CN108441533A - 从乳酸菌中提取细菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到微生物发酵领域，具体涉及一种从乳酸菌中提取细菌素的方法。所述方法包括：(1)将乳酸菌接种于发酵液中进行发酵培养，然后离心得到上清液；(2)对所述上清液进行微孔过滤除菌，然后调节pH值为6.0，利用4摄氏度70％～80％饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，离心获得下层沉淀；(3)将所述沉淀溶于pH6.0的磷酸钠缓冲液中，然后用分子量为1000Da的透析袋进行透析，得到含有细菌素的粗提液。通过本发明的方法，所提取得到的细菌素纯度高，品质好，可以作为饲料添加剂，可以预防肠道致病菌对动物肠道的危害。

Description

从乳酸菌中提取细菌素的方法
技术领域
本发明涉及到微生物发酵领域，具体涉及一种从乳酸菌中提取细菌素的方法。
背景技术
细菌素是细菌产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽，具有不残留、不使宿主产生抗药性等特性。与抗生素具有本质的区别，是食品、化妆品、保健品、饲料、生物农药的好材料，在医药、食品、化工等领域具有广泛的应用前景。半个世纪以来，细菌素的研究引起了国内外学者们的广泛关注。由于起步时间较早，国外对细菌素的分离纯化、结构、抑菌机制、抑菌谱进行了深入的研究。例如Nisin、subtilin、subtilosin、colicin，不仅克隆到它们的编码基因，而且还从结构上对它们的抑菌机理进行了深入的研究。国内对细菌素的研究较晚，随着人们生活水平的提高，健康意识的增强，细菌素逐渐引起人们的关注。迄今为止，国内对细菌素的应用研究主要集中于对植物抗菌蛋白的纯化，以及在食品防腐剂蛋白的纯化。实际在饲料作为抗生素的替代方面的研究相对比较少。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从乳酸菌中提取细菌素的方法，从用来提高制备得到细菌素的纯度，从而可以将其应用于饲料添加领域。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种从乳酸菌中提取细菌素的方法，包括：(1)将乳酸菌接种于发酵液中进行发酵培养，然后离心得到上清液；(2)对所述上清液进行微孔过滤除菌，然后调节pH值为6.0，利用4摄氏度70％～80％饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，离心获得下层沉淀；(3)将所述沉淀溶于pH6.0的磷酸钠缓冲液中，然后用分子量为1000Da的透析袋进行透析，得到含有细菌素的粗提液。由此，可以提高所制备得到的细菌素的产量以及纯度，从而可以将所制备得到的细菌素应用于饲料领域，作为饲料添加剂，可以用来预防肠道致病菌对动物肠道的危害。
本发明中所述4摄氏度70％～80％饱和度的硫酸铵溶液指的是达到4摄氏度条件下饱和溶液的70％～80％的硫酸铵溶液。
根据本发明的实施例，以上从乳酸菌中提取细菌素的方法可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述方法中，所述乳酸菌选自动物双歧杆菌、植物乳杆菌和粪链球菌中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述方法中，所述乳酸菌选自动物双歧杆菌N8101、植物乳杆菌N8603和粪链球菌N9301中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述方法中，所述发酵液为番茄液体培养基。
根据本发明的实施例，所述方法中，步骤(1)中将所述乳酸菌案号1％～3％体积比的接种量接种到所述发酵液中。
根据本发明的实施例，所述方法中，步骤(1)和步骤(2)中所述离心速度为3000～10000r/min，离心时间为20～40分钟。
根据本发明的实施例，所述方法中，步骤(2)中采用0.22μm的微孔滤膜进行所述微孔过滤除菌。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括对所述含有细菌素的粗提液采用Sephadex-G100进行纯化。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种细菌素，所述细菌素采用以上实施例所述的方法制备而成，所述细菌素的纯度在95％以上，所述细菌素的分子量为2kD～3kD。
本发明所取得的有益效果为：通过本发明从乳酸菌中提取细菌素的方法，所提取得到的细菌素纯度高，品质好，可以作为饲料添加剂，可以预防肠道致病菌对动物肠道的危害。
附图说明
图1为根据本发明的实施例提供的细菌素对酸碱稳定性的实验结果图。
图2为根据本发明的实施例提供的细菌素对不同的酶的稳定性的实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的发明人在实验过程中发现：当人们在不同的菌株中分离获得多种细菌素的同时，针对不同的细菌的培养条件和纯化的要求，各种技术(或化合物)被用来纯化或部分纯化细菌素。纯化程序的确定需要考虑对象的预期成品的性质。例如，一些氨基酸序列的测定需要高纯度的细菌素，而在细菌素作为生物的防腐剂的使用则要追求细菌素纯化的产量和活性。成本、重复性和物流管理也是影响纯化的选择程序。细菌素的存在可以由生物活性的滴度去检测纯化进度的每一步。蛋白质浓度(mg/ml)或特定活性(AU/mg)的波动往往适应提高细菌素的纯化。
由此，对于细菌素的提取和纯化，在提取和纯化的过程中，每个步骤都可能影响所制备得到的细菌素的品质，影响到细菌素的应用。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一
本发明分别利用三株乳酸菌菌株进行发酵培养，然后从发酵得到的发酵菌液中提取得到细菌素。其中所用到的三株乳酸菌是从从内蒙古的牛、羊肠道分离的48株乳酸菌中选出最佳的三株乳酸菌：动物双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp,animalis)N8101、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N8603和粪链球菌(Streptococcusfaecalis)N9301，发明人首先对这三株菌株进行了部分生物学特性的研究。
1、三株乳酸菌生化特性探究
本发明首先对所选的菌株进行菌落外观、显微镜下45°折光观察、在有氧培养、无氧培养、不同的培养温度进行了探究。
实验结果表明，动物双歧杆菌N8101为革兰氏阳性杆菌，大小0.5～0.8×2～8μm，呈杆状、棒状或分叉为V、Y型。在番茄固体培养基上菌落呈灰白色，中央***，表面平滑或粘液状。显微镜下45°折光观察，菌落结构较为细致，边缘不规则，有荧光度刻纹，边缘一部分有彩色光带。专性厌氧。15℃以下和45℃以上不生长。
植物乳杆菌N8603为革兰氏阳性杆菌，大小0.7～1.0×2～4μm，呈单个或双链排列。在番茄固体培养基上菌落呈乳白色，半透明，表面粗糙。显微镜下45°折光观察，发光均匀，有彩色光带。兼性厌氧。在15℃以下和45℃以上不生长。
粪链球菌N9301为革兰氏阳性球菌，直径0.5～1.0μm，菌体单个或成对存在，也常形成不规则的团堆。在番茄固体培养基上菌落呈灰白色，光滑，边缘整齐。兼性厌氧。在15℃以下和45℃以上不生长。
2、三株乳酸菌的发酵情况
利用不同的碳水化合物对三株乳酸菌的发酵情况进行了初步的鉴定。
实验结果表明：动物双歧杆菌N8101能发酵葡萄糖、***糖、木糖、核糖和乳糖。
植物乳杆菌N8603能发酵葡萄糖、***糖、麦芽糖、核糖和松三糖。
粪链球菌N9301能发酵葡萄糖、***糖、半乳糖、密二糖、果糖、纤维二糖、乳糖、蔗糖和海藻糖，不发酵松三糖、山梨醇、菊糖和木糖。在15℃～45℃培养条件下、含4％胆汁的培养基上、含6.5％氯化钠的培养基上、含0.1％醋酸铊的培养基上生长良好。
实施例二
分别利用实施例一得到的菌株按照如下方法提取细菌素：
(1)将实施例一的三株菌株分别按照1％体积比的接种量接种于番茄发酵液中，然后于37℃条件下静置培养12小时，得到发酵菌液。
其中，所用到的番茄发酵液的成分为：每1000mL发酵液包括：番茄汁50mL、酵母抽提液5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾2g、吐温80 1g、乙酸钠5g、琼脂15g，然后用水加至1000mL，调节pH值为6.8。
(2)将发酵菌液在4℃，3000r/min条件下，离心30min，得到上清液；
将上清液采用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用10％的NaOH调节PH至6.0，再利用4摄氏度条件下70％饱和度的硫酸铵进行沉淀，分离获得所述沉淀；
(3)将所述沉淀溶于无菌的pH值为6.0的磷酸钠缓冲液中，然后利用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析除盐，得到含有细菌素的粗提液；
将粗提液浓缩后，采用Sephadex-G100进行纯化，干燥，得到纯化干品。然后利用SDS-PAGE的方法测定其分子量。同时利用琼脂扩散法对所制备得到的细菌素的纯度进行检测。
实验结果表明：利用以上乳酸菌发酵获得的细菌素，细菌素的纯化干品的纯度可达到95％以上，细菌素的分子量在2～3KDa之间。
实施例三
实施例二对提取得到的细菌素粗提液的理化性质进行了检测，主要包括对细菌素粗提液的热稳定性，酸碱稳定性以及蛋白酶作用的稳定性进行了检测。包括：
1、细菌素粗提液热稳定性的测定
分别取lmL细菌素粗提液于5个试管中，分别在37摄氏度、60摄氏度、80摄氏度条件下处理l小时、在100摄氏度条件下处理30分钟、在121摄氏度条件下处理15分钟。冷却至室温后，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径(mm)，指示菌为大肠杆菌，以未经热处理的细菌素粗提液作对照。
实验结果表明，采用以上乳酸菌发酵获得的细菌素无论是在37摄氏度还是在60摄氏度条件下均表现出良好的热稳定性，在80摄氏度、100摄氏度以及121摄氏度条件下处理，虽然还具有一定的抑菌活性，但是相比较于在37摄氏度和60摄氏度条件下有一定的失活。
2、细菌素粗提液酸碱稳定性测定
分别在试管中各加入细菌素粗提液lmL，用0.lmol/L氢氧化钠或0.lmol/L盐酸将样品溶液分别调至pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，室温保持24h后再将各管的pH调回至pH约7.0，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径(mm)，指示菌为大肠杆菌。
实验结果如图1所示，实验表明，通过三株菌株制备得到的细菌素在pH为2～8条件下均保持良好的抑菌活性，在pH值9～13条件下活性有所下降。
3、细菌素粗提液蛋白酶作用测定
分别在试管中各加入细菌素粗提液lmL，分别经蛋白酶K(37℃，pH7)、胰蛋白酶(30℃，pH7)、胃蛋白酶(37℃，pH7)和а-淀粉酶处理6小时，最终酶浓度为lmg/mL。采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径(mm)，指示菌为大肠杆菌，以未处理的细菌素粗提液为对照。
实验结果如图2所示，实验结果表明，通过三株菌株制备得到的细菌素对于蛋白酶K、胃蛋白酶以及α-淀粉酶均表现出良好的耐受性。通过菌株动物双歧杆菌N8101以及粪链球菌N9301制备得到的细菌素对于胰蛋白酶也表现出良好的耐受性，通过菌株植物乳杆菌N8603制备得到的细菌素对于胰蛋白酶不耐受。
实施例四
实施例四对本发明实施例一制备得到的细菌素(以通过动物双歧杆菌N8101制备得到的细菌素为例)与市面上购买的乳酸链球菌素进行了对比，比较了这两种物质对于肉鸡生长作用的影响。
实验材料为：黑龙江靠河寨种鸡场AA肉鸡(商品代)随机选三栋，每栋18000只。其中，乳酸链球菌素购自天津耀彭生物技术有限公司，肉鸡所使用饲料购自于北京科星饲料公司。
实验分为对照组和实验组，其中对照组按常规饲养(即仅饲喂饲料)，实验组分为实验实验I组和实验II组，其中，实验I组：饮用细菌素1-5天，50g/1000只/天；实验II组：饮用赐美健组1-5天，4g/1000只/天；
统计不同处理对1-5周肉仔鸡死亡率的影响；以及不同处理对1-4周肉仔鸡周增重的影响，实验结果分别见表1和表2所示。
表1 赐美健、细菌素对1-5周肉仔鸡死亡率的影响(单位：‰)
从表1可以看出，相比较于对照组，无论是添加乳酸链球菌素组还是细菌素，均可以显著降低肉仔鸡的死亡率。而且添加了细菌素的实验组，相比较于添加了乳酸链球菌素的实验组，可以将死亡率降低3％左右。
表2 赐美健、细菌素制剂对1-4周肉仔鸡增重的影响(单位：g)
从表2可以看出，相比较于对照组，无论是添加乳酸链球菌素还是细菌素，均可以显著增加肉仔鸡的重量。
同时，本发明进一步进行了动物预防腹泻试验，从实验结果来看，通过本发明得到的细菌素制剂要好于成品乳酸链球菌素。而且初步实验证实，所产生的细菌素对于牛的***炎以及子***均表现出良好的效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种从乳酸菌中提取细菌素的方法，其特征在于，包括：
(1)将乳酸菌接种于发酵液中进行发酵培养，然后离心得到上清液；
(2)对所述上清液进行微孔过滤除菌，然后调节pH值为6.0，利用4摄氏度70％～80％饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，离心获得下层沉淀；
(3)将所述沉淀溶于pH6.0的磷酸钠缓冲液中，然后用分子量为1000Da的透析袋进行透析，得到含有细菌素的粗提液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌选自动物双歧杆菌、植物乳杆菌和粪链球菌中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌选自动物双歧杆菌N8101、植物乳杆菌N8603和粪链球菌N9301中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液为番茄液体培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将所述乳酸菌按照1％～3％体积比的接种量接种到所述发酵液中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述离心速度为3000～10000r/min，离心时间为20～40分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用0.22μm的微孔滤膜进行所述微孔过滤除菌。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用10％的NaOH调节pH为6.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述含有细菌素的粗提液采用Sephadex-G100进行纯化。
10.一种细菌素，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的方法制备而成，所述细菌素的纯度在95％以上，所述细菌素的分子量为2kDa～3kDa。
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