EA029205B1 - Method for serological diagnostics of microsporia in carnivorous animals - Google Patents

Abstract

The invention relates to veterinary medicine, particularly infectious disease diagnostics in animals. The technical task of the method is to develop an immunoenzyme assay for improved microsporia diagnostics in carnivores that is achieved by employing the cell wall antigen of fungus Microsporum canis No. 13, registration No. M-58-13/D, as an immobilisation antigen in styrene plates. Detection of IgG class antibodies specific to the said antigen, which are characteristic to microsporia infection, is performed in blood of cats and dogs using enzyme-labelled rabbit immunoglobulins against specific anti-ZgG. EIA results are coloured using a chromogen and are evaluated by either spectrophotometry or visually. Blood serum samples with mean optical density values at least 2 times exceeding mean optical value of the negative control serum, are regarded to be positive.

Description

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей способа является разработка иммуноферментного анализа для совершенствования диагностики микроспории плотоядных, которая достигается тем, что при постановке реакции в качестве антигена для иммобилизации полистиролового планшета используют антиген клеточной стенки гриба Мютокрогит сатк № 13, регистрационный № М-58-13/ Ό, а выявление в сыворотке крови кошек и собак, специфичных к названному антигену, антител класса 1дС, образование которых характерно для инфекционного процесса при микроспории, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти1дС. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина оптической плотности которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю оптическую плотность отрицательной контрольной сыворотки.The invention relates to veterinary medicine, in particular to the diagnosis of infectious animal diseases. The technical task of the method is the development of enzyme immunoassay to improve the diagnosis of microsporia carnivorous, which is achieved by setting the reaction as the antigen for immobilizing a polystyrene tablet using the antigen of the cell wall of the fungus Mytokrogit satk No. 13, registration number M-58-13 / Ό, and identifying in the serum of cats and dogs that are specific to the antigen, antibodies of class 1DC, the formation of which is characteristic of the infectious process in microsporia, are carried out using m chennyh enzyme rabbit antibodies against species anti1dS. The ELISA results are shown by the chromogen and evaluated spectrophotometrically or visually. Samples of blood sera are considered positive, the average optical density of which is not less than 2 times the average optical density of the negative control serum.

029205029205

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных.The invention relates to veterinary medicine, in particular to the diagnosis of infectious animal diseases.

Известен ряд способов диагностики микроспории, основанных на выявлении возбудителя инфекции в патологическом материале или на выявлении специфических антигенов к Мютозротит сашз в сыворотке крови животных.The known number of methods for the diagnosis of microsporia, based on the identification of the infectious agent in pathological material or on the identification of specific antigens to Muthosrotitis sashz in the blood serum of animals.

Люминесцентный анализ патологического материала, который проводится с использованием ртутно-кварцевых ламп и других люминесцентных аппаратов, оснащенных фильтром Вуда, используется для дифференциации микроспории от трихофитии [Ханис А.Ю. Вирулентные и люминесцентные свойства разных штаммов М. сашз // Ветеринария. - М., 2004. - №2. - С. 25-27]. Метод основан на способности волос, пораженных грибами рода Мютозротит, флуоресцировать ярко-зеленым светом при облучении ультрафиолетом с длинной волны 365 нм. Этот феномен связан с продукцией флуоресцирующего пигмента - птеридина.Luminescent analysis of pathological material, which is carried out using mercury-quartz lamps and other luminescent devices equipped with a Wood filter, is used to differentiate microsporia from trichophytia [Khanis A.Yu. Virulent and luminescent properties of different M. sashz strains // Veterinary science. - M., 2004. - №2. - p. 25-27]. The method is based on the ability of hairs affected by fungi of the genus Mutozrotit to fluoresce with bright green light when irradiated with ultraviolet light from a long wavelength of 365 nm. This phenomenon is associated with the production of fluorescent pigment - pteridine.

Микроскопию патологического материала [Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: справочник / Сост. Б.И. Антонов. - М., 1991. - С. 286] проводят, отбирая волоски с белыми чехликами у корня, предварительно обрабатывая их 10-20% раствором ΝαΟΗ или КОН с подогревом и просматриванием в капле 50% глицерина. Микроскопия проводится с использованием объектива х10, затем х40.Microscopy of pathological material [Laboratory studies in veterinary medicine: biochemical and mycological: a handbook / Comp. B.I. Antonov. - M., 1991. - p. 286] is carried out by selecting hairs with white caps at the root, pretreating them with a 10-20% ΝαΝ or KOH solution with heating and scanning 50% glycerol in a drop. Microscopy is performed using an x10 lens, then x40.

С целью точного определения вида выявленного возбудителя проводят выделение чистой культуры возбудителя [Горячкина Е.И. Дифференциальная диагностика культур родов Тг1сйорйу1оп и Мютозротит, полученных от пушных зверей, домашних животных и человека при посевах на различные питательные среды // Селекция, кормление, содержание животных и технология продуктов животноводства. - 1999. - С. 124-126]. Высев патологического материала производят на среду Сабуро или на суслоагар с добавлением антибиотиков с целью подавления роста сопутствующей микрофлоры при рН 6,2-6,8. Посевы выдерживают в аэробных условиях в термостате при температуре 28°С в течение 20-30 суток. Формирование колоний наступает на 10-14 день после начала роста для М.1апозит, на 20-25 день - для М.сатз.In order to accurately determine the type of pathogen identified, a pure culture of the pathogen is isolated [Goryachkina E.I. Differential diagnostics of the cultures of the Tg1syorutiop and Mutozrotit genera, obtained from fur-bearing animals, domestic animals, and humans when sowing on various nutrient media // Breeding, feeding, keeping animals and technology of animal products. - 1999. - P. 124-126]. The seeding of the pathological material is carried out on Saburo's medium or on wort syrup with the addition of antibiotics in order to suppress the growth of the accompanying microflora at pH 6.2-6.8. Crops are maintained under aerobic conditions in a thermostat at a temperature of 28 ° C for 20-30 days. The formation of colonies occurs on the 10-14 day after the beginning of growth for M. 1 deposit, on the 20-25 day - for M. satz.

Для диагностики микроспории кошек предложена реакция связывания комплемента (РСК) [Левченко Е.Н. Применение РСК при диагностике микроспории у домашних кошек // Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. Спец. выпуск (мат. межд. конф.). - Астана, 2008. - С. 299-303]. Постановка реакции осуществляется с антигеном, не обладающим антикомплементарными свойствами, в разведении 1:100. Сыворотка крови кошек на наличие антител к микроспоруму исследуется в разведении 1:5-1:10 после инактивации при 60°С в течение 30 мин. С помощью РСК выявляются животные с позитивными показаниями, из которых 46,1% имеют клинические признаки болезни. При клиническом исследовании 5,8% из них имели отрицательные показания, при отрицательной клинике - 7,7% из числа исследованных имели сомнительные показатели РСК.For diagnostics of cats microsporia, a complement binding reaction (RSC) was proposed [E.N. The use of RAC in the diagnosis of microsporia in domestic cats // Science Bulletin KazATU them. S.Seifullin. Specialist. release (mat. int. conf.). - Astana, 2008. - P. 299-303]. The reaction is set up with an antigen that does not possess anti-complementary properties at a dilution of 1: 100. The serum of cats for the presence of antibodies to microsporum is examined at a dilution of 1: 5-1: 10 after inactivation at 60 ° C for 30 minutes. With the help of RSK, animals with positive indications are detected, of which 46.1% have clinical signs of the disease. In a clinical study, 5.8% of them had negative indications, while in a negative clinic - 7.7% of those studied had questionable RAC indicators.

К общим недостаткам приведенных способов диагностики является их низкая чувствительность (процент выявления возбудителей культуральным методом - 22-61,5%, средняя чувствительность микроскопии - 53,8%, чувствительность РСК - 70,7%). К тому же применение РСК для серологической диагностики микроспории кошек не вышло за рамки лабораторных испытаний.The common disadvantages of these diagnostic methods are their low sensitivity (the percentage of pathogens detected by the culture method is 22-61.5%, the average sensitivity of microscopy is 53.8%, the sensitivity of CSC is 70.7%). In addition, the use of RSK for the serological diagnosis of microsporia of cats did not go beyond the scope of laboratory tests.

Одним из высокочувствительных и легко выполнимых аналитических тестов, используемых в иммунологии, является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящее время разработаны оптимальные условия и техника постановки твердофазного ИФА для диагностики кандидоза [Караев З.О., Бабенко Г.А., Игнатьева СМ., Соловьева Г.И. Антигенные препараты для иммунодиагностики кандидоза // ЖМЭИ. - 1990. - № 7. - С. 104-110], трихофитии крупного рогатого скота [Патент 24954 Республики Казахстан. МПК Ο01Ν 33/577 Ο01Ν 33/569. Способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота / Кухар Е.В., Киян В.С., Куйбагаров М.А., Боровиков С.Н.; заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - №2009/0084.1; заявл. 20. 01.2009, опубл. 15.11.2011. Бюлл. №11. - 5 с], руброфитии человека [Патент 24441 Республики Казахстан. МПК Ο2Ν 5/10 С12Р 21/08 Ο01Ν 33/577 Ο01Ν 33/569. Способ диагностики руброфитии / Акимбаева А.К. Кухар Е.В., Муканов К.К., Сураншиев Ж.А.; заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - №2009/1106.1; заявл. 03.09.2009, опубл. 15.08.2011. Бюлл. №8. - 4 с]. Получены моноклональные антитела, с использованием которых совершенствуются иммуноферментные тесты для диагностики микроспории или проводится идентификация возбудителей [Рш1ет Ь., ЕШз Т., Сюййга Р., №Ъ1е \У.С. РтобисИоп апб изе о£ топос1опа1 апйЪоФез 1о Мютозротит сашз // Уе1. МютоЪю1. - 1995. - Уо1. 46, 1з. 4. - Р. 435-444].One of the highly sensitive and easily performed analytical tests used in immunology is the indirect variant of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). At present, optimal conditions and techniques for the formulation of solid-phase ELISA for the diagnosis of candidiasis have been developed [Z. Karaev, G. Babenko, S. Ignatieva, SM., Solov'eva G. I. Antigenic preparations for immunodiagnosis of candidiasis // ЖМЭИ. - 1990. - № 7. - P. 104-110], trichophytosis of cattle [Patent 24954 of the Republic of Kazakhstan. IPC Ο01Ν 33/577 Ο01Ν 33/569. A method for the diagnosis of cattle trichophytosis / Kukhar EV, Kiyan VS, Kuybagarov MA, Borovikov SN; applicant and patent holder Kazakh Agrotechnical University. S. Seifullin. - №2009 / 0084.1; declare 20. 01.2009, publ. 11/15/2011. Bull №11. - 5 s], human ruprofitii [Patent 24441 of the Republic of Kazakhstan. IPC Ο2Ν 5/10 С12Р 21/08 Ο01Ν 33/577 01Ν 33/569. Method for the diagnosis of rubrofitii / Akimbaeva A.K. Kukhar EV, Mukanov KK, Suranshiev Zh.A .; applicant and patent holder Kazakh Agrotechnical University. S. Seifullin. - №2009 / 1106.1; declare 03.09.2009, publ. 08/15/2011. Bull №8. - 4 s]. Monoclonal antibodies have been obtained, using which enzyme immunoassays are improved for the diagnosis of microsporia or pathogens are identified [Ptlét b., Eshz T., Xuyga R., No. Rtobisis Apbée o £ £ Topos1opa ApioFez 1o Mutozrotit Sashz // Ye1. Myutobyu1. - 1995. - Wo1. 46, 1h. 4. - P. 435-444].

Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является иммуноферментный анализ, разработанный Кухар Е.В. с соавт. [Ин. патент 20706 Республики Казахстан. МПК Ο01Ν 33/53 А61К 39/00. Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота / Кухар Е.В., Муканов К.К., Шенжанов К.Т., Ескендирова С.З.; заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. №2007/1240.1; заявл. 10.10.2007, опубл. 15.01.2009. - Бюлл. №1. - 3 с], который предназначен для диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Непрямой вариант ИФА выявляет 1§О к антигенамThe closest technical solution for the combination of features and the achieved positive effect (prototype) is an enzyme immunoassay, developed by Kukhar EV et al. [Ying. patent 20706 of the Republic of Kazakhstan. IPC Ο01Ν33 / 53A61K 39/00. Method for serological diagnosis of cattle trichophytia / Kukhar EV, Mukanov KK, Shenzhanov KT, Eskendirova SZ; applicant and patent holder Kazakh Agrotechnical University. S. Seifullin. No. 2007/1240.1; declare 10.10.2007, publ. 01/15/2009. - Bull. №1. - 3 s], which is intended for the diagnosis of cattle trichophytia. Indirect ELISA detects IgO to antigens

- 1 029205- 1 029205

Т.усггисокит уаг. ГауНогтс 130 у 91% больных трихофитией животных, что свидетельствует о высокой чувствительности, подтверждает наличие клинических признаков и позитивные показания РА, является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики.T.usggisokit var. GaunNogts 130 in 91% of patients with trichophytia of animals, which indicates a high sensitivity, confirms the presence of clinical signs and positive indications of RA, is more sensitive compared with conventional diagnostic methods.

Однако известный способ диагностики имеет недостатки: он предназначен для работы с крупным рогатым скотом, возбудителем заболевания у скота является ТпсйоруЮп усггисокшп. имеющий определенный антигенный состав, а возбудителем микроспории плотоядных является Мюгокрогит сашк. Этот дерматомицет имеет другой антигенный состав, к тому же он имеет биологические особенности в строении макроконидий, является опасным зооантропонозным заболеванием, передающимся от животных человеку.However, the known diagnostic method has drawbacks: it is designed to work with cattle, the causative agent of the disease in cattle is TpsyoruYup usggisokshp. having a certain antigenic composition, and the causative agent of the microsporic carnivores is Myugrogrogit sash. This dermatomycete has a different antigenic composition, besides it has biological features in the structure of macroconidia, is a dangerous zooanthroponotic disease transmitted from animals to humans.

Технической задачей изобретения является разработка иммуноферментного анализа для совершенствования диагностики микроспории плотоядных, которая достигается тем, что при постановке иммуноферментного анализа в качестве антигена для иммобилизации полистиролового планшета используют антиген клеточной стенки гриба Мюгокрогит сашк штамма №13. Указанный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП "Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности" КН МОН РК и имеет регистрационный №М-58-13/О. Выявление в сыворотке крови кошек и собак специфичных к названному антигену антител класса 1дО, образование которых характерно для инфекционного процесса при микроспории, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти-1дО.An object of the invention is to develop an enzyme immunoassay to improve the diagnosis of microsporia carnivorous, which is achieved by the fact that when setting up an enzyme immunoassay as an antigen for immobilizing a polystyrene tablet, the antigen of the fungal cell Myugokrogit with strain No. 13 is used. The specified strain was deposited in the Collection of Microorganisms of the RSE “Research Institute for Problems of Biological Safety” of the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan and has a registration number M-58-13 / O. Detection in the serum of cats and dogs specific to the named antigen of class 1dO antibodies, the formation of which is characteristic of the infectious process in microsporia, is carried out with the help of rabbit immunoglobulins labeled with an enzyme against species anti-1DO.

Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально.The ELISA results are shown by the chromogen and evaluated spectrophotometrically or visually.

Положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина оптической плотности которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки.Samples of blood sera are considered positive, the average optical density of which is not less than 2 times the average optical density of the control negative serum.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Подбирают оптимальную концентрацию антигена для постановки ИФА, используя сыворотки крови иммунных мышей (табл. 1).Example 1. Pick up the optimal concentration of antigen for the production of ELISA using serum of immune mice (Table 1).

Таблица 1. Определение оптимальной концентрации антигена дерматомицета М.сашк при постановке ИФАTable 1. Determination of the optimal concentration of dermatomycete M. sacak antigen during ELISA formulation

Концент рация The concentrate walkie talkie Антисыворотки белых беспородных мышей Outbred white outbred mice Проба 1 Sample 1 Проба 2 Sample 2 Проба 3 Sample 3 антигена (мг/мл) antigen (mg / ml) ОП OP титр антител titer antibodies ОП OP титр антител titer antibodies ОП OP титр антител titer antibodies 0,005 0,005 0,772 0.772 1:800 1: 800 0,398 0.398 1:400 1: 400 0,487 0.487 1:1600 1: 1600 0,01 0.01 0,791 0.791 1:3200 1: 3200 0,678 0.678 1:3200 1: 3200 0,828 0,828 1:6400 1: 6400 0,02 0.02 1,235 1.235 1:3200 1: 3200 0,506 0.506 1:800 1: 800 0,914 0.914 1:6400 1: 6400

Примечания:Notes:

1) значение экстинкции отрицательного контроля - 0,067;1) the value of the extinction of the negative control - 0,067;

2) ОП сывороток представлены при разведении 1:100.2) OD serums are presented at a dilution of 1: 100.

Как видно из табл. 1, высокие показатели ОП при анализе результатов ИФА в разведении сывороток 1:100 регистрируются при использовании антигена в концентрации 0,01 и 0,02 мг/мл. Так как титр специфических антител, выявленный в сыворотках крови иммунных мышей антигенами в концентрации 0,01 и 0,02 мг/мл, практически одинаков, это указывает на возможность их применения в концентрации 0,01 мг/мл.As can be seen from the table. 1, high OD values in the analysis of ELISA results in dilution of 1: 100 serum are recorded when using antigen at a concentration of 0.01 and 0.02 mg / ml. Since the titer of specific antibodies detected in the serum of immune mice with antigens at a concentration of 0.01 and 0.02 mg / ml is almost the same, this indicates the possibility of their use at a concentration of 0.01 mg / ml.

Пример 2. Определение рабочего титра коммерческого препарата конъюгата ΑηΙί-са! (производство "81дта"), содержащего антивидовые антитела к иммуноглобулинам класса О против возбудителя микроспории, методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. Для постановки ИФА испытывали разведение конъюгата 1:5000, 1:10000, 1:15000 (табл. 2).Example 2. Determination of the working titer of the commercial drug conjugate ΑηΙί-sa! (production of "81dta") containing anti-virus antibodies to immunoglobulins of class O against the microsporia pathogen, by the method of chess titration in the indirect variant of ELISA. For staging, the ELISA was tested for dilution of the conjugate 1: 5000, 1: 10,000, 1: 15,000 (Table 2).

Таблица 2. Результаты анализа конъюгата Аий-са! с сыворотками крови кошек в непрямом варианте ИФАTable 2. The results of the analysis of the conjugate AI-sa! with blood serum of cats in indirect variant ELISA

Разведение Breeding Титр Titer Показатель Indicator Титр Titer Показатель Indicator конъюгата conjugate специфических specific ОП OP специфических specific ОП OP Апй-са( Apy-sa ( антител antibodies антител К” antibodies to ” К’ TO' 1:5 000 1: 5,000 1:3200 1: 3200 0,537 0.537 РО Ro 0,057 0.057 1:10 000 1:10 000 1:800 1: 800 0,389 0.389 РО Ro 0,066 0.066 1:15 000 1:15 000 1:400 1: 400 0,363 0.363 РО Ro 0,088 0.088

За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение, которое выявляет 1дО кошек вFor the working titer of the conjugate, they take its greatest dilution, which reveals 1 dO cats in

- 2 029205- 2 029205

концентрации не ниже 20-40 нг/мл. По данным табл. 2 применение конъюгата в разведении 1:5000 позволяет получить результаты, в 1,5-2 раза превышающие аналогичные по показанию ОП при других разведениях конъюгата.concentrations not lower than 20-40 ng / ml. According to the table. 2 application of the conjugate at a dilution of 1: 5000 allows to obtain results that are 1.5-2 times higher than those of OD according to other dilutions of the conjugate.

Пример 3. Определяют оптимальные параметры постановки и учета результатов непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител против микроспории в сыворотке крови кошек, в котором используется антиген гриба М1сгокрогит сатк.Example 3. Determine the optimal parameters for setting and recording the results of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against microsporia in the blood serum of cats, which uses the antigen of the fungus M1sogrogit satk.

Для постановки ИФА в ячейки 96-луночного плоскодонного планшета для микротитрования иммобилизуются антиген в концентрации 0,01 мг/мл в забуференном физиологическом растворе с рН 7,2-7,4 (ЗФР) при температуре 4°С в течение ночи или при 37°С в течение 2 ч. После удаления несвязавшегося антигена путем последовательной 3-кратной отмывки ЗФР с твином-20 (ЗФР-Тв) в ячейках готовятся двукратные разведения испытуемых сывороток крови (1:100 и выше). В качестве отрицательного контроля используется сыворотка крови здоровых кошек. В качестве положительного контроля используется сыворотка крови кошки с клинически выраженной микроспорией, в которой подтверждено наличие специфических антител.For placing the ELISA into the cells of a 96-well flat-bottomed microtiter plate, antigen is immobilized at a concentration of 0.01 mg / ml in buffered saline with a pH of 7.2-7.4 (PBS) at 4 ° C overnight or at 37 ° C for 2 hours. After removing the unbound antigen by successive 3-fold washing of PBS with tween-20 (PBS-Tv), two-fold dilutions of the tested blood sera are prepared in the cells (1: 100 and above). Blood serum of healthy cats is used as a negative control. Serum of a cat with clinically expressed microsporia, which confirmed the presence of specific antibodies, is used as a positive control.

Все компоненты реакции используются в объёме 0,1 мл. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшет отмывается вышеописанным способом, и вносятся антитела против иммуноглобулинов кошек, меченные пероксидазой хрена, в рабочем разведении. Через 1 ч носитель вновь отмывается и в ячейки вносится раствор субстрата, состоящего из перекиси водорода и хромогена - ТМБ в 1% растворе лимонной кислоты (рН 4,2).All components of the reaction are used in a volume of 0.1 ml. After incubation for 1 h at 37 ° C, the plate is washed as described above, and antibodies against cats immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase are applied in working dilution. After 1 h, the carrier is washed again and the substrate solution consisting of hydrogen peroxide and chromogen - TMB in 1% citric acid solution (pH 4.2) is added to the cells.

Результаты анализа учитываются на спектрофотометре при длине волны 492 нм либо визуально после остановки реакции стоп-реагентом. Результаты учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной отрицательной сывороткой (К), контроля конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой (К+) не менее 0,5 о.е. Реакцию считают положительной, если значения экстинкции исследуемых сывороток в два и более раза превышают величину ОП отрицательного контроля.The results of the analysis are taken into account on a spectrophotometer at a wavelength of 492 nm or visually after stopping the reaction with a stop reagent. The results take into account if the average values of optical density (OD) of the reaction liquid in the wells with the control negative serum (K), the control of the conjugate and the substrate is not more than 0.2 optical units (o.e.), and in the wells with the control positive serum (K +) not less than 0.5.e. The reaction is considered positive if the extinction values of the studied sera are two or more times higher than the OD value of the negative control.

При визуальном учёте реакции сравнивают содержимое лунок с исследуемыми сыворотками крови животных и содержимым лунок с положительным контролем. При наличии специфических антител к возбудителю микроспории содержимое лунок с исследуемыми сыворотками имеют желто-коричневое окрашивание, сравнимое с цветом окрашивания в лунках с положительной сывороткой. В зависимости от поставленной цели исследования проб испытуемых сывороток можно проводить двумя способами: без титрования и с титрованием.When visually taking into account the reaction, the contents of the wells are compared with the test animal blood sera and the contents of the wells with a positive control. In the presence of specific antibodies to the microsporia pathogen, the contents of the wells with the test sera have a yellow-brown staining, comparable to the color of the stains in the wells with positive serum. Depending on the goal, the samples of the tested sera can be tested in two ways: without titration and with titration.

Если исследование проб сывороток крови проводится без титрования, то это дает возможность провести качественную оценку результатов реакции ИФА по принципу - положительная реакция (в пробе выявлены специфические антитела к возбудителю микроспории) или отрицательная реакция (в пробе сыворотки нет специфических антител). При качественной постановке реакции (ответ "есть" или "нет") учет результатов ИФА проводят визуально по появлению окрашенного продукта ферментативной реакции. Выявление от светло-желтого до интенсивного желто-коричневого окрашивания считается положительным результатом.If the study of blood serum samples is carried out without titration, then this makes it possible to conduct a qualitative assessment of the results of the ELISA reaction according to the principle of a positive reaction (specific antibodies to the microsporia pathogen were detected in the sample) or a negative reaction (there are no specific antibodies in the serum sample). In the qualitative formulation of the reaction (the answer is "is" or "no"), the results of the ELISA are recorded visually by the appearance of a colored product of the enzymatic reaction. Detection from light yellow to intense yellow-brown staining is considered a positive result.

Если исследование проб сывороток крови проводится с титрованием, то это дает возможность выявить и учесть титры специфических антител, выявленные у кошек к возбудителю микроспории и дать ориентировочную количественную оценку результатов реакции. Для этого в ряду лунок с разведением испытуемой сыворотки находим отчетливо выраженный переход от интенсивного окрашивания к незначительному, фоновому. В лунках с разведением контрольной положительной сыворотки находим лунку с близким по концентрации цветом и принимаем ее за идентичный результат. Находим значение титра антител в положительном контроле. Поднимаясь вверх по ряду контрольной положительной и испытуемой сывороток, отсчитываем соответствующее разведение и находим титр специфических антител в испытуемой сыворотке.If the study of blood serum samples is carried out with titration, then this makes it possible to identify and take into account the titers of specific antibodies detected in cats to the microsporia pathogen and give a tentative quantitative assessment of the results of the reaction. To do this, in the series of wells with dilution of the test serum we find a clearly pronounced transition from intense staining to a slight, background. In the wells with dilution of the control positive serum, we find the well with a close color concentration and take it for an identical result. We find the value of the antibody titer in the positive control. Going up the row of control positive and test sera, count the appropriate dilution and find the titer of specific antibodies in the test serum.

Пример 4. Проводили определение диагностической ценности непрямого варианта ИФА для выявления специфических антител к М.сатк в сыворотках крови кошек, иммунизированных вакциной "Вакдерм" или имеющих клинические признаки микроспории (табл. 3).Example 4. The diagnostic value of an indirect ELISA variant for the detection of specific antibodies to M.satk in the blood sera of cats immunized with Vacterm vaccine or having microsporium clinical signs was carried out (Table 3).

Таблица 3. Анализ сывороток крови кошек в ИФА с антигеном дерматомицета Мюгокрогит саткTable 3. Analysis of the blood serum of cats in ELISA with the antigen of dermatomycete Myugokrogit satk

Сыворотки крови Blood serum Титры специфических антител ггпп/тах Titles specific antibodies ggpp / takh Средний титр антител Average titer antibodies Клинически здоровые животные Clinically healthy animals 1:100/ 1:400 1: 100/1: 400 1:160 ± 0,44 1: 160 ± 0.44 Клинически больные животные Clinically sick animals 1:200 / 1:6400 1: 200/1: 6400 1:1143 ±0,43 1: 1143 ± 0,43 Вакцинированные животные Vaccinated animals 1:100/ 1:800 1: 100/1: 800 1:210 ±0,34 1: 210 ± 0.34 Негативная сыворотка (К“) Negative Serum (K “) РО/ 1:100 PO / 1: 100 1:50 ±0,55 1:50 ± 0,55

Данные табл. 3 свидетельствуют о циркуляции специфических антител к возбудителю микроспорииThe data table. 3 indicate the circulation of specific antibodies to the pathogen microsporia

- 3 029205- 3 029205

в сыворотках крови кошек, что может служить важным диагностическим показателем при постановке диагноза на микроспорию. У иммунизированных животных показатели титров антител находились в пределах 1:100-1:800 (средний титр - 1:210 ± 0,34), у больных кошек 1:200-1:6400 (средний титр 1:1143 ± 0,43).in the blood serum of cats, which can serve as an important diagnostic indicator in the diagnosis of microsporia. In immunized animals, antibody titers ranged from 1: 100-1: 800 (average titer - 1: 210 ± 0.34), in sick cats 1: 200-1: 6400 (average titer 1: 1143 ± 0.43) .

Пример 5. Определение диагностической ценности непрямого варианта ИФА для выявления специфических антител к М.сатк, проводили постановкой непрямого варианта ИФА с сыворотками крови собак, имеющих клинические признаки микроспории (табл. 4).Example 5. Determination of the diagnostic value of an indirect ELISA variant for the detection of specific antibodies to M. scutca, was carried out by setting an indirect ELISA variant with blood sera of dogs with clinical signs of microsporia (Table 4).

Таблица 4. Анализ сывороток крови собак в ИФА с антигеном дерматомицета Мюгокрогит саткTable 4. Analysis of the blood serum of dogs in ELISA with the antigen of the dermatomatitis Myugokrogit satk

Сыворотки крови Blood serum Титры специфических антител тш/тах Titles specific antibodies tsh / takh Средний титр антител Average titer antibodies Клинически здоровые животные Clinically healthy animals 1:200/ 1:400 1: 200/1: 400 1:225 ±0,19 1: 225 ± 0,19 Клинически больные животные Clinically sick animals 1:800/ 1:3200 1: 800/1: 3200 1:1504 ±0,33 1: 1504 ± 0,33 Позитивная сыворотка (К⁺)Positive Serum (K ⁺ ) 1:6400 1: 6400 1:3200 ± 0,55 1: 3200 ± 0.55 Негативная сыворотка (К ) Negative Serum (K) РО Ro Н46±0,17 H46 ± 0.17

Данные табл. 4 свидетельствуют о наличии специфических антител к возбудителю микроспории в сыворотках крови собак, что позволяет использовать ИФА в диагностике болезни. Средний титр антител у клинически больных собак 1:800-1:3200 (средний титр 1:1504 ± 0,33), что в 6,68 раз выше показателя титров антител здоровых животных и позволяет достоверно выявить животных, зараженных дерматомицетом М.сашк.The data table. 4 indicate the presence of specific antibodies to the pathogen microsporia in the blood serum of dogs, which allows the use of ELISA in the diagnosis of the disease. The average antibody titer in clinically sick dogs is 1: 800-1: 3200 (average titer 1: 1504 ± 0.33), which is 6.68 times higher than the antibody titers of healthy animals and allows reliable identification of animals infected with M. sashk dermatomycetes.

Пример 6. Оценивают чувствительность предложенного способа диагностики микроспории плотоядных в сравнении с наличием клинических признаков и в реакции агглютинации в микроварианте (РМА) (табл. 5).Example 6. Evaluate the sensitivity of the proposed method for the diagnosis of carnivorous microsporia in comparison with the presence of clinical signs and in the agglutination reaction in a microvariant (PMA) (Table 5).

Таблица 5. Изучение специфичности иммуноферментного анализа с другими методами диагностики микроспории кошекTable 5. The study of the specificity of enzyme immunoassay with other methods of diagnosing microsporia cats

Группа животных Group of animals η η Клинические признаки Clinical the signs Капельный вариант РА RA drip option Непрямой вариант ИФА Indirect IFA option Нади чие Nadi whose % выявления % identify агглюти нация agglut nation % выявления % identify титр антител titer antibodies % выявления % identify Клинически здоровые животные, не иммунизированные Clinically healthy animals not immunized 11 eleven нет not 0 0 слабо выраже на weakly expression on 18,2 18.2 1:160 ± 0,44 1: 160 ± 0.44 45,5 45.5 Клинически здоровые животные, не иммунизированные Clinically healthy animals not immunized 35 35 нет not 0 0 слабо выраже на weakly expression on 56,4 56,4 1:2768 ±0,67 1: 2768 ± 0.67 88,6 88.6 Вакцинированные двукратно животные, кровь отобрана на 21 сутки Twice-vaccinated animals, blood taken on day 21 31 31 нет not 0 0 выраже на expression on 18,2 18.2 1:210 ± 0,34 1: 210 ± 0.34 77,42 77.42 Клинически больные животные, иммунизированные 1- или 2-кратно Clinically sick animals, immunized 1 or 2 times 12 12 да Yes 100 100 выраже на expression on 80,1 80.1 1:1120 ±0,39 1: 1120 ± 0.39 91,7 91.7

Клинически больные животные, не иммунизированные, лечение фунгицидами Clinically sick animals not immunized, fungicide treatment 3 3 да Yes 100 100 выраже на expression on 85,6 85,6 1:2000 ±0,43 1: 2000 ± 0.43 100 100 Отрицательный контроль Negative control 1 one нет not 0 0 Нет Not 0 0 1:65 ± 0,13 1:65 ± 0.13 0 0 Положительный контроль Positive control 1 one да Yes 100 100 выраже на expression on 100 100 1:12800 1: 12,800 100 100

Как видно из табл. 5, предложенный способ диагностики микроспории является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики: клиническим и серологическим (РА). В ИФА процент выявления больных животных составил 88%, клиническим методом 30%, в реакции микроагглютинации 74%. Наиболее показательные результаты получены по группе клинически здоровых животных, находившихся в питомнике: при отсутствии клинических признаков в группе кошек выявлены высокие титры специфических антител к возбудителю микроспории как в РМА, так и в ИФА.As can be seen from the table. 5, the proposed method for the diagnosis of microsporia is more sensitive than the standard diagnostic methods: clinical and serological (RA). In ELISA, the percentage of detection of sick animals was 88%, by the clinical method 30%, in the microagglutination reaction 74%. The most illustrative results were obtained for a group of clinically healthy animals that were in the nursery: in the absence of clinical signs in the group of cats, high titers of specific antibodies to the microsporia pathogen were detected in both PMA and ELISA.

- 4 029205- 4 029205

На основании экспериментальных данных были установлены показатели титра специфических антител сывороток крови плотоядных в непрямом варианте ИФА:Based on the experimental data, the titers of specific antibodies of serum carnivorous serum in the indirect ELISA variant were established:

1:200 - достаточный титр специфических поствакцинальных антител, свидетельствующих о выработке иммуноглобулинов у вакцинированных животных; также подозреваемые в заражении невакцинированные животные с обязательным повторным анализом сыворотки крови в ИФА через 2 недели;1: 200 - sufficient titer of specific vaccine-specific antibodies, indicating the production of immunoglobulins in vaccinated animals; also suspected of being infected, unvaccinated animals with a mandatory reanalysis of blood serum by ELISA after 2 weeks;

1:400 - животные, подозреваемые в заражении и/или в переболевании микроспорией, с обязательным повторным анализом сыворотки крови в ИФА через 2 недели и применением комплекса лечебнопрофилактических мероприятий;1: 400 - animals suspected of being infected and / or re-illicit with microsporia, with a mandatory reanalysis of blood serum in an ELISA after 2 weeks and the use of a set of preventive measures;

1:800 и выше - явно больные животные, требующие проведения дезинфекции, а также применения комплекса лечебно-профилактических мероприятий с назначением фунгицидных и/или фунгистатических препаратов местного и системного действия.1: 800 and above - obviously sick animals that require disinfection, as well as the use of complex therapeutic and preventive measures with the appointment of fungicidal and / or fungistatic drugs of local and systemic action.

Использование предлагаемого варианта твердофазного иммуноферментного анализа в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет мониторинга иммунного фона и ранней диагностики микроспории плотоядных.The use of the proposed variant of the enzyme-linked immunosorbent assay in veterinary practice will improve the effectiveness of the activities carried out by monitoring the immune background and early diagnosis of microsporia carnivorous.

Claims (1)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM Способ серологической диагностики микроспории плотоядных, включающий иммобилизацию полистиролового планшета антигеном и выявление в сыворотке крови кошек и собак специфичных к названному антигену антител класса 1§О, образующихся при микроспории, с помощью меченных ферментом пероксидазой хрена иммуноглобулинов кролика против видового анти-1§О кошек или собак, отличающийся тем, что в качестве антигена используют растворимые компоненты клеточной стенки дерматомицета М1сго8рогцт сатк № 13, учет результатов проводят на спектрофотометре или визуально по окрашиванию реакционной смеси в сравнении с положительным и отрицательным контролями, положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина ОП которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю ОП отрицательного контроля, при этом выявленные титры антител 1:200 указывают на вакцинированных или подозреваемых в заражении невакцинированных животных, 1:400 - на животных, подозреваемых в заражении и/или в переболевании микроспорией, 1:800 и выше - на явно больных животных.Method for serological diagnosis of carnivorous microsporia, including immobilization of a polystyrene tablet with an antigen and detection in serum of cats and dogs of IgG class-specific antibodies specific to this antigen, formed during microsporia, using horseradish immunoglobulin labeled with the enzyme against specific anti-IgO cats or dogs, characterized in that the soluble components of the cell wall of the thromboidase No. 13 dermatomycete No. 13 are used as the antigen, and the results are recorded on a spectrophotometer whether visually by staining the reaction mixture in comparison with positive and negative controls, samples of blood serums are considered positive, the average OD value of which is at least 2 times higher than the average OD of the negative control, while the detected antibody titers of 1: 200 indicate vaccinated or suspected infection of unvaccinated animals, 1: 400 - in animals suspected of being infected and / or re-ill with microsporia, 1: 800 and higher - in apparently sick animals.