EA023344B1 - Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией - Google Patents

Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией Download PDF

Info

Publication number
EA023344B1
EA023344B1 EA201190080A EA201190080A EA023344B1 EA 023344 B1 EA023344 B1 EA 023344B1 EA 201190080 A EA201190080 A EA 201190080A EA 201190080 A EA201190080 A EA 201190080A EA 023344 B1 EA023344 B1 EA 023344B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
neutropenia
dose
νευο
pegfilgrastim
treatment
Prior art date
Application number
EA201190080A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201190080A1 (ru
Inventor
Джейсон Бенджамин Бок
Адам Карр Белл
Джеффри Херпст
Original Assignee
Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд. filed Critical Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд.
Publication of EA201190080A1 publication Critical patent/EA201190080A1/ru
Publication of EA023344B1 publication Critical patent/EA023344B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A61K38/385—Serum albumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Предложен способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией. Способ, описанный в настоящем изобретении, включает введение субъекту, представляющему собой человека, от примерно 30 до примерно 60 мг рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

Description

Лейкопения представляет собой снижение содержания циркулирующих лейкоцитов (белых клеток крови), и часто определяется как количество лейкоцитов < 4000/мл. Основными клетками, которые затрагивает лейкопения, являются нейтрофилы. Однако пониженное содержание лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов также может способствовать пониженному общему содержанию лейкоцитов (Мегск Мапиа1, 17-е издание).
Нейтропения характеризуется снижением количества нейтрофилов в крови, которое часто приводит к повышенной чувствительности к бактериальным и грибковым инфекциям. Нейтропения классифицируется по количеству нейтрофилов и относительному риску развития инфекции следующим образом: легкая (от 1000 до 1500/мл), умеренная (3 степень, от 500 до 1000/мл) или тяжелая (4 степень, < 500/мл). Острая и тяжелая нейтропения представляет собой угрожающее жизни состояние, т.к. при ней пациент подвержен быстро развивающимся инфекциям с летальным исходом (Мегск Мапиа1, 17-е издание).
Нейтропения может быть вызвана нарушенной продукцией нейтрофилов в костном мозге или ускоренным разрушением нейтрофилов. Острая нейтропения может возникать в течение нескольких дней, когда потеря нейтрофилов происходит быстро, а их продукция сильно нарушена. Хроническая нейтропения может длиться многие месяцы и часто вызвана сниженной продукцией или секвестрацией нейтрофилов в селезенке. Нейтропению можно классифицировать в зависимости от того, является ли ее возникновение вторичным по отношению к факторам, не относящимся к миелоидным клеткам костного мозга, или внутренний дефект в миелоидных предшественниках (Мегск Мапиа1, 17-е издание).
Нейтропения и ее инфекционные осложнения принадлежат числу наиболее распространенных и серьезных побочных эффектов цитотоксической химиотерапии и других видов терапии рака, таких как лучевая терапия, биотерапия, направленная терапия и трансплантация костного мозга. Цитотоксическая химиотерапия, которая действует путем разрушения быстрорастущих клеток, индуцирует нейтропению из-за высокой скорости пролиферации предшественников нейтрофилов и быстрого обновления нейтрофилов в крови (Мегск Мапиа1, 17-е издание). Наиболее распространенные симптомы нейтропении у пациентов, подвергающихся химиотерапии, включают лихорадку, язвы в ротовой полости и ушные инфекции. Пациенты с тяжелой нейтропенией часто страдают от гнойных инфекций, таких как септицемия, кожный целлюлит, абсцессы печени, фурункулез, пневмония, стоматит, гингивит, периректальное воспаление, колит, синусит и отит среднего уха. Может возникать необходимость отложить химиотерапию до того момента, когда организм сможет вырабатывать больше нейтрофилов, а также иногда приходится вводить меньшие дозы, что приводит к снижению эффективности лечения.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предотвращения патологического состояния, характеризующегося пониженным содержанием лейкоцитов в крови по сравнению с нормой. Такие патологические состояния включают лейкопению и нейтропению, но не ограничиваются ими. Согласно первому варианту реализации изобретения предложен способ лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение субъекту, представляющему собой человека, страдающему нейтропенией или имеющего риск развития нейтропении, рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта. Согласно типичному варианту реализации изобретения субъект, представляющий собой человека, может иметь немиелоидные злокачественные новообразования и получать по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении.
Согласно второму варианту реализации изобретения предложен способ лечения или предотвращения лейкопении у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение субъекту, представляющему собой человека, страдающему лейкопенией или имеющему риск развития лейкопении, рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта.
Согласно третьему варианту реализации изобретения предложен способ снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией, у субъекта, представляющего собой человека, имеющего немиелоидные злокачественные новообразования и получающего по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении, включающий введение субъекту рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта.
В некоторых способах соединения, описанные в настоящей заявке, могут применяться для снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения композиции и способы включают гибридный полипептид, образованный из белка сывороточного альбумина человека (Η8Ά) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (О-С8Р). Длина гибридного полипептида составляет 759 аминокислот; 1-585 аминокислоты гибридного полипептида соответствуют аминокислотам зрелой формы Η8Ά, и 586-759 аминокислоты гибридного полипептида соответствуют аминокислотам зрелой формы
- 1 023344
О-С8Р человека. Последовательности аминокислот гибридного белка представлены на фиг. 1. Гибридный полипептид, имеющий название Нейгранин® (ΝΕϋΟ), вводят пациентам, страдающим лейкопенией или нейтропенией или имеющим повышенный развития лейкопении или нейтропении. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения способы включают лечение лейкопении или нейтропении у субъекта, представляющего собой человека, путем введения рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения представляет собой первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению или иммуноопосредованную нейтропению.
Согласно другим вариантам реализации изобретения нейтропения является вызванной или связанной с облучением, алкоголизмом, лекарственными средствами, аллергическими заболеваниями, гипопластической анемией, аутоиммунным заболеванием, Т-γ лимфопролиферативным заболеванием (Т-γ ЛПЗ), миелодисплазией, миелофиброзом, дисгаммаглобулинемией, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, раком, дефицитом витамина В12, дефицитом фолатов, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, повреждением селезенки, гемодиализом, трансплантацией, лейкемией, миеломой, лимфомой, метастатическими солидными опухолями, которые инфильтрируют и замещают костный мозг, токсинами, недостаточностью костного мозга, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяной гипоплазией, врожденным дискератозом, болезнью накопления гликогена ΙΒ типа, спленомегалией любой этиологии и внутренними дефектами миелоидных клеток или их предшественников. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения вызвана или связана с цитотоксической химиотерапией.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения субъект, представляющий собой человека, страдает от немиелоидных злокачественных новообразований, например рака молочной железы, и получает цитотоксическую химиотерапию. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения пациент получает по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения миелосупрессивные противораковые лекарственные средства представляют собой доксорубицин и доцетаксел. Согласно другим вариантам реализации изобретения примерно 50 мг/м2 доксорубицина и примерно 75 мг/м2 доцетаксела вводят последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Согласно другим вариантам реализации изобретения примерно 60 мг/м2 доксорубицина и примерно 75 мг/м2 доцетаксела вводятся последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения.
Согласно другим вариантам реализации способы включают способ снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией, у субъектов, представляющих собой людей. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения субъект, представляющий собой человека, имеет немиелодные злокачественные новообразования и получает по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят субъекту в количестве, эффективном для лечения нейтропении у указанного субъекта.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения у субъекта устраняют нейтропению или уменьшают продолжительность или выраженность нейтропении. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения устраняют нейтропениюЗ или 4 степени у субъекта. В других варианта реализации изобретения уменьшают продолжительность нейтропении 3 или 4 степени. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения продолжительность нейтропении 4 степени у субъекта составляет менее 5 дней; согласно некоторым вариантам реализации изобретения продолжительность нейтропении 4 степени у субъекта составляет менее 4 дней, менее 3 дней или менее 2 дней. Согласно другим вариантам реализации изобретения у субъекта устраняют нейтропению 3 степени, и/или продолжительность нейтропении 3 степени у субъекта снижается по сравнению с субъектами, не получающими лечение альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека приводит к повышению содержания лейкоцитов (\УВС) или снижению потери \УВС у субъекта. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения увеличивают количество нейтрофилов у субъекта; подавляют снижение содержания нейтрофилов у субъекта, повышают минимальное значение абсолютного числа нейтрофилов (АЯС) у субъекта, улучшают АСЯ в период восстановления у субъекта и/или снижают время восстановления АЯС у субъекта.
- 2 023344
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 40 до примерно 500 мкг/кг; согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 50 до примерно 450 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 50 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 150 мкг/кг, примерно 200 мкг/кг или примерно 250 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 300 мкг/кг, примерно 350 мкг/кг или примерно 400 мкг/кг. Согласно альтернативным вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 450 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 20 до примерно 100 мг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 30 до примерно 60 мг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 30 мг, примерно 40 мг, примерно 50 мг или примерно 60 мг.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят после проведения химиотерапии (например, после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства). Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят во время химиотерапии или вводится в течение 2, 4, 6, 12, 18, 24 или в течение 48 ч от времени введения химиотерапевтического лекарственного средства.
Согласно другому варианту реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека возможно вводят после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства. Например, рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека возможно вводят в момент времени, выбранный из группы, включающей: (а) по меньшей мере через 2 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (Ь) по меньшей мере через 4 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (с) по меньшей мере через 6 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (ά) по меньшей мере через 12 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (е) по меньшей мере через 18 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (ί) по меньшей мере через 24 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (д) по меньшей мере через 48 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; или (Ь) во время введения, или, по существу, одновременно с введением миелосупрессивного противоракового лекарственного средства.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека во время или после проведения химиотерапевтического лечения вызывает повышение числа лейкоцитов и/или вызывает повышение ЛЫС. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения ЛЫС и уровень лейкоцитов возвращаются к норме к 10 дню после проведения химиотерапии. Согласно другим вариантам реализации АЫС и уровень лейкоцитов возвращаются к норме к 11 дню после проведения химиотерапии, 12 дню после проведения химиотерапии, 13 дню после проведения химиотерапии, 14 дню после проведения химиотерапии или 15 дню после проведения химиотерапии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения на 14 день после введения химиотерапевтического лекарственного средства повышение АЫС у пациентов, получающих лечение рекомбинантным альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, меньше, чем повышение АЫС у пациентов, получающих лечение эквивалентной дозой пэгфилграстима. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения повышается количество лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов у субъекта. Согласно другим вариантам реализации изобретения подавляется снижение числа лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов у субъекта.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, достигаемый результат может быть выбран из группы, включающей: (а) устранение нейтропении 4 степени у субъекта; (Ь) снижение выраженности нейтропении 4 степени у субъекта; (с) снижение продолжительности острой нейтропении у субъекта; (ά) устранение
- 3 023344 нейтропении 3 степени у субъекта; (е) снижение продолжительности нейтропении 3 степени у субъекта или (ί) любую комбинацию указанных результатов.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, введение рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение содержания лейкоцитов крови. Согласно другим вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, достигаемый результат выбирают из группы, включающей (а) повышение количества нейтрофилов у субъекта; (Ь) подавление снижения содержания нейтрофилов у субъекта; (с) повышение минимального значения абсолютного числа нейтрофилов (ЛЫС) у субъекта; (ά) улучшение восстановления АЫС у субъекта; (е) снижение времени восстановления АЫС у субъекта; или (ί) любую комбинацию указанных результатов.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, выбрано из группы, включающей: (а) от примерно 50 до примерно 450 мкг/кг; (Ь) примерно 50 мкг/кг; (с) примерно 150 мкг/кг; (ά) примерно 300 мкг/кг; (е) примерно 450 мкг/кг; (ί) от примерно 30 до примерно 60 мг; (д) примерно 30 мг; (й) примерно 40 мг; (ί) примерно 50 мг; (]) примерно 60 мг или (к) любую комбинацию указанных количеств.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения, подверженная лечению или предотвращению, выбрана из группы, включающей первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению и имммуно-опосредованную нейтропению. Кроме того нейтропения может быть вызванной или связанной, например, с облучением, алкоголизмом, лекарственными средствами, аллергическими заболеваниями, гипопластической анемией, аутоиммунным заболеванием, Т-γ лимфопролиферативным заболеванием (Т-γ ЛПЗ), миелодисплазией, миелофиброзом, дисгаммаглобулинемией, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, раком, дефицитом витамина В12, дефицитом фолатов, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, пораением селезенки, гемодиализом или трансплантацией, лейкемией, миеломой, лимфомой, метастатическими солидными опухолями, которые инфильтрируют и замещают костный мозг, токсинами, недостаточностью костного мозга, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяной гипоплазией, врожденным дискератозом, болезнью накопления гликогена III типа, спленомегалией любой этиологии, внутренними дефектами миелоидных клеток или их предшественников.
Согласно вариантам реализации изобретения у субъекта, представляющего собой человека, имеющего немиелоидные злокачественные новообразования, немиелоидное злокачественное новообразование может представлять собой рак молочной железы. Согласно вариантам реализации изобретения вводимые миелосупрессивные противораковые лекарственные средства могут представлять собой доксорубицин и доцетаксел. Например, примерно 50 мг/м2 доксорубицина и примерно 75 мг/м2 доцетаксела могут вводиться последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Альтернативно, примерно 60 мг/м2 доксорубицина и примерно 75 мг/м2 доцетаксела могут вводиться последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения после проведения лечения АЫС и уровень лейкоцитов возвращаются к норме за период времени, выбранный из группы, включающей следующие периоды: (а) через 10 дней после проведения химиотерапии; (Ь) через 11 дней после проведения химиотерапии; (с) через 12 дней после проведения химиотерапии; (ά) через 13 дней после проведения химиотерапии: (е) через 14 дней после проведения химиотерапии или (ί) через 15 дней после проведения химиотерапии. Согласно другому варианту реализации изобретения на 14 день после введения химиотерапевтического средства повышение АЫС у пациентов, получающих лечение рекомбинантным альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, меньше, чем повышение АЫС у пациентов, получающих лечение эквивалентной дозой пэгфилграстима.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, или любой комбинации указанных. Согласно другим вариантам реализации изобретения у субъекта повышается уровень лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов или любой комбинации указанных. Согласно другим вариантам реализации изобретения снижение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, или базофилов подавляется у субъекта.
Приведенное выше общее описание изобретения и последующее краткое описание фигур, а также подробное описание изобретения приведены в качестве примера и пояснения и предназначены для более детального разъяснения предложенного изобретения. Другие объекты, преимущества и новые признаки будут очевидны специалистам в данной области техники из следующего подробного описания настоящего изобретения.
- 4 023344
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1А-1С: на фиг. 1А показаны последовательность нуклеиновых кислот и последовательность аминокислот гибридного белка рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (тНА-О-С8Р), имеющего название Нейгранин® (ΝΕυΟ); на фиг. 1В показана последовательность аминокислот О-С8Р человека; на фиг. 1С показана последовательность аминокислот сывороточного альбумина человека.
На фиг. 2 представлен график, описывающий абсолютное число нейтрофилов (АЫС) у субъектов в I фазе. Субъекты получали 300 мкг/кг ΝΕυΟ (п=19), 450 мкг/кг ΝΕυΟ (п=20) или 6 мг пэгфилграстима (№и1ак1а®) (п=9) в 1 цикле после проведения химиотерапии согласно исследованию.
На фиг. 3 представлен график, представляющий фармакокинентические свойства ΝΕυΟ в I фазе исследования у субъектов, представляющих собой людей. Концентрацию в сыворотке ΝΕυΟ, вводимого подкожно в указанных дозах (450, 300 или 150 мкг/кг), измеряли у субъектов, страдающих раком молочной железы, в отсутствие химиотерапии. Квадраты: 450 мкг/кг, 0 цикл; треугольники: 300 мкг/кг, 0 цикл; кружки: 150 мкг/кг, 0 цикл.
На фиг. 4 представлен график, представляющий фармакокинетические/фармакодинамические свойства (ΡΚ/ΡΌ) ΝΕυΟ в 1 цикле химиотерапии (исследование I фазы). Пациенты получали 450 мкг/кг ΝΕυΟ через один день после введения доксорубицина/доцетаксела в 1 Цикле. АЫС обозначено незакрашенными ромбами; концентрация ΝΕυΟ обозначена закрашенными квадратами. Пороговые значения для разделения нейтропении 3 и 4 степени показаны штриховыми линиями. Нижний предел количественного определения (ЕЬОЦ) для ΝΕυΟ показан точечной линией (доза 6 нг/мл).
На фиг. 5 представлен график, показывающий кривую ΑNС для пациентов, которые получали либо 30 мг ΝΕυΟ, либо 6 мг пэгфилграстима (Нейласты®) через один день после начала 1 цикла химиотерапии (исследование II фазы). Пороговые значения для разделения нейтропении 3 и 4 степени показаны штриховыми линиями.
На фиг. 6 показаны циклы химиотерапии для исследований I фазы.
На фиг. 7А и 7В представлены графики, показывающие АЫС и уровень лейкоцитов крови (\УВС) для субъектов в исследовании I фазы.
На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий пролиферацию клеток ΝδΡ-60 в присутствии ΝΕυΟ (альбугранина) или Нейпогена®.
На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий пролиферацию клеток ΝδΡ-60 в присутствии ΝΕυΟ или нейласты.
На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий число нейтрофилов (Οτ,1+) в периферической крови у мышей ΒΌΡ-1 после однократного δС введения ΝΕυΟ (альбугранина) и нейпогена (в зависимости от времени). Общее число Οτ,1+ клеток выражается как среднее группы +/- стандартная ошибка среднего (δΕΜ).
На фиг. 11 представлен график, демонстрирующий содержание гематопоэтических клетокпредшественников (с-кЮ) в периферической крови после однократного подкожного ^С) введения ΝΕυΟ (альбугранина) и нейпогена (в зависимости от времени). Общее число с-кй+ клеток выражается как среднее группы +/- δΕΜ (стандартная ошибка среднего).
На фиг. 12А и 12В представлены графики, демонстрирующие содержание гранулоцитов (Οτ,1+) периферической крови после однократного подкожного (δθ') введения ΝΕυΟ (альбугранина) или нейласты (№и1ак1а®) мышам ΒΌΡ-1. На фиг. 12А показана зависимость ответа от времени после введения однократной дозы нейласты или ΝΕυΟ и на фиг. 12В показана относительная активность ΝΕυΟ или нейласты.
Фиг. 13 представляет собой таблицу, в которой приведена композиция лекарственного продукта ΝΕυΟ, используемого в I фазе.
Фиг. 14 представляет собой таблицу, в которой приведена композиция лекарственного продукта ΝΕυΟ, используемого во II фазе.
На фиг. 15 представлен график, демонстрирующий содержание тгематопоэтических клетокпредшественников (с-кЮ) в периферической крови после однократного подкожного введения ΝΕυΟ (альбугранина) или Нейласты® (в зависимости от времени). Общее число с-кй+ клеток выражено как среднее и стандартная ошибка среднего, рассчитанная для каждой группы. Различия между лечебными группами анализировали с помощью ΐ-критерия Стьюдента с зависимой дисперсией.
На фиг. 16 представлен график, демонстрирующий число нейтрофилов периферической крови (Ογ,1+) после однократного подкожного введения ΝΕυΟ (альбугранина) или нейласты через 1 день после внутрибрюшинного (ΓΡ) введения 5-фторурацила (5-Ρϋ) в дозе 150 мкг/кг. Общее число ΟΚ,1+ клеток, подсчитываемых ежедневно, выражается как среднее и стандартная ошибка среднего, рассчитанная для каждой группы. Различия среди лечебных групп оценивали с помощью двухвыборочного ΐ-критерия Стьюдента с неодинаковой дисперсией. Лечение любым агентом при всех дозах приводило к статистически значимому повышению содержания нейтрофилов по сравнению с контролем плацебо.
На фиг. 17 представлен график, демонстрирующий эффект ΝΕυΟ (альбугранина) на относительное
- 5 023344 число нейтрофилов в периферической крови. Относительное число нейтрофилов на каждый день исследования представлено как среднее группы +/- δΕΜ. Данные на 8 и 9 день для дозы ΝΕυΟ 100 мкг/кг, Ц7, представлены как данные для 9 и 10 дня, соответственно, для возможности сравнения с другими группами. Контролем являлся физиологический раствор (плацебо), вводимый §С каждые 4 дня х 4, или Нейпоген®, вводимый §С ежедневно х 14. Период проведения лечения рассматривается как период с 1 по 14 день и период восстановления - с 15 по 28 день.
На фиг. 18 представлен график, показывающий сравнение многократных доз ΝΕυΟ (альбугранина) при подкожном (§С) введении, ΝΕυΟ при внутривенном (IV) введении или Нейласты® при подкожном (8С) введении на мобилизацию нейтрофилов у обезьян. Количество нейтрофилов (тысяч клеток/мкл) на каждый день исследования до 22 дня представлено как среднее группы +/- δΕΜ. Стрелки обозначают введение дозы. ΝΕυΟ вводили подкожно, 8С, (п=6) или внутривенно, IV, (п=6) в концентрации 1,0 мг/кг/доза, и нейласту вводили подкожно, 8С, (п=6) в концентрации 0,22 мг/кг/доза (доза, эквимолярная 1,0 мг/кг ΝΕυΟ). Контроль плацебо для ΝΕυΟ вводили подкожно, 8С, (п=2).
Фиг. 19А и 19В представляют собой таблицы, показывающие суммарные данные исследований фармакокинетических свойств ш νίνο.
Фиг. 20 представляет собой таблицу, показывающую суммарные данные доклинических исследований ш νίνο, которые обеспечивают данные по безопасности. Фиг. 21 представляет собой схему типичного процесса ферментации и очищения ΝΕυΟ.
Фиг. 22 представляет собой график, показывающий медианное абсолютное число нейтрофилов (ΑΝ6) для субъектов в I фазе, части А (0 цикл, или до проведения химиотерапии) от начала лечения до 14 дня. На 4 день кривые (сверху вниз) соответствуют дозам: 300, 450, 150 и 50 мкг /кг. Фиг. 23А и 23В показывают площадь под кривой (ΑυΟ) АЛС, построенной на основе значений АNС для каждого субъекта, получающего лечение в I фазе, части В, полученных на 0-15 день. Фиг. 23А представляет собой график; данные, представленные на фиг. 23А, суммированы в табл. 23В.
На фиг. 24 представлен график, показывающий площадь под кривой (ΑυΟ) ΑΝΟ, построенной на основе значений ΑNС для субъектов, получающих лечение во II фазе, полученных на 0-15 день 1 цикла (группы, получающие фиксированные дозы). Для всех субъектов во II фазе рассчитывали ΑυС ΑΝε (0-15 день). Диапазон доз для пациентов, получающих лечение нейгранином, составлял от 0,3 до 1 мг/кг (рассчитано на основе дозы, деленной на исходную массу). Рассчитанный с учетом массы тела диапазон доз делили на квартили и наносили на график относительно Αυ^^ (левая панель). Для всех субъектов, получающих лечение пэгфилграстимом (Ν=112), 30 мг (Ν=10), 40 мг (Ν=105) или 50 мг (Ν=105) нейгранина, также рассчитывали и сравнивали Αυ^ο Данные показаны как среднее +δΕΜ.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения, предупреждения и облегчения состояний и заболеваний, характеризующихся пониженным содержанием лейкоцитов. Способ, предложенный в настоящем описании, включают гибридный полипептид, образованный белком сывороточного альбумина человека (ΗδΑ) и гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека (Ο-СδΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения длина указанного гибридного полипептида составляет примерно 759 аминокислот; 1-585 аминокислоты указанного гибридного белка соответствуют аминокислотам зрелой формы ΗδΑ и 586-759 аминокислоты указанного гибридного белка соответствуют аминокислотам зрелой формы Ο-ί'.'δΡ человека. Аминокислотная последовательность гибридного белка представлена на фиг. 1.
Настоящее изобретение также включает гибридные белки, содержащие варианты или фрагменты ΟСδΡ, и гибридные белки, содержащие альбумин или его фрагменты или варианты. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие терапевтические гибридные белки альбумина согласно настоящему изобретению, терапевтические гибридные белки альбумина, композиции, фармацевтические композиции, составы и наборы. Клетки-хозяева, трансформированные полинуклеотидами, кодирующими терапевтические гибридные белки альбумина, также включены в настоящее изобретение, как и способы получения гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению с использованием указанных полинуклеотидов и/или клеток-хозяев.
Согласно одному варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению имеет длительный срок хранения.
Согласно второму варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению более стабилен, чем соответствующая негибридная молекула Ο-ί'.'δΕ
Настоящее изобретение также включает трансгенные организмы, модифицированные таким образом, что они содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, предпочтительно модифицированные таким образом, что они экспрессируют гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению. В целом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим гибридные белки альбумина; гибридным белкам альбумина и способам лечения, предупреждения или облегчения заболеваний или расстройств с применением гибридных белков альбумина или полинуклеотидов, кодирующих гибридные белки альбумина. В настоящем описании термин «гибридный белок аль- 6 023344 бумина» относится к белку, образованному путем слияния по меньшей мере одной молекулы альбумина (или ее фрагмента или варианта) с по меньшей мере одной молекулой С-С8Р (или ее фрагментом или вариантом). Гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере фрагмент или вариант С-С8Р и по меньшей мере фрагмент или вариант сывороточного альбумина человека, которые соединены друг с другом путем генетического слияния (т.е. гибридный белок альбумина получают путем трансляции нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий весь или часть С-С8Р, соединяют в рамке с полинуклеотидом, кодирующим весь или часть альбумина). С-С8Р и белок альбумин как часть гибридного белока альбумина могут называться частью, областью или фрагментом гибридного белка альбумина (например, О-С8Р-часть белка или альбуминовая). В наиболее предпочтительном варианте реализации гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну молекулу С-С8Р или ее фрагмент, или вариант (включая, но не ограничиваясь ей, зрелую форму белка С-С8Р) и по меньшей мере одну молекулу альбумина или ее фрагмент, или вариант (включая зрелую форму альбумина, но не ограничиваясь ей).
Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению процессируется клеткой-хозяином и секретируется в окружающую культурную среду. Процессинг образующегося гибридного белка альбумина, происходящий в секреторных путях хозяина, используемого для экспрессии, может включать, но не ограничивается ими, распад сигнального пептида, образование дисульфидных связей, соответствующий фолдинг, добавление и процессинг углеводов (например, Ν- и О-связанное гликозилирование), конкретное протеолитическое расщепление, и сборку с образованием мультимерных белков. Гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению предпочтительно находится в процессированной форме. В наиболее предпочтительном варианте реализации термин процессированная форма гибридного белка альбумина относится к гибридному белковому продукту альбумина, который подвергся отщеплению Ν-концевого сигнального пептида, в настоящем описании называемому также зрелым гибридным белком альбумина.
В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из СС8Р и белка сывороточного альбумина. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из белка С-С8Р и белка сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента белка С-С8Р и белка сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного варианта белка С-С8Р и белка сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации компонент, представляющий собой белок сывороточного альбумина, гибридного белка альбумина представляет собой зрелую часть сывороточного альбумина. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина.
В других вариантах реализации настоящего изобретения предложен гибридный белок альбумина, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из белка С-С8Р и биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из белка С-С8Р и биологически активного и/или терапевтически активного варианта сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации часть белка С-С8Р гибридного белка альбумина представляет собой зрелую часть белка С-С8Р. В другом предпочтительном варианте реализации часть белка С-С8Р гибридного белка альбумина представляет собой растворимый внеклеточный домен белка С-С8Р. В альтернативном варианте реализации часть белка С-С8Р гибридного белка альбумина представляет собой активную форму белка С-С8Р. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина.
В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента или варианта белка С-С8Р и биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента или варианта сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из зрелой части белка С-С8Р и зрелой части сывороточного альбумина. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина.
I. Определения
В настоящем описании термин полинуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из по меньшей мере одной молекулы альбумина (или ее фрагмента или варианта), соединенной в рамке по меньшей мере с одной молекулой гранулоцитарного колониестимулирую- 7 023344 щего фактора (О-С8Р) (или ее фрагментом или вариантом).
В настоящем описании термин гибридная конструкция альбумина относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей или, в качестве альтернативы, состоящей из полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну молекулу альбумина (или ее фрагмент или вариант), соединенного в рамке по меньшей мере с одним полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну молекулу О-С8Р (или ее фрагмент или вариант); и дополнительно содержащей, например, один или более следующих элементов: (1) функциональный самореплицирующийся вектор (включая, но не ограничиваясь ими, челночный вектор, вектор экспрессии, интеграционный вектор и/или систему репликации), (2) область инициации транскрипции (например, промоторная область, такая как, например, регулируемый или индуцируемый промотор, конститутивный промотор), (3) область терминации транскрипции, (4) лидерную последовательность и (5) селектируемый маркер. Полинуклеотид, кодирующий С-С8Р и белок альбумин как часть гибридной конструкции альбумина, каждый может называться частью, областью или фрагментом гибридной конструкции альбумина. Полипептид С-С8Р, проявляющий терапевтическую активность, или белок С-С8Р, который является терапевтически активным, означает полипептид С-С8Р, обладающий одним или более видами известной биологической и/или терапевтической активности, связанной с белком О-С8Р. В качестве не ограничивающего примера терапевтический белок О-С8Р представляет собой белок С-С8Р, подходящий для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, состояния или расстройства. В качестве не ограничивающего примера терапевтический белок О-С8Р может представлять собой белок, который специфично связывается с конкретным типом клеток (нормальным (например, лимфоциты) или аномальным (например, раковые клетки)), и, следовательно, может быть использован для направленного специфичного воздействия соединением (лекарственное средство или цитотоксический агент) на данный тип клеток.
II. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р) представляет собой гематопоэтический фактор роста, стимулирующий выработку нейтрофилов. Введение С-С8Р приводит к быстрой индукции нейтрофильного лейкоцитоза, если имеются доступные для стимуляции клетки-предшественники. Другой важной активностью С-С8Р ίη νίνο является стимуляция мобилизации гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови (ЭиНгееп е! а1., 1988; Мойпеих е! а1., 1999; КоЬейк е! а1., 1994). Данный эффект затрагивает не только линию дифференцировки нейтрофилов, но распространяется и на другие предшественники одной линии дифференцировки и нескольких линий дифференцировки, и плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки (Мойпеих е! а1., 1999). С-С8Р также усиливает клеточные явления, которые являются частью механизма защиты от инфекций, путем праймирования нейтрофилов, тем самым повышая как их фагоцитарную, так и антибактериальную активность в отношении опсонизированного золотистого стафилококка. С-С8Р также индуцирует хемотаксис нейтрофилов и моноцитов, и адгезию нейтрофилов (Уио е! а1., 1989; ^апд е! а1., 1988).
В настоящее время рекомбинантные продукты С-С8Р одобрены для ряда клинических показаний для стимуляции пролиферации и дифференцировки нейтрофилов. В клинических исследованиях филграстим (рекомбинантный метионил С-С8Р человека; Нейпоген®, Амген (Атдеп), Тйоикапй Оак8, СА) увеличивал число периферических нейтрофилов и тем самым снижал продолжительность нейтропении после миелосупрессивной химиотерапии. Рекомбинантный С-С8Р (филграстим) вводят ежедневно путем подкожной (§С) инъекции.
Другая рекомбинантная форма С-С8Р представляет собой пэгфилграстим, конъюгированный с полиэтиленгликолем, тС-С8Р (Нейласту®), который, как установлено, является безопасным и эффективным при применении в качестве альтернативы ежедневной терапии тС-С8Р при введении раз в цикл для уменьшения частоты возникновения фебрильной нейтропении у пациентов, получающих миелосупрессивные противораковые препараты (Но1те8, О'8йаидйпе88у е! а1., 2002; Отееп е! а1., 2003; №и1а8!а® 8тРС 2007).
Первичная профилактика О-С8Р рекомендуется для предотвращения фебрильной нейтропении у пациентов, которые относятся к группе повышенного риска развития фебрильной нейтропении на основании возраста, истории болезни, характеристик заболевания и миелотоксичности схемы химиотерапевтического лечения. Американское общество клинической онкологии и Европейская организация по исследованию и лечению рака рекомендуют применение О-С8Р в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет приблизительно 20%. Национальная сеть многопрофильных онкологических учреждений США рекомендует факультативное назначение профилактики О-С8Р в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет от 10 до 20%, и обязательное назначение профилактики ОС8Р в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет по меньшей мере 20% (διηίΐΐι е! а1., 2006, Уоде1 е! а1., 2005, Т1ттег-Воп!е е! а1., 2006, Νί’ί’Ν Ошйейпек).
Профилактика колониестимулирующими факторами рекомендуется для облегчения токсичности определенных схем химиотерапевтического лечения. Однако высокая стоимость данных способов лечения является существенной проблемой в США и, в особенности, в некоторых частях Европы, которая может приводить к недостаточному использованию профилактического лечения О-С8Р и может также
- 8 023344 ограничивать возможность отбора пациента для проведения схемы химиотерапевтического лечения интенсивными дозами (Типтег-ВоШе е! а1., 2006; Абатк е! а1., 2006, Νί'.’ί'.’Ν Ошбейпек).
Белок О-С8Р может кодироваться полинуклеотидной последовательностью дикого типа (например, либо полноразмерной, либо зрелой), или, в некоторых примерах, последовательность может представлять собой вариант полинуклеотидной последовательности дикого типа (например, полинуклеотид, который кодирует белок О-С8Р дикого типа, причем последовательность ДНК полинуклеотида оптимизирована, например, для экспрессии в определенных видах; или полинуклеотид, который кодирует вариант белка О-С8Р дикого типа (т.е., сайтнаправленный мутант; аллельный вариант)).
III. Сывороточный альбумин человека
Сывороточный альбумин человека (ΗδΑ или НА) представляет собой наиболее часто встречающийся в природе белок крови в системе кровообращения человека, уровень которого оценивается как приблизительно 40 г альбумина/л и сохраняющийся в кровообращении в течение более 20 дней. Альбумин представляет собой белок-носитель с минимальной активностью при физиологических концентрациях. Даже несмотря на то, что у ΗδΑ отсутствует ферментативная или иммунологическая функция, он широко распространен ίη νίνο, и известно, что он является носителем для различных веществ в крови (например, горманов, жирных кислот, несвязанного билирубина и т.д. (Уей е! а1., 1992)). Как ΗδΑ, так и рекомбинантный НА (гНА) обладают одинаково долгим циркулирующим временем полужизни у людей.
Исследование показало, что терапевтические белки, генетически гибридизованные с альбумином человека, могут приобретать свойство времени полужизни альбумина в циркулирующей крови (δ\τ6 е! а1., 1997). Например, у кроликов время полужизни СЭ4. гибридизованного с альбумином, в 140 раз больше, чем негибридного СЭ4 (Уей е! а1., 1992).
Сывороточный альбумин человека, белок, состоящий из 585 аминокислот, в зрелой форме (как показано на фиг. 1 патента США 7592010) ответственен за значительную часть осмотического давления сыворотки и также выполняет функцию носителя эндогенных и экзогенных лигандов. В настоящее время НА для клинического применения получают путем экстракции из крови человека. Получение рекомбинантного НА (гНА) в микроорганизмах описано в ЕР 330451 и ЕР 361991.
IV. Фрагменты и варианты полипептидов и полинуклеотидов А.
Фрагменты
Настоящее изобретение также относится к фрагментам белка С-С.ЪР белков альбумина и/или гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим фрагменты белка С-С'.ЪР белков альбумина и/или гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению. Даже если делеция одной или более аминокислот из Νконца белка приводит к модификации или потере одной или более биологических функций белка С-С'.ЪР белка альбумина и/или гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, другие виды терапевтической активности и/или функциональной активности (например, биологическая активность, способность мультимеризоваться, способность связывать лиганд) могут быть сохранены. Например, способность полипептидов с Ν-концевыми делециями индуцировать и/или связываться с антителами, которые распознают полные или зрелые формы полипептидов, в целом обычно сохраняется при удалении менее большинства остатков полного полипептида с Ν-конца. Сохраняет ли конкретный полипептид, в котором отсутствуют Ν-концевые остатки полного полипептида, указанные виды иммунологической активности, можно легко определить рутинными способами, указанными в настоящем описании и иными способами, известными в данной области техники. Возможно, мутантный белок с делетированием большого количества Ν-концевых аминокислотных остатков может сохранять некоторую биологическую или иммуногенную активность. В действительности, пептиды, состоящие из лишь шести аминокислотных остатков, часто могут вызывать иммунный ответ.
Соответственно, фрагменты белка С-С'.ЪР соответствующие части белка С-С'.ЪР гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, включают полноразмерный белок, а также полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков с аминоконца аминокислотной последовательности эталонного полипептида (т.е. белка С-С'.ЪР или части белка С-С'.ЪР гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина). В частности, Ν-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от т до ср где с.] представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в эталонном полипептиде (например, белке С-С'.ЪР или части белка С-С'.ЪР гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению), и т определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до с| минус 6. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Кроме того, фрагменты полипептидов сывороточного альбумина, соответствующие части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, включают полноразмерный белок, а также полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из аминоконца аминокислотной последовательности эталонного полипептида (т.е. сывороточного альбумина или части сывороточного альбумина гибридного белка альбумина). В предпочтительных вариантах реализации Νконцевые делеции могут быть описаны общей формулой от т до 585, где 585 представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в зрелом сывороточном альбумине
- 9 023344 человека, и т определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до 579. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. В дополнительных вариантах реализации Ν-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от т до 609, где 609 представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в полноразмерном сывороточном альбумине человека, и т определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до 603. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Более того, фрагменты гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению включают полноразмерный гибридный белок альбумина, а также полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из аминоконца гибридного белка альбумина, В частности, Ν-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от т до с.], где ц представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в гибридном белке альбумина, и т определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до с| минус 6. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Также, как указано выше, даже если делеция одной или более аминокислот из Ν-конца или С-конца эталонного полипептида (например, белка С-С8Р; белка сывороточного альбумина; или гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению) приводит к модификации или потере одной или более биологических функций белка, другие виды функциональной активности (например, биологическая активность, способность мультимеризоваться, способность связывать лиганд) и/или терапевтической активности по-прежнему могут сохранятся. Например, способность полипептидов с С-концевыми делециями индуцировать и/или связываться с антителами, которые распознают полные или зрелые формы полипептида, обычно сохраняется при удалении менее большинства остатков полного или зрелого полипептида из С-конца. Сохраняет ли конкретный полипептид, в котором отсутствуют Ν-концевые и/или Сконцевые остатки эталонного полипептида, терапевтическую активность, можно легко определить рутинными способами, указанными в настоящем описании и/или иными способами, известными в данной области техники.
Согласно настоящему изобретению также предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца аминокислотной последовательности белка С-С8Р, соответствующего части белка С-С8Р гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до п, где η представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до ц минус 1, и где ц представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в эталонном полипептиде (например, в белке С-С8Р или части белка С-С8Р гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина). Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца аминокислотной последовательности белка альбумина, соответствующего части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до п, где п представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до 584, где 584 представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в зрелом сывороточном альбумине человека минус 1. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до п, где п представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до 608, где 608 представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в сывороточном альбумине минус 1. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Более того, согласно настоящему изобретению предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до п, где п представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до с| минус 1, и где с| представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в гибридном белке альбумина согласно настоящему изобретению. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Кроме того, любые из вышеописанных Ν- или С-концевых делеции могут быть скомбинированы с получением Ν- и С-концевого делетированного эталонного полипептида. Согласно настоящему изобретению также предложены полипептиды, содержащие делецию одной или более аминокислот как из амино-, так и из карбоксиконца, которые в целом могут быть описаны как содержащие остатки от т до п эталонного полипептида (например, белка С-С8Р или части белка С-С8Р гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, или сывороточного альбумина, или части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, или гибридного белка альбумина, или гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина согласно настоящему изобретению), где п и т представляют собой целые числа, как описано выше. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Настоящая заявка также относится к белкам, содержащим полипептиды по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно
- 10 023344
94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичные эталонному полипептиду О-С8Р или эталонному полипептиду альбумина, указанному в настоящем описании, или их фрагментам. В предпочтительных вариантах реализации настоящая заявка относится к белкам, содержащим полипептиды по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичные эталонным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, соответствующую Ν- и С-концевым делециям, описанным выше. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Предпочтительные полипептидные фрагменты согласно настоящему изобретению представляют собой фрагменты содержащие или, в качестве альтернативы, состоящие из аминокислотной последовательности, проявляющей терапевтическую активность и/или функциональную активность (например, биологическую активность) полипептидной последовательности белка О-С8Р или белка сывороточного альбумина, фрагментом которого является данная аминокислотная последовательность.
Другие предпочтительные полипептидные фрагменты представляют собой биологически активные фрагменты. Биологически активные фрагменты представляют собой фрагменты, проявляющие активность, схожую, но не обязательно идентичную активности полипептида согласно настоящему изобретению. Биологическая активность фрагментов может включать улучшенную желаемую активность или сниженную нежелательную активность.
В. Варианты
Термин вариант относится к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте, отличающимся от эталонной нуклеиновой кислоты или полипептида, но сохраняющим их основные свойства. Как правило, варианты в целом очень схожи и во многих областях идентичны эталонной нуклеиновой кислоте или полипептиду.
В настоящем описании термин вариант относится к части белка О-С8Р гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, части альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению или гибридному белку согласно настоящему изобретению, отличающимся по последовательности от белка О-С8Р, белка альбумина и/или гибридного белка альбумина соответственно, но сохраняющим по меньшей мере одно их функциональное и/или терапевтическое свойство, как описано в других разделах настоящего описания или иным образом известно в данной области техники. Как правило, варианты в целом очень схожи и во многих областях идентичны аминокислотной последовательности белка О-С8Р, соответствующего части белка О-С8Р гибридного белка альбумина, белка альбумина, соответствующего части белка альбумина гибридного белка альбумина, и/или гибридного белка альбумина. Нуклеиновые кислоты, кодирующие данные варианты, также включены в настоящее изобретение.
Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим или, в качестве альтернативы, состоящим из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100% идентична, например, аминокислотной последовательности белка О-С8Р, соответствующего части белка О-С8Р гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, белков альбумина, соответствующих части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, и/или гибридных белов альбумина. Также предложены фрагменты данных полипептидов. Дополнительные полипептиды, включенные в настоящее изобретение, представляют собой полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению, в жестких условиях гибридизации (например, гибридизация с фильтр-связанной ДНК в 6х смеси хлорид натрия/цитрат натрия (§§С) при примерно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,2 х §§С, 0,1% додецилсульфата натрия при примерно 5065°С), в очень жестких условиях (например, гибридизация с фильтр-связанной ДНК в 6х смеси хлорид натрия/цитрат натрия (§§С) при примерно 45°С с последующей одной или более промывками в 0,1 х 88С, 0,2% додецилсульфата натрия при примерно 68°С) или в других жестких условиях гибридизации, которые известны специалисту в данной области техники (см., например, Ли5иЬе1, Р. М. е! а1., сЙ5.. 1989 Ситгеи! рго!осо1 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Отееи риЬГОЫид а55оаа1е5, 1пс., и 1ойи \УПеу & §ои5 1пс., №ν Уогк, страницы 6.3.1-6,3,6 и 2.10.3). Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение.
Под полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, 95% - идентичную запрашиваемой аминокислотной последовательности, подразумевают, что указанная аминокислотная последовательность рассматриваемого полипептида идентична запрашиваемой последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может содержать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную запрашиваемой аминокислотной после- 11 023344 довательности, до 5% остатков аминокислот в рассматриваемой последовательности могут быть встроены, удалены или заменены на другую аминокислоту. Данные изменения эталонной последовательности могут происходить в амино- и карбоксиконцевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или где-либо между данными концевыми положениями вперемежку либо по отдельности среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или более смежных групп в пределах эталонной последовательности.
С практической точки зрения, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичным, например, аминокислотной последовательности гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению или его фрагмента (например, части белка О-С8Р гибридного белка альбумина или части альбумина гибридного белка альбумина), может быть определено традиционным методом с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наибольшего полного соответствия между запрашиваемой последовательностью (последовательностью согласно настоящему изобретению) и рассматриваемой последовательностью, также известный как глобальное сопоставление последовательностей, может быть определен с использованием компьютерной программы ΡΆδΤΌΒ на основе алгоритма ВтиИад с1 а1. (Сотр. Арр. Βίοκοί. 6:237-245 (1990)). При сопоставлении последовательностей запрашиваемая и рассматриваемая последовательности либо обе представляют собой нуклеотидные последовательности, либо обе представляют собой аминокислотные последовательности. Результат глобального сопоставления последовательностей выражают в процентах идентичности. Предпочтительные параметры, используемые при выравнивании аминокислот ΡΆδΤΌΒ, представляют собой: Матрица = РАМ 0, к1ир1с=2. Штраф на несовпадение (М18ша1ск РеиаНу) = 1, Штраф на соединение (Зоиипд РеиаНу) = 20, Длина группы рандомизации (Рапбопп/аПоп Огоир ЬеидШ) = 0, Граница отсечения (СиЮГГ Бсоге) = 1, Размер окна (^ίηάον δί/е) = длина последовательности, Штраф на пробел (Оар РеиаНу )= 5, Штраф на размер пробела (Оар δί/е РеиаНу) = 0,05, Размер окна (\νίη6ο\ν δίζε) = 500 или длина рассматриваемой аминокислотной последовательности, в зависимости от того, которая короче.
Если рассматриваемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствие Ν- или С-концевых делеций, а не внутренних делеций, должна быть проведена ручная коррекция результатов. Причина заключается в том, что программа ΡΆδΤΌΒ не учитывает Ν- и С-концевые усечения рассматриваемой последовательности при расчете процента глобальной идентичности. Для рассматриваемых последовательностей, усеченных на Ν- и С-концах, относительно запрашиваемой последовательности, процент идентичности корректируют путем подсчета числа остатков запрашиваемой последовательности, которые являются Ν- и С-концевыми рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не сопоставлены с соответствующим рассматриваемым остатком, в виде процента от общих оснований запрашиваемой последовательности. Совпадает/сопоставлен ли остаток определяют по результатам сопоставления последовательностей ΡΆδΤΌΒ. Затем данный процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного посредством программы ΡΆδΤΌΒ выше, с использованием указанных параметров, с получением конечной величины процента идентичности. Именно данную конечную величину процента идентичности используют для целей настоящего изобретения. Только остатки на Ν- и С-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/сопоставлены с запрашиваемой последовательностью, рассматривают для целей ручной корректировки величины процента идентичности. То есть только запрашиваемые положения остатков за пределами самых дальних Ν- и С-концевых остатков рассматриваемой последовательности.
Например, состоящую из 90 остатков аминокислот рассматриваемую последовательность сопоставляют с состоящей из 100 остатков запрашиваемой последовательностью с определением процента идентичности. Делеция происходит на Ν-конце рассматриваемой последовательности и, следовательно, сопоставление ΡΆδΤΌΒ не показывает совпадение/сопоставление первых 10 остатков на Ν-конце. 10 непарных остатков составляют 10% последовательности (число не совпадающих остатков на Ν- и Сконцах/общее число остатков в запрашиваемой последовательности), поэтому 10% вычитают из величины процента идентичности, рассчитанной программой ΡΆδΤΌΒ. Если бы оставшиеся 90 остатков идеально совпадали, конечный процент идентичности составил бы 90%. В другом примере состоящую из 90 остатков рассматриваемую последовательность сравнивают с состоящей из 100 остатков запрашиваемой последовательностью. В этом примере делеции представляют собой внутренние делеции, поэтому нет остатков на Ν- или С-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой. В данном случае процент идентичности, рассчитанный посредством ΡΆδΤΌΒ, не корректируют вручную. Снова вручную корректируют только положения остатков за пределами Ν- и Сконцевых областей рассматриваемой последовательности, как показано при выравнивании ΡΆδΤΌΒ, которые не совпадают/сопоставлены с запрашиваемой последовательностью. Никаких других ручных корректировок для целей настоящего изобретения выполнять не нужно. Как правило, вариант будет обладать по меньшей мере примерно 75% (в других вариантах реализации по меньшей мере примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99%) идентичности последовательно- 12 023344 стей с длиной нормального белка НА или О-С8Р, который имеет ту же длину, что и указанный вариант. Гомологию или идентичность на уровне нуклеотидной или аминокислотной последовательности определяют путем анализа ВЬА§Т (средство поиска основного локального сопоставления) с применением алгоритма, используемого программами Ыа§1р, Ыа51п. ЫаЧх. 1Ыа51п и 1Ыа51\ (Катки с1 а1., Ргос. №И1. Асай. δοί. И8А 87: 2264-2268 (1990) и Лкскик 1. Мо1. Ενοί. 36: 290-300 (1993), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки), специально разработанными для поиска сходства последовательностей.
Подход, используемый программой ВЬА§Т, заключается в том, чтобы сначала рассмотреть схожие сегменты запрашиваемой последовательности и последовательности из базы данных, затем оценить статистическую значимость всех идентифицированных совпадений и, наконец, суммировать только те совпадения, которые удовлетворяют предварительно выбранному порогу значимости. Для рассмотрения основных вопросов по поиску сходства баз данных последовательностей см. Л115с1ш1 с1 а1., (№ииге Ссис1Ю5 6: 119-129 (1994)), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки.
Поисковые параметры для гистограммы, описаний, выравниваний, ожидания (т.е. порог статистической значимости для сообщения о совпадениях относительно последовательностей из базы данных), отсечения, матрицы и фильтра являются параметрами по умолчанию. Стандартная матрица замен, используемая Ыакф, Ыа81\, 1Ь1а51и и 1Ыак1\ представляет собой матрицу ВЬО§иМ62 (НешкоГГ е1 а1., Ргос. №11. Асай. §ск И8А 89: 10915-10919 (1992), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки). Для Ыа51п матрицу замен устанавливают соотношениями от М (т.е. «премия» для пары совпадающих остатков) до N (т.е. штраф на несовпадающие остатки), при этом значения по умолчанию для М и N представляют собой 5 и -4 соответственно. Четыре параметра Ыа81и могут быть скорректированы следующим образом: 0-10 (штраф на создание делеции (дар стеайои реиайу)); К = 10 (штраф на продолжение делеции (дар е\1еп5юп репа11у)); телик = 1 (генерирует «попадания» в слова в каждом положении даик.кирйк на протяжении запроса); и дарте = 16 (устанавливает ширину окна, в котором получают содержащие делеции сопоставления). Эквивалентные установки параметров В1а51р представляли собой О = 9; К = 2; тешк = 1; и дарте = 32. В сравнении ВеМп последовательностей, доступном в версии пакета ОСО 10,0, используют параметры ДНК ОАР = 50 (штраф на создание делеции (дар стеайои реиаНу)) и ΡΕΝ = 3 (штраф на продолжение делеции (дар еХеикюи реиайу)) и эквивалентные установки при сравнениях белка представляют собой ОАР = 8 и ΡΕΝ = 2.
Варианты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях или обеих областях. Наиболее предпочтительными являются варианты полинуклеотидов, содержащие изменения, которые образуют молчащие замены, добавления или делеции, но не изменяют свойства или виды активности кодируемого полипептида. Предпочтительны варианты нуклеотидов, образованные молчащими заменами из-за вырожденности генетического кода. Более того, предпочтительными также являются варианты полипептидов, в которых менее 50, менее 40, менее 30, менее 20, менее 10 или 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислоты заменены, удалены или добавлены в любой комбинации. Варианты полинуклеотидов могут быть получены по разным причинам, например, для оптимизации экспрессии кодоном для конкретного хозяина (изменение кодонов в мРНК человека на кодоны, предпочтительные для бактериального хозяина, такого как дрожжи или Е. сой). В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению, кодирующий часть альбумина гибридного белка альбумина, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В другом предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению, кодирующий часть белка О-С8Р гибридного белка альбумина, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В еще одном предпочтительном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В альтернативном варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий часть белка О-С8Р гибридного белка альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим белок О-С8Р, в жестких условиях гибридизации, как описано в настоящем описании. В другом варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий часть альбумина гибридного белка альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим белок альбумина, в жестких условиях гибридизации, как описано в настоящем описании. В другом варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий гибридный белок альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим часть белка О-С8Р или часть белка альбумина, в жестких условиях гибридизации, как описано в настоящем описании.
В дополнительном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий часть белка О-С8Р гибридного белка альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности данного белка О-С8Р. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий часть белка альбумина гибридного белка альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности белка альбумина. В альтернативном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий гибридный белок альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности части белка О-С8Р или части
- 13 023344 белка альбумина.
С использованием известных способов белковой инженерии и технологии рекомбинантных ДНК могут быть получены варианты для улучшения или изменения характеристик полипептидов согласно настоящему изобретению. Например, одна или более аминокислот могут быть удалены с Ν-конца или Сконца полипептида согласно настоящему изобретению, по существу, без потери биологической функции. В предпочтительных вариантах реализации варианты согласно настоящему изобретению содержат консервативные замены. Под термином консервативные замены подразумевают замены внутри групп, такие как замена алифатических или гидрофобных аминокислот А1а, Уа1, Ьеи и Не; замена гидроксильных остатков §ет и Таг; замена кислых остатков Акр и С1и; замена амидных остатков Аки и С1и, замена основных остатков Ьук, Агд и Шк; замена ароматических остатков РЬе, Туг и Тгр и замена аминокислот малого размера А1а, 8ет, ТЬг, Ме1 и С1у.
Руководство по получению фенотипически молчащие замены аминокислот приведено, например, в Во\\зе е1 а1., ОешрЬеппд 1Ье Меккаде ίη Рто1еш Зедиеисек: То1егапсе ίο Атшо АсЮ δηΠκίίΙυΙίοηκ. §с1еисе 247:1306-1310 (1990), в котором авторы отмечают, что существует две основные стратегии для исследования толерантности аминокислотной последовательности к изменению.
В первой стратегии используется толерантность к заменам аминокислот со стороны естественного отбора в процессе эволюции. Путем сравнения аминокислотных последовательностей у разных видов могут быть идентифицированы консервативные аминокислоты. Данные консервативные аминокислоты, вероятно, имеют важное значение для функции белка. В отличие от этого положения аминокислот, где замены были допущены естественным отбором, вероятно, не имеют критического значения для функции белка. Таким образом, положения, в которых допускается замена аминокислот, могут быть модифицированы, при этом биологическая активность белка сохраняется. Во второй стратегии для введения изменений аминокислот в конкретных положениях клонированного гена для идентификации областей, имеющих критическое значение для функции белка используется генная инженерия. Например, может быть использован сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (введение единичных мутаций аланина в каждом остатке в молекуле). См. СиишидЬат и ^е11к, 8аеисе 244:1081-1085 (1989). Полученные мутантные молекулы затем могут быть протестированы на биологическую активность.
Как утверждают авторы, данные две стратегии показали, что белки удивительно толерантны к заменам аминокислот. Авторы также показывают, какие изменения аминокислот, вероятно, будут разрешены в определенных положениях аминокислот в белке. Например, для большинства скрытых (в пределах третичной структуры белка) остатков аминокислот необходимы неполярные боковые цепи, тогда как некоторые особенности поверхностных боковых цепей, как правило, сохраняются. Более того, допустимые консервативные замены аминокислот включают замену алифатических или гидрофобных аминокислот А1а, Уа1. Ьеи и 11е; замену гидроксильных остатков §ет и ТЬг; замену кислых остатков Акр и С1и; замену амидных остатков Аки и С1и, замену основных остатков Бук, Агд и Шк; замену ароматических остатков РЬе, Туг и Тгр, и замену аминокислот малого размера А1а, 8ет, ТЬг, Ме1 и С1у. Помимо консервативной замены аминокислот, варианты согласно настоящему изобретению включают (ί) полипептиды, содержащие замены одного или более неконсервативных остатков аминокислот, при этом замененные аминокислотные остатки могут быть или могут не кодироваться генетическим кодом, или (ίί) полипептиды, содержащие замены одного или более остатков аминокислот, содержащих заменяющую группу, или (ίίί) полипептиды, которые были слиты или химически сопряжены с другим соединением, таким как соединение для увеличения стабильности и/или растворимости полипептида (например, полиэтиленгликоль), (ίν) полипептид, содержащий дополнительные аминокислоты, такой как, например, пептид с гибридной областью Рс 1дС. Предполагается, что указанные вариантные полипептиды находятся в рамках компетенции специалиста в данной области техники исходя из идей настоящего описания.
Например, варианты полипептидов, содержащие замены заряженных аминокислот на другие заряженные или нейтральные аминокислоты, могут приводить к образованию белков с улучшенными характеристиками, такими как пониженная агрегация. Агрегация фармацевтических составов одновременно снижает активность и повышает клиренс вследствие иммуногенной активности агрегата. См. РтскатД е1 а1., С1ш. Ехр. 1ттиио1. 2:331-340 (1967); РоЪЫик е1 а1., 01аЬе1ек 36: 838-845 (1987); С1е1аиД е1 а1., СгЪ. Кеу. ТЬетареиЬс Эгид Сатег 5>ук1етк 10:307-377 (1993).
В конкретных вариантах реализации полипептиды согласно настоящему изобретению содержат или, в качестве альтернативы, состоят из фрагментов или вариантов аминокислотной последовательности гибридного белка альбумина, аминокислотной последовательности белка С-С8Р и/или сывороточного альбумина человека, при этом указанные фрагменты или варианты содержат 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 1050 и 50-150 присоединений, замен и/или делеций остатков аминокислот по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью. В предпочтительных вариантах реализации замены аминокислот являются консервативными. Нуклеиновые кислоты, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Полипептид согласно настоящему изобретению может состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидные изостеры, и могут содержать аминокислоты, отличные от 20 генетически кодируемых аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы либо естественными путями, такими как по- 14 023344 сттрансляционный процессинг, или в соответствии с технологиями химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. Указанные модификации хорошо описаны в базовых учебниках и в более подробных монографиях, а также в обширной исследовательской литературе. Модификации могут происходить в любом месте полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксиконцы. Очевидно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степени в нескольких участках в данном полипептиде. Кроме того, конкретный полипептид может содержать много типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинилирования и они могут быть циклическими с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут являться проуктом посттрансляционных естественных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, сшивание, Циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СР1-«якоря». гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинилирование. (См., например, ΡΚ.ΟΤΕΙΝ3-3ΤΚ.υθΓυΚΕ и МОЬЕСиЬАК ΡΚΟΡΕΚΤΙΕ3, 2пй Εύ., Τ. Ε. Сге^Шои, Н. Ргеетап и Сотрапу, Яе\\ Уогк (1993); ΡΟ3ΤΤΚΑΝδΕΑΤΙΟΝΑΕ СОУАЕЕЯТ ΜΟΌΙΕΚΆΤΙΟΝ ОР ΡΚΟΤΕΙΝ8, В. С 1окп8оп, Εύ., Асайетю Рге§5, Яем Уогк, пг8. 1-12 (1983); Зейег е! а1., МеШ. Εη/уток 182:626-646 (1990); Кайап е! а1., Апп. Ν.Υ. Асай. Зс1. 663:4862 (1992)). С. Функциональная активность
Термин полипептид, обладающий функциональной активностью относится к полипептиду, способному проявлять один или более видов известной функциональной активности, ассоциируемой с полноразмерным белком, про-белком и/или зрелой формой белка О-СЗР. Указанные виды функциональной активности включают, но не ограничиваются перечисленными: биологическую активность, антигенность [способность связываться (или конкурировать с полипептидом за связывание) с антителом к полипептиду], иммуногенность (способность вызывать образование антитела, которое связывается с конкретным полипептидом согласно настоящему изобретению), способность образовывать мультимеры с полипептидами согласно настоящему изобретению и способность связываться с рецептором или лигандом полипептида. Термин полипептид, обладающий биологической активностью относится к полипептиду, проявляющему активность, близкую к, но не обязательно идентичную активности белка О-СЗР согласно настоящему изобретению, включая зрелые формы, измеряемую в конкретном биологическом анализе с зависимостью от доз или без нее. В предпочтительных вариантах реализации гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере одним видом биологической и/или терапевтической активности, связанной с частью белка О-СЗР (или его фрагментом или вариантом), не гибридизованного с альбумином.
Гибридные белки альбумина согласно настоящему изобретению могут быть исследованы на функциональную активность (например, биологическую активность) с использованием тестов, известных в данной области техники, или их рутинных модификаций, а также тестов, указанных в настоящем описании. Кроме того, специалист в данной области техники может рутинным способом исследовать фрагменты белка О-СЗР, соответствующие части белка О-СЗР гибридного белка альбумина. Кроме того, специалист в данной области техники может рутинным способом исследовать фрагменты белка альбумина, соответствующие части белка альбумина гибридного белка альбумина, на активность с использованием тестов, известных в данной области техники, и/или как описано в разделе Примеры ниже.
Например, в одном из вариантов реализации, в котором анализируют способность гибридного белка альбумина связывать или конкурировать с белком О-СЗР за связывание с антителом к полипептиду ОСЗР и/или антителом к альбумину, могут быть использованы различные иммуноанализы, известные в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленными: системы конкурентного и бесконкурентного анализа с использованием таких технологий, как радиоиммуноанализы, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы типа сэндвич, иммунорадиометрические анализы, гель-диффузионные реакции осаждения, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы ш Ши (с использованием коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток, например), вестерн-блоттинг, реакции осаждения, реакции агглютинации (например, реакции агглютинации в геле, реакции гемагглютинации), реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, тесты с белком белка А и исследования методом иммуноэлектрофореза и т.д. В одном из вариантов реализации связывание антитела обнаруживают путем детектирования метки на первичном антителе. В другом варианте реализации первичное антитело обнаруживают путем детектирования связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В другом варианте реализации вторичное антитело метят. В данной области техники известно много способов детектирования связывания в иммуноанализе и они входят в объем
- 15 023344 настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте реализации, в котором идентифицируют партнера по связыванию (например, рецептор или лиганд) белка О-С8Р, можно анализировать связывание с данным партнером по связыванию посредством гибридного белка альбумина, который содержит данный белок О-С8Р в качестве части белка О-С8Р указанного гибрида, например, способами, хорошо известными в данной области техники, такими как, например, восстанавливающая и невосстанавливающая гель-хроматография, аффинная хроматография белков и аффинный блоттинг. См., в целом, РЫ/юку с1 а1., МюгоЬюк Кеу. 59:94123 (1995). В другом варианте реализации способность физиологических коррелятов гибридного белка альбумина связываться с рецептором (рецепторами) полипептида С-С8Р, соответствующего части белка С-С8Р указанного гибрида, можно рутинным способом анализировать с использованием технологий, известных в данной области техники.
В альтернативном варианте реализации, в котором оценивают способность гибридного белка альбумина мультимеризоваться, можно анализировать связывание с другими компонентами мультимера, например, методами, хорошо известными в данной области техники, такими как, например, восстанавливающая и невосстанавливающая гель-хроматография, аффинная хроматография белков и аффинный блоттинг. См., в целом, Р1й/1ску е1 а1., выше.
Иммуноанализы, которые могут быть использованы для анализа белкового связывания, перекрестной реактивности, или идентичности, включают, но не ограничиваются перечисленными: системы конкурентного и бесконкурентного анализа с использованием технологий, таких как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы сэндвич-типа, реакции иммуноосаждения, реакции осаждения, гель-диффузионные реакции осаждения, иммунодиффузионные анализы, реакции агглютинации, реакции связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и анализы белка А, и другие. Указанные анализы являются рутинными и хорошо известны в данной области техники (см., например, Аи8иЬе1 е1 а1., еЙ5. 1994, СиггеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, νοί. 1, ίοΐιη \УНеу & δοηδ, 1пс., Ые\у Уогк, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки).
Антитела, которые связывают белок С-С8Р, соответствующий части белка С-С8Р гибридного белка альбумина, также могут быть описаны или охарактеризованы в терминах их аффинности к связыванию в отношении данного белка или антигена, предпочтительно антигена, который они специфично связывают. Предпочтительные значения аффинности связывания включают значения с константой диссоциации или Κά менее 5 χ 10-2 М, 10-2 М, 5 χ 103 М, 103 М, 5 χ 10-4 М, 10-4 М. Более предпочтительные значения аффинности связывания включают значения с константой диссоциации или Κά менее 5 χ 10-5 М, 10-5 М, 5 χ 10-6 М, 10-6 М, 5 χ 10-7 М, 10-7 М, 5 χ 10-8 М или 10-8 М. Еще более предпочтительные значения аффинности к связыванию включают значения с константой диссоциации или Κά менее 5 χ 10-9 М, 10-9 М, 5 χ 1010 М, 10-10 М, 5 χ 10-11 М, 10-11 М, 5 χ 10-12 М, 10-12 М, 5 χ 10-13 М, 10-13 М, 5 χ 10-14 М, 10-14 М, 5 χ 10-15 М или 10-15 М. Кроме того, тесты, указанные в настоящем описании или другие, известные в данной области техники, можно рутинно использовать для измерения способности гибридных белков альбумина и их фрагментов, вариантов и производных, вызывать биологическую активность и/или активность С-С8Р (либо ίη уйго, либо ίη νί\Ό), связанную или с частью белка С-С8Р и/или частью альбумина гибридного белка альбумина. Другие способы известны специалисту в данной области техники и входят в объем настоящего изобретения.
V. Гибридные белки С-С8Р и ΗδΑ
Рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (гНА-О-С8Р) представляет собой аналог С-С8Р. Примеры ГНА-О-С8Р описаны в патенте США № 5665863 и в патенте США Ыо. 7041478, оба из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Другой пример гНА-С-С8Р представляет собой Нейгранин® (ЫЕИО), разработанный компанией Τеνа ВюрЬагтасеШгсаИ И8А ЬТИ. ЫЕИО представляет собой гибридный полипептид с молекулярной массой приблизительно 85 кДа. ЫЕИО представляет собой одноцепочечный полипептид из 759 аминокислот, где остатки 1-585 соответствуют зрелой форме Н8А, и остатки 586-759 соответствуют зрелой форме О-С8Р человека. Последовательность аминокислот гибридного белка ЫЕИО показана на фиг. 1.
VI. Получение гибридного белка
Примеры способов синтетических процессов производства гНА-О-С8Р описаны в заявке на патент США 11/929828, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации ЫЕИО получают с использованием хозяйской системы на основе дрожжей (например, БассЬаготусек сегеу151ае), созданной методами генной инженерии для экспрессии гибридного белка ЫЕИО. ЫЕИО собирают из сбраживаемой среды дрожжевой культуры и очищают с использованием методов, хорошо известных в данной области техники (например, путем серии этапов хроматографии и фильтрации, таких как аффинная хроматография и ионообменная хроматография).
В одном из неограничивающих примеров гибридную конструкцию ЫЕИО получали следующим образом. Полноразмерную кДНК альбумина выделяли из библиотеки кДНК человека в лаборатории д-ра.
- 16 023344
Р.Е. Вага11е в Оксфордском университете, Великобритания. Данный клон отправляли в Эе11а Вю1есйпо1оду Ытйей, Ноттингем, Великобритания, в виде плазмиды рЛТ153ЛЬВ. Кроме того, модифицировали состоящий из 6 аминокислот пропептид Н8А (КОУРКГО) для обеспечения более эффективного процессинга в дрожжах (Р8БОКР).
Плазмида для получения ЫЕИО, модифицированный вектор экспрессии, основанный на р8ЛС35, основана на 2-мкм плазмиде, обнаруженной в 8ассйаготусе8 сегеу181ае дикого типа. Вектор экспрессии на основе Р8АС35 (см., например, патенты ЕР 286424 В, патент США 5637504) содержит ген ЬЕШ из 8ассйаготусе§ сегеу181ае в качестве селектируемого маркера, который дополняет дефицит лейцина хозяина 8. сегеу181ае для получения. Данная плазмида для получения также содержит сильный дрожжевой промотор, РКВ1, и последовательности плазмиды рИС9, обеспечивающие клонирование и воспроизводство в Е. сой. Кроме того, указанная плазмида устраняет последовательности из рИС9, необходимые для воспроизводства в Е. Сой, сразу после трансформации в дрожжи. Это достигается путем фланкирования распознающих РЬР мишеней (РРТ) и экспрессии рекомбиназы РЬР дрожжей с плазмиды после попадания в дрожжи. Таким образом, в организме, используемом для получения ЫЕИО, не присутствует бактериальная ДНК. Это подтверждено путем выделения и секвенирования 2 мкм плазмиды из дрожжей после получения главного банка клеток. Как описано выше, плазмиду для получения ЫЕИО, называемую СГО1643 (р8АС35:Н8А.ОС8Р(Т31-Р204)), получали из вектора экспрессии на основе р8АС35. Область, соответствующую Т31-Р204 О-С8Р человека, амплифицировали путем ПЦР при добавлении подходящих 5' и 3' сайтов рестрикции с обеспечением гладкого слияния с 3'-концом открытой рамки считывания Н8А.
Флаконы с затравкой ЫЕИО использовали для получения главного банка клеток сОМР в Нитап Оепоте 8с1епсе§, 1пс., в Роквилле, Мэриленд. Тестирование и исследование основного банка клеток ЫЕИО выполняли в Сйаг1е8 Р1уег йаЬогаЮпех (Малверн, Пенсильвания, США) и Ьагк Тесйпо1од1е8 (Хьюстон, Техас, США) согласно руководству 1СН Ο5Ω (Выделение и характеристика клеточных субстратов, используемых для производства биотехнологических/биологических продуктов).
Затем получали рабочий банк клеток сОМР, полученный из основного банка клеток, и тестировали его в Сйаг1е8 Ктуег й-аЬогаЮпех (Малверн, Пенсильвания, США). Все компоненты сред, применяемые в производстве банков линий клеток ЫЕИО, были синтетическими, биосинтетическими или растительного происхождения. В ходе получения линии клеток или банка клеток не использовали компоненты животного или человеческого происхождения.
Банки клеток хранят при температуре <-135°С в средах для криоконсервирования в предварительно стерилизованных 1,8 мл полипропиленовых пробирках Ыипс с винтовыми с внутренней стороны крышками.
Неограничивающий типичный способ выделения, очищения и приготовления гибридного белка гН8А-О-С8Р для фармацевтического применения показан на фиг. 21. Состав лекарственного вещества асептически фильтруют с использованием 0,2 мкм фильтра в автоклавированные тефлоновые бутылки. Наполненное жидкостью лекарственное средство хранят в замороженном виде при температуре примерно -80°С (номинальное значение, приемлемый диапазон температур хранения составляет до -65°С). Для улучшения устойчивости состава для перевозки и хранения в клинических базах, а также для обеспечения стабильности продукта с ожидаемым долгим сроком хранения, ЫЕИО может также быть лиофилизирован способами, хорошо известными в данной области техники.
VII. Примеры причинылейкопении и нейтропении
Как описано выше, лейкопения представляет собой снижение количества циркулирующих лейкоцитов (белых клеток крови, \УВС). а нейтропения характеризуется пониженным содержанием нейтрофилов крови, которое часто приводит к повышенной чувствительности к бактериальным или грибковым инфекциям. Далее следует неполный список факторов, на основании которых субъекта идентифицируют как имеющего риск развития лейкопении или нейтропении: прием лекарственных средств (например, фенитоина, хлорамфеникола, сульфамидных лекарственных средств и химиотерапевтических лекарственных средств); дефицит витамина В12 или дефицит фолатов; чрезмерное потребление алкоголя; рак или другие заболевания, которые поражают костный мозг (например, гипопластическая анемия, дисгаммаглобулинемия, ночная пароксизмальная гемоглобинурия, миелодисплазия, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, лейкемия, миелома, лимфома или метастатические солидные опухоли, которые инфильтрируют и замещают костный мозг); вирусные инфекции (например, грипп, ВИЧ, ранние стадии инфекционного мононуклеоза, детские вирусные заболевания); бактериальные инфекции (например, туберкулез); облучение; токсины (например, бензол и инсектициды); недостаточность костного мозга (например, Синдром Швахмана-Даймонда, хряще-волосяная гипоплазия, врожденный дискератоз, болезнь накопления гликогена 1В типа); повреждение селезенки, спленомегалия любой этиологии; врожденные дефекты миелоидных клеток или их предшественников; аллергические заболевания; аутоиммунные заболевания; Т-γ лимфопролиферативное заболевание (Т-γ ЛПЗ); гемодиализ или трансплантация; токсины.
Многочисленные лекарственные средства, которые используют в различных химиотерапевтических
- 17 023344 схемах лечения (например, схемах цитотоксической химиотерапии), связаны с высоким риском развития фебрильной нейтропении (например, > чем 20% риском). При использовании некоторых схем химиотерапии частота возникновения фебрильной нейтропении в отсутствие лечения О-С8Р составляет примерно 40% (например, схема химиотерапии, включающая внутривенное введение доксорубицина и доцетаксела). Неограничивающие примеры различных раковых заболеваний и схем лечения, связанных с риском развития фебрильной нейтропении, приведены ниже в табл. 1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гибридный белок Н8А-О-С8Р, показанный на фиг. 1, вводится пациенту для предотвращения, лечения или облегчения нейтропении, связанной с введением указанных лекарственных препаратов.
Таблица 1: Типичные раковые заболевания и схемы лечения, связанные с развитием фебрильной нейтропении
Рак Терапия
Рак мочевого пузыря МУАС (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин) (неоадъювантная, адъювантная, противометастатическая)
Рак молочной железы Доцетаксел + трастузумаб (противометастатическая или заместительная)
Рак Терапия
Плотнодозоваятерапия АС- Т (доксорубицин, Циклофосфамид, паклитаксел) (адъювантная) АТ (доксорубицин, паклитаксел) (противометастатическая или заместительная) АТ (доксорубицин, доцетаксел) (противометастатическая или заместительная) ТАС (доцетаксел, доксорубицин, Циклофосфамид) (адъювантная)
Рак пищевода и желудка Доцетаксел/цисплатин/фторурацил
Неходжкинская лимфома 1СЕ (изосфамид, карбоплатин, этопозид) (диффузная Вкрупноклеточная лимфома, периферические Т-клеточные лимфомы, терапия второй линии, резервная терапия) К1СЕ (ритуксимаб, изосфамид, карбоплатин, этопозид) СНОР-14 (Циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон) ΜΙΝΕ (месна, изосфамид, новантрон и этопозид) (диффузная В-крупноклеточная лимфома, периферические Т-клеточные лимфомы, терапия второй линии, рефрактерная терапия) ϋΗΑΡ (дексаметазон, цисплатин, цитарабин) (диффузная Вкрупноклеточная лимфома, периферические Т-клеточные лимфомы, терапия второй линии) Е8НАР (этопозид, метилпреднизолон, цисплатин, цитарабин) (диффузная В-крупноклеточная лимфома, периферическая Тклеточная лимфома, рецидивирующее раковое заболевание, терапия второй линии) ВЕАСОРР (блеомицин, этопозид, доксорубицин, Циклофосфамид, винкристин, прокарбазин, преднизон) ГиперСУАО + Ритуксимаб (Циклофосфамид, винкристин, доксорубицин, дексаметазон + ритуксимаб) (лимфома Беркитта)
Меланома Комбинация, включающая дакарбазин (дакарбазин, цисплатин, винбластин) (прогрессирующее, метастазирующее или рецидивирующее раковое заболевание) Комбинация, включающая дакарбазин и 1Ь-2, интерферональфа (дакарбазин, цисплатин, винбластин, 1Ь-2, интерферональфа) (прогрессирующее, метастазирующее или рецидивирующее раковое заболевание)
Миелодиспластический синдром Децитабин
Рак яичников Топотекан Паклитаксел Доцетаксел
Рак селезенки Г емцитабин/доцетаксел
Саркома МАШ (месна, доксорубицин, изосфамид, дакарбазин) Доксорубицин
Мелкоклеточный рак Топотекан
Рак Терапия
легких
Рак яичек Уе1Р (винбластин, изосфамид, цисплатин) У1Р (этопозид,изосфамид, цисплатин) ВЕР (блеомицин, этопозид, цисплатин) ТГР (паклитаксел, изосфамид, цисплатин)
- 18 023344
Схемы цитотоксического лечения мелкоклеточного рака легких, например, цисплатин + этопозид, также как и САЕ, тоже связаны с развитием фебрильной нейтропении.
Известны различные виды нейтропении, и согласно некоторым вариантам реализации изобретения гибридный белок Н8А-С-С8Р, показанный на фиг. 1, применяется для предотвращения, лечения или облегчения одного или более видов нейтропении, включая (но не ограничиваясь указанными) вызванную химиотерапией нейтропению, первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, Циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению или имммуно-опосредованную нейтропению.
VIII. Экспериментальные примеры
Следующие примеры приведены целью иллюстрации настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными условиями или деталями, описанными в приведенных примерах. Содержание всех общедоступных документов, ссылки на которые приведены в настоящем описании, включая (но не ограничиваясь указанными) патенты США, включено в настоящее описание посредством ссылки.
В следующих неограничивающих примерах Нейгранин® (ΝΕυΌ) тестировали на клеточных линиях, на мышах и обезьянах и также использовался для предотвращения, лечения и облегчения нейтропении и/или лейкопении, вызванной лекарственной терапией (например, химиотерапией), у субъектов, представляющих собой людей, для лечения рака молочной железы.
№ИС представляет собой аналог С-С8Р, у которого скорость плазматического клиренса снижена благодаря слиянию активного соединения С-С8Р с сывороточным альбумином человека. Полученный в результате полноразмерный рекомбинантный белок сохраняет фармакологическую активность С-С8Р ίη νίνο, т.е. стимулирует мобилизацию нейтрофилов и гематопоэтических стволовых клеток из костного мозга в периферический кровоток. Оценивали активность указанного белка у мышей и обезьян (см. Экспериментальные примеры, ниже). Наблюдаемое повышение уровня нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников происходило быстро и сохранялось в течение нескольких дней после однократного введения. Эффекты являлись дозозависимыми, при этом более высоким дозам соответствовал более интенсивный и продолжительный ответ на введение ΝΕΌΌ по сравнению с ответом на более низкие дозы. Клиренс ΝΕΌΌ был медленнее, чем клиренс Нейпогена® (филграстима). Кинетика нейтрофилии крови после однократного и многократного введения №ИС была почти такой же, как у животных, получающих лечение Нейластой® (пэгфилграстимом). Так как ΝΕΌΌ в 4,5 раз больше Нейласты® (пэгфилграстима) (по массе), для достижения подобного эффекта ίη νίνο может применяться большая (по массе), но эквимолярная доза ΝΕυΠ У обезьян эквимолярная доза ΝΕΌΌ оказывала эквивалентный пэгфилграстиму эффект, а у мышей было показано, что доза ΝΕυΠ превышающая в 1,5 раза дозу пэгфилграстима, приводила к достижению эквивалентной АиСЛКС. В указанных исследованиях 1 мг Нейласты® (пэгфилграстима) был эквивалентным по эффекту 4,5-7,7 мг ΝΕυΠ При этом максимальная доза, не приводящая к развитию наблюдаемых нежелательных явлений (ΝΘΑΕΡ), для ИРиС у обезьян составляла более 1 мг/кг/неделю. Доза 1 мг/кг оказывала в ~12 раз большее воздействие (Стах и АиС) у обезьян, чем у людей, получающих 0,45 мг/кг ΝΕυ& Таким образом, ΝΘΑΕΡ, показанная для обезьян, превышает диапазон доз, используемый для клинической оценки №иС (см. ниже).
В совокупности данные исследований показывают, что эквимолярные дозы NΕиС обеспечивают фармакологический эффект, близкий к эффекту Нейласты® (пэгфилграстиму) и оказывают такие же эффекты на популяцию гранулоцитов у человека.
А. Ш νίίτο и ίη νίνο исследования NΕиС
Далее следует обзор результатов исследований NΕиС ίη νίίτο и ίη νίνο, которые подробно описаны в Экспериментальных примерах, ниже. Ш νίίτο фармакологические исследования показали следующее:
1) NΕиС вызывает пролиферацию клеток линии ΝΡ8-60 дозозависимым образом.
2) NΕиС является в ~3 раза менее активным, чем Нейпоген® (филграстим) ίη νίίτο.
3) NΕиС эквивалентен Нейласте® (пэгфилграстиму) при оценке на основе молярных количеств (1 мг Нейласты® (пэгфилграстима) эквивалентен по эффекту 4,5 мг №иС).
На основании ίη νίνο фармакологических исследований были определены следующие свойства ΝΕυ&
1) NΕиС хорошо переносится мышами и яванскими макаками.
2) У мышей однократное введение №иС вызывает дозозависимое быстрое и продолжительное увеличение содержания нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови. При сравнении с имеющимися на рынке продуктами С-С8Р было показано, что повышение содержания нейтрофилов и клеток-предшественников при использовании NΕиС было более продолжительным, чем при использовании эквимолярной дозы Нейпогена® (филграстима), и идентичным использованию эквимолярной дозы Нейласты® (пэгфилграстима) по продолжительности и интенсивности.
3) У мышей эквивалентные эффект и ЛиСлХС достигались при дозе ΝΕυΠ в 7,7 раз превышающей
- 19 023344 дозу Нейласты® (пэгфилграстима).
4) У мышей с индуцированной 5-Ρυ нейтропенией однократные инъекции эквимолярных доз ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) приводили к эффективному ускорению восстановления нейтрофилов с идентичной кинетикой и выраженностью эффекта.
5) Однократные и многократные (один раз в неделю) дозы ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) вызывают одинаковое увеличение содержания периферических нейтрофилов у обезьян. При эквимолярных дозах как интенсивность, так и продолжительность повышения содержания нейтрофилов у обезьян были одинаковыми для животных, получающих лечение Нейластой® (пэгфилграстимом), и животных, получающих лечение ΝΕυΟ.
6) Как у мышей, так и обезьян ΝΕυΟ имеет более медленный клиренс, более длинный конечный период полувыведения и большее среднее время удержания, чем Нейпоген® (филграстим) при IV или §С введении.
7) У яванских макак конечный период полувыведения ΝΕυΟ (12,6 ч) приблизительно на 33% длиннее, чем у Нейласты® (пэгфилграстима) (9,49 ч) после 8С инъекции, и клиренс по отношению к биодоступности (СЬ/Р) для ΝΕυΟ составляет примерно половину значения СЬ/Р для Нейласты® (пэгфилграстима).
8) Клиренс ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) медленнее у мышей с 5-Ρυ-индуцированной цитопенией, чем у нормальных мышей, что указывает на то, что в выведение обоих белков вносит вклад рецептор-опосредованный клиренс.
9) Почечное выведение (показано на крысах) вносит значительный вклад в клиренс Нейпогена® (филграстима), вносит незначительный вклад в клиренс Нейласты® (пэгфилграстима) и не вносит значительного вклада в клиренс ΝΕυΟ.
10) ΝΕυΟ, белок человека, образованный из сывороточного альбумина человека и колониестимулирующего фактора человека, является иммуногенным у мышей и яванских макак. Нейласта® (пэгфилграстим) вызывала такую же заболеваемость и титр антител у обезьян. Антитела некоторых обезьян, получающих лечение ΝΕυΟ и Нейластой® (пэгфилграстимом), были нейтрализующими ш νίίτο, при этом как в случае ΝΕυΟ, так и в случае Нейласты® (пэгфилграстима), ответ нейтрофилов снижался при повторном воздействии, при этом у животных, положительных на присутствие антител, исходный уровень нейтрофилов был таким же, как уровень нейтрофилов у животных, отрицательных по присутствию антител, в течение периода восстановления.
Взятые вместе данные по фармакологическим свойствам ΝΕυΟ ш νίίτο и ш νίνο дают основания полагать, что ΝΕυΟ действует аналогичным Нейпогену® (филграстиму) и Нейласте® (пэгфилграстиму) образом в обеспечении мобилизации нейтрофилов и гематопоэтических клеток в кровоток. Неограничивающие экспериментальные примеры ш νίίτο и ш νίνο описаны ниже.
Пример 1. Пролиферация клеток ΝΡδ-60
ΝδΡ-60 представляет собой клеточную линию, обычно используемую в биологических тестах для измерения активности Ο-СЗР. Скорость пролиферации указанной клеточной линии повышается в ответ на введение С-С'ЪР. Сравнивали относительную активность рекомбинантого С-С8Р (Нейпогена®, филграстима) и ΝΕυΟ. Для измерения эффективности ΝΕυΟ и Нейпогена® (филграстима) в отношении стимуляции пролиферации клеток ΝΡδ-60 измеряли включение Н-тимидина через 24 ч после воздействия ряда концентраций указанных аналогов. Получали значения ЕС50, которые выражали в единицах массы (нг/мл).
Вкратце, 1х 10 клеток ΝΡδ-60 на лунку высевали на 96-луночные планшеты в конечном объеме 200 мкл полной среды, включающей указанное количество ΝΕυΟ (также называемого альбугранином) или Нейпогена® (филграстима). Все образцы тестировали трижды. Клетки инкубировали при температуре 30° С в течение 24 ч и вводили в течение последних 4 ч 0,5 мкКи 3Н-тимидина на лунку. Включение тимидина использовали для измерения пролиферации (фиг. 8).
ΝΕυΟ и Нейпоген® (филграстим) стимулировали пролиферацию дозозависимым образом. В настоящем анализе Нейпоген® (филграстим) являлся в 15 раз более активным, чем ΝΕυΟ при сравнении на основе массы. ΝΕυΟ в ~4,5 раза больше (по массе) Нейпогена® (филграстима), таким образом, при расчете на основе молярных количеств в настоящем анализе ΝΕυΟ являлся в ~3 раза менее активным, чем Нейпоген® (филграстим) ш νίίτο.
Нейласту® (пэгфилграстим) аликвотировали на основе массы рекомбинантного С-С'ЪР. массу модифицированного полиэтиленгликоля не включали в расчет дозировки. ΝΕυΟ в 4,5 раза больше рекомбинантного С-С'ЪР из-за вклада массы ΗδΑ, и, таким образом, для сравнения способности ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) стимулировать пролиферацию клеток ΝΡδ-60 использовали титры эквимолярных доз ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) и значения ΕС50 выражали как молярные концентрации. Вкратце, 1 х 10 ΝΡδ-60 клеток/лунку высевали на 96-луночные планшеты в конечном объеме 200 мкл полной среды, содержащей указанное количество ΝΕυΟ (альбугранина) или Нейласты® (пэгфилграстима). Все образцы тестировали трижды. Клетки инкубировали при температуре 37°С в течение 20 ч и вво- 20 023344 дили в течение последних 4 ч 0,5 мкКи 3Н -тимидина на лунку. Включение тимидина использовали для измерения пролиферации. Результаты показаны на фиг. 9.
Пример 2. Сравнение ΝΕυΟ и Нейпогена® (филграстима) у мышей ΒΌΡ-1
Целью настоящего исследования была оценка эффекта однократных доз ΝΕυΟ при его подкожном введении на нейтрофилы и гематопоэтические стволовые клетки периферической крови у мышей ΒΌΡ-1. Мышей ΒΌΡ-1 инъецировали подкожно (8С) однократной дозой ΝΕυΟ при 3 уровнях дозы (0,25, 1,25 или 5,0 мг/кг) или Нейпогеном® (филграстимом) при 2 уровнях дозы (0,25 и 1,25 мг/кг). Гранулоциты (Ог,1+) и гематопоэтические клетки-предшественники (ο-ΡίΙ1) периферической крови оценивали количественно с помощью проточной цитометрии ежедневно с 1 дня до 5 дня и сравнивали с данными для животных, получающих плацебо (среду без тестируемого соединения).
Как ΝΕυΟ, так и Нейпоген® (филграстим) вызывали повышение содержания нейтрофилов в периферической крови по сравнению с животными, получающими плацебо, но кинетика и интенсивность ответа различались (фиг. 10). В группах, получающих Нейпоген® (пэгфилграстим), максимальное 3кратное увеличение содержания нейтрофилов происходило на 1 день, и число нейтрофилов возвращалось к нормальному уровню ко 2 дню. Хотя однократное введение ΝΕυΟ приводило к такому же повышению содержания нейтрофилов, что и введение сопоставимых доз Нейпогена® (филграстима), число нейтрофилов, напротив, продолжало увеличиваться в группах, получающих ΝΕυΟ, причем выход на максимум кинетики и величины был дозозависимым. Дозы ΝΕυΟ 0,25, 1,25 и 5,0 мг/кг приводили к максимальному содержанию нейтрофилов в 5,4, 10 и 24 раз выше, чем у животных, получающих лечение средой. Более низкие две дозы вызывали максимальное повышение содержания нейтрофилов на 2 день, тогда как самая высокая тестируемая доза приводила к максимальному содержанию на 4 день. Число нейтрофилов возвращалось к нормальному уровню на 3, 4 и 5 день для при введении доз ΝΕυΟ 0,25, 1,25 и 5,0 мг/кг, соответственно (фиг. 10). Как показано на фиг. 10, увеличение содержания нейтрофилов в периферической крови, вызванное введением ΝΕυΟ, было более выраженным и более длительным, чем вызванное введением Нейпогена® (филграстима).
Влияние лечения ΝΕυΟ и Нейпогеном® (филграстимом) на содержание периферических гематопоэтических (с-ЮР) стволовых клеток в настоящем исследовании были аналогичны результатам, полученным для нейтрофилов периферической крови (фиг. 11). Эффект ΝΕυΟ был дозозависимым и близким к эффекту сопоставимых доз Нейпогена® (филграстима) на 1 день, но продолжал усиливаться на 2-4 день во всех лечебных группах, возвращаясь к задаваемой контролем, получавшим среду, базовой линии к 5 дню. Как показано на фиг. 11, вызванное ΝΕυΟ увеличение содержания клеток с-кй' было более выраженным и продолжительным, чем вызванное введением Нейпогена® (филграстима).
Пример 3. Сравнение ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) у мышей ΒΌΡ-1
Целью настоящего исследования являлось сравнение эффекта однократных подкожных (§С) инъекций ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) на нейтрофилы и гематопоэтические клеткипредшественники в периферической крови у мышей ΒΌΡ-1. Оценку проводили путем инъецирования мышам ΒΌΡ-1 (п=5) однократных доз ΝΕυΟ 5 или 10 мг/кг. Эффект ΝΕυΟ сравнивали с эффектом эквимолярных доз пэгфилграстима (Нейласты®) (1,12 и 2,24 мг/кг) при однократном введении. Две указанные дозы Нейласты® (пэгфилграстима) и ΝΕυΟ являются приблизительно эквимолярными. Результаты показаны на фиг. 12. Однократное введение ΝΕυΟ (5 и 10 мг/кг) или Нейласты® (1,12 и 2,24 мг/кг) приводило к эффективному увеличению количества гранулоцитов и гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови у мышей ΒΌΡ-1. В указанном эксперименте максимальная мобилизация периферических гранулоцитов происходила на 3 день (в случае использования ΝΕυΟ в дозе 5 мг/кг) и на 4 день (в случае использования ΝΕυΟ в дозе 10 мг/кг). Содержание гранулоцитов возвращалось к нормальному уровню на 6 день после проведения лечения ΝΕυΟ. У мышей, которым вводили однократную дозу Нейласты® (пэгфилграстима), максимальная мобилизация гранулоцитов происходила на 4 день. У мышей, получающих Нейласту® (пэгфилграстим) в дозе 2,25 мг/кг, на 6 день после введения лекарственного средства значение ΑNС было все еще значительно (р=0,036) выше, чем исходное, а абсолютное число нейтрофилов (ΑΝΟ) у мышей, получающих дозу 1,12 мг/кг, возвращалось к норме на 6 день (фиг. 12А).
Для оценки относительной активности у мышей рассчитывали площади под фармакодинамическими (ΡΌ) кривыми (Αυθ™ε) В зависимости от молярной эквивалентной дозы (нмоль/кг) (фиг. 12В). Линии ответа на дозу были параллельны, что указывает на то, что АЦС^ является приемлемым объектом сравнения в указанной модели. АЦС^, по-видимому, являлись дозозависимыми для обоих аналогов С-САР В указанном эксперименте относительная активность нейласты по отношению к ΝΕυΟ на основе массы составляла 7,7. То есть, 1 мг Нейласты® (пэгфилграстима) (при дозировании в клинике на основе массы гЮ-СВР) эквивалентен по эффекту 7,7 мг ΝΕυΟ, что в -1,5 раз превышает разницу по молекулярной массе между ΝΕυΟ и Нейластой® (пэгфилграстимом), составляющую 4,5 раз.
Однократное введение ΝΕυΟ или Нейласты® (пэгфилграстима) приводило к значительному (р<0,05) увеличению общего число гематопоэтических предшественников в периферической крови (фиг.
- 21 023344
15). Максимальная мобилизация гематопоэтических клеток-предшественников происходила на 4 день в группах, получающих лечение как ΝΕυΟ, так и Нейластой® (пэгфилграстимом). ΝΕυΟ в дозе 10 мг/кг и нейласта в дозе 1,12 и 2,24 мг/кг вызывали одинаковое увеличение содержания с-кП' клеток (р < 0,0001). Доза ΝΕυΟ 5 мг/кг приводила к статистически значимому (р<0,0001) увеличению содержания с-кП' клеток по сравнению с контролем ΗδΑ, однако это увеличение было примерно на 50% меньше, чем увеличение, наблюдаемое в обеих группах, получающих Нейласту® (пэгфилграстим) и оказалось субмаксимальным, так как большая в 2 раза доза приводила к увеличению значения максимального содержания скй+ клеток (фиг. 15).
Пример 4. Сравнение ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) у мышей ΒΌΡ-1 с вызванной 5-Ρυ нейтропенией
Продукты С-СБЕ используются в клинике для ускорения восстановления нейтрофилов после миелосупрессивной химиотерапии. Целью настоящего исследования было сравнение эффекта однократной подкожной ^С) инъекции ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима) на восстановление нейтрофилов в модели, где нейтропения была вызвана сублетальной дозой 5-Ρυ (150 мг/кг). Мышам ΒΌΡ1 давали однократную дозу ΝΕυΟ 5 или 10 мг/кг. Эффект ΝΕυΟ сравнивали с эффектом однократного введения Нейласты (1,12 мг/кг - доза, эквимолярная дозе 5 мг/кг ΝΕυΟ). Оба агента вводили через 1 день после введения однократной дозы 5-Ρϋ. Количество нейтрофилов периферической крови определяли ежедневно с 6 дня по 19 день. В указанный период времени у мышей, получающих 5-Ρυ, наблюдалось снижение числа нейтрофилов до минимума с последующей фазой медленного восстановления. Эксперимент был предназначен для определения влияния ΝΕυΟ на время и степень восстановления нейтрофилов. У мышей, инъецированных контролем плацебо или ΗδΑ через 1 день после введения 5-Ρυ, нейтропения достигала минимума к 6 дню (фиг. 16). Уровень нейтрофилов начинал восстанавливаться к 10 дню. Напротив, восстановление после нейтропении ускорялось, когда мышам проводили лечение либо ΝΕυΟ, либо нейластой на 1 день после введения 5-Ρυ. Лечение любым агентом при всех уровнях дозы приводило к статистически значимому увеличению содержания нейтрофилов по сравнению с контролем плацебо. На 9 день эффект ΝΕυΟ, вводимого в дозе 5 мг/кг, был ниже (р = 0,0048), чем эффект, обеспечиваемый эквимолярной дозой нейласты (1,12 мг/кг). Однако к 10 дню оба агента вызывали одинаковое увеличение общего содержания периферических нейтрофилов.
Взятые вместе данные исследований на мышах указывают на то, что однократное введение ΝΕυΟ нормальным мышам приводило к эффективному, дозозависимому, быстрому и длительному увеличению содержания нейтрофилов (Οτ,1+ клеток) и гематопоэтических клеток-предшественников (с-кП') в периферической крови. Ответ на ΝΕυΟ был близок ответу, вызванному Нейластой® (пэгфилграстимом), однако в указанном исследовании максимальный ответ на ΝΕυΟ был немного отсрочен по сравнению с Нейластой® (пэгфилграстимом). Однократное введение Нейпогена® (филграстима) приводило только к временному увеличению содержания нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови. С использованием клинически адекватной модели цитопении у мышей, в которой путем инъекции вводили внутрибрюшинно (ΓΡ) сублетальную дозу 5-Ρυ, вызывающую миелосупрессию и периферическую нейтропению, однократное введение ΝΕυΟ или Нейластыа® (пэгфилграстима) эффективно усиливало восстановление содержания нейтрофилов.
Пример 5. Тестирование ΝΕυΟ на яванских макаках
Для определения эффектов многократного введения ΝΕυΟ были выбраны яванские макаки. Были проведены два исследования на обезьянах с серийной оценкой гематологических показателей после многократного введения ΝΕυΟ: 2-недельное фармакологическое исследование для сравнения доз ΝΕυΟ и Нейпогена® (филграстима) при подкожном введении и более долгое (5 месяцев) исследование иммуногенности для сравнения эффекта ΝΕυΟ при его подкожном и внутривенном введении с эффектом Нейласты® (филграстимом) при подкожном введении. Оба исследования показали, что ΝΕυΟ вызывает длительное повышение содержания нейтрофилов в периферической крови у обезьян с активностью и фармакодинамическим профилем, аналогичным Нейласте® (пэгфилграстиму).
Пример 6. 2-недельное фармакологическое исследование ΝΕυΟ у обезьян
Для оценки фармакодинамики ΝΕυΟ у обезьян было проведено 2-недельное исследование повторного введения доз с гематологическими показателями в качестве конечной точки оценки эффективности. Двадцать ранее не подвергавшихся экспериментальным исследованиям самцов и самок яванских макак случайным образом распределяли в 5 лечебных групп по 2 самца и 2 самки в каждой группе. Обезьянам подкожно (δθ) инъецировали среду (плацебо) в область между лопатками, ΝΕυΟ или Нейпоген® (филграстим). В течение 14-дневной фазы экспериментального лечения плацебо вводили каждые 4 дня (Ο4Ω). ΝΕυΟ вводили в дозе 25 мкг/кг каждые 4 дня (Ο4Ω) или 100 мкг/кг каждые 4 или 7 дней (Ο4Ω или О7Э, соответственно), и Нейпоген® (филграстим) вводили в дозе 5 мкг/кг ежедневно.
ΝΕυΟ хорошо переносился яванскими макаками в дозе 25 мкг/кг или 100 мкг/кг при введении дозы каждые 4 дня и не вызывал нежелательных явлений. Гематологические изменения главным образом заключались в вызванном ΝΕυΟ повышении содержания нейтрофилов периферической крови с менее значительным повышением содержания моноцитов периферической крови. Повышение содержания ней- 22 023344 трофилов было максимальным через 24 ч после 8С введения дозы 100 мкг/кг (фиг. 17). Введение ΝΕυΟ в дозе 25 мкг/кг каждые 4 дня, или 5 мкг/кг Нейпогена® (филграстима) ежедневно приводило к умеренному увеличению содержания нейтрофилов, которое было значительным по сравнению с плацебо в течение второй недели введения. Все гематологические изменения, связанные с введением ΝΕυΟ, полностью восстанавливались в течение 2-недельного восстановительного периода в отсутствие лечения.
Другие наблюдения
Было установлено, что количество моноцитов в периферической крови увеличивается в ответ на ΟС8Р, но в меньшей степени, чем количество нейтрофилов. В настоящем исследовании только ΝΕυΟ в дозе 100 мкг/кг, вводимый каждые 4 дня, вызывал увеличение абсолютного числа моноцитов. На абсолютное число лимфоцитов периферической крови не влияло ни лечение ΝΕυΟ, ни лечение Нейпогеном® (филграстимом).
Пример 7. Сравнение ΝΕυΟ при IV и §С введении и Нейласты® (пэгфилграстима) при §С введении у обезьян
Исследование введения многократных доз ΝΕυΟ яванским макакам, не соответствующее требованиям надлежащей лабораторной практики, было проведено с основной целью оценки иммуногенности (Соуаисе §1ийу №. 6962-129). В качестве конечной точки исследований брали гематологические параметры. Указанное исследование также обеспечивает полезную фармакологическую информацию по сравнению эквимолярных доз ΝΕυΟ и Нейласты® (пэгфилграстима). Как ΝΕυΟ, так и Нейласту вводили раз в неделю в течение 3 недель. На фиг. 18 показано ЛЯС после каждого из первых 3 введений дозы ΝΕυΟ или Нейласты® (пэгфилграстима). В данном исследовании Нейгранин, вводимый §С и IV, и Нейласта® (пэгфилграстим), вводимая §С в эквимолярной дозе, приводили к значительному (<0,0001 по сравнению с плацебо) повышению содержания нейтрофилов в периферической крови. Как величина, так и кинетика нейтрофильного ответа были почти идентичными среди этих трех групп.
Пример 8. Фармакокинетика
Фармакокинетические свойства ΝΕυΟ оценивали у нормальных мышей ΒΌΡ-1 после однократной IV или §С инъекции у получающих лечение 5-Ρυ мышей ΒΌΡ-1, страдающих нейтропенией, после 8С инъекции, у крыс с нефроктомией после IV инъекции и у яванских макак после однократных и множественных IV и §С инъекций. Кроме того проводили сравнение между фармакокинетическими свойствами гНС-С5>Р (Нейпогеном®) и пегилированным гНС-С5>Р (Нейластой®). Сводные данные указанных исследований приведены ниже.
Во всех исследованиях концентрацию ΝΕυΟ в плазме измеряли с помощью ИФА в сэндвичмодификации с иммобилизованным С-С5Р и выявлением ΗδΑ. Такая схема анализа позволяет проводить количественную оценку интактного ΝΕυΟ без вмешательства или перекрестной реактивности с эндогенным С-С'ЪР и альбумином. Фармакокинетические исследования объединили в форме таблиц на фиг. 19. В описанных исследованиях ΝΕυΟ имел более медленный клиренс и более долгий конечный период полувыведения и среднее время удержания (МКТ), чем Нейпоген® (филграстим) при IV или §С введении мышам ΒΌΡ-1. Клиренс ΝΕυΟ приблизительно в 8 раз медленнее, чем клиренс Нейпогена® (филграстима), и МКТ (11,2-20,7 ч) приблизительно в 4 раза дольше. Клиренс как ΝΕυΟ, так и Нейласты® (пэгфилграстима) был медленнее у мышей, которые страдали вызванной 5-Ρυ цитопенией, чем у нормальных мышей, что наиболее вероятно связано с меньшим количеством нейтрофилов (после лечения 5Ρυ), которые играют роль в клиренсе Ο-СЗР. У яванских макак МКТ ΝΕυΟ составляет 17,9-27,2 часов. Кроме того Стах после введения последней из 5-недельных §С доз снижается по сравнению с Стах после первой дозы. Биодоступность при §С ведении ΝΕυΟ у яванских макак составляет приблизительно 22%. У яванских макак конечный период полувыведения ΝΕυΟ (12,6 ч) приблизительно на 33% длиннее, чем Нейласты® (пэгфилграстима) (9,49 ч) после 8С инъекции.
Почечный клиренс не играет значительной роли в выведении ΝΕυΟ (определено на крысах).
Пример 9. Обзор доклинических исследований токсичности
ΝΕυΟ хорошо переносился мышами и обезьянами. У обезьян, которым вводили ΝΕυΟ подкожно при концентрации 100, 500, или 1000 мкг/кг/доза раз в неделю в течение 4 недель, не наблюдалось неблагоприятных явлений. Наблюдали фармакодинамические ответы на лечение ΝΕυΟ после введения множественных §С или IV доз яванским макакам, которые соответствовали ранее показанным эффектами ΟС8Р. ΝΕυΟ стабильно приводил к развитию выраженного и дозозависимого лейкоцитоза и нейтрофилии с менее выраженным увеличением содержания моноцитов, эозинофилов и базофилов, и не всегда приводил к увеличению числа лимфоцитов. Ни в исследованиях в соответствии с ΟΕΡ, ни в не-ΟΕΡ исследованиях не была выявлена максимальная доза препарата, не приводящая к развитию наблюдаемых эффектов (ΝΟΕΕ), для ΝΕυΟ у обезьян , и, соответственно считается, что она ниже дозы 25 мкг/кг/ для подкожного введения. У обезьян, получающих лечение 8С ΝΕυΟ, не наблюдали нежелательных явлений, следовательно максимальная доза, при которой не наблюдаются нежелательные явления (ΝΟΛΕΕ), для подкожного введения ΝΕυΟ у обезьян больше чем 1000 мкг/кг/доза. Дополнительные наблюдения, соответствующие фармакологическим свойствам ΝΕυΟ, включали: увеличенную массу селезенки, микроскопические данные, свидетельствующие о миелоидной гиперплазии и лейкоцитозе.
- 23 023344
Данные доклинических исследований безопасности собраны в таблицах на фиг. 20.
Пример 10. Иммуногенность
ΝΕυΟ может (теоретически) вызывать иммунный ответ у пациентов, у которых развивается нейтрализующий ответ на О-С'.ЪЕ Также возможно образование антител к ΗδΑ, при этом их клиническая значимость не является достоверной, учитывая крайне высокую концентрацию ΗδΑ в крови (40 мг/мл). Для оценки иммуногенности у людей использовали ряд высоко чувствительных анализов, обеспечивающих детектирование антител ко всем компонентам ΝΕυΟ.
Для определения безопасности и токсикологических свойств ΝΕυΟ оценивали иммуногенность ΝΕυΟ в различных исследованиях. Указанные исследования демонстрируют, что О-С'.ЪР человека (Нейласта®, пэгфилграстим), альбумин человека и ΝΕυΟ являются иммуногенными у обезьян. В исследовании иммуногенности, которое включало группу, получающую лечение Нейластой® (пэгфилграстимом), большинство животных, которые получали лечение дозами ΝΕυΟ при его IV или δС введении раз в неделю, продуцировали антитела к Нейласте® (пэгфилграстиму). Антитела к ΝΕυΟ (или Нейласте®, пэгфилграстиму) впервые наблюдали на 22 день или после 22 дня (после 3-ей недельной дозы). Во многих случаях эти антитела имели нейтрализующий эффект в анализе ίη νί!ίο, хотя присутствие нейтрализующих антител не вызывало нейтропению и не препятствовало проявлению фармакологических эффектов ΝΕυΟ или Нейласты® (пэгфилграстима) у обезьян. Более того, после 2-недельного и 2-месячного периода без введения дозы ΑNС во всех группах были в пределах нормального диапазона, и не наблюдалось значительной разницы в кривых ΑΝΕ, независимо от состояния антител. Альбумин человека, как и большинство человеческих белков, является иммуногенным для животных. Опыт с другими гибридными белками альбумина продемонстрировал, что иммуногенность у обезьян не позволяет предсказать возникновение (или последствия) иммуногенности у людей. Например, Альбуферон® (гибридный белок, образованный из сывороточного альбумина человека и интерферона альфа) был высоко иммуногенным у обезьян (10/12 обезьян были положительны на антитела после однократной инъекции), иммунный ответ являлся нейтрализующим и значительно влиял на воздействие. В противоположность этому, по результатам недавнего исследования Альбуферона® во 2 фазе, с участием 458 пациентов, частота возникновения антител была очень низкой и при этом была значительно ниже в группах, получающих лечение Альбуфероном® (3%) по сравнению с группой, получающей лечение пэгилированным интерфероном (18%) в течение первых 12 недель лечения. Более того, появление антител не вызывало очевидных осложнений.
Антитела к ΝΕυΟ не выявляли у пациентов, представляющих собой людей, получающих до 3 доз ΝΕυΟ (см., например, раздел I фаза, 5.с и II фаза, 5.е, ниже). В отношении оценки риска ΝΕυΟ имеющиеся данные, полученные на людях и животных, дают основания полагать, что образование нейтрализующих антител к С-С'.ЪР не позволяет предсказать ответ на фармакологические дозы С-С'.ЪР и не предсказывают нормальный ответ на стимуляцию инфекционным агентом. На моделях возникновения нейтрализующих антител к С-С'.ЪР с использованием мышей было показано, что нейтрофилия может развиваться в ответ на стимуляцию инфекционным агентом, что указывает на избыточность в гранулопоэтической системе. Кроме того, описаны случаи возникновения аутоантител к С-С'.ЪР у людей с синдромом Фелти и системной красной волчанкой. У таких пациентов развивается нейтропения; однако лечение ΟСδΡ или СМ-С'.ЪР остается эффективным у большинства пациентов.
Суммарные данные исследований ίη νί!ίο и ίη νίνο и фармакокинетические характеристики ΝΕυΟ указывают на возможность применения ΝΕυΟ в виде однократной дозы для профилактики развития фебрильной нейтропении у пациентов, получающих миелосупрессивную противораковую терапию. Способность ΝΕυΟ приводить к повышенному содержанию гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови после введения однократной дозы может также иметь благоприятный эффект у пациентов или доноров для аутологической и аллогенной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток.
В. Исследования ΝΕυΟ на человеке
Следующие примеры разделены на две секции - I Фаза и II Фаза. Каждая фаза включает две части, часть А и часть В. Примеры из I фазы и II фазы приведены в табл. 2, ниже.
- 24 023344
ТАБЛИЦА 2: Суммарные данные клинических исследований ХЕСС на человеке
Исследова ние (Часть)/тип опухоли Цель Химиотерапевтиче ский агент Количество субъектов Лечебные группы
1 Фаза (А)/молочной железы Первоначальный подбор доз в отсутствие химиотерапии Отсутствует 13 50, 150, 300, 450 мкг/кг ΝΕυΟ
(В)/молочной железы Первоначальный подбор доз в присутствии химиотерапии Доксорубицин Доцетаксел 2 Цикла 51 300 или 450 мкг/кг ΝΕυΟ по сравнению с 6 мг пэгфилграстима
II Фаза (А)/молочной железы Подбор доз для фиксированных доз Нейгранина Доксорубицин Доцетаксел 4 Цикла 78 30, 40, 50 мг ΝΕυΟ по сравнению с 6 мг пэгфилграстима
(В)/молочной железы Демонстрация не меньшей эффективности ΝΕυΟ по сравнению с пэгфилграстимом Доксорубицин Доцетаксел 4 Цикла 256 40 и 50 мг ΝΕυΟ по сравнению с 6 мг пэгфилграстима
Каждая фаза разделена на пять частей: 1) цели, 2) характеристики пациентов, 3) исследуемый агент, 4) характеристики исследования и 5) результаты частей А и В.
Пример 11.1 Фаза
1. Цель
Исследование ΙΑ/Β, ПА/В Фазы проводили для оценки безопасности, переносимости, иммуногенности, фармакокинетики и фармакодинамики вводимого подкожно Нейгранина (ΝΕϋΟ) (рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека) у пациентов, получающих миелосупрессивную химиотерапию (доксорубицин/доцетаксел).
Для I Фазы основные цели исследования заключались в оценке характеристик безопасности ΝΕϋΟ, вводимого подкожно в диапазоне потенциальных терапевтических доз, по сравнению с пэгфилграстимом путем измерения частоты, тяжести и длительности возникших после начала лечения нежелательных явлений и соотнесения их со временем и дозой введения ΝΕϋΟ.
Вторичные цели исследования заключались в оценке фармакокинетики и иммуногенности ΝΕϋΟ, и сравнении влияния введения ΝΕϋΟ на частоту возникновения, тяжесть и продолжительность нейтропении с пэгфилграстимом у пациентов, получающих доксорубицин/доцетаксел.
I Фазу осуществляли в виде двух частей, части А и части В, как указано в табл. 2 выше.
2. Характеристики пациентов
Для I Фазы пациентов отбирали на основе следующих характеристик или параметров:
Включение:
1. Пациенты с гистологически подтвержденным раком молочной железы, для которых предусмотрено получение доксорубицина и доцетаксела.
2. Возраст: 18 лет или старше.
3. Удовлетворительная гематологическая функция.
4. А№С > 1500/мм3
5. Тромбоциты > 100,000/мм
6. Удовлетворительная функция печени и почек:
7. Креатинин сыворотки < 2,0 х верхней границы нормы
8. Общий билирубин в пределах нормы для местной лаборатории
9. Трансаминазы сыворотки ^ООЕ^ОРЕ) < 1,5 х верхней границы нормы
10. Щелочная фосфатаза < 2,5 х верхней границы нормы
11. Общее состояние ΕСОΟ 0 или 1.
12. Могут получать доксорубицин, если фракция выброса левого желудочка (ФВЛЖ) в пределах нормы.
13. Способны понимать требования исследования, предоставлять информированное согласие в письменной форме (включая согласие на использование и раскрытие относящейся к исследованию информации о состоянии здоровья) и соблюдать процедуры согласно протоколу исследования.
Исключение:
1. Более 1 предшествующего курса химиотерапии (включая адъювантную терапию, если получали в течение последних 12 месяцев); любая химиотерапия/иммунотерапия в течение 4 недель до вступления в исследование; кумулятивная доза антрациклина, которая могла бы препятствовать проведению 2 полнодозовых циклов доксорубицина в данном исследовании.
2. Предшествующее использование любой нитрозомочевины (ΒСNυ, ССИС) или митомицина-С в течение 6 недель химиотерапии исследования.
- 25 023344
3. Сердечные заболевания, признаки или симптомы в анамнезе, которые, по мнению Исследователя, исключают использование режима химиотерапии на основе антрациклинов.
4. Предшествующее хирургическое лечение или радиотерапия в течение 2 недель химиотерапии исследования.
5. Предшествующее широкопольное облучение таза или более 20% областей костного мозга или поражение костного мозга.
6. Предшествующая высокодозовая химиотерапия с трансплантатом гематопоэтических стволовых клеток.
7. Предшествующее использование миелоидных (С-С8Р или СМ-С8Р) факторов роста в течение 4 недель химиотерапии исследования.
8. Предшествующее использование эритропоэтина в течение 4 недель химиотерапии исследования.
9. Миелоидная злокачественная опухоль или миелодисплазия в анамнезе.
10. Известные метастазы в головном мозге без подходящего лечения (хирургическое лечение или радиотерапия), отсутствие данных о прогрессировании с минимум 3-недельным наблюдением и неврологической стабильности без противосудорожных средств и стероидов.
11. Известная серповидно-клеточная анемия.
12. Диагноз респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ).
13. Текущая инфекция, требующая внутривенного или перорального введения антибиотиков.
14. Установленная аллергия на получаемые из дрожжей продукты в анамнезе.
15. Установленная гиперчувствительность к получаемым из Е сой белкам, пэгфилграстиму, филграстиму или любому другому компоненту пэгфилграстима (только 2 фаза).
16. Беременная женщина или кормящая мать (в течение исследования все женщины должны применять метод контрацепции, обладающий более 90% надежности, или быть бесплодными, или находиться в периоде постменопаузы).
17. Установленная ВИЧ-положительный статус или активный гепатит (пациентов с неизвестным статусом не будут тестировать).
18. Мужчины, которые не согласны применять эффективную контрацепцию на протяжении всего исследования и в течение периода, составляющего 30 дней, после последней дозы исследуемого агента.
Субъектов исключали из дальнейшего лечения по следующим причинам:
1. Прогрессирование заболевания
2. Неприемлемые токсические явления несмотря на оптимальное лечение
3. Интеркуррентное заболевание по усмотрению Исследователя.
4. Режим доксорубицина - достижение максимально допустимой для жизни кумулятивной дозы (см. критерии отбора)
5. Отзыв согласия
6. Невыполнение/недоступность для наблюдения по завершении исследования
7. Беременность
Если лечение ΝΕυΟ прекращали, субъекты оставались в исследовании и их наблюдали в течение по меньшей мере 30 дней после последней дозы исследуемого лекарственного для запланированной оценки безопасности и ФК.
3. Исследуемый агент
ΝΕυΟ (рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, гН§А-О-С8Р) представляет собой гибридный белок с молекулярной массой приблизительно 85 кДа, соединенный в одну цепь, содержащую остатки 1-585, соответствующие зрелой форме ΗδΑ, и остатки 586-759, соответствующие зрелой форме О-САР человека. Терапевтический фрагмент ΝΕυΟ представляет собой получаемый из рекомбинантной ДНК человека О-САР.
ΝΕυΟ поставляли в виде стерильного, лиофилизированного состава в одноразовых флаконах из стекла 1 типа и хранили при 2-8°С. После восстановления 1,1 мл стерильной воды для инъекций каждый флакон содержал 15 мг/мл (доставляемые 15 мг/флакон) ΝΕυΟ в 10 мМ фосфате натрия, 200 мМ маннита, 60 мМ дегидрата трегалозы, 0,01% (мас./об.) полисорбата 80, рН 7,2.
Состав лекарственного продукта ΝΕυΟ, применяемого в I Фазе, представлен на фиг. 13.
Коммерчески доступную Нейласту® (пэгфилграстим) поставляли в 0,6 мл предварительно заполненных шприцах для подкожной инъекции. Каждый шприц содержит 6 мг пэгфилграстима (по массе белка) в стерильном, прозрачном, бесцветном, не содержащем консервантов растворе (рН 4,0), содержащем ацетат (0,35 мг), сорбит (30,0 мг), полисорбат 20 (0,02 мг), натрий (0,102 мг) в воде для инъекций. υδΡ (фармакопея США).
ΝΕυΟ (50, 150, 300 или 450 мкг) или Нейласту® (пэгфилграстим) (6 мг) вводили путем подкожного введения.
4. Характеристики исследования
А) Схема и продолжительность исследования
Данное исследование представляло собой первое, многоцентровое, открытое неконтролируемое ис- 26 023344 следование на людях с последовательным увеличением дозы, проводимое в режиме контролируемого рандомизированного исследования с участием 62 субъектов, страдающих раком молочной железы, для которых предусмотрено получение доксорубицина и доцетаксела. Указанное исследование состояло из 2 частей. Часть А представляла собой последовательное увеличение дозы у 13 субъектов, 4 группы доз (50, 150, 300 или 450 мкг/кг) с 3 субъектами в каждой из групп 50, 150 и 450 мкг/кг и 4 субъектами в группе 300 мкг/кг для оценки безопасности перед рандомизированной частью В исследования.
В Части А субъекты получали первую дозу ΝΕϋΟ по меньшей мере за 2 недели до начала химиотерапии (0 Цикл) для первоначальной оценки безопасности и влияния на абсолютное число нейтрофилов (АЫС) в отсутствие цитотоксической химиотерапии. После как минимум 2 недель наблюдения субъекты получали ΝΕϋΟ в той же дозе после химиотерапии в циклах 1 и 2, если в 0 Цикле не было дозолимитирующих нежелательных явлений, считающихся связанными с ΝΕϋΟ, и субъект продолжал соответствовать всем критериям отбора.
В части А дозолимитирующую токсичность (1ТЕТ) определяли как клинически значимое нежелательное явление (явления) 2 степени или выше, признанные, возможно, вероятно или определенно, связанными с исследуемым агентом, за исключением боли в костях 2 степени. В рамках каждой группы части А, исходное введение исследуемого лекарственного средства каждому субъекту, входящему в исследование, отделяли как минимум 24 ч для мониторинга острых нежелательных явлений. Решение об увеличении дозы до следующего уровня основывали на анализе данных по безопасности в течение по меньшей мере 7 дней после первого введения дозы ΝΕϋΟ для всех субъектов в данной группе. Если ни один из 3 субъектов не испытывал дозоограничивающую токсичность, дозу продолжали увеличивать с включением 3 субъектов на следующий уровень дозы. Если 1 из 3 субъектов в данной группе проявлял признаки дозоограничивающей токсичности, набирали других 3 субъектов на данных уровень дозы с получением всего 6 субъектов в группе. Увеличение дозы продолжало происходить, если только 1 из 6 субъектов испытывал дозоограничивающую токсичность. Если у 2 из 6 субъектов развивалась дозоограничивающая токсичность, прекращали увеличивать дозу и не вводили дополнительные лечебные средства ΝΕϋΟ.
Остальные субъекты завершали предусмотренные оценки безопасности, фармакокинетические и фармакодинамические оценки.
После демонстрации безопасности в исходных группах части А проводили часть В. В части В субъектов случайным образом распределяли параллельным образом в 1 из 3 групп лечения: ΝΕϋΟ 300 мкг/кг (и = 20), ΝΕϋΟ 450 мкг/кг (и = 21) или пэгфилграстим (и = 10) в разрешенной дозе, составляющей 6 мг, вводимой приблизительно через 24 ч после химиотерапии исследования.
В табл. 3 и 4 ниже суммировано распределение субъектов в I Фазе, части А и В. На фиг. 6 показаны циклы химиотерапии для исследования I Фазы, части А и В.
Таблица 3: Распределение субъектов в I Фазе
Часть А Доза N (ΝΕΕΓΟ/пэгфилграстим)
Последовательное увеличение дозы ΝΕυσ 50 мкг/кг 3/0
ΝΕΕΓΟ 150 мкг/кг 3/0
ΝΕΕΓΟ 300 мкг/кг 4/0
ΝΕΕΓΟ 450 мкг/кг 3/0
Часть В Доза N (ΝΕΕΓΟ/пэгфилграстим)
Параллельная рандомизация ΝΕΕΓΟ 300 мкг/кг 20/5
ΝΕΕΓΟ 450 мкг/кг 21/5
Таблица 4: Распределение субъектов в I Фазе
Лечение Часть А (Ν) Часть В (Ν) Всего
Нейласта® (пэгфилграстим) 0 10 10
ΝΕΕ1Ο 50 3 0 3
ΝΕΕΓΟ 150 3 0 3
ΝΕυΟ 300 4 20 23
ΝΕυΟ 450 3 21 24
Всего 13 51 64
Ъ) Сопутствующее лечение в ходе I Фазы, части А и В
Химиотерапия
Режим химиотерапии для данного исследования состоял из доксорубицина 50 мг/м и доцетаксела 75 мг/м2, вводимых последовательно путем внутривенной инфузии в 1 день лечения в течения до двух 21-дневных циклов.
- 27 023344
Перед получением каждого цикла терапии субъекты должны были демонстрировать абсолютное содержание нейтрофилов (АЫС) > 1,5 х 109/л и тромбоцитов > 100 х 109 /л3. Лечение могло быть отсрочено до двух недель для восстановления гематологических показателей.
Установлено, что комбинация доксорубицина и доцетаксела обладает значительной клинической активностью у пациентов, страдающих раком молочной железы. Однако указанная комбинация является крайне миелосупрессивной с более высокой частотой нейтропении 3 и 4 степени, по сравнению с другими стандартными режимами. Даже при добавлении С8Р комбинация доксорубицина и доцетаксела индуцировала нейтропению 4 степени у 79% пациентов и частоту фебрильной нейтропении, составляющую
9- 18%. Данный режим доксорубицин/доцетаксел был использован в исследованиях новых агентов для предотвращения нейтропении и ее осложнений. Следовательно, комбинация доксорубицина и доцетаксела представляет собой подходящий режим химиотерапии для исследования действия нового агента, такого как ΝΕυΟ.
Доксорубицин Фармакологические данные
Доксорубицина гидрохлорид - это антибиотик антрациклинового ряда, получаемый из 8!гер!отусе8 реисейик гаг саекшк, ингибирующий ДНК и ДНК-зависимый синтез РНК, а также синтез белков. Доксорубицин активен во всех фазах клеточного Цикла, но обладает максимальной цитотоксичностью в 8фазе. Выведение указанного лекарственного средства осуществляется преимущественно печенью; почечный клиренс незначителен.
Фармацевтические данные
Указанное лекарственное средство продается на коммерческой основе в 10, 20 50, 100 или 200 мг флаконах. Лиофилизированные препараты могут быть восстановлены стерильной водой для инъекций, 5% раствором декстрозы или 0,9% физиологическим раствором для инъекций.
Побочные эффекты и токсичность
Миелосупрессия, в первую очередь лейкопения, со снижением числа клеток до минимума в течение
10- 14 дней, и кардиотоксичность, включая редкий синдром острого перикардита-миокардита и отсроченную связанную с кумулятивной дозой кардиомиопатию, составляют дозолимитирующую токсичность доксорубицина.
Отмечаемая алопеция и умеренная тошнота/рвота представляют собой ожидаемые токсические явления. Сообщали о реакциях экстравазации, приводящих к местному повреждению кожи и тканей в месте случайной экстравазации, стоматите, гиперпигментации кожи (особенно ногтевых лунок) и местной воспалительной реакции в местах предшествующего облучения.
Доцетаксел
Фармакологические данные
Доцетаксел представляет собой полусинтетический таксоид, который связывается со свободным тубулином и способствует сборке стабильных микротрубочек, препятствуя митозу и репликации клеток (клеточный цикл, специфичный по М-фазе). Доцетаксел активно связывается с белком, интенсивно метаболизируется в печени с экскрецией с фекалиями приблизительно 75% дозы в течение 7 дней.
Фармацевтические данные
Доцетаксел (Таксотер™, 8апой АуепйЦ представлен в 80 мг/2 мл или 20 мг/0,5 мл флаконах с однократной дозой с прилагающимся флаконом разбавителя (13% этанол в воде для инъекций). Каждый мл Таксотера содержит 40 мг доцетаксела (безводного) и 1080 мг полисорбата 80.
Побочные эффекты и токсичность
Доцетаксел не следует назначать пациентам, у которых в анамнезе присутствуют тяжелые реакции гиперчувствительности к доцетакселу или другим лекарственным средствам, изготовленным с полисорбатом 80, таким как этопозид и витамин Е.
Пациентам, испытывающим тяжелые реакции гиперчувствительности, не следует повторно назначать препарат. Пациентам, получающим доцетаксел, должны быть введены кортикостероиды в качестве премедикации, как указано ниже.
Печеночная недостаточность от легкой до умеренной приводит к замедленному метаболизму с 27 и 38% увеличением системного воздействия (АиС). Доцетаксел не следует назначать пациентам с 8ООТ и/или 8ОРТ > в 1,5 раза больше нормы и щелочной фосфатазой > в 2,5 раза больше нормы. Задержка жидкости происходила у 17% (умеренная) и 6% (тяжелая задержка) пациентов в исследованиях III Фазы, несмотря на премедикацию кортикостероидами. Наблюдали тяжелые нейросенсорные симптомы (парестезия, дисестезия, боль).
Ожидаемые побочные эффекты включают миелосупрессию, в первую очередь лейкопению с самым низким уровнем приблизительно на 9 день и восстановлением к 15-21 дню. Сообщали об алопеции, изменениях ногтей и кожи, стоматите, миалгии/артралгии, тошноте/рвоте и гипотензии.
Химиотерапевтическая доза, введение и модификации доз
В 1 день каждого цикла лечения вводили химиотерапевтическое средство (доксорубицин, а затем доцетаксел).
- 28 023344
Доксорубицин вводили в дозе, составляющей 50 мг/м , путем внутривенного болюсного введения через боковое ответвление инфузионной капельницы или через центральный венозный катетер для избежания экстравазального повреждения.
Доцетаксел 75 мг/м разводили в 250 мл 0,9% физиологического раствора или 5% раствора декстрозы и вводили внутривенно в течение приблизительно 1 ч с помощью полиэтиленовой системы для инфузии. Основные показатели состояния организма определяли непосредственно перед и после окончания инфузии доцетаксела.
Перед получением каждого цикла терапии субъекты должны были обладать абсолютным содержанием нейтрофилов (АЫС) > 1500/мм3 и тромбоцитов > 100,000/мм3.
Лечение могло быть отсрочено до двух недель для восстановления гематологических показателей. 25% снижение химиотерапевтических доз предусматривали для негематологических токсических явлений 3-4 степени, инфекционных эпизодов двух степеней 3-4 или тромбоцитопении 4 степени.
Субъектов, испытывающих тяжелые реакции гиперчувствительности или негематологические токсические явления, которые препятствуют дальнейшим циклам химиотерапии, исключали из лечения в программе исследования, но они выполняли наблюдение по окончании исследования.
Премедикация для химиотерапии
Кортикостероиды для перорального введения (при необходимости внутривенного введения) (например, дексаметазон 8 мг два раза в сутки) вводили в течение трех дней, начиная за 1 день перед введением доцетаксела для снижения частоты возникновения и тяжести задержки жидкости и реакций гиперчувствительности.
Применение и выбор противорвотных средств или других средств премедикации (например, антагонисты Н2) оставляли на усмотрение лечащего врача.
Запрещенные лекарственные средства
Субъекты не должны были получать ни одно из следующих лекарственных средств и/или процедур в ходе данного исследования и в дополнительное время, указанное ниже:
1. Другие исследуемые агенты в течение 30 дней начала исследования агента и во время проведения исследования.
2. Последующие циклы химиотерапии не следует начинать пока не пройдет 14 дней после введения доз ЫЕИО.
3. Цитокины, другие гематопоэтические факторы роста и профилактические антибиотики во время проведения исследования, если не возникает пролонгированная или фебрильная нейтропения. Если субъектов лечили О-С8Р в любое время между периодом отбора и 0 Днем они не должны были получать ЫЕИО и их исключали из исследования.
Разрешенные лекарственные средства
Субъектам разрешали продолжать прием базового лекарственного средства (средств). Суточная доза каждого лекарственного средства при возможности поддерживалась постоянной на протяжении всего исследования. Если по какой-либо причине, считающейся исследователем необходимой, субъекту требовалось дополнительное лекарственное средство (средства) или изменение дозы, лекарственное средство (средства), способ введения и показание, по которому его вводили, регистрировали на соответствующих страницах индивидуальной регистрационной карты.
Антибиотики
Все субъекты получали пероральные антибиотики {например, ципрофлоксацин) после каждого курса химиотерапии в качестве профилактики для снижения вероятности инфекции. Если возникала фебрильная нейтропения или стабильная тяжелая нейтропения (АЫС < 0,5 х 10 /л в течение > 5 дней), субъекта признавали терапевтической неудачей, исключали из исследования, он полностью проходил наблюдение по завершении исследования и получал все стандартную поддерживающую терапию, включая поддерживающий фактора роста по усмотрению Исследователя.
Субъектов, испытывающих тяжелые реакции гиперчувствительности или негематологические токсические явления, которые препятствовали дальнейшим циклам химиотерапии, также исключали из лечения в программе исследования, они проходили наблюдение по завершению исследования.
с) Оценки безопасности
Безопасность ЫЕИО оценивали путем определения типа, частоты и тяжести нежелательных явлений (НЯ), изменений в клинических лабораторных тестах (гематология и клиническая биохимия), иммуногенности, путем медицинских осмотров и мониторинга основных показателей состояния организма с течением времени. Все НЯ и лабораторные токсические явления располагали по степеням на основе общих терминологических критериев для оценки нежелательных явлений Национального института рака (ЫС1-СТСАЕ Версия 3,0, 12 декабря 2003 г.). Нежелательные явления (включая серьезные нежелательные явления, СНЯ) фиксировали с начала введения исследуемого лекарственного средства и до 30 дней после конечной дозы какого-либо исследуемого лекарственного средства. Лабораторные оценки получали, как указано в схеме оценок. В случае какой-либо токсичности нейтропении 4 степени, лабораторные показатели получали каждый день до достижения АЫС > 500. Если отсрочивали следующий цикл лече- 29 023344 ния субъекта (и после последнего цикла лечения) проводили клинический анализ крови (СВ С) с подсчётом форменных элементов по меньшей мере два раза в неделю до достижения ΑΝΕ > 1500.
5. Результаты части А и части В I Фазы
a) Общие
Статистические методы:
Данные, имеющие отношение к параметрам безопасности, фармакокинетики (ФК), фармакодинамики (ФД) и иммуногенности, анализировали с использованием методов описательной статистики.
Представлены значения и процентные отношения для частоты и выраженности нежелательных явлений и лабораторных показателей токсичности.
Для оценки эффективности определяли частоту возникновения и продолжительность нейтропении 4 и 3 степени, минимальный уровень ΑΝΌ, время достижения минимального уровня ΑΝ6, время восстановления ΑΝ6 (до ΑNС > 0,5 х 10 /л и ΑΝ6 > 1,0 х 10 /л) и частоту возникновения фебрильной нейтропении.
Не было установлено строгих требований для значений статистической мощности при выборе объема выборки для настоящего исследования. Было рассчитано, что для исследования с мощностью 80% для демонстрации не меньшей эффективности ΝΕυΟ по сравнению с пэгфилграстимом при уровне значимости, составляющем 5%, требуется приблизительно 37 субъектов на лечебную группу. Так как указанные Фазы νΉΑ исследования проводилась в первую очередь для оценки безопасности, установленный объем выборки, необходимый для определения эффективности был больше, чем имеющийся. В связи с этим оценивали тенденции эффективности.
Распределение/демографические данные:
В часть А - группу исследования, получающую последовательно увеличивающуюся дозу, было включено всего 13 субъектов. Часть В включала 51 субъекта, случайным образом определенного в группу, получающую 300 мкг/кг ΝΕυΟ (п=20), группу, получающую 450 ΝΕυΟ мкг/кг (Ν=21), и группу, получающую 6 мг пэгфилграстима (п=10).
b) Результаты исследования
В ходе подбора первоначальной дозы в отсутствие химиотерапии было показано, что ΝΕυΟ является хорошо переносимым и приводит к ожидаемому повышению ΑNС с достижением максимального значения ΑNС между 2 и 4 днем и возвращением к норме к 14 дню (фиг. 22).
В части А у всех трех субъектов в группе, получающей дозу 50 мкг/кг ΝΕυΟ, и 1 субъекта в группе, получающей дозу 450 мкг/кг нейгранина, развивалась фебрильная нейтропения или острая нейтропения, длящаяся более 5 дней. В части В у одного субъекта в группе, получающей дозу 300 мкг/кг ΝΕυΟ, и 2 субъектов в группе, получающей дозу 450 мкг/кг ΝΕυΟ, развивалась фебрильная нейтропения или острая нейтропения, длящаяся более 5 дней. У одного субъекта в группе, получающей пэгфилграстим, развивалась фебрильная нейтропения или острая нейтропения, длящаяся более 5 дней.
c) Иммуногенность
Образцы сыворотки у субъектов, получающих ΝΕυΟ, для выявления антител к ΝΕυΟ собирали до введения дозы на 1 день каждого цикла лечения ΝΕυΟ и во время последнего посещения субъекта (по меньшей мере через 15 дней после введения последней дозы). Если в какое-либо время в течение исследования у субъекта выявлялась положительная реакция на антитела к ΝΕυΟ, получали повторный образец примерно через 6 месяцев после введения последней дозы ΝΕυΟ.
Все субъекты части А и части В завершали тестирование к моменту окончания лечения. Все образцы были отрицательными на антитела к ΝΕυΟ.
Ф) Нежелательные явления
В течение части А дозолимитирующую токсичность (ОЬТ) определяли как клинически значимое нежелательное явление (явления) 2, или более, степени, рассматриваемое как возможно связанное, вероятно связанное или связанное с агентом исследования, за исключением боли в позвоночнике 2 степени.
ЭЙТ не наблюдалась в 0 Цикле в какой-либо из групп части А. Были отмечены только 2 нежелательных явления, которые рассматривались как связанные с введением ΝΕυΟ: боль в кости и обострение предсуществующей гипертензии, при этом обострение предсуществующей гипертензии происходило через 7 дней после введения ΝΕυΟ. Оба явления разрешались без осложнений.
У 31 из 41 субъекта, получающих лечение ΝΕυΟ, возникало по меньшей мере 1 нежелательное явление. Частота возникновение НЯ среди субъектов, получающих лечение ΝΕυΟ и получающих лечение пэгфилграстимом, была сопоставимой (75,6 и 70%, соответственно).
Обзор обычно отмечаемых нежелательных явлений (НЯ, встречающиеся у 5% или больше, всех субъектов) для части В представлен в табл. 5.
- 30 023344
Таблица 5: Обзор возникших во время проведения лечения нежелательных явлений в популяции субъектов Части В I Фазы
Медицинский словарь регулирующей деятельности Термин предпочтительного употребления ΝΕυο 300 (N=20) ΝΕυο 450 (N=21) Пэгфилграстим (N=101
Связанные НЯ1:
Боль в кости 1 (4,5%) 3 (14,3%) 0 (0%)
Несвязанные НЯ2:
Тошнота 3 (15%) 3 (14,3%) 3 (30%)
Рвота 1 (5%) 3 (14,3%) 3 (30%)
Диарея 1 (5%) 1 (4,8%) 1 (10%)
Стоматит 0 (0%) 3 (14,3%) 0 (0%)
Утомляемость 0 (0%) 0 (0%) 1 (10%)
Фарингит 2 (10%) 0 (0%) 1 (10%)
Алопеция 4 (20%) 7 (33%) 2 (20%)
Т ромбоцитопения 0 (0%) 0 (0%) 1 (10%)
Головная боль 0 (0%) 1 (4,8%) 1 (10%)
Г ипокалиемия 0 (0%) 2 (10%) 1 (10%)
Недостаточность витамина ϋ 3 (15%) 0 (0%) 1 (10%)
Г ипертензия 0 (0%) 1 (4,8%) 1 (10%)
Связанные = рассматриваемые как возможно связанные, вероятно связанные или связанные
Наиболее часто отмечаемым нежелательным явлением, которое было признано связанным с NΕυО, была боль в костях, типичная нежелательная реакция, связанная с введением всех продуктов О-С8Р, которая отмечалась у 5 пациентов: 4 субъектов, перечисленных в вышеприведенной таблице, и одного субъекта из части А, получающего 450 мкг/кг. Во всех случаях боль в кости имела 1-2 степень выраженности согласно общим критериям для обозначения нежелательных явлений Национального института исследования рака ^С1-СТСАЕ), временной по продолжительности и разрешалась без осложнений. Повышение уровня щелочной фосфатазы и мочевой кислоты 1 степени происходило после введения NΕυО в 0 Цикле; указанные явления по мнению Исследователя не были клинически значимыми и разрешались самопроизвольно. Указанные явления представляли собой ожидаемые эффекты у пациентов, получающих О-С8Р (например, Нейласта®).
Другие общие отмечаемые нежелательные явления, возникающие во время циклов химиотерапии (тошнота, рвота, алопеция, стоматит), соответствовали ожидаемым нежелательным явлениям у пациентов, получающих лечение доксорубицином/доцетакселом.
Большинство зарегистрированных НЯ представляли собой НЯ 1 или 2 степени выраженности согласно общим критериям Национального института исследования рака (ΝΟ СТС). Было отмечено четыре НЯ, которые рассматривались как серьезные нежелательные явления. У двух субъектов (одного, получающего дозу 150 мкг/кг, и одного, получающего дозу 450 мкг/кг) возникла рвота, которая привела к госпитализации, при этом у одного из указанных субъектов развилось второе серьезное нежелательное явление (СНЯ) в следующем цикле химиотерапии - слабо выраженная рвота, которая привела к госпитализации или продлила срок госпитализации. Третий субъект, получающий дозу 450 мкг/кг, был госпитализирован с фебрильной нейтропенией. Явления были признаны не связанными с NΕυО.
Е) Фармакокинетика
У всех субъектов, получающих NΕυО, собирали образцы крови для определения концентраций ΝΕυθ в сыворотке в ходе исследования. Лекарственное средство выявляли с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) в сэндвич-модификации, специфичного к NΕυО. Данные зависимости концентрации лекарственного средства в сыворотке от времени использовали для анализа фармакокинетики с использованием программы Шп^оиНи Εη1е^р^^δе Εй^1^οп, версии 4,1 (или более поздней версии), с использованием независимого от модели анализа или анализа на основе модели. Оценивали следующие фармакокинетические параметры: площадь под кривой (АИСо-оо), клиренс (СЬ/Р), объем распределения (νζ/Ρ), максимальная концентрация (Стах), период полуабсорбции (11/2, аЬз), период полувыведения (11/2, ейт) и среднее время удержания (МКТ). Проводили оценку линейности фармакокинетических данных для диапазона доз, используемых в протоколе.
Фармакокинетические параметры для 0 Цикла (до проведения химиотерапии) приведены в табл. 6, и фармакокинетическая кривая для 0 Цикла изображена на фиг. 3.
- 31 023344
Таблица 6 Фармакокинетические данные для нейгранина у субъектов,
представляющих собой люде й (I Фаза, 0 Цикл)
Параметр ΝΕυσ ΝΕΙΚ3 ΝΕΙΚ3
Доза (мкг/кг) 150 мкг/кг 300 мкг/кг 450 мкг/кг
Число субъектов 3 4 3
АИС (час*нг/мл) (среднее ± δϋ) 1758 ±1675 3390 + 2003 10131 +9563
11/2,£епп(час) (среднее ± δϋ) 14,4 + 4,0 23,5 + 10 29 + 9,3
Стах (НГ/МЛ) (среднее ± δϋ) 72,7 + 59,7 108,9 + 50,5 294 + 351
1тах (час) (среднее) 12 15 18
δϋ - Стандартное отклонение
Эффект лекарственного средства, который измерялся на основании максимальной концентрации ΝΕυΟ в сыворотке и площади под кривой зависимости концентрации от времени, увеличивался дозозависимым образом. Концентрации в сыворотке субъектов группы, изначально получающей дозу 50 мкг/кг, были стабильно меньше нижнего предела дозирования (6,3 нг/мл). Ттах находилась в пределах 6-24 часов для всех доз от 150 до 450 мкг/кг. Стах варьировала от 72,7 ± 59,7 (среднее ± δϋ) нг/мл при дозе 150 мкг/кг до 294 ±351 нг/мл, при дозе 450 мкг/кг. Соответственно, Αυ^-οο варьировала от 1758 ± 1675 нг/мл-ч при дозе 150 мкг/кг до 10131 ± 9563 нг/мл-ч при дозе 450 мкг/кг. Диапазоны для 1 Цикла были сходными. Средний период полувыведения ΝΕυΟ варьировал от 14-30 ч.
Как отмечено в Характеристиках исследования (раздел 4, выше), субъекты в Части А получали первую дозу ΝΕυΟ по меньшей мере за 2 недели до начала проведения химиотерапии (0 Цикл) для первоначальной оценки безопасности и влияния на абсолютное число нейтрофилов (ΑΝΟ') в отсутствие цитотоксической химиотерапии. Как минимум через 2 недели наблюдения по завершению исследования, если не возникало дозолимитирующих нежелательных явлений в 0 Цикле, которые рассматривались как связанные с введением ΝΕυΟ, и субъект продолжал удовлетворять всем критериям отбора, указанный субъект получал ΝΕυΟ в той же дозе после проведения химиотерапии в 1 и 2 Циклах. ΝΕυΟ вводили через 24 ч после проведения химиотерапии. На фиг. 7 показаны ΑNС и ^ВС для субъектов, которые получали ΝΕυΟ в течение 1 и 2 Циклов.
ί) Фармакодинамика и определение доз для части В
При анализе данных, полученных для части А I Фазы исследования, были сделаны следующие выводы:
1. ΝΕυΟ вызывает дозозависимое повышение числа лейкоцитов и повышение ΑNС в 0 Цикле (до проведения химиотерапии) (см. данные 0 Цикла на фиг. 7А).
2. Повышение ΑNС в 0 Цикле было сопоставимо с имеющимися данными для эквимолярных доз пэгфилграстима.
3. Как и ожидалось, происходит снижение ^ВС и Α№ после проведения химиотерапии.
4. Восстановление после достижения минимального значения ΑNС происходит дозозависимым образом.
5. ΑNС и ^ВС восстанавливались до нормальных значений к 15 дню.
На основании вышеуказанных наблюдений и демонстрации безопасности всех размеров дозы части А для части В были выбраны дозы 300 и 450 мкг/кг. Как описано выше, субъектов случайным образом распределяли в группы, получающие 300 мкг/кг ΝΕυΟ, 450 мкг/кг ΝΕυΟ и пэгфилграстим в утвержденной фиксированной дозе 6 мг. Субъекты получали ΝΕυΟ или пэгфилграстим через день после введения доксорубицина/доцетаксела (вводимых в 2-х циклах с интервалом в 21 день). Данные для части В включают кривые ΑNС для популяции субъектов 1 Цикла. Суммированные результаты приведены на фиг. 8 и в табл. 5, ниже.
Частоту возникновения нейтропении 3 и 4 степени и кривые ΑNС в течение 1 Цикла описывали для 48 из 51 субъекта, получающего лечение, как показано в табл. 7 ниже. Отметим, что у 70-80% пациентов, получающих лечение доксорубицином/доцетакселом, возникала нейтропения 4 степени с продолжительностью в среднем 5 дней в отсутствие профилактического лечения ΟΝ'δΕ
- 32 023344
Таблица 7: Частота возникновения и продолжительность нейтропении 4 степени для Части В I Фазы после 1 Цикла химиотерапии
Лечение ΝΕυσ Пэгфилграстим
Доза 300 мкг/кг 450 мкг/кг 6 мг
Число субъектов 20 21 10
Случаи возникновения нейтропении 4 степени 9 6 3
Возникновение нейтропении 4 степени, % 45,0% 28,6% 30,0%
Среднее(дни) 1,1 1,0 0,7
δϋ (дни) 1,33 1,67 1,16
Диапазон (дни) 0-4 0-5 0-3
δϋ - Стандартное отклонение
Кривые средних АNС для лечебных групп представлены на фиг. 2. ΝΕυΟ является эффективным в лечении нейтропении 3 и 4 степени и фебрильной нейтропении. В отсутствие проведения лечения Ст-СВР для указанного химиотерапевтического лечения частота возникновения фебрильной нейтропении составляет примерно 40%. После введения ΝΕυΟ наблюдали дозозависимое повышение АNС и снижение частоты возникновения нейтропении по сравнению с ожидаемыми значениями для доксорубицина/доцетаксела. Не было выявлено неожидаемых или серьезных нежелательных явлений, связанных с введением ΝΕυΟ.
Частота возникновения нейтропении 3 и 4 степени была выше у пациентов, получающих 300 мкг/кг ΝΕυΟ, чем у пациентов, получающих пэгфилграстим (Нейласта®), и АСЫ в период восстановления до нормальных значений также происходило медленнее у пациентов, которые получали 300 мкг/кг ΝΕυΟ, чем у субъектов, которые получали пэгфилграстим. Кривые ΑΝΕ для пациентов, которые получали ΝΕυΟ в дозе 450 мкг/кг, и пациентов, которые получали пэгфилграстим, были одинаковыми, несмотря на то, что во время восстановления ΑΝΌ после нейтропении было в целом ниже у пациентов, которые получали ΝΕυΟ, чем у пациентов, которые получали пэгфилграстим. Таким образом, ΝΕυΟ в указанных дозах обеспечивает такой же эффект, как пэгфилграстим.
д) ФК/ФД кривые для Фазы I, части В
Фармакокинетические/фармакодинамические кривые (ФК/ФД) для пациентов, страдающих раком молочной железы, получавших 450 мкг/кг ΝΕυΟ через один день после введения доксорубицина/доцетаксела в 1 Цикле лечения, показаны на фиг. 4. Стах для ΝΕυΟ достигается в течение одного дня после введения и постепенно снижается до необнаруживаемого уровня к 10 дню. После введения ΝΕυΟ АКС повышается до максимального значения к 4 дню, а затем, как ожидается у пациентов, получающих доксорубицин/доцетаксел и лечение Ο-СЗР, АНС снижается до минимального значения на 8 день и возвращается к норме на 10 день. К 12 дню АМС находятся в пределах нормальных значений, и ΝΕυΟ не выявляется. Необходимо отметить, что у пациентов, которые не получали профилактическое лечение ΟС8Р, поддержание ΑNС на минимальном уровне и время восстановления уровня ΑNС было намного больше (например, 5-7 дней). После введения дозы 450 мкг/кг срединный период полувыведения ΝΕυΟ составлял примерно 30 ч по сравнению с 15-80 ч, описанными для стандартной дозы пэгфилграстима.
Р) Дополнительные различия между ΝΕυΟ и пэгфилграстимом
Более детальные различия в эффективности ускорения восстановления после нейтропении между ΝΕυΟ и пэгфилграстимом в тестируемых дозах наблюдаются при сравнении кривых ΑNС субъектов в 1 Цикле лечения. Максимальные значения ΑNС во всех группах были очень похожи, минимальные значения ΑNС у субъектов, получающих ΝΕυΟ в дозе 300 мкг/кг, были ниже, чем у субъектов, получающих ΝΕυΟ в дозе 450 мкг/кг, и минимальные значения ΑNС у субъектов, получающих пэгфилграстим, были в среднем самыми высокими. Восстановление после достижения минимального значения ΑNС до исходного уровня происходило к 14 дню во всех лечебных группах, но было медленнее у субъектов, которые получали 300 мкг/кг ΝΕυΟ, чем у субъектов, которые получали 450 мкг/кг ΝΕυΟ, и самым быстрым для субъектов, получающих пэгфилграстим.
Имеющиеся опубликованные данные исследования пэгфилграстима при его аналогичном введении до проведения химиотерапии сравнивали с ФК/ФД данными для ΝΕυΟ, полученными на пациентах, которые завершили I Фазу исследования с прохождением запланированного 0 Цикла (до проведения химиотерапии). Результаты указанного сравнения были следующие:
1. Бтах (максимальное наблюдаемое ΑNС) при дозе ΝΕυΟ 150 мкг/кг соответствует значениям для дозы пэгфилграстима 30 мкг/кг в 0 Цикле, которая, как позже было продемонстрировано, является следующей по эффективности после установленной эффективной дозой пэгфилграстима, составляющей 100 мкг/кг.
2. Бтах для доз нейгранина 300 и 450 мкг/кг соответствует значениям для дозы пэгфилграстима 100 мкг/кг в 0 Цикле.
- 33 023344
3. Для доз ΝΕυΟ 300 и 450 мкг/кг срединные значения Стах и срединные значения Итах были почти одинаковыми, таким образом, значение Стах также позволяло предсказывать значение Бтах.
4. Повышение ΑΝί'.' было сопоставимым с опубликованными данными для эквимолярных доз пэгфилграстима.
Как обсуждается выше, оценка ФК/ФД у животных соответствовала оценке эквивалентности доз ΝΕυΟ и пэгфилграстима при дозировании на эквимолярной основе. У мышей эквивалентные значения Αυθ™ο достигались при дозе, превышающей в 7,7 раз дозу пэгфилграстима. Поскольку альбумин вносит значительный вклад в молекулярную массу ΝΕυΟ, и Нейласта® (пэгфилграстим) дозируется на основе массы гНС-СБЕ (не включая вклад полиэтиленгликоля в массу пэгфилграстима), предполагается, что доза ΝΕυΟ, превышающая дозу Нейласта® (пэгфилграстима) в 4,5 раз (на основе массы), будет иметь такую же эффективность. По результатам данных, полученных на животных, эквивалентная по эффективности доза ΝΕυΟ превышает дозу пэгфилграстима в 4,5-7,7 раз (1 мг пэгфилграстима = 4,5-7,7 ΝΕυΟ). Доклинические данные по безопасности и эффективности соответствуют указанным оценкам доз и наряду с имеющимися клиническими данными формируют основу для выбора доз для проведения клинических исследований.
ί) Результаты I Фазы
Результаты по оценке фармакокинетических данных для I Фазы следуют далее. ΝΕυΟ выявляли в образцах сыворотки всех субъектов, получающих лечение ΝΕυΟ в дозах 150, 300 и 450 мкг/кг в 0 Цикле и 1 Цикле.
В 1 Цикле ΝΕυΟ выявляли вплоть до прохождения 144 ч у большинства субъектов (45/50 образцов) в группах, получающих дозы 150, 300 и 450 мкг/кг. Фактически не наблюдалось накопления лекарственного средства от цикла к циклу.
Воздействие лекарственного средства было выше в 1 Цикле и в 0 Цикле (до проведения химиотерапии) в каждой группе, получающей лечение. Повышенное воздействие ΝΕυΟ в 1 Цикле вероятно связано со сниженным количеством нейтрофилов, которые играют роль в рецептор-опосредованном клиренсе С-С'.БЕ Средний период полувыведения ΝΕυΟ в 1 Цикле составлял примерно 36 ч для группы, получающей дозу 300 мкг/кг, и 30 ч для группы, получающей дозу 450 мкг/кг. Описанный период полувыведения для филграстима составляет 3-4 ч и для пэгфилграстима составляет 42-67,5 ч, в зависимости от дозы. Наблюдали статистические значимые отличия между дозами по времени до максимальной концентрации в сыворотке (1тах) и периоду полуабсорбции (11/2,аъз)-Оба эти параметра увеличивались с повышением дозы ΝΕυΟ. Никакие другие стандартные фармакокинетические параметры не показали статистически значимых отличий между дозами доз.
Пример 12. II ФАЗА
II Фаза исследования представляла собой контролируемое рандомизированное исследование, проводимое на 334 субъектах, страдающих раком молочной железы, которые получали до 4 доз доксорубицина/доцетаксела. Исследование включало примерно 45 мест проведения и состояло из предварительной Фазы с двойной рандомизацией для оценки безопасности и эффективности ΝΕυΟ при его подкожном введении по сравнению с пэгфилграстимом и последующей основной Фазы, в которой субъектов случайным образом распределяли в группы, получающие пэгфилграстим и две хорошо переносимые дозы ΝΕυΟ (1:1:1), выбранные на основании результатов предварительной фазы. Объем выборки для основной Фазы выбирали в соответствии с необходимой статистической мощностью для определения эффективности ΝΕυΟ, не меньшей, чем у пэгфилграстима на основании главного конечного показателя, продолжительности острой (4 степени) нейтропении (ΌδΝ) в течение 1 Цикла химиотерапии. План исследования схематично показан ниже.
- 34 023344
1. Цель
Основная цель II Фазы заключалась в выборе доз ЫЕиО, демонстрирующих сравнимую с пэгфилграстимом эффективность, и оценке продолжительности острой нейтропении (Э8Ы) в 1 Цикле химиотерапии после проведения лечения ЫЕиО. Дополнительная цель заключалась в оценке О8Ы во 2-4 Циклах, оценке времени восстановления абсолютного числа нейтрофилов и частоты возникновения фебрильной нейтропении в 1-4 Циклах и оценке безопасности, переносимости, фармакокинетики (в 1 Цикле) и иммуногенности ЫЕиО.
2. Характеристики пациентов
Для II Фазы пациентов отбирали на основании следующих характеристик или параметров:
Включающие:
1. Пациенты с гистологически подтвержденным раком молочной железы, для которых предусмотрено получение 60 мг/м2 доксорубицина и 75 мг/м2 доцетаксела.
2. Возраст: 18 лет или старше.
3. Достаточная гематологическая функция.
4. АЫС > 1500/мм3
5. Тромбоциты > 100,000/мм
6. Удовлетворительная функция печени и почек:
7. Креатинин сыворотки < 2,0 х верхней границы нормы
8. Общий билирубин в пределах нормы (\\Ы1.) для местной лаборатории.
9. Трансаминазы сыворотки (8ООТ/8ОРТ) < 1,5 х верхней границы нормы.
10. Щелочная фосфатаза < 2,5 х верхней границы нормы.
11. Общее состояние 0-2 по шкале Многоцентровой онкологической исследовательской группы Востока США (ЕСОО).
12. Могут получать доксорубицин исходя, если фракция выброса левого желудочка (ФВЛЖ) в пределах нормы.
13. Способны понимать требования исследования, предоставлять информированное согласие в письменной форме (включая согласие на использование и раскрытие относящейся к исследованию информации о состоянии здоровья) и соблюдать процедуры согласно протоколу исследования.
Исключение:
1. Более 1 предшествующего химиотерапевтического лечения (включая адъювантную терапию, проведенную в течение последних 12 месяцев)
2. Кумулятивная доза антрациклина, которая могла бы препятствовать проведению 4 полнодозовых Циклов доксорубицина согласно настоящему исследованию.
3. Предшествующая химиотерапия/иммунотерапия в течение 30 дней до проведения химиотерапии согласно исследованию (в течение 6 недель до проведения химиотерапии согласно исследованию для нитрозомочевины (ВСЫи, ССЫи) или митомицина-С).
4. Сопутствующий прием трастузумаба (герцептина)
5. Прием какого-либо экспериментального препарата за прошедшие 30 дней.
6. Сердечные заболевания, признаки или симптомы в анамнезе, которые по мнению исследователя исключают использование химиотерапевтического лечения на основе антрациклинов.
- 35 023344
7. Предшествующее проведение хирургического лечения в течение 2 недель до проведения химиотерапии согласно исследованию.
8. Предшествующее проведение радиотерапии в течение 4 недель от проведения химиотерапии согласно исследованию (за исключением точечного облучения метастазов в кости).
9. Предшествующая химиотерапия с высокой дозой и с трансплантацией гематопоэтических стволовых клеток.
10. Предшествующее использование С-С8Р, СМ-С8Р или эритропоэтина в течение 4 недель от проведения химиотерапии согласно исследованию.
11. Прием системных антибиотиков в течение 72 ч от проведения химиотерапии согласно исследованию.
12. Злокачественные миелоидные опухоли или миелодисплазия в анамнезе.
13. Наличие метастазов в головном мозге без проведения подходящего лечения (хирургического лечения или радиотерапии), отсутствие данных о прогрессировании заболевания с наблюдением как минимум в течение 3 недель и данных о неврологической стабильности без применения противосудорожных средств и стероидов.
14. Наличие серповидно-клеточной анемии.
15. Диагноз респираторного дистресс-синдрома взрослых (РДСВ).
16. Имеющаяся аллергия на получаемые из дрожжей продукты в анамнезе.
17. Имеющаяся гиперчувствительность к получаемым из Ε.αοΐί белкам, пэгфилграстиму, филграстиму или любому другому компоненту пэгфилграстима.
18. Беременная женщина или кормящая мать (Все женщины с полноценной маткой должны иметь отрицательный сывороточный тест на беременность при скрининге субъектов. Все женщины, не прошедшие стерилизацию и не находящиеся в периоде менопаузы, должны использовать клинически одобренный способ контрацепции в течение исследования и в течение 30 дней после введения последней дозы исследуемого агента).
19. Мужчины, которые не согласны использовать эффективную контрацепцию на протяжении всего исследования и в течение 30 дней после введения последней дозы исследуемого агента.
20. ВИЧ-положительные субъекты или субъекты с активным гепатитом (пациенты с неизвестным статусом не подлежат тестированию).
Субъектов исключали из дальнейшего лечения по следующим причинам:
1. Прогрессирование заболевания.
2. Неприемлемые токсические явления, несмотря на оптимальное лечение.
3. Интеркуррентное заболевание по усмотрению исследователя.
4. Получение лечения доксорубицином с достижением максимально допустимой для жизни кумулятивной дозы (см. критерии отбора).
5. Отзыв согласия.
6. Несоблюдение требований/незавершение наблюдения.
7. Беременность.
Если лечение исследуемым лекарственным средством прекращали, субъекты оставались в исследовании на наблюдении в течение по меньшей мере 30 дней после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства для запланированной проверки безопасности и оценки фармакокинетических свойств.
3. Исследуемый агент
ΝΕυΟ (рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, гН8А-С-С8Р) представляет собой гибридный белок с молекулярной массой приблизительно 85 кДа, соединенный в одну цепь, содержащую остатки 1-585, соответствующие зрелой форме Н8А, и остатки 586-759, соответствующие зрелой форме С-С8Р человека. Терапевтический фрагмент №НС представляет собой полученный из рекомбинантной ДНК человека С-С8Р. №НС поставляли в виде стерильного, лиофилизированного состава в одноразовых стеклянных флаконах 1 типа и хранили при температуре 2-8°С. После восстановления 1,0 мл стерильной воды для инъекций каждый флакон содержал 50 мг/мл ЖиС (поставляется в дозе 50 мг/флакон) в 20 мМ фосфате натрия, 180 мМ манните, 60 мМ дегидрате трегалозы, 0,01% (мас./об.) полисорбате 80, рН 6,0. отметим, что NΕиС также предложен в виде жидкости, либо в ампулах, либо в предварительно заполненных шприцах.
Композиция лекарственного продукта, применяемого во II Фазе, представлена на фиг. 14. Различия между составами ΝΕυΟ использованными в I Фазе и II Фазе, показаны ниже в табл. 8.
- 36 023344
Таблица 8: сравнение составов сСМР
Свойство носителя состава Состав I Фазы Состав II Фазы Обоснование внесенного изменения
Активные фармацевтические ингредиенты (ΑΡΙ) 15,0 мг/мл 50 мг/мл Повышенная концентрация ΑΡΙ для снижения объема инъекции
Фосфат натрия 10 мМ 20 мМ Более высокая ионная сила снижает зависимую от концентрации агрегацию
Маннит 200 мМ 180 мМ Восстановленный для получения изоосмотического раствора
Дигидрат трегалозы 60 мМ 60 мМ Неизмененный—действует как сильный крио/лиопротектор.
Полисорбат 80 0,01% 0,01% Неизмененный—подавляет неспецифическую агрегацию и абсорбцию
рН 7,2 6,0 Пониженный рН снижает зависимую от концентрации агрегацию
Состав, применяемый в I Фазе, был достаточно стабильным со сроком хранения, составляющим по меньшей мере 2 года. По результатам исследования было показано, что более высокая ионная сила и более низкий рН также стабилизировали составы с более высокими концентрациями ΑРI (> 25 мг/мл) (данные не показаны). В связи с этим состав II Фазы имеет более низкий рН (6,0 по сравнению с 7,2) и более высокую концентрацию фосфата (20 по сравнению с 10 мМ). Результаты исследования форсированной деградации указывают на то, что указанный состав защищает лекарственное средство в жидком состоянии от повреждений после энергичного взбалтывания, повторных замораживаний -оттаиваний и зависимой от концентрации агрегации. Лиофильная сушка препарата II Фазы также приводит к получению хорошо оформленных таблеток.
Коммерчески доступный Нейласта® (пэгфилграстим) поставляли в предварительно заполненных шприцах на 0,6 мл для подкожной инъекции. Каждый шприц содержал 6 мг пэгфилграстима (исходя из массы белка) в стерильном, прозрачном, бесцветном, не содержащем консервантов растворе (рН 4,0), включающем ацетат (0,35 мг), сорбит (30,0 мг), полисорбат 20 (0,02 мг) и натрий (0,102 мг) в воде для инъекций (в соответствии с фармакопеей США, ЦЪР). ΝΕυΟ (30, 40, 50 или 60 мг) или Нейласта® (пэгфилграстим) (6 мг) доставляли путем подкожного введения.
Обоснование выбора дозы
Данные, полученные по результатам I Фазы, демонстрировали, что дозы ΝΕυΟ 300 и 450 мкг/кг были безопасными и хорошо переносимыми. Более того, по сравнению с утвержденными фиксированными дозами пэгфилграстима обе дозы ΝΕυΟ оказывали такое же влияние на кривые ΑNС у пациентов, страдающих раком молочной железы, проходящих цитотоксическую химиотерапию. АиС для кривых ΑNС служит как единичное измерение эффективности. Не наблюдалось статистически значимых отличий среди указанных лечебных групп относительно АиСА№3, однако, АиС для группы 450 мкг/кг немного выше, чем наблюдаемый для группы 300 мкг/кг и почти идентичен для наблюдаемого для группы, получающей пэгфилграстим (фиг. 23). На основе имеющихся данных было показано, что 300 мкг/кг ΝΕυΟ является менее эффективным, чем пэгфилграстим, и 450 мкг/кг приблизительно равняется минимальной необходимой дозе для обеспечения эквивалентного пэгфилграстиму эффекта.
Фиксированные дозы предназначены для определения таких доз, которые будут достаточными для обеспечения эффективности и безопасности для всех пациентов независимо от массы тела. Согласно результатам I Фазы было определено, что доза ΝΕυΟ 450 мкг/кг является минимальной дозой, необходимой для обеспечения подобного пэгфилграстиму эффекта, и доза > 300 мкг/кг была выбрана как минимальная доза для дальнейшего исследования в Фазе II. Для выбора фиксированных доз ΝΕυΟ отбирали популяцию пациентов (страдающих раком молочной железы) для II Фазы. Для диапазона масс тела 40100 кг фиксированная доза, составляющая 30 мг, обеспечивала пациента с самой большой массой тела минимальной дозой (300 или 0,3 мг/кг), тогда как приблизительно 75% пациентов получали по меньшей мере запланированную к исследованию дозу 450 мг/кг, в фиксированной дозе, составляющей 40 мг. Таким образом, дозы, выбранные для исследования во II Фазе, составляли 30, 40 и 50 мг. Они обеспечивали пациента со средней массой 70 кг дозами 0,42, 0,57 и 0,71 мг/кг соответственно.
Эквивалентные дозы в расчете на килограмм массы тела для фиксированных доз, определенных в настоящем исследовании, представлены в табл. 9.
- 37 023344
Таблица 9: Эквивалентные дозы в расчете на килограмм массы тела для предполагаемого диапазона масс субъектов
50 кг 60 кг 70 кг 80 кг 90 кг 100 кг
30 мг 0,600 0,500 0,429 0,375 0,333 0,300
40 мг 0,800 0,667 0,571 0,500 0,444 0,400
50 мг 1,000 0,833 0,714 0,625 0,556 0,500
60 мг 1,200 1,000 0,857 0,750 0,666 0,600
Доклиническая безопасность ΝΕυΟ обеспечивает дополнительные данные в пользу безопасности ΝΕυΟ в указанных дозах. Ожидается, что воздействие на пациентов указанных фиксированных доз (Ате и Стах) будет меньше, чем воздействие хорошо переносимых доз на обезьян. Например, Стах и Ате у обезьян при введении хорошо переносимой дозы 1 мг/кг в 12 раз превышал значение для людей при введении дозы 0,45 мг/кг, что указывает на возможность применения коэффициента для дальнейшей оценки безопасности более высоких доз у пациентов на основании результатов исследования токсичности многократных доз у обезьян, получающих дозы до 10 мг/кг (включительно), которые были хорошо переносимыми. Было показано, что такие высокие дозы пэгфилграстима, как 0,3 мг/кг, являются безопасными для пациентов.
4. Характеристики исследования
А) План и продолжительность исследования
Настоящее исследование представляло собой контролируемое рандомизированное исследование, проводимое приблизительно на 330 субъектах, страдающих раком молочной железы, которым показано получение вплоть до 4 доз доксорубицина/доцетаксела. Указанное исследование, которое включало 45 мест проведения, состояло из двух фаз, предварительной Фазы и основной Фазы. Часть А предварительной Фазы представляла собой двойное рандомизированное исследование для оценки безопасности и эффективности ΝΕυΟ по сравнению с пэгфилграстимом, с последовательным включением субъектов исследования в следующие группы доз: 30 мг ΝΕυΟ (Ν=10) по сравнению с пэгфилграстимом (Ν=5); 40 мг ΝΕυΟ (Ν=20) по сравнению с пэгфилграстимом (Ν=10), и 50 мг ΝΕυΟ (Ν=20) по сравнению с пэгфилграстимом (Ν=10). Согласно еще одному исследованию тестировали также 60 мг ΝΕυΟ (Ν=20) по сравнению с пэгфилграстимом (Ν=10). В Части А предварительной Фазы субъектов случайным образом распределяли в группы, получающие ΝΕυΟ и пэгфилграстим (в отношении 2:1) с общим числом субъектов в группе, получающей дозу 30 мг, равным 10, и общим числом субъектов в каждой из других групп, равным 20.
ΝΕυΟ или пэгфилграстим вводили субъектам через 24 ч после проведения химиотерапевтического лечения в каждом цикле. Субъектов распределяли по лечебным группам с использованием стратифицированной рандомизации для баланса весовых категорий среди лечебных групп (<50 кг, >50 кг и < 80 кг или > 80 кг) до проведения химиотерапии и общего распределения.
После предварительной Фазы 255 субъектов случайным образом распределяли (1:1:1) в группы, получающие пэгфилграстим и две хорошо переносимые дозы ΝΕυΟ с наиболее сопоставимым с пэгфилграстимом эффектом согласно результатам предварительной Фазы (фазы с уравновешенной рандомизацией в 3 группы). ΝΕυΟ или пэгфилграстим вводили через 24 ч после проведения химиотерапевтического лечения в каждом Цикле. Субъектов распределяли по лечебным группам с использованием стратифицированной рандомизации для баланса весовых категорий среди лечебных групп (<50 кг, > 50 кг и < 80кг, или >80 кг).
В течение предварительной фазы постоянно отслеживали возникновение нежелательных явлений. Повышение дозы от 30 до 50 мг осуществляли, пока результаты анализа поступающих данных указывали на безопасность дозы. Если кривая ΑNС в Цикле 1 для пациентов, получающих дозу нейгранина 40 мг, оказывается ниже кривой для пациентов, получающих пэгфилграстим, и доза нейгранина 50 мг является безопасной, то может быть сформирована дополнительная когорта пациентов, рандомизированных в группу, получающую 60 мг нейгранина, и группу, получающую пэгфилграстим, в отношении 2:1 с общим числом пациентов в когорте, равным 30.
Каждый уровень дозы ΝΕυΟ сравнивали с пэгфилграстимом на предмет безопасности и эффективности. В табл. 10 приведены суммарные данные по распределению пациентов в Части А и В II Фазы.
- 38 023344
Таблица 10: Распределение субъектов в Части А и Части В II Фазы
Фаза ΝΕυΟ 30 мг ΝΕυΟ 40 мг ΝΕυΟ 50 мг Пэгфилграстим 6 мг
Предварительная, 30 10 - - 5
Предварительная, 40 - 20 - 10
Предварительная, 50 - - 20 10
С рандомизацией в 3 группы - 85 85 85
Общее 10 105 105 110
Оценка безопасности:
Безопасность ΝΕϋΟ оценивали на основе типа, частоты и выраженности НЯ, изменений в клинических лабораторных анализах (общего анализа крови и клинического биохимического анализа), иммуногенности, результатов медицинского осмотра и мониторинга основных физиологических показателей с течением времени. Все НЯ и лабораторные показатели токсичности классифицировали на основе общих терминологических критериев для оценки нежелательных явлений Национального института рака (ΝΟСТСАΕ, версия 3,0 от 12 декабря 2003).
Нежелательные явления фиксировали с момента начала введения исследуемого лекарственного средства до 30 дня после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства. Серьезные нежелательные явления (СНЯ) фиксировали с момента согласия до 30 дня после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства. Лабораторные исследования проводили согласно плану исследования.
С) Сопутствующая терапия
Химиотерапия
Схема химиотерапевтического лечения для настоящего исследования включала последовательное введение путем внутривенной инфузии 60 мг/м2 доксорубицина и 75 мг/м2 доцетаксела, начиная с 1-го дня проведения лечения и в течение четырех 21-дневных циклов.
Для проведения каждого цикла терапии требовалось, чтобы субъекты имели абсолютное число нейтрофилов (АИС) > 1000/мм3 и абсолютное содержание тромбоцитов > 100,000/мм3. Лечение могло быть отсрочено до двух недель для гематологического восстановления. Снижение дозы на 25% от химиотерапевтической дозы было возможным в случае возникновения негематологической токсичности 3-4 степени, двух случаев инфекций 3-4 степени или тромбоцитопении 4 степени. Использование профилактических антибиотиков или других гематопоэтических факторов роста во время участия в исследовании было запрещено.
Согласно имеющимся данным комбинация доксорубицина и доцетаксела проявляет значительную активность при лечении пациентов, страдающих раком молочной железы. Однако указанная комбинация оказывает сильное миелосупрессивное действие и приводит к более высокой частоте возникновения нейтропении 3 или 4 степени, чем другие стандартные схемы лечения.
Даже при добавлении С8Р использование комбинации доксорубицина и доцетаксела вызывает развитие нейтропении 4 степени у 79% пациентов с частотой возникновения фебрильной нейтропении 918%. Указанную схему лечения доксорубицином/доцетакселом использовали для исследования новых агентов на предмет их способности предотвращать развитие нейтропении и ее осложнений. Таким образом, комбинация доксорубицина и доцетаксела является подходящей схемой химиотерапевтического лечения для исследования активности такого нового агента, как ΝΕϋΟ.
Доксорубицин Фармакологические данные
Доксорубицина гидрохлорид представляет собой антибиотик антрациклинового ряда, получаемый из 81гер1отусек реисеПик уаг саектк, ингибирующий ДНК и ДНК-зависимый синтез РНК, а также синтез белков. Доксорубицин активен во всех фазах клеточного Цикла, но обладает максимальной цитотоксичностью в 8-фазе. Выведение указанного лекарственного средства осуществляется преимущественно печенью; почечный клиренс вносит незначительный вклад.
Фармацевтические данные
Указанное лекарственное средство можно приобрести во флаконах, содержащих 10, 20 50, 100 или 200 мг. Лиофилизированные препараты могут быть восстановлены стерильной водой для инъекций, 5% раствором декстрозы или 0,9% физиологическим раствором для инъекций. Побочные эффекты и токсичность
Дозолимитирующая токсичность доксорубицина проявляется миелосупрессией, в первую очередь лейкопенией, с минимальным содержанием лейкоцитов в течение приблизительно 10-14 дней, и кардио- 39 023344 токсичностью, включая редкий синдром острого перикардита-миокардита и отсроченную связанную с кумулятивной дозой кардиомиопатию.
Значительная алопеция и умеренно выраженная тошнота/рвота представляют собой ожидаемые токсические явления. Отмечали случаи возникновении местного повреждения кожи и тканей в месте случайной экстравазации, стоматита, гиперпигментации кожи (особенно области ногтевого ложа) и местной воспалительной реакции в местах предшествующего облучения.
Доцетаксел
Фармакологические данные
Доцетаксел представляет собой полусинтетический таксоид, который связывается со свободным тубулином и способствует сборке стабильных микротрубочек, препятствуя митозу и репликации клеток (специфичное влияние на М-фазу клеточного Цикла).
Доцетаксел активно связывается с белком, интенсивно метаболизируется в печени, приблизительно 75% дозы выводится с фекалиями в течение 7 дней.
Фармацевтические данные
Доцетаксел (Τаxоΐе^е , Запой Ауепйк) поставляется во флаконах, содержащих дозу для однократного введения (80 мг/2 мл или 20 мг/0,5 мл) вместе с флаконом, содержащим разбавитель (13% этанол в воде для инъекций). Каждый миллилитр Таксотера содержит 40 мг доцетаксела (безводного) и 1080 мг полисорбата 80.
Побочные эффекты и токсичность
Доцетаксел не следует назначать пациентам, у которых в анамнезе присутствуют тяжелые реакции гиперчувствительности к доцетакселу или другим лекарственным средствам, содержащим полисорбат 80, таким как этопозид и витамин Е.
Пациентам, испытывающим тяжелые реакции гиперчувствительности, не следует повторно назначать препарат. Всем пациентам, получающим доцетаксел, должны быть введены кортикостероиды в качестве премедикации, как указано ниже.
Слабо или умеренно выраженная печеночная недостаточность приводит к замедлению метаболизма и увеличению системного воздействия на 27 и 38% (АИС). Доцетаксел не следует назначать пациентам с уровнем 3ΟΟΤ и/или 3ΟΡΤ, превышающим норму более чем в 1,5 раза, и уровнем щелочной фосфатазы, превышающим норму более чем в 2,5 раза. Задержка жидкости в организме происходила у 17% (умеренно выраженная) и 6% (сильно выраженная) пациентов в ΙΙΙ Фазе исследования, несмотря на проведенную премедикацию кортикостероидами. Наблюдались тяжелые нейросенсорные симптомы (парестезия, дисестезия, боль).
Ожидаемые побочные эффекты включают миелосупрессию, в первую очередь лейкопению, с минимальным содержанием лейкоцитов в течение приблизительно 9 дней и с восстановлением к 15-21 дню. Отмечались случаи развития алопеции, изменения ногтей и кожи, стоматита, миалгии/артралгии, тошноты/рвоты и гипотензии.
Химиотерапевтическая доза, введение и модификации доз
В 1 день каждого Цикла лечения вводили химиотерапевтическое средство (доксорубицин, а затем доцетаксел).
Доксорубицин доставляли в дозе, составляющей 60 мг/м2, путем внутривенного болюсного введения через боковое ответвление инфузионной капельницы или через центральный венозный катетер для избежания экстравазального повреждения.
мг/м доцетаксела разводили в 250 мл 0,9% физиологического раствора или 5% раствора декстрозы и вводили внутривенно в течение приблизительно 1 ч с помощью полиэтиленовой системы для инфузии. Основные показатели состояния организма определяли непосредственно перед и после окончания инфузии доцетаксела.
Субъектов, у которых возникали острые реакции гиперчувствительности или негематологическая токсичность, препятствующие проведению дальнейших циклов химиотерапии, исключали из программы лечения, предусмотренного исследованием, но указанные субъекты полностью проходили последующее наблюдение.
Премедикация для химиотерапии
Кортикостероиды для перорального введения (при необходимости внутривенного введения) (например, 8 мг дексаметазона два раза в сутки) вводили в течение трех дней, начиная за 1 день до введения доцетаксела для снижения частоты возникновения и выраженности задержки жидкости и реакций гиперчувствительности.
Применение и выбор противорвотных средств или других средств премедикации (например, антагонистов Н2) проводили на усмотрение лечащего врача.
Запрещенные лекарственные средства
Субъекты не должны были получать ни одно из следующих лекарственных средств и/или процедур в ходе данного исследования и в дополнительное время, указанное ниже:
1. Системные антибиотики в течение 72 ч от проведения 1 цикла химиотерапии.
2. Другие исследуемые агенты в течение 30 дней до начала проведения исследования агента и во
- 40 023344 время проведения исследования.
3. Последующие циклы химиотерапии не проводят, пока не пройдет 14 дней после введения доз ΝΕυΟ.
4. Цитокины, другие гематопоэтические факторы роста и профилактические антибиотики во время проведения исследования в отсутствие возникновения продолжительной или фебрильной нейтропении. Субъекты, получавшие лечение С-С'ЪР в интервале между периодом отбора и 0 днем исследования, не должны были получать ΝΕυΟ, и их исключали из исследования.
Разрешенные лекарственные средства
Субъектам разрешали продолжать прием базового лекарственного средства (средств). Суточную дозу каждого лекарственного средства при возможности сохраняли постоянной на протяжении всего исследования. Если по какой-либо причине, значимой с точки зрения исследователя, субъекту требовалось дополнительное лекарственное средство (средства) или изменение дозы, то лекарственное средство (средства), способ введения и показание, по которому его вводили, регистрировали.
Субъектов, у которых возникали острые реакции гиперчувствительности или негематологическая токсичность, препятствующие проведению дальнейших циклов химиотерапии, исключали из программы лечения, предусмотренного исследованием, но указанные субъекты полностью проходили последующее наблюдение.
й. Фармакокинетика
У всех субъектов, получающих ΝΕυΟ, собирали образцы сыворотки для определения концентрации ΝΕυΟ в течение 1 цикла. Лекарственное средство выявляли с использованием иммуноферментного анализа методом сэндвич-ИФА, специфичного к ΝΕυΟ. Данные зависимости концентрации лекарственного средства в сыворотке от времени подвергали фармакокинетическому анализу с использованием программы \Ут№пПп РгЦегр^е СйШои, версии 5 (или более поздней версии), с использованием независимого от модели анализа или анализа на основе модели. Определяли следующие фармакокинетические параметры: площадь под кривой (АЦСо-оо), клиренс (СЬ/Р), объем распределения (У//Р), максимальная концентрация (Стах), период полуабсорбции (!1/2, аЬ5), период полувыведения (!1/2, еПт) и среднее время удержания (МКТ).
е. Иммуногенность
Образцы сыворотки для выявления антител к ΝΕυΟ получали до введения дозы на 1 день каждого Цикла лечения ΝΕυΟ и во время последнего посещения (приблизительно через 30 дней после введения последней дозы) у субъектов, получающих ΝΕυΟ. Если в какое-либо время в ходе исследования у субъекта развивался положительный иммунный ответ с образованием антител против ΝΕυΟ, повторный образец получали приблизительно через 6 месяцев после введения последней дозы ΝΕυΟ; если в указанным образце наблюдали положительную реакцию, новый образец получали через 12 месяцев. Позже протокол был дополнен требованием получения образцов для оценки иммуногенности через 6 и 12 месяцев у всех субъектов.
5. Результаты
а) Общие
Статистические методы
Объем выборки, составляющий примерно 85 субъектов на группу в основной Фазе настоящего исследования (Части В), был выбран для обеспечения 91% мощности для определения эффективности ΝΕυΟ, не меньшей чем у пэгфилграстима, на основании главного конечного результата, средней продолжительности острой нейтропении (ΌδΝ) в Цикле 1, с пределом для неменьшей эффективности, составляющим 1 день, и общим односторонним уровнем значимости, подходящим для множественных сравнений (по методу Хохберга), составляющим 0,025. Объем выборки рассчитывали на основе нормального приближения для двух независимых групп со стандартным отклонением ΌδΝ в пределах лечебной группы, составляющим 1,6 дней для 1 Цикла, и максимальным значением для невыявляемого главного конечного результата, Ό8Ν в 1 Цикле, составляющем 20%.
Проводили сравнение эффективности двух выбранных доз ΝΕυΟ (либо 40 мг, либо 50 мг) и пэгфилграстима в фазе, включающей субъектов, рандомизированных в 3 группы (часть А).
Вторичная оценка эффективности включала определение Ό8Ν в каждом цикле химиотерапии от 2 до 4, минимального значения АХС в каждом из циклов от 1 до 4, частоты возникновения фебрильной нейтропении (РН) (выявляемой на основании значения АЫС < 0,5 х 109 /л с сопутствующей температурой тела, эквивалентной температуре во рту > 38,2°С) в каждом цикле и во всех циклах, и времени восстановления АNС до > 1,5 х 109 /л во всех циклах.
Данные, имеющие отношение к вторичной оценке эффективности, анализировали с использованием подходящих статистических методов. Параметры безопасности, фармакокинетики и иммуногенности анализировали с помощью методов описательной статистики.
Представлены значения и процентные отношения для частоты и выраженности нежелательных явлений и лабораторных показателей токсичности.
- 41 023344
Измерения эффективности
Клинический анализ крови (СВС) проводили на 1 день, на 3 день и каждый день начиная с 5 дня до момента восстановления АЫС > 2,0 χ 10 /л после достижения минимального значения, затем дважды в неделю и в конце проведения лечения.
b) Эффективность в Части А II Фазы
Из 78 субъектов, включенных в предварительную Фазу исследования, 13 субъектов не завершили исследование: 3 (27,3%), получающих лечение 30 мг ЫЕИО, 3 (14,3%), получающих лечение 40 мг ЫЕИО, 3 (15,0%), получающих лечение 50 мг ЫЕИО, и 4 (15,4%), получающих лечение пэгфилграстимом. Наиболее частыми причинами для досрочного исключения из исследования были отзыв согласия (7 субъектов) и решение исследователя (3 субъекта). Один субъект из группы, получающей 30 мг ЫЕИО, был исключен из-за возникновения нежелательного явления (синдрома диабетической стопы). Частота возникновения острой нейтропении и средняя продолжительность острой нейтропении (И§Ы) были одинаковыми среди лечебных групп в каждом цикле химиотерапии; однако данные по времени восстановления АЫС и частоте возникновения фебрильной нейтропении указывали на то, что доза 30 мг ЫЕИО не была такой же эффективной, как дозы 40 мг ЫЕИО и 50 мг или пэгфилграстим.
Во время 1 цикла процент субъектов, у которых возникала фебрильная нейтропения, составлял 20,0, 9,5, 10,0 и 8,0% для групп, получающих 30, 40, 50 ЫЕИО и пэгфилграстим соответственно. Фебрильная нейтропения наблюдалась еще только у трех субъектов в течение 2-4 циклов, у одного из каждой группы, получающей 30 мг ЫЕИО, 40 мг ЫЕИО и пэгфилграстим. На фиг. 5 показана кривая АЫС для группы пациентов, получающих либо 30 мг ЫЕИО, либо пэгфилграстим, у которых позже развивалась нейтропения 4 степени.
В 1 Цикле средняя была одинаковой для группы, получающей 30 мг ЫЕИО (0,9 дней), 50 мг ЫЕИО (1,1 дней), и пэгфилграстим (0,9 дней). Хотя средняя ИЗЫ была немного больше в группе, получающей 40 мг ЫЕИО (1,6 дней), чем в трех других лечебных группах, все различия среди лечебных групп составляли менее 1 дня, что позволяет рассматривать лечебные группы эквивалентными в основной Фазе. Срединное значение ИЗЫ составляло 0 или 1 день во всех четырех лечебных группах. Суммарные статистические данные по частоте возникновения и продолжительности нейтропении 3 или 4 степени были сходными, т.е., группы, получающие 30 мг ЫЕИО, 50 мг ЫЕИО и пэгфилграстим имели одинаковые результаты, тогда как частота возникновения и продолжительность нейтропении 3 или 4 степени были немного выше для группы, получающей 40 мг ЫЕИО, чем для других лечебных групп.
Количество субъектов в предварительной фазе (Часть А) было довольно маленьким, и наблюдаемые отличия не были статистически значимыми. Дозы 40 мг ЫЕИО и 50 мг ЫЕИО были выбраны для дальнейшего исследования в Части В - фазе исследования с рандомизацией в 3 группы.
c) Эффективность для части В II Фазы
Из 256 субъектов, включенных в основную Фазу исследования, 18 субъектов не завершили исследование; 10 (11,6%), получающих лечение 40 мг ЫЕИО, 5 (6,0%), получающих лечение 50 мг ЫЕИО, и 3 (3,5%), получающих лечение пэгфилграстимом. Наиболее частыми причинами для досрочного исключения из исследования являлись отзыв согласия (7 субъектов) и НЯ (4 субъекта), включая 2 смертельных исхода. По мнению Исследователя все из указанных НЯ рассматривались как несвязанные с исследуемым лекарственным средством или химиотерапией. В основной Фазе 1 субъект (1,2%) из группы, получающей 40 мг ЫЕИО, был исключен до начала проведения лечения исследуемым лекарственным средством.
Суммарные данные по частоте возникновения и продолжительности острой нейтропении в 1 Цикле приведены в табл. 11.
- 42 023344
Таблица 11: Часть В Фазы II: Частота возникновения и продолжительность острой нейтропении в Цикле 1
Нейгранин
40 мг (N=85) 50 мг (Ν = 84) Все дозы νεετο (Ν = 169) Пэгфилг растим (Ν = 86) 95% С1 97,5% С1
Частота возникновения острой нейтропении п(%) 50 мг ΝΕυΟ - 40 мг ИЕИО 40 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 50 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 50 (58,8%) 55 (65,5%) 105 (62,1%) 50 (58,1%) (-7,94; 21,24) (-14,09; 15,45) (-7,23; 21,90)
Продолжительность (дни) острой нейтропении η Среднее (5ϋ) Срединное значение Μΐη/Мах 84 1,0(1,09) 1 0/4 84 1,3(1,22) 1 0/5 168 1,2(1,16) 1 0/5 86 1,2(1,34) 1 0/5
50 мг ΝΕυΟ - 40 мг ΝΕΕΤΟ 40 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 50 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 95% С1 (-0,07; 0,58) (-0,57; 0,15) (-0,31; 0,41)
50 мг ΝΕυΟ - 40 мг ΝΕΕΤΟ 40 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 50 мг ΝΕυΟ - Пэгфилграстим 97,5% С1 (-0,12; 0,63) (-0,62; 0,21) (-0,37; 0,46)
Частота возникновения острой нейтропении варьировала от 58,1% в группе, получающей пэгфилграстим, до 65,5% в группе, получающей 50 мг ΝΕυΟ. Лечебный эффект не являлся статистически значимым (р=0,559). Результаты по Ώ8Ν были сопоставимы для лечебных групп в 1 Цикле со средними значениями 1,0, 1,3 и 1,2 дней для групп, получающих 40 мг ΝΕυΟ, 50 мг ΝΕυΟ и пэгфилграстим, соответственно. Двусторонние доверительные интервалы 95 и 97,5% для отличий между группами, получающими ΝΕυΟ и пэгфилграстим, были строго меньше 1 дня для обеих доз ΝΕυΟ. Результаты указанного анализа указывают на не меньшую эффективность ΝΕυΟ по сравнению с пэгфилграстимом. Среди циклов лечения частота возникновения острой нейтропении и нейтропении 3 или 4 степени была ниже во 24 циклах, чем в 1 цикле. Средняя Ι)8Ν и средняя продолжительность нейтропении 3 или 4 степени были меньше во 2-4 циклах, чем в 1 цикле. В течение отдельных циклов лечения лечебные группы были одинаковыми, и не наблюдалось значительных отличий каких-либо параметров лечебного эффекта в любом цикле химиотерапии.
Для того чтобы определить, являются ли достаточными фиксированные дозы ΝΕυΟ для пациентов всех весовых категорий, сравнивали Ι)8Ν разделенных на группы по весовым категориям пациентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фиксированные дозы являются достаточными для субъектов всех весовых категорий, поскольку не наблюдается значительных различий в средней Ι)8Ν между группами различных весовых категорий (табл. 12).
ТАБЛИЦА 12: Продолжительность острой нейтропении в 1 Цикле (в днях), по весу
Исходный вес (кг)
40-62 63-71 72-80 81-127
Пэгфилграстим 6 мг Среднее (80) N 1,1 (1,3) 16 1,3 (1,4) 21 1,5 (1,6) 26 1,0 (1,0) 23
Нейгранин 40 мг Среднее (8ϋ) N 1,0 (1,0) 22 1,0 (1,2) 21 0,9 (1,0) 21 1,4 (1,4) 21
Нейгранин 50 мг Среднее (8ϋ) N 1,3(1,1) 15 1,0(1,4) 26 1,4(1,3) 20 1,5(1,1) 23
δϋ - Стандартное отклонение
Обобщенные данные для всех циклов по частоте возникновения фебрильной нейтропении приведены в табл. 13. В течение 1 цикла фебрильная нейтропения возникала у 2 субъектов (3,5%), 5 субъектов (6,0%) и 2 субъектов (2,3%) в группах, получающих 40 мг ΝΕυΟ, 50 мг ΝΕυΟ и пэгфилграстим соответственно. В течение 2-4 циклов фебрильная нейтропения наблюдалась еще только у трех субъектов (2 субъектов у группе, получающей 40 мг ΝΕυΟ, и 1 субъекта в группе, получающей пэгфилграстим). Лечебный эффект не был статистически значимым ни в одном из циклов химиотерапии.
- 43 023344
Таблица 13: Частота возникновения фебрильной нейтропении в 1-4 Циклах
Лечение Общее Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 Цикл 4
Нейгранин 40 мг 4,7% (4/85) 3,5% 0,0% 2,4% 0,0%
Нейгранин 50 мг 6,0% (5/85) 6,0% 0,0% 0,0% 0,0%
Пэгфилграстим 3,5% (3/86) 2,3% 0,0% 0,0% 1,2%
Не наблюдали значительных различий в продолжительности острой нейтропении между лечебными группами во 2-4 Циклах (табл. 14).
Таблица 14: Средняя продолжительность острой нейтропении во 2-4 Циклах
Лечение Цикл 2 Цикл 3 Цикл 4
Нейгранин 40 мг 0,5 0,4 0,4
Нейгранин 50 мг 0,4 0,5 0,6
Пэгфилграстим 0,5 0,4 0,6
Среднее время восстановления АЫС (>1,5 х 109/Ь) составляло 2,0, 2,1, и 2,6 дней для групп, получающих 40 мг нейгранина, 50 мг нейгранина и пэгфилграстим, соответственно (табл. 15). Не наблюдалось значительных различий в минимальном значении АЫС или времени достижения минимального значения между лечебными группами.
Таблица 15: Минимальное значение АЫС, время достижения минимального значения АЫС и время восстановления
Нейгранин
Параметр 40 мг (Ы=85) 50 мг (Ы = 84) Все дозы ЫЕис (Ы = 169) Пэгфилг растим (Ы = 86) 95% С1 р- значен ие
Минимальное значение АЫС (109/л)
η Среднее (δϋ) Срединное значение Μίη/Мах 85 0,7 (0,88) 0 0/5 84 0,6 (0,68) 0 0/3 169 0,6 (0,79) 0 0/5 86 0,7 (1,04) 0 0/7 0,423
Время (дни) достижения минимального значения АЫС η Среднее (δϋ) Срединное значение Μίη/Мах 85 604 (1,38) 6 5/18 84 6,7 (2,62) 6 5/20 169 6,5 (2,09) 6 5/20 86 6,5 (2,05) 6 4/17 0,610
Время (дни) восстановления АЫС >1500 N Среднее (δϋ) Срединное значение Μίη/Мах 71 2,0 (0,94) 2 1/6 73 2,1 (1,03 2 1/6 144 2,0 (0,98) 2 1/6 72 2,6 (1,23) 2 1/6 0,005
Сравнение схем лечения 50 мг ЫЕИО 40 мг ЫЕИО (-0,31;0,39)
40 мг ЫЕИО Пэгфилграстим (-0,88;-0,17)
50 мг ЫЕИО Пэгфилграстим (-0,84; -0,13)
δϋ - Стандартное отклонение
ά) Фармакокинетические данные для части В II Фазы
Сывороточные концентрации нейгранина определяли с использованием валидированной тестсистемы для метода иммуноферментного анализа в модификации сэндвич с нижним пределом количественного определения (^^^), составляющим 6,312 нг/мл. Фармакокинетические параметры рассчитывали с использованием методов некомпонентного моделирования, за исключением периода полуабсорбции, который определяли с использованием однокомпонентной модели абсорбции первого порядка, излучения первого порядка. Моделирование осуществляли с помощью программы ШшЫопПп Рго£е§§юпа1 (версии 5,0,1). Концентрации в сыворотке ЫЕИО определяли в 1 цикле химиотерапии у всех субъектов, получающих лечение ЫЕИО во II Фазе. В части А II фазы срединное значение периода полувыведения ЫЕИО составляло 33 ч в группе, получающей дозу 30 мг, 46 ч в группе, получающей дозу 40 мг, и 18 ч в группе, получающей дозу 50 мг (табл. 16). В части В срединное значение периода полувыведения ЫЕИО
- 44 023344 составляло 40 ч для группы, получающей дозу 40 мг, и 39 ч для группы, получающей дозу 50 мг (табл. 17). В ходе части А образцы для фармакокинетического анализа собирали чаще (до введения дозы 3, 6, 12, 24 ч, 3 день, 5-9 день, 11 день), чем во время части В (до введения дозы, 3 день, 5-8 день).
Таблица 16: Срединное значение периода полувыведения во время проведения лечения, Части А II Фазы
ΝΕυσ 30 мг ΝΕυσ 40 мг ΝΕυσ 50 мг Пэгфилграстим 6 мг
Число субъектов 10 20 20 26
Число субъектов, у которых оценивали период полувыведения 3 12 16 19
Срединное значение периода полувыведения (часы) 33 46 18 40
Таблица 17: Срединное значение периода полувыведения во время
проведения лечения, Части В ' I Фазы
ΝΕϋΟ 40 мг ΝΕϋΟ 50 мг Пэгфилграстим 6 мг
Число субъектов 85 84 84
Число субъектов, у которых оценивали период полувыведения 48 54 52
Срединное значение периода полувыведения (часы) 40 39 50
Концентрацию пэгфилграстима в сыворотке определяли с использованием валидированной тестсистемы на базе сэндвич-ИФА в 1 Цикле химиотерапии II Фазы у всех субъектов, получающих лечение пэгфилграстимом. В части А срединное значение периода полувыведения пэгфилграстима составляло примерно 40 ч. В части В срединное значение периода полувыведения пэгфилграстима составляло примерно 50 ч. Описанный для филграстима период полувыведения составляет 3-4 ч, и описанный для пэгфилграстима период полувыведения составляет 42-67,5 ч (в зависимости от дозы).
е) Иммуногенность
Среди участников исследования был выявлен один субъект из группы, получающей лечение нейгранином, с подтвержденным иммунным ответом с образованием антител против О-С8Р/неоэпитопа и один субъект из группы, получающей лечение пэгфилграстимом, с наличием антител против О-С8Р, или 0,5 и 0,9% соответственно (табл. 18). В обоих случаях в образцах крови субъектов, полученных до введения лекарственного средства, наблюдали повышенное неспецифическое связывание.
Таблица 18: Обзор данных по выявлению С-С8Р-специфических связанных с проведением лечения иммунных реакций на ΝΕΙΤΪ и пэгфилграстим
ΝΕυΟ Положительный ответ/ количество субъектов Пэгфилграстим Положительный ответ/ количество субъектов
Фаза II, Часть А (максимум 4 Цикла) 0/50 0/26
Фаза II, Часть В (максимум 4 Цикла) 1/169 1/86
Общее число субъектов 1/219 1/112
У пациента после проведения лечения ΝΕϋΟ выявили подтвержденный положительный ответ на антитела к ΝΕϋΟ, уровень которого был очень низок, без видимого усиления иммунного ответа после введения повторных доз (данные не показаны). У получающего лечение пэгфилграстимом пациента наблюдали необычно высокий уровень неспецифического связывания; однако наблюдали только временный подтвержденный иммунный ответ с образованием антител после проведения 2 цикла лечения (данные не показаны). Не наблюдали нейтрализующего иммунного ответа. В указанной популяции субъектов присутствует природный низки уровень антител к Н5А. У 6,9% субъектов выявили антитела к Н5А в образцах, полученных до введения соединения. Образование во время лечения антител против Н5А наблюдалось у четырех субъектов, которым проводили лечение ΝΕϋΟ, 1,8% (табл. 19). Все иммунные ответы были временными и слабыми. После проведения первого Цикла лечения возникали три иммунных ответа, которые не выявлялись после проведения 2, 3 и 4 Циклов. После проведения третьего цикла лечения выявлялся один ответ, которые не обнаруживался на 30 день наблюдения после проведения 4-го Цикла лечения (данные не показаны).
- 45 023344
Таблица 19: Данные по выявлению ΗδΑ-специфичных иммунных реакций на ΝΕΤΓΟ, возникших в результате лечения
ΝΕυΟ Положительный ответ/количество субъектов
Фазы II, Часть А (максимум 4 Цикла) 0/50
Фазы II, Часть В (максимум 4 Цикла) 4/169
Общее число субъектов 4/219
ί) Возникшие во время лечения нежелательные явления в части В II Фазы
В части В II Фазы у >90% субъектов в каждой лечебной группе наблюдали по меньшей мере одно возникшее во время лечения нежелательное явление, и процент субъектов с по меньшей мере одним возникшим во время проведения лечения нежелательным явлением, связанным с введением исследуемого лекарственного средства, варьировал от 23,1% в группе, получающей пэгфилграстим, до 35,0% в группе, получающей 50 мг нейгранина. Процент субъектов, у которых возникало по меньшей мере одно СНЯ, был самым большим в группе, получающей 30 мг ΝΕυΟ (30%), и составлял приблизительно 15% в трех других лечебных группах. С введением исследуемого лекарственного средства не было связано никаких СНЯ. Один пациент (30 мг ΝΕυΟ) был исключен из исследования из-за развития симптома диабетической стопы, который рассматривался как несвязанное с введением исследуемого лекарственного средства явление. В Части В у всех кроме 8 субъектов (2 из группы, получающей 40 мг ΝΕυΟ, 3 из группы, получающей 50 мг ΝΕυΟ, 3 из группы, получающей пэгфилграстим) наблюдали по меньшей мере одно возникшее во время проведения лечения нежелательное явление. Процент субъектов, у которых наблюдали по меньшей мере одно возникшее во время проведения лечения нежелательное явление, связанное с введением исследуемого лекарственного средства, составлял 20,2% в группе, получающей 50 мг ΝΕυΟ, 22,4% в группе, получающей 40 мг ΝΕυΟ, и 22,1% в группе субъектов, получающих пэгфилграстим. Двое субъектов (1 из группы, получающей 40 мг ΝΕυΟ, 1 из группы, получающей пэгфилграстим) умерли во время исследования, и у 6-8 субъектов в каждой лечебной группе возникало по меньшей мере одно СНЯ. Ни один случай смерти или возникновения СНЯ не был признан связанным с введением исследуемого лекарственного средства.
Общее число возникших во время проведения лечения нежелательных явлений было одинаковым в лечебных группах в части А, при рассмотрении объема выборки для дозы 30 мг ΝΕυΟ, и в Части В. В обеих Частях А и В процент возникших во время проведения лечения нежелательных явлений 3 или более степени согласно общим критериям (СТС) был одинаковым для групп, получающих ΝΕυΟ и пэгфилграстим, также как и процент возникших во время проведения лечения нежелательных явлений, связанных с введением исследуемого лекарственного средства.
д) Дозозависимый эффект
Согласно результатам II Фазы исследования было показано, что обе фиксированные дозы ΝΕυΟ, 40 и 50 мг, обеспечивали безопасность и эффективность, эквивалентные эффективности и безопасности 6 мг пэгфилграстима у субъектов, страдающих раком молочной железы, получающих миелотоксическую химиотерапию. Хотя средняя ΌδΝ для лечебной группы, получающей 40 мг, была немного ниже, чем средняя ΌδΝ для группы, получающей 50 мг, указанные различия не были статистически достоверными. Дозозависимый эффект наблюдали для значений Αυ^^ (0-15 день 1 Цикла) как в группах, получающих рассчитанные с учетом массы тела дозы, так и в группах, получающих фиксированные дозы (фиг. 24). Значения Αυ^^ В группе, получающей дозу 30 мг, были немного ниже, чем в группе, получающей пэгфилграстим, что указывает на то, что фиксированная доза 30 мг была менее эффективной в настоящем исследовании, а значения ΑυСΑNС В группах, получающих 40 и 50 мг, являлись зависимыми от дозы и были выше (хотя незначительно), чем Αυ^^ В группе субъектов, получающих лечение пэгфилграстимом. Из приведенных выше данных очевидно, что когда ΝΕυΟ вводят в дозах, рассчитанных с учетом массы тела (мг/кг), дозозависимый эффект отсутствует. Однако по результатам сравнения ΌδΝ в 1 цикле части В II Фазы было показано, что дозы были достаточными для пациентов всех весовых категорий, поскольку ΌδΝ не варьировала значительно ни между лечебными группами (получающий 40 или 50 мг ΝΕυΟ или пэгфилграстим), ни по сравнению с субъектами, получающими рассчитанную с учетом массы дозу (мг/кг). Кроме того, не было свидетельств того, что фиксированная доза может приводить к измененному профилю безопасности у пациентов с меньшей массой, поскольку частота возникновения и выраженность связанных нежелательных явлений (в частности боль в кости; данные не показаны) не коррелировали с рассчитанной на килограмм массы тела дозой и не отличались от частоты возникновения и выраженности связанных нежелательных явлений для пэгфилграстима.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что в рамках объема и сущности настоящего изобретения возможны различные модификации и варианты способов и композиций согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение включает его возможные модификации и варианты при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.
- 46 023344
Перечень последовательностей
- 47 023344 <222> (1) .. (2277) <400> 3
дай 48 дса сас аад адН дад дНН дсН саН едд ННН ааа даН ННд дда даа
Азр 1 А1а Низ Ьуз Зег 5 С1и Уа1 А1а Низ Агд 10 РНе Ьуз Азр Ьеи С1у 15 С1и
даа 96 ааН ННс ааа дсс ННд дНд ННд аНН дсс ННН дсН сад НаН сНН сад
С1и Азп РНе Ьуз 20 А1а Ьеи Уа1 Ьеи Не 25 А1а РНе А1а С1п Туг 30 Ьеи С1п
сад 144 НдН сса ннн даа даН саН дНа ааа ННа дНд ааН даа дНа асН даа
С1п Суз Рго 35 РНе С1и Азр Низ Уа1 40 Ьуз Ьеи Уа1 Азп С1и 45 Уа1 ТНг С1и
ннн 192 дса ааа аса НдН дНН дсН даН дад Нса дсН даа ааН НдН дас ааа
РНе А1а 50 Ьуз ТНг Суз Уа1 А1а 55 Азр С1и Зег А1а С1и 60 Азп Суз Азр Ьуз
Нса 240 сНН саН асе сНН ННН дда дас ааа ННа Ндс аса дНН дса асН сНН
Зег 65 Ьеи Низ ТНг Ьеи РНе 70 С1у Азр Ьуз Ьеи Суз 75 ТНг Уа1 А1а ТНг Ьеи 80
сдН 288 даа асе НаН ддН даа аНд дсН дас Ндс НдН дса ааа саа даа ссН
Агд С1и ТНг Туг С1у 85 С1и МеН А1а Азр Суз 90 Суз А1а Ьуз С1п С1и 95 Рго
дад 336 ада ааН даа Ндс ННс ННд саа сас ааа даН дас аас сса аас сНс
С1и Агд Азп С1и 100 Суз РНе Ьеи С1п Низ 105 Ьуз Азр Азр Азп Рго 110 Азп Ьеи
ссс 384 еда ННд дНд ада сса дад дНН даН дНд аНд Ндс асН дсН ННН саН
Рго Агд Ьеи 115 Уа1 Агд Рго С1и Уа1 120 Азр Уа1 МеН Суз ТНг 125 А1а РНе Низ
дас 432 ааН даа дад аса ННН ННд ааа ааа Нас ННа НаН даа аНН дсс ада
Азр Азп 130 С1и С1и ТНг РНе Ьеи 135 Ьуз Ьуз Туг Ьеи Туг 140 С1и Не А1а Агд
ада 480 саН ссН Нас ННН НаН дсс сед даа сНс сНН ННс ННН дсН ааа адд
Агд 145 Низ Рго Туг РНе Туг 150 А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 155 РНе РНе А1а Ьуз Агд 160
НаН 528 ааа дсН дсН ННН аса даа НдН Ндс саа дсН дсН даН ааа дсН дсс
Туг Ьуз А1а А1а РНе 165 ТНг С1и Суз Суз С1п 170 А1а А1а Азр Ьуз А1а 175 А1а
Ндс 576 сНд ННд сса аад сНс даН даа сНН едд даН даа ддд аад дсН Нед
Суз Ьеи Ьеи Рго 180 Ьуз Ьеи Азр С1и Ьеи 185 Агд Азр С1и С1у Ьуз 190 А1а Зег
НсН 624 дсс ааа сад ада сНс аад НдН дсс адН сНс саа ааа ННН дда даа
Зег А1а Ьуз 195 С1п Агд Ьеи Ьуз Суз 200 А1а Зег Ьеи С1п Ьуз 205 РНе С1у С1и
ада 672 дсН ННс ааа дса Ндд дса дНа дсН сдс сНд аде сад ада ННН ССС
Агд А1а 210 РНе Ьуз А1а Тгр А1а 215 Уа1 А1а Агд Ьеи Зег 220 С1п Агд РНе Рго
ааа 720 дсН дад ННН дса даа дНН Нсс аад ННа дНд аса даН сНН асс ааа
Ьуз 225 А1а С1и РНе А1а С1и 230 Уа1 Зег Ьуз Ьеи Уа1 235 ТНг Азр Ьеи ТНг Ьуз 240
дНс 768 сас асд даа Ндс Ндс саН дда даН сНд сНН даа НдН дсН даН дас
Уа1 Низ ТНг С1и Суз 245 Суз Низ С1у Азр Ьеи 250 Ьеи С1и Суз А1а Азр 255 Азр
адд 816 дед дас сНН дсс аад НаН аНс НдН даа ааН саа даН Нед аНс Нсс
Агд А1а Азр Ьеи 260 А1а Ьуз Туг 11е Суз 265 С1и Азп С1п Азр Зег 270 Не Зег
адН 864 ааа сНд аад даа Ндс НдН даа ааа ссН сНд ННд даа ааа Нсс сас
Зег Ьуз Ьеи 275 Ьуз С1и Суз Суз С1и 280 Ьуз Рго Ьеи Ьеи С1и 285 Ьуз Зег Низ
Ндс 912 аНН дсс даа дНд даа ааН даН дад аНд ссН дсН дас ННд ссН Нса
Суз Не 290 А1а С1и Уа1 С1и Азп 295 Азр С1и МеН Рго А1а 300 Азр Ьеи Рго Зег
ННа 960 дсН дсН даН ННН дНН даа адН аад даН дНН Ндс ааа аас НаН дсН
Ьеи 305 А1а А1а Азр РНе Уа1 310 С1и Зег Ьуз Азр Уа1 315 Суз Ьуз Азп Туг А1а 320
дад дса аад даН дНс ННс сНд ддс аНд ННН ННд НаН даа НаН дса ада
1008
С1и А1а Ьуз Азр Уа1 РНе Ьеи С1у МеН РНе Ьеи Туг С1и Туг А1а Агд
325 330 335
адд саН 1056 ссН даН Нас НсН дНс дНд сНд сНд сНд ада сНН дсс аад аса
Агд Низ Рго Азр Туг Зег Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Агд Ьеи А1а Ьуз ТНг
340 345 350
НаН даа 1104 асс асН сНа дад аад Ндс НдН дсс дсН дса даН ссН саН даа
Туг С1и ТНг ТНг Ьеи С1и Ьуз Суз Суз А1а А1а А1а Азр Рго Низ С1и
- 49 023344
355 360 365
Ьдс как 1152 дсс ааа дЬд Нс даЬ даа Ш ааа ссЬ сЬЬ дЬд даа дад ссЬ
Суз Туг А1а Ьуз Уа1 РЬе Азр С1и РЬе Ьуз Рго Ьеи Уа1 С1и С1и Рго
370 375 380
сад ааЬ 1200 На аЬс ааа саа ааЬ ЬдЬ дад сЬЬ ЬЬЬ дад сад сЬЬ дда дад
С1п Азп Ьеи 11е Ьуз С1п Азп Суз С1и Ьеи РЬе С1и С1п Ьеи С1у С1и
385 390 395 400
Ьас ааа Нс сад ааЬ дед сЬа На дЬЬ сдЬ Ьас асе аад ааа дЬа ссс
1248 Туг Ьуз РЬе С1п Азп А1а Ьеи Ьеи Уа1 Агд Туг ТЬг Ьуз Ьуз Уа1 Рго
405 410 415
саа дЬд 1296 Ьса асЬ сса асЬ сЬЬ дЬа дад дЬс Ьса ада аас сЬа дда ааа
С1п Уа1 Зег ТЬг Рго ТЬг Ьеи Уа1 С1и Уа1 Зег Агд Азп Ьеи С1у Ьуз
420 425 430
дЬд ддс 1344 аде ааа ЬдЬ ЬдЬ ааа саЬ ссЬ даа дса ааа ада аЬд ссс ЬдЬ
Уа1 С1у Зег Ьуз Суз Суз Ьуз Ыз Рго С1и А1а Ьуз Агд МеЬ Рго Суз
435 440 445
дса даа 1392 дас ЬаЬ Па Нс дЬд дЬс сЬд аас сад ЬЬа ЬдЬ дЬд ЬЬд саЬ
А1а С1и Азр Туг Ьеи Зег Уа1 Уа1 Ьеи Азп С1п Ьеи Суз Уа1 Ьеи Ыз
450 455 460
дад ааа 1440 асд сса дЬа адЬ дас ада дЬс асе ааа Ьдс Ьдс аса даа Ьсс
С1и Ьуз ТЬг Рго Уа1 Зег Азр Агд Уа1 ТЬг Ьуз Суз Суз ТЬг С1и Зег
465 470 475 480
ЬЬд дЬд 1488 аас адд еда сса Ьдс Ш Ьса дсЬ сЬд даа дЬс даЬ даа аса
Ьеи Уа1 Азп Агд Агд Рго Суз РЬе Зег А1а Ьеи С1и Уа1 Азр С1и ТЬг
485 490 495
Ьас дЬЬ 1536 ссс ааа дад Ш ааЬ дсЬ даа аса ЬЬс асе ЬЬс саЬ дса даЬ
Туг Уа1 Рго Ьуз С1и РЬе Азп А1а С1и ТЬг РЬе ТЬг РЬе Ыз А1а Азр
500 505 510
аЬа Ьдс 1584 аса сЬЬ ЬсЬ дад аад дад ада саа аЬс аад ааа саа асЬ дса
Не Суз ТЬг Ьеи Зег С1и Ьуз С1и Агд С1п 11е Ьуз Ьуз С1п ТЬг А1а
515 520 525
сЬЬ дЬЬ 1632 дад сЬс дЬд ааа сас аад ссс аад дса аса ааа дад саа сЬд
Ьеи Уа1 С1и Ьеи Уа1 Ьуз Ыз Ьуз Рго Ьуз А1а ТЬг Ьуз С1и С1п Ьеи
530 535 540
ааа дсЬ 1680 дЬЬ аЬд даЬ даЬ ЬЬс дса дсЬ ЬЬЬ дЬа дад аад Ьдс Ьдс аад
Ьуз А1а Уа1 МеЬ Азр Азр РЬе А1а А1а РЬе Уа1 С1и Ьуз Суз Суз Ьуз
545 550 555 560
дсЬ дас 1728 даЬ аад дад асе Ьдс ЬЬЬ дсс дад дад ддЬ ааа ааа сЬЬ дЬЬ
А1а Азр Азр Ьуз С1и ТЬг Суз РЬе А1а С1и С1и С1у Ьуз Ьуз Ьеи Уа1
565 570 575
дсЬ дса 1776 адЬ саа дсЬ дсс ЬЬа ддс ЬЬа асе ссс сЬд ддс ссЬ дсс аде
А1а А1а Зег С1п А1а А1а Ьеи С1у Ьеи ТЬг Рго Ьеи С1у Рго А1а Зег
580 585 590
Ьсс сЬд 1824 ссс сад аде ЬЬс сЬд сЬс аад Ьдс ЬЬа дад саа дЬд адд аад
Зег Ьеи Рго С1п Зег РЬе Ьеи Ьеи Ьуз Суз Ьеи С1и С1п Уа1 Агд Ьуз
595 600 605
аЬс сад 1872 ддс даЬ ддс дса дед сЬс сад дад аад сЬд ЬдЬ дсс асе Ьас
Не С1п С1у Азр С1у А1а А1а Ьеи С1п С1и Ьуз Ьеи Суз А1а ТЬг Туг
610 615 620
аад сЬд 1920 Ьдс сас ссс дад дад сЬд дЬд сЬд сЬс дда сас ЬсЬ сЬд ддс
Ьуз Ьеи Суз Низ Рго С1и С1и Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи С1у Низ Зег Ьеи С1у
625 630 635 640
аЬс ссс Ьдд дсЬ ссс сЬд аде аде Ьдс ссс аде сад дсс сЬд сад сЬд
1968 11е Рго Тгр А1а Рго Ьеи Зег Зег Суз Рго Зег С1п А1а Ьеи С1п Ьеи
645 650 655
дса ддс 2016 Ьдс ЬЬд аде саа сЬс саЬ аде ддс сЬЬ ЬЬс сЬс Ьас сад ддд
А1а С1у Суз Ьеи Зег С1п Ьеи Низ Зег С1у Ьеи РЬе Ьеи Туг С1п С1у
660 665 670
сЬс сЬд 2064 сад дсс сЬд даа ддд аЬс Ьсс ссс дад ЬЬд ддЬ ссс асе ЬЬд
Ьеи Ьеи С1п А1а Ьеи С1и С1у 11е Зег Рго С1и Ьеи С1у Рго ТЬг Ьеи
675 680 685
дас аса 2112 сЬд сад сЬд дас дЬс дсс дас ЬЬЬ дсс асе асе аЬс Ьдд сад
Азр ТЬг Ьеи С1п Ьеи Азр Уа1 А1а Азр РЬе А1а ТЬг ТЬг 11е Тгр С1п
690 695 700
сад аЬд 2160 даа даа сЬд дда аЬд дсс ссЬ дсс сЬд сад ссс асе сад ддЬ
С1п МеЬ С1и С1и Ьеи С1у МеЬ А1а Рго А1а Ьеи С1п Рго ТЬг С1п С1у
705 710 715 720
дсс аЬд 2208 ссд дсс ЬЬс дсс ЬсЬ дсЬ ЬЬс сад сдс едд дса дда ддд дЬс
А1а МеЬ Рго А1а РЬе А1а Зег А1а РЬе С1п Агд Агд А1а С1у С1у Уа1
- 51 023344
725
730
735
сНд дНН дсс Нос саН сНд сад аде ННс сНд дад дНд Нед Нас еде дНН
2256
Ьеи Уа1 А1а Зег Низ Ьеи С1п Зег РНе Ьеи С1и Уа1 Зег Туг Агд Уа1
740 745 750
сНа сдс сас сНН дсс сад ссс
2277
Ьеи Агд Низ Ьеи А1а С1п Рго
755
<210> 4 <211> 759 <212> РКТ <213> Ното зариепз <400> 4
Азр А1а Низ Ьуз Зег С1и Уа1 А1а Низ Агд РНе Ьуз Азр Ьеи С1у С1и 15 10 15
С1и Азп РНе Ьуз А1а Ьеи Уа1 Ьеи Не А1а РНе А1а С1п Туг Ьеи С1п 20 25 30
С1п Суз Рго РНе С1и Азр Низ Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 Азп С1и Уа1 ТНг С1и 35 40 45
РНе А1а Ьуз ТНг Суз Уа1 А1а Азр С1и Зег А1а С1и Азп Суз Азр Ьуз 50 55 60
Зег Ьеи Низ ТНг Ьеи РНе С1у Азр Ьуз Ьеи Суз ТНг Уа1 А1а ТНг Ьеи 65 70 75 80
Агд С1и ТНг Туг С1у С1и МеН А1а Азр Суз Суз А1а Ьуз С1п С1и Рго 85 90 95
С1и Агд Азп С1и Суз РНе Ьеи С1п Низ Ьуз Азр Азр Азп Рго Азп Ьеи 100 105 110
Рго Агд Ьеи Уа1 Агд Рго С1и Уа1 Азр Уа1 МеН Суз ТНг А1а РНе Низ 115 120 125
Азр Азп С1и С1и ТНг РНе Ьеи Ьуз Ьуз Туг Ьеи Туг С1и 11е А1а Агд 130 135 140
Агд Низ Рго Туг РНе Туг А1а Рго С1и Ьеи Ьеи РНе РНе А1а Ьуз Агд 145 150 155 160
- 52 023344
Туг Ьуз А1а А1а РНе ТНг С1и Суз Суз С1п А1а А1а Азр Ьуз А1а А1а 165 170 175
Суз Ьеи Ьеи Рго Ьуз Ьеи Азр С1и Ьеи Агд Азр С1и С1у Ьуз А1а Зег 180 185 190
Зег А1а Ьуз С1п Агд Ьеи Ьуз Суз А1а Зег Ьеи С1п Ьуз РНе С1у С1и 195 200 205
Агд А1а РНе Ьуз А1а Тгр А1а Уа1 А1а Агд Ьеи Зег С1п Агд РНе Рго 210 215 220
Ьуз А1а С1и РНе А1а С1и Уа1 Зег Ьуз Ьеи Уа1 ТНг Азр Ьеи ТНг Ьуз 225 230 235 240
Уа1 Низ ТНг С1и Суз Суз Низ С1у Азр Ьеи Ьеи С1и Суз А1а Азр Азр 245 250 255
Агд А1а Азр Ьеи А1а Ьуз Туг Не Суз С1и Азп С1п Азр Зег 11е Зег 260 265 270
Зег Ьуз Ьеи Ьуз С1и Суз Суз С1и Ьуз Рго Ьеи Ьеи С1и Ьуз Зег Низ 275 280 285
Суз 11е А1а С1и Уа1 С1и Азп Азр С1и МеН Рго А1а Азр Ьеи Рго Зег 290 295 300
Ьеи А1а А1а Азр РНе Уа1 С1и Зег Ьуз Азр Уа1 Суз Ьуз Азп Туг А1а 305 310 315 320
С1и А1а Ьуз Азр Уа1 РНе Ьеи С1у МеН РНе Ьеи Туг С1и Туг А1а Агд 325 330 335
Агд Низ Рго Азр Туг Зег Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Агд Ьеи А1а Ьуз ТНг 340 345 350
Туг С1и ТНг ТНг Ьеи С1и Ьуз Суз Суз А1а А1а А1а Азр Рго Низ С1и 355 360 365
Суз Туг А1а Ьуз Уа1 РНе Азр С1и РНе Ьуз Рго Ьеи Уа1 С1и С1и Рго 370 375 380
С1п Азп Ьеи Т1е Ьуз С1п Азп Суз С1и Ьеи РНе С1и С1п Ьеи С1у С1и
- 54 023344
Ьуз Ьеи Суз Низ Рго С1и С1и Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи С1у Низ Зег Ьеи С1у 625 630 635 640
Не Рго Тгр А1а Рго Ьеи Зег Зег Суз Рго Зег С1п А1а Ьеи С1п Ьеи 645 650 655
А1а С1у Суз Ьеи Зег С1п Ьеи Низ Зег С1у Ьеи РНе Ьеи Туг С1п С1у 660 665 670
Ьеи Ьеи С1п А1а Ьеи С1и С1у 11е Зег Рго С1и Ьеи С1у Рго ТНг Ьеи 675 680 685
Азр ТНг Ьеи С1п Ьеи Азр Уа1 А1а Азр РНе А1а ТНг ТНг 11е Тгр С1п 690 695 700
С1п МеЬ С1и С1и Ьеи С1у МеЬ А1а Рго А1а Ьеи С1п Рго ТНг С1п С1у 705 710 715 720
А1а МеЬ Рго А1а РНе А1а Зег А1а РНе С1п Агд Агд А1а С1у С1у Уа1 725 730 735
Ьеи Уа1 А1а Зег Низ Ьеи С1п Зег РНе Ьеи С1и Уа1 Зег Туг Агд Уа1 740 745 750
Ьеи Агд Низ Ьеи А1а С1п Рго 755 <210> 5 <211> 204 <212> РРТ <213> Ното зариепз <400> 5
МеЬ А1а С1у Рго А1а ТНг С1п Зег Рго МеЬ Ьуз Ьеи МеЬ А1а Ьеи С1п 15 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Низ Зег А1а Ьеи Тгр ТНг Уа1 С1п С1и А1а ТНг Рго 20 25 30
Ьеи С1у Рго А1а Зег Зег Ьеи Рго С1п Зег РНе Ьеи Ьеи Ьуз Суз Ьеи 35 40 45
С1и С1п Уа1 Агд Ьуз 11е С1п С1у Азр С1у А1а А1а Ьеи С1п С1и Ьуз 50 55 60
- 55 023344
Ьей Суз А1а ТЬг Туг Ьуз Ьей Суз Наз Рго С1и С1и Ьей Уа1 Ьей Ьей 65 70 75 80
С1у Наз Зег Ьей С1у Не Рго Тгр А1а Рго Ьей Зег Зег Суз Рго Зег 85 90 95
С1п А1а Ьей С1п Ьей А1а С1у Суз Ьей Зег С1п Ьей Наз Зег С1у Ьей 100 105 110
РЬе Ьей Туг С1п С1у Ьей Ьей С1п А1а Ьей С1и С1у 11е Зег Рго С1и 115 120 125
Ьей С1у Рго ТЬг Ьей Азр ТЬг Ьей С1п Ьей Азр Уа1 А1а Азр РЬе А1а 130 135 140
ТЬг ТЬг 11е Тгр С1п С1п МеЬ С1и С1и Ьей С1у МеЬ А1а Рго А1а Ьей 145 150 155 160
С1п Рго ТЬг С1п С1у А1а МеЬ Рго А1а РЬе А1а Зег А1а РЬе С1п Агд 165 170 175
Агд А1а С1у С1у Уа1 Ьей Уа1 А1а Зег ЕИз Ьей С1п Зег РЬе Ьей С1и 180 185 190
Уа1 Зег Туг Агд Уа1 Ьей Агд ЕИз Ьей А1а С1п Рго 195 200 <210> 6 <211> 609 <212> РРТ <213> Ното зараепз <400> 6
МеЬ Ьуз Тгр Уа1 ТЬг РЬе 11е Зег Ьей Ьей РЬе Ьей РЬе Зег Зег А1а 15 10 15
Туг Зег Агд С1у Уа1 РЬе Агд Агд Азр А1а Наз Ьуз Зег С1и Уа1 А1а 20 25 30
Наз Агд РЬе Ьуз Азр Ьей С1у С1и С1и Азп РЬе Ьуз А1а Ьей Уа1 Ьей 35 40 45
11е А1а РЬе А1а С1п Туг Ьей С1п С1п Суз Рго РЬе С1и Азр Н1з Уа1 50 55 60
- 56 023344
Ьуз Ьей Уа1 Азп С1и Уа1 ТЬг С1и 65 70
РЬе А1а Ьуз ТЬг Суз Уа1 А1а Азр 75 80
С1и Зег А1а С1и Азп Суз Азр Ьуз 85
Зег Ьей Ыз ТЬг Ьей РЬе С1у Азр 90 95
Ьуз Ьей Суз ТЬг Уа1 А1а ТЬг Ьей 100
Агд С1и ТЬг Туг С1у С1и МеЬ А1а 105 110
Азр Суз Суз А1а Ьуз С1п С1и Рго 115 120
С1и Агд Азп С1и Суз РЬе Ьей С1п 125
Ыз Ьуз Азр Азр Азп Рго Азп Ьей 130 135
Рго Агд Ьей Уа1 Агд Рго С1и Уа1 140
Азр Уа1 МеЬ Суз ТЬг А1а РЬе Ыз 145 150
Азр Азп С1и С1и ТЬг РЬе Ьей Ьуз 155 160
Ьуз Туг Ьей Туг С1и 11е А1а Агд 165
Агд Ыз Рго Туг РЬе Туг А1а Рго 170 175
С1и Ьей Ьей РЬе РЬе А1а Ьуз Агд 180
Туг Ьуз А1а А1а РЬе ТЬг С1и Суз 185 190
Суз С1п А1а А1а Азр Ьуз А1а А1а 195 200
Суз Ьей Ьей Рго Ьуз Ьей Азр С1и 205
Ьей Агд Азр С1и С1у Ьуз А1а Зег 210 215
Зег А1а Ьуз С1п Агд Ьей Ьуз Суз 220
А1а Зег Ьей С1п Ьуз РЬе С1у С1и 225 230
Агд А1а РЬе Ьуз А1а Тгр А1а Уа1 235 240
А1а Агд Ьей Зег С1п Агд РЬе Рго 245
Ьуз А1а С1и РЬе А1а С1и Уа1 Зег 250 255
Ьуз Ьей Уа1 ТЬг Азр Ьей ТЬг Ьуз 260
Уа1 Ыз ТЬг С1и Суз Суз Ыз С1у 265 270
Азр Ьей Ьей С1и Суз А1а Азр Азр 275 280
Агд А1а Азр Ьей А1а Ьуз Туг 11е 285
Суз 61и Азп 61п Азр Зег 11е Зег
Зег Ьуз Ьей Ьуз 61и Суз Суз 61и
- 57 023344
290 295
300
Ьуз Рго Ьеи Ьеи С1и Ьуз Зег Низ 305 310
Суз Не А1а С1и \/а1 С1и Азп Азр 315 320
С1и МеЬ Рго А1а Азр Ьеи Рго Зег 325
Ьеи А1а А1а Азр РЬе Уа1 С1и Зег 330 335
Ьуз Азр Уа1 Суз Ьуз Азп Туг А1а 340
С1и А1а Ьуз Азр \/а1 РЬе Ьеи С1у 345 350
МеЬ РЬе Ьеи Туг С1и Туг А1а Агд 355 360
Агд Ыз Рго Азр Туг Зег Уа1 Уа1 365
Ьеи Ьеи Ьеи Агд Ьеи А1а Ьуз ТЬг 370 375
Туг С1и ТЬг ТЬг Ьеи С1и Ьуз Суз 380
Суз А1а А1а А1а Азр Рго Низ С1и 385 390
Суз Туг А1а Ьуз \/а1 РЬе Азр С1и 395 400
РЬе Ьуз Рго Ьеи Уа1 61и 61и Рго 405
61п Азп Ьеи 11е Ьуз 61п Азп Суз 410 415
С1и Ьеи РЬе С1и С1п Ьеи С1у С1и 420
Туг Ьуз РЬе С1п Азп А1а Ьеи Ьеи 425 430
Уа1 Агд Туг ТЬг Ьуз Ьуз Уа1 Рго 435 440
С1п Уа1 Зег ТЬг Рго ТЬг Ьеи Уа1 445
С1и Уа1 Зег Агд Азп Ьеи С1у Ьуз 450 455
Уа1 С1у Зег Ьуз Суз Суз Ьуз Ыз 460
Рго С1и А1а Ьуз Агд МеЬ Рго Суз 465 470
А1а С1и Азр Туг Ьеи Зег Уа1 Уа1 475 480
Ьеи Азп С1п Ьеи Суз Уа1 Ьеи Низ 485
С1и Ьуз ТЬг Рго \/а1 Зег Азр Агд 490 495
Уа1 ТЬг Ьуз Суз Суз ТЬг С1и Зег 500
Ьеи Уа1 Азп Агд Агд Рго Суз РЬе 505 510
Зег А1а Ьеи С1и Уа1 Азр С1и ТЬг 515 520
Туг Уа1 Рго Ьуз С1и РЬе Азп А1а 525
- 58 023344
С1и ТЬг 530 РЬе ТЬг РЬе ΗΪ3 А1а 535 Азр 11е Суз ТЬг Ьеи 540 Зег С1и Ьуз С1и
Агд С1п Не Ьуз Ьуз С1п ТЬг А1а Ьеи Ча1 С1и Ьеи Ча1 Ьуз ΗΪ3 Ьуз
545 550 555 560
Рго Ьуз А1а ТЬг Ьуз С1и С1п Ьеи Ьуз А1а Ча1 МеЬ Азр Азр РЬе А1а
565 570 575
А1а РЬе Ча1 С1и Ьуз Суз Суз Ьуз А1а Азр Азр Ьуз С1и ТЬг Суз РЬе
580 585 590
А1а С1и С1и С1у Ьуз Ьуз Ьеи Ча1 А1а А1а Зег С1п А1а А1а Ьеи С1у
595 600 605
Ьеи

Claims (2)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 Стадия
Накопление посевного материала во встряхиваемой колбе
Этап 2
1, 8,15, 22 и 59 день
Фиг. 20 • Хорошо переносятся, не вызывают заболеваемости или смертности » Дозолависимое повышение содержания гранулоцитов • Нормальные гематологические показатели после 2недельиого восстановления в отсутствии лечения • Антитела против нейгранина выявлялись у 8 из 1 2 обезьян, получающих лечение неигранином. к 21 дню • Хорошо переносятся, не вызывают заболеваемости иди смертности ® Антитела против нейгранина выявлялись у всех 13 мышей, получающих лечение нейгранином. к 8 дню ® Не наблюдалось макроскопических или микроскопических изменений в тканях, являющихся мишенями, через 2 недели после 8( введения нейгранина лрошо переносятся, не вызывают заболеваемости иди смертности » Дозозависимос повышение содержания лейкоцитов на 36 день » Увеличенная масса селезенки при конечной некроскопии »Дозозакненмып микроскопический лейкоцитоз в красной пульпе селезенки и миелоидная гиперплазия костного мозга по результатам некроскопии в конце исследования • Частота встречаемости и выраженность явлении, связанных с введением нейгранина. снижались после восстановления по результатам некроскопии ® Титр положительных антител к нейгрлнину у 24 из 30 получающих лечение нейгранином обезьян на 29 день и у 12 из 12 получающих лечение иейгранином обезьян на 45 день • т;г ι·ίΖίΐ) нейтрализация сывороткой οι о из 30 подучающих лечение нейгранином обезьян »Хорошо переносятся, не вызывают заболеваемости или смертности в течение фазы лечения или в течение но крайней мере 90 дней после последнего введения • Титр положительных антител, специфичных к нейгранину
О-С8Р и альбумину человека, наблюдался у всех обезьян получающих лечение неигранином нейгранина и тЬО-С8Р • Титры антител и нейтрализующая активность сиижа после 90-дневного промежутка в отсутствии лечен репидивирующей нейтрализующей активностью получающих лечение нейгранином обезьян
Процесс ферментации Этак 1
1 МКИУТИЗЪЪ ΡΕΡ88ΑΥ8ΗΘ НРККРАНКЗЕ', УАНКЁКВЕСЕ ЕИРКАЬУЫА РАСУЕООСРР
61 ΕΡΗΥΚΕΥΝΕν ТЕРАКТСУАО ЕЗАЕКСРКЗЕ НТЪРСЕКЬСТ НАТЕКЕТУСЕ МАРССАКОЕР
121 ЕНКЕСЕЕОНК ΟΕΝΡΝΕΡΕΕν КРЕУЕУЫСТА ΕΗΡΝΕΕΤΕΕΚ ΚΥΕΥΕΡΑΚΚΗ ΡΥΕΥΑΡΕΕΕΕ 181 ΕΑΚΗΥΚΑΑΕΤ ЕССОААРКАА СЕЕРКЕРЕЕК РЕСКАЗЗАКО НЕКСАЗЕОКЕ ΘΕΚΑΡΚΑΚΑν 241 АКЕЗОКЁРКА ЕЕАЕуАЗКЕу’Т НЕТКУНТЕСС НСРЕЕЕСАРР КАОЕАКУ1СЕ Ν0Ρ3Ι35ΚΕΚ 301 ЕССЕКРЕЕЕК ЗНС1АЕ7ЕКР ΕΜΡΑΕΕΡ3ΕΑ АРЕУЕЗКРУС КМУАЕАКРУЕ ЕСМЕЕУЕУАН 361 ΚΗΡΟΥδννΕΕ ЬКЕАКТУЕТТ ЕЕКССАААРР НЕСУАКУЕРЕ ЕКРЕУЕЕРОМ ΕΙКОКСЕЕЕЕ 421 ОЬСЕУКЕОМА ЕЕУКУТККУР ОУЗТРТЕУЕУ ЗКМЕСКУСЗК ССКНРЕАКНМ РСАЕРУЕЗуН 481 ЕКОЕСКЕНЕК ТРУЗРКУТКС СТЕЗЕУМ КНР СЕЗАЬЕУРЕТ СУРКЕΕΝΑΕΤ ЕТЕНАР1СТЕ 541 ЗЕКЕЩЛККО ТАЕУЕЕУКНК РКАТКЕОЕКА УМРРЕААЕУЕ КССКАЕΡΚΕΤ СЕАЕЕбККЕН 601 ΑΑ3ΩΑΑΕ5Ε Фиг. 1С
- 62 023344
- 63 023344
Фиг. 4
Фиг. 5
- 64 023344
Фиг. 6
Фиг. 7В
- 65 023344
- 66 023344
Фиг. 11
Плацебо
Сывороточный альбумин человека ' Альбугранин 5 мг/кг
Альбугранин 10 мг/кг Ф Нсйласта 1,12 мг/кг -Ф Нсйласта 2,14 мг/кг
1И
Альбугранин = Нейгранин (ΝΕΕΓΟ)
В
Фиг. 12
- 67 023344
Компонент Концентрация Доставляемое количество на флакон3 Степень чистоты Назначение Нейгранин 15,0 мтумл 15,0 мт ΑΡΙ Одноосновный фосфат натрия 0,44 мг/мл (3 мМ) 2,42 мг ϋδΡ, несколько фармакопеи Буферный агент Двухосновный фосфат натрия 0,97 мг/мл (7 мМ) 0,35 мг ϋδΡ, несколько фармакопеи Буферный агент Маннит 36,4 мг/мл (200 мМ) 32,79 мт И8Р, несколько фармакопей Буферный агент Дигидрат трегалозы 22,70 мг/мл (60 мМ) 22,7 мг Высокая чистота Криозащитный агент Полисорбат 80 0,1 мт/мл (0,01%) 0,1 мг ΌδΡ, несколько фармакопей Ингибирование агрегации Стерильная вода для инъекций Восстановление 1,0 мл 1,0 мл из? Разбавитель
аА 0,16 мл избыток содержится в каждом флаконе для обеспечения доставляемого объема 1,0 мл
Фиг. 13
Компонент Концентрация Доставляемое количество на флакон3 Степень чистоты Назначение Нейгранин 50,0 мг/мл 50,0 мг· ΑΡΪ Одноосновный фосфат натрия 2,42 мг/мл (17,4 мМ) 2,42 мг ϋδΡ, несколько фармакопей Буферный агент Двухосновный фосфат натрия 0,35 мг/мл (2,5 мМ) 0,35 мт изр, несколько фармакопеи Буферный агент Маннит 32,79 мг/мл (180 мМ) 32,79 мг изр, несколько фармакопей Объемообразующий агент Дигидрат трегалозы 22,70 мг/мл (60 мМ} 22,70 мг Высокая чистота Криозащитный агент Полисорбат 80 0,1 мг/мл (0,01%) 0,1 мг ϋδΡ, несколько фармакопей И нгибир ование агрегации Стерильная вода для инъекций Восстановление 1,0 мл 1,0 мл ШР Разбавитель
аА 0,11 мл избыток содержится в каждом флаконе для обеспечения доставляемого объема 1,0 мл.
Фиг. 14
Фиг. 15
- 68 023344
Фиг. 16
- 69 023344
Номеи гкс иоышч
НС45901 ОМ'Ъ'Л:
Фиг. 18
Огр’ЧМ кИИсТИ <ЕМ св чк гм йен маш 5 мышеи :У 1 > 1 ί и I Д 101 рТТГГО! Λ ИТ» инъекции
СОгрмакОкИНсГЯ •сСкие свойства пепгрзпп.чд и нейласты ν мышеи
Мышь
ВНР!
времен кую дочку'!
времен ную точку)
Продо лжите льиост ь (дин)
Способ введения и схема приема Связанные с исследованием наблюдения
Οΐ»»ρΊ4·4 Р, и κι Ч( ингекция неигранииа в дозе 1,25 и 0,25 ш кг неш.'Псяа в не II 2х· мг κι контроль плацебо для IV и 8С
Но сравнению с р<-ипг«-иол Нейгранин имеет оотее д щвиыи период но гу выведения, более медлепн' ггт г игреке и меиынии объем ρм цре_и. ,сннч при IV и 5( .,„1 Д1 {,.ш самцам мышеи В Г) г I
ГЬ пспграЕнгка снижается с увеличением тег ы как гля IV, гак и гля 8ί ιιιο>ούι вв> дс чия уьзжгвас па го иго фармакокинетические свойства неи'рзиг'Нл не имеют гннеииоц аависимоеиг <и дозъ д гя !Сс1ирУс\го!0 лгаплома
Фарма, гц инеш лес кие скотте гы яе-итц'ЯИНЗ , мышеи ВОР1.
получакчццч лечение ' РН соармакокигыги -сСкИЕ свойства нетргнпяа и нейласты ν мышеи ЬЬР1 с цитопекиеи времегг ную точку)
Однократная IV или 8С инъекция неигранииа в дозе ! ,25 и 5,0 мг/вг. ней лас г к в ;; не 2 ' мг , зд ί только Ч( введи яне) и О Г, плацебо
Однократная 8с инъекция нейгранина в дозе 5,0 мг/кг через ], 3 или 5 дней после введения 5-Ρϋ
Биолоступностъ неигранииа при 5С введении у мышеи состав гя-г г9ъс и 6Р\ при гоы> 0,2' и 0 12, μι кг соответственно
У мышеи ΒϋΡ 1 нейгранин имеет более коротким период позувь гя д· ния бо к е ι оротгое среднее вреия у дер кангпд и более быстрый клиренс. !сч иеиласга при IV ее 5с способах ВЕК-ДЕЯНЕ, КрС.Мс ГОГ О ОПОДО· 1\!ГНПСТЬ НЕ ягцачинз при вве гении енъг о, гем у цен Ыст ы 1263о по сравнег-ню с зг1 о) Клиренс неигранииа медленнее ν мышеи, которые страдают вызванной 5-Ρϋ цитопениеи, чем у нормальных аь шеи. ни· скорее всего связано с различиями в количестве нейтрофилов, которые играют важную роль в г тпрсиес (ιС8р '
Мышь
ВНР!
Однократная 8С инъекция нейгранина в юзе \0 μι <гт и ω нейласты в дозе 1.12 мгдкг иди планеоо через ί день после введения о-Р!
юлирекс неигранииа я нетгккгы ме, сгра 13Ю1 вызванной '-Р1 цитопениеи, мышеи, чго старее всего связано с раогг нейтрофилов.
дгыЕ играют важною рс,
Д ГСИГ’сС у мыты г· ч>-« у норапьнъчЕ гчиями в ко.пгчесгве
Фиг. 19А
Фиг. 19В
- 70 023344
Исследованяе/ломер Вид
Связанные е исследованием наблюдения
1Ь ледование ’ндчию я.тических •.вс-шп Λ«··ΐ!ί··;ρ<ί! и· г*, щыш ПГР)уг.%,ьян
НМУ(|1 ιΛι 0 Οι®
ТйеНштнле ί 123-109
Исследование иммуиогенности и токе икол огаческих свойств многокра гных доз (не СЕР) ν мышей НС45901.0КС.0.005
Исследование иммуиогенности и токсикологических свойств многократных доз (СИР) у обезьян Сохапсе 6962-114 НС-45 901. ОКС ,0.016 НС4590|.ОХС,0.018
25 и 100 мкг/кг 5 мкг/кг
0, 0,025 и 1,25 мг/кг
Исследование иммуиогенности многократных доз (не
Ηί.τνίίρ им 6 0 ПС, 5961 ОХС.О.П См алее ьаь2-12а
5 мужских особей/5 женских особей на группу
Нейгранин
АС)
0, 100, 500 и 100 мкг/кг
1000 мкг/кг (Нейгранин)
220 ми’/кг (Нейласта) г) 1 йласта (8С) , 8. 15, 22. 25 и 29
1 МАСРАТОЗРМ КЕМАЕОЕЕЕК НЗАЕЙТКрЕА ТРЕС-РАЗЗЕР озееексеео УР.КТОСРЗАА
61 ЪОЕКЕСАТУК ЕСНРЕЕЕ7ЕЕ ΘΗ3Ε6ΡРКАР ЕЗЗСРЗОАЕО ЕАССЕЗрЕНЗ ΘΕΕΕΥΟΘΕΕΟ
121 ΑΕΕ6Ι3ΡΕΕΘ РТЕОТЕОЕОН ΑΕΕΑΤΤΙΝΟΟ МЕЕЪСМАРАЕ ОРТуСАМРАЕ АЗАЕОКРАСС
181 УЕуАЗНЕОЗЕ ЕЕУЗУРКЕКН еаор
Фиг. 1В
1 0 81 ТСТСССССТССАСАТССТСАТСААТССТАТСССАААСТСТТССАТСААТТТАААССТСТТ 114 0 361 С А А Α Ε Ρ Η Е С Υ А К V Ε Ε Ξ Е К Р Ь 380
1141 СТССААСАСССТСАСААТТТААТСАААСААААТТСТСАССТТТТТСАССАССТТССАСАС 1200 381 УЕЕРСНЕ1К0ИСЕЕЕЕСЕСЕ 400
1201 ТАСАААТТССАСААТОСССТАТТАСТТССТТАСАССААСАААСТАССССААСТОТСААСТ 12 б О 401 Υ К Г N А Ε Ε V К Υ Т К К V Р □ V 5 Т 42 0
1261 ССААСТСТТСТАСАССТСТСААСАААССТАССААААСТССССАССАААТСТТСТАААСАТ 1320 421. Ρ Т Ь V Ε V 8 К N Ь С. К V 6 8 К С С К Н 440
1321 С С ТСААССАААААСААТ ССС С Т СТССАСААСАСТАТС ТАТС С СТССТС С Т СААССАСТТА 138 0 441 Ρ Е А К К Μ РСАЕЕЕЕЗ V У Ε Ν ζ) Е 4 60
13 81 ТСТСТСТТССАТСАСААААССССАСТААСТСАСАСАСТСАССАААТССТССАСАСААТСС
14 4 0 4 61 С V Ε Η Е К Т Ρ V 8 Ε В. V Т К С С Т Е 3 480
1441 ТТССТСААСАССССАССАТССТТТТСАССТСТССААСТССАТСАААСАТАССТТСССААА 1500 481. Е V N К К Р С Е 8 А I, Ε V Ε Ε Т Υ У Р К 500
15 01 САСТТТААТССТСАААСАТТСАССТТССАТССАСАТАТАТССАСАСТТТСТСАСААССАС 15 6 О 501 Ε Ε N А Ε Т Ε Т Ε Η Α ϋ I С Т Е 8 Е К Е 520
15 61 АСАСАААТСААСАААСАААСТССАСТТСТТСАССТССТСАААСАСААССССААСССААСА 16 2 О 521 К О 1 К К О Т А Е У Ε Ε V К Н К Р К А Т 540
1621 АААСАССААСТСАААССТСТТАТССАТСАТТТСССАССТТТТСТАСАСААСТССТССААС 1680 541 К Е О Ь К А V Μ Ε ϋ Р А А Ρ V Е К С С К 560
16 81 ССТОАССАТААОСАСАССТОСТТТСССОАССАОСОТААААААСТТСТТОСТОСААСТСАА
17 4 0 561 Α Е В К Ε Т С Ε А Ε Е С К К Е У А А 8 О 580
1741 ССТСССТТАСССТТААССССССТССССССТСССАССТСССТСССССАСАССТТССТССТС 1800 581 А А Е С I, Т Ρ Е С Р А 3 8 Ε Р С 8 Ε Ε Е 60 0
18 01 ААСТССТТАСАССААСТСАССААСАТССАСССССАТСССССАССССТССАССАСААССТС 18 б О 601 КСЕЕОУКК1О5РСААЕОЕКЕ 620
18 61 ТСТСССАССТАСААССТСТСССАСССССАССАССТССТССТССТСССАСАСТСТСТСССС 192 0
6 21 С А Т Υ К Е С Η Ρ Ε Ε Е У Ε Е 5 Н 3 Е 5 б 4 О
1921 АТССССТССССТССССТСАССАССТСССССАСССАСССССТССАССТСССАСССТССТТС 1980 641 1РЯАРЕЗЗСРЗОАЕОЕА6СЕ 660
1981 АСССААСТССАТАССССССТТТТССТСТАССАСССССТССТССАСССССТССААСССАТС 20 4 О 661 3 О Ε Н 3 О ί Ε Ε Υ О О Ε Ε О А Ε Е 5 I 680
2041 ТССССССАСТТСССТСССАССТТССАСАСАСТССАССТССАССТСССССАСТТТСССАСС 2100 681. 8 Ρ Ε Е С Ρ Т Ε Ε Т Ε О Ε Ε V А Ε Е А Т 700
2101 АС САТ С ТСССАССАСАТССААСААСТСССААТСССС С С ТССС С Т ССАССС САС С САСССТ 2160
701 Т1ЙССКЕЕЕ6НАРАЕСРТ0С 720
2161 СССАТСССССССТТССССТСТССТТТССАСССССССССАССАССССТССТССТТСССТСС 2220 7 21 &МРАЕА5АЕ0В.КАССУЕУА5 7 4 0
2221 САТСТССАОАЗСТТССТСеАССТЗТСС-ТАССССОТТСТАСЗССАССТТОСССАСССС 2280 '7 41 И 1с □ 8 Г Ь Ε V 8 Υ К V Ь Ε Η Т, А □ Р 75 9
Фиг. 1А
Условные обозначения:
Последовательность аминокислот О-С5Р подчеркнута.
Последовательность кДНК: А = аденин, С=цитозин, 6=туанин,
Т тимидин
Последовательность аминокислот: А = А1а, С = Суз, О = Азр, Е = С1п, Р =
РЬе, О = О1у, Η = Н1з, I = Не, К = Ьуз, Ь = Ьеи, М = МеЬ N = Азп, Р = Рго,
О - О1п, К - Лгу, 8 - 8ег, Т - ТЬг, V - Уа!. \¥ - Тгр, Υ - Туг
- 61 023344
1 САТ ССАСАСААСАСТ САООТ Т СС Т С АТ С ССТ Т Т АААСАТ Т Т СССАСАА СААААТ Т Т С ААА 6 О 1 О А Н К 8 Б V .А Н К Е К О В О Ε Ε N Е К 2 0 б1 ОССТТССТОТТОАТТОССТТТССТСАСТАТСТТСАССАСТОТССАТТТОААСАТСАТОТА 120 21 А Ь V Ь I А Ε Α ζ) Υ В ζ) ζ) С Ρ Ε Ε В Η V 4 0
121 41 АААТ Т АСТ СААТ СААСТААС Т СААТ Т Т ССА ААААСАТ ОТ ОТ Т СС Т СВАТ С АСТ С А ОС Т САА 18 0 К Ь V Ν Ε V Т Ε Е А К Т С V А В Е 8 А Е 60 181 61 А АТ Т СТ СА С АААТ С АС Т Т С АТ АС С С Т Т Т Т Т ССАСАСАААТ ТА Т ССАСАСТ Т ОСА АС Т СТТ 240 N С В К 5 Ь Η Т В Е С В К В, С Т V А Т В 8 0 241 81 С СТ САААС’С ТАТ ССТ САААТ ССС Т САС Т ССТ СТ ССААААСААСААС С Т САСАСАААТ САА 30 0 К Ε Т Υ С Ε М А В С С А К СЕРЕ К К Е 100 301 101 ТССТТСТТ ССААСАСАААСАТ САСААС С САААС С Т С С С С С САТ Т СОТ ОАСАС С АСАОСТ Т 3 6 0 С Е В о Н К В В Ν Ρ N В, Ρ Р. В V Ρ Ρ Е V 12 0 361 1 21 САТСТСАТСТССАСТССТТТТСАТСАСААТСААСАСАСАТТТТТСААААААТАСТТАТАТ 420 Ρ V М СТАЕ Η В Ν Ε Ε Т Е В, К К Υ В, Υ 140 421 141 САААТ Т СС САСААСАСАТ ССТ ТАС Т Т Т ТАТ СС С С СССААС Т С СТ Т Т Т С Т Т ТОС ТААААСС 4 8 0 Е 1 А Р К Η Ρ Υ Ε Υ А Ρ Е В В Ε Е А К Р 160 481 161 Т АТАААСС Т СС Т Т Т ТАС АСАА Т СТ Т СССААССТ ССТ САТАААССТСССТСССТСТТ ОС СА 5 4 0 Υ К А А Ε Т Е С С С А А В К А А С В В Р 180 541 181 ААСС Т С САТ СААСТТ С СССАТ СААСССААССС Т Т С СТ С Т СС САААСАСАОАС Т СААСТ СТ 6 0 0 К В В Е В Р В Е С К А 3 8 А К 0 Р В К С 200 601 2 01 СССАСТ сТ С СΑΑΑΆΑΤ ТТ ОСАСАДАСАОС ТТТСАААССАТ ОСССАСТАСС Т СССС ТСАСС 6 60 А 8 В С К Е С Е Р. А Е К А «Г А V А Ρ В, 8 22 0 6 61 221 САСАСАТТТСССАААОСТСАСТТТССАСААСТТТССААСТТАСТСАСАОАТСТТАССААА 720 □ Ρ Ε Р К А Ε Ε А Ε V 3 К В '7 Т В В Т К 24 0 721 241 СТССАСАСС5ААТ6СТСС САТ СОАСАТ С Т ОС Т ТСААТ ОТ ОС Т САТ ОАСАСССССОА,СС Т Т 7 8 0 V Η Т Е С С Н С В В В Е С А В В Р А В В 260 781 2 61 СССААСТАТАТСТСТСААААТСААСАТТССАТСТССАСТАААСТСААССААТССТСТСАА 840 А К Υ 1 С Е N С В 8 I 8 8 К В, К Е С С Е 280 841 281 АААСС Т С Т СТ Т ССАААААТ С С САС Т ССАТТ СС С СААСТ ССААААТ САТ САСАТ СС СТ ССТ 90 0 К Р В В Е К 8 Н С 1 А Ε V Е К В Ε Μ Р А 300 901 301 САС Т Т СС С Т ТСАТТАССТСС Т САТ Т ТТ СТ ТСАААСТАА СОАТ СТ Т Т ОСАААААС ТАТ ОС Т 9 6 0 В В Р 8 В А А В Е '7 Е 8 К В V С К Ν Υ А 32 0 961 321 САСССАААССАТСТСТТССТССССАТСТТТТТСТАТСААТАТССААСААСССАТССТСАТ 1020 Е А К В V Ε I, С Μ Ε I, Υ Ε Υ А Ρ Р Я Р В 34 0 1021 341 ТАСТ С Т СТ С СТ ОСТ СС Т ОС ТСАСАС Т Т ОС СААСАСАТАТ САААСС АС Т СТАОАСААСТ ОС 10 8 0 Υ 8 V V В В В Р В А К Т Υ Ε Т Т ВЕК С 360
- 60 023344
1. Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией, у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение субъекту, представляющему собой человека, от примерно 30 до примерно 60 мг рекомбинантного альбумина человека - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъект, представляющий собой человека, страдает от немиелоидного злокачественного новообразования и получает по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что нейтропения выбрана из группы, включающей первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, нейтропению, ассоциированную с синдромом, и имммуно-опосредованную нейтропению.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что нейтропения вызвана или связана с облучением, алкоголизмом, лекарственными препаратами, аллергическими заболеваниями, гипопластической анемией, аутоиммунным заболеванием, Т-γ лимфопролиферативным заболеванием (Т-γ ЛПЗ), миелодисплазией, миелофиброзом, дисгаммаглобулинемией, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, раком, дефицитом витамина Вп, дефицитом фолатов, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, поражением селезенки, гемодиализом или трансплантацией, лейкемией, миеломой, лимфомой, метастатическими солидными опухолями, которые инфильтрируют и замещают костный мозг, токсинами, недостаточностью костного мозга, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяной гипоплазией, врожденным дискератозом, болезнью накопления гликогена 1В типа, спленомегалией любой этиологии, врожденными дефектами миелоидных клеток или их предшественников.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что рекомбинантный альбумин человека - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят в момент времени, выбранный из группы, состоящей из следующих:
(a) по меньшей мере 12 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства;
(b) по меньшей мере 18 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства и (c) по меньшей мере 24 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства.
6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что немиелоидное злокачественное новообразование представляет собой рак молочной железы.
7. Способ по любому из пп.2-6, отличающийся тем, что миелосупрессивные противораковые лекарственные средства представляют собой доксорубицин и доцетаксел.
- 59 023344
2 Стадия
Накопление посевного материала в ферментаторах, затем помещение в 720-Ь производственный Ферментатор г
Процесс восстановления
Этан 3
Отбор н очистка супернатанта с помощью центрифугирования в дисковом сепараторе и глубинной фильтрации и/или микрофильтрации (МР)/диафилътрапни ГОР) ’ ф
Этап 4
Ультрафильтрация (иР)/Диафильтрация (ПР) супернатанта и фильтрация через 0,2 мкм Фильтр I
Процесс очищения
Этан 5
Хроматографическое очищение
Эт ан 6
Ультрафильтрация (ВР)/Диафилырация (ПР) (Лекарственное вещество до Формирования состава) ' ф ‘
Этан 7
Состав (Состав лекарственного вещества) ' г '
Этап 8
Асептическое заполнение емкости и хранение (Нерасфасовапное лекарственное вещество) (<-65°С)
EA201190080A 2009-01-16 2010-01-15 Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией EA023344B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14544009P 2009-01-16 2009-01-16
US14543609P 2009-01-16 2009-01-16
PCT/US2010/021241 WO2010083439A2 (en) 2009-01-16 2010-01-15 Recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor for the prevention of neutropenia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201190080A1 EA201190080A1 (ru) 2014-03-31
EA023344B1 true EA023344B1 (ru) 2016-05-31

Family

ID=42260335

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190079A EA201190079A1 (ru) 2009-01-16 2010-01-15 Новые стабильные составы рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека
EA201190080A EA023344B1 (ru) 2009-01-16 2010-01-15 Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190079A EA201190079A1 (ru) 2009-01-16 2010-01-15 Новые стабильные составы рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Country Status (16)

Country Link
US (4) US20100227818A1 (ru)
EP (2) EP2387420A2 (ru)
JP (2) JP5753095B2 (ru)
KR (2) KR20110132327A (ru)
CN (2) CN102395379B (ru)
AU (2) AU2010204547B2 (ru)
BR (2) BRPI1004940A2 (ru)
CA (2) CA2749786A1 (ru)
EA (2) EA201190079A1 (ru)
IL (2) IL214052A0 (ru)
MX (2) MX2011007582A (ru)
NZ (2) NZ594055A (ru)
SG (3) SG172940A1 (ru)
UA (2) UA103221C2 (ru)
WO (2) WO2010083434A2 (ru)
ZA (1) ZA201105171B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018187786A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Unipotent neutrophil progenitor cells, methods of preparation, and uses thereof

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ594055A (en) * 2009-01-16 2013-03-28 Teva Pharma New stable formulations of recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor fusion protein
EP2384759A1 (en) 2010-05-06 2011-11-09 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Sulphated hyaluronic acid in combination with G-CSF for use in mobilising blood stem cells
FI2575935T4 (fi) * 2010-06-07 2023-11-23 Amgen Inc Lääkeaineen vapautuslaite
CN102628869B (zh) * 2012-04-19 2014-04-02 上海蓝怡科技有限公司 提高甲胎蛋白抗体冻干稳定性的制剂
WO2014113359A1 (en) * 2013-01-15 2014-07-24 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Formulations of albu-bche, preparation and uses thereof
US20140271538A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor for the Prevention of Neutropenia in Pediatric Patients
MA40904A (fr) * 2014-11-03 2017-09-12 Hygeia Tech Inc Compositions d'ester de phorbol et procédés pour traiter ou réduire la durée d'une cytopénie
US10238650B2 (en) 2015-03-06 2019-03-26 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Method of treating cancer associated with a RAS mutation
BE1023343B1 (nl) * 2015-05-20 2017-02-09 Mycartis Nv Opslagbuffer
WO2017011399A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc Plinabulin compositions
WO2017017187A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Endor Technologies, S.L. Colony stimulating factor for use in pancreatic or colon cancer treatment
IL260933B2 (en) 2016-02-08 2023-04-01 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Preparations containing tocorsol or its analogues
CN106222221A (zh) * 2016-08-05 2016-12-14 山东科兴生物制品有限公司 制备重组人粒细胞刺激因子原液的纯化方法
US11278665B2 (en) 2016-11-22 2022-03-22 Eitan Medical Ltd. Method for delivering a therapeutic substance
CN110431135A (zh) 2017-01-06 2019-11-08 大连万春布林医药有限公司 微管蛋白结合化合物及其治疗用途
CA3052190A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Method of reducing neutropenia
CN109420159A (zh) * 2017-08-23 2019-03-05 江苏泰康生物医药有限公司 一种重组蛋白药物的新型稳定制剂
BR112020014960A2 (pt) 2018-01-24 2020-12-22 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Composição e método para redução de trombocitopenia
EP3746076A4 (en) * 2018-02-01 2021-12-22 Beyondspring Pharmaceuticals Inc. COMPOSITION AND METHOD FOR REDUCING CHEMOTHERAPY-INDUCED NEUTROPENIA BY THE ADMINISTRATION OF PLINABULINE AND G-CSF AGENT
US11583633B2 (en) 2018-04-03 2023-02-21 Amgen Inc. Systems and methods for delayed drug delivery
EP3632487B1 (en) 2018-10-05 2024-06-12 LTS Device Technologies Ltd Triggering sequence
CN111383745A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 医渡云（北京）技术有限公司 计算机数据处理方法、装置、存储介质及设备
US11684655B2 (en) 2019-05-31 2023-06-27 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex
US11267858B2 (en) 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
CN112316120A (zh) * 2019-08-05 2021-02-05 天津派格生物技术有限公司 使用低动员型g-csf有效且安全治疗粒细胞减少症的方法
KR102485892B1 (ko) * 2020-04-09 2023-01-09 주식회사 에이프릴바이오 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
CN111751552B (zh) * 2020-06-18 2022-09-16 广州市伊川生物科技有限公司 一种缺血修饰白蛋白测定试剂盒及其使用方法
US11723955B1 (en) * 2022-05-13 2023-08-15 Allgenesis Biotherapeutics Inc. VEGFR fusion protein pharmaceutical composition

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993015199A1 (fr) * 1992-01-31 1993-08-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et composition pharmaceutique les contenant
US5665863A (en) * 1992-01-31 1997-09-09 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Polypeptides having granulocyte colony stimulating activity, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US20030118612A1 (en) * 2000-01-10 2003-06-26 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US20080153751A1 (en) * 2001-12-21 2008-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU613030B2 (en) 1987-04-09 1991-07-25 Novozymes Delta Limited Yeast vector
JPH01215289A (ja) 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
DE4242863A1 (de) * 1992-12-18 1994-06-23 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von G-CSF
DE19549232C2 (de) * 1995-12-20 1998-05-20 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern
US7321023B2 (en) 1997-11-07 2008-01-22 Incyte Corporation SP16 protein
AU749815B2 (en) * 1998-03-06 2002-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-free preparations
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2002302814A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-23 Powderject Vaccines, Inc. Spray freeze-dried compositions
WO2003076567A2 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
US20070041987A1 (en) * 2003-03-19 2007-02-22 Daniel Carter Fragments or polymers of albumin with tunable vascular residence time for use in therapeutic delivery and vaccine development
US6972332B1 (en) * 2004-05-20 2005-12-06 Acura Pharmaceuticals, Inc. Process for the production of opiates
JP2009504157A (ja) * 2005-08-12 2009-02-05 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US8800782B2 (en) * 2006-04-13 2014-08-12 Wix Filtration Corp Llc Filter element
JP2008146587A (ja) * 2006-12-13 2008-06-26 Sony Corp 表示装置、表示プログラム、表示方法、画像提供装置、画像提供プログラム、画像提供方法及び記録媒体
NZ594055A (en) 2009-01-16 2013-03-28 Teva Pharma New stable formulations of recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor fusion protein

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993015199A1 (fr) * 1992-01-31 1993-08-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et composition pharmaceutique les contenant
US5665863A (en) * 1992-01-31 1997-09-09 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Polypeptides having granulocyte colony stimulating activity, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US20030118612A1 (en) * 2000-01-10 2003-06-26 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US20080153751A1 (en) * 2001-12-21 2008-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dave Mead: "Novozymes Biopharma-Rethinking Tomorrow", October 2008 (2008-10), XP002589546, Retrieved from the Internet:URL:http://www.biopharma.novozymes.com/Admin/Public/DWSDownload.aspx?File=%2FFiles%2FFiler%2FPresentations%2FBPE08_DaveMead_Oct08.pdf [retrieved on 2010-06-29], Slides 14, 16 *
HALPERN WENDY ET AL.: "Albugranin, a recombinant human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) genetically fused to recombinant human albumin induces prolonged myelopoietic effects in mice andmonkeys." PHARMACEUTICAL RESEARCH NOV 2002 LNKD-PUBMED:12458679, vol. 19, no. 11, November 2002 (2002-11), pages 1720-1729, XP002589130, ISSN: 0724-8741, the whole document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018187786A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Unipotent neutrophil progenitor cells, methods of preparation, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010083434A2 (en) 2010-07-22
US20100297062A1 (en) 2010-11-25
SG196821A1 (en) 2014-02-13
EA201190080A1 (ru) 2014-03-31
MX2011007583A (es) 2011-12-14
CA2749802A1 (en) 2010-07-22
AU2010204552A1 (en) 2011-08-04
WO2010083439A2 (en) 2010-07-22
UA103221C2 (ru) 2013-09-25
JP2012515221A (ja) 2012-07-05
CA2749802C (en) 2016-08-23
MX2011007582A (es) 2011-12-14
CN102378635A (zh) 2012-03-14
AU2010204552B2 (en) 2014-05-01
AU2010204547A1 (en) 2011-07-28
AU2010204547B2 (en) 2014-01-23
CA2749786A1 (en) 2010-07-22
WO2010083434A3 (en) 2010-09-10
CN102395379A (zh) 2012-03-28
KR20110132327A (ko) 2011-12-07
BRPI1005159A2 (pt) 2018-04-03
IL214051A0 (en) 2011-08-31
UA105201C2 (ru) 2014-04-25
BRPI1004940A2 (pt) 2018-06-19
JP2012515222A (ja) 2012-07-05
US8993519B2 (en) 2015-03-31
KR20110132326A (ko) 2011-12-07
ZA201105171B (en) 2015-12-23
CN102395379B (zh) 2015-07-22
US20150202268A1 (en) 2015-07-23
US20100227818A1 (en) 2010-09-09
EA201190079A1 (ru) 2013-02-28
SG172941A1 (en) 2011-08-29
US20130129669A1 (en) 2013-05-23
EP2387420A2 (en) 2011-11-23
SG172940A1 (en) 2011-08-29
JP5753095B2 (ja) 2015-07-22
NZ594056A (en) 2013-03-28
US8323634B2 (en) 2012-12-04
WO2010083439A3 (en) 2010-09-10
IL214052A0 (en) 2011-08-31
EP2387419A2 (en) 2011-11-23
NZ594055A (en) 2013-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023344B1 (ru) Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией
US11358995B2 (en) Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
JP2017519009A (ja) 製剤化された受容体ポリペプチドおよび関連する方法
ES2708655T3 (es) Métodos para tratar el rechazo mediado por anticuerpos en pacientes con trasplante de órganos con el inhibidor de la c1-esterasa
CN103917554A (zh) 用于改善重构后纯化的因子viii的稳定性的方法
KR20150121715A (ko) Ｃｓｆ１ 치료제
US20190241660A1 (en) Immune-stimulating peptides and checkpoint inhibitors, and uses thereof for treating cancer
BR112020024683A2 (pt) Métodos de uso de cd24 para a prevenção e tratamento de doença do enxerto versus hospedeiro e mucosite
US11560412B2 (en) Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use
US20210346464A1 (en) TREATMENT OF ANEMIA DUE TO VERY LOW, LOW, OR INTERMEDIATE RISK MYELODYSPLASTIC SYNDROMES IN SUBJECTS WITH RING SIDEROBLASTS USING ACTIVIN-ACTRll LIGAND TRAPS
US20180140724A1 (en) Tumor Deliverable Iron and Protein Synthesis Inhibitors as a New Class of Drugs for the Diagnosis and Treatment of Cancer
US10967047B2 (en) Mitochondrial antiviral-signaling (MAVS) polypeptides and detection and use thereof
CN118251406A (zh) 血管活性肠肽(vip)受体拮抗剂
US10695401B2 (en) Use of vimentin in the modulation of acute inflammation and thrombosis
US20140271538A1 (en) Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor for the Prevention of Neutropenia in Pediatric Patients
US10765720B2 (en) Composition for preventing or treating hyperoxia-induced lung injury comprising WKYMVm peptide as an active ingredient
US20230167162A1 (en) Homing peptide-guided decorin conjugates for use in treating epidermolysis bullosa
AU2014202190B2 (en) New Stable Formulations of Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Fusion Protein
JP2024505000A (ja) 複数のタンパク質の送達のための血小板アルファ顆粒
AU2014208224A1 (en) New Stable Formulations of Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Fusion Protein
BR112017001789B1 (pt) Polipeptídeos, dímero, método de produção dos mesmos, composição farmacêutica, uso dos mesmos e recipiente estéril para tratamento de distúrbios metabólicos

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU