EA019599B1 - Method for diagnosis of melanoma of a human based on determination of phf 10 gene expression level, diagnostic kit - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a method for diagnosis of melanoma of a human based on determination of PHF 10 gene expression level in patient cells, wherein the reduced PHF 10 gene expression level in sample cells of morphologically tumor tissue compared to that in sample cells of morphologically normal tissue proves the presence of melanoma in a patient. There is also disclosed a kit for carrying out diagnosis of melanoma in a patient comprising at least two pairs of primers, specific to the PHF 10 gene, and, at least, a pair of control primers.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области генной диагностики, в частности к диагностике меланомы с использованием олигонуклеотидов.The present invention relates to the field of genetic diagnosis, in particular to the diagnosis of melanoma using oligonucleotides.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Меланома является трудно диагностируемым заболеванием с плохим прогнозом и широким распространением в мире. В настоящее время ведутся активные поиски биологических маркеров меланомы.Melanoma is a poorly diagnosed disease with a poor prognosis and widespread worldwide. Active searches are currently underway for biological markers of melanoma.

В одном из исследований сыворотку больных меланомой и здоровых людей исследовали с целью идентификации белковых маркеров меланомы с помощью серологического протеомного подхода. Небольшое количество белков клеток 0361, разделенных с помощью двумерного гель-электрофореза и перенесенных на мембрану, инкубировали с сывороткой пациентов. Позитивные сигналы, которые взаимодействовали более чем с 5 образцами сыворотки, идентифицировали с помощью световой массспектрофотометрии. Было обнаружено 12 положительных сигналов и определено 5 белков: эукариотический фактор-2 элонгации (ЕЕЕ2), энолаза-1 (ΕΝΟ1), альдолаза (ΑΕΌΟΑ), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа (0ΑΡΌΗ) и гетерогенный ядерный рибонуклеотид (ΗΝΒΝΡ) А2В1. мРНК четырех белков (ЕЕЕ2, ΕΝΟ1, ΑΕΌΟΑ и ΗΝΚΝΡ А2В1) интенсивно экспрессировались в клетках 0361 по сравнению с меланоцитами. мРНК ЕЕЕ2, ΕNΟ1 и ΑΕΌΟΑ также часто экспрессировались в других культурах клеток меланомы (8ι.ιζι.ι1<ί Α., 1)хика Α., Коттуата М., Ките Α., Та1 8., ΟΙΜιίΙα С., Кигики Α., №1капшга Α., Уатото1о Α., Υ;·ιιη;·ιζ;·ι1<ί Ν., УккЫкауа 8., Кгуобата Υ., Αίάναιηα Υ. 1бепйГ1сайоп о! Ме1апота Αηΐί^ηδ Ик1пд а 8ето1од1са1 Рто1еоте Αρρ^оасй. Сапсег Оепот1ск Рго1еот1ск. 2010. 7(1):17-23).In one study, the serum of melanoma patients and healthy people was examined to identify protein markers of melanoma using a serological proteomic approach. A small amount of protein 0361 cells, separated by two-dimensional gel electrophoresis and transferred to the membrane, were incubated with the serum of patients. Positive signals that interacted with more than 5 serum samples were identified using light mass spectrophotometry. 12 positive signals were detected and 5 proteins were determined: eukaryotic elongation factor-2 (EEE2), enolase-1 (ΕΝΟ1), aldolase (ΑΕΌΟΑ), glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (0ΑΡΌΗ) and heterogeneous nuclear ribonucleotide (ΗΝΒΝΡ) A2B1. The mRNA of four proteins (EEE2, ΕΝΟ1, ΑΕΌΟΑ and ΗΝΚΝΡ A2B1) were intensively expressed in 0361 cells compared to melanocytes. mRNA EEE2, ΕNΟ1 and ΑΕΌΟΑ were also often expressed in other melanoma cell cultures (8ι.ιζι.ι1 <ί Α., 1) hika Α., Cottuata M., Kite Α., Ta1 8., ΟΙΜιίΙα S., Kigiki Α. , No. 1 Kapshga Α., Uatoto1o Α., Υ; · ιιη; · ιζ; · ι1 <ί Ν., UkkYkaua 8., Kguobata Υ., Αίάναιηα Υ. 1beepy1sayop about! Ме1апота Αηΐί ^ ηδ Ик1пд and 8ето1од1са1 Рто1еота Αρρ ^ оасй. Sapseg Oepot1sk Rgo1eot1sk. 2010.7 (1): 17-23).

Возникновение злокачественных опухолей обычно является следствием утраты контроля за интегрированностью генома, что приводит к его злокачественным изменениям. Сравнительная геномная гибридизация (СОН) является методом, который может быть осуществлен на ДНК из фиксированных тканей для определения полного генома на предмет изменения количества копий ДНК. Анализ по методу СОН позволил определить, что меланома отличается от невусов наличием часто повторяющихся хромосомных аберраций (Ваиег 1, Вак1а1п ВС. В1к1тдшкЫпд те1апосуйс пеу| Ггот те1апота Ьу ΌΝΑ сору питЬег сбапдек: сотратабуе депотю йуЬп^айоп ак а гекеагсб апб б1адпокИс 1оо1. Оегта1о1оду Тбегару. 2006. 19:40-49).The occurrence of malignant tumors is usually a consequence of the loss of control over the integration of the genome, which leads to its malignant changes. Comparative genomic hybridization (SON) is a method that can be performed on DNA from fixed tissues to determine the complete genome for changes in the number of DNA copies. Analysis by the SON method allowed us to determine that melanoma differs from nevus in the presence of frequently repeated chromosomal aberrations (Waier 1, Bacterium b. 2006. 19: 40-49).

С развитием наследственной меланомы ассоциирован ген ингибитора клеточного цикла ί.'ΌΙ<Ν2Α (р161М<4а1р11а). Было показано, что в спорадических меланомах происходят изменения уровня экспрессии р16. Проведены иммуногистохимические исследования с целью изучения ассоциации экспрессии р16 с клеточной пролиферацией, опухолевой пролиферацией и выживаемостью пациентов. Обнаружено, что для первичных опухолей характерно отсутствие окрашивания белка р16. Также отсутствие экспрессии р16 обнаружено и в метастазах. Отсутствие/минимальное окрашивание ядра по р16 позволяет предсказывать низкую выживаемость пациентов (81таите О., 8\Иапб Ь., Αккеη ΕΑ. Ьокк оГ пис1еаг р16 рто1еш ехргеккюп сотте1а!ек \\Й11 тстеакеб 1итог се11 ртоИГетабоп (К1-67) апб роог ртодпобк ш райеШк \\Й11 уетйса1 дтоМй рбаке те1апота.С11шса1 Сапсег Кекеагсб. 2000. 6:1845-1853).With the development of hereditary melanoma, the cell cycle inhibitor gene ί.'ΌΙ <Ν2Α (р161М <4а1р11а) is associated. It has been shown that changes in p16 expression level occur in sporadic melanomas. Immunohistochemical studies were conducted to study the association of p16 expression with cell proliferation, tumor proliferation, and patient survival. It was found that the primary tumors are characterized by the absence of staining of p16 protein. Also, the lack of p16 expression was also found in metastases. The absence / minimal staining of the nucleus for p16 allows us to predict low patient survival (81taite O., 8 \ Iapb b., Αkkeη ΕΑ. Bokk og pis1eag p16 rt1esh exrgekkup sotte1a! Ek \\ Y11 tsteakeb 1tog se11 rtogetobopt rbogtpod rb1-67 sh raiShk \\ Y11 yetisa1 dtMy rbake te1apota.S11shsa1 Sapseg Kekeagsb. 2000.6: 1845-1853).

Эпигенетический контроль динамики хроматина в процессе синтеза ДНК, репликации и репарации является фундаментальным для правильной последовательности клеточной пролиферации. Фактор-1 сборки хроматина (ί.ΆΕ-1) действует как главный регулятор этого процесса. Как было показано, его субъединица р60 является новым пролиферативным и прогностическим маркером для нескольких типов опухолей. С помощью иммуногистохимического метода, выполненного на парафиновых срезах первичной меланомы, было показано, что СΑΡ-1/р60 усиленно экспрессируется во всех изучаемых образцах (130 образцов), что позволяет рассматривать его как новый прогностический маркер для меланомы (Максо1о М., УессЫопе М.Ь., 11агб1 О., 8са1уе1Ш М., Мо1еа О., Όί Вепебейо М., Мщпек Ь., 81апо М., Ое Кока О., 81а1Ьапо 8. Ονе^еxр^екк^оη оГ Сйтотайп ΑккетЬ1у Еас1ог- 1/р60 бе1рк 1о ртебю! 1йе ртодпобк оГ те1апота райейк. ВМС Сапсег. 2010. 24:63-69).Epigenetic control of chromatin dynamics during DNA synthesis, replication, and repair is fundamental to the correct sequence of cell proliferation. Chromatin assembly factor-1 (ί.ΆΕ-1) acts as the main regulator of this process. As shown, its p60 subunit is a new proliferative and prognostic marker for several types of tumors. Using the immunohistochemical method performed on paraffin sections of primary melanoma, it was shown that CΑΡ-1 / p60 is strongly expressed in all studied samples (130 samples), which allows us to consider it as a new prognostic marker for melanoma (Maxso M., Wesseope M. B., 11agb1 O., 8ca1ue1Sh M., Mo1ea O., Όί Vepebeio M., Mschpek b., 81apo M., Oe Koka O., 81a1bapo 8. Ονе ^ exp ^ ekk ^ оη оГ Sitotayp Kkket1u Ес1ог-1 / p60 be1rk 1o rtebyu! 1st rtodpobk oG te1apota rayeyk. Navy Sapseg. 2010. 24: 63-69).

Полноразмерный М1ТЕ-М (ассоциированный с микрофтальмией транскрипционный фактор М) и кДНК его сплайс-варианта были клонированы из клеток меланомы 624те1 с помощью ОТ-ПЦР. Его экспрессию исследовали с помощью обычной ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в нормальных меланоцитах (ЫНЕМ), в клеточных линиях меланомы, в образцах тканей меланомы, в крови здоровых доноров и в клеточных линиях опухолей, отличных от меланомы. Был идентифицирован новый сплайс-вариант, названный М1ТЕ-Мбе1, который широко экспрессировался в меланоцитах, клеточных линиях и тканях меланомы, но полностью отсутствовал в немеланомных клеточных линиях и в крови здоровых доноров. Обе изоформы значительнее экспрессируются в тканях меланомы по сравнению с другими клеточными линиями (^апд Υ., КабГаг 8., Ьш 8., К1кег Α.Ε., Кбопд Н.Т. МйГ-Мбе1, а поуе1 те1апосу!е/те1апотакресШс 1коГогт оГ т1сгорййа1т1а-аккос1а1еб йапкспрбоп Гас1ог-М, ак а сапб1ба!е Ыотаткет Гог те1апота. ВМС Мебкте. 2010. 8:14-20).The full-sized M1TE-M (transcription factor M associated with microphthalmia) and its splice variant cDNA were cloned from 624te1 melanoma cells using RT-PCR. Its expression was studied using conventional PCR and quantitative RT-PCR in normal melanocytes (INHEM), in melanoma cell lines, in melanoma tissue samples, in the blood of healthy donors, and in tumor cell lines other than melanoma. A new splice variant was identified, called M1TE-Mbe1, which was widely expressed in melanocytes, cell lines and melanoma tissues, but was completely absent in non-melanoma cell lines and in the blood of healthy donors. Both isoforms are more significantly expressed in melanoma tissues compared to other cell lines (^ apd., KabGag 8., bsh 8., K1keg Α.Ε., Kbopd N.T. MyG-Mbbe1, and bye1 te1apos! E / te1apotacres 1coGogt OG t1sgoryya1t1a-akos1a1eb yapksprbop Gas1og-M, aka sapbba! e Yotatket Gog te1apota. Naval Forces. 2010. 8: 14-20).

В одном из исследований проводили флуоресцентную т кйи гибридизацию на невусах слизистой оболочки глаза и меланомах. Были использованы зонды к 6р25 (ККЕВ1), 6с.|23 (МТВ), 11д13 (ΟΟΝΌ1) и центромере 6 (СЕР6). Хромосомные перестройки были выявлены только в меланомах (Викат К., Еапд Υ., Л1апк\\аг 8.С., Ри1йает М.Р., Магг В., ΑЬ^аткоη Ό.Η. О1кйпсйоп оГ соп)ипсйуа1 те1апосуйс пеу| Ггот те1апотак Ьу Диогексепсе ш кйи йуЬ^^б^ζайоη. 1оитпа1 Си1апеоик Ра1йо1оду. 2010. 37:196-203).In one study, fluorescence tissue hybridization was performed on the nevi of the eye mucosa and melanomas. Probes were used for 6p25 (KKEV1), 6s. | 23 (MTV), 11d13 (ΟΟΝΌ1) and centromere 6 (SER6). Chromosomal rearrangements were detected only in melanomas (Vikat K., Eapd Υ., L1apk \\ ag 8.S., Riayayet M.R., Magg V., Αb ^ atkoη Ό.Η. O1kpsyop oG sop) ipsyuya teapapuys peu | Ggot te1apotak b Diogeksepse sh kyi bj ^^ b ^ ζãoη. 1oitpa1 si1apeoik ra1yo1odu. 2010.37: 196-203).

- 1 019599- 1 019599

Ранее белок 8ОХ-9 рассматривали только как регуляторный белок, который играет роль в дифференцировке мезенхимальных клеток в хондроциты. В настоящее время к его функциям относят и регуляцию транскрипции в ходе меланогенеза. Была проанализирована экспрессия 8ОХ-9 на срезах метастазирующей меланомы и проведено сравнение с 3 используемыми маркерами меланоцитов (МАКТ-1, антигеном НМВ-45 и белком 8-100). Опухоли, негативные по двум или трем маркерам, были позитивны по 8ОХ-9. Было показано, что 8ОХ-9 экспрессируется практически во всех меланомах (Као Р., Ри11ег 6.Ν., Рпе1о ν.6. Ехргеккюп оГ 8ОХ-9 ίη Ме1ак1а6с Ме1апота-А Ро1еп11а1 Э1адпок11с ΡίίίαΙΙ. Лтепеап 1онгпа1 Эегта1ора1йо1оду. 2010. 1: 16-21).Previously, the 8OX-9 protein was considered only as a regulatory protein, which plays a role in the differentiation of mesenchymal cells into chondrocytes. Currently, its functions include the regulation of transcription during melanogenesis. We analyzed the expression of 8ОХ-9 on sections of metastatic melanoma and compared with 3 used markers of melanocytes (MAKT-1, HMB-45 antigen, and protein 8-100). Tumors negative for two or three markers were positive for 8OX-9. It has been shown that 8ОХ-9 is expressed in almost all melanomas (Cao R., Pu11eg 6.Ν., Pn1o ν.6. Exrgekup оГ 8ОХ-9 ίη Ме1ак1а6с Ме1апота-А Ро1п11а1 Э1adпок11с ΡίίίαΙΙ. 16-21).

Также было показано, что в развитие рака вовлечена аберрантная экспрессия хроматинремодулирующего комплекса 8\νΐ/8ΝΡ. Обнаружено, что 8ΝΡ5, основная субъединица комплекса 8^Ι/8ΝΡ, участвует в регуляции клеточной дифференцировки, контроле клеточного цикла и апоптоза. С помощью иммуногистохимических методов изучали экспрессию 8ΝΡ5 в диспластических невусах, первичных меланомах и метастатических меланомах. Оказалось, что экспрессия 8ΝΡ5 в меланомах значительно редуцирована по сравнению с таковой в невусах. Таким образом, 8ΝΡ5 является важным маркером развития меланомы (Ьт Н., \Уопд К.Р., Майтка М., Ь1 6. Ьокк оГ 8ΝΡ5 ехргеккюп еотте1а1ек \\йй роог раБеп1 кшУ1уа1 ίη те1апота. Сйп. Сапсег Кекеагсй. 2009. 15:6404-6411).It was also shown that aberrant expression of the chromatin-modulating complex 8 \ νрем / 8ΝΡ is involved in the development of cancer. It was found that 8ΝΡ5, the main subunit of the 8 ^ Ι / 8ΝΡ complex, is involved in the regulation of cell differentiation, control of the cell cycle and apoptosis. Using immunohistochemical methods, 8–5 expression was studied in dysplastic nevi, primary melanomas, and metastatic melanomas. It turned out that 8–5 expression in melanomas was significantly reduced compared with that in nevi. Thus, 8–5 is an important marker for the development of melanoma (Lt. N., Wopd K.R., Maitka M., L1 6. Lokk OG 8ΝΡ5 exrgekkup eotte1a1ek \\ nd roGep1 kshU1ua1 ίη te1apota. Syp. Sapseg Kekerags. : 6404-6411).

Регуляция клеточного цикла имеет большое значение в развитии опухоли. Это послужило основанием для проведения исследования взаимосвязи изменения уровня экспрессии циклина Ό1, р14, СИК4 и ВВ с пролиферацией опухолевых клеток и прогрессированием опухоли. Иммуногистохимическим методом было выявлено, что в опухолевых клетках происходит усиление экспрессии этих белков (Вайтапп Ι.Μ., 8йаите О., Акк1еп Ь.А. АЙегеб ехргеккюп оГ се11 сус1е гещйаЮгк Сусйп Ό1, р14, р16, СИК4 апб КЬ т поби1аг те1апотак. ΝΤ 1оигпа1 Опсо1оду. 2004. 25(6): 1559-1565).The regulation of the cell cycle is of great importance in the development of the tumor. This served as the basis for the study of the relationship of changes in the level of expression of cyclin Ό1, p14, CIC4 and BB with tumor cell proliferation and tumor progression. An immunohistochemical method was found that the expression of these proteins is enhanced in tumor cells (Waitapp Ι.Μ., 8th. O., Akkep, A.A. ΝΤ 1oigpa1 Opto1odu. 2004.25 (6): 1559-1565).

В одном из исследований с помощью иммуногистохимических методов был изучен профиль экспрессии белков, участвующих в апоптозе, регуляции клеточного цикла, транскрипции и репарации ДНК. Было обнаружено, что белки 8-100, НМВ45, те1ап А, специфические циклины (циклин А, циклин Ό1, циклин Ό3), белки клеточного цикла КВ, рКВ, НЭМ-2, К1-67, Сус Ό3, белок апоптоза сурвивин, транскрипционный фактор 8ТАТ-1, белок репарации ДНК МЬН-1 характеризуются более высоким уровнем экспрессии в меланомах по сравнению с таковым в невусах, тогда как уровень экспрессии белков клеточного цикла Сус Ό1, СИК2, СЭК6, р16, р27, мембранного рецептора С-ΚΙΤ, транскрипционных факторов РКСВ, МИМ-1 в меланомах ниже (А1опко 8., ОгБх Р., Ро11ап М., Регех-Сотех В., 8апсйех Ь., Асипа М., Ра)агек К., Майтех-Те11о Р., Нойе1апо С., Ршк М., Кобпдиех-РеггаЮ ί. Ртодтеккюп ш сШапеоик тайдпап1 те1апота 1к аккос1а1еб \\йй б1к!1пс1 ехргеккюп ргоГПе. Атепсап 1оигпа1 оГ Ра!йо1оду. 2004. 164: 193203).In one study, immunohistochemical methods were used to study the expression profile of proteins involved in apoptosis, cell cycle regulation, transcription and DNA repair. It was found that proteins 8-100, HMB45, te1ap A, specific cyclins (cyclin A, cyclin Ό1, cyclin Ό3), cell cycle proteins KB, pKV, NEM-2, K1-67, Cyc Ό3, survivin apoptosis protein, transcriptional factor 8ТАТ-1, DNA repair protein МНН-1 are characterized by a higher level of expression in melanomas compared to that in nevi, whereas the expression level of cell cycle proteins Сс Ό1, СИК2, СЭК6, р16, р27, membrane receptor С-ΚΙΤ, transcriptional factors RKSV, MIM-1 in melanomas below (A1opko 8., OgBh R., Po11ap M., Regeh-Soteh V., 8apsyekh L., Asipa M., Ra) a ek K. Mayteh-TE11 R. Noye1apo S. Rshk M. Kobpdieh-Reggan ί. Ртодтеккюп с с Шапейик тидпап1 т1апота 1к акосос1а1еб \\ й й б1к! 1пс1 exgegkkup РГГГе. Atepsap 1oigpa1 oG Ra! Iod1odu. 2004.164: 193203).

Первичные меланомы исследовали методом микромассивов кДНК. Было показано, что в меланомах изменен уровень экспрессии 174 генов. Среди них гены белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла (СК82, СЭС2. ССИВ1. СЕИРР. ИНРК) и митоз (НСАР-С, 8ТК6), ингибирующих (В1КС5) и стимулирующих (СРК105) апоптоз, регулирующих репликацию ДНК (ТОР2А, ККМ2, ТУМ8, РСЫА, МСМ4, МСМ6), изменяющих уровень экспрессии в ответ на стресс (СЬКХ2, ОКАЗАЙ Н8РА4, Н8РА5, Н8РИ1, ТХМР), передающих сигнал внутри клетки (8ТМЫ2), ингибирующих сигнальный путь \Уп1 (СТЫХВ1Р1), ингибирующих экспрессию М1ТР (ЕМХ2), регулирующих протеолиз СТЛА), подавляющих метастазирование (ХМЕ1) (ХУтперепшпскх V., йахаг V., М1сй1е1к 8. е1 а1. Сепе ехргеккюп ртоййпд оГ рптагу сШапеоик те1апота апб сйшса1 оШсоте. Зонгпа1 №111 Сапсег 1пкй 2006. 98:472-482).Primary melanomas were investigated using cDNA microarrays. It was shown that in melanomas the expression level of 174 genes was changed. Among them are the genes of proteins involved in the regulation of the cell cycle (CK82, SES2. SSIV1. SEIRP. INRK) and mitosis (NSAP-S, 8TK6), inhibiting (B1KS5) and stimulating (CPK105) apoptosis that regulate DNA replication (TOR2A, KKM2 TUM8, RSIA, MCM4, MCM6), which alter the expression level in response to stress (CXX2, PROCESS H8PA4, H8PA5, H8PI1, TXMP), transmit a signal inside the cell (8TMY2), inhibit the signal pathway \ Yp1 (STYXB1P1), inhibit the expression of MTP EMX2), regulating the proteolysis of STLA), inhibiting metastasis (XME1) (Khuterepshpskh V., yahag V., M1sy1e1k 8. e1 a1. Sepe exrgek . Wn rtoyypd Og rptagu sShapeoik te1apota APB syshsa1 oShsote Zongpa1 №111 Sapseg 1pky 2006. 98: 472-482).

Методом микромассивов кДНК, Вестерн-блот анализа, количественной ПЦР в режиме реального времени было показано, что в линиях клеток меланомы происходит снижение уровня транскрипции генов, участвующих в развитии, таких как М1ТР, ЕИХКО, ИСТ и ТУК, и увеличение уровня транскрипции генов, участвующих во взаимодействии с клеточным окружением, таких как РЕАИК, VСЛN, Н1Ра (беГГк А.К., С1оует А.С., 81оЬЬе ЬЭ., \Уапд И., Не 8., Нах1е11 ТА., Атак!й А., \Уоо11еу А.С., Магкйа11 Е.8., .Токерй ^.К., Рпп1 С.С., Вади1еу В.С., Есс1ек М.К. А депе ехргеккюп кщпаШге оГ шуаыуе ро!еп11а1 ш те1ак1аБс те1апота се11к. РЬокОпе. 2009. 4(12):е8461).Using cDNA microarrays, Western blot analysis, and real-time quantitative PCR, it was shown that melanoma cell lines decrease the level of transcription of genes involved in development, such as M1TP, EIHCO, IST and TUK, and increase the level of transcription of genes involved in interaction with the cellular environment, such as REAIK, VСЛN, Н1Ра (bGGK A.K., C1ouet A.S., 81bbе L.E., \ Wapd I., He 8., Hah1e11 TA., Attack! A., \ Uoo11eu A.S., Magkya11 E.8., .Tokery ^ .K., Rpp1 S.S., Wadi1eu V.S., Ess1ek M.K. And depe exgekkup kschpaShge oG shuayue ro! Ep11a1 sh te1ak1 abs te1apota se11k.RokOpe. 2009.4 (12): e8461).

С использованием микромассивов кДНК из образцов рака прямой кишки было показано, что у больных изменена экспрессия 8 генов, кодирующих белки 1ТСВ2, МКР8И, №К1, ТХХЬ2, РНР10, РК888, КСМО 1АК3. Уровень экспрессии РНК измеряли методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. (СауаИеп Ό., Ио1ата Р., М1ш Е., Бисен С., Сайадшш С., Той 8., Мас1ас.| К., Эе Р1йрро С., №ЬШ 8., Мотдапй М., №1роК С., Тошш С., Васаш М., Вщдеп А., ТопеШ Р., Vа1аζаηο К., Ог1апбо С., Се1ш1ш 8., С1апсй1 Р., Меккепш Ь., БиххаНо Ь. Апа1ук1к оГ депе ехргеккюп ртоГбек теуеа1к поуе1 соггейДюпк \νίΐ1ι 1йе сйшса1 соигке оГ со1огес1а1 сапсег. Опсо1оду Кекеагсй. 2007. 16:535-548).Using cDNA microarrays from samples of colorectal cancer, it was shown that the expression of 8 genes encoding proteins 1TCB2, MKP8I, No.K1, TXXL2, PHP10, PK888, and KSMO 1AK3 was changed in patients. The level of RNA expression was measured by RT-PCR in real time. (SauaIep Ό., Ioata R., M1sh E., Bisen S., Sayadshsh S., Toy 8., Masl. | K., Ee P1yroro S., No. LS 8., Motdap M., No. 1roK S., Toshsh S., Vasash M., Vschdep A., Topesh R., Va1aζaηο K., Og1appbo S., Se1sh1sh 8., S1apsy1 R., Mekkeps b., Bikhkho But. syssa1 k oigke oG s1oges1a1 sapseg. Opsoodu Kekeagsy. 2007.16: 535-548).

Было показано, что ингибирование пути 1АК-8ТАТ приводит к ингибированию роста раковых клеток и к их апоптозу (ВготЬегд, Т, апб Иатпей, ί. Е., 1т. Тйе го1е оГ 8ТАТк ш йапкспрЦопа1 соп1го1 апб 1йе1г нпрас! оп се11и1аг Гипсбоп. Опсодепе, 2000. ν.19:2468-2473; Сабей-Ра1сопе К., ИаЙоп ^.8., апб 1оуе К. 8ТАТ рго1етк ак поуе1 1агде1к Гог сапсег 1йегару. 81дпа1 йапкбисег апб асбуаЮг оГ йапкспрБоп. Снггеп! Орт. Опсо1оду, 1999. 11: 490-496; Во^тап, Т. Сагаа К., Тигккоп I., апб 1оуе К. 8ТАТк т опсодепещк. Опсодепе, 2000. 19: 2474-2488; Ьт Т. 8., Майа_)ап, 8., апб Ргапк, И.А. 8ТАТ к1дпа1тд т 1йе ра1йодепек1к апбIt has been shown that inhibition of the 1AK-8TAT pathway leads to inhibition of the growth of cancer cells and their apoptosis (Wroteb, T, apb Iatpei, E., 1t. Thyelophilicus 8thlytanthynchylanthylorrhea. , 2000. 11: 490-496; Vo ^ tap, T. Sagaa K., Tigkop I., apb 1ou K. 8TATk t opsodepischek. Opsodepe, 2000. 19: 2474-2488; Lt T. 8., Maya_) ap, 8 ., apb Rgapk, I.A. 8TAT k1dpa1td t 1ye ra1yodepek1k apb

- 2 019599- 2 019599

1гса1шсп1 οί 1еикеш1а8. Опсодепе, 2000. 19: 2496-2504). При этом ингибирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ в нормальных фибробластах хотя и вызывает прекращение роста клеток, но не вызывает их апоптоз. Одно из объяснений этого эффекта заключается в том, что раковые клетки становятся необратимо связанными с работой пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ для поддержания своего существования, в то время как в нормальной клетке ингибирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ просто приводит к ее выходу из митотического цикла. Таким образом, ингибиторы пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ приводят к гибели только раковых клеток, что делает их важным потенциальным средством терапии опухолей.1gsa1shsp1 οί 1eikesh1a8. Osodepe, 2000.19: 2496-2504). Moreover, the inhibition of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway in normal fibroblasts, although it causes the cessation of cell growth, does not cause their apoptosis. One explanation for this effect is that cancer cells become irreversibly linked to the functioning of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway to maintain their existence, while in a normal cell, inhibition of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway simply leads to its exit from the mitotic cycle. Thus, inhibitors of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway lead to the death of only cancer cells, which makes them an important potential treatment for tumors.

Также были обнаружены селективные ингибиторы тирозинкиназ, что дает возможность воздействовать на первый этап пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ. Было показано, что подавление функции ΙΆΚ-киназы приводит к гибели клеток миеломы, рака предстательной и молочной желез и т.д. Тем не менее, недостатком ингибирования тирозинкиназ является неспецифичность этого воздействия. Кроме 1ΑΚ-8ΤΑΤ, оно влияет и на многие другие пути и, таким образом, может негативно влиять и на нормальные клетки.Selective tyrosine kinase inhibitors have also been discovered, which makes it possible to act on the first step of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway. It was shown that suppression of the function of ΙΆΚ kinase leads to the death of myeloma cells, prostate and breast cancer, etc. However, the lack of tyrosine kinase inhibition is the non-specificity of this effect. In addition to 1ΑΚ-8ΤΑΤ, it affects many other paths and, thus, can negatively affect normal cells.

Более специфическим является репрессирование пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ с помощью ингибирования экспрессии белков 8ΤΑΤ. Так, было показано, что воздействие на экспрессию 8ΤΑΤ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводит к блокированию роста и жизнеспособности клеток ряда опухолей (Ер1шд-Вигпейе, Ρ.Κ., Ыи 1. Н., СаЙе11-Ра1сопе, е! а1. 1п1иЬйюп οί 8ΤΑΤ3 81дпа11пд 1еабк ΐο ορορίοδίδ οί 1еикет1с 1агде дгапи1аг 1утр1юсу1е8 апб бесгеакеб Мс1-1 ехргеккюп. Ιοί-ΐη-κΕ С1йпс 1пуе8Йда1юп8. 2001. 107: 351-362). Ингибирование 8ΤΑΤ с помощью белкового ингибитора (доминантно-негативный вариант 8ΤΑΤ) приводит к ингибированию роста опухоли и ее регрессии. Хотя только 15% опухолевых клеток были транформированы доминантно-негативным вариантом 8ΤΑΤ, результатом воздействия была массовая гибель клеток меланомы.More specific is the repression of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway by inhibiting the expression of 8ΤΑΤ proteins. Thus, it was shown that the effect on the expression of 8ΤΑΤ with the help of antisense oligonucleotides leads to blocking the growth and viability of cells of a number of tumors (Ep1shd-Wigpeye, H.P., Li 1. N., Cae11-Ra1sope, e! A1. 1p1uyyup οί 8ΤΑΤ3 81dpa11fd 1eabk ΐο ορορίοδίδ οί 1eiket1s 1a where dgapi1ag 1utr1yusu1e8 apb besgeakeb Ms1-1 exrgekkup. Ιοί-ΐη-κΕ S1yps 1pu8ydayyup1yyp 35. Inhibition of 8ΤΑΤ using a protein inhibitor (dominant negative variant 8ΤΑΤ) leads to inhibition of tumor growth and its regression. Although only 15% of the tumor cells were transformed with a dominant-negative variant of 8ΤΑΤ, the result of the exposure was a massive death of melanoma cells.

Новый транскрипционный фактор эукариот РНР10, открытый и охарактеризованный в ИБГ РАН (Ν.Ε. Vο^οЬуеνа, Ν.ν. 8ο8йπ^кονа, 1.Ь. Κиζт^ηа, М.В. ^раШ^уа, IV. N^кο1еηкο. Ε.Ν. НпЫгосНкта, 8.С. Сеο^д^еνа. апб Υ.ν. 8Εί61ον8Κίί. Τίκ ηονе1 геди1аГОг οί теίаζοаη беуеФртеп! 8ЛУР ο^даπ^ζе8 а пис1еаг тоасбгаЮг 8ире^сοтр1еx. Се11 Сус1е. 2009. 8: 2152-2156), является регулятором клеточного цикла и взаимодействует с путем 1ΑΚ-8ΤΑΤ. Учитывая, что нарушение работы генов пути 1ΑΚ-8ΤΑΤ в клетках человека связано с развитием различных злокачественных новообразований, в частности меланом, было сделано предположение о том, что вероятность образования меланомы значительно увеличивается при возникновении мутации гена РНР10.A new transcription factor of eukaryotes RNP10, discovered and characterized in the IBG RAS (Ν.Ε. Vο ^ οЬуеνа, Ν.ν. 8ο8йπ ^ кονа, 1.Ь. Κиζт ^ ηа, M.V. ^ раШ ^ уа, IV. N ^ Könénkö. Ε.Ν. пЫЫосостаНк,,, 8., 8.S. 8: 2152-2156), is a regulator of the cell cycle and interacts with the path 1ΤΑΤ-8ΤΑΤ. Considering that the disruption of the function of the 1ΑΚ-8ΤΑΤ pathway genes in human cells is associated with the development of various malignant neoplasms, in particular melanoma, it was suggested that the likelihood of melanoma formation increases significantly when a mutation of the PHP10 gene occurs.

Белок РНР10 входит в состав комплекса 8νΐ/8ΝΡ, ремоделирующего хроматин. В пролиферирующих нервных стволовых клетках, а также их предшественниках РНР10 в составе этого комплекса регулирует промоторы генов компонентов сигнальных путей, таких как ΝοΚίκ 8НН (1. Ьеккагб, II. ^и, 1.Л. Вишкй, М. ^ап, М.М. \V^η81ο\ν. Β.Τ. 81ааЫ, Н.^и, В. ΑеЬе^8ο1б. Ι.Α. СгаеГ, С.В. СгаЫгее. Ап еккепшй 8\\йс11 1п киЬипй сοтрο8^ί^οη οί а сйготабп ^етοбе1^ηд оттр1ех бшгпд пеига1 беуеФртепк №игоп. 2007. 55: 201-215). Эти сигнальные пути играют большую роль в развитии организма, отвечают за правильную дифференцировку клеток и тканей. Как только нервная стволовая клетка начинает дифференцироваться, РНР10 в комплексе 8\νΐ/8Νί заменяется другой субъединицей. Экспрессия РНР10 полностью не прекращается, но в дифференцированных клетках значительно снижена. В большом количестве РНР10 содержится и в других пролиферирующих клетках, например в иммортализованных фибробластах человека. Выключение РНР10 с помощью РНК-интерференции приводило к уменьшению пролиферативной способности этих клеток, что доказывает важную функцию РНР10 в правильном росте клеток (8.8. Вапда, Ь. Репд, Т. Эа8дир1а, V. Ра1е_)теа1а, Н.Ь. Охег. РНР10 ίκ гецштеб Γογ се11 р^ο1^ίе^аί^οη ш 1югта1 апб 8V40-^ттο^ιа1^ζеб йитап ВЬгоЫак! се11к. СуГОдепебс апб дегюте гекеагсй. 2009. 126: 227-242). Также было показано, что изменение экспрессии РНР10 коррелирует с ростом опухолевых клеток рака желудка. В частности, уменьшение количества РНР10 приводило к апоптозу этих клеток ш νίίτο и ш νίνο. После выключения же РНР10 происходило повышение индукции каспазы-3, важнейшего модулятора апоптоза. РНР10 локализуется на промоторе каспазы-3 и ингибирует его, являясь репрессором экспрессии каспазы3 (М. Vе^. В. Ыи, 1. Ь1 е! а1. А ηονе1 р1ап! йοтеοбοта^η йпдег 10 -теб1а!еб аηΐ^арοрΐοΐ^с тесйашкт ίπνο1νшд гергеккюп οί сакраке-3 ш дак!г1с сапсег се11к. Мο1еси1а^ Сапсег таегареийск. 2010. 9:1764-1774).Protein PHR10 is part of the complex 8νΐ / 8ΝΡ, remodeling chromatin. In proliferating nerve stem cells, as well as their precursors, PHP10 in this complex regulates the promoters of the genes of signaling pathway components, such as 8HN (1. Ekkagb, II. ^ And, 1.L. Vishky, M. ^ ap, M.M. . \ V ^ η81ο \ ν. Β.Τ. 81aaY, N. ^ u, V. ΑеЬе ^ 8ο1б. Ι.Α. СгаеГ, S.V. СгаЫгее. Upkeep 8 \\ ys11 1n kiipy sotr88 ί ^ οη οί а сиготабп ^ etoobe1 ^ ηd ottr1ekh bshgpd peiga1 beuFrtepk no. 2007. 55: 201-215). These signaling pathways play a large role in the development of the body and are responsible for the proper differentiation of cells and tissues. As soon as the nerve stem cell begins to differentiate, PHP10 in the 8 \ νΐ / 8Νί complex is replaced by another subunit. The expression of PHP10 does not completely stop, but in differentiated cells is significantly reduced. A large number of PHR10 is also found in other proliferating cells, for example, in immortalized human fibroblasts. Turning off PHR10 via RNA interference led to a decrease in the proliferative ability of these cells, which proves the important function of PHP10 in the proper cell growth (8.8. Wapda, L. Repd, T. Ea8dir1a, V. Pa1e_) tea1a, N. L. Oheg. PHR10 ίκ general staff γ се се 11 11 11 11 11 11 11 11 11 ί ί ί ί юг юг юг юг ап ап ап ап!!!!!!!!! se11k. Sugodepebs apb debut geekages. 2009.126: 227-242). It was also shown that a change in the expression of PHR10 correlates with the growth of tumor cells of gastric cancer. In particular, a decrease in the amount of PHP10 led to apoptosis of these cells w νίίτο and w νίνο. After turning off RNP10, there was an increase in the induction of caspase-3, the most important modulator of apoptosis. RNP10 is localized on the caspase-3 promoter and inhibits it, being a repressor of caspase expression3 (M.Ve ^. V. Yi, 1. b1 e! A1. And ηονе1 р1ап! Йееобота ^ η ипд 10 10-бе1а! Еб аηΐ ^ ароррΐοΐ tesyashkt ίπνο1νшд гергеккюп οί сакраке-3 sh dak! g1s sapseg se11k. Mο1esi1a ^ Sapseg taegareisk 2010. 9: 1764-1774).

РНР10 содержит два РНЭ-домена, которые также называются ассоциированными с лейкозом доменами.PHP10 contains two RNE domains, which are also called leukemia-associated domains.

Таким образом, изменение экспрессии РНР10 негативно влияет на нормальный рост клеток, а снижение количества РНР10 приводит к разбалансировке и нарушению нормального функционирования клеток. Это позволило авторам настоящего изобретения предположить, что изменение экспрессии РНР10 может служить диагностическим критерием состояния, при котором у пациента имеет место нарушение клеточного деления, в частности злокачественной опухоли, например меланомы.Thus, a change in the expression of PHR10 negatively affects the normal growth of cells, and a decrease in the number of PHP10 leads to an imbalance and disruption of the normal functioning of cells. This allowed the authors of the present invention to suggest that a change in the expression of PHR10 can serve as a diagnostic criterion for the condition in which the patient has a violation of cell division, in particular a malignant tumor, such as melanoma.

- 3 019599- 3 019599

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена РНР10 в клетках пациента, предусматривающему следующие стадии:Thus, the present invention relates to a method for the diagnosis of human melanoma based on determining the level of expression of the PHR10 gene in patient cells, comprising the following steps:

а) получение у пациента с подозрением на меланому образцов морфологически опухолевой и нормальной тканей;a) obtaining from a patient with suspected melanoma samples of morphologically tumor and normal tissue;

б) выделение мРНК из клеток указанных образцов;b) the selection of mRNA from cells of these samples;

в) синтез кДНК на матрице указанной мРНК;C) the synthesis of cDNA on the matrix of the specified mRNA;

г) проведение количественной ПЦР на матрице полученной кДНК с использованием по меньшей мере двух пар праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одной пары контрольных праймеров;g) conducting quantitative PCR on the matrix of the obtained cDNA using at least two pairs of primers specific for the PHR10 gene and at least one pair of control primers;

д) интерпретация полученных данных об уровне экспрессии гена РНР10 в клетках пациента таким образом, что сниженный уровень экспрессии гена РНР10 в клетках образца морфологически опухолевой ткани по сравнению с таковым в клетках образца морфологически нормальной ткани свидетельствует о наличии у пациента меланомы.e) the interpretation of the obtained data on the level of expression of the PHP10 gene in the patient's cells in such a way that a reduced level of expression of the PHP10 gene in the cells of the morphologically tumor tissue sample compared to that in the cells of the morphologically normal tissue sample indicates the presence of melanoma in the patient.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для диагностики меланомы человека, содержащему по меньшей мере две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одну пару контрольных праймеров и необязательно содержащему другие компоненты для проведения диагностики.In addition, the present invention relates to a kit for the diagnosis of human melanoma, containing at least two pairs of primers specific for the PHP10 gene, and at least one pair of control primers and optionally containing other components for diagnostic purposes.

Другие компоненты для проведения диагностики меланомы человека, которые могут входить в состав набора, например, могут включать в себя отличные от праймеров реагенты, необходимые для проведения количественной ПЦР, такие как буфер для ПЦР, дезоксинуклеотидтрифосфаты, флуоресцентный краситель (например, 8ΥΒΚ-6ΚΕΕΝ х100) и полимераза Тад с горячим стартом.Other components for the diagnosis of human melanoma, which may be part of the kit, for example, may include reagents other than primers necessary for quantitative PCR, such as PCR buffer, deoxynucleotide triphosphates, fluorescent dye (for example, 8ΥΒΚ-6ΚΕΕΝ x100) and Tad polymerase with a hot start.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения две пары праймеров, специфичных к гену РНЕ10, могут представлять собой РНЕ-1_£от, РНЕ-1_геу, РНЕ-2_£от и РНЕ-2_геу. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения пара контрольных праймеров может представлять собой НорМ_£от и НорМ_гсу.According to a preferred embodiment of the present invention, two pairs of primers specific for the PHE10 gene can be PHE-1_ £ from, PHE-1_geu, PHE-2_ £ from and PHE-2_geu. In accordance with one embodiment of the present invention, the pair of control primers may be Norm__ from and Norm_gs.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

На фиг. 1 приведены кривые амплификации. При обработке результатов использовались данные достижения кривыми порогового значения, установленного на уровне 0,025. Проекция точки пересечения кривых с пунктиром на ось абсцисс в каждом случае соответствует значению е(1).In FIG. 1 shows the amplification curves. When processing the results, we used the data on the achievement by the curves of the threshold value set at 0.025. The projection of the intersection point of the curves with the dashed line on the abscissa axis in each case corresponds to the value of e (1).

На фиг. 2 проиллюстрированы уровни экспрессии РНЕ10, измеренные методом количественной ПЦР на праймерах РНЕ-1. В качестве контроля использовали материал невусов и мышечной ткани. По оси ординат отложены значения уровней экспрессии РНЕ10 относительно уровня экспрессии нормировочного (контрольного) гена актина в процентах. Из фигуры наглядно видна разница между уровнями экспрессии РНЕ10 в клетках различных меланом, уровнями экспрессии в клетках доброкачественных невусов и уровнем экспрессии в клетках мышечной ткани.In FIG. Figure 2 illustrates the levels of expression of PHE10 measured by quantitative PCR on the pHE-1 primers. The material used was nevi and muscle tissue as a control. The ordinates show the levels of expression of PHE10 relative to the expression level of the normalization (control) actin gene in percent. The figure clearly shows the difference between the levels of expression of PHE10 in cells of various melanomas, the levels of expression in benign nevi cells and the expression level in muscle tissue cells.

На фиг. 3 проиллюстрированы уровни экспрессии РНЕ10, измеренные методом количественной ПЦР на праймерах РНЕ-2. В качестве контроля использовали материал невусов и мышечной ткани. По оси ординат отложены значения уровней экспрессии РНЕ10 относительно уровня экспрессии нормировочного (контрольного) гена актина в процентах. Из фигуры наглядно видна разница между уровнями экспрессии РНЕ10 в клетках различных меланом, уровнями экспрессии в клетках доброкачественных невусов и уровнем экспрессии в клетках мышечной ткани.In FIG. Figure 3 illustrates the levels of expression of PHE10 measured by quantitative PCR using the PHE-2 primers. The material used was nevi and muscle tissue as a control. The ordinates show the levels of expression of PHE10 relative to the expression level of the normalization (control) actin gene in percent. The figure clearly shows the difference between the levels of expression of PHE10 in cells of various melanomas, the levels of expression in benign nevi cells and the expression level in muscle tissue cells.

Описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретенияDescription of specific embodiments of the present invention

Пример 1. Конструирование праймеров для амплификации методом количественной ПЦР.Example 1. Design of primers for amplification by quantitative PCR.

Для определения уровня экспрессии гена человека РНЕ10 в нормальных и злокачественных клетках были сконструированы олигонуклеотидные последовательности для их последующего использования в амплификации методом количественной ПЦР.To determine the level of expression of the human PHE10 gene in normal and malignant cells, oligonucleotide sequences were constructed for their subsequent use in amplification by quantitative PCR.

Конструирование проводили с помощью программы Усе1ог ΝΤΙ Циуйгодеи, США).The construction was carried out using the program Usilog и Tsiuigodey, USA).

В результате для дальнейшего анализа были выбраны пары праймеров, указанные в табл. 1.As a result, for further analysis, the primer pairs specified in Table 1 were selected. one.

Таблица 1Table 1

Название Title Последовательность Sequence Температура отжига Annealing temperature РНР-1_£ог PHP-1_ £ og 5’-ССОО<ЗААСССАТООААОАААО 5’-SSOO <ZAASSSATOOAAOAAAO 63°С 63 ° C ΡΗΡ-1_Γβν ΡΗΡ-1_Γβν 5 ’ -САСС АТСАСТОТСТАОАОСАОСОАОС 5 ’-CASS ATSASTOTSTAOAOOSAOOSAOOS 63°С 63 ° C рнг-2Дог rng-2dog 5 ’-ССАОССААОАСАО АААТСААААСАС 5 ’-CAOOSSAAOASAO AAATSAAAASAS 63°С 63 ° C РНР-2_геу PHP-2_geu 5 ’-ССАТТОТСАТАТССАООСААОААОО 5 ’-ССАТТОТСАТАТССАООАААААОО 63°С 63 ° C Норм_Гог Norm_Gog 5 ’-<ЗСАСАТСАОА<ЗСАСгСОАТТААСС 5 ’- <ЗСАСАТСАОА <ЗСАСгСОАТТААСС 63°С 63 ° C Норм_геу Norm_geu 5 ’-СЮАОТОАТТТСАОССАССААОТС 5 ’-SUAOOTOATTTSAOOSSASSAAOTS 63°С 63 ° C Ро!уА Ro! UA 5’-ТТТТТТТТТГТТТТТТТТТТ 5’-TTTTTTTTTGTTTTTTTTTT

- 4 019599- 4 019599

Праймеры РНЕ-1 и РНЕ-2 отжигаются на разные фрагменты транскрипта РНЕ10: РНЕ-1 в районе 720, и длина продукта составляет 228 п.н.; РНЕ-2 в районе 1100, и длина продукта составляет 233 п.н. Для достоверной оценки количества РНЕ10 в тканях необходимо проводить ПЦР в режиме реального времени с обеих пар праймеров и результаты обсчитывать относительно нормировочных (контрольных) праймеров (НорМ_Гог, НорМ_геу) отдельно.Primers RNE-1 and RNE-2 are annealed to different fragments of the RNE10: RNE-1 transcript in the region of 720, and the product length is 228 bp; RNE-2 in the region of 1100, and the product length is 233 bp For a reliable estimate of the amount of PHE10 in tissues, it is necessary to perform real-time PCR from both pairs of primers and calculate the results relative to the normalization (control) primers (NormMGog, NormM_geu) separately.

В качестве нормировочных (контрольных) были использованы праймеры к транскрипту гена ΕΝΥ2, экспрессия которого постоянна в разных типах клеток и тканей на разных стадиях развития и клеточного цикла.As normalization (control) primers were used for the transcript of gene ΕΝΥ2, the expression of which is constant in different types of cells and tissues at different stages of development and the cell cycle.

Пример 2. Проведение амплификации методом количественной ПЦР.Example 2. Amplification by quantitative PCR.

Выделение мРНК из культур клеток меланомы, полученных от пациентов ΙΙΙ-ΐν стадий меланомы (примерно из 5 млн. клеток каждой линии: меланома 1Ь, меланома МЕ, меланома Р, меланома С, меланома КОВ) и тканей (объемом ~100 мкл мышечной ткани и невусов) производили по следующему протоколу. Образец ткани в керамической ступке заливали жидким азотом и растирали в порошок. Жидкий азот доливали и добавляли 10 объемов буфера СТВ. Полученную смесь заливали жидким азотом и растирали в порошок. Лизат переносили в пробирку и расплавляли. Добавляли 0,1 объема раствора ацетата натрия, рН 5,0 (3 М). Компоненты смешивали (и заодно раздробляли ДНК), несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19С иглу. К смеси добавляли 1 объем водонасыщенного фенола и перемешивали. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем добавляли 0,2 объема хлороформа и интенсивно перемешивали на вортексе (в течение 3-4 мин). Смесь центрифугировали при ~1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5-10 мин, а затем при >4000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин. Водную фазу переносили в пробирку, содержащую 1 объем водонасыщенного фенола, и перемешивали. Смесь центрифугировали при >4000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем смесь экстрагировали добавлением хлороформа. Добавляли 1 объем изопропанола, перемешивали и выдерживали при -20°С в течение 1 ч. Смесь центрифугировали при >4000 об/мин при 4°С в течение 10-20 мин. Осадок промывали 75%-ным этанолом, растворяли в не содержащей РНКаз Н₂О и хранили при -70°С.Isolation of mRNA from cultures of melanoma cells obtained from patients with ΙΙΙ-ΐν stages of melanoma (from about 5 million cells of each line: melanoma 1b, melanoma ME, melanoma R, melanoma C, melanoma COB) and tissues (~ 100 μl of muscle tissue and nevus) produced according to the following protocol. A tissue sample in a ceramic mortar was poured with liquid nitrogen and ground into powder. Liquid nitrogen was added and 10 volumes of STB buffer were added. The resulting mixture was poured with liquid nitrogen and triturated. The lysate was transferred into a test tube and melted. Added 0.1 volume of a solution of sodium acetate, pH 5.0 (3 M). The components were mixed (and DNA was also fragmented), passing the lysate through a ~ 19С needle several (3-4) times. 1 volume of water-saturated phenol was added to the mixture and mixed. The resulting mixture was left at room temperature for 5 minutes. Then 0.2 volumes of chloroform were added and vortexed vigorously (for 3-4 minutes). The mixture was centrifuged at ~ 1000 rpm at room temperature for 5-10 minutes, and then at> 4000 rpm at room temperature for 10 minutes. The aqueous phase was transferred to a test tube containing 1 volume of water-saturated phenol and mixed. The mixture was centrifuged at> 4000 rpm at room temperature for 10 minutes. The mixture was then extracted with the addition of chloroform. 1 volume of isopropanol was added, stirred and kept at -20 ° C for 1 h. The mixture was centrifuged at> 4000 rpm at 4 ° C for 10-20 min. The precipitate was washed with 75% ethanol, dissolved in RNase-free H ₂ O and stored at -70 ° C.

Затем реакцию синтеза кДНК проводили с использованием выделенной мРНК каждой линии (~1 мкг/мкл). Смесь мРНК (1 мкг), праймера ро1уА 10 мМ (1 мкл) и воды (9 мкл) прогревали в течение 5 мин при 65°С, затем быстро охлаждали до 4°С и добавляли реакционную смесь (общий объем 20 мкл), содержащую 5х буфер М-Ми^ ВТ (4 мкл, ЕегшеШаб), ингибитор РНКаз В1ЬоЬоскВ№бе 1п1иЬбог (0,5 мкл, ЕегшеШаб), обратную транскриптазу ВеуейАгб М-Ми^ ВТ (1 мкл, ЕегтеШаз), 6ΝΊΒ 10 мМ (2 мкл), воду, не содержащую РНКаз (0,5 мкл). Синтез кДНК проводили на программируемом амплификаторе фирмы ЕррепбогГ в режиме: 42°С, 90 мин; затем 70°С, 10 мин.Then, the cDNA synthesis reaction was carried out using the selected mRNA of each line (~ 1 μg / μl). A mixture of mRNA (1 μg), po1uA primer 10 mM (1 μl) and water (9 μl) was heated for 5 min at 65 ° C, then quickly cooled to 4 ° C and the reaction mixture (total volume 20 μl) containing 5x buffer М-Ми ^ ВТ (4 μl, ExSec), RNase inhibitor B1bOboskbnoe 1n1iBog (0.5 μl, EgscheBab), reverse transcriptase VeuyeAgb Mi-Mi ^ VT (1 μl, EGTESbaz), 6 × 10 mM (2 μl ), RNase-free water (0.5 μl). Synthesis of cDNA was carried out on a programmable amplifier ErrepbogG company in the mode: 42 ° C, 90 min; then 70 ° C, 10 min.

Полученную кДНК (разведенную в 5 раз) использовали в качестве матрицы для определения уровня экспрессии РНЕ10 в линиях клеток методом количественной ПЦР. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала кДНК (3 мкл), 10 х буфер для ПЦР (Ти8С1, рН 8,6, КС1 0,5 М, МдС1₂ 15 мМ, Т\\ееп 20 1%) (3 мкл), бNТР 10 мМ (0,6 мкл), праймер_Гог 10 мкМ (0,9 мкл), праймер_геу 10 мкМ (0,9 мкл), флуоресцентный краситель 8ΥΒΒ-ΟΒΕΕΝ х100 (0,06 мкл), полимераза Тад Но!81ай (5 ед/мкл, Сибэнзим) (0,15 мкл), воду (21,4 мкл). Каждый образец амплифицировали в двух повторностях с двух пар праймеров для определения количества транскриптов РНЕ10 (РНЕ-1_Гог & РНЕ-1_геу, РНЕ-2_Гог & РНЕ-2_геу), используя нормировочные (контрольные) праймеры к (НорМ_Гог & НорМ_геу).The obtained cDNA (diluted 5 times) was used as a matrix to determine the level of expression of PHE10 in cell lines by quantitative PCR. The reaction mixture with a volume of 30 μl contained cDNA (3 μl), 10 x PCR buffer (Ti8Cl, pH 8.6, KCl 0.5 M, MDCl ₂ 15 mm, T \\ ehp 20 1%) (3 μl), bNTP 10 mM (0.6 μL), Gog primer 10 μM (0.9 μL), Geu primer 10 μM (0.9 μL), 8ΥΒΒ-ΟΒΕΕΝ x100 fluorescent dye (0.06 μL), Tad No! 81ay polymerase (5 units) / μl, Sibenzyme) (0.15 μl), water (21.4 μl). Each sample was amplified in duplicate from two pairs of primers to determine the number of RNE10 transcripts (RNE-1_Gog & RNE-1_geu, RNE-2_Gog & RNE-2_geu) using normalization (control) primers for (NormM_Gog & NormM_geu).

Реакцию проводили на программируемом амплификаторе фирмы Вю-Ваб для количественной ПЦР в следующем режиме: плавление 94°С, 2 мин; амплификация 50 циклов с шагами -94°С, 20 с; 63°С, 20 с; 70°С, 20с; считывание сигнала флуоресценции; заключительный синтез 70°С, 10 мин.The reaction was carried out on a Vu-Wab programmable thermocycler for quantitative PCR in the following mode: melting 94 ° С, 2 min; amplification of 50 cycles in steps of -94 ° C, 20 s; 63 ° C, 20 s; 70 ° C, 20 s; reading a fluorescence signal; final synthesis 70 ° C, 10 min.

Данные повторностей усредняли и количество транскриптов вычисляли по следующей формуле: Количество транскриптов (%) = 2^<с^^Норм’^с(1)^р|,,7> х 100%, где с(!)НорМ - среднее значение достижения кривыми амлификации порогового цикла продукта с нормировочных (контрольных) праймеров;The replicate data were averaged and the number of transcripts was calculated using the following formula: Number of transcripts (%) = 2 ^<c ^ ^Norm ' ^{s (1} ) ^{p | ,, 7} > x 100%, where c (!) Norm is the average value of reaching the threshold amplification curves product cycle with normalization (control) primers;

с(!)РНЕ - среднее значение достижения кривыми амлификации порогового цикла РНЕ-1 или РНЕ-2.c (!) RNE - the average value of the achievement of the amplification curves of the threshold cycle RNE-1 or RNE-2.

Пороговый цикл был установлен на уровне 0,025. Полученные кривые амплификации приведены на фиг. 1.The threshold cycle was set at 0.025. The obtained amplification curves are shown in FIG. one.

Результаты анализа экспрессии РНЕ10 представлены на фиг. 2 и 3 и в табл. 2. В нормальной мышечной ткани экспрессия РНЕ10 находится на достаточно высоком уровне: для праймеров РНЕ-1 и РНЕ2 соответственно 93% и 55% относительно экспрессии нормировочного (контрольного) гена. Экспрессия РНЕ10 в невусах снижена примерно в два раза по сравнению с мышечной тканью. Экспрессия же РНЕ10 в клетках линий меланом снижена по сравнению с экспрессией в невусах в среднем в два-три раза, а по сравнению с мышечной тканью в 5-10 раз.The results of the analysis of the expression of PHE10 are presented in FIG. 2 and 3 and in table. 2. In normal muscle tissue, the expression of PHE10 is at a fairly high level: for primers PHE-1 and PHE2, respectively, 93% and 55% relative to the expression of the normalization (control) gene. The expression of PHE10 in nevus is approximately halved compared to muscle tissue. Expression of PHE10 in melanoma cell lines is reduced compared with expression in nevi by an average of two to three times, and compared with muscle tissue by 5-10 times.

- 5 019599- 5 019599

Таблица 2table 2

Название ткани Fabric name РНР-1 PHP-1 РНГ-2 RNG-2 Меланома Н, Melanoma H 10,29489 10.29489 5,310531 5,310531 Меланома МЕ Melanoma ME 8,105247 8,105247 4,02463 4,02463 Меланома Р Melanoma P 15,33606 15.33606 10,5477 10,5477 Меланома КОК Melanoma COC 8,362047 8.362047 9,672281 9,672281 Невус 1 Nevus 1 46,65165 46.65165 20,80497 20.80497 Невус 2 Nevus 2 35,97334 35.97334 25,88162 25.88162 Мышцы Muscle 93,62722 93,62722 55,78654 55.78654

Таким образом, анализ уровня экспрессии РНР10 возможно использовать в качестве одного из способов диагностики меланомы, а РНР10 - в качестве маркера.Thus, analysis of the expression level of PHR10 can be used as one of the methods for diagnosing melanoma, and PHR10 as a marker.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН <120> СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РНЕ10, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР <160> 7 <210> 1 <211> 21 <212> 2ΝΑ <220> Праймер РНГ-1_£ог <400> 1 ссдддаасдсаЬддаадааад 21 <210> 2 <211> 26 <212> ϋΝΑ <220> Праймер ?НГ-1_ ге··.’ <400> 2 сассаисасидбсРададсадддадс 26 <210> 3 <211> 25 <212> ОМА <220> Праймер РНЕ-2_£ог <400> 3 ссадддаадасадаааисаааадас 25 <210> 4 <211> 25 <212> ОНА <220> Праймер РНЕ-2_г<эу <4 00> 4 ссаТРдисакаиссаддсаадаадд 25 <210> 5 <211> 23 <212> ЭМА <220> Праймер Норм_£ог <400> 5 дсадаОдададсадсдаЫзаасс 23 <210> 6 <211> 23 <212> 0ΝΑ <220> Праймер ΗορΜ_τβνLIST OF SEQUENCES <110> ESTABLISHMENT OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES INSTITUTE OF BIOLOGY OF THE GENE OF THE RAS <120> METHOD FOR DIAGNOSIS OF HUMAN MELANOMA <<BASED ON EXPRESSION 21 6102> 11 RNG-1_ £ og <400> 1 ssdddaasdsda д ddaadaaad 21 <210> 2 <211> 26 <212> ϋΝΑ <220> Primer? NG-1_ he ··. '<400> 2 sassa sasisbids Radadsaddads 26 <210> 3 <211> 25 <212> OMA <220> Primer RNE-2_ £ og <400> 3 ssaddadaadasaaisaaaaadas 25 <210> 4 <211> 25 <212> ITA <220> Primer RNE-2_g <uy <4 00> 4 ssaTrDisakaissaddsadadd 25 <210> 5 <211> 23 <212> EMA <220> Primer Norm_ £ og <400> 5 d garden Odadadsadda Yzaass 23 <210> 6 <211> 23 <212> 0ΝΑ <220> Primer ΗορΜ_τβν

- 6 019599 <400> 6 ддад£да££6садссассаад£с 23 <210> 7 <211> 20 <212> ОКА <220> Праймер Ро1уА <400> 7 бб£бббб£бб6£б£б66б6б 20- 6 019599 <400> 6 ddd £ yes £ £ 6 garden access £ s 23 <210> 7 <211> 20 <212> OKA <220> Primer Po1uA <400> 7 bb £ bbbb £ bb6 £ b £ b66b6b 20

Claims (5)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ диагностики меланомы человека на основании определения уровня экспрессии гена РНР10 в клетках пациента, предусматривающий следующие стадии:1. A method for the diagnosis of human melanoma based on determining the level of expression of the PHR10 gene in the patient’s cells, comprising the following steps: а) получение у пациента с подозрением на меланому образцов морфологически опухолевой и нормальной тканей;a) obtaining from a patient with suspected melanoma samples of morphologically tumor and normal tissue; б) выделение мРНК из клеток указанных образцов;b) the selection of mRNA from cells of these samples; в) синтез кДНК на матрице указанной мРНК;c) cDNA synthesis on the matrix of the indicated mRNA; г) проведение количественной ПЦР на матрице полученной кДНК с использованием по меньшей мере двух пар праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одной пары контрольных праймеров;g) conducting quantitative PCR on the matrix of the obtained cDNA using at least two pairs of primers specific for the PHR10 gene and at least one pair of control primers; д) интерпретация полученных данных об уровне экспрессии гена РНР10 в клетках пациента таким образом, что сниженный уровень экспрессии гена РНР10 в клетках образца морфологически опухолевой ткани по сравнению с таковым в клетках образца морфологически нормальной ткани свидетельствует о наличии у пациента меланомы.e) the interpretation of the obtained data on the level of expression of the PHP10 gene in the patient's cells in such a way that a reduced level of expression of the PHP10 gene in the cells of the morphologically tumor tissue sample as compared to that in the cells of the morphologically normal tissue sample indicates the presence of melanoma in the patient. 2. Способ по п.1, в соответствии с которым две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, представляют собой РНР-1_Гог. РНР-1_геу, РНР-2_Гог и РНР-2_геу, которым соответствуют последовательности БЕЦ ГО N0: 1-4 соответственно.2. The method according to claim 1, in accordance with which two pairs of primers specific for the PHR10 gene are PHP-1_Gog. RNR-1_geu, RNR-2_Gog and RNR-2_geu, which correspond to the sequence of CEC GO N0: 1-4, respectively. 3. Набор для диагностики меланомы человека по сниженному уровню экспрессии гена РНР10, выполняемой согласно способу по п.1, включающий по меньшей мере две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, и по меньшей мере одну пару контрольных праймеров.3. A kit for diagnosing human melanoma by a reduced level of expression of the PHP10 gene, performed according to the method of claim 1, comprising at least two pairs of primers specific for the PHP10 gene and at least one pair of control primers. 4. Набор по п.3, в котором две пары праймеров, специфичных к гену РНР10, представляют собой РНР-1_Гог, РНР-1_геу, РНР-2_Гог и РНР-2_геу, которым соответствуют последовательности БЕЦ ГО N0: 1-4 соответственно.4. The kit according to claim 3, in which two pairs of primers specific for the RNP10 gene are RNR-1_Gog, RNR-1_geu, RNR-2_Gog and RNR-2_geu, which correspond to the sequence of BETS GO N0: 1-4, respectively. 5. Набор по п.3, который дополнительно содержит другие компоненты для проведения диагностики меланомы человека, такие как отличные от праймеров реагенты, необходимые для проведения количественной ПЦР, включающие буфер для ПЦР, дезоксинуклеотидтрифосфаты, флуоресцентный краситель (например, БУВК.-ΟΚΕΕΝ х100) и/или полимеразу Тад с горячим стартом.5. The kit according to claim 3, which additionally contains other components for the diagnosis of human melanoma, such as reagents other than primers required for quantitative PCR, including PCR buffer, deoxynucleotide triphosphates, fluorescent dye (for example, BUVK.-ΟΚΕΕΝ x100) and / or Tad polymerase with a hot start.