EA022609B1 - Применение свободного фетального гемоглобина в качестве маркера преэклампсии - Google Patents

Применение свободного фетального гемоглобина в качестве маркера преэклампсии Download PDF

Info

Publication number
EA022609B1
EA022609B1 EA200970758A EA200970758A EA022609B1 EA 022609 B1 EA022609 B1 EA 022609B1 EA 200970758 A EA200970758 A EA 200970758A EA 200970758 A EA200970758 A EA 200970758A EA 022609 B1 EA022609 B1 EA 022609B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hemoglobin
level
free
sample
preeclampsia
Prior art date
Application number
EA200970758A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970758A1 (ru
Inventor
Стефан Ханссон
Бо Окерстрем
Original Assignee
А1М Фарма Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by А1М Фарма Аб filed Critical А1М Фарма Аб
Publication of EA200970758A1 publication Critical patent/EA200970758A1/ru
Publication of EA022609B1 publication Critical patent/EA022609B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99003—Heme oxygenase (1.14.99.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к биомаркерам преэклампсии, а также лечению данного заболевания. Конкретно изобретение относится к способам диагностики или способствованию диагностике преэклампсии у беременных особей млекопитающего для обнаружения повышенных уровней свободного фетального гемоглобина. Это облегчает и делает возможным раннюю диагностику и клиническое вмешательство, когда обнаружено состояние преэклампсии. В дополнение изобретение относится к набору для применения в способе по изобретению, содержащему средства для определения мРНК фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего.

Description

Настоящее изобретение относится к биомаркерам преэклампсии, а также лечению данного заболевания. Конкретно изобретение относится к способам диагностики либо способствованию диагностике преэклампсии беременной особи млекопитающего женского пола, чтобы выявить повышенные уровни отдельных веществ. Это облегчает и делает возможной раннюю диагностику и клиническое вмешательство при обнаружении состояния преэклампсии. В дополнение изобретение относится к способу лечения особей млекопитающих женского пола с преэклампсией с целью вызвать обратное развитие патологических состояний, связанных с данным заболеванием.
Уровень техники изобретения
Преэклампсия (РЕ), гестационная протеинурическая гипертензия, осложняет 3-7% всех беременностей и представляет собой мультисистемное нарушение со стороны матери. Ежегодно сообщается о 8500000 случаев во всем мире, из которых 5000 происходят в Швеции. Сегодня это наиболее частая причина смертности как детей, так и матерей во время беременности.
РЕ была названа заболеванием теорий [КоЬейв, 2001] и была описана еще 3000 лет назад древними египтянами [§!еуепв, 1975]. РЕ все еще представляет собой одно из доминирующих акушерских осложнений, вызывающее перинатальную и материнскую заболеваемость и смертность. Клинические проявления, т.е. гипертензия и протеинурия, появляются, начиная с 20 недели развития беременности, но лежащие в ее основе механизмы могут начаться еще в период имплантации. По мере прогрессирования заболевания спазм сосудов головного мозга и отек мозга могут вызывать серьезные эпилептические припадки - эклампсию [Ыр5!е1п е! а1., 2003].
Этиология РЕ все еще неизвестна; однако последние данные предполагают, что заболевание развивается в 2 стадии.
Стадия 1. Во время плацентации был показан дефект врастания плацентарных клеток, трофобластов, в мышечные слои спирально извитых артерий [Втовепв е! а1., 2002, Раде, 1939]. Растущая масса свидетельств предполагает, что окислительный стресс (см. ниже) в дальнейшем ухудшает сосудистую функцию плаценты [КоЬейв, 1999], что в свою очередь [ЗЬеииаи е! а1., 2001] вызывает ослабленную перфузию крови [Нипд е! а1., 2002]. Следствием этого являются сужение кровеносных сосудов и повышенное сопротивление к току крови. Совокупность данных, полученных авторами изобретения, показывает вовлечение генов как в окислительно-восстановительную регуляцию, так и в воспаление [Наиввоп е! а1., 2005].
Стадия 2. Сниженная плацентарная перфузия в сочетании с окислительным стрессом вызывает генерализованное повреждение эндотелиальных клеток плаценты. В поздней части 2 стадии воспаление эндотелия также повреждает сосудистую систему матери, в особенности почек, и представляет собой типичный гистологический показатель при РЕ [КоЬейв е! а1., 1989; бе Отоо! апб Тау1ог, 1993; Отапдет е! а1., 2001; §1теуеп8 е! а1., 2003]. Связь между первой и второй стадиями на сегодняшний день неизвестна.
Как правило, преэклампсия возникает у женщин во время их первой беременности, и наиболее часто затрагивает подростков и женщин в возрасте старше 35 лет. Женщины с основными заболеваниями, которые предрасполагают их к гипертензии, также находятся среди тех, которые подвержены повышенному риску развития данного состояния. Преэклампсия является ведущей причиной материнской смертности и заболеваемости. Она является причиной 12-18% всей материнской смертности, связанной с беременностью (приблизительно 70 материнских смертей в год в Соединенных Штатах и оценивается в 50000 материнских смертей в год во всем мире). Она также связана с высокой перинатальной смертностью и заболеваемостью, в первую очередь, вследствие ятрогенной недоношенности. Неврологические проявления являются общими для преэклампсии и включают от головной боли, зрительных нарушений до более тяжелых проявлений, таких как эпилептические припадки, нарушение мозгового кровообращения и корковая слепота. Единственным радикальным лечением преэклампсии является рождение плода и удаление плаценты - факт, который привел к общепринятой теории, что плацентарная патология является центральной в развитии преэклампсии. Несмотря на интенсивные усилия исследователей, этиология преэклампсии остается большей частью неизвестной.
Как упоминалось выше, существует мнение, что нарушенная плацентация, ведущая к уменьшению плацентарной перфузии, является ранней стадией развития РЕ. Сниженная перфузия, связанная с увеличением сосудистого сопротивления, может быть выявлена с помощью допплеросонографии, и женщины с признаками повышенного сопротивления в маточных артериях в ранние сроки беременности (по!сЫпд, узурация) имеют больший риск развития РЕ, чем женщины без данного показателя. По мере прогрессирования РЕ задействуется сосудистое русло матери, и наблюдается генерализованное воспаление эндотелия. Низкая плацентарная перфузия возникает в результате каскада патологических изменений: сниженная доставка кислорода, окислительный стресс, образование активных форм кислорода, повреждение эндотелия, повышенная проницаемость сосудов и воспаление (см. фиг. 1).
Как правило, симптомы преэклампсии появляются в третьем триместре беременности и обычно выявляются при плановом мониторинге артериального давления и мочи женщины. Однако эти способы мониторинга неэффективны для диагностики синдрома на ранней стадии. Ранняя диагностика может уменьшить риск для пациента или развития плода, и пациенты с высоким риском должны проходить
- 1 022609 специфический мониторинг. В дальнейшем эффективное лечение, которое на сегодня все еще отсутствует, было бы идеальным в сочетании с ранним выявлением.
Некоторые способы диагностики были описаны в предшествующем уровне техники, но пока ни один из них не применяется успешно во врачебной практике в больших масштабах. Например, могут быть упомянуты патенты США 5079171 и 5108898, которые раскрывают, что преэклампсия, гипертензия, индуцированная беременностью, и эклампсия могут быть диагностированы посредством идентификации присутствия маркера эндотелиальной клетки, клеточного фибронектина, в образце крови, плазмы или сыворотки беременной женщины, например, посредством применения сэндвич- или конкурентного иммуноанализа. Клеточный фибронектин происходит из эндотелиальных клеток, которые перфорирутся или повреждаются во время течения болезни. Патент США 5238819 раскрывает диагностику преэклампсии с использованием анализа измерения митогенного фактора в крови. Митогенный фактор представляет собой белковое соединение, составляющее приблизительно 160 кДа и способное стимулировать митоз фибробластов. Его присутствие определяют посредством определения усвоения меченного радиоактивным изотопом тимидина клетками, активированными сывороткой или плазмой больного преэклампсией. Данный маркер появляется после уже случившегося повреждения сосудистого русла матери, следовательно, на поздней стадии прогрессирования заболевания.
Публикация \νϋ 05/093413 (Уа1е ИшуегеНу аиб ВгщНат аиб ^отеи'к Но8рИа1) раскрывает способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных женщин, включающий измерение уровня свободного гемоглобина в образце спинно-мозговой жидкости.
На сегодняшний день лечение преэклампсии неизвестно. Преэклампсия может варьировать по тяжести от легкой до угрожающей жизни. Легкая форма преэклампсии может оставаться легкой на фоне постельного режима и частого мониторинга. Для средних и тяжелых случаев необходима госпитализация, а также показано медикаментозное лечение артериального давления и противосудорожные препараты для предотвращения эпилептических приступов. Если состояние становится угрожающим для жизни матери или ребенка, то единственное лечение заключается в прерывании беременности, что часто приводит к преждевременному рождению ребенка.
Несомненно, что отсутствие лечения преэклампсии, связанное с давней недостаточной возможностью диагностики, пока болезнь не прогрессировала в более тяжелую форму, вызывает необходимость в новых подходах для диагностики и лечения преэклампсии, представляющей собой значительную проблему общественного здоровья.
Описание изобретения
Соответственно, существует необходимость выявления биомаркеров, которые могут достоверно выявить ί) беременных пациенток с риском развития преэклампсии, ίί) беременных пациенток, страдающих ранней стадией преэклампсии, и/или ίίί) беременных пациенток, страдающих преэклампсией (независимо от того, была ли она диагностирована или нет). Более того, необходимо развитие схем лечения беременных женщин любой из групп ί)-ίίί), упомянутых выше.
Настоящее изобретение предоставляет такой биомаркер, а именно фетальный гемоглобин, который, как было показано, поступает в материнскую систему кровообращения беременной женщины, страдающей преэклампсией.
Настоящее изобретение основано на знаниях авторов изобретения и понимании того, что повышенные уровни свободного фетального гемоглобина у беременной женщины тесно связаны с повышенным риском развития преэклампсии. Следовательно, свободный фетальный гемоглобин может быть использован в качестве биомаркера для диагностики преэклампсии, а также является мишенью-кандидатом для лечения преэклампсии.
Данный биомаркер дает возможность выявления повышенного риска развития преэклампсии на ранней стадии, таким образом, оставляя больше надежд на эффективное лечение. Также в соответствии с настоящим изобретением способы диагностики преэклампсии позволяют избежать ненужной госпитализации беременной женщины, не находящейся в группе риска. Кроме того, способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии может помочь планировать рождение плода и уменьшить риск преждевременных родов.
Преэклампсия была кратко описана раньше в данном документе. У женщин уже после 12 недель беременности формируется маточно-плацентарный кровоток. Плацентарный барьер охраняет кровообращение плода, надежно отделенное от материнского (см. фиг. 2). Наименьшие функциональные единицы плаценты, а именно ворсинки, обеспечивают плод питательными веществами и кислородом, переносимыми через барьер. Однако при РЕ уменьшенная плацентарная перфузия приводит к менее оксигенированной крови, текущей к плаценте. Недостаток кислорода и неравномерная перфузия крови вызывают окислительный стресс в плаценте. Окислительный стресс индуцирует апоптоз плацентарных клеток, что, в свою очередь, является причиной воспаления и генерализованного повреждения эндотелиальных клеток плаценты (см. фиг. 3). При повреждении плацентарного барьера клетки плода могут переноситься в кровоток матери. Знание того, что клетки плода переносятся в кровоток матери, стало доступным, ориентировочно, в течение последних десяти лет, однако до настоящего времени никто не рассмотрел свободный гемоглобин (т.е. гемоглобин, обнаруженный вне клеток (например, в плазме) и, соответственно,
- 2 022609 не связанный в клетках). В основном проводили исследование свободной фетальной ДНК.
Подкрепленные показателями, представленными в экспериментальной части настоящего документа, авторы настоящего изобретения обнаружили повышенные уровни свободного фетального гемоглобина (или его субъединиц, α- и/или γ-цепи) у пациенток, страдающих РЕ. У женщин, не страдающих РЕ, уровень свободного фетального гемоглобина должен составлять приблизительно 0,038 мкг/мл [Тигрешеи с1 а1., 1992], тогда как показатели, полученные авторами изобретения, указывают на 20-кратное повышение до уровней приблизительно 1 мкг/мл или более в зависимости от тяжести заболевания.
Даже если имелись данные, что женщины, страдающие РЕ, имеют повышенный уровень общего гемоглобина, до настоящего времени нет сообщений о том, что свободный фетальный гемоглобин является достоверным показателем. Более того, измерение постепенно нарастающего повышения уровня свободного фетального гемоглобина, а не повышение общего гемоглобина, предоставляет намного более надежные и достоверные результаты. Причиной является то, что нормальный уровень общего гемоглобина намного выше, чем уровень фетального гемоглобина. Если уровень фетального гемоглобина в плазме у здоровой беременной женщины составляет 0,05 мкг/мл, а у пациентки с РЕ 1 мкг/мл, то его повышение составляет (1-0,05)/0, 05x100=2000% (или 21-кратное). Для сравнения уровни общего гемоглобина у здоровых или страдающих РЕ пациенток составляют 3 мкг/мл и 4,5 мкг/мл соответственно (см. пример 5.1), которые соответствуют повышению (4,5-3)/3х 100=50% (или в 1,5 раза).
Как показано на фиг. 1, результаты, полученные авторами изобретения, представленные в примерах в настоящем документе, показывают, что фетальный гемоглобин (НЬ-Р) представляет собой связь между стадией 1 и стадией 2. В течение многих лет предполагали, что индикатором РЕ является плацентарный токсин. Известно, что стадия 1 имеет место в плаценте как последствие гипоксии в результате нарушенной перфузии. Плацентарная реакция тогда воздействует на материнскую систему, но не было выявлено никакого специфического фактора. Основываясь на результатах, представленных в экспериментальном разделе, авторы настоящего изобретения полагают, что таким фактором является фетальный НЬ в соответствии с вышеуказанными механизмами. Ранняя диагностика может помочь отследить женщин, подверженных риску развития РЕ - начальное здоровье. Женщины с клиническими признаками РЕ могут наблюдаться как амбулаторные пациенты, исходя из того, что прогрессирование можно контролировать конкретно, следовательно, посредством последующих уровней фетального НЬ и/или соотношения фетальный НЬ/общий НЬ. Необходимость нового лечения является очевидной, а польза от него может быть громадной.
Уровень фетального гемоглобина может быть использован отдельно для оценки, находится ли пациентка в группе риска или уже имеет развившуюся преэклампсию, но он также может быть использован в сочетании с общим уровнем гемоглобина либо уровнем зрелого гемоглобина, присутствующего в конкретном организме в качестве индикатора прогрессирования заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что повышенные уровни свободного гемоглобина, в особенности фетального гемоглобина, у беременной женщины связаны с повышенным риском развития преэклампсии. Следовательно, фетальный гемоглобин может быть использован в качестве биомаркера для диагностики преэклампсии, а также он представляет собой подходящий объект для лечения преэклампсии.
Основываясь на данном наблюдении, настоящее изобретение относится к применению свободного фетального гемоглобина из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего в качестве маркера преэклампсии.
Предпочтительно неэмбриональный биологический образец представляет собой образец крови, образец плазмы, образец мочи или образец ткани плаценты.
Беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина плазмы повышена приблизительно в 20 раз или более, по сравнению с нормальной концентрацией фетального гемоглобина в плазме.
В одном из вариантов осуществления изобретения беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина плазмы составляет приблизительно 0,5 мкг/мл или более.
В другом варианте осуществления изобретения беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина мочи составляет приблизительно 0,06 мкг/мл или более.
Изобретение также относится к способу диагностики преэклампсии, включающему следующие стадии:
ί) получения неэмбрионального биологического образца от беременной особи млекопитающего, и) измерения уровня свободного фетального гемоглобина в указанном биологическом образце и ίίί) сравнения уровня свободного фетального гемоглобина в образце со средним уровнем свободного фетального гемоглобина в образцах контрольной группы, включающей беременные особи млекопитающих, у которых не диагностирована преэклампсия, в качестве контрольного значения, где повышен- 3 022609 ный уровень свободного фетального гемоглобина в образце относительно контрольного значения указывает на наличие преэклампсии или риска развития преэклампсии.
Изобретение далее включает способ диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии: ί) получения неэмбрионального биологического образца от беременной особи млекопитающего, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце и ίίί) сравнения соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах контрольной группы, включающей беременные особи млекопитающих, у которых не диагностирована преэклампсия, в качестве контрольного значения, где повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения указывает на наличие преэклампсии или риска развития преэклампсии.
Изобретение также включает способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий стадии:
ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где повышенный уровень свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии, а уменьшение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.
Изобретение также включает способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий стадии:
ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где повышенное соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии, а уменьшение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.
Кроме того, изобретение предусматривает способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий стадии:
ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего перед лечением или в момент времени Ь, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у той же беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени ΐ2, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где уменьшение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на то, что лечение эффективно для излечения преэклампсии.
Далее изобретение включает способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий стадии:
ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего перед лечением или в момент времени Ь, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у той же беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени ΐ2, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где уменьшение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на то, что лечение эффективно для излечения преэклампсии.
В предпочтительных вариантах осуществления способа по изобретению биологический образец представляет собой образец крови, образец плазмы, образец мочи или образец ткани плаценты.
Уровень свободного фетального гемоглобина измеряют посредством измерения уровня γ-цепи ге- 4 022609 моглобина (НЪ') в образце.
Предпочтительно уровень свободного фетального гемоглобина и/или общего свободного гемоглобина измеряют с использованием иммунологического анализа, где анализом может являться ЕЬ1§А.
В другом варианте осуществления изобретения уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного фетального гемоглобина, при этом может использоваться ПЦР в режиме реального времени.
В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.
Далее изобретение относится к применению набора для обнаружения свободного фетального гемоглобина согласно изобретению, где набор содержит:
ί) твердую поверхность, покрытую одним или несколькими антителами или их иммунореактивными фрагментами, которые специфично связываются со свободным фетальным гемоглобином из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего, ίί) компонент для обнаружения образования комплекса антиген-антитело и ίίί) инструкции по применению.
Набор может дополнительно содержать компоненты для измерения концентрации общего гемоглобина в образце. Компоненты, необходимые для измерения концентрации общего гемоглобина в образце, включают:
ί) одно или несколько антител или их иммунореактивный фрагмент, который специфично связывается с общим гемоглобином из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего, ίί) средство для обнаружения образования комплекса антиген-антитело.
Указанная твердая поверхность ί) может являться одной или несколькими лунками планшета для микротитрования.
Указанное антитело или фрагмент антитела ί) могут являться специфичными для α-цепи гемоглобина, β-цепи гемоглобина, δ-цепи гемоглобина, γ-цепи гемоглобина или его иммуногенного пептида, фрагмента или эпитопа.
Кроме того, указанное антитело ί) может являться моноклональным или поликлональным антителом.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления указанное антитело получают из кроликов.
Антитело может являться антителом, меченым ферментом, таким как, например, антитело, меченное щелочной фосфатазой.
Предпочтительно средство для обнаружения образования комплекса антиген-антитело содержит свиное антитело против кроличьего 1дО-щелочная фосфатаза.
Набор по изобретению может дополнительно содержать серии стандартных разведений гемоглобина в сосудах, готовые для применения.
Предпочтительно набор по изобретению применяется в проведении ЕЬРЗА типа сэндвича. При этом набор содержит:
ί) твердую поверхность, покрытую моноклональным или поликлональным антителом, специфичным к НЪ';'. и ίί) антигемоглобин-АЬР кролика.
Далее изобретение относится к набору для применения в способе в соответствии с изобретением, где набор содержит средства для определения мРНК фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего.
Предпочтительно набор содержит средство для проведения ЕЬРЗА типа сэндвича и твердую поверхность, покрытую моноклональным или поликлональным антителом, специфичным к НЪ'.
В одном из вариантов осуществления набор дополнительно содержит антигемоглобин-АЬР кролика.
Определения.
В данном описании, пока не определено иначе, формы единственного числа означают один или более.
Как используется в данном описании, термин преэклампсия определяется в соответствии с критериями, установленными комитетом по Терминологии американского колледжа Акушерства и гинекологии, т.е. гипертензия плюс протеинурия, выраженный отек или и то, и другое. Например, преэклампсия может быть определена при артериальном давлении >140/90 мм рт.ст. и протеинурии >0,3 г/л.
Существуют различные формы гемоглобина. Зрелый гемоглобин (гемоглобин А) состоит из двух альфа и двух бета полипептидных цепей (НЪа, НЪв), причем каждая содержит непептидную группу гема, которая обратимо связана с одной молекулой кислорода. Гемоглобин А2, другой компонент зрелого гемоглобина, состоит из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей (НЪа, НЪ<5). Фетальный гемоглобин (гемоглобин Р), с другой стороны, является главным компонентом гемоглобина у плода. Данный гемоглобин имеет две альфа и две гамма полипептидные цепи (НЪа, НЪ').
Термин свободный гемоглобин в данном описании относится к свободному гемоглобину в целом и включает общий свободный гемоглобин, свободный гемоглобин А, свободный гемоглобин А2, свобод- 5 022609 ный гемоглобин Р и любую субъединицу свободного гемоглобина (например, цепь НЬа, Ηόβ. НЬ5 или НЬу) или любую их комбинацию. Дополнительно он включает данные категории гемоглобина либо в полипептидной (белок) или нуклеотидной (РНК) форме за исключением, когда он выступает в качестве мишени для лечения. Термин свободный фетальный гемоглобин относится к свободному гемоглобину Р или любой субъединице гемоглобина Р и включает категории гемоглобина Р в полипептидной (белок) или нуклеотидной (РНК) форме за исключением, когда он выступает в качестве мишени для лечения.
В данном описании термин свободный при использовании, в числе прочего, в выражениях свободный гемоглобин, свободный фетальный гемоглобин либо субъединицы свободного гемоглобина (например, цепи НЬа, НЬ(Т НЬ5 или НЬу) относится к гемоглобину, фетальному гемоглобину или субъединицам гемоглобина, свободно циркулирующим в биологической текучей среде, в противоположность к клеточному гемоглобину, который относится к молекулам, остающимся внутри клеток. Термин свободный в этом смысле является, таким образом, наиболее используемым для того, чтобы отличить свободный гемоглобин от гемоглобина, который представлен в интактных эритроцитах.
Термины маркер и биомаркер в данном описании относятся к биомолекуле, предпочтительно полипептиду или белку, которая дифференциально присутствует в образце, взятом у женщины, страдающей преэклампсией, либо женщины с повышенным риском развития преэклампсии, по сравнению с образцом сравнения, взятым у женщины, называемой здоровой женщиной/пациенткой, которая не страдает преэклампсией или не подвержена повышенному риску развития преэклампсии.
Термин биологический образец от беременной особи млекопитающего женского пола или его эквиваленты предназначены обозначать образец от самого млекопитающего; соответственно, образец не получают, например, от плода или амниотической жидкости.
По всему описанию любая и все ссылки конкретно включены в данную патентную заявку посредством ссылки.
Касательно ί) способа диагностики РЕ.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предоставлен способ диагностики или способствования диагностике преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) получение биологического образца от беременной особи млекопитающего женского пола; (Ь) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце и (с) сравнение уровня свободного фетального гемоглобина в образце с контрольным значением или сравнение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с контрольным значением, для определения, страдает или не страдает преэклампсией указанная беременная особь, или подвержена она или нет повышенному риску развития преэклампсии.
Стадия получения биологического образца от указанной беременной особи млекопитающего женского пола включает процесс получения биологического образца, полученного стандартными способами, хорошо известными в данной области.
Биологический образец может представлять собой, например, кровь, плазму крови, мочу, вагинальный секрет, слезную жидкость, ткани, сыворотку, кал, гной, амниотическую жидкость и спинномозговую жидкость. В конкретных вариантах осуществления биологическим образцом является кровь, моча, амниотическая жидкость или плацентарная ткань.
В определенных вариантах осуществления биологическим образцом является кровь, плазма, моча или плацентарная ткань.
Количество собранного биологического образца варьирует в зависимости от индивидуальных потребностей и чувствительностей. Собранное количество может широко варьировать в зависимости от используемого типа тестирования, места сбора и возможности каких-либо неблагоприятных воздействий для матери или плода. В конкретном варианте осуществления количество образца крови находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 75 мл, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 40 мл.
Предполагается, что способы по данному изобретению являются применимыми к любым животным, которые являются плацентарными животными, т.е. животным, у которых внутриутробное питание плода происходит через плаценту. Такие животные включают, среди прочих, людей, других приматов, млекопитающих мясо-молочных животных. Предпочтительным животным для диагностики является человек или хозяйственно ценное животное или крупный рогатый скот.
В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.
В определенном варианте осуществления образцы собирают у беременных женщин. Беременная женщина может представлять собой индивидуума, у которого определили высокий риск преэклампсии, основываясь на ее личном или семейном анамнезе. А еще пациенты, в числе прочих, включают беременных женщин, о которых известно, что они страдают преэклампсией, и для которых тест применяют для того, чтобы определить эффективность терапии или лечения, которое они получают. Также пациенты могут включать здоровых беременных женщин, которым проводят тест, как часть регулярного исследования.
- 6 022609
Если желательно, образец может быть получен для того, чтобы повысить возможность выявления свободного фетального гемоглобина. Обычно получение образца включает разделение на фракции образца и собирание фракций, у которых определено, что они содержат свободный гемоглобин. Способы предварительного фракционирования включают, например, центрифугирование, извлечение РНК/ДНК, гель-хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез и жидкостную хроматографию.
Стадия измерения уровня свободного фетального гемоглобина может быть выполнена, например, посредством иммунологического анализа (например, ЕЬ1§Л, или другого твердофазного иммуноанализа, такого как δΡΚΙΆ или расширенного ЕЬ1§А, так называемого ΙΜΚΆΜΡ), анализа чипов белка, количественной ПЦР-амплификации в режиме реального времени, поверхностно-усиливаемой лазерной десорбции/ионизации (8ΕΕΌΙ), высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, гибридизации ίη δίίπ, иммуногистохимии, хемилюминисценции, нефелометрии/турбометрии, проточной или чистой или поляризованной флуоресценции или электрофореза. Однако для специалиста в данной области должно быть понятно, что данный список методов не является полным, и данные методы не являются единственно подходящими способами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для измерения уровня свободного фетального гемоглобина.
Вещества, подлежащие выявлению и/или измерению в способах изобретения, включают общий гемоглобин, гемоглобин А, гемоглобин А2, гемоглобин Р, любые из цепей гемоглобина (НЬа, Ηόβ. НЬ5 и НЬу) или любые их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления изобретения цепь гаммагемоглобина (НЬу) выявляют и измеряют способом по изобретению. Понятно, что гемоглобин Р и его субъединицы являются наиболее важными, поскольку эти обнаружения основаны на повышенных уровнях свободного фетального гемоглобина и его влиянии на развитие ΡΕ. Как обсуждается в данном документе, гамма-цепь служит признаком фетального гемоглобина, тогда как, например, бета- и дельта-цепи служат признаком зрелого гемоглобина. Основываясь на описании настоящего изобретения, специалист в данной области будет знать, какие цепи гемоглобина должны быть измерены.
В соответствии с настоящим изобретением иммунологический анализ (иммуноанализ) может быть использован для измерения уровня свободного гемоглобина. Иммуноанализ представляет собой анализ, в котором используют антитело для того, чтобы специфично связать антиген (например, гемоглобина).
Иммуноанализ отличается использованием свойств специфического связывания конкретных антител, для того чтобы выделить, пометить и/или определить количество антигена. Таким образом, в условиях обозначенного иммуноанализа, указанные антитела связывают конкретный белок по меньшей мере в два раза чаще, чем фоновый белок, и не связывают, по существу, значительное количество других белков, присутствующих в образце. Используя очищенные маркеры или последовательности их нуклеиновых кислот, могут быть получены антитела, которые специфично связаны с маркером (например, гемоглобином), с использованием любых подходящих способов, известных в данной области [см., например, Сойдап, 1991].
В определенном варианте осуществления первого аспекта уровень свободного фетального гемоглобина измеряют, например, используя иммунологический анализ. Конкретно, иммунологический анализ представляет собой ЕЬТЗА. Однако, как продемонстрировано в примерах в данном документе, также может быть использован вестерн-блоттинг.
В определенном варианте осуществления первого аспекта уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного фетального гемоглобина. Конкретно, РНК свободного фетального гемоглобина измеряют с использованием ПЦР в режиме реального времени. В тех случаях, когда также определяют уровень общего гемоглобина, данный уровень может быть также определен посредством измерения РНК альфа-цепи гемоглобина, например, посредством использования ПЦР в режиме реального времени.
В целом, образец, полученный у субъекта, может быть подвергнут взаимодействию с антителом, которое специфично связывает маркер. Необязательно, антитела могут быть зафиксированы на твердом носителе для того, чтобы облегчить отмывание и последующее выделение комплекса перед взаимодействием антител с образцом. Примеры твердых носителей включают стекло или пластик в виде, например, планшета для микротитрования, палочки, гранулы или микрогранулы.
После инкубации образцы с антителами, смесь отмывают, и образованный комплекс антителамаркер может быть обнаружен. Это может быть выполнено посредством инкубации отмытой смеси с реагентом для выявления. Данный реагент для выявления может представлять собой, например, второе антитело, которое помечают определяемой меткой. Примеры определяемых меток включают магнитные микроносители, флуоресцентные красители, радиоизотопные метки, ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие обычно используемые в ЕЬТЗА) и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластмассовые гранулы.
В качестве альтернативы маркер в образце может быть выявлен с использованием непрямого анализа, при котором, например, второе меченое антитело используют, чтобы выявить маркер, связанный специфическим антителом, и/или в конкурентном или анализе подавления, где, например, моноклональное антитело, которое связывает конкретный эпитоп маркера инкубируют одновременно со смесью.
- 7 022609
Способы измерения количества или наличия комплекса антитело-маркер включают, например, определение флуоресценсции, люминесценции, хемолюминесценции, абсорбции, отражения, проницаемости, показателя преломления (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, способ резонансного зеркала, синхронизированный способ со связанным волноводом или интеферометрия) или радиоактивность. Оптические способы включают микроскопию (как конфокальную, так и неконфокальную), способы с визуализацией и способы без визуализации. Электрохимические способы включают способы вольтаметрии и амперометрии. Радиочастотные способы включают мультиполярную резонансную спектроскопию.
Применяющиеся анализы являются хорошо известными в данной области, включая, например, ферментный иммуноанализ (Е1А), такой как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬРЗА), радиоиммуноанализ, такой как ΚΙΑ и 8ΡΚΙΑ; анализ вестерн-блоттинг или анализ слот-блоттинг.
В конкретном варианте изобретения ЕЬРЗА является предпочтительным способом измерения уровня свободного гемоглобина.
В соответствии с настоящим изобретением стадия измерения уровня свободного фетального гемоглобина также может быть выполнена посредством выявления и измерения свободной РНК, кодирующей полипептиды гемоглобина в образце, например, выявление последовательностей РНК, кодирующих гамма-цепь гемоглобина (НЬу) или ее фрагменты в плазме крови.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления РНК свободного гемоглобина подсчитывают, используя ПЦР в режиме реального времени.
На этапе сравнения уровня свободного гемоглобина в образце с нормальным значением или сравнения соотношения между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с нормальным значением, термин контрольное значение по отношению к настоящему изобретению в соответствии с вариантом осуществления относится к определенному исходному уровню или среднему уровню свободного гемоглобина, т.е. к уровню свободного гемоглобина, который измеряют на стадии (Ь), или соотношению между уровнем субъединицы свободного гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце из контрольной группы. Предпочтительно, чтобы контрольная группа включала беременных особей млекопитающих женского пола без диагноза преэклампсии.
При использовании контрольной группы, определение контрольного значения свободного фетального гемоглобина выполняют с использованием стандартных способов исследования/хорошо известных в данной области. Значение будет, конечно, изменяться в зависимости, например, от применяемого типа исследования, типа свободного гемоглобина, подлежащего измерению, типа биологического образца и группы пациенток. Например, нормальные средние уровни общего свободного гемоглобина крови в группе беременных женщин без диагноза преэклампсии и измеренные ЕЬРЗА находятся обычно в диапазоне от 2,5 до 3,5 мкг/мл, но, конечно, могут изменяться в зависимости от возраста, массы, количества предыдущих беременностей и т.д.
В случае, когда указанное контрольное значение представляет собой уровень свободного фетального гемоглобина или соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, повышенный уровень свободного фетального гемоглобина или повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения показывает, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или подвержена повышенному риску развития преэклампсии.
В определенном варианте осуществления первого аспекта контрольное значение представляет собой уровень свободного фетального гемоглобина или соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах из контрольной группы, где повышенный уровень свободного фетального гемоглобина или повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения показывает, что указанная беременная особь страдает преэклампсией или подвержена повышенному риску развития преэклампсии. Предварительные результаты - использование способа Вестерн-Блоттинга для определения свободного фетального гемоглобина - показывают, что женщины, имеющие уровень в плазме, равный приблизительно 5 мкг/мл или выше, или в качестве альтернативы уровень в моче, равный 1 мкг/мл или выше, подвержены РЕ или развитию РЕ. Ожидается, однако, что данные значения будут лучше идентифицироваться с использованием более чувствительного способа, как, например, ЕЬРЗА. В литературе сообщалось, что нормальный уровень в плазме фетального гемоглобина составляет приблизительно 0,3-76 мг/л, т.е. 0,0003-0,076 мкг/мл (см. Тигрешеп с1 а1., 1992) со средним значением, равным 0,038 мкг/мл. Соответственно, определенные уровни фетального гемоглобина были замечены у женщин при развитии РЕ или уже страдающих ΡΕ. Соответственно, предполагается, что женщины, имеющие уровень фетального гемоглобина в плазме в 510 раз или более выше нормального уровня (т.е. 0,3 мкг/мл или более), подвержены риску развития РЕ. Однако ожидается также, что данное значение будет лучше идентифицироваться с использованием более чувствительного способа, как, например, ЕЬРЗА. В конкретных вариантах осуществления предполагается, что если уровень фетального гемоглобина в плазме составляет приблизительно в 20 раз или более, приблизительно в 50 раз или более, приблизительно в 75 раз или более или приблизительно в 100 раз или
- 8 022609 более, то женщина либо подвержена риску развития, или страдает РЕ, либо на стадии 1 или 2. Другими словами, применяют рассмотренный и предоставленный вышеупомянутый нормальный диапазон, причем женщина подвержена риску или страдает РЕ, если уровень свободного фетального гемоглобина в плазме составляет приблизительно 0,5 мкг/мл или более, такой как, например, приблизительно 0,75 мкг/мл или более, приблизительно 1 мкг/мл или более, приблизительно 1,25 мкг/мл или более, приблизительно 1,5 мкг/мл или более, приблизительно 1,75 мкг/мл или более, приблизительно 2 мкг/мл или более, приблизительно 2,5 мкг/мл или более, приблизительно 3 мкг/мл или более, приблизительно 3,5 мкг/мл или более, приблизительно 4 мкг/мл или более, приблизительно 4,5 мкг/мл или более или приблизительно 5 мкг/мл. Предполагается, что болезнь на настоящей стадии с пониженным уровнем фетального гемоглобина является менее тяжелой. Прогрессирование (или регрессия) болезни могут сопровождаться частым измерением уровня фетального гемоглобина у одной и той же женщины.
Результаты примеров данного документа подкрепляют вышеупомянутые соображения. Таким образом, при использовании способа Вестерн-Блоттинга приблизительно 20% женщин во II группе (т.е. группе уже страдающих РЕ) имели уровень в плазме, равный 5 мкг/мл или более. Что касается уровня в моче приблизительно 20% женщин, страдающих РЕ, имели уровень фетального НЬ в моче, равный 1 мкг/мл или более (см. пример 5.2). Соответственно, что касается уровней в моче, оказывается, уровень немного ниже, чем уровень в плазме, и, соответственно, применяют все уровни, упомянутые выше для плазмы, но пониженные уровни в моче уменьшают до приблизительно 0,06 мкг/мл или более, приблизительно 0,1 мкг/мл или более, приблизительно 0,2 мкг/мл или более, приблизительно 0,4 мкг/мл или более и т.д.
Иным способом, чем рассматривать точный уровень фетального гемоглобина в плазме или моче с целью решить, подвержена ли женщина риску или уже имеется признак РЕ, является способ рассмотреть среднеквадратическое отклонение для теста, проводимого при определении уровня в плазме или моче (или, фактически, уровень в любой другой подходящей жидкости организма). В данном документе предполагается, что подходящим параметром является превышение нормального уровня (например, в плазме или моче и т.д.) 5-кратное среднеквадратическое отклонение или более, такое как, например, 10-кратное среднеквадратическое отклонение или более, 25-кратное среднеквадратическое отклонение или более, 50-кратное среднеквадратическое отклонение или более или 100-кратное среднеквадратическое отклонение или более.
Что касается измерения соотношения (Р) между свободным фетальным НЬ (НЬ Р) и свободным общим гемоглобином (общий НЬ), соотношение у нормальной женщины (т.е. не страдающей РЕ) является приблизительно 0,038 мкг/мл/3 мкг/мл=0,012, когда измеряют два параметра посредством флуорометрического иммуноанализа с разрешением во времени, как описано Титретеи с1 а1., и ЕЬ1§А, как описано ниже (пример 5). Соответственно, предполагается, что соотношение Р, равное 0,12 или более, указывает, что женщина подвержена риску или имеет уже развившуюся РЕ на определенной стадии. В определенных вариантах осуществления о риске РЕ или определенной стадии заболевания свидетельствует, если Р составляет 0,15 или выше, как, например, 0,2 или выше, 0,3 или выше, 0,4 или выше, 0,5 или выше или 0,6 или выше. Теоретически, Р=1, когда весь (100%) свободный общий НЬ является фетальным НЬ. Следовательно, это верхний предел.
Настоящее изобретение предполагает также использование способов, описанных в данном документе в сочетании с другими способами диагностики. Способы диагностики, которые могут быть использованы в сочетании со способами по изобретению включают существующие способы диагностики или способствования диагностике преэклампсии, известные медицинским практикующим специалистам в данной области, в качестве примеров таких способов может быть упомянуто измерение уровня урата или уровня цистатина С в сыворотке. Биологический образец может сперва быть проанализирован посредством способов, описанных в данном документе. Затем биологический образец может быть протестирован посредством других способов для подтверждения наблюдения. Следовательно, точность диагностического способа настоящего изобретения может быть улучшена посредством его сочетания с другими способами диагностики.
Касательно ίί) оценки прогрессирования/регрессии РЕ.
В дополнительных вариантах осуществления свободный фетальный гемоглобин, например субъединицы свободного фетального гемоглобина, могут быть использованы для определения состояния преэклампсии (например, тяжелая преэклампсия) и для прогнозирования, т.е. предварительной оценки исхода заболевания у пациентки, например концентрация свободного гемоглобина коррелирует с тяжестью преэклампсии (например, преэклампсия легкой тяжести и тяжелая преэклампсия). Известно, что неврологические проявления, такие как эпилептические припадки или кома (эклампсия), нарушения мозгового кровообращения, гипертензионная энцефалопатия, головные боли и нарушения зрения (скотома, диплопия, амавроз, гомонимная гемианопсия, являются общими при тяжелой преэклампсии) [Иоид1а8 аий Рейтап, 1994].
Таким образом, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предоставлен способ контроля прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий: (а) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего
- 9 022609 женского пола; (Ь) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у указанной беременной особи млекопитающего женского пола в более поздний момент времени; и (с) сравнение значений, измеренных на стадиях (а) и (Ь), где повышение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или увеличение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии; а понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.
Авторы изобретения проводили выездную часть своего исследования в МиЫшЬШ Ηοδρίΐαΐ в ДарЭс-Саламе, главном городе Танзании (см. пример 5). Данный МиЫшЬШ Ηοφίΐαΐ является специализированным центром третьего уровня, принимающим пациенток преимущественно из муниципальных больниц. МиЫшЬШ ипАсгЩу οί Неа1Ш апб АШеб ЗЫспссх (МПНА8) является единственным публичным университетом в стране, предлагающим высшее образование для обучения медико-санитарных дисциплинам. Большие количества беременностей, осложненных РЕ и эклампсией, в Танзании делают его подходящим для исследования, проведенного авторами изобретения. В МиЫшЬШ Ηοφίΐαΐ РЕ была обнаружена у 16% женщин, посещающих дородовые женские консультации. Частота встречаемости эклампсии на базе больницы составляла 200/10000 посещений, основываясь на исследованиях в период 1999-2000. Это можно сравнить с частотой встречаемости 5/10000 беременностей в Европе. Десять пациенток с тяжелой РЕ или эклампсией и десять связанных контрольных моделей были включены в исследование (см. следующую таблицу).
Таблица 1
Клинические характеристики родов пациенток, которые участвовали в данном исследовании
РЕ Контроль
Количество3 10 10
Возраст (годы) 28,5 (19-40) 21,5 (18-30)
Количество рожденных детей 1,6+2,3 0,6±1,4
Внутриутробный возраст плода (дни) 256 (217-266) 280 (231-287)
Систолическое давление (мм рт.ст. ) 191+34 115+9
Диастолическое давление (мм рт.ст.) 124+18 74±7
Протеинурия (г/л)**,ь 2,6 + 0,8 0,3+1,0
Масса при рождении (г) 2005+717 30401398
Масса плаценты (г) 335+120 506+68
Сечения (п) 6 4
ιυρϋ (η) 5 0
Эклампсия (η) 4 0
РЕ=преэклампсия.
Был использован односторонний дисперсионный анализ со вторичным тестом Бонферрони для статистической оценки различий между группами. Считалось, что значение р<0,05 является статистически значимым.
***Тест показал существенное различие между РЕ и контролем (р<0,001). а Один случай материнской смерти в течение 24 ч после родов в группе РЕ.
Ь Значения протеинурии являются неточными по причине ограничения способа. Наибольшее измеряемое значение было 3 г/л.
Пациентки были выбраны в течение шестинедельного периода, сентябрь-октябрь 2007 г. в отделении Гинекологии и Акушерства МиЫшЬШ Ηοφίΐαΐ. Группа преэклампсии была выбрана из блока интенсивной терапии эклампсии, где госпитализировали в среднем по две пациентки с РЕ в день. Признаками включения являлись либо тяжелая РЕ (диастолическое артериальное давление >110 мм рт.ст. при двух измерениях) или эклампсия. Все пациентки с зафиксированной хронической гипертензией перед беременностью были исключены из изучения. Пациентки были опрошены с использованием опросного лис- 10 022609 та, переведенного на Суахили. Медицинские карты для каждой участвующей пациентки были изучены для получения дополнительной информации. Женщины, включенные в исследование, имели стойкое повышение артериального давления в течение первых 24 ч госпитализации и протеинурию >1 г/л. Были зафиксированы возраст, количество рожденных детей, количество посещений предродовой консультации, способ родов, поступление в период родов, результаты для матери и плода.
Образцы мочи, собранные перед родами, показали статистически достоверное различие уровней общего гемоглобина между РЕ и контрольными группами (фиг. 21). Статистическая обработка данных была проведена посредством непараметрического И-теста по методу Манна и Уитни, который показал значение р, равное 0,0093. Среднее значение для группы преэклампсии было 31,0 мкг/мл по сравнению с 2,5 мкг/мл у контрольной группы. Высокое значение у контрольной группы наиболее вероятно является таким по причине высокого влияния малярии. Также были проанализированы образцы мочи, собранные после родов.
В конкретных вариантах осуществления предполагается, что повышение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двойному среднеквадратическому отклонению или более, такому как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическому отклонению, указывает на повышенный риск развития РЕ и/или прогрессирование заболевания. В аналогичном предмете понижение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двойному среднеквадратическому отклонению или более, такому как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, указывает на пониженный риск развития РЕ и/или регрессию заболевания. Еще один критерий может представлять собой соотношение (К1) между НЬ Р в момент времени ί2 и НЬ Р в момент времени ΐ1, где ΐ1 является временем взятия первого образца, а ΐ2 является временем взятия второго образца. Повышение К1 является указанием на прогрессирование заболевания, а понижение К1 является указанием на регрессию заболевания. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной, благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение К1, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение Κι, равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.
В тех случаях, когда используют соотношение Κ (т.е. соотношение между НЬ Р и общим НЬ), критерий обычно представляет собой соотношение между Κ (Κ2), полученным во второй момент времени, и Κ, полученным в первый момент времени (Κ^. Повышение Κ2/Κι представляет собой показатель прогрессирования заболевания, а понижение Κ2/Κ1 представляет собой показатель регрессии заболевания. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение Κ2/Κ1, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение К2/Кь равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.
Подробности, упомянутые в первом аспекте, также применяют к данному и следующим аспектам.
Касательно ίίί) способа оценки эффективности конкретного лечения РЕ.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предоставлен способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего женского пола перед лечением; (Ь) измерение уровня свободного фетального гемоглобина или измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце от той же беременной особи млекопитающего женского пола после лечения; и (с) сравнение уровня или уровней, определенных в (а), с уровнем или уровнями, определенными в (Ь), где понижение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце по отношению к уровню свободного фетального гемоглобина в первом образце или понижение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце по отношению к соотношению между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает, что лечение является эффективным для излечения преэклампсии.
В конкретных вариантах осуществления предполагается, что эффективность лечения может быть оценена посредством определения какого-либо понижения уровня свободного фетального гемоглобина. Если понижение уровня соответствует двум среднеквадратическим отклонениям или более, таким как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, это является показателем того, что лечение было эффективным для понижения прогрессирования РЕ и/или лечения заболевания и/или облегчения симптомов, связанных с заболеванием. В аналогичном предмете повышение уровня свободного фетального гемоглобина, соответствующего двум среднеквадратическим отклонениям или более, таким как, например, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 7 или более или 10 или более среднеквадратическим отклонениям, это является показателем того, что лечение было неэффективным. Еще один критерий может представлять собой соотношение (Κχ) между НЬ
- 11 022609
Р в момент времени ΐ2 и НЬ Р в момент времени ί1, где ί1 является временем взятия первого образца, а ΐ2 является временем взятия второго образца. Повышение Κι является указанием на прогрессирование заболевания, т.е. лечение является неудовлетворительным, тогда как повышение Κ1 является показателем регрессии заболевания и эффективного лечения. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной, благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение Кь равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение Кь равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.
В тех случаях, когда используют соотношение Κ (т.е. соотношение между НЬ Р и общим НЬ), критерий обычно представляет собой соотношение между Κ (Κ2), полученным во второй момент времени, и Κ, полученным в первый момент времени (Κι). Повышение Κ2/Κι представляет собой показатель прогрессирования заболевания, т.е. лечение, похоже, не удовлетворительно, а понижение Κ2/Κ1 представляет собой показатель регрессии заболевания, т.е. похоже, лечение имеет желательный эффект. Так как индивидуальная изменчивость, как ожидается, будет минимальной благодаря тому факту, что тестированию подвергают ту же самую женщину, полагают, что даже небольшое повышение или понижение является применимым показателем. Ожидается, что значение Κ2/Κ1, равное 1,1 или более, будет представлять собой показатель прогрессирования заболевания, тогда как значение К2/Кь равное 0,9 или менее, будет представлять собой показатель регрессии заболевания.
Касательно ίν) набора для диагностики.
В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения предоставлен набор для анализа для диагностики или способствования диагностике эклампсии в соответствии с настоящим изобретением, содержащий средства измерения уровня свободного фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола и инструкции по применению указанного средства определения.
Настоящее изобретение предоставляет наборы для диагностики или способствования диагностике эклампсии. Наборы используют для определения или скрининга наличия свободного гемоглобина, который дифференцировано присутствует в образцах пациенток с преэклампсией.
В одном варианте осуществления набор содержит средства для определения в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола уровней свободного гемоглобина (например, альфа-цепи гемоглобина (НЬа), бета-цепи гемоглобина (НЬв), дельта-цепи гемоглобина (НЬ5), гаммацепи гемоглобина (ΜΌγ) и общего свободного гемоглобина) или отдельно, или в сочетании с другими средствами определения, и инструкции по применению указанных средств определения. В качестве альтернативы или дополнительно набор в соответствии с изобретением содержит средства определения мРНК фетального НЬ.
В предпочтительном варианте осуществления набор содержит средства определения уровня свободного фетального гемоглобина, например средство измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (ΜΌγ) в образце. В еще одном варианте осуществления он дополнительно содержит средства определения уровня общего свободного гемоглобина.
В одном варианте осуществления средство определения содержит антитела, специфичные для гемоглобина, предпочтительно для фетального гемоглобина (например, антитела против НЬ/ человека).
В дополнительном варианте осуществления указанные инструкции содержат подходящие рабочие параметры в виде наклейки или отдельного вкладыша. Например, инструкции могут информировать потребителя, как собирать образец и как отмывать пробу. Особенно осторожно должны отбираться образцы крови, чтобы минимизировать гемолиз для того, чтобы избежать ложных значений общего НЬ.
Применяемый набор в способе изобретения может дополнительно содержать показатели нормы анализируемых веществ, реагенты и т.д.
В определенном варианте осуществления четвертого аспекта, уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (НЬ/).
В определенном варианте осуществления четвертого аспекта набор для анализа дополнительно включает средство определения уровня общего свободного гемоглобина, например, для того, чтобы определить соотношения общего НЬ и фетального НЬ и/или мРНК фетального НЬ.
Более конкретно, набор для диагностики изобретения может, например, содержать все компоненты (кроме воды), которые необходимы, чтобы выполнить ЕЬ1§А, разработанный для того, чтобы измерить концентрацию фетального гемоглобина в образце или два ЕЬ1§А, разработанные для того, чтобы измерить как концентрацию фетального гемоглобина, так и общего гемоглобина в образце. Предпочтительным способом измерения концентраций фетального гемоглобина является сравнительный вариант ЕЬ1§А, описанный ниже в данном документе.
Гемоглобин-Р, разбавленный до 1-5 мкг/мл в водном растворе, наносят на 96-луночные планшеты для микротитрования посредством выдерживания в течение ночи. Предварительные планшеты будут предоставлены готовыми для применения в наборе.
- 12 022609
В больнице лунки планшета для микротитрования должны быть выдержаны со смесью, содержащей 50 мкл кроличьих анти-гемоглобин-Р, разбавленных в 1000-10000 раз водным раствором А (например, 0,9% №С1. содержащий 0,1% детергента, например Т\\ееп 20, и 0,1% альбумина плазмы быка) плюс либо 50 мкл серий стандартных образцов оксигемоглобина-Р, разбавленных водным раствором А до концентраций 1-10000 нг/мл, или 50 мкл образцов от пациенток (разбавленных 100-10000-кратно водным раствором А). Данная смесь должна быть оставлена в лунках планшета для микротитрования в течение периода времени от 30 мин до 3 ч при комнатной температуре. Затем планшеты должны быть трижды отмыты водным раствором А, и каждая лунка выдерживается в течение 30 мин со 100 мкл свиной противокроличьей 1дО-щелочной фосфатазой (ЛЬР), разбавленной 1000-10000-кратно водным раствором А. Затем планшеты должны быть трижды отмыты водным раствором А и в заключение выдержаны в веществе, с которым АЬР может специфически реагировать, превращая его в окрашенный продукт. Раствор вещества может представлять собой, например, п-нитрофенилфосфат 1 мкг/мл в 1М диэтаноламина плюс 0,5 мМ МдС12, рН 9,8. Тогда концентрация продукта (интенсивность окрашивания) в лунке является пропорциональной количеству антигемоглобина-Р в той лунке, а количество антител в свою очередь является обратно пропорциональным количеству гемоглобина-Р пациента или контрольного образца. Интенсивность окрашивания может быть точно определена посредством микротитровальных планшет-ридеров светопоглощающего типа или даже оценена на глаз.
Специалисту в данной области техники очевидно, что именно фермент пероксидаза хрена (НРР), а не АЬР, присоединяется к вторичным антителам. В данном аспекте, однако, НРР не может быть использован, так как гемоглобин, который будет присутствовать в тех же лунках планшета для микротитрования, также представляет собой фермент пероксидазы и будет давать ошибочно высокие значения окрашенного продукта.
Насколько авторам изобретения известно, конкурентный ЕЫ§А, использующий поликлональную антисыворотку кролика в сочетании с АЬР, не был ранее использован для измерения фетального гемоглобина-Р.
Руководство пользователя, содержащее инструкции, касающиеся методики, точных значений, разбавлений, концентраций, периодов выдерживания и температур каждой стадии и реагента, будут предоставлены с набором. Также предоставляются предварительно покрытые планшеты для микротитрования, растворы оксигемоглобина-Р или общего гемоглобина для покрытия и серии разведенных стандартов, раствор антигемоглобина-Р кролика или антиобщего гемоглобина кролика, раствор антикроличьего 1дОАЬР свиньи, раствор АЬР-вещества и водный раствор А.
Оксигемоглобин-Р или общий гемоглобин будут получены в лабораториях авторов изобретения, как описано далее. Красные кровяные клетки из 50 мл крови хорды человека (получение НЬ-Р) или крови взрослого человека (получение общего НЬ) выделяют центрифугированием (1200/д, 10 мин) и отмывают 4 раза с 10 объемами фосфатного буферного солевого раствора (РВ§, 10 мМ фосфата, рН 7,4; 120 мМ ЫаС1 и 3 мМ КС1). Затем клетки крови растворяют посредством ресуспендирования в гипотоническом буфере (20 объемов Н2О:1 объем РВ§), имеющемся в запасе. Мембраны отделяют от цитозоли посредством центрифугирования (14000/д, 20 мин) и супернатант диализируют 3 раза против 15 мМ Трис-НС1, рН 8,0 при 4°С. 200 мл ДЕАЕ-сефарозы (ОЕ НеаНЪсате) заполняют в колонку и диализированный супернатант переносят в гель и разделяют посредством градиента, состоящего из 15 мМ Трис-НС1, рН 8,0 плюс 0,2М ЫаС1. Фракции собирают и измеряют поглощение при 280, 577 и 630 нм для идентификации и определения концентрации оксигемоглобина-Р или общего оксигемоглобина ^ииегЬоигп, 1990]. Раствор для покрытия и стандартные серии получают посредством разбавления в водном растворе А.
Антиобщий гемоглобин кролика куплен у ЭаРо, Оептагк, а антигемоглобин-Р кролика получают посредством иммунизации кроликов очищенной γ-цепью гемоглобина (НЬ-γ) и извлечения крови у кроликов в соответствии со стандартными протоколами.
Иммунизацию и извлечение крови проделывают коммерческим способом (аутсорсинг). НЬ-γ очищают от НЬ-Р в лаборатории авторов изобретения посредством диссоциирования и отделения α- и γцепей, главным образом, следуя протоколам Кар1а е! а1. [1969] и ЫоЬ1е [1971]. Калийфосфат (0,1 мл 1М КН2РО4) и хлорид натрия (0,2 мл 2М ЫаС1) добавляют к 10 мл 3% (м/о) раствора гемоглобина-Р. 50 мг пбензоата ртути растворяют в 0,2 мл 1М ЫаОН и к нему добавляют 1 мл воды. Данные два раствора смешивают, осторожно титруют с 1М уксусной кислоты до рН 4,5 и оставляют на холоде на ночь, слегка перемещая. Следующим утром рН доводят до 7 с 1М ЫаОН и центрифугируют (5000/д, 10 мин, 10°С). Осадок в пробирке удаляют, а супернатант диализируют против 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5. Диализированный образец затем переносят в колонку с 10 мл ДЕАЕ-сефарозы (ОЕ НеаНЪсате), который предварительно уравновесили с 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5. После внесения образца колонку ополаскивают 50 мл 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, а затем соляно-буферным градиентом, состоящим из 100 мл 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5 и 100 мл 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5 плюс 0,2М ЫаС1. Внесение образца, отмывание и градиентное элюирование проделывают при скорости потока 40 мл/ч и собирая 3 мл фракций. Концентрации α- и γ-цепей каждой элюированной фракции затем оценивают посредством поглощения света при 415 нм, δΌδ-РАОЕ, нативного РАОЕ и аминоконцевого секвенирования белков. Фракции, содержащие чистую γ-цепь, объе- 13 022609 диняют, добавляют 2-меркаптоэтанол до 50 мМ для диссациации п-бензотата ртути из полуцистинов. пБензоат ртути затем удаляют из белка посредством обессоливания на колонке 8ерЪабех О-25 (ΡΌ-10, ОЕ НеаЪЪсаге), элюируя 0,1М фосфата натрия рН 7,5 плюс 50 мМ 2-меркаптоэтанола. В заключение, элюированные белковые фракции диализируют против 0,1М фосфата натрия, рН 7,5.
Антикроличий 1дО-ЛЬР свиньи покупают в §1дта, тогда как раствор веществ и водный раствор А получают в лаборатории авторов изобретения из имеющихся в продаже химических веществ.
В качестве альтернативы ЕЬ1§А фетального гемоглобина может представлять собой ЕЬ1§А типа сэндвича с использованием для покрытия моноклональных или поликлональных антител, специфичных к НЬ-γ, клинического образца с соответствующим разбавлением или серий стандартного фетального гемоглобина на инкубационной стадии 1 и антигемоглобин-ЛЬР кролика на второй инкубационной стадии.
В качестве альтернативы белковый чип, покрытый моноклональными антителами, специфично реагирующими с НЬ-γ, могут быть применены в наборе для диагностики в качестве средства измерения концентрации фетального гемоглобина в клинических образцах.
Касательно ν) веществ и композиций для использования для предотвращения и/или лечения РЕ.
В соответствии с открытиями, публикуемыми в данном документе, что свободный фетальный гемоглобин является индикатором РЕ и что понижение уровня НЬ Р (или уровня НЬ в целом), вероятно, снижает какое-либо прогрессирование болезни, предполагается, что любые вещества, которые имеют ί) способность ингибировать образование свободного НЬ (свободного НЬ Р или любого другого НЬ), ίί) способность связывать свободный НЬ (свободный НЬ Р или любой другой НЬ) или ίίί) способный понижать концентрацию свободного НЬ в кровотоке (свободного НЬ Р или любого другого НЬ), будут представлять собой потенциальное вещество для эффективного лечения и/или предотвращения РЕ. Соответственно, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлено применение по меньшей мере одного составного элемента, выбранного из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин; средств, связывающих/разрушающих гем; средств, связывающих железо; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина, разрушение гема и/или образование комплекса с железом; и/или средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз для лечения РЕ. Более того, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлено применение такого вещества для производства фармацевтического препарата для лечения или профилактики преэклампсии.
Термины лечение или профилактика в своих разнообразных грамматических формах в отношении настоящего изобретения относятся к предотвращению, исцелению, вызыванию обратного развития, смягчению, облегчению, улучшению, ингибированию, минимизированию, подавлению или остановке (1) отрицательного воздействия преэклампсии, (2) прогрессирования заболевания или (3) причинного фактора заболевания.
Гемоглобин является ответственным за насыщение кислородом, но свободный гемоглобин в кровотоке является токсичным для тканей за счет изменения васкулярного окислительно-восстановительного баланса в процессе самоокисления гема из его двухвалентного в трехвалентное состояние |Мойегйп1 е! а1., 1995] и возможно через индукцию глобин-сосредоточенных свободных радикалов [^1в!ипепко е! а1., 1997].
Авторы изобретения предполагают, что повышение уровней свободного гемоглобина в крови женщин с преэклампсией служит не только маркером болезни, но является также ответственным или частично ответственным за протекание болезни, наблюдаемое обычно у таких пациенток. Следовательно, свободный гемоглобин является также возможной целью при лечении преэклампсии. Даже если свободный фетальный гемоглобин рассматривается как маркер для РЕ, предполагается, что снижение свободного гемоглобина, в целом (т.е. фетального гемоглобина, а также более неспецифичного гемоглобина, такого как, например, зрелый гемоглобина человека), будет минимизировать прогрессирование или лечение РЕ.
В определенном варианте осуществления данного аспекта средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляет собой а 1-микроглобуолин. В дальнейшем данное вещество будет называться альфа 1-микроглобуолин или α^-микроглобуолин и обозначаться α.μη. Другими названиями для данного вещества, которые использовались в научной литературе, являются белок НС (ответственный за гетерогенность; комплексообразующий у человека), АМВР-белок и альфа 1микрогликопротеин, но данные названия являются синонимичными к α.μη.
В определенном варианте осуществления данного аспекта средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее гем, представляют собой антитела, специфичные к гемоглобину и/или гему.
Соответственно, настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или профилактики преэклампсии, причем такой способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества одного или нескольких таких веществ, упомянутых выше, включая по меньшей мере один составной элемент, выбранный из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих/разрушающих гем, и/или средств, связывающих железо; средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина, и/или разрушение гема, и/или образование
- 14 022609 комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз. Обычно вещество может быть введено в виде фармацевтической композиции, содержащей активное вещество в сочетании с одним или более фармацевтически доступными наполнителями.
Более того, настоящее изобретение предоставляет применение по меньшей мере одного составного элемента, выбранного из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих/разрушающих гем, средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина, и/или разрушение гема, и/или образование комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз, для производства фармацевтического препарата для лечения или профилактики преэклампсии; и способ лечения или профилактики преэклампсии, причем такой способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего по меньшей мере один составной элемент, выбранный из группы, состоящей из средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих/разрушающих гем, и/или веществ, образующих комплекс с железом, средств, которые стимулируют разрушение гемоглобина, и/или разрушение гема, и/или образование комплекса с железом; и средств, которые ингибируют плацентарный гематопоэз. В данных аспектах целью является понижение количества свободного гемоглобина и продукта его разрушения гема, например, в материнской крови, для предотвращения повреждения тканей и дополнительного прогрессирования болезни.
Средства, связывающие гемоглобин, и/или средства, связывающие/разрушающие гем, представляют собой соединения, которые демонстрируют свойства связывания/разрушения гемоглобина и/или гема. Вещества, образующие комплекс с железом, представляют собой соединения, которые связывают свободное железо и предотвращают его участие в восстановительно-окислительных реакциях.
В одном варианте осуществления средства, связывающие гемоглобин, и/или средство, связывающее/разрушающее гем, представляют собой /т. Этот небольшой белок плазмы или ткани представляет собой средство, связывающее гем [Л11йоги с1 а1., 2002; Ьаг88оп с1 а1., 2004] и акцептор радикалов [Акег81гот е1 а1. 2007], а форма, разрушающая гем, 1-а,т. индуцируется протеолитическим удалением Стерминального тетрапептида, ЫРК, когда (/т смешивают со свободным гемоглобином [АПйоги е1 а1., 2002]. Он также может связываться с гемоглобином в плацентах (см. ниже). Свободный гемоглобин и активные формы кислорода являются причиной усиленного продуцирования (/т в клетках печени и клетках крови [О188оп е1 а1. 2007]. Вследствие этого, (/т является потенциальным гем- и гемоглобиновым антагонистом, который может защитить от гем- и гемоглобин-индуцированного повреждения соединений клеток и тканей. Примеры 5.4-5.7 предоставляют этому дополнительное доказательство. Таким образом, пример 5.4 показывает, что пациентки, страдающие преэклампсией, отвечают на болезнь повышением уровней а^ш, пример 5.5 показывает, что (/т ингибирует и восстанавливает геминдуцированное окислительное повреждение клеток и тканей, пример 5.6 описывает модель плаценты ίη уйго, где тестирования терапевтических веществ могут проводиться с пошаговым приближением к тестированиям ίη У1уо, пример 5.7 показывает, что гемоглобин связан (мт в ткани плаценты.
Другие вещества, которые, как предполагают, являются потенциально активными веществами для лечения или предотвращения РЕ, представляют собой нижеследующие.
Средства, связывающие гемоглобин
Антитела.
Могут быть получены моноклональные антитела с сильным связыванием гемоглобина и блокированием окислительно-восстановительной ферментной активности гемоглобина. Антитела могут быть получены посредством иммунизации ίη νί\Ό или ίη уйго или выбраны из предварительно существующих библиотек. Антитела могут быть выбраны для специфичности против альфа-, бета- или гаммаглобиновых цепей или против общих участков цепей данных глобинов. Антитела могут быть модифицированы для того, чтобы сделать их пригодными для лечения людей, т.е. обеспечить каркасом человеческого иммуноглобулина. Могут быть использованы любые части антител: Ρν-, РаЪ-фрагменты или целый иммуноглобулин.
Г аптоглобулин.
Гаптоглобулин представляет собой гликопротеин, обнаруженный в плазме крови. Существуют три формы гаптоглобулина, Нр1-1, Нр2-1 и Нр2-2. Все формы связываются с гемоглобином и образуют НрНЪ комплекс. Нр-НЪ комплекс имеет более слабую окислительно-восстановительную ферментную активность, чем свободный гемоглобин, и вследствие этого, является причиной меньшего окислительного повреждения. Связывание с НЪ предотвращает, например, потерю железа гемгруппы.
СЭ163.
СЭ163 представляет собой фагоцитарный рецептор, обнаруженный на макрофагах, моноцитах и ретикулоэндотелиальной системе, выстилающей кровеносные сосуды. Рецептор распознает Нр-НЪ комплекс и опосредует эндоцитоз и его доставку к лизосомам, разрушение посредством НО-1 (см. ниже) и секвестрацию свободного железа клеточным ферритином. Вследствие этого, СЭ163 участвует в элиминировании гемоглобин-индуцированного окислительного стресса.
- 15 022609
Средства, связывающие/разрушающие гем
Гемопексин.
Гемопексин представляет собой гликопротеин (60 кДа), обнаруженный в плазме крови человека, который элиминирует свободный гем из плазмы крови посредством сильного его связывания (Кб приблизительно 1 пмоль/л) и транспортировки гема в печень для разрушения в ретикулоэндотелиальной системе.
Гем-оксигеназа.
Гем-оксигеназа представляет собой клеточный гем-связывающий и разрушающий ферментный комплекс, который преобразует гем в биливердин, монооксид углерода и свободное железо. Последний секвестируется клеточным ферритином, а биливердин восстанавливается редуктазой биливердина в билирубин, который, в конечном счете, выделяется в мочу. Были описаны три вида генов оксигеназы гема, с очень различными структурами, НО-1, НО-2 и НО-3. НО-1 является наиболее важным. Данный ген активируется, практически, во всех клетках тела гемоглобином, свободным гемом, гипоксией, свободными радикалами, ΚΌδ (активными формами кислорода) и многими другими возбуждающими сигналами. НО1 является сильным антиоксидантом по причине того, что он элиминирует оксиданты гема и железа, но также по причине того, что он продуцирует билирубин, который имеет антиокислительное действие против некоторых аксидантов.
Альбумин.
Альбумин представляет собой 66 кДа белок в плазме крови человека, который может связывать гем. Нет свидетельства о клеточном захвате и разрушении комплекса альбумин-гем, и действие альбумина возможно состоит в том, чтобы выступать в качестве хранилища гема, предотвращая, таким образом, гем от вхождения в мембраны эндотелиальных клеток, базальные мембраны сосудов и т.д.
Средства, связывающие железо
Трансферрин.
Трансферрин представляет собой наиболее важный переносчик железа в крови. Комплекс трансферрин-железо опознается и связывается клеточными рецепторами, которые интернализируют и диссоциируют комплекс.
Ферритин.
Данный мультимерный белок, состоящий из 24 субъединиц двух типов, представляет собой главное межклеточное хранилище свободного железа. Он имеет высокую железосохраняющую способность, 4500 атомов железа/молекулу ферритина. Связанное ферритином железо наиболее сильно предохраняется от окислительных и восстановительных реакций, а вследствие этого, от вызванного окислением повреждения.
В дополнительном варианте осуществления средство, связывающее гемоглобин, представляет собой антитело, специфичное для гемоглобина и/или гема.
В конкретных вариантах осуществления фармацевтический препарат содержит комбинацию средств, связывающих гемоглобин, и/или средств, связывающих гем, и/или веществ, секвестирующих железо.
Вещества, которые стимулируют разрушение гемоглобина и/или разрушение гема, включают, но не ограничиваются подобным белку гаптоглобином, гемопексином и оксигеназой гема.
Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут быть введены плацентарному животному, такому как человек, другому примату или млекопитающему мясо-молочному животному. Предпочтительным животным для введения является человек или хозяйственно ценное животное или крупный рогатый скот.
Введение может быть выполнено различными путями, в зависимости от того, какое животное лечить, состояния животного, нуждающегося в указанном лечении и конкретном показателе для лечения. Способ введения может быть пероральным, ректальным, парентеральным или через назогастральный зонд. Примерами парентеральных способов введения являются внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное или подкожное впрыскивание.
Состав фармацевтического препарата должен быть выбран в зависимости не только от фармацевтических свойств активных ингредиентов, но также от их физико-химических свойств и вида способа введения. Различные способы составления фармацевтических препаратов хорошо известны специалистам в данной области.
Для парентеральных композиций предпочтительны жидкие композиции или твердые композиции, разработанные для восстановления их, например, жидкой средой перед применением. Подходящие вспомогательные средства включают растворители (например, воду, водную среду, спирты, растительные масла, липиды, органические растворители подобные пропиленгликолю и т.п.), регуляторы осмотического давления (например, хлорид натрия, маннитол и т.п.), солюбилизаторы, вещества, регулирующие рН, консерванты (если требуется), усилители абсорбции и т.д.
Для пероральных композиций композиции могут быть в твердой, полутвердой или жидкой формах. Подходящие композиции включают твердые лекарственные формы (например, таблетки, включающие все виды таблеток, саше и капсулы), порошки, гранулы, пеллеты, шарики, сиропы, микстуры, суспензии,
- 16 022609 эмульсии и т.п.
Подходящие вспомогательные средства включают, например, наполнители, связующие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и т.д. (для твердых лекарственных форм или композиций в твердой форме), растворители, такие как, например, вода, органические растворители, растительные масла и т.д., для жидкой или полу твердой форм. Более того, могут быть добавлены добавки, такие как вещества, регулирующие рН, вещества, исправляющие вкус лекарственных средств, отдушки, стабилизирующие вещества и т.д.
Более того, могут быть включены специфичные переносчики для выделения активного вещества в специфичной части тела. Например, комплекс антитело-а1т, где антитело выделяется в плаценте (хоминг) посредством его специфичности для плацент-эпитопа; стволовая клетка или рекомбинантная клетка со свойствами плацент-хоминга, например интегрин-рецепторы, специфичные для плаценты и с искусственно созданной или естественной способностью секретировать большое количество а1т. Лечение было бы более эффективным, если бы лекарство было сконцентрировано в плаценте.
Термин эффективное количество в связи с настоящим изобретением относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. Он означает предварительно заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемыми вспомогательными веществами и разбавителями; т.е. носителем или средствами введения. Дополнительно он означает количество, достаточное для снижения и наиболее предпочтительно предотвращения клинически значимого дефицита в активности и ответе хозяина. В качестве альтернативы терапевтически эффективное количество, достаточное для того, чтобы вызвать клинически значимое улучшение состояния хозяина. Специалистам в данной области понятно, что количество соединения может изменяться в зависимости от его специфической активности. Подходящий размер дозы может содержать предварительно определенное количество активной композиции, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемыми разбавителями; т.е. носителем или вспомогательным веществом. Дополнительно доза, предполагаемая к введению, будет изменяться в зависимости от используемого действующего начала или начал лекарственного вещества, возраста, массы и т.д. пациента, подлежащего лечению, но, в целом, будет в пределах диапазона от 0,001 до 1000 мг/кг массы тела/день. Более того, доза зависит от способа введения.
Касательно νί) НБА-ОРА1 в качестве биомаркера.
Дополнительный аспект изобретения относится к обнаружению, что фетальные клетки могут инициировать материнский иммунный ответ, поскольку они являются различными. Роль семейства генов НЬА заключается в том, чтобы презентировать чужеродные антигены материнской иммунной системе. Женщины, которые экпрессируют НЬА-ОРА1 гены, могут видеть фетальные клетки на ранней стадии, что могло бы помочь их защите от дальнейшего повреждения (на стадиях, о которых сообщается в данном документе, авторы наблюдали, что женщины с обнаруженной, но не развивающейся, РЕ экспрессировали НЬА-ОРА1).
Соответственно, НЬА-ОРА1 могут быть использованы в качестве непрямого индикатора для фетального гемоглобина и/или для РЕ. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предоставлен способ прогнозирования преэклампсии, включающий следующие стадии: (а) получение биологического образца у беременной особи млекопитающего женского пола; (Ь) измерение уровня человеческого лейкоцитарного антигена ЭРА1 (НЬА-ОРА1) в указанном биологическом образце и (с) сравнение уровня НЬА-ОРА1 в образце с контрольным значением. Предполагают, что, если присутствуют вышеуказанные композиции НЬА, у особи, возможно, имеется меньший риск развития РЕ (со свободным фетальным НВ или без него), тогда как, если особь не имеет данного защитного НЬА, то она подвержена большему риску, особенно, если также повышен уровень свободного фетального НЬ.
В определенном варианте осуществления данного аспекта стадии (а)-(с) осуществляют для того, чтобы определить, подвержена или не подвержена указанная беременная особь женского пола повышенному риску развития преэклампсии или подвержена или не подвержена повышенному риску развития тяжелой формы преэклампсии.
В определенном варианте осуществления данного аспекта экспрессия или сильная экспрессия НЬАОРА1 указывает на лучшее прогнозирование, чем без экспрессии НЬА-ОРАК
В последнем аспекте настоящего изобретения предоставлен набор для анализа для прогнозирования и способствования прогнозировании преэклампсии, в соответствии со способом прогнозирования для преэклампсии, в соответствии с изобретением, содержащий средства для определения в биологическом образце беременной особи млекопитающего женского пола уровней НЬА-ОРА1 и инструкции по применению указанных средств определения.
Настоящее изобретение будет теперь описано более подробно.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает расширенную модель развития преэклампсии, основанную на обнаружениях НЬР и НЬ-А в материнской плазме крови, выделении информации о появлении НЬ-Р и НЬ-А и возможном
- 17 022609 их использовании в качестве маркеров различных стадий болезни.
Фиг. 2А показывает плаценту на раннем сроке беременности (ультразвук), В показывает кровообращение плода в ворсинках, резко снижающееся в интервиллезном пространстве, наполненном материнской кровью, а С показывает наименьшую функциональную единицу-ворсинку с кровообращением плода.
Фиг. ЗА показывает кровообращение плода в ворсинках, резко снижающееся в интервиллезном пространстве, наполненном слабо оксигенированной материнской кровью (более темным), В показывает, что в клетках-трофобластах активными формами кислорода (ΚΌ8) индуцируется апоптоз (овальные штрихи), а С показывает поврежденный плацентарный барьер крови.
Фиг. 4 показывает результаты количественного определения мРНК НЬа, НЬу, НЬв и НЬЛ-ΌΡΆΙ в плаценте методом ПЦР в режиме реального времени.
Фиг. 5 показывает изображения гибридизаций ίη δίΐιι из образцов плаценты человека и плацентарной площадки.
Фиг. 6 представляет собой типичное изображение экспрессии белка НЬу в плаценте.
Фиг. 7 показывает диаграмму рассеивания уровней мРНК НЬу в материнской плаценте, отобранной перед родами, у женщины с РЕ, количественно определенного посредством ПЦР в режиме реального времени. Диаграмма показывает значение С'1 по левой оси, давая оценку количества уровней мРНК НЬу в образце.
Фиг. 8 показывает типичные гель-изображения для НЬ5. А) Образец РЕ, где пятно НЬ5 ясно видно (стрелка). В) Гель из контрольного образца, где пятно НЬ5 отсутствует (кружок).
Фиг. 9 показывает значения мРНК НЬ5 в плаценте, количественно определенные С|ПЦР, представленные на диаграмме рассеивания.
Фиг. 10 показывает изображения ίη 811и преэклампсированной плаценты, экспрессирующей мРНК
НЬ5.
Фиг. 11 - гибридизации ίη δίίπ образцов плаценты и плацентарной площадки (левая панель). Темное поле изображает экспрессию мРНК гемоглобина в типичном образце преэклампсированной плаценты и контроле. Экспрессия мРНК гемоглобина была особенно видна в и вокруг кровеносных сосудов (головки стрелок). Некоторые рассеянные клетки в интервиллезном пространстве видны в РЕ. Иммуногистохимия (правая панель) показывает накопление свободного фетального гемоглобина (стрелка) в просвете (1и) працентарной васкулатуры.
Фиг. 12 - общие концентрации гемоглобина в плазме женщин с преэкламптической беременностью (η=30) и нормальной беременностью (η=30). Концентрации были измерены посредством ЕЬРЗА с использованием антител против зрелого гемоглобина (НЬ-А), разбавление плазмы 1000х.
Фиг. 13 - определение НЬ-Р Вестерн-Блоттингом в плазме двух пациенток с преэклампсией (РЕ 1 и 2) и двух контрольных индивидуумов с нормальной беременностью (Контроль 1 и 2). Образцы плазмы обрабатывали альбумин-зкстрагирующими шариками, как описано, а затем применяли (15 мкл), не разбавленными, по методике электрофореза в полиакриламидном геле (8Э8-РАСЕ)/Вестерн-Блоттинга. Для того чтобы иметь возможность оценить концентрацию в мкг/мл, 0,1 мкг очищенного НЬ-Р применяли на отдельной полосе (очищенный НЬ-Р).
Фиг. 14 - кровообращение плода с клетками, синтезирующими гемоглобин (белые овалы с черными точками). Из-за нарушения плацентарного барьера фетальные клетки просачиваются в интервиллезное пространство и, таким образом, в кровоток матери.
Фиг. 15 - концентрации общей а4т в плазме женщин с преэкламптическими беременностями (η=30) и нормальными беременностями (η=30). Концентрации измеряли посредством ΚΙΆ с разбавлением плазмы 500х.
Фиг. 16А - клеточно-защитные свойства а4т против гем- и ΚΌδ-индуцированного окисления. Клетки К562 метили окислительно-чувствительным зондом Н2ОСРОЛ, отмывали и инкубировали с а4т (2,5 или 10 мкМ), АСР (2,5 или 10 мкМ) или аскорбатом (10 мкМ) перед добавлением 10 мкМ гема. Клетки инкубировали в течение 2 ч и анализировали РАС8. В. Клетки К562 культивировали с а4т (2,5 или 10 мкМ) или контрольным белком (αι-кислый гликопротеин, АСР) (10 мкМ) перед добавлением 200 мкМ гема и культивировали 4 ч. Клеточную суспензию собирали, смешивали с иодидом пропидия и анализировали РАС8.
Фиг. 17 - восстановление карбонильных групп на окисленном коллагене посредством ацп. Коллаген, нанесенный на плашки для микротитрования, окисляли посредством инкубирования с 50 мкМ гема в течение 17 ч. После отмывания добавили 0,1, 0,3 или 1 мкМ а4т овальбумина или аскорбата и инкубировали в течение 2 ч. Карбонильные группы измеряли посредством ЕЬРЗА. Каждый столбец представляет средние из трех значений ±СО.
Фиг. 18 - улавливание клеточного гема посредством ацп. Эритролейкемийные клетки человека (К562) культивировали либо с буфером или с 10 мкМ гема в течение 30 мин, отмывали и ресуспендировали в свежей культуральной среде. А: Затем клетки инкубировали с а4т (2 или 10 мкМ) в течение 2 ч, после чего культуральную среду сохраняли. Клетки отмывали и солюбилизировали посредством суспен- 18 022609 дирования в буфере, содержащем 1% ΝΡ-40. Затем культуральную среду и клеточную суспензию спектрофотометрически анализировали посредством считывания спектра поглощения (300-700 нм). В. Также визуально анализировали различные культуры. Клетки инкубировали либо с буфером или 10 мкМ гема в течение 30 мин (стадия 1), отмывали и затем инкубировали с буфером, 10 мкМ а1т или 10 мкМ ЛОР в течение 2 ч (стадия 2), отмывали и солюбилизировали, как описано выше.
Фиг. 19 показывает перфузию ίη νίίτο здоровой плаценты в течение 120 мин с раствором НЬ-Л (2 мкг/мл) на фетальной стороне (пустые символы) и только с буфером на материнской стороне (закрашенные символы) (1-ая перфузия) и в течение 120 мин на обеих сторонах только с буфером (2-ая перфузия). Образцы отбирали равномерно и концентрацию НЬ-Л измеряли посредством ЕБ18Л (левая диаграмма), ат с ΡΙΆ (правая диаграмма), а фетального НЬ-Л Вестерн-блоттингом (правое фото).
Фиг. 20 показывает электрофорез в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг комплекса гемоглобин-(/.|1п. извлеченного из ткани плаценты. Плаценту здорового донора гомогенизировали и центрифугировали при 100000 О в течение 60 мин. Супернатант вводили в колонку с анти-щт аффигелем, которую промывали и элюировали 0,1М глицин-НС1, рН 2,3. Элюат отделяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле, который либо окрашивали Кумасси (две левые дорожки), или переносили на мембраны РУЭР и блоттировали с анти-щт или анти-НЬ-Л.
Фиг. 21 показывает результат исследования в Танзании. Показан общий гемоглобин (мкг/мл) в моче перед родами.
Следующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения. Должно быть понятно, однако, что не предполагается ограничивать изобретение конкретными условиями и подробностями, описанными в данных примерах.
Пример 1. Обнаружение РНК НЬ и белка в плаценте.
Количественный ПЦР-РВ, гибридизацию ίη 8ίΙιι и иммуногистохимию проводили для анализа мРНК НЬа, НЬв и НЬу и экспрессии белка в образцах плаценты у пациенток с РЕ и контрольной группы.
Отбор образцов.
Ткань плаценты отбирали в отделении Акушерства и Гинекологии больницы Лундского Университета. Взятие материала, выполненное с письменного согласия, было одобрено Этическим комитетом Наблюдательного Совета для изучения людей-пациентов. В исследование включали ткани плаценты 10 преэклампсированных, 15 нормальных беременных, 5 пациенток с билатеральной узурацией и 5 пациенток с билатеральной узурацией, а также преэклампсией. Также отбирали образцы плацентарных площадок (см. ниже) у 5 пациенток с РЕ и 5 контрольной группы. Преэклампсию определяли как артериальное давление >140/90 мм рт.ст. и протеинурия >0,3 г/л. Были исключены пациентки с существенной гипертензией или другими системными заболеваниями. Образцы плаценты отбирали при рождении, немедленно замораживали и сохраняли при -80°С.
Отбор образцов тканей и операции с ними.
Образцы плаценты отбирали немедленно после родов. Кубик размером 10x10x10 мм ворсистой ткани удаляли из центральной части плаценты, избегая микроскопических областей некроза и инфаркта. Кубики размером 10x10x10 мм ткани матки отбирали у женщин, перенесших кесарево сечение. Образцы немедленно замораживали сухим льдом и сохраняли при -80°С до извлечения РНК. Ткань не размораживали перед извлечением РНК или криосекцией, для того чтобы обеспечить максимально возможную целостность РНК.
Извлечение РНК.
Общую РНК извлекали из замороженной ткани с использованием Ττίζοί® (Ιηνίίτο^βη) в соответствии с инструкциями производителя. Протеогликан и полисахариды удаляли посредством выполнения высокосолевого осаждения 0,8М цитратом натрия и 1,2М хлоридом натрия. Целостность РНК определяли посредством денатурирования электрофорезом в 1% агарозном геле с 6,7% формалином и 1хМОР8 буфером. Образцы сохраняли в воде без рибонуклеаз при -80°С до использования. Перед использованием образцы осаждали еще раз и отмывали 70% этанолом для того, чтобы удалить остатки тризола.
Лмплификация ПЦР в режиме реального времени.
кДНК синтезировали с обратной транскриптазой в соответствии с протоколами от Лррйеб Вю8у8ίет8. Использовали 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг общей РНК, 1хбуфера ТацМаи ΡΤ, 5,5 мМ М§С12, 500 мкМ 6ΝΤΡ, 2,5 мМ случайно выбранных гексамеров, 0,4 ед/мкл ингибитора РНКазы и 1,25 ед/мкл обратной транскриптазы МиШЗотЬе. Реакционные смеси инкубировали при 25°С в течение 10 мин, при 48°С в течение 30 мин и в заключение 5 мин при 95°С. Образцы хранили при -20°С до проведения анализа.
Транскрипты генов анализировали посредством ПЦР в режиме реального времени с использованием системы определения последовательностей ΑΒΙ ΡΡΙ8Μ® 7000 (ЛррБеб Вю8У81ет8). Праймеры и зонды разработали с использованием программного обеспечения Рптег Ехрге88® или заказали у Л88ау8 οη^е8^дη/^етаηά™ (ЛррйеД Β^ο8у8ίет8). Праймеры намечали различные экзоны генов интереса, чтобы избежать усиления контаминации геномной ДНК. Реакции проводили в 25 мкл конечного объема, содержащего 1хишуег8а1 РСР Ма51ег Μίχ (Лррйеб Β^ο8у8ίет8), 0,25 мкмоль/л зонда, 0,9 мкмоль/л прямого
- 19 022609 и обратного праймеров соответственно и 1 мкл 10 нг/мкл аликвоты ДНК. Условия теплового цикла были инициированы посредством активации ΉΝΟ при 50°С в течение 2 мин и начального денатурирования при 95°С в течение 10 мин. Затем провели 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин. Два негативных контроля без матрицы включали в каждый комплект амплификации, β-актин использовали в качестве ориентира для нормализации сигнала от образца. Количественная обработка была достигнута посредством создания калибровочной кривой с использованием серийных 4-кратных разведений матрицы ДНК (0,08-80 нг). Результаты выражены как соотношения с β-актином в качестве деноминатора.
Гибридизация ίη ήιι (18НН).
Гибридизации проводили, как предварительно описано [Напккоп е1 а1., 2005]. Замороженные срезы, которые сохраняли при -80°С до их использования, были установлены размороженными на предметные стекла, обработанные сиаловой кислотой. Свежезамороженную ткань использовали для предельного увеличения определения мРНК. Срезы фиксировали, обезвоживали, обезжиривали и гибридизировали, как ранее описано [Вгаб1еу е1 а1., 1992]. Гибридизацию проводили в течение 20-24 ч при 55°С 2x106 свм денатурированного зонда 358-КРНК на 80 мкл гибридизационного буфера (20 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 300 мМ №С1, 50% формамида, 10% дикстрансульфата, 1хОепНагб1 25 мкг/мл тРНК дрожжей, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 250 мкг/мл общей РНК дрожжей (фракция XI, 8щта). 150 мМ дитиотреитола (ΌΤΤ), 0,15% тиосульфата натрия (ΝΤ8) и 0,15% додецилсульфата натрия (8Ό8). После промывок предметные стекла устанавливали на Кобак НуретЫт Вютах МК на 2 дня, после чего их покрывали ядерной трековой эмульсией (ΝΤΒ-3, Кобак). Покровные стекла выдерживали в течение 3 (НЬа2, НЬу2) и соответственно 4 (Ηϋβ) недель при 4°С, после чего их проявляли в Эек1о1 (Кобак), фиксировали и контрастно окрашивали красителем Гиемса.
Иммуногистохимия.
Свежезамороженные срезы образцов плаценты толщиной 14 мкм фиксировали посредством погружения в 4% буферный формальдегид в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в блокинг-растворе (Ро^етЫоск; 2утеб) в течение 30 мин при комнатной температуре. После отмывания РВ8 срезы переносили в антитела против человеческого фетального гемоглобина, разбавленные 1:500 (Ве1йу1 Е-аЬогаЮпек), которые нарабатывали в овце. Вслед за инкубированием в течение часа при комнатной температуре срезы промывали и переносили на час при комнатной температуре в разбавленные 1:1000 антитела против овечьих СУ3, наработанные в осле Цасккоп 1аЬога1опек). Затем срезы отмывали, покрывали 0,1М Трис и рассматривали под микроскопом с обращенной флуоресценцией Ье1еа ΌΜΑ 6000. Изображения были получены с использованием программного обеспечения Уо1осйу.
Результаты.
Фиг. 4 показывает количественное определение НЬа, НЬу и НЬв в плаценте методом ПЦР в режиме реального времени. Все значения были нормализованы по отношению к количеству β-актина и представлены как диаграммы рассеивания. (А) Экспрессия мРНК НЬа плаценты. Были обнаружены значительные изменения между РЕ в сравнении с контролем (р=0,004) и между РЕ/узурация (РЕ с узурацией) в сравнении с контролем (р=0,03). (В) Значения НЬу относительно мРНК показывают значительные изменения между РЕ в сравнении с контролем (р=0,003) и между РЕ/узурация в сравнении с контролем (р=0,03). (С) НЬ(1 показал наличие значительной сверхэкспрессии РЕ в сравнении с контролем (р=0,02) и РЕ/узурация в сравнении с контролем (р=0,04).
Подводя итог, было обнаружено, что уровни мРНК НЬа (р=0,004), НЬу (р=0,003) и НЬ(1 (р=0,02) значительно увеличены в образцах РЕ в сравнении с контролем (фиг. 4А, В, С), а также в образцах с узурацией по сравнению с контролем (НЬа р=0,02, НЬу р=0,03 и НЬ(1 р=0,04). (НЬ(1 не был представлен в матрице, но изучался по причине изменений, выявленных для НЬа и НЬу.)
Фиг. 5 показывает результаты гибридизации ίη κίΙιι образцов плаценты и плацентарной площадки. Она показывает изображение плаценты человека, демонстрируя участок ворсинчатой ткани (V) плаценты и ниже участок плацентарной площадки (М) со спиральными артериями (8) между ними. (А) Изображение светлого поля экспрессии мРНК НЬа является типичным для образца преэкламптической плаценты. Экспрессия НЬа была особенно различима в кровеносных сосудах и вокруг них. Однако также различимы несколько рассредоточенных клеток в интервиллезном пространстве. (В) Изображение темного поля того же участка. (С) Изображение темного поля экспрессии мРНК НЬа типичной контрольной плаценты в сравнении с плацентами РЕ показывает меньшее количество НЬа экспрессирующих клеток в интервиллезном пространстве. (Ό) Изображение светлого поля образца типичной матки пациентки с РЕ. Экспрессия НЬа видна только в спиральных артериях, в ткани матки экспрессия не видна. (Е) Тот же участок матки в темном поле. (Р) Образец матки контрольной плаценты. Экспрессия мРНК НЬа является подобной экспрессии, наблюдаемой в матке РЕ.
Подводя итог, гибридизация ίη κίΙιι выявляет клетки с ярко выраженным ядром, экспрессирующие НЬа и НЬу, которые были рассеяны по всему интервиллезному пространству как в РЕ, так и в контрольных образцах. Оказалось, что плаценты пациенток с РЕ имеют больше клеток, содержащих НЬ, чем контрольные образцы (фетальный НЬ), а сигналы на клетку возникали более интенсивно, чем в контроль- 20 022609 ных. В нескольких из изученных образцов НЬ-положительные клетки были связаны со стенками кровеносных сосудов с несколькими клетками, находящимися свободно в просвете. Было обнаружено множество отдельных клеток в интервиллезном пространстве. Основываясь на их морфологии, локализации и распространении, можно заключить, что они не являются трофобластами.
Фиг. 6 представляет собой типичное изображение экспрессии белка НЬу в плаценте. Экспрессия белка указана красным флуоресцентным маркером. В плаценте РЕ наблюдается сильная экспрессия НЬу в просвете сосудов (1и), но НЬу также экспрессируется эндотелием сосудов (стрелка) (А). Однако плацента от контрольных пациенток с нормальным давлением не демонстрирует экспрессию НЬу в просвете сосудов (В), но НЬу (т.е. свободный фетальный гемоглобин) экспрессируется эндотелием сосудов (стрелка). Единица масштаба изображения составляет 25 мкм.
Подводя итог, экспрессия НЬу была преимущественно выявлена в просвете плацентарных кровеносных сосудов образцов плаценты РЕ, но также вблизи эндотелиальных клеток стенок сосудов. Контрольные образцы плаценты показали экспрессию НЬу в эндотелии сосудов без экспрессии в просвете сосуда.
Обсуждение.
Количественная ПЦР в режиме реального времени показала повышенную экспрессию мРНК НЬа и НЬу в РЕ по сравнению с контролем. Гибридизация ίη δίίπ показала повышенное количество клеток, экспрессирующих гемоглобин в образцах плаценты РЕ по сравнению с контрольными пациентами. Тот факт, что клетки, экспрессирующие гемоглобин, находились во взаимосвязи со стенками сосудов, может либо указывать на то, что клетки мигрируют в сосуды или из них, или что существуют связывающие участки на стенках сосудов для данных клеток. Тот факт, что сосуды матки обеднены клетками с ярко выраженным ядром, экспрессирующими мРНК НЬ, по сравнению с сосудами плаценты, которые обогащены ими, позволяет предположить, что данные клетки не могут быть материнского происхождения. Данные, полученные авторами изобретения, о том, что мРНК НЬу (фетального) представлена в плацентарных НЬ-положительных клетках, а также низкое число клеток, экспрессирующих НЬ в просвете кровеносных сосудов матки, указывают на то, что именно фетальные клетки являются ответственными за повышенную экспрессию НЬ, наблюдаемую в плацентах и крови при РЕ.
Если фетальные клетки, продуцирующие НЬ, которые описаны авторами изобретения, имеют быстрый кругооборот, то они могут высвобождать высокий уровень гема во вневорсинчатое пространство и кровеносные сосуды плаценты. Действительно, иммуногистохимия, выполненная авторами изобретения, выявила высокий уровень гемоглобина в просвете кровеносных сосудов плаценты РЕ. С другой стороны, контрольная плацента не выявила высвобождение гемоглобина в кровеносные сосуды. Гемолиз в некротических и тромботических зонах плаценты РЕ может добавлять туда количество свободного гемоглобина и ухудшать показатели.
Свободный гем представляет собой сильное окислительно-восстановительное вещество, которое может вызывать серьезные повреждения посредством образования активных форм кислорода (ΚΌ8). Гем окисляет некоторые липиды, включая липопротеины с низкой плотностью (БЭБ), превращая их в цитотоксические пероксиды, которые вызывают повреждение эндотелия. Более того, гем может напрямую повреждать клеточные мембраны, перфорируя их и окисляя белки мембран, что приводит к повышению мембранной проницаемости и цитолизу.
Таким образом, инфильтрация плаценты большими количествами НЬ позитивных клеток (т.е. фетальных клеток) является настораживающим признаком. Гем, высвобождающийся данными клетками, может быть достаточно вредным и может быть ответственным за многие из плацентарных патологий, связанных с РЕ.
В заключение, не имея желания связывать себя теорией, полагают, что данные, полученные авторами изобретения, позволяют предположить, что гены НЬ являются сверхэкспрессируемыми в субпопуляции клеток в преэкламптической плаценте. Продуцирование веществ, стимулирующих гемопоэз плацентраными клетками в ответ на пониженную перфузию и возможную локальную гипоксию, может вносить вклад в формирование, привлечение и распространение клеток. Несмотря на то, что, по-видимому, они присутствуют в плаценте женщин с нормальным течением беременности, их увеличение в плаценте пациенток с РЕ является фактом, заслуживающим рассмотрения. Если они имеют быстрый кругооборот и избыточно высвобождают свой НЬ (и гем), они могут повреждать расположенные рядом структуры, включая эндотелий сосудов.
Пример 2. Определение фетального НЬ в материнской крови.
Для анализа мРНК НЬ в образцах крови пациенток, страдающих РЕ, была проведена количественная ПЦР в режиме реального времени.
ПЦР в режиме реального времени.
РНК экстрагировали с использованием мининабора вирусных РНК Ц1Аатр (Ц1адеп) в соответствии с инструкциями изготовителя. Кратко, 3,6 мл буфера АУБ смешивали с 36 мкл РНК-носителя (Ц1адеп) переворачиванием пробирки 10 раз. 1 мл образца плазмы центрифугировали при 1150 д в течение 10 мин. К раствору буфера АУБ добавляли 900 мкл плазмы и 3,6 мкл 99% этанола. Приблизительно 650 мкл
- 21 022609 раствора добавляли на колонку 01Латр и центрифугировали при 6000 д в течение 1 мин. Это повторяли до тех пор, пока на колонку не добавляли объем общей плазмы. Колонку однократно промывали буфером АА1, затем центрифугировали при 6000 д в течение 1 мин, вслед за чем промывали буфером АА2, затем центрифугировали при 20000 д в течение 3 мин. РНК элюировали 50 мкл воды без РНКазы.
Количество РНК фетального НЬ определяли посредством ПЦР в режиме реального времени.
Результаты.
Фиг. 7 показывает диаграмму рассеивания уровней мРНК фетального НЬу материнской плазмы, взятой перед родами у женщины, страдающей РЕ, количественно определенных посредством ПЦР в режиме реального времени. Диаграмма показывает значение С! на левой оси, давая оценку количества уровней мРНК НЬу в образце. Это показывает, что возможно не только измерить уровни белка гемоглобина у в образцах материнской крови, но также количеств мРНК.
Пример 3. Определение профиля экспрессии белка преэкламптической плаценты с использованием 2И-гель-электрофореза.
Для того чтобы провести скрининг дифференцированно экспрессируемых белков в плаценте РЕ в сравнении с контрольными плацентами, авторы изобретения собирали образцы плаценты во время родов женщин, страдающих РЕ (п=30), и здоровых женщин контрольной группы (п=30). Используя технологию протеомики (электрофореза в 2-мерном геле), авторы изобретения сравнивали уровни экспрессии гемоглобина-дельта (НЬ5) в различных образцах плаценты.
Пациентки и сбор образцов.
женщин, госпитализированных в отделение Акушерства и Гинекологии больницы Лундского Университета, были включены в исследование и разделены на две группы: РЕ (п=30) и контрольная (п=30) (табл. 2). Диагноз РЕ ставили при артериальном давлении >140/90 мм рт.ст. и протеинурии >0,3 г/л или повышении артериального давления более чем на 20 мм рт.ст. по сравнению с первым триместром беременности. Сразу после удаления плаценты отбирали кубик размерами 10x10x10 мм ткани плаценты. Образцы немедленно замораживали сухим льдом и сохраняли при -80°С. Пациенты с другими системными заболеваниями были исключены из исследования. Исследование было одобрено Этическим комитетом Наблюдательного Совета для изучения людей-пациенток, а все женщины дали письменное информированное согласие.
Таблица 2
Контроль РЕ
п 30 30 пз
Возраст матерей (годы) 31,7+5,2 30,9+5,3 пз
Внутриутробный возраст плода (дни) 271,3±10,8 266,6±11,2 пз
Систолическое давление (мм рт.ст.) 116,3+11,3 149,8+12,1|
Диастолическое давление (мм рт.ст.) 67,3±4,4 103,3+7,9|
Протеинурия (г/л) ΝΟ 1,4+2,0)
Масса плаценты (г) 686,8+144,8 630,±128,0 пз
РЕ=Преэклампсия МЭ=Не определено п§ - нет значительной разницы между группами у - тест Манна-Виттни, показывающий значимость между группами, равную р<0,0001
Экстракция белка.
Белок был экстрагирован с использованием Ττίζοί® (ЧпуПгодеп) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко, ткань плаценты гомогенизировали в тризоле на льду и затем центрифугировали при 12000д в течение 10 мин при 4°С.
Белковую фракцию отделяли с использованием хлороформа и осаждали с использованием 2пропанола. Капли осажденного белка отмывали три раза в 1,5 мл 0,3М гуанидингидрохлорида и один раз в 1,5 мл 75% этанола. Осадок растворяли в 0,8М мочевины и 2% СНАР8 и измеряли концентрацию белка с использованием методики спектрофотометрии. Белки сохраняли при -20°С до использования.
Осаждение белка.
Перед изоэлектрическим фокусированием образцы осаждали ацетоном для инактивации протеолитических ферментов, удаления соли и примесных веществ. 400 мкг экстрагированного из каждой плаценты белка смешивали с ледяным ацетоном до окончательной концентрации, равной 80% ацетона. Об- 22 022609 разцы инкубировали в течение 1 ч при -20°С с последующим центрифугированием при 9000/д в течение 2 мин. Ацетон удаляли и белковому осадку давали возможность высохнуть на воздухе.
Двухмерный гель-электрофорез.
Сухие полоски иммобилина (180/3/0,5 мм, рН 3-10 ΝΣ, СЕ НеаИЪсаге ЫГе Заепсе8) регидратировали в 350 мкл солюбилизационного раствора, содержащего 8М мочевины, 2% СНАРЗ, 10 мМ дитиотреитола (ΌΤΤ) и 2% буфера 1РС 3-10 вместе с 400 или 800 мкг образцов при комнатной температуре в течение ночи. Стадию ГЕР выполняли при 20°С с использованием Ми1бр1юг II и проводили в соответствии со следующим планом: (1) 150 В в течение 1 ч, (2) 300 В в течение 3 ч и (3) 3000 В пока не достигали приблизительно 60000 В/ч. Полоски уравновешивали в течение 10 мин в растворе, содержащим 65 мМ ΌΤΤ, 6М мочевины, 30% (м/о) глицерина, 2% (м/о) додецилсульфата натрия (ЗИЗ) и 50 мМ Трис-НС1 рН 8,8. Также выполняли стадию второго уравновешивания в течение 10 мин в таком же растворе за исключением ΌΤΤ, который заменяли 259 мМ йодацетамида. Полоски были замочены в буфере для электрофореза (24 мМ Трис-основания, 0,2М глицина и 0,1% ЗИЗ) непосредственно перед вторым измерением. Полоски применяли на 12,5% гомогенном слое геля Иигасгу1 (240/190/1 мм или 290/245/1 мм). Полоски накладывали с раствором 1% агарозы в буфере для электрофореза (выдерживали при 60°С). Электрофорез проводили либо с использованием гелевого устройства НοеΓе^ ΌΑΣΤ (АтегеЬат РЬагтааа Вю1есЬ, Сан Франциско, КА, США) при 20°С и постоянных 80 В в течение 19 ч или с использованием гелевого устройства с применением того же буфера для электрофореза, как описано выше, и выполняли при 20°С при 18 мА пока окрашенный фронт не достигал дна геля. Время исполнения составляло приблизительно 17 ч.
Окрашивание геля.
Гели окрашивали серебром, а после окрашивания гели высушивали с использованием сушильного устройства для геля (З1аЬ де1 Игуег ЗСИ2000, Зауай).
Спот-анализ.
Гели сканировали с использованием СагюЗсап 995ΘΡ (Сагюп). Спот-анализ выполняли с использованием ЕРОРЕЗТ (версия 7.1.0) системы анализа двумерного геля (Βίο-Раб б^8сονе^у 8епе8, Вю-Раб Ьаόοπ-ιίοι^κ Сандбиберг, Швеция).
Идентификация с помощью масс-спектрометрии.
Исследуемые пятна отмывали 0,5 мл воды МПЬ-р с последующими четырьмя отмываниями 0,5 мл 40% ацетонитрила (АСИ) в 25 мМ бикарбоната аммония в течение 30 минут каждое. Затем кусочки геля высушивали в концентраторе ЗреебУас перед деградированием белков на характеристические фрагменты трипсином (степень чистоты реактива для секвенирования, Рготеда) в 25 мМ бикарбоната аммония в течение ночи при 37°С. Ферментативную обработку завершали посредством добавления 20 мкл 2% трифторуксусной кислоты, которая также экстрагировала пептиды из геля. После 2 ч при комнатной температуре пептиды очищали от буфера для ферментативной обработки с использованием С18 Ζίρΐίρδ (Миллипор). Кратко, твердая фаза была кондиционирована с использованием 2/10 мкл 50% АС^ 0,1% ΤΡΑ в воде МбИ-р. Органический растворитель смывали посредством двух отмываний 10 мкл 0,1% ΤΡΑ. Образцы аспирировали и распределяли несколько раз с последующими двумя отмываниями 0,1% ΤΡΑ для удаления солей и несвязанного вещества. Очищенные пептиды элюировали непосредственно на образцы мишени (Апс1югс1йр 1агде1. Вгикег Па^шк), куда было добавлено 0,7 мкл матрикса, 2,5дигидроксибензойной кислоты (3 мкг/мл в 30% АС^. Масс-спектры положительно заряженных ионов записывали на устройстве Вгикег Кейех III (Вгикег Па^шк), работающем в рефлекторном режиме. Общие из 160-210 одиночных коротких спектров были аккумулированы из каждого образца. Для обработки данных использовали комплекты программного обеспечения ХМАЗЗ 5,0 и МЗ ВюЬюй, предоставленные производителями. Известные продукты автопротеолиза из трипсина использовали для внутренней калибровки.
Анализ методом тандемной МС.
0,5 мкл каждого из пептидных экстрактов наносили в виде пятен непосредственно на мишень МАРШ из нержавеющей стали и оставляли высыхать. 0,5 мкл матричного раствора, содержащего 5 мкг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, 50% ацетонитрила, 0,1% ΤΡΑ и 50 мМ лимонной кислоты добавляли и давали возможность высохнуть. Спектры МΑ^^I-ΤΟΡ-МЗ и МЗ/МЗ записывали с использованием масс-спектрометра 4700 Р^οΐеοт^с8 Апа1у/ег (АррЬеб Вю8У81ет8, Фрамингем, СА, США) в положительном рефлекторном режиме. Производили внутреннюю калибровку полученных МС спектров с использованием двух пептидов после автопротеолиза трипсином с значениями т/ζ, равными 842,51 и 2211,097. Проводили идентификацию белка с использованием программного обеспечения СРЗ ЕхрШгег с внутренней поисковой системой Ма8Ш (МаФх Заеисе, Ροι^οπ, ИК) {Регкт8, 1999 #132} исследующей статистически неопределимую базу данных NСΒI. Параметрами, определенными для поиска, являлись таксоны, млекопитающие; пропущенные расщепления, 1; допустимая масса пептида ±30 м.д.; допустимая масса заряженного фрагмента ±0,15 Да; различные модификации, отсутствия.
Исследование базы данных.
Для идентификации белка последовательности белка человека были исследованы в базе данных
- 23 022609
Νί’ΒΙ с использованием РгоРоипй Рерййе Марршд (версия 4.10.5, ТНе РоскеГейет ишуеткйу ЕйШоп) и Максо! 8ойтаге (Майт\ §с1епсе Ий.).
Вестерн-блоттинг.
Вестерн-блоттинг выполняли на 12% бис-Трис-гелях Опуйгодеп, США) в соответствии с инструкцией производителя. Кратко, 20 мкг белка с 2,5 мл образца буфера ί-Όδ (1пуйтодеп, США) помещали в гель и выдерживали в течение 50 мин при 200 В в подвижном буфере 1χΜΟΡδ. Последующий гель для электрофореза блоттировали на мембрану РИУР (Вю-Рай, США) в течение 1 ч при 30 В, после чего мембрану инкубировали в Трис-забуференном физиологическом растворе (ΊΒδ), содержащем 0,1% Т\\ееп 20® (ΙΟΝ ВюшейкЬак 1пс., Огайо, США) и 2% сухого молока (Вю-Рай, США) в течение ночи при 4°С.
Блот инкубировали с первичными мышиными моноклональными антителами и 1дО1 (противчеловеческого НЬу (разбавленными 1:8000 в ΤΒδ-Τ с 2% сухим молоком) (№гйю Вюкйе АВ, Швеция) в течение 1 ч, после чего мембрану отмывали один раз в течение 15 мин в ΤΒδ-Τ и 3x5 мин в ΤΒδ-Τ.
Вслед за отмыванием блот инкубировали с козьими противомышиными вторичными антителами 1дО1-НРР (разбавленными 1:5000 в ΤΒδ-Τ) (δΌδ δаηΐа Сги/ Вю1есйпо1оду, США) в течение 1 ч, после чего мембрану отмывали, как описано выше. В дальнейшем мембрану подвергали усиленной хемилюминисценции ЕСЬ+ (ОЕ Неаййсате Вюкаепсек, Великобритания) в течение 3 мин. Авторадиографическую пленку (НуретШт ЕСЬ, Атеткйат, США) применяли для блоттинга в течение 1 мин для получения удовлетворительной выдержки.
Извлечение РНК.
Общую РНК извлекали в соответствии с инструкцией производителя с использованием РНКазы (Ц1адеп) из 10 образцов РЕ и 10 контрольных образцов от таких же пациенток, как описано выше. Кратко, образцы плаценты были гомогенизированы с использованием ТНиеку/ег в лизирующем буфере РНКазы (РЙТЬиГГег и (3-меркаптоэтанол) (Ц1адеп). Образцы осаждали в 70% этаноле и затем разделяли на фракции с использованием миниколонок РНКазы в соответствии с протоколом производителя. Образцы были элюированы в 50 мкл Н2О без РНКазы.
ПЦР в режиме реального времени (подобно описанной выше) кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя (Аррйей Вю+Ыеш).
Кратко, использовали 50 мкл реакционной смеси (0,5 мкг общей РНК, 1хбуфера ТацМап РТ, 5,5 мМ МдС12, 500 мкМ йЭТР, 2,5 мМ случайно выбранных гексамеров, 0,4 ед/мкл ингибитора РНКазы и 1,25 ед/мкл обратной транскриптазы Ми1^спЬе). Реакционные смеси инкубировали при 25°С (10 мин), при 48°С (30 мин) и в заключение при 95°С (5 мин). Образцы хранили при -20°С до проведения анализа.
Необходимые транскрипты генов количественно определяли посредством количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием системы определения последовательностей АВ1 РРШМ® 7000 (Аррйей ВючуЧеш). Праймеры и зонды для ТР (анализ ГО: Нк00169070_т1) и НЬ5 (анализ ГО: Нк00426283_т1) были заказаны у Аккаук-опГОетапй™ (Аррйей Вю+Ыеш). Праймеры покрывали по меньшей мере одну границу экзона для того, чтобы избежать усиления контаминации геномной ДНК. Реакции выполняли в 25 мкл конечного объема, содержащего конечные концентрации: 1хитует8а1 РСР МаЧег М1\ (Аррйей ВючуЧетО, 0,25 мкмоль/л зонда, 0,9 мкмоль/л прямого и обратного праймеров соответственно и 2,2 мкл аликвоты ДНК. Тепловой цикл был инициирован посредством активации υΝΟ при 50°С в течение 2 мин и начального денатурирования при 95°С в течение 10 мин. Вслед за денатурированием провели 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин. Два негативных контроля без матрицы включали в каждый комплект амплификации. β-актин использовали в качестве ориентира для стандартизации сигнала от образца. Количественное определение было достигнуто посредством создания калибровочной кривой с использованием серийных 4-кратных разведений матрицы ДНК (0,08-80 нг). Результаты выражены как соотношения с β-актином в качестве единицы измерения.
Гибридизация ш 5Йи (подобно описано выше).
Гибридизации проводили на 18 образцах РЕ и 19 контрольных образцах. Криостатные срезы были установлены размороженными на предметные стекла, обработанные сиаловой кислотой, которые сохраняли при -80°С до их использования. Свежезамороженную ткань использовали для предельного увеличения определения мРНК.
Срезы фиксировали, обезвоживали, обезжиривали и гибридизировали. Гибридизацию проводили в течение 20-24 ч при 55°С с 2x106 и/мин денатурированного зонда 35δ-ΚΡНΚ на 80 мкл гибридизационного буфера (20 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 300 мМ №С1, 50% формамида, 10% декстрансульфата, 1хЭепйагй1 25 мкг/мл тРНК дрожжей, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 250 мкг/мл общей РНК дрожжей (фракция XI, δ^дта), 150 мМ ИТТ, 0,15% тиосульфата натрия (ΝΎδ) и 0,15% δΌδ. Отмытые в дальнейшем предметные стекла устанавливали на Койак НуретШт Вюта\ МР на 2 дня, после чего их покрывали ядерной трековой эмульсией (№ГВ, Койак). Покровные стекла выдерживали в течение 4 недель при 4°С, после чего их проявляли в Оекю1 (Койак), фиксировали и контрастно окрашивали красителем Гиемза.
- 24 022609
Результаты.
Экстрагированные белки плаценты разделяли посредством 2Ό-ΡΑΟΕ для того, чтобы изучить различия в экспрессии белка между пациентками, страдающими РЕ, и здоровыми контрольными женщинами. В первой экспериментальной модели 400 мкг образцов помещали на ΙΡΟ-полосу и проводили второе измерение с использованием гелевого устройства НоеГег ЭАБТ. Только одно пятно было обнаружено со значительным различием между двумя группами. Для того чтобы идентифицировать пятно, 800 мкг образцов помещали на гели и обрабатывали все четыре образца, два образца РЕ и два контрольных образца. Для количественного анализа проводили второе измерение. При этом второе дифференциально выраженное пятно определяли невооруженным глазом в образцах РЕ (фиг. 8). Два белковых пятна, представляющих интерес, вырезали из гелей, подвергали ферментативной обработке и идентифицировали с использованием МАЬЭ1-ТОР М§. Первый белок идентифицировали как трансферрин, а второй - как гемоглобин.
Установить подкласс гемоглобина с помощью данных ΜΑΣΌΙ не представлялось возможным. Вот почему это пятно было в дальнейшем подвергнуто последующему анализу с использованием метода тандемной МС. Данные тандемной МС показали, что полученные последовательности принадлежат дельтацепи гемоглобина (НЬ5). В соответствии с определением белка ПЦР в режиме реального времени также показала значительное повышение экспрессии гена для НЬ5 в плацентах РЕ (р=0,04) в сравнении с контролем (фиг. 9).
Гибридизация ίη δίΐιι показала отдельные клетки, экспрессирующие мРНК НЬ5 по всему интервиллезному пространству. Клетки, экспрессирующие мРНК НЬ5, были особенно различимы в кровеносных сосудах плаценток и вокруг них. Похоже, что плаценты РЕ имеют больше клеток, экспрессирующих мРНК НЬ5, рассеянных за пределами сосудов, чем контрольные. В клетках-трофобластах сигнал не был определен. Клеточная морфология клеток, экспрессирующих НЬ5, была усеяна микрокристаллами серебра, покрывающими положительные клетки (фиг. 10).
Обсуждение.
Текущие данные, полученные авторами изобретения, подтверждают плацентарный гемопоэз посредством демонстрируемой в данном документе повышенной экспрессии белка НЬ5, а также соответствующей экспрессии генов при РЕ.
В плаценте повышенные уровни мРНК НЬ5 транслируются в белок, как показали в данном документе авторы изобретения, для того чтобы накапливаться в плаценте РЕ. Однако необязательно, чтобы продуцированные цепи НЬ были встроены в молекулы НЬ, функционирующие за счет связанных порфириновых колец и иона Ре. Транспорт и усвоение клеткой железа обеспечивает трансферрин (ТР). В данном документе 2Э-гели авторов изобретения также показали, что плацента РЕ обеднена внутриклеточным ТР. Данная нехватка белка ТР в РЕ плаценте может отражать нарушенный транспорт железа в популяцию клеток, экспрессирующих НЬ5. Таким образом, клетки, продуцирующие НЬ, следовательно могут быть лишены обеспечения их железом, что ведет к накоплению цепей НЬ и/или дисфункциональных молекул НЬ в плаценте РЕ. Любопытно, что не происходило накопления гемоглобина в контрольных плацентах, хотя даже гибридизация ίη δίΐιι показала экспрессию мРНК для НЬ5. В отличие от РЕ плаценты здоровая плацента способна регулировать продуцирование НЬ либо посредством регуляции трансляции мРНК, деградации белка или просто являясь экстрамедуллярным органом гемопоэза. Дефект синтеза НЬ может привести к дефекту эритробластов, тезис возможно является менее устойчивы и легко разваливается на части, что, в свою очередь, ведет к большему количеству свободного НЬ.
Пример 4. Обнаружение экспрессии РНК НЬА-ΌΡΑί.
Для анализа экспрессии РНК НЬА-ЭРА1 выполняли количественную ПЦР в режиме реального времени.
Сбор образцов; взятие тканей и подготовка; экстрагирование РНК и амплификацию ПЦР в режиме реального времени выполняли, как описано в примере 1 с необходимыми изменениями.
Результаты.
У главного комплекса гистосовместимости, II класса, ΌΡ альфа 1 (НЬА-ЭРА1) была значительно повышена регуляция в группе с узурацией по сравнению со всеми другими группами (р=0,01 по сравнению с РЕ без узурации, р=0,02 по сравнению с РЕ с узурацией и р=0,01 в сравнении с контролем) (см. фиг. 4Ό).
Обсуждение.
Женщины с выявленной узурацией в дальнейшем имеют повышенный риск развития РЕ во время своей беременности. Однако тот факт, что не у всех женщин с узурацией развивается РЕ, означает, что у них могут экспрессироваться гены, которые защищают либо репрессируют гены, которые им вредят. Как микроматрица, так и кПЦР показали повышенную экспрессию Н^Α-^ΡΑ1 в группе с узурацией в сравнении со всеми другими группами. Н^Α-^ΡΑ1 представляет собой часть класса II семейства главного комплекса гистосовместимости (МНС), элементы которого являются ответственными за презентирование чужеродных антигенов как часть адаптивного иммунного ответа. Молекулы только класса I МНС типов С и Е НЬА экспрессируются в клетках трофобластов. Полагают, что они изменяют материнский
- 25 022609 иммунный ответ при взаимодействии матери и плода, защищая плод от материнского иммунного ответа. Таким образом, НЬА-ОРА1, молекулы класса II МНС не могут производится трофобластами. Вместо этого материнскую реакцию может представлять собой присутствие фетальных клеток в плаценте.
Известно, что фетальные клетки поступают в систему кровообращения матери во время беременности, а их уровни повышаются в течение нормально протекающей беременности, предполагая непрерывное поступление фетальных клеток в материнскую систему через плацентарный барьер. При РЕ количество фетальных клеток в материнской системе кровообращения повышено в сравнении с беременностями с нормальным давлением. Как замечено выше, повышенная экспрессия НЬА-ЭРА1 в группе с узурацией позволяет предположить, что материнская иммунная система может реагировать на чужеродные антигены в плаценте, конкретно на фетальные клетки. Таким образом, НЬА-ЭРА1 могут участвовать в создании иммунологического барьера, который предотвращает фетальные клетки от попадания в системы матери посредством идентификации клеток и выделения их для разрушения. Если бы клетки, экспрессирующие НЪ, наблюдаемые в экспериментах авторов изобретения, были бы фетального происхождения, НЬА-ЭРА1 могли бы также предотвратить проникновение данных клеток в плаценту, тем самым, защищая плаценту от избыточного продуцирования гемоглобина и свободного гема.
Пример 5. Концентрации гемоглобина и а1-микроглобулина в плазме и моче, антиокисление посредством αι-микроглобулина и плацентарной перфузии ίη νίίΓΟ.
Материалы и способы.
Гемоглобин.
Гемоглобин был приобретен у §1дта. Оксигемоглобин А был получен в лаборатории авторов изобретения следующим образом. Красные кровяные клетки были выделены из 50 мл крови человека посредством центрифугирования (1200хд, 10 мин) и отмыты 4 раза 10 об. забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ§, 10 мМ фосфата, рН 7,4; 120 мМ ЫаС1 и 3 мМ КС1). Затем кровяные клетки были разрушены посредством ресуспендирования в гипотоническом буфере (20 об. Н2О:1 об. РВ§) на льду. Мембраны отделили от цитозоля посредством центрифугирования (14000хд, 20 мин) и супернатант подвергли диализу 3 раза против 15 мМ Трис-НС1, рН 8,0 при 4°С. 200 мл ОЕАЕ-§ерЪапбех А-50 (Атег8Йат Вюкаепсек АВ, Ирр8а1а, Швеция) наносили в колонку и диализированный супернатант вводили в гель и отделяли посредством градиента, состоящего из 15 мМ Трис-НС1, рН 8,0 и 15 мМ Трис-НС1, рН 8,0 плюс 0,2М ЫаС1. Фракции собрали и измерили коэффициент поглощения при 280 нм, 577 нм и 630 нм для того, чтобы идентифицировать и определить концентрацию оксигемоглобина А. Оксигемоглобин Р получали из хордальной крови человека с использованием такого же протокола.
Белки и антитела.
Рекомбинантный человеческий а3-микроглобулин (а3т) экспрессировали в Е.соП, очищали и рефолдировали, как описано [Ктакек е1 а1., 2007]. Кроличий антимышиный иммуноглобулин, кроличий антигемоглобин и свиной антикроличий иммуноглобулин-щелочная фосфотаза (АЬР) были приобретены в Эако (Дания). Мышиные моноклональные антитела против гамма-цепи гемоглобина были приобретены в §айа Сгих Вю1есЬпо1од1е8 1пс. (кат №. кс-21756). Кроличий античеловеческий а3т и козий антикроличий иммуноглобулин были получены соответственно, как описано [Е1Ъа8Ыг е1 а1., 1990, В_)огск е1 а1., 1977]. Моноклональные мышиные антитела против человеческого а1т (ВЫ11.10) были получены, как описано [ВаЫкег-МоПатеб е1 а1., 1991].
Мечение йодом.
Белки были мечены 1251 (Вю-Ыис1еаг АВ, Стокгольм, Швеция) с использованием метода с хлорамином Т [Огееиетооб е1 а1, 1963]. Меченые белки были отделены от свободного иодида посредством фильтрации в геле в колонке ЗерПабех 0-25 (РЭ-10, ОЕ НеаПНсаге). Специфические активности составляли приблизительно 0,3 МБк на 1 мкг белка для αμη и 0,5 МБк на 1 мкг белка для иммуноглобулинов.
Пациентки и сбор образцов.
Образцы плаценток и крови были собраны у женщин, поступивших в больницу Лундского Университета (30 контрольных, 30 РЕ). Отбор образцов проводили с письменного согласия и одобрения Этическим комитетом Наблюдательного Совета. Преэклампсия была определена при артериальном давлении свыше 140/90 мм рт.ст. и протеинурии свыше 0,3 г/л {МЛпе, 2005 #89}. Пациентки только с билатеральной узурацией были отобраны в группу с узурацией без РЕ. После родов извлекали ворсинчатую ткань в виде кубика размерами 10х10х10 мм и немедленно помещали в сухой лед. Образцы хранили при -80°С до момента использования. Образцы крови собирали перед родами и хранили с использованием Рахдепе В1ооб ΡΝΛ §у81ет (01адеп, Валенсия, США) при -20°С до использования. Различные параметры данных групп описаны в табл. 2, стр. 51. В дополнение образцы 10 пациенток и 10 женщин контроля исследования в Танзании были рассмотрены в примерах 5 (см. табл. 1, стр. 20-21).
ЕЬРЗА.
Концентрации гемоглобина А были измерены с использованием сравнительного иммуносорбентного анализа с применением фиксированных ферментов (ЕЫ8А), как описано для твердофазного радиоиммунного анализа (8РЫА) с использованием буферов, процедуры отмывания и периодов инкубирования, как описано [№коп е1 а1., 1986]. Гемоглобин (§1дта) был покрыт при 4 мкг/мл, планшеты отмывали и
- 26 022609 инкубировали со смесью кроличьего антигемоглобина и либо стандартного оксигемоглобина-А или неизвестных образцов, отмытых, инкубированных со свиным-антикроличьим 1дО-АЬР (Пако), отмытым и в завершение инкубированным с субстратом. Соответствующие разбавленные растворы каждой стадии и реагент титровали по отдельности. Коэффициент поглощения считывали при 415 нм (Βίο-Кай Мойе1 550, считывающее устройство для микропланшетов). Объем, используемый для каждой стадии инкубирования, составлял 100 мкл. Все эксперименты проводили с троекратным повторением.
К1А.
Концентрации αρνί определяли посредством радиоиммуноанализа (К1А), как описано [Р1е§иег е1 а1., 1975; АкепЛгот, 1985]. Кратко, козью антисыворотку против человеческого αρΐ'1 (0,2 мл, разв. 1:6000) смешивали с «|Ш, меченным 1251 (0,1 мл, приблизительно 0,05 пг/мл) и неизвестными образцами или стандартными концентрациями ( 1т (0,2 мл). Разбавленные растворы получали в 0,1М фосфата натрия, рН 7,5 плюс 0,1% В8А (К1А буфер). После инкубирования в течение ночи при комнатной температуре (цт, связанный с антителами, осаждали посредством добавления 0,3 мл бычьей сыворотки и 1,6 мл 15% полиэтиленгликоля в К1А буфер, центрифугируя при 1500x0 в течение 40 мин и анализируя активность 1251 осадков в гамма счетчике Аа11ас Αί/агй 1470 (Регкш Е1тег Ы1с §с1еисе8).
Определение концентраций НЬ-Р.
Концентрации гемоглобина Р плазмы определяли посредством Вестерн-блоттинга после извлечения альбумина плазмы с использованием Мойаде А1Ьитт Эер1е1е Κίΐ (са1 по. Ь§КАЭ0024; МйНроге). Кратко, шарики из десяти колонок собирали в одну пробу, промывали РВ§ и разделяли на 50 идентичных аликвот. После центрифугирования супернатант каждой аликвоты сливали и добавляли 40 мкл плазмы (разбавленной 1:1 РВ§) и дважды инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали, супернатант сохраняли, а шарики последовательно отмывали 1 мл 0,1М глицин-НС1, рН 2,3 и 1 мл 0,1М Трис-НС1, рН 8. После центрифугирования и удаления супернатанта добавляли плазму и снова инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования и удаления осадка отделяли 10 мкл, таким образом, альбумин-истощенной плазмы посредством δΌδ-РАОЕ (Т=13,5%; С=3,3%) и подвергали блоттингу с мышиной анти-человечьей γ-цепью НЬ-Р, разбавленной 600х, а затем с кроличьим анти-мышиным 1д (1 мкг/мл) и козьим анти- кроличьим 1дО, меченным 1251, как описано ниже. Количественную оценку гемоглобина Р получали посредством денситометрии положительных полос с использованием программного обеспечения 1таде Оаиде У4.0 (Рир, Токуо, 1арап) и стандартного гемоглобина Р (15 и 75 нг/лунку). Концентрации гемоглобина Р в моче определяли с использованием того же протокола, но исключая стадии с Мойаде А1Ьитт Эер1е1е Κίΐ.
Вестерн блоттинг.
δΌδ-РАОЕ (Т=12%, С=3,3%) выполняли, как описано [ЬаеттИ, 1970]. Гели проходили в восстанавливающих условиях с использованием высокомолекулярного стандарта массы (РатЬо\г тагкегк, АтегкНат Вюкшепсек, ВискшдНаткЫге, Великобритания). Отделенные белки переносили в поливинилидендифторидные (РУОР) мембраны (1ттоЬйоп, МйНроге, ВейГогй, МА, υδΛ), как описано [Ма18ийа1га, 1987]. Затем мембраны инкубировали с соответствующими антителами и проводили Вестерн-блоттинг с использованием вторичных козьих антикроличьих иммуноглобулинов, меченных 1251, как предварительно описано АеЧег е1 а1. [1997], и проявляли изображения на мембранах с использованием системы фосфоизображения Рир РЬА 3000 (Рц)гГНт δ\γейеη АВ, Стокгольм, Швеция).
Экстрагирование ткани плаценты и получение молекул αρνί.
Молекулы, содержащие αρτι, были очищены от ткани плаценты, как описано [Вегддагй е1 а1., 1999]. Приблизительно 200 г человеческой плаценты пациентки с явно нормальным сроком родов, взятой в течение 3 ч после родов, гомогенизировали в 200 мл 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 0,25М сахарозы, 2 мМ ЭДТА, пепстатине 1 мг/л, антипаине 5 мг/л и лейпептине 10 мг/л с использованием устройства РойегЕКеЬ)ет с плотно пригнанным тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 10000 О в течение 10 мин. Данный осадок промывали посредством повторного суспендирования 1:1 в гомогенизационном буфере и рецентрифугирования при 10000 О в течение 10 мин. Супернатант центрифугировали при 100000 О в течение 90 мин. Данный осадок, содержащий мембраны плаценты и белки, связанные с мембраной, растворяли в 40 мл гомогенизационного буфера, также содержащего 0,5% (о/м) Ыоййе1 Р-40 (ВЭН СНетюак), и центрифугировали при 20000 О в течение 30 мин для того, чтобы удалить дисперсный материал. Все стадии выполняли на льду или при 4°С. Проводили иммуносорбентную аффинную хроматографию с моноклональными мышиными анти-арт, ВЫ11.10, фиксированными на АГйде1 Н/ (20 мг/мл) в соответствии с инструкциями производителя (Вю-Кай ЬаЬогаЮйек, Ричмонд, СА, США).
Перфузия плаценты ίη νίΐΐΌ.
На сегодняшний день не существует адекватных животных моделей для РЕ. С целью изучить воздействие свободного гемоглобина авторы изобретения создали модель двусторонней плацентарной перфузии в сотрудничестве с Непйпд δΟιι-κ^Γ ОнлГлгаИ, Германия. Двусторонняя плацентарная перфузия представляет собой стабильную модель для того, чтобы изучать плацентарный кровоток ш νίΙΐΌ ^сНпеМег е1 а1., 1985]. В последнее время модель использовали для того, чтобы имитировать РЕ посредством стимулирования образования ΚΟδ ксантином и ксантиноксидазой [Όί δаηΐο е1 а1., 2007]. Самые
- 27 022609 последние данные авторов изобретения показывают, что плаценты, перфузируемые ксантином, имеют генный профиль, подобный плацентам РЕ.
Человеческая плацента является искусственно перфузированной оксигенированной средой. Как материнское, так и фетальное кровообращение перфузированы (отсюда двусторонняя) с помощью перистальтических насосов. Среду двух отдельных кровотоков контролировали на предмет утечек. Среду и ткань плаценты анализировали вышеуказанной технологией.
Пример 5.1. Уровень гемоглобина А повышен в преэкламптической плазме.
Результаты.
Результаты показаны на фиг. 11-12. Определение концентраций общего гемоглобина плазмы 30 пациенток, страдающих преэклампсией, и 30 контрольных беременностей посредством ЕЫ§Л показало почти двукратное повышение в группе преэклампсии. Среднее значение ± стандартное отклонение у пациенток составило 3,01 ± 0,39 мкг/мл, а в контрольной группе 4,44 ± 1,0. Данное отличие является значимым (Р<0,05).
Пример 5.2. Уровень гемоглобина Р повышен в преэкламптической плазме и моче.
Фетальный гемоглобин плазмы и мочи выявляли Вестерн-блоттингом как 15 кДа полосу, реагирующую с антигамма-цепью. Фиг. 13 показывает пример способа Вестерн-блоттинга, примененного к плазме двух пациенток (РЕ 1 и 2) и двух женщин контроля (контроль 1 и 2). Предел чувствительности способа составлял приблизительно 5 мкг/мл в плазме и 1 мкг/мл в моче. Концентрации НЬ-Р оценивали посредством денситометрии, и табл. 1 показывает частоту встречаемости НЬ-Р в образцах плазмы и мочи у РЕ и контрольных групп. Полоса была видна в плазме 9 пациенток, тогда как ни у одного из контрольных индивидуумов не было положительной реакции. Таким образом, 9 пациенток и ни одна из женщин контроля не имели фетального гемоглобина в плазме более чем 5 мкг/мл. Допуская, что концентрации в плазме у женщин контроля составляли 0,04 мкг/мл, как полагает исследование Титрешеп е! а1. [1992], т.е. нормальная концентрация в плазме, результаты авторов изобретения показывают 125-кратное увеличение фетального гемоглобина у 20% пациенток с РЕ. У 8 пациенток и 2 из контроля моча содержала полосу (табл. 3). Эти два индивидуума контроля были обнаружены среди танзанийских женщин с высокой вероятностью инфекций малярии. Слабая положительная полоса на 67 кДа, наиболее вероятно представляющая альбумин, была видна с равной интенсивностью во всех образцах.
Таблица 3
Частота встречаемости индивидуумов с НЬ-Р в плазме >5 мкг/мл и в моче >1 мкг/мл
Плазма Моча
Преэклампсия Контроль Преэклампсия Контроль
% % % %
19, 6 0 20 5
(9/46) (0/39) (8/40) (2/39)
Пример 5.3. Временная зависимость гемоглобина А и Р плазмы.
Гипоксия является возможным ранним патогенным фактором преэклампсии по причине, например, прерывистой перфузии, ненормльной имплантации или истощения. Гипоксия может активировать экспрессию НЬ-Р как в фетальных, так и в зрелых гемопоэтозных стволовых и клетках предшественниках [Ыатауап е! а1., 2005]. Наряду с повреждением физических барьеров плаценты это может приводить к просачиванию фетальных клеток, а также свободного НЬ-Р в материнское кровообращение между стадией 1 и 2 (см. фиг. 15). По мере прогрессирования заболевания количество будет увеличиваться, что можно наблюдать, как повышение уровней свободного фетального гемоглобина. Когда стенки материнских сосудов повреждаются свободным фетальным гемоглобином, материнские кровяные клетки также будут начинать отмирать. Это будет приводить к повышению уровней свободного материнского гемоглобина, дополнительно раскручивая негативную спираль заболевания. Гипотезой является то, что НЬ-Р предшествует общему НЬ.
Пример 5.4. αμη является повышенным в преэкламптической плазме и моче.
Небольшой белок плазмы и ткани α^-микроглобулин (αμη) представляет собой средство, связывающее гем [Л1Шотп е! а1., 2002; Ьатввоп е! а1., 2004] и акцептор радикалов [Лкегв!гот е! а1., 2007], а форма, разрушающая гем, ί-^т, индуцируется посредством протеолитического подавления Стерминального тетрапептида ЫРК, когда αμη смешивается со свободным гемоглобином [Л1Шотп е! а1., 2002]. Свободный гемоглобин и активные формы кислорода являются причиной повышенного продуцирования αμη в клетках печении и клетках крови [Л1Шотп е! а1., 2002]. Вследствие этого αμη является потенциальным антагонистом гема и гемоглобина, который может защищать от повреждения клетки и соединения тканей, вызываемого гемом и агемоглобином.
По согласованию с данной гипотезой мы обнаружили, что концентрации αμη в плазме и моче пациенток с преэклампсией по сравнению с контрольными беременностями являются повышенными со зна- 28 022609 чением Р<0,01 как для плазмы, так и для мочи (фиг. 15). Средняя концентрация (т в плазме (± СО) у пациенток составляла 19,1 (±5,5) мкг/мл, а в контроле 16,1 (±3,7) мкг/мл. Средняя концентрация (т в моче (±СО) у пациенток составляла 9,4 (±5,5) мкг/мл, а в контроле 5,3 (±4,6) мкг/мл. Данные результаты показывают, что 1) организм отвечает на преэкламптическое поражение посредством повышения продуцирования α.|ΐη. повышая, таким образом, концентрацию в плазме, и 2) гемоглобин, гем, железо и/или КО8 являются составными частями повреждения, поскольку (т регулируется по восходящей в клетках посредством повышения гемоглобина, гема, железа и/или ΚΌ8. Вследствие этого, скорее всего (ут представляет собой защитную реакцию организма против преэкламптического поражения. Следовательно, повышение концентраций (т до даже более высоких уровней, например 32 мкг/мл, что является удвоением нормальной концентрации, должно оказывать антипреэкламптическое воздействие, а (ут, вследствие этого, представляет собой потенциальное лекарство для лечения заболевания.
Пример 5.5. (ут защищает клетки и компоненты тканей посредством антиокисления и связывания гема.
Антиоксидантные свойства α1η проиллюстрированы на фиг. 16 и 17. Сперва было показано, что добавленный внеклеточно α1η может понижать окислительно-восстановительный заряд клеточного цитозоля и тиоловых групп цитозольного белка и ингибировать окисление данных соединений гемом и ΚΌ8. Добавленный внеклеточно α1η также ингибирует лизис клеток (т.е. смерть клеток), вызываемый гемом (фиг. 16). Окислительная модификация коллагена и липопротеинов низкой плотности (ЬОЬ) вовлечена в патогенез многих заболеваний и может также являться мишенью НЬ-индуцированного окисления при преэклампсии. α1η ингибировал гем- и КО8-индуцированное окисление коллагена, ЬПЬ, липидов мембран и целых клеток. α1η также удалял предварительно образовавшиеся продукты окисления коллагена и ЬОЬ (фиг. 17). Возможный механизм данных действий может представлять собой редуктазные свойства α1η, восстанавливая оксиданты, окислительные модификации или и те, и другие.
Для того чтобы изучить механизмы цитопротекторного действия α1η, авторы изобретения провели серии экспериментов для того, чтобы проанализировать взаимодействия между белком и связанным с клеткой гемом. Сперва клетки инкубировали с 10 мкМ гема в течение 30 мин, избыточный гем отмывали и добавляли α1η или контрольные белки в концентрации, равной 2 или 10 мкМ, и инкубировали в течение 2 ч. Культуральную среду сохраняли, клетки отмывали и солюбилизировали и как среду, так и солюбилизированные клетки анализировали посредством спектрофотометрии (фиг. 18А) и визуально (фиг. 18В). Гем был замечен как сильное коричневое окрашивание клеток и типичный спектр поглощения с неотчетливым пиком приблизительно 400 нм. При добавлении α1η гем был почти полностью удален из клеток и вместо этого обнаружился в среде. Контрольный липокалин АОР не оказывал никакого влияния на связанный с клеткой гем. Авторы изобретения предполагают, что уровни свободного гема при преэклампсии могут достигать 10 мкМ и выше, по меньшей мере, локально и что клетки, подвергающиеся токсическим воздействиям свободного гема, включают эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды.
Как описано в некоторых случаях выше, полагают, что окислительные повреждения свободным гемоглобином, свободным гемом и ΚΌ8, производимые автоокислением гемоглобина и гема, составляют основные патологические факторы развития преэклампсии. Коллаген и мембраны клеток эндотелия и цитозоли, конечно, представляют собой важные мишени окислительных повреждений. Результаты данного примера делают вероятным то, что может ингибировать и восстанавливать повреждение, сделанное свободным гемоглобином, гемом и ΚΌ8 также ш νίνο и, следовательно, могут действовать как терапевтическое средство при преэклампсии.
Пример 5.6. Перфузия ш νίίΓο гемоглобина вызывает просачиваемость плаценты и восходящую регуляцию (т.
Преэклампсию изучали с использованием модели перфузии плаценты ш νίίτο с двумя отдельными системами кровообращения, с фетальной и материнской сторонами соответственно. Сначала промывали обе системы кровообращения. Затем плаценту перфузировали в течение 120 мин раствором НЬ-А (2 мкг/мл) с фетальной стороны и в течение 120 мин только буфером с материнской стороны (1-я перфузия) и в течение 120 мин только буфером с обеих сторон (2-я перфузия). Постоянно из обоих кровообращений брали небольшие аликвоты и измеряли концентрации НЬ-А, НЬ-Р и (мп. Как показано на фиг. 19 (левая сторона), НЬ-А быстро появлялся на материнской стороне в процессе 1-ой перфузии и, в меньшей степени, в процессе 2-ой перфузии. Это могло быть результатом просачиваемости или эндогенного продуцирования НЬ-А в ткани плаценты или и того, и другого, (т также появлялся на материнской стороне в течение обоих периодов перфузии фиг. 19 (правая сторона). Это предполагает, что (т продуцируется в ткани плаценты в результате перфузии гемоглобина. В итоге, НЬ-Р появлялся в материнском кровообращении в конце 1-ой перфузии (120 мин), наиболее вероятно, в результате продуцирования в плаценте и просачиваемости в материнское кровообращение.
Таким образом, модель перфузии ш νίίτο может вследствие этого быть использована для изучения воздействия свободного гемоглобина в фетальном кровообращении на функционирование плацентарного
- 29 022609 барьера, защитных воздействий αρπ и защитного клеточного ответа ткани.
Пример 5.7. Новая молекула в плаценте, состоящая из αρπ и гемоглобина, связанных друг с другом. Предварительно было показано, что а1т может воровать гем-группу у гемоглобина при смешивании двух молекул в растворе [А11Ьогп с( а1., 2002; Ьагккоп с( а1., 2004]. Для достижения этого ίη νίνο молекулы гемоглобина и а1т должны быть нужны друг другу. Наличие такой молекулы гемоглобин-αμη было визуализировано в экстрактах плаценты после выделения видов молекул, содержащих а1т, с последующим анализом анти-НЬ блоттингом (фиг. 20). 43 кДа полоса реагирует на антитела против как а1т, так и НЬ-А. Полоса была показана посредством пептидного картирования Ма1б1-М8 на содержание а1т и как альфа-, так и бета-глобиновых цепей (не показано). Размер молекулы предполагает, что каждая молекула состоит из одной цепи αμη и еще одной цепи, которая может являться либо НЬа, или НЬу. Полосу нельзя увидеть после добавления меркаптоэтанола, что указывает на то, что цепи удерживаются вместе посредством дисульфидной связи.
Ссылки
Акегкйот В.Е ΒίοΙ. СЬет. 260 (1985) 4839-4844.
Акегкйот В., МадЬ/а1 С., ХУнИегЬоигп С.С., Кей1е А.Е I. ΒίοΙ. СЬет. 282 (2007) 31493-31503.
А11Ьот М., Вегддагб Т., ШгбЬегд I., 01ккоп М.Ь., Акегкйот Β. В1ооб. 99 (2002) 1894-1901. ВаЬ1кег-МоЬатеб Н., РогкЬегд М., 01ккоп М.Ь., ХУикцик! О., №1коп В.Н.К., ЬодбЬегд Ь., Акегкйот В.
8сапб. I. 1ттипо1. 34 (1991) 655-666.
Вегддагб Т., ЕпдЬЛб ЕЕ, Вабуе δ., 8а1айа С.М., ЬодбЬегд Ь., Акегкйот В. Ат I. Верг. 1ттипо1. 41 (1999) 52-60.
В]огск Ь., С1деп В., Вегддагб В., Ьо\у В., Вегддагб I. 8сапб. I. 1ттипо1. 6 (1977) 1063-1069.
Вгаб1еу Ό.Ε е1 а1. Е Уенгокса 12 (1992) 2288-2302.
Вгокепк ЕЕ, РупепЬогд В., Вгокепк 1.А., Ат I. 0Ьк1е1 Супесо1. 187, 1416 (2002).
СоЬдап ЕЕ. (еб). СиггеШ РгоЮсоЬ ш 1ттипо1оду. \УПеу Шегкаепсе. бе Сгоо1 С.ЕМ., Тау1ог Β.Ν., Аппа1к оГ Мебюше 25, 243 (1993).
Όί 8ап1о 8., 8адег В., Апбгек А.С., СиЬег δ., 8сЬпе1бег Н. Р1асеп(а (2007).
Ооид1ак апб Вебтап, Вг Меб. I. 309 (1994) 1395-1400.
Е1ЬакЬЬ М1., №1коп В., Акеккоп Р., Вргск Ь., Акегкйот, В. I. 1ттипо1. Мебюбк 135 (1990) 171-179. Сгапдег ЕР., А1ехапбег В.Т., ВеппеЬ У.А., КЬаЫ В.А., Ат I. Нурейепк. 14, 1788 (2001).
Сгеепетооб Р.С., Нийег \У.М., С1оуег I. δ. ВюсЬет. I., 89 (1963) 114-123. Напккоп δ.В. е( а1., Мо1.
Нитап ВергобисЬоп, (2005).
Нипд Т.Н., 8керрег ΕΝ., СкагпоскИопек Ό.8., Вийоп С.Е, Снс. Век. 90, 1274 (.Тип 28, 2002).
Куба А., ТатдисЫ К., 8Ьикиуа К. ВюсЫт ВюрЬук Ас1а 175 (1969) 41-48.
1<\\акек А., Октагк Р., А11Ьот М., ЕЫбсрак! А., Акегкйот В., \Уаку1е\ук1б Ζ. Рго1ет Ехрг. РшгГ. 53 (2007) 145-152.
ЬаеттЪ ЦК. №Ыге 227 (1970) 680-685.
Ьагккоп I., А11Ьот М., Акегкйот В. АгсЬ ВюсЬет. ВюрЬук. 432 (2004) 196-204.
Юрйет Н., Ьее С.С., Сгир1 В.8., Ат. I. Етегд. Меб. 21, 223 (Мау, 2003).
Майибана Р. I. Вю1. СЬет. 262 (1987) 10035-10038.
МойегЬт е( а1., Ат I. РЬукю1 269 (1995) 648-655.
Nа^ауаη А.О., Егкек А., СатрЬе11 Т.А., Со1оп О.М., Р1х1еу Εδ., Ζаη^аη^ Ε.Ό. Вг. I. НаетаЮ1. 128 (2005) 562-570.
№1коп В., В_)огск Ь. апб Акегкйот В. I. 1ттипо1. Мебюбк 91 (1986) 275-281.
№Ь1е В.У. I. Вю1. СЬет. 246 (1971) 2972-2976.
О1ккоп М.С., А11Ьот М., 01оГккоп Т., Акегкйот В. Ргее Ваб Вю1 Меб 42 (2007) 842-851.
Раде Е.У., Ат I. 0Ьк1е1 Супесо1. 37, 291 (1939).
Р1екпег Т., Шгдаагб-Ребегкеп В., ВоетксЬ Т. 8сапб I. СЬп. ЬаЬ. 1пуек1 35 (1975) 729-735.
ВоЬейк ЕМ. е( а1., Ат I. 0Ьк1е1 Супесо1. 161, 1200 (1989). ВоЬейк ЕМ., НиЬе1 С.А., Ь-апсе! 354, 788 (8ер 4, 1999). ВоЬейк ЕМ., Соорег ОЛУ., Ь-апсе! 357, 53 (2001). 8сЬпе1бег Н., НисЬ А., СопйгЬ Супесо1 0Ьке 13 (1985) 40.
8Ьеппап А.Н., РокЮп Ь., СЬарре11 Ь.С., 8ееб Р.Т., Еапсе! 357, 1534 (2001/5/12, 2001).
8(еуепк ЕМ., Меб. I. АикЕ 2, 949 (бес 20-27, 1975).
8йеуепк Н.е1 а1., Вг боЬк1е1 Супаесо1. 110, 831 (кер, 2003) 8\ак1ипепко е( а1., I. Вю1. СЬет. 272 (1997)
7114-7121
Тигрешеп и., 8(ептап и-Н. ОеЮгпипабоп оГ Ге1а1 Ьетод1оЬш Ьу бте-геко1уеб штипоПиоготейгс аккау. С1ш. СЬет. 38 (1992) 2013-2018.
ХУбЛегЬоит СС. 0х1байуе геасбопк оГ Ьетод1оЬт. Мебюбк Еп/уток 186 (1990) 265-272.

Claims (34)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение свободного фетального гемоглобина из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего в качестве маркера преэклампсии.
    - 30 022609
  2. 2. Применение по п.1, где неэмбриональный биологический образец представляет собой образец крови, образец плазмы, образец мочи или образец ткани плаценты.
  3. 3. Применение по п.1 или 2, где беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина плазмы повышена приблизительно в 20 раз или более по сравнению с нормальной концентрацией фетального гемоглобина в плазме.
  4. 4. Применение по любому из предыдущих пунктов, где беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина плазмы составляет приблизительно 0,5 мкг/мл или более.
  5. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, где беременная особь млекопитающего считается страдающей преэклампсией или имеющей повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация фетального гемоглобина мочи составляет приблизительно 0,06 мкг/мл или более.
  6. 6. Способ диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии:
    ί) получение неэмбрионального биологического образца от беременной особи млекопитающего, ίί) измерение уровня свободного фетального гемоглобина в указанном биологическом образце и ίίί) сравнение уровня свободного фетального гемоглобина в образце со средним уровнем свободного фетального гемоглобина в образцах контрольной группы, включающей беременные особи млекопитающих, у которых не диагностирована преэклампсия в качестве контрольного значения, где повышенный уровень свободного фетального гемоглобина в образце относительно контрольного значения указывает на наличие преэклампсии или риска развития преэклампсии.
  7. 7. Способ диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии:
    ί) получение неэмбрионального биологического образца от беременной особи млекопитающего, ίί) измерение уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в указанном биологическом образце и ίίί) сравнение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образце с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в образцах контрольной группы, включающей беременные особи млекопитающих, у которых не диагностирована преэклампсия в качестве контрольного значения, где повышенное значение указанного соотношения в образце относительно контрольного значения указывает на наличие преэклампсии или риска развития преэклампсии.
  8. 8. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий стадии:
    ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где повышенный уровень свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии, а уменьшение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.
  9. 9. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий стадии:
    ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где повышенное соотношение между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на прогрессирование преэклампсии, а уменьшение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на регрессию преэклампсии.
  10. 10. Способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий стадии:
    ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего перед лечением или в момент времени ί1, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у той же беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени ΐ2, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где уменьшение уровня свободного фетального гемоглобина во втором образце в сравнении с уровнем свободного фетального гемоглобина в первом образце указывает на то, что лечение эффективно для излечения преэклампсии.
  11. 11. Способ оценки эффективности лечения преэклампсии, включающий стадии:
    - 31 022609
    ί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина в первом биологическом образце, взятом у беременной особи млекопитающего перед лечением или в момент времени !1, ίί) измерения уровня свободного фетального гемоглобина и уровня общего свободного гемоглобина во втором биологическом образце, взятом у той же беременной особи млекопитающего в более поздний момент времени ΐ2, и ίίί) сравнения значений, измеренных на стадиях ί) и ίί), где уменьшение соотношения между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина во втором образце в сравнении с соотношением между уровнем свободного фетального гемоглобина и уровнем общего свободного гемоглобина в первом образце указывает на то, что лечение эффективно для излечения преэклампсии.
  12. 12. Способ по любому из пп.6-11, где биологический образец представляет собой образец крови, образец плазмы, образец мочи или образец ткани плаценты.
  13. 13. Способ по любому из пп.6-12, где уровень свободного фетального гемоглобина измеряют посредством измерения уровня гамма-цепи гемоглобина (Ή>γ) в образце.
  14. 14. Способ по любому из пп.6, 8 и 10, где уровень свободного фетального гемоглобина измеряют с использованием иммунологического анализа.
  15. 15. Способ по любому из пп.7, 9 и 11, где уровень свободного фетального гемоглобина и/или общего свободного гемоглобина измеряют с использованием иммунологического анализа.
  16. 16. Способ по п.14 или 15, где анализом является ЕЬКА.
  17. 17. Способ по любому из пп.6-13, где уровень свободного фетального гемоглобина определяют посредством измерения РНК свободного фетального гемоглобина.
  18. 18. Способ по п.17, где уровень измеряют, используя ПЦР в режиме реального времени.
  19. 19. Способ по любому из пп.6-18, где млекопитающим является человек.
  20. 20. Применение набора для обнаружения свободного фетального гемоглобина в способе, определенном в любом из пп.6-19, где набор содержит:
    ί) твердую поверхность, покрытую одним или несколькими антителами или их иммунореактивными фрагментами, которые специфично связываются со свободным фетальным гемоглобином из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего, ϊϊ) компонент для обнаружения образования комплекса антиген-антитело и ίίί) инструкции по применению.
  21. 21. Применение по п.20, где набор дополнительно содержит компоненты для измерения концентрации общего гемоглобина в образце.
  22. 22. Применение по п.21, где компоненты, необходимые для измерения концентрации общего гемоглобина в образце, включают:
    ί) одно или несколько антител или их иммунореактивный фрагмент, который специфично связывается с общим гемоглобином из выделенного неэмбрионального биологического образца беременной особи млекопитающего, ϊϊ) средство для обнаружения образования комплекса антиген-антитело.
  23. 23. Применение по любому из пп.20-22, где указанная твердая поверхность ί) является одной или несколькими лунками планшета для микротитрования.
  24. 24. Применение по любому из пп.20-23, где антитело или фрагмент антитела ί) являются специфичными для альфа-цепи гемоглобина, бета-цепи гемоглобина, дельта-цепи гемоглобина, гамма-цепи гемоглобина или его иммуногенного пептида, фрагмента или эпитопа.
  25. 25. Применение по любому из пп.20-24, где указанное антитело ί) является моноклональным или поликлональным антителом.
  26. 26. Применение по п.25, где указанное антитело получают из кроликов.
  27. 27. Применение по любому из пп.20-26, где антитело является антителом, меченым ферментом, таким как, например, антитело, меченое щелочной фосфатазой.
  28. 28. Применение по п.27, где средство для обнаружения образования комплекса антиген-антитело содержит свиное антитело против кроличьего 1дО-щелочная фосфатаза.
  29. 29. Применение по любому из пп.20-28, где набор дополнительно содержит серии стандартных разведений гемоглобина в сосудах, готовые для применения.
  30. 30. Применение по п.20 в проведении ЕЫ§А типа сэндвича.
  31. 31. Применение по п.30, где набор содержит:
    ί) твердую поверхность, покрытую моноклональным или поликлональным антителом, специфичным к НЬ-γ, и ίί) антигемоглобин-АЬР кролика.
  32. 32. Набор для применения в способе по любому из пп.6-19, содержащий средства для определения мРНК фетального гемоглобина в биологическом образце беременной особи млекопитающего.
  33. 33. Набор по п.32, содержащий средство для проведения ЕЫ8А типа сэндвича и содержащий твер- 32 022609 дую поверхность, покрытую моноклональным или поликлональным антителом, специфичным к НЪ-γ.
  34. 34. Набор по п.33, дополнительно содержащий антигемоглобин-АЬР кролика.
EA200970758A 2007-02-12 2008-02-12 Применение свободного фетального гемоглобина в качестве маркера преэклампсии EA022609B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0700339 2007-02-12
PCT/EP2008/001051 WO2008098734A1 (en) 2007-02-12 2008-02-12 Diagnosis and treatment of preeclampsia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970758A1 EA200970758A1 (ru) 2010-02-26
EA022609B1 true EA022609B1 (ru) 2016-02-29

Family

ID=39295873

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500335A EA031877B1 (ru) 2007-02-12 2008-02-12 Применение альфа-1-микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии
EA200970758A EA022609B1 (ru) 2007-02-12 2008-02-12 Применение свободного фетального гемоглобина в качестве маркера преэклампсии

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500335A EA031877B1 (ru) 2007-02-12 2008-02-12 Применение альфа-1-микроглобулина для профилактики или лечения преэклампсии

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8568999B2 (ru)
EP (3) EP2614832B1 (ru)
JP (2) JP5604111B2 (ru)
KR (2) KR101608501B1 (ru)
AU (1) AU2008214837B2 (ru)
BR (1) BRPI0808340A2 (ru)
CA (1) CA2674204C (ru)
DK (2) DK2111555T3 (ru)
EA (2) EA031877B1 (ru)
ES (2) ES2599003T3 (ru)
HR (2) HRP20130809T1 (ru)
HU (1) HUE031613T2 (ru)
MX (2) MX2009008408A (ru)
NZ (1) NZ578077A (ru)
PL (2) PL2614832T3 (ru)
PT (2) PT2614832T (ru)
WO (1) WO2008098734A1 (ru)
ZA (1) ZA200905101B (ru)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009008408A (es) 2007-02-12 2009-11-02 Stefan Hansson Diagnosis y tratamiento de preeclampsia.
JP5694928B2 (ja) * 2008-07-18 2015-04-01 エー１エム ファーマ エービーＡ１Ｍ Ｐｈａｒｍａ ＡＢ ラジカルスカベンジャー及び抗酸化剤アルファ−１−ミクログロブリンの医薬的使用
WO2011095981A1 (en) * 2010-02-03 2011-08-11 St. John's Research Institute An in-vitro method for characterizing hemoglobin variant
NZ602733A (en) * 2010-03-24 2014-03-28 Preelumina Diagnostics Ab Hbf and a1m as early stage markers for preeclampsia
JP5914326B2 (ja) * 2010-03-31 2016-05-11 積水メディカル株式会社 イムノクロマトグラフィーを利用した測定方法、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ及びイムノクロマトグラフィー用測定試薬キット
EP2766726A1 (en) 2011-10-14 2014-08-20 Aarhus Universitet Diagnostic and prognostic use of prombp-complexes
EP2900254B1 (en) * 2012-09-05 2016-08-03 A1M Pharma AB Alpha-1-microglobulin for use in the treatment of mitochondria-related diseases
US10928402B2 (en) 2012-12-28 2021-02-23 Nx Prenatal Inc. Treatment of spontaneous preterm birth
US20140186332A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 NX Pharmagen Biomarkers of preterm birth
US20180074070A1 (en) 2015-03-16 2018-03-15 A1M Pharma Ab Biomarkers for preeclampsia
KR101732933B1 (ko) 2015-07-29 2017-05-08 영남대학교 산학협력단 신생아의 성장 또는 심혈관계 질환 예후 진단 방법
WO2017096405A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Nx Prenatal Inc. Use of circulating microparticles to stratify risk of spontaneous preterm birth
CA3089655A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US11418353B2 (en) * 2019-08-26 2022-08-16 Micron Technology, Inc. Security descriptor generation
CN111626280B (zh) * 2020-04-13 2021-09-07 北京邮电大学 一种无定位点答题卡识别方法和装置
WO2024053586A1 (ja) * 2022-09-05 2024-03-14 栄研化学株式会社 遊離ヘモグロビン測定試薬、遊離ヘモグロビン測定方法および抗ヘモグロビン抗体

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1337778A1 (ru) 1984-06-25 1987-09-15 Новосибирский государственный медицинский институт Способ диагностики т жести позднего токсикоза беременных
US5079171A (en) 1988-09-15 1992-01-07 Adeza Biomedical Corporation Determining pregnancy induced hypertension and eclampsia by immunoassay of cellular fibronectin
US5238819A (en) 1988-12-14 1993-08-24 The Regents Of The University Of California Diagnostic assay for the detection of preeclampsia
US5939272A (en) 1989-01-10 1999-08-17 Biosite Diagnostics Incorporated Non-competitive threshold ligand-receptor assays
US5108898A (en) 1989-01-18 1992-04-28 Peters John H Use of fibronectin having a variable included type III repeat sequence as a marker for toxemia in pregnancy
US5612034A (en) * 1990-10-03 1997-03-18 Redcell, Inc. Super-globuling for in vivo extended lifetimes
US5166133A (en) 1991-04-17 1992-11-24 Cetus Corporation Method for inhibing adhesion of white blood cells to endothelial cells
US6103691A (en) 1994-03-23 2000-08-15 Tschesche; Harald Utilisation of angiogenin and/or α1 -microglobulin and/or complement factor D in order to inhibit the secretion of proteins
US5849474A (en) * 1995-12-06 1998-12-15 Olson; Camilla M. Diagnosis of preeclampsia in mammals
US5910482A (en) * 1996-03-19 1999-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Treatment or prevention of preeclampsia, eclampsia with calcitonin gene related peptide, CGRP analog, progestational agent, nitric oxide source, and cyclooxygenase inhibitor
US6169816B1 (en) * 1997-05-14 2001-01-02 Applied Imaging, Inc. Identification of objects of interest using multiple illumination schemes and finding overlap of features in corresponding multiple images
JP2001348342A (ja) 2001-04-12 2001-12-18 Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd 免疫調整・抗炎症剤
ATE458199T1 (de) 2001-05-04 2010-03-15 Biosite Inc Diagnostische marker der akuten koronaren syndrome und ihre verwendungen
ES2284911T3 (es) 2001-09-04 2007-11-16 Iq Corporation B.V. Determinacion y cuantificacion de poblaciones de globulos rojos en muestras.
JPWO2003083479A1 (ja) * 2002-03-29 2005-08-04 松下電器産業株式会社 血液処理方法、血液処理デバイス、ヘモグロビン類測定方法およびヘモグロビン類測定デバイス
DE10237423A1 (de) 2002-08-16 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verwendung von LCK-Inhibitoren für die Behandlung von immunologischen Erkrankungen
JP5624256B2 (ja) * 2003-06-20 2014-11-12 ラプター・ファーマシューティカル・インコーポレイテッド 脳および他の組織への治療化合物の送達
AR045074A1 (es) 2003-07-23 2005-10-12 Applied Research Systems Uso de cd164 soluble en desordenes inflamatorios y autoinmunes
EP1689386A1 (en) * 2003-11-26 2006-08-16 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Tubular proteinuria as an indicator for elevated cardiovascular risk
WO2005093413A2 (en) 2004-03-22 2005-10-06 Yale University Diagnosis and treatment of preeclampsia
US20070292421A1 (en) * 2005-07-28 2007-12-20 Feinberg Bruce B Method for treating preeclampsia
GB0600916D0 (en) 2006-01-17 2006-02-22 Perkinelmer Instr Las Inc detecting and predicting pre-eclampsia
CA2636353A1 (en) * 2006-01-18 2007-07-26 Georg Wick Test systems for the analysis of polypeptides and cells adhering to silicones
MX2009008408A (es) 2007-02-12 2009-11-02 Stefan Hansson Diagnosis y tratamiento de preeclampsia.
WO2009108073A1 (en) 2008-02-28 2009-09-03 Auckland Uniservices Limited Biomarkers for prediction of preeclampsia and/or cardiovascular disease
JP5694928B2 (ja) 2008-07-18 2015-04-01 エー１エム ファーマ エービーＡ１Ｍ Ｐｈａｒｍａ ＡＢ ラジカルスカベンジャー及び抗酸化剤アルファ−１−ミクログロブリンの医薬的使用
NZ602733A (en) 2010-03-24 2014-03-28 Preelumina Diagnostics Ab Hbf and a1m as early stage markers for preeclampsia

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI H. ET AL.: "Flow Cytometry-Based Minisequencing: A New Platform for High-Throughput Single-Nucleotide Polymorphism Scoring" GENOMICS, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, US, vol. 66, no. 2, 1 June 2000 (2000-06-01), pages 135-143, XP004439348 ISSN: 0888-7543 abstract page 136, column 1 - column 1 *
COTTON FREDERIC ET AL.: "Evaluation of a capillary electrophoresis method for routine determination of hemoglobins A2 and F" CLINICAL CHEMISTRY, vol. 45, no. 2, February 1999 (1999-02), pages 237-243, XP002477877 ISSN: 0009-9147 abstract *
HOLZGREVE W. ET AL.: "Fetal cells in cervical mucus and maternal blood" BAILLIERE'S BEST PRACTICE AND RESEARCH. CLINICAL OBSTETRICS AND GYNAECOLOGY, BAILLIERE TINDALL, LONDON, GB, vol. 14, no. 4, 2000, pages 709-722, XP008081646 ISSN: 1521-6934 abstract page 714, paragraph 2 page 717, paragraph 4 - page 719, paragraph 1 *
HUBEL CARL A. ET AL.: "Decreased transferrin and increased transferrin saturation in sera of women with preeclampsia: Implications for oxidative stress" AMERICAN JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY, vol. 175, no. 3 PART 1, 1996, pages 692-700, XP009099272 ISSN: 0002-9378 abstract *
LAFFERTY JOHN D. ET AL.: "Evaluation of a dual hemoglobin A(2)/A(lc) quantisation kit on the bio-rad variant II automated hemoglobin analyzer". ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE DEC 2002, vol. 126, no. 12, December 2002 (2002-12), pages 1494-1500, XP002477878 ISSN: 0003-9985 abstract *
OMU ALEXANDER E. ET AL.: "Connection between human leucocyte antigens D region and T helper cytokines in preeclampsia". ARCHIVES OF GYNECOLOGY AND OBSTETRICS, vol. 269, no. 2, January 2004 (2004-01), pages 79-84, XP002478038 ISSN: 0932-0067 abstract page 84, column 1, paragraph 2 *
PEPPLE D.J. ET AL.: "Fetal haemoglobin level in pre-eclampsia". THE WEST INDIAN MEDICAL JOURNAL MAR 2006, vol. 55, no. 2, March 2006 (2006-03), page 130, XP000999220 ISSN: 0043-3144 the whole document *
RAYMAN MARGARET P. ET AL.: "Abnormal iron parameters in the pregnancy syndrome preeclampsia" AMERICAN JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY, vol. 187, no. 2, August 2002 (2002-08), pages 412-418, XP002477876 ISSN: 0002-9378 abstract; table 2 page 417, column 1, paragraph 6 - column 2, paragraph 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA200970758A1 (ru) 2010-02-26
US8568999B2 (en) 2013-10-29
NZ578077A (en) 2012-04-27
EP2614832A1 (en) 2013-07-17
ZA200905101B (en) 2012-01-25
PT2111555E (pt) 2013-09-04
BRPI0808340A2 (pt) 2017-05-30
EP2111555B1 (en) 2013-05-29
PL2111555T3 (pl) 2013-10-31
HUE031613T2 (en) 2017-09-28
KR101608501B1 (ko) 2016-04-04
US20140065170A1 (en) 2014-03-06
AU2008214837A1 (en) 2008-08-21
CA2674204C (en) 2017-07-11
PT2614832T (pt) 2016-10-18
HRP20161266T1 (hr) 2016-12-16
PL2614832T3 (pl) 2017-01-31
ES2599003T3 (es) 2017-01-31
AU2008214837B2 (en) 2013-01-10
EP2111555A1 (en) 2009-10-28
US20180284087A1 (en) 2018-10-04
KR101454013B1 (ko) 2014-11-12
EP2614832B1 (en) 2016-07-13
MX347788B (es) 2017-05-12
JP2010518386A (ja) 2010-05-27
MX2009008408A (es) 2009-11-02
CA2674204A1 (en) 2008-08-21
US20100105070A1 (en) 2010-04-29
DK2614832T3 (da) 2016-10-31
DK2111555T3 (da) 2013-09-02
HRP20130809T1 (en) 2013-10-11
ES2426069T3 (es) 2013-10-21
US10359406B2 (en) 2019-07-23
JP5792772B2 (ja) 2015-10-14
KR20140095572A (ko) 2014-08-01
EP2613150A1 (en) 2013-07-10
EA031877B1 (ru) 2019-03-29
KR20100015315A (ko) 2010-02-12
EA201500335A1 (ru) 2016-08-31
JP2014012670A (ja) 2014-01-23
JP5604111B2 (ja) 2014-10-08
WO2008098734A1 (en) 2008-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022609B1 (ru) Применение свободного фетального гемоглобина в качестве маркера преэклампсии
King et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta
Guesdon et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.
JP4457191B2 (ja) 子癇前症および糖尿病の診断および処置に関する材料および方法
JPWO2005038457A1 (ja) 多量体アディポネクチンの分別測定方法
Agunanne et al. Marinobufagenin levels in preeclamptic patients: a preliminary report
Swan et al. Decorin expression is decreased in human idiopathic fetal growth restriction
Giovanni et al. Carbonic anhydrase I reduction in colonic mucosa of patients with active ulcerative colitis
US20230176073A1 (en) Assays and methods for targeted treatment of hydrosalpinx
KR102077987B1 (ko) 신장 질환 진단용 바이오 마커
Zhang et al. Complement component C4A and apolipoprotein AI in plasmas as biomarkers of the severe, early-onset preeclampsia
Matuszek et al. Haptoglobin elutes from human atherosclerotic coronary arteries—a potential marker of arterial pathology
Han et al. Expression of ammonia transporter family members, Rh B glycoprotein and Rh C glycoprotein, in the developing rat kidney
Yamashita et al. Massive platelet‐rich thrombus formation in small pulmonary vessels in amniotic fluid embolism: An autopsy study
US6300088B1 (en) Method of detecting prostate specific antigen
WO2023235487A1 (en) Methods relating to diagnosing stability following renal transplantation
Rhodes Biochemical and physiological properties of Tamm-Horsfall glycoprotein from cats and sheep
Langfur A Novel Assay for Serum Ferritin
POSTON et al. Pancreatic Society of Great Britain and Ireland

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU