательностей трансляции включают лидеры белка теплового шока маиса и петуньи (патент США № 5362865), лидеры белков оболочки вирусов растений, лидеры рибулозобифосфаткарбоксилазы/оксигеназы растений и другие. См., например, Turner and Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36. Неограничивающие примеры 5'UTR включают GmHsp (патент США № 5659122); PhDnaK (патент США № 5362865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990), J. Virol. 64:1590-7); и AGRtunos (регистрационный номер GenBank No. V00087; и Bevan et al. (1983), Nature, 304:184-7).

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующей молекулой нуклеиновой кислоты, также включают 3'-нетранслируемые последовательности, 3'-участки терминации транскрипции или участки полиаденилирования. Это генетические элементы, локализованные в 3'-области полинуклеотидной молекулы, включают полинуклеотиды, которые обеспечивают сигнал полиаденилирования и/или другие регуляторные сигналы, способные влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или на экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования функционирует в растениях для того, чтобы индуцировать добавление полиаденилатных нуклеотидов к 3'-концу мРНК-предшественника. Последовательность полиаденилирования может быть выделена из натурального гена, из множества растительных генов или из генов Т-ДНК. Неограничивающим примером 3'-участка терминации транскрипции является 3'-участок нопалин-синтазы (nos 3'; Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-7). Пример применения различных нетранслируемых 3'-участков предлагается в Ingelbrecht et al., (1989), Plant Cell, 1:671-80. Неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования включают сигнал из гена bcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984), EMBO, J. 3:1671-9) и AGRtu. nos (регистрационный номер GenBank No. E01312).

D. Трансформация клеток-хозяев молекулами нуклеиновой кислоты.

Для получения трансформированного растения согласно изобретению могут использоваться любые из методов, известных в данной области, для введения молекул нуклеиновых кислот в растения, например, для введения одной или нескольких ELP в геном растения-хозяина и/или для дополнительного введения интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. Подходящие методы трансформации растений включают любой метод, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку, такой как: электропорация, как проиллюстрировано в патенте США № 5384253; бомбардировка микрочастицами, как проиллюстрировано в патентах США № 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861 и 6403865; трансформа

- 9 031429 ция, опосредованная Agrobacterium, как проиллюстрировано в патентах США № 5635055, 5824877, 5591616; 5981840 и 6384301; и трансформация протопластов, представленная в патенте США № 5508184. Посредством применения методов, таких как эти, виртуально, клетки любого вида растения могут быть стабильно трансформированы, и эти клетки могут быть регенерированы в трансгенные растения с помощью методов, известных специалистам в данной области. Например, методы, которые могут быть конкретно применимы в контексте трансформации хлопка, раскрыты в патентах США № 5846797, 5159135, 5004863 и 6624344; методы трансформации растений Brassica конкретно раскрыты, например, в патенте США № 5750871; методы трансформации сои раскрыты, например, в патенте США № 6384301; и методы трансформации кукурузы раскрыты, например, в патентах США № 7060876, 5591616 и в международной публикации РСТ WO 95/06722.

После осуществления доставки экзогенной ДНК клеткам-реципиентам трансформированные клетки, как правило, идентифицируют для дальнейшего культивирования и регенерации растения. Для улучшения способности идентификации трансформантов, специалисту может быть целесообразно применить селектируемый и скринируемый ген маркера вместе с вектором трансформации, используемым для генерирования трансформанта. В этом случае потенциально трансформированная популяция клеток может быть проанализирована с помощью экспонирования клеток с селективным агентом или агентами, или клетки могут быть скринированы на присутствие свойства, присущего целевому гену маркера.

Клетки, которые жизнеспособны при экспонировании с селективным агентом, или клетки, которые оценили как положительные в скрининговом анализе, могут культивироваться в среде, которая поддерживает регенерацию растений. В некоторых вариантах осуществления любая подходящая среда для культивирования тканей растений (например, среда MS и N6) может быть модифицирована путем включения дополнительных веществ, таких как регуляторы роста. Ткань может поддерживаться на основной среде, содержащей регуляторы роста до тех пор, пока не будет доступно достаточно ткани для того, чтобы начать предпринимать усилия для регенерации растения, или после повторных раундов ручной селекции до тех пор, пока морфология ткани не будет подходящей для регенерации (например, по меньшей мере 2 недели), затем ткань переносят в среду, благоприятную для образования побегов. Культуры переносят периодически до тех пор, пока не происходит достаточное образование побегов. После того, как образовались побеги, их переносят в среду, благоприятную для образования корней. После образования достаточного количества корней, растения могут быть перенесены в почву для дальнейшего роста и созревания.

Для подтверждения присутствия интересующей молекулы нуклеиновой кислоты в регенерированном растении может быть осуществлено множество анализов. Такие анализы включают, например, молекулярно-билогические анализы, такие как саузерн- и нозерн-блотинг и ПЦР; биохимические анализы, такие как детектирование присутствия белкового продукта. например, с помощью иммунологических методов (тИФА и/или вестерн-блот) или с помощью ферментативной функции; анализы частей растения, такие как анализы листьев или корней; и анализ фенотипа цельного регенерированного растения.

События направленной интеграции могут быть скринированы, например, с помощью ПЦРамплификации с использованием, например, олигонуклеотидных праймеров, специфичных для интересующих молекул нуклеиновой кислоты. Понятно, что ПЦР-генотипирование включает, в частности, амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) геномной ДНК, полученной из выделенной каллюсной ткани растения-хозяина, которая предположительно содержит интересующую молекулу нуклеиновой кислоты, интегрированную в геном, с последующим стандартным клонированием и анализом последовательности продуктов ПЦР-амплификации. Методы ПЦР-генотипирования хорошо описаны (например, Rios, G. et al. (2002), Plant J. 32:243-53) и могут применяться к геномной ДНК, полученной из любого вида растений или типа ткани, включая клеточные культуры. Комбинации олигонуклеотидных праймеров, которые связываются как с последовательностью-мишенью, так и с введенной последовательностью, могут использоваться последовательно или одновременно в реакциях ПЦРамплификации. Возможно создание олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для отжига в сайте-мишени введенных последовательностей нуклеиновой кислоты, и/или их комбинация. Таким образом, стратегии ПЦР-генотипирования могут включать (но не ограничиваясь этим) амплификацию специфичных последовательностей в геноме растения, амплификацию множества специфичных последовательностей в геноме растения, амплификацию неспецифичных последовательностей в геноме растения или их комбинацию. Специалист в данной области может изобрести дополнительные комбинации праймеров и реакций амплификации для проверки генома. Например, может быть сконструирован набор прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров для отжига последовательностей нуклеиновых кислот, специфичных для мишеней за границами введенной последовательности нуклеиновой кислоты.

Прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры могут быть сконструированы для специфичного отжига на введенной интересующей молекуле нуклеиновой кислоты, например, на последовательности, соответствующей кодирующей области внутри интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, или соответствующей другим частям интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. Эти праймеры могут использоваться совместно с праймерами, описанными выше. Олигонуклеотидные праймеры могут быть синтезированы согласно целевой последовательности и являются коммерчески доступными (например,

- 10 031429 из Integrated DNA Technologies, Inc., Коралвилл, Айова). За амплификацией может следовать клонирование и секвенирование или прямой анализ продуктов амплификации. Специалисту в данной области очевидны альтернативные методы анализа продуктов амплификации, полученных в процессе ПЦРгенотипирования. В одном варианте осуществления олигонуклеотидные праймеры, специфичные для гена-мишени, применяются в ПЦР-амплификациях.

Е. Культивирование и применение трансгенных растений.

Трансгенное растение, включающее одну или несколько ELP и/или интересующую молекулу нуклеиновой кислоты, вставленную с помощью направленной рекомбинации в ELP-сайт согласно настоящему изобретению, может обладать одним или несколькими целевыми свойствами. Такие свойства могут включать, например, устойчивость к насекомым, другим вредителям и к агентам, вызывающим заболевания; устойчивость к гербицидам; повышенную стабильность, урожайность или срок годности; устойчивость к воздействию окружающей среды; производство лекарственного средства; производство промышленного продукта; и повышение питательных свойств. Целевые свойства могут придаваться одной или несколькими интересующими молекулами нуклеиновой кислоты, вставленными с помощью направленной рекомбинации по сайту ELP, которые экспрессируются в растении, демонстрирующем целевые свойства. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления целевые свойства могут возникнуть благодаря присутствию трансгена (трансгенов) в растении, который вводится в геном растения по сайту ELP. В дополнительных вариантах осуществления целевое свойство может быть получено посредством традиционного разведения, причем целевое свойство может придаваться с помощью одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, вставленных с помощью направленной рекомбинации по сайту ELP.

Трансгенное растение согласно изобретению может представлять собой любое растение, способное к трансформации с использованием молекул нуклеиновой кислоты по изобретению. Соответственно, растение может быть двудольным или однодольным. Неограничивающие примеры двудольных растений, используемых в способах по настоящему изобретению, включают люцерну, фасоль, брокколи, капусту, морковь, цветную капусту, сельдерей, китайскую капусту, хлопок, огурец, баклажан, салат, дыню, горох, перец, арахис, картофель, тыкву, хрен, рапс, шпинат, сою, тыкву крупноплодную, сахарную свеклу, подсолнечник, табак, томат и арбуз. Неограничивающие примеры однодольных растений, используемых в способах по настоящему изобретению, включают кукурузу, лук, рис, сорго, пшеницу, рожь, просо, сахарный тростник, овес, тритикале, просо волосовидное и газонную траву.

Трансгенные растения согласно изобретению могут использоваться или культивироваться любым способом, где целесообразно присутствие ELP и/или интересующих молекул нуклеиновой кислоты. Соответственно, среди прочего, могут быть созданы трансгенные растения, обладающие одним или несколькими целевыми свойствами, с помощью трансформации молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и они могут возделываться и культивироваться с помощью любого метода, известного специалисту в данной области.

Примеры

Следующие примеры включены для иллюстрации вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области понятно, что методы, раскрытые в примерах, представляют собой методы, разработанные авторами изобретения для успешного практического функционирования изобретения. Однако специалистам в данной области в свете настоящего описания будет понятно, что может быть произведено множество изменений в конкретных вариантах осуществления, которые раскрыты в данном документе, и, тем не менее, будут получены подобные или аналогичные результаты, не выходя при этом за рамки изобретения. Более конкретно, очевидно, что существуют определенные агенты, которые как химически, так и физиологически могут заменять агенты, описанные в данном документе, и при этом будут достигаться такие же или подобные результаты. Предполагается, что как таковые, подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, находятся в рамках изобретения, определенного с помощью прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1. Конструкция вектора.

Синтезировали две различных ELP, которые состоят из 5'-участка гомологии размером 1 т.п.н. (сконструированный участок посадочной площадки 1 (SEQ ID NO: 11) в pDAB100610/pDAB 100640 и сконструированный синтетический гомологичный участок 3 (SEQ ID NO: 12) в pDAB100611/pDAB100641) и 3'-участок гомологии размером 1 т.п.н. (сконструированный участок посадочной площадки 2 (SEQ ID NO: 13) в pDAB100610 и сконструированный синтетический гомологичный участок 4 (SEQ ID NO: 14) в pDAB100611/pDAB100641). Эти участки гомологии разделены двумя различными ТОЧНЫМИ сайтами связывания Нуклеазы домена цинковые пальцы (eZFN).

Две ELP, используемые для pDAB100610 и pDAB100611, обозначенные ELP1 (SEQ ID NO: 15) и ELP2 (SEQ ID NO: 16) соответственно, переносили с использованием реакции с помощью GATEWAY® LR-клоназы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в pDAB 100704, вектор двойного назначения, который получен из pSB11 (WO 94/00977 и WO 95/06722). pDAB100704 содержит промотор ZmUbil (промотор, 5'-нетранслируемый участок (UTR) и интрон, полученный из промотора убиквитина 1 Zea mays (Christensen et al. (1992), Plant Molecular Biology, 18(4); 675-89)), ген маркера селекции AAD-1 (синтетический, оптимизированный для растений вариант гена арилоксиалканоат диоксигеназы из Sphingobium

- 11 031429 herbicidovorans (АТСС® 700291), кодирующий фермент с альфа-кетоглутатарт-зависимой диоксигеназной активностью, который придает устойчивость к арилоксифеноксипропионатным гербицидам (WO 2005/107437, WO 2008/141154A2 и US 2009/0093366, каждый из которых включен в данный документ ссылкой), и ZmLip 3'UTR (3'-нетранслируемый участок (UTR), включающий терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена LIP Zea mays; регистрационный номер GenBank L35913).

Две ELP, используемые для pDAB 100640 и pDAB 100641, обозначенные ELP1 (SEQ ID NO: 15) и ELP2 (SEQ ID NO: 16) соответственно, переносили с использованием реакции с помощью GATEWAY® LR-клоназы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в pDAB101849, бинарный вектор, pDAB101849 содержит промотор OsAct1 (промотор и интрон, полученный из рисового промотора актина (патент США № 5641876)), ген маркера селекции pat (ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы; Wohlleben et al., (1988), Gene, 70:25-37) и ZmLip 3'UTR (3'-нетранслируемый участок (UTR), включающий терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена LIP Zea mays; регистрационный номер GenBank L35913).

Полученные в результате клоны, pDAB100610 (фиг. 1), PDAB100611 (фиг. 2), pDAB100640 (фиг. 3) и pDAB100641 (фиг. 4) подтверждали секвенированием. Векторы pDAB100610 и pDAB100611 переносили в Agrobacterium tumefaciens, штамм LBA4404, несущий бинарную плазмиду pSB1, и Т-цепочечный участок интегрировали в pSB1 посредством гомологичной рекомбинации. Векторы pDAB100640 и pDAB100641 переносили в Agrobacterium tumefaciens, штамм LBA4404. Структуру каждой плазмиды подтверждали с помощью гидролиза ферментами рестрикции.

Векторы, содержащие интересующие молекулы нуклеиновой кислоты (донорная ДНК), собирали путем вставки экспрессирующей кассеты YFP и либо PAT, либо AAD-1-экспрессирующей кассеты между укороченными вариантами 5'- и 3'-участков гомологии (обозначены как варианты 2 (v2)) для ELP1 и ELP2. Экспрессирующая кассета PAT содержит промотор OsAct1 (рисовый промотор актина; McElroy et al., (1990), Plant Cell, 2:163-171), который использовали для экспрессии гена pat (ген фосфинотрицинацетилтрансферазы; Wohlleben et al., (1988), Gene, 70:25-37), который фланкирован 3'-нетранслируемым участком ZmLip. Экспрессирующая кассета AAD-1 содержит промотор ZmUbi 1 для управления геном aad-1 и ZmPer5 3'-UTR (патент США № 6384207). Экспрессирующая кассета YFP состоит из промотора ZmUbil, который используется для управления экспрессии гена PhiYFP (желтый флуоресцентный белок (заявка США 2007/0298412)) и фланкирован ZmPer5 3'-UTR (патент США № 6384207).

Экспрессирующие кассеты PAT и YFP клонировали между укороченными вариантами сконструированной посадочной площадки 1 и сконструированной посадочной площадкой 2 в ELP1 (pDAB105955, фиг. 5). Альтернативно, экспрессирующие кассеты PAT и YFP клонировали между укороченными вариантами сконструированной посадочной площадки 3 и сконструированной посадочной площадкой 4 в ELP2 (pDAB 105956, фиг. 6). Аналогично, экспрессирующие кассеты AAD-1 и YFP клонировали между укороченными вариантами сконструированной посадочной площадки 1 и сконструированной посадочной площадкой 2 в ELP1 (pDAB105979, фиг. 7). Альтернативно, экспрессирующие кассеты AAD-1 и YFP клонировали между укороченными вариантами сконструированной посадочной площадки 3 и сконструированной посадочной площадкой 4 в ELP2 (pDAB105980, фиг. 8). Донорную ДНК клонировали в бинарный вектор для биолистической трансформации, для трансформации, опосредованной волокнами карбида кремния или Agrobacterium-опосредованной трансформации.

Кроме того, конструкции ДНК могут быть проклонированы в высококопийную плазмиду (например, производные pBR322, несущие последовательность начала репликации ColEl) для генерирования плазмидной ДНК, используемой для прямой доставки ДНК, а именно для трансформации.

Пример 2. Доставка ДНК, опосредованная волокнами карбида кремния.

Эмбриогенные клеточные культуры Hi-II маиса получали, как описано в патенте США № 7179902, и использовали в качестве источника живых растительных клеток, в которых осуществляли в качестве примера направленную интеграцию.

Фрагменты, содержащие кассету с маркером селекции растений AAD-1, а также ELP1 и ELP2 соответственно из pDAB100610 и pDAB 100611, и фрагменты, содержащие кассету с маркером селекции растений PAT, а также ELP1 и ELP2 соответственно из pDAB100640 и pDAB100641, использовали для генерирования трансгенных событий. Трансгенные события выделяли и охарактеризовывали. Эти события затем становились мишенью с использованием направленной гомологичной рекомбинации, где интересующую молекулу нуклеиновой кислоты можно было интегрировать внутри сконструированной посадочной площадки.

мл объема осажденных клеток (PCV) из сохраненной ранее с помощью криоконсервации клеточной линии вместе с 28 мл кондиционированной среды пересевали в 80 мл жидкой среды GN6 (N6 среда (Chu et al., (1975), Sci. Sin. 18:659-668), 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, рН 5,8) в 500 мл конической колбы Эрленмейера и помещали на шейкер при 125 об/мин при 28°C. Эту стадию повторяли два раза с использованием той же клеточной лини, так чтобы в целом 36 мл PCV было распределено по трем колбам. Через 24 ч жидкую среду GN6 удаляли и заменяли на 72 мл GN6 S/M осмотической среды (среда N6, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 45,5 г/л сорбита, 45,5 г/л маннита, 100 мг/л миоинозита, рН 6). Колбу инкубировали в темноте в течение 30-35 мин при 28°C с умеренным перемешиванием (125 об/мин). В

- 12 031429 течение периода инкубации получали 50 мг/мл суспензии волокон карбида кремния (Advanced Composite Materials, LLC, Грир, Южная Каролина) путем добавления 8,1 мл GN6 S/M жидкой среды к 405 мг стерильных волокон карбида кремния.

После инкубации в осмотической среде GN6 S/M содержимое каждой колбы объединяли в 250-мл центрифужную пробирку. После того как все клетки в колбе оседали на дно, содержание объема в избытке, составляющем приблизительно 14 мл жидкости GN6 S/M, извлекали и собирали в стерильную 1-л колбу для будущего использования. Предварительно увлажненную суспензию волокон смешивали при максимальной скорости на вортексе в течение 60 с, и затем добавляли в центрифужную пробирку.

170 мкг очищенного фрагмента или из pDAB100610 или из pDAB100611 плазмидной ДНК добавляли в каждую пробирку. После добавления ДНК пробирку немедленно помещали в модифицированный коммерческий смеситель для краски Red Devil 5400 (Red Devil Equipment Co., Плимут, Миннесота) и перемешивали в течение 10 с. После перемешивания коктейль клеток, среду, волокна и ДНК добавляли к содержимому 1-л колбы вместе с 125 мл свежей жидкой среды GN6 для снижения осмотического действия. Клеткам можно было извлечь на шейкере, установленном на 125 об/мин в течение 2 ч. 6 мл диспергированной суспензии фильтровали на фильтровальной бумаге Ватман #4 (5,5 см) с использованием стеклянного элемента коллектора клеток, соединенного с центральной вакуумной линией, так что на одну пробирку получали 60 фильтров. Фильтры помещали на чашки 60x20 мм твердой среды GN6 (такая же, как жидкая среда GN6 за исключением 2,5 г/л гелеобразующего агента Гелрит (Gelrite)) и культивировали при 28°C в условиях темноты в течение 1 недели.

Пример 3. Идентификация и выделение предполагаемых трансгенных событий.

Через одну неделю после доставки ДНК фильтровальную бумагу переносили на чашки 60x20 мм селекционной среды GN6 (1Н) (N6 среда, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 2,5 г/л Гелрита, рН 5,8), содержащей соответствующий селективный агент. Эти селекционные чашки инкубировали при 28°C в течение одной недели в темноте. Через 1 неделю после селекции в темноте ткань внедряли на свежую среду путем соскребания ^½ клеток с каждой чашки в пробирку, содержащую 3 мл агарозной среды GN6, поддерживаемой при 37-38°C (среда N6, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, 7 г/л SEAPLAQUE® агарозы, рН 5,8, автоклавированная в течение 10 мин при 121°C).

Смесь агарозы/ткани разрушали с помощью шпателя и затем равномерно распределяли 3 мл смеси агароза/ткань на поверхности чашки Петри 10x15 мм, содержащей среду GN6 (1Н). Этот процесс повторяли для обеих половин каждой чашки. После внедрения всей ткани чашки индивидуально герметично закрывали с помощью NESCOFILM® или PARAFILM® М и культивировали при 28°C в условиях темноты в течение срока до 10 недель. Предположительно трансформированные изоляты, которые росли в данных условиях селекции, удаляли из вставленных чашек и переносили на свежую селекционную среду в чашки 60x20 мм. Если стабильный рост был очевиден через приблизительно 2 недели, то предполагали, что событие устойчиво к применяемому гербициду (селективный агент), и аликвоту клеток затем собирали для анализа генотипирования.

Пример 4. Молекулярная характеризация событий.

Выделение геномной ДНК.

Геномную ДНК (гДНК) выделяли из выделенных клеток маиса и использовали в качестве матрицы для экспериментов ПЦР-генотипирования. гДНК выделяли из приблизительно 100-300 мкл объема осажденных клеток (PCV) каллюса Hi-II, которые выделяли согласно протоколам производителя, подробно описанным в наборе реагентов DNEASY® 96 Plant Kit (QIAGEN Inc., Валенсия, Калифорния). Геномную ДНК элюировали в 100 мкл буфера элюции из набора реагентов с получением конечной концентрации 20-200 нг/мкл, и затем анализировали посредством методов генотипирования на основе ПЦР.

Молекулярный анализ количества копий.

Определение количества копий трансгена с помощью анализа гидролиза зонда, аналогичного анализу TAQMAN®, осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени с использованием системы LIGHT CYCLER® 480 (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана). Анализы разрабатывали для генов AAD-1 и PAT и для гена внутреннего контроля с использованием компьютерной программы LIGHT CYCLER® Probe Design Software 2.0. Для амплификации, Мастер-микс для зондов системы LIGHT CYCLER® 480 (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана) получали в 1x конечной концентрации в 10 мкл объема многокомпонентной реакции, содержащей 0,4 мкМ каждого праймера и 0,2 мкМ каждого зонда. Двухстадийную реакцию амплификации осуществляли с протяжкой при 58°C в течение 38 с с приобретением флуоресценции. Все образцы прогоняли по три раза и средние пороговые значения для циклов (Ct) использовали для анализа каждого образца. Анализ данных ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием компьютерной программы LIGHTCYCLER® версии 1.5 с использованием модуля определения относительного количества на основе метода AACt. Для этого образец геномной ДНК из калибратора одной копии и известный 2-копийный контроль включали в каждый прогон (идентично тому, как использовалось в анализе INVADER® выше). На основе этих данных выявленное количество копий AAD-1 или PAT затем оценивали для каждого образца.

Дизайн праймеров для ПЦР-генотипирования.

- 13 031429

Олигонуклеотидные праймеры синтезировали (например, с помощью Integrated DNA Technologies, Inc. (Коралвилл, Айова)) при условиях стандартного обессоливания и разведения с помощью воды до концентрации 100 мкМ. Олигонуклеотидный праймер конструировали для отжига на концевые участки ДНК-вставки. Праймеры тестировали с использованием разведений плазмидной ДНК в присутствии ДНК, выделенной из не трансгенных организмов. Вставку pDAB100610, pDAB100611, pDAB100640 и pDAB100641 амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК предполагаемых трансгенных событий с использованием праймеров. Полученный в результате фрагмент клонировали в плазмидный вектор и секвенировали для подтверждения того, что сконструированная посадочная площадка полностью интегрировалась в геном растения в процессе трансформации.

Саузерн-блот анализ.

Саузерн-анализ осуществляли для подтверждения количества копий трансгена. Для этого анализа геномную ДНК гидролизовали с помощью соответствующих ферментов рестрикции и гибридизовали с зондами.

Ткань маиса идентифицировали как содержащую предполагаемую ELP с помощью локусспецифичной реакции ПЦР, которую адаптировали для саузерн-блот анализа. Для саузерн-анализа образцы ткани собирали в 2-мл пробирки Эппендорфа и лиофилизировали в течение 2 дней. Мацерацию ткани осуществляли с помощью гомогенизатора ткани Kleco и вольфрамовых шариков (Kleco, Висалия, Калифорния). После мацерации ткани геномную ДНК выделяли с использованием набора реагентов DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Германтаун, Мэриленд) согласно предлагаемому протоколу производителя.

Геномную ДНК оценивали количественно с помощью аналитического набора реагентов Quant-IT Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). ДНК с определенным количеством доводили до 4 мкг для саузерн-блот анализа и гидролизовали с использованием соответствующего фермента рестрикции в течение ночи при 37°C. Гидролизованную ДНК очищали с использованием Quick-Precip (Edge BioSystem, Гайтерсбург, Мэрилэнд) согласно предлагаемому протоколу производителя. Осажденную ДНК ресуспендировали в 10Х красителе и подвергали электрофорезу в течение 17 ч на 0,8% SeaKem LE агарозном геле (Lonza, Роклэнд, Мэрилэнд) при напряжении 40 В. ДНК переносили на нейлоновые заряженные мембраны (Millipore, Бедфорд, Массачусетс) в течение ночи и связывали с мембраной с использованием линкера UV Strata 1800 (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния). Блоты прегибридизовали с 20 мл PerfectHyb Plus (Sigma, Сент Луис, Миссури) и гибридизовали с соответствующим радиоактивно-меченым зондом в течение ночи. Блоты отмывали и помещали для визуализации на экраны люминофора на 24 ч и затем анализировали с использованием сканера STORM 860 (Molecular Dynamics).

Пример 5. Селекция трансгенных событий с вставкой ДНК.

События скринировали с помощью анализа с гидролизом зонда и с помощью ПЦР, как описано выше для интактной растительной транскрипционной единицы (PTU), содержащей кассеты с генами AD-1 или PAT и интактными ELP. Количество копий далее подтверждали с помощью саузерн-анализа с использованием стандартных методов с использованием зондов для генов AAD-1 и PAT и для ELP. Каллюс из селектированных трансгенных событий, несущих одну копию интактных вставок из pDAB100610 и pDAB100611, сохраняли для последующего тестирования экспрессии гена AAD-1. С помощью скрининга с использованием метода кРВ-ПЦР (количественный анализ с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, qRT-PCR) для AAD-1 и тИФА (ниже) идентифицировали события экспрессии AAD-1.

Анализ кРВ-ПЦР событий, экспрессирующих AAD-1.

Количественный анализ ПЦР в реальном времени (кРВ-ПЦР) использовали для количественной оценки мРНК-экспрессии гена AAD-1. Анализ разрабатывали для количественной оценки относительной экспрессии мРНК AAD-1 из образцов трансгенного каллюса Hi-II с помощью нормализации этого уровня относительно экспресиии мРНК гена внутреннего контроля. Нормализация мРНК AAD-1 относительно мРНК гена внутреннего контроля дает возможность сравнения экспрессии AAD-1 между различными образцами, и может использоваться для идентификации событий, которые, как выявлено, являются высоко-экспрессирующимися.

Суммарную РНК получали из свежей ткани каллюса с использованием набора реагентов Qiagen RNeasy® 96 Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния). РНК тестировали с помощью свободной от РНК-азы ДНК-азы согласно инструкциям набора реагентов для удаления загрязнений геномной ДНК. Синтез первой цепи проводили согласно инструкциям производителя для фермента обратная транскриптаза Superscript® III (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и затравляли синтез с помощью случайных гексамеров. Синтезированные цепи кДНК разводили в воде в соотношениях 1:10 и 1:50 (это обеспечивает достаточное количество матрицы для ПЦР-амплификации множества мишеней). Каждую аликвоту сохраняли при -20°C на неопределенный срок. Смеси реакций кРВ-ПЦР составляли для амплификации кДНК AAD-1, как указано далее: 7,5 мкл 2Х LC480 мастер-буфера для зондов (Roche Diagnostic, Индианаполис, Индиана), 0,3 мкл прямого праймера, специфичного для гена, из 10 мкМ концентрированного раствора, 0,3 мкл обратного праймера, специфичного для гена, из 10 мкМ-концентрированного раствора, 0,15 мкл

- 14 031429

UPL-зонда из концентрированного раствора зондов LightCycler® 480, Roche Diagnostic, Индианаполис, Индиана) 1,5 мкл 10% (мас./об.) поливинилпирролидона-40 (PVP-40) и 3,9 мкл воды. UPL-зонд (Roche Diagnostics, Индианаполис, США) блокирует нуклеиновую кислоту и, таким образом, обладает более высокой T_m, чем если рассчитывать по-другому. Все компоненты помещали обратно в морозильник перед стандартными или иными манипуляциями. 384-луночный микропланшет размечали и маркировали, добавляя в каждую лунку 13,5 мкл мастер-микса. Герметичной пленкой аккуратно обертывали микропланшет. Планшет центрифугировали в течение 1 мин при 3000 об/мин в центрифуге Qiagen для микропланшетов. Добавляли 1,5 мкл оттаянных, разведенных и синтезированных кДНК-цепей. Кроме того, добавляли в отдельные лунки 1,5 мкл стандартов количества копий плазмидной ДНК способом серийного разведения от самой низкой концентрации до самой высокой, эти стандарты сравнивали с кДНК AAD1 (синтезированной из суммарной мРНК) для оценки количества копий. Серии стандартов количества копий ДНК AAD-1 получали путем клонирования ампликона-мишени в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и путем получения серийных разведений для оценки количества копий. Пленку прочно фиксировали на планшет и центрифугировали, как описано ранее. Задавали ПЦР-программу и ДНК амплифицировали с помощью прибора для ПЦР в реальном времени LC480 (Roche, Индианаполис, Индиана) или в эквивалентном ему.

Пример 6. Определение белка AAD-1 в тканях маиса с помощью тИФА.

Был разработан способ количественного определения белка AAD-1 в каллюсе маиса с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА). Способ, описанный в данном документе, может использоваться для детектирования белка AAD-1 и для анализа образцов тканей растения из трансгенных каллюсов маиса.

Белок AAD-1 выделяли из образцов маиса с использованием каллюс-специфичных буферов на основе фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,05% Tween 20 (PBST) и, возможно, содержащего бычий сывороточный альбумин, протеазные ингибиторы или аскорбиновую кислоту. Экстракт центрифугировали; водную надосадочную жидкость собирали, разводили и анализировали с использованием AAD-1-специфичного анализа тИФА. Одновременно в этом анализе применяли формат сэндвичтИФА. Аликвоту разведенного образца и биотинилированное моноклональное антитело, связывающее AAD-1, (MAb 473F 185) инкубировали в лунках микропланшета с покрытием в виде иммобилизованного моноклонального антитела, связывающего AAD-1 (MAb 473H274). Эти антитела связаны с белком AAD-1, экспрессирующимся маисом, в лунках с образованием сэндвича с белком AAD-1, связанным между растворимым и иммобилизованным антителом. Несвязанные образцы и конъюгат затем удаляли с планшета путем промывки с помощью PBST. Избыток количества конъюгата стрептавидина и фермента (щелочная фосфатаза) добавляли к лункам для инкубирования. Присутствие AAD-1 детектировали с помощью инкубирования ферментного конъюгата с ферментным субстратом; генерируя окрашенный продукт. Так как AAD-1 был связан в сэндвиче антител, то уровень проявленного окрашивания связан с концентрацией AAD-1 в образце (т. е. чем меньше концентрация белка, тем меньше проявление окрашивания). Поглощение при 405 нм измеряли с использованием планшетного ридера.

Высокоэкспрессирующие AAD-1 события идентифицировали из селектированных трансгенных событий и сохраняли для последующего направленного воздействия донорной ДНК.

Пример 7. Опосредованная биолистикой доставка ДНК в растительные клетки, содержащие ELP. Регенерация трансгенных событий, содержащих ДНК-мишень.

События из pDAB100160 и pDAB100611, которые, как было подтверждено, являются низкокопийными и содержат интактные PTU, регенерировали с получением незрелого эмбрионального донорного материала для направленного воздействия. Здоровую выращенную ткань переносили сначала в 28+100 галоксифоп (haloxyfop) (среда MS (среда Мурасиге-Скуга (1962), Physiol Plant, 15: 473-497), 0,025 мг/л 2,4-D, 5 мг/л ВАР, 0,0362 мг/л галоксифоп, 30 г/л сахарозы, 2,5 г/л гелрит (gelrite), pH 5,7) и инкубировали при низком освещении (фотопериод 14 мкЕ/м²с 16 ч) в течение 7 дней с последующим высоким освещением (фотопериод 89 мкЕ/м²с 16 ч) в течение следующих 7 дней. Позеленевшие структуры переносили в среду галоксифоп 36+100 (та же среда 28+100 галоксифоп без ВАР и 2,4-D) и инкубировали при высоком освещении (фотопериод 40 мкЕ/м²с 16 ч) до тех пор, пока структуры побегов не образуют достаточные корневые структуры для пересадки в теплицу. Растения выращивали до созревания в теплице с использованием грунта в виде 95% Metro-Mix 360® и 5% глины и опыляли в зависимости от состояния растения. Энергично растущие растения, самоопыленные или переопыленные (растения от одного и того же события) и менее энергично растущие растения скрещивали с Hi-II, A188 или с В104 для сохранения эмбриогенной способности донорного материала.

Пример 8. Опосредованная биолистикой доставка ДНК в растительные клетки, содержащие ELP.

Направленное воздействие на события, полученные из PDAB100610 и pDAB100611.

Направленное воздействие донорной последовательности осуществляли с использованием двух различных протоколов трансформации. Для трансгенных событий с интактными ELP, которые содержат AAD-1 в качестве маркера селекции (события pDAB100610 и pDAB 100611), направленное воздействие осуществляли посредством опосредованной биолистикой доставки ДНК в прекаллюссные незрелые эм

- 15 031429 брионы. Эмбрионы размером 1,2-2 мм собирали через 10-13 дней после опыления и помещали на среду N6E (Νό-среда, 2 мг/л 2,4-D, 2,8 г/л L-пролина, 100 мг/гидролизата казеина, 100 мг/л миоинозита,

4,25 мг/л нитрата серебра, 30 г/л сахарозы, рН 5,8) и инкубировали при 28°C в течение 2-3 дней в темноте. Набухшие эмбрионы переносили на среду N60SM (та же среда N6E с добавлением 36,4 г/л сорбита, 36,4 г/л маннита и L-пролина, с уменьшенными концентрациями до 0,7 г/л), которая заполняла круг диаметром 2,5 см на фильтровальной бумаге Ватман # 4. Использовали экран 1000 мкм для содержания эмбрионов для бомбардировки и эмбрионы инкубировали в темноте при 28°C в течение 4 ч перед бомбардировкой. Для покрытия биолистических частиц ДНК 3 мг золотых частиц диаметром 0,6 мкм промывали один раз с помощью 100% этанола, два раза с помощью стерильной дистиллированной воды и ресуспендировали в 50 мкл воды в силиконизированных микроцентрифужных пробирках. Всего 5 мкг отдельных векторов плазмидной ДНК, кодирующей нуклеазу для доменов цинковые пальцы, и фрагмент донорной ДНК; pDAB 105955 или pDAB 105956, 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл хлорида кальция (2,5 М) добавляли по отдельности к суспензии золота и смешивали на вортексе. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, осаждали при 10000 об/мин в настольной микроцентрифуге в течение 10 с, ресуспендировали в 60 мкл холодного 100%-этанола, и 8-9 мкл распределяли на каждый макроноситель.

Бомбардировку проводили с использованием биолистической системы Biolistic PDS-1000/HE™ (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния). Планшеты, содержащие эмбрионы, помещали на среднюю полку при условиях давления 650 фунтов/кв. дюйм и 27 дюймов Hg⁺⁺ и бомбардировали один раз, следуя инструкциям производителя. Эмбрионы через 24 ч после бомбардировки переносили непосредственно на среду (без фильтровальной бумаги) N6E (тот же состав, как указано выше) для регенерации и инкубировали в течение 13 дней при 28°C в темноте. Эмбрионы переносили на селекционную среду N6S (Ж>-среда. 2 мг/л 2,4-D, 100 мг/л миоинозита, 0,85 мг/л нитрата серебра, 2 мг/л биалафоса, 30 г/л сахарозы, 2,5 г/л гелрита и при рН 5,8) в течение каждых 2 недель по 3 переноса на селекционную среду и инкубировали при 28°C в условиях темноты сроком до 10 недель. Предположительно трансформированные изоляты, которые росли в данных условиях селекции, удаляли из вставленных чашек и переносили в свежую селекционную среду на чашки 60x20 мм. Если стабильный рост был очевиден приблизительно через 2 недели, то предполагали, что событие устойчиво к применяемому гербициду (селективный агент), и аликвоту клеток затем собирали для анализа генотипирования (анализ описан ниже).

Направленное воздействие на события, полученные из PDAB10 0640 и pDAB10 06 41.

Для трансгенных событий с интактными ELP, которые содержат PAT в качестве маркера селекции (pDAB100640 и pDAB100641), направленное воздействие осуществляли посредством опосредованной биолистикой доставкой ДНК в эмбриогенный каллюс маиса. Через шесть-восемь дней после субкультивирования эмбриогенную маисовую ткань (приблизительно 0,4 мл PCV клеток) распределяли тонким слоем по окружности диаметром 2,5 см на поверхности фильтровальной бумаги Ватман #4, помещенной на чашки Петри 100x15 мм, содержащие GN6 S/M среду (Ш-среда, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 45,5 г/л сорбита, 45,5 г/л маннита, 100 мг/л миоинозита, рН 5,8), отверждаемую с помощью 2,5 г/л гелрита. Клетки инкубировали в темноте в течение 4 ч. ДНК готовили для бомбардировки, как описано ранее, pDAB105979 и pDAB105980 использовали для направленного воздействия.

Бомбардировку проводили с использованием биолистической системы Biolistic PDS-1000/HE™ (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния). Планшеты, содержащие клетки, помещали на среднюю полку при условиях давления 1100 фунтов/кв. дюйм и 27 дюймов Hg⁺⁺ и бомбардировали один раз, следуя инструкциям производителя. Через 24 ч после бомбардировки фильтровальную бумагу, содержащую клетки, переносили на твердую среду GN6 (Ш-среда, 2 мг/л 2, 4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, рН 5,8), отверждаемую с помощью 2,5 г/л Герлита, и инкубировали в течение 24 ч при 28°C в условиях темноты. Через 24 ч после периода регенерации фильтровальную бумагу, содержащую клетки, переносили на твердую среду GN6+100 галоксифоп (Ш-среда, 2 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы, 100 мг/л миоинозита, рН 5,8), отверждаемую с помощью 2,5 г/л герлита, и инкубировали в течение 24 ч при 28°C в условиях темноты. Переносы продолжали каждые 2 недели по 3 переноса на селекционную среду. Ткань инкубировали в течение срока до 12 недель до тех пор, пока не начнут появляться предполагаемые трансгенные изоляты, полученные в результате интеграции донорной ДНК. Предположительно трансформированные изоляты, которые росли в данных условиях селекции, удаляли из вставленных чашек и переносили на свежую селекционную среду на чашки 60x20 мм. Если стабильный рост был очевиден приблизительно через 2 недели, то предполагали, что событие устойчиво к применяемому гербициду (селективный агент) и аликвоту клеток затем собирали для анализа генотипирования (анализ описан ниже).

Пример 9. Скрининг на предмет направленных интегрированных событий посредством ПЦРгенотипирования.

Направленное воздействие донорных молекул (pDAB 105979, pDAB 105980, pDAB 105955, pDAB105956) в ELP в трансгенном маисе анализировали с использованием комбинации 1) локусспецифичной ПЦР; 2) донор-специфичного анализа с TaqMan и 3) локус-специфичного саузерн-блот анализа для оценки точности вставки, правильности и количества копий. Ожидается, что положительные

- 16 031429 направленные события обладают а) положительным результатом out-out ПЦР или перекрывание результатов in-out ПЦР и b) присутствием донора с помощью визуализации посредством саузерн-анализа.

Выделение ДНК.

Ткань из трансгенного маиса, повторно подвергнутого направленному воздействию, (ткань каллюса или листья растения) лиофилизировали в течение по меньшей мере 2 дней в 96-луночных коллекторных микропланшетах (Qiagen, Германтаун, Мэрилэнд). ДНК выделяли из лиофилизированной ткани с использованием рабочей станции BioSprint 96 (Qiagen, Германтаун, Мэрилэнд), следуя инструкциям производителя и ресуспендировали в 200 мкл воды. Для разрушения ткани использовали гомогенизатор ткани модели 2-96А Kleco (Garcia Manufacturing, Висалия, Калифорния).

Количественная оценка ДНК.

Полученную в результате геномную ДНК количественно оценивают с использованием аналитического набора реагентов QUANT-IT® Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen. Карлсбад, Калифорния). Пять стандартов ДНК с проведенной для них количественной оценкой концентраций, которые колеблются от 20 до 1,25 нг/мкл (серийные разведения) использовали для генерирования калибровочной кривой. Неизвестные образцы сначала разводили 1:10 или 1:20, так чтобы разведения были внутри линейного интервала анализа. 5 мкл разведенных образцов и стандартов смешивали с 100 мкл разведенного субстрата Pico Green (1:200) и инкубировали в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию затем записывали с использованием планшетного ридера Synergy2 (Biotek). Концентрацию геномной ДНК оценивали на основе калибровочной кривой, рассчитанной после коррекции фоновой флуоресценции. Затем ДНК нормализовали по отношению к концентрациям 2 нг/мкл с использованием автоматизированного жидкостного дозатора Biorobot-3000 (Qiagen, Германтаун, Мэрилэнд). Нормализованную ДНК использовали для ПЦР и анализа оценки количества копий.

ПЦР-анализ.

Три типа локус-специфичной ПЦР (out-out, 5' out-in, 3' out-in) осуществляли для оценки того, направлены ли донорные плазмиды к ELP. ПЦР-реакции осуществляли для исследования присутствия интактной копии донорной ДНК (out-out ПЦР). Дополнительные реакции ПЦР фокусировали на 5'-границе между мишенью и донором и 3'-границе между донором и мишенью (in-out ПЦР). Схема с положениями праймеров, использованных для анализа, приведена в качестве примера на фиг. 9. Ожидаемые ПЦР-продукты для каждого донора и ELP-мишени приведены в табл. 1. Последовательности праймеров, использованных для анализа, представлены в табл. 2.

Таблица 1

Ожидаемые размеры ампликонов для локус-специфичной ПЦР для анализа направленной интеграции донора

ID плазмиды, направленной на ELP	Донор повторного направленного воздействия	Праймеры*	Ожидаемый ампликон (т.п.н.)
pDAB100640	pl) АВ 105979 sLPlL-YFP-AADlsLPlR	610F-611R 610-YFP YFP-611	8.5 3.5 5.4
pDAB100641	pl) AB 105980 SLP2L-YFP-AAD1sLP2R	611/611 611/YFP YFP/611	7.6 4.4 3.5
pDAB 106685	pDAB 105979 sLP 1L-YFP -AAD1 sLPIR	610F-611R 6iO-YrP YFP-611	8.5 3.5 5.4
pDAB106686	pDAB 105980 SLP2L-YFP-AAD1sLP2R	611/611 611/YFP YFP/611	7.6 4.4 3.5
pDAB100610	pDAB 105955 sLPIL-YFP-PAT-sLPIR	610F-611R 610-YFP YFP-611	8.5 3.5 5.4
pDAB100611	pDAbl05956 sLP2L-YFP-PAT-sLP2R	611/611 611/YFP YFP/611	7.6 4.4 3.5

*Праймеры перечислены в порядке:

out-out,

5' in-out,

3' out-in.

Таблица 2

Последовательности праймеров, использованных

- 17 031429 для анализа направленной интеграции

Олигонуклеотид	SEQIDNO:	Последовательность
610F	SEQ ID N0:21	GCTACTAAGAACAATACCTAAGTTGC
611F	SEQ ID N0:22	TGCACTCATGTTCATATCC
611R	SEQ ID N0:23	TGTACAAGAAAGCTGGGTG
YFPF 3302	SEQ ID N0:24	TATGGTCCAGAGTTGAAGG
YFPR 4577	SEQ ID N0:25	TCATCTGCACAACTGGTGA
YFPF 4302	SEQ ID N0:26	TCTTTCCCAACACATGACC

ПЦР-амплификация.:

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли для оценки и подтверждения повторного направленного воздействия на ELP. ПЦР-реакции готовили в объеме 25 мкл с ДНК-полимеразой Phusion (New England Biolabs, Ипсуич, Массачусетс) или AccuPrime (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Для Phusion-ПЦР каждая реакция содержала 1X буфер Phusion GC, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров, 2,5 единиц ДНК-полимеразы Phusion и 20 нг геномной ДНК. От 10 до 20 нг плазмидной ДНК, сконструированной для иммитации направленного события, прогоняли в качестве положительного контроля. Также прогоняли контроль без матрицы (вода в качестве матрицы). Условия ПЦР указаны ниже: 35 циклов 98°C 1 мин, 98°C 10 с, 65°C 20 с, 72°C 2,5 мин с последующей протяжкой при 72°C 10 мин.

мкл ПЦР-реакции осуществляли с помощью AccuPrime (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), содержащей 1X буфер II, 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров, 2,5 единицы Taq-полимеразы AccuPrime и 20 нг геномной ДНК. Положительные и отрицательные контроли прогоняли, как описано для Phusion. Условия для AccuPrime указаны ниже: 35 циклов 98°C 1 мин, 98°C 10 с, 65°C 20 с, 68°C 2,5 мин с последующей протяжкой при 68°C 10 мин.

Амплифицированные фрагменты вырезали из геля и очищали согласно инструкциям производителя. Затем очищенные фрагменты клонировали в плазмидный вектор и трансформировали в компетентные клетки Е.^Н.

Индивидуальные колонии селектировали и подтверждали содержание амплифицированного ПЦРфрагмента. Реакции двухцепочечного секвенирования плазмидных клонов осуществляли для подтверждения того, что ПЦР-амплифицированная геномная последовательность содержит интегрированный донор. События, в которых идентифицировали содержание донорного фрагмента, представляют собой мишень, в которой произошла направленная гомологичная репарация ZFN-опосредованного двухцепочечного разрыва и направленная интеграция донорной ДНК в специфический ген-мишень.

TaqMan-анализ с гидролизом зонда.

TaqMan-анализ проводили для определения количества копий доноров в предполагаемых направленных событиях. Определение количества копий трансгена с помощью анализа гидролиза зонда, аналогичного анализу TAQMAN®, осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени с использованием системы LIGHT CYCLER® 480 (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана). Анализы разрабатывали для PAT и AADl и для гена внутреннего контроля GLP1 и инвертазы с использованием компьютерной программы LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Для амплификации LIGHTCYCLER® 480 Мастер-микс для зондов (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана) получали в 1X конечной концентрации в объеме 10 мкл многокомпонентной реакции, содержащей 0,4 мкМ каждого праймера и 0,2 мкМ каждого зонда (табл. 3). Двухстадийную реакцию амплификации осуществляли с протяжкой при 58°C в течение 38 с для PAT/GLP1 и при 60°C в течение 40 с для AAD-1 и с инвертазой для получения флуоресценции. Все образцы прогоняли по три раза и средние пороговые значения для циклов (Ct) использовали для анализа каждого образца.

Анализ данных ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием компьютерной программы LIGHTCYCLER® версии 1.5 с использованием модуля определения относительного количества на основе метода AACt. Для этой цели в каждый прогон включали гДНК из калибратора одной копии и известный двухкопийный контроль.

- 18 031429

Таблица 3

Информация о праймерах и зондах для анализа с гидролизом зонда pat и внутреннего контроля (HMG)

Название праймера	Последовательность	Детектирование
TQPATS	SEQ IDN0:27; 5’ ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT 3’
TQPATA	SEQ IDN0:28; 5’ CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT 3’
TQPATFQ	SEQ ID N0:29; 5’CY5GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG-BHQ2 3 ’	Cy5
ZGP3S	SEQ IDN0:30; 5’ CCTGCTCCACTACCAGTACAA 3’
ZGP3A	SEQ IDN0:31; 5’ GTCCAAGAAGGTGACCITCTC 3’
TQZGP3	SEQ ID N0:32; 5’FAMAGATCACCGACTTTGCGCTCTTT-BHQ1 3’	FAM
GAAD1F	SEQ IDN0:33; 5’ TGTTCGGTTCCCTCTACCAA 3’
GAAD1R	SEQ IDN0:34; 5’ CAACATCCATCACCTTGACTGA 3 ’
GAAD1P	SEQ IDN0:35; 5’FAMCACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA 3’	FAM
IVF-Taq	SEQ IDN0:36; 5’ TGGCGGACGACGACTTGT 3’
INR-Taq	SEQ IDN0:37; 5’ AAAGTITGGAGGCTGCCGT 3 ’
IV-Probe	SEQIDN0:38; 5’HEX CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC 3’	HEX

Саузерн-блот анализ.

Саузерн-анализ осуществляли для подтверждения направления донорной ДНК в локус ELP. Для этого анализа геномную ДНК гидролизовали с помощью соответствующего фермента рестрикции и гибридизовали с зондом в виде локус-специфичного радиоактивно-меченого фрагмента (не присутствующего в доноре).

Использовали каллюс маиса (pDAB100640 и pDAB100641-направленные эксперименты) или растения маиса Т0 (pDAB100610- и pDAB 100611-направленные эксперименты). Образцы ткани собирали в 2-мл микроцентрифужные пробирки и лиофилизировали в течение 2 дней. Мацерацию ткани осуществляли с помощью гомогенизатора ткани Kleco и вольфрамовых шариков. После мацерации ткани геномную ДНК выделяли с использованием набора реагентов DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Германтаун, Мэриленд) согласно предлагаемому протоколу производителя.

Геномную ДНК оценивали количественно с помощью аналитического набора реагентов Quant-IT Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). 4 мкг ДНК для каждого образца гидролизовали с помощью соответствующего фермента рестрикции в течение ночи при 37°C. Гидролизованную ДНК очищали с использованием Quick-Precip (Edge BioSystem, Гайтерсбург, Мэрилэнд) согласно предлагаемому протоколу производителя. После электрофореза на 0,8% SeaKem LE агарозном геле (Lonza, Роклэнд, Мэрилэнд), ДНК переносили на нейлоновые заряженные мембраны (Millipore, Бедфорд, Массачусетс) в течение ночи и связывали с мембраной с использованием линкера UV Strata 1800 (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния). Блоты прегибридизовали с 20 мл PerfectHyb Plus (Sigma, СентЛуис, Миссури) и гибридизовали с соответствующим радиоактивно-меченым зондом в течение ночи.

- 19 031429

Блоты отмывали и помещали для визуализации на экраны люминофора на 24 ч и затем анализировали с использованием сканера STORM 860 (Molecular Dynamics).

Пример 10. Конструкция промежуточного трансформирующего вектора растений, которая акцептирует ELP, маркеры селекции и дает возможность вырезания независимых элементов конструкции.

Сконструированные сайты связывания нуклеазы для доменов цинковые пальцы (eZFN) и элементы ELP могут быть инкорпорированы индивидуально или вместе в трансформирующие векторы растений, так что полученные в результате трансформированные растительные клетки, ткани или растения будут иметь следующие характеристики: 1) возможность повторно трансформироваться дополнительными трансгенами точным направленным образом внутри ELP по исходному сайту вставки трансгена и 2) возможность модификации трансгенных локусов путем предсказуемого и эффективного удаления трансгенов, конкретно генов маркеров селекции растений. Серии векторов конструировали для трансформации ряда видов растений. Этого достигали путем использования промежуточного трансформирующего вектора растений (описано ниже), вектора для воздействия на инкорпорирование eZFN, фланкирующих все маркеры селекции и ELP, в основные векторы, известные как векторы первичной трансформации.

Конструировали промежуточный трансформирующий вектор растений, который включал остов бинарного трансформирующего вектора Agrobacterium с уникальным сайтом множественного клонирования (MCS), расположенного между правой и левой границами Т-ДНК. Этот промежуточный вектор представляет собой pDAB104132 (фиг. 10). MCS, используемый в pDAB104132, содержит уникальные сайты ферментов рестрикции для AgeI, NotI, FseI, SwaI, XbaI, AseI, PacI, XhoI, SalI и NsiI. В данном примере эти сайты использовались для инкорпорирования ключевых функциональных элементов в конечные первичные трансформирующие векторы. Уникальный сайт NotI может использоваться для введения фрагмента, несущего кассету вектора целевого назначения GATEWAY™, которая может затем использоваться для расположения множества трансгенов в трансформирующем векторе с использованием системы GATEWAY™. Уникальный сайт FseI может использоваться для введения ELP, которые содержат сайты FseI на своих концах. Как описано ранее в данных примерах, когда ELP присутствуют в трансгенном растении, они могут использоваться в качестве сайтов-мишеней для вставки дополнительных генов с использованием eZFN. Другие сайты в MCS могут использоваться для вставки других интересующих генов, включающих гены маркеров селекции. С использованием уникальных сайтов рестрикции, описанных выше, могут использоваться промежуточные трансформирующие векторы растений, такие как pDAB104132, для переноса вместе с ним в одном трансформирующем векторе растений любой или всех комбинаций функциональных элементов, включающих кассеты вектора целевого назначения GATEWAY™, ELP, модули маркеров селекции-ZFN, и любые другие трансгены, которые могут или не могут быть способны к вырезанию eZFN.

Пример 11. Конструкция кассет с маркером селекции растения с возможностью их вырезания с использованием модулей нуклеаз для доменов цинковые пальцы.

В данном примере сайты связывания eZFN используются для возможности делеции любого трансгена, включающего гены маркеров селекции, из трансформированного растения. См. предварительную патентную заявку США № 61/297628, которая включена в настоящей документ ссылкой. Эта способность достигается путем фланкирования трансгенов с помощью одного или нескольких сайтов связывания eZFN и затем путем инкорпорирования этих вырезаемых генных модулей в трансформирующие векторы растений, которые затем используются для генерации трансгенных растительных клеток. Конструкция таких модулей и векторов может быть выполнена специалистом в данной области с использованием стандартных методов молекулярной биологии.

Промежуточная плазмида, несущая модуль с сайтом связывания с ZFN, представляет собой первую применяемую стадию на пути к конструированию вырезаемых генных кассет. Модуль с сайтом связывания с ZFN представляет собой сегмент ДНК, который содержит по меньшей мере два сайта связывания с eZFN, фланкирующие один или несколько сайтов связывания с ферментами рестрикции, по которым клонировали трансген. Примером является ZFN-модуль 2:4-MCS-2:4, представленный с помощью SEQ ID NO: 20 и фиг. 11. Этот модуль содержит сайт множественного клонирования (MCS), состоящий из сайтов рестрикции AseI, HindIII, PacI, SbfI, SphI и SalI, которые фланкированы парами сайтов связывания для eZFN2 и eZFN4. Также внутри этого ZFN-модуля есть две идентичные копии последовательности, состоящей из 100 п.н. случайной последовательности, которая фланкирует сайты связывания с eZFN. Кроме того, пары сайтов ферментов рестрикции SpeI и XhoI фланкируют цельный функциональный модуль, давая возможность для его клонирования в трансформирующий вектор растений. pDAB104126, плазмида, несущая модуль ZFN 2:4-MCS-2:4, представлена на фиг. 12.

Четыре различных гена маркеров селекции индивидуально вставляли в модуль ZFN 2:4-MCS-2:4 в pDAB104126 с использованием стандартных методов молекулярного клонирования. Один ген маркера селекции это функциональный ген PAT, разработанный для придания устойчивости к глуфосинату у двудольных растений. Этот ген PAT включает кодирующую последовательность PAT, функционально связанную с CsVMV-промотором и с 5'-нетранслируемым участком, выделенным из вируса мозаики

- 20 031429 прожилок маниоки; Verdaguer et al. (1996), Plant Molecular Biology, 31(6):1129-1139) и AtuOR 1 3'-UTR. Кассету с геном PAT вставляли в виде фрагмента HindIII-SphI по сайтам HindIII-SphI модуля ZFN с получением плазмиды pDAB104136 (фиг. 13).

Второй ген маркера селекции - это функциональный ген PAT, разработанный для придания устойчивости к глуфосинату у однодольных растений. Этот ген PAT включал кодирующую последовательность PAT, функционально связанную с OsAct1-промотором и с ZmLip 3' UTR. Этот ген PAT однодольных вставляли в виде фрагмента PacI-SphI по сайтам PacI-SphI модуля ZFN с получением плазмиды pDAB104138 (фиг. 14).

Третий ген маркера селекции включал ген AAD-1, разработанный для придания устойчивости к галоксифопу или к 2,4-D у однодольных растений. Этот ген AAD-1 включал кодирующую последовательность AAD-1, функционально связанную с ZmUbil-промотором и с ZmLip 3'-UTR. Этот ген AAD-1 однодольных растений вставляли в виде фрагмента HindIII-SbfI по сайтам HindIII-SbfI модуля ZFN с получением плазмиды pDAB104140 (фиг. 15).

Четвертый ген маркера селекции - это функциональный ген PAT, разработанный для придания устойчивости к глюфосинату у растений канолы. Этот ген PAT включал кодирующую последовательность PAT, функционально связанную с CsVMV-промотором и с AtuORF 1 3'-UTR, и был помещен внутри нарушенного гена изопентенилтрансферазы (ipt). Ген PAT вставляли в виде фрагмента AseI-SalI по сайтам AseI-SalI модуля ZFN с получением плазмиды pDAB104142 (фиг. 16).

Таким образом, pDAB104136, pDAB104138, pDAB104140 и pDAB104142 - это промежуточные плазмиды, которые несут различные модули вырезания ZFN с возможностью инкорпорирования различных генов маркеров селекции в трансформирующие векторы растений. При конечном инкорпорировании в геном растения с помощью трансформации модули ZFN с маркерами селекции дают возможность последующего удаления гена маркера селекции. Этого можно достичь путем получения белков eZFN2 или eZFN4 в растительных клетках, или с помощью транзиторной экспрессии, или с помощью стабильной экспрессии генов, их кодирующих. Например, eZFN2 или, альтернативно, eZFN4 могут экспрессироваться в ранее трансформированных растительных клетках с помощью транзиторной экспрессии eZFN из гена eZFN2 или eZFN4. Ферменты eZFN будут распознавать и связываться со специфичными сайтами связывания eZFN и вызывать двухцепочечные разрывы, которые появляются в геноме в этих положениях. Двухцепочечные разрывы с обеих сторон гена маркера селекции внутри модуля приведут в результате к вырезанию гена маркера селекции из геномной ДНК. Затем двухцепочечный разрыв будет подвержен репарации либо с не гомологичным соединением концов, либо гомологичной одноцепочечной репарации между повторяющимися 100 п.н.-последовательностями, которые включены в модуль ZFN. Этот процесс приведет в результате к получению постоянной делеции гена маркера селекции в его исходной геномной локализации.

Пример 12. Сборка первичных трансформирующих векторов растений.

Специалист в данной области способен собрать элементы, описанные выше, пошагово в комбинации с получением первичных трансформирующих векторов растений для применения в различных культурах растений. ELP1 вставляли в сайт FseI pDAB104132 с получением pDAB104133 (фиг. 17). Затем кассету GATEWAY™ вектора целевого назначения вставляли по сайту NotI pDAB104133 с получением pDAB104134 (фиг. 18) и pDAB104135 (фиг. 19), которые отличаются только по своей ориентации кассеты Gateway относительно последовательности ELP. Затем четыре модуля ZFN с маркерами селекции, описанными выше, клонировали в pDAB104135 с получением четырех новых трансформирующих векторов растений (PTV). Эту сборку может осуществить любой специалист в данной области с использованием стандартных методов клонирования ДНК, как описано ниже.

Модуль PAT ZFN для двудольных растений вырезали из pDAB104136 с использованием SpeI и клонировали по сайту XbaI pDAB104135 с получением PTV pDAB104137 (фиг. 20). pDAB104137 представляет собой бинарный трансформирующий вектор растений, несущий ELP1 и модуль ZFN с вырезаемым маркером селекции двудольных растений PAT, а также представляет собой целевой вектор GATEWAY™, который дает возможность для GATEWAY'™-клонирования дополнительных трансгенов.

Модуль PAT ZFN для однодольных растений вырезали из pDAB 104138 с использованием SpeI и клонировали по сайту XbaI pDAB104135 с получением PTV pDAB104139 (фиг. 21). pDAB104139 представляет собой бинарный трансформирующий вектор растений, несущий ELP1 и модуль ZFN с вырезаемым маркером селекции однодольных растений PAT, а также представляет собой целевой вектор GATEWAY™.

Модуль AAD1 ZFN для однодольных растений вырезали из pDAB104140 с использованием SpeI и клонировали по сайту XbaI pDAB104135 с получением PTV pDAB104141 (фиг. 22). pDAB104141 представляет собой бинарный трансформирующий вектор растений, несущий ELP1 и модуль ZFN с вырезаемым маркером селекции однодольных растений AAD1, а также представляет собой целевой вектор GATEWAY™.

Модуль PAT канолы ZFN для однодольных растений вырезали из pDAB104142 с использованием XhoI и клонировали по сайту XhoI pDAB104135 с получением PTV pDAB104143 (фиг. 23). pDAB104143

- 21 031429 представляет собой бинарный трансформирующий вектор растений, несущий ELP1 и модуль ZFN с вырезаемым маркером селекции PAT канолы, а также представляет собой целевой вектор GATEWAY'™.

Эти конструкции могут использоваться для трансформации культур растений с использованием методов трансформации растений. Полученные в результате трансгенные события могут быть затем подвергнуты направленному воздействию дополнительных новых трансгенов, где новый трансген направляется посредством гомологичной рекомбинации к ELP. Кроме того, экспрессирующая кассета с маркером селекции может быть удалена или вырезана. Полученная в результате ELP, которую получают после вырезания кассеты с маркером селекции, может быть затем подвергнута направленному воздействию нового трансгена посредством гомологичной рекомбинации с использованием методов, описанных выше.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Dow AgroSciences LLC

Ainley, William Michael

Blue, Ryan C.

Murray, Michael G.

Corbin, David Richard Miles, Rebecca Ruth Webb, Steven R.

<120> СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПОСАДОЧНЫЕ ПЛОЩАДКИ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ГЕН В РАСТЕНИЯХ <130> 2971-9880.1PC (69559) <150> US 61/297,641 <151> 2010-01-22 <160> 38 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 1
ttcatctttg	gacaagggaa	taaagactcc	ccacttgcta	ctaagaacaa	tacctaagtt	60
gcccagacat	gactgtaccc	attcagagac	ctaccaccca	ttagggctat	gacactaaca	120
ctagcccctg	gaggttgacc	atgctaggca	gtgggggtct	cacctatgac	ccactcagat	180
aggggattgg	tccagtgggt	gggatctcag	cctcatatag	gtgtttgtgg	tgagctttct	240
cctagacaag	agaaccctga	agaacagcaa	gaaccagcta	atatgatatg	tagacatagt	300
gggttgctca	aattttgtgt	ttagtcatat	tagaattgac	ctcagtgacc	actcagaaag	360
tgcccaagcc	catctatagg	ggccaaagtg	ctattgactg	gtgtgtctgt	gaattgttcc	420
tccctacaga	gttggtgctg	atatatccta	gcattctttg	gaaaacctag	ctagggactg	480
tcaagtgtaa	gatacctcct	gaattggagg	gaacactagc	tgccctgtac	cttctggcta	540
gtaccttaca	ccctgaatgg	gttagggggt	ctattatttg	ctggaaatat	accagtttca	600

- 22 031429 gtagggctgc atgcacgtga ccctctggaa cagcctgggc tggagtagat cattcaaagg tcatctagga tgccttaggt acttaatgat tgggtgtagt ttaaagtgaa ggtgacctga gctatcatgg gttctctttt cccacaaggt gttatagcca catcttgctc gaatgggatg ctatccctgt gatcaagtcc atgccacccc gtaacatgtg caacaccaac tggatctgcc tcccagaaat cctatgggca taagtcaact acagtgatcc ctcaatagtt cttggtttgc tgaatcattg attttgggtg caatctatca gttgtttacc gcactaccac agtttgacat gggctgtatg agaagaatcc tcagatattg tggcagacat

660

720

780

840

900

960

1000 <210> 2 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <220>

<223>

<400> 2 taaaatatag tttcctctcc ccctgtaact aggatgccaa gataatatgt ctccctggtc gtgtcctact gaacccccct ggccttgtct tgaggaaaca ctcaatctgc gtgaatgata gggatgttgt agaaaactga ggcacataac agtgaagcaa aggggactgt agtatagggg atgccactcc agagtcctca gggatacctg aaacagtttg ctcaataggg cacacattgt gggtgcaaga aggttgtgtg agactaagtc aagctggaat gctagtctgt taagttcaca ccaagccctc accagcaagg tgacttcaaa acttctgtag ttatcatcac catttttaac gaggtgagcc aaatgggaag ttgagagatt aaggcactac gtgcctggaa ctgggtgcta aggtggctag cttgactcct gagtactggg ttattagtag ttgcacactt atgggtgtat agcctgtcat tctacttgaa attactttcc agagaagcta ctaccaactg atcccatatt ttgtggggct gatgagagct acaagaaacc aaatgttact gtgactgggt gcatcatggc cttattacat tgcagatccc ccaaaaaagt ggagaccctc gggaacaaca aaccaccatc ggcatggagt ctcattaacc ttgctggagg aaatcccaag aacaaatggg gagtcctcct gactttgaga tgggtttgat tagtatttgg gaatgagtct aatacctcat gacctggtgg ctgggattct cagtgagggg tccatccagt aacctcctgg tcaaacaata ataagccatg gcctctgtta ggagactcca cattagggct gggaatcaga ggtggccatg caactgcact agggcctcca tggacacagt aattgatgag atattatgct ggctacaaag tgagtgccct aacataccag ctacttcaag gaacttccta ttcctttcag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1000 <210> 3 <211> 1000 <212> ДНК

- 23 031429 <213> Искусственная последовательность

Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <220>

<223>

<400> 3 tgcactcatg tgtagggtcc aggtcccacc agaatctgga tcagcttgac ctaaccattt ggtcagatcc ccataccgga ctaagctgtg tgcttatcca ggtgggtgaa cagctgatta ggagcatgaa tacaccatta cacctgtagc gtggcaatgg ggcagtgctg ttcatatcca tgctacctgg acacacaaga cctgttagag caaccccttt ggccagtacc ccactccata gagtctgttc gagtgatggt gtggtctgtt ggctgttggg cctaactcct cctggcaata tggaccctga tcataccaat ctatccagtg agtccatcac tcacacccac ccatgtaggt gcttctaaag gaaccagtac agtattcacc tggcactcac gtgcatagct cctggtttcg tctggcacca ctcatggata aagtgtgcct tgggatgtct taaagtattt ggcaagctgt ctttaagctc aacctgaccc cccaaatact tgaggcagat tttgggctgg gtcatggtgt cttacaaggg tctggcagac accagtggag ggccacatga accgggagtg cctgtgggtc ttcaaggctt atgaagcccc caaacaaatg catctaaggg ctggcccact agagcaaagt aattagtggc gtccataggc attgcagtga gaaacaagga gctggatgag gatggtccac accagctttg actacagagc tactttaccc ggccaccttg tgatagcaca gtatagatgg aacaaagaga tttcaaggcc tcttatacaa ctagctacct tcagaagccc ccattggatt gagggttgca aaataatcca aaggccatta cctttaatca ggattcctat tacatgaatg tagatatttg tctttggggc tgccccctcc aaaaggatga ttagacagta cttttccctt attacccttt ggcaaatgtc ttcagtgaca attgaaaact

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1000 <210> 4 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <220>

<223>

<400> 4 tcagaccacc tggtcatctt acctgaggaa gcccatgcct ccccttgttc gtccagctat tcaccaccac tggtgtcctc taatggcctc gtgccctagt catagtgaga taacacctgg aaagccttgc ctacccatta aatggcatcc ttaaagagga atgggaggtg ctagggatta cctgaccacc gagagagcca acaagtctca gtgatggtgc tgggccattc acacagtgat ttgtaggctg ctttcatacc ctgggttggc ttcctgcctc tgacaaagga acctggttga gcctagacaa agcatccagt ctgaggagca ttgagtggaa ttttggacaa aggtgggagg

120

180

240

300

360

- 24 031429

gcaagtgatc	taacaaatct	gttttgcaaa	ggacatcaga	aatctgaggt	gcctatagag	420
aacatcccca	aggtttagca	gaaagaactc	tttaggctga	ctcctggata	atctttccaa	480
ggtggagcca	ttaggcacac	aactgggata	cttgtcagta	gggattaaag	acctttataa	540
gtctcaaggt	ctgggtgtta	aaggacagag	tttattccaa	gagggaatag	agcaaaggca	600
tatatgggag	tgtgggactg	atccctgacc	tctataatgg	gagaggacat	taggacctaa	660
ggtgcagaat	agtggccttc	cttagcctct	ggaagtaatg	gtgggattcc	ccttaacata	720
ccctcctaaa	aactgagaag	tgggggaccc	tggggtggga	tcaaaagatt	agggactggt	780
gtgtaaggtg	aacatgtgct	gcaaggatca	tcctggctgt	ggttgcctca	tcagctagag	840
aaagcccctg	ccactaagcc	atctgcaatg	cctaatcttg	gaacaaggaa	gctgggactg	900
atccattatt	gtcaaaacaa	ctggtgaggg	tgtgccctaa	ggttggtgtt	tactgattgt	960
ggtcttgggt	ctagggactt	ccagatatgg	aaaaaattag			1000

<210> 5 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 5
tgtaccaatg	ttgtctccct	taactaggga	atatctggcc	agccctcatg	tataggtgtt	60
ttagtacact	ctggtgagtg	cattgctcag	tcaactggtg	gaacctgtcc	ccccatccta	120
agggcaaccc	cttgtaccca	atttgaagat	agggttgcta	gagcagtgca	atgaggtccc	180
ttgagtaagc	agatggcctg	ctaggcttca	aacctcagac	ctggtttttt	gtatggcctg	240
ggatcagttg	attatctacc	ccatcatcaa	taacttgccc	ttaatactta	aacatagggc	300
caatcattgt	ggggcctcta	gggaaactgt	ttggtcctgg	cactgtttct	aaaaggggaa	360
cacatcataa	tcagtaggaa	acagaaaagc	aagagtggag	cctaccctag	ttgcccagtg	420
tgggagcaaa	attgatgtaa	ggctacatag	aacccctata	ccctagtagg	tttacctgat	480
cattaggctg	gctccccctg	tcccatagag	cacactcaat	ctcatggcca	agacttgaag	540
gttaaaatct	catggggctg	ctgatcagat	tgcccacaaa	aggtgttacc	tgatacagtc	600
taacttctta	cctgccagca	aaaattttga	tggaagtatc	ctggcaactg	taatcctcta	660
ccacttaaag	attctagtat	tgattaactt	ctctccatac	ctaaacagca	gaatgtagca	720
taggttcata	ggcttccttt	ggaggttcac	tatggaactt	accactggat	gacaaccctc	780
acctgtgcta	ctctccctac	cttggaggac	cattgttgac	ctagagactt	atctgagtgc	840
taacccatga	cattaacctc	tgggggcttc	cccatccctg	gacatgtggc	tggagaaaat	900

- 25 031429 ataggtcaaa aacattgagc acattaggtt gccaatggtg aggctctcta agggtctggg 960 ttacaccaga ttagcagttc ttgacatggg agagtgtgat

1000

<210> <211> <212> <213>

6 1000 ДНК Искусственная последовательность

<220>

<223> Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 6
tcgtctcacg	cttgctgaat	ctgatcagac	tattaggccc	ctcatcttga	acatctttgc	60
catcctttta	gcttggttgt	cagtggaaac	tagggtccaa	tggtttagag	tccagccaga	120
tggaggttgg	gcacaatgcc	cctgcactat	ccaccctagc	tgtagaagtt	atgcttgtcc	180
aaaggttatg	caactgctgt	ctgttgggct	tgagccaaga	gattggtggg	aaatcttgcc	240
agagttggcc	agttgtctcc	tgtccaccaa	catgatccta	tatatgggtc	cccaccctgg	300
ttcccaagcc	actcttgtag	gctgaagagg	aaacacctca	gaagctgagt	agtccaagac	360
tgcttgcacc	aagtttccac	cccttacctg	tcctgaaatt	aaaggcacca	gtgttccggt	420
tcccttggac	tttctacttg	tagtgtagca	ctgggtggac	ctactccctt	tatcctggga	480
tcatggcact	ttctattaca	gtgggtcaca	acttgaggca	gccctgtagt	tgagtatata	540
gtggagagca	ccagatgatg	attttacttg	gtgtaggttg	tccctggccc	ttagctgtgg	600
tgaccccatt	gtcatcctcc	agttccaact	ttccatttcc	tgcaatgagt	ggtccacatt	660
gctggctggg	ggtggatcta	tccctccatt	tgggaagaaa	cagtgatatg	gacactaacc	720
accataagtg	gatggattct	tcatagagtg	gttgcttttg	cccaagtctg	tgcagcagag	780
gtgtcaacct	ggtccccaat	tagtgaaata	atctcacagc	ctgggggcta	ctcgtattag	840
gaccagtacc	cattccagcc	tggcccaaaa	ctttagttga	gcctagacct	tcccacttac	900
atggactgat	tgtggcggtt	ccagatgact	gttgacttcc	tatccatttg	gacttttgga	960
ggggccagaa	acctattcct	ccagtatagt	cctccacatt			1000

<210>	7
<211>	1000
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Пример последовательности, фланкирующей по	меньшей мере один
	сайт связывания эндонуклеазы направленного	действия
<400>	7
tgtcacccag aggttccctc tgtacagctg aaaatccatt agtaaagcca tataactccc	60

- 26 031429

acccagaggg	tggcagtatc	ctatctcaat	accactgctg	ggtgatagct	tctcatccct	120
tattactgag	gcccaaggct	atttgaccaa	tagagctggt	ctcccccact	tcatcaaccc	180
tcactattaa	ccctgtatct	actagccact	tgaaaccagt	gccattctta	aaatgtagga	240
tggttttagc	catagagaac	tggcatagtg	gagggagtgt	aggggcctct	gcctggtggg	300
aaggaaccct	gattcagagc	tttaagcctg	tagggcctta	aaagtacctt	gatgacttgg	360
gtccctaaag	tcccttgggc	caatgctgat	ggatacctct	tggtccccaa	aggattccct	420
tgaattacat	ctgataggga	ctccattgga	cagcagcaca	aaagtctgat	ctaaactcac	480
ctgagatagt	tactctgcat	ccattgctgg	ccattacaag	tccatcacaa	tgtggaaggt	540
tttggagggt	gaacagagcc	aaggacagct	taatgacttt	tcccaaggag	ggctaggcac	600
tcacaagtgt	tgtttgtaca	ccatctggct	atggcaaaac	ccaaaacact	ttatgcctgg	660
tggaaaagaa	gtggccatga	tactttgttg	atgggcagtt	caagaaagag	tgggtgatat	720
gaccctcttg	ttaggcagag	tttcaaggat	tacctcctcc	agcagatggg	accatgttcc	780
ctcaaggtga	gtagggccta	aatcatgcct	ggagttggag	tttgtagggt	ctatgagaca	840
ttttcatact	gtagaaacat	cctattgtag	gaggcaagcc	acaagtggat	tgtttaaagt	900
ggtgtcagtt	gaattgaata	gaactccatg	ttagagggtc	cctagtgttg	tccctgcatg	960
tattttagtg	ccatccatct	agtctataat	atcacctagt			1000

<210> 8 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 8
ttccaccctg	acagagttaa	tcctagctta	cccaagggca	gtaacatgca	gtggatggca	60
gtagggcaca	actctgctgt	ttatccacct	ttgagtgtct	ggcatcctag	cataactggc	120
tacatgagag	ggttaatggt	ccctggcagc	cctggtggtt	gcagcctgtc	ctggctccaa	180
gttaataccc	ctatattggg	atctattgga	cttgctgggc	actgcctgat	ggttcaccag	240
ctatgtcaca	tggttgggag	tggacaccca	agtgatacct	cctaagtgag	aggagcaaat	300
tacaatgcca	ctttatgggc	cactgggtgc	atttgaggag	cctagtgttg	ctttttcttg	360
ggacccattg	gtgctgggaa	agggattcca	cacagtggga	gggtgcctta	aactcctcat	420
gtgggggttg	gagctggaac	taggagtggc	tgactacaag	cctggcttat	tgacatcatt	480
agtggtgaat	ggtttccaga	gcttgacaaa	gctgaactgt	taggaggacc	tgggaccaat	540
cagagataat	cttctaactg	gcattggtgc	tattaagtaa	accatctcac	cagtcagcca	600

- 27 031429 aggggttctt tgttcaactg ggggcttctt ttgggcactt tactgtccca aagatcaaga agatggcagt tcactgtcta atcctgacat gacagttaag gtgattccca taaggttgtg acctagtcac tgggcttatg cttgtgggac ttctcagctt gtgacacctt ccttactgtc gcctaacctt ttctgtagtg gaggatctac cttggccaca aacagatgga agttggctga cacattgcca tgggctgcaa agtatggcag tgcctacagt ctggtggacc cctacttggc catgtaaact ccagtttgct attaacatga tgataagcag catctattgg accacattgg ccagtgatcc accaaggctt atatccatag cttgactcct

660

720

780

840

900

960

1000

1000

ДНК

Искусственная последовательность

Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <210>

<211>

<212>

<213> <220>

<223>

<400> 9 tgcttgactc ctgaggcaag caagccacca tagcacacct ttttggagtc cctgaggaga agctggtggg ggaagtggga ttccagcatc aaccagtacc aagatattgc tcagtgtcca gttaatcaag agtgtaaacc ggatggtatc caacagctga tacccttgga ttgcatagtg aactccagtg gcactggcta cttactgttc ctacaatcct ctgggccaca ttggttccct tatagggaag ttgacccaaa tcttacaatt cattctgctc ccttacagag tttatctggt tcactatttc agaagaggat taatggaagt ttcaaggagc tacttccacc gcacttattc accctgaagg taatggactt cttagaacaa acttccttat ggcagtttag agaaatgtag agattacagt ccccactctt actgattatt gccatgtaga cactagggac tgtcaaaccc cgcccaagcc cacctccttg acttaccaaa cacacactca tatgatccca caaggatatt aatctacgat cctatgggca agggcattgt tagggccaaa cattggagca atttgaacta tctgctactg ttggtcagct tagtcactat tgcaaacaca tgacatcatg cccttccact accacgctac gcccagaccc aaccttaata aactaggcaa acatccagac ctcacgatca tatatccatt gagacctgct tagcagatac tgttaaacta agtgtggagc tgccttatgc ggattggcat attactcagc atgcccatca ctagaggagc gacttctgga taaatgctta taggccatcc gggactagca acctcggacg tgggggggtc cttctctcaa atgagggagt gtcctttcat aaaagacttt accaaaaaac cctgcgttga gggaaaacaa tcatagacct ttcccacgct aacactgcct gttgtgaagg tcaattcacc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1000 <210> 10 <211> 1001 <212> ДНК

- 28 031429

<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Пример последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия
<400> 10 tttcataggg	atatgtgagg	actaaccttg	gccaaaggag	ctggaactgc	ttatgtaagg	60
gccttagtcc	aaattgctcc	accctctggg	aagctaatgg	tccctccttg	ggccttatag	120
tgaagcggaa	tgggcatacc	tagttgtctg	ttctgggttg	accctgctgg	actcctcagt	180
tttagttcca	ctaccaaaga	ccttgagtct	acagatgtgt	tgctaaatcc	tcacaaacct	240
ccaacaattt	ttatgccctc	tatcttctcc	aaagttgctg	ctgatccctg	ccctcttatt	300
aagagccata	gcaacaatac	ctgaggtgag	ggtttcacca	ccaccatcta	cctggaaaca	360
tcagccctcc	tacatcttac	cactcccaat	agggggctta	gccactcttg	aggtggtcat	420
cctttagcac	ctttggttct	aggataggct	gggcaccctg	gcagatgccc	actgacagcc	480
ctagaggaac	ccaaggggaa	acaagccact	acatacaact	tggcaagcaa	gtcaaggcaa	540
ggcttgacta	atctatagat	caaggttagt	accacttaat	tggggaagtc	cagaaagtga	600
gcactaagta	tgagcaaccc	tctaatgact	cagactaaag	ggtgacaagc	caagtaaatg	660
ttttctacat	tagaggttcc	tgggggcttg	atttctactt	ccttaggatt	ccctggtctt	720
agggagaata	tgtcctctta	ggtgtcctag	ccaaggacca	gtaacaattc	ttcctggacc	780
tctattttgc	tttataccac	actcaatcac	tttgggattc	attccatgcc	tcaagagaca	840
ccaagataga	gggaaattgg	ggacccaagt	ggggagcatt	ttttgtctct	ccttgagggc	900
aactctggac	agtgaggaac	taggagggtg	tgatctctat	atagatggag	tgttgtacct	960
aagggtgaaa	gctggcacat	ccattggttc	aagtttgccc	t		1001

<210> 11 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 11
ttcatctttg	gacaagggaa	taaagactcc	ccacttgcta	ctaagaacaa	tacctaagtt	60
gcccagacat	gactgtaccc	attcagagac	ctaccaccca	ttagggctat	gacactaaca	120
ctagcccctg	gaggttgacc	atgctaggca	gtgggggtct	cacctatgac	ccactcagat	180
aggggtttaa	accagtgggt	gggatctcag	cctcatatag	gtgtttgtgg	tgagctttct	240
cctagacaag	agaaccctga	agaacagcaa	gaaccagcta	atatgatatg	tagacatagt	300
gggttgctca	aattttgtgt	ttagtcatat	tagaattgac	ctcagtgacc	actcagaaag	360

- 29 031429

tgcccaagcc	catctatagg	ggccaaagtg	ctattgactg	gtgtgtctgt	gaattgttcc	420
tccctacaga	gttggtgctg	atatatccta	gcattctttg	gaaaacctag	ctagggactg	480
tcaagtgtaa	gatacctcct	gaattggagg	gaacactagc	tgccctgtac	cttctggcta	540
gtaccttaca	ccctgaatgg	gttagggggt	ctattatttg	ctggaaatat	accagtttca	600
gtagggctgc	tgccttaggt	cccacaaggt	gtaacatgtg	ctcaatagtt	gcactaccac	660
atgcacgtga	acttaatgat	gttatagcca	caacaccaac	cttggtttgc	agtttgacat	720
ccctctggaa	tgggtgtagt	catcttgctc	tggatctgcc	tgaatcattg	gggctgtatg	780
cagcctgggc	ttaaagtgaa	gaatgggatg	tcccagaaat	attttgggtg	agaagaatcc	840
tggagtagat	ggtgacctga	ctatccctgt	cctatgggca	caatctatca	tcagatattg	900
cattcaaagg	gctatcatgg	gatcaagtcc	taagtcaact	gttgtttacc	tggcagacat	960
tcatctagga	gttctctttt	atgccacccc	acagtgatcc			1000

<210> 12 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 12
tgcactcatg	ttcatatcca	tcacacccac	tgaggcagat	attgcagtga	gagggttgca	60
tgtagggtcc	tgctacctgg	ccatgtaggt	tttgggctgg	gaaacaagga	aaataatcca	120
aggtcccacc	acacacaaga	gcttctaaag	gtcatggtgt	gctggatgag	aaggccatta	180
agtttaaaca	cctgttagag	gaaccagtac	cttacaaggg	gatggtccac	cctttaatca	240
tcagcttgac	caaccccttt	agtattcacc	tctggcagac	accagctttg	ggattcctat	300
ctaaccattt	ggccagtacc	tggcactcac	accagtggag	actacagagc	tacatgaatg	360
ggtcagatcc	ccactccata	gtgcatagct	ggccacatga	tactttaccc	tagatatttg	420
ccataccgga	gagtctgttc	cctggtttcg	accgggagtg	ggccaccttg	tctttggggc	480
ctaagctgtg	gagtgatggt	tctggcacca	cctgtgggtc	tgatagcaca	tgccccctcc	540
tgcttatcca	gtggtctgtt	ctcatggata	ttcaaggctt	gtatagatgg	aaaaggatga	600
ggtgggtgaa	ggctgttggg	aagtgtgcct	atgaagcccc	aacaaagaga	ttagacagta	660
cagctgatta	cctaactcct	tgggatgtct	caaacaaatg	tttcaaggcc	cttttccctt	720
ggagcatgaa	cctggcaata	taaagtattt	catctaaggg	tcttatacaa	attacccttt	780
tacaccatta	tggaccctga	ggcaagctgt	ctggcccact	ctagctacct	ggcaaatgtc	840
cacctgtagc	tcataccaat	ctttaagctc	agagcaaagt	tcagaagccc	ttcagtgaca	900

- 30 031429 gtggcaatgg ctatccagtg aacctgaccc aattagtggc ccattggatt attgaaaact 960 ggcagtgctg agtccatcac cccaaatact gtccataggc

1000 <210> 13 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 13
taaaatatag	agtatagggg	ttatcatcac	agagaagcta	ttgctggagg	gcctctgtta	60
tttcctctcc	atgccactcc	catttttaac	ctaccaactg	aaatcccaag	ggagactcca	120
ccctgtaact	agagtcctca	gaggtgagcc	atcccatatt	aacaaatggg	cattagggct	180
aggatgccaa	gggatacctg	aaatgggaag	ttgtggggct	gagtcctcct	gggaatcaga	240
gataatatgt	aaacagtttg	ttgagagatt	gatgagagct	gactttgaga	ggtggccatg	300
ctccctggtc	ctcaataggg	aaggcactac	acaagaaacc	tgggtttgat	caactgcact	360
gtgtcctact	cacacattgt	gtgcctggaa	aaatgttact	tagtatttgg	agggcctcca	420
gaacccccct	gggtgcaaga	ctgggtgcta	gtgactgggt	gaatgagtct	tggacacagt	480
ggccttgtct	aggttgtgtg	aggtggctag	gcatcatggc	aatacctcat	aattgatgag	540
tgaggaaaca	agactaagtc	cttgactcct	cttattacat	gacctggtgg	atattatgtt	600
taaactctgc	aagctggaat	gagtactggg	tgcagatccc	ctgggattct	ggctacaaag	660
gtgaatgata	gctagtctgt	ttattagtag	ccaaaaaagt	cagtgagggg	tgagtgccct	720
gggatgttgt	taagttcaca	ttgcacactt	ggagaccctc	tccatccagt	aacataccag	780
agaaaactga	ccaagccctc	atgggtgtat	gggaacaaca	aacctcctgg	ctacttcaag	840
ggcacataac	accagcaagg	agcctgtcat	aaccaccatc	tcaaacaata	gaacttccta	900
agtgaagcaa	tgacttcaaa	tctacttgaa	ggcatggagt	ataagccatg	ttcctttcag	960
aggggactgt	acttctgtag	attactttcc	ctcattaacc			1000

<210> 14 <211> 1000 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <400> 14 tcagaccacc tcaccaccac aaagccttgc cctgaccacc ttgtaggctg gcctagacaa 60

- 31 031429

tggtcatctt	tggtgtcctc	ctacccatta	gagagagcca	ctttcatacc	agcatccagt	120
acctgaggaa	taatggcctc	aatggcatcc	acaagtctca	ctgggttggc	ctgaggagca	180
gcccatgcct	gtgccctagt	ttaaagagga	gtgatggtgc	ttcctgcctc	ttgagtggaa	240
ccccttgttc	catagtgaga	atgggaggtg	tgggccattc	tgacaaagga	ttttggacaa	300
gtccagctat	taacacctgg	ctagggatta	acacagtgat	acctggttga	aggtgggagg	360
gcaagtgatc	taacaaatct	gttttgcaaa	ggacatcaga	aatctgaggt	gcctatagag	420
aacatcccca	aggtttagca	gaaagaactc	tttaggctga	ctcctggata	atctttccaa	480
ggtggagcca	ttaggcacac	aactgggata	cttgtcagta	gggattaaag	acctttataa	540
gtctcaaggg	tttaaactta	aaggacagag	tttattccaa	gagggaatag	agcaaaggca	600
tatatgggag	tgtgggactg	atccctgacc	tctataatgg	gagaggacat	taggacctaa	660
ggtgcagaat	agtggccttc	cttagcctct	ggaagtaatg	gtgggattcc	ccttaacata	720
ccctcctaaa	aactgagaag	tgggggaccc	tggggtggga	tcaaaagatt	agggactggt	780
gtgtaaggtg	aacatgtgct	gcaaggatca	tcctggctgt	ggttgcctca	tcagctagag	840
aaagcccctg	ccactaagcc	atctgcaatg	cctaatcttg	gaacaaggaa	gctgggactg	900
atccattatt	gtcaaaacaa	ctggtgaggg	tgtgccctaa	ggttggtgtt	tactgattgt	960
ggtcttgggt	ctagggactt	ccagatatgg	aaaaaattag			1000

<210> 15 <211> 2099 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример сконструированной посадочной площадки <400> 15

ggccggccgg	atccttcatc	tttggacaag	ggaataaaga	ctccccactt	gctactaaga	60
acaataccta	agttgcccag	acatgactgt	acccattcag	agacctacca	cccattaggg	120
ctatgacact	aacactagcc	cctggaggtt	gaccatgcta	ggcagtgggg	gtctcaccta	180
tgacccactc	agataggggt	ttaaaccagt	gggtgggatc	tcagcctcat	ataggtgttt	240
gtggtgagct	ttctcctaga	caagagaacc	ctgaagaaca	gcaagaacca	gctaatatga	300
tatgtagaca	tagtgggttg	ctcaaatttt	gtgtttagtc	atattagaat	tgacctcagt	360
gaccactcag	aaagtgccca	agcccatcta	taggggccaa	agtgctattg	actggtgtgt	420
ctgtgaattg	ttcctcccta	cagagttggt	gctgatatat	cctagcattc	tttggaaaac	480
ctagctaggg	actgtcaagt	gtaagatacc	tcctgaattg	gagggaacac	tagctgccct	540
gtaccttctg	gctagtacct	tacaccctga	atgggttagg	gggtctatta	tttgctggaa	600
atataccagt	ttcagtaggg	ctgctgcctt	aggtcccaca	aggtgtaaca	tgtgctcaat	660

- 32 031429

agttgcacta	ccacatgcac	gtgaacttaa	tgatgttata	gccacaacac	caaccttggt	720
ttgcagtttg	acatccctct	ggaatgggtg	tagtcatctt	gctctggatc	tgcctgaatc	780
attggggctg	tatgcagcct	gggcttaaag	tgaagaatgg	gatgtcccag	aaatattttg	840
ggtgagaaga	atcctggagt	agatggtgac	ctgactatcc	ctgtcctatg	ggcacaatct	900
atcatcagat	attgcattca	aagggctatc	atgggatcaa	gtcctaagtc	aactgttgtt	960
tacctggcag	acattcatct	aggagttctc	ttttatgcca	ccccacagtg	atccgccttt	1020
tgcagtttat	ccactaggga	caggattgcc	accccacagt	ggggcctcta	tgcccgggac	1080
aagtgtaaaa	tatagagtat	aggggttatc	atcacagaga	agctattgct	ggagggcctc	1140
tgttatttcc	tctccatgcc	actcccattt	ttaacctacc	aactgaaatc	ccaagggaga	1200
ctccaccctg	taactagagt	cctcagaggt	gagccatccc	atattaacaa	atgggcatta	1260
gggctaggat	gccaagggat	acctgaaatg	ggaagttgtg	gggctgagtc	ctcctgggaa	1320
tcagagataa	tatgtaaaca	gtttgttgag	agattgatga	gagctgactt	tgagaggtgg	1380
ccatgctccc	tggtcctcaa	tagggaaggc	actacacaag	aaacctgggt	ttgatcaact	1440
gcactgtgtc	ctactcacac	attgtgtgcc	tggaaaaatg	ttacttagta	tttggagggc	1500
ctccagaacc	cccctgggtg	caagactggg	tgctagtgac	tgggtgaatg	agtcttggac	1560
acagtggcct	tgtctaggtt	gtgtgaggtg	gctaggcatc	atggcaatac	ctcataattg	1620
atgagtgagg	aaacaagact	aagtccttga	ctcctcttat	tacatgacct	ggtggatatt	1680
atgtttaaac	tctgcaagct	ggaatgagta	ctgggtgcag	atcccctggg	attctggcta	1740
caaaggtgaa	tgatagctag	tctgtttatt	agtagccaaa	aaagtcagtg	aggggtgagt	1800
gccctgggat	gttgttaagt	tcacattgca	cacttggaga	ccctctccat	ccagtaacat	1860
accagagaaa	actgaccaag	ccctcatggg	tgtatgggaa	caacaaacct	cctggctact	1920
tcaagggcac	ataacaccag	caaggagcct	gtcataacca	ccatctcaaa	caatagaact	1980
tcctaagtga	agcaatgact	tcaaatctac	ttgaaggcat	ggagtataag	ccatgttcct	2040
ttcagagggg	actgtacttc	tgtagattac	tttccctcat	taaccagatc	tggccggcc	2099

<210>	16
<211>	2103
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Пример сконструированной	посадочной	площадки
<400>	16
ggccggccgg atcctgcact catgttcata	tccatcacac	ccactgaggc	agatattgca	60
gtgagagggt tgcatgtagg gtcctgctac	ctggccatgt	aggttttggg	ctgggaaaca	120

- 33 031429

aggaaaataa	tccaaggtcc	caccacacac	aagagcttct	aaaggtcatg	gtgtgctgga	180
tgagaaggcc	attaagttta	aacacctgtt	agaggaacca	gtaccttaca	aggggatggt	240
ccacccttta	atcatcagct	tgaccaaccc	ctttagtatt	cacctctggc	agacaccagc	300
tttgggattc	ctatctaacc	atttggccag	tacctggcac	tcacaccagt	ggagactaca	360
gagctacatg	aatgggtcag	atccccactc	catagtgcat	agctggccac	atgatacttt	420
accctagata	tttgccatac	cggagagtct	gttccctggt	ttcgaccggg	agtgggccac	480
cttgtctttg	gggcctaagc	tgtggagtga	tggttctggc	accacctgtg	ggtctgatag	540
cacatgcccc	ctcctgctta	tccagtggtc	tgttctcatg	gatattcaag	gcttgtatag	600
atggaaaagg	atgaggtggg	tgaaggctgt	tgggaagtgt	gcctatgaag	ccccaacaaa	660
gagattagac	agtacagctg	attacctaac	tccttgggat	gtctcaaaca	aatgtttcaa	720
ggcccttttc	ccttggagca	tgaacctggc	aatataaagt	atttcatcta	agggtcttat	780
acaaattacc	cttttacacc	attatggacc	ctgaggcaag	ctgtctggcc	cactctagct	840
acctggcaaa	tgtccacctg	tagctcatac	caatctttaa	gctcagagca	aagttcagaa	900
gcccttcagt	gacagtggca	atggctatcc	agtgaacctg	acccaattag	tggcccattg	960
gattattgaa	aactggcagt	gctgagtcca	tcaccccaaa	tactgtccat	aggcaagact	1020
cccgcccatc	tctctatgcc	cgggacaagt	ggagtccatg	ctcaacaccg	tgcactaggg	1080
acaggattgt	cagaccacct	caccaccaca	aagccttgcc	ctgaccacct	tgtaggctgg	1140
cctagacaat	ggtcatcttt	ggtgtcctcc	tacccattag	agagagccac	tttcatacca	1200
gcatccagta	cctgaggaat	aatggcctca	atggcatcca	caagtctcac	tgggttggcc	1260
tgaggagcag	cccatgcctg	tgccctagtt	taaagaggag	tgatggtgct	tcctgcctct	1320
tgagtggaac	cccttgttcc	atagtgagaa	tgggaggtgt	gggccattct	gacaaaggat	1380
tttggacaag	tccagctatt	aacacctggc	tagggattaa	cacagtgata	cctggttgaa	1440
ggtgggaggg	caagtgatct	aacaaatctg	ttttgcaaag	gacatcagaa	atctgaggtg	1500
cctatagaga	acatccccaa	ggtttagcag	aaagaactct	ttaggctgac	tcctggataa	1560
tctttccaag	gtggagccat	taggcacaca	actgggatac	ttgtcagtag	ggattaaaga	1620
cctttataag	tctcaagggt	ttaaacttaa	aggacagagt	ttattccaag	agggaataga	1680
gcaaaggcat	atatgggagt	gtgggactga	tccctgacct	ctataatggg	agaggacatt	1740
aggacctaag	gtgcagaata	gtggccttcc	ttagcctctg	gaagtaatgg	tgggattccc	1800
cttaacatac	cctcctaaaa	actgagaagt	gggggaccct	ggggtgggat	caaaagatta	1860
gggactggtg	tgtaaggtga	acatgtgctg	caaggatcat	cctggctgtg	gttgcctcat	1920
cagctagaga	aagcccctgc	cactaagcca	tctgcaatgc	ctaatcttgg	aacaaggaag	1980
ctgggactga	tccattattg	tcaaaacaac	tggtgagggt	gtgccctaag	gttggtgttt	2040

- 34 031429 actgattgtg gtcttgggtc tagggacttc cagatatgga aaaaattaga gatctggccg 2100 gcc

2103 <210> 17 <211> 990 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия

<400> 17
tgtaccaatg	ttgtctccct	taactaggga	atatctggcc	agccctcatg	tataggtgtt	60
ttagtacact	ctggtgagtg	cattgctcag	tcaactggtg	gaacctgtcc	ccccatccta	120
agggcaaccc	cttgtaccca	atttgaagat	agggttgcta	gagcagtgca	atgaggtccc	180
ttgagtaagc	agatggcctg	ctaggcttca	aacctcagac	ctggtttttt	gtatggcctg	240
ggatcagttg	attatctacc	ccatcatcaa	taacttgccc	ttaatactta	aacatagggc	300
caatcattgt	ggggcctcta	gggaaactgt	ttggtcctgg	cactgtttct	aaaaggggaa	360
cacatcataa	tcagtaggaa	acagaaaagc	aagagtggag	cctaccctag	ttgcccagtg	420
tgggagcaaa	attgatgtaa	ggctacatag	aacccctata	ccctagtagg	gtttaaacct	480
gatcattagg	ctggctcccc	ctgtcccata	gagcacactc	aatctcatgg	ccaagacttg	540
aaggttaaaa	tctcatgggg	ctgctgatca	gattgcccac	aaaaggtgtt	acctgataca	600
gtctaacttc	ttacctgcca	gcaaaaattt	tgatggaagt	atcctggcaa	ctgtaatcct	660
ctaccactta	aagattctag	tattgattaa	cttctctcca	tacctaaaca	gcagaatgta	720
gcataggttc	ataggcttcc	tttggaggtt	cactatggaa	cttaccactg	gatgacaacc	780
ctcacctgtg	ctactctccc	taccttggag	gaccattgtt	gacctagaga	cttatctgag	840
tgctaaccca	tgacattaac	ctctgggggc	ttccccatcc	ctggacatgt	ggctggagaa	900
aatataggtc	aaaaacattg	agcacattag	gtcgactgcc	aatggtgagg	ctctctaagg	960
gtctgggtta	caccagatta	gcagttcttg				990

<210> 18 <211> 1022 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пример модифицированной последовательности, фланкирующей по меньшей мере один сайт связывания эндонуклеазы направленного действия <400> 18 catgggagag tgtgattcgt ctcacgcttg ctgaatctcg agtcagacta ttaggcccct 60

- 35 031429

catcttgaac	atctttgcca	tccttttagc	ttggttgtca	gtggaaacta	gggtccaatg	120
gtttagagtc	cagccagatg	gaggttgggc	acaatgcccc	tgcactatcc	accctagctg	180
tagaagttat	gcttgtccaa	aggttatgca	actgctgtct	gttgggcttg	agccaagaga	240
ttggtgggaa	atcttgccag	agttggccag	ttgtctcctg	tccaccaaca	tgatcctata	300
tatgggtccc	caccctggtt	cccaagccac	tcttgtaggc	tgaagaggaa	acacctcaga	360
agctgagtag	tccaagactg	cttgcaccaa	gtttccaccc	cttacctgtc	ctgaaattaa	420
aggcaccagt	gttccggttc	ccttggactt	tctacttgta	gtgtagcact	gggtggacct	480
actcccgttt	aaactcctgg	gatcatggca	ctttctatta	cagtgggtca	caacttgagg	540
cagccctgta	gttgagtata	tagtggagag	caccagatga	tgattttact	tggtgtaggt	600
tgtccctggc	ccttagctgt	ggtgacccca	ttgtcatcct	ccagttccaa	ctttccattt	660
cctgcaatga	gtggtccaca	ttgctggctg	ggggtggatc	tatccctcca	tttgggaaga	720
aacagtgata	tggacactaa	ccaccataag	tggatggatt	cttcatagag	tggttgcttt	780
tgcccaagtc	tgtgcagcag	aggtgtcaac	ctggtcccca	attagtgaaa	taatctcaca	840
gcctgggggc	tactcgtatt	aggaccagta	cccattccag	cctggcccaa	aactttagtt	900
gagcctagac	cttcccactt	acatggactg	attgtggcgg	ttccagatga	ctgttgactt	960
cctatccatt	tggacttttg	gaggggccag	aaacctattc	ctccagtata	gtcctccaca	1020

tt 1022

<210> <211> <212> <213>

19 2082 ДНК Искусственная последовательность

<220>

<223> Пример сконструированной посадочной площадки <400> 19

tgtaccaatg	ttgtctccct	taactaggga	atatctggcc	agccctcatg	tataggtgtt	60
ttagtacact	ctggtgagtg	cattgctcag	tcaactggtg	gaacctgtcc	ccccatccta	120
agggcaaccc	cttgtaccca	atttgaagat	agggttgcta	gagcagtgca	atgaggtccc	180
ttgagtaagc	agatggcctg	ctaggcttca	aacctcagac	ctggtttttt	gtatggcctg	240
ggatcagttg	attatctacc	ccatcatcaa	taacttgccc	ttaatactta	aacatagggc	300
caatcattgt	ggggcctcta	gggaaactgt	ttggtcctgg	cactgtttct	aaaaggggaa	360
cacatcataa	tcagtaggaa	acagaaaagc	aagagtggag	cctaccctag	ttgcccagtg	420
tgggagcaaa	attgatgtaa	ggctacatag	aacccctata	ccctagtagg	gtttaaacct	480
gatcattagg	ctggctcccc	ctgtcccata	gagcacactc	aatctcatgg	ccaagacttg	540
aaggttaaaa	tctcatgggg	ctgctgatca	gattgcccac	aaaaggtgtt	acctgataca	600

- 36 031429

gtctaacttc	ttacctgcca	gcaaaaattt	tgatggaagt	atcctggcaa	ctgtaatcct	660
ctaccactta	aagattctag	tattgattaa	cttctctcca	tacctaaaca	gcagaatgta	720
gcataggttc	ataggcttcc	tttggaggtt	cactatggaa	cttaccactg	gatgacaacc	780
ctcacctgtg	ctactctccc	taccttggag	gaccattgtt	gacctagaga	cttatctgag	840
tgctaaccca	tgacattaac	ctctgggggc	ttccccatcc	ctggacatgt	ggctggagaa	900
aatataggtc	aaaaacattg	agcacattag	gtcgactgcc	aatggtgagg	ctctctaagg	960
gtctgggtta	caccagatta	gcagttcttg	gccttttgca	gtttatctct	atgcccggga	1020
caagtgaaga	ctcccgccca	tccaggatga	ggatgaccaa	catgggagag	tgtgattcgt	1080
ctcacgcttg	ctgaatctcg	agtcagacta	ttaggcccct	catcttgaac	atctttgcca	1140
tccttttagc	ttggttgtca	gtggaaacta	gggtccaatg	gtttagagtc	cagccagatg	1200
gaggttgggc	acaatgcccc	tgcactatcc	accctagctg	tagaagttat	gcttgtccaa	1260
aggttatgca	actgctgtct	gttgggcttg	agccaagaga	ttggtgggaa	atcttgccag	1320
agttggccag	ttgtctcctg	tccaccaaca	tgatcctata	tatgggtccc	caccctggtt	1380
cccaagccac	tcttgtaggc	tgaagaggaa	acacctcaga	agctgagtag	tccaagactg	1440
cttgcaccaa	gtttccaccc	cttacctgtc	ctgaaattaa	aggcaccagt	gttccggttc	1500
ccttggactt	tctacttgta	gtgtagcact	gggtggacct	actcccgttt	aaactcctgg	1560
gatcatggca	ctttctatta	cagtgggtca	caacttgagg	cagccctgta	gttgagtata	1620
tagtggagag	caccagatga	tgattttact	tggtgtaggt	tgtccctggc	ccttagctgt	1680
ggtgacccca	ttgtcatcct	ccagttccaa	ctttccattt	cctgcaatga	gtggtccaca	1740
ttgctggctg	ggggtggatc	tatccctcca	tttgggaaga	aacagtgata	tggacactaa	1800
ccaccataag	tggatggatt	cttcatagag	tggttgcttt	tgcccaagtc	tgtgcagcag	1860
aggtgtcaac	ctggtcccca	attagtgaaa	taatctcaca	gcctgggggc	tactcgtatt	1920
aggaccagta	cccattccag	cctggcccaa	aactttagtt	gagcctagac	cttcccactt	1980
acatggactg	attgtggcgg	ttccagatga	ctgttgactt	cctatccatt	tggacttttg	2040
gaggggccag	aaacctattc	ctccagtata	gtcctccaca	tt		2082

<210> 20 <211> 530 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Модуль ZFN 2:4-MCS-2:4 <400> 20 actagtctcg agtgtccgat actggatcgt tctttcatgt agcagagcgg ttggcccaaa 60

- 37 031429

tgtttattgg	gatatcgtga	gtcagatgtt	cacttggtca	atgggtacag	tccgccgcca	120
gtgtctattt	gagcctctct	gcaagactcc	cgcccatctc	tctatgcccg	ggacaagtgt	180
ggacgacaag	cgagtgcagc	cggcttacag	ccttttgcag	tttatctcta	tgcccgggac	240
aagtgattaa	taagctttta	attaacctgc	agggcatgcg	tcgacaagac	tcccgcccat	300
ctctctatgc	ccgggacaag	tgtcgagagg	aatggccatg	agtatttggt	ttgccttttg	360
cagtttatct	ctatgcccgg	gacaagtgca	gagcggttgg	cccaaatgtt	tattgggata	420
tcgtgagtca	gatgttcact	tggtcaatgg	gtacagtccg	ccgccagtgt	ctatttgagc	480
ctctctgcgt	acatgataac	ctcagttggc	gagcgttgct	cgagactagt		530

<210>	21
<211>	26
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотид 610F
<400>	21
gctactaaga acaataccta agttgc	26

<210>	22
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотид 611F
<400>	22
tgcactcatg ttcatatcc	19

<210>	23
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотид 611R
<400>	23
tgtacaagaa agctgggtg	19

<210>	24
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотид YFPF_3302
<400>	24
tatggtccag agttgaagg	19

- 38 031429 <210> 25 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотид YFPR_4577 <400>25 tcatctgcac aactggtga19

<210>	26
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Олигонуклеотид YFPF_4302
<400>	26
tctttcccaa cacatgacc	19

<210>	27
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер TQPATS
<400>	27
acaagagtgg attgatgatc tagagaggt	29

<210>	28
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер TQPATA
<400>	28
ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt	29

<210>	29
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер TQPATFQ
<400>	29
ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctgg	29

<210>30

- 39 031429 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ZGP3S <400> 30 cctgctccac taccagtaca a 21

<210>	31
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер ZGP3A
<400>	31
gtccaagaag gtgaccttct c	21

<210>	32
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер TQZGP3
<400>	32
agatcaccga ctttgcgctc ttt	23

<210>	33
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер GAAD1F
<400>	33
tgttcggttc cctctaccaa	20

<210>	34
<211>	22
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер GAAD1R
<400>	34
caacatccat caccttgact ga	22

<210> <211> <212> <213>

35 24 ДНК Искусственная последовательность

- 40 031429 <220>

<223> Праймер GAAD1P <400> 35 cacagaaccg tcgcttcagc aaca

<210>	36
<211>	18
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер IVF-Taq
<400>	36
tggcggacga cgacttgt	18

<210>	37
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер INR-Taq
<400>	37
aaagtttgga ggctgccgt	19

<210>	38
<211>	26
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер IV-Probe
<400>	38
cgagcagacc gccgtgtact tctacc	26

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения клетки трансгенного растения, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность в целевом локусе генома, включающий введение в клетку растения по меньшей мере одной эндонуклеазы направленного действия и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность, где клетка растения содержит в целевом локусе сконструированную посадочную площадку (ELP), которая содержит по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-14, 17 и 18, и по меньшей мере один сайт распознавания эндонуклеазы направленного действия, где по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-14, 17 и 18, фланкируют по меньшей мере один сайт распознавания эндонуклеазы направленного действия;

   эндонуклеаза направленного действия, введенная в растительную клетку, распознает сайт распознавания эндонуклеазы направленного действия в ELP и молекула нуклеиновой кислоты, введенная в растительную клетку, содержит две нуклеотидные последовательности, фланкирующие представляющую интерес нуклеотидную последовательность, где каждая из двух дополнительных нуклеотидных последовательностей гомологична одной из нуклеотидных последовательностей в ELP, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-14, 17 и 18,

   - 41 031429 таким образом, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность стабильно интегрируется в геном клетки растений посредством гомологичной рекомбинации в целевом локусе.
2. 2. Способ по п.1, где эндонуклеазу направленного действия вводят в клетку растения путем трансформации клетки растения молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей эндонуклеазу направленного действия.
3. 3. Способ по п.1, где эндонуклеаза направленного действия представляет собой нуклеазу домена цинковых пальцев.
4. 4. Способ по п.1, где способ дополнительно включает регенерацию растительной ткани из клетки трансгенного растения.
5. 5. Способ по п.1, где способ дополнительно включает регенерацию растения из клетки трансгенного растения.
6. 6. Способ по п.1, где клетка растения содержит более чем одну ELP в целевом локусе.

   Участок 1 сконструированной посадочной площадки eZFNI-сайт

   J-сайт

   Р1 v1

   Участок 2 сконструированной посадочной площадки

   Т-ДНК Граница В

   ZmUbil-промотор v2

   ZmLip 3' UTR v1

   Т-ДНК Граница А

   Фиг. 1

   Участок 3 сконструированной посадочной площадки Ezfn2-cafrr связывания eZFNS-сайт связывания

   LP2 v1 _ Участок 4 сконструированной посадочной площадки

   ZmUbil-промотор v2

   ZmLip 3' UTR v1

   Левая граница

   Фиг. 2

   - 42 031429

   Участок 1 сконструированной синтетической посадочной площадки ieZFNI-сайт связывания eZFNЗ-caйτ связывания ELP1 v1

   Участок 2 сконструированной синтетической посадочной площадки

   ZmLip 3' UTR v1

   Т-ДНК Граница А Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   Фиг. 3 руированный синтетический гомологичный участок 3 eZFN2-cafrr связывания eZFNS-сайт связывания

   ELP2 v1

   Сконструированный синтетический гомологичный участок 4

   OsActl -промотор v2 \ ZmLip 3' UTR v1 \ Т-ДНК Граница А Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   Фиг. 4

   ZmPer5

   OsActl -г

   ZmLip 3' UTR v1

   Правая граница

   Фиг. 5

   Участок 1 v2 сконструированной синтетической посадочной площадки

   Участок 2 v2 сконструированной синтетической посадочной площадки

   Левая граница —_Левая граница

   Левая граница

   - 43 031429

   Участок 3 v2 сконструированной синтетической посадочной площадки

   Т-ДНК Граница В

   3' UTR v1

   Фиг. 6

   Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Грг

   Участок 4 v2 сконструированной синтетической посадочной площадки

   Участок 1 v2 сконструированной посадочной площадки

   AAD-1 v3

   Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   ZmLip 3' UTR v1

   Участок 2 v2 сконструированной посадочной площадки

   Фиг. 7

   Участок 3 v2 сконструированной посадочной площадки

   T-J

   Т-ДНК Граница А Т-ДНК Граница А

   ZmLip 3' UTR v1

   Участок 4 v2 сконструированной посадочной площадки

   Фиг. 8

   - 44 031429

   а) 100610_100640 SLP1 е2РЫЗ-сайт связывания г

   Участок 1 синтетической посадочной площадки ^е2™¹’^сайт связывания

   Участок 2 синтетической посадочной площадки

   610F

   611R

   b) 105955_105979 SLP1 ξ=ΑΤ ν3 з и π?

   Левое плечо синтетической посадочной площадки 1

   XXX

   ZmUbil экзон v1 { 5'-область участка v2 промотора ZmUbil { ί Правое плечо синтетической ; i ; посадочной площадки 1 t ,.ΐ I . / :-.

   С) Событие с повторным направленным воздействием

   Ζΐ,-.ί (f- 3 ОТА ·./!

   Левое плечо синтетической посадочной площадки 1

   ZmUbil экзон v1

   I 5'-область участка v2 промотора ZmUbil

   I ’i Правое плечо синтетической ] l’ ,· посадочной площадки 1

   610/811F

   YFPF

   YFPR

   611R

   Фиг. 9

   Фиг. 10

   - 45 031429

   MCS eZFN4-caiiT связывания

   Буферная последовательность

   Xhd (8)

   Spi (2^ eZFN2-caiiT связывания eZFN4-caiiT связывания

   Буферная последовательность

   Фиг. 11

   Модуль eZFN2-caiiT связывания

   Asd (183)

   Spd (1763

   Xhol (1757)

   Буферная последов

   -сайт связывания

   Asd (1485)

   Hindi!! (1490)

   Рас! (1500)

   MCS

   Sbfi (1509)

   Sphl (1516)

   Sail (1518)

   ZFN2-cafrr связывания eZFN4-canT связывания

   Фиг. 12

   Spd (1239) hoi (1245)

   Буферная последовательность eZFN2-cauiT связывания

   - 46 031429

   Фиг. 13

   Фиг. 14

   - 47 031429

   ZmUbil

   -сайт связывания eZFN4-cafrr связывания

   Asel (1954) ori

   Sphl (3271)

   Фиг. 15

   Канамицин уферная последовательность •-----eZFN2-cafrr связывания eZFN4-cafrr связывания

   Asel (3256)

   H/ndlll (3261) eZFN2-cafrr связывания eZFN4-cawr связывания

   Буферная последовательность

   Spel (246)

   AtuORF!

   CsVMV-i ori

   PAT

   Spel (3884

   5&/Ϊ

   Фиг. 16

   Канамицин

   Spel (3001)

   Xhol (3007)

   Буферная последовательность eZFN2-cafrr связывания ZFN4-cawr связывания

   Asel (3247)

   - 48 031429 eZFNI-сайт связывания

   Фиг. 17 eZFM3-catiT связывания

   Fsd (2252) wd (2258)

   Xbdl (2263)

   Asd (2269)

   Pad (2273)

   XhA (2277)

   Sall (2283) №1 (2293)

   Т-ДНК Граница A Т-ДНК Граница A Т-ДНК Граница A

   Хлорамфеникол вектора целевого назначения attR1 -сайт eZFNI-сайт связывания eZFN3-cafrr связывания ELP1 vl (4528)

   A.Xwcl (4534)

   Xbd (4539)

   Asd (4545) (4549)

   Xhd (4553)

   Sad (4559) №1 (4569)

   Т-ДНК Граница A

   Т-ДНК Граница A

   Т-ДНК Граница A

   Фиг. 18

   - 49 031429

   Gateway вектора целевого назначения Хлорамфеникол

   Gateway вектора целевого назначения it связывания связывания

   ELP1 V1

   I \ Т-ДНК Граница А ' Т-ДНК Граница А

   Т-ДНК Граница А

   Фиг. 19

   Т-ДНК Граница

   Т-ДНК Граница А Т-ДНК Граница А

   Nst (6909Ц\5

   -сайт

   Xhol (6873) .

   связывания связывания

   Буферная последов егБИД-сайт eZFN2-cafrr

   Sall (6634)'

   XbA (6622)

   --Кассета Gateway вектора целевого назначения Хлорамфеникол attR2 „ №>1(2425) eZFNI-сайт связывания eZFN3-cafrr связывания

   ELP1 v1 yisd (4528) .Swd (4534)

   CsVMV-промотор v2

   Фиг. 20

   Фиг. 21 attR1 -сайт ~ ccdB

   Кассета Gateway вектора целевого назначения Хлорамфеникол

   Natl (2425) (2437)

   Т-ДНК Граница

   Т-ДНК Граница А \ eZFNI-сайт связывания eZFNS-сайт связывания

   ELP1 V1 rscl (4528)

   5» Л (4534)

   6L_Xtol(4545) \ Буферная последовательность cZFN2-cailT связывания

   Буферная последовательность , eZFN4-canT связывания eZFN2-cauT связывания

   Sall

   Xbal

   Asel

   ZmLip

   - 50 031429

   Т-ДНК Граница В

   Фиг. 22 (2437)

   Кассета Gateway вектора целевого назначения Хлорамфеникол

   Т-ДНК Граница Т-ДНК Граница А

   Буферная последовательность eZFN4-caiiT eZFN2-cam eZFNI-сайт связывания eZFNS-сайт связывания

   ELP1 v1

   ·.<.! (4528)

   St al (4534) йо1(4545)

   Буферная последовательность eZFN2-caiiT связывания eZFN4-caiiT связывания ul(478')

   Xbal (4858) \ Sail (5421)

   А7ю1(5521) \ ZmUbil-промотор v2

   Фиг. 23 целевого назначения

   Т-ДНК т-днь

   Т-ДНК Граница А

   Nsl (8680)/Sall (8670).

   Xhol (8664)

   Буферная последовательность eZFN4-cafrr связывания еггИ2-сайт связывания Нарушенный ген ipt

   Sall ( / ,d (4528)

   Mid (4534) ttol (4539) id (4545) \ Pad (4549) \ \7zoT (4553) \ \ Буферная последовательность \\eZFN2-cawr связывания \ eZFN4-caiiT связывания

   Asd (4793)

   Нарушенный ген ipt

   CsVMV-промотор v2