EA027649B1

EA027649B1 - Штамм pasteuria sp. для защиты сельскохозяйственных культур от нематод, композиция и способ защиты сельскохозяйственных культур от нематод

Info

Publication number: EA027649B1
Application number: EA201101019A
Authority: EA
Inventors: Томас Э. Хьюлетт; Джон П. Уотерс
Original assignee: Зингента Кроп Протекшн Аг
Priority date: 2009-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2017-08-31
Also published as: WO2010085795A2; BRPI1006992B1; PL2389434T3; BRPI1006992A2; AR075165A1; EP2389434A2; ES2548993T3; AU2010206533A1; AU2010206533B2; CN102317434A; US20100189693A1; EA201101019A1; EP2389434B1; US8652490B2; WO2010085795A3; DK2389434T3; EP2389434A4

Abstract

Данное изобретение предлагает новый и улучшенный штамм бактерии Pasteuria sp. ATCC PTA-9643 для защиты сельскохозяйственных культур от нематод или его мутант или вариант. Также предлагаются нематоцидные композиции, содержащие штамм Pasteuria sp. или его мутант или вариант, и способ защиты сельскохозяйственных культур от нематод, живущих в почве.

Description

Почковидная нематода, также известная как Ко1у1епсйи1ик гешГогпик. является экономически значимым видом в роду Ро1у1епс1ш1ик. Самки почковидной нематоды наносят значительный ущерб корневой системе растений, т.к. они живут практически внутри корней. Термин почковидная относится к телу зрелых самок, которое имеет форму почки. Почковидные нематоды также делают растения более восприимчивыми к другим организмам, которые вызывают болезни.

Почковидные нематоды паразитируют на корнях целого ряда растений, включая хлопок, вигну китайскую, батат, соевые бобы, ананасы, чай, и различные овощи, такие как томаты, бамия, тыква и латук. Патогенность почковидных нематод нанесла значительный ущерб сельскому хозяйству. Например, они привели к 40-60% снижению урожая хлопка в Луизиане наряду с увеличением увядания от Рикагшт.

Фумигация земли перед посевом является популярным способом борьбы с нематодами. Один из наиболее популярных фумигантов - метилбромид признали предназначенным к удалению из употребления из-за его способности разрушать озон. Кроме того, такая практика фумигации земли полностью убивает все организмы в почве и имеет риск к уничтожению полезных микробов вместе с болезнетворными организмами. Общий рынок для эффективного нематоцида с положительными эффектами для окружающей среды по оценкам приближается во всем мире к одному млрд. долларов.

Рак1еиг1а впервые описал Мечников в 1888 (Аппа1ек бе 1'1п8Йи1 Рак1еиг 2:165-170) как паразита водяных блох. Позднее Кобб (СоЬЬ) описал заражение Рак1еиг1а нематоды Оогу1аппик Ьи1ЫГегоик (2^пб еб. На\\аиап §идаг Р1ап1егк Аккос., Εχρΐ. §1а. Όίν. Ра1й. РЬу8ю1. Ви11. 5:163-195, 1906).

Жизненный цикл бактерий начинается, когда эндоспоры прилипают к оболочке нематод в земле. Райешта размножается в теле нематоды и проходят несколько задокументированных морфологических фаз, включая мицелиальные структуры и талии, а кульминацией является развитие новых эндоспор. Эндоспоры высвобождаются, когда тело нематоды распадается.

Рост бактерий внутри нематоды уменьшает или исключает продуцирование яиц нематодой, что существенно ограничивает скорость репродукции нематод. Экономический убыток для урожая обычно наносится первым потомством нематод и упреждается благодаря РакЮнпа. которая снижает концентрацию потомства нематод в зоне корневой системы растений.

Хотя штаммы РакЮнпа продуцировали на различных видах нематод, таких как Ме1о1бо§упе шсодпйа (Уегбейо, 8. апб К. Мапкаи. 1986. 1оита1 оГ №та1о1оду. 18:635) и Мейободупе агепапа (патент США № 6,919,197), штамм Рак1ешта до настоящего времени не наблюдали и не культивировали на почковидных нематодах.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение предлагает выделенный штамм РаМешта кр. АТСС РТА-9643 для защиты сельскохозяйственных культур от нематод или его мутант или вариант, содержащий полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% одной из последовательностей 8ΕΟ ГО ΝΟκ: 1-4. Этот новый и усовершенствованный штамм бактерий РакЮнпа кр., которые паразитируют на почковидных нематодах, и был депонирован в Американской Коллекции Типов Культур (Атепсап Туре Си11иге СоИесбоп) и ему был присвоен номер АТСС РТА-9643.

Эти бактерии способны продуцировать эндоспоры, которые обладают уникальным и полезным свойством прикрепляться к, инфицировать, врастать, вновь продуцировать споры и уничтожать почковидные нематоды и другие фитопатогенные нематоды.

Мутант описанного штамма РакЮнпа кр. также обладает в основном такими же или улучшенными нематоцидными свойствами. Методики продуцирования мутантов хорошо известны в области микробиологии. Например, для этого широко используют ультрафиолетовый свет и нитрозогуанидин.

Варианты описанного штамма Рак1еипа кр. можно идентифицировать при помощи, например, полинуклеотидных последовательностей, более высоко гомологичных по сравнению с последовательностями

- 1 027649 от изолята, для которого приведен пример, а также тем, что имеет место требуемая биологическая активность против почковидных нематод.

Данное изобретение также включает композиции, которые содержат нематоцидно эффективное количество описанного штамма бактерий Рабсила и пригодный для использования в сельском хозяйстве носитель, и используются для борьбы с фитопатогенными нематодами.

Данное изобретение также относится к способу защиты сельскохозяйственных культур от нематод, включающему приведение нематод в контакт с нематоцидно эффективным количеством штамма Рабсила 8р.

При этом семя растения сперва обрабатывают прилипателем, которые может прилипать к спорам Ра81сипа 8р. и/или композиций, содержащей споры. Прилипатель может представлять собой, например, клей и/или один или более полимеров или сополимеров. Примеры прилипателей включают, но не ограничиваясь этим, клеи (такие как клей ЕЬМЕК.8 ); поливинилацетаты; силиконовые материалы; и природные неорганические материалы, такие как силикагель и глину.

Кроме того, по крайней мере часть поверхности семени покрывают композицией Ра81сипа 8р., при этом композиция Ра81сипа 8р. содержит эффективное количество спор Ра81сипа 8р. для борьбы с нематодами.

Краткое описание последовательностей

8ЕО ГО N0:1 представляет собой частичную последовательность 168 τΌΝΆ бактерии в соответствии с одним из вариантов изобретения.

8Е0 ГО N0:2 представляет собой частичную последовательность 8ро11АВ бактерии в соответствии с одним из вариантов изобретения.

8Е0 ГО N0:3 представляет собой частичную последовательность а1рА бактерии в соответствии с одним из вариантов изобретения.

8Е0 ГО N0:4 представляет собой частичную последовательность а1рЕ бактерии в соответствии с одним из вариантов изобретения.

Подробное описание

Новый бактериальный штамм данного изобретения обладает нематоцидной активностью против фитопатогенных нематод, включая почковидные нематоды. Культура микроба была депонирована в Американской Коллекции Типов Культур (АТСС), 10801 Ишуегейу Βίνά., Мапа88а8, Уа. 20110-2209 И8А. Депонированному штамму в хранилище был присвоен порядковый номер АТСС N0. РТА-9643 и депонирование имело место 4 декабря 2008 г.

Данная культура была депонирована в условиях, обеспечивающих доступ к культуре в период действия данной патентной заявки для лица, определенного уполномоченным по патентам и товарным знакам в соответствии с 37 СЕК 1.14 и 35 И.8.С 122. Депозит доступен, как требуется по патентным законам стран, в которых поданы аналоги данной заявки или ее продолжение. Однако следует понимать, что доступность депозита не означает лицензию на практическое использование данного изобретения в нарушение патентных прав, наделенных правительственным действием.

Кроме того, данный депозит культуры будет храниться и быть доступным для общественности в соответствии с положениями Будапештского Договора о Депонировании Микроорганизмов, т.е. он будет храниться со всеми мерами предосторожности для сохранения его живучести и предохранения от загрязнения на протяжении по меньшей мере пяти лет от самого последнего запроса на предоставление образца депозита в любом случае на протяжение по меньшей мере 30 (тридцати) лет после даты депонирования или периода жизни любого патента, который может быть выдан, описывающего эту культуру. Депозитарий подтверждает обязательство заменить депозит, если депозитарий будет неспособен предоставить образец, когда его запросят, из-за состояния депозита. Все ограничения на доступ общественности к депозиту данной культуры будут немедленно сняты при выдаче патента, описывающего ее.

Как использовано здесь, ссылка на изолированный означает, что штамм удален из среды, в которой он существует в природе. Таким образом, изолированный штамм может существовать как, например, биологически чистая культура или, как споры (или другие формы штамм) в сочетании с сельскохозяйственным носителем.

Как использовано здесь, термин включающий дополнительно охватывает сценарии, в которых композиция и/или способ состоит из или состоит в основном из перечисленных компонентов и/или стадий. Как использовано здесь, ссылка на состоит в основном из относится к ситуации, где дополнительные компоненты и/или стадии являются только теми, которые не оказывают влияния на пестицидную активность композиции и/или способа.

Нематоцидно эффективное количество, как использовано здесь, относится к количеству спор Ра81сипа 8р., способных уничтожать, бороться, или инфицировать нематоды; задерживать рост или репродукцию нематод; уменьшать популяцию нематод; и/или уменьшать ущерб, который нематоды наносят растениям.

В конкретных вариантах воплощения данное изобретение предлагает бактериальный штамм АТСС РТА-9643 и его мутанты. Методики продуцирования мутантов хорошо известны в области микробиологии. Например, для этого широко используют ультрафиолетовый свет и нитрозогуанидин.

- 2 027649

Данный штамм проверен и является новым штаммом РахЮипа 8р. §ЕЦ ГО N08:1-4 являются полинуклеотидными последовательностями определенных генов бактерии данного изобретения.

В других аспектах изобретение предлагает варианты АТСС РТА-9643, которые обладают нематоцидной активностью. В одном из вариантов воплощения вариант имеет полинуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с высокой жесткостью по меньшей мере с одной, лучше, 2, 3, или всеми 4 §ЕЦ ГО N0: 1-4.

Г ибридизация относится к реакции, в которой один или более полинуклеотидов вступают в реакцию с образованием комплекса, который стабилизируется через водородную связь между определенным пурином и определенным пиримидином в двухцепочечных молекулах нуклеиновой кислоты (ΌΝΑ-ΌΝΑ, ΌΝΑ-ΡΝΑ, или ΡΝΑ-ΡΝΑ). Главными специфичными конъюгациями являются гуанин с цитозином и аденин с тимином или урацилом. Могут быть использованы гибридизация с различной степенью жесткости. Чем более жесткими являются условия, тем большей является комплементарность, которая требуется для образования дуплексов. Жесткость условий можно контролировать температурой, концентрацией зонда, длиной зонда, ионной длиной, временем и т.д.

Предпочтительно проводить гибридизацию, используя условия высокой жесткости при помощи методик, которые хорошо известны в данной области, как описанные, например, в Ке11ег, О.Н. & М.М. Мапак, ΌΝΑ РгоЬе8, и сопутствующем томе ΌΝΑ РгоЬе8: Васкдгоии', ΑρρΙίοαΙίοηδ, Ргосе'иге8 (различные издания, включая 2^й'¹ Е'йЮи, №!иге РиЬЙ8Ыи§ Огоир, 1993). Гибридизация также широко описана в справочниках по молекулярному клонированию, изданных издательством Со1' 8ргш§ НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88, включая ЗатЬгоок & Ри88е11, Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬогаЮгу Маииа1 (2001). Каждая из этих публикаций включена шляхом ссылки на ее содержание.

Не ограничивающий пример условий высокой жесткости для гибридизации является по меньшей мере приблизительно 6Х §§С и 1% δΌδ при 65°С, с первой промывкой в течение 10 мин при приблизительно 42°С приблизительно 20% (об./об.) формамидом в 0,1Х §§С, и с последующей промывкой 0,2Х 88С и 0,1% δΌδ при 65°С. Неограничительный пример условий гибридизации являются условия, выбранные таким образом, что они являются приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25°С, ниже термической точек плавления (Т_т) для специфичной последовательности в определенном растворе. Т_т является температурой (зависящей от ионной силы и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется до идеально гармоничного зонда. Т_тобычно увеличивается с концентрацией [№+], т.к. катионы натрия электростатически экранируют анионные фосфатные группы нуклеотидов и минимизируют их отталкивание. Использованные промывки можно проводить в течение приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, или более минут каждая и жесткость при необходимости может увеличиваться.

Расчеты для определения Т_т хорошо известны в данной области. Например, температуру плавления можно описать при помощи наведенной ниже формулы (ВеПх, Ο.Α., Κ.Α. 1асоЬ8, Т.Н. ЕЮкЬшй, Р.Т. СйегЬа8, аи' Р.С. Ка1аЮ8, Ме1йо'8 о! Еп/уто1о8у. Р. \Уи. Ь. Ого88тап аи' К. Мо1'ауе [е'8.] Αсаάет^с Рге88, \еи Уогк 100:266-285, 1983).

Т_т = 81,5°С + 16,6 Ьод[№+] + 0,41(%О+С) - 0,61(%формамид) - 600/длина дуплекса в базовых парах.

Более точный расчет Тт можно получить, используя ближайшие модели. Вге81аиег, е! а1., Ргос. №11 Αсаά. δα. υδΑ, 83:3746-3750 (1986); δаиίа^ис^а, Ргос. Νη!1 Αсаа. бс1. υδΑ, 95: 1460-1465 (1998); Α11ηΜ & δΗΛο^^, ВЮсйет181гу 36:10581-94 (1997); δид^тοЮ е! а1., Νϋ^κ Αα'8 Ре8., 24:4501-4505 (1996). Т_тможно также измерить рутинно при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии ГОидщ' е! а1., ВЮрйу8 1, 71:3350-60, 1996) в выбранном растворе, или посредством других методов, известных в данной области, таких как УФ-плавление с мониторингом. При увеличении жесткости условий гибридизации получают боле высокие степени гомологии.

Обычные способы, которые могут быть использованы для идентификации присутствия последовательности ДНК, как описано здесь, включают, но не ограничиваясь этим, определение гибридизации специфичной последовательности ДНК, используя специфичные олигонуклеотиды, прямое программирование ДНК, гидролизат рестрикционного фермента, защиту РНКазы, химическое расщепление, и детектирование, опосредствованное лигазой.

Как пример варианта ΑТСС РТΑ-9643 является штамм, содержащий полинуклеотид, имеющий выше, чем 85, 90, 95, 98 или 99% идентичность последовательностей относительно какой-либо или всех из δΙΤ) ГО Ν0δ:1-4.

Кристаллическая структура Р1-Αΐра8е описана δΡκΙ^Γ е! а1., δΙπκΙιιΐΌ 15(8):904-914 (2007) и функцию Р1-Αίра8е интенсивно изучали. См., например, МесЬашса11у 'птеи ΑТР 8уи!йе818 Ьу Р1-Αίра8е, №!иге 427(6973):407-8 (2004), а также ссылки, которые там приведены. В некоторые вариантах воплощения изобретения вариантные последовательности 3ψΑ кодируют полипептид, который удерживает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, или все из отличий δερ ГО Ν0:4 относительно соответствующей части ΝΟΕΙ д1 93007315 из Ра8!ешта гато8а.

Протеин 8рοIIΑВ представляет собой анти-сигма фактор. Оиисаи & Ьо81ск, Ргос №Ш Αсаά δα υδΑ, 90(6): 2325-2329 (1993). Целый ряд кристаллических структур является доступным. Ма8и'а е! а1., 1 Мо1

- 3 027649

ΒίοΙ, 340(5): 941-956 (2004); СатрЬе11 е! а1., Се11, 108(6):795-807 (2002). В некоторых вариантах воплощения вариантные последовательности зроПЛВ кодируют полипептид, который удерживает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, или все из отличий ЗЕР ГО N0:2 относительно соответствующей части NСΒI §ί 30173229 из Раз!еипа репе!гапз и/или NСΒI §ί 93007308 из Раз!еипа гатоза.

Структурные и функциональные данные для субъединицы Ь синтазы Е.сой АТР дают, например, 1)е1 Κΐζζο е! а1., I Μο1 Βΐο1, 364(4):735-46 (2006); и С1адде!! е! а1., I Вас1ейо1, 189(15):5463-5471 (2007). В некоторые вариантах воплощения изобретения вариантные последовательности а!рЕ кодируют полипептид, который удерживает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, или все отличия из ЗЕР ГО N0:3 относительно соответствующих частей NСΒI д1 41019057 из Раз!еипа репе!гапз и/или NСΒI д1 93007313 из Раз!еипа ^атο8а.

В некоторых вариантах воплощения изобретения штаммы Раз!еипа репе!гапз, которые паразитируют на почковидных нематодах, представляют собой те штаммы Раз!еипа, которые филогенетически ближе относятся к АТСС РТА-9643, чем к любому штамму известному в данное время штамму Ра8!еийа (или, альтернативно, ближе относятся к АТСС РТА-9643, чем к любому известному штамму Раз!еипа репе!гап8, который паразитирует на не почковидных нематодах), как определено рутинным анализом 16з рибосомных последовательностей. Ряд инструментов и данных пригодных для анализа 16з ΓϋΝΆ известны в данной области. Следующие номера по возрастанию предоставленные NСΒI В1аз! базой данных пг дают 16з рибосомных последовательностей со ссылкой на NСΒI д1 номер:

157357381; 145690675; 55168340; 215499254; 29169172; 197777542; 153816650; 189353846; 154483090; 27360487;

153816533; 27359371; 10039641; 153816651; 153813776; 169191254; 77959837;

223489039; 224155181; 197766214; 197782632; 223475320; 165924309; 225111262;

50363539; 169189407; 119632772; 167630417; 147836457; 321193; 47570202; 229499565;

29565682; 5531888; 27360062; 197763227; 121592110; 227495267; 3256603; 197781048; 154500167; 154500794; 150251526; 197735635; 153813782; 167425567; 212632978; 15921449; 218151942; 163781875; 169869672; 78033426; 157354103; 40062645; 115762746; 83595848; 196018328; 115379816; 1780806; 198417694; 154500170;

108707408; 224033543; 223947683; 226443382; 237831283; 195614328; 194703406; 212274346; 149633895; 118086080; 119178984; 74007189; 197768010; 191162148;

219461701; 169213810; 167630416; 19927; 196018322; 182701819; 156341374;

115467400; 126433538; 119190145; 56422945; 50545958; 223466311; 212507121;

197762411; 169194840; 192291641; 152012802; 3831447; 67903352; 3256604; 171686416; 158294661; 154273901; 119720343.

В некоторых вариантах воплощения изобретения вариантные последовательности 6з гДНК кодируют РНК, которая удерживает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, или все отличия относительно одной или более (или любой комбинации) из 16з гДНК последовательностей, указанных в данном абзаце. В некоторых вариантах воплощения 16з гДНК последовательностей, установленных числом NСΒI д1 в этом абзаце могут быть исключены из заявленного изобретения.

Большие количества этих бактерий могут быть продуцированы с использованием методик ферментации. Споруляция происходит из стадии поздней вегетативной фазы бактерий с получением зрелых, находящихся в состоянии спячки спор. Эндоспоры Раз!еипа не повреждаются при высушивании. Таким образом, их можно хранить в течение продолжительных периодов при комнатной температуре.

Способы выращивания Раз!еипа известны в данной области и включают, например, способы, описанные в патентах США № 5,094,954 и 7,067,299, которые оба включены путем ссылки на их содержание.

Данное изобретение предлагает композиции бактериальных эндоспор, которые являются полезными для борьбы с паразитами. Конкретными примерами являются композиции эндоспор бактерий, которые являются патогенными по отношению к нематодам и растут в или на живых тканях нематод.

Эндоспоры можно формовать в смачиваемый порошок, жидкий концентрат, гранулы или композиции путем добавления поверхностно-активных веществ, диспергаторов, инертных носителей и других компонентов для получения нематоцидной композиции, которые облегчают обработку и применение для определенных целевых нематод.

Препарат для коммерческого применения должен иметь высокую концентрацию эндоспор, обычно выше 1 χ 10⁷ спор/мл и лучше - выше 1 χ 10⁹ спор на мл или грамм сухого продукта.

Композиция может также включать один или больше следующих ингредиентов: другие пестициды,

- 4 027649 включая соединения, которые действуют только ниже уровня земли; фунгициды, такие как каптан, тирам, металаксил, флюдиоксонил, оксадиксил и изомеры каждого из этих материалов и т.п.; гербициды, включая соединения, выбранные из карбаматов, тиокарбаматов, ацетамидов, тиазинов, динитроаналинов, эфиров глицерина, пиридазинонов, урацилов, фенокси, мочевин и бензойных кислот; гербицидных антидотов, таких как бензоксанин, производные бензгидрила, Ν,Ν-диалил дихлорацетамид, различные дигалоацилы, соединения оксазолидинила и тиазолидинила, этанон, соединения нафталинового ангидрида и производные оксима; удобрения; и средства биологического контроля, такие как другие природные или рекомбинантные бактерии или грибки из рода КЫ/оЬинп. ВасШиз, Рзсиботоиаз, 8сггаба, Тпсйобсииа, О1отиз, О1юс1абшт и микоризные грибки.

Методики формования и применения хорошо известны в данной области и их используют с коммерческими штаммами РазЮнпа. Нематоцидную композицию можно распылять или наносить на лиственную систему для борьбы с фитопатогенными нематодами.

Другой подход, который можно принять, заключается в том, что эндоспоры включают в гранулы, необязательно содержащие аттрактант, и эти гранулы наносят на почву для борьбы с нематодами, обитающими в почве. Обычно при контакте с водой споры высвобождаются из гранул с затем споры прилипают к и инфицируют нематоды. Споры в составе композиций можно также наносить как покрытие для семян для обработки корней или обработки всего растения.

Количество нанесенных эндоспор должно быть нематоцидно эффективным. В одном варианте воплощения для эффективной борьбы с нематодами количество эндоспор составляет менее одной кварты эндоспор на акр.

Лучше, когда композиции можно легко наносить при помощи обычного оборудования для нанесения. Способ действия эндоспоры делает развитие стойкости к их действию маловероятным. Большинство из доступных нематоцидов следует наносить перед высеванием, так как химикаты могут иным способом повредить растения. В отличие от этого штамм РазЮнпа не наносит вред растениям и его можно наносить в любое время.

В другом аспекте изобретение предлагает семена, обработанные данной композиций РазЮнпа зр. В одном варианте предлагаются семена, по меньшей мере часть поверхности которых покрыта композицией РазЮшла зр.. В конкретном варианте воплощения семена, обработанные РазЮшла зр., где концентрация спор составляет от приблизительно 10 до приблизительно 10 спор на семя. Семена могут также иметь больше спор на семя, как например, 1х 10¹⁰, 1 χ 10¹¹ или 1 χ 10¹² спор на семя.

Материалы и способы данного изобретения могут быть использованы для уменьшения ущерба растениям, включая, но не ограничиваясь этим, зеленый горошек, дерновые злаки, бататы, томаты, хлопок, кукуруза, соевые бобы, окру, салат-латук, тыкву, овощи, ананас, чай, пшеницу, ячмень, рис и канолу.

Далее приводится пример, который иллюстрирует практическое воплощения изобретения. Этот пример не должен рассматриваться как ограничивающий. Все процентные соотношения даны по весу, если не указано иное.

Пример 1. Обработка семян.

В соответствие с данным изобретением споры РазЮнпа зр. можно эффективно доставлять для борьбы с фитопатогенными нематодами путем нанесения покрытия из спор РазЮшла зр. на семена растений.

Споры РазЮнпа зр. можно непосредственно наносить на семена, или, предпочтительно, их можно переработать в жидкую или твердую композицию перед нанесением покрытия на семена. Например, твердую композицию, содержащую споры можно получить путем смешивания твердого носителя с суспензией спор, пока твердый носитель не пропитается суспензией спор. Эту смесь затем высушивают для получения требуемых частиц.

Твердый носитель предпочтительно представляет собой гранулы. Гранулы могут быть, например, гранулами диатомовой земли от ΑΧΙδ® и/или гранулы глины сорта дгссиздгабс от РКОРГЬЕ®. В суспензионную смесь носителя и спор также можно включать различные добавки, такие как прилипатели, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, питательные вещества и буферные ингредиенты.

В конкретном варианта воплощения покрытие кроме спор может дополнительно содержать слой прилипателя. Прилипатель должен быть нетоксичным, биологически разлагаемым и клейким. Пример таких материалов включают, но не ограничиваясь этим, поливинилацетаты; сополимеры поливинилацетата; поливиниловые спирты; сополимеры поливинилового спирта; целлюлозы, такие как метилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы и гидроксиметилпропилцеллюлозы; декстрины; альгинаты; сахары; мелассы, поливинилпиролидоны; полисахариды; протеины; жиры; масла; гуммиарабики; желатины; сиропы; и крахмалы. Больше примеров можно найти, например, в патенте США № 7,213,367, который включен путем ссылки на его содержание.

Слой прилипателя может помочь в закреплении спор на поверхности семени и предотвратить возможное стекание. Кроме того покрытие также может содержать другие химические или биологические агенты, которые создают полезный эффект в комбинации со спорами РазЮшла зр. для борьбы с нематодами и/или борьбы с другими вредителями. Покрытия также могут включать удобрения и другие компоненты, которые способствуют прорастанию семян, и/или росту растений и/или здоровью растений.

- 5 027649

Таким образом, данное изобретение предлагает способ получения покрытия из спор Райешга ер. на семени растений. В конкретном варианта воплощения способ включает комбинирование смесей высушенных гранул, пропитанных спорами Рабсила ер. и семени, покрытого прилипателем.

Хотя обработку семян можно проводить в любом физиологическом состоянии, лучше, чтобы семена пребывали в достаточно надежном состоянии, чтобы им не был нанесен вред во время процесса обработки. Обычно семя убирают с поля; отделяют от растения; и отделяют от любого другого растительного материала, которые не относится к семени. Семя предпочтительно должно являться биологически стабильным до такой степени, чтобы обработка не нанесла биологического вреда семени. В одном варианте воплощения, например, обработку можно применять к семени кукурузы, которое было собрано, очищено и высушено до содержания влаги ниже приблизительно 15 мас.%. В альтернативном варианте воплощения семя может представлять собой семя, которое было высушено и затем подвергнуто предварительной обработке водой и/или другим материалом и затем вновь высушено перед или во время обработки композицией спор Рав1ешга ер. В пределах вышеописанных ограничений обработку можно применять к семени в любое время между сбором семени и высеванием семени. Как использовано здесь, термин не высаженное семя включает семя в любой период между сбором семени и высаживанием семени в почву для целей высевания и роста растения.

Как использовано здесь, когда говорится о том, что не высаженное семя обрабатывают композицией, содержащей Рав1ешга ер., такая обработка не включает те частицы, к которым Рав1ешга ер. применена в почве, а не семени.

Споры Рав1ешга обычно применяют к семенам в форме пестицидной композиции. Такая композиция содержит один или более желательных компонентов, включая, но не ограничиваясь этим, жидкие разбавители, наполнители для защиты семян при стрессовых условиях, и пластификаторы для улучшения гибкости, адгезии и/или способности к распределению покрытия на поверхности. Кроме того, можно при желании в композицию добавлять осушители, такие как карбонат кальция, каолин или бентонитовую глину, перлит, диатомовую землю или любой другой адсорбент. Использование таких компонентов в обработке семян известно в данной области. См., например, патент США № 5,876,739. Специалист в данной области, используя преимущества данного описания, может легко выбрать желаемые компоненты для использования в композиции.

Семена можно также обработать одним или более из следующих ингредиентов: другие пестициды, включая соединения, которые действуют только под землей; фунгициды, такие как каптан, тирам, металаксил, флудиоксонил, оксадиксил и изомеры каждого из этих материалов и т.п.; гербициды, включая соединения, выбранные из глифосата, карбаматов, тиокарбаматов, ацетамидов, тиазинов, динитроанилинов, эфиров глицерина, пиридазинонов, урацилов, феноксисоединений, мочевин и бензойных кислот; гербицидные антидоты, такие как бензоксанин, производные бензгидрила, Ν,Ν-диалил дихлорацетамид, различные дигалоацилы, соединения оксазолидинила и тиазолидинила, этанон, соединения нафталинового ангидрида и производные оксима; удобрения; и агенты для биологического контроля, такие как другие природные или рекомбинантные бактерии и грибки из рода КЫ/оЬппп, ВасШив, Рвеиботопав, 8еггайа, ТпсНобеппа, С1отив, О1юс1абшт и микоризные грибки. Эти ингредиенты можно добавлять как отдельный слой на семени, или альтернативно их можно добавлять как часть композиции Рав1ешга вр.

Лучше, чтобы количество новой композиции или других ингредиентов, которые используют в обработке семян, не ингибировало проращивание семян или не наносило семени фитотоксичного вреда.

Композиция, которую используют для обработки семени в данном изобретении, может быть в форме суспензии; эмульсии; суспензии частиц в водной среде (например, воде); смачиваемого порошка; смачиваемых гранул (сухая текучесть); и сухих гранул. Если композицию готовить в форме суспензии или раствора, концентрация активного ингредиента в композиции составляет предпочтительно приблизительно от 0,5% до приблизительно 99 мас.% (вес./вес.), лучше - 5-40%, или для композиции, полученной иным способом, известным специалистам в данной области.

Как упоминалось выше, в композицию можно вводить другие обычные неактивные или инертные ингредиенты. Такие инертные ингредиенты включают, но не ограничиваясь этим: обычные агенты для прилипания; диспергирующие агенты, такие как метилцеллюллоза (Ме1йосе1 А15ЬУ или Ме1йосе1 А15С, которые, например, служат как комбинированные диспергирующие агенты/агенты для прилипания для использования в обработке семян); поливиниловый спирт (например, Е1уапо1 51-05); лецитин (например, Уе1кто1 Р), полимерные диспергаторы (например, поливинилпиролидон/винилацетат РУР1УА 8-630); загустители (например, загустители на основе глины, такие как Уап Се1 В для улучшения вязкости и снижения седиментации частиц суспензии); стабилизаторы эмульсии; поверхностно-активные вещества; антифризы (например, мочевина), красители; пигменты и т.п. Больше инертных ингредиентов, которые можно использовать в данном изобретении, можно найти в книге МсСи1сйеоп'в, уо1. 1, ЕтиЫйегв апб Пе1егдеп1в, МС РиЬБвЫпд Сотрапу, С1еп Коск, Ν.Τ, И.8.А., 1996. Дополнительные инертные ингредиенты, которые можно использовать в данном изобретении, можно найти в книге МсСи1сйеоп'в, уо1. 2, Рипс1юпа1 Ма1епа1в, МС РиЬйвЫпд Сотрапу, С1еп Коск, Ν.Τ, И.8.А., 1996.

Композиции для покрытия согласно данному изобретению можно наносить на семена различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, перемешивание в контейнере (например, бутылке или

- 6 027649 мешке), механическое нанесение, обработка в барабане, напыление и погружение. Целый ряд активных или инертных материалов можно использовать для контактирования семян с пестицидами в соответствии с настоящим изобретением, таких как обычные пленкообразующие материалы, которые включают, но не ограничиваясь этим, пленкообразующие материалы на водной основе, такие как 8ЕРШЕТ™ (8ерр1С, 1пс., РапПеИ, N.1.) и ОРАСОАТ™ (ВетМпй РЬатт. §ету1се8, \Ус51рош1. Ра.).

Способы и композиции для покрытия семян, которые хорошо известны в данной области, можно использовать, если их модифицировать путем добавления одного из вариантов воплощения данного изобретения. Такие способы покрытия и устройства для их осуществления описаны, например, в патентах США №№ 5,918,413, 5,891,246, 5,554,445, 5,389,399, 5,107,787, 5,080,925, 4,759,945 и 4,465,017. Композиции для покрытия семян описаны, например, в патентах США №№ 5,939,356, 5,882,713, 5,876,739, 5,849,320, 5,834,447, 5,791,084, 5,661,103, 5,622,003, 5,580,544, 5,328,942, 5,300,127, 4,735,015, 4,634,587, 4,383,391, 4,372,080, 4,339,456, 4,272,417 и 4,245,432, среди других.

Связующие, которые можно использовать в данном изобретении, предпочтительно содержат адгезивный полимер, который может быть натуральным или синтетическим и без фитотоксичного эффекта на семя, которое подвергают обработке. Связующее можно выбрать из поливинилацетатов; сополимеров поливинилацетата; сополимеров этиленвинилацетата (ЕУА); поливиниловых спиртов; сополимеров поливинилового спирта; целлюлоз, включая этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы; поливинилпиролидоны; полисахаридов, включая крахмал, модифицированный крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны; жиров; масел; протеинов, включаю желатин и цеины; гуммиарабиков; шеллаков; винилиденхлорида и сополимеров винилиденхлорида; лигносульфонатов кальция; акриловых сополимеров; поливинилакрилатов; оксида полиэтилена; полимеров и сополимеров акриламида; полигидроксиэтилакрилата; мономеров метилакриламида; и полихлорпрена.

Количество Ра81ешта 8р., которое может быть использовано в обработке семени зависит от типа семени и типа активных ингредиентов, но обработка включает контактирование семян с таким количеством Ра81ешта 8р., которое является пестицидно активным. Как использовано здесь, нематоцидно эффективное количество означает такое количество Ра81ешта 8р., которое будет уничтожать нематод, или будет постоянно уменьшать или сдерживать ущерб, наносимый нематодами.

Пестициды, которые используют в обработке, не должны ингибировать прорастание семени и должны быть эффективными в защите семени и/или растения на протяжении жизненного цикла нематоды, во время которого она наносит вред семени или растению. В общем покрытие должно быть эффективным в течение от приблизительно 1 ч до 120 дней после высевания.

Покрытия, сформованные с пестицидом, представляют собой такие покрытия, которые способны обеспечить медленное высвобождение пестицида через матрицу в окружающую среду.

Дополнительно к слою покрытия семя может быть обработано одним или более из следующих ингредиентов: другими пестицидами, включая фунгициды и гербициды; гербицидными антидотами; удобрениями и/или агентами биологического контроля. Эти ингредиенты могут быть добавлены как отдельный слой или альтернативно могут быть добавлены в пестицидный покрывной слой.

Пестицидная композиция может быть нанесена на семена при помощи различных методик и устройств, таких как методики псевдоожиженного слоя, способа валковой мельницы, устройств для ротостатической обработки семян, и барабанных устройств для нанесений покрытий. Могут быть также использованы и другие способы, такие как способ фонтанирующего слоя. Перед покрытием семена могут быть рассортированы по размерам. После покрытия семена обычно высушивают и затем помещают в сортировочную машину для сортировки. Такие методики известны в данной области.

Семена, обработанные Ра81ешта 8р., могут быть также покрыты оболочкой при помощи внешнего покрытия пленкой для защиты покрытия. Такие внешние покрытия известны в данной области и могут быть нанесены с использованием методик псевдоожиженного слоя и барабанного нанесения покрытий.

В другой варианте воплощения настоящего изобретения споры Ра81ешта 8р. могут быть нанесены на семя с использованием твердой матричной заготовки. Например, определенное количество спор Ра81ешта 8р. можно перемешать с твердым матричным материалом и затем семя можно ввести в контакт с твердым матричным материалом на период времени, в течение которого пестицид проникает в семя. Семя затем можно необязательно отделить от твердого матричного материала и хранить или использовать, или смесь твердого матричного материала плюс семя можно хранить или непосредственно высевать. Твердые матричные материалы, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают полиакриламид, крахмал, глину, кремнезем, глинозем, почву, песок, полимочевину, полиакрилат или любой другой материал, способный адсорбировать или адсорбировать пестицид на время и высвобождать этот пестицид в или на семя. Полезно убедиться, что пестицид и твердый матричный материал совместимы друг с другом. Например, твердый матричный материал следует выбрать таким образом, чтобы он мог высвобождать пестицид с разумной скоростью, например, в течение периода, который составляет минуты, часы или дни.

В отличие от вегетативной формы бактерии споры Ра81ешта не повреждаются при высушивании и

- 7 027649 их можно хранить в течение длительных периодов времени при комнатной температуре. Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является то, что высушивание и другие жесткие стадии, используемые в способах покрытия, можно применять в соответствии с данным изобретением для покрытия семян без существенного снижения эффективности спор. Длительный период хранения семян в соответствии с данным изобретением также позволяет проводить изменения в графике высаживания. Кроме того, степень выживания спор РаЛсипа значительно выше, чем для вегетативной формы бактерий при транспортировке и высаживании, когда их помещают в почву.

В общем, эффективное количество спор находится в диапазоне от приблизительно 1х10⁵ до 1х10¹²(или выше) спор/семя. Лучше, чтобы концентрация спор составляла от приблизительно 1 χ 10⁶ до приблизительно 1х10⁹ спор/семя.

В одном из вариантов воплощения изобретения для получения смеси гранул соотношение спор Рав1сипа ер. к грануле составляет от приблизительно 3х10⁷ до 5х10⁷ спор/г гранул. В конкретном варианте воплощения приблизительно 3-5 мл суспензии спор РаЛсипа вр., содержащей приблизительно 2х10⁷спор/мл буферного раствора добавляют к приблизительно 2 г гранул. Соотношение может зависеть от типа гранул. Например, приблизительно 5 мл суспензии спор можно наносить на 2 г гранул ΑΧΙδ®, в то время как приблизительно 3 мл суспензии спор лучше добавлять к такому же количеству гранул РКОР1ЬЕ®. Прилипатель может представлять собой любой коммерческий клей, который является биосовместимым с семенем и почвой, такой как чистый канцелярский клей Е1тег, содержащий поливинилацетат.

Можно проводить дополнительную стадию тепловой обработки для уничтожения нематод, если споры продуцируются в организмах-хозяевах нематод. Стадию тепловой обработки можно применить к суспензии спор перед смешиванием с гранулами. Альтернативно, эту стадию можно применить после образования смеси гранул.

Все патенты, патентные заявки, временные заявки и публикации, на которые имеются ссылки или которые цитируются, включены путем ссылки на их содержание, включая все фигуры и таблицы, до степени, когда они не противоречат данному описанию.

Следует понимать, что приведенные примеры и варианты воплощения предназначены только для иллюстративных целей и различные модификации или изменения будут предложены специалистам в данной области и они должны быть включены в объем и сферу действия данной заявки.

Список последовательностей

- 8 027649 <110> Раккеийа Вю§с1епсе, ΙΝΟ.

ΗεννΙεΙΙ, ТНотак Ε.

\Уа1ег< Ιο Η η Ρ.

<120> Штамм ΡΑδΊΈυΚΙΑ §ρ. для защиты сельскохозяйственных культур от нематод, композиция и способ защиты сельскохозяйственных культур от нематод <130> РВ8.104ХС1РСТ <150> 61/147,174 <151> 2009-01-26 <160>4 <170> Версия Ра1еп11п 3.5 <210> 1 <211> 1170 <212> ДНК <213> Ра§1ешта <400> 1

1§саа§1с§а §с§с§сас1с εΙΙΙΙββββΙ £С£а%с££С£ ξΜξξξί&ΐξ 1аасас§1§§ 60 а1аасс1§са са§аа§ас§§ §§а11асссс с§§ааас§§§ §§1саа1асс §§а!ас§сс! 120 сс1а§а1с§с а1§а1сс§§§ а^аая^! §ссйс§§§с §сс§сШ1§ §а§§§а1сс§ 180 с§§с§сайа §с1а§11§§1 §а§§1аа§§§ с!сассаа§§ с§ас§а!§с§ 1а§сс§§сй 240 §§§а§а§с§§ ас§§ссасас 1§§§ас1§а§ асас§§ссса §ас!сс!ас§ §§а§§са§са 300 §1а§§§аа11 Псс§саа1§ ё§сёааа§сс 1§ас§§а§с§, ас§сс§с§1§, §§1§аа§ас§ 360 §ссйс§§§11§1ааа§ссс 1§11са1с§§ §аа§аа§ааа 1§ас§§1асс §§1§аа§ааа 420 §сссс§§с1а ас1ас§1§сс а§са§сс§с§, §1аа1ас§1а βββββεβΗβε §11§1сс§§§ 480 а1§а11§§§с §1ааа§§§с§ 1§1а§§с§§а 1аса1а§§1с §§§с§1§ааа §§с§с§§§с1 540 саассс§1§1 §а§с§11с§а аас§§1§1§1 с11§а§1§са §1а§а§§§аа §с§§ааШс 600

1§§1§1а§с§ §1§§аа1§с§ 1а§а1а1са§ аа§§аасасс §§1§§с§аа§ §с§§сйсс1 660 §§ас1§11ас 1§ас§с1§а§ £С£С£аа%£с §1§§§§а§са аасадщШа §а1ассс1§§ 720

1а§1ссас§с §§1ааас§а1 §а§1§с1а§а 1§1а§§§а1§ с1са§са1с111§1§сс§аа 780 §§ааассса! 1аа§сас1сс §сс!§§§§а§ 1ас§§1с§са а§§с!§ааас 1сааа§§аа1 840

1§ас§§§§§с сс§сасаа§с §§1§§а§са1 §1§§Шаа11с§а1§саас §с§аа§аасс 900

- 9 027649

11ассаа§§с 11§аса1ссс §§1§ааа§§с с1с§ааа§а§ 1§сс§1§ссс сс11с§§§§§ 960 ёа§са1сё§1 §аса§§1§§1 §са1§§11§1 с§1са§с1с§ 1§1с§1§а§а ΙβΙΙβββΙΙε 1020 а§1ссс§саа с§а§с§саас сс!1а1с1сс §§11§сса§с ас§1аа§§§1 §§§сасШ§ 1080 §а§а§аса§с с§§с§ааа§с с§§а§§аа§§ с§§§§ас§ас §1сааа1са1 са1§ссссй 1140 а1§1111§§§ с1асасас§1 §с1асаа1§§ 1170 <210> 2 <211>252 <212> ДНК <213> Ра§1ешта <400> 2

1с§1§1«с1 §1§§а§а1а§ а§§а1ассса §§1а§с1ай ас§§йаса§ αεεββββοβΐ 60 §§§аай§1а §а1§1§§а§с а§§сса§§са а1сШ§1а1 ас11с1а§§с са§аа1§§§а 120 §с§с§с§§§§ а1§§§§1111 сса11а1§§а асаШса!§ §а1са§§1§а §§§Пс§Пс 180

1ас§ссс§§1 саа§§1асс§ 1а§1аса1а1 §а1аааааа§ 11§са§§с§а §1а§§аа1§1 240 а§сс§11§с§ а! 252 <210> 3 <211> 764 <212> ДНК <213> Ра§1ешта <400> 3 сас§1а1аса с§§Ш§а§1 §аа§саа1§1 с1§§с§а§с1 с§й§а§Щ 1с1аа§§§1а 60 а1с1§§§аа1 §§11§с§аас с1§§а§а1§§ а§аа1§1с§§ ΙβΙΙβΙββΙα с1§§§а1сй 120 §1§а1§а§а1 ΙεαΙβΗββββ §ассс!§1ас §сс§1асаёё 1с§§11§а1§ §аа§1ассёё 180 1§§§1§а§§с а11§с1§§§1 εβββΐΗβΙεα ассссс1с§§ аса^ссссса βαίββββοαβ 240 §§сс1аШс с1с§§аасас 11сс§1сс1§ 1§§ааа1§сс а§с1§са§§1 §11§1§§а1с 300 §сс§а!с1§11са1са§ссс с!§са§аса§ §§а!саа§§с §а1с§а1§с§ а!§§1§ссса 360 «ββίεβεββ ёсаас§с§аё а§а1сай§ §§§а1с§1са %ас%£££ааа ас§ас§§а§ 420 с§§1§§а1ас §а1сс1§аа1 са§аа§§а1а с§§§1§1сс111§1§1с1ас §1а§с§а11§ 480 §1са§аа§са §1с1аса§1§ βοβεαββίββ 1§§а§ааай ас§асаас§§ §§1§с§а1§§ 540 а§1а1ассас §с§а§1§с!1 сс§а!ссс111сссс11с1§ 1ас11а§ссс 600 сс1а1§с§§§ П§1§1§а1§ §§с§а§1аП Йа1§1а1са §§§1§§сса1 §1§11§1§1§ 660

1а1ас§а1§а 1сШссаа§ са§§с1§с§§ сс1асс§§§а §сШссс1111ас11с§1с 720 §1сс£сса§§ ас§1§аа§сс 1асссс§§§§ а1§111111а сИа 764 <210> 4 <211>245 <212> ДНК <213> Ра Л сипа <400> 4 §§1§1с§ааа а1§а1§§а§£ сас§1ас§§а §а§§аИаа§ 1с1ас1с1§§ а§§а§§са§а 60 а§с§аа§с§§ аа§§а§§ссс 11с1с1а1§1 а§а§са§1аа а§§§а§§сс! 1§аа§саа§с 120 сс^са^а§, §с!са§§§§а 1§сй£ссас 1§с§с§1Ш са&аа^а^с а§§а§§с§§с 180 §1с§а1сс1а са§§а£§с§а ё§са§а§а§с с§а§сааас§ 11§§а§1с1§ с1аа§1с§§а 240 §β!1β 245

Claims

§β!1β 245

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный штамм Ра&еипа δρ. АТСС РТА-9643 для защиты сельскохозяйственных культур от нематод.
2. Вариант штамма по п.1, содержащий полинуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% одной из последовательностей 5Е9 II) ΝΟ: 1-4.
3. Вариант штамма по п.1, содержащий полинуклеотидные последовательности, идентичные по меньшей мере на 95% последовательностям 8ЕО II) ΝΟ: 1-4.
4. Выделенный штамм Ра^еипа δρ. по п.1, активный против почковидной нематоды.
5. Нематоцидная композиция, содержащая нематоцидно эффективное количество штамма Раз1;еипа

- 10 027649

8р. по п.1 и пригодный для использования в сельском хозяйстве носитель.
6. Композиция по п.5, где штамм Ра81сипа 8р. прикреплен к семени сельскохозяйственной культуры, выбранной из группы, состоящей из зеленого горошка, дерновых злаков, батата, томата, хлопка, кукурузы, соевых бобов, окры, салата-латука, тыквы, овощей, ананаса, чая, пшеницы, ячменя, риса и канолы.
7. Способ защиты сельскохозяйственных культур от нематод, включающий нанесение на почву или поверхность семян сельскохозяйственной культуры эффективного количества штамма Ра81сипа 8р. по п.1.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что нематода представляет собой почковидную нематоду.
9. Способ по п.7, где сельскохозяйственная культура выбрана из группы, состоящей из зеленого горошка, дерновых злаков, батата, томата, хлопка, кукурузы, соевых бобов, окры, салата-латука, тыквы, овощей, ананаса, чая, пшеницы, ячменя, риса и канолы.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что сельскохозяйственная культура является хлопком.
11. Способ по п.7, отличающийся тем, что штамм Ра81сипа 8р. наносят на почву для борьбы с нематодами, живущими в почве.
12. Способ по п.7, отличающийся тем, что штамм Ра81сипа 8р. наносят на поверхность семян.