EA017420B1 - Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека - Google Patents

Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека Download PDF

Info

Publication number
EA017420B1
EA017420B1 EA200901500A EA200901500A EA017420B1 EA 017420 B1 EA017420 B1 EA 017420B1 EA 200901500 A EA200901500 A EA 200901500A EA 200901500 A EA200901500 A EA 200901500A EA 017420 B1 EA017420 B1 EA 017420B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
region
represented
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
EA200901500A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901500A1 (ru
EA017420B9 (ru
Inventor
Тобиас РАУМ
Хепп (урожденная Хенкель), Юлия
Эва Визер
Петч (урожденная Миттельштрасс), Зилке
Стивен Цеман
Андреас Вульф
Сандра Брукмайер
Original Assignee
МИКРОМЕТ ГмбХ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МИКРОМЕТ ГмбХ filed Critical МИКРОМЕТ ГмбХ
Publication of EA200901500A1 publication Critical patent/EA200901500A1/ru
Publication of EA017420B1 publication Critical patent/EA017420B1/ru
Publication of EA017420B9 publication Critical patent/EA017420B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к человеческому моноклональному антителу или его фрагменту, которые специфически связываются с GM-CSF приматов и нейтрализуют его.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам и их фрагментам, которые нейтрализуют активность человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р). Данное изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела и их фрагменты, а также к применениям таких антител и их фрагментов для получения лекарственных средств для лечения различных состояний.
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), первоначально описанный как сильнодействующий стимул роста и дифференцировки клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов ίη νίίτο, представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 23 кДа со структурой пучка из четырех α-спиралей, который связывается с гетеродимерным рецептором, состоящим из субъединиц, принадлежащих к семейству цитокиновых рецепторов типа 1. Среди прочего он стимулирует созревание макрофагов, нейтрофилов, гранулоцитов, эозинофилов и антигенпредставляющих дендритных клеток для увеличения их функциональной способности в борьбе с инфекциями. Эксперименты по генетической абляции, т.е эксперименты с сайленсингом или нокаутом интересующего гена - здесь СМ-С8Р - у мышей показали, что СМ-С8Р необходим для поддержания функциональной активности некоторых популяций макрофагов, таких как популяции, которые участвуют в очистке поверхностно-активного соединения в легких и в реакции на определенные типы инфекции или в иммунных ответах.
В то время как СМ-С8Р имеет мощные стимулирующие активности ίη νίίτο на клеткипредшественники нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов и, в меньшей степени, на эритроидные клетки и мегакариоциты, результаты, полученные ίη νίνο на мышах с нокаутом генов, говорят о том, что основная физиологическая роль СМ-С8Р заключается в поддержании или стимуляции функциональной активности зрелых макрофагов и гранулоцитов и в стимуляции презентации антигена иммунной системе. Он осуществляет последнее благодаря его прямым эффектам на продукцию дендритных клеток и макрофагов, а также посредством повышения экспрессии главного комплекса гистосовместимости класса II и Рсрецепторов на макрофагах и дендритных клетках.
ОМ-С8Р стимулирует функциональные активности нейтрофилов, эозинофилов и моноцитовмакрофагов. Они включают повышение активности хемотаксиса, увеличенную экспрессию клеточных адгезивных молекул, повышенную адгезию к поверхностям и повышенную фагоцитарную активность, а также ингибирование и задержку апоптоза этих клеток. Нейтрофилы представляют собой первую линию защиты против вмешательств. Программируемая смерть нейтрофилов задерживается провоспалительными стимулами, включающими ОМ-С8Р, для обеспечения правильного рассасывания воспаления во времени и в пространстве. ОМ-С8Р также стимулирует способность этих клеток опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность и внутриклеточно убивать микроорганизмы и оказывает примирующий эффект на эти клетки для усиления их реакции на последующие стимулы в отношении окислительного взрыва (продукция супероксид-аниона), дегрануляции и высвобождения противомикробных агентов и хемотаксиса. Кроме того, ОМ-С8Р стимулирует высвобождение из этих клеток вторичных цитокинов и медиаторов, включающих 1Ь-1, О-С8Р, М-С8Р и лейкотриены из нейтрофилов, а также 1Ь-1, ΤΝΡ, 1Ь-6, О-С8Р, М-С8Р и простагландины из макрофагов.
Из вышеуказанного очевидно, что ОМ-С8Р играет ключевую роль в активации и поддержании популяций клеток, необходимых для предупреждения инфекции. Однако в некоторых случаях активация этих популяций клеток может быть нежелательной. Например, активация вышеупомянутых клеточных линий, когда патоген отсутствует, во многих случаях приводит к острым и/или хроническим воспалительным состояниям, которые в крайних случаях могут угрожать жизни. Аналогично, сверхэкспрессия ОМ-С8Р может приводить к избытку иммунной активации, приводящему к воспалению. В таких случаях может быть желательной нейтрализация активности ОМ-С8Р с тем, чтобы симптомы этих воспалительных состояний устранялись или, по меньшей мере, ослаблялись.
Примеры такой нейтрализующей активности существуют в предшествующем уровне техники. Например, обнаружили, что нейтрализующее антитело против ОМ-С8Р способствовало увеличению скорости апоптоза эозинофилов в образцах периферической крови (Капкааптап!а е1 а1. (2000) 1оитпа1 οί А11егду ап4 Сйшса1 Iттиηο1ο§у 106, 77-83). Так как повышенная выживаемость эозинофилов коррелирует с астмой, то ожидают, что усиление апоптоза эозинофилов будет ослаблять астматические симптомы.
При хронических воспалительных заболеваниях, таких как астма, ревматоидный артрит и рассеянный склероз, уровни ОМ-С8Р возрастают локально и в некоторых случаях системно, и они коррелировали с воспалительным процессом при этих заболеваниях.
Целью данного изобретения, следовательно, является улучшение способов нейтрализации повышенной и/или нежелательной активности ОМ-С8Р, известной ранее в предшествующем уровне техники.
Соответственно, один аспект данного изобретения относится к человеческому моноклональному антителу или его фрагменту, которые специфически связываются с ОМ-С8Р приматов и нейтрализуют его.
Термин специфически связывает или родственные выражения, такие как специфическое связывание, связывающий специфически, специфический связыватель и т.д. в том виде, как они здесь используются, относятся к способности человеческого моноклонального антитела или его фрагмента раз
- 1 017420 личать ОМ-С8Е приматов и любое число других потенциальных антигенов, отличных от СМ-С8Р приматов, в такой степени, что из пула множества различных антигенов, служащих в качестве потенциальных партнеров связывания, связывается только СМ-С8Р приматов, или связывается в значительной степени. В контексте данного изобретения ОМ-С8Е приматов значительно связывается, когда из пула множества в равной степени доступных различных антигенов, служащих в качестве потенциальных партнеров связывания, ОМ-С8Е приматов связывается по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно в 50 раз, наиболее предпочтительно в 100 или более раз чаще (в кинетическом смысле), чем любой другой антиген, отличный от ОМ-С8Е приматов. Такие кинетические измерения можно провести на установке В1асоге.
Термины нейтрализация, нейтрализатор, нейтрализующий и их грамматически родственные варианты в том виде, как они здесь используются, относятся к частичному или полному ослаблению биологического(их) эффекта(ов) ОМ-С8Е. Такое частичное или полное ослабление биологического(их) эффекта(ов) ОМ-С8Е происходит из-за модификации, прерывания и/или отмены ОМ-С8Еопосредованной трансдукции сигнала, что проявляется, например, во внутриклеточной передаче сигнала, пролиферации клеток или в высвобождении растворимых веществ, в повышающей или понижающей регуляции внутриклеточной активации генов, например той, которая приводит к экспрессии поверхностных рецепторов для лигандов, отличных от ОМ-С8Е. Как понятно специалисту в данной области, существует множество способов определения того, подлежит ли агент, например рассматриваемое антитело или его фрагмент, классификации в качестве нейтрализатора. В качестве примера, это может быть осуществлено с помощью стандартного анализа ίη νίίτο, который обычно проводят следующим образом. В первом эксперименте по пролиферации клеточную линию, для которой известно, что степень ее пролиферации зависит от активности ОМ-С8Е, инкубируют в серии образцов с варьирующими концентрациями ОМ-С8Е, после чего измеряют степень пролиферации данной клеточной линии. Из этого измерения определяют концентрацию ОМ-С8Е, обеспечивающую полумаксимальную пролиферацию данных клеток. Затем проводят второй эксперимент по пролиферации с использованием в каждой из серий образцов такого же количества клеток, которое использовалось в первом эксперименте по пролиферации, определенной выше концентрации СМ-С8Р. и на этот раз варьирующих концентраций антитела или его фрагмента, которое, как предполагают, является нейтрализатором ОМ-С8Е. Вновь измеряют пролиферацию клеток для определения концентрации антитела или его фрагмента, достаточной для осуществления полумаксимального ингибирования роста. Если полученный график ингибирования роста относительно концентрации антитела (или его фрагмента) имеет сигмоидальную форму, приводящую к уменьшению клеточной пролиферации при увеличении концентрации антитела (или его фрагмента), тогда обеспечивается некоторая степень антителозависимого ингибирования роста, т.е. активность ОМ-С8Е была до некоторой степени нейтрализована. В таком случае антитело или его фрагмент можно рассматривать как нейтрализатор в контексте настоящего изобретения. Одним примером клеточной линии, для которой известно, что уровень ее пролиферации зависит от активности ОМ-С8Е, является клеточная линия ТЕ-1, как описано в Кйашига, Т. е1 а1. (1989). 1. Се11. РЬ.у8ю1. 140, 323-34.
Как понятно среднему специалисту в данной области, степень клеточной пролиферации является не единственным параметром, с помощью которого можно установить нейтрализующую способность. Например, для идентификации предполагаемого нейтрализатора ОМ-С8Е можно использовать измерение уровня сигнальных молекул (например, цитокинов), уровень секреции которых зависит от ОМ-С8Е.
Другие примеры клеточных линий, которые могут быть использованы для определения того, является ли рассматриваемое антитело или его фрагмент нейтрализатором активности ОМ-С8Е приматов, включают АМЬ-193 (Ьапде, В. е1 а1. (1987), Β1οοά 70, 192-9); ΟΕ-Ό8 (КатЬаИц А. е1 а1. (1993), Β1οοά 81, 1376-83); ОМ/8О (Оех, 8. е1 а1. (1990), ЕхрепшепЫ НетаЮ^ду 18, 1108-11); МО7Е (Аνаηζ^, О.С. е1 а1. (1990), .^ита! οί Се11и1аг ΡΗ\'5ίο1οβ\· 145, 458-64); ТАЬЬ-103 (УаШеп, М. е1 а1. (1987), ίουΓηη1 οί Iттиηο1οβ\' 138, 4042-50); ИТ-7 (Кοтаΐ8и, N. е1 а1. (1991), Сапсег Вебеатск 51, 341-8).
Человеческое антитело или его фрагмент по данному изобретению являются моноклональными. Следует понимать, что термин моноклональное в том виде, как он здесь используется, имеет значение, обычно приписываемое ему в данной области, а именно антитело (или его соответствующий фрагмент), происходящее из одного клона антитело-продуцирующей клетки, такой как В-клетка, и распознающее один эпитоп на связываемом антигене. Особенно сложно получить человеческие антитела, которые являются моноклональными. В отличие от слияний мышиных В-клеток с бессмертными клеточными линиями, слияния В-клеток человека с бессметрными клеточными линиями являются нежизнеспособными. Таким образом, человеческое моноклональное антитело по данному изобретению является результатом преодоления значительных технических трудностей, которые, как общеизвестно, существуют в области технологии антител. Моноклональная природа антитела делает его особенно хорошо приспособленным для применения в качестве терапевтического агента, поскольку такое антитело будет существовать в виде единственной гомогенной молекулярной частицы, которая может быть хорошо охарактеризована и воспроизводимо получена и очищена. Эти факторы приводят к получению продукта, биологическая активность которого может быть предсказана с высоким уровнем точности, что очень важно, если собираются получить одобрение регулирующего органа для терапевтического введения такой молекулы чело
- 2 017420 веку.
Особенно важным является то, чтобы моноклональное антитело (или соответствующий фрагмент) по изобретению представляли собой человеческое антитело (или соответствующий фрагмент). При рассмотрении агента, представляющего собой антитело, предназначенного для терапевтического введения человеку, весьма полезно, чтобы это антитело имело человеческое происхождение. После введения пациенту, являющемуся человеком, человеческое антитело или его фрагмент скорее всего не будет вызывать сильной иммуногенной реакции иммунной системы пациента, т.е. не будет распознаваться как чужеродный, т.е. нечеловеческий белок. Это означает, что антитела хозяина, т.е. пациента, не будут генерироваться против терапевтического антитела, что, в противном случае, блокировало бы активность терапевтического антитела и/или ускоряло бы элиминацию терапевтического антитела из организма пациента, предотвращая, таким образом, оказание им желательного терапевтического эффекта.
Следует понимать, что термин человеческое антитело в том виде, как он здесь используется, означает, что антитело по данному изобретению или его фрагмент включает аминокислотную(ые) последовательность(и), которые содержатся в спектре человеческих антител зародышевой линии. Поэтому с целью определения здесь антитело или его фрагмент можно считать человеческим, если оно состоит из такой(их) (а) аминокислотной(ых) последовательности(ей) зародышевой линии человека, т.е. если аминокислотная(ые) последовательность(и) рассматриваемого антитела или его фрагмента идентична(ы) экспрессируемой(ым) аминокислотной(ым) последовательности(ям) человеческой зародышевой линии. Антитело или его фрагмент также можно считать человеческими, если они состоят из (а) последовательности(ей), которая(ые) отклоняется(ются) от ближайшей к ней(им) последовательности(ей) человеческой зародышевой линии не более чем ожидалось бы из-за импринтинга соматической гипермутации. Кроме того, антитела многих млекопитающих, не являющихся человеком, например грызунов, таких как мыши и крысы, содержат аминокислотные последовательности УН СЭК.3, которые, как можно ожидать, также существуют в спектре экспрессируемых человеческих антител. Любая такая(ие) последовательность(и) человеческого или нечеловеческого происхождения, которая(ые), как можно ожидать, существует(ют) в экспрессируемом человеческом спектре, также считалась(ись) бы человеческой(ими) для целей настоящего изобретения.
Согласно одному воплощению изобретения ОМ-С8Т приматов представляет собой СМ-С8Е человека (Ното 5;·ιρίοη5) или СМ-С8Е приматов, не являющихся человеком. Особенно предпочтительные варианты ОМ-С8Т приматов, не являющихся человеком, включают в себя СМ-С8Е обезьяны гиббона (N0та5С115 сопсо1ог, также известный как западный черный гиббон) и СМ-С8Е обезьян семейства макак, например ОМ-С8Т макака-резуса (Масаса ти1айа) и ОМ-С8Т макака-крабоеда (Масаса Га5С1си1ап5). Согласно этому воплощению изобретения человеческое моноклональное антитело или его фрагмент демонстрируют перекрестную реактивность как между человеком, так и по меньшей мере одним из видов обезьян, упомянутых выше. Это является особенно полезным для молекулы антитела, которая предназначена для терапевтического введения человеческим субъектам, так как такое антитело в норме должно будет пройти через множество тестов перед тем, как будет одобрено регулирующими органами, из которых некоторые ранние тесты включают вид животных, не являющихся человеком. При проведении таких тестов обычно желательно использовать в качестве видов, не являющихся человеком, виды, имеющие высокую степень генетического сходства с человеком, так как результаты, полученные таким образом, обычно будут в значительной степени предсказывать соответствующие результаты, которые можно ожидать при введении той же молекулы человеку. Однако такая прогнозирующая способность, основанная на тестах с животными, по меньшей мере, частично зависит от сравнимости молекулы и является очень высокой, когда из-за перекрестной реактивности между видами одна и та же терапевтическая молекула может быть введена человеку и животным моделям. Как и в этом воплощении изобретения, когда молекула антитела перекрестно реагирует с одним и тем же антигеном у человека и у другого близкородственного вида, тесты с использованием одной и той же молекулы антитела можно проводить и у человека, и у этого близкородственного вида, например у одного из видов обезьян, упомянутых выше. Это увеличивает как эффективность самих тестов, так и прогнозирующую способность, обеспечиваемую такими тестами, относительно поведения таких антител у человека, основного вида, представляющего интерес с терапевтической точки зрения.
Согласно другому воплощению изобретения человеческое моноклональное антитело может представлять собой 1§С антитело. Как хорошо известно в данной области, 1§С содержит не только вариабельные области антитела, ответственные за высокоизбирательное распознавание и связывание антигена, но также и константные области тяжелых и легких полипептидных цепей антитела, обычно присутствующие в эндогенно продуцируемых антителах, и в некоторых случаях даже декорирование по одному или более чем одному сайту углеводами. Такое гликозилирование обычно является отличительным признаком 1дО-формата, и части этих константных областей составляют так называемую Тс-область целого антитела, которая, как известно, индуцирует различные эффекторные функции ίη угуо. Кроме того, Тсобласть опосредует связывание 1дС с Тс-рецептором и, следовательно, пролонгирование периода полувыведения ίη угуо, а также облегчение хоминга 1дС к местам с повышенным присутствием Тсрецепторов, например к воспаленной ткани. Преимущественно !дС антитело представляет собой !дС1
- З 017420 антитело или 1дС4 антитело, форматы, которые являются предпочтительными, так как их механизм действия ίη νίνο является особенно хорошо изученным и охарактеризованным. Это особенно верно для 1дС1 антител.
Согласно другому воплощению изобретения фрагмент человеческого моноклонального антитела может представлять собой ксЕА, однодоменное антитело, Εν, антитело УНН, диатело, тандемное диатело, ЕаЬ, ЕаЬ' или Е(аЬ)2. Эти форматы обычно можно разделить на два подкласса: на те фрагменты, которые состоят из одной полипептидной цепи, и на те, которые содержат по меньшей мере две полипептидные цепи. Члены первого подкласса включают в себя 5сЕу (содержащий одну УН-область и одну УЪ-область, соединенные в одну полипептидную цепь через полипептидный линкер); однодоменное антитело (содержащее одну вариабельную область антитела), такое как антитело УНН (содержащее одну УНобласть). Члены последнего подкласса включают в себя Εν (содержащий одну УН-область и одну УЪобласть в виде отдельных полипептидных цепей, которые не связаны ковалентно друг с другом); диатело (включающее две, ковалентно несвязанные полипептидные цепи, каждая из которых содержит две вариабельные области антитела: обычно одну УН и одну УЪ на полипептидную цепь, где эти две полипептидные цепи организованы в конформацию голова-к-хвосту, так что образуется молекула бивалентного антитела); тандемное диатело (биспецифические одноцепочечные Εν антитела, содержащие четыре ковалентно связанные вариабельные УН- и УЪ-области иммуноглобулина двух разных специфичностей, образующие гомодимер, который в два раза больше диатела, описанного выше); ЕаЬ (содержащий в качестве одной полипептидной цепи целую легкую цепь антитела, которая сама включает УЪ-область и всю константную область легкой цепи и в качестве другой полипептидной цепи часть тяжелой цепи антитела, содержащей всю УН-область и часть константной области тяжелой цепи, где две указанные полипептидные цепи связаны между собой через межцепьевую дисульфидную связь); ЕаЬ' (в виде ЕаЬ, описанного выше, за исключением дополнительных восстановленных дисульфидных связей, имеющихся на тяжелой цепи антитела); и Е(аЬ)2 (содержащий две молекулы ЕаЬ', где каждая молекула ЕаЬ' связана с другой соответствующей молекулой ЕаЬ' через межцепьевые дисульфидные связи). В общем, фрагменты антител описанных выше типов обеспечивают большую гибкость в приспособлении, например, фармакокинетических свойств антитела, желательного для терапевтического введения, к конкретным имеющимся потребностям. Например, может быть желательным уменьшение размера вводимого антитела для того, чтобы увеличить степень проникновения в ткань, когда известно, что ткани, которые лечат, являются недостаточно васкуляризованными (например, суставы). При некоторых обстоятельствах также может быть желательным увеличение скорости, с которой терапевтическое антитело элиминируется из организма, где указанная скорость обычно ускоряется при уменьшении размера вводимого антитела.
Согласно другому воплощению изобретения указанное человеческое моноклональное антитело или его фрагмент могут быть представлены в моновалентной моноспецифической; поливалентной моноспецифической, конкретно в бивалентной моноспецифической или в поливалентной полиспецифической, конкретно в бивалентной биспецифической формах. В общем, поливалентное моноспецифическое, конкретно бивалентное моноспецифическое антитело, такое как целый 1дС человека, как описано выше, может иметь терапевтическое преимущество в том, что нейтрализация, осуществляемая таким антителом, потенцируется эффектами авидности, т.е. связыванием одного и того же антитела со многими молекулами одного и того же антигена, здесь СМ-С8Е приматов. Несколько форм моновалентных моноспецифических фрагментов антитела по изобретению было описано выше (например, 5сЕу. Εν, УНН или однодоменное антитело). Поливалентные полиспецифические, в частности бивалентные биспецифические формы человеческого моноклонального антитела против СМ-С8Е приматов по изобретению могут включать целый 1дС, в котором один связывающий домен связывается с СМ-С8Е приматов, тогда как другой связывающий домен связывается с другим антигеном, отличным от СМ-С8Е приматов. Другая поливалентная полиспецифическая, в частности бивалентная биспецифическая форма может представлять собой преимущественно человеческое одноцепочечное биспецифическое антитело, т. е. конструкцию рекомбинантного человеческого антитела, содержащую две структурные единицы 5сЕу. как описано выше, соединенные в одну непрерывную полипептидную цепь коротким полипептидным спейсером, вставленным между ними, как общеизвестно в данной области (см., например, \¥О 99/54440 относительно антиСЭ19 х анти-СЭ3 биспецифического одноцепочечного антитела). Здесь один 5сЕу участок биспецифического одноцепочечного антитела, содержащегося в биспецифическом одноцепочечном антителе, будет специфически связывать СМ-С8Е приматов, как указано выше, тогда как другой соответствующий 5сЕу участок этого биспецифического одноцепочечного антитела будет связывать другой антиген, который, как было определено, имеет терапевтическую пользу.
Согласно другому воплощению может быть получено производное человеческого моноклонального антитела или его фрагмента, например, с органическим полимером, например с одной или более чем одной молекулой полиэтиленгликоля (РЕС) и/или поливинилпирролидона (РУР). Как известно в данной области, получение такого производного может быть полезным в модуляции фармакодинамических свойств антител или их фрагментов. Особенно предпочтительными являются молекулы РЕС, полученные в виде РЕС-малеимида, обеспечивающего конъюгацию с антителом или его фрагментом сайтспецифическим образом через сульфгидрильную группу аминокислоты цистеина. Особенно предпочти
- 4 017420 тельными из них являются 20 и/или 40 кДа РЕС-малеимид как в разветвленной форме, так и в прямоцепочечной форме. Особенно полезным может быть увеличение эффективной молекулярной массы меньших фрагментов человеческих антител против СМ-С8Е приматов, таких как 5сЕу фрагменты, путем связывания последних с одной или более чем одной молекулой РЕС, особенно с РЕС-малеимидом.
Согласно другому воплощению изобретения человеческое моноклональное антитело или его фрагмент специфически связывается с эпитопом, в частности с прерывистым эпитопом человеческого или не являющегося человеческим СМ-С8Е приматов, содержащим аминокислоты 23-27 (ККЕЬЫ) и/или аминокислоты 65-77 (С>1 .К/ОС151 ,ТК1 .КС1Р1.).
Вариабельность в положении 67 в пределах отрезка аминокислотной последовательности 65-77, указанного выше, отражает гетерогенность в этом участке СМ-С8Е приматов, с одной стороны, между СМ-С8Е человека и гиббона (у которых в положении 67 находится К.), а с другой стороны, между СМС8Е обезьян из семейства макак, например макака-крабоед и макака-резус (у которых в положении 67 находится О).
В том виде, как она здесь используется, нумерация человеческого и не являющегося человеческим СМ-С8Е приматов относится к нумерации зрелого СМ-С8Е, т.е. СМ-С8Е без его 17-аминокислотной сигнальной последовательности (общая длина зрелого СМ-С8Е и у человека, и у приматов, не являющихся человеком, описанных выше, составляет 127 аминокислот). Последовательность СМ-С8Е человека и СМ-С8Е гиббона является следующей:
ΟΡΗΕΗνΝΑΙΟ
ЬУКОСЬЯСЗЬ
КОРЬЬУ1РРО
Последовательность СМ-С8Е у определенных членов семейства обезьян макак, таких как, например, макака-резус и макака-крабоед, является следующей:
ЕАНКШЫЬЗЙ ΟΤΑΑΕΜΝΚΤν ЕУУЗЕМГОЬО
ТКЬКОРЬТММ А8НУК0НСРР ТРЕТ5САТ01
СНЕРУОЕ
ЕАКНЬЪЫАЗЯ ΟΤΑΑΕΜΝΕΤν ЕУ13ЕМЕМ.О
ТКЬКСРЬТММ АЗНУКОНСРР ТРЕТЗСАТС1 СИЕРУОЕ
АРАВ8РЗРЗТ
ЕРТСЬОТЕЬЕ
ТТРЕЗРКЕЫЬ аракзрзрот
ЕРЗСЬОТКЬЕ
ГТРОЗРКЕЫЬ
ΟΡΗΕΗνΝΑΙΟ ЬУКаСЪОЕЗЬ
КОЕЬЬУГРРО
Минимальный эпитоп, преимущественно прерывистый эпитоп, связываемый человеческим моноклональным антителом по изобретению (или его фрагментом), как описано выше, указан в приведенной выше последовательности СМ-С8Е жирным шрифтом. Термин прерывистый эпитоп в том виде, как он здесь используется, следует понимать как по меньшей мере два несмежных отрезка аминокислотной последовательности в данной полипептидной цепи, здесь зрелого человеческого и не являющегося человеческим СМ-С8Е приматов, которые одновременно и специфически (как представлено выше) связываются антителом. Согласно этому определению такое одновременное специфическое связывание может представлять собой связывание полипептида СМ-С8Е в линейной форме. Здесь можно представить, что зрелый полипептид СМ-С8Е образует протяженную петлю, в одном участке которой две последовательности, указанные выше жирным шрифтом, выравниваются, например, более или менее параллельно и поблизости друг от друга. В этом состоянии они специфически и одновременно связываются фрагментом антитела по изобретению. Согласно этому определению одновременное специфическое связывание двух отрезков последовательности зрелого СМ-С8Е, указанных выше, также может принимать форму связывания антитела с конформационным эпитопом. Здесь зрелый СМ-С8Е уже образовал свою третичную конформацию, в которой он обычно существует ίη νίνο (8ип, Η.ν., 1. ВсгпНадсп. с( а1. (1996). Ргос Ναΐΐ Асай 8с1 И8А 93, 5191-6). В этой третичной конформации полипептидная цепь зрелого СМ-С8Е свернута таким образом, чтобы привести два отрезка последовательности, указанных выше, в пространственную близость, например, на наружной поверхности конкретной области зрелого, свернутого СМ-С8Е, где они затем распознаются благодаря их трехмерной конформации в контексте окружающих полипептидных последовательностей.
В предпочтительном воплощении приведенный выше (прерывистый) эпитоп дополнительно содержит аминокислоты 28-31 (Ь8КО), указанные курсивом в приведенных выше последовательностях человеческого и не являющегося человеческим СМ-С8Е приматов. В особенно предпочтительном воплощении любой из указанных выше (прерывистых) эпитопов дополнительно содержит аминокислоты 32-33 (ТА) и/или аминокислоты 21-22 (ЕА), где каждый из этих отрезков подчеркнут в приведенных выше последовательностях человеческого и не являющегося человеческим СМ-С8Е приматов.
Согласно другому воплощению изобретения человеческое моноклональное антитело или его фрагмент содержат в вариабельной области его тяжелой цепи область СПК.3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, определенных в любой из 8ЕО ΙΌ N0: 1-13 или 56. Предпочтительным является человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие последовательность СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 1; или содержащее последовательность СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, как
- 5 017420 представлено в 8ЕО ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 2; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 3; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 4; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 5; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 6; или содержащее последовательность ί.'ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 7; или содержащее последовательность ί.'ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность ί.'ΌΕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 8; или содержащее последовательность ί.'ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность ί.'ΌΕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность ί.'ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 9; или содержащее последовательность ί.'ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность ί.'ΌΕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 10; или содержащее последовательность ί.'ΌΕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 11; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 12; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 13; или содержащее последовательность СЭЕ1 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, последовательность СЭЕ2 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и последовательность СЭЕ3 вариабельной области тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 56.
Еще более предпочтительно любая из 14 комбинаций последовательностей СЭКЕ СЭЕ2 и СЭЕ3. определенных выше, существует в человеческом моноклональном антителе или его фрагменте, дополнительно содержащем в вариабельной области его легкой цепи область СЭКЕ содержащую аминокислотную последовательность, определенную в 8Е0 ΙΌ N0: 16, область СЭК2, содержащую аминокислотную последовательность, определенную в 8Е0 ΙΌ N0: 17, и область СЭК3, содержащую аминокислотную последовательность, определенную в 8Е0 ΙΌ N0: 18.
Согласно другому воплощению человеческое моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент содержат в вариабельной области его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19. Предпочтительным является человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 20; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 21; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 22; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 23; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой це
- 6 017420 пи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 24; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 25; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 26; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 27; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 28; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 29; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 30; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 31; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 32; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 33; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 52; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 53.
Согласно другому воплощению человеческое моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент содержат в вариабельной области его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 54. Предпочтительным является человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 20; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 21; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 22; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 23; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 24; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 25; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 26; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕЦ ΙΌ N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 27;
- 7 017420 или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 28; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 29; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 30; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 31; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 32; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 33; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 52; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 54, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 53.
Согласно другому воплощению человеческое моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент содержат в вариабельной области его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55. Предпочтительным является человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 20; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 21; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 22; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 23; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 24; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 25; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 26; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 27; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 28; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 29; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕС ГО N0: 30; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область
- 8 017420 легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕО ΙΌ N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 31; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 32; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 10 N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 33; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 52; или человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, вариабельная область легкой цепи которого содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 53.
В предпочтительном воплощении предложено человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭКЕ содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 16, область СЭК.2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 17, и область СЭК.3, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 18, и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭКЕ содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, область СЭК.2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и область СЭК.3, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 56.
В другом предпочтительном воплощении данное человеческое моноклональное антитело содержит в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 35; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 36; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 37; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 38; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 39; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 40; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 41; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 42; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 43; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 44; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 45; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 46; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 47; или в его легкой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и в его тяжелой цепи аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 48.
Согласно предпочтительным воплощениям, приведенным выше, предложены молекулы человеческого моноклонального антитела и/или его фрагмента, которые являются особенно полезными в качестве нейтрализаторов активности СМ-С8Е приматов, особенно СМ-С8Е человека. Человеческие моноклональные антитела или их фрагменты согласно этим особенно предпочтительным воплощениям являются весьма полезными по нескольким причинам.
Во-первых, они высокоспецифически распознают СМ-С8Е приматов, то есть в смеси СМ-С8Е приматов с другими колониестимулирующими факторами приматов (например, с С-С8Е или М-С8Е) связывающие молекулы согласно этим особенно предпочтительным воплощениям являются в высокой степени избирательными к СМ-С8Е приматов, тогда как другие колониестимулирующие факторы в той же среде не распознаются. Это означает, что ожидается, что человеческое моноклональное антитело или его
- 9 017420 фрагмент согласно этим воплощениям при введении человеку будут специфически связываться и нейтрализовать только желательную мишень, тогда как другие нежелательные мишени не связываются и не нейтрализуются. В конечном счете, это приводит к высокой степени предсказуемости относительно терапевтического способа действия ίη νίνο.
Во-вторых, связыватели согласно этим особенно предпочтительным воплощениям связываются с СМ-С8Т приматов с чрезвычайно высокой аффинностью. Для молекул этого класса наблюдали значения 1<ι, от примерно 4х10-9М до таких низких значений, как примерно 0,04х10-9М, причем последнее соответствует примерно 40 пМ. Поскольку кинетика скорости ассоциации (оп-га1е) таких молекул в водных средах главным образом контролируется диффузией и, следовательно, не может улучшаться в большей степени, чем позволяют локальные условия диффузии при физиологических условиях, низкая Кс возникает главным образом в результате кинетики скорости диссоциации (к^), которая для наивысшей аффинности связывателя антитела составляет приблизительно 10-5 с-1. Это означает, что как только образуется комплекс между человеческим моноклональным антителом или его фрагментом согласно любому из этих воплощений изобретения, с одной стороны, и СМ-С8Т приматов, с другой стороны, он распадается с трудом или, по меньшей мере, не быстро. Для связывающих молекул, предназначенных быть нейтрализаторами биологической активности, эти характеристики являются весьма полезными, так как желательный нейтрализующий эффект обычно длится только при условии, что молекула, биологическая активность которой подлежит нейтрализации (здесь СМ-С8Т приматов), остается связанной с нейтрализующей связывающей молекулой. Так что нейтрализующая молекула, которая остается связанной с ее заданной мишенью в течение длительного периода времени, будет продолжать осуществлять нейтрализацию в течение соответствующего длительного периода времени.
Высокая аффинность связывания человеческих моноклональных антител или их фрагментов с СМС8Т приматов имеет дополнительное преимущество. Обычно антитела или их фрагменты будут элиминироваться из кровотока пациента в зависимости от их размера, причем меньшие молекулы экскретируются и элиминируются раньше, чем более крупные молекулы. Поскольку комплекс двух полипептидов антитела или фрагмента антитела и связанного СМ-С8Т - очевидно больше, чем одно антитело, низкая ко££, упомянутая выше, оказывает эффект в том, что терапевтический нейтрализатор экскретируется и элиминируется из организма человека более медленно, чем это было бы в том случае, если бы он не был связан с СМ-С8Т. Таким образом, увеличивается не только величина нейтрализующей активности, но также и ее продолжительность ίη νίνο.
Наконец, нейтрализующая активность, определенная для связывателей согласно этим особенно предпочтительным воплощениям, является неожиданно высокой. Как будет описано более подробно здесь ниже, нейтрализующую активность измеряли ίη νίΐτο с использованием анализа ингибирования роста ТТ-1 (Кйатига, Т. е1 а1. (1989). 1. Се11. Рйузюк 140, 323-34). В качестве показателя нейтрализующего потенциала измеряли значения 1С50, где 1С50 представляет собой концентрацию человеческого моноклонального антитела или его фрагмента согласно любому из этих воплощений изобретения, необходимую для вызывания полумаксимального ингибирования пролиферации клеток ТТ-1. Для человеческих моноклональных антител или их фрагментов согласно любому из этих воплощений изобретения было определено значение 1С50 приблизительно 3х10-10 М или примерно 0,3 нМ. Следовательно, связывающие молекулы согласно любому из этих воплощений изобретения являются высокоэффективными нейтрализаторами активности СМ-С8Т приматов.
В заключение, в таком случае человеческое моноклональное антитело или его фрагмент согласно любому из приведенных выше воплощений изобретения демонстрирует высокую степень распознавания желательного антигена, связывает этот антиген чрезвычайно прочно и в течение длительного периода времени и демонстрирует весьма мощную нейтрализующую активность в течение длительного периода времени, пока оно остается связанным. В то же самое время длительная персистенция комплекса связыватель-антиген замедляет элиминацию этого связывателя из организма, удлиняя тем самым продолжительность желательного терапевтического эффекта ίη νίνο.
Согласно другому аспекту изобретения предложено человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную гомологию с аминокислотной последовательностью, как представлено в любой из 8ЕО ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56. Гомологию можно определить стандартными программами выравнивания последовательностей, такими как УесЮг ΝΤΙ (1п[огМах™. Магукщб. И8Л). Такие программы сравнивают выравненные последовательности по принципу аминокислота за аминокислотой, и в них можно установить разные уровни строгости для сравнения (например, идентичная аминокислота, консервативная аминокислотная замена и т.д.). В том виде, как здесь используется данный термин, две рассматриваемые аминокислоты считаются консервативными заменами друг друга, если они принадлежат к одному и тому же химическому классу, т.е. к классу кислых, неполярных, незаряженных полярных и основных аминокислот. В качестве неограничивающего примера две разные аминокислоты, принадлежащие к классу неполярных аминокислот, считаются консервативными заменами друг друга, даже если эти две аминокислоты не являются идентичными, тогда как неполярная аминокислота, с одной стороны, и основная аминокислота, с другой
- 10 017420 стороны, не считаются консервативными заменами друг друга. В табл. 3.1 в Мо1еси1аг Βίοίοβν οί 1Пе Се11, 4‘ь Εάίίίοη (2002), Ьу Л1Ьег15. 1оЬи8ои, йе\\'й. ЕаГГ. КоЬегй апб ХУаНет, аминокислоты сгруппированы в четырех основных группах: кислые, неполярные, незаряженные полярные и основные. В целях настоящего изобретения такое группирование можно использовать для определения того, является ли конкретная аминокислота консервативной заменой другой рассматриваемой аминокислоты или нет.
Согласно другому аспекту изобретения предложена полинуклеотидная молекула, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, или нуклеотидную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70%-ную гомологию с ними, где гомологию можно определить путем сравнения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность любой из ЗЕЦ ΙΌ N0: 148 и/или 52-56, с рассматриваемой нуклеотидной последовательностью путем выравнивания последовательностей (как описано выше для аминокислотных последовательностей), где нуклеотид в рассматриваемой последовательности считается гомологичным, если он является либо идентичным соответствующему нуклеотиду в нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность из любой из ЗЕЦ ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, или если одно или более чем одно отклонение(я) в нуклеотидах рассматриваемой последовательности от соответствующего одного или более чем одного нуклеотида(ов) в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность из любой из ЗЕЦ ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, приводит к образованию нуклеотидного триплета, который при трансляции дает аминокислоту, которая либо идентична (благодаря вырожденному триплету) соответствующей аминокислоте в соответствующей аминокислотной последовательности из любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, либо является консервативной заменой соответствующей аминокислоты в соответствующей аминокислотной последовательности из любой из ЗЕЦ ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56. Здесь термин консервативная замена следует понимать, как описано выше.
Согласно другому аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая человеческое моноклональное антитело, или его фрагмент, или полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, или кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную гомологию с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-48 и/или 52-56, где гомологию следует понимать, как объяснено в данном описании выше. Согласно данному изобретению термин фармацевтическая композиция относится к композиции для введения пациенту, преимущественно пациенту, являющемуся человеком. В предпочтительном воплощении данная фармацевтическая композиция содержит композицию для парентерального, трансдермального, интралюминального, внутриартериального, интратекального и/или интраназального введения или путем прямой инъекции в ткань. Конкретно предусматривается, что указанную фармацевтическую композицию вводят пациенту посредством инфузии или инъекции. Введение подходящих композиций можно осуществлять разными путями, например внутривенным, интраперитонеальным, подкожным, внутримышечным, местным или интрадермальным введением. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают в себя забуференные фосфатом физиологические растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии типа масло-в-воде, разные типы увлажнителей, стерильные растворы, липосомы и т. д. Композиции, содержащие такие носители, можно приготавливать в виде препаратов с помощью общеизвестных традиционных способов. Эти фармацевтические композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе. Схема дозирования определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер тела пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, которые вводятся одновременно. Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные наполнители включают в себя раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера, или нелетучие масла. Внутривенные наполнители включают в себя жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители (такие как наполнители на основе декстрозы Рингера) и тому подобное. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать белковые носители, подобные, например, сывороточному альбумину или иммуноглобулину, предпочтительно человеческого происхождения. Предусматривается, что фармацевтическая композиция по данному изобретению, помимо человеческого моноклонального антитела или его фрагментов (как описано в этом изобретении), может содержать дополнительные биологически активные агенты, в зависимости от предполагаемого применения
- 11 017420 данной фармацевтической композиции. Такие агенты могут представлять собой лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечную систему, лекарственные средства, действующие как цитостатики, лекарственные средства, предотвращающие гиперурикемию, лекарственные средства, ингибирующие иммунореакции (например, кортикостероиды), лекарственные средства, модулирующие воспалительную реакцию, лекарственные средства, действующие на систему кровообращения, и/или такие агенты, как цитокины, известные в данной области.
Согласно другому аспекту изобретения предложено применение человеческого моноклонального антитела или его фрагмента, как описано здесь выше, или полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8ЕО Ш N0: 1-48 и/или 52-56, или кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную гомологию с любой из 8Е0 ГО N0: 1-48 и/или 52-56, где гомологию следует понимать так, как объяснено в данном описании выше, в изготовлении лекарственного средства, возможно содержащего один или более чем один противовоспалительный агент, для лечения воспалительных заболеваний. Воспалительные заболевания преимущественно выбраны из группы, состоящей из ревматоидного артрита (КА) (включая КА, который является устойчивым к лечению нейтрализаторами ΤΝΕ-α), астмы, рассеянного склероза (М8), хронического обструктивного заболевания легких (СОРЭ). острого респираторного дистресс-синдрома (АКЭ8), болезни Крона, идиопатического легочного фиброза (1РР), воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ), увеита, дегенерации желтого пятна, колита, псориаза, Уоллеровской дегенерации, антифосфолипидного синдрома (АР8), острого коронарного синдрома, рестеноза, атеросклероза, рецидивирующего полихондрита (КР), острого или хронического гепатита, неудачного приживления ортопедических имплантатов, гломерулонефрита, волчанки или аутоиммунных расстройств.
Особый интерес представляет собой применение человеческого моноклонального антитела или его фрагмента согласно данному изобретению для получения лекарственного средства для лечения КА (включая КА, который является устойчивым к лечению нейтрализаторами ΤΝΕ-α), астмы, М8 и/или болезни Крона.
Что касается КА, астмы и/или М8, то есть две популярные теории относительно патогенеза ревматоидного артрита (КА). Первая принимает, что Т-клетка, через взаимодействие с еще неидентифицированным антигеном, является первичной клеткой, ответственной за инициацию заболевания, а также за развитие хронического воспалительного процесса. Эта теория основана на известной связи КА с главными антигенами гистосовместимости класса II, большим количеством СГО4+ Т-клеток и с использованием деформированного гена рецептора Т-клеток в синовиальной оболочке, пораженной КА. Известно, что СМ-С8Р усиливает антиген-презентирующую функцию через увеличение экспрессии поверхностных молекул МНС класса II, и СМ-С8Р продуцируется Т-клетками, что указывает на предполагаемую роль СМ-С8Р в развитии заболевания согласно гипотезе, основанной на Т-клетках.
Вторая теория принимает, что, хотя Т-клетки могут играть важную роль в инициации данного заболевания, хроническое воспаление может долго поддерживаться макрофагами и фибробластами независимым от Т-клеток образом. Эта теория основана на относительном отсутствии фенотипов активированных Т-клеток при хроническом КА и на преобладании фенотипов активированных макрофагов и фибробластов. СМ-С8Р является мощным стимулятором макрофагов и стимулирует пролиферацию моноцитов и макрофагов.
Известно, что СМ-С8Р, продуцируемый главным образом эффекторными клетками (макрофагами) и клетками соединительной ткани (фибробластами), экспрессируется в большом количестве в синовиальной оболочке, пораженной КА, и в синовиальной жидкости, как измерено с помощью ЕБ48А или исследований мРНК. Согласно макрофагально-фибробластной теории КА, эти два типа клеток, повидимому, в значительной степени отвечают за создание состояния длительно поддерживающегося воспаления, при котором участие Т-клеток может больше не быть критическим. При этом сценарии активированный макрофаг непрерывно секретирует ГС-1 и ΤΝΡ, которые поддерживают синовиальный фибробласт в активированном состоянии. Фибробласт, в свою очередь, секретирует большие количества: а) цитокинов - ГО6, Ю8 и 6М-С8Р; б) простагландинов и в) протеаз. 6М-С8Р подвергается действию обратной связи для стимуляции созревания вновь рекрутированных моноцитов до макрофагов. ГО8 и ΣΕ6 способствуют рекрутингу и/или активации других клеточных популяций, тогда как простагландины и протеазы непосредственно действуют при эрозии и разрушении близлежащих соединительных тканей, таких как кости и хрящи.
Что касается болезни Крона, то рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (гСМ-С8Р) из дрожжей продемонстрировал эффективность при лечении болезни Крона, тяжесть которой варьировала от умеренной до тяжелой формы (О1ескдгае£е ВК, Κοι^ηίΕ Ж (2002). Ьапсе! 360, 1478-80). С этого времени в нескольких обзорных статьях были высказаны предположения о терапевтическом эффекте этого мощного провоспалительного цитокина в данном заболевании, которое, как считают, имеет воспалительную природу. Возможные объяснения способа действия гСМ-С8Р включали компонент иммунонедостаточности при болезни Крона, деформацию Τ112 и экспан
- 12 017420 сию дендритных клеток, стимулирующих дифференцировку регуляторных Т-клеток (\νί11< Ν.ί., Уйпеу Й.Ь. (2002). Сигг Ορίη 1пуеЧ Эгидк 3, 1291-6; Ео1\\'асхпу С. ей а1. (2003). Еиг. Й. Сакйгоепйего1 Нерайой 15, 621-6). Авторы изобретения считают, что, по-видимому, существует более простой способ действия, который в то же время больше согласуется с известной ролью СМ-С8Е в других провоспалительных заболеваниях.
СМ-С8Е является одним из самых мощных известных адъювантов, вследвие чего данный цитокин используют для совместного введения во многих продолжающихся в настоящее время исследованиях по вакцинации. В то же время СМ-С8Е является высокоиммуногенным (Вадпйаттаг Р. ей а1. (1994). В1оо6 84, 4078-87). В совсем недавнем исследовании (Κίηί В. ей а1. (2005) Суйокйпе 29, 56-66) было показано, что ежесуточное подкожное лечение с использованием гСМ-С8Е из дрожжей, которое осуществляли при исследовании болезни Крона (Ойескдгаейе В.К., Когхешк Й.Р. (2002). Ьапсей 360, 1478-80), в течение трех месяцев приводило у 87% (13/15) пациентов с раком простаты к развитию антител против данного цитокина. У 60% пациентов (9/15) появлялись (поликлональные) антитела, нейтрализующие СМ-С8Е. В исследовании болезни Крона не исследовалась возможность нейтрализующей реакции на СМ-С8Е, а также не определялись уровни СМ-С8Е в сыворотке при терапии. В пределах объема данного воплощения изобретения предполагают, что пациенты с болезнью Крона, которых лечили гСМ-С8Е, не реагировали непосредственно только на иммуностимулирующую активность данного цитокина, но также, по меньшей мере частично, клинически реагировали на антительный ответ, нейтрализующий как введенный, так и эндогенный СМ-С8Е, который, как известно, сверхпродуцируется при болезни Крона (АдпЪо1й й. ей а1. (2004) Еиг. й. Сакйгоепйего1 Нерайо1 16, 649-55). Тогда нейтрализующие антитела против СМ-С8Е могут иметь аналогичную терапевтическую активность при болезни Крона, как и гСМ-С8Е, и их следует рассматривать в качестве альтернативного терапевтического подхода, как это предусмотрено выше.
В другом аспекте изобретения предложено применение человеческого моноклонального антитела или его фрагмента, как описано выше, или полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-48 и/или 52-56, или кодирующую аминокислотную последовательность, включающую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную гомологию с любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-48 и/или 52-56, где гомологию следует понимать, как объяснено выше, в изготовлении лекарственного средства, возможно содержащего один или более чем один дополнительный противораковый агент, для лечения опухолевого заболевания или другого состояния с замедленным апоптозом клеток, повышенным выживанием или пролиферацией клеток. Предпочтительное опухолевое заболевание представляет собой рак, из которого особенно предпочтительными являются лейкоз, множественная миелома, карцинома желудка или карцинома кожи.
Окег и др. ((2002) Сапсег Сйетоййег Рйагтасо1. 50, 171-8) подкожно применяли антагонист СМС8Е Е21Р у пациентов с солидными опухолями, для которых известно, что в них экспрессируются рецепторы СМ-С8Е, что приводило лишь к временному снижению уровней Р8А в сыворотке. Кроме того, применение этого антагониста СМ-С8Е при остром миелоидном лейкозе (АМЬ) не выявило клинической активности (йакирогю ей а1. (2004) В1оо6 103, 3230-2.). Более того, применение моноклональных антител против СМ-С8Е у пациентов с АМЬ не выявило антилейкозного эффекта, несмотря на достаточные сывороточные уровни и биологическую активность данного антитела йп νί\Ό (ВоиаЬбаИай ей а1. (1998) Ьеик Ьутркота 30, 539-49). Поэтому авторы изобретения заключили, что у пациентов с АМЬ лечение антителами против СМ-С8Е является неэффективным.
Данное изобретение теперь будет описано более подробно в следующих неограничивающих примерах и графических материалах, обзор которых приведен ниже.
Фиг. 1 - интенсивность поглощения (прямо пропорциональна силе связывания) для целого ряда молекул 8сΕν против ГЙСМ-С8Е, полученных после четырех или пяти раундов пэннинга в фаговом дисплее, как определено с помощью ЕЫ8А;
фиг. 2 - средняя интенсивность флуоресценции (обратно пропорциональна силе нейтрализации) для целого ряда 8сΕν против ГЙСМ-С8Е и других тестируемых молекул, как определено с помощью анализа на основе проточной цитометрии;
фиг. 3 - результаты анализа ингибирования пролиферации ТЕ-1, проведенного с использованием молекулы 8сΕν 5-306 против ЛСМ-С8Е;
фиг. 4 - интенсивность поглощения (прямо пропорциональна силе связывания) для целого ряда человеческих молекул 8сΕν против ГЙСМ-С8Е, полученных после четырех или пяти раундов пэннинга в фаговом дисплее, как определено с помощью ЕЬ18А;
фиг. 5 - результаты анализа ингибирования пролиферации ТЕ-1, проведенного с использованием различных репрезентативных удачных человеческих 8сΕν против ГЙСМ-С8Е;
фиг. 6 - специфичность связывания человеческих моноклональных антител против СМ-С8Е человека и других колониестимулирующих факторов человека;
фиг. 7 - измерения поверхностного плазмонного резонанса, характеризующего кинетическое связывание человеческих моноклональных антител и их фрагментов против СМ-С8Е;
фиг. 8А - выравнивание последовательностей СМ-С8Е приматов, не являющихся человеком, и СМС8Е человека;
- 13 017420 фиг. 8В - радиограмма пептидных пятен, демонстрирующая связывание фрагмента человеческого моноклонального антитела против СМ-С8Т с СМ-С8Т человека;
фиг. 9 - качественные результаты анализа ингибирования пролиферации ТТ-1, проведенного с использованием различных репрезентативных 5сТу-фрагментов человеческих антител против ГЙСМ-С8Т;
фиг. 10 - количественные результаты анализа ингибирования пролиферации ТТ-1, проведенного с использованием различных репрезентативных человеческих 1дС и соответствующих 5сТу-фрагментов против ГЙСМ-С8Т;
фиг. 11 - количественные результаты анализа продукции 1Ь8, проведенного с использованием различных репрезентативных 5сТу-фрагментов человеческих антител против ЛСМ-С8Т;
фиг. 12 - количественные результаты анализа ингибирования пролиферации ТТ-1, проведенного с использованием различных репрезентативных человеческих 1дС и соответствующих 5сТу-фрагментов против тасСМ-С8Т (СМ-С8Т макака);
фиг. 1З - результаты сравнительного исследования связывания, показывающие селективность связывания антитела 1дС В против СМ-С8Т с рекомбинантным СМ-С8Т человека и СМ-С8Т из разных видов, не являющихся приматами;
фиг. 14 - результаты анализа зависимости нейтрализующего потенциала антитела 1дС В против СМ-С8Т от гликозилирования СМ-С8Т;
фиг. 15 - результаты исследования эффекта антитела 1дС В против СМ-С8Т на СМ-С8Топосредованное выживание эозинофилов;
фиг. 16 - результаты исследования эффекта антитела 1дС В против СМ-С8Т на СМ-С8Топосредованную активацию эозинофилов;
фиг. 17 - результаты токсикологического исследования ех уьуо с использованием антитела 1дС В против СМ-С8Т, измеренного на основе фагоцитоза (А-С) и окислительного взрыва (Ό-Т) гранулоцитами;
фиг. 18 - результаты исследования токсикологии ех уьуо с использованием антитела 1дС В против СМ-С8Т, измеренной на основе фагоцитоза (А-С) и окислительного взрыва (Ό-Т) моноцитами.
Примеры
Пример 1. Получение рекомбинантного человеческого (гЬ) СМ-С8Т антигена, используемого для получения нейтрализующих человеческих антител и их фрагментов.
Пример 1.1. Клонирование, экспрессия и очистка ГЙСМ-С8Т антигена.
Ген, кодирующий СМ-С8Т антиген человека, субклонировали в вектор рЕТ22Ь(+) (Ыоуадепе, И8А) из экспрессирующего вектора рОЯР-йСМ-С8Т (Ыоуадеп, И8Л) через ПЦР-введенные сайты распознавания рестрикционными ферментами Ыйе1 и Х1ю1. 1СМ-С8Т кодирующий ген в рЕТ22Ь(+) подвергали слиянию с лидерной последовательностью ре1В, и он подходит для экспрессии в периплазме Е. со11.
Продуцирование и очистку белка осуществляли, как описано производителем. Кратко, Е. со11 ВЬ2ЮЕ3 трансформировали экспрессирующей плазмидой и выращивали при 37°С в селективной среде до оптической плотности 0,5-0,8 при 600 нм. Продуцирование белка индуцировали путем добавления 1РТС до 1 мМ и снижения температуры до 25°С. Получение периплазмы осуществляли с помощью осмотического шока, используя 20%-ный раствор сахарозы для избирательного разрушения клеточной стенки при сохранении интактной клеточной мембраны. Нативный ЕСМ-С8Т содержит два дисульфидных мостика, и экспрессия в окислительной периплазме Е. сой обеспечивает образование этих функционально важных дисульфидных мостиков.
Рекомбинантный человеческий СМ-С8Т (ГЙСМ-С8Т) очищали в процессе двухступенчатой очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (1МАС) и гель-фильтрации. Для хроматографии использовали систему ТРЬС Ак1а® и программу Ишсот®. Все реактивы имели качество, подходящее для использования в исследованиях, и были приобретены у 81дта (Эе15епНоГеп) или Мегск (Эагт51ай1).
1МАС осуществляли с использованием колонки Оьадеп Νί-ΝΓΑ 8ирегГ1о\\· согласно протоколу производителя. Колонку уравновешивали буфером А2 (20 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 0,4М №1С1) и препарат периплазмы (РРР) (100 мл) наносили на колонку (2 мл) при скорости протока 2 мл/мин. Колонку промывали 5 об. колонки 5%-ного буфера В2 (20 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 0,4М №С1, 0,5М имидазола) для удаления несвязавшегося образца. Связанный белок элюировали с использованием 100%-ного буфера В2 в 5 об. колонки. Элюированные белковые фракции объединяли для дальнейшей очистки.
Гель-фильтрацию осуществляли на колонке 8ирегйех 200 Ргер Сгайе (Рйагтасьа), уравновешенной РВ8 (С1Ьсо). Образцы элюированного белка (скорость протока 1 мл/мин) подвергали стандартному ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и Вестерн-блоттингу для определения. Перед очисткой колонку калибровали для определения молекулярной массы (набор маркеров молекулярной массы, 8щта М\У СТ-200). Концентрации белка определяли, измеряя ΟΌ при 280 нм, и рассчитывали с использованием специфического для последовательности коэффициента молекулярной экстинкции.
Пример 1.2. Биотинилирование ГЙСМ-С8Т антигена.
Для селекции фаговой библиотеки ГЙСМ-С8Т антиген, продуцируемый в Е.сой (см. выше), биоти
- 14 017420 нилировали. Биотинилирование осуществляли в РВ8. содержащем 5% ДМСО (81дта), с пятикратным молярным избытком ΕΖ-Ыпк 8и1!о ИН8-ЬС-ЬС-В1ойп (Р1егсе) в течение 1 ч при комнатной температуре в смесителе для образцов (Бупа1). Для разделения свободного биотина и биотинилированного ГЙСМ-С8Б антигена осуществляли анионообменную хроматографию (Векоигсе О. АтегкНат Вюкшепсек) согласно стандартным протоколам. При обоих подходах (обозначенных А и В. описанных ниже) хроматография давала два пика элюции. В случае А первый элюированный пик вновь фракционировали посредством второй стадии анионообменной хроматографии (такие же условия. как описано выше) на два пика элюции. Затем полученные фракции последовательно разбавляли (разведения 1:2; исходная концентрация 6 мкг/мл. определенная из высоты пика). вносили их в 96-луночные планшеты для ЕЫ8А и осуществляли определение. Определение осуществляли. используя (А) антитело М500-А против СМ-С8Б человека (81дта. 2.5 мкг/мл в РВ8/1% БСА (бычий сывороточный альбумин)). определяемое поликлональным антителом козы. специфическим в отношении БаЬ2 мыши. конъюгированным с пероксидазой хрена (Όίαηονα. 1 мкг/мл РВ8/1% БСА). и (Б) материнское антитело (1 мкг/мл РВ8/1% БСА). определяемое поликлональным антителом козы против антитела крысы. конъюгированным с пероксидазой хрена (Όίαηονα. 1 мкг/мл РВ8/1% БСА). Успешное биотинилирование продемонстрировали с помощью аналогичного эксперимента с использованием ЕЫ8А. который осуществляли с использованием стрептавидина. конъюгированного с пероксидазой хрена (Бако. 1 мкг/мл РВ8/1% БСА). Сигнал проявляли путем добавления раствора субстрата ОРБ (81дта) и определяли при длине волны 492 нм (эталонная длина волны 620 нм). Для оценки степени биотинилирования вышеупомянутую ЕЫ8А осуществляли с использованием фракций непосредственно от анионообменной хроматографии или после стадии инкубации с 6.7х107 магнитных стрептавидиновых шариков (БупаЬеайк М-280-81тер1ау1йш. Бупа1) с осторожным перемешиванием в течение 30 мин. Полученный супернатант вносили в лунки 96-луночных планшетов для ЕЫ8А и осуществляли определение. как описано выше. Результаты ЕЫ8А показали. что второй элюированный пик содержал биотинилированный ТЙСМ-С8Б и что примерно 95% элюированного ТЙСМ-С8Б было конъюгированным. Концентрации оценивали. используя в качестве стандарта исходный материал. и оказалось. что они составляли примерно 20 мкг/мл.
Сохраняющуюся биоактивность биотин-меченого ТЙСМ-С8Б подтверждали в анализах пролиферации ТБ-1 согласно протоколам. описанным ниже. при характеристике одноцепочечных антител (ксБу).
Пример 1.3. Мечение ТЙСМ-С8Б антигена флуоресцеином.
Для исследований связывания на клетках ТБ-1 рекомбинантный СМ-С8Б антиген человека. продуцируемый в Е. сой (см. пример 1.2 выше). конъюгировали с Ν-сукцинимидиловым эфиром флуоресцеин5(6)-карбоксиамидокапроновой кислоты (Б1ика. флуоресцеин-ΝΗδ). Стадию конъюгации осуществляли в боратном буфере (0.05М борная кислота. 0.1М №С1. рН 8.5). содержащем 17.5% ДМСО. с пятикратным молярным избытком флуоресцеина-ΝΗδ в течение 1 ч при комнатной температуре в смесителе для образцов. Затем осуществляли гель-фильтрацию (8ерНайех 025. АтегкНат Вюкшепсек) для диссоциации флуоресцеин-меченого ТЙОМ-С8Б антигена из свободного флуоресцеин-ΝΗδ. В результате гельфильтрации получали два пика. которые измеряли при длине волны 485 нм (эталонная длина волны 535 нм). тогда как первичный пик представляет собой Б1ТС-меченый ТЙОМ-С8Б. Степень мечения определяли путем нахождения соотношения Б/Р конъюгата ([мг/мл]=(А280-0.35хА493)х1.08; Б/Р=(А493/
73.000)х(15.000/([мг/мл])). Определенная концентрация составляла 0.041 мг/мл с отношением Б/Р. равным 1.2.
Пример 2. Получение и селекция человеческих нейтрализующих антител и их фрагментов против ОМ-С8Б.
Пример 2.1. Клонирование материнской УН из гибридомы НВ-9569.
Термин материнская У-область в том виде. как он используется во всех вышеупомянутых примерах. означает. что рассматриваемая У-область происходит из молекулы целого иммуноглобулина.
Термин удачная (Ы1) в том виде. как он используется во всех вышеупомянутых примерах. означает молекулу. о которой известно. что она связывает интересующий антиген. но данное связывание не было количественно оценено. Удачной является молекула на ранней стадии определения характеристик. для которой возможно уже было осуществелено продуцирование в малом масштабе. Такая молекула находится на стадии подтверждения характеристик.
Термин потенциальная (1еай) молекула в том виде. как он используется во всех вышеупомянутых примерах. означает молекулу. потенциалы связывания и нейтрализации которой были количественно охарактеризованы. Продуцирование потенциальной молекулы уже имело место в крупном масштабе.
В следующих примерах описан один из возможных способов получения полностью человеческого моноклинального антитела - нейтрализатора ОМ-С8Б. и получения его фрагментов.
Целью этого эксперимента является выделение и субклонирование гена. кодирующего УН в материнском тАЬ. продуцируемом линией гибридомных клеток НВ-9569. Гибридому НВ-9569 получали из АТСС (Американская коллекция типовых культур. США). Гибридомные клетки культивировали в полной ростовой среде АТСС: среда ВРМ1 1640. содержащая 2 мМ Ь-глутамина. и бикарботат натрия. содержание которого доведено до 1.5 г/л. 4.5 г/л глюкозы. 10 мМ НЕРЕ8 и 1.0 мМ пирувата натрия. и до
- 15 017420 полненная 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 10% фетальной коровьей сыворотки, 37°С с 5% СО2. Для получения общей РНК использовали 1х107 клеток, и РНК получали, как описано в руководстве к продукту 01адсп Отш-8кпр1 КИ (О1адсп. Германия). кДНК синтезировали согласно стандартным способам (8атЬгоок, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк 1989, 8есопй Еййюп).
Для выделения ДНК V-области тяжелой цепи осуществляли ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы) с использованием набора праймеров МНАЬТ1 К.У: ССС САА ТТС САС САТ ССК АТС 8АС СТС КСТ МАТ 8СТ СТТ и г1§С2а/Ь расы С8Р: САС АСС ССТ ССА САС ССС ТСС АСА СТТ СС. Для амплификации использовали следующую программу ПЦР: денатурацию при 94°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 90 с осуществляли в течение 40 раундов с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. Затем выделяли ДНК ν-фрагментов тяжелой цепи согласно стандартным протоколам.
ДНК ν-фрагмента тяжелой цепи клонировали в РСК кспрГСАМ (81га!адепе), как описано производителем. Последовательности идентифицировали секвенированием.
Пример 2.2. Селекция УЪ человека.
Целью этого эксперимента является селекция УЕ человека, которая может образовать пару с материнской УН, клонированной, как описано выше.
Пример 2.2.1. Выделение РНК из селектированных 1дБ-положительных В-клеток.
У пяти здоровых человеческих доноров брали 100 мл крови. Выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) в градиенте фикола согласно стандартным способам. Для селекции 1дБположительных клеток 1 мл антимышиных 1дС-шариков (СЕЬЬесйоп™ Рап Мойке 1дС Κίΐ; БУНАЙ) покрывали 20 мкг мышиного антитела против человеческого 1дБ (РйагМтдеп). Добавляли к шарикам приблизительно 2,5х107 РВМС и инкубировали при 4°С в течение 15 мин. После промывки четыре раза 1 мл среды КРМ1 (ВюСйгот) 1дБ-положительные клетки высвобождали из шариков путем добавления 8 мкл буфера для высвобождения (БЫаке) и переносили в чистые пробирки. Этим способом смогли получить от 0,9х105 до 3,7х106 1дБ-положительных клеток. Общую РНК выделяли из 1дБ-положительных клеток с использованием КЫеаку® М1й1 Κίΐ (Р1АСЕЫ), следуя инструкциям производителя. кДНК синтезировали согласно стандартным способам (8атЬгоок, Со1й 8рппд НагЬог ЙаЬогаЮгу Ргекк 1989, 8есопй Еййюп).
Пример 2.2.2. ПЦР-амплификация вариабельных областей легкой цепи (УЪ-областей).
Для выделения ДНК У-области легкой цепи осуществляли ОТ-ПЦР с использованием наборов праймеров У-к-(5'-йиУК1-8ас1-2001 (5'-САСССССАСС АСССССАССТ ССАСАТСАСС САСТСТСС3'), 5'-1шУК2/4-8ас1-2001 (5'-САСССССАСС АСССССАССТ ССТСАТСАСУ САСТСТСС-3'), 5'-йиУК38ас1-2001 (5'-САСССССАСС АСССССАССТ ССТС^ТСАСК САСТСТСС-3'), 5'-йиУК5-8ас1-2001 (5'САСССССАСС АСССССАССТ САСАСТСАСС САСТСТСС-3'), 5'-йиУК6-8ас1-2001 (5'САСССССАСС АСССССАССТ ССТССТСАСТ САСТСТСС-3'), 3'-йи-Ук-Н-8ре1-Вк1№1 (5'САССАСАСТА СТТССАСССА СССТАССТТТ САТТТССАСС ТТССТСС-3'), 3'-йц-Ук-12/4-8ре1-Вк1№1 (5'-САССАСАСТА СТТССАСССА СССТАССТТТ САТСТССА8С ТТССТСС-3'), 3'-йи-Ук-13-8ре1Βδΐνΐ (5'-САССАСАСТА СТТССАСССА СССТАССТТТ САТАТССАСТ ТТССТСС-3'), 3'-йи-Ук-158ре1-Вк1\\1 (5'-САССАСАСТА СТТССАСССА СССТАССТТТ ААТСТССАСТ ССТСТСС-3'). РНК из 1дБ-положительных В-клеток транскрибировали в кДНК (как описано выше) и использовали в качестве матричной ДНК в ПЦР-реакциях. В каждой ПЦР-реакции один 5'-праймер объединяли с одним 3'праймером. Число разных ПЦР-реакций определялось числом возможных комбинаций 5'- и 3'праймеров. Для амплификации использовали следующую ПЦР-программу: денатурацию при 94°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 90 с осуществляли в течение 40 раундов с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. Затем выделяли ДНК У-фрагментов легкой цепи согласно стандартным протоколам.
Пример 2.2.3. Конструирование библиотеки - клонирование пула УЪ человека.
Библиотеку фагового дисплея обычно конструировали на основе стандартных методик, как раскрыто, например, в Рйаде Б1кр1ау: А ЙаЬогаЮгу Мапиа1; Ей. ВаГЬак, ВиПоп, 8со11 & 8йуегтап; Со1й 8рппд НагЬог ЙаЬогаЮгу Ргекк, 2001.
Праймеры, выбранные для ПЦР-амплификации, приводили к образованию сайтов распознавания 5'8ас1 и 3'-8ре1 для У-фрагментов легкой цепи. Ставили две реакции лигирования, причем каждая из них включала 400 нг фрагментов к-легкой цепи (расщепленных 8ас1-8ре1) и 1400 нг плазмиды рВ1иекспр1 К8+ (расщепленной 8ас1-8ре1; большой фрагмент). Каждый из двух образующихся пулов У-легкой цепи антитела затем трансформировали в 300 мкл электрокомпетентных клеток ЕксЬепсЫа соБ ХЙ1 В1ие путем электропорации (2,5 кВ, просвет кюветы 0,2 см, 25 мФ, 200 Ом, прибор Сепе-Ри1кег Вюгай), что приводило к получению библиотеки размером 5,8х 108 независимых клонов.
ДНК-фрагменты каппа (легкая цепь) из разных ПЦР-амплификаций взвешивали для каждого лигирования следующим образом: каждый 5'-праймер определяет специфическую группу. В этих группах 3'праймеры определяют подгруппы. Данные подгруппы взвешивали 1:2:1:1, что соответствует праймерам 3'-йи-Ук-Н-8ре1-Вк1^1:3'-йи-Ук-12/4-8ре1-Вк1^1:3'-йи-Ук-13-8ре1-Вк1^1:3'-йи-Ук-15-8ре1-Вк1^1. Данные
- 16 017420 группы взвешивали согласно их распределению в зародышевой линии 1:1:1:0,2:0,2, что соответствует праймерам 5'-йиУК1-8ас-2001:5'-йиУК3-8ас-2001:5'-йиУК2/4-8ас-2001:5'-йиУК5-8ас-2001:5'-йиУК6-8ас2001.
После электропорации данный образец инкубировали в бульоне 8ОС (Р1ика) для экспрессии фенотипа. Каждую культуру затем инкубировали в 500 мл селективной среды 8В, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина и 2% мас./об. глюкозы, в течение ночи. На следующие сутки клетки собирали центрифугированием и получение плазмиды осуществляли с использованием имеющегося в продаже набора для получения плазмид (Ц1адеп).
Пример 2.2.4. Конструирование библиотеки антител: УЪ человека - материнская УН.
ПЦР осуществляли для амплификации материнской УН из вектора, содержащего материнскую УН, описанную выше в примере 2.1. Для амплификации следовали протоколу ПЦР согласно стандартным методикам с использованием 5'-праймера МУН8 (5'-СЛС СТТ САС СТС САС САС ТСТ ССА ССТ-3') и З'-праймера З'-МиУНВкШП (5'-ТСА ССА САС ССТ САС ССТ ССТ ССС ТТС ССС ССА С-3').
После очистки продукта амплификации, имеющего размер приблизительно в 350 п.н., из аналитического агарозного геля, фрагмент ДНК вырезали рестрикционными ферментами ВйЕП и Х1ю1. Фагмиду рСошЬ3Н5ВН18 (этот вектор описан в диссертации Бг. Ра1Г ЬиРегЬике) расщепляли соответствующим образом и большой фрагмент лигировали с вышеупомянутым фрагментом. После трансформации в Е.со11 ХЬ1 Ь1ие, одиночный клон культивировали в 100 мл среды 8В (содержащей 50 мкг/мл карбенициллина) и плазмиду получали согласно стандартным протоколам. Успешное клонирование подтверждали секвенированием вставки (8ес.|Ш5егуе. Мюнхен).
Этот вектор рСотЬ3Н5ВН18/материнская УН разрезали рестрикционными ферментами 8ас1 и 8ре1. Выделяли большой фрагмент вектора. Плазмидную ДНК, содержащую УК-библиотеку из примера 2.2.3, вырезали рестрикционными ферментами 8ас1 и 8ре1. Выделяли полосу малого фрагмента УК (приблизительно 350 п.н.).
1200 нг фрагмента данного вектора лигировали с 400 нг фрагментов УК и трансформировали в 300 мкл электрокомпетентных клеток Е. сой ХЬ1 В1ие путем электропорации (2,5 кВ, просвет кюветы 0,2 см, 25 мФ, 200 Ом), что приводило к получению общей библиотеки зсРу размером 2,8х108 независимых клонов.
После экспрессии фенотипа и медленной адаптации к карбенициллину, библиотеку антител переносили в селективную среду с 8В-карбенициллином (50 мкг/мл). Библиотеку антител затем инфицировали инфекционной дозой 1х1012 частиц хелперного фага УС8М13, что приводило к продуцированию и секреции нитевидного фага М13, где каждая фаговая частица содержала одноцепочечную рСотЬ3Н5ВН18-ДНК, кодирующую наполовину человеческий зсРу-фрагмент, и экспонировала соответствующий зсРу-белок в виде трансляционного слияния с оболочечным белком III фага.
Пример 2.2.5. Селекция УЪ человека с помощью фагового дисплея.
Фаговые частицы, несущие репертуар зсРу, собирали из культурального супернатанта осаждением с помощью РЕС8000/ЫаС1 и центрифугированием. Затем приблизительно от 1x10 до 1х1012 5сРу фаговых частиц ресуспендировали в 0,4 мл РВ8/0,1% БСА и инкубировали с рекомбинантным биотинилированным растворимым ГЙСМ-С8Р (продуцируемым в Е. сой, как описано выше в примере 1) в течение 2 ч при слабом перемешивании в общем объеме 0,5 мл (концентрации антигена: раунды 1-3: 100 нм; раунд 4: 10 нм; раунд 5:1 нМ). Затем добавляли 6,7х107 стрептавидиновых магнитных шариков (БупаЬеайз М280-81гер1ау1йш, Буиа1) и осуществляли дополнительную инкубацию при слабом перемешивании в течение 30 мин.
8сРу фаг, который специфически не связывался с антигеном-мишенью, удаляли на стадиях промывки с помощью РВ8/0,1% БСА. Для этой цели собирали магнитом комплексы биотинилированный антиген-стрептавидиновый шарик (с потенциальными связывателями зсРу) и ресуспендировали в 1 мл раствора для промывки (одна стадия промывки). Эту процедуру промывки повторяли вплоть до четырех раз в дополнительных раундах.
После промывки связывающие структурные единицы элюировали с использованием НС1-глицина, рН 2,2. После нейтрализации с помощью 2М Трис, рН 12 данный элюат использовали для инфицирования свежей неинфицированной культуры Е. сой ХЬ1 В1ие. Для элюции оставшихся структурных единиц с сильным связыванием эту стадию повторяли с использованием НС1-глицина, рН 1,0. Этот второй элюат вновь нейтрализовали и использовали для инфицирования свежей неинфицированной культуры Е. сой ХЬ1 В1ие. Обе инфицированные культуры Е. сой затем смешивали и клетки, которые были успешно трансдуцированы фагмидной копией, кодирующей фрагмент человеческого зсРу, вновь подвергали селекции на устойчивость к карбенициллину и затем инфицировали хелперным фагом УС8М13 для начала второго раунда дисплея антител и селекции ίη \йго.
Из культур Е. сой выделяли плазмидную ДНК, соответствующую 4 и 5 раундам пэннинга. Для продукции растворимого белка зсРу, УЪ-ДНК фрагменты вырезали из плазмид (8ас1-8ре1) и клонировали через те же сайты рестрикции в плазмиде рСотЬ3Н5ВР1ад/Н18 с материнской УН, отличающейся от исходной рСотЬ3Н5ВН18/матринской УН тем, что экспрессируемая конструкция (например, зсРу) включает Р1ад
- 17 017420 метку (ТСРУКРОРРК) между 5сЕу и Нй6-меткой, и дополнительные фаговые белки делетированы.
После лигирования каждый пул (разные раунды пэннинга) плазмидной ДНК трансформировали в 100 мкл компетентных к тепловому шоку клеток Е. отН ХЬ1 В1ие и переносили в чашки на ЬВ-агар с карбенициллином. Одиночные колонии собирали в 100 мкл ЬВ-карбенициллина (50 мкг/мл).
мкл этой клеточной суспензии типично инкубировали в 5 мл среды 8В, дополненной карбенициллином до концентрации 50 мкг/мл и МдС12 до конечной концентрации 20 мм, в течение приблизительно 6 ч при 37°С при перемешивании. Затем добавляли 1РТС до конечной концентрации 1 мМ и продолжали инкубацию в течение ночи на шейкере при 30°С.
Клетки центрифугировали до осадка и этот осадок типично ресуспендировали в 0,5 мл РВ8. С помощью четырех раундов замораживания при -70°С и оттаивания при 37°С наружную мембрану бактерий разрушали осмотическим шоком и растворимые периплазматические белки, включающие хсЕм, высвобождали в супернатант. После удаления интактных клеток и клеточного дебриса дополнительным центрифугированием (5 мин при 10000хд), супернатант (т.е. РРР), содержащий хсЕм, собирали и далее исследовали.
КЙ6М-С8Р антиген (Ьеикте Ь1дшй, 1ттипех) иммобилизовали на планшетах для ЕЫ8А в течение ночи при 4°С (50 мкл 1 мкг антигена/мл РВ8 на лунку). После промывки лунок один раз РВ8 и блокирования с помощью 3% БСА в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре в лунки добавляли 100 мкл РРР, содержащего ^Ρν, и типично инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех промывок РВ8/0,05% Тетееп 20 определение 8сΡν-фрагментов, связанных с иммобилизованным антигеном, осуществляли с использованием М2 против Над (1 мкг/мл РВ8/1% БСА) и определяли с помощью специфического поликлонального антитела козы против РаЬ2 мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена (^^аηονа, 1 мкг/мл РВ8/1% БСА). Сигнал проявляли путем добавления раствора субстрата 2,2'азино-ди-[3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты] (АВТ8) и определяли при длине волны 405 нм согласно стандартным протоколам.
Из 20 протестированных клонов (10, полученных после 4 раундов, и 10, полученных после 5 раундов пэннинга) 5 лизатов показывали сильные сигналы в ЕЫ8А на рекомбинантном антигене по сравнению с РВ8 в качестве отрицательного контроля. Результаты ЕБ18А показаны на фиг. 1, на которой разные протестированные молекулы 5сЕу расположены вдоль оси X, а ось Υ показывает интенсивность измеренного поглощения, причем более сильное поглощение указывает на более прочное связывание. Отрицательный контроль с РВ8 показан на оси X слева. Молекулы 5сЕу, демонстрирующие существенное связывание, отмечены над соответствующим столбиком, показывающим интенсивность поглощения, либо ромбиком, либо звездочкой. Ромбик или звездочка на фиг. 1 представляют собой две разные последовательности, т.е. 5сЕу, столбик интенсивности поглощения которого показан ромбиком, представлял собой одну последовательность, тогда как все хсЕу, столбики интенсивности поглощения которых показаны звездочками, имеют одинаковую общую последовательность.
Пять ЕЫ8А-положительных клонов подвергали секвенированию ДНК. Секвенирование осуществляли в 8ес.|Ш5егуе (Мюнхен). Всего четыре клона имели последовательность ДНК, соответствующую 8сΡν 5-306, тогда как другая последовательность (4-301) была идентифицирована только один раз. Доминантная последовательность, соответствующая 8сΡν 5-306, а также последовательность 4-301 имели человеческое происхождение и демонстрировали очень близкую гомологию с последовательностью Ук1О12 зародышевой линии человека.
Пример 2.2.6. Характеристика удачных конструкций 8сΡν, полученных в результате селекции йиУЪ.
Целью следующих экспериментов была характеристика удачных 8сΡν, полученных вышеописанными способами.
Пример 2.2.6.1. Экспрессия и очистка в малом масштабе удачных 8сΡν (полученных, как описано выше) в Е. οο1ΐ.
Чтобы получить РРР, клетки выращивали в среде 8В, дополненной 20 мМ МдС12 и 50 мкг/мл карбенициллина, и повторно растворяли в 1 мл РВ8 после сбора. Наружную мембрану бактерий разрушали температурным шоком (четыре раунда замораживания при -70°С и оттаивания при 37°С) и растворимые периплазматические белки, включающие 8сΡν, высвобождались в супернатант. После удаления интактных клеток и клеточного дебриса центрифугированием, супернатанты, содержащие 8сΡν, собирали и исследовали далее. Для дальнейшей очистки к соответствующему РРР добавляли 25 мкл 20 мМ ΝβΗ^Ο^ 400 мМ №С1, 250 мМ имидазола, рН 7,0. РРР очищали с помощью колонок №-ОТА 8рш (Р1адеп), как рекомендовано в руководстве по применению. Кратко, соответствующий раствор РРР добавляли к предварительно уравновешенной колонке для связывания со смолой. Колонки 8рт дважды промывали 20 мМ NаН2РО4, 400 мМ №С1, 20 мМ имидазола, рН 7,0. Связанный белок дважды элюировали в 200 мкл 20 мМ NаН2РО4, 400 мМ №С1, 250 мМ имидазола, рН 7,0. Очищенные белки 8сΡν дополнительно анализировали в отношении силы связывания (кинетика скорости диссоциации) и способностей к нейтрализации (ингибирование СМ-С8Е-зависимой пролиферации ТЕ-1), как описано в следующих примерах. Несмотря на отсутствие разделения или различия между разными возможными конформациями 8сΡν, эта грубая очистка РРР дает белок 8сΡν 80% чистоты, как оценено вестерн-блот-анализом (данные не показаны).
Пример 2.2.6.2. Ингибирование Е1ТС-меченого ГЙСМ-С8Е.
- 18 017420
Целью этого эксперимента является демонстрация того, что идентифицированные клоны 8сРу способны ингибировать связывание ЛСМ-С8Р с рецепторным комплексом СМ-С8Р, экспонированным на поверхности клеток ТТ-1. Ожидалось, что нейтрализующие конструкции 8сРу будут конкурировать за эпитоп связывания с рецептором на молекуле Г11СМ-С8Е. делая невозможным связывание ЛСМ-С8Р с рецепторным комплексом СМ-С8Р. В той степени, в которой связывание ЛСМ-С8Р с его рецептором ингибируется описанным выше способом, ожидается, что будет наблюдаться снижение интенсивности флуоресцентного окрашивания клеток ТТ-1 флуоресцеин-меченым ЛСМ-С8Р (гкСМ-С8Р-Р1ТС) в анализе на основе проточной цитометрии.
Следующее описывает эффективность такого анализа, основанного на проточной цитометрии. Конечную концентрацию 0,4 мкг/мл конъюгата гНСМ-С8Е-ПТС в РВ8 инкубировали с 10 мкг/мл материнского антитела или неразведенного периплазматического экстракта ксРй, который очищали на колонке N^NΤА δρίη. Образцы белка оставляли уравновешиваться при 25°С в течение 1 ч перед добавлением клеточной суспензии ТР-1. Клетки ТР-1 культивировали в среде КРМ1 1640 (СЛот; не содержит Ьглутамин, феноловый красный), 10% инактивированной нагреванием РС8, в отсутствие ЛСМ-С8Р в течение ночи. Использовали конечную концентрацию 2х106 клеток/мл и 150 мкл клеточной суспензии на образец. Клетки собирали центрифугированием при 500хд при 4°С в течение 3 мин и дважды промывали буфером РЛС8. Промытые клетки ресуспендировали в 100 мкл предварительно уравновешенного образца белка, содержащего ЛСМ-С8Р-Р1ТС и соответствующее материнское антитело или 8сРу. Образцы инкубировали при 4°С в течение 60 мин. После двух дополнительных промывок клетки ресуспендировали в 150 мкл ледяного буфера РЛС8 и затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты показаны на фиг. 2. Конкретно, на фиг. 2 показан график, на котором разные тестируемые молекулы расположены вдоль оси X и на котором средняя интенсивность флуоресценции (МР1) показана на оси Υ. Как можно видеть на фиг. 2, с материнским антителом наблюдали очевидную потерю интенсивности флуоресценции клеток ТР-1 (второй слева вдоль оси X). Конкурентное связывание молекулы хсРу, обозначенной 5-306, с ГЙСМ-С8Р можно было отслеживать по потере флуоресцентного окрашивания клеток ТР-1, тогда как молекула 8сРу 4-301 едва показала какой-либо эффект. Поскольку эти результаты говорят о том, что молекула хсРу, обозначенная 5-306, может быть многообещающим нейтрализатором СМ-С8Р, дальнейший анализ нейтрализующей активности был ограничен 8сРу 5-306.
Пример 2.2.6.3. Крупномасштабная экспрессия и очистка потенциального 8сРу.
Крупномасштабное продуцирование и очистку белка осуществляли следующим образом. Кратко, Е. от К ВЬ21ИЕ3 трансформировали экспрессирующей плазмидой и выращивали при 37°С в 1 л селективной среды до оптической плотности 0,5-0,8 при 600 нм. Продуцирование белка индуцировали путем добавления 1РТС до концентрации 1 мМ и культуры инкубировали в течение еще 16 ч с перемешиванием при температуре 25°С. Клетки собирали центрифугированием при 5000хд в течение 10 мин и ресуспендировали в 100 мл 1хРВ8. Периплазматические белки экстрагировали оптимальным последовательным замораживанием в этаноле/сухом льду и оттаиванием в водяной бане при 37°С в течение четырех раундов. Наконец, данный экстракт центрифугировали при 10000хд в течение 20 мин.
8сРν 5-306 выделяли в процессе двухступенчатой очистки, включающем аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом (1МАС) и гель-фильтрацию. Все потенциальные (8сРν) очищали согласно этому способу. Для хроматографии использовали систему Ак1а® РРЬС (Ркагтааа) и программное обеспечение ишотт®. Все реагенты имели аналитическую степень чистоты и были приобретены у 8щта (^е^8еηкοίеη) или Мегск (Иагт81ай1).
1МАС осуществляли с использованием колонки ^^адеη №-№ТА Зире^Ьте согласно протоколу производителя. Колонку уравновешивали буфером А2 (20 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 0,4М №1С1) и РРР (100 мл) наносили на колонку (2 мл) при скорости протока 2 мл/мин. Колонку промывали 5 об. колонки 5%-ного буфера В2 (20 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 0,4М №С1, 0,5М имидазола) для удаления несвязавшегося образца. Связанный белок элюировали, используя 100%-ный буфер В2 в 5 об. колонки. Фракции элюированного белка объединяли для дальнейшей очистки.
Гель-фильтрацию осуществляли на колонке Η^^οаάΤМ 16/60 8ирегбех 75 Ргер Сгабе (Ркагташа), уравновешенной РВ8 (СФот). Образцы элюированного белка (скорость протока 1 мл/мин) подвергали стандартному ПААГ-ДСН и вестерн-блоттингу для определения. Перед очисткой колонку калибровали для определения молекулярной массы (набор маркеров молекулярной массы, 8щта М\У СР-200). Зависимое от размера разделение на колонке 8ирегбех 75 Ргер Сгабе приводило к получению четко различимых пиков фракций мономера и ассоциативного димера потенциальных 8сРν. Концентрации белка определяли, измеряя оптическую плотность при 280 нм, и рассчитывали, используя коэффициент молекулярной экстинкции, специфической для последовательности, соответствующего потенциального 8сРν.
Пример 2.2.6.4. Ингибирование гкСМ-С8Р-зависимой пролиферации клеток ТР-1 потенциальным 8сРν.
Целью этого эксперимента является получение количественной информации относительно нейтрализующей активности наполовину человеческого 8сРν 5-306 с использованием гкСМ-С8Р-зависимой клеточной линии ТР-1 (И8М2 АСС 334). Клетки ТР-1 культивировали в среде КРМ1 1640 (СФот; не со
- 19 017420 держит Ь-глутамин, феноловый красный), 10% инактивированной нагреванием ЕС8 в присутствии 2,5 нг/мл ГЙСМ-С8Е, как описано дистрибьютером (ОеШхсНе 8атт1иид уои М1кгоогдаш8теи ииб 2е11ки1!игеи СтЬН, Вгаии8скете1д, Германия). Клетки выращивали до плотности клеток 0,5х106 клеток/мл. Для анализа пролиферации клетки ТЕ-1 собирали центрифугированием при 300хд в течение 4 мин и промывали 1хРВ8 (Пи1Ьессо'8, С1Ьсо). Клетки ресуспендировали в конечной концентрации 1х105 клеток/мл в ΚΡΜΙ 1640, 10% ЕС8 и использовали 90 мкл клеточной суспензии на лунку плоскодонного планшета для клеточных культур М1сго!е8! (0,9х104 клеток/лунку). Для стимуляции пролиферации клеток ТР-1 использовали конечную концентрацию ЛСМ-С8Е 0,3 нг/мл. Для нейтрализации ЬСМ-С8Е-зависимой пролиферации добавляли 10 мкл очищенного 5сЕу к 100 мкл ТР-1 и раствору ЛСМ-С8Е в серии разведений, варьирующих от приблизительно 100 мкг/мл до 100 пг/мл. Образцы инкубировали при 37°С в 5% С02 в течение 72 ч. Через 72 ч определяли пролиферативный статус клеток ТР-1, добавляя ХУ8Т-1 и наблюдая за колориметрическим изменением с помощью ЕЫ8Л-ридера при 450 нм. Данные аппроксимировали для полумаксимального ингибирования пролиферации (ТС5о), используя построение нелинейной кривой регрессии с помощью программы Ргйш.
Можно было наблюдать очевидный дозозависимый эффект 5сЕу 5-306 в отношении ингибирования пролиферации, и он был сравнимым для мономерной и димерной конформационных форм. Путем аппроксимации полумакисмального ингибирования пролиферации определили значение Ю, 7,3 нМ для мономерной формы и 3,5 нМ - для димерной формы. Результаты показаны на фиг. 3.
Пример 2.3. Конструирование библиотек антител и селекция человеческих УН с помощью фагового дисплея.
Целью следующих экспериментов является селекция набора человеческих УН-областей, которые образовывали бы пары с человеческой УЪ-областью 5сЕу 5-605, выбранного, как описано выше.
Пример 2.3.1. Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).
От пяти здоровых доноров брали по 100 мл крови. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли с помощью градиента фиколла согласно стандартным способам. Общую РНК выделяли из РВМС, используя К№а§у® М1б1 Κίΐ ^АСЕ^, следуя инструкциям производителя. кДНК синтезировали согласно стандартным способам (8атЬгоок, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8 1989, 8есоиб ЕбШои).
Пример 2.3.2. ПЦР-амплификация вариабельных областей тяжелых цепей (УН-областей).
Конструировали библиотеку УН и называли ее Ь1Ь 134-УН. Эта библиотека УН состоит из репертуара ЕР 1-СОР2-ЕР2-СОИ2-ЕИ3 человека из ПЦР-амплифицированных УН-областей описанного выше пула РВМС, связанных функциональным образом с УН СЭР3 материнского антитела, после которой следует человеческая последовательность ЕР4 зародышевой линии.
Для выделения человеческих матричных УН-областей осуществляли ОТ-ПЦР с использованием набора 5'-УН-специфических праймеров (5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001 (5'-АСС ТСС АСС ТСС ТСС АСТ СТС С-3'), 5'-йиУН4-Хйо1-2001 (5'-САС СТС САС СТС СТС САС ТСС СС-3'), 5'-йиУН4В-Хйо1-2001 (5'-САС СТС САС СТА СТС САС ТСС СС-3') и набора из двух 3'-УН-специфических праймеров (3'-йцУН-ВйЕП-2001 (5'-СТС АСС АСА ССС ТСА СС-3'), 3'-йи-УН-13-ВйЕП-2001 (5'-СТС ААС АСА ССС ТСА СС-3')). Для каждой ПЦР-реакции один 5'-праймер объединяли с одним 3'-праймером, причем число разных ПЦР-реакций определялось числом возможных комбинаций 5'- и 3'-праймеров. В качестве источника УН-генов использовали только кДНК РВМС (как описано выше) четырех доноров. Для амплификации использовали следующую программу ПЦР: денатурацию при 94°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 60 с осуществляли в течение 40 раундов с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. Выделяли продукты амплификации с размером приблизительно 350 п.н. согласно стандартным способам.
Для выделения Ь1Ь 134-УН-областей осуществляли ОТ-ПЦР в две стадии. Во-первых, человеческие УН-сегменты тяжелой цепи (ЕР1-СОР1-ЕИ2-СОИ2-ЕИ3) амплифицировали с помощью ПЦР из выделенных матричных УН-фрагментов, используя такой же набор 5'-УН-специфических праймеров, как описано выше (5'-ЬиУН1,3,5-ХЬо1-2001, 5'-йиУН4-Хйо1-2001, 5'-йиУН4В-Хйо1-2001), и набор 3'специфических праймеров (3'-Ь1Ь 134-УН-1А-МН3 (5'-СТА АТС ААА СТА САС ТСС ТАТ САС АСС ССА ТСТ УСС АСА СТА АТА САС ССС-3'), 3'-Ь1Ь 134-УН-1В-МН3 (5'-СТА АТС ААА СТА САС ТСС ТАТ САС АСС ССА ТСТ УСС АСА СТА АТА САУ РСС-3'), 3'-ЫЬ 134-УН-3А-МН3 (5'-СТА АТС ААА СТА САС ТСС ТАТ САС АСС ССА ТСТ АСА СТА АТА САС РСС-3'), 3'-Ь1Ь 134-УН-3В-МН3 (5'СТА АТС ААА СТА САС ТСС ТАТ САС АСС ССА ТСТ \С>С АСА СТА АТА САА РСС-3'), 3'-Ь1Ь 134УН-4-МН3 (5'-СТА АТС ААА СТА САС ТСС ТАТ САС АСС ССА ТСТ 8СС АСА СТА АТА САС РСС-3')) для человеческих УН-подсемейств 1, 3 и 4, совместимых в самой концевой области ЕР3.
Использовали следующие комбинации праймеров:
а) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-1А-МН3;
б) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-1В-МН3;
в) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-3А-МН3;
г) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-3В-МН3;
- 20 017420
д) 5'-йиУН4-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-4-МН3;
е) 5'-йиУН4В-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-4-МН3.
Для каждой ПЦР-реакции один 5'-праймер объединяли с 3'-праймером; число разных ПЦР-реакций определялось числом возможных комбинаций 5'- и 3'-праймеров. Для амплификации использовали следующую программу ПЦР: денатурацию при 94°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 90 с осуществляли в течение 40 раундов с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. С помощью этой стадии ПЦР и соответствующей последовательности 3'-праймера человеческие УН-области удлиняли на часть материнской УН СЭВ3. которая, в свою очередь, представляет собой затравочный сайт для 3'-праймера второй стадии ПЦР.
Эти УН-(РВ1-СПВ1-РВ2-СПВ2-РВ3) ДНК-фрагменты затем использовали в качестве матрицы во второй ПЦР-реакции, снова используя соответствующий 5'УН-специфический праймер и универсальный 3'-праймер, соответствующий универсальному 3'-концу амплифицированных фрагментов ДНК (3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2, 5'-АСА САС ССТ САС САТ ТОТ ССС ТТС ССС ССА СТА АТС ААА СТА САС ТСС3').
Для амплификации использовали следующую программу ПЦР: денатурацию при 94°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 60 с осуществляли в течение 40 раундов с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. У-фрагменты ДНК выделяли согласно стандартным протоколам.
Пример 2.3.3. Конструирование библиотеки - клонирование пула УН человека.
Во втором раунде вышеуказанного способа выбирали человеческую УЪ 5сРу 5-306, идентифицированного в первой, предыдущей процедуре селекции, и затем объединяли с библиотекой человеческих УН-фрагментов, описанных в примере 2.3.2, с целью получения человеческого 5сРу. Библиотеку фагового дисплея обычно конструировали на основе стандартных методик, как, например, раскрыто в Рйаде Экр1ау: А ЬаЬога!огу Мапиа1; Еб. ВагЬак, Вийои, 8соб & 8йуегшаи; Со1б 8ргшд НагЬог 1аЬога!огу Рге§8, 2001.
ДНК-фрагменты тяжелой цепи из разных ПЦР-амплификаций взвешивали для каждого лигирования следующим образом:
а:б:в:г:д:е = 3:1:3:1:1:1, где а-е имеют следующие значения:
а) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-1А-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2;
б) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-1В-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2;
в) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-3А-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2;
г) 5'-йиУН1,3,5-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-3В-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2;
д) 5'-йиУН4-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-4-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2;
е) 5'-йиУН4В-Хйо1-2001х3'-ЫЬ 134-УН-4-МН3х3'-Ь1Ь 134-Ш3-В81Е2.
Проводили одну реакцию лигирования, включающую 400 нг пула человеческих Ь1Ь 134-УН фрагментов (расщепленных ХйоРВйЕП) и 1200 нг плазмиды рСошЬ3Н5ВН18/5-306 УЪ (ДНК, кодирующую УЪ-область 5сРу 5-306, клонировали через сайты рестрикции 8ас1 и 8ре1 в рСошЬ3Н5ВН18 согласно стандартным методикам). Полученный пул УН человеческих антител затем трансформировали в 300 мкл электрокомпетентных клеток ЕксйегюЫа сой ХЬ1 В1ие путем электропорации (2,5 кВ, просвет кюветы 0,2 см, 25 мФ, 200 Ом, прибор Сеие-Рикег Вюгаб), что приводило в целом к размеру библиотеки 1,6х108 независимых клонов.
После электропорации реакционную среду инкубировали в бульоне 80С (Р1ика) для экспрессии фенотипа. Затем каждую культуру инкубировали в 500 мл селективной среды 8В, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина и 2% об./об. глюкозы, в течение ночи. На следующие сутки клетки из культур собирали центрифугированием и осуществляли получение плазмид с использованием имеющегося в продаже набора для получения плазмид (О|адеп) для сохранения библиотеки ДНК.
1,5 мкг этого плазмидного пула, кодирующего соответствующий пул ксРу, затем вводили путем электропорации в Е. сой ХЬ1 В1ие (2,5 кВ, просвет кюветы 0,2 см, 25 мФ, 200 Ом, прибор Сеие-Рикег Вюгаб), что приводило в целом к размеру библиотеки 2,4х109 независимых клонов. После экспрессии фенотипа и медленной адаптации к карбенициллину библиотеку антител переносили в селективную среду 8В-карбенициллин (50 мкг/мл). Данную библиотеку антител затем инфицировали инфекционной дозой 1х 1012 частиц хелперного фага УС8М13, что приводило к продуцированию и секреции нитевидного фага М13, где каждая частица фага содержала одноцепочечную рСошЬ3Н5ВНк-ДНК, кодирующую человеческий ксРу-фрагмент, и экспонировала соответствующий белок 5сРу в виде трансляционного слияния с оболочечным белком ΙΙΙ фага.
Пример 2.3.4. Селекция УН человека с помощью фагового дисплея.
Полученную фаговую библиотеку, несущую клонированный репертуар ксРу, собирали из культурального супернатанта путем осаждения с помощью РЕС8000/№1С1 и центрифугирования. Приблизительно от 1х 1011 до 1х 1012 фаговых частиц с ксРу ресуспендировали в 0,4 мл РВ8/0,1% БСА и инкубировали с рекомбинантным биотинилированным растворимым ЛСМ-С8Р (материал Е. со11, как описано в примере 1) в течение 1 ч при слабом перемешивании в общем объеме 0,5 мл. Затем добавляли 6,7х107
- 21 017420 магнитных шариков, покрытых стрептавидином (ИупаЬеайк М-280-§!тер!ау1йш, Буиа1), и инкубировали далее при слабом перемешивании в течение 30 мин.
ксЕу фаг, который специфически не связывается с антигеном-мишенью, устраняли стадиями промывки с РВ8/0.1% БСА. Для этой цели комплексы биотинилированный антиген-стрептавидиновый шарик (с потенциальными связывателями 5сРу) собирали магнитом и ресуспендировали в 1 мл раствора для промывки (одна стадия промывки). Эту процедуру промывки повторяли вплоть до четырех раз. После промывки связывающие структурные единицы элюировали с использованием НС1-глицина, рН 2,2 и после нейтрализации с использованием 2М Трис, рН 12 элюат использовали для инфицирования свежей неинфицированной культуры Е. со11 ХЬ1 В1ие.
Для элюции оставшихся сильно связывающих структурных единиц шарики непосредственно ресуспендировали в 200 мкл свежей культуры Е. сой ХЬ1 В1ие (ОП600>0,5) и инкубировали в течение 10 мин при слабом перемешивании. Затем смешивали обе культуры и клетки, успешно трансдуцированные фагмидной копией, кодирующей ксЕу-фрагмент человека, вновь подвергали селекции на устойчивость к карбенициллину и затем инфицировали хелперным фагом УСМ813 для начала второго раунда дисплея антител и селекции ίη νίίτο.
Для двух антител осуществляли в целом 4 раунда селекции. Концентрации антигена во время селекции снижали до конечных концентраций следующим образом:
1- й раунд 100 нм.
2- й раунд 10 нм.
3- й раунд 10 нм,
4- й раунд 10 нм.
Выделяли плазмидную ДНК из культур Е. сой, соответствующих 3 или 4 раунду пэннинга.
Для получения растворимого 5сР\'-белка фрагменты УН-УЪ-ДНК вырезали из плазмид (Хйо1-8ре1) и клонировали через те же сайты рестрикции в плазмиде рСошЬ3Н5ВЕ1ад/Нщ (без дополнительных фаговых белков, необходимых для фаговой инфекции). После лигирования каждый пул (разные раунды пэннинга) плазмидной ДНК трансформировали в 100 мкл компетентных к тепловому шоку клеток Е. сой ТС1 и переносили на чашки с карбенициллином и ЬВ-агаром. Одиночные колонии отбирали и инокулировали в 120 мкл ЬВ-карбенициллина (50 мкг/мл), 1% глюкозы в 96-луночных планшетах (Стешет). Лунки запечатывали полупроницаемой мембраной (Стешет) и планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С во встряхиваемом инкубаторе (основной планшет). Затем 10 мкл культур из основных планшетов переносили во второй 96-луночный планшет (рабочий планшет), содержащий 90 мкл ЬВкарбенициллина (50 мкг/мл), 0,1% глюкозы на лунку. После инкубации в течение 4 ч при 37°С во встряхиваемом инкубаторе продуцирование 5сЕ\' индуцировали путем добавления 20 мкл ЬВ-карбенициллина, 6 мМ 1РТС в каждую лунку. После другой стадии инкубации в течение ночи при 30°С со встряхиванием клетки лизировали при инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью 40 мкл лизирующего буфера (400 мМ борной кислоты, 320 мМ ЫаС1, 4 мМ ΕΌΤΑ рН 8, 2,5 мг/мл лизоцима). Оставшиеся клетки и клеточный дебрис отделяли центрифугированием в течение 12 мин при 1900хд (Нейюй).
Супернатанты, содержащие молекулы 5сЕ\'. затем тестировали на связывание в ЕЬ18А-анализах. Определение 5сР\'-фрагментов. связанных с иммобилизованным антигеном ГЙСМ-С8Е (лейкин), осуществляли с использованием анти-йад М2 (1 мкг/мл РВ8/1% БСА), которые определяли специфическим поликлональным антителом козы против ЕаЬ2 мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена (^^аηονа, 1 мкг/мл РВ8/1% БСА). Сигнал проявляли путем добавления раствора субстрата АВТ8 и определяли при длине волны 405 нм.
Из приблизительно 100 клонов, протестированных после третьего раунда селекции, 12 клонов показали сильное связывание с ГЙСМ-С8Е. Из приблизительно 160 клонов, протестированных после четвертого раунда, свыше 80% лизатов показало сильные сигналы в ЕЬ18А на рекомбинантном антигене по сравнению с РВ8 в качестве отрицательного контроля. Результаты от репрезентативных клонов показаны на фиг. 4, на которой эти репрезентативные клоны расположены вдоль оси Х, а интенсивность поглощения указана по оси Υ. Как можно видеть на фиг. 4, отрицательный контроль с РВ8 (второй справа по оси X) не показал существенного связывания, тогда как репрезентативные клоны 5сЕ\г: 5сЕ\' А, 5сЕ\' 3035, 5сЕ\' 3039, 5сЕ\' 3080 и 5сЕ\' 5-306 показали разные уровни силы связывания, определенные с помощью ЕЫ8А.
Все лизаты тестировали без ГЙСМ-С8Е в параллельных экспериментах на неспецифическое связывание с блокирующим агентом. Никакого значимого определимого сигнала не наблюдали, что указывает на специфичность связывания с ГЙСМ-С8Е.
Определяли последовательности ДНК более чем 13 ЕЬ18А-положительных клонов 5сЕ\'. Всего идентифицировали шесть разных последовательностей. Все последовательности имели человеческое происхождение и были близкородственными с человеческой последовательностью зародышевой линии УН-1 1-02.
Пример 2.3.5. Характеристика человеческих конструкций 5сЕ\'. содержащих человеческие УЬ- и УН-области.
- 22 017420
Пример 2.3.5.1. Крупномасштабное продуцирование и очистка потенциальных конструкций ксБу, полученных способом, описанным в примере 3.
Потенциальные ксБу выделяли и очищали, как описано в примере 2.2.6.3.
Пример 2.3.5.2. Кинетический анализ связывания потенциальных ксБу с помощью поверхностного плазмонного резонанса (8РК).
Целью данного эксперимента является глубокая характеристика потенциальных ксБу. Кинетику связывания (кй и ка) потенциальных 5сЕу измеряли, инъецируя 10 мкл очищенного белка в серии разведений, варьирующих от 10 мкг/мл до 1 пг/мл очищенного 5сЕу. и отслеживая диссоциацию при 25°С в течение 100 с. Белок забуферивали в НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15М ЫаС1, 3 мМ ΕΌΤΆ, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20). Данные аппроксимировали с использованием программы ΒΙΛο уа1иайои™, определяющей константу скорости для кинетики диссоциации и ассоциации с помощью уравнения связывания Ленгмюра 1:1 (формулы 1 и 2), где А представляет собой концентрацию инъецированного анализируемого вещества и В представляет собой концентрацию лиганда.
άΒ/άί = -(ка*[А]*[В]-кс/*[АВ]) (1) с1АВ/(Н = -(ка*[Д]*[е]-к€/*ИВ]) (2)
Кривые кинетики связывания определяли с использованием вплоть до 8 концентраций каждого проанализированного потенциального ксБу. Независимая аппроксимация исходных данных дала константы скорости диссоциации и ассоциации, которые использовали для расчета равновесной константы диссоциации (ΚΌ, результаты показаны в табл. 1).
Таблица 1
ка [1/мс] кй [1/с] КО [М] 1С50 [нМ]
3035 1,6 х 10® ± 1,1 х 10® 1,5 х 10'3 + 0,4х 10'3 0,9 х 10’“ 3,2
3039 0,6 х 10*+ 0,4 х 104 0,9 х 10^ +0,1 х 104 1,7 х 10’® 130,5
асРуа 1,7x10®+1,1x10® 1,6 х 10'3±0,2х 10’3 1,2 х 10’9 2,6
3080 1,0x10= ±0,5x10® 3,5 х 103 ± 0,2 х 1О‘Э 3,5x10'® 19,1
2.3.5.3. Ингибирование гйСМ-С8Б-зависимой пролиферации клеток ΤΡ-1 потенциальными ксБу.
После подтверждения того, что у потенциальных ксБу сохранялась сила специфического связывания, целью этого эксперимента был анализ специфичности взаимодействия потенциального ксБу с антигеном ГЙСМ-С8Б. Ингибирование биологической функции гНСМ-С8Р антигена путем связывания ксБу характеризовали в эксперименте по ингибированию пролиферации ΤΡ-1.
Эксперименты по ингибированию пролиферации ΤΕ-1 осуществляли, как описано выше. Клетки ресуспендировали в конечной концентрации 1 х 105 клеток/мл в ΚΡΜΙ 1640, 10% БС8 и использовали 90 мкл клеточной суспензии на лунку (0,9х104 клеток/лунку). Для стимуляции пролиферации клеток ΤΡ-1 использовали конечную концентрацию ЛСМ-С8Б 0,3 нг/мл. Для нейтрализации гйСМ-С8Б-зависимой пролиферации добавляли очищенный ксБу в 1хРВ8 в серии разведений с конечными концентрациями белка, варьирующими от 100 мкг/мл до 10 пг/мл. 10 мкл диализованного и подвергнутого стерилизующей фильтрации белкового раствора (фильтр 0,22 мкм) добавляли к 100 мкл раствора ΤΡ-1 и ГЙ6М-С8Б. Образцы инкубировали при 37°С в 5% С02 в течение 72 ч. Через 72 ч определяли пролиферативный статус клеток ΤΕ-1, добавляя \¥8Τ-1 и отслеживая колориметрическое изменение с помощью ЕЫ8А-ридера при 450 нм (фиг. 5). Как можно видеть на фиг. 5, четко продемонстрирована активность, нейтрализующая СМ-С8Б человека. 8сБу А продемонстрировал самую сильную нейтрализующую активность.
Пример 2.4. Оптимизация характеристик связывания выбранных ксБу.
Предусматривалось, что биологическую активность нейтрализующего агента в отношении мономерного лиганда можно улучшить или даже оптимизировать путем увеличения силы связывания между нейтрализатором и лигандом, конкретно путем повышения скорости диссоциации нейтрализатора.
Предпочтительно этого можно добиться мутированием последовательности соответствующей УНили УЪ-области случайным образом путем (1) введения одной или более чем одной случайной мутации в пределах всей последовательности или путем (2) введения одиночных мутаций или множественных смежных мутаций (например, отрезков из пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот) в области 8сБу, которые имеют высокую вероятность взаимодействия с антигеном. Соответствующие мутанты затем необходимо охарактеризовать в отношении любого увеличения активности или перед характеристикой их необходимо улучшить до предпочтительных качеств (например, более сильное связывание) с помощью подходящих способов селекции (например, фаговый дисплей).
Пример 2.4.1. Увеличение аффинности мутированием УН СЭКЗ в одном или более чем одном положении.
Для улучшения характеристик связывания фрагмента антитела, например молекулы ксБу, с помощью одиночных точечных мутаций или коротких аминокислотных отрезков необходимо сделать мишенями аминокислотные остатки, которые имеют очень высокую вероятность взаимодействия с соответст
- 23 017420 вующим антигеном. При таком подходе нет необходимости подвергать скринингу более чем только ограниченное число мутантов, без снижения вероятности успеха. ί.ΌΚ3 тяжелой цепи антитела или его фрагмента обычно вносит существенный вклад в связывание антигена этим антителом или фрагментом антитела в целом. Поэтому предусматривалось, что многообещающим способом увеличения аффинности связывания антитела или фрагмента антитела может быть мутирование нуклеотидной последовательности, кодирующей УН ί.ΌΚ3. Существует целый ряд разных методологий для проведения такого направленного случайного мутагенеза, некоторые из которых описаны ниже в контексте того, как можно увеличить аффинность связывания молекул ксЕу, описанных выше.
A) Для того чтобы сделать УН ί.ΌΚ3 мишенью, необходимо ввести в нуклеотидную последовательность в УН ί.ΌΚ3 подходящий сайт рестрикции, предпочтительно путем синтеза гена целой УНобласти с модифицированной нуклеотидной последовательностью СОКЗ, сохраняя первоначальную аминокислотную последовательность (Еп1е1есйоп, Германия). Посредством расщепления соответствующим ферментом рестрикции и добавления нуклеазы 81/ДНК-полимеразы Ι Кленова и 6СТР с последующим добавлением мутантного олигомерного дуплекса можно провести направленный случайный мутагенез в одном или более чем одном положении аминокислот согласно МаНеисс! апб Неупекег, М.1с1е1С Ααάκ Векеагсй 11: 3113 ££ (1983). Мутировавшие УН затем объединяют с соответствующей УЪ (через подходящий линкер) в подходящем векторе для экспрессии ксЕу и трансформируют в клетки Е. со11. Одиночные колонии, экспрессирующие вариантные ксЕу, затем можно собрать и подвергнуть скринингу на улучшенные ксЕу, как описано для скрининга и характеристики удачных ксЕу и потенциальных ксЕу в предыдущих примерах.
Б) Альтернативным способом является олигонуклеотидопосредованный мутагенез, с помощью способа с двойным праймером, как подробно описано у 8атЬгоок, Егйксй, Машайк (1989) Α 1аЬога1огу тапиа1. По существу, УН-область клонируют в вектор на основе М13 и выделяют одноцепочечную плазмиду. Праймер, способный к гибридизации с одноцепочечной плазмидной матрицей, содержащей рандомизированную последовательность, отжигают и удлиняют. После размножения соответствующего плазмидного пула в Е. сой мутировавшие УН можно собрать из пула плазмид и объединить с первоначальной УЬ (через подходящий линкер) в подходящем векторе для экспрессии ксЕу и трансформировать в клетки Е. со11. Одиночные колонии, экспрессирующие вариантные ксЕу, выбирают и подвергают скринингу на улучшенные ксЕу, как описано для скрининга и характеристики удачных ксЕу и потенциальных ксЕу в предыдущих примерах.
B) Еще одной альтернативой является мутирование вплоть до шести или даже большего числа смежных аминокислот. Для этой цели можно сконструировать делеционный вариант нуклеотидной последовательности УН, имеющей делетированные СЭР3 и ЕВ4. Эту конструкцию используют в качестве матрицы для одно- или двухступенчатой ПЦР-амплификации, при которой подходящий 5'-праймер (гибридизующийся с 5'-концом последовательности УН и добавляющий подходящий сайт клонирования) объединяют с набором 3'-праймеров, которые гибридизуются на 3'-конце ЕВ3-области в качестве матрицы и добавляют к амплифицируемому фрагменту СЭР3 и ЕВ4 область (с подходящим сайтом рестрикции). Этот набор 3'-праймеров содержит последовательность из одного или более чем одного триплета для вставки случайных кодонов в последовательность ί.ΌΕ3. Этот пул УН-областей, содержащих рандомизированные области СОК3, затем можно последовательно объединить с соответствующей УЪ (через подходящий линкер) в подходящем векторе для экспрессии ксЕу и трансформировать в клетки Е. со11. Одиночные колонии, экспрессирующие вариантные ксЕу, затем отбирают и подвергают скринингу на улучшенные ксЕу, как описано для скрининга и характеристики удачных ксЕу и потенциальных ксЕу в предыдущих примерах.
Соответствующие пулы мутировавших ксЕу, которые имеют более высокое разнообразие (которые можно легко подвергнуть скринингу), можно клонировать в подходящий вектор для фагового дисплея, и улучшенные ксЕу затем можно подвергнуть селекции с помощью фагового дисплея на интересующем антигене, предпочтительно в условиях снижающихся концентраций антигена для выбора более высоких аффинностей. Селекции с помощью фагового дисплея проводят согласно стандартным протоколам, как описано здесь в другом месте. Любой из приведенных выше способов А-В можно объединять или проводить в повторяющихся циклах для дальнейшего улучшения и оптимизации уже модифицированных ксЕу.
Пример 2.4.2. Увеличение аффинности путем случайного мутирования У-областей в пределах всей последовательности.
Вместо мутирования специфических сайтов ксЕу, которые имеют высокую вероятность взаимодействия с соответствующим антигеном, можно осуществлять более прагматичный подход путем введения точечных мутаций в пределах всей последовательности УН и/или УЪ и затем проведения скрининга в отношении оптимизированных ксЕу или селекции и проведения скрининга оптимизированных ксЕу. В качестве примера последовательность УН и/или УЪ можно подвергнуть мутагенезу с использованием штаммов-мутаторов Е. сой (как описано у Боте е1 а1. 260: 359 ГГ 1. Мо1. Бю1. (1996)) или неправильного включения нуклеотидов ДНК-полимеразами, как подробно описано у 8атЬгоок, Егйксй, Машайк (1989) Α 1аЬога1огу тапиа1. Клонирование, экспрессию и селекцию оптимизированных вариантов ксЕумолекул можно проводить с помощью фагового дисплея или часто используемой технологии рибосомно
- 24 017420 го дисплея (как описано в ЕР 0975748 А1). Оптимизированные версии экспрессируют в подходящих системах векторов/Е. сο1^ для скрининга улучшенных кандидатов 8сЕу.
Подходящую методологию, как описано выше в примере 2.4, использовали для оптимизации репрезентативного потенциального 8сЕу (8сЕу А), что приводило к получению класса фрагментов моноклональных человеческих нейтрализующих антител против СМ-С8Р, представленного молекулами 8сЕу В-Ν. Характеристики этих молекул 8сЕу будут выявлены и дополнительно описаны в следующих примерах. Получение молекул моноклонального ЦС из выбранных молекул 8сЕу описано в следующем примере.
Пример 3. Клонирование и экспрессия эукариотами моноклональных антител из селектированных 8СРν.
Хотя бактерии, как известно, экспрессируют функциональные РаЬ-фрагменты, они обычно не способны продуцировать полностью функциональные иммуноглобулины. Для продукции полностью функциональных антител необходимо использовать клетки млекопитающих, и поэтому УЪ-область 8сРν 5-306 и разные УН-области молекул 8сРν, селектированных в предыдущих примерах, субклонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих (особенно УН-области 8сРν А и 8сРν В).
Пример 3.1. Клонирование человеческой легкой цепи на основе 8сРν 5-306.
Для получения подходящих терминальных сайтов рестрикции фрагмент ДНК, кодирующий УЪобласть 8сРν 5-306, повторно амплифицировали с помощью ПЦР, что давало Ук-фрагменты с сайтом Вби361 на 5'-конце и сайтом Х1ю1 на 3'-конце. Этот фрагмент затем субклонировали в плазмиду В8РОЪЪ Вби361 и Х1ю1 с использованием 5'-праймера (5'-АС6ΤСАССΤΤА66Τ6ΤССАСΤСС6АΤАΤССА6А Τ6АСССА6ΤСΤССАΤСΤΤСС6Τ6ΤСΤ6С-3') и 3'-праймера (5'-САΤ6САСΤС6А6СΤΤ66ΤСССΤСС ССССАААС-3'), добавляя, таким образом, лидерную последовательность млекопитающих и человеческую константную область Ск, и подтверждали секвенированием. Используя ЕотШ и 8аП, ДНК 5-306 УЪ-Ск вырезали из В8РОЪЪ и субклонировали в эукариотический экспрессирующий вектор рЕР-АЭА, происходящий из экспрессирующего вектора рЕР-ЭНРК (Маск е! а1. (1995) Ргос. №!1. Аса4. 8сг И8А. 92, 7021-5), путем замещения кДНК, кодирующей мышиную дигидрофолатредуктазу (ОНРК), на кДНК, кодирующую мышиную аденозиндезаминазу (АЭА).
Пример 3.2. Клонирование вариабельных доменов человеческой тяжелой цепи.
Из разных человеческих УН-областей, селектированных в предыдущих примерах (особенно УНобластей 8сРν А и 8сРν В), вариабельную область повторно амплифицировали с помощью ПЦР, генерируя на обоих концах сайты рестрикции Взи361. Для всех конструкций использовали комбинацию двух праймеров 5'-праймера УН-Взи361 (5'-АС6ΤСАССΤΤА66Τ6ΤССАСΤСССА66Τ6СА6СΤ66ΤССА6 ΤСΤ6666СΤ6А66Τ6АА6АА6С-3') и 3'-праймера (5'-АС6ΤСАССΤ6А66А6АС66Τ6АССАΤΤ6Τ СССЕГО^'). Полученные фрагменты ДНК затем субклонировали с использованием этих сайтов рестрикции в эукариотический экспрессирующий вектор рЕР-ЭНРК, уже содержащий эукариотическую лидерную последовательность и фрагмент ДНК, кодирующий константную область тяжелой цепи человеческого ^01. Вариабельные области тяжелой цепи, таким образом, вставляли между лидерной последовательностью и константной областью тяжелой цепи. Правильные последовательности вариабельных областей подтверждали секвенированием.
Пример 3.3. Превращение 8сРν-фрагментов в полные ЦС человека.
Плазмиду, кодирующую легкую цепь (УЪ 5-306/Ск), и плазмиду, кодирующую одну тяжелую цепь (УН/константная область человеческого !дС1), котрансфицировали в клетки НЕК согласно стандартным протоколам для временной экспрессии белка и данные клетки культивировали для обеспечения экспрессии и продукции иммуноглобулинов в культуральную среду. Этим способом продуцировали ЦС А, происходящий из 8сРν А, и ЦС В, происходящий из 8сРν В. После соответствующего периода продукции собирали супернатанты и выделяли человеческие иммуноглобулины с помощью протеин Ахроматографии согласно стандартным протоколам для очистки иммуноглобулинов. Очищенные иммуноглобулины затем использовали для дальнейших экспериментов по определению характеристик.
Пример 3.4. Реконверсия ^С-специфичностей в 8сРν-фрагменты.
УН-области из конструкций ЦС (ЦС А и ЦС В, как описано выше) повторно клонировали в подходящий экспрессирующий вектор 8сРν согласно стандартным протоколам и функциональным образом связывали через гибкий линкер с УЪ-областью, происходящей из человеческой легкой цепи из примера 3.1. Эти конструкции продуцировались в растворимой форме в периплазме Е. отЪ как описано выше. Характеристика этих 8сРν ЬсЕу О, происходящего из ЦС А, и 8сРν Р, происходящего из ЦС В) описана в следующих примерах.
Пример 4. Оценка специфичности связывания человеческого моноклонального антитела против 6М-С8Р в отношении 6М-С8Р приматов и человека.
Целью этого эксперимента была демонстрация того, что антитело, полученное, как представлено выше, специфически связывается с СМ-С8Е. Поэтому связывание такого антитела с разными рекомбинантными человеческими (г1) колониестимулирующими факторами (г11С-С8Е и ГЙМ-С8Р, 8!га!йтапп) сравнивали со связыванием того же антитела с ЛСМ-С8Р с помощью ЕЫ8А.
мкл конкретного антигена (1 мкг/мл в РВ8) наносили на планшет для ЕЫ8А (Мшс, Маx^8ο^р) в
- 25 017420 течение 1 ч при комнатной температуре. После промывок 3 раза РВ8/0,05% Тетееп 20 лунки блокировали 200 мкл РВ8/3% обезжиренного сухого молока на лунку в течение 1,5 ч при комнатной температуре с последующей промывкой 3 раза РВ8/0,05% Тетееп 20. 50 мкл/лунку серий человеческих антител (например, ЦС А и ЦС В), каждого с идентичными легкими цепями с последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0: 34, но с разными тяжелыми цепями согласно 8ЕО ΙΌ N0:35-48, добавляли в серии разведений, варьирующих от 1 мкг/мл до 0,5 нг/мл (в РВ8/0,05% Тетееп 20/3% обезжиренного сухого молока), и инкубировали в течение 1 ч. После 3 промывок РВ8/0,05% Тетееп 20 связанное антитело определяли с использованием 50 мкл антитела козы против человеческого ЦС, конъюгированного с пероксидазой хрена (010110^1, разбавленное 1:1000 в РВ8/0,05% Т\уееп 20/3% обезжиренного сухого молока). Сигнал проявляли путем добавления 50 мкл/лунку раствора АВТ8 (КосНе) и поглощение измеряли при 405 нм, используя длину волны 450 нм в качестве эталона.
Имеющиеся в продаже антитела кролика (81га£Ьтапп В101есН АС), специфические, соответственно, к гЬМ-С8Р и гБС-С8Р, использовали в качестве положительных контролей для связывания этих антигенов, где указанное связывание определяли с использованием антител козы против антител кролика, конъюгированных с щелочной фосфатазой. Сигнал проявляли с помощью 50 мкл/лунку раствора рЦэр (81дта) и поглощение измеряли при 405 нм, используя длину волны 450 нм в качестве эталона.
Результаты показаны на фиг. 6А, 6В и 6С для двух репрезентативных человеческих антител ЦС А и В.
Как можно видеть на фиг. 6А, возрастающая концентрация титруемого антитела приводила к увеличению поглощения, что указывает на хорошее связывание обоих репрезентативных антител ЦС А и ЦС В с ЛСМ-С8Р. На фиг. 6В показаны результаты связывания тех же двух репрезентативных антител с гЬМ-С8Р. Как можно видеть на этом чертеже, увеличение концентраций кроличьего антитела против гЬМ-С8Р приводило к увеличению поглощения, т.е. к увеличению связывания этого контрольного антитела (закрашенные кружки), тогда как поглощения для двух репрезентативных антител, описанных выше (закрашенные квадратики и закрашенные треугольники), накладывались друг на друга в виде продолжения исходного поглощения, которое не увеличивается при увеличении концентрации тестируемого антитела. Полностью аналогичный результат виден как для контрольного антитела, так и для репрезентативных тестируемых ЦС А и В на фиг. 6С, на которой показаны результаты связывания с ЛС-С8Р.
Вместе взятые эти данные, представленные на фиг. 6А, 6В и 6С, показывают, что два репрезентативных тестируемых антитела, ЦС А и В, специфически связываются с ЛСМ-С8Р, но не с другими колониестимулирующими факторами, такими как М-С8Р и С-С8Р. Такая специфичность связывания антигена является важной для многообещающего терапевтического антитела-антитела.
Пример 5. Характеристика данных по связыванию для человеческих моноклональных антител и их фрагментов против СМ-С8Р.
Было желательным создание качественного ранжирования разных членов, идентифицированных в ЕЫ8А в качестве положительных связывателей гБСМ-С8Р, как описано выше в примере 2. Данное ранжирование было предназначено для того, чтобы отражать кинетические (скорость диссоциации) и равновесные (аффинность) параметры различных репрезентативных антител-связывателей, идентифицированных таким образом. Для этой цели осуществляли поверхностный плазмонный резонанс (8РК) на установке ВМсоге™ 2000, В1асоге АВ (Ирр5а1а, Швеция) со скоростью протока 5 мкл/мин и НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15М №С1, 3 мМ ЕЭТА, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) в качестве проточного буфера при 25°С. Рекомбинантный человеческий СМ-С8Р (лейкин, Вег1ех, ниже альтернативно именуемый антиген или гБСМ-С8Р), продуцируемый в дрожжах, иммобилизовали в проточных ячейках 2-4 на сенсорном чипе СМ5. Поверхность чипа активировали путем впрыскивания 80 мкл 0,1М гидроксисукцинимида натрия, 0,4М №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (NН8/Е^С). Антиген связывали путем впрыскивания вручную 10 мкг/мл ЛСМ-С8Р в 0,01М ацетата натрия, рН 4,7. В проточных ячейках 2-4 иммобилизовали разные плотности антигена, регулируя количество ручных впрыскиваний. Проточную ячейку 1 оставляли немодифицированной, тогда как проточную ячейку 2 покрывали наиболее высокой из возможных плотностью ЛСМ-С8Р (800 КН). Проточную ячейку 3 покрывали 50% количества антигена, иммобилизованного на проточной ячейке 2, и проточную ячейку 4 покрывали самой низкой плотностью ЛСМ-С8Р (типично 10%). Активированную поверхность сенсорного чипа блокировали путем впрыскивания 85 мкл 1М этаноламина и оставляли чип уравновешиваться в течение ночи при постоянной скорости тока НВ8-ЕР 5 мкл/мин.
Пример 5.1. Качественное определение кинетических параметров связывания (скорость диссоциации) для 5сΡν-фрагментов человеческих моноклональных антител против СМ-С8Р.
Эксперименты с использованием В1асоге проводили, как изложено в предыдущем параграфе. Перед данным экспериментом растворы элюированного белка периплазматического препарата (РРР) диализовали против РВ8 при 25°С в течение 2 ч и разбавляли 1:1 в НВ8-ЕР. Кинетики связывания членов заявленного класса измеряли, впрыскивая 10 мкл раствора очищенного периплазматического белка при 25°С на сенсорный чип. Неспецифическую фоновую адсорбцию белка на поверхности немодифицированного сенсорного чипа (РС1) вычитали из ответного сигнала в проточных ячейках с иммобилизованным гНСМС8Р (РС2, РС3, РС4). Определяли относительный ответный сигнал (РС2-1, РС3-1, РС4-1), и специфиче
- 26 017420 скую скорость диссоциации отслеживали в течение 100 с.
Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 7А для серии репрезентативных 5сТу-фрагментов, которые ранее были идентифицированы как положительные связыватели ЛСМ-С8Т в экспериментах с использованием ЕЬ18А. Репрезентативные 5сТу фрагменты антител, для которых данные В1Асоге показаны на фиг. 7А, являются следующими: 5сТу А, 5сТу В, 5сТу С, 5сТу Ό, 5сТу Е, 5сТу Т, 5сТу С, 5сТу Н, 5сТу I, 5сТу ί. 5сТу К, 5сТу Ь, 5сТу М и 5сТу Ν.
Обычно при интерпретации результатов Вьасоге амплитуда пика связывания (КИтах) непосредственно кореллирует с концентрацией белка в инъецированном образце. Кинетическая скорость ассоциации (ка) зависит от концентрации и из-за варьирующих концентраций белка в РРР не может использоваться для качественного ранжирования членов заявленного класса. Кинетическая скорость диссоциации (кй) не зависит от концентрации белка и характеризует силу связывания соответствующих членов заявленного класса. Все идентифицированные члены заявленного класса демонстрируют специфическое связывание с иммобилизованным ЛСМ-С8Т. Члены заявленного класса с наилучшей кажущейся скоростью диссоциации были идентифицированы и после дополнительной корреляции данных 8РЯ с данными по ингибированию представлены для определения аффинности с помощью экспериментов по равновесному связыванию на В1Асоге.
При оценке фиг. 7 А видны отдельные пики для каждого из репрезентативных 5сТу фрагментов А-Ν антител, верхние части каждого из которых демонстрируют характерную кривизну, которую можно экстраполировать для получения скорости диссоциации рассматриваемого 5сТу-фрагмента. Тогда с точки зрения качества можно заключить, что каждый из репрезентативных 5сТу-фрагментов хорошо связывается с человеческим СМ-С8Т.
Пример 5.2. Количественное определение равновесных параметров связывания (аффинности) для определенных человеческих антител и их 5сТу-фрагментов против СМ-С8Т.
Установив в примере 5.1 качественно, что целый ряд 5сТу-фрагментов антител против СМ-С8Т, которые ранее были протестированы в качестве положительных на связывание СМ-С8Т в ЕЫ8А, демонстрируют приемлемые кинетические скорости диссоциации при связывании с человеческим СМ-С8Т, затем было желательным получение количественного представления такого связывания для антител и их фрагментов, фокусируясь на равновесных характеристиках связывания с рекомбинантным человеческим СМ-С8Т. Как показано выше в примере 4, специфическое связывание с антигеном - здесь ЛСМ-С8Т является одной из характеристик и специфических атрибутов класса антител и их фрагментов против СМ-С8Т, как здесь заявлено.
Кинетику связывания (скорость диссоциации (кй) и скорость ассоциации (ка)) определенных репрезентативных членов класса человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Т измеряли путем инъекции 10 мкл очищенного белка (например, антитела или его фрагмента) в серии разведений, варьирующих от 10 мкг/мл до 1 пг/мл очищенного белка, и отслеживанием диссоциации при 25°С в течение 100 с. Очищенный белок забуферивали в НВ8-ЕР. Данные аппроксимировали с использованием программы В1Аеуа1ийоп™, определяя константу скорости для кинетики диссоциации и ассоциации с помощью уравнения связывания Ленгмюра 1:1 (см. формулы 1 и 2 ниже), где А представляет собой концентрацию инъецированного очищенного анализируемого белка, и В [0] представляет собой Ктах с/В/сП = -(ка*[А]*[В]-М*[А8]) (Формула 1) дАВ/сК = -(ка*[А]*[В]-М*[АВ]) (Формула 2)
Кривые кинетики связывания определяли с использованием вплоть до 8 концентраций каждого репрезентативного анализируемого человеческого антитела или его фрагмента против СМ-С8Т. Независимая аппроксимация исходных данных давала константы скорости диссоциации и ассоциации, которые использовали для расчета равновесной константы диссоциации (КО). Результаты, полученные для каждого репрезентативного человеческого антитела или его фрагмента против СМ-С8Т, показаны на фиг. 7В-1. Конкретно, на фиг. 7В показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 1дС В; на фиг. 7С показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 1дС А; на фиг. 7Ό показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу С; на фиг. 7Е показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу I; на фиг. 7Т показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу В; на фиг. 7С показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу А; на фиг. 7Н показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу Е, и на фиг. 71 показаны данные по связыванию, полученные для репрезентативного 5сТу Ό. Эти данные обобщены ниже в табл. 2.
- 27 017420
Таблица 2 Количественные данные по аффинности связывания для определенных репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Е
Антитело /его НаФиг. ка^М'1) кй (с1) КО(М) фрагмент
ЗсРу А 7(3 4,41x10° ±3,00x10° 1,84 х10” 16,55 хЮ4 4,17x10”
ЗСРуВ 7Е 1,01 х10*±4,08 хЮ® 8,07 х10л ±3,73 хЮ * 7,98x10”
зсРу Е 7Н 1,26 хЮ* ±5,57 хЮ4 2,55 х104 ±8,12x10·® 2.03 хЮ®
зсРу С 7ϋ 1,73 хЮ* ±8,23 хЮ4 4,77 хЮ4 ±1,91 хЮ4 2,76x10·®
зсРу ϋ 71 7,60x10*16,70 хЮ* 8,66 x1ο·4 ±2,13x1 О'4 1,14x10*’
зсРу) 7Р 2,32x10*12,13x10® 3,47x1 О'4 ±8,78x10·® 1,50 хЮ'9
1д6 А 7С 2,09x10*11,32 хЮ® 1,81 х1 О'4 ±8,77x10·® 8,70x10”
1д<3 В 7В 3,63x10*12,40 хЮ* 1,68 ХЮ'® ±5,74 хЮ® 4,64x10'11
Пример 6. Требования для минимального эпитопа определенного репрезентативного фрагмента человеческого антитела против СМ-С8Е.
Было желательным определить эпитоп, связываемый человеческими антителами и их фрагментами против СМ-С8Е, как описано и заявлено здесь. Для этой цели провели анализ пептидных пятен (реркрой) с использованием ксΕν А в качестве репрезентативного члена этого класса молекул и СМ-С8Е человека в качестве антигена.
В общем, реркрой эксперимент осуществляли следующим образом.
Перекрывающиеся 13-мерные пептиды, происходящие из аминокислотной последовательности 11СМ-С8Е (относительно последовательности СМ-С8Е человека и определенных других приматов см. выше, а также фиг. 8А, а также 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 49-51), ковалентно связывали С-концом с целлюлозной мембраной VЬаΐтаη 50, тогда как ацетилированный Ν-конец оставался свободным. Индивидуальные полученные 13-мерные пептиды (полученные ЙРТ Рерййбе ТесЬпо1одйек СтЬН) показаны ниже в табл. 3. Длина перекрывающейся последовательности любых двух соответствующих пептидов была установлена на уровне 11 аминокислот. Согласно протоколу производителя мембрану промывали абсолютным ЕйОН в течение 1 мин с последующей промывкой ТВ8 и блокированием ТВ8/3% БСА в течение ночи. Как и в случае каждой последующей инкубации и промывки, блокирование осуществляли при комнатной температуре. После промывки 3 раза ТВ8/0,05% Т\гееп 20 в течение 10 мин мембрану инкубировали с 1 мкг/мл ксΕν А в ТВ8/3% БСА в течение 2,5 ч с последующей промывкой, проведенной, как описано выше. Определение ксΕν осуществляли с использованием антитела против пента-Н1к Юйадеп, 0,2 мкг/мл в ТВ8/3% БСА) с последующим использованием антитела козы против 1дС мыши (Ес-у-специфического), конъюгированного с пероксидазой хрена (О|апоуа. 1:10000 в ТВ8/3% БСА), где инкубацию с каждым из этих соответствующих антител осуществляли в течение 1 ч. После промывки 3 раза ТВ8/0,05% Т\гееп 20 в течение 10 мин сигнал проявляли повышенной хемилюминисценцией (8ирег8|дпаЖек1 Рюо Ьит1по1/Еп11апсег 8о1ийюп и 8ирег8|дпаЖек1 Рюо 81аЬ1еРегох16е 8о1и1юп; Рйегсе) и экспозицией на пленке ВюМах (Кобак).
Сильные сигналы связывания ксΕν А с отрезками человеческого СМ-С8Е определяли на отрезке пептидных пятен между пятном А и В, а также на пятне С (см. табл. 3 ниже и фиг. 8В). Как можно видеть на фиг. 8В, связывание с другими пятнами, по-видимому, имело меньшую силу. Отрезок пятен, охватывающий точки А и В, соответствует аминокислотным остаткам 15-35. Все 13-мерные пептиды, составляющие эту область, содержат один минимальный аминокислотный отрезок из аминокислот 23-27 (ККЪЬК). Пятно С соответствует аминокислотным остаткам 65-72 (СЬКСЗЬТКЬКСРЬ) СМ-С8Е человека. Эти данные подразумевают, что ксΕν А, по-видимому, распознает прерывистый эпитоп.
Во вторичной структуре СМ-С8Е человека аминокислоты 15-35 расположены в спирали А, тогда как остатки, соответствующие пятну С, представляют собой часть петлевой структуры, локализованной между спиралями С и Ό. Трехмерная модель укладки данной молекулы выявляет тесную стерическую близость этих сайтов относительно друг друга.
Минимальный мотив аминокислотной последовательности в пептидах пятен А-В соответствует остаткам 23-27 СМ-С8Е человека (ККЪЬЩ. Увеличение силы сигнала от пятна А к В можно объяснить лучшей доступностью эпитопа ΚΚΕΕΝ в пептиде, соответствующем пятну В, чем в пептиде, соответствующем пятну А. В пептиде А данный эпитоп локализован непосредственно на С-конце, который связан с мембраной, тогда как в пептиде В он локализован на более доступном Ν-конце данного пептида.
- 28 017420
Таблица 3 Последовательность перекрывающихся 13-мерных пептидов, иммобилизованных на целлюлозной мембране
ι. ΑΡΑκεΡδΡετ{3ΡΗ 16. ηΤΑΑΕΜΝΕΤνενΐ 31. ьукоськезьткь 46. ΤΡΕΤ33ΑΤΏΤΙΤΓ
2. АНЗРЗРЗТОРИЕН 17. ΑΑΕΜΜΕΤνΕνΐ5Ε 32. коськсзьткькс 47 . ΕΤΞ5ΑΤΰΤΙΤΕΈ5
3. ЗРЗРЗТОРИЕНУМ 10, ΕΜΝΕτνΕνιεεΜΓ 33 · <с) 48. 55ΑΤ0ΤΪΤΕΈ5ΓΚ
4, ЗРЗТфРИЕНУЙДГ 19, ЫЕТГЕУТЗЁМГОЬ 34. ксзьткьксрьтм 49. ΑΤ5ΤΙΤΕΕ3ΕΚΕΚ
5. ΞΤΰΡΐϊΕΗνΝΑϊΏΕ 20. ΤνενίΞΕΜΕΌΙΟΕ 35. ЕЬТКЪКЯРЬТММД 50. ΟΤΙΤΡΕ5ΓΚΕΝΒΚ
б. ΟΡΝΕΗνΝΑΓΟΕΑΗ 21. ЕУГЗЕМГРЬОЕРТ 36. ткькйрьтммаэн 51.
7. ИЕНтаыЦЕАККЬ 22. ГЗЕМЕОЪОЕРТЗЬ 37. ЬКСРЪТММАЙНУК 52. ГЕЕГКЕИЬКОЕЪЪ
8. НУИаЮЕД^М (А) 23. ЕМГОЬОЕРТЗЬОТ 30. 6ΡΏΤΜΜΑ3ΗΥΚΏΗ 53 . ЗРКЕЫЬКОЕЪЫП
9. МАЮЕЫЩИЪВ 24. ГПЕОЕРТЗВДТКЬ 33. ЪТММЙЗНУКОНЗР 54 . ΚΕΝίΚΟΓίΛνίΡΓ
10. гациаакаьзяр 25, ЬОЕРТЗЮТКЬЕЬ 40. ммазнгконзррт 55 . ΝΚΚϋΕΤΓνίΡΕΌΞ
11. ЕАЯаайВъЗМПА 26. ЕРТЗЬ0ТМ.ЕЬ¥К 41. Α5ΗΥΚ0Η5ΡΡΤΡΕ 56. ΚΟΕΊΛνΐΡΓΟ3ΡΪΕ
12. нМыжотале (В) 27. ТаьаТИЬЕЬУКОС 42. НУК<ЗНЗ₽РТРЕТЗ 57. ЕЬЬУГРПШГСЕРУ
13. ЫЛЬЗЙОТААЕШ 14, ЫЬЗВОТААВДЫЕТ 15. δΚΟΤΑΑΕΜΝΕΤνΕ 20. ЬОТВЬЕЬУКаеГК 29. ΤΡ.ΕΕ1ΥΚς«Ε?,33 30. ЬЕЬУКОСЬНСЗЬТ 43. КС?НБРРТРЕТ35А 44. ΗΞΡΡΤΡΕΤΞ5ΑΤ0 45. ΡΡΤΡΕΤ38ΑΤΟΤΙ 58. ΕνίΡΡΊΉΚΕΡνΟΕ
Пример 7. Эффективность нейтрализации определенных человеческих антител/фрагментов антител против 6М-С8Р человека.
Пример 7.1. Качественная оценка нейтрализующего потенциала определенных репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Р человека.
Целью этого эксперимента является получение качественной информации о нейтрализующей активности репрезентативных человеческих нейтрализующих антител и их фрагментов против СМ-С8Р. Для этого использовали человеческую СМ-С8Р-зависимую клеточную линию ТР-1 (Ό8ΜΖ, АСС 334). Скорость пролиферации этой клеточной линии зависит от присутствия СМ-С8Р человека, так что для определения, существует ли такая нейтрализующая активность на самом деле, можно использовать измерение роста клеток после инкубации клеток с человеческим СМ-С8Р в присутствии или в отсутствие антитела, у которого подозревают наличие СМ-С8Р-нейтрализующей активности.
Клетки ТТ-1 культивировали в среде ЕРМ[ 1640 (ШЬсо; не содержит Ь-глутамин, феноловый красный), 10% инактивированной нагреванием РС8, в присутствии 2,5 нг/мл ЛСМ-С8Р, как описано дистрибьютером (ЭспЬсНс 8атт1иид νοη М1кгоогдаш8теи иий ΖοΙΙΚυΙΙυΓοη 6тЬН, Вгаии8скете1д, Германия). Клетки выращивали до плотности клеток 0,5х106 клеток/мл. Для анализа пролиферации клетки ТР-1 собирали центрифугированием при 300хд в течение 4 мин и промывали 1хРВ8 (среда Дульбекко, ШЬсо). Клетки ресуспендировали до конечной концентрации 1х105 клеток/мл в КРΜI 1640, 10% РС8 и использовали 90 мкл клеточной суспензии лунку в плоскодонном планшете для культуры клеток Мсго1е81 (0,9х104 клеток/лунку). Для стимуляции пролиферации клеток ТР-1 использовали конечную концентрацию 0,3 нг/мл Л6М-С8Р. Для нейтрализации 6М-С8Р-зависимой пролиферации очищенный РРР соответствующих фрагментов человеческого антитела против СМ-С8Р диализовали против 1хРВ8 при 25°С в течение 2 ч. 10 мкл диализовали и белковый раствор, подвергнутый стерилизующей фильтрации (0,22 мкм фильтр), добавляли к 100 мкл раствора, содержащего ТР-1 и Л6М-С8Р.
После инкубации в течение 72 ч при 37°С в 5% С02 определяли пролиферативный статус клеток ТР-1 с помощью колориметрического анализа, основанного на расщеплении тетразолиевых солей (ЭД8Т1, Косйе) митохондриальной дегидрогеназой в жизнеспособных клетках. Формазановый краситель, образуемый метаболически активными клетками, количественно оценивали путем измерения его абсорбции с помощью ЕИ8А-ридера при 450 нм.
Ингибирование пролиферации клеток ТР-1, зависимой от СМ-С8Р человека, тестируемыми репрезентативными фрагментами человеческого антитела против СМ-С8Р человека, варьировало по силе (фиг. 9). В то время как два таких фрагмента не имели нейтрализующего эффекта ЦсГ' Р и 8сРν Ь), пять конструкций (8сРν 1, 8сРν К, 8сРν М, 8сРν N и 8сРν Н) показывали промежуточное ингибирование и семь конструкций (8сРν В, 8сРν Ι, 8сРν Е, 8сРν Ό, 8сРν 6, 8сРν С, 8сРν А) показывали сильное ингибирование СМ-С8Р-зависимой пролиферации клеток ТР-1. Недостаток или более низкий уровень нейтрализующего эффекта мог быть обусловлен более низким уровнем экспрессии конкретных репрезентативных 8сРν или менее стабильным комплексом, образующимся между конкретным репрезентативным 8сРν и ЛСМ-С8Р в течение 72-часового периода инкубации при 37°С.
Пример 7.2. Количественная оценка нейтрализующего потенциала определенных репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Р человека, измеренная с помощью пролиферации клеток.
Выбранные репрезентативные молекулы 8сРν, которые, как было показано выше, показывают силь
- 29 017420 ное ингибирование пролиферации ТЕ-1, затем подвергали количественному анализу эффективности нейтрализации. С этой целью использовали ту же клеточную линию ТЕ-1, зависимую от СМ-С8Е человека (Р8М2 АСС 334). Клетки ТЕ-1 культивировали и готовили для анализа пролиферации, как подробно описано выше в примере 7.1. Для стимуляции пролиферации клеток ТЕ-1 использовали конечную концентрацию Г11СМ-С8Е 0,3 нг/мл. Для нейтрализации СМ-С8Е-зависимой пролиферации к раствору, содержащему 100 мкл ТЕ-1 и ГЙСМ-С8Е, добавляли в серии разведений 10 мкл очищенных образцов репрезентативных человеческих нейтрализующих моноклональных антител или их фрагментов против СМС8Е человека. Конечные концентрации белка варьировали от 10 мкг/мл до 10 пг/мл.
Образцы инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 72 ч. Через 72 ч определяли пролиферативный статус клеток ТЕ-1, как описано выше в примере 7.1. Данные аппроксимировали для полумаксимального ингибирования пролиферации (1С50), используя аппроксимацию нелинейной кривой регрессии с помощью программы Ргйш.
Очевидный эффект нейтрализации СМ-С8Е, наблюдаемый в качественном эксперименте по ингибированию пролиферации, описанном в примере 7.1 выше, можно было подтвердить и количественно оценить. Все протестированные 5сЕу-фрагменты человеческих моноклональных нейтрализующих антител против СМ-С8Е человека демонстрировали в этом эксперименте по ингибированию пролиферации константу полумаксимального ингибирования (1С50) в наномолярном интервале. Можно было установить четкое ранжирование эффективности нейтрализации, как видно на фиг. 10А.
Протестированные человеческие моноклональные нейтрализующие антитела 1дС против СМ-С8Е человека демонстрируют значительно более высокую эффективность нейтрализации, чем их 5сЕу аналоги. Константа полумаксимального ингибирования молекул 1дС, полученных в этом эксперименте, находилась в субнаномолярном интервале. Как можно видеть на фиг. 10В, 1С50, оцениваемая для 1дС А, составляла 0,9 нМ, и 1дС В имел 1С50 0,3 нМ.
Для того чтобы проверить, соответствуют ли фрагменты антител хсЕу, полученные из 1дС А и В (8сΡν О и Р соответственно), количественно по их нейтрализующему потенциалу фрагментам 8сΡν А и В, выполнили аналогичные анализы нейтрализации ТЕ-1, как описано выше, за исключением использования в качестве тестируемых молекул 8сΡν О и Р. Данные результаты показаны на фиг. 10С и 10Ό для 8сΡν Р и О соответственно. Как можно увидеть на фиг. 10Ό, 8сΡν О имеет такой же нейтрализующий потенциал, как и 8сΡν А, что показывает, что реконверсия из 1дС обратно в формат 8сΡν возможна без потери биологической активности.
Пример 7.3. Количественная оценка нейтрализующего потенциала определенных репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против ЛСМ-С8Е, измеренная с помощью снижения продукции Ш-8.
Этот эксперимент проводили для количественной оценки нейтрализующей активности репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Е человека путем измерения СМ-С8Езависимой продукции 1Ь-8 клетками И-937. Антиген СМ-С8Е, используемый в вышеупомянутых экспериментах, представлял собой Г11СМ-С8Е. Моноцитарные клетки И-937 культивировали в среде ВРМ1 1640 Οί^ο (не содержит Ь-глутамин, феноловый красный), дополненной 10% инактивированной нагреванием ЕС8, как описано дистрибьютером (Реийсйе 8атт1ипд νοη М^к^οο^даш8теη ипй 2е11ки1!игеп СтЬН, Вгаип8скете1д, Германия). Клетки выращивали до плотности клеток 1х 106 клеток/мл.
При проведении анализа ингибирования, основанного на измерении продукции 1Ь-8, клетки собирали центрифугированием при 300хд в течение 4 мин и ресуспендировали до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл в ВРМ1 1640, 10% ЕС8. 1,8х105 клеток/лунку (180 мкл клеточной суспензии) высевали в лунку плоскодонного планшета для культур клеток М1сго!еб!. Для стимуляции продукции 1Ь-8 клетками И-937 использовали конечную концентрацию Г11СМ-С8Е 1 нг/мл. К 180 мкл клеток И-937 и раствора Г11СМ-С8Е в серии разведений добавляли 20 мкл очищенного 8сΡν или 1дС, что давало конечные концентрации белка, варьирующие от 10 мкг/мл до 10 пг/мл.
После инкубации в течение 18 ч при 37°С и 5% СО2 клетки осаждали центрифугированием культуральных планшетов при 600хд в течение 2 мин. Культуральные супернатанты собирали с помощью пипетки в новый планшет и анализировали для определения в них концентрации 1Ь-8 с использованием набора Ор1Е1А Нитап 1Ь-8 ЕЫ8А (ВесЮп Ωχΐ^ι·^!·! апй Готраму).
Определение с помощью ЕЫ8А осуществляли согласно инструкциям производителя. Кратко, 50 мкл иммобилизованного антитела, разведенного в 0,1М карбоната натрия, рН 9,5, наносили на планшеты для микротестирования в течение ночи при 4°С. После промывки 3 раза РВ8/0,05% Т\гееп 20, блокировали лунки 200 мкл РВ8/ 10% ЕС8 на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре с последующими промывками 3 раза РВ8/0,05% Тетееп 20. Затем в лунки добавляли 50 мкл образцов культурального супернатанта и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Для последующей количественной оценки концентрации 1Ь-8 осуществляли последовательное разведение стандарта 1Ь-8, предоставленного производителем, в течение данной процедуры.
После промывки 5 раз РВ8/0,05% Тетееп 20 осуществляли определение с использованием 50 мкл рабочего детектора (определение АЬ+Ау-НВР), предоставленного в наборе Ор!Е1А Нитап 1Ь-8 ЕЫ8А.
- 30 017420
После 1 ч инкубации при комнатной температуре лунки промывали еще 7 раз. Сигнал проявляли путем добавления раствора субстрата ОРБ (81дта) и определяли при длине волны 490 нм (используя эталонную длину волны 620 нм).
Строили стандартную кривую 1Ь-8 для калибровки и концентрацию 1Ь-8 в образцах культуральных супернатантов рассчитывали согласно этой калибровочной кривой. Данные аппроксимировали для полумаксимального ингибирования продукции 1Ь-8 (1С50) с использованием аппроксимации нелинейной кривой регрессии с помощью программы Рпкт.
Все протестированные репрезентативные фрагменты человеческих моноклональных нейтрализующих антител против гкСМ-С8Б показывали очевидное ингибирование СМ-С8Б-зависимой продукции 1Ь8 клетками И-937. как можно ясно видеть по снижению концентрации 1Ь-8 при увеличении концентрации ксБу на фиг. 11. Ранжирование по эффективности нейтрализации. наблюдаемое в этом эксперименте. согласуется с ранжированием. полученным при тестировании таких же молекул на их нейтрализующий эффект в эксперименте по ингибированию пролиферации ТБ-1. описанном выше.
Следует отметить. что значения 1С50. определенные в этом эксперименте. выше при сравнении со значениями. полученными для таких же молекул в предыдущем эксперименте по пролиферации ТБ-1. Это обусловлено более высокой концентрацией СМ-С8Б. необходимой для стимуляции продукции 1Ь-8 клетками И-937. чем концентрация. необходимая для стимуляции ТБ-1.
Пример 7.4. Количественная оценка нейтрализующего потенциала репрезентативных человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Б человека на рекомбинантном СМ-С8Б макак. измеренная с помощью пролиферации клеток.
Целью этого эксперимента была демонстрация нейтрализующей способности соответствующих человеческих антител и их фрагментов против СМ-С8Б человека в отношении СМ-С8Б из нечеловекообразных приматов семейства макак (тасСМ-С8Б).
Для демонстрации нейтрализующего эффекта селектированных молекул ксБу и 1дС на тасСМ-С8Б провели эксперимент по ингибированию пролиферации согласно протоколу. описанному в примерах 7.1 и 7.2. используя тасСМ-С8Б вместо НСМ-С8Б. И НСМ-С8Б. и тасСМ-С8Б стимулируют пролиферацию клеток ТБ-1 с такой же полумаксимальной эффективностью (ЕС50). Конечную концентрацию 3 нг/мл тасСМ-С8Б использовали для стимуляции пролиферации клеток ТБ-1 в эксперименте. тестирующем молекулы ксБу. и 0.3 нг/мл гкСМ-С8Б использовали в эксперименте. тестирующем 1дС В в качестве репрезентативного человеческого антитела против СМ-С8Б. Для того чтобы нейтрализовать пролиферацию клеток ТБ-1. 10 мкл очищенного человеческого антитела или его фрагмента против СМ-С8Б человека добавляли к 100 мкл раствора ТБ-1 и тасСМ-С8Б в серии разведений. Конечные концентрации белка варьировали от 10 мкг/мл до 10 пг/мл. Образцы инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 72 ч. Через 72 ч определяли пролиферативный статус клеток ТБ-1. как описано в примерах 7.1 и 7.2. Данные аппроксимировали для полумаксимального ингибирования пролиферации (1С50) с использованием аппроксимации нелинейной кривой регрессии с помощью программы Рпкт.
Как видно на фиг. 12А. определенные репрезентативные фрагменты человеческих моноклональных антител против СМ-С8Б человека также демонстрировали явный нейтрализующий потенциал в отношении тасСМ-С8Б (ксБу В. ксБу Е. ксБу С. ксБу I. ксБу А). Кроме того. как можно видеть на фиг. 12В. возрастающие концентрации репрезентативного человеческого моноклонального антитела 1дС В против СМ-С8Б человека явно приводили к снижению пролиферации ТБ-1. демонстрируя нейтрализующий потенциал этого антитела. Интересно. что значение 1С50. полученное в этом эксперименте для 1дС В (0.3 нМ) с использованием тасСМ-С8Б для индукции пролиферации клеток ТБ-1. равно значению. полученному в эксперименте с использованием НСМ-С8Б. демонстрируя явную перекрестную реактивность 1дС В в отношении СМ-С8Б у этих видов.
Пример 8. Перекрестная реактивность 1дС В с СМ-С8Б из разных видов.
Перекрестную реактивность 1дС В с СМ-С8Б из разных видов. не являющихся человеком. исследовали для идентификации видов. подходящих для последующих исследований ίη у1уо. В первой группе экспериментов тестировали связывание 1дС В с имеющимися в продаже рекомбинантными СМ-С8Б человека (Лейкин®. Вег1ех). свиньи. собаки. крысы (В&Б 5>ук1етк. \У1екЬайеп. Германия) и мыши (8(га(Нтапп Вю1ес11. НатЬигд. Германия) в ЕЫ8А-эксперименте. Конкретно. планшет для ЕЫ8А покрывали 1 мкг/мл СМ-С8Б из разных упомянутых видов. 1дС В добавляли в серии разведений и определяли с использованием антитела против человеческого 1дС1. конъюгированного с пероксидазой хрена. ЕЫ8А проявляли путем добавления раствора субстрата ОРБ (о-фенилендиамин. ОРБ. желто-оранжевый при реакции с пероксидазой) (Воске. Германия) и осуществляли измерение при 490 нм.
Как видно на фиг. 13. 1дС В продемонстрировал надежное связывание с рекомбинантным человеческим СМ-С8Б. тогда как СМ-С8Б из других протестированных видов не распознавался. Свинья. собака. крыса или мышь. следовательно. не могут быть подходящими видами для тестирования ш у1уо. Однако как видно выше в примере 7.4. 1дС В демонстрирует заметную перекрестную реактивность с тасСМС8Б (из макака-крабоеда. Масаса Баксюи1апк). что наводит на мысль о применимости по меньшей мере одного вида обезьян из семейства макак для исследований 1дС В ш у1уо.
Пример 9. Связывание 1дС В с различно гликозилированными вариантами СМ-С8Б.
- 31 017420
Целью этого эксперимента было определение степени, до которой связывание 1дС В с СМ-С8Р зависит от картины гликозилирования последнего. С этой целью серии разведений кондиционированной среды, содержащей природный 1СМ-С8Р (человеческое гликозилирование), а также рекомбинантный 1СМ-С8Р из Е. сок (нет гликозилирования) и дрожжей (дрожжевое гликозилирование), а также рекомбинантный СМ-С8Р макака тестировали на их способность индукцировать пролиферацию ТР-1.
Человеческий гликозилированный СМ-С8Р получали из культурального супернатанта клеток ВЕА8-2В, обработанных ΙΗ-1β (человеческие клетки легкого, полученные от АТСС СКЬ-9609). Клетки ВЕА8-2В размножали в среде ВЕВМ, замещенной набором ВЕСМ Ви11е! (СатЬгех, УеМега, Ве1дшт), но культивировали в КРМ1 1640, 10% РС8 в присутствии 50 нг/мл ΙΗ-1 β (81га11тапп Вю!еск, НатЬигд, Германия) для индууции продукции СМ-С8Р. После 48-часовой инкубации при 37°С, 5% СО2, культуральный супернатант анализировали на содержание в нем СМ-С8Р с использованием набора для ЕЫ8А Ор1Е1Л Нитап СМ-С8Р (ВБ Вюкшепсек, Не1бе1Ьегд, Германия) согласно инструкциям производителя.
Рекомбинантный 1СМ-С8Р из Е. сой продуцировался внутри, как представлено в примере 1.1 ХУО 2005/105844. Рекомбинантный 1СМ-С8Р из дрожжей получали из коммерческого источника под торговым наименованием Лейкин (Вег1ех, И8А). СМ-С8Р макака рекомбинантно продуцировали в клетках НЕК293.
Серию разведений кондиционированной среды, содержащей природный 1СМ-С8Р, а также рекомбинантный 1СМ-С8Р из Е. со11 и дрожжей и СМ-С8Р макака, сначала тестировали на их способность индуцировать пролиферацию ТР-1. Все три варианта гликозилирования СМ-С8Р человека и СМ-С8Р макака показывали очень сходные значения ЕС50 для активации ТР-1. Они составляли 10 пг/мл для 1СМС8Р, продуцируемого Е. со11, 15 пг/мл для 1СМ-С8Р, продуцируемого дрожжами, 36 пг/мл для 1СМС8Р, продуцируемого клетками легкого человека, и 11 пг/мл для СМ-С8Р макака, соответственно (фиг. 14А).
Затем определяли нейтрализующую активность 1дС В в присутствии 0,3 нг/мл рекомбинантного 1СМ-С8Р или 0,2 нг/мл физиологического 1СМ-С8Р. Через 72 ч пролиферативный статус клеток ТР-1 в присутствии разных концентраций 1дС В количественно оценивали с помощью колориметрической реакции (фиг. 14Б).
Взятые вместе эти данные, показанные на фиг. 14, демонстрируют, что СМ-С8Р-зависимая пролиферация клеток ТР-1, ингибируемая 1дС В в субнаномолярных концентрациях, по-видимому, не зависит от картины гликозилирования СМ-С8Р человека. Следовательно, картина гликозилирования СМ-С8Р человека не оказывает существенного влияния на способность 1дС В нейтрализовать активность СМС8Р.
Пример 10. Влияние 1дС В на биологические активности СМ-С8Р на эозинофилах.
Пример 10.1. Влияние 1дС В на СМ-С8Р-опосредованное выживание эозинофилов.
Одной из многих биологических активностей СМ-С8Р является продление выживания эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов. Так как воспалительные заболевания легких связаны с локальным накоплением эозинофилов, которые играют существенную роль в поддержании воспаления, протестировали эффективность 1дС В в ингибировании СМ-С8Р-опосредованного выживания эозинофилов.
Эозинофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров путем элиминации СБ16+ нейтрофилов из популяции гранулоцитов, полученной центрифугированием в градиенте плотности, и лизиса эритроцитов. Свежевыделенные эозинофилы периферической крови высевали с плотностью 5х104 клеток/лунку в ВРМ1 1640/10% РС8 и пенициллин/стрептомицин в 96-луночные плоскодонные планшеты для микротестов. СМ-С8Р добавляли в серии разведений, варьирующих от 33 нг/мл до 10 пг/мл для мониторинга выживания эозинофилов, зависимого от концентрации. Для анализа ингибирующего потенциала 1дС В на СМ-С8Р-зависимое выживание эозинофилов добавляли антитело в серии разведений, варьирующих от 10 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Для воздействия на выживание эозинофилов использовали конечную концентрацию СМ-С8Р 0,1 нг/мл. После инкубации в течение 72 ч при 37°С, 5% СО2 добавляли реагент \У8Т-1. Полученную в результате колориметрическую реакцию, соответствующую части жизнеспособных клеток, количественно оценивали путем измерения поглощения при 450 нм. Данные анализировали и аппроксимировали для полумаксимального ингибирования выживания (1С50), используя аппроксимацию нелинейной кривой регрессии с помощью программного пакета Ргйт. Как видно на фиг. 15 А, определили полумаксимальную эффективную дозу (ЕС50) ЛСМ-С8Р, составляющую 0,02 нг/мл. Как видно на фиг. 15В, наблюдали мощный нейтрализующий эффект 1дС В с полумаксимальным ингибированием выживания эозинофилов при концентрации антитела 0,13 нМ.
Эти данные указывают на то, что 1дС В эффективен при ингибировании СМ-С8Р-зависимого выживания эозинофилов дозозависимым образом.
Пример 10.2. Влияние 1дС В на СМ-С8Р-индуцированную активацию эозинофилов.
Также было желательным исследовать влияние 1дС В на СМ-С8Р-индуцированную активацию эозинофилов. Обнаружили, что экспрессия СБ69 подвергается повышающей регуляции на периферических эозинофилах (СБ16-), выделенных из крови человека после стимуляции в течение 20 ч или 3 суток (а) 0,1 нг/мл СМ-С8Р или (б) 0,1 нг/мл СМ-С8Р, 1Ь-3 и 1Ь-5, но не с (в) 0,1 нг/мл только 1Ь-3 и 1Ь-5 (фиг. 16А).
- 32 017420
Эозинофилы, культивируемые в присутствии только среды, не демонстрировали повышающей регуляции Γ.Ό69. Следовательно, СЭ69 можно взять в качестве маркера активации эозинофилов СМ-С8Е, и уровень экспрессии Γ.Ό69 отслеживали как показатель СМ-С8Е-зависимой активации эозинофилов. В оба момента времени (20 ч и 3 суток) 1дС В (10 мкг/мл) практически полностью предотвращал СМ-С8Езависимую активацию эозинофилов, что видно по отсутствию экспрессии СЭ69 при проточной цитометрии.
Эозинофилы выделяли, как описано выше в примере 10.1, и культивировали при плотности 5х105 клеток/лунку в КРМ1 1640/10% ЕС8 и пенициллин/стрептомицин в 48-луночном плоскодонном планшете для микротестов. Клетки инкубировали только со средой или в присутствии только 0,1 нг/мл СМ-С8Е или совместно с 0,1 нг/мл 1Ь-3 и 1Ь-5. 10 мкг/мл 1дС В использовали для нейтрализации СМ-С8Е. После инкубации в течение 1 или 3 суток клетки анализировали на экспрессию Γ.Ό69 с помощью проточной цитометрии.
Определение Γ.Ό69 с помощью проточной цитометрии.
Экспрессию СЭ69 на эозинофилах определяли на установке ЕАС8 СаНЬиг (ВеСоп Пккшкоп). 105 клеток инкубировали с 5 мкл антитела против человеческого СЭ16. конъюгированного с МТС (клон 3С8, ВО Вюкаепсек), и антитела против человеческого СЭ69. конъюгированного с РЕ (клон ΕΝ50, ВО ВюксГ епсек), с каждым в течение 1 ч при 4°С. В качестве отрицательного контроля использовали нерелевантные, соответствующие по изотипу МТС- и РЕ-конъюгированные антитела. После инкубации клетки дважды промывали РВ8, 1% ЕС8, 0,05% №Ν3 и ресуспендировали в 250 мкл РВ8, 1% ЕС8, 0,05% №Ν3. Непосредственно перед ЕАС8 анализом добавляли йодистый пропидий до конечной концентрации 1 мкг/мл для того, чтобы пометить мертвые клетки. Интерпретацию данных осуществляли с использованием программы Се110ие81Рго (ВО Вюкаепсек). Окрашиваемые йодистым пропидием (т.е. мертвые) клетки исключали из анализа экспрессии Γ.Ό69.
1дС В также снижал процентное содержание живых и активированных эозинофилов при мониторинге путем окрашивания йодистым пропидием клеток ί.Ό16-/ί.Ό69' в присутствии 0,1 нг/мл СМ-С8Р. 1дС В снижал процентное содержание активированных клеток от 35 до 8% через 1 сутки и от 43 до 3% через 3 суток после культивирования. В присутствии 0,1 нг/мл СМ-С8Р, 1Ь-3 и 1Ь-5 процентное содержание живых и активированных эозинофилов снижалось от 32 до 8% и от 48 до 11% после 1 и 3 суток соответственно. Даже несмотря на то, что повышающая регуляция Γ.Ό69 полностью ингибировалась 1дС В, более высокие количества эозинофилов в состоянии покоя (ί.Ό16-/ί.Ό69') выживали в течение 3 суток в присутствии 0,1 нг/мл СМ-С8Р, 1Ь-3 и 1Ь-5 по сравнению с клетками, инкубируемыми со средой или только с СМ-С8Р (фиг. 16А, последний столбец). То же самое наблюдали для клеток, инкубируемых в присутствии 0,1 нг/мл 1Ь-3 плюс 1Ь-5.
В экспериментах по нахождению дозы 1дС В добавляли в серии разведений к эозинофилам, культивируемым в присутствии 0,1 нг/мл СМ-С8Р (фиг. 16В). Ингибирующий эффект 1дС В на СЭ69зависимую среднюю интенсивность флуоресценции (МЕ1) наблюдали с полумаксимальной концентрацией 1дС В 0,22 нМ.
При совместном рассмотрении эти данные указывают на то, что 1дС В является эффективным нейтрализатором активности СМ-С8Р в биологическом контексте, весьма релевантном для воспалительных заболеваний дыхательных путей, например, астмы.
Пример 11. Предварительные исследования токсичности ех νί\Ό с использованием 1дС В.
Как объяснено выше, нейтрализация активности СМ-С8Р может быть терапевтически полезной при целом ряде болезненных состояний. Однако в то же время СМ-С8Р играет важную роль в нормальной функции иммунной системы при борьбе с экзогенными патогенами, например, как это происходит при фагоцитозе нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами. Эта природная функция нейтрофилов и моноцитов должна оставаться не подверженной воздействию в присутствии терапевтических количеств 1дС В. Поэтому авторы изобретения исследовали два аспекта процесса фагоцитоза: 1) поглощение бактерий (фагоцитоз) и 2) активность окислительного взрыва (свидетельствующая о внутриклеточном киллинге). Эти исследования подробно описаны в следующих примерах.
Пример 11.1. Поглощение бактерий (фагоцитоз).
Определение фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов в гепаринизированной цельной крови осуществляли с использованием набора Р11адо1ек1. произведенного Огредеп (Не1йе1Ьегд, Германия). Этот тест основан на поглощении опсонизированных, флуоресцентно меченых клеток Е. сой фагоцитами. Эти клетки затем можно определить по зеленой флуоресценции при проточной цитометрии. 20 мкл флуоресцеинмеченых опсонизированных клеток Е. со11 добавляли к 100 мкл гепаринизированной цельной крови и инкубировали при 37°С. В качестве отрицательного контроля осуществляли инкубацию при 0°С. Через 10 мин процесс фагоцитоза останавливали путем охлаждения образцов на льду и добавления 100 мкл гасящего раствора (Огредеп). Этот раствор позволяет различать прикрепление и интернализацию бактерий путем гашения Е1ТС-флуоресценции бактерий, связанных на поверхности, тогда как флуоресценция интернализованных частиц не подвергается воздействию. После трех стадий промывки 3 мл раствора для промывки (Огредеп) эритроциты лизировали. Оставшиеся лейкоциты один раз промывали 3 мл раствора для промывки (Огредеп). После добавления 200 мкл раствора для окрашивания ДНК, который
- 33 017420 обеспечивает исключение агрегированных бактерий или клеток, анализировали клетки с помощью проточной цитометрии. Процентное содержание клеток, осуществивших фагоцитоз, определяли посредством Р1ТС-флуоресценции.
Для определения влияния 1дС В на фагоцитоз в три идентичных образца крови добавляли 1дС В до конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем эти три образца оставляли инкубироваться при 37°С с 1дС В в течение разных периодов времени перед добавлением Е. отК. В первый образец добавляли Е. отй немедленно, тогда как во второй и в третий образец добавляли Е. отЯ соответственно, через 24 и 48 ч.
Результаты, наблюдаемые для гранулоцитов: непосредственно после взятия крови свыше 98% гранулоцитов поглощали бактерии как в присутствии, так и в отсутствие 1дС В (фиг. 17 А). После инкубации образцов крови с 1дС В в течение 24 ч определяли снижение до примерно 92% без 1дС В и до 90% в присутствии 1дС В (фиг. 17В). Через 48 ч 81% гранулоцитов были положительными в отношении фагоцитоза в отсутствие и 89% - в присутствии 1дС В (фиг. 17С).
Результаты, наблюдаемые для моноцитов: независимо от того, присутствует 1дС В или нет, непосредственно после взятия крови 98% моноцитов были фагоцитирующими (фиг. 18А). После 24 ч предынкубации с 1дС В 90% моноцитов были положительными (фиг. 18В). После 24 ч предынкубации без 1дС В такими были 92% моноцитов. Авторы изобретения обнаружили, что через 48 ч 81% моноцитов без 1дС В и 89% с 1дС В были положительными в отношении фагоцитоза (фиг. 18В).
Пример 11.2. Окислительный взрыв.
Определение активности окислительного взрыва гранулоцитов и моноцитов в гепаринизированной цельной крови осуществляли с использованием набора РйадοЬи^8ΐ от Огредег1 (Не1бе1Ьегд, Германия). Этот анализ позволяет определять процентное содержание фагоцитирующих клеток, которые продуцируют реакционноспособные окислители, путем окисления субстрата дигидрородамина (ΌΗΚ) 123 до флуоресцентного Я 123. Клетки, демонстрирующие активность окислительного взрыва, можно идентифицировать при проточной цитометрии. Гепаринизированную кровь инкубировали с разными стимулами для индукции активности окислительного взрыва: с форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) в качестве сильного стимула; с немечеными, опсонизированными клетками Е. отй в качестве промежуточного стимула и с хемотаксическим пептидом №формил-Ме1ЬеиРйе (ГМРЬ) в качестве слабого стимула. 100 мкл цельной крови инкубировали с этими стимулами при 37°С. В качестве отрицательного контроля осуществляли инкубацию без стимуляции. После 10 мин инкубации добавляли раствор субстрата ΌΗΚ 123 и осуществляли инкубацию в течение еще 10 мин. ΌΗΚ 123 превращается окисляющими клетками в флуоресцентный Я 123. После трех стадий промывки 3 мл раствора для промывки (Огредей) эритроциты лизировали. Оставшиеся лейкоциты промывали один раз 3 мл раствора для промывки (Огредей). После добавления 200 мкл раствора для окрашивания ДНК, что обеспечивает исключение агрегированных бактерий или клеток, анализировали клетки с помощью проточной цитометрии.
Для определения влияния 1дС В на окислительный взрыв, к трем идентичным образцам крови добавляли 1дС В в конечной концентрации 10 мкг/мл. Каждый из этих трех образцов затем делили на три аликвоты и давали им инкубироваться при 37°С в течение разного периода времени перед добавлением к отдельным аликвотам Е. отЯ ГМЬР или РМА. Е. отЯ ГМЬР или РМА добавляли к трем аликвотам первого образца немедленно, тогда как Е. отЯ ГМЬР или РМА добавляли к трем аликвотам второго и третьего образца, соответственно, через 24 и 48 ч. Параллельные образцы крови, не содержащие 1дС В, обрабатывали идентично тому, как это описано выше для контролей. Результаты показаны ниже в табл. 4, где + во втором столбце слева указывает на то, что 1дС В присутствует в тестируемой аликвоте образца, и - во втором столбце слева указывает на контроль, не содержащий 1дС В.
Таблица 4
Влияние 1дС В на поведение гранулоцитов, связанное с окислительным взрывом
Момент времени 1дсв Процент окисляющих гранулоцитов после стимуляции... Результаты показаны на ...
Ε.οοΙί ίΜΙ Ρ РМА
0ч - 97 9 99 Фиг. 17ϋ
+ 94 10 99
24 ч - 82 8 97 Фиг. 17Е
+ 80 10 95
48 ч - 68 6 64 Фиг. 17Е
4- 71 5 64
Аналогичные результаты получали при использовании моноцитов вместо гранулоцитов. Данный эксперимент осуществляли аналогично эксперименту, описанному выше, и результаты показаны ниже в табл. 5, где + во втором столбце слева указывает на то, что 1дС В присутствует в тестируемой аликвоте образца, и - во втором столбце слева указывает на контроль, не содержащий 1дС В.
- 34 017420
Таблица 5
Влияние 1дС В на поведение моноцитов, связанное с окислительным взрывом
Момент времени |д<з в Процент окисляющих моноцитов после стимуляции ... Результаты показаны на ...
Е.соН (ΜίΡ РМА
Оч - 62 0 79 Фиг. 18ϋ
+ 57 1 81
24 ч - 30 4 35 Фиг. 18Е
+ 26 6 28
48 ч - 29 4 17 Фиг. 18Р
+ 28 3 14
Поэтому в целом можно заключить, что присутствие 1дС В при физиологически релевантных температурах не оказывает вредного воздействия на фагоцитоз или окислительный киллинг бактерий как гранулоцитами, так и моноцитами. Тогда, в контексте ίη уьуо, эти результаты говорят о том, что не ожидается, что терапевтическое введение 1дС В окажет вредное воздействие на нормальные иммунные защитные механизмы пациента.

Claims (45)

1. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Т (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, область СИК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 17, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 14, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1.
2. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Т приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 16, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 17, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 14, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2.
3. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Т приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 16, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 17, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 14, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: З.
4. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Т приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 16, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 17, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 14, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 4.
5. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Т приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 16, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 17, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 14, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15, и область СИКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 5.
- З5 017420
6. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СГОКЕ содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8ЕО ГО N0: 16, область СОК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 6.
7. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СТОК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 7.
8. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 8.
9. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 9.
10. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 10.
11. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 11.
12. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 16, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 17, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭК1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 14, область СПК2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ГО N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последова
- 36 017420 тельность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 12.
13. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Р приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СОВ1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 16, область СОВ2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 17, и область СОВ3, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭКЕ содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, область СОРТ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 13.
14. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с СМ-С8Е приматов и нейтрализуют его, содержащее в вариабельной области его легкой цепи область СОВ1, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 16, область СОВ2, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 17, и область СОВ3, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 18; и содержащее в вариабельной области его тяжелой цепи область СЭВЕ содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 14, область СОРТ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 15, и область СОКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 56.
15. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-14, где указанный примат представляет собой человека или примата, не являющегося человеком.
16. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по п.15, где указанный примат, не являющийся человеком, представляет собой макака-крабоеда, макака-резуса или гиббона.
17. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-16, где указанное антитело представляет собой ЦС.
18. Человеческое моноклональное антитело по п.17, где указанный Ι§0 представляет собой !дС 1 или Ιβ64.
19. Фрагмент человеческого моноклонального антитела по любому из пп.1-16, где указанный фрагмент представляет собой ксЕу, однодоменное антитело, Εν, УНН антитело, диатело, тандемное диатело, ЕаЬ, ЕаЬ' или Е(аЬ)2.
20. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-19, где указанное человеческое моноклональное антитело или его фрагмент специфически связываются с эпитопом, предпочтительно с прерывистым эпитопом, СМ-С8Е примата, содержащим аминокислоты 23-27 (ВВББН) и/или аминокислоты 65-77 (СБВ/0С8БТКБКСРБ).
21. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по п.20, где указанный прерывистый эпитоп дополнительно содержит аминокислоты 28-31 (Ь8КЭ).
22. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по п.20 или 21, где указанный прерывистый эпитоп дополнительно содержит аминокислоты 32-33 (ТА) и/или аминокислоты 21-22 (ЕА).
23. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 35.
24. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 36.
25. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 37.
26. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 38.
27. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 39.
28. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 40.
29. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 41.
30. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 42.
- 37 017420
31. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8ЕО ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 43.
32. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 44.
33. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 45.
34. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 46.
35. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 47.
36. Человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0: 48.
37. Человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-14, где указанное человеческое моноклональное антитело или его фрагмент содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную гомологию с соответствующей аминокислотной последовательностью, как представлено в любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56.
38. Полинуклеотидная молекула, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56, или нуклеотидную последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 70%-ную гомологию с ней, где гомологию можно определить путем сравнения полинуклеотидной молекулы, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56, с молекулой полинуклеотида, имеющей рассматриваемую нуклеотидную последовательность, путем выравнивания последовательностей, где нуклеотид в рассматриваемой последовательности считается гомологичным, если он либо является идентичным соответствующему нуклеотиду в нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56, либо если одно или более чем одно нуклеотидное(ые) отклонение(я) в рассматриваемой последовательности от одного или более чем одного соответствующего нуклеотида(ов) в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность любой из 8Е0 ΙΌ N0: 118 и/или 56, приводит к образованию триплета нуклеотидов, который при трансляции дает аминокислоту, которая либо идентична (благодаря вырожденному триплету) соответствующей аминокислоте в соответствующей аминокислотной последовательности любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56, либо является консервативной заменой соответствующей аминокислоты в соответствующей аминокислотной последовательности любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-18 и/или 56.
39. Фармацевтическая композиция, содержащая человеческое моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-37.
40. Фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотидную молекулу по п.38.
41. Применение человеческого моноклонального антитела или его фрагмента по любому из пп.1-37 или полинуклеотидной молекулы по п.38 в изготовлении лекарственного средства, возможно содержащего один или более чем один дополнительный противовоспалительный агент, для лечения воспалительных заболеваний.
42. Применение по п.41, где указанные воспалительные заболевания выбраны из группы, состоящей из ревматоидного артрита (КА) (включая КА, который является устойчивым к лечению нейтрализаторами ТНР (фактор некроза опухолей)-а), астмы, рассеянного склероза (М8), хронического обструктивного заболевания легких (С0РО), острого респираторного дистресс-синдрома (АКЭ8), идиопатического легочного фиброза (ГРР), воспалительного заболевания кишечника (ΙβΌ), увеита, дегенерации желтого пятна, колита, псориаза, Уоллеровской дегенерации, антифосфолипидного синдрома (АР8), острого коронарного синдрома, рестеноза, атеросклероза, рецидивирующего полихондрита (КР), острого или хронического гепатита, неудачного приживления ортопедических имплантатов, гломерулонефрита, волчанки или аутоиммунных расстройств.
43. Применение человеческого моноклинального антитела или его фрагмента по любому из пп.1-37 или полинуклеотидной молекулы по п.38 в изготовлении лекарственного средства, возможно содержащего один или более чем один дополнительный противораковый агент, для лечения опухолевого заболевания или другого состояния с замедленным апоптозом клеток, повышенным выживанием клеток или пролиферацией.
44. Применение по п.43, где указанное опухолевое заболевание представляет собой рак.
45. Применение по п.44, где указанное раковое заболевание представляет собой лейкоз, множест- 38 017420 венную миелому, карциному желудка или карциному кожи.
EA200901500A 2005-04-18 2006-04-18 Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека EA017420B9 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05008410 2005-04-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200901500A1 EA200901500A1 (ru) 2010-10-29
EA017420B1 true EA017420B1 (ru) 2012-12-28
EA017420B9 EA017420B9 (ru) 2013-03-29

Family

ID=37115507

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702008A EA013162B1 (ru) 2005-04-18 2006-04-18 Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека
EA200901500A EA017420B9 (ru) 2005-04-18 2006-04-18 Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702008A EA013162B1 (ru) 2005-04-18 2006-04-18 Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8017748B2 (ru)
EP (2) EP2468774A3 (ru)
JP (1) JP5085533B2 (ru)
KR (2) KR20150091193A (ru)
CN (2) CN103342751B (ru)
AU (1) AU2006237159B2 (ru)
BR (1) BRPI0608281B8 (ru)
CA (1) CA2605402C (ru)
CY (1) CY1116632T1 (ru)
DK (1) DK1874819T3 (ru)
EA (2) EA013162B1 (ru)
ES (1) ES2545769T3 (ru)
HK (2) HK1112003A1 (ru)
HR (1) HRP20150773T1 (ru)
HU (1) HUE025134T2 (ru)
IL (2) IL186486A0 (ru)
ME (1) ME02191B (ru)
MX (1) MX2007012569A (ru)
NO (1) NO344249B1 (ru)
NZ (1) NZ562093A (ru)
PL (1) PL1874819T3 (ru)
PT (1) PT1874819E (ru)
RS (1) RS54127B1 (ru)
RU (2) RU2458071C2 (ru)
SG (1) SG161292A1 (ru)
SI (1) SI1874819T1 (ru)
UA (1) UA94403C2 (ru)
WO (1) WO2006111353A2 (ru)
ZA (1) ZA200708201B (ru)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2545769T3 (es) 2005-04-18 2015-09-15 Amgen Research (Munich) Gmbh Anticuerpos neutralizantes del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano
JP4736037B2 (ja) 2005-10-26 2011-07-27 株式会社イーベック ヒトｇｍ−ｃｓｆに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分
HUE032584T2 (en) 2006-02-08 2017-09-28 Morphotek Inc Antigen GM-CSF peptides and GM-CSF antibodies
WO2008063898A2 (en) * 2006-11-08 2008-05-29 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating idiopathic thrombocytopenia purpura using a gm-csf antagonist
US8398972B2 (en) 2006-11-21 2013-03-19 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating dementia using a GM-CSF antagonist
WO2008097510A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Merck & Co., Inc. Antibodies specific for dkk-1
EP2160407A4 (en) * 2007-05-23 2011-07-27 Crc For Asthma And Airways Ltd NEUTRALIZING ANTIBODIES
TW200918553A (en) * 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
SI2215119T1 (sl) * 2007-11-13 2013-04-30 Evec Inc. Monoklonska protitelesa, ki se veĹľejo na hGM-CSF, in medicinski sestavki, ki jih obsegajo
TWI564021B (zh) * 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
KR101852915B1 (ko) * 2008-04-28 2018-04-27 휴머니건, 아이엔씨. 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자에 대한 항체
EP2279001B1 (en) * 2008-04-29 2015-09-30 Amgen Research (Munich) GmbH Inhibitors of gm-csf and il-17 for therapy
ES2886063T3 (es) * 2008-12-22 2021-12-16 Univ Melbourne Tratamiento de la artrosis
RU2630969C2 (ru) 2008-12-22 2017-09-15 Де Юниверсити Оф Мельбурн Лечение боли
KR20120011883A (ko) * 2009-05-05 2012-02-08 모르포시스 아게 다발성 경화증의 치료
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
AU2012280267B2 (en) 2011-07-06 2016-04-21 Morphosys Ag Therapeutic combinations of anti-cd20 and anti-gm-csf antibodies and uses thereof
WO2013090989A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Csl Limited Method of treating inflammatory bowel disease
US20140004121A1 (en) 2012-06-27 2014-01-02 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2014068029A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Takeda Gmbh Lyophilized formulation comprising gm-csf neutralizing compound
AR093297A1 (es) * 2012-10-31 2015-05-27 Amgen Res (Munich) Gmbh Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf
US20160024200A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-28 John Schrader Human monoclonal antibodies that neutralize bioactivity of granulocyte macrophage colony-stimulating factor and methods and uses thereof
WO2015028666A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Takeda Gmbh Neutralizing antibody or a fragment thereof specifically binding primate gm-csf for use in the treatment and/or prevention of psoriasis
WO2015028657A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Takeda Gmbh Antibodies neutralizing gm-csf for use in the treatment of rheumatoid arthritis or as analgesics
ES2960807T3 (es) 2013-10-11 2024-03-06 Us Health Anticuerpos contra TEM8 y su uso
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
JP6769879B2 (ja) * 2014-05-07 2020-10-14 タケダ・ゲー・エム・ベー・ハーＴａｋｅｄａ ＧｍｂＨ Ｇｍ−ｃｓｆ中和化合物を含む液体製剤
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
WO2016079276A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist and an anti-ccr2 antagonist in the treatment of an infectious disease
WO2016079277A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist in the treatment of an infectious disease
KR20170140180A (ko) 2015-02-24 2017-12-20 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도
GB201503139D0 (en) * 2015-02-25 2015-04-08 Univ Leicester Diagnostic and therapeutic target
PL3271389T3 (pl) 2015-03-20 2020-08-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizujące przeciwciała wiążące się z gp120 i ich stosowanie
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
GB201519331D0 (en) * 2015-11-02 2015-12-16 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Treatment paradigm
US11236152B2 (en) 2015-11-03 2022-02-01 The United States of America, as represented by the Sectetary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 GP41 and their use
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN106872428A (zh) * 2017-02-07 2017-06-20 远见生物科技（上海）有限公司 一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒
US11021535B2 (en) 2017-02-10 2021-06-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP3691663A4 (en) 2017-10-02 2021-08-18 Humanigen, Inc. METHOD OF TREATING IMMUNOTHERAPY ASSOCIATED TOXICITY USING GM-CSF ANTAGONIST
US10899831B2 (en) 2017-10-02 2021-01-26 Humanigen, Inc. Method of reducing the level of non-GM-CSF cytokines/chemokines in immunotherapy-related toxicity
US10927168B2 (en) 2017-10-02 2021-02-23 Humanicen, Inc. Method of reducing tumor relapse rate in immunotherapy by administration of lenzilumab
US11130805B2 (en) 2017-10-02 2021-09-28 Humanigen, Inc. Methods of treating CART-T cell therapy-induced neuroinflammation using a GM-CSF antagonist
US11084888B2 (en) 2017-10-24 2021-08-10 ASM, Inc. Production method for low inclusion rate polyrotaxane
WO2019136029A1 (en) 2018-01-02 2019-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
RU2020130795A (ru) 2018-02-21 2022-03-21 Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эс Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз Нейтрализующие антитела к env вич-1 и их применение
EP3827016A4 (en) * 2018-10-15 2022-05-04 Elixiron Immunotherapeutics (Hong Kong) Limited ANTIBODIES TO GRANULOCYTE AND MACROPHAGE GROWTH FACTOR AND THEIR USES
US11078264B2 (en) 2018-10-17 2021-08-03 University Of Connecticut Inhibiting granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) prevents preterm birth
WO2020132214A2 (en) 2018-12-20 2020-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
US20220227853A1 (en) 2019-05-03 2022-07-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
CN114269783B (zh) 2019-07-02 2024-03-26 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 结合egfrviii的单克隆抗体及其应用
WO2021204649A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Gm-csf antagonists for use in the treatment of severe pulmonary covid-19, cytokine release syndrome and/or acute respiratory distress syndrome
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
MX2023009244A (es) 2021-02-09 2023-09-11 Us Health Anticuerpos contra la proteina espicular de coronavirus.
CN117396502A (zh) 2021-02-09 2024-01-12 佐治亚大学研究基金会有限公司 针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
WO2024138151A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebolavirus (sudan and zaire) antibodies from non-human primates and human vaccinees

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001058459A1 (en) * 2000-02-14 2001-08-16 Mitsubishi Pharma Corporation Remedies for hepatitis c
WO2003068924A2 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Ludwig Institute For Cancer Research Fusion proteins of humanized g250 specific antibodies and uses thereof
US6846634B1 (en) * 1997-10-20 2005-01-25 Domantis Limited Method to screen phage display libraries with different ligands

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8624899D0 (en) * 1986-10-17 1986-11-19 Sandoz Ltd Monoclonal antibodies
US5070013A (en) * 1988-05-31 1991-12-03 Schering Corporation Immunochemical assay for human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
CA2060741A1 (en) * 1991-02-11 1992-08-12 Robert S. Greenfield Gm-csf inhibiting oligopeptides
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
JP4086325B2 (ja) 1997-04-23 2008-05-14 プリュックテュン，アンドレアス 標的分子と相互作用する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の同定方法
IL138857A0 (en) 1998-04-21 2001-10-31 Micromet Ges For Biomedizinisc Cd19xcd3 specific polypeptides and uses thereof
US7157091B1 (en) * 1999-06-18 2007-01-02 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
ATE435238T1 (de) 2004-05-05 2009-07-15 Micromet Ag Herstellung eines einkettigen fv antikörperfragments
ES2545769T3 (es) * 2005-04-18 2015-09-15 Amgen Research (Munich) Gmbh Anticuerpos neutralizantes del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano
PT1888643E (pt) 2005-05-18 2015-01-14 Morphosys Ag Anticorpos anti-fec-gm e as respectivas utilizações
HUE032584T2 (en) 2006-02-08 2017-09-28 Morphotek Inc Antigen GM-CSF peptides and GM-CSF antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846634B1 (en) * 1997-10-20 2005-01-25 Domantis Limited Method to screen phage display libraries with different ligands
WO2001058459A1 (en) * 2000-02-14 2001-08-16 Mitsubishi Pharma Corporation Remedies for hepatitis c
WO2003068924A2 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Ludwig Institute For Cancer Research Fusion proteins of humanized g250 specific antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEIBOER S.H. et al. "Guided selection of a pan carcinoma specific antibody reveals similar binding characteristics yet structural divergence between the original murine antibody and its human equivalent", J. Mol. Biol., 2000 Feb 25; 296(3):833-49, реферат, [найдено 06.05.2010]. Найдено из PubMed PMID: 10677285 *
KANAKURA Y. et al. "Identification of functionally distinct domains of human granu locyte-macrophage colony-stimulating factor using monoclonal antibodies", Blood., 1991, Mar 1; 77(5):1033-43, реферат, [найдено 06.05.2010]. Найдено из PubMed PMID: 1704802 *
VAN DIJK M.A. et al. "Human antibodies as next generation therapeutics", Curr. Орin. Biol., 2001 Aug; 5(4):368-74, реферат, [найдено 06.05.2010]. Найдено из PubMed PMID: 11470598 *
ЛАХТИНА О.Е. и др. "Иммуноферментное определение гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с помощью моноклональных антител", Биоорганическая химия, 1999, т. 25, No. 9, с. 673-678 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL220412A (en) 2017-04-30
KR20080005962A (ko) 2008-01-15
CN103342751B (zh) 2015-12-23
SI1874819T1 (sl) 2015-09-30
CN101184777B (zh) 2013-07-17
DK1874819T3 (en) 2015-08-31
EP2468774A3 (en) 2013-01-02
KR20150091193A (ko) 2015-08-07
PT1874819E (pt) 2015-09-17
KR101704809B1 (ko) 2017-02-08
EP1874819A2 (en) 2008-01-09
EA200901500A1 (ru) 2010-10-29
SG161292A1 (en) 2010-05-27
CN101184777A (zh) 2008-05-21
NZ562093A (en) 2011-01-28
JP2008536505A (ja) 2008-09-11
US8017748B2 (en) 2011-09-13
HUE025134T2 (en) 2016-01-28
RU2007138341A (ru) 2009-05-27
RS54127B1 (en) 2015-12-31
US10138297B2 (en) 2018-11-27
ME02191B (me) 2016-02-20
CY1116632T1 (el) 2017-03-15
IL186486A0 (en) 2008-01-20
RU2012115683A (ru) 2013-10-27
JP5085533B2 (ja) 2012-11-28
WO2006111353A2 (en) 2006-10-26
BRPI0608281A2 (pt) 2009-12-15
HK1190161A1 (zh) 2014-06-27
EP1874819B1 (en) 2015-05-27
ES2545769T3 (es) 2015-09-15
IL220412A0 (en) 2012-07-31
UA94403C2 (ru) 2011-05-10
RU2458071C2 (ru) 2012-08-10
BRPI0608281B1 (pt) 2020-01-28
PL1874819T3 (pl) 2015-10-30
NO344249B1 (no) 2019-10-21
US20120009195A1 (en) 2012-01-12
EA017420B9 (ru) 2013-03-29
BRPI0608281B8 (pt) 2021-05-25
CA2605402C (en) 2017-05-23
HK1112003A1 (en) 2008-08-22
EA200702008A1 (ru) 2008-06-30
AU2006237159A1 (en) 2006-10-26
NO20075802L (no) 2008-01-10
US20160130338A1 (en) 2016-05-12
MX2007012569A (es) 2007-12-06
WO2006111353A3 (en) 2007-04-19
EA013162B1 (ru) 2010-02-26
CA2605402A1 (en) 2006-10-26
AU2006237159B2 (en) 2011-03-24
US20090297532A1 (en) 2009-12-03
US9067993B2 (en) 2015-06-30
ZA200708201B (en) 2008-07-30
CN103342751A (zh) 2013-10-09
HRP20150773T1 (hr) 2015-08-28
EP2468774A2 (en) 2012-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017420B1 (ru) Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека
US20210164011A1 (en) Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
ES2658039T3 (es) Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
JP4833850B2 (ja) Ｉｌ−１７活性阻害による多発性硬化症を治療するための方法
CN107207564A (zh) 靶向xten缀合物组合物及其制备方法
EA022796B1 (ru) Антитело, способное связывать тимусный стромальный лимфопоэтин, нуклеиновая кислота, его кодирующая, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, гибридома, способ получения антитела и его применение
EA028178B1 (ru) Улучшенные связывающие сывороточный альбумин варианты
WO2013185010A1 (en) HUMAN BISPECIFIC EGFRvIII ANTIBODY ENGAGING MOLECULES
CN117715942A (zh) 使用抗体-寡核苷酸缀合物的增强的靶向
CN116249547A (zh) 脑特异性血管生成抑制剂1(bai1)抗体及其用途
WO2024138175A1 (en) Methods of treating acute and chronic graft versus host diseases
KR20140047170A (ko) 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체
CN115803062A (zh) 滋养层细胞表面抗原2(trop-2)抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PD1A Registration of transfer to a eurasian application by order of succession in title
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent