EA028030B1

EA028030B1 - Способ количественного определения биологической активности экстракта пантов

Info

Publication number: EA028030B1
Application number: EA201501156A
Authority: EA
Inventors: Татьяна Анатольевна Харлампович; Оксана Александровна Шмакова
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Эвалар"
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2017-09-29
Also published as: EA201501156A1

Abstract

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для количественного определения биологической активности экстракта пантов и препаратов на его основе. Способ включает подготовку испытуемого образца и его последующее взаимодействие с холинэстеразой, причём реакционная смесь дополнительно содержит хромоген и фосфатный буфер, при этом параллельно готовят контрольную реакционную смесь, не содержащую испытуемый образец, обе реакционные смеси одновременно инкубируют, добавляют по меньшей мере через 20 мин тиохолиновый субстрат и одновременно регистрируют изменение оптической плотности в обеих реакционных смесях. Биологическую активность экстракта пантов определяют по степени ингибирования холинэстеразы, которую вычисляют по формулегде ΔА1 - изменение оптической плотности реакционной смеси, содержащей пробу испытуемого образца; ΔА2 - изменение оптической плотности реакционной смеси, не содержащей пробу испытуемого образца.

Description

Изобретение относится к области биохимии и аналитической химии и может быть использовано для количественного определения биологической активности экстракта пантов и препаратов на его основе.

Панты - молодые, неокостеневшие рога изюбра, марала, пятнистого и северного оленей. Экстракт пантов является адаптогеном широкого спектра действия. Он оказывает тонизирующее влияние на центральную нервную систему, сердечно-сосудистую систему, желудочно-кишечный тракт, скелетную мускулатуру, повышает работоспособность при переутомлении, нормализует артериальное давление при артериальной гипотензии.

Основные современные способы получения экстракта пантов основаны на извлечении биологически активных веществ пантов марала, изюбра, пятнистого и северного оленя из измельченного сырья различными экстрагентами (вода, спирт и т.д.) с последующим удалением растворителя или использованием продукта в жидком виде.

Действующим началом экстракта пантов является комплекс биологически активных веществ (БАВ) - липидов, аминокислот, оснований нуклеиновых кислот, пептидов, микроэлементов, витаминов, азотистых оснований, энзимов, гормоноподобных веществ, чем и обусловлены специфические фармакологические свойства экстракта.

Основной проблемой количественного определения биологической активности экстракта пантов является широкий спектр содержащихся в экстракте БАВ и широкий диапазон их концентраций вследствие разного происхождения биологического сырья, разных способов получения экстрактов. Это объясняет отсутствие стандартного образца экстракта пантов и в значительной мере осложняет стандартизацию препаратов.

Современные физико-химические способы исследования экстракта пантов (пантокрина) с помощью аппаратных методов (ВЭЖХ, спектральный анализ, атомно-абсорбционный анализ и др.) показывают содержание основных групп биологически активных веществ, содержащихся в исходном сырье.

Общим недостатком всех физико-химических методов является то, что на сегодняшний день не установлены индивидуальные вещества или группы веществ, количественное содержание которых могло быть объективным критерием биологической активности экстракта пантов (пантокрина).

К биологическим способам определения биологической активности экстракта пантов относят методы с использованием животных.

Из патента КИ 2045269 известно определение биологической активности пантокрина путем исследования его влияния на течение иммобилизационного стресса у крыс.

Известен способ определения биологической активности пантов и экстракта пантов на модели предельного плавания крыс (Земцова Н.П., Зверев Я.Ф., Турецкова В.Ф. Сравнительная общетонизирующая активность измельченных пантов марала).

Единственным фармакопейным методом был и остается биологический тест контроля активности препарата Пантокрин в соответствии с требованиями фармакопейной статьи ФС 42-2323-85. Биологическая активность проверяется по снижению артериального давления у наркотизированных кроликов после внутривенного введения пантокрина. Препарат считают активным, если испытуемый раствор пантокрина вызывает снижение артериального давления у трех животных из пяти для препаратов из пантов марала не менее чем на 25% от исходного уровня, а для препаратов из пантов пятнистого оленя - не менее чем на 30%.

Основным недостатком известных биологических методов определения биологической активности экстракта пантов, помимо биоэтического аспекта, является низкая воспроизводимость результатов теста из-за высокой вариабельности факторов, связанных с индивидуальными особенностями животных, которые даже при стандартизированном содержании обладают различной чувствительностью к препарату.

Широкий спектр БАВ, содержащихся в пантовом экстракте, и широкий диапазон их концентраций вследствие разного происхождения биологического сырья, разных способов получения экстрактов является основной проблемой, которая до сих пор не позволила найти единый аппаратный способ количественного определения биологической активности экстракта пантов.

Из клинической практики известно свойство фермента холинэстеразы ферментативно гидролизовать тиохолиновый субстрат с последующим изменением окраски реакционного раствора, содержащего хромоген. На этом свойстве основан ряд способов определения активности холинэстеразы в крови, в других жидкостях (способ Хестрина, способ Эллмана, 8И 1668949, §И 1728770). Известные способы предназначены для диагностики, для определения степени тяжести заболевания или степени загрязнения вредными химическими веществами.

Из уровня техники не известно применение биохимического способа определения биологической активности экстракта пантов по степени ингибирования холинэстеразы.

Недостатками известных биохимических способов является то, что они предназначены для других целей, их стандартные условия не обеспечивают полноту реакции ингибирования холинэстеразы экстрактом пантов.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа количественной оценки биологической активности экстракта пантов, исключающего недостатки известных способов, снижающего

- 1 028030 риск возникновения ложных результатов.

Авторы впервые биохимическим методом экспериментально установили факт ингибирования холинэстеразы веществами, содержащимися в экстракте пантов, опираясь на холинергические процессы, протекающие при проведении биологических тестов на кроликах.

Технический результат: создание биохимического способа количественного определения биологической активности экстракта пантов, основанного на оценке степени ингибирования холинэстеразы, с параметрами, обеспечивающими специфичность, воспроизводимость и линейность в рабочем диапазоне.

Поставленная задача достигается предложенным способом количественного определения биологической активности экстракта пантов, который включает подготовку испытуемого образца при температуре не выше 50°С, при упаривании образца от 10 до 20% первоначального объема и его последующее взаимодействие с холинэстеразой, причем реакция проходит в среде буфера в присутствии хромогена. При этом дополнительно параллельно готовят контрольную реакционную смесь, не содержащую испытуемый образец, обе реакционные смеси одновременно инкубируют, добавляют по меньшей мере через 20 мин тиохолиновый субстрат и одновременно регистрируют изменение оптической плотности в обеих реакционных смесях, причем активность экстракта пантов определяют по степени ингибирования холинэстеразы по формуле

100 · ΔΑ1

X = ЮО------------------ΔΑ2 где ΔΑ1 - изменение оптической плотности реакционной смеси, содержащей пробу испытуемого образца;

ΔΑ2 - изменение оптической плотности реакционной смеси, не содержащей пробу испытуемого образца.

При этом в качестве хромогена используют гексацианоферрат (ΙΙΙ+), а в качестве тиохолинового субстрата используют бутирилтиохолин.

Способ характеризуется тем, что холинэстераза катализирует гидролиз бутирилтиохолина до масляной кислоты и тиохолина. Тиохолин в свою очередь восстанавливает окрашенный калия гексацианоферрат (ΙΙΙ+) до бесцветного калия гексацианоферрата (ΙΙ+). Результатом данного процесса является снижение оптической плотности (фиг. 1).

Введение в реакционную среду прошедшего пробоподготовку образца экстракта пантов приводит к ингибированию каталитической активности холинэстеразы и замедлению скорости реакции гидролиза бутирилтиохолина. Результатом является статистически значимое замедление снижения оптической плотности (фиг. 2).

Величину оптической плотности регистрируют двухточечным способом на линейном участке кинетической кривой. Скорость снижения оптической плотности при 405 нм пропорциональна активности холинэстеразы (ΔΑ₂).

Более подробно способ описан с помощью не ограничивающего изобретение примера его реализации.

Способ осуществляют с использованием реагентов, имеющихся в продаже. В качестве субстрата выбран тиохолиновый эфир карбоновой кислоты - бутирилтиохолин. В качестве хромогена гексациано - (ΙΙΙ+) - феррат калия. В качестве буфера - пирофосфатный буфер рН 7,6 (37°С). Используют сывороточную холинэсретазу с активностью, соответствующей нормальным величинам, например 1 .κμικί 120.

Анализ проводят на известном оборудовании, обеспечивающем одновременное проведение анализа и фиксирование данных двух реакционных смесей: содержащей и не содержащей пробу экстракта пантокрина. Например, двухлучевой спектрофотометр, оснащенный многокюветным держателем, с функцией термостатирования кювет.

При реализации заявленного способа берут от 20 мл экстракта пантокрина жидкого или извлечения из экстракта пантокрина сухого. Упаривают на роторном испарителе при температуре бани 4±5°С до объема около 3-4 мл. Остаток после упаривания переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят водой до метки (раствор испытуемого образца).

В две кюветы с толщиной слоя 10 мм помещают магнитные мешалки, устанавливают в многокюветный держатель спектрофотометра и нагревают до температуры 37±0,1°С.

В первую кювету помещают 1,0 мл раствора испытуемого образца, во вторую 1,0 мл воды, в каждую кювету прибавляют по 0,04 мл раствора холинэстеразы, 2,0 мл 2,5 ммоль/л раствора калия гексацианоферрата (ΙΙΙ) в 92 ммоль/л пирофосфатном буфере рН 7,6 (37°С) и ровно через 30 мин прибавляют по 0,4 мл 91 ммоль/л раствора бутирилтиохолина предварительно нагретого до 37°С. Одновременно измеряют оптическую плотность реакционной смеси в первой и второй кювете при длине волны 405 нм в режиме кинетика точно в интервале между второй и четвертой минутами от старта реакции. Степень ингибирования (X, %) вычисляют как разницу между 100% ингибированием и остаточной активностью холинэстеразы по формуле

- 2 028030

100 ΔΑ1

Χ = ιοο------------------ΔΑ2 где ΔΑ1 - изменение оптической плотности реакционной смеси, содержащей пробу испытуемого образца;

ΔΑ2 - изменение оптической плотности реакционной смеси, содержащей пробу воды.

Рабочие параметры способа разработаны с учётом биологических особенностей экстракта пантов и подтверждены экспериментально.

Образец концентрируют вакуумной отгонкой при низкой температуре, позволяющей сохранить свойства пробы.

Установлено, что время взаимодействия экстракта пантов с холинэстеразой, необходимое для наиболее полного ингибирования фермента, составляет по меньшей мере около 20 мин. Оптимальное время инкубации реакционной смеси до момента прибавления субстрата составляет 30 мин - это время, необходимое для выхода показателя степени ингибирования фермента на стабильный уровень, что позволяет получать максимально воспроизводимые результаты. Инкубировать более 30 мин нецелесообразно (фиг. 3).

Анализ контрольного раствора и раствора с образцом препарата выполняют одновременно. Постановка эксперимента в таких условиях исключает влияние небольших изменений внешних факторов на результат.

Выбран отрезок времени, на котором снижение оптической плотности протекает линейно как для контрольного раствора, так и для раствора с испытуемым образцом, обладающим активностью в заданном диапазоне методики. Границы временного диапазона исключают период, во время которого концентрация промежуточных соединений только выходит на стационарный уровень, и включают в себя стационарный участок, на котором принято измерять скорость ферментативных реакций, когда кинетика процесса характеризуется постоянным уровнем концентраций промежуточных соединений (фиг. 4).

На основании изучения линейности и воспроизводимости установлено, что степень ингибирования холинэстеразы экстрактом пантов можно количественно определять в диапазоне от 10 до 80 % (фиг. 5, таблица).

Κ8Ό результатов определения на разных уровнях установленного диапазона

! V, мл	35	30	25	20	15	10	5
Степень	77,4	67,1	57,3	45,6	34,9	21,2	9,9
ингибирования	76,3	69,5	59,2	44,6	35,2	22,2	11,2
Х,%	74,1	68,2	56,3	43,1	36,8	19,5	12,0
Хер, %	75,9	68,3	57,6	44,4	35,6	21,0	11,0
Κδϋ, %	5,6	2,9	4,3	3,2	2,1	3,7	9,6

Таким образом, создан количественный способ определения биологической активности экстракта пантов, основанный на определении степени ингибирования холинэстеразы, обеспечивающий специфичность, точность, воспроизводимость и линейность анализа. Полученные количественные характеристики экстракта пантов создают возможность контролировать выпуск лекарственных препаратов высокого качества, не утративших в процессе технологической обработки природные достоинства сырья.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ количественного определения биологической активности экстракта пантов, заключающийся в том, что готовят реакционную смесь, содержащую испытуемый образец, и параллельно контрольную реакционную смесь, не содержащую испытуемый образец, в обе смеси вводят раствор холинэстеразы, хромоген и фосфатный буфер, одновременно инкубируют, добавляют по меньшей мере через 20 мин тиохолиновый субстрат и одновременно измеряют оптическую плотность обеих смесей, затем определяют активность экстракта пантов (X, %) по формуле

100 · ΔΑ1

Х,% =100...................

ΔΑ2 где ΔΑ1 - изменение оптической плотности реакционной смеси, содержащей пробу испытуемого образца;

ΔΑ2 - изменение оптической плотности реакционной смеси, не содержащей пробу испытуемого образца.
2. Способ по п.1, где подготовка испытуемого образца предусматривает упаривание от 10 до 20% первоначального объема при температуре не выше 50°С.
3. Способ по п.1, где в качестве хромогена используют гексацианоферрат (ΙΙΙ+).

4. Способ по п.1, где в качестве тиохолинового субстрата используют бутирилтиохолин.

- 3 028030

График снижения оптической плотности при взаимодействии холинэстеразы с субстратом бутирилтиохолина

График снижения оптической плотности при взаимодействии холинэстеразы с субстратом бутирилтиохолина в присутствии экстракта пантов

График зависимости степени ингибирования от времени взаимодействия ингибитора с холинэстеразой * 20

V о

ГО 15 20 25 30 35

Время ингибирования, мин

Фиг. 3

- 4 028030

График изменения оптической плотности во времени

1,8 у = -0,033 5х+ 1,5504 1,6 К⁵ = 0,9989 1,4 .. ~-ф------ф 1,2 1 ®....._β » -В--Н у = -0,0498х+ 1,3266 0,8 К^г = 0,9999 0,6 од 0,2 0 0 12 3 4 Время, мин *αι

Фиг. 4

График зависимости степени ингибирования от объема препарата