EA017957B1 - Композиции и способы, ингибирующие грипп - Google Patents

Композиции и способы, ингибирующие грипп Download PDF

Info

Publication number
EA017957B1
EA017957B1 EA201070053A EA201070053A EA017957B1 EA 017957 B1 EA017957 B1 EA 017957B1 EA 201070053 A EA201070053 A EA 201070053A EA 201070053 A EA201070053 A EA 201070053A EA 017957 B1 EA017957 B1 EA 017957B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
influenza
virus
amino acid
variant
Prior art date
Application number
EA201070053A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070053A1 (ru
Inventor
Роберт Ф. Гарри
Рассел Б. Уилсон
Original Assignee
Дзе Администрейторс Оф Дзе Тьюлейн Эдьюкейшнл Фанд
АУТОИММЬЮН ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Администрейторс Оф Дзе Тьюлейн Эдьюкейшнл Фанд, АУТОИММЬЮН ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЭлЭлСи filed Critical Дзе Администрейторс Оф Дзе Тьюлейн Эдьюкейшнл Фанд
Publication of EA201070053A1 publication Critical patent/EA201070053A1/ru
Publication of EA017957B1 publication Critical patent/EA017957B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/00033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к пептидам, аналогам пептидов, производным пептидов и к фармацевтическим композициям, пригодным для лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа или профилактики передачи от лица к лицу инфекции вирусом гриппа. Пептид по изобретению содержит часть, ингибирующую слияние вирус гриппа-клетка, области инициации слияния (FIR) белка гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа или ее вариант. В предпочтительном варианте изобретения пептид по изобретению состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков части белка гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа или его варианта, причем часть белка содержит FIR белка и вплоть до пяти аминокислотных остатков на амино- и карбоксиконцевой сторонах FIR.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим пептиды, эффективные для профилактики или ингибирования вирусной инфекции клеток вирусом гриппа, и к способам лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа с их помощью.
Предпосылки изобретения
Все вирусы должны связываться с клетками-хозяевами и проникать в них для репликации. Для оболочечных вирусов, включающих РНК-вирусы, имеющие мембранные белки слияния класса I, процесс вовлекает (а) связывание вириона с клеткой-мишенью, (Ь) слияние оболочки вируса с плазматической мембраной или внутренней клеточной мембраной, (с) дестабилизацию вирусной оболочки и клеточной мембраны в области слияния с образованием поры слияния, (6) перенос вирусной РНК через пору и (е) модификацию клеточной функции посредством вирусной РНК.
Стадии (Ь) и (с), указанные выше, которые вовлекают слияние вирусной мембраны и клеточной оболочки, опосредуются взаимодействием вирусного трансмембранного гликопротеина (белка слияния) с поверхностными белками и мембранами клетки-мишени. Эти взаимодействия вызывают конформационные изменения белка слияния, которые приводят к встраиванию вирусного пептида слияния в мембрану клетки-мишени. После этого встраивания следуют дальнейшие конформационные изменения белка слияния, которые тесно сближают вирусную оболочку и клеточные мембраны и приводят к слиянию двух бислоев мембраны.
Вирус не способен распространяться и размножаться в его хозяине, если процесс слияния нарушается. Намеренного нарушения этого процесса слияния можно достигать направлением пептидов и пептидных миметиков, гомологичных последовательностям белка слияния, антител, которые распознают белок слияния, и других факторов, которые могут действовать против белка слияния.
Гемагглютинин 2 (НА2), белок оболочки вируса гриппа, являющегося ортомиксовирусом, представляет собой прототипный белок слияния класса I РНК-вирусов. НА2 содержит Ν-концевой гидрофобный домен, обозначаемый как пептид слияния, который экспонируется при расщеплении белкапредшественника гемагглютинина. Ретровирусные трансмембранные белки содержат несколько структурных признаков, являющихся общими с известной структурой НА2, в дополнение к пептиду слияния, включая удлиненную Ν-концевую спираль (Ν-спираль, обычно семикратный повтор или лейциновую молнию), С-концевую спираль (С-спираль) и ароматический мотив вблизи трансмембранного домена. Наличие по меньшей мере четырех из этих пяти доменов определяет белок оболочки вируса как белок слияния класса I.
На фиг. 1 представлены пять описанных ранее доменов белков слияния шести семейств вирусов класса I. Белки слияния начинаются гидрофобным пептидом слияния, оканчиваются якорным пептидом и включают удлиненную Ν-концевую альфа-спираль (Ν-спираль, обычно семикратный повтор или лейциновую молнию), С-концевую альфа-спираль (С-спираль) и иногда ароматический мотив вблизи оболочки вириона. Также для каждого из семейств вирусов показан шестой домен, обозначаемый в настоящем документе как область инициации слияния (ЕШ), который был выявлен авторами настоящего изобретения и описан в патентной заявке США № 10/578013.
Каждый год приблизительно от 10 до 20% популяции США страдают сезонным гриппом. Хотя большинство индивидов выздоравливают от гриппа в течение от одной до двух недель, у очень молодых, пожилых лиц и лиц с хроническими медицинскими состояниями может развиться постгриппозная пневмония и другие летальные осложнения. Этиологическим фактором гриппа является вирус гриппа, ортомиксовирус, который легко образует новые штаммы посредством процесса смешивания и мутации сегментированного вирусного генома.
Высоковирулентные штаммы вируса гриппа типа А могут вызывать эпидемии и пандемии. В последние годы появился высокопатогенный штамм вируса птичьего гриппа А подтипа Η5Ν1, способного вызывать высокий уровень смертности. Вследствие угрозы вируса гриппа как здоровью населения, так и в качестве потенциального агента для биотерроризма разработка лекарственных средств для борьбы с сезонным гриппом и возрастающей угрозой пандемического гриппа имеет высокий приоритет.
- 1 017957
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к пептидам, аналогам пептидов, производным пептидов и фармацевтическим композициям, пригодным для лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа и/или профилактики передачи от лица к лицу инфекции вирусом гриппа. Пептид по изобретению содержит ингибирующую слияние вирус гриппа-клетка часть области инициации слияния (НЯ) белка гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа или его варианта. Вариант отличается от белка дикого типа определенными заменами в последовательности аминокислотных остатков белка гемагглютинина 2 дикого типа.
В первом варианте осуществления выделенный пептид по изобретению состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков части выбранного белка гемагглютинина 2 дикого типа или его варианта. Часть белка гемагглютинина 2 содержит область инициации слияния (НЯ) белка и вплоть до пяти аминокислотных остатков на Ν-концевой и С-концевой сторонах НЯ. Также часть включает, по меньшей мере, последовательность ΥΝΛΕΕΕ (8ЕО Ш N0: 1) или ее вариант, который отличается от 8Е0 Ш N0: 1 одной или несколькими аминокислотными заменами, выбранными из группы, состоящей из Υ18, Υ1Τ, Υ1№, Υ1Α, N20, А3Ь, Α3Ι, АЗУ, Ε4Ό, Е4К, Е4Я, Е4Н, Ь51, Ь5У, Ь5Л, Ь61, ЬбУ и ЬбА.
В этом первом варианте осуществления вариант отличается от выбранной последовательности дикого типа одной или несколькими аминокислотными заменами в аминокислотной последовательности части выбранного белка дикого типа, указанной выше. Замены могут быть выбраны из соответствующих аминокислотных остатков других белков гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа или консервативных замен остатков дикого типа, и предпочтительно они выбраны так, чтобы сохранялся профиль поверхностной гидропатии ^У1т1су-^УН11с для варианта, имеющий локальные максимумы и локальные минимумы в профиле в пределах приблизительно 5 аминокислотных остатков от локальных максимумов и локальных минимумов профиля поверхностной гидропатии \Уип1су-\У1Шс соответствующей области по меньшей мере одной аминокислотной последовательности гемагглютинина 2 дикого типа. Предпочтительно вариант выбранной последовательности дикого типа обладает по меньшей мере 50%-ной идентичностью последовательности с последовательностью дикого типа.
Во втором варианте осуществления пептид по изобретению содержит часть из 8-40 аминокислотных остатков НЯ белка гемагглютинина 2 вируса гриппа А или вируса гриппа В дикого типа из области белка в диапазоне остатков с 72 по 113 или ее варианта, который отличается от остатков с 72 по 113 последовательности дикого типа на одну или несколько замен аминокислотных остатков в последовательности дикого типа. Замены в варианте выбирают из соответствующих аминокислотных остатков других белков гемагглютинина 2 дикого типа или их консервативных замен, и предпочтительно их выбирают для сохранения, в целом, формы профиля гидропатии \Уип1су-\У1Шс пептидов, т.е. для сохранения профиля гидропатии ^У1т1су-^УН11е варианта, имеющего локальные максимумы и локальные минимумы в пределах приблизительно 5 аминокислотных остатков от локальных максимумов и локальных минимумов профиля гидропатии ^У1т1еу-^УН11е соответствующей аминокислотной последовательности гемагглютинина 2 дикого типа. Предпочтительно варианты в этом варианте осуществления отличаются от последовательности дикого типа консервативной заменой.
В третьем варианте осуществления пептид по изобретению состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 2 (ЕУЕСЯ1ОПЕЕКУУЕПТК1ПЕ^8УУ'ЛЕЕЕУЛЕЕУОНТ1ПЕТП8) или ее варианта. 8ЕС) ΙΌ N0: 2 включает аминокислотные остатки с 72 по 113 белка гемагглютинина 2 вируса гриппа Α подтипа Н3 дикого типа (8Е0 Ш N0: 19). Пептид из 8-40 аминокислот содержит, по меньшей мере, аминокислотные остатки с 23 по 28 8Е0 Ш N0: 2 или ее варианта. В этом варианте осуществления вариант отличается от 8Е0 Ш N0: 2 одной или несколькими аминокислотными заменами, выбранными из группы, состоящей из:
- 2 017957
ЕЮ, Ε1Ν, ЕЮ, ν26 , У23, ν2Τ, ν2Ι, ν21, ν2Α, У2М , ν20, Ε3ϋ,
Ε3Ν, ЕЗО, 64Т, 043 , 64Κ, 64Β, 64Η, 640, 64Ν, Ε5Κ , Κ5Η, Η50,
Κ5Ν, 16Ь, I 6У, Ι6Α , Ι6Μ, 16С, 07Ν, 07Ε, 07 ϋ, 076 , 073, Ω7Τ,
ϋ8Ε, ϋ8Ν, ϋ80, Ώ8Μ, 08С, 191, Ь9У, Ο9Α, Ο9Μ, , 190, Ε10Ο, ΕΙΟΝ,
ΕΙΟβ, Ε10Ι, ЕЮЬ, ΕΙΟν, Ε10Α, Ε10Μ, Е10С, Κ11Κ, Κ11Η, Κ11Ώ,
КИЕ, Κ11Ν, К1Ю, Υ12Η, Υ12Κ, ,Υ12Β, Υ12Η, ν13Ι, VI31, VI ЗА,
νΐ3Ε, νΐ3τ, νΐ33, ν13Μ, νι зс, Ε14ϋ, Ε14Κ, Ε14Κ, Ε14Η, ϋ15Ε,
ϋ15Κ, ϋ15Ν, ϋ150, Τ166, Τ163, Τ16Α, Τ160, Τ16Ν, Κ17Ε, Κ17Κ.,
К17М, К17С, Κ17Ι, К17У, Κ171, Κ17Α, 1181, Ι18ν, Ι18Α, Ι18Τ,
1182, 1186, И80, Ι18Ν, ϋ19Ε, ϋ19Ν, ϋ190, 1,201, 120ν, Ο20Α,
1200, 120Μ, Η21Υ, И21А, 3221, 3226, 322Α, 522Μ, 322С, Υ23Ν,
Υ235, Υ23Τ, Υ23Α, N240, Ν24ϋ, Ν24Ε, Α25Ι, Α25ν, Α250, Α25Μ,
Ε26ϋ, Ε26Κ, Ε2 6Κ, Ε26Η, 127Α, 0271, 127ν, 027Μ, 0281, 1,2 8ν,
Ь28А, 128Μ, ν29Ι, ν291, ν2 9Α, ν29Μ, Α30Ι, АЗОЬ, Α30ν, АЗОМ,
АЗОС, 1311, 131У, 13 ΙΑ, 131Μ, Ь31С, Ε32β, Ε32Ν, Ε320, N330,
N330, Ο34Ε, Ν33Ε, Ο34Ε, 034ϋ, 0346, 0345, Ο34Τ, Η35Κ, Η35Β,
Η35Ν, Η35Ο, Τ363, Τ366, 137Ь, Ι37ν, Ι37Α, Ι37Μ, 137С, Б38Е,
ϋ38Ν, 0380, 03 9Γ, 1391, 139ν, 13 9Μ, 1,390, 03 9Α, Ο39Ε, 1390,
Ь39И, 13 90, Τ40Η, Τ40Κ, Τ40Κ, Τ4ρ3, Τ406, Τ40Α, Τ40Μ, Ρ41Ε,
041Ν, ϋ410. 5426, 342Τ, 3421, 3421, 342ν, 342Ά, 342Μ и 342С.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид, состоящий по меньшей мере из 8 последовательно расположенных аминокислотных остатков любой из последовательностей 8ЕО Ш N0: 3-13, которые соответствуют областям НЯ белка гемагглютинина 2 вируса гриппа А (НА2) или гемагглютинина вируса гриппа В (НВ) дикого типа. В других предпочтительных вариантах осуществления пептид состоит по меньшей мере из 8 последовательно расположенных аминокислотных остатков варианта с любой из 8Е0 Ш N0: 3-13. В этом альтернативном варианте осуществления вариант отличается от выбранной последовательности одной или несколькими аминокислотными заменами, предпочтительно консервативными заменами, аналогичными заменам, описанным для третьего варианта осуществления, рассмотренного выше.
При введении в носовую полость хорьков пептид по изобретению, обозначаемый в настоящем документе как ингибитор-3 гриппа (Е3), эффективно блокировал развитие гриппа у животных и передачу гриппа от животного к животному. Аминокислотная последовательность Е3 идентична остаткам 84-99 НА2 большинства вирусов гриппа А подтипа Н3, включая штаммы Α/Η3Ν2, в настоящее время распространяющиеся у человека. Также Е3 является активным против рекомбинантного вируса гриппа Η5Ν1 и против двух штаммов вируса гриппа В (В/§йаидйа1/361/2002 и В/§йаидйа1/10/2003), ίη νίίτο, в иммунном анализе бляшкообразования с 1С50 в низком нМ-диапазоне (<5 нМ). Учитывая разнообразие этих различных штаммов вируса гриппа А и В, Е3, вероятно, является эффективным против большинства вирусов гриппа.
В других аспектах настоящее изобретение относится к аналогам пептида по изобретению (например, циклическим пептидам или пептидам, содержащим неприродную аминокислоту), производным пептида или аналога по изобретению, в которых пептид или аналог включает группу не из НА2, связанную с остатком пептида (например, липид или пептидная последовательность не-НА2 вируса гриппа), и к выделенному антителу, которое является специфичным к пептиду, аналогу или производному (т.е. способным специфично и селективно связываться с ними) по изобретению.
Другой аспект изобретения представляет собой применение пептида, аналога, производного или антитела по изобретению в терапевтическом способе для лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа. Это применение может включать применение пептида, аналога, производного или антитела по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения гриппа. Пептиды, аналоги, производные и антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
- 3 017957
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены пять указанных выше доменов белков слияния из шести семейств вирусов типа I, а также шестой домен, известный как область инициации слияния (НЯ).
На фиг. 2 показано выравнивание последовательности вариантов НА2: Н1 (8ЕЦ ГО N0: 17), Н2 (5ЕО ГО N0: 18), Н3 (8Ер ГО N0: 19), Н4 (5ЕО ГО N0: 20), Н5 (5ЕО ГО N0: 21), Н6 (5ЕО ГО N0: 22), Н7 (5ЕО ГО N0: 23), Н9 (5ЕО ГО N0: 24), Н10 (5ЕО ГО N0: 25), Н13 (5ЕО ГО N0: 26), Н14 (5ЕО ГО N0: 27), Н15 (5ЕО ГО N0: 28) и Н16 (5ЕО ГО N0: 29).
На фиг. 3 показана последовательность аминокислотных остатков гемагглютинина 2 вируса гриппа В, В/Уатада1а/16/1988 (5ЕО ГО N0: 30).
На фиг. 4 показано сравнение остатков 72-113 белков гемагглютинина 2 вируса гриппа А и вируса гриппа В, конкретно остатков 72-113 вируса гриппа А подтипов Н1 (8ЕЦ ГО N0: 17), Н2 (5 ЕС) ГО N0: 18), Н3 (5ЕС) ГО N0: 19), Н4 (5ЕС) ГО N0: 20), Н5 (5ЕС) ГО N0: 21), Н6 (5ЕС) ГО N0: 22), Н7 (5 ЕС) ГО N0: 23), Н9 (5ЕС) ГО N0: 24), Н10 (5ЕС) ГО N0: 25), Н13 (5ЕС) ГО N0: 26), Н14 (8ЕЦ ГО N0: 27), Н15 (8ЕЦ ГО N0: 28), Н16 (8ЕЦ ГО N0: 29), и гемагглютинина 2 вируса гриппа В/Хатада!а/16/1988 (5ЕС) ГО N0: 30).
На фиг. 5 представлен возможный механизм слияния вирус-клетка.
На фиг. 6 представлены патологические ответы, наблюдаемые для двух групп хорьков, которых заражали вирусом гриппа А/Са1/07/04 и которым вводили пептид по изобретению или контрольный пептид.
На фиг. 7 представлены анализы титров вируса в образцах от хорьков, которым вводили пептид по изобретению или контрольный пептид и которых инфицировали вирусом гриппа А/Са1/07/04.
На фиг. 8 представлен график поверхностной гидропатии \Уип1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н1.
На фиг. 9 представлен график поверхностной гидропатии ^1ш1еу-^Ы1е для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н2.
На фиг. 10 представлен график поверхностной гидропатии \Уип1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н3.
На фиг. 11 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н4.
На фиг. 12 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н5.
На фиг. 13 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н6.
На фиг. 14 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н7.
На фиг. 15 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н9.
На фиг. 16 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н10.
На фиг. 17 представлен график поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н13.
На фиг. 18 представлен график поверхностной гидропатии \Уип1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н14.
На фиг. 19 представлен график поверхностной гидропатии \Уип1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н15.
На фиг. 20 представлен график поверхностной гидропатии \Уип1еу-\У1Ше для гемагглютинина 2 вируса гриппа А Н16.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Настоящее изобретение относится к пептидам, аналогам пептидов, производным пептидов, антителам и фармацевтическим композициям, пригодным для лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа или профилактики передачи от лица к лицу инфекции вирусом гриппа. В настоящем изобретении использованы пептиды, имеющие сходство аминокислотной последовательности с частями области инициации слияния (НЯ) белков гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа. Пептиды по изобретению могут ингибировать слияние вирус гриппа-клетка, и тем самым они могут осуществлять лечение и/или профилактику инфекции вирусом гриппа. Пептиды по изобретению могут содержать выбранные части белков гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа в области НЯ или варианты выбранных частей. Варианты отличаются от белка дикого типа выбранными заменами в последовательности аминокислотных остатков белка гемагглютинина 2 дикого типа. Без связи с теорией полагают, что пептид по изобретению осуществляет профилактику и лечение инфекций вирусом гриппа, препятствуя нормальному взаимодействию домена НЯ пептида слияния вируса с поверхностью клетки-мишени, например препятствуя агрегации белков или конформационным изменениям, требуемым для активации или слияния.
- 4 017957
В первом варианте осуществления выделенный пептид по изобретению состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков, предпочтительно от 9 до 16 последовательно расположенных аминокислотных остатков, части выбранного белка гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа, содержащей область инициации слияния (ΡΙΒ) белка и вплоть до пяти аминокислотных остатков на Ν-концевой и С-концевой сторонах ΡΙΚ. или ее варианта. Пептид из 8-40 аминокислот включает, по меньшей мере, последовательность УНАЕБЕ (8ЕО ΙΌ N0: 1) или ее вариант, который отличается от 8Е0 ΙΌ N0: 1 одной или несколькими аминокислотными заменами, выбранными из группы, состоящей из Υ18, Υ1Τ, Υ1№, Υ1Α, УЗО, А3Б, Α3Ι, АЗУ, Ε4Ό, Е4К, Е4К Е4Н, Б51, Б5У, Б5А, Б61, Б6У и Б6А. 8Е0 ΙΌ N0: 1 представляет собой одну из наиболее высококонсервативных частей ΡΙΚ. всех из охарактеризованных белков гемагглютинина 2 вируса гриппа А (т.е. остатки с 94 по 99 последовательности гемагглютинина 2 вируса гриппа А). Аминокислотная последовательность ΡΙΚ. включает эту часть выбранного белка гемагглютинина 2 дикого типа, начинающуюся приблизительно в остатке 77 в Ν-спирали белка и кончающуюся в остатке в диапазоне от остатка 110 до остатка 119 выбранного белка гемагглютинина 2 дикого типа. С-конец ΡΙΚ. вируса гриппа, как описано в настоящем документе, представляет собой остаток, непосредственно предшествующий первому остатку после остатка 104 (С-конец Ν-спирали), который начинается в области повышенной поверхностной гидрофобности ^1т1еу-^Ы1е. Иным образом, ΡΙΚ. характеризуется последовательностью аминокислотных остатков, которая обладает пиком профиля поверхностной гидропатии ^1т1еу-^Ы1е белка гемагглютинина 2 дикого типа, начинающимся в Ν-спирали (в остатке 77) и кончающимся в пределах приблизительно 15 остатков после С-конца Ν-спирали. С-конец области пика (т.е. ΡΙΚ.) характеризуется локальным минимумом в профиле гидропатии. Остаток, непосредственно следующий за локальным минимумом на С-конце ΡΙΚ, начинает другой пик профиля гидропатии (т.е. область повышения поверхностной гидрофобности).
В этом первом варианте осуществления вариант отличается от выбранной последовательности дикого типа одной или несколькими аминокислотными заменами в аминокислотной последовательности части выбранного белка дикого типа, указанного выше. Замены выбирают из соответствующих аминокислотных остатков других белков гемагглютинина 2 вируса гриппа дикого типа или консервативных замен соответствующих остатков, и предпочтительно их выбирают так, чтобы сохранялся профиль поверхностной гидропатии ^1т1еу-^Ы1е для варианта, имеющий локальные максимумы и локальные минимумы в профиле в пределах приблизительно 5 аминокислотных остатков от локальных максимумов и локальных минимумов профиля поверхностной гидропатии \Упп1еу-\У1Ше соответствующей области по меньшей мере одной аминокислотной последовательности ΡΙΚ. гемагглютинина 2 дикого типа. Например, источником гемагглютинина 2 дикого типа может быть подтип, выбранный из группы, состоящей из вариантов Н1, Н2, НЗ, Н4, Н5, Н6, Н7, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н15 и Н16 гемагглютинина 2 вируса гриппа А (8Е0 ΙΌ Ν0: 17-29), или белок гемагглютинина 2 вируса гриппа В (8Е0 ΙΌ Ν0: 30). Аминокислотные последовательности гемагглютинина 2 вируса гриппа А подтипов Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н15 и Н16 представлены на фиг. 2, причем области ΡΙΒ заключены в черную рамку. Аминокислотная последовательность гемагглютинина 2 вируса гриппа В (8Е0 ΙΌ Ν0: 30) представлена на фиг. 3. Предпочтительно варианты выбранной последовательности дикого типа обладают по меньшей мере 50%-ной идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80%-ной идентичностью последовательности) с последовательностью дикого типа.
Во втором варианте осуществления пептид по изобретению содержит от 8 до 40, предпочтительно от 9 до 16 последовательно расположенных аминокислотных остатков из остатков с 72 по 113 ΡΙΚ. белка гемагглютинина 2 вируса гриппа А или вируса гриппа В дикого типа или ее варианта, который отличается от остатков с 72 по 113 последовательности дикого типа одной или несколькими заменами аминокислотных остатков. Замены в варианте выбирают из соответствующих аминокислотных остатков других белков гемагглютинина 2 дикого типа или их консервативных замен, и предпочтительно их выбирают, чтобы сохранялась общая форма профиля гидропатии \Упп1еу-\У1Ше пептида дикого типа, т.е. чтобы сохранялся гидропатический профиль ^1т1еу-^Ы1е для варианта, имеющий локальные максимумы и локальные минимумы в профиле в пределах приблизительно 5 аминокислотных остатков от локальных максимумов и локальных минимумов профиля поверхностной гидропатии ^1т1еу-^Ы1е соответствующей области по меньшей мере одной аминокислотной последовательности ΡΙΚ. гемагглютинина 2 дикого типа. Например, предпочтительно варианты в этом варианте осуществления содержат консервативные замены определенных аминокислотных остатков дикого типа.
Как используют в настоящем, документе, термин консервативные замены и его грамматические варианты относится к наличию аминокислотного остатка в последовательности пептида, который отличается от остатка дикого типа, но относится к тому же классу аминокислот (т.е. неполярный остаток заменяет неполярный остаток, ароматический остаток заменяет ароматический остаток, полярный незаряженный остаток заменяет полярный незаряженный остаток, заряженный остаток заменяет заряженный остаток). Кроме того, консервативные замены могут включать остаток, имеющий значение поверхностной гидропатии того же знака и, как правило, сходной величины, что и остаток дикого типа, который он заменяет. Как используют в настоящем документе, термин неполярный остаток относится к глицину,
- 5 017957 аланину, валину, лейцину, изолейцину и пролину; термин ароматический остаток относится к фенилаланину, тирозину и триптофану; термин полярный незаряженный остаток относится к серину, треонину, цистеину, метионину, аспарагину и глутамину; термин заряженный остаток относится к отрицательно заряженным аминокислотам: аспарагиновой кислоте и глутаминовой кислоте, а также к положительно заряженным аминокислотам: лизину, аргинину и гистидину.
На фиг. 4 представлено сравнение остатков 72-113 каждого из подтипов гемагглютинина 2 вируса гриппа А, представленных на фиг. 2, вместе с соответствующей областью гемагглютинина 2 вируса гриппа В (т.е. остатками 72-113 8ЕО ΙΌ N0: 30). Как очевидно из фиг. 4, существует значительное сходство последовательностей между различными подтипами гемагглютинина. Область из остатков 72-113 каждого из подтипов гемагглютинина 2 вируса гриппа А обладает 50%-ной или более идентичностью последовательности с соответствующей областью подтипа Н3 (т.е. 8Е0 ΙΌ N0: 2). Процентная идентичность последовательностей между 5>Е0 ΙΌ N0: 2 и остатками 72-113 различных других подтипов является следующей: Н4 и Н14 обладают приблизительно 95,2% идентичностью последовательностей с 8Е0 ΙΌ N0: 2; Н7 и Н15 обладают приблизительно 59,5% идентичностью последовательностей с 8Е0 ΙΌ N0: 2; Н10 и Н16 обладают приблизительно 54,7% идентичностью последовательностей с 8Е0 ΙΌ N0: 2; Н5 и Н6 обладают приблизительно 52% идентичностью последовательностей с 8Е0 ΙΌ N0: 2; Н1, Н2, Н9 и Н13 обладают 50% идентичностью последовательностей с 8Е0 ΙΌ N0: 2. Остатки 72-113 гемагглютинина 2 вируса гриппа В обладают приблизительно 30,9% идентичностью последовательности с 8Е0 ΙΌ N0: 2; однако различия между 8Е0 ΙΌ N0: 2 и остатками 72113 белка вируса гриппа В, главным образом, представляют собой консервативные замены.
Как очевидно из фиг. 2-4, известные белки гемагглютинина 2 дикого типа в совокупности имеют аминокислотные остатки в положениях в диапазоне остатков 72-113, которые относятся более чем к одному классу аминокислот. Таким образом, в этом случае варианты пептидов по изобретению также могут включать аминокислотные замены более чем из одного класса аминокислот в таких положениях. Предпочтительно вариант выбранной последовательности дикого типа обладает по меньшей мере 50%ной идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% идентичностью последовательности) с последовательностью дикого типа.
В третьем варианте осуществления пептид по изобретению состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков, предпочтительно из 9-16 последовательно расположенных аминокислотных остатков, аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2 (1Л1Х)1Ш91)ЕЕК¥\Т1)ТКГОЕ\\АУ\АЕЕЕ\АЕЕ\ОНТГОЕТ1)8) или ее варианта. 8ЕО ΙΌ N0: 2 представляет собой часть белка гемагглютинина 2 вируса гриппа А подтипа Н3 дикого типа, включающую его аминокислотные остатки с 72 по 113. В этом варианте осуществления пептид содержит, по меньшей мере, аминокислотные остатки с 23 по 28 8Е0 ΙΌ N0: 2 или ее варианта, и вариант отличается от 8Е0 ΙΌ N0: 2 одной или несколькими аминокислотными заменами. Одна или несколько замен аминокислотных остатков в последовательности варианта выбраны из группы замен, представленных в табл. 1. Предпочтительно вариант обладает по меньшей мере 50%-ной идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% идентичностью последовательности) с 8Е0 ΙΌ N0: 2. В табл. 1 первый столбец замен является предпочтительным, второй столбец замен является более предпочтительным, и они являются более консервативными, чем в первом столбце, а в третьем столбце замен представлены альтернативы, которые могут быть включены в пептиды по изобретению.
- 6 017957
Таблица 1
Положение Предпочтительные
Замены в 8Е0 ГО N0: 2
Более замени предпочтительные
Альтернативные предпочтительные замены замены
1 ЕЮ, Ε1Ν, ЕЮ ЕЮ, Ε1Ν, ЕЮ
2 ν23, 723, ν2Τ, У21, У2Ь, ν2Ά, У2М, 72С ν23, Ύ2Τ, ν2Ι, У2Е, ν2Α, 72Μ
3 Ε3ϋ, Ε30, Ε3Ν Ε3ϋ
4 С4Т, 343, С4К, С4К, 64Η, 34β, 34Ν С4Т, 343, С4К, 34Κ, 34Η, 340, 64Ν
5 Κ5Κ, Ε.5Η, Κ50, Κ5Ν Κ5Κ, Κ50, Κ5Ν
6 1бь, ιεν, ΐ6Α, Ι6Μ, 16С 16Ь, Ι6ν, Ι6Α, ΙδΜ
Ί 07Ν, 07Ε, 070, 073, 075, 07Τ 07Ν, 07Ε, 07ϋ, 073
8 ϋ8Ε, 08Ν, 080, Ц8М, О8С ϋ8Ε, ϋ8Ν, ϋ80, 08Μ , *'
9 1,91, 197, ЬЭА, Ь9М, Ь9С 1,91, ЬЭТ, ЬЭА, Ε9Μ
10 ΕΙΟϋ, Ε10Ν, Ε100, Ε10Ι, ЕЮЬ, ΕΙΟν, Ε10Α, Ε10Μ, Е10С ΕΙΟϋ, ΕΙΟΝ, Ε100, Ε10Ι, ЕЮЬ, ΕΙΟν, Ε10Α
11 Κ11Κ, Κ11Η, Κ11ϋ, Κ11Ε, Κ11Ν, К1Ю Κ11Κ, К1Ю, Κ11Ε, Κ11Ν, К1Ю
12 Υ12Η, Υ12Κ, Υ12Κ, Υ12Η Υ12Η, Υ12Κ, Υ12Κ
13 νΐ3Ι, У13Ь, νΐ3Α, νΐ3ο, νΐ3τ, νΐ3δ, νΐ3Μ, VIЗС νΐ3Ι, νΐ3ΐ,, νΐ3Α, νΐ33, νΐ3Τ, νΐ35, νΐ3Μ
14 Ε14ϋ, Ε14Κ, Ε14Η, Ε14Η Ε140, Е14Й, Ε14Κ Е14Ц, Ε14Κ
- 7 017957
15 Μ5Ε, ϋ150 Ω15Κ, Ώ15Ν, ϋ15Ε Μ5Ε, ϋ15Κ
16 τΐ6ε, Т163, Т16А, Т16С, Τ163, Τ160, Ι16Α
Τ16β, Τ16Ν Τ16Ν,
11 Κ17Ε, К17К, К17М, Κ17Γ, Κ17Μ, Κ17Ι, Κ17Κ
К17С, Κ17Ι, К17У, Κ17ν, Κ175, Κ17Α,
Κ175, К17А
18 1185, 118У, Ι18Α, 118Ь, Ι18ν, Ι18Α, Ι18Α
Ι18Τ, 1183, 5180, Ι18Τ, Ι185Λ 1180,
Ι18β, Ι18Ν Ι18Ν
19 Ο19Ε, Ω19Ν, М90 019Ε ϋ19Ε
20 5201, 520ν, Ь20А, 5201, Ь20у, 520Α Ь20А
Ь20М, Ь20С
21 Η21Υ, Н21А Η21Υ Β21Υ, N2 ΙΑ
22 322Τ, 3220, 322Α, 322Τ, 322С, 322Α, 322Μ
322Μ, 322С 522Μ
23 Υ23Η, Υ233, Υ23Τ, Υ23Η, Υ233 Υ2 3Κ, Υ23Α
Υ23Α,
24 N240, Ν24Ό, Ν24Ε, N240 N240
25 Α25Ι, Α25ν, А25Ь, Ά251, А25У, Α255, Α25Ι
Α25Μ
26 Ε26ϋ, Е26К, Е26Е, Ε26Ο, Ε26Κ Ε26ϋ, Ε26Κ
Ε26Η,
27 Ь27А, 5271, 527ν, Ь27А, 5271, 527ν Ь27А
Ь27М
28 5281, 528ν, 528А, 1,281, Γ.2&ν, Ь28А 528Α
ьгзм
29 У291, У29Ь, ν29Α, ν2 9Ιν У29Щ ν2 9Α
У2 9М
30 Α30Ι, А305, АЗОУ, Α30Ι, АЗОЬ, Α30ν
АЗ ОМ, АЗОС
31 5311, 531У, Ь31А, Ь311, 531ν, 1,31α,
ь31м, Ь31С Ь31М
32 Е32О, Е320, Ε32Ν Ε32ϋ
- 8 017957
33 N330, Ν33Ε, N330 N330
34 0340, 034Ν, 034Е, 0340, 034Т, 0343 0346, 034Ν, О34Е, 034Ω
35 Н35К, Н35К, Η35Ν, Н350 Н35К', Н35К·
36 Τ36Ξ, Т366, Τ36Ξ
37 137Ъ, Ι37ν, Ι37Α, Ι27Μ, 137С 137Ъ, Ι37ν, Ι37Α
38 О38Е, ϋ38Ν, ϋ38Ο О38Е
39 ЬЗЭЕ, 1,391, ЬЗЭУ, ЬЗЭМ, ЬЗЭС, ЬЗЭА, Ь39Е, 1.390, ЬЗЭИ, 1390 ЬЗЭЕ, Ъ391, ЬЗЭУ, ЬЗЭМ, ЬЗЭА/ ЬЗЭЕ, ЬЗЭО
40 Т40Н, Т40К, Т40К, Т403, Т406, Т40А, Т40М, Т40Н, Т403, Т406, Т40А, Т40М
41 Э41Е, ϋ41Ν, ϋ410 ϋ41Е
42 542С, Ξ42Τ, 3421, 342Ь, Ξ42ν, 342А, 842М, 342С 3426, 342Т, 3421, 342Ь, 342У, 342А
В определенных предпочтительных вариантах осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид, состоящий по меньшей мере из 8 последовательно расположенных аминокислотных остатков любой из последовательностей, представленных в табл. 2 (8ЕО ΙΌ N0: 3-13), которые представляют собой части ΕΙΚ белка гемагглютинина 2 (НА2) вируса гриппа А или гемагглютинина (НВ) вируса гриппа В дикого типа. В других предпочтительных вариантах осуществления пептид состоит по меньшей мере из 8 последовательно расположенных аминокислотных остатков варианта любой из 8Е0 ΙΌ N0: 3-13. В этом альтернативном варианте осуществления вариант отличается от выбранной последовательности одной или несколькими аминокислотными заменами, предпочтительно консервативными заменами, и предпочтительно они выбраны из соответствующих остатков для замены в каждом положении пептида, как представлено в табл. 1.
Кроме того, последовательности, представленные на фиг. 2 и 4, указывают на количество остатков, выделенных жирным шрифтом, которые представляют собой консенсусные остатки в указанных положениях выровненных аминокислотных последовательностях гемагглютинина 2. Как используют в настоящем документе, термин консенсусный, при применении в отношении аминокислотного остатка при сравнении путем выравнивания аминокислотных последовательностей, относится к аминокислоте, которая представлена в большинстве из выровненных последовательностей в данном положении. На фиг. 2 консенсусные остатки представляют собой аминокислоты, которые находятся в данном положении по меньшей мере в 7 из 13 последовательностей, представленных на фигуре. На фиг. 4 консенсусные остатки представляют собой аминокислоты, которые находятся в данном положении по меньшей мере в 8 из 14 последовательностей, представленных на фигуре. В области остатков с 72 по 113 последовательностей гемагглютинина 2, сравниваемых на фиг. 4, консенсусные остатки представляют собой: У73, Е74, К76, 177, Ь80, Ό86, Ό90, +92, 893, Υ94, N95, А96, Е97, Ь98, Ь99, У100, Ь101, Ь102, Е103, N104, Т107, Ό109, Ό112 и 8113. Предпочтительно пептиды по изобретению, включая любой из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, включают один или несколько из этих консенсусных остатков, вплоть до всех и включая все из консенсусных остатков в области белка НА2 или его варианта, охватываемых пептидом.
- 9 017957
Идентификатор последовательности
Таблица 2
Вариант НА или НВ
Последовательность пептида
УЕОТКЮЬИЗУНАЕЪЪ ЗЕ<2 10 N0: 3 остатки А/Н4 и 84-99 А/НЗ, А/Н14
3Ξ0 10 N0: 4 остатки 84-102 А/Н1
ΜΕΟΟΒΈΟνΉΤΥΝΑΕΕΟ ЗЕО 10 N0: 5 остатки 84-99 А/Н5
ТКОЗМТЕ^ЗУ^АЕЪЪ ЗЕО 10 N0: 6 остатки 84-99 А/Н7
Х/ОООЮОТИАУМАЕЬЬ ЗЕО ю N0: Ί остатки 84-99 А/Н9
У00ЬКА0Т18801ЕЬА ЗЕО ю N0: 8 остатки 84-99 НВ
МЕОСЕЬОУИТУКАЕЪЬ ЗЕО 10 N0: 9 остатки 84-99 А/Н2 и
А/Н6
ТКО31ТБ1ИТУИАЕ1Ь
ΙΟβΑνΤΏΙΗΞΥΝΑΚΙ,Ε
ТГФЗЬТЕ1И8УИАЕ1Д νΌϋΑνΤϋΙΜΒΥΝΑΚΕΕ остатки
5ΕΟΙΟΝΟ: 10
ЗЕО Ιϋ
ΞΕΟ 10
ЗЕОШ
Все из последовательностей в табл. 2, за
N0:
N0:
МО:
исключением остатки остатки остатки пептида
А/Н10
А/Н13
А/Н15
А/Н16
84-99
84-99
84-99 84-99 гемагглютинина 2 вируса гриппа (8Е0 ГО N0: 8), обладают более чем 50%-ной идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0: 3, т.е. 8ЕО ГО N0: 4, 5, 9 и 13 на 62,5% идентичны 8Е0 ГО N0: 3 и 8ЕО ГО N0: 6, 7, 9, 10, 11 и 12 на 56,2% идентичны 8Е0 ГО N0: 3. Гемагглютинин 2 вируса гриппа В обладает приблизительно 31%-ной идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0: 3, однако различия между 8Е0 ГО N0: 8 и 8Е0 ГО N0: 3, главным образом, представляют собой консервативные замены. Кроме того, каждый из пептидов, представленных в 8Е0 ГО N0: 3-13, включает один или несколько из консенсусных остатков Ό86, Ό90, \У92. 893, Υ94, N95, А96, Е97, Ь98, Ь99, У100, Ь101 и Ь102.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогам пептида по изобретению. В одном варианте осуществления аналог включает циклический пептид, содержащий по меньшей мере два остатка цистеина, имеющих дисульфидную связь (т.е. цистеиновый мостик), с образованием циклической структуры. Каждый остаток цистеина независимо представляет собой остаток пептида, остаток, связанный с №концом пептида, либо прямо, либо через линкерную пептидную последовательность, или остаток, связанный с С-концом пептида, либо прямо, либо через линкерную пептидную последовательность. Известно, что структуры циклических пептидов повышают биологическую стабильность ίη νίνο множества пептидов. В другом варианте осуществления аналог содержит по меньшей мере один неприродный аминокислотный остаток (например, остаток Ό-аминокислоты, ^метилированный остаток, такой как N метилвалин, гидроксипролин, аминомасляную кислоту и т.п.). Известно, что некоторые из таких замен в виде неприродных аминокислот обеспечивают устойчивость к расщеплению пептидазами во многих пептидных соединениях (например, Ό-аминокислоты, гидроксипролин) или повышают содержание альфа-спиралей в пептиде (например, аминомасляная кислота).
В другом варианте осуществления аналог может включать одну или несколько природных аминокислотных замен аминокислотных остатков пептида на один или несколько остатков пролина, глицина или глутаминовой кислоты. Остатки пролина и глицина могут снижать содержание альфа-спиралей пептида, если необходимо или желательно, а остатки глутаминовой кислоты могут повышать содержание альфа-спиралей пептида.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к производному пептида или аналогу по изобретению, в котором пептид или аналог включает присоединенную группу. В одном варианте осуществления присоединенная группа представляет собой липид, такой как С8-С20-алкильная группа или алкилкарбоксилатная группа, связанная с пептидом сложноэфирной, амидной, простой эфирной, сложной тиоэфирной или простой тиоэфирной связью. Например, производное может включать группу сложного эфира жирного алкила, такую как миристатная группа, связанная с остатком пептида. Липидные заместители, например, могут повышать биологическую стабильность пептида.
В другом варианте осуществления производное содержит группу полиэтиленгликоля (РЕО), присоединенную к амино, гидроксильному или тиольному заместителю на боковой цепи одного или нескольких аминокислотных остатков пептида. Такие производные РЕО часто могут улучшать фармакокинетику белков, например, путем ингибирования захвата в органы, такие как печень, которые включают значительные уровни пептидаз.
В другом варианте осуществления производного, пептид включает полипептидную последовательность не-НА2, связанную с №концом пептида из 8-40 аминокислот, С-концом пептида или с обоими концами. Последовательность не-НА2 может представлять собой белок не-НА2 (например, сывороточный альбумин) или часть белка не-НА2 или она может содержать, например, последовательность для облегчения солюбилизации пептида, такую как А8К8К8К (8Е0 ГО N0: 15) или ее вариант, предпочтительно добавляемую к С-концу пептида.
- 10 017957
Другое предпочтительное производное по изобретению представляет собой выделенный полипептид, содержащий первый сегмент пептида, состоящий из пептида по изобретению (например, от 8 до 40 последовательно расположенных аминокислотных остатков части белка НА2 вируса гриппа дикого типа из области остатков с 72 по 113 последовательности дикого типа или ее варианта), и по меньшей мере один дополнительный пептидный сегмент, содержащий последовательность пептида не-НА2, связанную Ν-концом, С-концом, или как с Ν-, так и с С-концами первого пептидного сегмента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое является специфичным к пептиду, аналогу или производному по изобретению (т.е. способным специфично и селективно связываться с ними). Такие антитела пригодны в качестве реагентов для определения наличия концентрации пептида, аналога или производного по изобретению в биологическом образце от субъекта, которого лечат композицией по изобретению. Кроме того, антитела, которые нацеливают пептиды по изобретению, которые содержат части подтипов гемагглютинина 2 дикого типа, также могут связывать природные белки гемагглютинина 2. Такое связывание также может обеспечить некоторый уровень ингибирования процесса слияния вирус гриппа-клетка. Предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело, которое может быть химерным или гуманизированным антителом, образованным из антитела не относящегося к человеку животного, такого как мышь. Способы получения моноклональных антител из данного белка или пептида хорошо известны в данной области. Способы получения химерных или гуманизированных антител также хорошо известны специалисту в данной области.
Другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид, аналог, производное или антитело по изобретению, которые можно использовать в способе лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа. В определенных предпочтительных вариантах осуществления эта композиция включает пептид, аналог, производное или антитело по изобретению в фармацевтически приемлемой среде или носителе, пригодных для доставки пептида, аналога, производного или антитела субъекту, например, в носовой ход или дыхательные пути. Среды и носители, пригодные для доставки активного ингредиента в носовой ход или дыхательные пути, хорошо известны в данной области и включают солевые растворы, буферные солевые растворы, ингалируемые порошки и т.п. Также носитель может включать другие эксципиентные ингредиенты, такие как поверхностно-активные вещества, консерванты, диспергирующие вещества и т.п. Композиции можно доставлять в качестве аэрозоля, в качестве неаэрозольной жидкости, мази или крема (например, для применения в нос) и т.п. Фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать в качестве части способа лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа путем введения субъекту, страдающему вирусом гриппа, ингибирующего вирус гриппа количества фармацевтической композиции по изобретению.
Другой аспект изобретения представляет собой применение пептида, аналога, производного, антитела или фармацевтической композиции по изобретению для лечения или профилактики инфекции вирусом гриппа. Оно может включать применение пептида, аналога, производного или антитела по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения вируса гриппа.
Вирусы гриппа.
Существует множество подтипов вируса гриппа А. Каждый подтип вируса содержит одно конкретное сочетание вариантов двух гликопротеинов, которые погружены в липидные мембранные оболочки вирусов. Двумя определяющими подтип гликопротеинами являются гемагглютинин 2 (НА2) и нейраминидаза. Существует 16 известных вариантов НА2, которые обозначают с Н1 по Н16 соответственно и 9 известных вариантов нейраминидазы, которые обозначают с N1 по N9 соответственно. Каждый указанный подтип вируса характеризуется его номерами вариантов гемагглютинина 2 и нейраминидазы. Например, подтип Η3Ν2 вируса гриппа А представляет собой вирус свиного гриппа, и подтип Η5Ν1 представляет собой вирус птичьего гриппа.
НА2 представляет собой белок слияния всех вирусов семейства ортомиксовирусов, которое включает вирусы гриппа. НЯ каждого вируса гриппа находится в его гликопротеине НА2. Аминокислотные последовательности 13 из 16 известных вариантов НА2, Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16 представлены на фиг. 2 (5ΕΟ ΙΌ N0: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 и 29 соответственно). Последовательности подтипов Н8, Н11 и Н12 не были описаны. Области инициации слияния гемагглютинина 2 Н3 в данной работе идентифицированы как остатки с 77 по 119 аминокислотной последовательности Н3 (8Ε0 ΙΌ N0: 19), как показано на фиг. 2.
Было выявлено, что выделенный пептид, обозначаемый в настоящем документе как ингибитор-3 гриппа (Е3), который включает аминокислотную последовательность VΕ^ТI<I^^\V8ΥNАΕ^^. 8Ε0 ΙΌ N0: 3 (остатки 84-99 8Ε0 ΙΌ N0: 19; Н3 НА2), обладает сильными противовирусными свойствами. Выделенный пептид, содержащий указанные 16 аминокислот в переставленной случайным образом последовательности 8\УЕУМ<1УЕТ00ЕУЕБ (8Ε0 ΙΌ N0: 14), не проявляет заметных противовирусных свойств. Противовирусные свойства Е3 включают ингибирование связывания вируса, как показано анализами гемагглютинации. Также Е3 ингибирует связывание вируса, слияние и инфицирование, как показано в анализах бляшкообразования.
- 11 017957
Активность против вируса гриппа.
Р3 обладает сильной активностью ингибирования инфекции широким диапазоном вирусов гриппа Н1, Н3, Н5 и вирусов гриппа В, которые проявляют значительное разнообразие как в общей последовательности, так и в структуре их соответствующих белков НА2. Широкий спектр активности Р3 может быть связан, по меньшей мере частично, с тем фактом, что ΡΙΒ и, в частности, часть ΡΙΡ. соответствующая остаткам 84-99 всех известных подтипов вируса гриппа А и вируса гриппа В, является одной из наиболее консервативных областей в белке НА2. Без связи с теорией, полагают, что сходство последовательностей между Р3 и соответствующей областью (остатки 84-99) подтипов НА2 дикого типа позволяет пептидам эффективно связываться или иным образом взаимодействовать с соответствующей частью ΡΙΒ в подтипах НА. Это взаимодействие препятствует нормальному действию белка НА в ходе процесса слияния (например, путем препятствования агрегации белков или конформационным изменениям, необходимым для протекания процесса слияния).
Р3 синтезирован в граммовых количествах на смоле РЕС-Р8-РАБ с использованием стандартной химии РМОС. Сыпучий пептидный продукт очищали с использованием ВЭЖХ до >95% с остаточным материалом, представляющим более короткие родственные пептиды. Очищенный пептид лиофилизировали для удаления растворителя. Лиофилизированный порошок можно подвергать дальнейшей обработке, например путем растворения его в гексафторизопропаноле и выпаривания растворителя с помощью потока сверхчистого азота (Ртахаи ИНР, 99,999%). Затем полученный порошок можно позднее перерастворять растворением порошка в водном буфере, таком как 10 мМ фосфат калия или фосфатно-солевой буфер (РВ8). Концентрацию Р3 в растворе можно определять с использованием формулы: мг/мл=(А280хшет)/е, где е представляет собой сумму коэффициентов молекулярной экстинкции двух хромогенных аминокислот в аминокислотной последовательности пептида при 280 нм, т.е. сумму 5560 (Тгр)+1200 (Туг), с получением е=6760.
Р3 обладает сильной и широкой активностью ингибирования вируса гриппа А, и он проявляет пикомолярное ингибирование в анализах снижения бляшкообразования. С использованием иммунного анализа бляшкообразования с микрокристаллической целлюлозой АУ1СЕЬ® в качестве верхнего слоя (Ма1то8ОУ1сй с1 а1., 2006) детекцию бляшек проводят фиксированием монослоев специфичным антителом к нуклеопротеину вируса гриппа. В анализе ингибирования пептидом пептид предварительно инкубируют приблизительно с 100 бляшкообразующих единиц (б.о.е.) вируса в течение приблизительно 1 ч, затем используют для инфицирования монослоев. Для инкубации использовали два типа условий: (1) стандартные условия, при которых пептид включают в верхний слой в той же концентрации, которую использовали на стадии предварительной инкубации, или (2) условия, при которых пептид не включают в верхний слой.
Р3 оценивали в отношении ингибирования множества подтипов вирусов гриппа А с использованием анализа бляшкообразования на клетках почки собаки Мабш-ОатЬу (МОСК), проводимого с использованием подтипов А/А8Ы/33 (НШ1) и А/Шогп/72 (Н3Ы2) вируса гриппа А. Разведения от 50 до 2,5 мкМ Р3 и контрольного пептида со случайной перестановкой (8ЕО ΙΌ N0:14) использовали для оценки эффектов этих пептидов на инфекционность вируса. Шесть разведений Р3 и контрольного пептида тестировали против подтипа вируса НШ1; и другие шесть разведений каждого пептида тестировали против подтипа вируса №N2.
В условиях (1) Р3 ингибировал образование бляшек нормального размера несколькими штаммами НШ1 и №N2 вируса гриппа А с 1С50 в диапазоне приблизительно 100-500 пмоль (пМ). В условиях (2) 1С50 для ингибирования бляшек нормального размера находилась в диапазоне приблизительно от 10 до 100 нмоль (нМ) для Р3. При низких нМ-концентрациях (<10 нМ) для условий (1) или низких мкМ-концентрациях (<10 мкМ) для условий (2) было заметным наличие мини-бляшек.
Контрольный пептид с перестановкой не ингибировал образование бляшек вируса гриппа А в любых условиях, указывая на то, что аминокислотная последовательность пептида важна и что неспецифические эффекты не могут объяснить ингибирование.
Также Р3 является активным против рекомбинантного вируса гриппа 45Ν1 и против двух штаммов вируса гриппа В (В/8йаидйа1/361/2002 и В/8йаидйа1/10/2003), ίη νίίτο, в иммунных анализах бляшкообразования с 1С50 в низком нМ-диапазоне (<5 нМ). С учетом разнообразия этих различных штаммов вируса гриппа А и В, Р3, вероятно, является эффективным против большинства вирусов гриппа.
С использованием способов, описанных в патентной заявке США с серийным № 10/578013, Р1Р подтипа Н1 вирусов гриппа А в данной работе идентифицирована как остатки с 77 по 110 последовательности Н1 НА2 (8ЕО ΙΌ N0: 17). Выделенный пептид, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 4, обозначаемый в настоящем документе как ингибитор-1 гриппа (Р1), также обладает сильной (пикомолярной) противовирусной активностью как против подтипа Н1, так и против подтипа Н3, вируса гриппа А в анализах бляшкообразования. Аминокислотная последовательность Р1 соответствует остаткам 84-102 последовательности РШ Н1, 8Е0 ΙΌ N0: 17.
- 12 017957
Исследования проводили на различных штаммах вируса гриппа для лучшего понимания механизма действия пептидов по изобретению, например, для определения того, какая стадия в репликационном цикле вируса ингибируется Ε3, Ε1 и родственными ингибирующими вирус гриппа пептидами. При оптимальных количествах эритроцитов и концентрациях вируса гриппа Л/РК/8/34 (Η1Ν1) как Ε3, так и Ε1 ингибировали индуцируемую вирусом гриппа гемагглютинацию при концентрации приблизительно 10 мкМ. При оптимальных разведениях клеток и вируса (1:8 в обоих случаях) Ε3 ингибировал гемагглютинацию при концентрациях между 12,5 и 6,25 мкМ. Сходные результаты получали для других штаммов Н3 и Η1, т.е. штаммов Λ/Νο\ν Са1ебоша/20/99 и Λ/Ψ8Ν/33 Η1Ν1; и штаммов А/Са11Гогша/07/2004, Λ/Νο\ν Уогк/55/04 и А/ибогп/72 Η3Ν2. Напротив, контрольный пептид, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 14, представляющий собой вариант Е3 с перестановкой, не ингибировал гемагглютинацию при любой концентрации.
Более высокие концентрации вируса могут преодолеть ингибирование гемагглютинации, указывая на стохастический механизм. Результат этого традиционного анализа связывания вируса с клеткой позволяет предположить, что пептиды по изобретению взаимодействуют непосредственно с вирионами, ингибируя связывание с клетками. Напротив, лекарственное средство против ВИЧ ΕυΖΕΟΝ® взаимодействует с короткоживущим промежуточным соединением для слияния, но не со структурой вириона (ЭеЬпаШ, 2006; Р1ай, Онгшп. апб КаЬа1. 2005). Прямое взаимодействие с нативными структурами вириона может объяснить, по меньшей мере частично, очень высокую эффективность Ε3 и Ε1 (приблизительно 200 пМ для бляшек нормального размера) относительно лекарственного средства против ВИЧ ΕυΖΕΟΝ® (от 4 до 280 нМ, в зависимости от штамма ВИЧ-Ι) в анализах инфекционности вируса. Минибляшки, описанные выше, могут быть следствием повторного сворачивания ΗΛ на вирионе.
Ранее предполагали, что повторное сворачивание ΗΛ происходит после воздействия низкомолекулярного ингибитора вируса гриппа А, который, как известно, взаимодействует с ΗΛ (С1апс1 е1 а1., 1999; Ьио, Со1оппо, апб Кгуйа1, 1996; Ьио е1 а1., 1997). Этот и другие ингибиторы проникновения (ИоГГшап е1 а1., 1997) были довольно существенными достижениями в поздние 1990-е гг., поскольку они идентифицировали ΗΛ в качестве важной терапевтической мишени. Однако такие низкомолекулярные ингибиторы до настоящего времени не были разработаны в качестве лекарственных средств против гриппа, наиболее вероятно, вследствие их относительно низкой эффективности, с 1С50 в диапазоне от низкой до средней мкМ-концентрации. Развивающаяся согласованность в растущей области ингибиторов проникновения вирусов сходится на том, что низкомолекулярные лекарственные средства могут быть не способны эффективно препятствовать обширным структурным переходам белков и множеству внутримолекулярных взаимодействий, которым ΗΛ и другие белки слияния вируса подвергаются в ходе процесса проникновения вируса.
Рабочую модель для процесса слияния вирус гриппа-клетка можно экстраполировать из интенсивной работы по вирусу гриппа и другим РНК-вирусам в течение многих десятилетий. Схематичное изображение такой модели представлено на фиг. 5. Хотя все еще гипотетическая в некоторых аспектах, эта модель может осветить важность структурных/функциональных мотивов гликопротеинов вируса гриппа А, которые могут служить в качестве мишеней для разработки лекарственных средств. На фиг. 5, на панели А представлено связывание белка гемагглютинина 1 (ΗΛ1) вируса гриппа с клеточным рецептором, который состоит из сиалолипидов или сиалобелков. На панели В представлено вхождение вириона вируса гриппа в эндоцитарную везикулу. Белок вируса гриппа, известный как виропорин, М2 снижает рН для запуска перестройки спиральных доменов белка ΗΛ2. Последовательность белка ΗΛ2, соответствующая аминокислотной последовательности Ε3 (8Еф ΙΌ ΝΟ:3) расположена рядом с метастабильной последовательностью кргшд. Перестройка позволяет части пептида слияния белка ΗΛ2 взаимодействовать с мембраной везикулы. На панели С и Ό проиллюстрировано раскручивание ΗΛ2 посредством механизма шнурок в желобке, приводящего вирусные и клеточные мембраны в близкое расположение. Для ясности, ΗΛ1 и сиалорецепторы не показаны на панелях С-Е. На панели С представлен альтернативный механизм, посредством которого последовательности ΗΛ2, которые образуют участок со способностью связываться с бислойными мембранами, могут способствовать объединению клеточных и вирусных мембран. На панели Е представлено образование поры слияния и проникновение сегментов рибонуклеопротеина из вируса в клетку.
Исследования на живых животных.
Хорька, главным образом, считают наилучшей моделью инфицирования вирусом гриппа человека (Ооуогкоуа е1 а1., 2005; Ηатр8оη, 2006; Майег апб Ое81еГапо, 2004; уап Ше1 е1 а1., 2007). Действительно, в руководстве Европейского союза по эффективности вакцин против гриппа конкретно требуется тестирование в модели на хомяках. Мышей и других небольших млекопитающих можно инфицировать штаммами вируса гриппа А человека, однако это, как правило, требует, в случае сезонных штаммов, адаптации вируса к новому хозяину. Напротив, хорьков можно инфицировать большинством штаммов вирусов гриппа А человека без адаптации. Распределение в тканях и патогенез адаптированных вирусов гриппа А у мышей отличается от распределения в тканях и патогенеза, которые происходят при заболевании человека (Ьи е1 а1., 1999). Патогенез инфекции вирусом А у хорьков высоко сходен с патогенезом, наблюдае- 13 017957 мым у человека. Когда хорькам экспериментально проводят интраназальную инокуляцию, происходит локальная репликация вируса в верхних дыхательных путях. Распределение рецепторов сиаловых кислот в дыхательных путях хорьков сходно с распределением у человека (ναη ΡίοΙ с1 а1., 2006; Уеи с1 а1., 2007).
Путем, удивительно сходным с путем у людей с гриппом, у хорьков развивается сниженная активность, лихорадка, отсутствие аппетита, выделения из носа, чихание, диспноэ, диарея, конъюнктивальные выделения и неврологические признаки. Основным патологическим показателем как у хорьков, так и у человека является десквамация реснитчатого дыхательного эпителия и инфильтрация подслизистой оболочки носовой полости инфильтрирующими воспалительными клетками. В пределах 48 ч после инфицирования хорька вирусом гриппа происходит практически полное разрушение дыхательного эпителия носовой полости и остается только базальная мембрана.
Основным отличием между гриппом у хорьков и человека является длительность проявления симптомов заболевания. У хорьков начинается развитие симптомов гриппа скорее чем через одни сутки после инфицирования, однако через 4 суток инфекция разрешается по большинству из хорошо известных признаков (сниженная активность, лихорадка, снижение аппетита, выделения из носа, чихание и т.д.). Следует отметить, что многие штаммы вируса гриппа А человека способны инфицировать нижние дыхательные пути хорьков в различной степени. Как и у человека, высокопатогенные штаммы вируса гриппа А способны распространяться у хорьков либо из верхних дыхательных путей в головной мозг, либо из нижних дыхательных путей в кровоток и другие органы. Современные штаммы Η5Ν1 вируса птичьего гриппа А могут вызывать летальные инфекции у хорьков (Сотогкота е1 а1., 2005; Т1пгу е1 а1., 2007; УаЫеикатр аиб Нагбег, 2006).
Первоначальные исследования ίη νίίτο были сфокусированы на хорошо охарактеризованных лабораторных штаммах вируса гриппа А, соответствующих подтипам, в настоящее время циркулирующим у человека, включая Α/^δΝ/33 (Η1Ν1), А/РК./8/34 (Η1Ν1) и А/ибогп/72 (Η3Ν2). Пептиды Р3 и Р1 продемонстрировали сходную эффективность в анализах снижения бляшкообразования против нескольких других штаммов вируса гриппа А, включая клинические изоляты штаммов Η1Ν1 (Λ/№\ν Са1ебои1а/20/99) и Η3Ν2 (А/НУ/55/04; А/Са1/07/04), которые не оценивали обширно в лаборатории. Исследования последних клинических изолятов, таких как эти, являются важными для определения эффективности лекарственных средств с вирусами, в текущее время вызывающими грипп у человека. Важно, что эти штаммы также вызывали грипп у хорьков, вырастая до высоких титров в носовых раковинах и легких этого вида после интраназальной инокуляции.
Для всех исследований изоляты вирусов размножали в куриных яйцах с зародышем (полученных от С1аг1е8 РР'ег ЬаЬогаЮпек или Ьошыаиа 8ίаίе ипкегайу Роийгу Зшеисек Оераг1тен1) с использованием стандартных способов. Аллантоисную жидкость собирали из 11-дневных яиц через одни сутки после инокуляции и пулы вирусов исследовали в отношении активности гемагглютинации против эритроцитов индейки (ШВС) (Ьатрпе ЬаЬогаЮпек, И8А) с использованием стандартных способов. Пулы с положительной гемагглютинацией (>256 единиц ΗА) титровали анализом бляшкообразования вирусом, как описано выше, и хранили в жидком азоте до применения для исследований иммунизации. Пептиды изготавливали в фосфатном буфере и буферные растворы наносили прямо в носовые ходы хорьков под анестезией с использованием пипетки (интраназальный способ введения).
Исследование заражения 1.
Хорькам предварительно вводили Р3 или контрольный вариант пептида с перестановкой (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14) в течение 2 суток до воздействия вируса (сутки -2 и сутки -1) в дозе приблизительно 0,3 мг/кг интраназальным путем либо один раз в сутки, либо два раза в сутки. Через 12 ч после последнего введения животных инфицировали путем интраназальной инокуляции приблизительно 105 б.о.е. штамма А/Са1/07/04 вируса гриппа Η3Ν2, что по меньшей мере в 100 раз превышает минимальную инфекционную дозу, как определено в исследованиях выявления инфекционной дозы. Пептиды повторно вводили хорькам в дозе 0,3 мг/кг приблизительно через 12 ч на 0 сутки, а также на 1- и 2-е сутки после воздействия вируса. На 2 сутки у всех хорьков, которым вводили контрольный пептид с перестановкой, развивалось выраженное затруднение дыхания (быстрое неглубокое дыхание), высокая лихорадка и чихание. Напротив, ни у одного из животных, которым вводили Р3, не было тяжелого затруднения дыхания, хотя подгруппа (2/5 в группе с предварительным введением два раза в сутки, 1/6 в группе с предварительным введением один раз в сутки) показала некоторые очень мягкие дыхательные признаки с небольшой лихорадкой. На 3 сутки у всех хорьков, которым вводили Р3, не было выявлено клинических признаков гриппа, хотя у 50% хорьков, которым вводили контрольный пептид с перестановкой, все еще имелась сонливость, и у 100% хорьков, которым вводили контрольный пептид с перестановкой, были показаны выраженные выделения из носа. Очевидно, Р3 обеспечивал выраженную и удивительно эффективную пользу при лечении в этом исходном эксперименте с заражением.
Исследование заражения 2.
Во втором исследовании заражения 12 хорьков были включены в группу введения Р3 и 12 хорьков были включены в группу контрольного пептида. Животных инфицировали приблизительно 105 б.о.е.
вируса гриппа А/Са1/07/04; однако в этом исследовании хорькам вводили 0,3 мг/кг Р3 или контрольного пептида через 4 ч после воздействия вируса на 0 сутки, без введений до воздействия вируса. На 2 сутки у
- 14 017957 всех 12 хорьков, которым вводили контрольный пептид с перестановкой, развивалось выраженное затруднение дыхания, высокая лихорадка и чихание. Напротив, ни одного из животных, которым вводили Р3, к этому времени не было каких-либо признаков затруднения дыхания или других признаков гриппа. На фиг. 6 показаны патологические ответы, наблюдаемые у хорьков в ходе исследования, полученные мониторингом затрудненного дыхания (панель А), выделений из носа (панель В) и активности (панель С) для обеих групп введения в ходе прижизненного периода исследования.
Как указано на фиг. 6, у мышей, которым вводили Р3, были показаны значительно сниженные патологические ответы относительно контрольной группы. Только у двух животных в группе, в которой вводили Р3, развивались мягкие признаки гриппа, и это происходило на 4 сутки эксперимента, через 2 суток после прекращения введения пептида. В дополнение к клиническим параметрам, на протяжении периода исследования собирали носовые аспираты и легочные и внелегочные ткани с суточными интервалами для анализа титра вируса, макроскопической патологии и гистопатологического анализа. У животных, которым вводили Р3, были показаны нормальные легочные показатели. Напротив, у хорьков, которым вводили контрольный пептид, были показаны признаки воспаления. В тканях хорьков, которым вводили Р3, была показана значительно более низкая патология по сравнению с животными, которым вводили контрольный пептид, причем у хорьков, которым вводили контрольный пептид была показана инфильтрация, воспаление бронхов с экссудатами бронхов, характерными для инфекции гриппом.
Количественный анализ посредством КТ-РСК. и консервативные праймеры для гена нуклеопротеина, вируса гриппа обеспечивают надежные анализы уровней геномной РНК вируса в гомогенатах тканей хорьков, которым проводили введение и инфицирование. Образцы носовых аспиратов собирали от животных в ходе периода исследования. Титры вирусов из этих образцов представлены на фиг. 7, панель А. Результаты анализов гомогенатов тканей хорьков, взятых из головного мозга, трахеи, печени, селезенки и крови на 1 сутки исследования, представлены на панели В фиг. 7. Данные на панели А демонстрируют, что пиковые титры вируса гриппа в носовых смывах хорьков снижались более чем на 2,0 1од10 и в легких более чем на 6,0 1од10. Эти результаты указывают на то, что Р3 значительно снижал репликацию вируса гриппа в верхних дыхательных путях хорьков. Данные на панели В указывают на то, что Р3 эффективно блокировал распространение вируса в нижние дыхательные пути, а также в другие органы.
Идентификация Р1К вируса гриппа.
С-конец Р1К вируса гриппа можно определить как остаток, непосредственно предшествующий первой пептидной последовательности, которая проявляется положительно возрастающей поверхностной гидрофобностью на кривой поверхностной гидропатии \У1т1еу-\У1н(е, которая находится после С-конца Ν-спирали (остаток 104). В табл. 3 представлена шкала поверхностной гидрофобности ^1т1еу-^Ы1е для белков на мембранных поверхностях, как описано ^1т1еу и ^УН11е в 1996. Эта шакала гидрофобности или гидропатии основана на заряде свободной энергии, требуемом для переноса остатка пептида с гидрофобной поверхности бислойной мембраны в водную фазу. На этой шкале положительная свободная энергия (ДО), в килокалориях на моль, указывает на более гидрофобный остаток (т.е. энергию необходимо добавлять для переноса гидрофобного остатка из гидрофобной мембраны в воду). Аналогично, отрицательная свободная энергия указывает на более гидрофильный остаток. На кривой поверхностной гидрофобности \Уип1еу-\У1Ше Р1К характеризуется пиковой областью гидропатии (т.е. областью относительно более высокой гидрофобности, включая локальный максимум гидрофобности, расположенный между двумя локальными минимумами гидрофобности). Эта пиковая область начинается в Ν-спирали белка НА2 и кончается в пределах приблизительно 15 остатков после Ν-спирали.
- 15 017957
Таблица 3
Шкала поверхностной гидрофобности ^1т1еу-^1йе ЛС остаток X рН (ккал моль )
А1а 8 -0,17±0,06
Асд 2 -0,81+0,11
Азп . 8 . ,,-0, 42+0,06
Азр 8 -1,23+0,07
Азр 2 0,07+0,11
Суз 8 0,24+0,06
С1п 8 -0, 58+0,08
С1и 8 -2,02+0,11
С1и 2 , ' 0,01+0,15
С1у 8 -0,ОНО,05
Ηί3 8 -0,17±0,06
ΗΪ3 2 -0,96±0,12
Не 8 0,31±0,06
Ьеи 8 0,56+0,04
Ьуз 2 -0,99+0,11
МеС 8 0,23+0,06
РЬе 8 1,13+0,05
Рго 8 -0,45±0,12
Зег 8 -0,13+0,08
ТЬг 8 -0,14+0,06
Тгр 8 1,85+0,06
Туг 8 0,94+0,06
Уа1 8 -0,07+0,05
Для вычисления профиля поверхностной гидропатии белка или полипептида можно использовать компьютерные программы, такие как МетЬгапе Рго!еш Ехр1огег (МРЕх), доступные на \\еЬ-сайте: Ь1апсо.Ьюто1.ис1.е6и/трех. Программа МРЕх включает шкалы гидропатии ^1т1еу-^ййе, и она представляет собой предпочтительный способ установления степени поверхностной гидрофобности этих пептидных последовательностей. Компьютерную программу МРЕх использовали для облегчения охарактеризации С-конца ЕШ в каждом из 13 отсеквенированных вариантов НА2, представленных на фиг. 2. Компьютерная программа МРЕх строит графики показателя поверхностной гидропатии \¥пп1еу-\¥1Ше для представляющего интерес белка или пептида путем усреднения значений общей гидропатии остатка для всех остатков в окне, состоящем из фиксированного количества последовательно расположенных аминокислотных остатков (предпочтительно приблизительно 19 остатков), и нанесения на график среднего значения гидропатии в окне в качестве показателя гидропатии для среднего остатка в окне. Затем окно сдвигают на один остаток, перемещаясь в направлении от Ν-конца к С-концу, и процесс повторяют до тех пор, пока не определят показатель гидропатии для каждого остатка в представляющей интерес области.
Поверхностные профили гидропатии \¥пп1еу-\¥1и1е для всех из 13 подтипов НА2, представленных на фиг. 2, получали, применяя программу МРЕх, с использованием окна из 19 аминокислотных остатков. Ν-конец ЕШ выявлен в точке в Ν-спирали белка, в которой поверхностная гидропатия начинает устойчиво возрастать после локального минимума (т.е. в остатке 77 для всех из исследованных к настоящему времени белков НА2). С-конец ЕШ представляет собой остаток, непосредственно предшествующий первому локальному минимуму в гидрофобности после Ν-спирали, т.е. остаток, непосредственно предшествующий первой пептидной последовательности с положительно возрастающей поверхностной гидрофобностью, которая находится после С-конца Ν-спирали. В каждом подтипе НА2 вируса гриппа А, представленном на фиг. 2, Ν-спираль оканчивается в остатке 104. График показателей гидропатии \¥нп1еу\¥1Ше не обязательно должен пересекать ноль на оси, чтобы он был пригодным для установления положения С-конца ЕШ, в нем только должно быть повышение показателя гидропатии относительно предыдущих остатков пептида.
На фиг. 8-20 представлены профили гидропатии ХУтбеу-ХУНПе, полученные с помощью МРЕх, для отсеквенированных вариантов белка слияния НА2 вируса гриппа А (на этих фигурах А указывает на
Е!Е пептида, характеризующийся пиком на графике гидропатии).
- 16 017957
С-конец НЯ указан на каждой из фиг. 8-20 как В. Из анализов было показано, что вконец НЯ начинается в остатке 77 последовательности НА2, в каждом подтипе вируса НА2. С-конец НЯ варьирует между остатками 110 и 119 для каждого из подтипов НА2. Область НЯ выделена на фиг. 2 с помощью затемненной рамки вокруг остатков с 77 по 110 или 119.
Пептиды по изобретению, обладающие повышенной активностью, можно идентифицировать получением гнездовых наборов пептидов, которые являются либо более длинными (соответствующими фланкирующим последовательностям НА), либо укороченными по сравнению с активной частью ингибиторного белка-мишени НЯ (например, 8ЕЦ ГО N0: 2). Пептиды, которые удлиняют аминокислотную последовательность НА-мишень на 3-6 аминокислот на N или С-концах пептидов, тестируют систематически против ряда вирусов гриппа для определения того, приводят ли аминокислотные сегменты на каждой стороне последовательности к повышенному ингибированию инфекционности. Если пептид, более длинный, чем последовательность-мишень, ингибирует инфекционность вируса гриппа А с меньшей 1С50, чем у мишени, тогда пептиды, имеющие меньшее количество дополнительных аминокислот, чем мишень, можно систематически тестировать для определения минимального пептида с активностью ингибирования инфекционности. Активные пептиды, специфичные к конкретному типу/или подтипу, также можно тестировать против нескольких дополнительных штаммов того же типа или подтипа вируса гриппа для определения широты ингибиторной активности. Например, пептид-мишень на основе 8Е0 ГО N0: 5 должен ингибировать множество вирусов подтипа Н5 с 1С50<100 нМ.
Другие варианты пептидов, пригодные для тестирования, можно определять, систематически заменяя остатки в последовательности-мишени на остатки аланина (что обозначают в настоящем документе как сканирование аланином). Сравнение модифицированных аланином пептидов с пептидами дикого типа идентифицирует остатки, важные для ингибирования слияния/инфекционности. Если более одной аминокислоты влияют на ингибирование, можно синтезировать дополнительные пептиды с заменами в каждом имеющем значение остатке.
Функциональные домены, на которые предположительно нацелены пептиды по изобретению (например, с 8Е0 ГО N0: 3 по 8ЕЦ ГО N0: 13), имеют конфигурацию альфа-спирали. Варианты пептидов, которые повышают или снижают спиральность, могут изменять активность пептидов в качестве ингибиторов слияния/инфекционности вируса гриппа А. Таким образом, варианты или аналоги активных пептидов можно получать заменой аминокислот, которые способствуют содержанию спиралей, таких как аминобутират (А1В) или глутаминовая кислота, другими аминокислотами. Аналогично, добавление остатков пролина или остатков глицина в пептид может снизить содержание альфа-спиралей, что информативно либо повысит, либо снизит ингибиторную активность. Дополнительные аналоги пептидов с повышенным связыванием с НА2, идентифицированные скринингом комбинаторных библиотек, также можно тестировать в отношении ингибирования инфекционности вируса гриппа.
Пептидазы в носовой полости или в легком могут потенциально ограничить применимость основных лекарственных средств ίη νίνο. Если вариант пептида, который является активным в анализах снижения бляшкообразования, деградируется или быстро выводится из дыхательных тканей, можно проводить дополнительные модификации для повышения стабильности и удержания пептидов. Сухой порошок или изменения/добавления в состав могут повысить стабильность пептидов. Циклические аналоги пептидов с двумя дополнительными остатками цистеина, добавленными для получения циклизованного дисульфидом пептида, могут стабилизировать вторичные структуры и делать пептид более устойчивым к деградации. Замена двух или более остатков пролином также может значительно повысить стабильность синтетических пептидов. Различные N или С-концевые модификации или конъюгация с белками (например, сывороточным альбумином) или липидами (например, миристиновой кислотой) также могут повысить стабильность активности вирусных ингибиторных пептидов (ОигекЫ е1 а1., 1990), так же как и введение неприродных аминокислот (гидроксипролина или Ό-аминокислот) в участки расщепления пептидазой.
В случае, когда ингибиторные пептиды демонстрируют низкую растворимость в водных растворах, варианты пептидов можно синтезировать с вариацией в последовательности А8К8К8К (8ЕЦ ГО N0: 15), добавленной на С-конце для повышения растворимости пептида. Было показано, что эта последовательность повышает растворимость модельных пептидов при сохранении вторичной структуры. Повышенная растворимость также может снижать концентрацию, требуемую для ингибирования опосредуемого оболочкой вируса гриппа слияния.
Последовательности консервативных остатков.
Было выявлено, что высококонсервативная последовательность ΥNΑΕ^^ (8ЕЦ ГО N0: 1) находится в НЯ 11 из 13 отсеквенированных подтипов НА2 и что соответствующая последовательность ΥNΑК^^ (8ЕЦ ГО N0: 16), которая обладает одной аминокислотной заменой в 8ЕЦ ГО N0: 1, встречается в других двух подтипах. Только одна другая последовательность в 13 отсеквенированных вариантах НА2 является более высококонсервативной, чем ΥNΑΕ^^ (8ЕЦ ГО N0: 1). Эта последовательность, А1А0НЕ (8ЕЦ ГО N0: 31, остатки 5-11 полноразмерного белка), находится в пептиде слияния, или ЕР, белка НА2. Домен ЕР представляет собой 1 из 5 ранее известных доменов вирусных белков слияния класса I, и, как было известно ранее, домен ЕР играет важную роль в процессе слияния вируса и клетки.
- 17 017957
Использование форм единственного числа и сходных обозначений в контексте описания изобретения (конкретно, в контексте представленной ниже формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее форму как единственного, так и множественного числа, если в настоящем документе нет иных указаний или если этому не противоречит контекст. Термины содержащий, имеющий, включающий и охватывающий следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие включающий, но не ограничивающийся ими), если нет иных указаний. Перечисление диапазонов величин в настоящем документе предназначено только для сокращенного обозначения индивидуально каждого отдельного значения, находящегося в диапазоне, если в настоящем документе нет иных указаний, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было конкретно приведено в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, можно выполнять в любом пригодном порядке, если в настоящем документе нет иных указаний, или в ином случае, если этому явно не противоречит контекст. Применение любых и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, такой как), представленных в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать, как указывающие на какой-либо незаявленный элемент, как необходимый для осуществления на практике изобретения.
Предпочтительные варианты осуществления этого изобретения описаны в настоящем документе, включая наилучший способ осуществления изобретения, известный авторам изобретения. Варианты этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалисту в данной области при прочтении представленного выше описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты соответствующим образом, и авторы изобретения предполагают применение на практике изобретения иным образом, чем конкретно описано в настоящем документе. Таким образом, это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, приведенного в формуле изобретения, прилагаемой к настоящему документу, как допустимые действующим законом. Более того, любое сочетание описанных выше элементов во всех возможных их вариантах охватывается изобретением, если в настоящем документе нет иных указаний или если в ином случае этому явно не противоречит контекст.

Claims (27)

1. Выделенный пептид, способный ингибировать слияние вируса гриппа с мембраной клетки хозяина, где пептид состоит из 8-40 последовательно расположенных аминокислотных остатков 8ЕО ΙΌ N0: 2 (ЕУЕ6К1ОЭкЕК¥УЕт'К1Эк+8¥\АЕккУАкЕ\ОНТ1ЭкТЭ8) или ее варианта, причем вариант отличается от 8ЕО ΙΌ N0: 2 одной или несколькими аминокислотными заменами, где пептид содержит, по меньшей мере, аминокислотные остатки с 23 по 28 8ЕО ΙΌ N0: 2 или ее варианта и где одна или несколько замен аминокислотных остатков выбраны из группы, состоящей из:
У2С, ν28, ν2Τ, У21, У2Ь, ν2Α, У2М, У2С, Ε3ϋ, Ε3Ν , Ε30, С4Т, (348, Θ4Κ, 04 Ε, 04Η, 040, (34Ν, Κ5Κ, К5Н, К50, Ε5Ν, 16Ь, Ι6ν, Ι6Α, Ι5Μ, 16С, 07Ν, 07Ε, Ω7Β, 070, 078, 07Т, Ώ8Ε, 08Ν, 080, ϋ3Μ, Ό80, Ь91, Ь9У, ЬЭА. , ЬЭМ, ЬЭС, ΕΙΟϋ, ΕΙΟΝ, Е100, Ε10Ι, ЕЮЬ, ΕΙΟν, Ε10Α, Е10М, Е10С, КИК, КИН, , К1Ю, КИЕ, Κ11Ν, К1Ю, Υ12Μ, Υ12Κ, Υ12Ε, Υ12Η, У131,У13Ь, νΐ3Α, νΐ3(3, , νΐ3Τ , VI38 ϊ, νΐ3Μ, У13С, Ε14ϋ, Е14К, Е14Й, , Е14Н, ϋ15Ε, Ώ15Κ, Β15Ν, 0150, , Τ160, Τ168, Τ16Α, изо, Τ16Ν. , Κ17Ρ, Κ17Ε, Κ17Μ, К17С, Κ17Ι. , Κ17ν, Κ17Ε, Κ17Α, изь, ιιβν , Ι18Α, Ι18Τ, 1138, 118(3, 1180. , Ι18Ν, Ό19Ε, Β19Ν, шэо, Ь201. , Ь20У, Ь20А, Ь20С, Ь20М, Κ21Υ , И21А, 522Τ, 822С, 822А, 822Μ, , 822С, Υ23Ν, Υ235, Υ23Τ, Υ23Α , N240, Ν24ϋ, Ν24Ξ, Α25Ι, А25У. , А25Ь, Α25Μ, Ε26ϋ, Ε26Κ, Е26К, , Ξ26Η, Ь27А, Ь271, Ιι27ν, Ь27М. , Β28Ι, Ь28У, Ь28А, Ь28М, У291, , У29Ь, ν29Α, У29М, АЗ ΟΙ, АЗОЬ , АЗОУ, АЗОМ, АЗ ОС, ЬЗИ, Β3ΐν. , Ь31А, Б31М, Ь31С, Е32В, Ε32Ν, , Ε320, N330, N330, 034Ε, Ν33Ε, , 034Ε, 034ϋ, 034(3, 0348, 034Τ , Η35Κ, Η35Κ, Η35Ν, Η350, Τ363. , Т36СЗ, 137Ь, Ι37ν, 13 7А, 13 7Μ, , 137С, Ό38Ε, ϋ3 3Ν, Ό380, ЬЗЭЕ, , Β39Ι, β39ν. ЬЗЭМ, ЬЗЭС, ЬЗЭА , ЬЗЭЕ, £39β, ЬЗЭЫ, ьзэо. Т40Н. , Τ40Ε, Τ40Κ, Τ403, Τ40Θ, Т4 0А , Τ40Μ, ϋ41Ε, В41Ν, 0410, 8420 , 342Τ, 8421, 842Ь, 342Υ, 84 2А, 842Μ и 842С.
2. Выделенный пептид по п.1, где вариант обладает по меньшей мере 50%-ной идентичностью последовательности с 8ЕО ΙΌ N0: 2.
3. Выделенный пептид по п.1, где вариант обладает по меньшей мере 60%-ной идентичностью последовательности с 8Е0 ΙΌ N0: 2.
4. Выделенный пептид по п.1, где вариант обладает по меньшей мере 70%-ной идентичностью последовательности с 8Е0 ΙΌ N0: 2.
5. Выделенный пептид по п.1, где вариант обладает по меньшей мере 80%-ной идентичностью последовательности с 8Е0 ΙΌ N0: 2.
6. Выделенный пептид по любому из пп.1-5, где вариант 8Е0 ΙΌ N0: 2 включает замену Е26К.
7. Выделенный пептид по п.1, где пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 6, 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8ЕО ΙΌ N0: 8, 8ЕО ΙΌ N0: 9, 8ЕО ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 11, 8ЕО ΙΌ N0: 12, 8ЕО ΙΌ N0: 13, и вариант 8Е0 ΙΌ N0:3, включающий одну или несколько аминокислотных замен в указанной аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из:
- 19 017957
VII, У1Ь, νΐΑ, νια. νιτ. νΐ3. νΐΜ, Ε2ϋ, Ε2Κ, Ε2Κ, ИЗЕ, Т46, Т43, Т40, Τ4Ν, К5Г, К5М, Κ5Ι, Κ5ν, К5Ь, Κ5Α, 16Ь, 167, Ι6Τ, 163, 160, Ι6Ν, И7Е, Ь81, Ь8У, Ь8А, Η9Υ, 310Τ, 3100, 310А и Э10М
где вариант содержит последовательность ΥΝΑΕΕΕ (8ΕΟ ΙΌ N0: 1) и обладает по меньшей мере 50%-ной идентичностью последовательности с 8Ε0 ΙΌ N0: 3.
8. Производное пептида по любому из пп.1-7, где пептид включает группу, образованную из неНА2, связанную с пептидом.
9. Производное по п.8, где группа, образованная из не-НА2, включает по меньшей мере одну из следующих групп:
(a) липид, связанный с остатком пептида;
(b) группа полиэтиленгликоля, связанная с остатком пептида; или (c) пептидная последовательность не-НА2, связанная с аминоконцом, карбоксиконцом или обоими концами пептида.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид по любому из пп.1-7 в фармацевтически приемлемом носителе.
11. Применение пептида по любому из пп.1-7 для лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа.
12. Применение пептида по любому из пп.1-7 для профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа.
13. Применение пептида по любому из пп.1-7 для изготовления лекарственного средства для лечения гриппа.
14. Способ лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа, включающий введение субъекту, страдающему гриппом, ингибирующего количества фармацевтической композиции по п.10.
15. Способ по п.14, где субъект страдает от инфекции, вызванной вирусом гриппа А подтипа Н1, Н3 или Н5.
16. Способ по п. 14, где субъект страдает от инфекции, вызванной вирусом гриппа В.
17. Способ профилактики передачи инфекции, вызванной вирусом гриппа, от инфицированного субъекта к неинфицированному субъекту, причем способ включает введение субъекту, страдающему гриппом, ингибирующего количества фармацевтической композиции по п.10.
18. Способ по п.17, где субъект, инфицированный вирусом гриппа, страдает от инфекции вирусом гриппа А подтипа Н1, Н3 или Н5.
19. Способ по п.17, где субъект, инфицированный вирусом гриппа, страдает от инфекции вирусом гриппа В.
20. Способ профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа, у субъекта, причем способ включает введение субъекту ингибирующего грипп количества фармацевтической композиции по п.10.
21. Способ по п.20, где инфекция, вызванная вирусом гриппа, представляет собой инфекцию, вызванную вирусом гриппа А подтипа Н1, Н3 или Н5.
22. Способ по п.20, где инфекция, вызванная вирусом гриппа, представляет собой инфекцию, вызванную вирусом гриппа В.
23. Способ по любому из пп.14-22, где введение включает интраназальное введение фармацевтической композиции.
24. Выделенный пептид по п.1, имеющий длину от 9 до 16 аминокислотных остатков.
25. Композиция по п.10, в которой фармацевтически приемлемый носитель содержит буферный солевой раствор.
26. Композиция по п.10, в которой фармацевтически приемлемый носитель содержит фосфатный буфер.
27. Композиция по п.10, где фармацевтическая композиция находится в форме ингалируемого порошка.
EA201070053A 2007-06-25 2008-06-25 Композиции и способы, ингибирующие грипп EA017957B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93712007P 2007-06-25 2007-06-25
PCT/US2008/007918 WO2009002516A1 (en) 2007-06-25 2008-06-25 Influenza inhibiting compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070053A1 EA201070053A1 (ru) 2010-08-30
EA017957B1 true EA017957B1 (ru) 2013-04-30

Family

ID=40185954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070053A EA017957B1 (ru) 2007-06-25 2008-06-25 Композиции и способы, ингибирующие грипп

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8604165B2 (ru)
EP (1) EP2170365B1 (ru)
JP (2) JP5450402B2 (ru)
KR (4) KR101719135B1 (ru)
CN (2) CN101848719B (ru)
BR (1) BRPI0813922A2 (ru)
CA (1) CA2691358C (ru)
DK (1) DK2170365T3 (ru)
EA (1) EA017957B1 (ru)
ES (1) ES2581381T3 (ru)
HK (2) HK1142804A1 (ru)
HU (1) HUE029921T2 (ru)
IL (2) IL202450A (ru)
MX (2) MX2009013635A (ru)
PL (1) PL2170365T3 (ru)
PT (1) PT2170365T (ru)
WO (1) WO2009002516A1 (ru)
ZA (1) ZA200909130B (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110126501A1 (en) 2009-10-16 2011-06-02 Woongjin Coway Co., Ltd. Composition for prevention of influenza viral infection comprising tannic acid, air filter comprising the same and air cleaning device comprising the filter
KR101153630B1 (ko) * 2009-10-16 2012-06-18 웅진코웨이주식회사 타닌산을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 기상필터 및 상기 필터를 포함하는 공기청정기
SG11201406769RA (en) * 2012-05-10 2014-11-27 Massachusetts Inst Technology Agents for influenza neutralization
US9649375B2 (en) * 2013-03-14 2017-05-16 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Immunogenic peptide conjugate and method for inducing an anti-influenza therapeutic antibody response therewith
US20180128545A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
US20190367567A1 (en) * 2016-12-02 2019-12-05 Emory University Peptides and Uses for Managing Viral Infections
KR20230038416A (ko) 2020-05-08 2023-03-20 아카데미아 시니카 키메릭 인플루엔자 백신
WO2021253172A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 上海市公共卫生临床中心 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法
CN113801206B (zh) * 2020-06-15 2024-07-02 上海市公共卫生临床中心 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6680054B1 (en) * 1996-11-14 2004-01-20 Biota Scientific Management Pty Ltd. Macromolecular neuraminidase-binding compounds
US20060280754A1 (en) * 2003-11-04 2006-12-14 Garry Robert F Method of preventing virus: cell fusion by inhibiting the function of the fusion initiation region in rna viruses having class i membrane fusogenic envelope proteins
US20070031453A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-08 Erich Hoffmann Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1711888A (en) 1987-04-24 1988-12-02 Biogen, Inc. Immunotherapeutic methods and compositions
US5747239A (en) * 1990-02-16 1998-05-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and preventions thereof as vaccines
US5567805A (en) * 1990-03-09 1996-10-22 Administrators Of The Tulane Educational Fund The cellular receptor for the CS3 peptide of human immunodeficiency virus
WO1994017826A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 Smithkline Beecham Corporation Vaccinal polypeptides
US5464933A (en) * 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
US6037348A (en) * 1996-02-09 2000-03-14 Eli Lilly And Company Inhibition of viral replication
GB9712892D0 (en) * 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
US6750008B1 (en) 1999-07-09 2004-06-15 Trimeris, Inc. Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission
AU3334001A (en) 2000-02-10 2001-08-20 Panacos Pharmaceuticals Inc Assay for detection of viral fusion inhibitors
GB0022969D0 (en) * 2000-09-19 2000-11-01 Chiron Spa Influenza a virus subtype H16
US7894999B2 (en) * 2001-03-27 2011-02-22 Samuel Bogoch Systems and methods for identifying Replikin Scaffolds and uses of said Replikin Scaffolds
US7189800B2 (en) * 2001-03-27 2007-03-13 Samuel Bogoch Replikin peptides in rapid replication of glioma cells and in influenza epidemics
EP1603590A4 (en) * 2003-03-07 2008-08-27 Merck & Co Inc INFLUENZA VIRUS VACCINE
WO2005016238A2 (en) 2003-05-08 2005-02-24 Duke University Severe acute respiratory syndrome
EP1648927A1 (en) 2003-07-21 2006-04-26 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
DE102005060920A1 (de) * 2005-12-18 2007-06-21 Charité - Universitätsmedizin Berlin Peptide für die Wechselwirkung mit alpha-helikalen Coiled-Coil-Strukturen und/oder Coiled-Coil-Sequenzen, davon abgeleitete Mittel und ihre Verwendung
AU2007300663A1 (en) * 2006-07-21 2008-04-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to influenza virus using peptide and nucleic acid compositions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6680054B1 (en) * 1996-11-14 2004-01-20 Biota Scientific Management Pty Ltd. Macromolecular neuraminidase-binding compounds
US20060280754A1 (en) * 2003-11-04 2006-12-14 Garry Robert F Method of preventing virus: cell fusion by inhibiting the function of the fusion initiation region in rna viruses having class i membrane fusogenic envelope proteins
US20070031453A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-08 Erich Hoffmann Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100056442A (ko) 2010-05-27
HK1142804A1 (zh) 2010-12-17
CN101848719B (zh) 2015-09-23
PL2170365T3 (pl) 2017-03-31
AU2008269081A1 (en) 2008-12-31
KR20180021930A (ko) 2018-03-05
EA201070053A1 (ru) 2010-08-30
JP2010531362A (ja) 2010-09-24
IL202450A (en) 2015-05-31
KR101719135B1 (ko) 2017-03-23
WO2009002516A1 (en) 2008-12-31
US20100152109A1 (en) 2010-06-17
US20140194347A1 (en) 2014-07-10
IL238404A0 (en) 2015-06-30
CA2691358C (en) 2017-08-22
DK2170365T3 (en) 2016-09-05
US9353157B2 (en) 2016-05-31
KR20160113331A (ko) 2016-09-28
BRPI0813922A2 (pt) 2017-05-09
CA2691358A1 (en) 2008-12-31
IL238404A (en) 2017-03-30
EP2170365B1 (en) 2016-05-25
KR101660363B1 (ko) 2016-09-28
JP2013241432A (ja) 2013-12-05
JP5450402B2 (ja) 2014-03-26
MX2009013635A (es) 2010-05-19
PT2170365T (pt) 2016-07-12
CN105237629B (zh) 2019-06-18
CN105237629A (zh) 2016-01-13
ZA200909130B (en) 2010-09-29
EP2170365A1 (en) 2010-04-07
US8604165B2 (en) 2013-12-10
ES2581381T3 (es) 2016-09-05
MX363240B (es) 2019-03-15
HK1215037A1 (zh) 2016-08-12
EP2170365A4 (en) 2012-05-02
CN101848719A (zh) 2010-09-29
IL202450A0 (en) 2011-08-01
JP5764621B2 (ja) 2015-08-19
HUE029921T2 (en) 2017-04-28
KR20150117303A (ko) 2015-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017957B1 (ru) Композиции и способы, ингибирующие грипп
JP6643981B2 (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用
CA2862391C (en) Stabilized antiviral fusion helices
JP2023517293A (ja) 抗ウイルスの構造的に安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドおよびその使用
TW202304947A (zh) 胜肽及包含胜肽之組成物
CN117098551A (zh) 编码截短的ns1蛋白和sars-cov受体结合域的流感病毒
US8222204B2 (en) Influenza inhibiting compositions and methods
WO2018084247A1 (ja) 免疫誘導剤
JP5396111B2 (ja) インフルエンザ治療／予防薬
AU2008269081B2 (en) Influenza inhibiting compositions and methods

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU