EA017633B1 - Пептиды, увеличивающие продукцию бактериоцинов, способы увеличения продукции бактериоцинов и выделенные бактериоцины - Google Patents
Пептиды, увеличивающие продукцию бактериоцинов, способы увеличения продукции бактериоцинов и выделенные бактериоцины Download PDFInfo
- Publication number
- EA017633B1 EA017633B1 EA200801294A EA200801294A EA017633B1 EA 017633 B1 EA017633 B1 EA 017633B1 EA 200801294 A EA200801294 A EA 200801294A EA 200801294 A EA200801294 A EA 200801294A EA 017633 B1 EA017633 B1 EA 017633B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- bacteriocin
- peptide
- approximately
- bacteria
- strain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В изобретении новые пептиды, продуцируемые бактериоцин-продуцирующими бактериями, стимулируют продукцию бактериоцинов in vitro. Бактерии-продуценты культивируют в присутствии новых бактерий-индукторов и пептида, имеющего карбокситерминальную последовательность VKGLT для того, чтобы осуществить увеличение продукции бактериоцина.
Description
Это изобретение относится к новым пептидам, которые стимулируют продукцию бактериоцинов бактериями-продуцентами в присутствии бактерий-индукторов, и к способам использования этих пептидов для продуцирования бактериоцина.
Описание родственного уровня техники
Нормальные кишечные бактерии являются критически важными для здоровья любого животногохозяина. Хозяин получает пользу от способствующих пищеварению метаболических процессов, опосредованных нативной бактериальной биотой. Что касается кишечных бактерий, то конкуренция и являющаяся ее результатом эволюция обеспечивают питательные вещества и жизненное пространство и увеличивают репродуктивный потенциал, что позволяет определенным штаммам и видам получать преимущество в выживании. В ходе бактериальной эволюции возникла продукция бактериоцинов. Бактериоцины являются антагонистами по отношению к другим организмам в пределах данной конкурентной ниши и таким образом обеспечивают экологическое преимущество. Эти бактериоцины, как правило, представляют собой низкомолекулярные полипептиды, и их классифицируют на основании различий в молекулярной массе (К1аеийашшег, БЕМ8 МюгоЬю1. Кет.. νοί. 12-39-85, 1993). Эти соединения могут быть легко расщеплены до составляющих их аминокислот протеазными ферментами хозяина. Бактериоцины могут представлять собой существенный компонент преимуществ, возникающих из-за конкурентного исключения (Νιιηηί апб Ваи1а1а, Ха1иге, Бопбоп. νοί. 241, 210-211, 1973).
Νιιπηί и К.аи1а1а (1973, см. выше) впервые описали преимущества конкурентного исключения в контроле колонизации сальмонеллой вылупившихся цыплят посредством использования неидентифицированной бактериальной флоры, полученной из фекалий здоровых взрослых птиц. Этот подход является привлекательной альтернативой существующим в настоящее время сельскохозяйственным практикам с использованием синтетических антибиотиков. Описана выделенная из слизистой оболочки способная к конкуретному исключению флора (81еги е1 а1., патент США 5451400, выдан в сентябре 1995 г.) в виде анаэробной культуры, полученной из соскобов слизистой выстилки кишечника здоровых взрослых куриц. Эта неидентифицированная флора обеспечивала у цыплят великолепную защиту против колонизации 8а1шоие11а, однако демонстрировала только неустойчивый контроль колонизации Сашру1оЬас1ег (81еги, Рои11. 8с1, νοί. 73, 402-407, 1994). Конкурентное исключение имеет место в кишечном тракте диких птиц и вносит вклад в экологию здорового кишечника.
Микроорганизмы продуцируют множество разных соединений, которые демонстрируют антибактериальные свойства. Одна из групп этих соединений, бактериоцины, состоит из бактерицидных белков, у которых механизм действия такой же, как у ионофорных антибиотиков. Бактериоцины часто являются активными против видов, которые являются близкородственными продуценту бактериоцина. Их широкое распространение в видах бактерий, выделенных из комплексных микробных сообществ, таких как кишечный тракт, ротовая полость или другие эпителиальные поверхности, свидетельствует о том, что бактериоцины могут играть регуляторную роль в смысле популяционной динамики в бактериальных экосистемах. Бактериоцины определяют как продуцируемые бактериями соединения, которые имеют биологически активную белковую группировку и обладают бактерицидным действием (Тадд е1 а1., Вас1епо1ощса1 Рет1е\\'5. νοί. 40, 722-256, 1976). Другие характеристики могут включать: (1) узкий спектр ингибиторной активности, сосредоточенный в области близкородственных видов; (2) присоединение к специфическим клеточным рецепторам; (3) плазмидные генетические детерминанты продукции бактериоцина и иммунитет клетки-хозяина к бактериоцину. Не полностью определенные антагонистические вещества были обозначены как бактериоцин-подобные вещества. Некоторые бактериоцины, эффективные против грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных бактерий, имеют широкий спектр активности. Было предложено, что термин бактериоцин, когда его используют для описания ингибиторных агентов, продуцируемых грамположительными бактериями, должен отвечать следующим минимальным критериям: (1) представлять собой пептид и (2) обладать бактерицидной активностью (Тадд е1 а1., см. выше).
Для того чтобы сделать коммерческое использование бактериоцинов экономически выгодным, необходима оптимизация выхода в ходе продуцирования (Сйеи аиб Ноотег, СошргейеиДте Ве\зе\\ъ ш Бооб 8с1еисе аиб Бооб 8аГе1у. νοί. 2, 82-100, 2003). Сйеи и Ноотег утверждают, что в случае продуцирования низина было установлено, что ключевыми факторами в ростовых средах являлось поддержание оптимального рН и обогащение среды специфичными питательными веществами для каждого штамма или штаммов, продуцирующего(их) бактериоцин.
Кии!8еи е1 а1. (1оигиа1 оГ Вас1егю1оду, то1. 186 (10), 3078-3085, 2004) раскрывают бактериоцининдуцирующий пептид (В1Р), состоящий из 27 аминокислот, который индуцирует продукцию бактериоцина в 81гер1ососси5 риеишошае. Э1ер е1 а1. (Мо1еси1аг Вю1оду, то1. 47 (2), 483-494, 2003) указывают на то, что согласно ряду сообщений ряд грамположительных бактерий используют так называемый основанный на пептидных феромонах путь передачи сигналов для регуляции продукции антимикробных пептидов, известных как бактериоцины, многочисленными молочно-кислыми бактериями. Они также раскрывают пептидный феромон, Р1иА, который индуцирует продукцию бактериоцина. Уаи Ве1киш и 8111е5 (№11. Ргоб. Кер., то1. 17, 323-335, 2000) сообщают о том, что некоторым бактериоцинам для их продукци
- 1 017633 рования требуются продукты регуляторных генов. Они утверждают, что эти гены кодируют секретируемые индукторные пептиды и белки, которые гомологичны гистидинкиназам и регуляторам ответных реакций. Эта ссылка дополнительно раскрывает то, что некоторые бактериоцины класса II индуцируются индукторным пептидом, в то время как другие, такие как карнобактериоцин В2 и сакацин Р, индуцируются индукторным пептидом или подвергаются автоиндукции синтезированным бактериоцином.
При том, что найдены различные пептиды, которые индуцируют продукцию бактериоцинов в бактериях, в данной области остается необходимость в комерческом получении бактериоцинов с использованием пептидов, которые увеличивают выход продукции бактериоцина ίη νίίτο. В изобретении предложены пептиды, которые отличаются от пептидов из предшествующего уровня техники, и предложен способ продуцирования больших количеств бактериоцинов для коммерческого использования.
Краткое описание сущности изобретения
Таким образом, задача изобретения состоит в том, чтобы предложить пептиды, которые стимулируют продукцию бактериоцинов ίη νίίτο.
В задачу изобретения также входит предложение пептидов, которые стимулируют продукцию бактериоцинов ίη νίίτο и имеют карбокси-терминальную последовательность УКОЬТ (δΕΟ ΙΌ N0: 1).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность \1\ЭК8Е\ТА\\ЛЛАЕЕЛСС1\1\КС,ЕТ (δΕρ ΙΌ N0: 3).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность Т\\ЗК8\\Л\ТЕАС1С\(фАЛ8\С\СС1\\КС,ЕТ(8ЕО ΙΌ N0: 5).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность \\ЛК¥КТ\\\АТ8\Г\ТС1САСАА\КС,ЕТ(8ЕО ΙΌ N0: 7).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцинов ίη νίίτο, при котором пептид, имеющий карбокситерминальную последовательность УКОЬТ (δΕΟ ΙΌ N0: 1) добавляют к культуре бактериоцин-продуцирующих клеток.
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 0К.-7 ίη νίίτο, при котором пептид, имеющий δΕΟ ΙΌ N0: 3, добавляют к культуре клеток ЬасФЪасШи8 8;·ι1ίν;·ιπι.ΐ8 Р\О-32 (ИККЬ В-30514).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 50-52 ίη νίίτο, при котором пептид, имеющий δΕΟ ΙΌ N0: 5, добавляют к культуре клеток ΕηίθΓοοοοου8 Еаесшш Ь\Р 50-52 (ИККЬ В-30746).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 760 ίη νίίτο, при котором пептид, имеющий δΕΟ ΙΌ N0: 7, добавляют к культуре клеток δίκρίοсцсси8 спсеШ8 Ь\Р 760 (ИККЬ В-30745).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина линией клеток-продуцентов дополнительным включением индукторной клеточной линии.
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 0К.-7 линией клеток-продуцентов ЬасЮЪасШш 8;·ι1ίν;·ιτίι.ΐ8 ΡΥΌ-32 дополнительным включением индукторной клеточной линии ЬасФЪасШи8 сп8раШ8 БАУР 252 (НККЬ В-30884).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 50-52 линией клеток-продуцентов Е^ею^сс^ Еаесшш Ь\Р 50-52 дополнительным включением индукторной клеточной линии ЬасЮЪасШш ;·ιαάορ1ιί1ιΐ8 Ь\Р 320 (НККЬ В-30510).
Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукция бактериоцина 760 линией клеток-продуцентов δίτορίοοοοοπ8 спсеШ8 Ь\Р 760 дополнительным включением индукторной клеточной линии ЬасЮЪасШш ;·ιαάορ1ιί1ιΐ8 Ь\Р 320.
Дополнительные аспекты и преимущества этого изобретения должны стать очевидными из нижеследующего описания.
Депонирование микроорганизмов
ЬасЮЪасШш 8α1ίνατίυ8. обозначенный как НККЬ В-30514 (штамм ΗΎΏ32), депонирован 3 августа 2001 г. δ^ρΙο^^ιΐ8 спсеШ8, обозначенный как НККЬ В-30745 (штамм Ь\Р 760), и ЕЩею^сс^ Еаесшш, обозначенный как НККЬ В-30746 (штамм Ь\Р-50-52), были депонированы 3 мая 2004 г.; и ЬасЮЪасй1и8 οαύορίιιΐι^ обозначенный как НККЬ В-30510 (штамм Ь\Р 320), был депонирован 3 августа 2001 г. ЬасЮЪасШш ст18раШ8, обозначенный как НККЬ В-30884 (штамм Ь\Р 252), депонирован 4 ноября 2005 г. Все указанные штаммы были депонированы в соответствии с Будапештским договором соместно с υ.δ.Ό.Α. Адг1си1Тига1 Ре8еатс11 8етуюе Ρаίеηί Сийите ΟοΙΕΛίοη (^Οοη^ СеШет ίοτ Адпси1Шта1 υΐίΐίζοίίοη К.е8еатсй, 1815 N. ишуегайу δϋ^ί, Ρеο^^а, Ι11ΐηοΪ8 61604).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина 0К.-7 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ-РАОЕ) (А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гель наносили СатруЕБасЫ )ещш для определения того, какая(ие) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 1 дорожка 1 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 210012500 (Ашег8Йаш Рйатшаста Вю1ес11): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 2, содержащая чис
- 2 017633 тый бактериоцин ΘΚ-7, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 5,5 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид из РУО-32, имела массу приблизительно 2,5 кДа. На фиг. 1Б дорожка 1 содержит чистый бактериоцин ΘΚ-7, что соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела р1 приблизительно 8,4. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из РУО-32, имела р1 приблизительно 7,9. Дорожка 3 содержала стандарты р1 (Рго!еш Тек! М1х!иге I, Магкег Рго!ешк, Бегуа): 10,0, 9,2, 8,1, 6,9, 5,5, 4,3.
Фиг. 2А и 2Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина 50-52 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гели наносили Сатру1оЬас!ег )сщш для определения того, какая(ие) полоса(ы) соответствует антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 2А дорожка 1 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 2100-12500 (Атегкйат Рйагташа Вю!есй): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 2, содержащая чистый бактериоцин 50-52, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 3,9 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид для ЬУР-50-52, имела массу приблизительно 3,1 кДа. На фиг. 2Б дорожка 1 содержит чистый бактериоцин 50-52, что соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела р1 приблизительно 8,4. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из ЬУР-50-52, имела р1 приблизительно 8,1. Дорожка 3 содержала стандарты р1 (Рго!еш Тек! М1х!иге I, Магкег Рго!ешк, Бегуа): 10,0, 8,1, 7,9, 6,4, 5,5, 4,3, 4,1 и 3,8.
Фиг. 3А и 3Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина 760 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гели наносили Сатру1оЬас!ег )сщш для определения того, какая(ые) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 3А дорожка 3 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 2100-12500 (Атегкйат Рйагтас1а Вю!есй): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 1, содержащая чистый бактериоцин 760, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 5,5 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид из БУР 760, имела массу приблизительно 2,1 кДа. На фиг. 3Б полоса на дорожке 1, содержащая чистый бактериоцин 760, соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела р1 приблизительно 9,5. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из БУР-760, имела р1 приблизительно 8,9. Дорожка 3 содержала стандарты р1 (Рго!еш Тек! М1х!иге I, Магкег Рго!етк, 8еп/а): 10,0, 8,1, 7,9, 6,4, 5,5, 4,3, 4,1 и 3,8.
Подробное описание изобретения
Важность кишечных инфекций у людей признается все шире, и связь заражения домашней птицы и инфекции у человека хорошо документирована. Способность уменьшить эту опасность для здоровья вмешательствами на птицеводческих предприятиях также хорошо известна. При производстве и обработке бройлеров фекальные вещества, содержащие патогены, переносятся на мясо и сохраняются при кухонной обработке пищи.
Метаболиты конкурирующих организмов могут вносить вклад в контроль таких патогенов, как Сатру1оЬас!ег _)е.)иш и Ба1топе11а. Ьас!оЬасШик каЛуапик, обозначенный как ΝΒΚΕ В-30514 (штамм НУО32), Б!гер!ососсик спсе!ик, обозначенный как ΝΚΚΕ В-30745 (штамм БУР-760); и Еп!егососсик Гаесшт, обозначенный как ΝΚΚΕΒ-30746 (штамм ЬУР-50-52), продуцируют новые бактериоцины, которые представляют собой объект находящейся на рассмотрении заявки на патент США 10/644927, поданной 21 августа 2003 г., и находящейся на рассмотрении заявки на патент США 10/426688, дата подачи 1 мая 2003, причем обе полностью включены сюда ссылкой. Эти штаммы также продуцируют новые пептиды, который стимулируют эти штаммы к продуцированию повышенных количеств бактериоцинов ίη У1!го.
В изобретении предложены новые сигнальные пептиды и штаммы, продуцирующие эти пептиды, новые индукторные штаммы, аминокислотные последовательности и способы использования новых пептидов и индукторных штаммов.
Ьас!оЬасШик каЛуагшк, РУО-32, (ΝΚΚΕ В-30514) продуцирует сигнальный пептид БЕС ГО ΝΟ: 3. Он представляет собой аэробные грамположительные бациллы, способные к росту при приблизительно 37°С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями неправильной формы. Колонии имеют белый цвет и достигают приблизительно 3 мм в диаметре после аэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С.
Еп!егососсик Гаесшт, БУР 50-52 (ΝΚΕΕ В-30746) продуцирует сигнальный пептид БЕС ГО ΝΟ: 5. Эти факультативно аэробные грамположительные кокки способны к росту при приблизительно 37°С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов, образуя колонии с краями неправильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 2 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования при приблизительно 37° в течение приблизительно
- 3 017633
ч.
8!гер!ососси8 спсе!и8. Ь^Р-760 (ΝΚΚΕ В-30745) продуцирует сигнальный пептид 8ЕС Ш N0: 7. Эти факультативно аэробные грамположительные кокки способны к росту при приблизительно 37°С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями правильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 1 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С.
Ьас1оЬасШи8 асИорййик. Ь^Р 320 (ΝΡΚΕ В-30510). является индукторным штаммом. который представляет собой факультативно аэробные граммположительные кокки и способен к росту при приблизительно 37°С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями неправильной формы.
Колонии имеют белый цвет и достигают приблизительно 3 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С.
Ьас1оЬасШи8 спкраШк Ь^Р 252 (ΝΒΚΕ В-30884) является индукторным штаммом. который представляет собой аэробные грамположительные кокки и способен к росту при приблизительно 37°С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями правильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 1 мм в диаметре после аэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С.
Сигнальные пептиды из штаммов. продуцирующих бактериоцины. были выделены и очищены. Клетки продуцентов в основном секретируют бактериоцины класса II посредством системы транспортации АВС (Науетйет е! а1.. Мо1. МкгоЬюЕ. уо1. 16. 229-240.1995; Сарс е! а1.. I. Вю1. СЕет.. уо1. 36. 3429134298. 2003). Секреция некоторых бактериоцинов этого класса имеет место благодаря сигнальным пептидам. которые активируются 8ес-транслоказой. локализованной на цитоплазматических мембранах (С1и1а8 е! а1.. Арр1. Еиупои. МкгоЫоЕ. уо1. 63. 4321-4330. 1997; Эо1 е! а1.. I. ВюксЕ Вюеид.. уо1. 93. 434436. 2002; Ьеег е! а1.. М1сгоЬю1о§у. уо1. 141. 1629-1635. 1995; Марте/ е! а1.. МюгоЬю1о§у. уо1. 145. 31553161. 1999; Тотйа е! а1.. I. Вас!епо1.. уо1. 178. 3585-3593. 1999; ХУогоЬо е! а1.. I. Вас!епо1.. уо1. 177. 31433149. 1995 и Неггапх е! а1.. I. Арр1. Епуиоп. МкгоЬюЕ. уо1. 71 (4). 1959-1963. 2005). Другая функция сигнальных пептидов вероятно ассоциирована с бактериальным феноменом сщогит кепкшд ((восприятие кворума). Эе К1еуй е! а1. 1пЕесйоп апб 1ттипИу. уо1. 68(9). 4839-4849. 2000; Эиппу е! а1.. ίη: М1сгоЫа1 δίβпайпд апб Соттишса!юп. Епд1апб е! а1. (ебк.). Ипщегкйу Ргекк. СатЬпбде. Ипйеб Ктдбот. 117-138.1999; Эипшпд апб Ьеопагб. Аппи. Неу. МюгоЫоЕ. уо1. 51. 527-564. 1997 и К1еегеЬехет е! а1.. Мо1. МюгоЫоЕ. уо1. 24. 895-904. 1997). Сигнальный пептид либо в отдельности. либо в комплексе с метаболитами индукторного штамма активирует гистидин-протеинкиназу в продуценте. тем самым увеличивая продукцию бактериоцина. Для получения максимальной продукции пептида клетки. которые продуцируют сигнальные пептиды. такие как РУЭ 32. Е\УР 50-52 и Ь^Р 760. культивировали приблизительно 2-10 ч в бульоне М9. обогащенном аминокислотами. выбранными из группы. состоящей из фенилаланина. триптофана. аланина и их смесей. Предпочтительное воплощение изобретения включает количества аминокислот в диапазоне от приблизительно 0.01 до приблизительно 0.1% для каждой аминокислоты. включенной в композицию. Среда. представляющая собой приблизительно 10% бульон для Вгисе11а. приводит к продукции сигнального пептида в более низкой концентрации.
Сигнальный пептид выделяют из супернатанта культуры. используя осаждение сульфатом аммония с последующими: (1) гель-фильтрацией с использованием хроматографии высокого разрешения на 8ирегоке 12 и (2) гидрофобной хроматографией на октил-сефарозе 6В Еак! Е1о\т.
Сигнальные пептиды по изобретению используют для увеличения продукции бактериоцинов ίπ νί!го клетками-продуцентами в присутствии бактерий-индукторов. Сигнальный пептид можно добавлять в любой момент времени в ходе культивирования бактерий-индукторов и продуцентов. Из подробного описания изобретения обычный специалист в данной области может легко определить. когда добавлять сигнальный пептид для достижения высоких уровней продукции бактериоцина по сравнению с продукцией бактериоцина в культурах. содержащих только пептид и продуцент или только и бактериииндукторы. и продуценты.
Антагонистическая активность бактериоцинов. продуцируемых при использовании сигнального пептида и индукторного штамма бактерий. против С. )ер.1ш и δ. еп1епНб18 оценивали при помощи капельного теста. Его стадии включают в себя внесение различных концентраций чистого препарата (мкг/мл) бактериоцина в объем приблизительно 10 мкл. наносимый на обогащенный кровью агар для Сатру1оЬас!ег или питательный агар (агар МРА или Ме!а Рер!опе). предварительно засеянный клетками целевых бактерий. Чашки. содержащие культуры С. )ер.1ш. инкубировали при приблизительно 42°С в микроаэробных условиях. Чашки. содержащие 8. еп1епНб18. инкубировали при приблизительно 37°С в аэробных условиях. Активность бактериоцина выражали в произвольных единицах измерения (АИ) на один миллилитр препарата. в котором появляется видимая зона ингибирования роста культуры (Непбегкоп е! а1.. АгсЕАек оГ Вюс11е1Ш81гу апб Вюрйукюк. νо1. 295. 5-12. 1992; включено сюда ссылкой). Удель
- 4 017633 ную активность можно также выражать в произвольных единицах измерения на миллиграмм чистого бактериоцина.
Сигнальные пептиды по изобретению включают любой пептид с карбокситерминальной последовательностью УКСЬТ (8ЕО Ш N0: 1), продуцируемый бактериоцин-секретирующими бактериями, который увеличивает продукцию бактериоцина при добавлении к культуре, включающей в себя бактериипродуценты или бактерии-продуценты и бактерии-индукторы.
В рамках изобретения бактерия-индуктор определена как любая бактерия, которая при культивировании с бактериоцин-продуцирующей бактерией, то есть бактерией-продуцентом, и с сигнальным пептидом продуцента увеличивает продукцию бактериоцина по сравнению с продукцией культуры, содержащей только бактерию-продуцент и ее сигнальный пептид.
В рамках изобретения термин пептид означает соединение по меньшей мере из двух или более аминокислот или аналогов аминокислот. Аминокислоты или аналоги аминокислот могут быть связаны пептидными связями. В еще одном воплощении аминокислоты могут быть связаны другими связями, например сложноэфирной, простой эфирной и т.д. Пептиды могут находиться в любой структурной конфигурации, включая линейные, разветвленные или циклические конфигурации. При использовании здесь термин аминокислоты относится к природным или синтетическим аминокислотам, в том числе Ό- или Ь-оптическим изомерам, и к аналогам аминокислот.
Производные и аналоги пептидов по изобретению включают, без ограничения, производные и аналоги, которые содержат в качестве первичной аминокислотной последовательности полную или частичную аминокислотную последовательность пептида, включая измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки заменены остатками в последовательности, приводящими к консервативной аминокислотной замене.
Например, один или более чем один аминокислотный остаток в последовательности можно заменить другой аминокислотой с такой же полярностью, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит к скрытому изменению. Замены аминокислоты в последовательности можно выбирать из других членов того класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Аминокислотами, содержащими ароматические кольцевые структуры, являются фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Такие изменения нельзя считать значительно влияющими на кажущуюся молекулярную массу при определении электрофорезом в полиакриламидном геле или по изоэлектрической точке. Неконсервативные аминокислотные замены также можно водить для замены аминокислотой с особенно предпочтительным свойством. Например, Сук можно вести в потенциальный сайт для образования дисульфидных мостиков с другим Сук. Рго можно ввести по причине его особенно плоской структуры.
Пептиды по изобретению можно синтезировать химическим путем. Синтетические пептиды можно получать при использовании хорошо известных методик твердофазной, жидкофазной или пептидной конденсации или любой их комбинации, и они могут включать природные и/или синтетические аминокислоты. Аминокислоты, используемые для синтеза пептидов, могут быть стандартной Вос(№-аминозащищенной №трет-бутилоксикарбонил)аминокислотной смолой при стандартных протоколах снятия защиты, нейтрализации, сочетания и промывки по исходному твердофазному способу МеглГ1е1б (1. Ат. С11ст. Бое, νοί. 85, 2154, 1963), или лабильной при действии щелочи №-аминозащищенной 9флуоренилметоксикарбонилом (Ртое) аминокислотой (Сагрто апб Нап, 1. Огд. Сйет., νοί. 37, 3403-3409, 1972). Кроме того, способ по изобретению можно использовать с другими №-защитными группами, известными специалистам. Твердофазный пептидный синтез можно осуществлять методиками в пределах квалификации обычного специалиста в данной области (см., например, 81е\\'ай апб Уоипд, 8оНб Рйаке 8уп1йек1к, Бесопб Ебйюп, Р1егсе Сйет1еа1 Сотрапу, ВоскГогб, III., 1984; Р1е1бк апб №Ь1е, 1п1 I. Рер1. Рго1еш Век., νο1. 35, 161-214, 1990) или при использовании автоматических синтезаторов.
Нижеследующие примеры предназначены только для того, чтобы дополнительно иллюстрировать это изобретение и не предназначены для того, чтобы ограничить объем этого изобретения, определенный формулой изобретения.
Пример 1.
Клетки штаммов Ейегососсик Гаесшт Ь^Р50-52, 81гер!ососсик спсеЮк Ь^Р-760 и ЬасФЬасШик ка1б'апик РУЭ-32 высевали в колбы, содержащие приблизительно 300 мл следующей среды: бульон для Вгисе11а, 10%-ный бульон для Вгисе11а или М9, обогащенная аминокислотами, как указано ниже в табл. 1. Колбы культивировали при вращении при приблизительно 37°С в течение приблизительно 2, 4, 6 и 8 ч. Скорость вращения составляла приблизительно 120 об/мин. Аликвоты культуральной жидкости центрифугировали при приблизительно 6000 д в течение приблизительно 15 мин при приблизительно -4°С. Пептиды выделяли осаждением белков приблизительно 40%-ным раствором (ΝΗ4)28Ο4 при приблизи
- 5 017633 тельно 4°С в течение приблизительно 24 ч с последующей гель-фильтрацией с использованием хроматографии высокого разрешения на 8ирего§е-12 с отбором низкомолекулярных фракций. Эти фракции наносили на колонку для гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе 6 В Рай Б1оте и белки элюировали с использованием градиента приблизительно 0,4-0,9 М К2НРО в 0,1 М трис-буфере, рН 5,1. Результаты представлены ниже в табл. 1. Как видно из табл. 1, пептиды, выделенные из продуцентов РУН 32, БУР 50-52 и БУР 760, вляются низкомолекулярными и накапливаются в основном в культурах, содержащих голодные среды (М9 + указаны аминокислоты).
Таблица 1
Выделение и очистка индукторных пептидов из штаммов РУИ-32, БУР-50-52 и БУР-760
Культивирование | Время в культуре (часы) | |||
2 | 4 | 6 | 8 | |
Р\/0-32 | ||||
Бульон для ВгисеПа | 0 | 0 | 0 | 0 |
10%-ный бульон для ВгисеПа | 0 | 0 | Пептид, мол масса 2,5 кДа 0,4 мг/мл, объем * 1 мл | 0 |
М9 * 0,03% фенилаланина 0,07% триптофана | 0 | Пептид, мол масса 2,5 кДа 0,2 мг/мл, объем ~ 1 мл | Пептид, мол масса 2,5 кДа 0,9 мг/мл, объем = 1 мл | 0 |
□/УР-50-52 | ||||
Бульон для ВгисеПа | 0 | 0 | 0 | 0 |
10%-ный бульон для ВгисеПа | 0 | Пептид, мол масса 3,1 кДа 0,5 мг/мл, объем = 1 мл | 0 | 0 |
М-9, 0,05% триптофана | 0 | 0 | Пептид, мол масса 3,1 кДа 1,3 мг/мл, объем = 1 мл | Пептид, мол масса 3,1 кДа 0,1 мг/мл, объем = 1 мл |
!УУР-760 | ||||
Бульон для ВгисеПа | 0 | 0 | 0 | 0 |
10%-ный бульон для ВгисеПа | 0 | 0 | Пептид, мол масса 2,1 кДа 2,1 мг/ мл, объем = 1 мл | 0 |
М-9 0,02% аланина 0,07% фенилаланина | 0 | 0 | Пептид, мол масса 2,1 «Да 2,8 мг/ мл, объем = 1 мл | 0 |
Выделенный сигнальный пептид для РУО-32 обладает слабой антагонистической активностью против С. ,|сщш и 8. ЕЩепБбБ. как определено капельным тестом. Его активность составляла приблизительно 200 Аи/мл, а его молекулярная масса составляла приблизительно 2,5 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрическая точка (р1) составляла приблизительно 7,9 (фиг. 1А и 1Б).
Выделенный сигнальный пептид для БУР50-52 не обладал антагонистической активностью против С. )сщш и 8. еШегШбБ при определении капельным тестом. Его молекулярная масса составляла приблизительно 3,1 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а изоэлектрическая точка (р1) составляла приблизительно 8,1 (фиг. 2А и 2Б).
Выделенный сигнальный пептид для БУР-760 не обладал антагонистической активностью по отношению к С. )сщш и 8. еШепБбБ при определении капельным тестом. Его молекулярная масса составляла приблизительно 2,1 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, и его изоэлектрическая точка составляла приблизительно 8,9 (фиг. ЗА и 3Б).
Пример 2.
Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из клеток РУО-32, в продукции бактериоцина ОР-7 клетки РУО-32 культивировали в колбах с приблизительно 300 мл приблизительно 10%-ного бульона для Вгисе11а. К бульону добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток РУО-32, содержащей приблизительно 109 КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл, также добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма БУР 252, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, и приблизительно 0,10, 0,01 или 0,001 мг/мл сигнального пептида РУО 32. Контрольная проба не содержала сигнальный пептид. Некоторые пробы содержали другие концентрации сигнального пептида и штамма-продуцента без индукторного штамма. Две пробы содержали либо 0,1 мг/мл сигнального пептида из БУР 760, либо 0,1 мг/мл сигнального пептида из БУР-50-52 как с индукторным штаммом, так и со штаммом-продуцентом. Колбы культивирвали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 14 ч при скорости перемешивания приблизительно 120 об/мин. Результаты суммированы ниже в табл. 2.
По окончании 14 ч супернатант из культур помещали в центрифужные колбы на 500 мл с приблизительно одним миллилитром регенерирированной сефарозы 8Р Бай Б1о\г (500:1 об./об.). Эту смесь инкубировали приблизительно 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Суспензию затем промывали при приблизительно 100 мл 0,2 М буфера трис-НС1 с рН приблизительно 6,4. Бактериоцины элюировали центрифугированием с приблизительно 100 мл приблизительно 0,2 М К2НРО4, рН приблизительно 5,8, при приблизительно 7000 д в течение приблизительно 10 мин. Антагонистическую активность фракций бактериоцина против С. )сщш и 8. еШегШбБ оценивали с помощью капельного теста, как описано выше. Уровень чистоты фракций бактериоцина определяли электрофорезом в полиакриламид
- 6 017633 ном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрические точки фракций определяли изоэлектрической фокусировкой. Концентрации белка для всех фракций бактериоцина определяли при 215 нм при использовании спектрофотометра. Результаты представлены в табл. 2 ниже.
Как видно из табл. 2, культивирование РУО-32 (продуцент) с ЬУР-252 (индуктор) в присутствии приблизительно 0,01 мг очищенного сигнального пептида из РУО-32 увеличивает выход бактериоцина ΘΚ.-7 до приблизительно 214,5 мг из одного литра культуральной жидкости. Добавление сигнальных пептидов, выделенных из штаммов БЛУР 50-52 и Б\УР 760, не увеличивает выход бактериоцина ΘΚ.-7 по сравнению с контролем. Это указывает на то, что сигнальный пептид является высокоспецифичным по отношению к продуценту. Синтез бактериоцина увеличивается, когда сигнальный пептид, продуцент и индуктор одновременно введены в культуральную жидкость.
Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина при крупномасштабном культивировании продуцирующие и индуцирующие штаммы выращивали в биореакторе с приблизительно шестью литрами культуральной жидкости. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида составляло 109 КОЕ/мл РУО-32 (штамм-продуцент), 109 КОЕ/мл БУР-252 (индукторный штамм) и 0,01 мг/мл очищенного сигнального пептида из РУО-32. Бактериоцин ОК.-7 выделяли после приблизительно 8, 10, 12 и 14 ч культивирования, см. табл. 3. Схема очистки является такой, как описано выше. Эксперименты повторяли три раза.
Таблица 2
Влияние сигнального пептида, выделенного из РУО-32, на продукцию бактериоцина ОК.-7
Условия эксперимента | Объем фракции мл | Конц-ия белка, мг/мл | Активность, АН/ мл | Удельная активность, ди/мг | мгбелка в литре | Увеличение белка по сравнению с контролем |
10% В-В, ρνϋ- 32 Ι.ννΡ-252 Контроль | 100 | 0.2 | 409600 | 2048000 | 66 | 1 |
10% В-В, ΗΥϋ32, РУО-32 сигнальный пептид -0,1 мг | 100 | 0,18 | 102400 | 568888 | 59,4 | 0,9 |
10% В-В, РУО-32, РУО-32 сигнальный пептид Ό.01 мг | 100 | 0,2 | 204800 | 1024000 | 66 | 1 |
10% В-В, РУО-32, РУО-32 сигнальный пептид -0,001 мг | 100 | 0,2 | 204800 | 1024000 | 66 | 1 |
10% В-В. РУО-32, ΐννΡ-252, РУО-32 сигнальный пептид - 0,1 мг | 100 | 0,22 | 409600 | 1861818 | 72,6 | 1,1 |
10% в-в, РУО-32, 1МР-252, РУО-32 сиг- нальный пептид -0,01 мг | 100 | 0,65 | 1638400 | 2520615 | 214,5 | 3.25 |
10% В-В, РУО-32, 1МР-252, РУО-32 сигнальный пептид -0,001 МГ | 100 | 0,22 | 409600 | 1861818 | 72,6 | 1,1 |
10% В-В, РУО-32, 1.УУР-252, ЬУУР 50-52 сигнальный пептид 0,1 мг | 100 | 0,17 | 51200 | 301176 | 56,1 | 0,85 |
10% В-В, РУО- 32, МЛ/Р-252, и/УР 760 сигнальный пептид 0,1 мг | 100 | 0,19 | 102400 | 538947 | 62,7 | 0,95 |
- 7 017633
Таблица 3
Культивирование штамма-продуцента РУО-32 и индукторного штамма БУР-252 в присутствии сигнального пептида РУО-32 в условиях большего масштаба
Условия эксперимента | Объем фракции, мл | Конц-ия белка, мг/мл | Активность, ди/ мл | Удельная активность, Аи/мг | Кол-во белка продуцированного в одном литре | Увеличение кол-ва белка в сравнении с контролем |
Контроль | 900 | 0,5 | 512000 | 1024000 | 75 | 1 |
РУО-32. 1_УУР-252, 0,2 мг сигнального пептида РУО-32 | 900 | 1,5 | 3276800 | 2184533 | 225 | 3 |
Контроль: биореактор У-61, 10%-ный бульон для Вгисе11а, РУО-32, БУР 252, при рН 6,9, 37°С, 150 об/мин, 14 ч культивирования. Сигнальный пептид: биореактор У-61, 10%-ный бульон для Вгисе11а, РУО-32, БУР252, сигнальный пептид РУО-32 - 0,2 мг, рН 6,9, 37°С, 150 об/мин, 14 ч культивирования.
Одновременное культивирование РУО-32 (штамм-продуцент) и БУР-252 (индукторный штамм) в присутствии специфичного сигнального пептида, выделенного из РУО-32, обеспечивает продукцию приблизительно 214-225 мг бактериоцина ΘΚ.-7 на литр культуральной жидкости.
Пример 3.
Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из БУР 50-52, в продукции бактериоцина 50-52 культивирвали БУР 50-52 при 37°С, как описано выше в примере 2. К 10%-ному бульону для Вгисе11а добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток БУР 50-52, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, добавляли к бульону приблизительно 109 КОЕ/мл индукторного штамма БУР-320, и также добавляли приблизительно 0,10, 0,01 или 0,001 мг/мл сигнального пептида БУР 50-52. Контрольная проба не содержала сигнальный пептид. Некоторые пробы содержали другие концентрации сигнального пептида и штамма-продуцента без индукторного штамма. Две пробы содержали либо 0,10 мг/мл сигнального пептида из БУР 760, либо 0,10 мг/мл сигнального пептида из РУО-32 как с индукторным штаммом, так и со штаммом-продуцентом. Колбы культивирвали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 14 ч при использовании скорости перемешивания приблизительно 120 об/мин. Результаты суммированы ниже в табл. 4.
Выделение бактериоцина 50-52 включает две стадии: (1) выделение бактериоцина из супернатанта культуральной жидкости и (2) выделение бактериоцина из осадка клеток обоих штамов, индукторного и продуцента. На стадии 1 культуры собирали и отделяли центрифугированием при приблизительно 10000 д в течение приблизительно 15 мин для осаждения клеток. Супернатант наносили на колонку с октилсефарозой 4 Баз( Б1о\г для получения бактериоцина при использовании буфера для элюции, представляющего собой буфер К2НРО4 приблизительно 20 мМ с рН приблизительно 7,0. Осадок клеток со стадии 2 суспендировали в фосфатном буфере с приблизительно 0,7% №С1. рН приблизительно 5,6 (буфер для элюции) и суспензию перемешивали и инкубировали приблизительно 20 мин. После инкубации суспензию центрифугировали при приблизительно 10000 д приблизительно 15 мин. Бактериоцин выделяли из супернатанта с помощью ионообменной хроматографии на 8ирегозе 8Р Бак! Б1о\г при использовании буфера для элюции, содержащего приблизительно 10 мМ трис-НС1 и приблизительно 125 мМ ЫаС1, рН приблизительно 7,5. Антагонистические активности фракции бактериоцина против С. _)е_)иш и 8. еп(ег1(1άίδ оценивали в капельном тесте. Уровень чистоты бактериоцинов определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрические точки фракций определяли при использовании изоэлектрической фокусировки.
Концентрации белка для всех фракций бактериоцина определяли при приблизительно 215 нм с помощью спектофотометрического способа.
- 8 017633
Таблица 4
Влияние сигнального пептида, выделенного из ЬЛУР 50-52, на продукцию бактериоцина 50-52
Условия эксперимента | Объем фракции (мп) | Конц-ия белка (мг/мл) | Активность (ди/мл) | Удельная активность (Аи/мг) | мг белка в литре | Увеличение белка по сравнению с контролем |
10%-ный В-В, ίννρ 50-52, 1Л/УР-320 (контроль) | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, ШР 50-52, сигнальный пептид ίν/Р 50-52: 0,1 мг/мл | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, Ц/УР 50-52, сигнальный пептид 11Л/Р 50-52:0,1 мг/мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 0.27 | 819200 | 3034074 | 89,1 | 1,08 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид ЬУУР 50-52:0,10 мг/ мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 0,27 | 819200 | 3034074 | 89,1 | 1,08 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 50-52: 0,10 мг/мл, добавлен после приблизительно 6 часов культивирования | 100 | 0,26 | 819200 | 3150769 | 85,8 | 1,04 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 50-52; 0,01 мг/мг | 100 | 0,27 | 819200 | 3034074 | 89,1 | 1,08 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 50-52: 0.01 мг/мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 0,31 | 819200 | 2642580 | 102,3 | 1,24 |
10%-ный В-В, □/УР 50-52. сигнальный пептид □Л/Р 50-52. 0,01 мг/мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 0,27 | 819200 | 3034074 | 89,1 | 1,08 |
- 9 017633
10%-ный В-В, 1_\*УР 50-52, сигнальный пептид ΙΛΛΖΡ 50-52: 0,01 мг/мл добавлен после приблизительно 6 часов культивирования | 100 | 0,27 | 819200 | 3034074 | 89,1 | 1,08 |
10%-ный В-В, иЛ/Р 50-52. сигнальный пептид 1ЛЛ/Р 50-52: 0,001 мг/ мл | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, 1ЛУР 50-52, сигнальный пептид Ε_ννΡ 50-52: 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, ЬУУР 50-52, сигнальный пептид 1_МР 50-52: 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, (.УУР 50-52, сигнальный пептид 1ЛУР 50-52: 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно б часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, Ι_νν₽ 50-52, сигнальный пептид Ι_ννρ 320: 0,1 мг/мл | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, 1ЛУР 50-52, сигнальный пептид Ι_ννΡ 320: 0,1 мг/ мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В. Ι_ννρ 50-52, сигнальный пептид ИЛ/Р 320: 0,1 мг/ мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, ΙΛνΡ 50-52, сигнальный пептид 1 УУР 320: | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
- 10 017633
0,1 мг/ мл, добавлен после приблизительно 6 часов культивирования | ||||||
10%-ный В-В. Ι_ννρ 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0.01 мг/ мл | 100 | 1,0 | 1638400 | 1638400 | 330,0 | 4 |
10%-ный В-В, 1ДЛ/Р 50-52, сигнальный пептид Ι-ΛΛ/Ρ 320: 0,01 мг/мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 1,07 | 3275300 | 3062429 | 353,1 | 4,28 |
10%-ныйВ-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0,01 мг/мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 1,0 | 1638400 | 1638400 | 330,0 | 4 |
10%-ный В-В, 1ЛЛ/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0,01 мг/мл, добавлен после приблизительно б часов культивирования | 100 | 1,о | 1638400 | 1638400 | 330,0 | 4 |
10%-ный В-В, Ι_ννΡ 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0,001 мг/ мл | 100 | 0,25 | 819200 | 3276300 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В. □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно 2 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320: 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно 4 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82.5 | 1 |
10%-ный В-В, Ι_ννΡ 50-52, сигнальный пептид □Л/Р 320 0,001 мг/мл, добавлен после приблизительно 6 часов культивирования | 100 | 0,25 | 819200 | 3276800 | 82,5 | 1 |
10%-ный В-В, 1_УУР 50-52, □Л/Р 320, добавлен сигнальный пептид ЬЛЛ/Р 760 0,1 мг/ мл | 100 | 0 25 | 819200 | 3276800 | 82.5 | 1 |
10%-ный В-В, □Л/Р 50-52. Ι_ννρ 320, добавлен сигнальный пептид Ρνϋ-32 0,1 мг/мл | 100- | 0 25 | 819200 | 3276800 | 82 5 | 1 |
Как видно из табл. 4, одновременное культивирования Ь^Р 50-52 (штамм-продуцент) и ЬЛУР 320 (индукторный штамм) в присутствии приблизительно 0,01 мг/мл сигнального пептида из Ь^Р 50-52 в течение приблизительно 8 ч увеличивает выход бактериоцина 50-52 до приблизительно 353,1 мг из 1 л культуральной жидкости. Добавление сигнальных пептидов, изолированных из РУО-32 и Ь^Р 760 не увеличивает выход бактериоцина 50-52 по сравению с контролем. Следует отметить, что синтез бактериоцина увеличивается максимально, если сигнальный пептид вводят в культуральную жидкость приблизительно через 2 ч после начала культивирования при суммарном времени культивирования приблизительно 12 ч.
Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина при крупномасштабном культивировании продуцирующие и индуцирующие штаммы выращивали в биореакторе У-6 л, содержащем приблизительно 6 л среды. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида поддерживали, как в табл. 5, для условий 10%-ного бульона для Вгисе11а, ЬЛУР 50-52, ЬЛУР 320, 0,01 мг/мл сиг- 11 017633 нального пептида ЬУР 50-52, добавленного после приблизительно 2 ч культивирования. Выделение бактериоцина 50-52 осуществляли в моменты приблизительно 8, 10, 12 и 14 ч культивирования, как описано выше. Контроль содержал 10%-ный бульон для Вгисе11а, ЬУР 50-52, ЬУР-320, при рН приблизительно 6,9, при приблизительно 37°С и приблизительно 150 об/мин. Бактериоцин 50-52 выделяли после приблизительно 12 ч культивирования. Для второго условия условия были теми же, за исключением того, что приблизительно 0,22 мг сигнального пептида ЬУР 50-52 добавляли после 2 ч культивирования. Результаты показаны ниже в табл. 5. Каждое условие повторяли три раза.
Таблица 5
Культивирование штамма-продуцента ЬУР 50-52 и индукторного штамма ЬУР-320 в присутствии сигнального пептида ЬУР 50-52
Условия эксперимента | Объем фракции (мл) | Конц-ия белка (мг/мл) | Активность (Аи/мл) | Удельная активность (Аи/мг) | Кол-во белка на литр среды, мг | Увеличение белка при сравнении с контролем |
Контроль | 900 | 0.6 | 1638400 | 2730667 | 90 | 1 |
0,22 мг сигнального пептида ΙΑΛ/Ρ 50-52 добавлен после 2 часов культивирования | 900 | 2,4 | 6553600 | 2730665 | 360 | 4 |
Культивирование ЬУР 50-52 с ЬУР-320 в присутствии сигнального пептида ЬУР 50-52, внесенного приблизительно через 2 ч после начала культивирования, обеспечивает продукцию 360 мг/литр бактериоцина 50-52 после приблизительно 12 ч культивирования.
Пример 4.
Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из ЬУР-760, для продукции бактериоцина 760 культивирвали ЬУР-760 при приблизительно 37°С, как описано выше в примере 2. К приблизительно 10%-ному бульону для Вгисе11а добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток ЬУР760, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, и приблизительно 1 мл, 0,1, 0,01 или 0,001 мг/мл препарата сигнального пептида ЬУР-760 добавляли либо во время культивирования, либо приблизительно через 2, 4 или 6 ч после начала культивирования. Для другой совокупности переменных к приблизительно 10%-ному бульону для Вгисе11а добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток ЬУР-760, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, добавляли к этому бульону приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма ЬУР-320, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, и приблизительно 1 мл, приблизительно 0,1, 0,01 или 0,001 мг/мл препарата сигнального пептида ЬУР-760 либо во время культивирования, либо приблизительно через 2, 4 или 6 ч после начала культивирования. Следующая совокупность условии включала в себя приблизительно 1 мл суспензии клеток ЬУР-760, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, которую добавляли к приблизительно 10%-ному бульону для Вгисе11а, приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамм ЬУР-320, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, которую добавляли к бульону, и приблизительно 1 мл, приблизительно 0,1 мг/ мл препарата очищенного сигнального пептида ЬУР-50-52 или очищенного сигнального пептида РУО-32, который добавляли в начале культивирования. Контроль содержал приблизительно 1 мл суспензии клеток ЬУР-760, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл, и приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма ЬУР-320, содержащей приблизительно 109 КОЕ/мл в 10%-ном бульоне для Вгисе11а.
Бактериоцин 760 выделяли с помощью центрифугирования для разделения клеток и культуральной жидкости при приблизительно 10000 д в течение приблизительно 15 мин. Супернатант наносили на колонку с октил-сефарозой-4 Еак! Е1оте для извлечения бактериоцина и элюировали буфером для элюции, представляющим собой приблизительно 15 мМ К2НРО4 при рН приблизительно 6,3. Клеточный осадок суспендировали в фосфатном буфере, содержащем приблизительно 0,7% №С1, рН приблизительно 5,6 (буфер для элюции), и суспензию перемешивали и инкубировали в течение приблизительно 20 мин. После инкубационного периода суспензию центрифугировали при приблизительно 10000 д в течение приблизительно 15 мин. Супернатант наносили на колонку Бирегоке БР Еак! Иоте для выделения бактериоцина с помощью буфера для элюции, содержащего приблизительно 25 мМ трис-НС1 и приблизительно 90 мМ №1С1 при рН приблизительно 6,4. Антагонистические активности фракций бактериоцина против С. _)е_)иш и Б. еп!еп!1б1к оценивали в капельном тесте, как описано выше. Уровень чистоты бактериоцина 760 определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрическую точку определяли с помощью изоэлектрической фокусировки. Концентрации белка определяли при приблизительно 215 нм с помощью спектрофотометрического способа. Результаты представлены ниже в табл. 6.
- 12 017633
Таблица 6
Влияние сигнального пептида Ь^Р-760 на продукцию бактериоцина 760
Условия эксперимента | Объем фракции (мл) | Конц-ия белка (мг/мл) | Активность (Аи/мл) | Удельная активность (Аи/мг) | Белок, продуцированный из 1 литра культуральной жидкости, мг | Увеличение кол-ва белка по сравнению с контролем |
Контроль 1ЭЛ/Р760 ЦЛ/Р320 | 100 | о.з | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
1_УУР 760 + 0,1 мг сигнального пептида Ι3Λ/Ρ 760 | 100 | 0,31 | 1638840 | 5286580 | 102,3 | 1,03 |
ЬУУР 760 + 0,1 мг сигнального пептида Ι_ννρ 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 0,31 | 1638840 | 5286580 | 102,3 | 1,03 |
ЦЛ/Р760 + 0,1 мг сигнального пептида Ь1Л/Р 760, добавленного приблизительно через 4 часа культивирования | 100 | 0,31 | 638840 | 5286580 | 102,3 | 1,03 |
Ι_ννρ 760 + 0.1 мг сигнального пептида ЬУУР 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 0,31 | 1638840 | 5286580 | 102,3 | 1,03 |
1ЛУР 760 + 0,01 мг сигнального пептида ί,ννρ 760 | 100 | 0,3 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
ί,ννρ 760 + 0,01 мг сигнального пептид» ί,ννρ 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 0.30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
Ι,ννρ 760 + 0,01 мг сигнального пептиде ί,ννΡ 760, добавленного приблизительно через 4 часа культивирования | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
Ι,ννρ 760 + 0,01 мг сигнального пептида (_ννΡ 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
ЬШР 760 + 0,001 мг сигнального пептиде ίΛΛ/Ρ 760 | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
- 13 017633
ил/р 760 ♦ 0,001 мг сигнального пептид! Ι_ννρ 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
1ДЛ/Р 760 + 0,001 мг сигнального пептида 760, добавленного приблизительно через 4 часа культи вирова ния | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
ί,ννρ 760 + 0,001 мг сигнального пептида ил/р 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
1_УУР 760 + 1ЛЛ/Р 320 + 0,1 мг сигнальной пептида 1ЛУР 760 | 100 | 0,28 | 1638840 | 5853000 | 92,4 | 0,9 |
ΐννρ 760 + Ь\Л/Р 320 + 0,1 мг сигнального пептида ИЛ/Р 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 0,35 | 1638640 | 4682400 | 115,5 | 1,16 |
ЬУУР 760 + Ι_ννρ 320 · 0,1 мг сигнальногс пептида 13Л/Р 760, добавленного приблизительно через 4 часа культивирования | 100 | 0,35 | 1638840 | 4682400 | 115,5 | 1,16 |
□Л/р 760 + !>ννρ 320 » 0,1 мг сигнального пептида ИЛ/Р 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 0,35- | 1638840 | 4682400 | 115,5 | 1,16 |
1УУР 760 + 1_УУР 320 » 0,01 мг сигнального пептида 1 УУР 760 | 100 | 1,56 | 6533600 | 4201025 | 514,8 | 5,2 |
1АЛ/Р 760 + Ι,ννρ 320 4 0,01 мг сигнального пептида 1_УУР 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 1,56 | 6553600 | 4201025 | 514,8 | 5,2 |
ί,ννρ 760 + ί,ννρ 320 4 0,01 мг сигнального пептида Ь¥УР 760, добавленного приблизительно через 4 часа культивирования | 100 | 2,1 | 13107200 | 6241523 | 693 | 7 |
ί,ννρ 760 + ί,ννρ 320 Η 0,01 мг сигнальногс пептида ί,ννρ 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 1,56 | 6553600 | 4201025 | 514,8 | 5,2 |
1_М/Р 760 + 1ЭЛ/Р320 4 0,001 мг сигнальногс пептида ί,ννΡ 760 | юо | 0,32 | 1638840 | 5121375 | 105,6 | 1,06 |
1_УУР 760 + 1_УУР 320 4 0,001 мг сигнальногс пептида 1,УУР 760, добавленного приблизительно через 2 часа культивирования | 100 | 0,32 | 1638840 | 5121375 | 105,6 | 1,06 |
Ι_ννΡ 760 4- Ι,ννΡ 320 4 0,001 мг сигнальногс пептида ί,ννρ 760, добавленного приблизительно через 4 часа культивирования | 100 | 0,32 | 1638840 | 5121375 | 105,6 | 1,06 |
Ι,ννΡ 760 4. Ц/Ур 320 4 0,001 мг сигнальногс пептида 1_М/Р 760, добавленного приблизительно через 6 часов культивирования | 100 | 0,32 | 1638840 | 5121375 | 105,6 | 1,06 |
ί,ννρ 760 + ί,ννρ 320 4 0,1 мг сигнальногс пептида ЕУУР 50-52 | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
ί,ννρ 760 + Ι_ννΡ320 4 0,1 мг сигнальногс пептида Ι νΥΡ ΡΫϋ 32 | 100 | 0,30 | 1638840 | 5462666 | 99 | 1 |
Как видно из табл. 6 выше, культивирование индукторного штамма Ь^Р 760 с индукторным штаммом 320 и приблизительно 0,01 мг сигнального пептида из БАУР 760 при 4 ч культивирования увеличивает выход бактериоцина 760 до приблизительно 693 мг из одного литра культуральной жидкости. Внесение сигнального пептида из РУО 32 и Ь^Р 50-52 не увеличивает выход продукции бактериоцина 760 по сравнению с контролем.
Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина в крупномасштабных условиях выращивали Ь^Р 760 и Ь^Р 320 в биоректоре У-6 л с приблизительно 6 л 10%-ного бульона для Вгисе11а. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида поддерживали как для условий, которые дают 510 мг/литр бактериоцина 760 в указанной табл. 7. Бактериоцин 760 выделяли приблизительно через 8, 10, 12 и 14 ч культивирования. Максимум продукции бактериоцина имел место после 12
- 14 017633 ч культивирования (табл. 7 ниже).
Таблица 7
Культивирование штамма-продуцента Ь^Р 760 и индукторного штамма бАУР 320 в присутствии ЬЛУР сигнального пептида в крупномасштабных условиях
Условия эксперимента | Объем фракции (мл) | Конц-ия белка (мг/мл) | Активность (ди/мл) | Удельная активность (Аи/мг) | Белок, продуцированный на один литр среды, (мг) | Увеличение колва белка по сравнению с контролем |
Контроль | 900 | 0,8 | 3276800 | 4096000 | 120 | 1 |
0,22 мг сигнального пептида 760 | 900 | 3,4 | 13107200 | 3855058 | 510 | 4,25 |
Контроль: биореактор У-6 л, 10%-ный бульон для Вгисе11а, ЬЛУР 760, ЬЛУР 320, при рН 6,9, 37°С, 150 об/мин, 12 ч культивирования. Сигнальный пептид: биореактор У-6 л, 10%-ный бульон для Вгисе11а, Ь^Р 760, ЬЛУР 320, сигнальный пептид ЬЛУР 760 - 0,22 мг, добавлен через 2 ч культивирования, рН 6,9, 37°С, 150 об/мин, 12 ч культивирования.
Пример 5.
Аминокислотные последовательности сигнальных пептидов определяли расщеплением по Эдману при использовании автоматического секвенатора 491 сЬС (Аррбеб ВюкукЮтк, Ьа 1о11а, Са11Г.) по инструкциям изготовителя. Определение молекулярной массы каждого сигнального пептида осуществляли времяпролетной масс-спектрометрией с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (МАЬИ1Т0РМ8) с использованием масс-спектрометра с электрораспылительной ионизацией (АР1 111ТАСА 6000Е, С1ЕХ, МитЬа1, Индия) по инструкциям изготовителя. Результаты показаны в табл. 8 ниже.
Таблица 8
Аминокислотные последовательности бактериоцинов 0Р-7, Ь^Р 50-52 и 6ЛУР 760 и их соответствующих сигнальных пептидов
Образец | Аминокислотная последовательность | Мол. масс. (кДа) |
Бактериоцин ОК-7 | ΚΤΥΥΘΤΝΘνΗΟΤΚΝδίννβΚνΚΙΚΝΜΚΥΟΟΝΤΤΥΜΘΚίΟΟΙίΙΘννΑΤΘΑΡ ΘΚΤΗ ЗЕО Ю ΝΟ 2 | 5123 |
Сигнальный пептид ρνϋ 32 | МУТК6ЬУ1АМУУА1_1АССМ Ι/ΚΘίΤ ЗЕО ΙΟ ΝΟ 3 | 2347 |
Бактериоцин 50-52 | ΤΤΚΝΥΟΝΘνΟΝδνΝννΟΟΟΟΝνννΑδΟΝΙ-ΑΤΟΟΑΑννίΟΚΙΑ ЗЕО Ю ΝΟ 4 | 3932 |
Сигнальный пептид Ι ννρ 50-52 | ΤΝνΤΚ3νννννΐΑ00ΝθννΑ3Ν0Ν€0Ν νΚβΙ-Τ ЗЕО Ю ΝΟ 5 | 3065 |
Бактериоцин η 760 | ΝΡννΥΟΝδΑΑΟΟνΟΟΑΑνΟΘίΑΘΥνΟΕΑΚΕΝΙΑΘΕνΚΚΟννΟΜΑΘΟΕΤΗ ΝΚΑΟΚδΕΡΟδΟννΑδΟ ЗЕО Ю ΝΟ 6 | 5362 |
Сигнальный пептид | ννΝΚΥΚΤΝν\Μ_3ν0ΝΤ60Α0ΑΑνΚ6ί.Τ ЗЕО Ю ΝΟ 7 | 2095 |
| ШУР 760 г
Вышеприведенное подробное описание дано для иллюстрации. Такие подробности даны исключительно для обеспечения возможности того, чтобы специалисты смогли вносить вариации без отклонения от духа и объема этого изобретения.
- 15 017633
Перечень последовательностей <110> Стерн, Норман Дж.
Светоч, Эдуард А.
Ерусланов, Борис В.
Перелыгин, Владимир В. Левчук, Владимир П.
<120> Пептиды-индукторы бактериоцина <130> 800-267НО <140> РСТ/и52006/047088 <141> 2006-12-08 <150> и8 11/297,841 <151> 2005-12-08 <160>7 <170> РаЪепЫп уегзхоп 3.3 <210> 1 <211>5 <212> ПРТ <213> бактерии <400>1
Уа1 Ьуз С1у Ьеи ТЬг <210> 2 <211>53 <212> ПРТ <213> ЬасЬоЬасШиз за1±уаг1из <400> 2
Ьуз ТЬг Туг Туг С1у | ТЬг | Азп | С1у Уа1 | Н1$ 10 | Суз | ТЬг Ьуз Азп | Зег 15 | Ьеи | |||||||
1 | 5 | ||||||||||||||
Тгр | С1у | Ьуз | Уа1 | Агд | Ьеи | Ьуз | Азп | МеЬ | Ьуз | Туг | Азр | С1п | Азп | ТЬг | ТЬг |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Туг | МеЬ | С1у | Агд | Ьеи | С1п | Азр | Не | Ьеи | Ьеи | С1у | Тгр | А1а | ТЬг | С1у | А1а |
35 | 40 | 45 |
РЬе С1у Ьуз ТЬг Н13
<210> | 3 |
<211> | 24 |
<212> | ПРТ |
<213> | ЬасьоЬасШиз за11Уаг1из |
<400> | 3 |
- 16 017633
Мер Уа1 1 | ТЬг | Ьуз | Зег 5 | Ьеи | Уа1 | Ьеи | А1а | Тгр 10 | Уа1 | Уа1 | А1а | Ьеи | Ьеи 15 | А1а |
Суз С1у | - МеЬ | Уа1 20 | Ьуз | С1у | Ьеи | ТЬг | ||||||||
<2Ю> <211> <212> <213> | 4 39 ПРТ ЕпЦетсососсиз | £аес1ит | ||||||||||||
<4 0 Оь | 4 | |||||||||||||
ТЬг ТЬг 1 | Ьуз | Азп | Туг 5 | С1у | Азп | 61у | Уа1 | Суз 10 | Азп | 5ег | Уа1 | Азп | Тгр 15 | Суз |
С1п Суз | С1у | Азп 20 | Уа1 | Тгр | А1а | Зег | Суз 25 | Азп | Ьеи | А1а | ТЬг | С1у 30 | Суз | А1а |
А1а Тгр | Ьеи 35 | Суз | Ьуз | Ьеи | А1а | |||||||||
<210> <211> <212> <213> | 5 30 ПРТ ЕпОегососсиз | £аес!ит | ||||||||||||
<400> | 5 | |||||||||||||
ТЬг Азп 1 | Уа1 | ТЬг | Ьуз 5 | Зег | Тгр | Тгр | Уа1 | Ьеи 10 | А1а | С1у | Суз | Азп | С1ь 15 | Уа1 |
Уа1 А1а | Зег | Азп 20 | Суз | Азп | Суз | С1у | Азп 25 | Уа1 | Ьуз | С1у | Ьеи | ТЬг 30 |
<210> 6 <211> 62 <212> ΠΡΤ <213> 51геррососсиз сгхсеЕиз <400>6
Азп Агд 1 | Тгр | Туг | Суз 5 | Азп | 5ег | А1а | А1а С1у С1у 10 | Уа1 | С1у | С1у | А1а 15 | А1а | |||
Уа1 | Суз | 61у | Ьеи | А1а | 61у | Туг | Уа1 | 61у | С1и | А1а | Ьуз | С1и | Азп | Не | А1а |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
С1у | С1и | Уа1 | Агд | Ьуз | С1у | Тгр | С1у | МеЬ | А1а | С1у | С1у | РЬе | ТЬг | Η1Ξ | Азп |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ьуз | А1а | Суз | Ьуз | 5ег | РЬе | Рго | С1у | 2ег | С1у | Тгр | А1а | 5ег | С1у | ||
50 | 55 | 60 |
<210>7 <211> 26 <212> ΠΡΤ <213> ЗЬгерРососсиз спсеШ <400>7
Тгр Азп Ьуз Туг Ьуз ТЬг Азп Тгр Уа1 Ьеи 5ег Уа1 1510
Суэ Азп ТЬг С1у
Суз А1а Суз А1а А1а Уа1 Ьуз С1у
Ьеи ТЬг
Claims (16)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептид, который имеет карбокситерминальную аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 1, где указанный пептид увеличивает продукцию бактериоцина при добавлении в культуру бактериоцин-продуцирующих клеток.
- 2. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 3.
- 3. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 5.
- 4. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 7.- 17 017633
- 5. Способ увеличения продукции бактериоцина, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующих бактерий с бактерией-индуктором в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 6. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8Е0 Ш ΝΌ: 2, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Ьас!оЬасШик кайуапик ΝΚΗΣ В30514 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасШик спкраШк ΝΕΚΣ 30884 в систему культивирования;(б) добавление пептида, имеющего 8ЕО Ш NО: 3;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 7. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8ЕО Ш NО: 4, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий ЕгИегососсик Гаесшт ΝΚΗΣ В30746 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасШик аакорЫ1ик ΝΚΗΣ В-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида, имеющего 8ЕО Ш NО: 5;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 8. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8ЕО Ш NО: 6, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий §!гер!ососсик спсеЮк ΝΚΗΣ В-30745 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасШик ас1корЫ1ик ΝΚΗΣ В-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида, имеющего 8ЕО Ш NО: 7;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 9. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8ЕО Ш NО: 2, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Ьас!оЬасШик кайуапик ΝΚΗΣ В30514 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасй1ик спкраШк ΝΕΚΣ 30884 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 10. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8ЕО Ш ΝΌ: 4, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий ЕгИегососсик Гаесшт ΝΚΗΣ В-30746 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасШик ас1корЫ1ик ΝΚΗΣ В-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1 в указанную систему;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 11. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего 8ЕО Ш ΝΌ: 6, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий §!гер!ососсик спсеЮк ΝΚΗΣ В30745 и индукторного штамма бактерий Ьас!оЬасШик ас1корЫ1ик ΝΚΗΣ В-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина.
- 12. Выделенный штамм бактерий Еп1егососснк Гаесшт ΝΚΗΣ В-30746, продуцирующий бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΌ: 4.
- 13. Выделенный штамм бактерий ΝΚΗΣ В-30745, продуцирующий бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΌ: 6.
- 14. Выделенный бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш ΝΌ: 4 и 8ЕО Ш ΝΌ: 6.
- 15. Бактериоцин по п.14, продуцируемый штаммом ΝΚΚΕ В-30746.
- 16. Бактериоцин по п.14, продуцируемый штаммом ΝΚΚΕ В-30745.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/297,841 US7354904B2 (en) | 2005-12-08 | 2005-12-08 | Bacteriocin inducer peptides |
PCT/US2006/047088 WO2007078633A2 (en) | 2005-12-08 | 2006-12-08 | Bacteriocin inducer peptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200801294A1 EA200801294A1 (ru) | 2013-01-30 |
EA017633B1 true EA017633B1 (ru) | 2013-02-28 |
Family
ID=38140199
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801294A EA017633B1 (ru) | 2005-12-08 | 2006-12-08 | Пептиды, увеличивающие продукцию бактериоцинов, способы увеличения продукции бактериоцинов и выделенные бактериоцины |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7354904B2 (ru) |
EP (1) | EP1968623B1 (ru) |
CN (2) | CN102977187A (ru) |
AP (1) | AP2415A (ru) |
AT (1) | ATE546152T1 (ru) |
AU (1) | AU2006333246B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0619512A2 (ru) |
CA (1) | CA2632826A1 (ru) |
DK (1) | DK1968623T3 (ru) |
EA (1) | EA017633B1 (ru) |
ES (1) | ES2382466T3 (ru) |
NZ (2) | NZ568964A (ru) |
WO (1) | WO2007078633A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200805195B (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005329462B2 (en) * | 2005-03-18 | 2011-12-01 | State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology | Bacteriocins and novel bacterial strains |
US7354904B2 (en) * | 2005-12-08 | 2008-04-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Bacteriocin inducer peptides |
AU2006342396B2 (en) * | 2005-12-08 | 2013-03-07 | State Research Center For Applied Microbiology And Biotechnology | Novel Enterococcus and Streptococcus strains and bacteriocins |
US7700729B2 (en) | 2006-05-15 | 2010-04-20 | Avidbiotics Corporation | Modified bacteriocins and methods for their use |
US8445639B2 (en) * | 2006-05-15 | 2013-05-21 | Avidbiotics Corporation | Recombinant bacteriophage and methods for their use |
WO2009059054A2 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Bacteria strains an d bacteriocin produced therefrom |
CN108441533A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-08-24 | 北京中特养生物技术研究所有限公司 | 从乳酸菌中提取细菌素的方法 |
WO2020104662A1 (en) | 2018-11-22 | 2020-05-28 | Syngulon S.A. | Peptides for inducing bacteriocin synthesis and methods to identify and/or select and/or optimize the same |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2172324C2 (ru) * | 1995-08-07 | 2001-08-20 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Бактериоцин, способ его получения, штамм micrococcus varians, нуклеотидный фрагмент, сигнальный пептид |
US20020042368A1 (en) * | 2000-02-25 | 2002-04-11 | Fanslow William C. | Integrin antagonists |
US6551795B1 (en) * | 1998-02-18 | 2003-04-22 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics |
WO2003100044A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-04 | Scandinavian Biotechnology Research (Scanbi) Ab | New improved acyltransferase |
WO2004024069A2 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Genentech, Inc. | Novel compositions and methods for the treatment of immune-related diseases |
WO2004035732A2 (en) * | 2002-08-29 | 2004-04-29 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Human polypeptides encoded by polynucleotides and methods of their use |
US20050027457A1 (en) * | 2000-01-24 | 2005-02-03 | Mandell Arnold J. | Algorithmic design of peptides for binding and/or modulation of the functions of receptors and/or other proteins |
US20050153881A1 (en) * | 2003-08-21 | 2005-07-14 | Stern Norman J. | Baceriocins and novel bacterial strains |
US20070135339A1 (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Stern Norman J | Bacteriocin inducer peptides |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO954575D0 (no) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | Vincent G H Eijsink | Ekspresjonssystem i mikroorganisme og dets anvendelse til å uttrykke heterologe og homologe proteiner |
US7988958B2 (en) * | 2005-04-05 | 2011-08-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Enterococcus and Streptococcus strains and bacteriocins |
-
2005
- 2005-12-08 US US11/297,841 patent/US7354904B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-12-08 BR BRPI0619512-1A patent/BRPI0619512A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-08 EP EP06849028A patent/EP1968623B1/en not_active Not-in-force
- 2006-12-08 NZ NZ568964A patent/NZ568964A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-12-08 EA EA200801294A patent/EA017633B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-08 CN CN2012102915928A patent/CN102977187A/zh active Pending
- 2006-12-08 AT AT06849028T patent/ATE546152T1/de active
- 2006-12-08 AP AP2008004512A patent/AP2415A/xx active
- 2006-12-08 ES ES06849028T patent/ES2382466T3/es active Active
- 2006-12-08 DK DK06849028.3T patent/DK1968623T3/da active
- 2006-12-08 AU AU2006333246A patent/AU2006333246B2/en not_active Ceased
- 2006-12-08 CA CA002632826A patent/CA2632826A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-08 WO PCT/US2006/047088 patent/WO2007078633A2/en active Application Filing
- 2006-12-08 CN CN2006800519318A patent/CN101848723B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-08 ZA ZA200805195A patent/ZA200805195B/xx unknown
- 2006-12-08 NZ NZ594112A patent/NZ594112A/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-24 US US11/782,223 patent/US7662592B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2172324C2 (ru) * | 1995-08-07 | 2001-08-20 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Бактериоцин, способ его получения, штамм micrococcus varians, нуклеотидный фрагмент, сигнальный пептид |
US6551795B1 (en) * | 1998-02-18 | 2003-04-22 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics |
US20050027457A1 (en) * | 2000-01-24 | 2005-02-03 | Mandell Arnold J. | Algorithmic design of peptides for binding and/or modulation of the functions of receptors and/or other proteins |
US20020042368A1 (en) * | 2000-02-25 | 2002-04-11 | Fanslow William C. | Integrin antagonists |
WO2003100044A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-04 | Scandinavian Biotechnology Research (Scanbi) Ab | New improved acyltransferase |
WO2004035732A2 (en) * | 2002-08-29 | 2004-04-29 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Human polypeptides encoded by polynucleotides and methods of their use |
WO2004024069A2 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Genentech, Inc. | Novel compositions and methods for the treatment of immune-related diseases |
US20050153881A1 (en) * | 2003-08-21 | 2005-07-14 | Stern Norman J. | Baceriocins and novel bacterial strains |
US20070135339A1 (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Stern Norman J | Bacteriocin inducer peptides |
US7354904B2 (en) * | 2005-12-08 | 2008-04-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Bacteriocin inducer peptides |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
EIVIND KNUTSEN et al., Two Separate Qourum-Sensing Systems Upregulate Transcription of the Same ABC Transporter in Streptococcus pneumoniae, J. Bacteriol, 2004 May, 186(10): 3078-3085, с. 1, 2 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ594112A (en) | 2012-12-21 |
US20080003647A1 (en) | 2008-01-03 |
EA200801294A1 (ru) | 2013-01-30 |
WO2007078633A3 (en) | 2010-03-11 |
US7354904B2 (en) | 2008-04-08 |
US7662592B2 (en) | 2010-02-16 |
DK1968623T3 (da) | 2012-06-04 |
CA2632826A1 (en) | 2007-07-12 |
ES2382466T3 (es) | 2012-06-08 |
AP2415A (en) | 2012-06-01 |
CN101848723B (zh) | 2012-10-03 |
AU2006333246B2 (en) | 2012-02-02 |
AP2008004512A0 (en) | 2008-06-30 |
NZ568964A (en) | 2011-09-30 |
BRPI0619512A2 (pt) | 2011-10-04 |
WO2007078633A2 (en) | 2007-07-12 |
ATE546152T1 (de) | 2012-03-15 |
CN101848723A (zh) | 2010-09-29 |
EP1968623B1 (en) | 2012-02-22 |
EP1968623A4 (en) | 2009-12-02 |
CN102977187A (zh) | 2013-03-20 |
WO2007078633A8 (en) | 2008-07-31 |
ZA200805195B (en) | 2009-08-26 |
AU2006333246A1 (en) | 2007-07-12 |
EP1968623A2 (en) | 2008-09-17 |
US20070135339A1 (en) | 2007-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA017633B1 (ru) | Пептиды, увеличивающие продукцию бактериоцинов, способы увеличения продукции бактериоцинов и выделенные бактериоцины | |
US7452544B2 (en) | Bacteriocins and novel bacterial strains | |
CN101198689A (zh) | 调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物 | |
AU2005329462B2 (en) | Bacteriocins and novel bacterial strains | |
DE60034879T2 (de) | Lantibiotikum | |
Vaca et al. | Bacillus sp. bacteriocins: natural weapons against bacterial enemies | |
KR20090105171A (ko) | 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제조성물 | |
KR102037394B1 (ko) | 신규한 크로노박터 사카자키 특이 박테리오파지 cs4 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
US10092566B2 (en) | Composition for controlling a gut immunity and use thereof | |
KR20090129019A (ko) | 박테리오신을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 육계용생균제 조성물 | |
CN116056587A (zh) | 一种作为改善生长表现和免疫反应的饲料补充物的重组抗微生物胜肽 | |
KR102569795B1 (ko) | 강도다리에서 유래한 유비퀴틴 관련 신규 항균 펩티드 및 이의 용도 | |
AU2011218596B2 (en) | Bacteriocins and novel bacterial strains | |
MX2008007342A (es) | Peptidos inductores de baceriocina | |
KR20220148429A (ko) | 강도다리 유비퀴틴 유래의 신규한 항균 펩티드 및 이의 용도 | |
Kudryavtseva et al. | kk k kkkS kk kkkkS ke Kanatani, K. et al (Isolation and characterization of Acidocin A and | |
EP2351494A1 (en) | Bacteriocins and novel bacterial strains | |
AU2011218597A1 (en) | Bacteriocins and novel bacterial strains | |
NZ585698A (en) | Bacteriocins and Lactobacillis and Enterococcus strains |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |