EA025859B1 - Конденсированное бициклическое 2,4-диаминопиримидиновое производное в качестве двойного alk и fak ингибитора - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I) или его солевой форме. Соединение формулы (I) обладает активностью, ингибирующей ALK и FAK, и их можно применять для лечения пролиферативных нарушений.

Description

Уровень техники

Киназа анапластической лимфомы (АЬК) представляет собой клеточную трансмембранную рецепторную тирозинкиназу, которая принадлежит к подсемейству инсулиновых рецепторов.

Преобладающая экспрессия АЬК осуществляется в мозге новорожденных, предполагая возможную роль АЬК в развитии мозга (Пиук!ет, 1. е! а1., Опсодепе, 2001, 20, 5623-5637).

АЬК также участвует в развитии определенных опухолей. Например, приблизительно 60% анапластических крупноклеточных лимфом (АЬСЬ) связаны с мутацией хромосомы, которая генерирует слитый белок, состоящий из нуклеофосмина (ΝΡΜ) и внутриклеточного домена АЬК (Аттйаде, ЬО. е! а1., Сапсег: Ргтар1е апй Ртасйсе оГ Опсо1оду, 6-е издание, 2001, 2256-2316; Ки!ок ЬЬ. & Ак!ег ЕС., 1. Сйп. Опсо1, 2002, 20, 3691-3702). Данный мутантный белок, ΝΡΜ-АЬК, содержит конститутивно активный тирозинкиназный домен, который является ответственным за его онкогенные свойства посредством активации нижележащих эффекторов (РаПпт, В. е! а1., В1оой, 1999, 94, 3509-3515; Мотк, 8.^. е! а1., Βτίΐ. 1. Наета!о1, 2001, 113, 275-295; Энук1ег е! а1.; Ки!ок & А^ег). Кроме того, трансформирующий гибридный ген ЕМЬ4-АЬК обнаружен у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (ЖСйС) (8ойа, М., е! а1., №!ите, 2007, 448, 561-566), и он представляет собой один из списка АЬК слитых белков, которые представляют собой перспективные мишени для терапии, ингибирующей АЬК. Экспериментальные данные показали, что нарушенная экспрессия конститутивно активной АЬК непосредственно участвует в патогенезе АЬСЬ и что ингибирование АЬК может заметно нарушать рост АЬК+ лимфомных клеток (КнеГег. Ми е! а1., В1оой, 1997, 90, 2901-2910; Вац К.У. е! а1., Мо1. Се11 Вю1, 1998, 18, 6951-6961; Вац К.У. е! а1., В1оой, 2000, 96, 4319-4327; Етдш, М. е! а1., Ехр. Нета!о1, 2001, 29, 1082-1090; 81ир1апек, А. е! а1., Сапсег Кек., 2001, 61, 2194-2199; Тийигго, Р. е! а1., С1ш. Сапсег Кек., 2002, 8, 240-245). Конститутивно активированная химерная АЬК также обнаружена при приблизительно 60% воспалительных миофибробластических опухолей (1МТ), медленно растущей саркомы, которая в основном поражает детей и молодых людей (Ьаотепсе, В. е! а1., Ат. 1. Ра!йо1, 2000, 157, 377-384; Эиук!ег е! а1.).

Кроме того, АЬК и ее предполагаемый лиганд, плеотрофин, сверхэкспрессируются в человеческих глиобластомах (8!оюа, О. е! а1., 1. Вю1. Сйет., 2001, 276, 16772-16779). В исследованиях на мышах обеднение АЬК замедляло рост глиобластомной опухоли и повышало выживаемость животных (Ро^етк, С. е! а1., 1. Вю1. Сйет., 2002, 277, 14153-14158; МепИет, К. е! а1., 1. №игосйет., 2002, 83, 747-753).

Ожидается, что ингибитор АЬК будет или обеспечивать долговременное излечение при комбинировании с современной химиотерапией для АЬСЬ, 1МТ, пролиферативных нарушений, глиобластомы и других возможных солидных опухолей, или, в качестве единственного терапевтического агента, его можно применять для поддержания предотвращения повторного проявления рака у пациентов. Сообщают о различных ингибиторах АЬК, таких как индазолоизохинолины (\УО 2005/009389), тиазоламиды и оксазоламиды (\УО 2005/097765), пирролопиримидины (\УО 2005080393) и пиримидиндиамины (\УО 2005/016894).

\УО 2008/051547 описывает конденсированные бициклические производные 2,4диаминопиримидина в качестве ингибиторов АЬК и с-Ме!. Лидирующее потенциальное лекарственное средство, описанное в '547 заявке, представляет собой СЕР-28122, эффективный ингибитор АЬК с пероральной активностью относительно 8ИР-М2 и Каграк-299 АЬК-зависимых опухолей в моделях мышиных ксенотрансплантатов. Испытания СЕР-28122, прошедшие до исследований, обеспечивающих заявку на регистрацию нового экспериментального лекарственного средства до его разработки, были прекращены из-за неожиданного возникновения тяжелой легочной токсичности у обезьян, обработанных СЕР28122.

Киназа фокальной адгезии (РАК) представляет собой эволюционно консервативную нерецепторную тирозинкиназу, расположенную у фокальных контактов, местах клеточного контакта с ЕСМ (внеклеточным матриксом), который функционирует в качестве важнейшего трансдуктора сигнала от интегриновых рецепторов и многочисленных рецепторных тирозинкиназ, включая ЕОР-К, НЕК2, 1ОР-К1, РЭОР-К и УЕОР-К2 и Т1Е-2 (Рагкопк, ЬТ.; 81аск-Эау1К, 1.; Тйдйтап, К.; Койейк, \У.О. Роса1 аййекюп 1йпаке: !атде!шд аййекюп ыдпайпд ра1й\уаук Гог 1йетареийс ш!етуеп!юп. Сйп. Сапсег Кек., 2008, 14, 627-632; Куи-Но Нап, Е.; МсОошда1, Т. Ко1е оГ Госа1 аййекюп Опаке ш йитап сапсег - а ро!епйа1 !агде! Гог йгид й1ксоуету. Апй-сапсет Адеп!к Мей. Сйет., 2007, 7, 681-684). РАК, активируемая интегрином, образует двойной комплекс с 8гс, который может фосфорилировать другие субстраты и запускать многочисленные сигнальные пути. Принимая во внимание центральную роль связывания и фосфорилирования РАК в регулировании передачи сигнала с помощью многочисленных 8Н2- и 8Н3-доменных белков, являющихся эффекторами (Мйта, 8.К.; Напкоп, Э.А.; 8сй1аерег, Ό.Ό. Роса1 аййекюп Опаке: ш соттапй апй сопДо1 оГ

- 1 025859 се11 тоЫйу. №!ите Кеу. Мо1. Се11 ΒίοΙ, 2005, 6, 56-68), активированная РАК играет центральную роль в регулировании клеточной адгезии, миграции, морфогенеза, пролиферации и выживаемости нормальных и злокачественных клеток (Мйта е! а1., 2005; МсЬеап, С.\У.; СаггадЬег, Ν.Ο.; Ау1//1епу1е. Е.; е! а1., Тйе го1е оГ Госа1 айЬекюп ктаке ίη сапсег - а пе\у !ЬегареиИс орройипИу. №!ите Ке\ае\ук Сапсег, 2005, 5, 505-515; и Куи-Но Нап апй МсОошда1, 2007). В опухолях активация РАК регулирует безъякорное клеточное выживание, один из признаков раковых клеток. Более того, сверхэкспрессия и активация РАК, повидимому, связана с повышенно инвазивным и метастатическим фенотипом и ангиогенезом опухоли при злокачественных новообразованиях (Отепк, Ь.У.; Хи, Ь.; Стауеп, К.Е; е! а1. Оует ехртеккюп оГ 1Ье Госа1 айЬекюп ктаке (р1 25 РАК) ш шуаыуе Ьитап (итоге. Сапсег Кек., 1995, 55, 2752-2755; ТтешЫау, Ь.; Наиск, Роса1 айЬекюп кгпаке (рр125РАК) ехртеккюп, асИуайоп апй аккоааОоп \уПЬ рахШш апй р50С8К ш Ьитап те!ак!аИс ргок!а!е сатсшота. 1п!. 1. Сапсег, 1996, 68, 164-171; КотпЬетд, 1.1. Роса1 айЬекюп ктаке ш ога1 сапсеге. Неай апй №ск, 1998, 20: 634-639; Мс С1еап е! а1., 2005; Куи-Но Нап апй МсОошда1, 2007) и коррелирует с плохим прогнозом и более коротким сроком жизни без метастазов.

Многочисленные предварительные исследования клинической эффективности, проведенные на различных солидных опухолях, применяя киРНК (На1йет, 1.; Ката!, А.А.; Ьапйеп, Ο.Ν.; е! а1. Роса1 айЬекюп ктаке !атде!тд икшд ш у1уо кЬог! ШетГетщд ΚΝΛ йеЬуету ш пеи!га1 Ьрокотек Ют оуапап сатсшота (Ьегару. СЬп. Сапсег Кек., 2006, 12, 4916-4924), доминантно-негативную РАК и низкомолекулярные ингибиторы РАК (На1йет, 1.; Ьш, Υ.Ο.; Мет!!, \У.М.; е! а1., ТЬетареиНс еГПсасу оГ а поуе1 Госа1 айЬекюп к1паке шЫЬЬот, ТАЕ226 ш оуапап сатсшота. Сапсег Кек., 2007, 67, 10976-10983; КоЬейк, \У.С.; Ипд, Е.; \УЬа1еп, Р.; е! а1. АпИ-Штот асйуйу апй рЬагтасо1оду оГ а ке1есйуе Госа1 айЬекюп кгпаке 1пЫЬЬот, РР562,271. Сапсег Кек., 2008, 68, 1935-1944; Вад1 С.М.; КоЬейк С.\У.; и Апйегкеп С.1. Ииа1 Госа1 айЬекюп кгпке/Рук2 1пЬ1ЬЬог Ьак рокЫуе еГГес!к оп Ьопе !итогк - 1трЬса!юпк Гог Ьопе те!ак!акек. Сапсег, 2008, 112, 2313-2321) обеспечили доклиническое подтверждение терапевтической применимости ингибирования РАК в качестве противоопухолевой/антиангиогенной стратегии, в частности для андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и плоскоклеточного рака органов головы и шеи. В преклинических моделях рака молочной железы человека (МОА-МВ-231) на безтимусных крысах, введение низкомолекулярного ингибитора РАК (РР-562271) ингибировало рост первичной опухоли и внутритибиальное распространение опухоли и восстанавливало потерю костной ткани, вызванную опухолью (Вад1 е! а1., 2008). КоЬейк е! а1. (2008) показали, что РР-562271 ингибировал метастазы в кости, предотвращал атрофию кости и улучшал остеогенез у пациентов с раком молочной железы или андрогеннезависимым раком простаты с и без метастазов в кости, обеспечивая дополнительный полезный результат ингибирования РАК при данных специфических злокачественных опухолях.

Таким образом, имеются убедительные генетические и биологические доказательства, которые связывают нарушенную активацию АЬК и конститутивную активацию РАК с возникновением и развитием определенных типов рака у людей. Большое число данных показывает, что АЬК- и РАК-положительные опухолевые клетки требуют данные онкогены для пролиферации и выживания, в случае РАК, для вторжения и метастазирования в отдаленных органах и тканях, в то время как ингибирование передачи сигнала и АЬК и РАК приводит к остановке роста опухоли и апоптозу, приводя в результате к объективным циторедуктивным эффектам.

Ингибирование РАК также приводит в результате к ослаблению подвижности, инвазивности и распространения метастазов опухоли, в частности при специфических типах рака, характеризующихся распространением метастазов в костях и остеолитическим заболеванием. Активация РАК защищает опухолевые клетки от апоптоза, вызванного химиотерапией, способствуя устойчивости опухоли; регулирование активности РАК (киРНК или фармакологически) усиливает эффективность химиотерапевтических агентов ш у1уо (например, доксорубицина, доцетаксела и гемцитабина), предполагая применимость для обоснованной комбинационной терапии при специфическим типах рака. АЬК и РАК минимально экспрессируются в большинстве нормальных тканей у здорового взрослого человека и активируются и/или дезрегулируются при специфических типах рака при онкогенезе и/или на ранних стадиях развития злокачественной опухоли.

Следовательно, целевые эффекты лечения двойным ингибитором АБК и РАК нормальных клеток должны быть минимальными, давая подходящий терапевтический индекс.

Существует необходимость в дополнительных безопасных и эффективных ингибиторах АЬК и/или РАК для лечения рака

- 2 025859

Сущность настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

или его солевой форме.

Соединение формулы (I) обладает АЬК и РАК ингибирующей активностью, и его можно применять в лечении нарушений и заболеваний, опосредованных АЬК- или РАК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение настоящего изобретения вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает схему способа получения СЕР-37440.

Фиг. 2 показывает порошковую рентгеновскую дифрактограмму кристаллической трибензолсульфонатной соли СЕР-37440.

Фиг. 3 показывает порошковую рентгеновскую дифрактограмму кристаллического дигидрата тригидрохлоридной соли СЕР-37440.

Фиг. 4 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 у мышей с опухолевым ксенотрансплантатом §ир-М2 АЕСЬ.

Фиг. 5 показывает вес тела мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат §ир-М2 АЕСЬ, которым вводили перорально СЕР-37440.

Фиг. 6 показывает концентрацию в плазме и опухоли СЕР-37440 у мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат §ир-М2 АЕСЬ, после перорального дозирования.

Фиг. 7 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 у мышей с опухолевым ксенотрансплантатом Кагра§-299.

Фиг. 8 показывает вес тела мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат Каграк-299, которым вводили перорально СЕР-37440.

Фиг. 9 показывает концентрацию в плазме и опухоли СЕР-37440 у мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат Каграк-299, после перорального дозирования.

Фиг. 10 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 у мышей с опухолевым ксенотрансплантатом ЫС1-Н2228 Ы§СЬ.

Фиг. 11 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 у мышей с опухолевым ксенотрансплантатом ЫС1-Н3122 Ы§СЬ.

Фиг. 12 показывает концентрацию в плазме и опухоли СЕР-37440 у мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат ЫС1-Н2228 Ы§СЬ, после перорального дозирования.

Фиг. 13 показывает концентрацию в плазме и опухоли СЕР-37440 у мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат ЫС1-Н3122 Νδί',Έ. после перорального дозирования.

Фиг. 14 показывает вес тела мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат ЫС1-Н2228 Νδί',Έ. которым вводили перорально СЕР-37440.

Фиг. 15 показывает вес тела мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат ЫС1-Н3122 Νδί',Έ. которым вводили перорально СЕР-37440.

Фиг. 16 показывает противоопухолевую активность и продолжительные регрессии опухоли перорального СЕР-37440 у мышей с опухолевым ксенотрансплантатом ЫС1-Н2228 Ы§СЬ.

Фиг. 17 показывает вес тела мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат ЫС1-Н2228 Νδί',Έ. которым вводили перорально СЕР-37440.

Фиг. 18 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 и РР-562271 у безтимусных мышей, содержащих опухолевый ксенотрансплантат простаты РС-3, с конститутивной активацией РАК.

Фиг. 19 показывает противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 и РР-562271 у безтимусных мышей, содержащих ксенотрансплантаты человеческой карциномы Ы§СЬ НСС-827 (ЕМЬ4-АЕК негативная).

Фиг. 20 показывает вес тела безтимусных мышей, содержащих ксенотрансплантаты человеческой карциномы ЖСБ НСС-827 (ЕМБ4-АБК негативная), которым вводили перорально СЕР-37440 или РР562271.

Фиг. 21 показывает фармакодинамическое ингибирование опухоли РАК и противоопухолевую активность перорального СЕР-37440 и РР-562271 у мышей §СГО, содержащих ксенотрансплантаты человеческой карциномы НЫ§СС ΌβΐΓοίΐ 562 (ЕМБ4-АБК негативная).

- 3 025859

Подробное описание настоящего изобретения

I. Определения.

Как применяют в настоящем изобретении, следующие термины имеют значения, приписанные им, если не указано иначе.

Фармацевтическая композиция относится к композиции, имеющей профиль безопасности/эффективности, пригодный для введения человеку.

Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество относится к физиологически переносимым материалам, которые обычно не вызывают аллергической или другой нежелательной реакции, такой как расстройство желудка, головокружение и подобных, при введении человеку.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, имеющей профиль безопасности/эффективности, пригодный для введения человеку.

Субъект относится к члену класса млекопитающие. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, людей, приматов, шимпанзе, грызунов, мышей, крыс, кроликов, лошадей, домашний скот, собак, кошек, овец и коров.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения, достаточному для ослабления или ингибирования ухудшения симптомов, связанных с нарушением или расстройством, вылечиваемым у конкретного субъекта или популяции субъектов. Ясно, что определение подходящих лекарственных форм, дозируемых количеств и путей введения находится в пределах возможностей специалиста в фармацевтической и медицинской области техники.

Лечение относится к неотложному или профилактическому ослаблению или облегчению по меньшей мере одного симптома или характеристики, связанной или вызванной нарушением, которое лечат. Например, лечение может включать ослабление симптома нарушения или полное устранение нарушения.

II. Соединение.

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

или его солевой форме. Соединение формулы (I) имеет химическое название 2-[[5-хлор-2-[[(6§)-6[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензо [7]аннулен-2-ил]амино] пиримидин-4-ил]амино]-Ы-метилбензамид и также известно как СЕР-37440. Авторы изобретения обнаружили, что соединение формулы (I) обладает удивительными и неожиданными свойствами по сравнению с СЕР-28122 и другими родственными соединениями.

Солевая форма соединения формулы (I) является предпочтительно фармацевтически приемлемой. Фармацевтически приемлемые солевые формы кислоты и соединения формулы (I) включают, но не ограничиваются перечисленными, соли, полученные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфорная и их смеси, а также соли, полученные из органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, алкандикарбоновые кислоты, ароматические кислоты и алифатические и ароматические сульфокислоты. Таким образом, данные соли кислоты включают, но не ограничиваются перечисленными, сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, нитрат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензолсульфонат, толуолсульфонат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартрат, метансульфонат и их смеси. В определенных вариантах осуществления, указанную соль кислоты выбирают из бензолсульфоната и хлорида. В определенных вариантах осуществления соль кислоты представляет собой хлорид. В определенных вариантах осуществления соль кислоты представляет собой трибензолсульфонат. В определенных вариантах осуществления трибензолсульфонатная соль характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей один или более пиков, выбранных из 7,62, 13,11, 13,76 и 14,05±0,2° 2Θ. В определенных вариантах осуществления трибензолсульфонатная соль характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей один или более пиков, выбранных из 6,85, 7,62, 8,01, 13,11, 13,76, 14,05 и 14,60±0,2° 2Θ. В определенных вариантах осуществления трибензолсульфонатная соль характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей один или более пиков, выбранных из 7,62, 13,11, 13,76, 14,05, 17,10, 17,86 и 18,10±0,2° 2Θ. В определенных вариантах осуществления соль кислоты представляет собой тригидрохлорид. В определенных вариантах осуществления соль кислоты представляет собой дигидрат тригидрохлорида. В определенных вариантах осуществления

- 4 025859 дигидрат тригидрохлоридной соли характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей один или более пиков, выбранных из 5,42, 8,86, 14,06, 17,52 и 18,51±0,2° 2Θ. В определенных вариантах осуществления дигидрат тригидрохлоридной соли характеризуется порошковой рентгеновской дифрактограммой, содержащей один или более пиков, выбранных из 5,42, 5,91, 8,86, 10,80, 11,79, 14,06, 14,72, 17,02, 17,52 и 18,51±0,2° 2Θ. В определенных вариантах осуществления соль кислоты представляет собой моногидрат тригидрохлорида.

Кислотно-аддитивные соли можно получить взаимодействием соединения формулы (I) с достаточным количеством требуемой кислоты, получая соль в общепринятом смысле. Свободное основание из соединения формулы (I) можно регенерировать контактом солевой формы с основанием и выделением свободного основания общепринятым способом.

Настоящее изобретение включает соединение формулы (I) и его солевые формы в любой физической форме, включая аморфные или кристаллические твердые состояния в любой полиморфной форме, с любой степенью чистоты. Кристаллические полиморфные формы включает несольватированные формы, а также сольватированные формы, такие как гидратные формы. Способы получения кристаллических и аморфных форм органических соединений, таких как соединение формулы (I), являются хорошо известными специалисту в данной области техники.

III. Фармацевтическая композиция.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение по настоящему изобретению (например, соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль), вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. Для получения фармацевтической композиции из соединения по настоящему изобретению, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут быть или твердыми или жидкими. Вспомогательное вещество может представлять собой одно или более веществ, которые могут служить в качестве, например, носителя, разбавителя, ароматизатора, связующего, консерванта, разрыхлителя для таблеток или инкапсулирующего материала. Фармацевтическая композиция может содержать два или более соединений по настоящему изобретению (например, две или более отличных солевых формы соединения формулы (I)).

Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой формы. В одном варианте осуществления композиция содержит количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, эффективное для лечения АЬК- или РАК-опосредованного нарушения или заболевания.

Предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению будет вызывать ослабление симптомов или признаков заболевания, связанных с АЬК- или РАК-опосредованным нарушением, как измерено количественно или качественно. Композиция может также содержать, в добавление к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой формы и фармацевтически приемлемому вспомогательному веществу, другое терапевтическое соединение, такое как соединение, пригодное для лечения рака.

Соединение по настоящему изобретению можно формулировать в виде фармацевтической композиции в любой форме, такой как сироп, эликсир, суспензия, порошок, гранула, таблетка, капсула, таблетка для рассасывания, пастилка, водный раствор, крем, мазь, лосьон, гель, эмульсия и т.д. Препараты в твердой форме включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы, крахмальные капсулы, суппозитории и диспергируемые гранулы.

Предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой таблетку или капсулу. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой таблетку. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой капсулу.

В порошках, вспомогательное вещество может представлять собой мелкодисперсное твердое вещество в смеси с мелкодисперсным активным компонентом. В таблетках, активный компонент можно смешивать со вспомогательным веществом, обладающим требуемыми связующими свойствами, в подходящих соотношениях и прессовать до требуемой формы и размера. Подходящие вспомогательные вещества включают карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, легкоплавкий воск, масло какао и т.п.

Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит от 1% до 95% (те/те) активного соединения. Более предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит от 5% до 70% (те/те) активного соединения.

Для получения суппозиторий низкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот или масло какао, можно плавить и гомогенно диспергировать в нем активный компонент, перемешиванием. Затем, расплавленную гомогенную смесь выливают в формы подходящего размера, охлаждают и, посредством этого, смесь затвердевает.

Препараты в жидком виде включают растворы, суспензии и эмульсии. Композиции, пригодные для парентерального введения, такого как, например, внутривенным, внутримышечным, внутрикожным и подкожным путем, включают водные и неводные, изотонические стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые

- 5 025859 делают композицию изотоничной крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты, агенты, улучшающие растворимость, загустители, стабилизаторы и консерванты. При практическом осуществлении настоящего изобретения композиции можно вводить, например, внутривенным вливанием, перорально, местно, внутрибрюшинно, интравезикально или интратекально. Композиции соединений могут быть предоставлены в герметичных контейнерах с одной или несколькими дозами, таких как ампулы и пробирки. Растворы и суспензии для инъекций можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток типа, описанного ранее.

Соединение по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, можно получить в виде аэрозольных композиций (т.е. их можно распылять), которые будут вводить ингаляцией. Аэрозольные композиции можно помещать в подходящий пропеллент под давлением, такой как дихлордифторметан, пропан, азот и подобные.

Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества определяются, в свою очередь, конкретной композицией, которую вводят, а также конкретным способом, применяемым для введения композиции. Соответственно, существует большое разнообразие подходящих составов фармацевтических композиций по настоящему изобретению (см., например, КетшдФп: ТЬе Зсьеисе апб РгасЬсе о£ РЬаттасу, 20ΐ1ι сТ. Оеииато е( а1., Εάδ., ЫрршсоЬ ХУПЬапъ апб 2000).

Количество активного компонента в фармацевтической композиции может изменяться или доводиться, например, до 1-1000 мг, 5-500 мг, 10-300 мг или 25-250 мг, в зависимости от конкретного применения.

Доза, вводимая субъекту, является предпочтительно достаточной для того, чтобы вызвать благотворный терапевтический ответ у субъекта с течением времени. Эффективная доза может изменяться от субъекта к субъекту, в зависимости от, например, заболевания субъекта, веса тела, площади поверхности и подверженности побочным эффектам. Введение можно осуществлять в виде одной или раздельных доз.

IV. Способ лечения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения АЬК- или РАКопосредованного нарушения или заболевания у субъекта, включающему: введение субъекту соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой формы. В другом аспекте, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой форме для применения в лечение АЬК- или РАК-опосредованного нарушения или заболевания у субъекта. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой форме для применения в получении лекарственного средства для лечения АЬК- или РАК-опосредованного нарушения или заболевания у субъекта.

Предпочтительно соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую солевую форму вводят субъекту в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Предпочтительно соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую солевую форму вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. В одном варианте осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой рак. В другом варианте осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из анапластической крупноклеточной лимфомы (АРСЬ), немелкоклеточного рака легкого (Νδί'ΡΤ')· нейробластомы, глиобластомы, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака (8СС) и рака молочной железы. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АРСЬ, ЕМР4-АРК-положительного ^СЬС, нейробластомы, глиобластомы, андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и плоскоклеточного рака головы и шеи (ΗΝδί'Τ.'). В определенных вариантах осуществления АЬК-или РАКопосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АРСЬ, ЕМЬ4-АЬКположительного ^СЬС, нейробластомы, андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и ΗΝδί'Ό В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АРСЬ, ЕМЬ4-АРК-положительного №СЬС, нейробластомы и глиобластомы. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАКопосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АРСЬ, ЕМЬ4-АЬКположительного Ы§СЬС и нейробластомы. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАКопосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ и ЕМЬ4-АЬКположительного Ы§СЬС. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и ΗΝδί'Ό В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой АЬК-опосредованное заболевание или нарушение. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой РАК-опосредованное заболевание или расстройство. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой миофибробластическую опухоль. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой миофибробластическую опухоль с ТРМ3-АРК или ТРМ4-АЬК

- 6 025859 онкогенами. В определенных вариантах осуществления ЛЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой миофибробластическую опухоль с ТРМ3-АЬК онкогенами. В определенных вариантах осуществления АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой миофибробластическую опухоль с ТРМ4-АЬК онкогенами.

АЬК- или РАК-опосредованное нарушение или заболевание можно лечить профилактически, остро или хронически, применяя соединения по настоящему изобретению в зависимости от природы нарушения или заболевания. Предпочтительно субъект в каждом из способов представляет собой человека.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пролиферативного нарушения у субъекта, включающему введение субъекту соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой формы. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой форме для применения в лечении пролиферативного нарушения у субъекта. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солевой форме для применения в получении лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения у субъекта. Предпочтительно соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую солевую форму вводят субъекту в фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Предпочтительно соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую солевую форму вводят субъекту в фармацевтически приемлемом количестве. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение является АЬК- или РАК-опосредованным. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение представляет собой рак. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из анапластической крупноклеточной лимфомы (АЬСЬ), немелкоклеточного рака легкого (Я§СЬС), нейробластомы, глиобластомы, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака (8СС) и рака молочной железы. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы§СЬС, нейробластомы, глиобластомы, андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы, и плоскоклеточного рака головы и шеи (НЫ§СС). В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы§СЬС, нейробластомы, андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и НЫ§СС. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы§СЬС, нейробластомы и глиобластомы. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬКположительного Ы§СЬС и нейробластомы. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ и ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы§СЬС. В определенных вариантах осуществления пролиферативное нарушение выбрано из андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и НЫ§СС.

Пролиферативное нарушение можно лечить профилактически, остро или хронически, применяя соединения по настоящему изобретению в зависимости от природы нарушения или заболевания. Предпочтительно субъект в каждом из способов представляет собой человека.

При терапевтических применениях соединения по настоящему изобретению можно получить и вводить в виде большого разнообразия пероральных и парентеральных лекарственных форм. Таким образом, соединения по настоящему изобретению можно вводить инъекцией, а именно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, интрадуоденально или внутрибрюшинно. В определенных вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению вводят внутривенно или подкожно. Кроме того, соединения, описанные в настоящем изобретении, можно вводить ингаляцией, например, интраназально. Кроме того, соединения по настоящему изобретению можно вводить трансдермально. В другом варианте осуществления соединения по настоящему изобретению доставляют перорально. Соединения можно также доставлять ректально, буккально или инсуффляцией.

Определение подходящей дозы для конкретной ситуации находится в пределах способностей специалиста. Обычно, лечение начинают с меньшими дозами, которые являются меньшими, чем оптимальная доза соединения. После этого, дозирование увеличивают небольшими повышениями до достижения оптимального эффекта в данных обстоятельствах. Для удобства, суммарную дневную дозу можно разделять и вводить порциями в течение дня, при необходимости. Стандартная доза составляет от приблизительно 1 мг до приблизительно 1000 мг в день, такую как от приблизительно 5 мг до приблизительно 500 мг в день. В определенных вариантах осуществления доза составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 300 мг в день, такую как от приблизительно 25 мг до приблизительно 250 мг в день.

V. Химия.

СЕР-28122

Амид (1§,2§,3К,4К)-3-[5-хлор-2-((§)-1-метокси-7-морфолин-4-ил-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-2-иламино)пиримидин-4-иламино]бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-карбоновой кислоты (СЕР28122) получают, как описано в примере 882 \УО 2008/051547 (АЬтеб е! а1.).

- 7 025859

СЕР-37440

Получение 2-(5-хлор-2-{(§)-6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро5Н-бензоциклогептен-2-иламино}пиримидин-4-иламино)-Н-метилбензамида можно осуществлять согласно фиг. 1, следуя способам, показанным на стадиях 1-8.

Стадия 1: 5-метокси-1-метилен-1,2,3,4-тетрагидронафталин.

К суспензии 5-метокси-3,4-дигидро-2Н-нафталин-1-она (25 г, 0,14 моль) и йодида метилтрифенилфосфония (1,13 экв.) в ТНР (250 мл) при комнатной температуре добавляли трет-бутоксид калия (1,6 экв.) при такой скорости, чтобы поддерживать температуру не выше чем теплая на ощупь. Реакционную смесь перемешивали в течение одного часа и концентрировали. Затем, реакционную смесь азеотропно упаривали с тремя объемами гексана для удаления избытка трет-бутанола. Добавляли свежий гексан и оставляли раствор стоять в течение ночи, осуществляя растирание. Красно-коричневый твердый остаток удаляли фильтрованием, фильтрат промывали водой и концентрировали. Очистка хроматографией на 18СО (330 г δίθ₂ картридж: пошагово гексан, затем ΌΟΜ) давала заявленное в заголовке соединение в виде бледно-желтого масла (24 г, 99%).

’Н-ЯМР (400 МГц, ССС1_;) 7,29 (д, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,15 (т, 1=8,0 Гц, 1Н), 6,76 (д, 1=8,0 Гц, 1Н), 5,49 (с, 1Н), 4,98 (с, 1Н), 3,85 (с, 3Н), 2,77 (т, 1=6,4 Гц, 2Н), 2,53-2,50 (м, 2Н), 1,93-1,87 (м, 2Н).

Стадия 2: 1-метокси-5,7,8,9-тетрагидробензоциклогептен-6-он.

5-Метокси-1-метилен-1,2,3,4-тетрагидронафталин (23,8 г, 0,137 моль) в 150 мл МеОН добавляли одной порцией к свежеполученному раствору тригидрата нитрата таллия(111) (1,0 экв.) в 300 мл МеОН. Перемешивали 1 мин и добавляли 400 мл хлороформа. Раствор фильтровали и органические вещества распределяли между дихлорметаном и водой. Органический слой сушили (М§§О₄) и концентрировали. Очистка хроматографией (18СО, 330 г картридж с силикагелем; пошаговое элюирование гексана (5 минт), затем 7-минутный градиент до 100% дихлорметана (20 мин)) давало заявленное в заголовке соединение в виде самого полярного из продуктов в виде бледно-желтого масла (26 г, 97%).

’Н-ЯМР (400 МГц, С1ХТ) 7,16 (т, 1=7,9 Гц, 1Н), 7,84 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 6,79 (д, 1=7,5 Гц, 1Н), 3,84 (с, 3Н), 3,73 (с, 2Н), 3,05-3,01 (м, 2Н), 2,55 (т, 1=7,0 Гц, 2Н), 2,01-1,96 (м, 2Н).

ЬС/М8 (Ε8Ι+) ш//=191 (М+Н)+.

Стадия 3: 1-метокси-2-нитро-5,7,8,9-тетрагидробензоциклогептен-6-он.

К нитрату калия в ацетонитриле (50 мл) и ангидриде трифторуксусной кислоты (100 мл) при 0°С добавляли по каплям 1-метокси-5,7,8,9-тетрагидробензоциклогептен-6-он (25 г, 0,131 моль) в 50 мл ацетонитрила. Реакцию перемешивали в течение 2,5 ч при нагревании до комнатной температуры. Реакционную смесь концентрировали без нагревания на роторном испарителе. Добавляли МеОН и недолго перемешивали. Повторно концентрировали и обрабатывали распределением между дихлорметаном и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяли и сушили (М§§О₄), концентрировали и очищали хроматографией 18СО (330 г картридж с силикагелем: градиентное элюирование - 10-50% ЕА:НЕХ в течение 60 мин), получая два изомера. Заявленное в заголовке соединение элюировалось последним (10,7 г, 34,6% выход).

’Н-ЯМР (400 МГц, ССС1_;) 7,70 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 7,06 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 3,92 (с, 3Н), 3,80 (с, 2Н), 3,13-3,09 (м, 2Н), 2,60 (т, 1=7,0 Гц, 2Н), 2,10-2,03 (м, 2Н).

Стадия 4: 2-[4-(1-метокси-2-нитро-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6-ил)пиперазин-1ил]этанол.

1- Метокси-2-нитро-5,7,8,9-тетрагидробензоциклогептен-6-он (15,09 г, 64,15 ммоль) в хлористом метилене (870 мл) обрабатывали 2-пиперазин-1-илэтанолом (3 экв.), с последующей обработкой уксусной кислотой (10 экв.). Смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч и охлаждали до 0°С, добавляли триацетоксиборгидрид натрия (4 экв.), затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали. После нескольких часов перемешивания исходное соединение все еще присутствовало. Добавляли дополнительные 0,4 экв. триацетоксиборгидрида натрия, затем снова через 6 ч. Перемешивали в течение ночи. Выливали в раствор насыщенного водного бикарбоната натрия и льда и делали основным до рН 10 1Ν гидроксидом натрия, экстрагировали 2х дихлорметаном, сушили М§§О₄, фильтровали и концентрировали. Данную смесь растворяли в этаноле и добавляли НС1/этанол. Полученный в результате осадок растирали в течение 2 ч, затем фильтровали. Твердый остаток переводили в свободное основание, применяя №ГОН. с последующей обработкой бикарбонатом натрия, и экстрагировали в дихлорметан, получая заявленное в заголовке соединение (19 г, 85% выход).

’Н-ЯМР (400 МГц, С1ХТ) 7,56 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 7,00 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 3,63-3,06 (м, 2Н), 3,29-3,24 (м, 1Н), 3,00-2,86 (м, 3Н), 2,72-2,67 (м, 2Н), 2,60-2,51 (м, 8Н), 2,46-2,37 (м, 2Н), 2,12-2,07 (м, 2Н) , 1,87-1,78 (м, 1Н), 1,37-1,29 (м, 1Н).

ЬС/М8 (Ε8Ι+) т/ζ 3 50 (М+Н)+.

Стадия 5: 2-[4-(2-амино-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6-ил)пиперазин-1ил]этанол.

2- [4-(1-Метокси-2-нитро-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6-ил)пиперазин-1-ил]этанол (19,0 г, 54,4 ммоль) разделяли на две партии и растворяли в суммарном количестве этанола (232 мл). 10% Рй/С (1,74 г, 1,64 ммоль) разделяли на две порции и реакционную смесь гидрировали в течение 3-4 ч при

- 8 025859 фунт/кв.дюйм. Каждую реакционную смесь фильтровали через целит, удаляя Р6. Фильтраты объединяли, затем концентрировали и заявленное в заголовке соединение выделяли в виде пенообразного твердого остатка (17,25 г, 99% выход).

Ή-ЯМР (400 МГц, СИС1₃) 6,76 (д, 1=7,9 Гц, 1Н), 6,53 (д, 1=7,9 Гц, 1Н), 3,72 (уш.с, 3Н), 3,71 (с, 3Н), 3,64 (т, 1=5,4 Гц, 2Н), 3,26-3,20 (м, 1Н), 2,84-2,72 (м, 5Н), 2,62-2,56 (м, 8Н), 2,42-2,35 (м, 2Н), 2,40-2,37 (м, 1Н), 1,81-1,74 (м, 1Н), 1,70 (уш.с,1Н), 1,41-1,33 (м, 1Н).

ЬС/М8 (Ε8Ι+) т// 320 (М+Н)+.

Стадия 6: 2-[4-((8)-2-амино-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6-ил)пиперазин-1ил]этанол.

г рацемического 2-[4-(2-амино-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6ил)пиперазин-1-ил]этанола разделяли, применяя 8РС (сверхкритический жидкий СО₂) хроматографию, применяя СЫга1се1 О1-Н (3x15 см) 808041 колонку с 15% метанолом (0,2% ИЕА)/СО₂, 100 бар градиент при скорости потока 80 мл/мин, контролируя при длине волны 220 нм с вводимым объемом: 0,5 мл, 20 мг/мл этанола. 16,9 г (Р)-энантиомера и 17 г заявленного в заголовке соединения выделяли с химической чистотой >99% и энантиомерным избытком (ее) >99% (измеренным, применяя СЫга1се1 О1-Н аналитическую колонку). ЯМР и масс были эквивалентными рацемическому соединению. Абсолютную конфигурацию первого элюирующегося изомера однозначно определяли как (Р)-конфигурацию низкомолекулярным рентгеновским анализом, применяя аномальную дисперсию бис-п-бромбензильного производного: 2-{4-[(Р)-2-(4-бромбензоиламино)-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6-ил]пиперазин-1-ил}этиловый эфир 4-бромбензойной кислоты. Таким образом, определяли, что второй элюирующийся энантиомер имел (8)-конфигурацию.

Стадия 7: 2-(2,5-дихлорпиримидин-4-иламино)-Ы-метилбензамид.

К 2-амино-Ы-метилбензамиду (24,4 г, 0,16 моль) в ИМР (0,5 л) добавляли 2,4,5-трихлорпиримидин (39 г, 1,3 экв.) и карбонат калия (1,3 экв.). Перемешивали в атмосфере аргона при 75°С в течение 5 ч и затем при комнатной температуре в течение ночи. Выливали в 1 л воды, осадок выделяли фильтрованием и промывали 1:1 ацетонитрил:вода, с последующей сушкой в потоке воздуха и в вакууме, получая заявленное в заголовке соединение в виде желтого твердого остатка (38 г, 78% выход).

Ή-ЯМР: 11,70 (с, 1Н), 8,74 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 7,59 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,53 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 7,16 (т, 1=8,4 Гц, 1Н), 6,28 (с, 1Н), 3,06 (д, 1=4,7 Гц, 3Н).

Стадия 8: 2-(5-хлор-2-{(8)-6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Нбензоциклогептен-2-иламино}пиримидин-4-иламино)-Ы-метилбензамид.

В герметичной пробирке 2-[4-((8)-2-амино-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-6ил)пиперазин-1-ил]этанол (2,69 г, 8,41 ммоль) и 2-(2,5-дихлорпиримидин-4-иламино)-Л-метилбензамид (2,00 г, 6,73 ммоль) смешивали в 1-метокси-2-пропаноле (120 мл, 1200 ммоль), с последующим добавлением метансульфокислоты (2,44 мл, 37,7 ммоль). Затем, реакционную смесь грели при 90°С в течение 18 ч. Реакционную смесь переносили в делительную воронку и разбавляли насыщенным бикарбонатом до образования белесоватого осадка. Его экстрагировали дихлорметаном 3х. Затем, органический слой промывали соляным раствором, сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Остаток сушили на насосе, затем хроматографировали на 18СО флэш-колонке. Его вводили в дихлорметане в колонку с нормальной фазой и элюировали градиентом 0-10% (дихлорметан: 10% ЫН₄ОН в МеОН). Требуемый продукт элюировался в районе 9-10%, 10% градиент выдерживали до полного элюирования продукта. Смешанные фракции концентрировали и хроматографировали СИбои обращено-фазовой ВЭЖХ, с градиентным элюированием 0-40% СН₃СЛ. Хроматографию повторяли, применяя силикагель с нормальной фазой и обращено-фазовую ВЭЖХ, осуществляя дополнительную очистку, при необходимости. После нейтрализации и концентрирования всего материала, твердый остаток получали растворением пены в Е1ОАс и концентрированием досуха несколько раз, получая заявленное в заголовке соединение (1,1 г, 28%).

Ή-ЯМР: 11,02 (с, 1Н), 8,69 (д, 1=8,9 Гц, 1Н), 8,13 (с, 1Н), 8,08 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7, 59-7, 50 (м, 2Н), 7,41 (с, 1Н), 7,13 (т, 1=7,4 Гц, 1Н), 6,91 (д, 1=8,1 Гц, 1Н), 6,21 (с, 1Н), 3,74 (м, 3Н), 3,66-3,63 (м, 2Н), 3,293,23 (м, 1Н), 3,06 (д, 1=4,3 Гц, 3Н), 2,92-2,72 (м, 5Н), 2,66-2,55 (м, 8Н), 2,48-2,39 (м, 2Н), 2,16-2,10 (м, 2Н), 1,87-1,77 (м, 1Н), 1,42-1,32 (м, 1Н).

ЬС/М8 (Ε8Ι+) т/ζ 580 (М+Н)+.

Аморфная НС1 соль СЕР-37440

Гидрохлорид 2-(5-хлор-2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Нбензоциклогептен-2-иламино}пиримидин-4-иламино)-Ы-метилбензамида.

2-(5-Хлор-2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Нбензоциклогептен-2-иламино}пиримидин-4-иламино)-Ы-метилбензамид (4,90 г, 8,45 ммоль) и 2,5 М НС1 в этаноле (13,5 мл, 33,8 ммоль) грели до его растворения в этаноле (164 мл). Реакционную смесь концентрировали два раза с этанолом, затем нагревали в небольшом количестве этанола до полного растворения. Данный раствор медленно охлаждали при перемешивании (<100 об/мин). Твердый остаток образовывался быстро перед охлаждением раствора. Данную смесь перемешивали до достижения температуры

- 9 025859 окружающей среды и затем фильтровали. Твердый остаток промывали этанолом, с последующей промывкой эфиром, затем непосредственно сушили на вакуумном насосе, получая гидрохлорид 2-(5-хлор-2{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5Н-бензоциклогептен-2-иламино}пиримидин-4-иламино)-Ы-метилбензамида (5,3 г, количественный выход).

Ή-ЯМР (МеОИ, 400 МГц) δ 8,55 (с, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 7,80 (д, 1=7,7 Гц, 1Н), 7,55 (т, 1=6,8 Гц, 1Н), 7,46 (уш.с, 1Н), 7,36 (т, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,23 (д, 1=8,5 Гц, 1Н), 4,00-3,95 (м, 4Н), 3,83-3,72 (м, 5Н), 3,73 (с, 3Н), 3,65-3,59 (м, 2Н), 3,47-3,38 (м, 5Н), 2,95 (с, 3Н), 2,72-2,65 (м, 1Н), 2,44-2,38 (м, 1Н), 2,29-2,28 (м, 1Н), 2,19-2,12 (м, 1Н), 1,59-1,49 (м, 1Н).

БС/М8 (ΕδΙ+) т/ζ 580 (М+Н)+.

Скрининг СЕР-37440 соли

Эксперименты по скринингу соли проводили (а) в метаноле, применяя 27 различных кислот (уксусная кислота, аскорбиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, лимонная кислота, И-глюкуроновая кислота, ИЬ-глютаминовая кислота, ИЬ-молочная кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, гликолевая кислота, гиппуровая кислота, бромисто-водородная кислота (48% водный раствор), хлористо-водородная кислота (2,5 М, этанол), Ь-аспарагиновая кислота, Ь-винная кислота, Ь-пироглутаминовая кислота, лактобионовая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, нафталин-2-сульфоновая кислота, ортофосфорная кислота, моногидрат птолуолсульфоновой кислоты, пропионовая кислота, янтарная кислота, серная кислота); (Ь) в дихлорметане и тетрагидрофуране, применяя 9 различных кислот (бензолсульфоновая кислота, этан-1,2дисульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бромисто-водородная кислота (48% водный раствор), нафталин-2-сульфоновая кислота, о-фосфорная кислота (85%), серная кислота, п-толуолсульфоновая кислота и хлористо-водородная кислота (этанол)); и (с) в хлороформе, ацетоне, этилацетате и 1пропаноле, применяя бензолсульфоновую кислоту, бромисто-водородную кислоту (48% р-р), офосфорную кислоту, серную кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту и хлористо-водородную кислоту (этанол)). Хотя многие из данных экспериментов давали солевые формы, только несколько из экспериментов давали в результате кристаллические соли, и только две солевые формы были кристаллическими, стабильными и воспроизводимыми: трибензолсульфонатная форма и дигидрат тригидрохлоридной формы. С фармацевтической точки зрения дигидрат тригидрохлорида является предпочтительным по сравнению с трибензолсульфонатом, поскольку НС1 представляет собой кислотно-аддитивную соль присоединения кислоты класса 1, которая обычно расценивается как безопасная (ОКА.8), тогда как бензолсульфонатная соль представляет собой кислотно-аддитивную соль класса 2, которая не является ОКА.8 (см. 81аЫ, Н.Р. & ХУегтШй. С.С., Εάίΐοτδ, 2002 НаийЬоок οί РЬагтасеийса1 заИз; РтореШез, 8е1есйоп. аий Изе. У\\ег1а§ НекейсаСЫтка Лс1а аий \УНеу-УС.’Н). В добавление к тому, что она является менее токсичной, НС1 имеет меньший молекулярный вес, чем бензолсульфоновая кислота, что дает большее соотношение ΑΡΙ/кислота и меньшую эффективную дозу.

Порошковые рентгеновские дифрактограммы регистрировали на дифрактометре РАИа1у1ка1 X Рей Рго, снабженном детектором Х'се1ета1от, применяя СиК_а излучение при 45 кВ и 40 мА. Κ_α1 излучение получали монохроматором падающих лучей с высокоориентированным кристаллом (Се111). 10 мм лучевой шаблон и фиксированные щели расходимости (1/4°) и антирассеивания (1/8°) устанавливали на стороне падающего луча. Фиксированную 5 мм приемную щель и щель Соллера 0,04 радиан устанавливали на стороне отраженного луча. Порошковую рентгенограмму получали от приблизительно 2 до 40° 2Θ с шагом 0,0080° и 96,06-секундным временем счета, которые давали в результате частоту развертки приблизительно 0,5°/мин. Образец распределяли на силиконовой пластинке с нулевым фоном (ΖΒΟ) для измерения. Образец вращали, применяя РАЯа1у1ка1 Р\У3064 Зршиет (15 об/мин). Измерение δί стандартного образца перед регистрацией данных приводило в результате к величинам для 2Θ и интенсивности, которые были в допустимых пределах 28,44<2Θ<28,50 и значительно большими, чем высота минимального пика 150 сП.

Трибензолсульфонат СЕР-37440

Свободное основание СЕР-37440 (500 мг, 0,862 ммоль) растворяли в 6 мл тетрагидрофурана перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 мин. Данный раствор добавляли один мл за один раз к бензолсульфоновой кислоте (545,6 мг, 3,45 ммоль) в стеклянном 20 мл сцинтилляционном флаконе (16x60 мм). Образец перешивали, применяя стержень магнитной мешалки в процессе добавления (при комнатной температуре). Обращали внимание на масло плюс твердое вещество после добавления всего раствора СЕР-37440. Образец перемешивали при 5-7°С в течение 19 ч на блоке НЕЬ Ро1уЬ1оск™. Твердый остаток отделяли фильтрованием с отсасыванием. Твердый остаток сушили при 50°С в вакууме в течение 5 ч, получая 835 мг (80% выход) слегка желтого твердого остатка. Чистота по ВЭЖХ, содержание и цвет соединения улучшали суспендированием 616 мг в 1,5 мл воды и перемешиванием полученной в результате суспензии в течение 30 мин при комнатной температуре. Твердый остаток выделяли фильтрованием с отсасыванием и твердый остаток на слое фильтра промывали 1 мл воды. Белый твердый остаток сушили при 50°С в вакууме в течение 68 ч, получая 406 мг (67% выход). Трибензолсульфонатная соль имеет растворимость в воде приблизительно 20-33 мг/мл. Характеристические данные рентгеност- 10 025859 руктурного анализа кристаллической трибензолсульфонатной соли показаны в табл. 1 и на фиг. 2.

Таблица 1

Большие относительные интенсивности с углами два тета и межатомные расстояния в ангстремах для порошковой рентгеновской дифрактограммы трибензолсульфонатной соли СЕР-37440

Νο.	Угол [26.]	Межатомное	Угол [26]	Межатомное
расстояние в ангстремах [А]	Относительная	расстояние в ангстремах [А]	Относительная интенсивность [%]
интенсивность ш	Но-
1	6, 85	12,897	8	11	15, 25	5, 805	б
2	7,62	11,593	100	12	15, 47	5, 724	5
3	8,01	11,031	9	13	15, 57	5, 686	8
4	10, 77	8, 209	6	14	15, 74	5, 625	6
5	12, 07	7, 324	5	15	16, 02	5, 528	2
6	13, 11	6, 747	20	16	16, 66	5, 317	3
7	13, 34	6, 630	5	17	17, 10	5, 181	40
8	13,76	6, 430	44	18	17, 59	5, 038	4
9	14, 05	6, 296	21	19	17, 86	4, 962	24
10	14, 60	6, 061	9	20	18, 10	4, 898	47

Наибольший пик (интенсивность 100%) отмечен выделенными буквами.

Дигидрат тригидрохлорида СЕР-37440

В 20-мл сцинтилляционный флакон, содержащий 200 мг свободного основания СЕР-37440, добавляли н-бутиловый спирт (5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 5 мин, свободное основание было в растворе. Затем, добавляли НС1 (2,5 М в ЕЮН, 0,435 мл, 3,15 экв.), получая в результате промежуточный осадок белого твердого вещества (аморфная соль НС1). Полученную в результате суспензию нагревали до 85°С в течение 20 мин (обратите внимание: при приблизительно 60°С в растворе не оставалось твердых веществ). Перемешивание раствора при 80-85°С приводило в результате к самообразованию зародышей кристаллов через 30 мин, что приводило в результате к последующему осаждению белого твердого вещества. После перемешивания реакции в течение в сумме 2 ч, полученную в результате суспензию охлаждали до 5°С в течение 1 ч. Суспензию перемешивали при 0-5°С в течение дополнительного часа, затем фильтровали, промывали минимальным количеством н-бутилового спирта. Затем, твердый остаток сушили при 55°С в течение ночи. При стоянии на воздухе при КН 30-70% получали 208 мг СЕР-37440-3НС1-2Н₂О.

Характеристические данные рентгеноструктурного анализа кристаллического дигидрата тригидрохлоридной соли показаны в таблице 2 и на фиг. 3. Соль является стабильной при 30-80% относительной влажности, но обратимо превращается в моногидратную тригидрохлоридную форму ниже 30% КН и необратимо превращается в сильно гидратированную аморфную форму при КН выше 80%.

Таблица 2

Большие относительные интенсивности с углами два тета и межатомные расстояния в ангстремах для порошковой рентгеновской дифрактограммы дигидрата тригидрохлоридной соли СЕР-37440

Νο.	Угол	[2θ·]	Межатомноерассто яние в ангстремах [А1	относительная интенсивность Ш	Νο.	Угол [2Θ]	Межатомноерассто яние в ангстремах [А]	относительная интенсивность [%]
1	5,	42	16,306	100	11	15, 70	5, 641	15
2	5,	91	14,940	39	12	17, 02	5,204	44
3	7,	02	12,575	8	13	17, 52	5, 059	83
4	8,	86	9, 967	77	14	17,76	4,990	14
5	10,	, 80	8, 184	46	15	18, 51	4,789	56
6	11.	, Об	7, 995	14	16	19, 13	4,635	3
7	11.	, 79	7, 498	33	17	20, 56	4,316	20
8	14.	, 06	6, 292	64	18	20, 79	4,269	17
9	14.	, 22	6, 223	26	19	21, 12	4,204	24
10	14.	, 72	6, 014	45	20	21, 66	4,099	17

Наибольший пик (интенсивность 100%) отмечен выделенными буквами. VI. Биология.

- 11 025859

13-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на крысах Спрага-Доули, включая 4-недельный период восстановления

Трем группам обработки 20 крыс/пол вводили СЕР-28122 при относительных уровнях дозы 30, 75 и 150 мг свободного основания/кг/день (вводили в виде монометансульфонатной, моно-НС1 солевой формы). Одна дополнительная группа из 20 животных/пол служила в качестве контроля и получала плацебо, дистиллированную воду. Лекарственное средство или плацебо вводили всем группам зондовым пероральным введением один раз в день в течение 91 последующих дней при объеме дозы 10 мл/кг/доза. После периода дозирования, пять животных/пол/группа оставляли на 4-недельный период восстановления. Кроме того, одна группа из трех животных/пол и три группы из девяти животных/пол/группа служили в качестве животных для токсикокинетического исследования (ТК) и им вводили плацебо или лекарственное средство аналогичным способом и при тех же уровнях доз, как в группах основного исследования.

Проводили наблюдения за клиническими проявлениями, смертностью, повреждениями и наличием пищи и воды по меньшей мере дважды в день для всех животных. Клинические наблюдения проводили на животных основных групп еженедельно. Измеряли и записывали вес тела для всех животных перед началом дозирования (неделя -1) и еженедельно в процессе исследования. Измеряли и записывали потребление пищи для животных основных групп еженедельно.

Офтальмоскопические эксперименты проводили на животных основных групп предварительно и перед некропсией после завершения введения и некропсией после восстановления. Образцы крови для оценки указанной клинической патологии собирали у животных основных групп в конце 4 недели и после некропсии после завершения введения и некропсии после восстановления. Образцы мочи для анализа мочи собирали у животных основных групп перед некропсией после завершения введения и некропсией после восстановления. Образцы крови для определения концентрации в плазме лекарственного средства собирали у указанных животных ТК в указанные моменты времени в 1 день, на 4 неделе и 13 неделе. После конечного сбора крови, животных ТК подвергали эвтаназии и тела выбрасывали. В конце фазы введения и фазы восстановления, проводили исследование после некропсии, записывали веса органов и выбранные ткани исследовали микроскопически.

13-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на макаках-крабоедах с 6-недельным периодом восстановления

СЕР-28122 растворы получали еженедельно растворением монометансульфонатной, моно-НС1 соли СЕР-28122 в стерильной воде для инъекций (δ^ΡΙ), получая требуемые концентрации доз.

Сорок не применяемых в экспериментах макак-крабоедов (20 мужских особей и 20 женских особей) в возрасте 2,5-4,4 лет для мужских особей и 2,5-4,0 лет для женских особей и весящих 2,1-3,3 кг для мужских особей и 2,0-3,1 кг для женских особей в начале (день -1) исследования приписывали к одной из трех групп дозирования и группе с контролем плацебо. Пять животных/пол приписывали к каждой группе дозирования и вводили ежедневно пероральные дозы 0 (плацебо), 20, 40 или 80 мг/кг в течение вплоть до 91 дней. Из-за возникновения конвульсий у нескольких животных, которым вводили 80 мг/кг/день в течение первых двух недель дозирования, большую дозу снижали до 60 мг/кг/день. Трех животных/пол/группа переводили на режим окончания обработки в конце периода дозирования (день 92), двух животных/пол/группа переводили на 6-недельную фазу восстановления без введения доз и прекращали на 134 день.

Животных оценивали на изменения клинических симптомов (наблюдения через стенку клетки и потребление пищи [дважды в день], и наблюдения после введения дозы [1-2 ч после введения дозы в каждый день дозирования]), веса тела (недели -2 и -1, и еженедельно после этого, начиная с 7 дня, и перед некропсией), по электрокардиограммам, офтальмическим экспериментам и измерениям кровяного давления (перед началом исследования и на 1, 4 и 13 неделе), эхокардиографическим измерениям (11 неделя), показателям клинической патологии, включая биохимический анализ крови, гематологию и коагуляцию (в пределах первой недели перед началом дозирования и вблизи конца 1, 4, 10 и 13 недели; и для оставшихся животных вблизи конца периода восстановления; и на тропонин I (перед исследованием; перед дозированием и через 2, 4, и 24 ч после введения дозы на 1, 4 и 13 неделе, и в один момент времени вблизи конца фазы восстановления). Получали образцы мочи для анализа мочи только проколом мочевого пузыря в процессе некропсии. Образцы мочи для анализа мочи и химического анализа мочи также получали дренажом из специальных суден из нержавеющей стали для клеток на -1, 1, 4 и 13 неделе, и у оставшихся животных вблизи конца периода восстановления.

Образцы крови собирали для токсикокинетического анализа в различные моменты времени в 1 день и в течение 4 и 13 недели. Двадцать одно животное (3/пол/группа 1, 2 мужские особи/3 женские особи/группа 2, 3 мужские особи/2 женские особи/группа 3 и 2 мужские особи/3 женские особи/группа 4) подвергали эвтаназии через один день после последней дозы. Оставшихся 14 животных (2/пол для каждой группы 1 и 2, 1 мужская особь/2 женские особи/группа 3 и 2 мужские особи/1 женская особь/группа 4) переводили на исследования без дополнительного дозирования и подвергали эвтаназии приблизительно через 6 недель после последней дозы. При окончании, проводили для всех животных полную некропсию, и ветеринар-патолог, сертифицированный американским колледжем ветеринарных патологов, собирал, консервировал, обрабатывал и исследовал микроскопически ткани.

- 12 025859

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на макаках-крабоедах с 4-недельным периодом восстановления

СЕР-28122 (монометансульфонатная, моно-НС1 соль) вводили зондовым пероральным введением группам макак-крабоедов (5/пол/группа) при уровнях доз 0 (контроль плацебо), 3, 10, 20 или 40 мг/кг/день. После 4-недельного периода обработки, для 3 животных/пол/группа прекращали обработку, и 2 животных/пол/группа переводили на 4-недельный период восстановления без обработки.

Следующие параметры и ожидаемые результаты оценивали в данном исследовании: клинические признаки (контроль смертности/состояния агонии, наблюдения через стенку клетки и потребление пищи и наблюдения после введения дозы), вес тела, ветеринарный осмотр, оценка легких, офтальмология, электрокардиография, измерение кровяного давления и частоты ударов сердца, параметры клинической патологии (гематология, коагуляция, клиническая биохимия, анализ мочи, химический состав мочи и анализ на тропонин I), токсикокинетические параметры, обобщенные данные некропсии, веса органов и гистопатологические исследования.

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-37440 на крысах Спрага-Доули с 4-недельным периодом восстановления

Мужские особи и женские особи крыс (15/пол/группа) приписывали к 4 группам обработки и группе с контролем плацебо (обратноосмотическая вода с регулированным рН), и СЕР-37440 вводили в виде дигидрата тригидрохлоридной соли, как указано в следующей таблице. Животным вводили дозы зондовым пероральным введением.

		№ животных	Уровень
Группа®	Подгруппа*3	мужская женская	дозы13'11
		особь особь	(мг/кг/день)

1	(Контроль)	1 (Токсичность)	15 3	15 3	0 0
2	(Токсикокинетика)
2	(Низкая)		1 (Токсичность)	15	15	1
		2	(Токсикокинетика)	9	9	1
3	(Средняя)		1 (Токсичность)	15	15	3
		2	(Токсикокинетика)	9	9	3
4	(Средняя-		1 (Токсичность)	15	15	10
	высокая)	2	(Токсикокинетика)	9	9	10
5	(Высокая)		1 (Токсичность)	15	15	30
		2	(Токсикокинетика)	9	9	30

^а Группе 1 вводили только контроль плацебо (КО вода с регулированным рН).

Животных в исследованиях токсичности, указанных для умерщвления через 24 ч после завершения исследования (вплоть до пяти животных/пол в группах 1, 2, 3, 4 и 5), подвергали 4 неделям восстановления после введения последней дозы.

^с Дозы выражены для свободного основания.

⁰ Объем дозы составлял 10 мл/кг.

Оценка токсичности основана на смертности, клинических наблюдениях, весе тела, изменениях веса тела, потреблении пищи, офтальмических исследованиях и клинической и анатомической патологии. Образцы крови собирали для токсикокинетической оценки.

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-37440 на макаках-крабоедах с 4-недельным периодом восстановления

Мужские особи и женские особи макак-крабоедов (Масаса ГазсюЫапз) приписывали к 4 группам (3 группы обработки и контрольная группа с введением плацебо), состоящим из 5 обезьян/пол/группа. Уровни доз, оцениваемые в данном исследовании, составляли 0 (обратноосмотическая вода с регулированным рН), 2,5, 7,5 и 20 мг/кг/день. Объем дозы составлял 5 мл/кг. СЕР-37440 вводили в виде дигидрата тригидрохлоридной соли. После завершения фазы дозирования, 3 обезьян/пол/группа подвергали эвтаназии, и 2 обезьян/пол/группа переводили на фазу восстановления без обработки на дополнительные 4 недели.

Исследования противоопухолевой активности - общий протокол

Мышей с опухолями случайным образом распределяли в различные группы обработки (8-10 мышей/группа) и вводили перорально или плацебо (РЕО-400) или испытуемое соединение, сформулированное в РЕО-400, при указанных дозах (выраженных в мг/кг эквивалентах свободного основания) и с указанной частотой дозирования (два раза в день или четыре раза в день), с объемом дозы 100 мл. Длину (Ь)

- 13 025859 и ширину (V) каждой опухоли измеряли штангенциркулем с нониусом, и вес тела мыши определяли каждые 2-3 дня. Затем, объемы опухолей рассчитывали по формуле

0,5236-Ь-ЖЬ+№)/2.

Статистический анализ объемов опухолей и веса тела мыши осуществляли, применяя ранговый критерий Манна-Уитни. Образцы плазмы и опухоли получали через 2 ч после конечной дозы при каждом уровне дозы, и концентрации соединения в лизатах плазмы и крови измеряли ЬСМ§/М§.

Противоопухолевая активность в ксенотрансплантатных моделях ΝΡΜ-АЬК положительной 8ир-М2 и Каграх-299 АЬСЬ опухоли на мышах

СЕР-37440 вводят перорально в РЕ0400 четыре раза в день или два раза в день мышам, содержащим ксенотрансплантат ΝΡΜ-АЬК положительной §ир-М2 ЛЕСЬ опухоли, в течение 12 дней. Также оценивали противоопухолевую активность СЕР-37440 (аморфная НС1 соль) во второй, более устойчивой ксенотрансплантатной модели ΝΡΜ-АЬК-положительной АЬСЬ (Кагра8-299) опухоли на §СГО мышах.

Противоопухолевая активность в ксенотрансплантатной модели ЕМЬ4-АЬК положительной (ΝΟ-Η2228 и ΝΟ-Η3122) ^СЬС опухоли на мышах при пероральном дозировании

Линии человеческих клеток рака легких, ΝΟ-Η2228 и Νί'Ί-Η1650 (АТСС, Маиа88а8, УЛ) и ΝΤΊН3122 (любезно предоставленных Иг. Οίοτ§ίο 1идЫгатц университет Турина, Италия), выращивали в КРМ1-1640 среде, снабженной 10% фетальной бычьей сывороткой (РВ§, Са!# 8Н3007003, Нус1опе, Ьодаи, ИТ). N0^2228 клетки содержали ЕМЬ4-АЬК вариант 3а/Ь, и Ж1-Н3122 клетки содержали ЕМЬ4-АЬК вариант 1, определенные флуоресцентной ίη 8йи гибридизацией и ПЦР с обратной транскрипцией, как сообщалось ранее (Кощииеи ТР., Мегте1 С., 2срш11а1ш К., Митрйу С., ЬЛ8И!8 Е., Но1те8 А.Т, е! а1., ЕМЬ4-АЬК йшюи деие аиб ейтсасу ой аи АЬК кша8е йййЬйог ίη 1иид саисег. С1ш Саисег Ке8 2008, 14:4275-8).

Генерацию женских особей §СГО мышей/мышей с врожденным отсутствием естественных клетоккиллеров (6-8 недель, Тасошс, Ниб8ои, ΝΥ) с ЕМЕ4-АЕК-положительными и ЕМЬ4-АЬКотрицательными ЖСЬС подкожными опухолевыми ксенотрансплантатами содержали 5/клетка в микроизоляторных блоках при стандартном лабораторном питании (Тек1аб ЬаЬсйоте, Наг1аи Тек1аб, Маб18ои, VI). Животных содержали в условиях с контролируемой влажностью и температурой, и цикл день/ночь устанавливали на 12-часовые интервалы. Мышей изолировали по меньшей мере за 1 неделю до экспериментальных манипуляций. Все исследования на животных проводили согласно протоколу (#03-023), одобренному комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (1АСИС) Сер1а1ои, 1ис. Вкратце, ЕМЕ4-АЬК-положительные и отрицательные ЖС'ЪС клетки собирали и суспендировали в КРМ1-1640 среде при плотности 5х10⁷/мл. Аликвоту (100 мкл) клеточной суспензии (5х 10⁶ клеток) вводили подкожно в левый бок каждой мыши 23 д иглой (2301, Са!# 305145, ВесЮи Июкт8ои, РгаикНи, Ν1). Мышей отслеживали до того, как объемы ксенотрансплантата опухоли не достигали 200500 мм³.

Мышей с опухолями распределяли случайным образом в различные группы обработки (8-10 мышей/группа) и вводили или плацебо (РЕ0-400) или СЕР-37440 аморфную НС1 соль, сформулированную в РЕ0-400, при указанных дозах, два раза в день, с 100 мкл объемом дозы. Длину (Ь) и ширину (V) каждой опухоли измеряли штангенциркулем с нониусом, и вес тела мышей определяли каждый второй - третий день. Объемы опухоли рассчитывали по формуле

0,5236·Ε·ν·(Ε+ν)/2.

Ингибирование в процентах роста опухоли (% Т01) рассчитывали следующим способом:

(объем опухоли контрольной группы в конце обработки - объем опухоли обрабатываемой группы в конце обработки)/объем опухоли контрольной группы в конце обработки.

Частичную регрессию опухоли (РК) определяли как объем опухоли обработанной группы в конце обработки, меньший, чем объем опухоли обработанной группы в начале обработки. Полную регрессию опухоли (СК) определяли как объем опухоли обработанной группы в конце обработки менее чем 5% объема опухоли обработанной группы в начале обработки. Статистический анализ объемов опухоли и веса тела мышей осуществляли ранговым критерием Манна-Уитни. Образцы плазмы и опухоли получали через 2 ч после последней дозы при каждом уровне дозы, и концентрации соединения в лизатах плазмы и опухоли измеряли ЬС-М§/М§.

Исследования противоопухолевой активности на ксенотрансплантате опухоли человеческого гормон-независимого рака предстательной железы, ^СЬ рака и Н^С рака

Линии клеток человеческого рака предстательной железы, θνΚ22 и РС3 и линию клеток человеческого плоскоклеточного рака головы и шеи Ие!то1! 562 получали у американской коллекции опухолевых клеточных культур (АТСС, Маиа88а8, УА). СVК22 клетки выращивали в КРМ1 (АТСС, Са! # 30-2001), снабженной 10% фетальной бычьей сывороткой (РВ§, Са!# 8Н3007003, Нус1оие ЬаЬота!огу 1ис, Ьодаи, ИТ), РС3 выращивали в Р12 среде (АТСС, Са!# 30-2004), снабженной 10% РВ§, и Иейой 562 выращивали в ЕМЕМ (АТСС, Са!# 30-2003), снабженной 10% РВ§. Линию клеток человеческого немелкоклеточного рака легкого НСС-827 и линию клеток человеческого рака молочной железы ВТ474 также получали у АТСС (Маиа88а8, УА) и выращивали в КРМ1 (Са!# 10-040, МеЙ1а!есй 1ис, Маиа88а8, УА) с 10% РВ§.

- 14 025859

Кроличьи фосфо-РАК(Туг397) (Са!# 3283) и РАК антитела (Са!# 3285) приобретали у Се11 §1дпа1шд Тесйио1оду (Веует1у, МА).

Генерацию 8СГО мышей/врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров или Νιι/Νιι женских особей 8СГО мышей/врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров (6-8 недель, Тасотс, Нибкоп, ΝΥ) или №/№ мышей (6-8 недель, Сйат1ек Ктует ЬаЬогаЮгу. ХУПпйпдЮп. МА) содержали 5/клетка в микроизоляторных блоках при стандартном лабораторном питании (Тек1аб ЬаЬсйоте, Наг1ап Тек1аб, Майкоп, XVI).

Животных содержали в условиях с контролируемой влажностью и температурой, и цикл день/ночь устанавливали на 12-часовые интервалы. Мышей изолировали по меньшей мере за 1 неделю до экспериментальных манипуляций. Все исследования на животных проводили согласно протоколу (#03-023), одобренному комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (1АСИС) Серйа1оп, 1пс. Вкратце, клетки собирали и суспендировали в КРМ1 среде при плотности 5х10⁷/мл, и аликвоту (100 мкл) клеточной суспензии (4х10⁶ или 5х10⁶ клетки) вводили подкожно в левый бок каждой мыши 23 д иглой (2301, Са1# 305145, ВесЮп Оюкшкоп, РтапкНп, N1). Затем, за мышами наблюдали ежедневно.

Мышей с опухолями распределяли случайным образом в различные группы обработки (8-10 мышей/группа) и вводили или плацебо (РЕ0-400) или СЕР-37440, сформулированную в РЕ0-400, при указанных дозах (выраженных в виде мг/кг эквивалентов свободного основания) с указанной частотой дозирования с 100 мкл объемом дозы. Длину (Ь) и ширину (V) каждой опухоли измеряли штангенциркулем с нониусом, и вес тела мышей определяли каждый второй - третий день. Объемы опухоли рассчитывали по формуле

0,5236·Ε·ν·(Ε+ν)/2.

Статистический анализ объемов опухоли и веса тела мыши осуществляли, применяя ранговый критерий Манна-Уитни. Образцы крови и опухоли получали через 2 ч после последней дозы при каждом уровне доз, и концентрации соединения в лизатах плазмы и опухоли измеряли ЬС-М8/М§. Т01 величины рассчитывали в конце исследования сравнением объемов опухоли (ТУ) каждой группы обработки СЕР37440 с объема опухоли группы, обработанной плацебо, по следующей формуле:

[1-(объем опухоли в последний день группы, обработанной соединением/объем опухоли группы, обработанной плацебо)]· 100.

VII. Результаты.

Биологические данные для СЕР-37440 и СЕР-28122 обобщены в табл. 3 и представлены и обсуждаются ниже.

Таблица 3

Сводка данных для СЕР-37440 и СЕР-28122

Активность	СЕР-37440	СЕР-28122
АЪК ферментативная 1С50 (НМ)	3, 5	3
АЪК клеточная 1С50 (нМ)	40	30
АЪК клеточная 1С50 у 75% плазмы мышей (нМ)	200	300
АЪК клеточная 1С50 в 75% плазмы человека (нМ)	120	300

- 15 025859

ГАК ферментативная 1С50 (нМ)	2,3	29, 5
ГАК клеточная Ю50 (нМ)	82	944
Ферментативная ΙΚ 1С50 (нМ)	бб	996
Отношение ферментативной ΙΚ/АЬК 1С50	19	332
Клеточная ΙΡ. 1С50 (нМ)	2000	>10,000
Отношение клеточной ΙΡ./ΑΑΚ 1С50	50	>333
Киназная селективность - 442 киназы (АшЬП К1ЫОМЕзсап ргоГШпд @ 1 мкМ)	5(80): 0,131; 3(90): 0,084; 5(99): 0,016	5(80); 0,172; 3(90); 0,125; 5(99); 0,016
Рецепторная селективность (Сегер) (Κί, мкМ)	Гистаминовый: Н2=5,2; Мускариновый: М1=2,46, М2=2,0, М3=3,5, М4=0,4б; Нейрокининовый: ЫК1=1,2; Серотониновый: 5-НТ1В=3,3; Транспортер допамина=2,1	Адренергический Я1в (К) , 2,2; Адренергический «ю (Н), 1,1
НЕКС рабсЬ. с1атр (1С50, МКМ)	>10	>10
Равновесная растворимость при рН 2/рН 7,4 (мг/мл)	>1/0,28	>3/0,013
сЬод И?.4	2,95	3, 9
ίη νίζηο метаболическая стабильность (6ι/2, мин)	>40 (Μ), >40 (К), 21 (МО), >40 (Н)	13.2 (Μ), 6,7 (К), 19,9 (ϋ), <5 (Мо), 10.3 (Н)

- 16 025859

Ингибирование цитохрома Р4 50 (1С5о, мкМ)	1А2; >30; 2С9; >30; 2С19: >20; 2Б6; >30; ЗА4; 5	1А2: >30; 2С9: 1,3; 2С19: 6,8; 2Б6: 17,3; ЗА4; 1,1
Индукция ΟΥΡ3Α4 ίη νίίΓΟ (кратный)	1, 5 при 10 мкМ	0, 95 при 0,3 мкМ; 1,3 при 3,0 мкМ; 2,0 при 10 мкМ
Сасо-2 Раррх1(У6 см/с (РБК)	1,26 (РБК: 4,7)	12,6 (ΡϋΚ: 3,6)
Связывание белка (В связанного)	85 (М) , 94 (Ц), 95 (Н)	95 (М) , 96 (Б) , 99,2 (Н)
Биодоступность у крыс	>42/	25%
Биодоступность у мышей	102/ (СР-1), 99/ (5С1ф	51% (СБ-1), 71% (ЗС1б)
Биодоступность у обезьян	50/ при 10 мг/кг, 74/ при 30 мг/кг	16% при 10 мг/кг, 37/ при 30 мг/кг

Метаболическая стабильность/связывание белка: (М) мышь, (К) крыса, (Мо) обезьяна, (Н) человек, (Ό) собака.

Эксперименты на биодоступность у мышей и обезьян для СЕР-37440 проводили с аморфной солью НС1 СЕР-37440.

Данные показывают, что и СЕР-37440 и СЕР-28122 являются эффективными ингибиторами АЬК. Однако СЕР-37440 является предпочтительным по сравнению с СЕР-28122 из-за того, что СЕР-37440 представляет собой гораздо более эффективный ингибитор РАК, ослабляет связывание белка и увеличивает активность в плазме человека, увеличивает собственную растворимость (облегчает поглощение), уменьшает липофильность (большая липофильность связана с повышенной токсичностью), увеличивает метаболическую стабильность (обеспечивает большую концентрацию в крови при меньших дозах, что снижает ксенобиотическую нагрузку на тело - меньшее воздействие лекарственного средства и метаболитов и меньшее давление на метаболическую систему, например, печень), снижает вероятность взаимодействия лекарственного средства с лекарственным средством благодаря ослабленному ингибированию Р450, в частности относительно СУР3А4 и СУР2С9 (ослабленное вмешательство в нормальный метаболизм и выведение совместно вводимых лекарственных средств), и обладает улучшенной пероральной биодоступностью и меньшей скоростью выведения ίη νίνο (большие концентрации в крови при меньших дозах). Выгодные свойства СЕР-37440 по сравнению с СЕР-28122 являются удивительными и неожиданными.

13-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на крысах Спрага-Доули, включая 4-недельный период восстановления

Смерти, связанные с введением лекарственного средства, и эффекты, связанные с лекарственным средством, на вес тела, потребление пищи или концентрации сердечного тропонина отсутствовали в процессе исследования. Эффекты, связанные с лекарственным средством, на гематологические параметры ограничивались минимальными, не неблагоприятными уменьшениями эритроцитов, гемоглобина и гематокрита у женских особей и минимальными, не неблагоприятными увеличениями тромбоцитов у обоих полов. Другие статистически значимые различия наблюдали и не считали важными из-за величины или изменения знака и/или отсутствия зависимости от дозы.

Тромбоциты оставались слегка повышенными у мужских особей и женских особей при 150 мг/кг/день при восстановлении. Возможные эффекты, связанные с лекарственным средством, на параметры коагуляции ограничивались продлением протромбинового времени (РТ) и частичного тромбопластинового времени (АРТТ) у мужских особей при введении 150 мг/кг/день и сокращением АР и АРТТ у женских особей при всех уровнях доз (величины для женских особей оставались в пределах ожидаемого диапазона). Отсутствовали значительные изменения, заметные в конце периода восстановления.

Изменения, связанные с лекарственным средством, параметров клинической биохимии ограничивались умеренными, но непостоянными увеличениями аланинаминотрансферазы (АТТ), суммарного билирубина, аспартатаминотрансферазы (А8Т), γ-глютамилтрансферазы (СОТ) и сорбитолдегидрогеназы (8ЭН) среди мужских особей, которым вводили >75 мг/кг/день. Данные эффекты были более четко выражены в конце 13-недельного периода дозирования, чем они были во время 4-недельного интервала сбора образцов и были главным образом связаны с эффектами у отдельного животного. А8Т и АТТ также повышались у женских особей, которым вводили 150 мг/кг/день, но данные эффекты были в общем

- 17 025859 гораздо меньшей величины, чем наблюдаемые у мужских особей. Примечательно, женские особи также имели статистически значимое, зависящее от дозы и постепенное увеличение холестерина при всех уровнях доз. В конце периода восстановления, А8Т. АЬТ и 8ΌΗ оставались повышенными у отдельных мужских особей, которым вводили 75 мг/кг/день в течение периода введения доз. А8Т, АЬТ и 8ΌΗ оставались умеренно повышенными у мужских особей, которым вводили 150 мг/кг/день в процессе дозирования и, с меньшей величиной, у женских особей, которым вводили 150 мг/кг/день в процессе дозирования.

Суммарный белок и глобулины увеличивались зависящим от дозы способом у мужских особей, которым вводили >75 мг/кг/день, и у женских особей, которым вводили >30 мг/кг/день. Альбумин также статистически увеличивался у женских особей, которым вводили >75 мг/кг/день, но величины оставались в пределах ожидаемых диапазонов. Статистические увеличения кальция считали вторичными по отношению к повышенному альбумину и суммарному белку. Другие случайные статистически значимые различия наблюдали при завершении введения и считали незначительными из-за величины или направления изменения, и/или отсутствия зависимости от дозы. Эффекты дозирования на суммарный белок, глобулин, альбумин или кальций в конце период восстановления отсутствовали.

Объемы мочи увеличивались, и относительная плотность снижалась у мужских особей и женских особей при 150 мг/кг/день при завершении введения. Другие заметные изменения не наблюдали в параметрах анализа мочи при завершении введения или восстановлении.

Увеличенные веса печени (относительно контроля) отмечали у женских особей, которым вводили >30 мг/кг/день, и у мужских особей, которым вводили >75 мг/кг/день (у мужских особей также снижался вес тимуса относительно контроля при 75 мг/кг/день). Увеличенные веса почек, селезенки и надпочечника отмечали у обоих полов при дозах >75 мг/кг/день. Вес сердца также умеренно увеличивался при дозах >75 мг/кг/день. Однако из-за того, что отсутствовали соответствующие данные микроскопического исследования для сердца, токсикологическая значимость этих данных неясна. Эффекты на почки, сердце и селезенку мужских особей сохранялись к концу четырехнедельного периода восстановления. Отсутствовали устойчивые эффекты, связанные с лекарственным средством, заметные у женских особей. В конце 13-недельного периода дозирования, появление коричневой или черной окраски почек наблюдали макроскопически у мужских особей, которым вводили 150 мг/кг/день, и у женских особей, которым вводили 75 мг/кг/день. Одна мужская особь, которой вводили 150 мг/кг/день, имела каверну/каверны на почках, которые коррелируют микроскопически с канальцевым пигментом в конце восстановления. В конце 13недельного периода дозирования, были заметны микроскопические изменения, связанные с лекарственным средством, почек, надпочечника, печени, легкого, бурой жировой ткани, брыжеечных лимфатических узлов, селезенки и щитовидной железы у животных, которым вводили >30 мг/кг/день. Данные для надпочечника, печени, легкого, бурой жировой ткани, брыжеечных лимфатических узлов, селезенки и щитовидной железы не считали неблагоприятными из-за низкой степени тяжести и существенного доказательства восстановления в течение 4-недельного периода восстановления. Прогрессирующую нейропатию, заметную в почках животных, которым вводили >75 мг/кг/день, считали неблагоприятной из-за высокого показателя распространения и постоянства в течение всего 4-недельного периода восстановления. Пигментация, вероятно из-за накопления лекарственного средства, также была заметна в нескольких тканях при восстановлении, но ее не считали неблагоприятной.

Минимальный - средний отек лентикулярных волокон, особенно в подкапсулярной центральной коре, был заметен у животных в фазе восстановления, которым вводили >75 мг/кг/день в процессе периода дозирования. Данные результаты соответствуют клинической катаракте у данных животных. Однако набухание волокон хрусталика может являться артефактом фиксации жидкостью Дэвидсона, являющимся результатом клеточного отека, связанного с уксусной кислотой. Отек волокон хрусталика в подкапсулярной корковой области отмечали у обработанных животных (включая животных, перечисленных выше, и других обработанных животных с отсутствием клинической катаракты) и, в меньшей степени, у некоторых контрольных животных в данном исследовании. Кроме того, отек волокон хрусталика в периферическом, переднем корковом образце отмечали у нескольких обработанных животных при 75 и 150 мг/кг/день, но не было соответствующих офтальмоскопических данных, данные считали артефактом, вторичным к фиксации жидкостью Дэвидсона. В силу описанных причин, отек волокон хрусталика, наблюдаемый в данном исследовании, считали артефактом и не записывали в качестве микроскопических данных. Однако нельзя полностью исключить возможность действительных предсмертных изменений, которые скрывались артефактами.

На основе результатов, приведенных выше, уровень отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (ЫОАЕЬ) для данного исследования считали равным 30 мг/кг/день, ограниченный неблагоприятными гистопатологическими эффектами на почки, которые сохраняются в течение всего 4-недельного периода восстановления при дозах >75 мг/кг/день.

- 18 025859

13-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на макаках-крабоедах с 6-недельным периодом восстановления

Введение СЕР-28122 ежедневным назогастральным зондовым введением в течение последующего 91 дня при уровнях доз 20, 40 и 80/60 мг/кг приводило в результате к нескольким неблагоприятным эффектам, связанным с лекарственным средством, при всех уровнях доз, включая клинические проявления и летальность у двух животных, которым вводили дозу 80/60 мг/кг и, вероятно, у еще двух животных (одного, которому вводили дозу 40 мг/кг, и другого, которому вводили дозу 20 мг/кг). Было еще одно животное, которое подвергалось ранней некропсии; однако, это не было связано с введением СЕР-28122. Введение 80 мг/кг приводило в результате к конвульсиям у 2 животных на 9 и/или 10 день и приводило к снижению уровня доз до 60 мг/кг для всех животных в данной группе. Отсутствовали изменения, связанные с СЕР-28122, потребления пищи, веса тела, офтальмических экспериментов, параметров коагуляции, параметров анализа мочи и частоты ударов сердца, и отсутствовали существенные изменения, связанные с СЕР-28122, кровяного давления или тропонина I.

Клиническую историю для животных, которые подергались ранней некропсии, можно, в общем, разделить на две категории: 1) животные, которые имели постепенное ухудшение состояния здоровья в течение нескольких дней/недель, и 2) животные, которые, по-видимому, были клинически толерантными к лекарственному средству до ближайшего времени после введения дозы в день ранней некропсия. Что касается животных первой категории, были клинические патологические изменения, указывающие на коагулопатию, ответ острой фазы, сильное обезвоживание и/или токсичность для печени, тогда как у животных во второй категории в основном отсутствовали клинические патологические изменения. Хотя была клиническая история быстрых клинических проявлений (в пределах 1-3 мин введения дозы) и летальности (в пределах 15 мин введения дозы) у животных 2 категории, указывающая на внедрение лекарственного средства или проникновение в легкие, введение дозы в легкие нельзя обнаружить на основе гистопатологии. Не могли определить причину быстрого возникновения клинических проявлений/летальности, но поглощение лекарственного средства из легких не может быть исключено.

У рано умерших животных данные гистопатологии, связанные с лекарственным средством, были получены для легкого, печени, селезенки, брыжеечных лимфатических узлов и почек. В легком, макроскопические и гистологические эффекты, соответствующие отеку легких, обнаруживали во всех группах дозирования, и они обычно соответствовали более тяжелому состоянию, чем эффекты, если они вообще были, для животных, которые доживали до 92 или 134 дня.

У выживших животных были клинические признаки, связанные с СЕР28122, присутствующие при всех уровнях доз (20, 40 и 80/60 мг/кг), и они включали: рвоту, снижение активности, сгорбленный вид и водянистые испражнения. В общем, данные клинические признаки не были зависящими от дозы (за исключением водянистых испражнений). Данные клинические признаки не обнаруживали в фазе восстановления данного исследования. Были повышенные аланинаминотрансфераза (АЬТ) и аспартатаминотрансфераза (ΑδΤ), связанные с СЕР-28122, у животных, которым вводили дозы 80/60 мг/кг, указывающие на влияние на печень; однако, данные величины возвращались к исходному значению к концу периода восстановления. Отсутствовали отличительные гистологические корреляты в печени.

Изменения, связанные с СЕР-28122, параметров гематологии ограничивались снижением лимфоцитов у животных, которым вводили дозы 80/60 мг/кг, которое начиналось на 28 день и сохранялось в течение всего оставшегося времени в фазе дозирования данного исследования. Число лимфоцитов возвращалось до исходной величины к концу периода восстановления.

На 92 день, гистопатологические эффекты, связанные с лекарственным средством, определяли для печени, селезенки, брыжеечных лимфатических узлов и почек. Гистологические эффекты, соответствующие отеку легких и большему хроническому повреждению легких, аналогичному повреждению, обнаруженному у рано умерших животных, наблюдали на 92 и 134 день, они были пропорциональными дозе и обычно меньшей распространенности и/или тяжести, чем у рано умерших животных. Пропорциональную дозе эозинофильную гранулярность в макрофагах в печени, селезенке и брыжеечных лимфатических узлах обнаруживали обычно у животных, которым вводили 40 и 80/60 мг/кг СЕР-28122, с включением минимальных изменений у одного животного, которому вводили 20 мг/кг СЕР-28122. Эффекты связаны с гепатоцеллюлярным одноклеточным некрозом в печени у одного животного, которому вводили большую дозу, но повышенная частота заболеваемости последнего на 134 день и ее связь с изменением эозинофильной гранулярности предполагало связь с введением лекарственного средства. Пропорциональный дозе коричневый гранулярный пигмент в канальцевом эпителии почек обнаруживали во все группах обработки лекарственным средством, он был минимальным - слабым, в противоположность минимальному - умеренному у рано умерших животных, и не был связан с дегенерацией/некрозом канальцевого эпителия.

На 92 день обнаруживали увеличение весов органов и/или соотношений весов органов, связанное с введением СЕР-28122, для печени, легких и почек мужских особей животных, которым вводили 40 и 80/60 мг/кг СЕР-28122 (печень и почки), и 20, 40 и 80/60 мг/кг СЕР-28122 (легкие). Данные увеличения были взаимосвязаны с эозинофильной гранулярностью в клетках Купфера и гепатоцитах в печени, отеком легких и накоплением коричневого пигмента в канальцевом эпителии почек.

- 19 025859

На 134 день обнаруживали гистологические эффекты, связанные с лекарственным средством, для легких, печени, селезенки, брыжеечных и подчелюстных лимфатических узлов и почек. Гистологические изменения, соответствующие отеку легких, были устойчивыми с аналогичной, но немного сниженной тяжестью во всех группах дозирования по сравнению с животными с некропсией после завершения введения, и были аналогично непропорциональными дозе. Минимальные изменения, соответствующие большему хроническому повреждению легких, присутствовали у одного животного, которому вводили большую дозу.

Эозинофильную гранулярность в макрофагах в печени, селезенке и брыжеечных и подчелюстных лимфатических узлах определяли обычно для животного (животных), которому вводили 40 и/или 80/60 мг/кг СЕР-28122, и она была пропорциональной дозе, где подвергалась воздействию более одной группы, за исключением селезенки. Данное изменение печени было обычно более тяжелым, чем изменение на 92 день. Что касается селезенки, было снижение тяжести по сравнению с 92 днем для группы с 80/60 мг/кг и изменяющаяся тяжесть в единичных случаях в группах с 20 и 40 мг/кг. Степень коричневой гранулярной пигментации в областях эозинофильной гранулярности в печени и селезенки была обычно повышенной для данных групп восстановления по сравнению с более ранними моментами времени. По сравнению с 92 днем, пропорциональный дозе коричневый гранулярный пигмент в клетках канальцевого эпителия почек был обычно устойчивым, но менее тяжелым у животных, которым вводили 40 мг/кг СЕР28122, и устойчивым и более тяжелым у животных, которым вводили 80/60 мг/кг СЕР-28122. Минимальную дегенерацию/некроз канальцевого эпителия обнаруживали у некоторых животных, которым вводили 80/60 мг/кг СЕР-28122, с самым серьезным накоплением пигмента.

На 134 день увеличения весов органов и/или соотношений весов органов, связанные с введением СЕР-28122, обнаруживали у женских особей для печени и почек, они были у животных, которым вводили 40 и/или 80/60 мг/кг СЕР-28122, и они аналогично коррелировали, как и у животных с некропсией после прекращения введения. Отек легких был значительной проблемой в данном исследовании. Во многих случаях появление отека легких было бессимптомным перед быстрым ухудшением и летальностью. Кроме того, не было различимого сердечнососудистого компонента для возникновения отека легких, посредством этого, классифицировали эффект как некардиогенный отек легких. Быстрое возникновение и отсутствие сердечнососудистого эффекта может сделать очень трудным диагностирование или предотвращение отека легких в клинических условиях, делая СЕР-28122 небезопасным для применения на людях.

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-28122 на макаках-крабоедах с 4-недельным периодом восстановления

Введение СЕР-28122 пероральным зондовым введением один раз в день в течение 4 недель при уровнях доз 3, 10, 20 и 40 мг/кг/день не приводило в результате к любым клиническим проявлениям или летальности. Отсутствовали эффекты, связанные с СЕР-28122, на потребление пищи, вес тела, легкие (аускультацией), глаза, электрокардиографию, кровяное давление, частоту ударов сердца, гематологию, коагуляцию, общий анализ мочи, химический анализ мочи, тропонин I или макропатологические показатели при любом оцениваемом уровне дозы.

Гистологические эффекты, связанные с СЕР-28122, возникали при уровнях доз >10 мг/кг/день. Данные состоят из минимального или слабого многоочагового увеличения количества вакуолизированных клеток в легком (предполагаемый альвеолярный эпителий) и минимальной пневмоцистной гиперплазии II типа (только при уровне дозы 20 мг/кг/день). Увеличенное количество вакуолизированных клеток коррелируют с повышенным весом легкого и отношениями весов легкого у животных при уровнях доз >10 мг/кг/день, но не коррелирует с любым клиническим проявлением или клиническими эффектами для легких аускультацией. После 4-недельного периода восстановления, повышенное количество вакуолизированных клеток в легком все еще присутствовало у животных при уровнях доз >20 мг/кг/день, хотя и с меньшей частотой заболеваемости и/или тяжестью. Полная нормализация данных эффектов действительно происходит при уровне дозы 10 мг/кг/день. Пневмоцистную гиперплазию II типа не обнаруживали у животных, которым вводили 20 мг/кг после 4-недельного периода восстановления, что также способствует минимальному суммарному снижению тяжести.

Возможные эффекты, связанные с СЕР-28122, включали тошноту после введения дозы у животных при уровнях доз 20 и 40 мг/кг и небольшое увеличение триглицеридов (только при уровне дозы 40 мг/кг). Данные эффекты не обнаруживали в процессе периода восстановления. Гистопатологические изменения в слоях сетчатки одной женской особи, которой вводили 10 мг/кг/день, на 29 день считали эффектом, неопределенно связанным с СЕР-28122. Отсутствовали корреляции в офтальмическом исследовании.

Данное 4-недельное исследование при меньших дозах показывает, что нельзя избежать токсичности СЕР-28122 для легких. Особенно интересным был тот факт, что повреждение легкого протекало без продромальных признаков (аускультация). На основе возникновения и стабильности токсичности для легких в 4- и 13 -недельных исследованиях на обезьянах, был сделан вывод, что СЕР-28122 является слишком опасным для применения на людях, и исследование прекращали.

- 20 025859

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-37440 на крысах Спрага-Доули с 4-недельным периодом восстановления

Не отмечали связанных с лекарственным средством клинических проявлений в течение фазы введения доз или восстановления. Клинические проявления, возникающие гораздо реже, были временными, со сравнимыми с контролем частотами заболеваемости, связанными с умирающими животными, связанными с известными ошибками зондового введения или возникали у животных, чью смерть или умерщвление не считали связанными с лекарственным средством; следовательно, клинические проявления не считали связанными с лекарственным средством.

Мужские особи и женские особи, которым вводили 30 мг/кг/день, набирали меньше веса, чем контрольные животные в течение всех интервалов фазы дозирования. В течение 1-28 дней фазы дозирования мужские особи набирали на 31% меньше, чем контрольные животные. В течение 1-28 дней фазы дозирования женские особи набирали на 65% меньше, чем контрольные животные. Мужские особи и женские особи, которым вводили 30 мг/кг/день, набирали такой же или больший вес, чем контрольные животные в течение всех интервалов фазы восстановления. В течение 1-28 дней фазы восстановления мужские особи набирали на 24% больше, чем контрольные животные. В течение 1-28 дней фазы восстановления женские особи набирали на 29% больше, чем контрольные животные. Мужские особи и женские особи, которым вводили 30 мг/кг/день, потребляли меньше пищи, чем контрольные животные в течение всех интервалов фазы дозирования. Данные различия в диапазоне на 4-10% меньше у мужских особей и на 1224% меньше у женских особей. Не отмечали эффектов, связанных с лекарственным средством, на потребление пищи в течение фазы восстановления. Пониженный средний вес тела после завершения обработки наблюдали при умерщвлении подопытного животного по завершении исследования у мужских особей и женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день (0,90х и 0,79х соответственно), и он был статистически значимым у женских особей.

Не отмечали офтальмических эффектов, связанных с лекарственным средством, в течение фазы дозирования или восстановления. Не наблюдали эффектов, связанных с лекарственным средством, в результатах исследований на клиническую патологию вплоть до 10 мг/кг/день. Несколько незначительных эффектов клинической патологии наблюдали при 30 мг/кг/день, которые имели минимальную - небольшую величину. Все данные считали неблагоприятными или токсикологически важными.

Данные гематологии и коагуляции при введении лекарственного средства при 30 мг/кг/день включали следующее данные:

слегка пониженная масса красных кровяных клеток (т.е. количество красных кровяных клеток, гемоглобина и гематокрита) у женских особей на 29 день фазы дозирования;

слегка пониженное абсолютное количество ретикулоцитов у мужских особей на 15 и 29 день фазы дозирования и у женских особей на 15 день фазы дозирования;

слегка пониженное абсолютное количество нейтрофилов у мужских особей на 15 и 29 день фазы дозирования;

слегка пониженное абсолютное количество эозинофилов у женских особей на 29 день фазы дозирования;

минимально повышенный фибриноген у мужских особей на 15 и 29 день фазы дозирования.

Влияние на количество тромбоцитов, по-видимому, отсутствовало. Снижение массы красных кровяных клеток, абсолютных количеств ретикулоцитов, нейтрофилов и эозинофилов могло отражать мягкое подавление деятельности костного мозга/токсичность, но соответствующих гистопатологических данных не наблюдали в костном мозге. Данные показывали обратимость в конце стадии восстановления. Больший средний объем эритроцита у женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день в конце фазы восстановления, был, вероятно, результатом большей доли более молодых красных кровяных клеток, которые обычно имеют больший размер.

Данные клинической биохимии, связанные с лекарственным средством, при 30 мг/кг/день включали следующие данные:

слегка пониженный альбумин у женских особей на 29 день фазы дозирования; минимально повышенный глобулин у женских особей на 15 и 29 день фазы дозирования; пониженное соотношение альбумин-глобулин у женских особей на 15 и 29 день фазы дозирования; минимально повышенный холестерин у мужских особей и женских особей на 15 и 29 день фазы дозирования;

слегка повышенная концентрация кальция в сыворотке у мужских особей на 29 день фазы дозирования;

минимально пониженный хлорид в сыворотке у мужских особей и женских особей на 29 день фазы дозирования.

Пониженные альбумин и отношение альбумина к глобулину и повышенный глобулин соответствуют воспалению и могут быть связаны с хроническим воспалением полости грудной клетки, наблюдаемым гистологически. Повышенный холестерин может быть связан с пониженным потреблением пищи и набором веса тела, наблюдаемыми у данных животных. Низкий хлорид в сыворотке, по-видимому, являются результатом усиленного выделения с мочой. Механизм для повышенного кальция является неиз- 21 025859 вестным. Не наблюдали влияние, связанное с лекарственным средством, на концентрацию тропонина Ι при любом уровне дозы. Все эффекты клинической биохимии показывали обратимость в конце фазы восстановления.

Данные химического анализа мочи, связанные с лекарственным средством, при 30 мг/кг/день включали следующие данные:

минимально повышенное выведение хлорида с мочой у мужских особей и женских особей на 15 и день фазы дозирования;

минимально повышенный фракционный клиренс с мочой хлорида у мужских особей и женских особей на 15 и 29 день фазы дозирования.

Низкий хлорид в сыворотке был, вероятно, связан с большим суммарным выведением и большим фракционным клиренсом хлорида в моче животных, которым вводили 30 мг/кг/день. Коррелирующие гистопатологические эффекты не наблюдали в почках данных животных. Все данные химического анализа мочи показывали обратимость в конце фазы восстановления. Не наблюдали явных эффектов в результатах общего анализа мочи при любом уровне доз.

Статистически значимые или иначе значительные отличия в других результатах исследований на клиническую патологию считали случайными, поскольку они обычно имели небольшую величину, не были связаны с дозой или были непостоянными с течением времени и между полами.

Семь незапланированных смертей произошли у животных с токсичностью в течение фазы дозирования. Ни одна из незапланированных смертей не имела отношения к лекарственному средству. Одна контрольная мужская особь и одна женская особь, которым вводили 30 мг/кг/день, умерли вскоре после отбора крови; их считали случайными смертями из-за отсутствия данных клинической или анатомической патологии, предполагающих эффект, связанный с лекарственным средством. Трое животных проявляли макроскопические и/или микроскопические эффекты, соответствующие повреждениям, связанным с зондовым введением, включая одну женскую особь, которой вводили 1 мг/кг/день, умерщвленную в состоянии агонии на 25 день, одну женскую особь, которой вводили 3 мг/кг/день, найденную мертвой на 9 день, и одну женскую особь, которой вводили 10 мг/кг/день, умерщвленную в состоянии агонии на 25 день фазы дозирования. Причина смерти не была ясна для одной мужской особи, которой вводили 30 мг/кг/день, найденной мертвой на 10 день, и одной женской особи, которой вводили 10 мг/кг/день, умерщвленной в состоянии агонии на 15 день фазы дозирования. Все другие животные с токсичностью в фазе дозирования и в фазе восстановления доживали до их запланированного умерщвления.

При умерщвлении подопытного животного по завершении исследования статистически значимое увеличение среднего веса органов (с учетом веса тела по завершении исследования) наблюдалось в печени мужских особей, которым вводили 30 мг/кг/день, и предстательной железе мужских особей, которым вводили 10 мг/кг/день. Поскольку данные изменения не имели микроскопических коррелятов, соответствия между полами (только для печени) и/или данных о дозозависимом эффекте, их не считали связанными с лекарственным средством. Скорректированный средний вес тимуса снижался более чем на 10% и зависящим от дозы способом у мужских особей, которым вводили 30 мг/кг/день (0,86х), и женских особей, которым вводили 10 мг/кг/день (0,85х) или 30 мг/кг/день (0,79х). Из-за отсутствия статистической значимости или микроскопических коррелятов, связь между снижением веса тимуса и лекарственным средством в данных группах является неопределенной. Все другие изменения весов органов при умерщвлении подопытного животного по завершении исследования и все изменения весов органов при умерщвлении после восстановления, были, вероятно, результатом нормальной биологической изменчивости, и их не считали прямым эффектом лекарственного средства.

Макроскопические показания рубцов на сердце и рубцов или разрастаний в легких наблюдали при умерщвлении подопытного животного по завершении исследования у женских особей, которым вводили мг/кг/день, и рубцы на сердце наблюдали при умерщвлении после восстановления у одной женской особи, которой вводили 30 мг/кг/день. Настоящие макроскопические показания коррелировали с микроскопическими показаниями фиброза и/или хронического воспаления в сердце и легких, и их считали связанными с лекарственным средством. Все другие макроскопические показания считали спонтанными, случайными или связанными со случайной смертью, и их не приписывали лекарственному средству.

При умерщвлении подопытного животного по завершении исследования микроскопические показания, соответствующие хроническому воспалению полости грудной клетки, получали для серозной поверхности сердца и легких и в околотимусной соединительной ткани женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день. Хроническое воспаление и/или фиброз серозной/эпикардиальной поверхности сердца и плевральной/субплевральной поверхности легких наблюдали у 5/10 женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день. Показания были многоочаговыми - диффузными вдоль серозной поверхности сердца и легких и изменялись в зависимости от фиброзного утолщения от нескольких воспалительных клеток до более тяжелого хронического воспаления. Хроническое - хроническое активное воспаление также наблюдали в свободной волокнисто-сосудистой соединительной ткани, окружающей тимус, у 4/10 женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день. При умерщвлении после восстановления, хроническое воспаление и/или фиброз серозной поверхности сердца или легких наблюдали у 2/5 женских особей, которым

- 22 025859 вводили 30 мг/кг/день. Результаты при умерщвлении после восстановления характеризовались многоочаговым - диффузным фиброзным утолщением серозных поверхностей с небольшим воспалением, предполагая частичное рассасывание.

Поскольку показания хронического воспаления в полости грудной клетки наблюдали при запланированном умерщвлении в сумме у 7/15 женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день, и поскольку макроскопические или микроскопические показания по другой причине для данных эффектов отсутствовали, фиброз и/или воспаление на серозных поверхностях сердца или легких и в околотимусной фиброзно-жировой ткани женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день, считали наиболее вероятно связанными с лекарственным средством, и они могли быть результатом серозного воспаления, вторичного к плевральному и перикардиальному экссудату.

Небольшое увеличение количества альвеолярных макрофагов в легких наблюдали при умерщвлении подопытных животных по завершении исследования у женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день, и считали, что оно, наиболее вероятно, связано с лекарственным средством. Повышенное количество альвеолярных макрофагов не наблюдали при умерщвлении после восстановления, предполагая, что настоящие эффекты являются обратимыми. Все другие микроскопические эффекты при запланированном и незапланированном умерщвлении считали спонтанными, случайными или связанными со случайной смертью и не приписывали лекарственному средству.

В предварительно проведенном 10-дневном исследовании по определению диапазона доз СЕР37440, ежедневное введение лекарственного средства зондовым введением при 10, 30 или 60 мг/кг/день крысам было хорошо переносимым при 10 мг/кг/день. Неблагоприятные эффекты, связанные с лекарственным средством, на вес тела в комбинации с данными анатомической патологии костного мозга (бедность ткани клетками); селезенку, тимус и лимфатическую железу (пониженные лимфоциты); и легкие (повышенные альвеолярные макрофаги) наблюдали у животных, которым вводили >30 мг/кг/день. Изменения, связанные с лекарственным средством, не наблюдали у животных, которым вводили 10 мг/кг/день. В настоящем исследовании, неблагоприятные и связанные с лекарственным средством эффекты наблюдали у мужских особей и женские особи, которым вводили 30 мг/кг/день. Данные эффекты включали ослабленный набор веса тела у мужских особей и женских особей, меньшее потребление пищи у мужских особей и женских особей, и микроскопические показания у женских особей соответствуют хроническому воспалению полости грудной клетки.

Не наблюдали эффекты, связанные с лекарственным средством, в исследовании на клиническую патологию вплоть до 10 мг/кг/день. Несколько незначительных эффектов клинической патологии наблюдали при 30 мг/кг/день, которые были минимальными - небольшими по величине. Не один из данных эффектов не считали неблагоприятным, токсикологически важным или определенно коррелирующим с другими неблагоприятными прижизненными эффектами или показаниями анатомической патологии.

Снижение массы красных кровяных клеток, абсолютного количества ретикулоцитов, нейтрофилов и эозинофилов могло отражать мягкое подавление деятельности костного мозга/токсичность, но соответствующие гистопатологические показания не были обнаружены в костном мозге. Эффекты проявляли обратимость в конце фазы восстановления. Больший средний объем эритроцитов в конце фазы восстановления у женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день, был, вероятно, результатом большей доли более молодых красных клеток, которые обычно имеют больший размер.

Пониженный альбумин и отношение альбумина к глобулину и повышенный глобулин соответствовали воспалению, и они могли быть связаны с хроническим воспалением полости грудной клетки, наблюдаемым гистологически. Повышенный холестерин мог быть связан с пониженным потреблением пищи и набором веса тела, наблюдаемыми у данных животных. Пониженный хлорид в сыворотке, был, вероятно, результатом повышенного выведения с мочой. Механизм для повышенного кальция является неизвестным. Не наблюдали эффекта, связанного с лекарственным средством, на концентрацию тропонина I при любом уровне доз. Все показания клинической биохимии показывали обратимость в конце фазы восстановления.

Пониженный хлорид в сыворотке, был, вероятно, связан с повышенной общей секрецией и большим фракционным клиренсом хлорида с мочой животных, которым вводили 30 мг/кг/день. Соответствующие гистопатологические эффекты не наблюдали в почках данных животных, и все данные химического анализа мочи показывали обратимость в конце фазы восстановления.

В заключении, пероральное введение СЕР-37440 крысам при дозах <10 мг/кг/день в течение 28 дней были клинически хорошо переносимыми. Микроскопические эффекты, соответствующие хроническому воспалению полости грудной клетки, присутствовали у женских особей, которым вводили 30 мг/кг/день.

Снижение изменений веса тела и потребления пищи присутствовали у мужских особей и женские особи, которым вводили 30 мг/кг/день. На основе настоящих данных, максимальная доза препарата, не приводящая к развитию наблюдаемых нежелательных эффектов (МОЛЕЬ), в данном исследовании составляла 10 мг/кг/день.

4-недельная пероральная токсичность и токсикокинетическое исследование СЕР-37440

- 23 025859 на макаках-крабоедах с 4-недельным периодом восстановления

Все животные доживали до их запланированного умерщвления.

Не отмечали клинических эффектов, связанных с лекарственным средством, в течение фазы дозирования или восстановления. Клинические эффекты возникали довольно редко, были временными или были со сравнимой частотой случаев как для контроля; следовательно, их не считали связанными с лекарственным средством.

Отсутствовали эффекты, связанные с лекарственным средством, на вес тела или набор веса тела, отмеченные в течение фазы дозирования или восстановления. Отсутствовали данные об замеченных офтальмических нарушениях, связанных с лекарственным средством. Кроме того, отсутствовали эффекты, связанные с лекарственным средством, отмеченные в процессе измерения кровяного давления.

Не наблюдали изменений, связанных с лекарственным средством, интервала РК, длительности 0К5>, интервала βΧ скорректированного интервала ОТ (ОТс), интервала КК или частоты ударов сердца на 3 и 27 день фазы дозирования или 28 день фазы восстановления у животных, которым вводили 2,5, 7,5 или 20,0 мг СЕР-37440/кг веса тела/день (мг/кг/день). Нарушения ритма или качественные изменения ЕСО, которые можно приписать СЕР-37440, не наблюдали в процессе качественной оценки ЕСО.

СЕР-37440 введение вплоть до 20,0 мг/кг/день не оказывало влияния на результаты исследования на клиническую патологию в конце фазы введения дозы или фазы восстановления.

Несколько отдельных животных имели показатели клинической патологии, соответствующие воспалению (включая слабое заметное увеличение красных клеток крови и абсолютного количества нейтрофилов, фибриногена и С-реактивного белка) в течение фазы дозирования, но данные животные были обычно разбросаны по всем группам, включая контрольную группу. В этой связи, данные показания считали несвязанными с лекарственным средством, поскольку они не были зависящими от дозы, часто были изменчивыми со временем (особенно количество лейкоцитов), и принадлежали некоторым контрольным животным.

Отсутствовали статистически значимые изменения весов тела или веса органов при умерщвлении подопытного животного по завершении исследования. Все изменения весов органов, имеющиеся при запланированном умерщвлении после фазы введения или фазы восстановления, приписывали нормальной биологической изменчивости, и считали несвязанными с лекарственным средством.

Отсутствовали явные макроскопические показания, связанные с лекарственным средством, при умерщвлении после фазы введения или фазы восстановления. При умерщвлении подопытных животных по завершении исследования, все (3/3) мужские особи, которым вводили 7,5 мг/кг/день, и 2/3 женские особи, которым вводили 20,0 мг/кг/день, имели от одного до нескольких, от красных до темно красных очагов на слизистой поверхности желудка. Серозная оболочка у одной мужской особи, которой вводили 20,0 мг/кг/день, содержала несколько красных областей.

Микроскопическими коррелятами было очаговое кровоизлияние в мышцах слизистой и/или подслизистого слоя/оболочки с или без наличия дистрофии гладких мышц в мышцах оболочки. Наличие аналогичных показаний у одной контрольной женской особи предполагает, что данные показания являются случайными и несвязанными с лекарственным средством.

Отсутствовали явные микроскопические показания, связанные с лекарственным средством, при умерщвлении после фазы введения или фазы восстановления. Макроскопические показания для слизистой или серозной оболочки желудка у некоторых животных, которым вводили СЕР-37440, обычно коррелировали с микроскопическими показаниями очагового кровоизлияния в мышцах слизистой и/или подслизистого слоя/оболочки с или без наличия дистрофии гладких мышц в мышцах оболочки. Однако связь макроскопических и микроскопических показаний с СЕР-37440 введением в настоящем изобретении является сомнительной, принимая во внимание наличие аналогичных и более тяжелых микроскопических показаний для желудка женской особи, которой вводили плацебо, и тот факт, что дегенерация гладких мышц желудка представляет собой известное сопутствующее показание у макак-крабоедов. Другие микроскопические эффекты имелись в желудке одного или более животных, но их связь с лекарственным средством является сомнительной из-за их низкой тяжести и/или частоты заболеваемости, отсутствия явного дозозависимого эффекта или одновременного наличия у контрольного животного.

Все оставшиеся микроскопические показания при умерщвлении после фазы введения или фазы восстановления, включая минимальные, очаговые инфильтраты альвеолярных макрофагов в легком двух женских особей, которым вводили 20,0 мг/кг/день, приписывали нормальной биологической изменчивости и считали случайными.

В заключение, пероральное введение СЕР-37440 макакам-крабоедам при дозах вплоть до 20 мг/кг/день в течение 28 последовательных дней было хорошо переносимым, и эффекты, связанные с лекарственным средством, не наблюдали при любом уровне доз. Что особенно важно, отсутствовали какие бы то ни было данные об отеке легких, и определяли, что СЕР-37440 является безопасным для применения в испытаниях на людях. Лучший профиль безопасности СЕР-37440 по сравнению с СЕР-28122, и в частности отсутствие токсичность для легких, был удивительным и неожиданным.

- 24 025859

Противоопухолевая активность в ксенотрансплантатных моделях ΝΡΜ-АЬ положительной 8ир-М2 и Каграх-299 АЬСЬ опухолей у мышей

Не наблюдали значительной противоопухолевой активности после 12-дневной обработки СЕР37440 при 10 мг/кг или ниже два раза в день; частичную регрессию опухоли наблюдали после 12дневной обработки СЕР-37440 при 30 мг/кг четыре раза в день; полную или практически полную регрессию опухоли наблюдали после 12-дневной обработки СЕР-37440 при 30 мг/кг два раза в день или 55 мг/кг четыре раза в день (фиг. 4). Введение СЕР-37440 является хорошо переносимым без явной токсичности и без заметной потери веса тела, связанной с соединением, у мышей всех режимах дозирования (фиг. 5). Зависящие от дозы концентрации СЕР-37440 обнаруживали в лизатах плазмы и опухоли, собранных через 2 ч после последнего введения дозы (фиг. 6). Следует отметить, что СЕР-37440 нельзя было наблюдать в опухолях при уровнях доз 30 мг/кг два раза в день и 55 мг/кг четыре раза в день, поскольку данные животные не имели опухолей полная регрессия опухоли. Концентрации СЕР-37440 являлись приблизительно в 2-3 раза большими в плазме и более чем в 10 раз большими в опухолях, чем концентрации через 2 ч после единичной пероральной дозы в РК/РЭ исследованиях, предполагая некоторое накопление соединения в плазме и опухолях при режимах перорального введения доз два раза в день или четыре раза в день при 10 и 30 мг/кг.

В Каграк-299 опухолевом ксенотрансплантате, значительную противоопухолевую активность наблюдают при 30 мг/кг четыре раза в день, и полную или практически полную регрессию опухоли наблюдают после 12-дневной обработки при 30 мг/кг два раза в день или 55 мг/кг четыре раза в день (фиг. 7). СЕР-37440 введение является хорошо переносимым без явной токсичности и без значительной потери веса тела при режимах дозирования (фиг. 8). Зависящие от дозы концентрации СЕР-37440 наблюдали в лизатах плазмы и опухоли, собранных через 2 ч после последнего дозирования (фиг. 9). Следует отметить, что СЕР-37440 можно наблюдать в опухолях при уровне дозирования 50 мг/кг четыре раза в день, поскольку данные животные не содержали опухолей - полная регрессия опухоли.

Противоопухолевая активность в ксенотрансплантате ЕМЬ4-АЬ положительной (ΝΟ-Η2228 и ΝΟ-Η3122) ^СЬС опухоли у мышей с пероральным дозированием

Что касается моделей трансплантата ΝΟΉ2228 опухоли, обработка СЕР-37440 (НС1 соль) при 30 мг/кг четыре раза в день и два раза в день и 55 мг/кг четыре раза в день перорально в течение 12 дней приводит в результате к регрессии опухоли (фиг. 10). Что касается моделей трансплантата N0-43122 опухоли, обработка СЕР-37440 (НС1 соль) при 30 мг/кг два раза в день или 55 мг/кг четыре раза в день перорально в течение 12 дней приводит в результате к остановке роста опухоли и частичной регрессии (фиг. 11). Повышенная противоопухолевая активность, наблюдаемая в ксенотрансплантате ΝΟΉ2228 опухоли, по-видимому, является результатом лучшего распределения в опухоли СЕР-37440 (фиг. 12 и 13). Обработка данных мышей с опухолями является хорошо переносимой без явной токсичности или потери веса, связанных с соединением (фиг. 14 и 15), исключая дозу 30 мг/кг два раза в день у мышей, содержащих ΝΟ-Π3122 опухоль (фиг. 15).

Четыре недели дополнительной обработки мышей, содержащих ΝΟ-Π2228 опухоль, при 55 мг/кг четыре раза в день перорально обеспечивает стойкую полную регрессию опухоли у 100% животных (фиг. 16). Дополнительная обработка является хорошо переносимой без явной токсичности и значительной потери веса тела (фиг. 17). Стойкая регрессия опухоли наблюдалась у 100% мышей в течение 40 дней после прекращения обработки, без повторного возникновения опухоли у любой из мышей (фиг. 16).

Это является важным, поскольку это предполагает, что опухоли полностью ликвидируются и что мыши эффективно вылечиваются после приблизительно 6 недель обработки СЕР-37440.

Исследования противоопухолевой активности на человеческих опухолевых ксенотрансплантатах гормон-независимого рака предстательной железы, N8^ рака и Н^С рака

В достоверной модели ксенотрансплантата РАК-положительной РС-3 опухоли предстательной железы, введение СЕР-37440 в течение 36-дневного периода приводит в результате к 55% ингибированию роста опухоли (ТО1) и 10% случаям полной регрессии опухоли, профилю, аналогичному профилю эквивалентной дозы РР-562271 в данной модели (69% ИРО и 25% случаев частичной регрессии опухоли) (фиг. 18). Все режимы дозирования являются хорошо переносимыми без явной токсичности или значительной наблюдаемой потери веса тела.

Немелкоклеточный рак легкого ^8СЬ)

СЕР-37440 демонстрирует связанную с дозой противоопухолевую активность с 80% ИРО и 60% случаями регрессии опухоли (30% полная и 30% частичная) при 55 мг/кг два раза в день и значительную эффективность (60% ИРО и данные частичной регрессии опухоли) при 30 мг/кг два раза в день к 28 дню исследования (фиг. 19). Значительную противоопухолевую активность (66% ИРО) наблюдали с РР562271 при 55 мг/кг два раза в день, но наблюдали умеренный рецидив роста опухоли, начиная с 23 дня. Введение и СЕР-37440 и РР-562271 является хорошо переносимым без явной токсичности или наблюдаемой значительной потери веса тела (фиг. 20). Следует отметить, что значительная активность, достигаемая с СЕР-37440, не является результатом ингибирования фосфорилирования (активации) ЕОР-К в данной модели трансплантата ЕМЬ4-АЬК негативной опухоли.

- 25 025859

Плоскоклеточный рак головы и шеи (ΗΝδϋϋ)

У ЗСЮ мышей, содержащих стандартные Иейой 562 НИ8СС ксенотрансплантаты, СЕР-37440 и РР-562271 проявляли четкий опухолевый фармакодинамический эффект по ингибированию активации РАК без влияния на суммарные степени экспрессии РАК (фиг. 21). В течение 28-дневного периода, СЕР37440 и РР-562271 приводили в результате к остановке роста опухоли и 20% случаям (СЕР-37440, 30 мг/кг два раза в день) и 30% случаям (СЕР-37440 и РР-562271, 55 мг/кг два раза в день) частичной регрессии опухоли. Величина активности, наблюдаемая с СЕР-37440 (обе дозы), является сравнимой с величиной, наблюдаемой с 55 мг/кг два раза в день РР-562271 (КоЪейк с1 а1., 2008). Режимы дозирования являются хорошо переносимыми без наблюдаемых клинических проявлений или смертельности.

Данные исследования являются важными, поскольку они показывают, что СЕР-37440 демонстрирует значительное фармакодинамическое ингибирование и РАК и АЬК-независимую противоопухолевую активность в стандартных моделях ксенотрансплантатов гормон-независимого рака предстательной железы, Ы§СЬ рака и НИ8СС - включая объективные ремиссии опухоли.

Ясно, что примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, служат только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалисту в данной области техники, и они будут включены в сущность и сферу действия настоящего патента и объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение с помощью ссылки во всей своей полноте для всех целей.

1. Соединение формулы (I)

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение формулы I по п.1.
3. 3. Соль соединения формулы (I) по п.1, где соль представляет собой соль присоединения кислоты.
4. 4. Соль соединения формулы (I) по п.1, где соль представляет собой трибензолсульфонатную соль.
5. 5. Трибензолсульфонатная соль соединения формулы (I) по п.4, имеющая порошковую рентгеновскую дифрактограмму, содержащую один или более пиков, выбранных из 7,62±0,2° 2Θ, 13,11±0,2° 2Θ, 13,76±0,2° 2Θ и 14,05±0,2° 2Θ.
6. 6. Трибензолсульфонатная соль соединения формулы (I) по п.4, имеющая порошковую рентгеновскую дифрактограмму, содержащую один или более пиков, выбранных из 6,85±0,2° 2Θ, 7,62±0,2° 2Θ, 8,01±0,2° 2Θ, 13,11±0,2° 2Θ, 13,76±0,2° 2Θ, 14,05±0,2° 2Θ и 14,60±0,2° 2Θ.
7. 7. Трибензолсульфонатная соль соединения формулы (I) по п.4, имеющая порошковую рентгеновскую дифрактограмму, содержащую один или более пиков, выбранных из 7,62±0,2° 2Θ, 13,11±0,2° 2Θ, 13,76±0,2° 2Θ, 14,05±0,2° 2Θ, 17,10±0,2° 2Θ, 17,86±0,2° 2Θ и 18,10±0,2° 2Θ.
8. 8. Соль соединения формулы (I) по п.1, где соль представляет собой дигидрат тригидрохлоридной соли.
9. 9. Дигидрат тригидрохлоридной соли соединения формулы (I) по п.8, имеющий порошковую рентгеновскую дифрактограмму, содержащую один или более пиков, выбранных из 5,42±0,2° 2Θ, 8,86±0,2° 2Θ, 14,06±0,2° 2Θ, 17,52±0,2° 2Θ и 18,51±0,2° 2Θ.
10. 10. Дигидрат тригидрохлоридной соли соединения формулы (I) по п.8, имеющий порошковую рентгеновскую дифрактограмму, содержащую один или более пиков, выбранных из 5,42±0,2° 2Θ, 5,91±0,2° 2Θ, 8,86±0,2° 2Θ, 10,80±0,2° 2Θ, 11,79±0,2° 2Θ, 14,06±0,2° 2Θ, 14,72±0,2° 2Θ, 17,02±0,2° 2Θ, 17,52±0,2° 2Θ и 18,51±0,2° 2Θ.
11. 11. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение или соль по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
12. 12. Твердый препарат, представляющий собой таблетку или капсулу, содержащую композицию по

    п.11.
13. 13. Способ лечения АЬК- или РАК-опосредованного заболевания или нарушения у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества соединения или соли по любому из пп.1-10.
14. 14. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из анапластической крупноклеточной лимфомы (АРСЬ), немелкоклеточного рака легкого (ИБСЬС), ней- 26 025859 робластомы, глиобластомы, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака (8СС) и рака молочной железы.
15. 15. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы8СЬС, нейробластомы, глиобластомы, андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и плоскоклеточного рака головы и шеи (НЫ8СС).
16. 16. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы8СЬС, нейробластомы, андрогеннезависимого рака предстательной железы, рака молочной железы и НЫ8СС.
17. 17. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы8СЬС, нейробластомы и глиобластомы.
18. 18. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ, ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы8СЬС и нейробластомы.
19. 19. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из АЬК-положительной АЬСЬ и ЕМЬ4-АЬК-положительного Ы8СЬС.
20. 20. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение выбрано из андроген-независимого рака предстательной железы, рака молочной железы и НЫ8СС.
21. 21. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой АЬК-опосредованное заболевание или нарушение.
22. 22. Способ по п.13, в котором АЬК- или РАК-опосредованное заболевание или нарушение представляет собой РАК-опосредованное заболевание или нарушение.