EA028377B1 - Противомикробная композиция - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биозащиты, в частности к противомикробной композиции, включающей штамм Lactobacillus rhamnosus и/или штамм Lactobacillus paracasei. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению такой противомикробной композиции, пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов, включающих такую противомикробную композицию, способу получения такого пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов и способу снижения содержания нежелательных микроорганизмов в таком пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах.

Description

Настоящее изобретение относится к области биозащиты, в частности к противомикробной композиции, включающей штамм Ьас1оЬасШик гйатпокик и/или штамм Ьас1оЬасй1ик рагасакег Кроме того, настоящее изобретение относится к применению такой противомикробной композиции, пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов, включающих такую противомикробную композицию, способу получения такого пищевого продукта, корма и фармацевтических продуктов и способу снижения содержания нежелательных микроорганизмов в таком пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах.

Предшествующий уровень техники

Биозащитные культуры применяют в качестве альтернативы химическим консервантам в различных пищевых продуктах. В молочных продуктах контаминация дрожжами и плесневыми грибами может ограничивать продолжительность хранения молочных продуктов. Продукты, в которых встречается значительная проблема контаминации дрожжами и плесневыми грибами, включают свежие сыры.

Для преодоления этих проблем в молочной промышленности разработаны биозащитные растворы. Некоторыми из самых известных и, вероятно, наиболее применяемых противогрибковых биозащитных растворов на рынке являются культуры НОЬПВЛС™ ΥΜ-Ь и НОЙПВАС™ ΥΜ-С от компании ЭинЕсо. которые содержат комбинации подвидов РгорюшЬас1епа и Ьас1оЬасй1ик.

Применение пропионовокислых бактерий вместе с молочнокислыми бактериями для ингибирования роста микроорганизмов описано в патентных заявках США 2005/00 95318 и \УО 2004/041305.

Считается, что виды ргорюшЬас1епа способствуют противогрибковому действию, главным образом, посредством образования пропионовой кислоты, а также и посредством образования уксусной кислоты и других метаболитов.

Однако эти виды являются довольно дорогостоящими в промышленном масштабе, и получение пропионовой кислоты может вызывать нежелательные органолептические свойства у полученных молочных продуктов.

Другие противогрибковые биозащитные растворы на рынке молочных продуктов включают Ьуойак! ЬРКА от БАССО, а также Агота-Ргох®РР80 от ΒΙΟΡΚΌΧ. Оба из этих продуктов включают комбинации йасЮйасШик р1аи1агит и ЙасЮйасШик гйатпокик.

Тйагтага_) и Бйай (2009) описывают скрининг кандидатов биозащитных молочнокислых бактерий для сйееке-Ьакеб Фрк. Все штаммы ЙасЮйасШик гйатпокик и ЙасЮйасШик рагасакей тестированные по отдельности, проявили максимальное ингибирующее действие против дрожжей и плесневых грибов. Однако никакие комбинации ЙасЮйасШик гйатпокик и Ьас1оЬасШик рагасаке1 не исследовали.

Таким образом, существует промышленная потребность в разработке улучшенных биозащитных растворов, которые не включают виды ргорюшЬас1епа без угрозы снижения противогрибковой эффективности.

Сущность настоящего изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали новые штаммы молочнокислых бактерий, которые эффективны в ингибировании роста бактериальных и грибковых микроорганизмов, которые, как известно, встречаются в виде контаминант в молоке и молочных продуктах. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что определенная группа молочнокислых бактерий при объединении с другой группой молочнокислых бактерий демонстрирует значительный синергический противомикробный эффект. Противомикробный эффект двух объединенных групп бактерий, к удивлению, больше суммы индивидуальных эффектов двух групп бактерий.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм Ьас1оЬасШик гйатпокик и по меньшей мере один штамм Ьас1оЬасШик рагасакей В предпочтительном варианте осуществления указанная противомикробная композиция включает:

(a) по меньшей мере один штамм Ьас1оЬас111ик, выбранный из группы, состоящей из Ьас1оЬасй1ик гйатпокик СНСС12697 и Ьас1оЬасШик гйатпокик СНСС14226 и их мутантов, и (b) по меньшей мере один штамм Ьас1оЬасШик рагасакег выбранный из группы, состоящей из Ьас1оЬасШик рагасаке1 СНСС12777 и его мутантного штамма. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение описывает противомикробную композицию, которая включает по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из Ьас1оЬасй1ик гйатпокик штамм СНСС12697, Ьас1оЬасШик гйатпокик штамм СНСС14226, Ьас1оЬасй1ик рагасаке1 штамм СНСС12777 и их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

Композиции по настоящему изобретению обеспечивают преимущество в том, что может быть ингибирован рост нежелательных микроорганизмов, выбранных из грибов, бактерий и их смесей, например, на пищевом продукте, корме и фармацевтических продуктах и у людей, и у животных. В частности, предусматривается предотвращение и/или ингибирование роста грибов, таких как дрожжи и плесневые грибы. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления термин противомикробный необходимо

- 1 028377 понимать как противогрибковый.

Поэтому второй аспект настоящего изобретения направлен на применение одной из противомикробных композиций первого аспекта для получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.

Третий аспект относится к применению одной из противомикробных композиций первого аспекта для ингибирования роста нежелательных микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из грибов, бактерий и их смесей. В частности, композиции по настоящему изобретению необходимо применять для ингибирования и/или предотвращения роста грибов и бактерий, которые являются традиционно известными контаминантами в процессах молочной промышленности, таких как процессы ферментации молока.

Четвертый аспект относится к применению одной из противомикробных композиций первого аспекта в качестве фармацевтического продукта. Фармацевтический продукт является предпочтительным для применения при лечении заражения объекта бактериями или грибами, более предпочтительно плесневыми грибами.

Пятый аспект относится к пищевому продукту, корму или фармацевтическому продукту, включающему одну из противомикробных композиций согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта согласно пятому аспекту настоящего изобретения, способу, включающему добавление одной из противомикробных композиций согласно первому аспекту настоящего изобретения во время получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. Там, где способ включает добавление противомикробной композиции, которая включает штамм Ьас1оЬасй1ик гйатпокик в комбинации со штаммом Ьас1оЬасШик ратасакец указанную композицию добавляют таким образом, чтобы каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма Ьас1оЬасй1ик тйатпокик и по меньшей мере одного штамма Ьас1оЬасШик рагасаке1 составляла по меньшей мере 1х10⁶ Кое/г, предпочтительно 5х10⁶ Кое/г, или каждая составляла по меньшей мере 1х10⁶ Кое/мл, предпочтительно 5х10⁶ Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта, или каждая составляла по меньшей мере 1х10⁵ Кое/см², предпочтительно 1х10⁷ Кое/см² поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта, и производственные параметры контролируют во время получения таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Ьас1оЬасШик тйатпокик и по меньшей мере одного штамма Ьас1оЬасШик рагасаке1 увеличивалась или оставалась постоянной.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к Ьас1оЬасй1ик тйатпокик штамм СНСС12697, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24616, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к Ьас1оЬасШик тйатпокик штамм СНСС14226, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24652, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к Ьас1оЬасй1ик рагасаке1 штамм СНСС12777, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24651, или его мутантному штамму, где мутантный штамм получен с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает рост дрожжей и плесневых грибов в чашках с молоком, ферментированным только с одной стартовой культурой (контроль, первый столбец), вместе с ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 (второй столбец), вместе с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 (третий столбец) или вместе с комбинацией ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 и ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 (четвертый столбец). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте слева направо: К. шатапик, Р. Гегтеп1апк, Υ. Иро1уйса и С. каке, соответственно в верхнем ряду чашек. На втором ряду чашек сверху добавляли Р. иа1дюуепке, виды С1аДюкротшт добавляли ниже слева и Р. соттипе добавляли ниже справа. В последнем ряду чашек добавляли только виды Μιτ^ί. Чашки инкубировали при 7±1°С в течение 17 дней.

Фиг. 2 показавает подсчет количества клеток в изоляте Υπη^χΕι Иро1уйса, добавленном к цельному молоку, инокулированному стартовой культурой СНЫ-19 в отдельности (залитый ромб) или вместе со следующими штаммами: НОЬОВЛС™ ΥΜ-Β (незалитый квадрат), НОЬОВЛС™ ΥΜ-С (залитый ромб), ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 (залитый квадрат), ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 (залитый треугольник) или комбинация ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 (залитый круг), все из которых добавляли перед ферментацией при 29±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,65±0,05.

Фиг. 3 показывает рост дрожжей и плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным со стартовой культурой в отдельности (контроль, первый столбец), вместе с ЬЬ. тйатпокик СНСС14226 (второй столбец), вместе с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 (третий столбец) или вместе с комбинацией ЬЬ.

тйатпокик СНСС14226 и ЬЬ. ратасаке! СНСС12777 (четвертый столбец). Целевые контаминанты добав- 2 028377 ляли в концентрациях, указанных в тексте слева направо: К. татх1апц8, Р. ГсгтсШапз. Υ. Нро1у1юа и С. 8аке, соответственно в верхнем ряду чашек. В нижнем ряду чашек сверху добавляли Р. шйдюуспзс. виды С1аШо8ротшт добавляли ниже слева и Р. соттипе добавляли ниже справа. Чашки инкубировали при 7±1°С в течение 15 дней.

Фиг. 4 показывает подсчет количества клеток в изоляте К1ууетотусе8 тагх1апи8, добавленном к цельному молоку, инокулированному стартовой культурой СНЫ-19 в отдельности (залитый ромб) или вместе со следующими штаммами: НОЬИВАС™ ΥΜ-Β (незалитый квадрат), НОЬИВАС™ ΥΜ-С (залитый ромб), ЬЬ. ратаса8е1 СНСС12777 (залитый квадрат), ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (залитый треугольник) или комбинация ЬЬ. рагаса8е1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (залитый круг), все из которых добавляли перед ферментацией при 29±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,65±0,05.

Фиг. 5 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным со стартовой культурой в отдельности (контроль, первое изображение), вместе с ЬЬ. рагаса8е1 СНСС14676 (второе изображение), вместе с ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС5366 (третье изображение) или вместе с комбинацией ЬЬ. рагаса8е1 СНСС14676 и ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС5366 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: РешсП1шт па1д1оуе8е, РетсШшт соттипе, Л8рег§й1и8 уеШсоШт и РетсШшт сги81о8ит соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°С в течение 12 дней.

Фиг. 6 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным только со стартовой культурой (контроль, первое изображение) в отдельности, вместе с ЬЬ. рагаса8е1 СНСС14676 (второе изображение), вместе с ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (третье изображение) или вместе с комбинацией ЬЬ. рагаса8е1 СНСС14676 и ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: РешсШ 1шт па1дюуе8е, РетсШшт соттипе, Л8рег§й1и8 уег8юо1ог и РетсШшт сги81о8ит соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°С в течение 12 дней.

Фиг. 7 показывает рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным только со стартовой культурой (контроль, первое изображение) в отдельности, вместе с ЬЬ. рагаса8е1 СНСС12777 (второе изображение), вместе с ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (третье изображение) или вместе с комбинацией ЬЬ. рагаса8е1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпо8И8 СНСС14226 (четвертое изображение). Целевые контаминанты добавляли в концентрациях, указанных в тексте с верхнего левого угла до нижнего правого угла: РешсШ 1шт па1дюуе8е, РетсШшт соттипе, Л8регдШи8 уег8юо1ог и РетсШшт сги81о8ит соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°С в течение 12 дней.

Фиг. 8 показывает результаты исследования на сметане с участием Ьас1оЬасШи8 ратаса8е1 СНСС12777. Продемонстрировано, что Р. соттипе (Μ6), А. уег8юо1ог (М7), Р. ВтеуюотрасШт (Μ1), Р. сги81о8ит (Μ10) и Р. §1аЬгит (Μ8) растут хорошо на сметане, полученной из молока, ферментированного только со стартовой культурой (верхний ряд) или со стартовой культурой и культурой НОЬЭВАС™ ΥΜΒ (средний ряд). Напротив, в присутствии Ьас1оЬасШи8 рагаса8е1 СНСС12777 при ферментации молока (нижний ряд) ингибировался рост всех тестированных плесневых грибов.

Фиг. 9 показывает исследование на твороге с участием Ьас1оЬасй1и8 тйатпо8И8 СНСС12697. Продемонстрировано, что виды Мисог хорошо растут на твороге, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой СНЫ-19 (Контроль). Плесневые грибы также хорошо растут на твороге, полученном из молока, ферментированного со стартовой культурой и культурой НОЬЭВАС™ ΥΜ-В, и в меньшей степени на твороге, полученном из молока, ферментированного со стартовой культурой и культурой НОЬИВАС™ ΥΜ-С. Однако в присутствии штамма СНСС12697 Ьас1оЬасШи8 тйатпо8И8 при ферментации молока наблюдается значительно более заметное ингибирование роста видов Μιτ^ί.

Фиг. 10 показывает исследование на йогурте с участием Ьас1оЬасй1и8 тйатпо8Ц8 СНСС14226. Р. ЬтеуюотрасШт (Μ1), Р. соттипе (Μ6), А. уег8юо1ог (Μ7) и Р. стц81о8ит (Μ10) растут хорошо на йогурте, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой ΥΡ-Ε901 (верхний ряд) или со стартовой культурой и культурой НОЬЭВАС™ ΥΜ-В (средний ряд). Напротив, в присутствии Ьас1оЬасШи8 тйатпо8И8 СНСС14226 при ферментации молока (нижний ряд) ингибировался рост всех тестированных плесневых грибов.

Фиг. 11 показывает количественное определение ингибирующего действия Ьас1оЬасШи8 ратаса8е1 СНСС12777 и Ьас1оЬасШи8 тйатпо8И8 СНСС12697 в отношении К. 1асЕ8 в твороге. Продемонстрировано, что рост К. 1асЙ8 ингибировался в присутствии штамма СНСС12777 Ьас1оЬасШи8 рагаса8ец и в присутствии штамма СНСС12697 Ьас1оЬасШи8 тйатпо8И8 при инокулировании вместе со стартовой культурой СНЫ-19 перед ферментацией. Оба штамма, штамм СНСС12777 Ьас1оЬасШи8 рагаса8е1 и штамм СНСС12697 Ьас1оЬасШи8 гйатпо8И8, вызывали значительно большее ингибирование, чем коммерческая культура НОЬИВАС™ ΥΜ-В.

Фиг. 12 показывает количественное определение ингибирующего действия Ьас1оЬасШи8 гйатпо8И8

СНСС14226 в отношении ОеЬаготусе8 Ьап8епи в йогурте. Рост Ό. Ьап8епи ингибировался в присутствии штамма СНСС14226 Ьас1оЬасШи8 гйатпо8И8, при инокулировании вместе со стартовой культурой ΥΡЬ901 перед ферментацией. Штамм оказывал значительно большее ингибирующее действие, чем коммер- 3 028377 ческая культура НОЬЭВЛС™ ΥΜ-Β.

Подробное описание настоящего изобретения

Определения

Термин молочнокислая бактерия обозначает грамположительную, микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с образованием кислот, включая молочную кислоту в качестве преимущественно образуемой кислоты. В промышленном отношении самые полезные молочнокислые бактерии находятся в отряде Ьас1оЪасШа1е8, который включает виды Ьас1ососси8, виды 51герЮсоссих. виды Ьас1оЪасШи8, виды Ьеисоио81ос, виды РкеибокисопокФс, виды Ребюсоссик, виды Вгеу1Ъас1егшш и виды ЕПегососсик. Их часто применяют в отдельности в качестве пищевых культур или в комбинации с другими молочнокислыми бактериями.

Молочнокислые бактерии, включая бактерии видов Ьас1оЪасШи8 и §1гер1ососси8 1йегторЫ1и8, обычно поставляются в молочную промышленность или в виде замороженных культур, или в виде сублимированных культур для размножения промышленной закваски, или в качестве так называемых культур Инес!: Уа1 8а1 (Όνδ), предназначенных для прямой инокуляции в сосуд ферментации или чан для получения молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт или сыр. Такие культуры молочнокислых бактерий в целом называют стартовые культуры или закваски.

Термин мезофил в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при умеренных температурах (15-40°С). В промышленном отношении самые полезные мезофильные бактерии включают виды Ьас1ососси8 и виды ЬеисопокФс. Термин мезофильная ферментация в настоящем описании относится к ферментации при температуре между приблизительно 22°С и приблизительно 35°С. Термин мезофильный ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочным продуктам, получаемым мезофильной ферментацией мезофильной стартовой культуры, и включает такие ферментированные молочные продукты как пахта, простокваша, сквашенное молоко, сметана, сливки и свежий сыр, такой как кварк, творог и сливочный сыр.

Термин термофил в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при температурах выше 43°С. В промышленном отношении самые полезные термофильные бактерии включают виды ЕйгерЮсоссщ и виды Ьас1оЪасШи8. Термин термофильная ферментация в настоящем описании относится к ферментации при температуре выше приблизительно 35°С, такой как от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С. Термин термофильный ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочным продуктам, получаемым термофильной ферментацией термофильной стартовой культуры, и включает такие ферментированные молочные продукты как неперемешиваемый йогурт, перемешиваемый йогурт и питьевой йогурт.

Термин молоко необходимо понимать как молочную секрецию, получаемую путем доения любых млекопитающих, таких как коровы, овцы, козы, буйволы или верблюды. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молоко является коровьим молоком. Термин молоко также включает белковые/жировые растворы, получаемые из растительных материалов, например, соевое молоко.

Термин молочный субстрат может обозначать любой сырой и/или переработанный молочный материал, который может быть подвергнут ферментации согласно способу по настоящему изобретению. Таким образом, полезные молочные субстраты включают, но не ограничены ими, растворы/суспензии любых молочных или молокоподобных продуктов, содержащих белок, такие как цельное или обезжиренное молоко, снятое молоко, пахта, восстановленное из сухого молока, сгущенное молоко, сухое молоко, сыворотка, сывороточный пермеат, лактоза, маточный раствор от перекристаллизации лактозы, концентрат сывороточного белка или крем. Очевидно, молочный субстрат может быть получен от любого млекопитающего, например, будучи существенно чистым молоком млекопитающего или восстановленным из сухого молока.

До ферментации молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован согласно способам, известным в области техники.

Гомогенизация, как используется в настоящем описании, обозначает интенсивное смешивание для получения растворимой суспензии или эмульсии. Если гомогенизация выполняется до ферментации, она может быть выполнена так, чтобы разрушить капли молочного жира до меньших размеров так, чтобы он больше не отделялся от молока. Этого можно достичь путем пропускания молока под высоким давлением через небольшие отверстия.

Пастеризация, как используется в настоящем описании, обозначает обработку молочного субстрата для снижения количества или удаления живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается путем поддерживания определенной температуры в течение определенного периода времени. Определенная температура, как правило, достигается путем нагревания. Температуру и продолжительность можно выбирать так, чтобы уничтожить или инактивировать конкретные бактерии, такие как вредоносные бактерии. Затем может следовать стадия быстрого охлаждения.

Ферментация в способах по настоящему изобретению обозначает преобразование углеводов в спирты или кислоты под действием микроорганизма. Предпочтительно ферментация по способам настоящего изобретения включает в себя преобразование лактозы в молочную кислоту.

- 4 028377

Процессы ферментации, применяемые при получении молочных продуктов, известны, и специалист в области техники знает как выбирать подходящие условия способа, такие как температура, содержание кислорода, количество и характеристики микроорганизма(-ов) и продолжительность. Очевидно, условия ферментации выбирают так, чтобы поддержать достижение настоящего изобретения, т.е. чтобы получить молочный продукт в твердом виде (таком как сыр) или жидком виде (таком как ферментированный молочный продукт).

Термин нежелательные микроорганизмы в настоящем описании относится к микроорганизмам, таким как бактерии и грибы, такие как дрожжи, которые являются патогенными и/или могут ухудшать состояние пищевого продукта, корма или фармацевтических продуктов.

Термины ингибировать и быть ингибирующим в отношении нежелательных микроорганизмов означают, например, что рост или количество или концентрация нежелательных микроорганизмов, например, в продуктах питания и/или на поверхности продуктов питания, включающих противомикробную композицию, меньше, чем в продуктах питания и/или на поверхности продуктов питания, которые не включают такую противомикробную композицию.

В настоящем контексте термин мутант следует понимать как штамм, полученный из штамма по настоящему изобретению путем, например, генной инженерии, облучения и/или химической обработкой. Предпочтительно, чтобы мутант являлся функционально эквивалентным мутантом, например, мутантом, который имеет, по существу, те же самые или улучшенные свойства (например, в отношении получения диацетила, вязкости, жесткости геля, покрытия ротовой полости, аромата, постацидификация, скорость ацидификации и/или живучесть бактериофага) как материнский штамм. Такой мутант является частью настоящего изобретения. В частности, термин мутант относится к штамму, получаемому путем подвергания штамма по настоящему изобретению любой традиционно применяемой мутагенной обработке, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (ΕΜδ) или Ы-метил-Ы'-нитроΝ-нитрогуанидин (ΝΤΟ), УФ-свет, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант может быть получен в результате нескольких мутагенных обработок (единичную обработку следует считать за одну стадию матагенизации с последующей стадией скрининга/отбора), но сейчас считается предпочтительным, чтобы проводилось не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадии скрининга/отбора). В настоящем, в предпочтительном мутанте менее 5%, или менее 1%, или даже менее 0,1% нуклеотидов в бактериальном геноме сдвинуто другим нуклеотидом или удалено по сравнению с материнским штаммом.

Применение терминов в единственном числе в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте формулы изобретения) необходимо рассматривать как охватывающие и единственное, и множественное число, если не указано иначе в настоящем описании или нет четкого противоречия с контекстом. Термины включающий, имеющий и содержащий необходимо рассматривать как обозначающие включающий, если не указано иначе. Перечисление диапазонов значений в настоящем описании предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуального обращения к каждому отдельному значению, попадающему в диапазон, если не указано иначе в настоящем описании, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было индивидуально указано в настоящем описании. Все способы, описанные в настоящем описании, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если не указано иначе в настоящем описании или иначе четко не противоречат контексту. Применение любого и всех примеров или выражения, например, такой как, предназначено для лучшего освещения настоящего изобретения и не налагает ограничения на объем настоящего изобретения, если не заявлено иначе. Никакие выражения в настоящем описании не должны быть интерпретированы как указание на какой-либо незаявленный элемент, что существенно для практики настоящего изобретения.

Осуществление и аспекты настоящего изобретения

Авторы изобретения провели обширный скрининг и исследование для того, чтобы описать противомикробную композицию, включающую один или смесь двух различных штаммов молочнокислых бактерий, эффективных против нежелательных микроорганизмов, таких как плесневые грибы и дрожжи.

Авторы настоящего изобретения проскринировали 200 кандидатов Еас1оЬасШи8 р1айагит, Ьас1оЬасШи8 рагаса8е1 и Еас1оЬасШи8 гйатиокик для того, чтобы найти самые эффективные одиночные штаммы или комбинации из двух штаммов против широкого диапазона микроорганизмов, таких как дрожжи и плесневые грибы.

Скрининги были выполнены в модельном испытании, имитирующем в максимально возможной степени мезофильные ферментированные молочные продукты в питательных средах на основе молока, к которым добавляли соответствующую стартовую культура с или без биозащитных кандидатов и которые ферментировали в условиях, соответствующих мезофильным ферментированным молочным продуктам. Из мезофильных ферментированных молочных продуктов выделяли целевые организмы. Как очищенные молочнокислые бактерии из культур НОЬОВАС™ от Эашксо А/δ, Дания, так и полные культуры НОЬОВАС™ ΥΜ-В и НОДЭВАС™ ΥΜ-С, содержащие и молочнокислые бактерии, и пропионовокислые бактерии, применяли в качестве контролей.

- 5 028377

Обнаружили, что семнадцать кандидатов среди Ьас1оЬасШиз рагасазе1 и Ьас1оЬасШиз гкатпозиз в целом ингибировали 12 индикаторных грибов также хорошо или лучше, чем молочнокислые бактерии контроля при тестировании при 25°С. Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм ЬасФЬасШиз гкатпозиз или Ьас1оЬасШи8 рагасазек

Девять из идентифицированных штаммов-кандидатов также проявляли активность в том же самом диапазоне как и молочнокислые бактерии контроля при тестировании в условиях охлаждения, и в частности, три штамма оказались очень эффективными: ЬасФЬасШиз рагасазе1 СНСС12777 с номером доступа Ό8Μ24651, Ьас1оЬасШиз гкатпозиз СНСС12697 с номером доступа Ό8Μ24616 и Ьас1оЬасШиз гкатпозиз СНСС14226 с номером доступа Ό8Μ24652. Эти три штамма были депонированы в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Ό8ΜΖ).

Эти отдельные штаммы оказались лучше или сопоставимыми по действию против различных дрожжей при тестировании в так называемом бутылочном испытании по сравнению с культурами НОЬИВАС™. Таким образом, эти отдельные штаммы являются в высокой степени подходящими для применения в качестве бактерицидных агентов. Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретение описывает противомикробную композицию, включающую по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из

Ьас1оЬасШиз гкатпозиз СНСС12697, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Ό8ΜΖ) под номером Ό8Μ24616,

Ьас1оЬасШиз гкатпозиз СНСС14226, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Ό8ΜΖ) под номером Ό8Μ24652,

Ьас1оЬасШиз рагасазе1 СНСС12777, который депонировали в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Ό8ΜΖ) под номером Ό8Μ24651, и их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

В частном предпочтительном варианте осуществления противомикробная композиция по настоящему изобретению включает один из вышеуказанных штаммов или его мутант в виде единственного агента, который обнаруживает противомикробную активность.

Кроме трех указанных выше штаммов, настоящее изобретение также относится к мутантам, которые происходят от этих штаммов, т.е. их получают с применением одного из депонированных штаммов СНСС12777, СНСС12697 или СНСС14226 в качестве исходного материала. Мутантный штамм может быть получен из одного из этих штаммов, например, путем генной инженерии, облучения, УФ-света, химической обработки и/или способами, которые вызывают изменения в геноме. Мутант по настоящему изобретению ингибирует и/или предотвращает рост определенных бактерий или грибов, предпочтительно плесневых грибов. Предпочтительно, чтобы мутант обладал существенным по меньшей мере 80% или более, по меньшей мере 90% или более, по меньшей мере 95% или более, или даже вплоть до 100% или более противомикробным действием, например, противогрибковым действием по сравнению со своим материнским штаммом при определении, например, в испытании, как описано в примере 2, с применением одних из дрожжей К. татапиз, Р. ГегтеШаз, Υ. Иро1уИса или С. заке в качестве контаминанта.

Ингибирующее действие этих штаммов в отношении нежелательных микроорганизмов может быть определено при хранении бутылей при подходящей температуре в течение подходящего времени хранения, как описано в примерах ниже.

В целом, подходящая температура, при которой следует осуществлять этот способ, зависит от температуры, при которой, как правило, конкретный пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт хранят и/или производят. Температуры, при которых обычно хранят бутыли, составляют между 5°С и 26°С, предпочтительно температура составляет приблизительно 8°С.

Продолжительность хранения при определенной температуре зависит от времени, в течение которого, как правило, хранят пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт (срок годности). Продолжительность хранения обычно составляет 7-28 дней, предпочтительно продолжительность хранения составляет приблизительно 21 день.

При тестировании комбинаций из 2 штаммов неожиданно обнаружили, что комбинации из самых эффективных отдельных штаммов были даже более эффективны, чем любой из штаммов по отдельности, даже когда общие концентрации добавляемых клеток были равны в тестах отдельных штаммов и комбинаций из 2 штаммов. Комбинации ЬасФЬасШиз рагасазе1 СНСС12777 и ЬасФЬасШиз гкатпозиз СНСС12697 или ЬасФЬасШиз рагасазе1 СНСС12777 и ЬасФЬасШиз гкатпозиз СНСС14226 обнаруживали большую эффективность, чем контрольные культуры НОЬИВАС™ ΥΜ-В и НОЬИВАС™ ΥΜ-С от Иап1зсо, Дания.

Соответственно в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к противомикробной композиции, включающей по меньшей мере один штамм ЬасФЬасШиз гкатпозиз и по меньшей мере один штамм ЬасФЬасШиз рагасазек в которой по меньшей мере один штамм ЬасФЬасШиз гкатпозиз выбран из группы, состоящей из ЬасФЬасШиз гкатпозиз СНСС12697 с номером Ό8Μ24616,

ЬасФЬасШиз гкатпозиз СНСС14226 с номером Ό8Μ24652 и их мутантных штаммов, где мутантные

- 6 028377 штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один штамм ЬасбоЬасШик рагасаке1 выбран из группы, состоящей из ЬасЛЬасШик рагасаке1 СНСС12777 с номером Ό8Μ24651 и его мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к противомикробным и более предпочтительно к противогрибковым композициям, включая по меньшей мере один штамм басЮЬасШик тйатпокик и по меньшей мере один штамм ЬасбоЬасШик ратасакец в которых по меньшей мере один штамм ЬаскЬасШик тйатпокик выбран из группы, состоящей из ЬасбоЬасШик тйатпокик СНСС12697 с номером Ό8Μ24616, басЮЬасШик тйатпокик СНСС14226 с номером Ό8Μ24652 и их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала; и по меньшей мере один штамм ЬасЛЬасШик рагасаке1 выбран из группы, состоящей из ЬасЛЬасШик рагасаЫ СНСС12777 с номером Ό8Μ24651 и его мутантных штаммов, где мутантные штаммы получены с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере ЬасЛЬасШик тйатпокик СНСС12697 и ЬасЛЬасШик рагасаЫ СНСС12777, является предпочтительной. Аналогично, противомикробная композиция, включающая по меньшей мере басЮЬасШик тйатпокик СНСС14226 и ЬасЛЬасШик рагасаке1 СНСС12777, является предпочтительной согласно настоящему изобретению.

Противомикробная композиция, как правило, включает бактерии в концентрированной форме, включая замороженные, высушенные или сублимированные концентраты, как правило, с концентрацией жизнеспособных клеток в диапазоне 10⁴-10¹² Кое (колониеобразующих единиц) на грамм композиции, включая по меньшей мере 10⁴ Кое/г композиции, как, например, по меньшей мере 10⁵ Кое/г, например, по меньшей мере 10⁶ Кое/г, как, например, по меньшей мере 10⁷ Кое/г, например, по меньшей мере 10⁸ Кое/г, как, например, по меньшей мере 10⁹ Кое/г, например, по меньшей мере 10¹⁰ Кое/г, как, например, по меньшей мере 10¹¹ Кое/г. Таким образом, противомикробная композиция по настоящему изобретению предпочтительно находится в замороженной, высушенной или сублимированной форме, например, такой как культура Эйес! Уа1 §е! (Όνδ). Однако, как используется в настоящем описании, противомикробная композиция может также представлять собой жидкость, полученную после суспендирования замороженных, высушенных или сублимированных концентратов клеток в жидкой среде, такой как вода или фосфатно-солевой буфер. Где противомикробная композиция по настоящему изобретению представляет собой суспензию, концентрация жизнеспособных клеток находится в диапазоне 10⁴-10¹² Кое (колониеобразующих единиц) на мл композиции, включая по меньшей мере 10⁴ Кое/мл композиции, как, например, по меньшей мере 10⁵ Кое/мл, например, по меньшей мере 10⁶ Кое/мл, как, например, по меньшей мере 10⁷ Кое/мл, например, по меньшей мере 10⁸ Кое/мл, как, например, по меньшей мере 10⁹ Кое/мл, например, по меньшей мере 10¹⁰ Кое/мл, как, например, по меньшей мере 10¹¹ Кое/мл.

Композиция может дополнительно содержать в качестве дополнительных компонентов криопротекторы и/или традиционные добавки, включая питательные вещества, такие как дрожжевые экстракты, сахар и витамины, например, витамин А, С, Ό, К или витамины из семейства витамина В. Подходящие криопротекторы, которые могут быть добавлены к композициям по настоящему изобретению, являются компонентами, которые улучшают устойчивость микроорганизмов к холоду, такими как маннитол, сорбит, триполифосфат натрия, ксилит, глицерин, рафиноза, мальтодекстрин, эритрит, треитол, трегалоза, глюкоза и фруктоза. Другие добавки могут включать, например, углеводы, ароматизаторы, минералы, ферменты (например, реннин, лактаза и/или фосфолипаза).

В противомикробных композициях по настоящему изобретению, которые включают штамм басЮЬасШик тйатпокик и штамм басЮЬасШик ратасакец соотношение между штаммом басЮЬасШик тйатпокик и штаммом басЮЬасШик рагасакеб например, соотношение между концентрацией или количеством бактерий басЮЬасШик тйатпокик и концентрацией или количеством бактерий басЮЬасШик рагасаке1 предпочтительно составляет от 1:100 до 100:1, предпочтительно от 1:10 до 10:1.

Противомикробная композиция по настоящему изобретению может быть использована в любом пищевом продукте, корме и фармацевтическом продукте, который подвержен микробному разложению и/или контаминации дрожжами и плесневыми грибами. Они включают, но не ограничены ими, плоды и овощи, включая производные продукты, зерно и получаемые из зерна продукты, молочные продукты, мясо, домашнюю птицу и морепродукты. В особенно предпочтительных вариантах осуществления композицию применяют к молочным продуктам и/или мясу и домашней птице. В предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению предназначены для применения в качестве добавки при получении молочных продуктов, таких как йогурт, творог, сметана, творожный сыр и т.п.

Противомикробная композиция согласно настоящему изобретению также может применяться для ингибирования роста нежелательных микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из грибов и бактерий и их смесей. Композиции по настоящему изобретению особенно полезны для ингибирования и/или предотвращения роста грибов и бактерий, являющихся традиционно известными контаминантами в процессах молочной промышленности, таких как процесс ферментации молока.

В предпочтительном варианте осуществления противомикробные композиции по настоящему изо- 7 028377 бретению применяют против грибов, таких как дрожжи и плесневые грибы. Это означает, что композиции применяют для ингибирования и/или предотвращения роста грибов, которые вызывают контаминацию в процессах молочной промышленности, в частности в процессе ферментации молока. Противомикробные композиции по настоящему изобретению могут применяться, например, для ингибирования и/или предотвращения роста дрожжей, таких как дрожжи родов К1ууетотусек (например, К. тамапцк, К. 1асйк), РюШа (например, Р. Гегтейапк), Уаггсщщ (например, Υ. Иро1уДса), СапФба (например, С. каке) и т.п.; или плесневых грибов, таких как плесневые грибы из рода РешсШшт (например, Р. па1дюуеп8е, Р. соттипе, Р. сгикШкиш, Р. ЬгеуюотрасШт, Р. д1аЬгит), виды Мисог, виды С1аШокрогшт, АкрегдШик (например, А. ует51со1от), ОеЬатотусек (например, Ό. Ьапкепи) и т.п. Особенно предпочтительно применение противомикробных композиций по настоящему изобретению для ингибирования и/или предотвращения роста видов К1ууетотусек татапик, Υа^^о\γ^а йро1уйса, РешсШшт па1дюуепке, видов С1аШокрогшт, РешсШшт соттипе, видов Мисог, РешсШшт ЬгеуюотрасШт, АкрегдШик уеткюо1ог, РешсШшт сгикЮкит, КШууеготусек 1асДк и/или ОеЬатотусек Ьапкепи.

Противомикробная композиция по первому аспекту настоящего изобретения также может применяться в качестве фармацевтического продукта для лечения инфекций патогенными грибами, предпочтительно патогенными дрожжами.

Как указано выше, настоящее изобретение в одном аспекте относится к пищевому продукту, корму или фармацевтическому продукту, включающим противомикробные композиции по первому аспекту настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такой пищевой продукт выбран из группы, состоящей из фруктов, и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морепродуктов и их смесей.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является молочным продуктом, предпочтительно мезофильным или термофильным ферментированным молочным продуктом, таким как творожный сыр, йогурт, сметана или творог.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является мясом или домашней птицей.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический продукт является продуктом, полезным для введения противомикробной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения человеку или животному для ингибирования патогенных микроорганизмов и облегчения симптомов, связанных с патогенными микроорганизмами. Примеры таких симптомов включают симптомы, связанные с дрожжевой инфекцией. В таком варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический продукт может представлять собой единичную лекарственную форму, включающую противомикробную композицию. Предпочтительно единичная лекарственная форма представляет собой капсулу или таблетку. Однако единичная лекарственная форма также может быть подходящей для применения к слизистой оболочке или коже и, таким образом, быть в форме пасты, крема, мази и т.п.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта согласно пятому аспекту настоящего изобретения, включающему добавление противомикробной композиции согласно первому аспекту настоящего изобретения во время получения пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик гкатпокик или ЬасШЬасШик рагасаке! составляет по меньшей мере 1х 10⁶ Кое/г, предпочтительно 5х10⁶ Кое/г, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1х 10⁸ Кое/г или по меньшей мере 1х10⁶ Кое/мл, предпочтительно по меньшей мере 5х10⁶, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1х 10⁸ Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1х 10⁵ Кое/см², предпочтительно по меньшей мере 1х 10⁵ Кое/см², наиболее предпочтительно по меньшей мере 1х 10⁷ Кое/см² поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.

Там, где пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт получают путем добавлением композиции, включающей по меньшей мере один штамм ЬасШЬасШик гкатпокик и по меньшей мере один штамм ЬасШЬасШик ратасакец каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасй1ик гкатпокик и по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик рагасаке1 составляет по меньшей мере 1 х 10⁶ Кое/г или по меньшей мере 1х 10⁶ Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1 х 10⁵ Кое/см² поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. Предпочтительно каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик гкатпокик и по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик рагасаке1 составляет 5х10⁶ Кое/г, по меньшей мере 5х10⁶ Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 5х10⁵ Кое/см² поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения каждая из концентраций по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик гкатпокик и по меньшей мере одного штамма ЬасШЬасШик ратасаке! составляет по

- 8 028377 меньшей мере 1х 10⁸ Кое/г или по меньшей мере 1х10⁸ Кое/мл пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта или по меньшей мере 1х10⁷ Кое/см² поверхности пищевого продукта, корма или фармацевтического продукта.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения параметры получения контролируются во время получения таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма ЬасЮЬасШик гЬатпокик и по меньшей мере одного штамма Ьас1оЬасШик рагасаке! увеличивалась или оставалась постоянной.

Противомикробную композицию по настоящему изобретению наиболее легко применять путем смешивания и/или нанесения на смешиваемый пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт, но она также должна быть эффективна для обработки поверхности твердых пищевых продуктов или внутренней части таких продуктов, например, путем инъекции. Во все еще других вариантах осуществления композиция может применяться в качестве маринада, панировки, приправы при вялении, глазури, пигментной смеси и т.п., при этом ключевым критерием является то, что противомикробная композиция доступна на поверхности, которая подвергается бактериальному разложению и контаминации дрожжами и плесневые грибами. Во все еще других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может быть приведена в контакт с поверхностью пищевого продукта косвенно, путем применения композиции к упаковке пищевых продуктов с последующим применением упаковки к поверхности пищевого продукта. Оптимальное количество для применения зависит от состава конкретного обрабатываемого пищевого продукта и способа применения композиции к поверхности пищевого продукта, но может быть определено простым экспериментированием.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает одну или более стадий ферментации, и противомикробная композиция может быть добавлена в пищевой продукт, корм или фармацевтический продукт до, во время или после такой одной или более стадий ферментации.

В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает ферментацию молочного субстрата со стартовой культурой, включающей по меньшей мере один штамм из родов, выбранных из Ьас1оЬасШик, ЕНгерЮсоссщ. Ьас1ососсик и Ьеисопок1ос, такой как по меньшей мере один штамм ЬасЮЬасШик Ьи1даг1сик и по меньшей мере один штамм §1тер1ососси8 (ЬегторЬПек или такой как по меньшей мере один штамм Ьас1ососсик 1асЬк подвида 1асйк, по меньшей мере один штамм ЬеисопокЮс текейетоМек подвида сгетопк и по меньшей мере один штамм Ьас1ососсик 1асйк подвида Фасе1у1асйк.

Последние аспекты настоящего изобретения относятся к штамму Ьас1оЬасШик тЬатпокик СНСС12697, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24616, или его мутантному штамму, штамму Ьас1оЬасШик гЬатпокик СНСС14226, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24652, или его мутантному штамму и штамму Ьас1оЬасШик рагасаке1 СНСС12777, который депонировали в немецкой Коллекцией микроорганизмов и клеточных культур (ΌδΜΖ) под номером ΌδΜ24651, или его мутантному штамму, где мутантные штаммы получены с применением депонированных штаммов в качестве исходного материала.

Специалистам в области техники ясно, что с применением депонированного штамма в качестве исходного материала, специалист путем обыкновенного мутагенеза или техники повторного выделения может рутинным образом получить дополнительные мутанты или их производные, которые сохраняют приведенные в настоящем описании соответствующие свойства и преимущества. Соответственно термин их мутант в первом аспекте относится к мутантным штаммам, получаемым с применением депонированного штамма в качестве исходного материала.

Варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже при помощи неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1: полуколичественные определения ингибирующего действия ЬЬ. Рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гЬатпокик СНСС12697 в отдельности и в комбинации против различных дрожжей и плесневых грибковых контаминант

Для полуколичественных измерений ингибирующего действия ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гЬатпокик СНСС12697, как в отдельности, так и в комбинации, проводили испытание на агаре, воспроизводя производственный способ и получение свежего сыра.

Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°С в течение 20 с и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Ρ-Όνδ СНЫ-19 производства СЬг. Напкеп Α/δ, Дания) инокулировали при 0,1 и/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Различные бутыли инокулированы с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и/или ЬЬ. гЬатпокик СНСС12697 в общих концентрациях 5х10⁶ Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 5% рН-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли для получения показателя скорости окисления и получения синего/зеленого цвета питатель- 9 028377 ных сред, что позволяло легче обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,1. После ферментации бутыли сразу же охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°С и добавляли к 40 мл 5%-ного стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°С. Этот раствор ферментированного молока и агара затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.

Отобранные дрожжи и плесневые грибы наносили каплями в концентрациях 10⁴, 10³ и 10² Кое/капля соответственно для дрожжей К1ууетотусек татапик, РюЫа Гегтеп1апк, Уагго\\ш Иро1уйса и СапбМа каке. Полностью проросшие суспензии спор разбавлены в 1000, 100, 10 раз или применяли неразведенные для плесневых грибов РетсШшт па1дюуепке, видов Мисог, РетсШшт соттипе и видов С1аШокрогшт соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°С и регулярно обследовали на предмет на роста дрожжей и плесневых грибов.

Результаты анализа на агаре, представленные на фиг. 1, показывают, что все тестированные дрожжи и плесневые грибы росли очень хорошо в чашках с агаром, полученным из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда во время ферментации молока присутствовали ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. тйатпокик СНСС12697, получаемые чашки с агаром предотвращали рост К. татх1апик и Υ. йро1уйса, добавленных во всех концентрациях. Кроме того, значительное ингибирование наблюдали для всех плесневых грибов, нанесенных каплями на чашки, когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. Кйашпокик СНСС12697 присутствовали во время ферментации молока. Ни в случае, когда добавляли ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777, ни в случае, когда добавляли ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 в качестве единственного штамма, они не оказывали какого-либо ингибирующего действие на Р. Гегтеп1апк или штаммы С. каке. Однако когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 оба присутствовали во время ферментации молока, ингибирование роста Р. ГегтеШапк наблюдали при его нанесении каплями в низких концентрациях 10² и 10³ Кое/капля, и плесневые грибы видов С1аШокротшш, а также видов Мисог, ингибировались больше, чем тогда, когда добавляли только какой-либо один из штаммов ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. тйатпокик СНСС12697. Эти результаты иллюстрируют некоторое синергическое противогрибковое действие двух штаммов ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС12697.

Пример 2. Количественные определения ингибирующего действия ЬЬ. Рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 против ΥηπΌ\γίη йро1уйса по отдельности и в комбинации

Для количественного анализа ингибирующего действия ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 в отдельности и в комбинации проводили анализ, воспроизводящий производственный способ и получение свежего сыра:

Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°С в течение 20 секунд и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Р-ЭУ8 СНЫ-19 производства Сйг. Напкеп А/δ, Дания) инокулировали с 0,1 и/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 1 л. Различные бутыли инокулировали с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и/или ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 в общих концентрациях 5х 10⁶ Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 2 бутыли инокулировали либо НОЬЭВАС™ ΥΜ-Β (50ЭСЬ/100Ь: Эашксо А/δ, Дания), либо НОЬЭВАС™ ΥΜ-С (20 ЭСЬ/100Ь: Эашксо Α/δ, Дания) вместе со стартовой культурой СНЫ-19. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,65±0,05. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят.

Содержание каждой бутыли распределяли по более мелким пластмассовым чашкам для инокуляции штаммом дрожжей ΥηπΌ\γίη йро1уйса, ранее изолированным в качестве контаминанта из свежего сырного продукта. Две отдельные чаши инокулировали объемом 1% (об./мас.) для достижения итогового уровня контаминации Υ. Иро1уйса в ферментированном молочном продукте приблизительно 1х10² Кое/г. Пластмассовые чаши запечатывали и хранили при 8±1°С. Пробы ферментированных молочных продуктов регулярно отбирали для определения уровня контаминации Υ. Иро1уйса путем посева в чашки соответствующих 10-кратных разведений, полученных в солевом пептоне, на Υеакΐ О1исоке Сй1отатрйешсо1 (ΥΟΟ) агаре с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°С. Кроме того, рН различных образцов ферментированного молока регулярно измеряли в течение хранения.

Как проиллюстрировано на фиг. 2, рост Υ. Иро1уйса ингибировался в присутствии обоих штаммов ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 при их применении в качестве единственного штамма вместе со стартовой культурой СНЫ-19 перед ферментацией. Оба штамма вызывали значительно более сильное ингибирование, чем НОЬЭВАС™ ΥΜ-Β и НОЬЭВАС™ ΥΜ-С. Кроме того, синергическое ингибирующее действие было обнаружено при применении ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС12697 в комбинации по сравнению с ингибирующим действием каждого штамма, примененного по отдельности. При применении в комбинации, штаммы ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. тйатпокик СНСС12697 резко влияли как на продолжительность лаг-фазы, так и на максимальное количество кле- 10 028377 ток, полученное для Υ. йро1уйса в ферментированном молочном продукте, и этот синергический эффект, может способствовать продлению срока хранения для подобных продуктов.

Пример 3. Полуколичественные определения ингибирующего действия ЬЬ. Рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 по отдельности и в комбинации против различных дрожжей и плесневых контаминант

Для полуколичественного анализа ингибирующего действия ЬЬ. рагасаке! СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение свежего сыра.

Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°С в течение 20 с и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Р-ЭУ§ СНЫ-19) инокулировали при помощи 0,1 и/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Различные бутыли инокулировали с ЬЬ. рагасаке! СНСС12777 и/или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 в общих концентрациях 5х10⁶ Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, добавляли 5% рН-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого для получения индикации скорости окисления и получения синего/зеленого цвета питательных сред, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°С и добавляли к 40 мл 5%-ного стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°С. Этот раствор ферментированного молока и агара затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.

Отобранные дрожжи и плесневые грибы, нанесенные по каплям с концентрациями 10⁴, 10³ и 10² Кое/капля соответственно, для дрожжей К1ууетотусек татапик, РюЫа ГегтеШапк, ΥαπΌ\νία йро1уйса и СапДМа каке. Полностью проросшие суспензии спор разбавляли в 1000, 100, 10 раз или применяли неразведенными для плесневых грибов РетсШшт паЦюуепке, видов Мисог, РетсШшт соттипе и видов С1аШокрогшт соответственно. Чашки инкубировали при 7±1°С и регулярно обследовали на предмет роста дрожжей и плесневых грибов.

Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 3, показывают что все тестированные дрожжи и плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках, полученных из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль).

Однако, когда во время ферментации молока присутствовал ЬЬ. рагасаке! СНСС12777, полученные пластинки предотвращали рост К. татапик и Υ. йро1уйса, добавленных во всех концентрациях. Для ЬЬ. гйатпокик СНСС14226, полученные пластинки также предотвращали рост К. таг.Чагшк, добавленного во всех концентрациях, а также Υ. йро1уйса, добавленного в двух самых низких концентрациях. Когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 добавляли в качестве единственного штамма, они также, казалось, вызвали небольшое ингибирующее действие на Р. ГегтеШапк, добавленный в самых низких концентрациях. Однако, когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 оба присутствовали во время ферментации молока, рост Р. ГегтеШапк предотвращался при его добавлении в самой низкой концентрации 10² Кое/капля. Для плесневых грибов значительное ингибирование наблюдали тогда, когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 присутствовал во время ферментации молока. При применении комбинации ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 рост видов С1аШокротшт ингибировался больше, чем тогда, когда один из штаммов ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 добавляли в отдельности. Эти результаты иллюстрируют некоторое синергическое противогрибковое действие двух штаммов ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226.

Пример 4. Количественные определения ингибирующего действия ЬЬ. Рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 по отдельности и в комбинации против К1ууетотусек татапик

Для анализа ингибирующего действия ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 в отдельности и в комбинации проводили анализ, воспроизводящий производственный способ и получение свежего сыра:

Цельное (3,5 мас./об.%) гомогенизированное молоко пастеризовали при 79±1°С в течение 20 секунд и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Р-ЭУ§ СНЫ-19) инокулировали с 0,1 и/л, и инокулированное молоко распределяли по бутылям объемом 1 л. Различные бутыли инокулировали с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и/или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 в общих концентрациях 5х10⁶ Кое/мл, и одна бутыль служила контролем и была инокулирована только стартовой культурой. Кроме того, 2 бутыли инокулировали или с НОЬПВЛС™ ΥΜ-Β (50ПСИ/100Ь) или с НОЬПВЛС™ ΥΜ-С (20 ПСИ/100Ь) вместе со стартовой культурой СНЫ-19. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 29±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,65±0,05. После ферментации бутыли немедленно охлаждались на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят.

Содержание каждой бутыли распределяли по более мелким пластмассовым чашкам для инокуляции штаммом дрожжей К1ууетотусек татапик, ранее изолированным в качестве контаминанты из свежего

- 11 028377 сырного продукта. Две отдельных чашки инокулировали объемом 1% (об./масс.) для достижения итогового уровня контаминации К. татапив в ферментированном молочном продукте приблизительно 1х 10² Кое/г. Пластмассовые чашки запечатывали и хранили при 8±1°С. Регулярно отбирали пробы ферментированных молочных продуктов для определения уровня контаминации К. татапив путем посева в чашки соответствующих 10-кратных разведений в солевом пептоне на агаре Уеав1 С1исове Ск1огатркетсо1 (УСС) с последующей аэробной инкубацией в течение 3-5 дней при 25°С. Кроме того, рН различных образцов ферментированного молока регулярно измеряли в течение хранения.

Как проиллюстрировано на фиг. 4, рост К. татапив ингибировался в присутствии обоих штаммов ЬЬ. рагасаве1 СНСС12777 и ЬЬ. гкатповив СНСС14226 при их применении в качестве единственного штамма вместе со стартовой культурой СНЫ-19 перед ферментацией. Как замечено в примере 2, ЬЬ. рагасаве1 СНСС12777 также вызывал значительно более высокое ингибирование К. татапив, чем культуры НОЬПВАС™ ΥΜ-Β и НОЬПВАС™ ΥΜ-С, тогда как ингибирование, вызываемое ЬЬ. гкатповив СНСС14226, как обнаружили, было на том же самом уровне, что и у культуры НОЬПВАС™. Синергическое ингибирующее действие обнаружили при применении ЬЬ. рагасаве1 СНСС12777 и ЬЬ. гкатповив СНСС14226 в комбинации по сравнению с ингибирующим действием каждого штамма, примененного в отдельности. Применении в комбинации штаммов ЬЬ. рагасаве1 СНСС12777 и ЬЬ. гкатповив СНСС14226 приводило к более медленному росту К. татапив в ферментированном молочном продукте, и поэтому это может способствовать продлению срока хранения для этого типа продуктов.

Пример 5. Полуколичественные определения ингибирующего действия ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 и ЬЬ. ткатиовив СНСС5366 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант

Для полуколичественного анализа ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 и ЬЬ. ткатиовив СНСС5366 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение йогурта:

Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°С в течение пяти минут и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Р-ЭУ8 ΥΟ-350 производства Скг. Напвеп А/δ, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулировали с ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676, ЬЬ. гкатповив СНСС5366 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1х 10⁷ Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стартовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% рН-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить индикацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, которые позволяют легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°С и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°С. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.

Полностью проросшие суспензии спор с соответствующими разведениями отобранных плесневых грибов РетсШшт па1дюуеве (10х), РетсШшт соттипе (100х), АврегдШив уегвюоЮг (100х) и РетсШшт сгивЮвит (100х) наносили по каплям на чашки. Чашки инкубировали при 7°С и оценивали на предмет роста плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.

Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 5, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 или ЬЬ. гкатповив СНСС5366 присутствовали во время ферментации молока, полученные пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 и ЬЬ. гкатповив СНСС5366 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, для РешсШшт соттипе, АврегдШив уетвюоЮт и РетсШшт сгивЮвит. нанесенных каплями на чашки с агаром, наблюдали значительное ингибирование.

Пример 6. Полуколичественные определения ингибирующего действия ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 и ЬЬ. гкатповив СНСС14226 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант

Для полуколичественного анализа ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676 и ЬЬ. гкатповив СНСС14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводившее производственный способ и получение йогурта:

Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°С в течение 5 мин и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Ρ-Όνδ Υоί1еx® Μί1ά производства Скг. Напвеп А/δ, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулированы с ЬЬ. рагасаве1 СНСС14676, ЬЬ. гкатповив СНСС14226 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1х10⁷ Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стартовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% рН-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить инди- 12 028377 кацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43±1°С и ферментировали при этих условиях до тех пор, пока показатель рН не достигал 4,60±0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°С и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°С. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.

Полностью проросшие суспензии спор с соответствующими разведениями отобранных плесневых грибов РетсШшт па1дюуеке (10х), РетсШшт соттипе (100х), АкрегдШик уегк1со1ог (100х) и РетсШшт сгийокит (100х) наносили каплями на чашки. Чашки инкубировали при 7°С и оценивали на предмет роста плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.

Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 6, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда ЬЬ. рагасаке! СНСС1466 или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 присутствовали во время ферментации молока, получаемые пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда ЬЬ. рагасаке! СНСС14676 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, значительное ингибирование наблюдали для РетсШшт соттипе, АкрегдШик уегкюо1ог и РетсШшт сгикЮкит, нанесенных каплями на чашки с пластинками агара.

Пример 7. Полуколичественные определения ингибирующего действия ЬЬ. Рагасаке! СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 по отдельности и в комбинации против различных плесневых контаминант

Для полуколичественного анализа ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 по отдельности и в комбинации проводили испытание на агаре, воспроизводящее производственный способ и получение йогурта:

Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5 мас./об.%) пастеризовали при 95°С в течение пяти минут и немедленно охлаждали. Коммерческую стартовую культуру (Ρ-Όνδ УС-350 производства Сйг. Напкеп А/δ, Дания) инокулировали с 0,02%, и молоко распределяли по бутылям объемом 220 мл. Бутыли дополнительно инокулировали с ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777, ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 и комбинацией этих двух штаммов соответственно в общих концентрациях 1х10⁷ Кое/мл. Одна бутыль без дополнительной инокуляции кроме стратовой культуры служила контролем. Кроме того, 5% рН-индикатор из бромкрезола фиолетового и бромкрезола зеленого добавляли ко всем бутылям, чтобы получить индикацию скорости окисления и получить питательные среды синего/зеленого цвета, что позволяет легко обнаруживать последующий рост целевых дрожжей и плесневых грибов. Все бутыли инкубировали на водяной бане при 43±1°С и ферментировали в этих условиях до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,1. После ферментации бутыли немедленно охлаждали на льду и энергично взбалтывали, чтобы разрушить коагулят. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°С и добавляли к 40 мл 5%-ого стерильного раствора агара, расплавленного и остывшего до 60°С. Этот раствор затем заливали в стерильные чашки Петри, и чашки высушивали на лабораторном столе с ламинарным воздухопотоком в течение 30 мин.

Полностью проросшие суспензии спор в соответствующих разведениях отобранных плесневых грибов РетсШшт па1дюуеке (10х), РетсШшт соттипе (100х), АкрегдШик уегкюо1ог (100х) и РетсШшт сгикШкит (100х) наносили каплями на чашки с агаром. Чашки инкубировали при 7°С и оценивали на предмет рост плесневых грибов с подходящим, регулярным интервалом.

Результаты испытания на агаре, представленные на фиг. 7, показывают, что все тестированные плесневые грибы росли очень хорошо на агаровых пластинках из молока, ферментированного только со стартовой культурой (контроль). Однако, когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 или ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 присутствовали во время ферментации молока, получаемые пластинки предотвращали рост всех плесневых грибов. Кроме того, когда ЬЬ. рагасаке1 СНСС12777 и ЬЬ. гйатпокик СНСС14226 присутствовали в комбинации во время ферментации молока, значительное ингибирование наблюдали для всех плесневых грибов, нанесенных каплями на чашки с агаром.

Пример 8. Исследование задачи на сметане с ЬасШЬасШик рагасаке1 СНСС12777

Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12777 ЬасШЬасШик рагасаке1 на различные плесневые грибы Р. соттипе, А. уегкюо1ог, Р. Ьгеу1сотрас1нт, Р. сгнкЮкнт и Р. д1аЬгит получали сметану:

Пастеризованное цельное молоко инокулировали коммерческой гетероферментативной стартовой культурой (Ρ-Όνδ ΌδΟ-2000 производства Сйг. Напкеп А/δ, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали НОЬОВАС™ ΥΜ-В (100Си/100Ь) или штаммом СНСС12777 ЬасШЬасШик гйатпокик (5х 10⁶ Кое/г), и одну партию применяли в качестве контроля и инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 28°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,05, и за- 13 028377 тем дообрабатывали сметану. Сметану перемешивали и охлаждали до 20°С±1°С и хранили при 7°С±1°С.

Через один день после получения сметаны проводили инокуляцию различными плесневыми грибами в виде поверхностных контаминант с двойной повторностью в чашки с йогуртом одной каплей на поверхности йогурта с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 45 дней при 7°С±1°С.

Результат теста на сметане, представленный на фиг. 8, показывает, что Р. соттипе (Μ6), А. уегкЬ со1ог (Μ7), Р. ЪгеукотрасШт (Μ1), Р. сгик1окит (Μ10) и Р. §1аЪгит (Μ8) хорошо росли на сметане, полученной из молока, ферментированного только со стартовой культурой (верхний ряд) или со стартовой культурой и НОЬОВАС™ ΥΜ-В культура (средний ряд). Напротив, когда ЬасЭоЪасШик рагасаке! СНСС12777 присутствовал во время ферментации молока (нижний ряд), рост всех тестированных плесневых грибов ингибировался.

Пример 9. Исследование задачи на твороге с Ьас1оЪасШик гЬатпокик СНСС12697

Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12697 ЬасЮЪасШик гЬатпокик на виды тисог получали творог:

Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (Ρ-Όνδ СНЫ-19 производства СЬг. Напкеп А/δ, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали НОЬОВАС™ ΥΜ-В (50Си/100Ь) или штаммом СНСС12697 ЬасЮЪасШик гЬатпокик (5х10⁶ Кое/г), и одну партию применяли в качестве контроля и инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 28°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,05. Температура варки составляла около 38-40°С. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.

Через один день после получения творога проводили инокуляцию видами Мисог в виде поверхностных контаминант в чашках с двойной повторностью из пипетки тремя каплями на поверхности творога (100 г) с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 18 дней при 7°С±1°С.

Результат теста на твороге, представленный на фиг. 9, показывает, что виды Мисог хорошо росли на твороге, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой СНЫ-19 (контроль). Плесневые грибы также росли хорошо на твороге, полученном из молока, ферментированного стартовой культурой и культурой НОЬОВАС™ ΥΜ-В и в меньшей степени на твороге, полученном из молока, ферментированного стартовой культурой и культурой НОЬОВАС™ ΥΜ-С. Однако когда штамм СНСС12697 ЬасЮЬасШик гЬатпокик присутствовал во время ферментации молока, наблюдали значительно более заметное ингибирование роста видов Мисог.

Пример 10. Исследование задачи на йогурте с ЬасЮЬасШик гЬатпокик СНСС14226

Для визуальной оценки ингибирующего действия отдельного штамма СНСС14226 ЬасЮЪасЫик гЬатпокик на различных плесневых грибах Р. ЪгеукотрасШт, Р. соттипе, А. уегысо1ог и Р. сгикЮкит получали йогурт с содержанием жира 1,5%

Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5%) пастеризовали при 95°С±1°С в течение 5 мин в бутылях объемом 1 л на водяной бане и немедленно охлаждали. Проводили инокуляцию коммерческой стартовой культурой (Ρ-Όνδ ΥΡ-Ρ901 производства СЬг. Напкеп А/δ, Дания) в количестве 0,02%. Молоко было дополнительно инокулировали с НОЬОВАС™ ΥΜ-В (20ПСи/100Ь) или ЬасФЪасШик гЬатпокик СНСС14226 (1х 10⁷ Кое/мл), и одну бутыль, которая служила контролем, инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 43°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,05. Полученный йогурт выливали в чашки (100 г) и хранили при 7°С±1°С.

Через один день после получения йогурта проводили инокуляцию различными плесневыми грибами в виде поверхностных контаминант на чашках с йогуртом с двойной повторностью по одной капле на поверхности йогурта с содержанием целевой культуры 100 спор/капля. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 45 дней при 7°С±1°С.

Результат теста на йогурте, представленный на фиг. 10, показывает что Р. ЪгеукотрасШш (М1), Р. соттипе (М6), А. уегк1со1ог (Μ7) и Р. сгик1окит (М10) росли хорошо на йогурте, полученном из молока, ферментированного только со стартовой культурой ΥΡ-Ρ901 (верхний ряд) или со стартовой культурой и НОЬОВАС™ ΥΜ-В культура (средний ряд). Напротив, когда ЬасЮЬасШик гЬатпокик СНСС14226 присутствовали во время ферментации молока (нижний ряд), рост всех тестированных плесневых грибов ингибировался.

Пример 11. Количественные определения ингибирующего действия ЬасФЪасЫик рагасаке1 СНСС12777 против К. 1асЬк в твороге

Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12777 ЬасЮЪасП1ик рагасаке1 на К. 1асЬк получали творог.

Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (Ρ-Όνδ СНЫ-19 производства СЬг. Напкеп А/δ, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали с НОЬОВАС™ ΥΜ-В (200Си/100Ь) или штаммом СНСС12777 Ьас1оЬасШик гЬатпокик (5х10⁶

- 14 028377

Кое/г), и одну партию, которую применяли в качестве контроля, инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 28°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,05. Температура варки составляла 38-40°С. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.

На следующий день после получения творога отрезали типовые блоки творога массой приблизительно 10 г и помещали в гомогенизирующие пакеты. Затем блоки инокулировали с двойной повторностью 0,1 мл дрожжевого инокулята с концентрацией 10000 Кое/мл путем впрыскивания дрожжей внутрь творога тонкой иглой. Пакеты оборачивали вокруг творога и запечатывали клейкой лентой.

Образцы хранили при 7°С±1°С и анализированы с подходящим интервалом времени на уровень контаминации К. Ьасйк путем посева в чашки 1 г творога с дополнительным соответствующим 1кратным разведением в солевом пептоне на агаре Уеак1 О1исоке Сй1огашрйешсо1 (УОС) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°С.

Как проиллюстрировано на фиг. 11, рост К. 1асййк ингибировался в присутствии штамма СНСС12777 Ьас1оЬасШик рагасакей когда инокуляцию проводили вместе со стартовой культурой СНЫ-19 перед ферментацией. Штамм СНСС12777 ЙасЮйасШик рагасаке1 вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерческая культура, НОЬОВАС™ ΥΜ-Β.

Пример 12. Количественные определения ингибирующего действия ЬасЮЬасШик гйатпокик СНСС12697 против К. 1асйк в твороге

Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС12697 йасЮЬасП1ик гйатпокик на К. 1асйк получали творог:

Пастеризованное обезжиренное молоко инокулировали коммерческой стартовой культурой (Р-ЭУБ СНЫ-19 производства Сйг. Напкеп А/Б, Дания) в количестве 0,01%. Молоко дополнительно инокулировали с НОЬОВАС™ ΥΜ-Β (5ЭСи/100й) или штаммом СНСС12697 ЬасЮЬасШик гйатпокик (5х10⁶ Кое/г), и одну партию, которую применяли в качестве контроля, инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 28°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,05. Температура варки составляла около 38-40°С. После дренирования творожистый осадок отжимали в течение 30 мин под давлением 1 бар.

Через один день после получения творога отрезали типовые блоки творога массой приблизительно 10 г и помещали в гомогенизирующие пакеты. Затем блоки инокулировали с двойной повторностью 0,1 мл дрожжевого инокулята с концентрацией 10000 Кое/мл путем впрыскивания дрожжей внутрь творога тонкой иглой. Пакеты оборачивали вокруг творога и запечатывали клейкой лентой.

Образцы хранили при 7°С±1°С и анализировали с подходящим интервалом времени на уровень контаминации К. 1асййк путем посева в чашки 1 г творога с дополнительным соответствующим 1 -кратным разведением в солевом пептоне на агаре Υеакΐ О1исоке Сй1огашрйешсо1 (УОС) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°С.

Как проиллюстрировано на фиг. 11, рост К. 1асййк ингибировался в присутствии штамма СНСС12697 йасЮЬасШик гйатпокик, когда проводили инокуляцию вместе со стартовой культурой СНЫ19 перед ферментацией. Штамм вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерческая культура НОЙСВАС ™ ΥΜ-В.

Пример 13. Количественные определения ингибирующего действия ЬасЮЬасШик гйатпокик СНСС14226 против ОеЬагошусек йапкепи в йогурте

Для количественного анализа ингибирующего действия отдельного штамма СНСС14226 йасЮЬасП1ик гйатпокик на Ό. Напкепп получали йогурт следующим образом.

Гомогенизированное молоко (содержание жира 1,5%) пастеризовали при 95°С±1°С в течение 5 мин в бутылях объемом 1 л на водяной бане и затем немедленно охлаждали. Проводили инокуляцию коммерческой стартовой культурой (Р-ЭУБ ΥΡ-Ρ901 производства Сйг. Напкеп А/Б, Дания) в количестве 0,02%. Молоко дополнительно инокулировали с НОЬОВАС™ ΥΜ-В (20ЭСи/100й) или Ьас1оЬасШик гйатпокик СНСС14226 (1х 10⁷ Кое/г), и одну бутыль, которая служила контролем, инокулировали только стартовой культурой.

Молоко ферментировали при 43°С±1°С до тех пор, пока значение рН не достигало 4,60±0,1. Полученный йогурт выливали в чашки (100 г) и хранили при 7°С±1°С.

Через один день после получения йогурта чашки инокулировали с двойной повторностью дрожжами в количестве 1,00 мл/чашка с концентрацией целевой культуры 20 Кое/г. Дрожжи равномерно распределяли в йогурте. Чашки хранили под крышкой при 7°С±1°С и анализировали с подходящим интервалом времени на уровень контаминации Ό. Напкепп путем посева в чашки 1 мл йогурта с дополнительным соответствующим 1-кратным разведением в солевом пептоне на агаре Υеакΐ О1исоке Сй1огашрйешсо1 (ΥΟΟ) с последующей аэробной инкубацией в течение 5 дней при 25°С.

Как проиллюстрировано на фиг. 12, рост Ό. Напкепп ингибировался в присутствии штамма СНСС14226 ЬасЮЬасШик гйатпокик, когда инокуляцию проводили вместе со стартовой культурой ΥΡЬ901 перед ферментацией. Штамм вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерче- 15 028377 ская культура НОЬБВЛС™ ΥΜ-Β.

Депонирование и экспертное решение

Заявитель просит, чтобы образец депонированных микроорганизмов, указанных ниже, мог быть доступным для эксперта только до даты, до которой выдается патент.

Штамм СНСС12697 Ьас1оЬасШик гйатпокик, депонированный 01.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (БеШксйе δатт1иη§ уоп Μ^к^оо^§ап^ктеп ипй /х'ПкиЙигеп ОтЬН; ΌδΜΖ), 1пйоГГепк1г. 7В, Ό-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: ΌδΜ2 4 616.

Штамм СНСС14226 Бас1оЬасШик гйатпокик, депонированный 15.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (БеШксйе δатт1ип§ уоп Μ^к^оо^§ап^ктеп ипй /х'ПкиЙигеп ОтЬН; ΌδΜΖ), 1пйоГГепк1г. 7В, Ό-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: ΌδΜ24652.

Штамм СНСС12777 Бас1оЬасШик рагасакец депонированный 15.03.2011 в немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Оеи1ксйе δатт1иη§ уоп Μ^к^оо^§ап^ктеп ипй Ζе11ки1ΐи^еп ОтЬН; ΌδΜΖ), 1пйоГГепк1г. 7В, Ό-38124, Брауншвейг, с присвоенным номером: ΌδΜ24651.

Депонирования были сделаны согласно Будапештскому соглашению о международном признании депонирования микроорганизмов в целях процедуры выдачи патента.

Ссылки из 2005/0095318 (ЗсНи/епп1пдег е£ а1. ) №0 2004/041305 (УаИо ΙΛά)

ТЬагтага^, Ν. & ЗЬаЬ, Ν.Ρ. (2009) Ап£1т1сгоЫа1 е££ес£з о£ ргоЫоИс Ьас£ег1а ада1пз£ зе1ес£ес1 зресАез о£ уеазкз апс! то10з ίη сЬеезе-Ъазес! сНрз. 1п£егпа£1опа1 Лоигпа1 о£ Γοοά ЗсАепсе & ТесЬпо1оду. 44: 1916-1926.

Claims (9)

1. Противомикробная композиция, включающая по меньшей мере один штамм Еас1оЬасШик гйатпокик и по меньшей мере один штамм Еас1оЬасШик рагасакец в которой по меньшей мере один штамм Еас1оЬасШик гйатпокик выбран из группы, состоящей из Еас1оЬасШик гйатпокик СНСС12697 ΌδΜ24616 и БасЮЬасШик гйатпокик СНСС14226 ΌδΜ24652.

2. Противомикробная композиция по п.1, в которой штамм Еас1оЬасШик рагасаке1 представляет собой БасЮЬасШик рагасаке1 СНСС12777 ΌδΜ24651.

3. Применение противомикробной композиции по любому из предшествующих пунктов для получения пищевого продукта.

4. Пищевой продукт, включающий противомикробную композицию по п.1 или 2.

5. Пищевой продукт по п.4, который выбран из группы, состоящей из фруктов и продуктов, получаемых из фруктов, овощей и продуктов, получаемых из овощей, зерна и продуктов, получаемых из зерна, молочных продуктов, мяса, домашней птицы и морских продуктов и их смесей.

6. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление противомикробной композиции по п. 1 или 2 на любой стадии осуществления данного способа.

7. Способ по п.6, в котором противомикробную композицию по п.1 или 2 добавляют таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Еас1оЬасШик гйатпокик и по меньшей мере одного штамма Еас1оЬасШик рагасаке1 составляла по меньшей мере 1х10⁶ Кое/г, или по меньшей мере 1х10⁶ Кое/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1 х 10⁵ Кое/см² поверхности пищевого продукта.

8. Способ по п.6 или 7, в котором способ включает одну или более стадий ферментации.

9. Штамм Еас1оЬасШик гйатпокик СНСС14226 ΌδΜ24652, используемый для получения противомикробной композиции.