EA026153B1 - Лечение гематологических злокачественных заболеваний с помощью анти-cxcr4 антитела - Google Patents

Лечение гематологических злокачественных заболеваний с помощью анти-cxcr4 антитела Download PDF

Info

Publication number
EA026153B1
EA026153B1 EA201490957A EA201490957A EA026153B1 EA 026153 B1 EA026153 B1 EA 026153B1 EA 201490957 A EA201490957 A EA 201490957A EA 201490957 A EA201490957 A EA 201490957A EA 026153 B1 EA026153 B1 EA 026153B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cxc4
cells
fragment
antibodies
Prior art date
Application number
EA201490957A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490957A1 (ru
Inventor
Мишель Р. Кунэ
Чинь Пань
Джозефин М. Кардарелли
Original Assignee
Бристол-Майерс Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бристол-Майерс Сквибб Компани filed Critical Бристол-Майерс Сквибб Компани
Publication of EA201490957A1 publication Critical patent/EA201490957A1/ru
Publication of EA026153B1 publication Critical patent/EA026153B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

Изобретение предусматривает человеческие моноклональные антитела, которые специфически связывают CXCR4 с высокой аффинностью. Изобретение также предусматривает способ лечения субъекта, страдающего раком, экспрессирующим CXCR4, в частности гематологическим злокачественным заболеванием, таким как множественная миелома, острая миелоидная лимфома или неходжкинская лимфома, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей анти-CXCR4 антитело по изобретению. Изобретение также описывает набор для лечения рака у субъекта, включающий дозу анти-CXCR4 антитела и инструкции для применения анти-CXCR4 антитела в способах лечения по изобретению.

Description

В изобретении в скобках в качестве ссылок приведены различные публикации с указанием имени автора и даты или номера патента или номера опубликованной заявки. Полные названия этих публикаций можно найти в конце описания непосредственно перед формулой изобретения. Описания этих публикаций включены в данное описание посредством ссылок во всей своей полноте, что позволяет более полно описать уровень техники, известный специалистам в данной области на момент создания изобретения, описанного и заявленного в настоящем документе. Тем не менее, ссылки на цитируемую литературу не следует толковать как указание, что данная ссылка является частью предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.
Область техники
Настоящее изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с нативной человеческой молекулой СХСК4, экспрессирующейся на поверхности клетки, и к применению этих антител в способах лечения рака, в частности гематологических злокачественных заболеваний, в том числе острой миелоидной лейкемии (ЛМЬ), множественной миеломы (ММ) и неходжкинских лимфом (ЯНЬ), таких как хроническая лимфоидная лейкемия (СЬЬ), фолликулярная лимфома (РЬ) и диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ПЬВСЬ).
Уровень техники
Хемокины представляют собой семейство примерно из 50 небольших белков, которые модулируют перемещение клеток и ангиогенез, а также играют важную роль в опухолевом микроокружении (Уюап е! а1., 2002). В зависимости от структуры хемокины классифицируются на С-С хемокины (содержащие цистеин-цистеиновый мотив) и С-Х-С хемокины (содержащие мотив цистеин-Х-цистеин). Рецепторы, связывающие такие хемокины, таким образом, классифицируются на семейства ССК или СХСК соответственно.
Один из членов семейства СХСК - это рецептор СХСК4 (СХСК4), также известный как ί'.Ό184. с семью трансмембранными доменами, связанный с О-белком, состоящий из внеклеточного Ν-концевого фрагмента и трех внеклеточных петель. Внутриклеточный карбоксиконцевой фрагмент СХСК4 соединен с гетеротримерным О-белком, состоящим из β- и γ-субъединиц и α-субъединицы Οί, чувствительной к коклюшному токсину (Ьое!8сйег е! а1., 1994). На данный момент был идентифицирован только один лиганд для СХСК4, хемокин, известный как СХСЬ12 (также известный и взаимозаменяемо обозначаемый здесь как фактор из стромальных клеток 1, или 8ΌΡ-1) (В1еи1 е! а1., 1996; ОЬегПп е! а1., 1996). Связывание СХСЬ12 с СХСК4 стимулирует активацию фосфолипазы С и впоследствии приводит к повышению уровня свободного кальция в цитозоле. Связывание с СХСК4 в конечном итоге приводит к индукции хемотаксиса и миграции (ТасЫЬапа е! а1., 1998; Ζου е! а1., 1998). СХСК4 также играет важную роль в эмбриогенезе, гомеостазе и воспалении. Исследования на мышах, дефицитных по СХСК4 или СХСЬ12, обнаружили вовлеченность пути СХСК4/СХСЫ2 в васкуляризацию органов, а также в работу иммунной и кроветворной систем (ТасЫЬапа е! а1., 1998). Кроме того, было показано, что СХСК4 функционирует в качестве корецептора для Т-лимфотропных изолятов ВИЧ-1 (Репд е! а1., 1996).
У здоровых взрослых СХСК4 преимущественно экспрессируется на гематопоэтических клетках, включая В- и Т-клетки, моноциты, макрофаги, ΝΚ и дендритные клетки, а также СО34+-клеткипредшественники костного мозга (ВМ) (Ьее е! а1., 1999). Низкие уровни СХСК4 также экспрессируются в эндотелиальных и эпителиальных клетках, астроцитах и нейронах (Оир!а е! а1., 1998; Не88е1де88ег е! а1., 1997). Было показано, что СХСБ12 вызывает миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и совместно с УБОР приводит к усилению неоангиогенеза (Ои1епд е! а1., 2005). Повышенная экспрессия СХСК4 также была обнаружена в 75% случаев рака, в том числе при лейкозе, лимфоме, раке поджелудочной железы, молочной железы, яичников, легких, простаты и толстого кишечника; кроме того, взаимодействие с СХСБ12 имеет большое значение для хоминга и поддержания гемопоэтических стволовых клеток в микроокружении ВМ (МоЫ1е е! а1., 1998). Было показано, что бициклический антагонист СХСК4 Плериксафор (ΆΜΌ3100; Мо/оЬП) приводит к мобилизации стволовых клеток в кровяное русло (Оат е! а1., 2011). ΆΜΌ3100 и ΆΜΌ3465, другой бициклический антагонист СХСК4, усиливают хемосенсибилизацию опухолевых клеток ЛМЬ, блокируя сигнализацию СХСК4/СХСБ12 (№τνί е! а1., 2009; Ζеη§ е! а1., 2009).
ЛМЬ является быстро растущим раком миелоидной линии клеток крови, характеризуется быстрым ростом анормальных белых кровяных клеток, которые накапливаются в ВМ и препятствуют продукции нормальных клеток крови. При ЛМЬ наблюдается высокий уровень экспрессии СХСК4 на СЭ34' фракции клеток ВМ. Более низкие уровни СХСК4 на клетках ЛМЬ коррелируют с более благоприятным прогнозом, при котором наблюдаются более длительные интервалы между рецидивами и более высокая выживаемость. Низкая экспрессия рецептора СХСК4 снижает миграцию предшественников клеток ЛМЬ к СХСБ12, экспрессируемому в хемозащищенном окружении ВМ (ΤηνοΓ е! а1., 2004).
Множественная миелома (ММ) - это одна из форм рака, которая возникает в результате злокачественной пролиферации плазматических клеток. После неходжкинской лимфомы этот вид рака находится на втором месте по частоте встречаемости среди видов гематологического рака; в год во всем мире фиксируется приблизительно 80000 новых случаев (20000 в Соединенных Штатах) и примерно 62000 смертей (10500 смертей/год в США) (1еша1 е! а1., 2008; 2009). ММ клетки растут преимущественно в ВМ, где
- 1 026153 они мешают продукции нормальных клеток крови и нормальных антител, приводя к иммунодефициту, разрушению скелета, гипокальциемии, нарушению работы ВМ и почечной недостаточности. Кроме ЛМЬ, уровни СХСЬ12 в сыворотке крови также повышены у пациентов с ММ, а экспрессия СХСК4 повышается при экстрамедуллярной плазмоцитоме - проявлении поздней стадии ММ. Кроме того, блокирование пути СХСЫ2/СХСК4 ослабляет миграцию клеток ММ и хоминг этих клеток в ВМ (АПауеб с1 а1., 2007).
Неходжкинские лимфомы включают различные виды рака лимфоцитов, отличающиеся от лимфомы Ходжкина. ΝΉΒ могут возникнуть в любом возрасте и часто сопровождаются увеличением лимфатических узлов, лихорадкой и потерей веса. Разнообразные типы ΝΉΒ значительно различаются по своей тяжести, от очень агрессивных (быстрорастущих) до вялотекущих (медленно растущих) типов, они могут образовываться из В-клеток или Т-клеток. В-клеточные ΝΉΤ включают лимфому Беркитта, хроническую лимфоидную лейкемию/мелкоклеточную лимфоидную лимфому (СЕЬ/8ЕЬ), диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ОБВСЬ), фолликулярную лимфому (РЬ), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников и лимфому из клеток мантийной зоны. Т-леточные ΝΗΤ включают грибовидные микозы, анапластическую крупноклеточную лимфому и Т-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников. По некоторым оценкам в 2012 году в США возникнет примерно 70000 новых случаев ΝΗΕ что приведет примерно к 19000 смертельных исходов. Высокий уровень экспрессии СХСК4 был обнаружен в 18 из 19 протестированных первичных клеточных линий ΝΗΤ (ВепоНш е1 а1., 2002). Кроме того, было показано, что СХСЬ12 усиливает миграцию фолликулярных клеток ΝΗΤ (Согсюие е1 а1., 2000), а СХСК4-СХСЫ2 путь, по-видимому, важен для миграции клеток СЬЬ (Вигдег е1 а1., 1999).
Человеческие анти-СХСК4 моноклональные антитела, которые обладают множеством предпочтительных свойств, были ранее описаны в международной публикации РСТ № XVО 2008/060367 (заявка № РСТ/и 82007/021152), претендующей на приоритет предварительной заявки США 60/827,851, поданной 2 октября 2006 г. Описания обеих этих заявок включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылок в данном документе. Как описано в νθ 2008/060367, ίη νίίτο исследования показывают, что эти моноклональные антитела связываются с СХСК4-экспрессирующими клетками с низкой наномолярной аффинностью, блокируя связывание СХСЬ12 с СХСК4-экспрессирующими клетками и ингибируя СХСЬ12-индуцированную миграцию и вход кальция с низкими наномолярными значениями ЕС50. Одно из полностью человеческих моноклональных антител, ВМ8-936564 (обозначенное в νθ 2008/060367 как Р7, а также ранее обозначаемое как МОХ-1338; все три обозначения используются в данном документе как взаимозаменяемые), которое неожиданно проявило противоопухолевое действие в доклинических исследованиях, было выбрано для проведения дальнейшего исследования с целью определения его активности в отношении гематологических раков ίη νίνο и дальнейшего выяснения механизмов, обеспечивающих противораковую активность. Антитело ВМ8-936564 также находится на стадии клинических исследований для пациентов с рецидивирующими/резистентными АМЬ, ММ и ΝΗΠ
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности человеческим моноклональным антителам, которые связываются с человеческим СХСК4 и проявляют множество свойств, желательных для терапевтического антитела. Эти свойства включают способность связываться с низким наномолекулярным сродством с нативным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки, способность ингибировать связывание 8ΌΡ-1 с человеческим СХСК4 с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или менее, ингибировать δΌΡ-1-индуцированный вход кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, с ЕС50 для ингибирования 3 нМ или менее, ингибировать δΌΡ-1-индуцированную миграцию клеток, экспрессирующих СХСК4, с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или менее, ингибировать образование капилляров эндотелиальными клетками пупочной вены человека (НиУЕС), индуцировать апоптоз в разнообразных клетках, экспрессирующих СХСК4, ингибировать пролиферацию опухолевых клеток ίη νίίτο, ингибировать рост опухоли ίη νίνο, подавлять метастазы СХСР4' опухолевых клеток и/или увеличивать время жизни субъектов с СХСР4' опухолями.
В предпочтительном варианте данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, предпочтительно моноклональному антителу человека или его антигенсвязывающей части, где моноклональное антитело:
(a) связывается с нативным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
(b) ингибирует связывание 8ΌΡ-1 (СХСЬ12) с человеческим СХСК4;
(c) ингибирует 8ОР-1-индуцированный вход кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4;
(ά) ингибирует 8ОР-1-индуцированную миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4;
(е) ингибирует образование капилляров эндотелиальными клетками пупочной вены человека.
Еще более предпочтительными свойствами антитела являются индукция апоптоза клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4-, индукция апоптоза опухолевых клеток ίη νίνο и/или ингибирование роста СХСР4' опухолевых клеток.
- 2 026153
Это изобретение также обеспечивает способ лечения субъекта, страдающего раком, экспрессирующим СХСК4, в том числе гематологическими злокачественными заболеваниями; такой способ лечения подразумевает введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-СХСК4 антитела, которое специфически связывается с человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело ингибирует активность СХСК4. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анти-СХСК4 антитело индуцирует апоптоз экспрессирующих СХСК4 клеток-мишеней. Соответственно, анти-СХСК4 антитело используется в некоторых вариантах осуществления в качестве монотерапии. В других вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело используется в комбинации с другими противораковыми агентами. В предпочтительных вариантах осуществления гематологическими злокачественными заболеваниями являются ММ, АМЬ или ИНЬ. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой человеческое антитело. Более предпочтительно это антитело представляет собой ВМ8-936564.
Изобретение дополнительно обеспечивает применение антител СХСК4 для изготовления фармацевтической композиции для лечения субъекта, страдающего раком, в том числе гематологическими злокачественными заболеваниями.
Это изобретение также обеспечивает наборы для лечения рака у субъекта, где набор включает (а) дозу анти-СХСК4 антитела и (Ь) инструкцию по применению анти-СХСК4 антитела любым из описанных здесь способов. В предпочтительном варианте осуществления анти-СХСК4 антитело представляет собой антитело ВМ8-936564.
Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны быть истолкованы как ограничивающие. Содержание всех ссылок, записей ΟΕΝΒΑΝΚ®, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в данном описании, включено в настоящий документ посредством ссылок.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 33) и аминокислотная последовательность (8Ε0 ГО N0: 25) вариабельной области (А) тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Р7 (ВМ8-936564). Выделены области СИК1 (8ЕЕ) ГО N0: 1), СИК2 (8ЕЕ) ГО N0: 5) и СИК3 (8Ε0 ГО N0: 9) и указаны изменения последовательности участков V, И и 1 в зародышевых линиях. Также показаны нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 37) и аминокислотная последовательность (8Ε0 ГО N0: 29) вариабельной области легкой цепи (В) Р7. Выделены области СИК1 (8ЕС ГО N0: 13), СИК2 (8Ε0 ГО N0: 17) и СИК3 (8ЕС ГО N0: 21) и указаны изменения в V и 1 участках в зародышевых линиях.
Фиг. 2 показывает связывание человеческих анти-СХСК4 антител Р7, Р9, И1 и Е2 с клетками СЕМ, которые экспрессируют нативный человеческий СХСК4 на своей поверхности.
На фиг. 3 показано конкурентное связывание Р1ТС-меченого анти-СХСК.4 антитела Р9 и панели немеченных человеческих анти-СХСК4 антител с СЕМ клетками.
На фиг. 4 представлен результат анализа связывания ВМ8-936564 методом проточной цитометрии. Это антитело связывается с клетками АМЬ линий N01110-1 и НЬ-60 (А), СХСК4-трансфицированными клетками линий К1610, СЕМ и Каток (В), клеточными линиями ММ, ТГО-3К и М0ЬР8 (С) и первичными клетками АМЬ из крови пациентов (И).
На фиг. 5 показано ингибирование связывания 1251-меченого СХСЬ12 с СХСК4, экспрессирующимся на клетках СЕМ, человеческими анти-СХСК4 антителами Р7 (ВМ8-936564), Р9 и И1. Антитело Е2 не ингибирует связывание СХСЬ12 с клетками СЕМ.
Фиг. 6 показывает ингибирование связывания 1251-меченого СХСЬ12 с клетками СЕМ анти-СХСК4 антителом МИХ-1338 (ВМ8-936564) (А) или анти-СХСЬ12 антителом (В) и ингибирование связывания 1251-меченого СХСЬ12 с клетками Каток антителом МИХ-1338 (С). Анализ связывания лиганда проводили путем инкубации 100 пМ 1251-СХСЬ12 с клетками СЕМ в присутствии возрастающей концентрации МИХ-1338, анти-СХСЕ12 или контрольного изотипического антитела. Для определения неспецифического связывания (№В) добавляли немеченный СХСБ12 в 1000-кратном молярном избытке (100 нМ). Для определения общего возможного связывания добавляли 1251-СХСЬ12 без антитела или без немеченного конкурентного вещества (Всего).
На фиг. 7 показано ингибирование СХСБ12 (8ИР-1)-индуцированного входа кальция в клетки СЕМ человеческими анти-СХСК4 антителами Р7 (ВМ8-936564), Р9 и И1. Антитело Е2 не оказывает значительного ингибирующего эффекта на СХСЫ2-индуцированный вход кальция.
На фиг. 8 показано ингибирование СХСЬ12-индуцируемого входа кальция в клетки СХСК4+ антиСХСК4 антителами МИХ-338 (ВМ8-936564) или анти-СХСЬ12 антителами. Анализ входа кальция проводили путем инкубации клеток Каток (А) или клеток СЕМ (В) с красителем Са1ешт 4 в присутствии или в отсутствие тестируемого антитела или контрольного изотипа. Клетки, нагруженные красителем, инкубировали при комнатной температуре с 50 и 5 нМ СХСБ12 для клеток Каток и СЕМ соответственно. Была вычислена площадь под кривой флуоресценции от 20 до 200 с и рассчитано значение ЕС50.
На фиг. 9 показано ингибирование СХСЬ12-индуцированной миграции клеток СЕМ человеческими анти-СХСК4 антителами Р7 (ВМ8-936564) и Р9, в то время как антитела И1 и Е2 несущественно ингиби- 3 026153 руют миграцию.
На фиг. 10 показано ингибирование СХСЬ12-индуцированной миграции СХСК4+-клеток антиСХСК4 антителом МОХ-1338 (ВМБ-936564) или анти-СХСЬ12 антителом. Анализ миграции клеток Каток (А) и СЕМ (В) проводили в присутствии 1,25 и 0,05 нМ СХСЬ12 соответственно. Количество меченых клеток, которые мигрировали в нижнюю камеру, измеряли на планшетном спектрофотометре Ри5юи (РегкшЕ1тег). Каждая точка представляет N=3.
На фиг. 11А показано ингибирование деления опухолевых клеток Каток ίη νίίτο человеческими анти-СХСК4 антителами Р7 (ВМБ-936564), Р9 и Е2 и ингибирование деления клеток Каток антителом МОХ-1338 (ВМБ-936564) в сравнении с отсутствием ингибирования анти-СХСЬ12 антителом (В). На фиг. 11В также показаны эффекты различных пептидных антагонистов СХСК4.
На фиг. 12 показано ингибирование деления опухолевых клеток Каток ίη νίνο на модели подкожной опухоли человеческими анти-СХСК4 антителами Р7 (ВМБ-936564) и Р9. На фиг. 12А представлена кривая роста среднего объема опухоли; на фиг. 12В представлена кривая роста медианы объема опухоли; и на фиг. 12С показан средний % изменения массы тела.
На фиг. 13 показан процент выживаемости мышей, получавших человеческое анти-СХСК4 антитело Р9 (А) или анти-СХСК4 антитело ВМБ-936564 и анти-СХСЬ12 антитело (В) в системной модели опухолевых клеток Каток. ВМБ-936564 обладает высокой эффективностью в этой системной модели Каток, в то время как анти-СХСЬ12 антитело не проявило эффективного действия.
На фиг. 14 представлены результаты анализа на апоптоз, осуществляемого путем инкубации клетки Каток в течение 24 ч при температуре 37°С с 10 мкг/мл МОХ-1338 (ВМБ-936564) или контрольного изотипа. Клетки окрашивали аннексином У-Р1ТС и йодистым пропидием (РГ) (А). Был определен процент клеток, позитивных только по аннексину V или по аннексину V и Р1 (В).
На фиг. 15 видно, что индукция апоптоза МОХ-1338 (ВМБ-936564) является СХСК4-специфичной. МОХ-1338 или контрольный изотип были добавлены к СХСК4-трансфицированным клеткам (А) или исходным клеткам К1610 (В), которые были затем окрашены аннексином ν-РГТС и РГ. Представлен процент клеток, положительных только по аннексину V или по аннексину V и РГ.
На фиг. 16 представлено ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов Каток-клеточной лимфомы ίη νί\Ό антителами к СХСК4 МОХ-1338 (ВМБ-936564) и ритуксимабом (химерное анти-СО20 моноклональное антитело) в качестве положительного контроля; при использовании анти-СХСЬ12 антитела отсутствует ингибирование роста опухоли.
На фиг. 17 представлено торможение опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток НЬ60 (А) и Мто-1 (В) острой миелоидной лейкемии ίη νί\Ό антителами МОХ-1338 (ВМБ-936564). Цитарабин, как и ожидалось, не ингибировал опухолевый рост цитарабин-устойчивой опухоли Мто-1,
На фиг. 18 показано торможение опухолевого роста ксенотрансплантатов различных СХСК4+ клеток множественных миелом ίη νί\Ό антителом МОХ-1338 (ВМБ-936564). На фиг. 18 представлено ингибирование опухолевого роста клеток ксенотрансплантатов МОБР8 путем обработки только МОХ-133 8 или обработки МОХ-1338 в комбинации с леналидомидом или бортезомибом (А); ингибирование опухолевого роста клеток ксенотрансплантатов ΠΝ-3Ρ. путем обработки МОХ-1338 или леналидомидом или бортезомибом (В); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов исходных клеток ΠΝ-3 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-1338 в комбинации с бортезомибом (С); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов исходных клеток ΠΝ-3 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-1338 в комбинации с леналидомидом (ϋ); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток КРМГ-8226 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-13 38 в комбинации с леналидомидом (КЕV^ГΜГ^®) (Е); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток КРМГ-8226 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-1338 в комбинации с бортезомибом ^ЕБСЛОЕ®) (Р); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток ММ.18 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-1338 в комбинации с леналидомидом (С); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток ОМР-2 путем обработки только МОХ-1338 или МОХ-1338 в комбинации с бортезомибом (Н); ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантатов клеток ОРМ-2 путем обработки только МОХ1338 или МОХ-1338 в комбинации с леналидомидом (Г).
- 4 026153
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с нативным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления антитела данного изобретения получены из определенных последовательностей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии и/или имеют определенные структурные особенности, такие как вариабельные районы или СОК, включающие специфические аминокислотные последовательности. Это изобретение также обеспечивает способы применения антител для модулирования активности СХСК4 или лечения заболеваний или расстройств, связанных с экспрессией СХСК4 или связанных с путем СХСК4/СХСЫ2, например рака, в частности злокачественных гематологических заболеваний, метастаз опухолей, ВИЧ-инфекции, воспаления и ангиогенеза.
Термины
Для того чтобы настоящее изобретение было более понятным, далее приведены определения некоторых терминов. Используемые в данном описании термины, за исключением случаев, когда прямо указано иное, имеют значение, приведенное ниже. Дополнительные определения приведены по тексту документа.
Введение относится к физическому введению композиции, содержащей терапевтический агент, субъекту с применением любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в данной области. Предпочтительные способы введения антител для настоящего изобретения включают внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрибрюшинное, спинальное введение или другие способы парентерального введения, например, путем инъекции или инфузии. Сочетание парентеральное введение, используемое в данном описании, обозначает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно осуществляемые путем инъекции, и включает в себя, без ограничения, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, внутрилимфатическое введение, введение в очаг поражения, внутрикапсульное, внутриглазничное, внутрисердечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, субкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, эпидуральное и внутригрудинное введение путем инъекции и инфузии, а также электропорации ίη νίνο. В альтернативном варианте антитело данного изобретения может быть введено не парентеральным путем, например местно, эпидермально или в слизистую, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно. Введение также может быть выполнено, например, один раз, множество раз и/или в течение одного или более длительных периодов времени.
Термин антитело (ЛЬ) означает, не ограничиваясь этим, гликопротеин иммуноглобулин, который специфически связывается с антигеном и включает по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, или антигенсвязывающий участок антитела. Каждая Н-цепь содержит вариабельный район тяжелой цепи (сокращенно обозначается здесь νΗ) и константный район тяжелой цепи. Константный район тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного района легкой цепи (сокращенно обозначается здесь νθ и константного района легкой цепи. Константный район легкой цепи состоит из одного домена Сц. Районы νΗ и V!, могут быть далее разделены на гипервариабельные районы, называемые определяющими комплементарность районами (СЭР), чередующиеся с районами, которые являются более консервативными, так называемыми каркасными районами (РК). Каждый район νΗ и V!, состоит из трех СЭР и четырех РК, расположенных от Ν-конца к С-концу в следующем порядке: РК1, СИК1, РК2, СИК2, РК3, СИК3, РК4. Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные районы антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулина тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, клетками-эффекторами) и первым компонентом (С1д) классической системы комплемента.
Антитела обычно специфически связываются с узнаваемым ими антигеном с высоким сродством, что соответствует константе диссоциации (Кс) от 10-5 до 10-11 М-1 или менее. Любая Кс выше примерно 10-4 М-1 в целом считается показателем неспецифического связывания. В настоящем документе указание на то, что антитело специфически связывается с антигеном, относится к связыванию антитела с антигеном и существенно идентичными антигенами с высоким сродством, т.е. антитело имеет Кс 10-7 М или менее, предпочтительнее 10-8 М или менее, еще более предпочтительно 5х10-9 М или менее и наиболее предпочтительно от 10-8 и 10-10 М или менее, но не связывается с высоким сродством с неродственными антигенами. Антиген является существенно идентичным данному антигену, если он имеет высокую степень идентичности последовательности с данным антигеном, например, если он обладает по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, предпочтительнее по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 97% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с последовательностью данного антигена. Например, антитело, которое специфически связывается с человеческим СХСК4, может также иметь кросс-реактивность к СХСК4-антигенам определенных видов приматов, но не обладает кросс-реактивностью к антигенам СХСК4 некоторых видов грызунов или антигенам, отличным от СХСК4, например человеческому антигену ΡΌ-ЬТ
- 5 026153
Иммуноглобулин может относиться к любому из известных изотипов, включая, но не ограничиваясь ими, 1§Л, секреторный 1§Л, 1§С и 1дМ. Подклассы 1§С также хорошо известны специалистам в данной области и включают, не ограничиваясь ими, человеческие Ι§Οι, Ι§02, 1§О3 и 1§О4. Термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или Ι§Οι), последовательность которого кодируется генами константного района тяжелой цепи. Термин антитело включает, например, как антитела естественного происхождения, так и неприродные антитела; как моноклональные, так и поликлональные антитела; химерные и гуманизированные антитела; человеческие или нечеловеческие антитела; полностью синтетические антитела и одноцепочечные антитела. Нечеловеческие антитела могут быть гуманизированы с помощью рекомбинантных методов с целью снижения их иммуногенности для человека. Если специально не указано или если это не противоречит контексту, термин антитело также включает антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий участок любого из вышеупомянутых иммуноглобулинов и включает одновалентный и двухвалентный фрагмент или часть, и одноцепочечное антитело.
Термин выделенное антитело относится к антителу, которое является, по существу, свободным от других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с СХСК4, по существу, свободно от антител, которые специфически связываются с другими антигенами, отличающимися от СХСК4). Выделенное антитело, которое специфически связывается с СХСК4, может, однако, иметь кросс-реактивность к другим антигенам, таким как молекулы СХСК4 других видов организмов. Кроме того, выделенное антитело может быть, по существу, свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термины анти-антиген антитело, антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используются здесь взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.
Термин моноклональное антитело (шЛЬ) относится к препарату молекул антитела одного молекулярного состава, т. е. молекул антитела, первичные последовательности которых по существу идентичны и которые имеют одинаковую специфичность связывания и аффинность для конкретного эпитопа. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью гибридомной, рекомбинантной, трансгенной технологии или другими способами, известными специалистам в данной области.
Человеческое антитело (НиМАЬ) относится к антителу, имеющему вариабельные районы, в которых как каркасные районы, так и СИК получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константный район, константный район также получен из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или путем соматической мутации ίη νίνο). Однако термин человеческое антитело, используемый здесь, не включает антитела, в которых последовательности СИК получены из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мыши, и перенесены на каркасные последовательности человека. Термины человеческие антитела и полностью человеческие антитела используются как синонимы.
Термин гуманизированное антитело относится к антителу, в котором некоторые аминокислоты, большинство аминокислот или все аминокислоты вне доменов СИК не человеческого антитела заменены соответствующими аминокислотами, полученными из человеческих иммуноглобулинов. В одном из вариантов гуманизированной формы антитела некоторые аминокислоты, большинство аминокислот или все аминокислоты вне доменов СИК были заменены аминокислотами из иммуноглобулинов человека, тогда как некоторые аминокислоты, большинство аминокислот или все аминокислоты в одном или нескольких районах СИК остаются неизменными. Небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот допустимы, если они не приводят к потере способности антитела связываться с определенным антигеном. Гуманизированные антитела сохраняют антигенную специфичность, аналогичную специфичности исходного антитела.
Термин химерное антитело относится к антителу, в котором вариабельные районы получены из организма одного вида, а константные районы получены из другого вида, например, включает антитела, в которых вариабельные районы получены из мышиного антитела, а константные районы получены из антитела человека.
Термин антигенсвязывающий участок антитела (также называемый антигенсвязывающий фрагмент) относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность целого антитела специфически связываться с антигеном.
Термин рак относится к широкой группе различных заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом анормальных клеток в организме. Нерегулируемые деления и рост клеток приводят к образованию злокачественных опухолей, которые вторгаются в соседние ткани, а также могут метастазировать в отдаленные части тела путем проникновения через лимфатическую систему или кровь.
Термин СХСК4 (С-Х-С рецептор хемокинов 4) включает в себя варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфичные к СХСК4, могут в некоторых случаях перекрестно реагировать с молекулами СХСК4 других видов, отличных от человека. В других вариантах осуще- 6 026153 ствления антитела, специфичные к человеческому СХСК4, могут быть полностью специфичными к человеческому СХСК4 и не обладать кросс-реактивностью к молекулам других видов или типов.
Термин человеческий СХСК4 относится к последовательности человеческого СХСК4, например полной аминокислотной последовательности человеческого СХСК4, имеющей номер доступа Р61073 в ΟΕΝΒΑΝΚ® (8ЕЦ ГО N0: 51). СХСК4 также известен в данной области как, например, ЬЕ8ТК, Рикш или СО 184. Последовательность человеческого СХСК4 может отличаться от человеческого СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51, например, мутациями в консервативных или неконсервативных районах, при этом СХСК4 имеет, по существу, такую же биологическую функцию, как человеческий СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51. Например, биологической функцией человеческого СХСК4 является несение эпитопа на внеклеточном домене СХСК4, который специфически связывается антителом по настоящему изобретению, или биологической функцией человеческого СХСК4 является связывание хемокинов или вовлеченность в метастатический процесс.
Конкретная последовательность человеческого СХСК4, как правило, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности человеческого СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51 и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют аминокислотную последовательность как человеческую по сравнению с аминокислотными последовательностями СХСК4 других видов (например, мышиных). В некоторых случаях человеческий СХСК4 может быть по меньшей мере на 95 или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным аминокислотной последовательности СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51. В некоторых вариантах последовательность человеческого СХСК4 не будет иметь более 10 отличий в аминокислотной последовательности по сравнению с СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51. В некоторых вариантах человеческий СХСК4 может иметь не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 отличия в аминокислотной последовательности по сравнению с СХСК4 из 8ЕЦ ГО N0: 51. Процент идентичности может быть определен, как описано в настоящем документе.
СХСК4-экспрессирующий рак или СХСК4+-рак представляет собой рак, при котором злокачественные клетки, которые характеризуют этот рак, экспрессируют СХСК4 на поверхности клеток, и обычно на высоком уровне.
Термин гематологические злокачественные новообразования в настоящем документе включает в себя лимфому, лейкемию, миелому или лимфоидное злокачественное заболевание, а также рак селезенки и лимфатических узлов. Примеры лимфом, которые поддаются лечению описанными анти-СХСК4 антителами по данному изобретению включают Β-клеточные и Т-клеточные лимфомы. Β-клеточные лимфомы включают в себя как лимфому Ходжкина, так и большинство неходжкинских лимфом. Неограничивающие примеры Β-клеточных лимфом включают диффузную крупноклеточную Β-клеточную лимфому (ЛЬВСЬ), фолликулярную лимфому (РЬ), ассоциированную со слизистой лимфому лимфатической ткани (МАРТ), мелкоклеточную лимфобластную лимфому (перекрывается с хронической лимфоидной лейкемией), лимфому мантийных клеток (МСЬ), лимфому Беркитта, крупноклеточную Β-клеточную лимфому средостения, макроглобулинемию Вальденстрема, Β-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны узла (NМΖ^), лимфому маргинальной зоны селезенки (8ΜΖΡ), внутрисосудистую крупноклеточную Β-клеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому, лимфоматоидный гранулематоз. Неограничивающие примеры Т-клеточных лимфом включают экстранодальные Т-клеточные лимфомы, кожную Т-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому и ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому. Гематологические злокачественные заболевания также включают лейкозы, включая, но не ограничиваясь ими, вторичный лейкоз, хроническую лимфоцитарную лейкемию (СБЬ; также называемую хронической лимфоидной лейкемией), острую миелоидную лейкемию (АМЬ; также называемую острый лимфолейкоз), хроническую миелоидную лейкемию (СМЬ), пролимфоцитарную Β-клеточную лейкемию (Β-РРЬ), острую лимфобластную лейкемию (АРЬ) и миелодисплазию (МЛ8). Гематологические злокачественные заболевания дополнительно включают миеломы, включая, но не ограничиваясь ими, множественную миелому (ММ) и вялотекущую множественную миелому (8ММ). Другие гематологические и/или Β-клеточно- или Т-клеточно-ассоциированные раки охватываются термином гемобластозы. Например, гематологические злокачественные опухоли также включают раковые заболевания других гематопоэтических клеток, в том числе дендритных клеток, тромбоцитов, эритроцитов, естественных киллеров и полиморфно-ядерных лейкоцитов, например базофилов, эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов. Специалистам в данной области должно быть понятно, что эти предраковые состояния и раковые заболевания часто имеют разные названия, связанные с изменениями системы классификации, и что пациентам, имеющим лимфомы, классифицированные под различными названиями, также могут помочь терапевтические режимы согласно настоящему изобретению.
Термин 8ЛР-1 относится к фактору стромальных клеток 1, который является лигандом для СХСК4. Термин 8ЛР-1 охватывает различные изоформы 8ЛР-1, такие как 8ЛР-1а и 8ΌΡ-1β. Аминокислотная последовательность человеческого 8ЛР-1а имеет номер доступа № 954637 в СΕNΒΑNΚ®. Аминокислотная последовательность человеческого 8ΌΡ-1β имеет номер доступа № 000600 в СΕNΒΑNΚ®. Человеческий 8ЛР-1 также описан в патенте США № 5756084. 8ЛР-1 также известен как СХСЬ12. Аминокислотная последовательность человеческого 8ЛР-1 может отличаться от
- 7 026153
8ΌΡ-1ΝΡ 954637 или ΝΡ 000600, как описано здесь для СХСК4.
Термин путь передачи сигнала относится к биохимическим взаимодействиям между различными молекулами, вовлеченными в передачу сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Здесь используется словосочетание рецептор клеточной поверхности, которое включает, например, молекулы и комплексы молекул, способных принимать и передавать сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером рецептора клеточной поверхности по настоящему изобретению является рецептор СХСК4.
Термин субъект включает человека или любое другое животное. Термин другое животное включает, не ограничиваясь ими, позвоночных, таких как приматы, овцы, собаки, кошки, кролики, хорьки, грызуны, такие как мыши, крысы и морские свинки, различные виды птиц, таких как куры, а также амфибии и рептилии. В предпочтительных вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, такое как примат, овца, собака, кошка, кролик, хорек или грызун. В более предпочтительных вариантах осуществления субъектом является человек. Термины субъект, пациент и лицо используются здесь взаимозаменяемо.
Терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная доза лекарственного средства или терапевтического агента, такого как антитело по изобретению, - это любое количество лекарственного средства, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом способствует регрессу заболевания, о чем свидетельствуют снижение выраженности симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания или предотвращение неблагоприятных последствий или инвалидности в результате подавления заболевания. Терапевтически эффективное количество или доза лекарственного средства включают в себя профилактически эффективное количество или профилактически эффективную дозу, которые являются любым количеством лекарственного средства, которое при введении отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом субъекту с риском развития заболевания или субъекту, страдающему от рецидивов заболевания, подавляет развитие или рецидивы болезни. Свойство терапевтического агента способствовать регрессу заболевания может быть оценено с помощью различных способов, известных специалисту в данной области, например с помощью исследований на человеке в ходе клинических испытаний, исследований в модельных системах на животных для прогнозирования эффективности для человека или путем определения активности агента с помощью анализов ίη νίίτο.
Например, противораковый агент вызывает регресс рака у субъекта. В предпочтительных вариантах терапевтически эффективное количество лекарственного средства вызывает регресс рака вплоть до его устранения. Термин вызывает регресс рака означает, что введение эффективного количества лекарственного средства, как самого по себе, так и в комбинации с противоопухолевым агентом, приводит к снижению роста опухоли или уменьшению ее размера, некрозу опухоли, снижению тяжести по меньшей мере одного симптома заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания, предотвращению неблагоприятных последствий или инвалидности в результате подавления заболевания или иному ослаблению симптомов заболевания у пациента. Кроме того, термины эффективный и эффективность в отношении лечения включает в себя как фармакологическую эффективность, так и физиологическую безопасность. Фармакологическая эффективность относится к способности препарата приводить к регрессу рака у пациента. Физиологическая безопасность относится к уровню токсичности или другим нежелательным физиологическим эффектам на клеточном, органном и/или организменном уровне (побочным эффектам) в результате введения лекарственного средства.
Например, терапевтически эффективное количество или доза препарата для лечения опухолей предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% по сравнению с субъектами, не подвергающимися лечению. В наиболее предпочтительных вариантах терапевтически эффективное количество или доза лекарственного средства полностью ингибирует рост клеток или рост опухоли, т. е. предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли на 100%. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена в модельной системе на животных для прогнозирования эффективности в отношении опухолей человека. Кроме того, это свойство композиции может быть оценено путем анализа способности соединения ингибировать рост клеток; такое ингибирование может быть оценено ίη νίίτο с помощью анализов, известных специалисту в данной области. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения регресс опухоли может наблюдаться и продолжаться в течение по меньшей мере примерно 20 дней, более предпочтительно по меньшей мере примерно 40 дней или даже более предпочтительно по меньшей мере примерно 60 дней.
Термины лечение или терапия субъекта относятся к любому типу вмешательства или процесса, выполняемого над субъектом, или введения активного агента субъекту с целью изменения, облегчения, уменьшения, подавления, замедления или предотвращения наступления, прогрессирования, развития, степени тяжести или рецидивов симптомов, осложнения, состояния или биохимических признаков, связанных с заболеванием.
- 8 026153
Различные аспекты настоящего изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.
Анти-СХСК.4 антитела.
Человеческие моноклональные анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению могут быть получены с применением трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих компоненты иммунной системы человека, а не иммунной системы мыши. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых здесь НИМАВ ΜΘυδΕ® (ЪопЬсгд с1 а1., 1994) и КМ ΜΘυδΕ® (\УО 02/43478) соответственно. Получение примеров анти-СХСК4 антител по настоящему изобретению подробно описано в \УО 2008/060367. Антитела по настоящему изобретению характеризуются определенными функциональными особенностями или свойствами. Например, антитела связываются с нативным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. Предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению связывалось с СХСК4 с высоким сродством, например с К 1х 10-7 М или менее. Анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению предпочтительно имеют одну или несколько следующих характеристик:
(a) связывание с нативным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
(b) ингибирование связывания δΌΡ-1 с СХСК4;
(c) ингибирование δΌΡ-1-индуцированную входа кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4;
(б) ингибирование δΌΡ-1-индуцированной миграции клеток, экспрессирующих СХСК4;
(е) ингибирование образования капилляров эндотелиальными клетками пупочной вены человека;
(ί) связывание с человеческим СХСК4 с Кс 1 х 10-7 М или менее;
(д) индукции апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСК4;
(Н) ингибирование пролиферации опухолевых клеток СХСК4+ ίη νίίτο;
(ί) ингибирование пролиферации СХСК4 '-опухолевых клеток и/или индукция апоптоза СХСК4+опухолевых клеток ίη νίνο;
(ί) ингибирование метастазирования опухолевых клеток СХСК4' и/или (к) увеличение времени жизни субъекта, имеющего СХСК4'-опухоль.
Предпочтительно, чтобы антитело по данному изобретению связывалось с человеческим СХСК4 с Кс 5х10-8 М или менее, Кс 2х10-8 М или менее, Кс 5х10-9 М или менее, Кс 4х10-9 М или менее, Ки 3х 10-9 М или менее или Кс 2х 10-9 М или менее.
Предпочтительно, чтобы антитело ингибировало связывание δΌΡ-1 с человеческим СХСК4 с ЕС50 ингибирования 50 нМ или менее, более предпочтительно 30 нМ или менее, или 15 нМ или менее, или 10 нМ или менее, или 5 нМ или менее, или 3 нМ или менее (например, ЕС50 ингибирования составляет 28,60 нМ или менее, или 12,51 нМ или менее, или 2,256 нМ или менее).
Предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению ингибировало δΌΡ-1индуцированный вход кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4, с ЕС50 ингибирования 3 нМ или менее, более предпочтительно 2 нМ или менее, или 1 нМ или менее, или 0,9 нМ или менее, или 0,8 нМ или менее, или 0,7 нМ или менее, или 0,6 нМ или менее, или 0,5 нМ или менее, или 0,4 нМ или менее (например, 0,9046 нМ или менее, 0,5684 или менее, или 0,3219 нМ или менее).
Предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению ингибировало δΌΡ-1индуцированную миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4, с ЕС50 ингибирования 50 нМ или менее, более предпочтительно 30 нМ или менее, или 20 нМ или менее, или 15 нМ или менее (например, 18,99 нМ или менее, или 12,44 нМ или менее).
Стандартные анализы для оценки способности антитела связывать нативный человеческий СХСК4, экспрессирующийся на поверхности клетки, известны в данной области и включают, например, анализ методом проточной цитометрии с применением линии клеток, которые изначально экспрессируют нативный СХСК4 или которые были трансфицированы для экспрессии нативного СХСК4. Подходящие виды анализа описаны подробно в примерах. Предпочтительной линией клеток, экспрессирующей нативный СХСК4, является Т-клеточная линия СЕМ. Подходящие виды анализа для оценки ингибирования связывания δΌΡ-1, ингибирования δΌΡ-1-индуцированного входа кальция, ингибирования δΌΡ-1-индуцированной миграции клеток, ингибирования образования капилляров клетками НиУЕС, индукции апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСК4 ίη νίίτο и/или ίη νίνο, ингибирования роста СХСК4'-опухолевых клеток ίη νίίτο и/или ίη νίνο и/или ингибирования метастазирования СХСК4'-опухолевых клеток также описаны подробно в примерах. Аффинность связывания антител также может быть определена с помощью стандартных методов, например, путем анализа Скэтчарда.
Анти-СХСК4 антитела по изобретению также включают антигенсвязывающие фрагменты вышеуказанных антител. Было убедительно показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающий фрагмент антитела, включают (ί) РаЬ-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уь, УН, Съ и СН1; (ίί) Р(аЬ')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рб-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; и (ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из Уь и УН доменов одного плеча антитела.
- 9 026153
Из этих фрагментов, первоначально полученных путем протеолиза такими ферментами, как папаин и пепсин, впоследствии были разработаны моновалентные и поливалентные антигенсвязывающие фрагменты. Например, несмотря на то, что два домена Ρν-фрагмента, V и νΗ, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных методов синтетическим пептидным линкеров, что дает им возможность существовать в виде одной белковой цепи, в которой Уь и νΗ районы спарены с образованием моновалентных молекул, известных как одноцепочечные вариабельные фрагменты (δοΡν). Дивалентные или бивалентные молекулы δοΡν (ди-δϋΡν или би-δϋΡν) могут быть сконструированы путем объединения двух δϋΡν в одну пептидную цепь, известную как тандем δϋΡν, который содержит два района νΗ и два района Уь. δοΡν-димеры и более крупные мультимеры также могут быть сконструированы с помощью линкерных пептидов, содержащих менее 10 аминокислот и являющихся слишком короткими для сворачивания вместе двух вариабельных районов, что заставляет фрагменты δοΡν димеризоваться и образовывать диатела или формировать другие мультимеры. Было показано, что диатела связываются со своим антигеном с гораздо более высокой аффинностью, чем соответствующие δϋΡν, и имеют до 40 раз более низкие константы диссоциации, чем значения Кс для δοΡν. Очень короткие линкеры (<3 аминокислот) приводят к образованию трехвалентных триател или четырехвалентных тетрател, которые обладают еще более высоким сродством к своим антигенам, чем диатела. Другие варианты включают минитела, которые являются димерами 8θΡν-ΟΗ3, и более крупные фрагменты δοΡν-Ρο (димеры δθΡν-Сш-Сш), и даже изолированные СОК, которые могут проявлять антигенсвязывающую функцию. Эти фрагменты антител получают с применением обычных рекомбинантных методов, известных специалистам в данной области, а полученные фрагменты подвергают скринингу в отношении желаемых свойств таким же образом, как и интактные антитела. Все вышеперечисленные протеолитические и сконструированные фрагменты антител и связанные с ними варианты (см. Ηο11ίη§βΓ с1 а1., 2005; ΘΙαΓδοη с1 а1., 2010 для дополнительной информации) охватываются термином антигенсвязывающий участок антитела.
Моноклоналъные антитела Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2.
Предпочтительными антителами по настоящему изобретению являются человеческие моноклональные антитела Ρ7 (ΒΜδ-936564), Ρ9, Ό1 и Е2, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности νΗ антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 25, 26, 27 и 28 соответственно. Аминокислотные последовательности ν антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 ГО ΝΟ: 29, 30, 31 и 32 соответственно. Кроме того, были созданы альтернативные формы Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2, в которых определенные каркасные остатки были замещены остатками, соответствующими зародышевой линии, которые упоминаются здесь как Ρ7ΟΕ, Ρ9ΟΕ, ОЮЬ и Е2ОЬ. Аминокислотные последовательности νΗ антител Ρ7ΟΕ, Ρ9ΟΕ, ОЮЬ и Е2ОЬ показаны в 8Е0 ГО ΝΟ: 41, 42, 43 и 44 соответственно. Аминокислотные последовательности ν3 антител Ρ70Ε, Ρ90Ε, ОЮЬ и Е2ОЬ показаны в 8Е0 ГО ΝΟ: 45, 46, 47 и 48 соответственно. Другие анти-СХСК4 антитела по данному изобретению включают антитела, полученные в результате смешивания и составления различных районов νΗ и ν или различных СОК для создания антител, которые специфически связываются СХСК4, как описано в \\Ό 2008/ 060367.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает антитела, которые включают СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 тяжелой цепи и легкой цепи антител Ρ7, Ρ9, Ό1 или Е2, или их комбинации. Аминокислотные последовательности СГОК1 νΗ антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 1-4 соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК2 νΗ антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 5-8 соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК3 νΗ антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 9-12 соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК1 νι< антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 13-16 соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК2 νι< антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 17-20 соответственно. Аминокислотные последовательности СГОК3 νι< антител Ρ7, Ρ9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО ГО ΝΟ: 21-24 соответственно. Районы СОК, указанные выше, были определены с применением системы Кабат (КаЬа1 с1 а1., 1991).
В одном аспекте данное изобретение обеспечивает моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые специфически связывают СХСК4, предпочтительно человеческий СХСК4, и включают комбинацию районов νΗ и Уь, каждый из которых содержит три определяющих комплементарность района (СОК). В предпочтительных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок включает в себя:
(a) домены СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 в вариабельном районе тяжелой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 25 или 41, и СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 домены в вариабельном районе легкой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 29 или 45;
(b) домены СГОК 1, СГОК2 и СГОК3 в вариабельном районе тяжелой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 26 или 42, и СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 домены в вариабельном районе легкой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 30 или 46;
(c) домены СЭК.1, СГОК2 и СГОК3 в вариабельном районе тяжелой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 27 или 43, и СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 домены в вариабельном районе легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 31 или 47; или
- 10 026153 (б) домены СЭК1. СЭК2 и СЭВ3 в вариабельном районе тяжелой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 28 или 44, и СГОК1. СГОК2 и СГОВ3 домены в вариабельном районе легкой цепи, имеющем последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 32 или 48.
В других предпочтительных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению включают в себя:
(a) СГОВ1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 1, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 5, или их консервативные модификации; СГОВ3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 9, или их консервативные модификации; СГОВ1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 13, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 17, или их консервативные модификации; и СГОВ3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 21;
(b) СГОВ1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 2, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 6, или их консервативные модификации; СГОВ3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 10, или их консервативные модификации; СГОВ1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 14, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 18, или их консервативные модификации; и СГОВ3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 22;
(c) СГОВ1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 7, или их консервативные модификации; СГОВ3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11, или их консервативные модификации; СГОВ1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 15, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 19, или их консервативные модификации; и СГОВ3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 23; или (б) СГОВ1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 4, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанных аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или их консервативные модификации; СГОВ3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 12, или их консервативные модификации; СГОВ1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 16, или их консервативные модификации; СГОВ2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 20, или их консервативные модификации; и СГОВ3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 24.
В других вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению включают в себя:
(a) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 25 или 41, или их консервативные модификации, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 29 или 45, или консервативные модификации;
(b) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 26 или 42, или их консервативные модификации, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 30 или 46, или их консервативные модификации;
(c) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 27 или 43, или их консервативные модификации, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последова- 11 026153 тельности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 31 или 47, или их консервативные модификации; или (ά) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 28 или 44, или их консервативные модификации, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 32 или 48, или их консервативные модификации.
В предпочтительном варианте осуществления анти-СХСК4 антитело или его антигенсвязывающая часть включают в себя:
(a) СГОК1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 1;
(b) СГОК2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 5;
(c) СГОК3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 9;
(ά) СГОК1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 13;
(е) СГОК2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 17; и (ί) СГОК3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 21.
В другом предпочтительном варианте осуществления анти-СХСК4 антитело или его антигенсвязывающая часть включают в себя:
(a) СГОК1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 2;
(b) СГОК2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 6;
(c) СГОК3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 10;
(ά) СГОК1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 14;
(е) СГОК2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 18; и (ί) СГОК3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 22.
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и анти-СХСК4 антитела.
В другом варианте настоящее изобретение обеспечивает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопным районом (т. е. с таким же или перекрывающимся эпитопом) человеческого СХСК4, как любое из анти-СХСК4 моноклональных антител по настоящему изобретению (например, антитела, которые перекрестно конкурируют за связывание СХСК4 с любым из моноклональных антител по настоящему изобретению). В предпочтительных вариантах осуществления исходным антителом для исследований перекрестной конкуренции может быть моноклональное антитело Р7 (ВМ8-936564) (имеющее последовательности УН и Уь, показанные в §ЕЦ ГО N0: 25 и 29 соответственно) или моноклональное антитело Р9 (имеющее последовательности УН и Уъ, показанные в §ЕЦ ГО N0: 26 и 30 соответственно), или моноклональное антитело Ό1 (имеющее последовательности УН и Уъ, показанные в §ЕЦ ГО N0: 27 и 31 соответственно), или моноклональное антитело Е2 (имеющее последовательности УН и Уъ, показанные в §ЕЦ ГО N0: 28 и 32 соответственно).
Таким образом, данное изобретение обеспечивает человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые перекрестно конкурируют за связывание человеческого СХСК4 с антителом сравнения или его антигенсвязывающим участком сравнения, где антитело сравнения или его участок включают в себя:
(a) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 25, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 29;
(b) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 26, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 30;
(c) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 27, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 31; или (ά) вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 28, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 32.
- 12 026153
В предпочтительном аспекте перекрестно конкурирующее анти-СХСК4 моноклональное антитело по изобретению содержит район ^, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, полученной из последовательности зародышевой линии человеческого V 3-48, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 49, и/или район содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, полученной из последовательности зародышевой линии человеческого V Ь15, приведенной в §ЕЦ ГО N0: 50.
Перекрестно конкурирующие антитела могут быть идентифицированы по их способности к перекрестной конкуренции с Р7, Р9, Ό1, Е2 или любым другим анти-СХСК4 антителом сравнения по изобретению в стандартном анализе связывания СХСК4, например, анализе методом проточной цитометрии с клетками СЕМ, в котором антитело сравнения является РГТС-меченым и в котором оценивают способность тестируемого антитела к ингибированию связывания РГТС-меченого антитела сравнения с СЕМклетками.
Фармацевтические композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей одно моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению или их комбинацию, введенные в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, чтобы носитель был пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). Фармацевтическая композиция по изобретению может включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей, один или несколько антиоксидантов, водных и неводных носителей и/или адъювантов, таких как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты.
Режимы дозирования лекарственного средства подобраны для обеспечения оптимального желаемого ответа, например, терапевтического ответа или минимальных побочных эффектов.
Диапазоны дозировок для введения человеческого анти-СХСК4 антитела составляют примерно от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 20 мг/кг и, более предпочтительно, от 0,1 до 10 мг/кг веса тела субъекта. Например, дозы могут составлять 0,1, 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг веса тела, более предпочтительно 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг веса тела. Схемы дозирования, как правило, предназначены для достижения экспозиции, которая на основании типичных фармакокинетических свойствах антитела приводит к устойчивому связыванию рецепторов. Пример схемы лечения включает введение один раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в месяц, раз в 3 месяца или раз в 3-6 месяцев. Учитывая, что антитело ГдС4 обычно имеет период полувыведения 2-3 недели, предпочтительная схема дозирования анти-СХСК4 антитела по изобретению включает введение 0,3-20 мг/кг веса тела, предпочтительно 1-10 мг/кг веса тела, внутривенным путем, где антитело вводят каждые 7 или 14 дней в течение 6-, 8- и 12-недельного циклов до полного ответа или подтверждения прогрессирования заболевания.
Дозе и график дозирования могут меняться в течение курса лечения. Например, схемы дозирования анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению включают введение 1, 3 или 10 мг/кг веса тела антитела путем внутривенного (IV) введения, где антитело вводят согласно одному из следующих графиков дозирования: (Г) каждые 7 дней в течение 6-недельных циклов; (ГГ) каждые две недели вплоть до шести доз, затем каждые три месяца; (ГГГ) каждые три недели; (IV) 1-10 мг/кг веса тела один раз, а затем 1 мг/кг веса тела каждые 2-3 недели.
В некоторых методах одновременно вводят два или более моноклональных антитела с различной специфичностью связывания, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Антитела обычно вводят по несколько раз. Интервалы между разовыми дозами могут составлять, например, неделю, месяц, три месяца или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, и могут определяться, исходя из измерения уровней антител к антигену-мишени в крови у пациента. В некоторых способах дозу доводят до достижения концентрации антитела в плазме примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - примерно 25-300 мкг/мл.
В альтернативном варианте, антитело можно вводить в виде композиции пролонгированного высвобождения; в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота изменяются в зависимости от периода полувыведения антител у пациента. В целом, человеческие антитела показывают самый длительный период полувыведения, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и не человеческие антитела. Доза и частота введения могут изменяться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических целях вводят относительно низкие дозы при относительно длительных интервалах в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение на протяжении всей жизни. При терапевтическом применении иногда требуется введение относительно высокой дозы через относительно короткие интервалы, пока не замедлится или не прекратится прогрессирование заболевания и, предпочтительно, пока у пациента не будет наблюдаться частичное или полное облегчение симптомов болезни. После этого пациента можно
- 13 026153 переводить на профилактический режим.
Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут изменяться таким образом, чтобы получать такое количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, конкретной композиции и способа введения, но без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций по настоящему изобретению, или их сложных эфиров, солей или амидов, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, подлежащего лечению, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины. Композиция по настоящему изобретению может быть введена с помощью одного или нескольких путей введения, одного или нескольких способов, хорошо известных в данной области. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов.
Активные соединения могут быть смешаны с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, например, в композициях с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Множество способов приготовления таких препаратов запатентованы или хорошо известны специалистам в данной области. См., например, КоЬшкоп (1978).
Терапевтические композиции могут быть введены с помощью медицинских устройств, известных в данной области. Например, в предпочтительном варианте терапевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена с помощью безыгольного подкожного инъекционного устройства, такого как устройства, описанные в патентах США №5399163, 5383851 или 4941880. Раскрытия этих патентов включены в настоящее описание посредством ссылки. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули известны специалистам в данной области.
Применение и способы изобретения.
Такие антитела, композиции антител и способы по настоящему изобретению имеют многочисленные диагностические и терапевтические применения ίη νίίΐΌ и ίη νί\Ό. связанные с диагностикой и лечением СХСК4-ассоциированных расстройств, включая, например, способы лечения субъекта, страдающего СХСК4-экспрессирующим раком, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента, которые специфически связываются с СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. Предпочтительно, чтобы субъекты включали пациентов, имеющих нарушения, такие как гематологические злокачественные заболевания, которые связаны или опосредованы или зависят от активности СХСК4, или в которые вовлечен СХСК4/СХСЫ2 путь. В некоторых вариантах осуществления данных способов лечения пациента с раком анти-СХСК4 антитело или его фрагмент вводят в виде монотерапии, в то время как в других вариантах способов лечения его вводят в комбинации с другим агентом, таким как противоопухолевый химиотерапевтический агент. Когда антитела к СХСК4 вводят в комбинации с другим агентом, то оба компонента могут быть введены в любом порядке или одновременно.
СХСК4, как известно, экспрессируется на самых разнообразных типах опухолевых клеток и также, как известно, участвует в метастазировании опухолей. Кроме того, СХСК4, как известно, участвует в ВИЧ-инфекции в качестве ко-рецептора для проникновения ВИЧ в Т-клетки. Кроме того, было показано, что путь СХСК4/СХСЫ2 участвует в воспалительных процессах. Более того, СХСК4/СХСЫ2 путь, как было показано, участвует в ангиогенезе или неоваскуляризации. Соответственно, анти-СХСК4 антитела (а также иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы) по настоящему изобретению могут быть использованы в различных клинических случаях, включая следующие.
А. Рак.
Сверхэкспрессия СХСК4 была также продемонстрирована приблизительно для 75% раковых заболеваний, а в некоторых случаях была установлена обратная зависимость между экспрессией СХСК4 и прогнозом или выживаемостью пациентов. Неограничивающие примеры типов рака, связанных с экспрессией СХСК4 или путем СХСК4/СХСЫ2, включают опухоли, такие как опухоли груди (Ми11ег е! а1., 2001), яичников (Бсойоп е! а1., 2001), предстательной железы (ТаюЫтап е! а1., 2002), немелкоклеточный рак легких (§рапо е! а1., 2004), опухоли поджелудочной железы (КокЫЬа е! а1., 2000), прямой кишки ^ее1епЬег§ е! а1., 2003), почек (БсЫайег е! а1., 2002) и щитовидной железы (Н^апд е! а1., 2003), карциному носоглотки (^апд е! а1., 2005), меланому (§са1а е! а1., 2005), почечно-клеточный рак (§1а11ег е! а1., 2003), нейробластому (Оеттйег е! а1., 2001), глиобластому (Кетре1 е! а1., 2000), рабдобластому (ЫЬига е! а1., 2002) и остеосаркому (^аνе^ά^е^е е! а1., 2005), а также гематологические злокачественные заболевания, такие как острая лимфобластная лейкемия (Сга//о1ага е! а1., 2001), острая миелоидная лейкемия (МоЫ1е е! а1., 1998; КотЬоиЫ е! а1., 2004), множественная миелома (ЛНауей е! а1., 2007; Л/аЬ е! а1., 2009),
- 14 026153 хроническая лимфоидная лейкемия (МоЫе е! а1., 1999; Вигдег е! а1., 1999), хроническая миелоидная лейкемия (Ли е! а1., 2008) и неходжкинская лимфома (ВеЛоЛт е! а1., 2002; \Уепд е! а1., 2003).
Кроме того, этот путь вовлечен в стимулирование метастатического процесса нескольких новообразований (Мигрйу, 2001). В клинических исследованиях было показано, что СХСК4 связан с повышенной склонностью к метастазированию и снижением выживаемости и СХСК4 был определен в качестве прогностического показателя острой миелоидной лейкемии, рака молочной железы, толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников и рака поджелудочной железы, в которых высокая экспрессия СХСК4 коррелирует с тяжестью заболевания (8роо е! а1., 2007; Нй1ег е! а1., 2011; Ошйапо е! а1., 2006; 8рапо е! а1., 2004; Лапд е! а1.; 2006; МагееЛа1 е! а1., 2009).
Стромальные клетки костного мозга (ВМ8С) секретируют СХСЛ12, и его взаимодействие с СХСК4 имеет важное значение для хоминга и поддержания гемопоэтических стволовых клеток в микросреде ВМ (МоЫе е! а1., 1998). Лейкозные клетки экспрессируют высокие уровни СХСК4, и этот путь играет важную роль в миграции лейкозных клеток в ВМ, что, в свою очередь, поддерживает их рост и выживаемость. СХСК4 имеет важное значение для метастазирования в органах, таких как ВМ, где экспрессируется СХСБ12. В совокупности СХСК4 играет важную роль как в хоминге, так и в поддержании гемопоэтических стволовых клеток в ВМ, и антагонист СХСК4 направляет стволовые клетки в кровоток, что было показано с низкомолекулярным антагонистом СХСК4 АМО3100 (плериксафор; Мозобил), который был одобрен РИА для использования в комбинации с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором для аутологичных трансплантаций у пациентов с ИНЬ и ММ (Иаг е! а1., 2011). Было показано, что другой ингибитор СХСК4, АМЭ3465, является антагонистом СХСЬ12-индуцированного и стромаиндуцированного хемотаксиса и ингибирует активацию СХСЬ12-индуцируемых сигнальных путей лейкозных клеток, способствующих их выживанию Шепд е! а1., 2009). Кроме того, было показано, что АМО3465, отдельно или в комбинации с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, индуцировал выход АМЬ клеток и клеток-предшественников в кровоток и повышал антилейкемический эффект химиотерапии сорафенибом, в результате чего заметно снижалась тяжесть лейкемии и увеличивалось время жизни животных Шепд е! а1., 2009). Такие результаты показывают, что нарушение взаимодействий СХСК4/СХСЫ2 можно использовать для сенситизации лейкозных клеток к химиотерапии, нацеливаясь на защитное микроокружение костного мозга.
Как описано в примерах, были разработаны новые первые в своем классе человеческие терапевтические моноклональные антитела, направленные на СХСК4. Эти моноклональные антитела связываются с СХСК4-экспрессирующими клетками с низкой наномолярной аффинностью, блокируя взаимодействие СХСЬ12 с СХСК4-экспрессирующими клетками и ингибируя СХСЬ12-индуцированную миграцию и вход кальция с низкими наномолярными значениями ЕС50. Важно отметить, что в дополнение к блокированию индуцированного СХСЬ12 входа кальция и миграции, данные, представленные в примерах, также показывают, что механизм действия этих человеческих анти-СХСК4 антител включает антителозависимую индукцию апоптоза СХСК4-экспрессирующих опухолевых клеток. Антитело-индуцированный апоптоз приводит к воспроизводимой эффективности ίη У1уо для множества ксенотрансплантатных моделей гемопоэтической опухоли. Так как низкомолекулярные СХСК4-антагонисты усиливают выход опухолевых клеток СХСК4 из ВМ, тем самым увеличивая хемосенситизацию, но не убивают напрямую опухолевые клетки, эффективность уничтожения раковых клеток анти-СХСК4 антителами по настоящему изобретению была удивительной и неожиданной.
Поскольку СХСК4 играет роль в нескольких фундаментальных аспектах рака, включая пролиферацию, миграцию/инвазию и ангиогенез, антагонист потенциально может действовать на злокачественные новообразования, в которых экспрессируется СХСК4, через различные направления. Для того чтобы разобщать указанный путь, были разработаны полностью человеческие моноклональные антитела к СХСК4 и СХСЬ12 соответственно. Как анти-СХСК4, так и анти-СХСЬ12 антитела ингибируют связывание лиганда с СХСК4, приводя к ингибированию лиганд-индуцированных клеточных реакций, таких как вход кальция и миграция (примеры 4-6). В дополнение к этим функциям путь СХСК4/СХСЫ2 был вовлечен в стимуляцию ангиогенеза (Си1еп§ е! а1., 2005); Ρίη§ е! а1., 2011). Анти-СХСК4 (пример 7) и антиСХСЬ12 (данные не приведены) антитела также ингибируют формирование эндотелиальной трубки демонстрации ангиогенеза ίη уйго.
Чтобы исследовать эффекты нарушения взаимодействий СХСК4/СХСЫ2, была протестирована эффективность антител в отношении ослабления роста опухоли в разнообразных ксенотрансплантатных моделях ίη У1уо. В качестве модели ИНЬ (лимфома Беркитта) мышам 8СГО были привиты клетки Каток, и в качестве положительного контроля был использован ритуксимаб. Неожиданным оказалось то, что анти-СХСЬ12 антитела не контролировали рост опухоли и не отличались от введения носителя и контрольного изотипа. В противоположность этому, анти-СХСК4 антитела ВМ8-936564 продемонстрировали почти полный контроль роста опухоли с активностью, аналогичной ритуксимабу (пример 14). Поскольку блокирование хемотаксиса ίη уйго было похожим для этих двух антител (пример 6), то противоопухолевый эффект, вероятно, не зависит от блокирования пути СХСЫ2/СХСК4. Соответственно, далее был протестирован прямой цитотоксический эффект ВМ8-936564 в анализе пролиферации клеток Каток. СХСЬ12 участвует как аутокринный фактор, способствующий росту клеток, и в отдельном ис- 15 026153 следовании миРНК для СХСБ12 ингибирует рост клеток ВК5-1 (Ьш с1 а1., 2011; Кщ1и с1 а1., 2011). Несмотря на то что подавление роста было частичным, наблюдалось дозозависимое ингибирование пролиферации антителами анти-СХСК4, в то время как ΆΜΌ3100 и анти-СХСЬ12 антитела не имели никакого эффекта (пример 8). Недавно было показано, что полипептид из 14 аминокислотных остатков, который является специфическим антагонистом СХСК4 (ВКТ140), ингибирует пролиферацию клеток множественной миеломы (ВсИсг с1 а1., 2011). Было высказано предположение, что ΆΜΌ3100 является слабым частичным агонистом, в то время как ВКТ140 действует как обратный агонист (Ζ1ι;·ιη§ с1 а1., 2002).
С учетом вышеизложенного анти-СХСК.4 антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в способе лечения человека, больного раком, экспрессирующим СХСК4, включающем введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента, которые специфически связываются с рецептором СХСК4, экспрессирующимся на поверхности раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления способ лечения используется в качестве профилактики для субъекта, который был ранее болен или который имеет риск ракового заболевания. В предпочтительных вариантах осуществления субъектом является человек, и антитело или его фрагмент связывается с человеческим рецептором СХСК4. В других предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, который связывается с рецептором СХСК4, ингибирует активность рецептора. Соответственно, антитело или его фрагмент нарушают хоминг и поддержание гемопоэтических стволовых клеток в микроокружении ВМ и/или увеличивают выход клеток из ВМ на периферию и тем самым повышают чувствительность гематопоэтических раковых клеток к химиотерапевтическим агентам. В других предпочтительных вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело или его фрагмент индуцируют апоптоз в экспрессирующих СХСК4 клетках. Апоптоз целевых раковых клеток позволяет использовать антитела в качестве монотерапии.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент являются химерными, гуманизированными или человеческими. В предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент представляют собой человеческое антитело или его фрагмент. В других предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент включают домены СГОКЕ СЭК2 и СЭК3 в вариабельном районе тяжелой цепи, содержащем последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8ЕО ГО N0: 25, и домены СОК1, СГОК2 и СГОК3 в вариабельном районе легкой цепи, содержащем последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 81ГО ГО N0: 29.
В некоторых вариантах осуществления в соответствии с разграничением СОК последовательностей по системе Кабат анти-СХСК4 антитело или его фрагмент содержат СГОК1 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 1, СГОК2 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 5, СГОК3 вариабельного района тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 9, СЭК1 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 13, СГОК2 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 17, и СГОК3 вариабельного района легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, которая приведена в 8Е0 ГО N0: 21.
В других вариантах осуществления настоящих способов анти-СХСК4 антитело или его фрагмент содержат вариабельный район тяжелой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 25, и вариабельный район легкой цепи, содержащий последовательно связанные аминокислоты в последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 29. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анти-СХСК4 антитело или его фрагмент представляют собой антитело ΙβΟι или Ι§04 или его фрагмент. В более предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент являются ВМ8-936564 или его СХСК4-связывающим фрагментом.
Раковые заболевания, поддающиеся способам лечения, описанным здесь, включают солидные опухоли и гематологические злокачественные новообразования. В некоторых вариантах опухоль является опухолью молочной железы, яичников, предстательной железы, немелкоклеточным раком легкого, опухолью поджелудочной железы, щитовидной железы, толстой кишки и раком почки, раком носоглотки, меланомой, почечно-клеточной карциномой, нейробластомой, глиобластомой, рабдомиосаркомой и остеосаркомой. В других вариантах гематологические злокачественные новообразования являются множественной миеломой, острой миелоидной лимфомой, неходжкинской лимфомой, хронической лимфоидной лейкимией, фолликулярной лимфомой, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, лимфомой Беркитта, иммунобластной крупноклеточной лимфомой, В-лимфобластной лимфомой из клетокпредшественников, лимфомой из клеток мантийной зоны, острой лимфобластной лейкемией, грибовидным микозом, анапластической крупноклеточной лимфомой и Т-лимфобластной лимфомой из клетокпредшественников. В предпочтительных вариантах осуществления гематологические злокачественные новообразования являются множественной миеломой, неходжкинской лимфомой, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, фолликулярной лимфомой, острой миелоидной лимфомой, острой
- 16 026153 лимфобластной лейкемией или хронической лимфоидной лейкемией.
Множественная миелома (ММ) является злокачественным новообразованием плазматических клеток и характеризуется накоплением злокачественных секретирующих иммуноглобулин плазматических клеток в костном мозге, что может привести к разрушению костной ткани, нарушениям работы спинного мозга, нарушению функции почек и периферической нейропатии. Средняя выживаемость после традиционных способов лечения составляет 3-4 года и может быть увеличена до 5-7 лет при лечении с применением высоких доз с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (Н8СТ) (КааЬ е! а1., 2009).
В настоящее время утвержденные схемы, обычно используемые для ММ, включают схемы на основе мелфалана для индукции и бортезомиба (УЕЬСАОЕ®) или иммуномодулирующих препаратов (ΙΜίΌ), включая схемы, основанные на талидомиде или леналидомиде (КЕУЫМГО®) в качестве препаратов для индукции и для субъектов с рецидивами. Для пациентов с рецидивирующей или резистентной ММ варианты лечения включают Н8СТ, повторение предыдущей схемы лечения химиотерапией или новую схему химиотерапии. Н8СТ связана с более высоким риском причинения вреда пациенту. Кроме того, некоторым субъектам Н8СТ не доступна в связи с тяжелым соматическим статусом или сопутствующими заболеваниями. В настоящее время не существует способа излечения заболевания, и существующие способы лечения могут лишь замедлить прогрессирование заболевания, продлить время жизни и свести к минимуму симптомы. Почти все субъекты с ММ, которые выживают после терапии, имеют рецидив или далее не поддаются лечению, независимо от линии терапии, и требуют дальнейшего лечения (1еша1 е! а1., 2005). Таким образом, для пациентов с ММ существует значительная неудовлетворенная медицинская потребность. В предпочтительном варианте осуществления способов лечения по настоящему документу гематологической злокачественной опухолью является множественная миелома, в том числе рецидивирующая или резистентная ММ.
Острая миелоидная лейкемия (АМЬ) является наиболее распространенной острой лейкемией у взрослых, составляя 80% случаев. Более 13000 пациентов с АМЬ диагностируется в США в год, количество смертей составляет более чем 8820 (Сапсег Рас!к аиб Идигек, 2008). Лечение взрослых с АМЬ включает индукционную химиотерапию для достижения ремиссии и химиотерапию после ремиссии (совместно с трансплантацией стволовых клеток или без нее) во избежание рецидива. Частота индукции ремиссии колеблется от 50 до 85%. Болезнь повторяется у большинства субъектов. Лечение рецидивов АМЬ связано с относительно низкими уровнями ремиссии, и немногие пациенты имеют длительный положительный эффект (Вгеетк е! а1., 2005).
Текущие варианты лечения взрослых с рецидивирующей или резистентной АМЬ включают химиотерапию и Н8СТ. Аллогенная Н8СТ считается наиболее предпочтительным методом лечения при недостаточной первичной индукции или после первой полной ремиссии (СК) и приводит к долгосрочной выживаемости без заболевания лишь примерно у 20% больных. Тем не менее, Н8СТ не является приемлемой или недоступной для большого количества пациентов по различным причинам (например, ранний рецидив, нет доступа к ресурсам для трансплантации). Все это, наряду с тем, что пациенты, имеющие рецидивы или являющиеся невосприимчивыми к традиционной химиотерапии, имеют худшие прогнозы и ответы на химиотерапию в сравнении с теми, у кого впервые была выявлена острая лейкемия, требует разработки новых нацеленных средств для данной группы пациентов. В предпочтительном варианте осуществления способов лечения по настоящему документу гематологическое злокачественное заболевание является острой миелоидной лейкемией, в том числе рецидивирующей АМЬ.
Хроническая лимфоидная лейкемия (СЬЬ) является наиболее распространенным лейкозом в западных странах и составляет 30% всех лейкозов в США. Примерно 14570 новых случаев СЬЬ будет выявлено в 2011 году (81еде1 е! а1., 2011), и смертность составит около 4400 пациентов. Заболевание характеризуется прогрессированием функционально некомпетентных моноклональных лимфоцитов, что приводит к лимфаденопатии, спленомегалии, гепатомегалии и значительному лимфоцитозу в периферической крови и костном мозге. Большинство пациентов с СЬЬ первоначально демонстрируют полную или частичную ремиссию после химиотерапии, но, за исключением тех пациентов, которых лечили Н8СТ, почти у всех пациентов проявляются рецидивы после прекращения лечения или развивается устойчивость к терапии. В настоящее время первичное лечение СЬЬ включает обычную химиотерапию и/или терапию моноклональными антителами (ритуксимаб). Время жизни большинства пациентов составляет 5-10 лет с усилением заболевания с течением времени. Для пациентов с рецидивирующей/резистентной СЬЬ в настоящее время способы лечения не излечивают болезнь, и средняя выживаемость, по некоторым оценкам, составляет 16 месяцев. В предпочтительном варианте осуществления способов лечения по настоящему документу гематологическим злокачественным заболеванием является хроническая лимфоидная лейкемия, в том числе рецидивирующая СЬЬ.
Фолликулярная лимфома (РЬ) является второй наиболее распространенной лимфомой в Соединенных Штатах и Западной Европе, что составляет около 20% от ΝΉΕ (в целом) и большую часть лимфом низкой тяжести. Несмотря на то что большинство пациентов реагирует на первичную терапию (примерно 40-80% полной ремиссии), в зависимости от схемы лечения, почти у всех пациентов позднее развива- 17 026153 ется прогрессирующее заболевание. Кроме того, до 10% пациентов являются нечувствительными к первичному лечению. Таким образом, требуются новые, более эффективные способы лечения. В предпочтительном варианте осуществления способов лечения по настоящему документу гематологическим злокачественным заболеванием является фолликулярная лимфома, в том числе рецидивирующая РЬ.
Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ИЬВСЬ) является наиболее распространенным типом ΝΉΡ, на который приходится 25-30% случаев заболеваний взрослых (40% от ΝΉΡ среди пациентов старше 75 лет). ИЬВСЬ имеет несколько подтипов, включая, но не ограничиваясь ими, лимфому из зародышевого центра В (ОСВ), лимфому активированных В-клеток (АВС) и лимфому первичного медиастинального типа (О155с1Ьгсс1и с1 а1., 2011). Общая выживаемость (Θ8) в течение 3 лет у пациентов после лечения для ОСВ и АВС составляет 84 и 56% соответственно. Большинство пациентов с ИЬВСЬ не излечиваются традиционной терапией. После рецидива, в то время как по меньшей мере 60% пациентов остаются чувствительными к традиционной терапии, менее 10% пациентов имеют более длительную выживаемость без признаков заболевания при схеме лечения второй линии (О|55с1ЬгссН1 с1 а1., 2010). У подгруппы пациентов с чувствительным к химиотерапии заболеванием рецидивирующая или резистентная (г/г) ИЬВСЬ подвергается лечению химиотерапией (совместно с ритуксимабом или без него) с целью применения последующей высокодозовой химиотерапии и трансплантации. Примерно 50% пациентов, отвечающих на схему второй химиотерапии, при последующей Н8СТ, поддерживают ответ в течение 2 лет. Для пациентов, не являющихся кандидатами на трансплантацию, которые не ответили на вторую линию, или пациентов, имеющих рецидивы после трансплантации, терапия является паллиативной. Без трансплантации химиотерапия обеспечивает краткосрочный контроль г/г заболеваний ИЬВСЬ. Для пациентов, не отвечающих на первичное лечение, низка вероятность достижения СК после второй схемы химиотерапии, и наблюдается рецидив, а вторая ремиссия обычно не является длительной (§тдет с1 а1., 1986). Так как ИЬВСЬ первоначально является восприимчивым к химиотерапии заболеванием, то дополнительное применение агента, такого как анти-СХСК4 антитело по настоящему изобретению, для восстановления чувствительности к химиотерапии является надежной стратегией для лечения этого заболевания. В предпочтительном варианте способов лечения по настоящему документу гематологическим злокачественным новообразованием является диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, в том числе рецидивирующая или резистентная ИЬВСЬ.
Исходя из данных исследований ВИЧ-1, описывающих СХСК4-опосредованный апоптоз при связывании гликопротеина оболочки ВИЧ-1 др120 с СХСК4 (Оагд е1 а1., 2006; Ветб! е1 а1., 1998), была оценена способность анти-СХСК4 антитела по изобретению, ВМ8-936564, индуцировать апоптоз экспрессирующих СХСК4 клеточных линий. ВМ8-936564-индуцированный апоптоз был продемонстрирован более чем на 20 различных экспрессирующих СХСК4 клеточных линиях (см. пример 11 и табл. 3 и 4), что подтверждает, что этот механизм не ограничивается одним типом клеток.
Апоптоз был также продемонстрирован на ίη νίίτο модели минимальной остаточной болезни (МКИ) для хронической лимфоидной лейкемии (КаШуар е! а1., 2012). Избавление от МКИ является одной из самых сложных задач лечения СЬЬ. На этой модели МКИ, которая основана на ко-культивировании стромальных клеток, которые экспрессируют и секретируют СХСБ12 и обеспечивают поддержание выживания первичных лейкозных клеток от пациентов с СЬЬ, СЬЬ-клетки демонстрируют повышенную жизнеспособность (20-60% через 48 ч) и устойчивость к химиотерапевтическим агентам. Тем не менее, наномолярные концентрации (2-200 нМ) ВМ8-936564 индуцировали гибель СЬЬ-клеток как культивированных отдельно, так и инкубированных с применением модели МКИ. Проапоптотическая активность ВМ8-936564 оказалась Р53-независимой, так как апоптоз наблюдался среди СЬЬ-клеток пациентов с делецией 17р и резистентностью к флударабину ίη νίίτο. ВМ8-936564 также ингибирует СХСЬ12опосредованную полимеризацию Р-актина в СЬЬ-клетках при более низких концентрациях, чем с АМИ-3100, низкомолекулярный ингибитор СХСК4. Эти данные позволяют предположить, что ВМ8-936564 может эффективно действовать на СЬЬ-клетки, присутствующие в опухолевом микроокружения ίη νίνο, которые могут способствовать МКИ (Какйуар е! а1., 2012).
Апоптотический эффект анти-СХСК4 антител по изобретению, свойство, которое не проявляется низкомолекулярными антагонистами СХСК4, например АМИ3100, указывает, что эти антитела могут быть использованы отдельно, в виде монотерапии, для лечения пациентов с раком. Предыдущие исследования влияния антагонистов СХСК4 ίη νίνο на опухолевых моделях АМЬ и ММ предполагают, что эти антагонисты эффективны для повышения чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии (А/аЬ е! а1., 2009; геид е! а1., 2009). В противоположность этому, данные, представленные в данном документе в примерах, показывают, что статистически значимое ингибирование роста опухоли было достигнуто, когда ВМ8-936564 вводили в виде монотерапии при самых различных моделях АМЬ, ΝΗΕ и ММ. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способов лечения по настоящему документу антиСХСК4 антитело или его фрагмент вводят в виде монотерапии. В предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент индуцируют апоптоз экспрессирующих СХСК4 клеток. Соответственно, это изобретение обеспечивает способ индукции апоптоза экспрессирующих СХСК4 раковых клеток, включая клетки большинства гематологических злокачественных новообразований, путем введения субъекту, страдающему раком, терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента,
- 18 026153 которые специфически связывают рецептор СХСК4, экспрессирующийся на поверхности клетки.
Поскольку ΒΜδ-936564 является 1§С4 антителом, его эффективность ίη νίνο не может быть объяснена АОСС или СЭС. Тем не менее, не исключено, что антитело при связывании с СХСК4-экспрессирующими клетками взаимодействует с рецепторами Рсу К1, экспрессируемыми на антиген-презентирующих клетках, что ведет к фагоцитозу. Клеточные линии, в которых наблюдалась эффективность ΒΜδ-936564 ίη νίνο, требовали вторичные анти-Рс-антитела к ΒΜδ-936564 для индукции апоптоза ίη νίίτο (пример 11). Это может быть следствием более низкой экспрессии СХСК4 на этих конкретных клеточных линиях. Если механизм инициации апоптоза зависит от близости молекул СХСК4, и плотность СХСК4 на поверхности клетки низка по сравнению с расстоянием, обеспечиваемым связыванием анти-СХСК4 антителом, то вторичные анти-Рс антитела с высоким сродством могут потребоваться для преодоления этого расстояния и группировки рецепторов с целью проведения сигнала апоптоза. Ιη νίνο это может быть достигнуто с помощью Рсу К1-рецепторов.
Данные, описанные здесь, предполагают новый механизм действия анти-СХСК4 антител в дополнение к их роли в мобилизации клеток, включающий апоптоз СХСК4-экспрессирующих клетокмишеней. Эти данные показывают, что ΒΜδ-936564 могут обеспечить эффективную терапию гематологических злокачественных заболеваний, включая ΜΜ, ΑΜΡ и различные ΝΗΡ, такие как РЬ и ΌΡΒί'.Έ а также для солидных злокачественных опухолей. Однако способы по настоящему изобретению необязательно ограничены каким-либо конкретным механизмом действия анти-СХСК4 антитела по изобретению. Например, СХСК4 может модулировать эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) в ММ-клетках, а анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению могут ингибировать ЕМТ, в пользу чего свидетельствуют данные о том, что ΒΜδ-936564 ингибирует ЕМТ-родственные белки Τ^ίδί, δηαίΐ и δΐιΐβ и частично регулирует Е-кадгерин (Κο^ατο с1 а1., 2012). Эти данные подтверждают мнение о том, что СХСК4 может представлять собой важную терапевтическую мишень из-за его способности модулировать ЕМТ.
Ранее было показано, что путь СХСК4/СХСЫ2 играет важную роль в хоминге и передвижении клеток ММ к ВМ, а нарушение взаимодействия опухолевых клеток с ВМ приводит к повышенной чувствительности к терапевтическим агентам (АРаусй с1 а1., 2007; А/аЬ с1 а1., 2009). Эти данные позволяют предположить, что новое анти-СХСК4 человеческое антитело ΒΜδ-936564 может предотвратить хоминг и адгезию клеток ММ в ВМ и сделать эти клетки чувствительными к терапевтическим агентам. Примечательно, что важность этого принципа для нацеливания на СХСК4 далее подтверждается данными ίη νίνο, представленными ^ссаго с1 а1. (2012), которые использовали первичные клетки ΜΜ (СО138+), клеточные линии ΜΜ (ΜΜ.1δ, ΚΡΜΙ.8226) и первичные ΜΜ стромальные клетки костного мозга (ΒΜδС), чтобы оценить миграцию к СХСЬ12 и ΒΜδΟ Цитотоксичность и синтез ДНК измеряли с помощью МТТ-теста и поглощения тимидина соответственно. Для проверки эффекта анти-СХС4 на модуляцию метастазов опухолевых клеток была использована модель меланомы мыши ίη νίνο. Было показано, что (1) мыши, получавшие ΒΜδ-936564, имели меньшее распространение клеток ММ в дальних участках костного мозга по сравнению с мышами, получавшими носитель, что, в свою очередь, подтверждает гипотезу о том, что СХСК4 может представлять собой важный модулятор распространения опухолевых клеток; (2) на модели ксенотрансплантата меланомы мыши, получавшие ΒΜδ-936564, демонстрировали уменьшенное количество метастазов по сравнению с мышами, получавшими носитель; и (3) ΒΜδ-936564 ίη νίίτο функционально влиял на клетки ММ в отношении миграции, адгезии и выживания (^ссаго с1 а1., 2012).
Кроме того, было показано, что ΒΜδ-936564 дозозависимо ингибирует миграцию клеток ММ в направлении СХСБ12 и первичных ΜΜ ΒΜδΟ Адгезия первичных клеток ММ к ΒΜδС также дозозависимо ингибируется ΒΜδ-936564 и также включает индукцию цитотоксичности для первичных СЭ138' клеток ВМ. Антитела ΒΜδ-936564 влияли на клетки ММ в отношении среды ВМ путем преодоления ΒΜδС-индуцированной пролиферации опухолевых клеток. Кроме того, ΒΜδ-936564 синергически усиливает бортезомиб-индуцированную цитотоксичность для клеток ΜΜ (Κο^ατο с1 а1., 2012). Как описано в примере 11, ΒΜδ-936564-зависимая активации апоптоза в клетках ММ была продемонстрирована путем расщепления каспазы-9 и ΡΑΚΡ. ΒΜδ-936564 дозозависимо ингибировало СХСЬ12-индуцированное фосфорилирование ЕКК, Ак! и δΐΌ. Важно отметить, что, как описано в примере 16, ΒΜδ-936564 ингибирует пролиферацию клеток ΜΜ ίη νίνο на модели ксенотрансплантата мыши.
В целом, эти данные четко показывают, что влияние на СХСК-4 на клетках ММ с помощью антиСХСК4 антитела обеспечивает эффективное средство для лечения рака в целом и, в частности, ММ, возможно, действующее через несколько механизмов.
Анти-СХСК4 антитела по изобретению могут быть также использованы в комбинации с другими противоопухолевыми средствами, такими как операция и/или облучение, и/или могут быть введены совместно с одним или более другими терапевтическими агентами, например цитотоксическим агентом, радиотоксичным агентом или иммунодепрессантом, которые усиливают или увеличивают терапевтический эффект анти-СХСК4 антитела. Антитело может быть связано с агентом (в виде иммуноконъюгата) или может быть введено отдельно от агента. В последнем случае (раздельное введение) антитело можно
- 19 026153 вводить до, после или одновременно с агентом, или можно вводить совместно с другими известными терапевтическими агентами, в том числе обычными химиотерапевтическими препаратами и антителами, которые связываются с антигенами опухоли или иммунорегуляторными компонентами. Химиотерапевтические препараты включают, среди прочих, доксорубицин (адриамицин), сульфат блеомицина, цисплатин, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, леналидомид, бортезомиб, дексаметазон, митоксантрон, этопозид, цитарабин, бендамустин, ритуксимаб, ифосфамид, карбоплатин и этопозид. Совместное введение анти-СХСК4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению с химиотерапевтическими агентами обеспечивает два противораковых агента, которые действуют по разным механизмам и которые приводят к цитотоксическому действию на опухолевые клетки человека. Такое совместное введение может решить проблемы развития резистентности к лекарственным средствам или к изменению антигенности опухолевых клеток, которые делают их инертными по отношению к антителу.
В других вариантах осуществления субъект может дополнительно получать агент, который модулирует, например увеличивает или ингибирует, экспрессию или активность Рсу или рецепторов Рсу, например субъекта можно лечить цитокином. Предпочтительные цитокины для введения при лечении мультиспецифической молекулой включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), интерферон-γ (ΙΡΝ-γ) и фактор некроза опухоли (ΤΝΡ).
Антитела по настоящему изобретению могут также использоваться в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими антителами или другими связывающими агентами, такими как слитые белки 1д. Неограничивающие примеры других антител или связывающих агентов, с которыми анти-СХСК4 антитела данного изобретения могут быть введены в комбинации, включают антитела или связывающие агенты к СТЬА-4, Р8МА, СЭ30. ΙΡ-10, ΙΡΝ-γ, СЭ70. ΡΌ-1, ΡΌ-Ы, ΚΙΚ, ΤΝΡ, ΤΝΡК, УЕОР, УЕОР-К, ССК5, 1Ь-1, 1Ь-18, 1Ь-18К, СО19, СО52, С81, ЕОРК, СО33, СО20, Нег-2, СО25, др11Ь/111а, 1дЕ, СЭ11а, а 4 интегрину, ΙΡΝα и ΙΡΝΑΚ1.
Существует все больше доказательств, что нарушение пути СХСК4 и нарушения взаимодействия между гематологическими раковыми клетками, такими как клетки ММ, и их микроокружением в костном мозге придает большую чувствительность ММ к противораковым методам лечения, таким как методы лечения с применением леналидомида и бортезомиба. Как описано в примерах, неклинические данные о ВМ8-936564 в качестве монотерапии или о комбинации этого антитела с химиотерапией на клеточных линиях ММ и ксенотрансплантатах показывают, что ВМ8-936564 активен в отношении ММ и может повышать эффективность режимов лечения, таких как леналидомид/дексаметазон и бортезомиб. Доклинические исследования также показали, что ингибирование СХСК4 молекулой АМЭ3100 приводит к откреплению клеток ММ от стромальных клеток костного мозга и мобилизации этих клеток на периферию, что приводит к повышенной чувствительности к бортезомибу (А/аЬ еί а1., 2009). Анти-СХСК4 антитела по изобретению аналогично усиливают действие химиотерапии за счет их способности высвобождать злокачественные клетки из защитной среды ВМ. В дополнение к мобилизации клеток ММ и повышению их чувствительности к химиотерапии эти антитела среди других возможных механизмов имеют дополнительный эффект непосредственного уничтожения клеток ММ путем апоптоза (пример 11). Было показано, что ВМ8-936564 ингибирует рост опухоли ММ ίη νίνο при введении как отдельно, так и в комбинации с леналидомидом или бортезомибом (пример 16).
В некоторых вариантах осуществления способов лечения по настоящему документу способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного химиотерапевтического агента в комбинации с анти-СХСК4 антителом или его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ММ, а по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство представляет собой леналидомид в комбинации с низкими дозами дексаметазона или бортезомиб в комбинации с дексаметазоном. Эти комбинации химиотерапии являются стандартные схемами, которые доказали терапевтическую эффективность у пациентов с рецидивирующей или резистентной ММ, а профиль безопасности этих химиотерапевтических агентов хорошо исследован. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело вводят еженедельно в цикле 1 в течение первых двух недель в качестве монотерапии, а затем в комбинации с курсом химиотерапии, который включает леналидомид в комбинации с низкими дозами дексаметазона или бортезомиб в комбинации с дексаметазоном.
Например, для лечения ММ с помощью ВМ8-936564 в комбинации с леналидомидом и дексаметазоном иллюстративный режим дозирования включает в себя:
(1) введение ВМ8-936564 (1, 3 или 10 мг/кг) в виде одной 60-минутной внутривенной инфузии на 1, 8, 15, 22, 29 и 36 дни (цикл 1) и на 1, 8, 15 и 22 дни (цикл 2 и последующие циклы);
(2) введение леналидомида (25 мг перорально) в течение 21 дня (15-35 дни; цикл 1) и на 1-21 дни (цикл 2 и последующие циклы);
(3) введение дексаметазона (40 мг) на 15, 22, 29 и 36 дни (цикл 1) и на 1, 8, 15 и 22 дни (цикл 2 и последующие циклы).
- 20 026153
Для лечения ММ с помощью ΒΜδ-936564 в комбинации с бортезомибом и дексаметазоном иллюстративный режим дозирования включает в себя:
(1) введение ΒΜδ-936564 (1, 3 или 10 мг/кг) в виде одной 60-минутной внутривенной инфузии на 1, 8, 15, 22 и 29 дни (цикл 1) и на 1, 8 и 15 дни (цикл 2 и последующие циклы);
(2) введение бортезомиба (1,3 мг/м2) в виде 3-5-секундных внутривенных введений на 15, 18, 22 и 25 дни (цикл 1) и на 1, 4, 8, 11 дни (цикл 2 и последующие циклы);
(3) введение дексаметазона (20 мг) на 15, 16, 18, 19, 22, 23, 25 и 26 дни (цикл 1) и на 1, 2, 4, 5, 8, 9, 11 и 12 дни (цикл 2 и последующие циклы).
В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ЛМЬ и по меньшей мере один химиотерапевтический агент, вводимый пациенту с раком в комбинации с анти-СХСК4 антителом или его фрагментом по изобретению, является митоксантроном, этопозидом и/или цитарабином, поскольку такие схемы считается стандартными для лечения рецидивов и не отвечающих на терапию пациентов с ЛМЬ (Атайоп с1 а1., 1991). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело вводят еженедельно, в цикле 1 в течение первых двух недель в качестве монотерапии, а затем в комбинации с курсом химиотерапии, который включает митоксантрон, этопозид и цитарабин.
Например, для лечения ЛМЬ с помощью ΒΜδ-936564 в качестве монотерапии иллюстративный режим включает введение ΒΜδ-936564 (0,3, 1, 3 или 10 мг/кг) в виде одной 60-минутной внутривенной инфузии на 1 день в цикле 1 и на 1, 8, и 15 дни в последующих циклах.
Для лечения ΆΜΌ с помощью ΒΜδ-936564 в комбинации с химиотерапией иллюстративный режим включает в себя (1) введение ΒΜδ-936564 в первый день химиотерапии до первой дозы химиотерапии. ΒΜδ-936564 вводят на 1, 8 и 15 дни в цикле 2 и в последующих циклах. Кроме того, для циклов 2-13 химиотерапия состоит из следующих режимов (28-дневный цикл): (2) введение митоксантрона (8 мг/м2) в течение 15 мин с 1 по 5 день; (3) введение этопозида (100 мг/м2) в течение 1 ч с 1 по 5 день и (4) введение цитарабина (Ага-С; 1 г/м2 IV) в течение 1 ч с 1 по 5 день.
В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой СЬЬ или РЬ и по меньшей мере один химиотерапевтический агент, вводимый пациенту, страдающему раком, в комбинации с антиСХСК4 антителом или его фрагментом по изобретению является бендамустином и/или ритуксимабом. Доклинические исследования показали, что существует противоопухолевое синергическое действие между бендамустином и ритуксимабом в отношении нескольких клеточных линий лейкемии и лимфомы (Китте1 с1 а1., 2002), так как последний сенсибилизирует Β-клеточные лимфомы к апоптозу, индуцируемому химиотерапией, в том числе бендамустином (С1ю\у е1 а1., 2002). Бендамустин в комбинации с ритуксимабом (ΒΚ) проявил эффективность в отношении лимфом у пациентов, которые не подвергались лечению ритуксимабом, предварительно лечились ритуксимабом или были резистентны к нему (РпейЬегд е1 а1., 2008). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело вводят в комбинации с бендамустином и ритуксимабом.
В предпочтительных вариантах осуществления способа лечения ΌΕΒί'.Έ анти-СХСК4 антитело используют в комбинации с ритуксимабом, ифосфамидом, карбоплатином и/или этопозидом (КетаЬаташ е1 а1., 2004). Ни одна из схем химиотерапии не проявила эффективного действия в отношении рецидивирующей или резистентной ΌΡΒΟΗ К-1СЕ (ритуксимаб, ифосфамид, карбоплатин и этопозид) является одной из наиболее часто используемых схем для г/г ΌΕΒί'.Έ из-за ее сопоставимой эффективности с другими схемами и сниженной токсичности по сравнению с К-ЭНАР (дексаметазон, высокие дозы цитарабина, цисплатин), за ней для пациентов, отвечающих на терапию, следует высокодозовая химиотерапия и аутологичная Ηδί','Τ (САеШгесШ е1 а1., 2010). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-СХСК4 антитело вводят в комбинации с ритуксимабом, ифосфамидом, карбоплатином и этопозидом.
Например, для лечения пациентов с РЬ, ΌΕΒίΈ и СЬЬ с помощью ΒΜδ-936564 в качестве монотерапии предпочтительная схема включает введение ΒΜδ-936564 (0,3-10 мг/кг) в виде одной 60-минутной внутривенной инфузии в 1 день в цикле 1 и в 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни в последующих циклах.
При введении в комбинации с химиотерапией для лечения субъектов с СЬЬ, РЬ и ΌΕΒίΈ пример варианта лечения включает введение ΒΜδ-936564 в первый день химиотерапии до первой дозы химиотерапии и введение химиотерапии по меньшей мере через 1 ч после завершения инфузии ΒΜδ-936564. ΒΜδ-936564 вводят в 1 и 8 дни в цикле 2 и последующих циклах.
Химиотерапия СЬЬ предусматривает следующий режим (28-дневный цикл): ритуксимаб (375 мг/м2 IV) в 1-й день в цикле 2 и последующих циклах, затем 500 мг/м2 в 1-й день в последующих циклах; и бендамустин (70 мг/м2 IV) в течение 60 мин в 1-й день цикла 2.
Химиотерапия РЬ предусматривает следующий режим (28-дневный цикл): ритуксимаб (375 мг/м2 IV) в 1-й день цикла 2 и последующих циклов, затем 500 мг/м2 в 1-й день последующих циклов и бендамустин (90 мг/м2 IV) в течение 60 мин в 1-й день цикла 2.
Химиотерапия ΌΕΒίΈ предусматривает следующий режим (28-дневный цикл): ритуксимаб (375 мг/м2 IV) в 1-й день цикла 2 и последующих циклов; ифосфамид (5000 мг/м2) в виде непрерывной
IV инфузии на 4-й день, а также Месна (2-меркаптоэтансульфононат натрия; 5000 мг/м2) в виде непрерывной IV инфузии в течение 24 ч, которую начинают на 4 день цикла 2 и последующих циклов; карбоп- 21 026153 латин (дозировка с получением целевого АИС 5 мг/мл-мин рассчитывается по формуле Калверта; максимальная доза = 800 мг) на 4-й день цикла 2 и последующих циклов; этопозид (100 мг/м2 IV) ежедневно на 3-5 дни цикла 2 и последующих циклов.
Одним из аспектов настоящего изобретения является применение любого анти-СХСК4 антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению для получения лекарственного средства для лечения субъекта, страдающего раком СХСК4+. Применение любого анти-СХСК4 антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению для получения лекарственных средств может быть осуществлено для всего диапазона раковых заболеваний, описанных в настоящем документе. В предпочтительных вариантах такого применения рак включает гематологические злокачественные заболевания, такие как рецидивирующая или резистентная множественная миелома, рецидивирующая острая миелоидная лимфома, рецидивирующая хроническая лимфоидная лейкемия, рецидивирующая фолликулярная лимфома или резистентная диффузная крупноклеточная Β-клеточная лимфома. Это изобретение также обеспечивает медицинское применение любого анти-СХСК4 антитела или его антигенсвязывающей части по изобретению в соответствии со всеми вариантами осуществления способов лечения, использующих антиСХСК4 антитела, описанными в настоящем документе.
Также в объем настоящего изобретения включены наборы, содержащие любые анти-СХСК4 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или их композиции по настоящему изобретению и инструкции по применению. Соответственно, настоящее изобретение относится к набору для лечения рака у субъекта, причем набор включает (а) одну или несколько доз любого анти-СХСК4 антитела или его СХСК4-связывающего фрагмента по изобретению и (б) инструкции по применению анти-СХСК4 антитела или его фрагмента в любом из способов лечения, описанных в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах анти-СХСК4 антитело в наборе включает в себя домены СЛК1, СЛК2 и СЛК3 в вариабельном районе тяжелой цепи, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 25, и домены СГОР1. СЛК2 и СГОР3 в вариабельном районе легкой цепи, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 29. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анти-СХСК4 антитело представляет собой ΒМ8-936564. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных терапевтических реагентов, описанных в настоящем документе, например иммунодепрессант, химиотерапевтический агент или радиотоксичный агент или одно или более дополнительных антител, которые распознают различные антигены.
Наборы обычно включают этикетку, указывающую на предполагаемое применение содержимого набора, и инструкции для применения. Термин этикетка включает в себя любую надпись или записанные данные, нанесенные на набор или поставляемые с набором. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического набора анти-СХСК4 антитела могут быть совместно упакованы с другими терапевтическими агентами в единичной дозированной форме.
B. Вирусные инфекции, в том числе ВИЧ-инфекция.
Было показано, что СХСК4 является корецептором для проникновения ВИЧ в Т-клетки, и, кроме того, было показано, что некоторые мышиные анти-СХСК4 антитела были способны ингибировать проникновение ВИЧ в выделенные Т-клетки (см. Нои с1 а1., 1998; Сатес е! а1., 2005). Таким образом, СХСК4 может быть использован в качестве рецептора вирусами для проникновения в клетки, и антитела к СХСК4 могут быть использованы для ингибирования проникновения в клетки таких вирусов, использующих СХСК4 в качестве рецептора. Существует информация о СХСК4-опосредованном апоптозе в результате связывания гликопротеина оболочки др120 ВИЧ-1 с СХСК4 (Оаг§ е! а1., 2006).
Исследование показало, что антитела, сшитые с СХСК4, могут имитировать гибель клеток, наблюдаемую при индукции др120 (Негий! е! а1., 1998), что позволяет предположить, что применение антител к рецептору хемокина для предотвращения инфекции ВИЧ-1 может привести к эффективному и быстрому разрушению экспрессирующих соответствующий рецептор Т-клеток. Соответственно, человеческие анти-СХСК4 антитела настоящего изобретения могут быть использованы для ингибирования проникновения вируса в клетку, где вирус использует СХСК4 в качестве рецептора для входа в клетку, подавляя, таким образом, вирусную инфекцию. В предпочтительном варианте антитела используют для ингибирования проникновении ВИЧ в Т-клетки, например, при лечении или профилактике ВИЧ/СПИДа. Антитело можно использовать отдельно или в комбинации с другими противовирусными агентами, такими как антиретровирусные препараты, такие как ΑΖΤ или ингибиторы протеаз.
C. Воспалительные состояния.
СХСК4/СХСЫ2 путь, как было показано, играет важную роль в различных воспалительных состояниях, включая, но не ограничиваясь ими, воспалительные заболевания печени (Тегайа е! а1., 2003), аутоиммунное воспаление суставов (Ма!!йук е! а1., 2001); аллергические заболевания дыхательных путей (Соп/а1о е! а1., 2000) и пародонтоз (Нокока^а е! а1., 2005).
Соответственно, человеческие анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению, которые ингибируют связывание СХСЬ12 с СХСК4, могут быть использованы для ингибирования воспаления при воспалительных заболеваниях, в том числе расстройствах, выбранных из группы, состоящей из воспалительного заболевания печени, аутоиммунного воспаления суставов, аллергических заболеваний дыхательных путей, пародонтоза, ревматоидного артрита, воспалительной болезни кишечника, системной
- 22 026153 красной волчанки, диабета типа I, воспалительных заболеваний кожи (например, псориаза, красного плоского лишая), аутоиммунного заболевания щитовидной железы, синдрома Шегрена, воспаления легких (например, хронической обструктивной болезни легких, легочного саркоидоза, лимфоцитарного альвеолита) и воспалительного заболевания почек (например, 1дА нефропатии, гломерулонефрита). Антитело может быть использовано отдельно или в комбинации с другими противовоспалительными агентами, такими как нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), кортикостероиды (например, преднизон, гидрокортизон), метотрексат, ингибиторы СОХ-2, ТОТ-антагонисты (например, этанерцепт, инфликсимаб, адалимумаб) и иммунодепрессанты (например, 6-меркаптопурин, азатиоприн и циклоспорин А).
И. Ангиогенез.
Было показано, что СХСИ12 индуцирует образование новых сосудов посредством привлечения СХСК4-экспрессирующих гемангиоцитов (Лп с1 а1., 2006). Кроме того, блокада пути СХСК4/СХСЫ2 может ослаблять рост опухоли ίη νίνο путем ингибирования ангиогенеза \РОР-независимым способом (Ои1еп§ с1 а1., 2005). Более того, как показано в примере 7, антитела по настоящему изобретению способны ингибировать образование капилляров ίη νίίτο. Соответственно, анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению ингибируют связывание СХСЬ12 с СХСК4 и могут быть использованы для ингибирования ангиогенеза путем прерывания пути СХСК4/СХСЫ2. Ингибирование ангиогенеза может быть использовано, например, для ингибирования роста опухоли или метастазирования опухоли (вне зависимости от того, является ли опухоль СХСК4+). Антитело может быть использовано отдельно или в комбинации с другими анти-ангиогенными агентами, такими как анти-\РОР антитела.
Ε. Аутологичная трансплантация стволовых клеток.
Стволовые клетки периферической крови являются предпочтительным источником стволовых клеток для использования для трансплантации аутологичных стволовых клеток, например, при лечении некоторых гематологических злокачественных новообразований. Получение стволовых клеток из периферической крови требует мобилизации стволовых клеток СИ34+ из костного мозга в периферическую кровь. В регулирование этого процесса вовлечены различные цитокины, хемокины и молекулы адгезии (см. обзор в Са/П1. 2001), в том числе и взаимодействие СХСК4 и 8ИР-1. Кроме того, было показано, что низкомолекулярный антагонист СХСК4 стимулирует быструю мобилизацию стволовых клеток СИ34 из ВМ на периферию (см., например, Иеуте е1 а1., 2004; Вгохтеуег е1 а1., 2005; ИотепЬегд е1 а1., 2005). Соответственно, анти-СХСК4 антитела по настоящему изобретению ингибируют активность СХСК4 (т.е. являются антителами-антагонистами) и могут быть использованы для стимулирования мобилизации стволовых клеток СИ34+ из ВМ в периферическую кровь для обеспечения доступности таких стволовых клеток для трансплантации (например, для аутотрансплантации), например, при лечении гематологических заболеваний, таких как множественная миелома и неходжкинская лимфома. Антитело может быть использовано отдельно или в комбинации с другими агентами, используемыми для стимуляции мобилизации стволовых клеток, такими как С-С8Р и/или ОМ-С8Р. Таким образом, в другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ стимуляции мобилизации стволовых клеток СИ34+ из костного мозга в периферическую кровь субъекта, включающий введение субъекту анти-СХСК4 антитела по изобретению таким образом, чтобы происходила стимуляция мобилизации стволовых клеток СИ34+ из ВМ в периферическую кровь. Способ может дополнительно включать в себя сбор стволовых клеток СИ34+ из периферической крови, например для использования в аутологичной трансплантации стволовых клеток.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничение изобретения. Содержание всех фигур и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных в даннои документе, специально включено в настоящий документ посредством ссылки.
Пример 1.
Получение человеческих моноклональных антител к СХСК4 и СХСЬ12
Анти-СХСК4 человеческие моноклональные антитела были получены с применением комбинированного подхода, при котором сначала трансгенных трансхромосомных мышей, экспрессирующих гены антител человека (Мейагех КМ М0И8Е®, МЛрйак, СА, описаны в публикации РСТ \0 02/43478 и патенте США №7041870), иммунизировали СХСК4-трансфицированными клетками человека К1610, чтобы повысить у мышей репертуар человеческих иммуноглобулинов, специфичных к человеческому СХСК4, а затем из клеток селезенки указанных мышей получали библиотеку человеческих антител, которую представляли методом фагового дисплея, и бактериофагов скринировали на экспрессию фрагментов вариабельных районов, имеющих аффинность к СХСК4, методом сортировки с человеческим СХСК4, включенным в магнитные протеолипосомы (СХСК4-МРЬ). Фрагменты вариабельных районов, представляющие интерес, клонировали в вектор экспрессии РаЬ и РаЬ повторно тестировали на связывание антигена трансфицированных СХСК4-экспрессирующих клеток. РаЬ-клоны Р7 (переименован в МИХ-1338 или ВМ8-936564), Р9, И1 и Е2 были отобраны для дальнейшего анализа. Полноразмерные антитела были получены из РаЬ-фрагментов с применением стандартных методов молекулярной биологии. Этот комбинированный подход в общих чертах описан в патенте США № 6,794,132 и специально подробно описан в \\'0 2008/060367.
- 23 026153
Для получения анти-СХСЬ12 антитела трансгенных мышей МеБагех КМ® иммунизировали рекомбинантным человеческим СХСЙ12 (РергсйесН. Коску НШ, Νί). Лизаты селезенки собирали и обрабатывали, как описано ранее (патент США № 6794132). С помощью соответствующего метода фагового дисплея, в Вюкйе получали фрагменты антител (библиотека РаЬ). Фагов, которые связывают СХСЙ12, отбирали с помощью биотинилированного СХСЙ12. Выбранные антиген-реактивные фрагменты РаЬ были преобразованы в полноразмерные ГдС4 (8228Р) и повторно экспрессированы в клетках СНО.
Контрольное изотипическое антитело ГдС4, содержащее мутацию 8228Р в шарнирной области для уменьшения образования половинчатых антител (Анда1 еί а1., 1993), было получено в Вю1одюк Ойсоуегу СайГогта, СА).
Пример 2.
Исследование структуры человеческих анти-СХСК4 моноклональных антител Р7, Р9, Ό1 и Е2.
Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные районы тяжелой и легкой цепей Р7, Р9, Ό1 и Е2 РаЬ-клонов, полученных с помощью скрининга библиотеки методом фагового дисплея, как описано в примере 1, были отсеквенированы с помощью стандартных методов секвенирования ДНК.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района тяжелой цепи Р7 показаны на фиг. 1А и в 8ЕЦ ГО N0: 33 и 25 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района легкой цепи Р7 показаны на фиг. 1В и в 8ЕЦ ГО N0: 37 и 29 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Р7 с известными последовательностями тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина зародышевой линии показало, что тяжелая цепь Р7 содержит сегмент VII зародышевой линии человека VII 3-48, сегмент Ό зародышевой линии человека 4-23 и сегмент 1Н зародышевой линии человека ТН 6В. Дальнейший анализ последовательности V Р7 с применением системы Кабат для определения СГОК района привел к выделению в тяжелой цепи районов СГОКЕ СИК2 и СИК3, как показано на фиг. 1А и в 8ЕЦ ГО N0: 1, 5 и 9 соответственно. Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Р7 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что Р7 легкой цепи содержит сегмент V!, зародышевой линии человека V, Ь15 и сегмент ТК зародышевой линии человека ТК 1. Дальнейший анализ последовательности Р7 V!, с применением системы Кабат для определения СИК районов привел к выделению в легкой цепи районов СГОКЕ СГОК2 и СИ3, что показано на фиг. 1В и в 8ЕЦ ГО N0: 13, 17 и 21 соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района тяжелой цепи Р9 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 34 и 26 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района легкой цепи Р9 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 38 и 30 соответственно. Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Р9 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что в тяжелой цепи Р9 содержится сегмент VII зародышевой линии человека VII 3-48, сегмент Ό зародышевой линии человека 4-23 и сегмент ТН зародышевой линии человека ТН 6В. Дальнейший анализ последовательности Р9 с применением системы Кабат для определения СГОК районов привел к выделению в тяжелой цепи районов СИК1, СГОК2 и СИ3, что показано в 8ЕЦ ГО N0: 2, 6 и 10 соответственно. Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Р9 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что в легкой цепи Р9 содержится сегмент V!, зародышевой линии человека V, Ь15 и сегмент ТК зародышевой линии человека ТК1. Дальнейший анализ последовательности Р9 V!, с применением системы Кабат для определения СГОК районов привел к выделению в легкой цепи районов СГОК 1, СГОК2 и СИ3, что показано в 8ЕЦ ГО N0: 14, 18 и 22 соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района тяжелой цепи Ό1 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 35 и 27 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района легкой цепи Ό1 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 39 и 31 соответственно. Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Ό1 с известными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что тяжелая цепь Ό1 содержит сегмент V зародышевой линии человека 3-48, сегмент Ό зародышевой линии человека 4-23 и сегмент ТН зародышевой линии человека ТН 6В. Дальнейший анализ последовательности Ό1 с применением системы Кабат для определения СГОК районов привел к выделению в тяжелой цепи районов СИК1, СГОК2 и СИ3, что показано в 8ЕЦ ГО N0: 3, 7 и 11 соответственно. Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Ό1 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что легкая цепь Ό1 содержит сегмент V!, зародышевой линии человека V, Ь15 и сегмент ТК зародышевой линии человека ТК1. Дальнейший анализ последовательности Ό1 V!, с применением системы Кабат для определения СГОК районов привел к выделению в легкой цепи районов СИК1, СГОК2 и СИ3, что показано в 8ЕЦ ГО N0: 15, 19 и 23 соответственно.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района тяжелой цепи Е2 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 36 и 28 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района легкой цепи Е2 показаны в 8ЕЦ ГО N0: 40 и 32 соответственно. Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Е2 с известными последовательностями тяжелой цепи им- 24 026153 муноглобулина зародышевой линии человека показало, что тяжелая цепь Е2 содержит сегмент УН зародышевой линии человека УН 3-48, сегмент Ό зародышевой линии человека 4-23 и сегмент Ш зародышевой линии человека Ш 6В. Дальнейший анализ последовательности Е2 УН с применением системы Кабат для определения СОК районов привел к выделению в тяжелой цепи районов СОК1, СОК2 и СО3, что показано в §Е0 Ш N0: 4, 8 и 12 соответственно. Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Е2 с известными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии человека показало, что в легкой цепи Е2 содержится сегмент Уъ зародышевой линии человека УК Ь15 и сегмент Ж зародышевой линии человека Ж1. Дальнейший анализ последовательности Е2 Уъ с применением системы Кабат для определения СОК районов привел к выделению в легкой цепи районов СОК1, СОК2 и СОК3, что показано в §Е0 ГО N0: 16, 20 и 24 соответственно.
Анализ каркасных последовательностей районов УН и Уъ антител Р7, Р9, О1 и Е2 в сравнении с последовательностями зародышевой линии, из которых они были получены, позволил выявить остатки аминокислот каркасных районов, которые отличались от зародышевой линии. Некоторые каркасные остатки в Ν-концевых участках сегментов УН и Уъ были выбраны для обратной мутации с целью восстановления каркасных остатков последовательности зародышевой линии, поскольку эти остатки не зародышевой линии в Ν-концевой части были закодированы в праймерах, используемых для создания библиотеки для фагового дисплея, описанной в примере 1. В частности, модифицированные формы сегментов УН и Уъ антител Р7, Р9, О1 и Е2 (называемые ОЬ формами, от зародышевой линии) были созданы с применением стандартных методов молекулярной биологии заменой аминокислотного остатка зародышевой линии в указанном положении каркасного района. Конкретные обратные мутации аминокислот и выравнивание последовательностей ОЬ вариантов с последовательностями исходных вариабельных районов Р7, Р9, О1 и Е2 приведены в \У0 2008/060367.
РаЬ-фрагменты Р7, Р9, О1 и Е2 преобразовали в полноразмерные антитела с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК. Например, ДНК, кодирующую районы УН и УК одного из РаЬфрагментов, можно клонировать в экспрессионный вектор, который несет константные районы тяжелой и легкой цепей таким образом, что вариабельные районы являются функционально соединенными с константными районами. В качестве альтернативы могут быть использованы отдельные векторы для экспрессии полноразмерных тяжелой и легкой цепей. Неограничивающие примеры экспрессионных векторов, пригодных для использования в создании полноразмерных антител, включают векторы р1Е, описанные в патенте США № 7674618. РаЬ фрагменты Р7 (ВМ8-936564) были преобразованы в полноразмерные 1дО4 (8228Р) антитела и вновь экспрессированы в клетках СНО.
Пример 3.
Характеристика связывания анти-СХСК4 человеческих моноклональных антител.
В данном примере характеристики связывания антител анти-СХСК4 были исследованы с помощью проточной цитометрии. Человеческие Т-клетки линии СЕМ, экспрессирующие нативный человеческий СХСК4 на своей поверхности, использовали для исследования способности антител Р7, Р9, О1 и Е2 связываться с нативным СХСК4 на клеточной поверхности. Полноразмерные Р7, Р9, О1 и Е2 титровали в сериях последовательных разбавлений 1:3, в результате чего был получен диапазон концентраций от 300 нМ до 5 пМ. Антитела затем смешивали с клетками СЕМ и инкубировали для связывания, а затем детектировали вторичным Р1ТС-конъюгированным антителом к человеческому 1дО. Затем клетки анализировали с помощью флуоресцентной цитометрии. Полученные средние значения интенсивности флуоресценции показаны на графике на фиг. 2, по которому видно, что все четыре анти-СХСК4 антитела связываются с СЕМ-клетками. ЕС50 для связывания Р7, Р9, О1 и Е2 составили 21, 14, 80 и 290 нМ соответственно.
Чтобы определить способность панели анти-СХСК4 антител конкурировать за связывание с СХСК4, проводили исследование конкурентного связывания. Четыре человеческих анти-СХСК4 антитела Р9, Р7, Е2 и О1 были использованы вместе с четырьмя коммерчески доступными мышиными моноклональными антителами анти-СХСК4 (12О5, 708, 716 и 717; К&О §у8ίет8 каталог № МАВ170, МАВ171, МАВ172 и МАВ173 соответственно). Анти-СХСК4 антитела титровали в серии последовательных разбавлений 1:3, получая концентрации в диапазоне от 300 до 5 пМ, в присутствии постоянной концентрации Р1ТС-меченого анти-СХСК4 антитела Р9. Смесь антител затем добавляли к клеткам СЕМ и оставляли для связывания. Способность каждого антитела конкурировать с Р9 за связывание с СЕМ клетками оценивали с помощью флуоресцентной цитометрии и обнаружения Р1ТС. Полученные средние значения интенсивности флуоресценции показаны на графике на фиг. 3, откуда видно, что все семь исследованных антител (Р7, Е2, О1, 12О5, 708, 716 и 717) были способны конкурировать с Р9 за связывание с клетками СЕМ, хотя антитело Е2 при высоких концентрациях продемонстрировало только частичное ингибирование по сравнению с другими антителами.
В другой серии экспериментов исследовали способность тАЬ ВМ8-936564 связываться с различными клеточными линиями методом проточной цитометрии путем проведения титрования на РАС8.
Возрастающие количества тАЬ (от менее чем 0,001 до более чем 100 мкг/мл) инкубировали с 100000 клеток и оценивали связывание с помощью проточной цитометрии. Также было определено значение
Втах, которое указывает на то, сколько примерно молекул СХСК4 присутствуют на каждой клетке. На
- 25 026153 основании кривых связывания было определено значение ЕС50 для связывания антитела; результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты титрования РАС8 для определения связывания Р7 (ВМ8-936564) с различными клеточными линиями
Тип клетки ЕС50 (мкг/мл) Втах
Катов 0,48 106,000
Ка]1 0,34 52,536
КатаЬеа 1,57 116,000
Ь540 3,69 31,868
ПМ879 3,99 24,587
ΜϋΑ-ΜΒ-231 9,24 14,186
Втах = максимальное связывание (единицы ОМР1).
Результаты показывают, что тАЬ Р7 (ВМ8-936564) способно эффективно связываться с каждой из шести испытанных клеточных линий, причем самые низкие ЕС50 наблюдались для клеточных линий Каток и КаД. Эти данные также показывают, что экспрессия рецептора СХСК4 является самой высокой у клеток Каток и Ν;·ιιη;·ι1\ν;·ι и самой низкой у клеток МЭА-МВ-231 и ЭМ879.
В другом эксперименте исследовали способность тАЬ ВМ8-936564 связывать различные субпопуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС). Человеческие РВМС выделяли стандартными методами, а различные клеточные субпопуляции выделяли с помощью РАС8. В частности, были выделены следующие субпопуляции клеток: (I) СЭ3+, (II) СЭ20'; (III) СЭ11Ь+ и (IV) СЭ14'. Эксперименты на основе проточной цитометрии, проведенью с тАЬ ВМ8-936564 (при 33 мкг/мл), показали, что эти антитела способны эффективно связываться с каждой из четырех субпопуляций в сравнении с контрольным изотипическим антителом.
В другом эксперименте на связывание с ВМ8-936564 с помощью проточной цитометрии оценивали другой набор СХСК4+ клеточных линий человека. Клетки были подготовлены для проточной цитометрии (РАС8) путем суспендирования клеток с указанными концентрациями исходного ВМ8-936564 или биотинилированного ВМ8-936564, затем смеси антител и клеток инкубировали с козьим антителом к человеческому РСγ-ΡΕ или РЕ-конъюгированным стрептавидином. Клетки анализировали на РАС8 путем отбора живой клеточной популяции, определяемой с помощью Р8С и 88С. Дозозависимое связывание было обнаружено для клеточных линий К1610-ЫиСХСК4 (фибробласты хомяка К1610, трансфицированные человеческим СХСК4 и селектируемые на О418); Каток (человеческие В-лимфобласты лимфомы Беркитта); СЕМ (человеческие Т-лимфобласты острой лимфобластной лейкемии); Номо-1 (клетки острой миелоидной лейкемии человека); НЬ-60 (человеческие промиелобласты); МОЬР8 (клетки человеческой ММ) и ΙΙΝ-3Ρ (линия клеток человеческой ММ с устойчивостью к бортезомибу). См. фиг. 4. Было обнаружено отсутствие связывания с исходными клетками К1610. Исходя из значений среднего геометрического интенсивности флуоресценции (ОМИ) уровни СХСК4 были самыми высокими для клеток К1610-ЫиСХСК4 и Каток, затем следовали клетки СЕМ (фиг. 4В), Номо-1 и НЬ60 (фиг. 4А). Клетки линии множественной миеломы МОЬР-8 и ΙΙΝ-3Ρ экспрессировали наименьшее количество рецепторов (фиг. 4С). Значения ЕС50 для связывания представлены в табл. 2. Кроме того, ВМ8-936564 связываются с РВМС здоровых доноров (данные не показаны), а также с 7/8 образцов РВМС, взятых у больных АМЬ, с различными ОМИ (фиг. 4Ό). Эти данные показывают, что СХСК4 экспрессируется на многих линиях гемопоэтических клеток и по-разному экспрессируется у больных АМЬ.
Таблица 2
Связывание ВМ8-936564 с человеческими СХСК4+-клеточными линиями
- 26 026153
Пример 4.
Ингибирование связывания СХСБ12 с СХСК4 антителами анти-СХСК4 и анти-СХСЬ12.
Чтобы определить способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать связывание СХСБ12 с СХСК4, проводили исследование конкурентного связывания с применением 1251-меченого СХСБ12 (РеткшЕ1тег, УаИНат, МА) и клеток СЕМ, которые экспрессируют СХСК4. Сравнение антиСХСК4 антител по их способности блокировать связывание СХСЬ12 с клетками СЕМ было выполнено с помощью стандартного анализа с радиоактивно меченым лигандом. Анти-СХСК4 антитела разводили в сериях 1:3 с получением диапазона концентраций от 300 нМ до 137 мкМ. Антитела были добавлены к 750000 клеток СЕМ в 100 мкл в присутствии 100 пМ 1251-СХСЬ12 с удельной активностью 2000 Ки/ммоль (АтегкНат, каталог # 1М314-25ИС1). Не связывающее антитело того же изотипа использовали в качестве отрицательного контроля. Общее возможное связывание меченного радиоактивным изотопом лиганда определяли путем инкубации 1251-СХСЬ12 с клетками СЕМ в отсутствие антител в течение 2 ч при 4°С. Неспецифическое связывание радиоактивно меченого лиганда определяли путем инкубации 1251-СХСЬ12 в присутствии 1 мкМ немеченого СХСЬ12 (Рерго1ес1т каталог # 300-28А). Количество связанного с клетками 1251-СХСЬ12 было определено с помощью стандартных методов. Результаты показаны на фиг. 5, на которой видно, что антитело Р7 (ВМБ-936564) обеспечивает наиболее эффективное блокирование связывания СХСЬ12 с СХСК4, экспрессирующимся на клетках СЕМ. Антитела Р9 и Ό1 также блокируют связывание СХСЬ12, хотя и в меньшей степени, чем Р7. Антитело Е2, хотя и связывается с СХСК4 на клетках СЕМ (как показано в примере 3), не обеспечивает эффективного блокирования связывания СХСЬ12 с СХСК4 на клетках СЕМ. Значения ЕС50 для блокирования СХСЬ12 антителами Р7, Р9 и Ό1 составили 2,3, 12,5 и 28,6 нМ соответственно.
В другом эксперименте сравнивали блокирование связывания СХСЬ12 с СХСК4 антителами ВМБ-936564 и анти-СХСЬ12. Были протестированы серии разведений ВМБ-936564, анти-СХСЬ12 и контрольного антитела в отношении блокирования связывания 1251-СХСЬ12 с СХСК4+-клетками СЕМ. Конкурентное связывание 1251-СХСЬ12 (РеткшЕ1тег, УаНЬат, МА) с СХСК4 на клетках СЕМ было продемонстрировано с применением фиксированной концентрации 1251-СХСЬ12 (100 пМ) и титрования концентраций ВМБ-936564 с 5 пМ до 300 нМ. Изотипическое антитело было использовано в качестве отрицательного контроля, а немеченный СХСБ12 был использован в качестве положительного контроля. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, фильтры промывали, вынимали и считывали число импульсов в минуту (СРМ) на гамма-счетчике РеткшЕ1тег ΧνίΖΛΡΩ ® (УаЬЪат, МА). Для всех исследований ίη νίίτο данные были представлены в графическом виде и проанализированы с помощью программного обеспечения СгарНР;й Рпзт (§ап О1едо, СА) с применением нелинейной регрессии и сигмоидальных кривых доза-ответ.
Исследования насыщения связывания проводили с применением радиоактивно меченого СХСБ12 и клеток СЕМ, экспрессирующих СХСК4Ы. Кс связывания 1251-СХСЬ12 с клетками СЕМ было определено как 4,3 нМ (данные не показаны), что соответствует данным литературы для К связывания СХСБ12 с СХСК4 на уровне от 3,0 до 5,4 нм (ΌίδηΡΌ еί а1., 2000). ВМБ-936564 титровали с применением субоптимальной фиксированной концентрации 1-СХСБ12 (100 пМ) и наблюдали дозозависимое ингибирование связывания 1251-СХСЬ12 со значением ЕС50 около 2 нМ (фиг. 6А). Следует отметить, что анти-СХСЬ12 антитело было более сильным и вызывало дозозависимое ингибирование связывания 1251-СХСЬ12 с клетками СЕМ со значением ЕС50 примерно 90 пМ (фиг. 6В).
Было также показано, что ВМБ-936564 дозозависимо блокирует связывание 1251-СХСЬ12 с клетками Каток со значением ЕС50 около 11 нМ (фиг. 6С).
Пример 5.
Ингибирование СХСЬ12-индуцированного входа кальция антителами анти-СХСК4 и анти-СХСЬ12.
Для определения способности анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать индуцированный СХСБ12 вход кальция в клетки СЕМ сначала клетки СЕМ были помечены флуоресцентным красителем Са1с1ит 3 (Мо1еси1аг Эе^се^ 8иппууа1е, СА). Анти-СХСК4 антитела титровали в серии последовательных разбавлений 1:3 для получения диапазона концентраций от 100 нм до 1 пМ и инкубировали их с 200000 клеток СЕМ в 200 мкл в течение 10 мин при комнатной температуре перед измерениями на приборе Ρ^ЕX§ΤАΤЮN® (Мо1еси1аг Эеу1се5). В качестве отрицательного контроля использовали не связывающее антитело того же изотипа. Затем клетки стимулировали рекомбинантным человеческим СХСЬ12а в конечной концентрации 50 нМ (Рерго(есН): добавляли 500 нМ в объеме 22 мкл до конечного объема 222 мкл. Вход кальция измеряли в течение 200 с в каждой лунке. В качестве положительного контроля стимулировали клетки СХСЬ12а в отсутствие антитела (раствор в буферном солевом растворе Хенкса (НВ§) с 0,1% ВБА или НВ§) с целью достижения максимально возможного сигнала входа кальция. Для определения фонового значения к клеткам добавляли НВ§ с 0,1% ВБА. СХСЬ12а стимулированное высвобождение кальция определяли по развитию кальций-зависимой флуоресценции с течением времени. Площадь под полученной кривой флуоресценции использовали в качестве индикатора входа кальция. Результаты ингибирования входа кальция антителами анти-СХСК4 представлены на фиг. 7. По этим данным были построены графики и были рассчитаны ЕС50 с применением программного
- 27 026153 обеспечения ОгарЬРаб Ргып и нелинейной аппроксимации кривой по формуле сигмоидальной зависимости доза-ответ. Антитела Р7 (ВМ8- 936564), Р9 и Ό1 ингибируют СХСЬ12а-индуцированный вход кальция. Несмотря на то что антитело Е2 связывалось с СХСК4 (как показано в примере 3), оно не существенно ингибировало СХСЬ12а-индуцированный вход кальция. ЕС50 ингибирования СХСЬ12индуцированного входа кальция антителами Р7, Р9 и Ό1 составили 0,90, 0,32 и 0,57 нМ соответственно.
В другом эксперименте сравнивали возможности антител ВМ8-936564 и анти-СХСЬ12 ингибировать СХСЬ12-индуцированный вход кальция. Клетки линии Капю5 и СЕЬЬ инкубировали с красителем РПРК® Са1сшт 4 (Мο1еси1а^ Ое\асе5) и для стимуляции входа кальция использовали фиксированную концентрацию СХСЬ12. Для ингибирования ответа использовали титрование антителами ВМ8-936564 или анти-СХСЬ12 в концентрациях от 50 пМ до 100 нМ. Максимальный кальциевый ответ был зафиксирован при стимуляции СХСЬ12 без антител. Фоновое значение ответа было получено при инкубации клеток с буфером без СХСЬ12. Вход кальция определяли на РЕЕХ8ТАТЮЫ® (Мο1еси1а^ Ое\асе5). Было показано, что СХСЬ12 приводит к дозозависимому росту внутриклеточного кальция с пиком входа кальция при 50 и 5 нМ СХСЬ12 для клеток Катο5 и СЕМ соответственно. Для стимулирования входа кальция использовали оптимальную концентрацию СХСЬ12 и для ингибирования этого процесса использовали титрование антителами ВМ8-936564 или анти-СХСЬ12 (фиг. 6С и 6Ό). Оба антитела ВМ8-936564 и анти-СХСЬ12 дозозависимо блокировали СХСЬ12-индуцированный вход кальция. ВМ8-936564 блокировали с ЕС50 примерно 10 нМ и 8 нМ для клеток Катο5 и СЕМ соответственно (фиг. 8А и 8В), в то время как анти-СХСЬ12 блокировали с ЕС50 примерно 35 нМ (Катο5) и 2 нм (СЕМ) (фиг. 8А и 8В).
Пример 6.
Ингибирование СХСЬ12-индуцированной миграции клеток СЕМ антителами анти-СХСК4 и антиСХСЬ12.
Чтобы определить способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать миграцию клеток СЕМ, индуцированную СХСЬ12, клетки СЕМ сначала были помечены ВАТИА (бис-(ацетоксиметил)2,2':6',2-терпиридин-6,6-дикарбоксилатом), хемилюминесцентным реагентом на миграцию (РегкшЕ1тег). Анти-СХСК4 антитела титровали в серии последовательных разбавлений 1:3 до получения концентраций в диапазоне от 100 нМ до 1 пМ и инкубировали с клетками СЕМ при плотности 10 млн/мл. В качестве отрицательного контроля использовали не связывающее антитело того же изотипа. Рекомбинантный человеческий СХСЬ12а (Ρер^οίесЬ) в количестве 5 нМ в 30 мкл добавляли в нижнюю камеру каждой лунки 96-луночного планшета для миграции клеток №ωΌρΓο^ с фильтрами диаметром 5,7 мм к каждой лунке. Каждая лунка содержала поры 5 мкм. Меченые клетки СЕМ с антителами и без них наносили на фильтры в концентрации 0,5 млн клеток/лунку в объеме 50 мкл. Планшет для миграции инкубировали при 37°С в течение 2,5 ч. Мигрировавшие клетки были собраны в нижней камере планшета, лизированы и детектированы с помощью раствора европия для детекции ИЕЬР^® (Регкш Е1тег). Хемилюминесцентный сигнал был зафиксирован на приборе Рикюи. Обнаруженное ингибирование СХСЬ12а-индуцированной миграции клеток антителами анти-СХСК4 показано на фиг. 9. Полученные данные демонстрируют, что антитела Ρ7 и Ρ9 эффективно ингибируют миграцию, в то время как антитела Ό1 и Е2 не существенно ингибируют миграцию. ЕС50 ингибирования СХСЬ12-индуцированной миграции клеток СЕМ антителами Ρ7 и Ρ9 составили 12,44 и 18,99 нМ соответственно.
В другом эксперименте сравнивали способность антител ВМ8-936564 и анти-СХСЬ12 ингибировать СХСЬ12-индуцированную миграцию клеток Катο8 и СЕМ. Клетки были окрашены ВАТИА. Для стимулирования миграции клеток через фильтр, содержащий поры 5 мкм, в планшете для миграции №иго РгоЬе (ОакЬегеЬшд, МИ) использовали фиксированную концентрацию СХСЬ12. Клетки титровали антителами ВМ8-936564 или анти-СХСЬ12 от 20 пМ до 300 нМ. СХСЬ12 без антител был использован для обеспечения максимальной миграции. Миграция только к среде без СХСЬ12 был использована для определения фонового значения миграции. После 2 ч инкубации при 37°С мигрировавшие клетки детектировали путем добавления раствора европия ИЕЬРП® (Регкш Е1тег) к лизированным клеткам и детектирования с помощью флуоресценции с временным разрешением на приборе Ριϊδίοη. Оптимальная концентрация СХСЬ12 для стимулирования миграции клеток Катο8 была определена на уровне 10 нг/мл (1,25 нМ), в то время как клетки СЕМ оказались более чувствительными к СХСЬ12 и обнаружили максимальную миграцию при 0,05 нМ СХСЬ12. Было показано, что антитела ВМ8-936564 блокировали СХСЬ12-индуцированную миграцию со значением ЕС50 примерно 1 нМ в клетках Катο8 и 4 нМ в клетках СЕМ (фиг. 10А и 10В). Антитела анти-СХСЬ12 ингибировали СХСЬ12-индуцированную миграцию со значением ЕС50 примерно 0,9 нМ (Катοδ) и 0,13 нм (СЕМ) (фиг. 10А и 10В).
Пример 7.
Ингибирование формирования капиллярной трубки НиУЕС антителами анти-СХСК4.
В этом примере исследовали способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать образование капиллярной трубки человеческими эндотелиальными клетками пупочной вены (НиУЕС). МАТКЮЕЬ® разводили КΡМI в соотношении 1:1 и вносили в лунки 96-луночного планшета и оставляли полимеризоваться в течение 30 мин при 37°С. НиУЕС (СатЬгех, саР # СС- 2519) при плотности 80% трипсинизировали и ресуспендировали в КΡМI с 0,5% РВ8 до концентрации 1х 106 клеток в мл. Антите- 28 026153 ла хорошо перемешивали с НиУЕС в конечной концентрации 3 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Не связывающее антитело того же изотипа или только среду использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля для ингибирования образования трубки использовали мышиные антитела против человеческого ανβ3 (С.О51/С061) (Κ&Ό 8ук!етк, са!. # МАВ3050). НиУЕС с антителами или без них высевали на лунки МАТКЮЕЬ® с покрытием и инкубировали при 37°С в течение 18 ч.
Клетки НиУЕС, инкубированные только со средой или с соответствующим контрольным изотипическим антителом, формировали капиллярные трубки, что приводило к появлению в планшете связанных клеток по 3-5 точек связывания или точек ветвления на клетку. НиУЕС, инкубированные либо с анти-СХСК4 человеческим антителом, либо анти-(/.\Д3 антителом, не образовывали капиллярные трубки. Клетки выглядели выделенными, с немногими точками ветвления или без них. Анти-СХСК4 антитела, которые были наиболее эффективными в блокировании связывания СХСЬ12, СХСЬ12-индуцированного входа кальция и СХСЬ12-индуцированной миграции, а именно Р7 и Р9, также были наиболее эффективными в ингибировании образования капиллярной трубки. Анти-СХСК4 антитело Е2, которое связывается с СХСК4, но не блокирует связывание СХСЬ12 или СХСЬ12-индуцированные эффекты, не ингибирует образование капиллярной трубки.
Пример 8.
Анти-СХСК4 антитела, но не анти-СХСЬ12 антитела, ингибируют пролиферацию СХСК4экспрессирующих клеток ίη νί!Γ0.
В этом примере исследовали способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать пролиферацию опухолевых клеток Каток (клеточная линия человеческой лимфомы Беркитта) ίη νίίτο. В этом анализе 1 х 104 клеток на лунку инкубировали с возрастающими количествами (от 10-3 до 300 нМ) антитела Р7 1дС4, антитела Р9 1дОь антитела Е2 1дОь антитела РаЬ'Р9 или контрольного изотипа. Клетки инкубировали с антителами в течение 72 ч, 3Н-тимидин добавляли в последние 24 ч инкубации для контроля пролиферации клеток. После инкубации включение 3Н-тимидина клетками измеряли с помощью стандартных методик. Результаты показаны на графике на фиг. 11 А. Результаты демонстрируют, что каждое из антител Р7 1дС4, Р9 1дС1 и Е2 1дС1 было способно ингибировать пролиферацию клеток Каток, что отражается в снижении включения 3Н-тимидина при инкубации с этими антителами, в то время как фрагмент РаЬ'-Р9 не ингибирует пролиферацию клеток. Эти результаты показывают, что анти-СХСК4 антитела человека имеют непосредственное антипролиферативное действие на опухолевые клетки ίη νί!το, и поэтому не требуют вторичного взаимодействия для достижения антипролиферативного действия.
В другом эксперименте сравнивали эффекты МОХ-1338, анти-СХСЬ12, и низкомолекулярных антагонистов СХСК4, АМО3100 и ВКТ140, на пролиферацию клеток Каток. Клетки Каток суспендировали до концентрации 1х 105 клеток в 1 мл питательной среды, инкубировали с соответствующими антителами, в том числе с контрольным изотипом и другими агентами для анализа, и культивировали в течение 72 ч при 37°С. Се11-ТНег-С1о (Рготеда) добавляли в лунки, смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Планшет считывали на люминометре С1оМах (Рготеда). Результаты представлены на фиг. 11В. Максимальное ингибирование пролиферации клеток Каток приблизительно на 50% наблюдали при обработке 40 нМ ВМ8-936564 в сравнении с контрольным изотипом, но антиСХСЬ12 не ингибировали пролиферацию клеток. Кроме того, АМО3100, низкомолекулярный антагонист СХСК4, не ингибирует пролиферацию. Недавно описанный пептидный антагонист из 14 аминокислотных остатков, ВКТ140, ингибировал пролиферацию, но при гораздо более высокой концентрации (100 мкМ). Камптотецин (СРТ) полностью ингибировал пролиферацию клеток при 10 мкМ.
Пример 9.
Ингибирование пролиферации опухолевых клеток анти-СХСК4 антителами ίη νί\Ό.
В этом примере исследовали способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать пролиферацию сформировавшейся солидной опухоли ίη νί\Ό с применением модели подкожной опухоли клеток Каток. В этом анализе 10х 106 клеток Каток на мышь имплантировали в бок каждой мыши и опухоли позволяли расти до среднего размера 40 мм3, рассчитываемого как (длинах ширинах высота)/2. Мыши затем получали внутрибрюшинную (ΙΡ) инъекцию первой дозы антитела (обозначенную как день 0 лечения) и получали вторую ΙΡ дозу антитела на 7 день. Мыши, получавшие РаЬ'-фрагмент антитела, также получили ΙΡ дозы антител на день 3 и день 10. Группы мышей (η=8) получали (ί) носитель; (ίί) контрольный изотип (15 мг/кг); (ίίί) Р7 1дС4 (15 мг/кг); (ίν) Р9 1дС1 (15 мг/кг); (ν) Р9 РаЬ' (10 мг/кг) или (νί) положительный контроль анти-СО20 (15 мг/кг). Объем опухоли и вес тела мыши измеряли через определенные промежутки времени (примерно 2-3 раза в неделю) с дня 0 по день 30 после введения препарата. Результаты эксперимента представлены на фиг. 12А, 12В и 12С, которые отражают средний объем опухоли (фиг. 12А), медиану объема опухоли (фиг. 12В) и средний% изменения веса тела (фиг. 12С). Результаты показали, что, как и положительный контроль, антитела Р7 1дС4 и Р9 1дС1 значительно ингибируют рост опухолевых клеток, что определено по увеличению объема опухоли, тогда как фрагмент РаЬ'-Р9 не ингибирует рост опухолевых клеток по сравнению с контрольным изотипом. Все способы ле- 29 026153 чения хорошо переносились, что отражает незначительное изменение веса тела. Различия в весе тела при разных способах лечения проявились, вероятно, из-за веса опухолей. Результаты показывают, что антиСХСК4 человеческие антитела способны ингибировать рост сформировавшейся солидной опухоли ίη νίνο.
Пример 10.
Увеличение времени жизни в клеточной модели системной опухоли на мышах при обработке антиСХСК4 антителами, но не анти-СХСЬ12 антителами.
В данном примере исследовали способность человеческого анти-СХСК4 антитела увеличивать время жизни мышей в модели системной опухоли клеток Каток. В этом анализе 1х106 клеток Каток на мышь вводили внутривенно (IV) каждой мыши в день 0. Мыши затем получали внутрибрюшинную (ΙΡ) инъекцию первой дозы антитела в день 1 (т.е. через день после IV введения опухолевых клеток) и получали еще четыре ΙΡ дозы антител в дни 5, 8, 15 и 22 (мыши, получавшие антитело положительного контроля, были обработаны только в день 1). Группы мышей (η=8) получали (ί) носитель; (ίί) контрольный изотип (15 мг/кг); (ίίί) Р9 Ι§Οι (15 мг/кг) или (ίν) анти-СЭ19 положительный контроль (15 мг/кг). Входе исследования зависимости ответа от дозы ранее обнаружено, что 15 мг/кг является эффективной дозой анти-СЭ19 (данные не представлены). Процент выживаемости измеряли через фиксированные промежутки времени между днем 0 и днем 50 после введения дозы (паралич задних конечностей был использован в качестве индикатора конечной точки эксперимента). Результаты эксперимента представлены на фиг. 13А, которая отражает процент выживаемости с течением времени. Медиана времени выживания мышей, получавших либо носитель, либо контрольный изотип, составила 23 и 25,5 дней соответственно, в то время как медиана времени выживания мышей, получавших одну дозу положительного контроля анти-СЭРЛ составила 39 дней. Важно отметить, что 100% мышей в группе, получавшей пять доз антитела Р9 Ι§Οι, выжили к концу эксперимента. Эти результаты показывают, что человеческое анти-СХСК4 антитело способно увеличивать время выживания мышей клеточной модели системной опухоли.
Аналогичный эксперимент проводили для сравнения способности антител ВМ8-936564 и антиСХСЬ12 увеличивать время жизни мышей. Мышей 8СГО, несущих системные опухолевые ксенотрансплантаты Каток, обрабатывали 15 мг/кг антител ВМ8-936564, анти-СХСЬ12, анти-СЭ19 в качестве положительного контроля, человеческими Ι§04 или Ι§Οι в качестве контрольного изотипа или носителем (РВ8), как описано выше. Было обнаружено, что ВМ8-936564 существенно более эффективны в отношении увеличения времени жизни мышей в системной модели Каток, чем положительный контроль антиСЭ19 (см. фиг. 13В). Медиана времени жизни мышей, которые получали носитель или контрольный изотип, составила 23-24 дня, в то время как медиана времени жизни мышей, получивших одну дозу положительного контроля анти-СП19, составила 9 дней. Важно отметить, что в конце эксперимента через 120 дней после имплантации в группе, получившей пять доз ВМ8-936564, выжило 100% мышей. В противоположность этому, антитело анти-СХСЬ12 неожиданно не проявило эффективности, и выживаемость оказалась по существу идентичной таковой для носителя и контрольного изотипа. Эти данные показывают, что ίη νίνο должен (должны) действовать механизм (механизмы), отличающийся от блокирования СХСЬ12-индуцированных эффектов или дополняющий его.
Пример 11.
Антитело ВМ8-936564 вызывает апоптоз СХСК4-экспрессирующих клеток.
Устойчиво воспроизводимая противоопухолевая активность ВМ8-936564 ίη νίνο потребовала дальнейших исследований, направленных на понимание механизма действия антитела ВМ8-936564. В частности, набор экспериментов был направлен на исследование способности анти-СХСК4 тАЬ Р7 (ВМ8-936564) индуцировать апоптоз различных клеточных линий. При анализе апоптоза 10 мкг/мл Р7 тАЬ инкубировали с клетками Каток (500000 клеток), №нпа1\уа (500000 клеток) или К1610, трансфицированными СХСК4 для его экспрессии (100000 клеток). Нетрансфицированные клетки К1610 использовали в качестве отрицательного контроля. Анти-СХСК4 антитела тАЬ Р7 или контрольный изотип инкубировали с клетками при 37°С и отбирали по 250 мкл пробы после 24, 48 и 72 ч. Для оценки апоптоза клетки из различных временных точек инкубировали с аннексином ν-НТС-РЫ и йодистым пропидиемРЬ3, а затем подсчитывали с помощью проточной цитометрии. Полученный процент клеток, подсчитанных в РЬ1, РЬ3 и РР1-РЬ3 дважды положительных квадрантах, считался апоптотическими клетками. Для учета фонового значения процент апоптотических клеток, инкубированных с контрольным изотипом, вычитали из процента апоптотических клеток после индукции ВМ8-936564.
Результаты приведены в табл. 3 ниже; по этим данным видно, что Р7 тАЬ способно индуцировать апоптоз в клетках Каток, №та1\уа и К1610-СХСК4; в то же время Р7 никак не влияли на индукцию апоптоза исходных клеток К1610, что указывает на специфичность ответа к СХСК4.
- 30 026153
Таблица 3
Индукция апоптоза анти-СХСК4 тАЬ Р7
Клетки Время (часы) % апоптоза
К1610 72 <1
К.1610-СХСК.4 24 39
К1610-СХСК4 48 58
К1610-СХСК4 72 46
Катоз 24 22
Катоз 48 31
Катоз 72 22
ЧатаРуа 24 17
ЫатаЬуа 48 24
№ипа1\уа 72 44
Общий % значения апоптоза корректировали с учетом изменений базового значения, измеренных с помощью контрольного изотипического антитела.
В другом эксперименте исследовали способность антител ΒΜδ-936564 индуцировать апоптоз на большем количестве клеточных линий (см. табл. 4). Клетки (5х 105 клеток в мл) инкубировали с 10-330 нМ ΒΜδ-936564 или контрольного изотипа при 37°С в течение 24 ч. К этому набору линий клеток (см. табл. 4) было добавлено поперечно связывающее антитело (козье поликлональное АЬ против Рс 1дО человека) в шестикратном избытке. Ко всем типам клеток в качестве положительного контроля индукции апоптоза был добавлен камптотецин (СРТ), цитотоксический хинолиновый алкалоид, ингибирующий фермент ДНК-топоизомеразу I, в концентрации 10 мкМ на 24 ч при 37°С. Затем клетки ресуспендировали в связывающем буфере для аннексина V (10 мМ ΗΕΡΕδ, рН 7,4, 140 мМ №С1, 2,5 мМ СаС12) и окрашивали аннексином ν-АРС и 7-аминоактиномицином Ό (7-ААЭ) или йодистым пропидием (ΡΙ). Клетки промывали, ресуспендировали в связывающем буфере для аннексина V и анализировали с помощью проточной цитометрии (РАСЪАггау 5У51ст. ΒΌ Вюкаепсек, δαη ίοχο. СА) и программного обеспечения Ρ1ο\νίο (Тгее81аг, 1пс., δαη Сат^к, СА).
Клеточные линии Κатο8 человеческой В-лимфобластной лимфомы Беркитта (Са!. СКЬ-1596), ССКР-ΟΕΜ человеческого Т-лимфобластного острого лейкоза (ССЬ-119), НЬ-60 человеческих промиелобластов (ССЬ-240), Nата1νа человеческой В-лимфобластной лимфомы Беркитта (СКЬ-1432), Кац человеческой В-лимфобластной лимфомы Беркитта (ССЬ-86), ΚΡΜΙ 8226 человеческой миеломы (ССЬ-155), ΜΜ.1δ человеческой В-лимфобластной ΜΜ (СКЬ-2974), И226В1 человеческой миеломы (ΤΙΒ-196), МВ-4-11 человеческого бифенотипического В-миеломоноцитарного лейкоза (СКЬ-9591), ΜΙ человеческой Т-клеточной лимфомы (СКЬ-8294), НН человеческой Т-клеточной лимфомы (СКЬ-2105), НиТ78 человеческой лимфобластной кожной лимфомы (ΤΙΒ-161), ΝΚ92 человеческой ΝΚ-клеточной неходжскинской лимфомы (СКЬ-2407) были приобретены в АТСС, Μαπα^δαδ, VΑ.
Клеточные линии Nοтο-1 человеческой острой миелоидной лейкемии (АСС 542), ΜΘΕΡ-8 ММ (АСС 569), δυ-ΌΗΕ6 человеческой В-клеточной неходжкинской лимфомы (АСС 572), Ь540 человеческой лимфомы Ходжкина (АСС 72), КО-1 человеческой ΑΜ^ (АСС 14), ΜΘΕΡ-8 человеческой ММ (АСС 569), ОРМ-2 человеческой ММ (АСС 50), Ь-363 человеческого лейкоза плазматических клеток (АСС 49) были приобретены в ΌδΜΖ, Вгаип8сЙ№е1д, Оегтапу.
- 31 026153
Таблица 4
Индукция апоптоза панели клеточных линий антителами ΒΜδ-936564
Клеточная линия Тип клеток Экспрессия СХСК4 Скорректированный процент апоптоза % ингибирования опухолевого роста (монотерапия)
Катоз* Лимфома ++++ 71 80
ХатаЬса* Лимфома ++++ 30 66
Кар* Лимфома ++++ 15 35
ЭНЬб* Лимфома + 3 55/77
Ь540* Лимфома +++ 35
II то АМЬ ++ 31 60/82
Хото-1 АМЬ ++++ 34 88
КС-1 АМЬ ++ 8 23
МОЬР-8 ММ ++ 19 66
ΚΡΜΙ 8226 ММ ++ 17
ММ 18 ММ + 15 49
Ы226 ММ + 22
1ΓΝ3Κ ММ 31 97
ОРМ2 ММ ++ 17
Ь-363 ММ + 16
МУ-4-11 ММ ++ 1
МЛ тсь ++ 9
НН тсь +++ 9
НиТ78 тсь + 22
ССКР-СЕМ* АЬЬ +++ 45 72
ΝΚΣ ΝΚ +++ 36
ΚΗΥΟ-1 ΝΚ + 10
ΝΚ-92 ΝΚ ++ 48
Первичные человеческие* В (СП19+) ++ 17
Первичные человеческие* Т (СОЗ+) + 6
Первичные человеческие* Моноциты (СО 14+) ++ 24
* Без поперечного связывания.
Значения экспрессии СХСК4
МПсЮнМАЬ Степень экспрессии (+)
400-2000 +
2000-10.000 ++
10,000 - 50,000 +++
50,000 - 250,000 +^+
Фибробласты хомяка К1610 (СКЬ-1657), приобретенные в АТСС, трансфицировали человеческим СХСК4 и селектировали на 0418 в концентрации 500 мкг/мл. Клетки ίίΝ-3 (АСС 541), приобретенные в ΌδΜΖ, селектировали в ΒΜδ для устойчивости к бортезомибу. Линия человеческих МК клеток крупноклеточного гранулоцитарного лейкоза ΝΕΕ предоставлена Оапа-ЕагЬсг Сапсег ΙηδΙίΙυΙο; клеточная линия человеческого ΝΧ-клеточного лейкоза Κ.ΗΥ0-1 (1СКВ0156) была приобретена в ^ο1ΐ1ι δ^ι^ Кеδеа^сΗ ^δοω^δ Βаηк, ίοροη ШаИЪ δ^ι^δ Ροиηάаί^οη.
Способность ΒΜδ-936564 индуцировать апоптоз СХСК4+-клеток сравнивали со способностью индуцировать апоптоз низкомолекулярного СХСК4-антагониста ΆΜΌ3100. Апоптоз исследовали при инкубации клеток Ππωοδ с 10 мкг/мл ΒΜδ-936564 или контрольного изотипического антитела в течение
- 32 026153 ч при 37°С. Для сравнения клетки Каток инкубировали с 6 мкМ ΆΜΌ3100, что соответствует концентрации, которая ингибирует СХСЬ12-индуцированные вход кальция и миграцию. Клетки окрашивали аннексином У-Р1ТС и йодистым пропидием (ΡΙ). Был определен процент клеток, позитивных по аннексину V или по аннексину V и ΡΙ. ΒΜδ-936564 вызвало увеличение позитивного окрашивания аннексином V (31,2%) и аннексином ν/ΡΙ (27,3%) по сравнению с клетками, которые не подвергали обработке (1,7% и 4,1%), инкубировали с контрольным изотипом (0,5 и 2,8%) или обрабатывали ΆΜΌ3100 (2,0 и 2,7%) (фиг. 14А и 14В).
Для подтверждения специфичности апоптотического ответа к ΒΜδ-936564 для анализа апоптоза были использованы исходные клетки К1610, которые не связывают ΒΜδ-936564 (данные не представлены), и К1610, трансфицированные человеческим СХСК4 и связывающие ΒΜδ-936564 (фиг. 4). МИХ-1338 (ΒΜδ-936564) или контрольный изотип были добавлены к клеткам К1610 и
СХСК4-трансфецированным клеткам на 24 ч при 37°С, затем клетки окрашивали аннексином ν-РГТС и йодистым пропидием (ΡΙ). Был определен процент клеток, которые были положительными по аннексину V или по аннексину V и РЬ Трансфицированные клетки К1610-НСХСК4 демонстрировали повышенный уровень окрашивания аннексином V и аннексином ^ΡΙ после инкубации с ΒΜδ-936564 (24,3 и 11,4%), в то время как для контрольного изотипического антитела (2,5 и 0,9%) или образца без обработки (2,6 и 0,9%) значения были минимальными (фиг. 15А). Исходные клетки К1610 не проявляли апоптоза в ответ на обработку ΒΜδ-936564 (фиг. 15В), что свидетельствует о специфичности эффекта для НСХСК4. По результатам этих данных было показано, что ΒΜδ-936564 индуцирует апоптоз в нескольких СХСК4-клеточных линиях, а также в нормальных РВМС (табл. 4).
Данные об апоптозе, индуцированном ΒΜδ-936564, в различных СХСК4-клеточных линиях в сравнении с контрольным изотипом приведены в табл. 5.
Таблица 5
ΒΜδ-936558-индуцированный апоптоз в клеточных линиях множественной миеломы ίη νίίτο
Линия клеток Экспрессия СХСК4 Обработка антителом % клеток, позитивных по аннексину V % клеток, позитивных по аннексину V + 7ААО
МОЬР-8 ++ Изотип 16,4 11,9
ВМК-936564 32,7 14,2
ΕΡΜΙ-8226 ++ Изотип 27,1 16,9
ВМК-936564 36,3 24,6
ММ 18 + Изотип 20,5 8,4
ВМК-936564 34,1 9,8
ΗΝ-3Κ ++ Изотип 15,0 4,8
ВМК-936564 46,8 25,1
ОРМ-2 ++ Изотип 14,4 2,8
ВМК-936564 31,1 3,7
Данные, обобщенные в табл. 4 и 5, показывают, что ΒΜδ-936564 индуцирует апоптоз и, таким образом, может быть эффективным терапевтическим агентом, в частности, в отношении каждой опухолевой клетки, экспрессирующей СХСК4.
Пример 12.
Дополнительные исследования, отражающие ингибирование пролиферации опухолевых клеток анти-СХСК4 антителами ίη νίνο.
В этом примере исследовали способность анти-СХСК4 человеческих антител ингибировать пролиферацию или индуцировать апоптоз сформировавшихся солидных опухолей ίη νίνο с применением дополнительных моделей опухолевых клеток, аналогичных модели Каток, описанной выше в примере 9. Были рассмотрены различные опухолевые клеточные линии. Ниже представлены репрезентативные эксперименты и полученные результаты.
В одном эксперименте 7,5х106 человеческих клеток рака молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ231 было имплантировано в бок каждой мыши, клетки оставляли расти до среднего размера опухоли 100 мм3, рассчитываемого как (длинах ширинах высота)/2, который был достигнут на 7 день после имплантации. Мыши были рандомизированы в различные группы для лечения и получили внутрибрюшинную (ΙΡ) инъекцию первой дозы антител на 7 день после имплантации, вторую ΙΡ дозу антител - на 14 день после имплантации, а затем третью дозу - на 46 день после имплантации. Группы мышей (η=9) получали (ί) носитель (ΡΒδ); (ίί) контрольный изотип Ι§Οι (15 мг/кг); (ίίί) контрольный изотип Ι§Ο4 (15 мг/кг); (ίν) Р7 Ι§Οι (15 мг/кг) или (ν) Р7 Ι§Ο4 (15 мг/кг). Объемы опухолей измеряли с регулярными интервалами и определяли средний объем и медиану объема опухоли для каждой группы на каждом интервале. Результаты
- 33 026153 этого эксперимента представлены ниже в табл. 6, которая отражает средний объем опухоли (в мм3) и % ингибирования роста опухоли (ТО1) на 52 день и средний объем опухоли (в мм3) и % ТО1 на 59 день после имплантации. Кроме того, у одной из мышей в группе с обработкой Р7 1дО4 опухоль отсутствовала на 59 день. Результаты демонстрируют, что Р7 тАЬ способно ингибировать рост клеток рака молочной железы МИА-МВ231 ίη νίνο.
Во втором эксперименте 5х106 клеток человеческой мелкоклеточной карциномы легкого ИМ879 было имплантировано в бок каждой мыши, после чего опухоли позволяли расти до среднего размера 160 мм3, рассчитываемого как (длинахширинахвысота)/2, который был достигнут на 7 день после имплантации. Мыши были рандомизированы в различных группах лечения и получили внутрибрюшинные (ΙΡ) инъекции антител согласно графику дозирования О3Их5 (каждые три дня, пять циклов). Группы мышей (η=10) получали (ί) носитель (РВ8); (ίί) контрольный изотип 1дО4 (10 мг/кг) или (ίίί) Р7 1дО4 (10 мг/кг). Объемы опухолей измеряли с регулярными интервалами и определяли средний объем и медиану объема опухоли для каждой группы лечения в каждом интервале. Результаты этого эксперимента представлены ниже в табл. 7, которая отражает средний объем и медиану объема опухоли (в мм3) и % ингибирования роста опухоли (ТО1) на 34 день после имплантации. Результаты демонстрируют, что Р7 тАЬ способны ингибировать рост клеток человеческой мелкоклеточной карциномы легкого ИМ879 ίη νίνο.
Таблица 6
Ингибирование опухолевого роста клеток МИА-МВ231 антителами тАЬ Р7 ίη νίνο
Среднее ΤΟΙ (%) Медиана ΤΟΙ (%)
Носитель 154 187
контрольный ИЗОТИП ]§О 1 172 216
контрольный изотип 1§С4 188 226
Р7 анти-СХСК4 1§О1 86 50 130 40
Р7 анти-СХСК.4 1§С4 79 58 108 52
Таблица 7
Ингибирование опухолевого роста клеток ИМ879 антителами тАЬ Р7 ίη νίνο
Для тестирования способности анти-СХСК4 антитела ингибировать рост опухоли в экспериментах, аналогичных тем, которые описаны выше и в примере 9, были использованы дополнительные модели подкожного ксенотрансплантата. В эксперименте с применением клеток 8и-ИНЬ-6 В-клеточной лимфомы результаты показали, что применение тАЬ Р7 1дО4 в концентрации 15 мг/кг приводило к приблизительно 60%-ному ингибированию роста опухоли. Аналогичным образом, в эксперименте с применением клеток Ν;·ιιη;·ι1\ν;·ι лимфомы Беркитта результаты показали, что применение Р7 1дО4 тАЬ в концентрации 3 мг/кг приводило приблизительно к 70%-ному ингибированию роста опухоли. В противоположность этому, ингибирования роста опухоли антителами тАЬ Р7 не наблюдалось в экспериментах с применением клеток ΝΙΗ-Η226 карциномы легкого или клеток НРАС аденокарциномы поджелудочной железы человека. Тем не менее, окрашивание этих клеток антителами Р7 тАЬ в экспериментах с проточной цитометрией обнаружило минимальную экспрессию ίη νίίτο. Несмотря на то что опухолевые клетки ίη νίνο были способны к окрашиванию тАЬ методом иммуногистохимии, было не ясно, на какой стадии их роста в опухоли они начали экспрессировать СХСК4. Это говорит о том, что экспрессия СХСК4 на этих двух клеточных линиях была недостаточной, чтобы обеспечить ингибирование опухолевого роста или индукцию апоптоза ίη νίνο путем обработки анти-СХСК4 антителами.
Пример 13.
Ингибирование метастазов в легких антителами анти-СХСК4 ίη νίνο.
В этом примере исследовали способность анти-СХСК4 тАЬ Р7 ингибировать метастазы в легких в модели системной опухоли на мышах С57. 0,4х106 клеток В16-СХСК4 (клетки В16, трансфицированные для экспрессии человеческого СХСК4) вводили внутривенно каждой из 30 мышей линии С57. Мышей рандомизировали на три группы по десять мышей в каждой, которые затем получали (ί) носитель (РВ8); (ίί) контрольный изотип 1дО4 (5 мг/кг) или (ίίί) Р7 1дО4 (5 мг/кг). Антитело или носитель вводили внутрибрюшинно через 30 мин после внутривенного введения В16-СХСК4. Легкие собирали на 14-й день и оп- 34 026153 ределяли количество метастатических узелков в легких. Результаты приведены в табл. 8, в которой отражено среднее количество и медиана количества легочных метастазов в каждой группе. Эти результаты показывают, что применение тАЬ Р7 привело к уменьшению среднего числа метастатических узелков в легких на 56%, тогда как снижение в случае применения контрольного изотипического антитела составило только 15%, что свидетельствует о том, что моноклональное антитело Р7 способно ингибировать метастазы в легких в модели системной опухоли.
Таблица 8
Ингибирование метастазов в легких ίη νί\Ό антителами тАЬ Р7
Лечение Число метастазов в лёгких % ингибирования метастазов в лёгких (среднее)
Среднее Медиана
Носитель 364 397
контрольный изотип 1вО4 309 294 15%
Р7 антн-СХСЕ4 1§О4 157 186 56%
Пример 14.
ВМ8-936564 ингибирует рост опухоли в модели неходжкинской лимфомы (NН^) ίη νί\Ό.
Активность ВМ8-936564 и анти-СХСЬ12 в отношении ингибирования роста опухоли была протестирована ίη νί\Ό на мышах 8СГО, несущих ксенотрансплантаты опухоли. Мышам 8СГО подкожно имплантировали 10 миллионов клеток Каток (человеческие клетки линии В-лимфобластной лимфомы Беркитта) в 0,1 мл фосфатно-солевого буфера (РВ8) и 0,1 мл МАТКЮЕЬ® с применением шприца объемом 1 см3 и полудюймовой иглы калибра 25. После достижения среднего размера и медианы размера опухоли 80 мм мышей рандомизировали (п=8) в соответствии с объемом опухоли. В дни 0 и 7 каждому животному вводили внутрибрюшинно (1Р) примерно 200 мкл ВМ8-936564 (15 мг/кг/доза), анти-СХСЬ12 (15 мг/кг/доза), контрольного изотипа 1§С4 человека (15 мг/кг/доза), ритуксимаба (15 мг/кг/доза) или РВ8 (контроль, носитель) в объеме 0,3 мл 1Р. В исследовании зависимости ответа от дозы ранее было обнаружено, что доза ритуксимаба 15 мг/кг должна быть эффективной (данные не показаны). Все дозы антител хорошо переносились, и не наблюдалось потери веса тела. Опухоли и вес тела измеряли дважды в неделю. Объемы опухолей измеряли по трем параметрам (длинахширинахвысота/2) с помощью электронного штангенциркуля Ро\\!ег Е1ес1готс И1дйа1 СаЬрег (Мойе1 62379-531; Ргей V. Ро\\!ег Со., №Юоп, МА), и данные были записаны в электронном виде с помощью программного обеспечения 81ийу ИйесЮг от 81ийуЬод 8ук1етк, 1пс. (8ои1Н 8ап Ргапсйсо, СА). Животных проверяли ежедневно на изменения положения тела, груминга и дыхания, а также на вялость. Мыши были подвергнуты эвтаназии, когда опухоли достигли конечной точки 2000 мм или появились изъязвления.
ВМ8-936564 и положительный контроль, ритуксимаб, ингибировали рост опухоли в сравнении с носителем и контрольным изотипом. Лечение ВМ8-936564 привело к средней задержке роста на 99% на 21-й день, и ингибирование поддерживалось в течение 60 дней (фиг. 16). В противоположность этому антитело анти-СХСЬ12 не ингибировало рост опухоли и проявляло себя сходно с контрольным изотипическим антителом.
Пример 15.
ВМ8-936564 ингибирует рост опухоли в модели острой миелоидной лейкемии (АМЬ) ίη νί\Ό.
Чтобы оценить эффективность антитела в отношении АМЬ, были использованы две модели цитарабин-резистентных мышиных ксенотрансплантатов: НЬ-60 и №то-1. Экспрессия СХСК4 в каждой клеточной линии была подтверждена с помощью окрашивания РАС8 (фиг. 4А). Мышам 8СГО подкожно имплантировали 10 миллионов клеток НЬ-60, как описано в примере 14. Когда объем опухоли достигал примерно 136 мм3, мышей рандомизировали (п=10) и вводили дозы 1Р антител ВМ8-936564 (10 мг/кг/доза), контрольного изотипа 1§С4 человека (10 мг/кг/доза) или РВ8 (контроль, носитель) в дни 0, 3, 7, 10 и 14; мышей наблюдали в течение 41 дня. В день 27 среднее ингибирование роста опухоли составило 88% и 83% по сравнению с контрольным изотипом и носителем соответственно (фиг. 17А).
В модели №то-1 (7,5 млн клеток имплантировали подкожно, как в примере 14), когда объем опухоли достигал приблизительно 84 мм3, мышей рандомизировали (η=9) и вводили им ВМ8-936564 (10 мг/кг/доза), контрольный изотип 1§С4 (10 мг/кг/доза), РВ8 (контроль, носитель) или цитарабин (20, 60 или 90 мг/кг/доза) в дни 0, 3, 7, 10 и 14 и наблюдали их в течение 57 дней. В 34 день среднее ингибирование опухоли у обработанных ВМ8-936564 мышей составило 88% в сравнении с контрольным изотипом или носителем (фиг. 17В). Как и ожидалось, цитарабин (также известный как арабинофуранозил цитидин или Ага-С) не ингибирует рост опухоли (фиг. 17В).
- 35 026153
Пример 16.
ΒΜδ-936564 ингибирует опухолевый рост в модели множественной миеломой (ΜΜ) ίη νίνο.
Разнообразные СХСК4'-клетки миеломы, а именно ΜΘΌΡ8, ΗΝ-3Ρ. ΗΝ-3. КРΜI-8226, ΜΜ.1δ и ОРМ-2, тестировали на чувствительность к ΒΜδ-936564 в модели δίΊΌ ксенотрансплантата опухоли. Во всех экспериментах мышам вводили внутрибрюшинно в дни 0 и 7 контрольный изотип !дС4 и носитель ΡΒδ. Клетки ΜΘΌΡ-8 (2,5 млн) имплантировали в мышей δΟίΌ, как описано в примере 14. Когда объем опухоли достигал примерно 100 мм3, мышей рандомизировали в группы по 8 мышей (η=8) и в дни 0, 3, 7, 10 и 14 им вводили дозы только ΒΜδ-936564 (10 мг/кг/доза) или в комбинации с 50 мг/кг леналидомида (НЕУЕ^ГО®), или в комбинации с 0,8 мг/кг бортезомиба (УЕЬСАОЕ®). ΒΜδ-936564 значительно задерживал средний рост опухоли на 66 и 56% по сравнению с антителом контрольного изотипа на 25 день (последний день, когда все мыши в каждой группе оставались в исследовании) (фиг. 18 А). Опухоли ΜΘΕΡ8 были относительно устойчивы к леналидомиду и бортезомибу, и эффективность ΒΜδ-936564 не была усилена в комбинации с любым из этих препаратов (фиг. 18А). В конце исследования на 42-й день в группе, получавшей ΒΜδ-936564, оставались 5 из 8 мышей, в то время как в группе, получавшей контрольный изотип, мышей не осталось.
Клетки ΡΓΝ-3Κ, резистентные к бортезомибу, (5 млн) были имплантированы в δίΊΌ мышей, как описано выше. При объеме опухоли около 100 мм3 мышей рандомизировали (η=8), вводили им ΒΜδ-936564 (10 или 30 мг/кг/доза ГР) или леналидомид (50 мг/кг/доза ГР), или бортезомиб (0,8 мг/кг/доза IV) в дни 0, 4, 7, 11 и 14 и наблюдали их в течение 25 дней. Средний рост опухоли с течением времени показан на фиг. 18В. Ни леналидомид, ни бортезомиб не ингибируют рост опухоли, в то время как среднее ингибирование роста опухоли для мышей, получавших ΒΜδ-936564, на 25 день составило 100% в сравнении с мышами, получавшими контрольный изотип.В конце исследования 4 мыши из 7 остались без опухоли в группе, получавшей 30 мг/кг ΒΜδ-936564.
При использовании исходных клеток ΌΝ-3 ни бортезомиб, ни леналидомид существенно не проявили эффективности в отношении ингибирования опухоли. 5 млн клеток ΌΝ-3 были имплантированы в каждую мышь δΟίΌ, когда объем опухоли достигал приблизительно 77 мм3, мышей рандомизировали в группы по 8. Затем мышам вводили только ΜΌΧ-1338 (10 мг/кг/доза ΣΡ) или в комбинации с бортезомибом (0,8 мг/кг/доза IV) или леналидомидом (50 мг/кг/доза ТР) в дни 0, 3, 7, 10 и 14. ΜΌΧ-1338 ингибировал рост опухоли на 52% на 25 день по сравнению с мышами, которые получали носитель (фиг. 18С). Бортезомиб проявил максимальную эффективность в отношении ингибирования роста опухоли на модели клеток ΗΝ-3, но его сочетание с ΜΌΧ-1338 несколько повысило уровень ΜΌΧ-1338индуцированного ингибирования до 58% на 25 день по сравнению с носителем (фиг. 18В). Леналидомид был неэффективным в отношении ингибирования роста опухоли, также и сочетание леналидомида и ΜΌΧ-1338 было неэффективным и проявляло меньшее ингибирование, чем только ΜΌΧ-1338 (фиг. 18Ό).
Клетки КΡΜI-8226 (10 млн) имплантировали в мышей δΟΌ, как описано в примере 14. Мышей рандомизировали (η=8), когда объем опухоли достигал приблизительно 20 мм3, и вводили им в дни 0, 3, 7, 10 и 14 дозы только ΜΌΧ-1338 (10 мг/кг/доза) или в комбинации с 50 мг/кг леналидомида, или в комбинации с 0,8 мг/кг бортезомиба. ΜΌΧ-1338 значительно задерживал средний рост опухоли на 53% по сравнению с носителем на 44 день (фиг. 18Е). Леналидомид при введении отдельно проявил максимальную эффективность в модели ΡΡΜΕ 8226, но эффективность ΜΌΧ-1338-ингибирования роста опухоли заметно повышалась при использовании комбинации 50 мг/кг леналидомида и 10 мг/кг ΜΌΧ-1338 и составила 79% на 44 день в сравнении контрольным изотипом (фиг. 18Е). Бортезомиб проявил хорошую эффективность в подавлении среднего роста опухоли на 70% на 44 день в сравнении с контрольным изотипом (фиг. 18Р) и несколько повышал эффективность ΜΌΧ-1338 в отношении ингибирования роста опухоли с 61 до 82% на 44 день в сравнении с контрольным изотипом (фиг. 18Р).
Клетки ΜΜ.1δ (10 млн) были имплантированы в мышей δΟίΌ, которых рандомизировали (η=8), когда объем опухоли достигал приблизительно 30 мм3, и в дни 0, 4, 7, 11 и 14 мышам вводили дозы только ΜΌΧ-1338 (10 мг/кг/доза) или в комбинации с 100 мг/кг леналидомида. ΜΌΧ-1338 значительно задерживал средний рост опухоли на 60% в сравнении с контрольным изотипом на 25 день (фиг. 21). Леналидомид был еще более эффективным и задерживал средний рост опухоли на 70% на 25 день, а комбинация ΜΌΧ-1338 и леналидомида значительно ингибировала рост опухоли на 86% на 25 день (фиг. 18С).
- 36 026153
Таблица 9
Экспрессия СХСК4, апоптоз и ингибирование роста опухоли в клеточных линиях множественной миеломы
Клеточн ая линия Экспресси я СХСК4 Апоптоз, индуцирова нный только МОХ-1338 Апоптоз в присутствии перекрестно связывающего АЬ Ингибирование опухолевого роста
МОЬР8 ++ + ΜϋΧ-1338 = 56% Только КЕУЫМЮ® = 35% Комбинация = 68%
4Ν-3Κ - +++ ΜϋΧ-1338 = 100%
ΒΝ-3 ++ - +++
ΚΡΜΙ- 8226 ++ ++ ΜϋΧ-1338 = 61% Комбинация с леналидомидом = 90% Комбинация с бортезомибом = 82%
ММ. 18 + ++ МОХ-1338 = 60% КЕУЫМГО® = 70% Комбинация = 86%
ОРМ-2 ++ ++ ΜϋΧ-1338 = 46% Комбинация с бортезомибом = 92%
Клетки ОРМ-2 (10 миллионов) имплантировали в 8СГО мышей, как описано выше. При объеме опухоли приблизительно 77 мм мышей рандомизировали (п=8) и вводили им только МОХ-1338 (10 мг/кг/доза ΙΡ) или в комбинации с бортезомибом (0,8 мг/кг/доза IV) или леналидомидом (50 мг/кг/доза ΙΡ) в дни 0, 4, 7, 11 и 14. МОХ-1338 ингибировал средний рост опухоли на 45% на 24 день в сравнении с мышами, которые получали носитель (фиг. 18Н). Бортезомиб ингибировал рост опухоли на 75% на 24 день, а комбинация МОХ-1338 и бортезомиба имела более высокую эффективность со средним ингибированием роста опухоли на 99% на 24 день (фиг. 18Н). Леналидомид проявил минимальную эффективность в модели ОРМ-2, и несущественно повышал эффективность МОХ-1338 (фиг. 18Ι).
Результаты ингибирования роста опухоли, полученные на этих клеточных ксенотрансплантатах ММ, приведены в табл. 9 вместе с данными об экспрессии СХСК4 и чувствительности к апоптозу, индуцированному МОХ-1338.
Примеры 14-16 показывают, что при применении для монотерапии сформировавшихся опухолей ВМ8-936564 проявляет противоопухолевую активность на нескольких ксенотрансплантатных моделях ЫНЬ, АМЬ и ММ. Поскольку ВМ8-936564 является антителом 1дО4, оно не вызывает комплементзависимой цитотоксичности (СОС) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АОСС). Данные, представленные в примере 11, демонстрируют, что ВМ8-936564 индуцирует апоптоз как один из механизмов ингибирования роста опухоли.
- 37 026153
Ссылки
А1зауе<1 Υ й а1. (2007) Βϊοοά 109(7):2708-17.
Атайоп 8 είαί. (1991)ЗСИпОпсо!9(7):1210-4.
Ап§а1 8 ею}. (1993)Мен' 1ттипо! 30(1):105-8.
А/аЬ АК е! а1. (2009) Βϊοοά 113( 18 ):4341 -51.
ВеИег К е( а1. (2011) Ехр Нета1о139(3):282-92.
ВепнИСйя/ (1998)РгасАаГ/Лшй8й иВА 95:12556-61.
ΒβΠοϋηϊ Р е> αί. (2002) Сапсег Кея 62(11):3106-12.
В1еи1 СС й а1. (1996) Ναίυτε 382(6594):829-33.
Вгеетз О А е(а1. (200$) А СИп Опсо! 23(9):1969-78.
Вгохтеуег НЕ й αί (2005) 7 Ехр Μεά 201:1307-18.
Вшьгег ДА й αί. (1999) Βϊοοά 94:3658-67.
Сапсег Еас(я αηά Е}§ргея 2008, Атепсап Сапсег 8ос1е1у, АЙаШа СА (2008).
Сатес X й а1. (2005) ά νίτοί 79:1930-8.
С1ю\¥ КС! й а1. (2002) Наетаюкррса 87:33-43.
Согиопе Α εί αί (2000)./ Ναΐί Сапсег 1пя192:628-35.
Сог\га1а N й αί. (2011) Роз(ег ргезетес! а( 102ηά Аппиа1 Меепп§ οί ΐΐιβ Атепсап Лззосапоп Гог Сапсег Кезеагск, Αρπΐ 2-6, 2011, Ог1ап(1о. РЬ,
Сгагго1ага К. й αί. (2001) Вг АНаетаю! 115:545-53.
Оаг А й αί. (2011) Ееике/Ма 25(8): 1286-96.
Оеуте 8М είαί. (2004)/Сйп Опсо! 22:1095-102.
Οί 8ако I βίαί. (2000) Еиг ά Ркагтасо! 409:143-154.
Репд Υ είαί. (1996) Ваепсе 272:872-7.
Р1отепЬег§ N е! αί. (2005) Βϊοοά 106:1867-74.
РпеЙЬегд ΡΥ είαί. (2008)У СИп Опсо1 26(2):204-10.
Оаг§ Η είαί. (2006)Л.еикосу1е Βίοι 79:351-62.
Са/.ίΙΙ Υ (2001) ά НетаЮ11гег (Нет Се11 Кея 10:229-36.
Оеттс1ег йа/ (2001) 71ттипо1167:4747-57.
С|‘,<;е1Ьгес1п С С1 αί. (2011) Νονβΐ А§епв Гог ΟιΓΓιιίβ Ьаг§е В-се11 ЬутрНота, А8СО Ес1иса0оп Воок 2011, раде 321.
- 38 026153
С|<,<;е1Ьгес1и С е/ а!. (2010)А СИп Опсо! 28:4184-90.
Оопга1о ДА είαΐ. (2000) ААттшю! 165.499-508.
Си1еп§ В е!а!. (2005) Сапсег Ле1· 65(13):5864-71.
Оир(а 5К е( αί (1998) 4ΒίοΙ Скет 273(7):4282-7.
Некзе^еззег Л е!а!. (1997) Сигг Βίοι 7(2):112-21.
НШегШе/а/. (2011) 8иг%егу 150(3):459-65.
НоШпуег е! а! (2005) Лашее Вю1есИ 23(9): 1126-36.
Нозоката Υ е( αί (2005) СИп Ехр 1ттипо! 141:467-74.
НоиТе!а!. (1998)71ттипо1 160:180-8.
Пиану ДН е! а!. (2003) .7СИп ЕпАосппо! Ме1ак 88:408-16.
Дета1 Α είαί (2005) СА Сапсег./Οίη 55:10-50.
Дета1 А ею!. (2008) СА Сапсег Л СИп 58:71-96.
Дета1 Α είαί (2009) СА Сапсег А СИп 59:225-49.
Лап§ ΥΡ еГа1. (2006) Оупесо1 Опсо! 103(1):226-33.
Дт ВКе/ αί (2006) Να МеА. 12:557-67.
Дт Ь е!а1. (2008)Мо! Сапсег Ткег 7:48-58.
КаЬа! ЕА е! а!. (1991) Зециепсеа о/Ргогепк о/ 1ттипо!о$!са! ЛИееееи. ΓιΙΪΙι ΕώΙιοη. и.8. Вералтет оГНеа1(Ь ап<Л Нитап Зепасез. ΝΙΗ РиЬПсайоп Νο. 91-3242.
КаьЬуар МК, Китаг ϋ, Допеь Н, Ме1о-Саг4епаз Д, Кикпе МЕ., ЗаЬЬакт Р, СоЬеп ЬД. СапДагеШ ДМ, Иррз ТД апс! Сааио ДЕ (2012) АЬз(гас1 Гог ргезеШаТюп а! Атепсап 8ос1е(у оГНетаю1о§у (АЗН) 54<ь Аппиа1 МееЬпу. ОесетЬег 8-11, 2012, АИап(а, ОА.
КеиаЬаташ Т е!а! (2004) ΒΙοοά 103(10):3684-8.
КозЫЬаТ е1 а!. (2000) СИп Сапсег Псе 6:3530-5.
ЬауегсЬеге С ег а!. (2005) СИп Сапсег Лее 11:2561-7.
Ьее В είαί. (1999)РгосΝαίί АсаА8с! ΙΑΒΑ 96(9):5215-20.
ИЬига Д είαί. (2002) ΒΙοοΑ 100:2597-606.
ЬоеВсЬег М е! а!. (1994) Α Βίο! Скет 269(1):232-7.
ЬопЬегу N ег а! (1994) Мииее 368 (6474):856-859.
Ι.ηιΖ е! а!. (2011)ЕшЪсилоуш 54(8):2067-76.
МагесЬа1 Ее/ а/. (2009) ВгИ А Сапсег 100(9):1444-51.
МаиЬуз Р ег αί (2001) А/ттипо! 167:4686-92.
МоЫе Ее/а!. (1998)Βίοοά91(12):4523-30.
МоЫе Ее/о/. (1999) Ьеикетга 13:1954-9.
Ми11ег А είαί. (2001) №агиге 410:50-6.
- 39 026153
МигрЬу РМ (2001) Νεκ ΕηξΙΑΜεά 345(11):833-5.
ΝβπΊ Ъе(а1. (2009) Β’,οοί 113:6206-14.
ОЬегПп Е еГа/. (1996) №г/мге 382-833-5
О1а6еп е! а!. (2010) 8етт ΝυοΙΜεά40(3): 167-81.
Ойа1апо А е(а!. (2006) СНп Сапсег Ка 12(9):2795-803.
Публикация РСТ \С0 02/43478, опубликована 6 июня 2002, заявители Мейагех, 1пс. и Κϊπη Веег КаЬиз1ик1 Кан.Ка
Публикация РСТ 2008/060367, опубликована 22 мая 2008, , заявители Мейагех, 1пс
Публикация РСТ ΆΌ 2008/142303, опубликована 27 ноября 2008, Ρίβιτβ РаЬге МесПсатент
Публикация РСТ Ά Ο 2009/140124, опубликована 19 ноября 2009, ЕП Ы11у ап<1 Со Публикация РСТ \\Ό 2010/043650, опубликована 22 апреля 2010, АЫупх Νν.
Рта ΥΡ е( (А. (2011)./ΡαΟιοΙ 224(3):344-54.
Рогуазтк 8 είαί (2009) ТИе Рго$1а1е 69:1460-9.
КааЬ М3 είαί (2009) Гипсе! 374 (9686):324-39.
Кетре1 8А а а1. (2000) СНп Сапсег Кея 6:102-11.
КдсПеП М е! а1. (2009) ОпсоГ Кер 21:76-7.
Κί§Πί Е е1 а1 (2011) Сапсег Кея 71 (16): 5522-34.
КоЬтзоп Ж (ей.) (1978) 8ияГатеВ апА СоМгоНеА КеГеаяе Оги§ ОеНсегу Вушетя. Магсе1 Оеккег, 1пс., Νβ\ν Уогк.
Коссаго АМ, 8ассо А, КиЬпе М, ЛкаЬ А, Магзо Ρ, /Ιιαιι§ Υ, I,ί и Υ, Μ ί сЬ ае1 а К, Ν§ο НТ, риане, Р, СагбагеШ ДА ап<1 СИюЬпа! ΙΜ (2012) АЬз1гас1 Рог ргезяЯайоп а! Атепсап 8ос1е1у οί Нета1о1о§у (А8Н) 54(|‘ Аппиа1 Мее1т§, ОесетЬег 8-11, 2012, А(1ап(а, ОА.
КотЬои1з Е.ТС е( αί (2004) ΒΙοοά 104:550-7.
Китте! М1 ег αί (2002) 8етт ОпсоГ29(3ирр1. 13):12- 4.
8са1а 8 ег а1. (2005) СНп Сапсег Кея 11:1835-41.
ЗсоЯоп С ег аГ (2001) Вг ./ Сапсег 85:891-7.
ЗсПгаЯег Αί είαί. (2002) Вг.! Сапсег 86:1250-6.
8ιβ§β1 ΚβίαΙ. (2011) СА Сапсег А СНп 61(4):212-36.
Зтиег СК. апс! Οοΐάδίοηβ АН (1986) СНп Наета1о115:105.
8рапо1Ре/а/. (2004) Апп Опсо115:613-7.
Зроо АС еГаГ. (2007) ΒΙοοΑ 109(2):786-91.
- 40 026153
81а11ег Р εί αί (2003) Ναίινε 425:307-11.
ТасЫЬапа К είαί. (1998) Ναίων 393(6685):591-4.
ТаюНтап Κ8 εί αί (2002) Сапсег Κε$ 62:1832-7.
Τανοι 8 ει αΐ. (2004) Сапсег Кеч 64(8):2817-24.
Тега) а К. ε! αί (2003) ЬаЬ ίηνεζί 83:665-72.
Патент США 5,399,163, выдан 21 марта 1995, Ре1егзеп 8Р е/ а1.
Патент США 5,383,851, выдан 24 января 1995, МсИппоп, 1г. С\ είαί.
Патент США 4,941,880, выдан 17 июля 19906 Игкгы Ью
Патент США 6,794,132, выдан 21 сентября 2004, ВиесЫег I είαί.
Патент США 7,041,870, выдан 9 мая 2006, Тони гика К είαί.
Патент США 7,674,618, выдан 9 марта 2010, В1аск А.
Опубликованная заявка США 2012/0052097, опубликована 1 марта 2012, Ре1гег ОЗ ег αί.
Υιοίΐπ АР εί а!. (2002) Су!окте СгселАк Рас1ог Κεν 13:143-154.
\\'аи§ Ν εί αί. (2005).! ΤταηαΙΜεά 3:26-33.
ХСепд АР εί а1. (2003) Ат.) СНп Ραίίϊοί 119:424-30.
гее1епЬег£ 18 εί αί. (2003) Сапсег Κει 63:3833-9.
Ζβη§ Ζ είαί. (2009) ΒίοοΑ 113(24)-6215-24.
ΖΐΜη§ είαί. (2002)/Βίοι Скет 277(27):24515-21.
гои Υ εί αί. (1998) Ναίιικ 393(6685):595-9.
- 41 026153
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БРИСТОЛ-МАЙЕРС СКВИББ КОМПАНИ
<120> СХСР4 ЛЕЧЕНИЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПОМОЩЬЮ АНТИ АНТИТЕЛА
<130> 11900-ИО-РСТ
<140> <141>
<150> <151> 61/557,815 2011-11-09
<150> <151> 61/569,113 2011-12-09
<160> 51
<170> РаЬепЫп Уег. 3.3
<210> <211> <212> <213> 1 5 РРТ Ното зараепз
<400> 1
Зег Туг Зег МеЬ Азп 1 5
<210> <211> <212> <213> 2 5 РРТ Ното зараепз
<400> 2
Зег Туг Зег МеЬ Азп 1 5
<210> <211> <212> <213> 3 5 РРТ Ното зараепз
<400> 3
Зег Туг Зег МеЬ Азп 1 5
<210> <211> <212> <213> 4 5 РРТ Ното зараепз
<400> 4
Зег Туг Зег МеЬ Азп 1 5
- 42 026153 <210> 5 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 5
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 6 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 6
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 7 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 7
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Ьуз ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 8 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 8
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег УаЬ Ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 9 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 9
Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеН Азр Уа1 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз
- 43 026153 <400> 10
Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг 10 Туг
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 11
Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг
1 5 10
<210> 12
<211> 16
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 12
Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Нтз Туг Туг
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 13
Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 14
Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 15
Агд ТЬг Зег 61п С1у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 16
Туг С1у МеС Азр Уа1 15
Туг С1у МеС Азр Уа1 15
Туг С1у МеС Азр Уа1 15
- 44 026153
Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Азп Тгр Ьеи А1а 10
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 17
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 18
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 19
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 20
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 21
61п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд ТЬг
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 22
С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд ТЬг
1 5
- 45 026153 <210> 23 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 23
С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 24
С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд 1 5 <210> 25 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зартепз
<400> 25
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1п Зег С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
Зег МеН Азп 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40
Зег Туг 50 11е Зег Зег Агд Зег 55 Агд
Ьуз 65 С1у Агд РНе ТНг 11е 70 Зег Агд
Ьеи С1п МеН Азп Зег 85 Ьеи Агд Азр
А1а Агд Азр Туг 100 С1у С1у С1п Рго
Азр Уа1 Тгр 115 С1у С1п С1у ТНг ТНг 120
С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 10 15
С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг 30
С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 45
11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 60
Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 75 80
Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 90 95
Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеН 110
ТНг Уа1 Зег Зег 125 <210> 26 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зартепз
<400> 26 Ьеи Уа1 5 С1п Зег С1у
С1п 1 Уа1 С1п
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а
С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
15
С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг
- 46 026153
Зег МеЬ Азп 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеЬ
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 27 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зараепз
<400> 27 С1п Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Ьуз ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Агд Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеЬ
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 28 <211> 125 <212> РКТ <213> Ното зараепз
<400> 28
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
- 47 026153
Зег МеЬ Азп 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Нтз Туг Туг Туг С1у МеЬ
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 29 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното зартепз
<400> 29 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
А1а 1 11е Агд МеЬ ТЬг 5
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе Уа1 ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 30 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 30
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25 Зег С1п С1у 11е Зег 30 Зег Тгр
Ьеи А1а Тгр 35 Туг С1п С1п Ьуз Рго 40 С1и Ьуз А1а Рго Ьуз 45 Зег Ьеи 11е
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Рго Агд РЬе Зег С1у
- 48 026153
55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Vа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 31
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното ί зартепз
<400> 31
ναι 11е Тгр Vа1 ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Vа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд ναΐ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд ТЬг Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Vа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Vа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 32
С1и 11е να1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Vа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд να1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Азп Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Vа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
- 49 026153
ТНг РНе С1у С1п 100 С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 105
<210> 33
<211> 375
<212> ΌΝΑ
<213> Ното зартепз
<220>
<221> СЫЗ
<222> (1).. (375)
<400> 33
сад дНд сад сНд дНд сад НсН ддд дда
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у С1у
1 5
Нсс сНд ада сНс Нсс НдН дса дсс дсН
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а
20 25
адс аНд аас Ндд дНс сдс сад дсН сса
Зег МеН Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго
35 40
Нса Нас аНН адН адН ада адН ада асс
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТНг
50 55
аад ддс сда ННс асс аНс Нсс ада дас
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр
65 70
сНд саа аНд аас адс сНд ада дас дад
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и
85
дсд ада даН Нас ддН ддН саа ссс ссН
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго
100 105
дас дНс Ндд ддс саа ддд асс асд дНс
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1
115 120
11е Ьуз
ддс С1у 10 ННд Ьеи дНа Уа1 сад С1п ссН Рго ддд С1у 15 ддд С1у 48
дда ННс асс ННс адН адс НаН 96
С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг
30
ддд аад ддд сНд дад Ндд дНН 144
С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
45
аНа Нас Нас дса дас НсН дНд 192
11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
60
ааН дсс аад аас Нса сНд НаН 240
Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
75 80
дас асд дсН дНд НаН Нас НдН 288
Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
Нас Нас Нас Нас Нас ддН аНд 336
Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеН
110
асс дНс Нсс Нса 375
ТНг Уа1 Зег Зег
125 <210> 34 <211> 375 <212> ΌΝΑ <213> Ното заргепз <220>
<221> СЫЗ <222> (1)..(375) <400> 34
сад С1п 1 дНд Уа1 сад С1п сНд Ьеи дНд Уа1 5 сад С1п НсН Зег ддд С1у дда С1у ддс С1у 10 ННд Ьеи дНа Уа1 сад С1п ссН Рго ддд С1у 15 ддд С1у 48
Нсс сНд ада сНс Нсс НдН дса дсс дсН дда ННс асс ННс адН адс НаН 96
- 50 026153
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а А1а 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
аде аПд аас Пдд дПс сдс сад дсП сса ддд аад ддд сПд дад Пдд дПП 144
Зег МеП Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Пса Пас аПП адП адП ада адП ада адс аПа Пас Пас дса дас ПсП дПд 192
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сда ППс асс аПс Псс ада дас ааП дсс аад аас Пса сПд Пас 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
сПд саа аПд аас адс сПд ада дас дад дас асд дсП дПд ПаП Пас ПдП 288
Ьеи С1п МеП Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дсд ада даП Пас ддП ддП саа ссс ссП Пас Пас Пас Пас Пас ддП аПд 336
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеП
100 105 110
дас дПс Пдд ддс саа ддд асс асд дПс асс дПс Псс Пса 375
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 35 <211> 375 <212> ВИА <213> Ното зарЬепз <220>
<221> СПЗ <222> (1)..(375) <400> 35
дад С1и 1 дПд Уа1 сад С1п сПд Ьеи дПд Уа1 5 сад С1п ПсП Зег ддд С1у дда С1у ддс С1у 10 ППд Ьеи дПа Уа1 сад С1п ссП Рго ддд С1у 15 ддд С1у 48
Псс сПд ада сПс Псс ПдП дса дсс дсП дда ППс асс ППс адП адс ПаП 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
адс аПд аас Пдд дПс сдс сад дсП сса ддд аад ддд сПд дад Пдд дПП 144
Зег МеП Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Пса Пас аПП адП адП сдП адП ааа асс аПа Пас Пас дса дас ПсП дПд 192
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Ьуз ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад Ьуз 65 ддс С1у сда Агд ППс РЬе асс ТЬг аПс 11е 70 Псс Зег ада Агд дас Азр ааП Азп дсс А1а 75 адд Агд аас Азп Пса Зег сПд Ьеи ПаП Туг 80 240
сПд саа аПд аас адс сПд ада дас дад дас асд дсП дПд ПаП Пас ПдП 288
Ьеи С1п МеП Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
- 51 026153
дед А1а ада Агд даЕ Азр Еас Туг 100 ддЕ С1у ддЕ С1у саа С1п ссс Рго ссЕ Рго 105 Еас Туг Еас Туг Еас Туг Еас Туг Еас Туг 110 ддЕ С1у аЕд МеЕ 336
дас дЕс Едд ддс саа ддд асс асд дЕс асс дЕс Есс Еса 375
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 36 <211> 375 <212> ΌΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<221> СЫЗ <222> (1)..(375) <400> 36
дад С1и 1 дЕд Уа1 сад С1п сЕд Ьеи дЕд Уа1 5 сад С1п ЕсЕ Зег ддд С1у дда С1у ддс С1у 10 ЕЕд Ьеи дЕа Уа1 сад С1п ссЕ Рго ддд С1у 15 ддд С1у 48
Есс сЕд ада сЕс Есс ЕдЕ дса дсс дсЕ дда ЕЕс асс ЕЕс адЕ адс ЕаЕ 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг
20 25 30
адс аЕд аас Едд дЕс сдс сад дсЕ сса ддд аад ддд сЕд дад Едд дЕЕ 144
Зег МеЕ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Еса Еас аЕЕ адЕ адЕ ада адЕ ада асс аЕа Еас Еас дса дас ЕсЕ дЕд 192
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сда ЕЕс асс аЕс Есс ада дас ааЕ дсс аад аас Еса сЕд ЕаЕ 240
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
сЕд саа аЕд аас адс сЕд ада дас дад дас асд дсЕ дЕд ЕаЕ Еас ЕдЕ 288
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дсд ада даЕ Еас ддЕ ддЕ саа ссс ссЕ Еас сас Еас Еас Еас ддЕ аЕд 336
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг НЬз Туг Туг Туг С1у МеЕ
100 105 110
дас дЕс Едд ддс саа ддд асс асд дЕс асс дЕс Есс Еса 375
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 37
<211> 321
<212> Е^А
<213> Ното зартепз
<220>
<221> СЫЗ
<222> (1). · (321)
<400> 37
- 52 026153
дсс А1а 1 а5с 11е сдд Агд а5д Ме5 асс ТНг 5 сад С1п 5с5 Зег сса Рго 5сс Зег 5са Зег 10 с5д Ьеи 5с5 Зег дса А1а 5с5 Зег д5а Уа1 15 дда С1у 48
дас ада д5с асс а5с ас5 5д5 сдд дсд ад5 сад дд5 а55 адс адс 5дд 96
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
55а дсс 5дд 5а5 сад сад ааа сса дад ааа дсс сс5 аад 5сс с5д а5с 144
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
5а5 дс5 дса 5сс ад5 55д саа ад5 ддд д5с сса 5са адд 55с адс ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у
50 55 60
ад5 дда 5с5 ддд аса да5 55с ас5 с5с асс а5с адс адс с5д сад сс5 240
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа да5 555 д5а ас5 5а5 5ас 5дс саа сад 5а5 аа5 ад5 5ас сс5 сдд 288
С1и Азр РНе Уа1 ТНг Туг Туг Суз С1п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд 55с ддс саа ддд асс аад д5д даа а5с ааа 321
ТНг РНе С1у 61п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105 <210> 38 <211> 321 <212> ΌΝΑ <213> Ното зариепз <220>
<221> СЫЗ <222> (1)..(321) <400> 38
даа С1и 1 а55 11е д5д Уа1 с5с Ьеи асс ТНг 5 сад С1п 5с5 Зег сса Рго 5сс Зег 5са Зег 10 с5д Ьеи 5с5 Зег дса А1а 5с5 Зег д5а Уа1 15 дда С1у 48
дас ада д5с асс а5с ас5 5д5 сдд дсд ад5 сад дд5 а55 адс адс 5дд 96
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
55а дсс 5дд 5а5 сад сад ааа сса дад ааа дсс сс5 аад 5сс с5д а5с 144
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
5а5 дс5 дса 5сс ад5 55д саа ад5 ддд д5с сса сса адд 55с адс ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Рго Агд РНе Зег С1у
50 55 60
ад5 дда 5с5 ддд аса да5 55с ас5 с5с асс а5с адс адс с5д сад сс5 240
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа да5 555 дса ас5 5а5 5ас 5дс саа сад 5а5 аа5 ад5 5ас сс5 сдд 288
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
90 95
- 53 026153
асд ННс ддс саа ддд асс аад дНд даа аНс ааа 321
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 39
<211> 321
<212> ЫЫА
<213> Ното зарЬепз
<220>
<221> СЫЗ
<222> (1).. (321)
<400> 39
дНс аНс Ндд дНд асс сад НсН сса Нсс Нса сНд НсН дса НсН дНа дда 48
Уа1 11е Тгр Уа1 ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас ада дНс асс аНс асН НдН сдд асд адН сад ддН аНН адс адс Ндд 96
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд ТНг Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
ННа дсс Ндд НаН сад сад ааа сса дад ааа дсс ссН дад сНс сНд аНс 144
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
НаН дсН дса Нсс адН ННд саа адН ддд дНс сса Нса адд ННс адс ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у
50 55 60
адН дда НсН ддд аса даН ННс асН сНс асс аНс адс адс сНд сад ссН 240
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даН ННН дса асН НаН Нас Ндс саа сад НаН ааН адН Нас ссН сдд 288
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд ННс ддс саа ддд асс аад дНд даа аНс ааа 321
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 40 <211> 321 <212> ЫЫА
<213> Ното зарЬепз
<220> <221> СЫЗ <222> (1).. (321)
<400> 40 даа аНН дНд сНс асс сад НсН сса Нсс Нса сНд НсН дса НсН дНа ддд 48
С1и 11е Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас ада дНс асс аНс асН НдН сдд дсд адН сад ддН аНН адс аас Ндд 96
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Азп Тгр
20 25 30
ННа дсс Ндд НаН сад сад ааа сса дад ааа дсс ссН аад Нсс сНд аНс 144
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
40 45
- 54 026153
ЬаЬ дсЬ дса Ьсс адЬ ЬЬд саа адЬ ддд дЬс сса Ьса адд ЬЬс адс ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
адЬ дда ЬсЬ ддд аса даЬ ЬЬс асЬ сЬс асс аЬс адс адс сЬд сад ссЬ 240
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даЬ ЬЬЬ дсд асЬ ЬаЬ Ьас Ьдс саа сад ЬаЬ ааЬ адЬ Ьас ссЬ сдд 288
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд ЬЬс ддс саа ддд асс аад дЬд даа аЬс ааа 321
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 41
<211> 125
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 41
61и Уа1 61п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеЬ
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 42
<211> 125
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 42
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
40 45
- 55 026153
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеС
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 43
<211> 125
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 43
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Ьуз ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Агд Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеС
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 44
<211> 125
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 44
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
- 56 026153
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп
65 70
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр
85 90
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг
100 105
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг
115 120
<210> 45
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 45
Азр 11е С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег
1 5 10
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег
20 25
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз
35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1
50 55
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг
65 70
С1и Азр РНе Уа1 ТНг Туг Туг Суз С1п С1п
85 90
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 46
Азр 11е С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег
1 5 10
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег
20 25
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз
35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1
50 55
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг
65 70
А1а
ТНг
Нтз
Уа1
Ьеи
С1п
А1а
Рго
11е
Туг
Ьуз
Ьуз
А1а
Туг
Зег
Зег
С1у
Рго
Зег
Зег
Азп
Азп
Уа1
Туг
Зег
125
А1а
11е
Ьуз
Агд
Зег
Зег
Зег Ьеи Туг 80
Туг Туг Суз 95
Туг С1у МеН 110
Зег Уа1 С1у 15
Зег Зег Тгр 30
Зег Ьеи 11е
РНе Зег С1у
Ьеи С1п Рго 80
Туг Рго Агд 95
Ьеи
С1п
А1а
Рго
11е
Зег
С1у
Рго
Рго
Зег
А1а
11е
Ьуз
Агд
Зег
Зег Уа1 С1у 15
Зег Зег Тгр 30
Зег Ьеи 11е
РНе Зег С1у
Ьеи С1п Рго 80
- 57 026153
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното ; зартепз
<400> 47
Азр 11е С1п МеЬ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд ТЬг Зег 61п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 48
Азр 11е С1п МеЬ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Азп Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
- 58 026153 <210> 49 <211> 98 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 49
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеН Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Зег Зег Зег ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд
<210> 50
<211> 95
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 50
Азр 11е С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго
85 90 95
<210> 51
<211> 352
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 51
МеН '.Ьи С1у 11е Зег 11е Туг ТНг Зег Азр Азп Туг ТНг С1и С1и МеН
1 5 10 15
- 59 026153
С1у Зег С1у Азр 20 Туг Азр Зег МеЕ Ьуз 25 С1и Рго Суз РНе Агд 30 С1и С1и
Азп А1а Азп РНе Азп Ьуз 11е РНе Ьеи Рго ТНг 11е Туг Зег 11е 11е
35 40 45
РНе Ьеи ТНг С1у 11е Уа1 С1у Азп С1у Ьеи Уа1 11е Ьеи Уа1 МеЕ С1у
50 55 60
Туг С1п Ьуз Ьуз Ьеи Агд Зег МеЕ ТНг Азр Ьуз Туг Агд Ьеи Нтз Ьеи
65 70 75 80
Зег Уа1 А1а Азр Ьеи Ьеи РНе Уа1 11е ТНг Ьеи Рго РНе Тгр А1а Уа1
85 90 95
Азр А1а Уа1 А1а Азп Тгр Туг РНе С1у Азп РНе Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1
100 105 110
Нтз Уа1 11е Туг ТНг Уа1 Азп Ьеи Туг Зег Зег Уа1 Ьеи 11е Ьеи А1а
115 120 125
РНе 11е Зег Ьеи Азр Агд Туг Ьеи А1а 11е Уа1 Нтз А1а ТНг Азп Зег
130 135 140
С1п Агд Рго Агд Ьуз Ьеи Ьеи А1а С1и Ьуз Уа1 Уа1 Туг Уа1 С1у Уа1
145 150 155 160
Тгр 11е Рго А1а Ьеи Ьеи Ьеи ТНг 11е Рго Азр РНе 11е РНе А1а Азп
165 170 175
Уа1 Зег С1и А1а Азр Азр Агд Туг 11е Суз Азр Агд РНе Туг Рго Азп
180 185 190
Азр Ьеи Тгр Уа1 Уа1 Уа1 РНе С1п РНе С1п Нтз 11е МеЕ Уа1 С1у Ьеи
195 200 205
11е Ьеи Рго С1у 11е Уа1 11е Ьеи Зег Суз Туг Суз 11е 11е 11е Зег
210 215 220
Ьуз Ьеи Зег Нтз Зег Ьуз С1у Нтз С1п Ьуз Агд Ьуз А1а Ьеи Ьуз ТНг
225 230 235 240
ТНг Уа1 11е Ьеи 11е Ьеи А1а РНе РНе А1а Суз Тгр Ьеи Рго Туг Туг
245 250 255
11е С1у 11е Зег 11е Азр Зег РНе 11е Ьеи Ьеи С1и 11е 11е Ьуз С1п
260 265 270
С1у Суз С1и РНе С1и Азп ТНг Уа1 Нтз Ьуз Тгр 11е Зег 11е ТНг С1и
275 280 285
А1а Ьеи А1а РНе РНе Нтз Суз Суз Ьеи Азп Рго 11е Ьеи Туг А1а РНе
290 295 300
Ьеи С1у А1а Ьуз РНе Ьуз ТНг Зег А1а С1п Нтз А1а Ьеи ТНг Зег Уа1
305 310 315 320
Зег Агд С1у Зег Зег Ьеи Ьуз 11е Ьеи Зег Ьуз С1у Ьуз Агд С1у С1у
325 330 335
Нтз Зег Зег Уа1 Зег ТНг С1и Зег С1и Зег Зег Зег РНе Нтз Зег Зег
340 345 350

Claims (24)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения субъекта, страдающего множественной миеломой, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента, которые специфически связывают рецептор СХСК4, экспрессирующийся на поверхности клетки множественной миеломы.
  2. 2. Способ по п.1, в котором субъектом является человек и антитело или его фрагмент связывают рецептор СХСК4 человека.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором множественная миелома представляет собой рецидивирующую или резистентную множественную миелому.
  4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент вызывают апоптоз клеток множественной миеломы.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент ингибируют рост и/или пролиферацию клеток множественной миеломы.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент вводят субъекту в виде монотерапии.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-5, в котором антитело или его фрагмент вводят субъекту в комбинации с операцией облучением и/или с одним или более другими терапевтическими агентами.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-5, в котором антитело или его фрагмент ингибируют активность рецептора СХСК4 и повышают чувствительность клетки множественной миеломы к хемотерапевтическим агентам.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного хемотерапевтического агента в комбинации с антителом или его фрагментом.
  10. 10. Способ по п.9, в котором по меньшей мере один хемотерапевтический агент представляет собой:
    (а) леналидомид и/или дексаметазон и/или (б) бортезомиб и/или дексаметазон.
  11. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент представляют собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело или его фрагмент.
  12. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент включают домены СЭК1, СЭК2 и СЭК3 в вариабельной области тяжелой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 25, и домены СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 в вариабельной области легкой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 29.
  13. 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент включают СГОК1 вариабельной области тяжелой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 1, СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 5, СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 9, СГОК1 вариабельной области легкой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 13, СГОК2 вариабельной области легкой цепи, имеющей непрерывно соединенные аминокислоты, последовательность которых приведена в 8Е0 ГО N0: 17, СГОК3 вариабельной области легкой цепи, имеющей 8Е0 ГО N0: 21.
  14. 14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент представляют собой ВМ8-936564 или его СХСК4-связывающий фрагмент.
  15. 15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело или его фрагмент представляют собой антитело 1дС1 или 1дС4 или его фрагмент.
  16. 16. Способ по п.6, в котором антитело или его фрагмент вводят субъекту в дозе от примерно 0,1 до
    10 мг/кг веса тела.
  17. 17. Способ по п.16, в котором доза составляет от 0,3, 1,3 или 10 мг/кг веса тела.
  18. 18. Способ по п.10, в котором ВМ8-936564 или его фрагмент вводят субъекту в комбинации с леналидомидом и дексаметазоном в режиме дозирования, который включает:
    (a) введение ВМ8-936564 (1,3 или 10 мг/кг) в виде внутривенной инфузии на 1, 8, 15, 22, 29 и 36 дни (цикл 1) и на 1, 8, 15 и 22 дни (цикл 2 и последующие циклы);
    (b) введение леналидомида (25 мг) перорально в течение 21 дня (15-35 дни; цикл 1) и на 1-21 дни (цикл 2 и последующие циклы);
    (c) введение дексаметазона (40 мг) на 15, 22, 29 и 36 дни (цикл 1) и на 1, 8, 15 и 22 дни (цикл 2 и последующие циклы).
  19. 19. Способ по п.10, в котором ВМ8-936564 или его фрагмент вводят субъекту в комбинации с бортезомибом и дексаметазоном в режиме дозирования, который включает:
    (a) введение ВМ8-936564 (1, 3 или 10 мг/кг) в виде внутривенной инфузии на 1, 8, 15, 22 и 29 дни (цикл 1) и на 1, 8 и 15 дни (цикл 2 и последующие циклы);
    (b) введение бортезомиба (1,3 мг/м2) в виде внутривенных введений на 15, 18, 22 и 25 дни (цикл 1) и на 1, 4, 8, 11 дни (цикл 2 и последующие циклы);
    (c) введение дексаметазона (20 мг) на 15, 16, 18, 19, 22, 23, 25 и 26 дни (цикл 1) и на 1, 2, 4, 5, 8, 9,
    11 и 12 дни (цикл 2 и последующие циклы).
  20. 20. Набор, включающий анти-СХСК4 антитело или его СХСК4-связывающий фрагмент для применения в способе лечения множественной миеломы у субъекта, при этом набор дополнительно включает
    - 61 026153 инструкции для применения анти-СХСК4 антитела или его фрагмента в соответствии со способом по любому из предшествующих пунктов.
  21. 21. Набор по п.20, в котором анти-СХСК4 антитело или его фрагмент включает домены СЭК1. СГОК2 и СЭК3 в вариабельной области тяжелой цепи, имеющей 8ЕЦ ГО N0: 25, и домены СГОКЬ СГОК2 и СГОК3 в вариабельной области легкой цепи, имеющей 8ЕЦ ГО N0: 29.
  22. 22. Набор по п.20 или 21, в котором анти-СХСК4 антитело или его фрагмент представляет собой ВМ8-936564 или его фрагмент.
  23. 23. Набор по любому из пп.20-22, дополнительно включающий один или более дополнительных терапевтических реагентов.
  24. 24. Набор по любому из пп.20-22, дополнительно включающий один или более хемотерапевтических агентов.
EA201490957A 2011-11-09 2012-11-09 Лечение гематологических злокачественных заболеваний с помощью анти-cxcr4 антитела EA026153B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161557815P 2011-11-09 2011-11-09
US201161569113P 2011-12-09 2011-12-09
PCT/US2012/064395 WO2013071068A2 (en) 2011-11-09 2012-11-09 Treatment of hematologic malignancies with an anti-cxcr4 antibody

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490957A1 EA201490957A1 (ru) 2014-08-29
EA026153B1 true EA026153B1 (ru) 2017-03-31

Family

ID=47179025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490957A EA026153B1 (ru) 2011-11-09 2012-11-09 Лечение гематологических злокачественных заболеваний с помощью анти-cxcr4 антитела

Country Status (23)

Country Link
US (2) US10428151B2 (ru)
EP (1) EP2776032B1 (ru)
JP (1) JP6541350B2 (ru)
KR (1) KR102024957B1 (ru)
CN (1) CN104039320B (ru)
AU (1) AU2012335553B2 (ru)
BR (1) BR112014011144A2 (ru)
CA (1) CA2855155A1 (ru)
CY (1) CY1121331T1 (ru)
DK (1) DK2776032T3 (ru)
EA (1) EA026153B1 (ru)
ES (1) ES2705001T3 (ru)
HR (1) HRP20182183T1 (ru)
HU (1) HUE043001T2 (ru)
IL (1) IL232517B (ru)
LT (1) LT2776032T (ru)
MX (1) MX357100B (ru)
PL (1) PL2776032T3 (ru)
PT (1) PT2776032T (ru)
RS (1) RS58102B1 (ru)
SG (1) SG11201401386XA (ru)
SI (1) SI2776032T1 (ru)
WO (1) WO2013071068A2 (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8450464B2 (en) * 2006-10-02 2013-05-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies that bind CXCR4
EP2726634B1 (en) 2011-07-01 2017-02-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Discovery of a somatic mutation in myd88 gene in lymphoplasmacytic lymphoma
WO2015019284A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
AU2014318614B2 (en) 2013-09-12 2021-01-07 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Methods for evaluating and treating Waldenstrom's macroglobulinemia
JP6837837B2 (ja) * 2013-11-06 2021-03-03 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗ｃｘｃｒ４抗体によるｃ１０１３ｇ／ｃｘｃｒ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療
US10612095B2 (en) 2013-12-06 2020-04-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to distinguish Waldenström's Macroglobulinemia from IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance
KR20240042192A (ko) 2013-12-17 2024-04-01 크링 바이오테라퓨틱스 비.브이. 골수 증식성 또는 림프 증식성 질환에 대응하는 수단 및 방법
WO2015118538A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti cd84 antibodies, compositions comprising same and uses thereof
EP3125919A4 (en) * 2014-02-19 2018-01-03 Microconstants China Inc. Chemokine receptor antagonist and its combinational therapy
CN107427574B (zh) * 2015-01-09 2022-02-08 阿达尔塔有限公司 Cxcr4结合分子
HUE050894T2 (hu) 2015-04-17 2021-01-28 Bristol Myers Squibb Co Kompozíciók, amelyek tartalmazzák ipilimumab és nivolumab kombinációját
WO2016201425A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer by combined blockade of the pd-1 and cxcr4 signaling pathways
JP2018521983A (ja) 2015-07-16 2018-08-09 バイオカイン セラピューティックス リミテッド がんを治療するための組成物および方法
CA2999756A1 (en) * 2015-09-24 2017-03-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for reducing metastases
AU2016352910A1 (en) * 2015-11-09 2018-05-31 The General Hospital Corporation D.B.A Massachusetts General Hospital Unit dose formulations for use as an anti-fugetactic agent
BR112018016924A2 (pt) * 2016-02-23 2019-01-02 Biokine Therapeutics Ltd método de seleção de regime de tratamento para indivíduo que tem leucemia mieloide aguda (lma), método de maximização de resposta ao tratamento de leucemia mieloide aguda (lma), método de tratamento de lma, antagonista de cxcr4 e agente quimioterápico no tratamento de lma
US10525060B2 (en) 2016-04-29 2020-01-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. HCK as a therapeutic target in MYD88 mutated diseases
MX2018013868A (es) 2016-05-20 2019-02-21 Biohaven Pharm Holding Co Ltd Uso de agentes de modulacion de glutamato con inmunoterapias para tratar cancer.
WO2017216368A1 (en) * 2016-06-16 2017-12-21 Centre National De La Recherche Scientifique Compounds useful for decreasing interferon level
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
JP2020508697A (ja) * 2017-01-31 2020-03-26 エム・エス・エム・プロテイン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 抗ｃｘｃｒ４抗体
TWI693074B (zh) * 2017-02-21 2020-05-11 美商庫拉腫瘤技術股份有限公司 以法呢基轉移酶(farnesyltransferase)抑制劑治療癌症之方法
US20210101980A1 (en) 2017-03-31 2021-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
EP3694884A1 (en) 2017-10-15 2020-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
US20210162009A1 (en) * 2017-12-08 2021-06-03 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Chemokine variants as immune stimulants
CN112513079A (zh) * 2018-03-13 2021-03-16 拉巴斯大学医院生物医学研究基金会 用于癌症免疫疗法的联合激活和扩增的自然杀伤细胞的抗cxcr4抗体
PE20210665A1 (es) 2018-03-23 2021-03-31 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra mica y/o micb y sus usos
WO2019191133A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Real-time monitoring of protein concentration using ultraviolet signal
CN111971306A (zh) 2018-03-30 2020-11-20 百时美施贵宝公司 ***的方法
WO2020172658A1 (en) 2019-02-24 2020-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
CN114245869A (zh) 2019-05-23 2022-03-25 百时美施贵宝公司 监测细胞培养基的方法
US20230374064A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for concentrating proteins
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
WO2023173011A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Bristol-Myers Squibb Company Transient expression of therapeutic proteins

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008060367A2 (en) * 2006-10-02 2008-05-22 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
CA2117953C (en) 1993-10-14 2001-12-11 Tasuku Honjo Human stromal derived factor 1 alpha and 1 beta and dnas encoding the same
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
US7674618B2 (en) 2003-09-04 2010-03-09 Medarex, Inc. Expression vector
WO2006089141A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
US8569280B2 (en) * 2005-04-25 2013-10-29 Immune Disease Institute Methods for the treatment of multiple myeloma
ES2575518T3 (es) 2006-02-28 2016-06-29 Pharma Mar S.A. Tratamiento mejorado de mieloma múltiple
FR2915102B1 (fr) 2007-04-23 2014-05-16 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cxcr4 pour le traitement du cancer
MX2010012435A (es) 2008-05-14 2011-05-03 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-cxcr4.
EP2352764B1 (en) 2008-10-14 2018-03-28 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES TARGETING HUMAN CD4 and CXCR4, CCR5, TLR4, ALPHAV INTEGRIN, BETA3-INTEGRIN,BETA1-INTEGRIN, HUMAN ALPHA2-INTEGRIN, CD81, SR-BI, CLAUDIN-1, CLAUDIN-6 AND/OR CLAUDIN-9, RESPECTIVELY, AND NEUTRALIZING VIRAL ENTRY
JP5709766B2 (ja) * 2009-03-12 2015-04-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 造血器腫瘍の治療のためのホスホイノシチド３キナーゼ阻害剤化合物と化学療法剤の併用
TWI546537B (zh) * 2009-05-19 2016-08-21 維維亞生技公司 提供針對血液腫瘤之體外個人化藥物測試之方法
BR112013003823A2 (pt) 2010-08-20 2016-06-28 Cerulean Pharma Inc conjugados de peptídeo terapêutico-políemro, partículas, composições, e métodos relacionados

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008060367A2 (en) * 2006-10-02 2008-05-22 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATHIEU WEMEAU, SANDY BALKARAN, XAVIER LELEU: "Majoration de la sensibilité au bortézomib dans le myélome multiple en favorisant la migration des cellules tumorales dans le sang par un inhibiteur de CXCR4, l€AMD3100", HEMATOLOGIE, vol. 15, no. 3, 1 May 2009 (2009-05-01), pages 194 - 196, XP002690189, ISSN: 1264-7527, DOI: 10.1684/hma.2009.0358 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102024957B1 (ko) 2019-09-24
IL232517A0 (en) 2014-06-30
HUE043001T2 (hu) 2019-07-29
JP2014533279A (ja) 2014-12-11
MX357100B (es) 2018-06-26
AU2012335553A1 (en) 2014-07-03
SI2776032T1 (sl) 2018-12-31
EA201490957A1 (ru) 2014-08-29
DK2776032T3 (en) 2019-02-04
IL232517B (en) 2018-05-31
EP2776032B1 (en) 2018-10-17
CN104039320A (zh) 2014-09-10
AU2012335553B2 (en) 2017-09-21
CN104039320B (zh) 2019-10-15
SG11201401386XA (en) 2014-10-30
ES2705001T3 (es) 2019-03-21
PL2776032T3 (pl) 2019-03-29
PT2776032T (pt) 2019-01-21
WO2013071068A2 (en) 2013-05-16
WO2013071068A3 (en) 2013-07-18
JP6541350B2 (ja) 2019-07-10
HRP20182183T1 (hr) 2019-02-22
RS58102B1 (sr) 2019-02-28
US20140322208A1 (en) 2014-10-30
BR112014011144A2 (pt) 2017-05-16
EP2776032A2 (en) 2014-09-17
US20200231683A1 (en) 2020-07-23
US10428151B2 (en) 2019-10-01
KR20140093945A (ko) 2014-07-29
LT2776032T (lt) 2018-12-10
CY1121331T1 (el) 2020-05-29
CA2855155A1 (en) 2013-05-16
MX2014005267A (es) 2014-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026153B1 (ru) Лечение гематологических злокачественных заболеваний с помощью анти-cxcr4 антитела
US10316094B2 (en) Compositions and methods for inducing phagocytosis of MHC class I positive cells and countering anti-CD47/SIRPA resistance
US11459388B2 (en) Compositions and methods for inducing phagocytosis of MHC class I positive cells and countering anti-CD47/SIRPA resistance
JP5340935B2 (ja) 抗ｃｓ１抗体に基づく組合せ療法を用いて多発性骨髄腫を処置する方法
JP5756401B2 (ja) 免疫系を増強する為の組成物および方法
US11220548B2 (en) Treatment of C1013G/CXCR4-associated Waldenstrom&#39;s macroglobulinemia with an anti-CXCR4 antibody
US11230598B2 (en) Antibodies and methods for depleting regulatory bio cells and use in combination with immune checkpoint inhibitors
RU2404808C2 (ru) Антитела против рецептора ccr7 для лечения рака
CN108367073A (zh) 以双重靶向cd47和egfr来治疗癌症
JP2014040421A (ja) 多発性骨髄腫を処置するための抗ｃｓｉ抗体を用いる組成物および方法
US20220324965A1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US20170355768A1 (en) Combination of anti-cs1 and anti-pd1 antibodies to treat cancer (myeloma)
US20230092668A1 (en) Radioconjugates targeting cd33 in the treatment of cancers
CN109071661A (zh) 通过膜受体连接的抗病毒免疫疗法
EA035888B1 (ru) Режимы дозирования иммунотерапевтических средств и их комбинаций
Ingelshed et al. MDM2/MDMX inhibition by Sulanemadlin synergizes with anti–Programmed Death 1 Immunotherapy in wild-type p53 tumors
US20210340274A1 (en) Targeting CLPTMIL for Treatment and Prevention of Cancer
JP2022546686A (ja) 形質細胞に対する抑制剤または細胞傷害剤を使用する慢性疲労症候群の処置のための方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU