EA023080B1 - Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin - Google Patents
Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin Download PDFInfo
- Publication number
- EA023080B1 EA023080B1 EA201201595A EA201201595A EA023080B1 EA 023080 B1 EA023080 B1 EA 023080B1 EA 201201595 A EA201201595 A EA 201201595A EA 201201595 A EA201201595 A EA 201201595A EA 023080 B1 EA023080 B1 EA 023080B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rifabutin
- liposomes
- liposomal
- emulsion
- phosphatidylcholine
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к фармацевтике, а именно к получению липосом, содержащих антибиотик рифабутин, для ингаляционного введения при лечении туберкулеза.The invention relates to pharmaceuticals, namely to the production of liposomes containing the antibiotic rifabutin for inhalation administration in the treatment of tuberculosis.
Туберкулез (ТБ) - инфекционное заболевание с высоким уровнем смертности (10%), от которого умирает ежегодно более миллиона человек. В настоящее время наиболее распространен туберкулез легких, т.к. заражение человека туберкулезом происходит в большинстве случаев (в 95%) через дыхательные пути. Для лечения туберкулеза разработана схема терапии, согласно которой лечение проводят длительно в течение 4-6 мес., в сочетании приема (внутривенным введением и пероральным путем) нескольких препаратов первого ряда, в том числе рифампицином (РМ) или его производным рифабутином. Эффективность лечения больных ТБ может быть увеличена при использовании наиболее короткого пути попадания антибиотики в очаг поражения - легкие при ингаляционном введении.Tuberculosis (TB) is an infectious disease with a high mortality rate (10%), from which more than a million people die each year. Currently, the most common pulmonary tuberculosis, because human infection with tuberculosis occurs in most cases (95%) through the respiratory tract. A treatment regimen has been developed for the treatment of tuberculosis, according to which the treatment is carried out for a long time for 4-6 months, in combination with the administration (intravenous and oral) of several first-line drugs, including rifampicin (RM) or its derivative rifabutin. The effectiveness of treatment for TB patients can be increased by using the shortest route of antibiotic entry into the lesion - the lungs when inhaled.
Рифабутин (РБ) или 4-дезоксо-3,4-[2-спиро-И-изобутил-4-пиперидил] 2,5-дигидро-1Н-имидазол]рифамицин δ (С46Н62Ы4О11)-полусинтетический антибиотик рифамицинового ряда, гидрофобное соединение, плохо растворимое в воде (растворимость равна 0,19 мг/мл) со следующей химической формулой:Rifabutin (RB) or 4-deoxo-3,4- [2-spiro-I-isobutyl-4-piperidyl] 2,5-dihydro-1H-imidazole] rifamycin δ (C 46 H 62 N 4 O 11 ) -semi-synthetic rifamycin antibiotic, hydrophobic compound, poorly soluble in water (solubility 0.19 mg / ml) with the following chemical formula:
ОABOUT
Длительное применение рифабутина в виде капсул или инъекций оказывает выраженные побочные эффекты (тошнота, рвота, нарушение функции печени). Разработка новой лекарственной формы препарата, обеспечивающей повышенную растворимость рифабутина в воде, и направленное введение в легкие снизит его гепатотоксичность.Long-term use of rifabutin in the form of capsules or injections has pronounced side effects (nausea, vomiting, impaired liver function). The development of a new dosage form of the drug, providing increased solubility of rifabutin in water, and directed administration to the lungs will reduce its hepatotoxicity.
В следующих источниках описаны липосомальные композиции на основе рифабутина.The following sources describe rifabutin-based liposome compositions.
В частности, известна работа Шакиной Ю.Н., Вострикова В.В., Сорокоумовой Г.М., Селищевой А.А., Швеца В.И. Зависимость свойств рифабутина и его включения в липосомы от рН среды // Антибиотики и химиотерапия, 2005, т. 50, № 7, стр. 3-7, в которой проведено систематическое изучение физико-химических свойств рифабутина и показано, что включение РБ в липосомы является максимальным в кислой среде. В данной работе не приводятся значения эффективности включения рифабутина в липосомы, а рассчитывается связывание его с липосомальным фосфатидилхолином.In particular, the work of Shakina Yu.N., Vostrikov V.V., Sorokoumova G.M., Selishcheva A.A., Shvets V.I. The dependence of the properties of rifabutin and its incorporation into liposomes on the pH of the medium // Antibiotics and Chemotherapy, 2005, v. 50, No. 7, p. 3-7, which systematically studied the physicochemical properties of rifabutin and showed that the incorporation of RB into liposomes is maximum in an acidic environment. In this work, the values of the efficiency of rifabutin incorporation into liposomes are not presented, but its binding to liposomal phosphatidylcholine is calculated.
Известен патент КИ 2420287 Способ получения капсулированной формы противотуберкулезных препаратов рифамицинового ряда (опубликован 10.06.2011). Авторы для получения липосом использовали смесь липидов следующего состава: гликосфинголипиды 60%; фосфолипиды - 37% холестерин и триацилглицериды - 3%. Липосомы получали путем наслаивания порошка смеси липидов на поверхность водного раствора антибиотика с последующим диспергированием при слабом перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течении 30 мин. Эффективность включения РБ в липосомы составляла 33%. В работе не определялась стабильность данного препарата при хранении и не предлагался путь их дальнейшего введения в организм при лечении.Known patent KI 2420287 A method of obtaining an encapsulated form of anti-tuberculosis drugs of the rifamycin series (published on 06/10/2011). To obtain liposomes, the authors used a mixture of lipids of the following composition: glycosphingolipids 60%; phospholipids - 37% cholesterol and triacylglycerides - 3%. Liposomes were obtained by layering a powder of a mixture of lipids on the surface of an aqueous solution of an antibiotic, followed by dispersion with gentle stirring with a magnetic stirrer at room temperature for 30 minutes. The efficiency of incorporating RB into liposomes was 33%. The work did not determine the stability of this drug during storage and did not suggest a way for their further introduction into the body during treatment.
Известна работа Сакраг М.М., Сги/ А., Реийа А.Р.,Кеутао 1., 8ои§а А.С., Е1еи1егю С.У., Иоттдиек δ.Α., Ргада А.С., Ьоидайо Р.А., Сги/ М.Е.М., Ребгока 1. КйаЪийи еиеаркиШеб ίη Прокотек ехИЪПк ίηсгеакеб ШегареиПс асЛуйу ίη а тобе1 оГ ШккеттаЮб ШЪегсШоык // 1йетаПопа1 1оита1 оГ АпПт1егоЫа1 АдеШк, 2008, 31, рр. 37-45. Авторами работы была создана и изучена ίη νί\Ό модель диссеминированного туберкулеза на мышах, органами-мишенями которого являются в основном печень, селезенка и легкие. Популяция мышей была инфицирована 5х104 КОЕ штамма М. 1иЪегси1ок1к Η37Κν. Были приготовлены и охарактеризованы липосомальные препараты с РБ, различающиеся липидным составом. Получали и исследовали действие РБ в составе липосом из фосфатидилхолина и фосфатидилглицерина (ФХ:ФГ), димиристоилфосфатидилхолина и димиристоилфосфатидилглицерина (ДМФХ:ДМФГ), дипальмитоилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилглицерина (ДПФХ:ДПФГ) и пегелированного дипальмитоифосфатидилхолина (ДПФХ:ПЭГ).The well-known work is Sacrag M.M., Sgi / A., Reiya A.R., Keutao 1., 8oega A.S., E1ei1egyu S.U., Iottiek δ.Α., Rgada A.S., Loidayo R.A., Sghi / M.E.M., Rebgoka 1. Kyaiyi eearkiSheb ίη Prokotek exIbpk ίηsgeakeb ShegareiPs asLuyu ίη and tobe1 og Shkkettaub ShbegsShoyyk // 1yeta Popa 1 1a1 Shyglya, St. Petersburg. 37-45. The authors of the work created and studied the ίη νί \ Ό model of disseminated tuberculosis in mice, the target organs of which are mainly the liver, spleen and lungs. The mouse population was infected with 5x10 4 CFU of the strain M. 1uBegi1ok1k Η37Κν. Liposome preparations with RB, differing in lipid composition, were prepared and characterized. The effect of RB in the composition of liposomes from phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol (PF: FG), dimyristoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPH: DMFG), dipalmitoylphospholiphylphenyl diphalide diphalide diphalide diphalide diphalide
Сравнительный анализ профилей распределения свободного РБ и различных липосомальных препаратов в организме мышей при внутривенном введении показал, что главными органами-мишенями липосом являются печень, легкие и особенно селезенка. Оказалось, что наиболее эффективную доставку препарата в ткани-мишени обеспечивали липосомы с РБ состава ДПФХ:ДПФГ. Оказалось, что в рассмотренной модели лечения диссеминированного туберкулеза липосомальным РБ большее снижение бактериальной нагрузки наблюдалось в селезенке и печени, а не в легких. Было показано, что для лече- 1 023080 ния легочного туберкулеза внутривенный путь введения липосомального препарата не имеет больших преимуществ перед свободным РБ.A comparative analysis of the distribution profiles of free RB and various liposome preparations in the body of mice with intravenous administration showed that the main target organs of liposomes are the liver, lungs, and especially the spleen. It turned out that the most efficient delivery of the drug to the target tissue was provided by liposomes with RB of the composition of DPPC: DPPH. It turned out that in the considered treatment model for disseminated tuberculosis with liposomal RB, a greater decrease in bacterial load was observed in the spleen and liver, and not in the lungs. It was shown that for the treatment of pulmonary tuberculosis, the intravenous route of administration of a liposomal preparation does not have great advantages over free RB.
По мнению авторов, в качестве наиболее близкого аналога данного изобретения возможно рассматривать исследования, описанные в работе Сакраг ММ, Νονα 8, Ройаек Р, Рейгана Τ δίίνα МТ, Сти/ МЕ Тйегареийс еГПсасу оГ Йро8ота1 йГаЪийи ίη а МусоЪасЮгшт гтит тойе1 оГ 1иГесйои. // Аийт1сгоЪ Аден® Сйето1йег. 2000 8ер;44(9):24,) в которой получение липосом с инкапсулированным в них РБ проводили в две стадии: вначале получали дисперсию мультиламмелярных везикул (МЛВ) путём диспергирования плёнки высушенных липидов в физиологическом или буферном растворах, а затем получали липосомы путём продавливания образцов через ядерный фильтр. Содержание РБ в липосомах определяли во фракции липосом после отделения свободного РБ от фракции липосом методом гель-фильтрации. Включение РБ в липосомы рассчитывали как отношение включенного РБ к фосфолипидам липосом, в которых он находился. Было показано, что отрицательно заряженные фосфолипиды увеличивают включение РБ. Установлено, что при внутривенном введении липосомы с РБ преимущественно накапливаются в печени и селезенке, а их накопление в легких незначительно. Это происходит потому, что липосомы легко фагоцитируются клетками ретикулоэндотелиальной системы (например, клетками Купфера), из-за чего эффективность их действия резко снижается. В данном исследовании нашли незначительное повышение эффективности действия липосом с РБ по сравнению с водным раствором РБ. Оценку стабильности компонентов, входящих в состав препарата (фосфолипидов и рифампицина), не проводили.According to the authors, as the closest analogue of the present invention, it is possible to consider the studies described in the work of Sacrag MM, Νονα 8, Royaek R, Reagan Τ δίίνα MT, Sti / ME Tjegareijs eGPsasu oG Yo8ota1 gGiiyi ίη and Musojasuhtogti tgtoy. // Aiit1ggo Aden® Syeto1yeg. 2000 8er; 44 (9): 24,) in which the preparation of liposomes with RB encapsulated in them was carried out in two stages: first, a dispersion of multilamellar vesicles (MLV) was obtained by dispersing the dried lipid film in physiological or buffer solutions, and then liposomes were obtained by forcing samples through a nuclear filter. The content of RB in liposomes was determined in the liposome fraction after separation of free RB from the liposome fraction by gel filtration. The incorporation of RB into liposomes was calculated as the ratio of the incorporated RB to the phospholipids of the liposomes in which it was located. Negatively charged phospholipids have been shown to increase the incorporation of RB. It was established that with intravenous administration, liposomes with RB mainly accumulate in the liver and spleen, and their accumulation in the lungs is insignificant. This is because liposomes are easily phagocytosed by cells of the reticuloendothelial system (for example, Kupffer cells), which is why their effectiveness decreases sharply. This study found a slight increase in the effectiveness of liposomes with RB compared with an aqueous solution of RB. Assessment of the stability of the components that make up the drug (phospholipids and rifampicin) was not performed.
Вместе с тем, при заражении туберкулезом клетки микобактерий туберкулеза после попадания в легкие и закрепления на сурфактанте способны проникать по механизму фагоцитоза в альвеолярные макрофаги, где происходит их размножение. Липосомы размером более 0,1 мкм также легко фагоцитируются альвеолярными макрофагами, и таким образом может быть осуществлена направленная доставка в макрофаги лекарственного препарата, находящегося в липосомах. Размер липосом важен для эффективности действия препарата. С одной стороны, чем больше размер частиц, тем эффективнее они захватываются альвеолярными макрофагами. С другой стороны, крупные частицы (около микрона в диаметре) осаждаются в носоглотке, и только небольшие частицы (не более 0,3-0,5 мкм) достигают альвеол. Кроме того, при лечении туберкулеза легких возможно местное применение препарата липосом с антибиотиком в виде ингаляций, при котором лекарственный препарат сразу попадет в место поражения.At the same time, when tuberculosis is infected, the cells of mycobacterium tuberculosis after getting into the lungs and fixing on a surfactant are able to penetrate through the mechanism of phagocytosis into alveolar macrophages, where they multiply. Liposomes larger than 0.1 μm are also easily phagocytosed by alveolar macrophages, and thus targeted delivery to the macrophages of a drug located in liposomes can be achieved. The size of liposomes is important for the effectiveness of the drug. On the one hand, the larger the particle size, the more efficiently they are captured by alveolar macrophages. On the other hand, large particles (about a micron in diameter) are deposited in the nasopharynx, and only small particles (not more than 0.3-0.5 microns) reach the alveoli. In addition, in the treatment of pulmonary tuberculosis, local use of the liposome preparation with an antibiotic in the form of inhalation is possible, in which the drug will immediately reach the site of damage.
Исходя из сказанного, для терапии легочного туберкулеза предпочтителен ингаляционный путь введения липосомального РБ, в следствии чего существует потребность в создании липосомального препарата РБ, обладающего высоким включением активного ингредиента в липосомы и стабильностью при хранении, который можно было бы применять местно для лечения туберкулеза легких. Результат, полученный при создании заявленного способа, состоит в возможности получения липосомального препарата рифабутина (РБ), характеризующегося максимально возможной степенью включения РБ в липосомы (до 73-75%), стабильным при хранением (не менее одного года) и пригодным для ингаляционной формы введения. В качестве такой лекарственной формы в данном изобретении предложена липосомальная форма рифабутина, т.к. на одной из начальных стадий получения липосом происходит солюбилизация малорастворимого РБ, за счет чего можно значительно (в десятки раз) повысить содержание антибиотика в водной фазе.Based on the foregoing, the inhalation route of administration of liposomal RB is preferable for the treatment of pulmonary tuberculosis, as a result of which there is a need to create a liposomal preparation of RB with a high inclusion of the active ingredient in liposomes and storage stability that could be applied topically for the treatment of pulmonary tuberculosis. The result obtained when creating the inventive method consists in the possibility of obtaining a liposomal preparation of rifabutin (RB), characterized by the highest possible degree of inclusion of RB in liposomes (up to 73-75%), stable during storage (at least one year) and suitable for inhalation administration . As such a dosage form, the present invention provides a liposomal form of rifabutin, as at one of the initial stages of liposome production, solubility of poorly soluble RB occurs, due to which it is possible to significantly (tenfold) increase the antibiotic content in the aqueous phase.
Задачей заявленного способа является упрощение процесса получения и повышение качества липосомального препарата по показателям стабильности как липосомальной структуры так и стабильности фармакологически активной субстанции рифабутина, при этом результат, полученный при решении поставленной задачи, состоит в достижении стандартности и стабильности содержащих рифабутин липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), высокой инкапсуляции рифабутина в липосомы, стабильности рифабутина в процессе хранения и снижении токсического действия липосомального рифабутина (в частности, более, чем в три раза по сравнению с нелипосомальным аналогом).The objective of the claimed method is to simplify the process of obtaining and improving the quality of the liposomal preparation in terms of stability of both the liposomal structure and the stability of the pharmacologically active substance rifabutin, while the result obtained in solving this problem is to achieve standardization and stability of rifabutin-containing liposomes (the size of liposomes is presented in narrow range), high encapsulation of rifabutin in liposomes, stability of rifabutin during storage and reduced toxicity someone steps liposomal rifabutin (eg, more than three times compared to neliposomalnym analogue).
Для достижения поставленного результата предлагается способ получения липосомального препарата, включающий создание композиции фосфатидилхолина и рифабутина, высушивание смеси, её эмульгирование в водной среде, диспергирование эмульсии, гомогенизацию, добавление криопротектора, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание, при этом эмульгирование проводят в водной среде, гомогенизацию проводили в два этапа: первоначальный при 500 атм, последующий при 8001000 атм, добавление криопротектора (лактозы, трегалозы, сахарозы или маннита) проводили первоначально при эмульгировании, а затем в процессе или после гомогенизации, при этом соотношение компонентов в полученном препарате рифабутин : фосфолипиды : криопротектор находится в переделах 7 : (10,0-700,0) : (28-120), соответственно, а в качестве фосфолипида используют фосфатидилхолин или фосфатидилхолин : отрицательно заряженные фосфолипиды в соотношении 1:1.To achieve the result, a method for producing a liposomal preparation is proposed, which includes creating a composition of phosphatidylcholine and rifabutin, drying the mixture, emulsifying it in an aqueous medium, dispersing an emulsion, homogenizing, adding a cryoprotectant, sterilizing filtration and freeze drying, while emulsifying is carried out in an aqueous medium, homogenization was carried out in two stages: initial at 500 atm, subsequent at 8001000 atm, adding a cryoprotectant (lactose, trehalose, sucrose or mannitol) initially carried out during emulsification, and then during or after homogenization, while the ratio of the components in the resulting preparation of rifabutin: phospholipids: the cryoprotectant is in the range 7: (10.0-700.0): (28-120), respectively, and phosphatidylcholine or phosphatidylcholine is used as a phospholipid: negatively charged phospholipids in a ratio of 1: 1.
В общем виде процессе практической реализации способ предусматривает использование яичного фосфатидилхолина и рифабутина в органических растворителях, удаление растворителя упариванием в вакууме, диспергирование полученной массы в водной среде с рН 6,3-7,3, диспергирование многослойных липосом при возрастающем давлении, добавление криопротектора до, во время или после гомогенизации, получение липосом размером 80-140 нм, стерилизующую фильтрацию полученной липосомальной эмульсии, разлив во флаконы, лиофилизацию и герметизацию в атмосфере инертного газа (или азо- 2 023080 та).In general terms, the process of practical implementation of the method involves the use of egg phosphatidylcholine and rifabutin in organic solvents, removing the solvent by evaporation in vacuo, dispersing the resulting mass in an aqueous medium with a pH of 6.3-7.3, dispersing multilayer liposomes with increasing pressure, adding a cryoprotectant to, during or after homogenization, obtaining liposomes with a size of 80-140 nm, sterilizing the filtration of the obtained liposomal emulsion, filling into bottles, lyophilization and sealing in the atmosphere inert gas (nitrogen or she 2 023 080).
Способ иллюстрируется графиками фармакокинетических профилей рифабутина в печени, мозге, почках и сердце крыс (рис. 1-4, соответственно).The method is illustrated by graphs of the pharmacokinetic profiles of rifabutin in the liver, brain, kidneys and heart of rats (Fig. 1-4, respectively).
Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте липидного компонента - фосфатидилхолина оцененивали методом тонкослойной хроматографии на пластинках по хроматограмме раствора целевого продукта в метаноле, на которой основное пятно желтого цвета находится на уровне основного пятна раствора стандартного образца фосфатидилхолина;The effectiveness of the proposed method for the qualitative and quantitative identification of the finished product of the lipid component - phosphatidylcholine was evaluated by thin-layer chromatography on plates by chromatogram of a solution of the target product in methanol, on which the main yellow spot is at the level of the main spot of a solution of a standard sample of phosphatidylcholine;
индекс окисленности липидов проводили УФ-спектроскопией при двух длинах волн: 233 нм и 215нм.the lipid oxidation index was carried out by UV spectroscopy at two wavelengths: 233 nm and 215 nm.
Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте рифабутина оцененивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили для количественного определения посторонних примесей и содержания рифабутина в образцах препарата. Использовали хроматограф 5>1итай/и. колонка 11,0 см х 4,6 мм ос4у18т1у1 51Йса де1 £ог сйгота!одгарЬу К (5 рт) или аналогичная, подвижные фазы: раные объемы ацетонитрила и калия дигидрофосфата; скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 254 нм.The effectiveness of the proposed method for qualitative and quantitative identification in the finished product of rifabutin was evaluated by high performance liquid chromatography, which was carried out for the quantitative determination of impurities and the content of rifabutin in the samples of the drug. A chromatograph 5> 1 titanium / i was used. column 11.0 cm x 4.6 mm os4u18t1u1 51Ysa de1 £ oh sigot! odar K (5 ppm) or similar, mobile phases: early volumes of acetonitrile and potassium dihydrogen phosphate; the speed of the mobile phase is 1.0 ml / min; detection at a wavelength of 254 nm.
Оценивали физико-химические свойства полученного липосомального препарата.The physicochemical properties of the obtained liposome preparation were evaluated.
Определением величины частиц липосом проводили на наносайзере 2е1а51/ег Иаио Ζδ, Ма1уеги методом фотонной корреляционной спектроскопии. Размер частиц измеряли при помощи полупроводникового лазера при длине волны 375 нм.The determination of the size of the liposome particles was carried out on a nanosizer 2e1a51 / eaaio иоδ, Ma1uegi by photon correlation spectroscopy. Particle size was measured using a semiconductor laser at a wavelength of 375 nm.
Нижеследующие примеры иллюстрируют способ получения липосомального препарата Рифабутина, а также варианты получения. Подразумевается, что хотя в подробном описании и конкретных примерах раскрыты предпочтительные варианты осуществления изобретения, они приведены лишь для наглядности, поскольку из описания, а также формулы изобретения для специалиста в данной области техники станут очевидными различные изменения и усовершенствования, не выходящие за пределы существа и объема изобретения.The following examples illustrate the method for producing the liposomal preparation Rifabutin, as well as production options. It is intended that although preferred embodiments of the invention are disclosed in the detailed description and specific examples, they are provided for illustrative purposes only, as various changes and improvements will be apparent to those skilled in the art from the description as well as the claims, without departing from the spirit and scope. inventions.
Пример 1. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 4000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.Example 1. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 4000 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the resulting lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) to completely remove ethanol.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 3,5 г трегалозы (из 10 необходимых). Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 6.6, which contained 3.5 g of trehalose (out of 10 required). The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900-1000 атм до размера частиц не более 150 нм. При достижении заданного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор трегалозы (6,5 г). Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 148,4 нм - 100%. Включение антибиотика после стерилизующей фильтрации 77,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then continued homogenization at 900-1000 atm to a particle size of not more than 150 nm. Upon reaching the specified particle size, the remaining sterile trehalose solution (6.5 g) was added to the emulsion. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 10 minutes. The particle size after sterilizing filtration of 148.4 nm is 100%. The inclusion of the antibiotic after sterilizing filtration is 77.4%. The volume of the sterile emulsion is 90 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение рифабутина не менее 75,4%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:40:100). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; particle size is stored in the nanoscale pH of 6.65. The inclusion of rifabutin is not less than 75.4%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. The mass ratio of the components in the preparation: The ratio of the components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: trehalose - (7: 40: 100). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction.
Пример 2. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин сои в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл этанола. Кардиолипин в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл хлороформа. Хлороформный раствор и этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя.Example 2. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Soy phosphatidylcholine in an amount of 2000 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Cardiolipin in an amount of 2000 mg was dissolved in 100 ml of chloroform. The chloroform solution and ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the obtained lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) until the solvent was completely removed.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин, кардиолипин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,0, в которой находилось 7,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine, cardiolipin and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 6.0, which contained 7.0 g of trehalose. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомо- 3 023080 генизацию при 800 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 138,0 нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 87,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then homogenization was continued at 800 atm to a particle size of not more than 150 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 10 minutes. The particle size after sterilizing filtration 138.0 nm - 100%. The inclusion of rifabutin after sterilizing filtration is 87.4%. The volume of the sterile emulsion is 90 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН-6,15. Включение антибиотика не менее 87,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: кардиолипин : трегалоза - (7:20:20:70). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; particle size is kept in the nanometer range of pH-6.15. The inclusion of an antibiotic is not less than 87.0%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. Mass ratio of components in the preparation: The ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: cardiolipin: trehalose - (7: 20: 20: 70). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction.
Пример 3. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилглицерин в количестве 2000 мг растворяли в 100 мл хлороформа. Хлороформный раствор и этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя.Example 3. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 2000 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. 2000 mg phosphatidylglycerol was dissolved in 100 ml of chloroform. The chloroform solution and ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the obtained lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) until the solvent was completely removed.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин, фосфатидилглицерин и рифабутин, добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,5, в которой находилось 12,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and rifabutin, 100 ml of a pH 7.5 buffer mixture containing 12.0 g of trehalose was added. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 141,8, нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 83,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then homogenization was continued at 900 atm to a particle size of not more than 150 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 10 minutes. The particle size after sterilizing filtration is 141.8, nm - 100%. The inclusion of rifabutin after sterilizing filtration is 83.4%. The volume of the sterile emulsion is 90 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение рифабутина не менее 82,5%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: кардиолипин : трегалоза - (7:20:20:120). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; particle size is stored in the nanoscale pH of 6.65. The inclusion of rifabutin is not less than 82.5%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. Mass ratio of components in the preparation: The ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: cardiolipin: trehalose - (7: 20: 20: 120). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction.
Пример 4. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин сои в количестве 70000 мг растворяли в 200 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.Example 4. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Soy phosphatidylcholine in an amount of 70,000 mg was dissolved in 200 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the resulting lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) to completely remove ethanol.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,0, в которой находилось 12,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 7.0, which contained 12.0 g of trehalose. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 1000 атм до размера частиц не более 220 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 20 мин (с заменой фильтров). Размер частиц после стерилизующей фильтрации 198,4 нм - 100%. Включение рифабутина после стерилизующей фильтрации 80,4%. Объем стерильной эмульсии 79 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then continued homogenization at 1000 ATM to a particle size of not more than 220 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 20 min (with filter change). The particle size after sterilizing filtration of 198.4 nm is 100%. The inclusion of rifabutin after sterilizing filtration is 80.4%. The volume of the sterile emulsion is 79 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение не менее 80,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:700:120). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; particle size is stored in the nanoscale pH of 6.65. Inclusion of at least 80.0%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. The mass ratio of components in the preparation: The ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: trehalose - (7: 700: 120). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction.
Пример 5. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 1000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтро- 4 023080 вали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.Example 5. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 1000 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 µm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37–40 ° C. Then, the resulting lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) to completely remove ethanol.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 7,2, в которой находилось 2,8 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To the lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 7.2, which contained 2.8 trehaloses. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 143,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 72,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then homogenization was continued at 800 atm to a particle size of not more than 150 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 10 minutes. The particle size after sterilizing filtration of 143.4 nm is 100%. The inclusion after sterilizing filtration of 72.4%. The volume of the sterile emulsion is 90 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 7,05. Включение не менее 70,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:7:28). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; the particle size is stored in the nanoscale pH of 7.05. Inclusion of at least 70.0%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. The mass ratio of components in the preparation: The ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: trehalose - (7: 7: 28). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction.
Пример 6. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 600 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.Example 6. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 600 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the resulting lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) to completely remove ethanol.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 10 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 6.6, in which there were 10 trehaloses. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 130 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила не удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 20 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 118,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 47,4%. Объем стерильной эмульсии 65,0 мл (потери за счет необходимости замены фильтров для отделения не включенного антибиотика).The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then homogenization was continued at 900 atm to a particle size of not more than 130 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters with a 0.2 micron filter. Filtration was not satisfactory: 100 ml was filtered no more than 20 minutes. The particle size after sterilizing filtration of 118.4 nm is 100%. The inclusion after sterilizing filtration of 47.4%. The volume of the sterile emulsion is 65.0 ml (losses due to the need to replace filters to separate an antibiotic not included).
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,55. Включение рифабутина не менее 48,0%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин : трегалоза - (7:5:100). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлена стабильность липосомальной формы рифабутина: размер частиц, степень включения рифабутина в липосомы, продукты деструкции липидов. Как видно из приведенных ланных снижение в составе липосом фосфатидилхолина приводит к снижению включения рифабутина в липосомы, к трудностям при проведении стерилизующей фильтрации из-за присутствия в образцах свободного антибиотика.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; the particle size is stored in the nanoscale pH of 6.55. The inclusion of rifabutin is not less than 48.0%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. The mass ratio of components in the preparation: the ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: trehalose - (7: 5: 100). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. The stability of the liposomal form of rifabutin was established: particle size, degree of incorporation of rifabutin into liposomes, products of lipid destruction. As can be seen from the above data, a decrease in the composition of liposomes of phosphatidylcholine leads to a decrease in the incorporation of rifabutin into liposomes, to difficulties in sterilizing filtration due to the presence of a free antibiotic in the samples.
Пример 7. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 85000 мг растворяли в 200 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления этанола.Example 7. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 85,000 mg was dissolved in 200 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° C. Then, the resulting lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) to completely remove ethanol.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 10 трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 6.6, in which there were 10 trehaloses. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 1000 атм до размера частиц не более 150 нм. При содержании в 1 мл эмульсии 800 мг фосфатидилхолина нам не удалось получить липосомы размером менее 400 нм. Эмульсию не удалось профильтровать через 0,22 мкм. Таким образом, увеличение соотношения рифабутин : фосфатидилхолин до 7 : 850 не позволило получить липосомы размером менее 200 нм.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then continued homogenization at 1000 ATM to a particle size of not more than 150 nm. With a content of 800 mg of phosphatidylcholine in 1 ml of emulsion, we were not able to obtain liposomes with a size of less than 400 nm. The emulsion could not be filtered through 0.22 μm. Thus, an increase in the rifabutin: phosphatidylcholine ratio to 7: 850 did not allow liposomes smaller than 200 nm in size.
- 5 023080- 5 023080
Пример 8. Рифабутин в количестве 700 мг растворяли в 100 мл этанола. Фосфатидилхолин яичного желтка в количестве 4000 мг растворяли в 100 мл этанола. Этанольные растворы объединяли, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 37-40°С в течение 90 мин. Затем полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 0,5 ч до полного удаления этанола.Example 8. Rifabutin in an amount of 700 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Egg yolk phosphatidylcholine in an amount of 4000 mg was dissolved in 100 ml of ethanol. Ethanol solutions were combined, filtered through 0.22 μm membranes and concentrated in vacuo on a rotary evaporator at 37-40 ° С for 90 min. Then, the obtained lipid film was treated with nitrogen gas with stirring (60-80 rpm) for 0.5 h until the ethanol was completely removed.
К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и рифабутин добавляли 100 мл буферной смеси с рН 6,6, в которой находилось 2,0 г трегалозы. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в до полного эмульгирования липидной пленки.To a lipid film containing phosphatidylcholine and rifabutin was added 100 ml of a buffer mixture with a pH of 6.6, which contained 2.0 g of trehalose. The emulsion container was mixed at 130-150 rpm until the lipid film was completely emulsified.
Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-43°С. Первоначальное давление (всего два цикла) составляло 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 900 атм до размера частиц не более 150 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 100 мл фильтровали не более 10 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 148,4 нм - 100%. Включение после стерилизующей фильтрации 79,4%. Объем стерильной эмульсии 90 мл.The emulsion was transferred to a high pressure homogenizer and homogenized at a temperature of 38-43 ° C. The initial pressure (only two cycles) was 500 atm. Then homogenization was continued at 900 atm to a particle size of not more than 150 nm. The emulsion was filtered through a cascade of filters, with a 0.2 micron finish filter. Filtration was satisfactory: 100 ml was filtered for no more than 10 minutes. The particle size after sterilizing filtration of 148.4 nm is 100%. Inclusion after sterilizing filtration 79.4%. The volume of the sterile emulsion is 90 ml.
Проводили розлив во флаконы и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы фиолетового цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне рН 6,65. Включение не менее 75,4%. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции рифабутина. Массовое соотношение компонентов в препарате: Соотношение компонентов в препарате: рифабутин : фосфатидилхолин: трегалоза - (7:40:20). Полученные образцы хранят при температуре +4°С в течение 1 года. Установлено, что после лиофилизации размер частиц значительно увеличился до 250 нм, обнаружено также нестабильность стабильность липосомальной формы рифабутина, что может быть сязано с уменьшением содержания в препарате криопоотектора лактозы.Spent bottling and lyophilization. The bottles were sealed in an atmosphere of inert gas (nitrogen). According to the results of the control of the product obtained by the proposed method, after lyophilization, it was found that the drug is presented in the form of a light amorphous mass of purple with a characteristic odor; particle size is stored in the nanoscale pH of 6.65. Inclusion of at least 75.4%. The amount of impurities in the liposomal product at the level of the initial substance of rifabutin. The mass ratio of components in the preparation: The ratio of components in the preparation: rifabutin: phosphatidylcholine: trehalose - (7:40:20). The obtained samples are stored at a temperature of + 4 ° C for 1 year. It was found that after lyophilization, the particle size significantly increased to 250 nm, instability of the liposomal form of rifabutin was also found to be unstable, which can be associated with a decrease in the lactose cryoprotector in the preparation.
Пример 9.Example 9
При исследовании фармакокинетики липосомального и нелипосомального рифабутина при однократном инъекционном введении крысам наблюдается его быстрое выведение из плазмы крови с максимальной концентрацией около 375 нг/мл, что согласуется с данными инструкции по медицинскому применению оригинального препарата рифабутина.When studying the pharmacokinetics of liposomal and non-liposomal rifabutin with a single injection to rats, it is rapidly excreted from blood plasma with a maximum concentration of about 375 ng / ml, which is consistent with the instructions for medical use of the original rifabutin preparation.
Существенные различия наблюдались при определении рифабутина в печени крыс. Стах для липосомальной формы составляла около 77,5 мкг/г (Ттах - 0,25 ч), для нелипосомальной - около 217 мкг/г (Ттах - 8 ч). Липосомальный рифабутин практически полностью выводился из печени к 72 ч, в отличие от нелипосомального, который сохраняется в печени к 72 ч после введения на уровне 173,6 мкг/г, причем наблюдается тенденция к его кумуляции. Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 183 мкг-ч/мл, период полувыведения - 11,1 ч, МКТ - 16 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 9173 мкг-ч/мл.Significant differences were observed in the determination of rifabutin in rat liver. The max for the liposomal form was about 77.5 μg / g (T max - 0.25 h), for the non-liposomal form - about 217 μg / g (T max - 8 h). Liposomal rifabutin was almost completely eliminated from the liver by 72 hours, in contrast to the non-liposomal rifabutin, which persists in the liver by 72 hours after administration at the level of 173.6 μg / g, with a tendency to its cumulation. For the liposomal dosage form, the AIS (72) was 183 μg-h / ml, the half-life was 11.1 hours, and MKT was 16 hours. For the non-liposomal dosage form, the AIS (72) was 9173 μg / h.
Также различия наблюдались для мозга - липосомальный рифабутин практически не проникал через ГЭБ и обнаруживался в небольших (до 1900 нг/г) не позднее 1,5 ч после введения. Нелипосомальный рифабутин обнаруживался в мозге крыс даже спустя 72 ч после введения в диапазоне концентраций 1600-7200 нг/г).Differences were also observed for the brain - liposomal rifabutin practically did not penetrate the BBB and was found in small ones (up to 1900 ng / g) no later than 1.5 hours after administration. Non-liposomal rifabutin was detected in rat brain even 72 hours after administration in the concentration range 1600-7200 ng / g).
Схожие фармакокинетические профили наблюдались для почек: для липосомального рифабутина Стах составила около 118 мкг/г, для нелипосомального - 93 мкг/г (Ттах - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 210 мкг-ч/мл, период полувыведения 18,1 ч, МКТ - 31,2 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 651 мкг-ч/мл.Similar pharmacokinetic profiles were observed for the kidneys: for liposomal rifabutin, C max was about 118 μg / g, for non-liposomal, 93 μg / g (T max 0.25 h in both cases). For the liposomal dosage form, the AIS value (72) was 210 μg-h / ml, the elimination half-life was 18.1 hours, and MKT was 31.2 hours. For the non-liposomal dosage form, the AIS value (72) was 651 μg / h.
Аналогичная как и для почек картина наблюдалась и для сердца. Для липосомального рифабутина Стах составила около 56 мкг/г, для нелипосомального - 34,1 мкг/г (Ттах - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 487 мкг-ч/мл, период полувыведения 27,4 ч, МКТ - 36,9 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина АИС(72) составила 700 мкг*ч/мл, период полувыведения - 19,9 ч, МКТ - 46,4 ч.A similar pattern for the kidneys was observed for the heart. For liposomal rifabutin, C max was about 56 μg / g, for non-liposomal rifabutin, 34.1 μg / g (T max 0.25 h in both cases). For the liposomal dosage form, the AIS value (72) was 487 μg-h / ml, the elimination half-life was 27.4 hours, and MKT was 36.9 hours. For the non-liposomal dosage form, the AIS (72) was 700 μg * h / ml, the half-life - 19.9 hours; MKT - 46.4 hours.
Таким образом, в связи с низким проникновением липосомального рифабутина в печень и мозг, можно предположить о его потенциально низкой гепатотоксичности и нейротоксичности.Thus, due to the low penetration of liposomal rifabutin into the liver and brain, it can be assumed about its potentially low hepatotoxicity and neurotoxicity.
Подытоживая, полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что продукт, полученный согласно заявленному способу - гомогенизация в два цикла: первоначально при 500 атм и последующая при 800-900 атм до указанного размера; и соотношение компонентов в итоговом препарате: рифабутин : фосфолипиды : трегалоза - 7 : (10,0-700,0) : (28-120) (см. примеры 1-5), обеспечивают стабильность композиции липосом с включенным в них рифабутином и обладают низкой гепатотоксичностью и нейротоксичностью. Воспроизведение заявленного способа при изменении параметров влечет трудности в реализации собственно способа и снижение качества целевого продукта, а именно увеличение размера и неоднородность дисперсионного состава липосом (пример 7); уменьшение включения рифабутина в липосомы и нестабильность размеров липосом (пример 6);Summing up, the obtained research results indicate that the product obtained according to the claimed method is homogenization in two cycles: initially at 500 atm and subsequent at 800-900 atm to the specified size; and the ratio of components in the final preparation: rifabutin: phospholipids: trehalose - 7: (10.0-700.0): (28-120) (see examples 1-5), ensure the stability of the liposome composition with rifabutin included in them and have low hepatotoxicity and neurotoxicity. Reproduction of the claimed method when changing the parameters entails difficulties in implementing the actual method and reducing the quality of the target product, namely an increase in the size and heterogeneity of the dispersion composition of liposomes (example 7); a decrease in the incorporation of rifabutin into liposomes and instability of liposome sizes (example 6);
- 6 023080 существенное увеличение времени стерилизующей фильтрации или невозможность фильтрации липосомальной эмульсии (пример 6);- 6 023080 a significant increase in the time of sterilizing filtration or the inability to filter the liposomal emulsion (example 6);
нестабильность липосом после лиофилизации (пример 8).instability of liposomes after lyophilization (example 8).
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было проведено изучение стабильности рифабутина после лиофилизации образцов липосом по сравнению с исходной субстанцией. Подтверждена идентичность качественного и количественного состава рифабутина после высушивания и последующей регидратации образцов липосом. Содержание примесей и время их удерживания не изменились, что может свидетельствовать о стабильности рифабутина в процессе получения липосом и их последующего сублимационного высушивания.The method of high performance liquid chromatography was used to study the stability of rifabutin after lyophilization of liposome samples compared to the original substance. The identity of the qualitative and quantitative composition of rifabutin after drying and subsequent rehydration of liposome samples was confirmed. The content of impurities and their retention time have not changed, which may indicate the stability of rifabutin in the process of obtaining liposomes and their subsequent freeze-drying.
Таким образом, использование наночастиц, представляющих собой искусственные мембраны - липосомы, нагруженные рифабутином, представляют несомненный интерес для дальнейшего изучения.Thus, the use of nanoparticles, which are artificial membranes - liposomes loaded with rifabutin, are of undoubted interest for further study.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201201595A EA023080B1 (en) | 2012-12-24 | 2012-12-24 | Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201201595A EA023080B1 (en) | 2012-12-24 | 2012-12-24 | Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201201595A1 EA201201595A1 (en) | 2014-06-30 |
| EA023080B1 true EA023080B1 (en) | 2016-04-29 |
Family
ID=51013733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201201595A EA023080B1 (en) | 2012-12-24 | 2012-12-24 | Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA023080B1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2071765C1 (en) * | 1994-07-14 | 1997-01-20 | Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии | Method of liposome preparation |
| RU2223764C1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-02-20 | Закрытое акционерное общество "АИП-Наука" | Method for preparing rifampicin liposomal form |
| EA200802431A2 (en) * | 2008-12-30 | 2009-04-28 | Ооо «Научно-Производственный Комплекс "Наносистема"» | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF TUBERCULOSIS, METHOD OF ITS RECEPTION, METHOD OF TREATMENT AND LIPID-POLYMERIC MATRIX FOR THE MANUFACTURE OF PHARMACEUTICAL COMPOSITION |
| RU2391966C1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-06-20 | ООО "ЭкоБиоФарм" | Based on botanical phospholipids nanosystem for actuation of biologically active compounds, and method of its manufacture (versions) |
| EA013569B1 (en) * | 2009-02-24 | 2010-06-30 | Ооо "Научно-Производственный Комплекс "Наносистема"" | Pharmaceutical composition of rifabutin for treating tuberculosis and other diseases mediated by helicobacter pylori, method of production thereof and method for treatment thereof |
-
2012
- 2012-12-24 EA EA201201595A patent/EA023080B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2071765C1 (en) * | 1994-07-14 | 1997-01-20 | Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии | Method of liposome preparation |
| RU2223764C1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-02-20 | Закрытое акционерное общество "АИП-Наука" | Method for preparing rifampicin liposomal form |
| EA200802431A2 (en) * | 2008-12-30 | 2009-04-28 | Ооо «Научно-Производственный Комплекс "Наносистема"» | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF TUBERCULOSIS, METHOD OF ITS RECEPTION, METHOD OF TREATMENT AND LIPID-POLYMERIC MATRIX FOR THE MANUFACTURE OF PHARMACEUTICAL COMPOSITION |
| RU2391966C1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-06-20 | ООО "ЭкоБиоФарм" | Based on botanical phospholipids nanosystem for actuation of biologically active compounds, and method of its manufacture (versions) |
| EA013569B1 (en) * | 2009-02-24 | 2010-06-30 | Ооо "Научно-Производственный Комплекс "Наносистема"" | Pharmaceutical composition of rifabutin for treating tuberculosis and other diseases mediated by helicobacter pylori, method of production thereof and method for treatment thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СЕЛИЩЕВА Алла Анатольевна. Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук. Москва, 2007, с. 29-34 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201201595A1 (en) | 2014-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1339008C (en) | Amphotericin b liposome preparation | |
| Laouini et al. | Preparation, characterization and applications of liposomes: state of the art | |
| RU2216315C2 (en) | Method for preparing liposomes | |
| AU2013296651B2 (en) | Cochleates made with soy phosphatidylserine | |
| WO2010083778A1 (en) | Lung targeting injectable pharmaceutical composition of liposome | |
| JPH0534334B2 (en) | ||
| JP2798302B2 (en) | Preparation of liposome and lipid complex compositions | |
| US20070178147A1 (en) | Liposomal compositions | |
| JP3245955B2 (en) | Liposome | |
| WO2008130137A1 (en) | Anionic lipid nanosphere and preparation method of the same | |
| KR101739208B1 (en) | A hybrid multilamellar nanostructure of epidermal growth factor and liposome and a preparation method of the same | |
| JP2001500105A (en) | Amphiphilic drug composition encapsulating liposomes | |
| US20110020428A1 (en) | Gel-stabilized liposome compositions, methods for their preparation and uses thereof | |
| Ruckmani et al. | Tissue distribution, pharmacokinetics and stability studies of zidovudine delivered by niosomes and proniosomes | |
| US20150157610A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating inflammatory disease | |
| EP3616726B1 (en) | Protein particle wrapped with medicine insoluble in water and preparation method therefor | |
| EA023080B1 (en) | Process for preparation of inhalational liposomal form of rifabutin | |
| KR102487437B1 (en) | Highly Efficient Encapsulation of Hydrophilic Compounds in Monolayer Liposomes | |
| Kucuk et al. | Incorporation of Biologically Active Ingredient Gallic Acid Into Nano-scale Lipid Vesicles | |
| JP7343643B2 (en) | Lipid particle compositions and pharmaceutical compositions | |
| CN105832665A (en) | Itraconazole/phospholipid composite and preparation method thereof, itraconazole sub-micro-emulsion, preparation method and application thereof | |
| JP2015010069A (en) | Liquid premix preparation of polyene macrolide antibiotics, and manufacturing method of the same | |
| KR20240037280A (en) | Method for preparing liposomal formulations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |