BRPI0608281B1 - anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, seu uso no tratamento de doenças inflamatórias, bem como composição farmacêutica que o compreende - Google Patents

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Abstract

anticorpos neutralizadores de fator estimulador de colónia de granulócitos macrófagos humanos. a presente invenção se refere a um anticorpo monoclonal humano ou fragmento seu que se liga especificamente a gm-csf de primata e o neutraliza.

Description

“ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO OU SEU FRAGMENTO, SEU USO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE” [001] A presente invenção se refere a anticorpos e a seus fragmentos que neutralizam a atividade de fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos. A invenção se refere ainda a composições farmacêuticas que compreendem tais anticorpos e seus fragmentos assim como aos usos de tais anticorpos e de seus fragmentos para a preparação de medicamentos para o tratamento de diversas condições.
[002] Originalmente descrito como um estímulo potente do crescimento e diferenciação de células precursoras de granulócitos e macrófagos in vitro, o fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) é uma glicoproteína de aproximadamente 23 kDa com uma estrutura de quatro feixes helicoidais alfa que se liga a um receptor heterodimérico composto de subunidades que pertencem à família de receptor de citocina do tipo 1. Ele estimula a maturação, dentre outros, de macrófagos, neutrófilos, granu-lócitos, eosinófilos e de células dendríticas apresentadoras de antígeno, para aumentar a sua capacidade funcional de combater infecções. Os experimentos com ablação genética, isto é, experimentos que silenciam ou eliminam o gene de interesse - aqui GM-CSF - em camundongos indicavam que GM-CSF é essencial para a manutenção da atividade funcional de algumas populações de macrófagos, tais como aquelas envol-vidas em eliminar o tensoativo no
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2/124 pulmão e na resposta a determinados tipos de infecção ou respostas imunes.
[003] Embora GM-CSF tenha atividades estimuladoras potentes in vitro sobre células genitoras para neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, e até um ponto menor sobre células eritróides e megacariocíticas, os resultados obtidos in vivo com camundongos com os genes eliminados sugerem que o principal papel fisiológico de GM-CSF consiste em manter ou estimular a atividade funcional de macrófagos e granulócitos maduros e em estimular a apresentação de antígenos ao sistema imune. Ele desempenha esta última função pelos seus efeitos diretos sobre a produção de células dendríticas e de macrófagos, mas também por aumentar a expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II e de receptores Fc em macrófagos ou em células dendríticas.
[004] GM-CSF estimula as atividades funcionais de neutrófilos, eosinófilos e monócitos-macrófagos. Estas incluem o aumento da atividade quimiotática, um aumento da expressão de moléculas de adesão celular e um aumento de adesão a superfícies, e um aumento da atividade fagocítica assim como a inibição e retardo de apoptose destas células. Os neutrófilos representam a primeira linhagem de defesa contra agressões. A morte programada de neutrófilos é retardada por estímulos pro-inflamatórios incluindo GM-CSF para assegurar uma resolução adequada da inflamação no tempo e local. GM-CSF também estimula a capacidade destas células de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
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3/124 e de destruir microorganismos intracelularmente e tem um efeito de preparação destas células para aumentar a sua resposta a estímulos subsequentes para a ruptura oxidante (produção de ânions de superóxidos), desgranulação e liberação de agentes antimicrobianos e quimiotaxia. Além disso, GM-CSF estimula a liberação de citocinas secundárias e mediadores destas células incluindo IL-1, G-CSF, M-CSF e de leucotrienos de neutrófilos, assim com IL-1, TNF, IL-6, GCSF, M-CSF e de prostaglandinas de macrófagos.
[005] É evidente do exposto acima que GM-CSF representa um papel chave na ativação e manutenção de populações celulares necessárias para afastar a infecção. No entanto, em alguns casos, a ativação destas populações de células pode ser indesejável. A ativação das linhagens de células acima, por exemplo, quando não há nenhum patógeno presente leva em muitos casos a condições inflamatórias agudas e/ou crônicas que, em casos extremos, podem colocar a vida em perigo. De modo análogo, a sobre-expressão de GM-CSF pode levar a uma ativação imune excessiva resultando em inflamação. Em tais casos, pode ser desejável se neutralizar a atividade de GM-CSF de tal modo que os sintomas destas condições inflamatórias sejam eliminados ou pelo menos atenuados.
[006] Exemplos de tal atividade neutralizadora existem na técnica anterior. Foi descoberto, por exemplo, que um anticorpo neutralizador anti-GM-CSF contribuía para um aumento em taxa de apoptose de eosinófilos em amostras de sangue periférico (Kankaanranta et al. (2000) Journal of
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Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83) . Como a sobrevivência aumentada de eosinófilos é correlacionada com asma, seria de se esperar que um aumento de apoptose de eosinófilos atenuasse os sintomas asmáticos. Em doenças inflamatórias crônicas tais como asma, artrite reumatóide e esclerose múltipla, os níveis de GM-CSF estão aumentados localmente e em alguns casos sistemicamente e foram correlacionados com o processo inflamatório nestas doenças.
[007] É, portanto, um objetivo da presente invenção melhorar os modos de se neutralizar uma atividade aumentada e/ou indesejável de GM-CSF anteriormente conhecida na técnica anterior.
[008] Consequentemente, um aspecto da invenção se refere a um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que se liga especificamente a GM-CSF de primata e o neutraliza.
[009] O termo “se liga especificamente ou expressões correlatas tais como ligação específica, ligando-se especificamente, ligante específico etc., conforme empregado no presente, se referem à capacidade do anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de discriminar entre o GM-CSF de primata e qualquer número de outros antígenos potenciais diferentes do GM-CSF de primata a um ponto tal, que, de um conjunto de uma multiplicidade de diferentes antígenos como parceiros de ligação potenciais, somente o GM-CSF de primata se liga, ou se liga significativamente. Dentro do significado da presente invenção, GM-CSF de primata é significativamente ligado,
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5/124 quando de um conjunto de uma multiplicidade de antígenos diferentes com igual acesso como parceiros de ligação potenciais, o GM-CSF de primata se liga com uma frequência de pelo menos 10 vezes, de preferência 50 vezes, sendo o mais preferível 100 vezes ou mais (no sentido cinético) do que qualquer outro antígeno diferente do GM-CSF de primata. Tais medições cinéticas podem ser conduzidas em um aparelho Biacore.
[0010] Conforme empregado no presente, neutralização neutralizador neutralizar e variantes gramaticalmente relacionadas deles se referem a uma atenuação parcial ou total do(s) efeito(s) biológico (s) de GM-CSF. Tal atenuação parcial ou total do(s) efeito(s) biológico(s) de GM-CSF resulta da modificação, interrupção e/ou eliminação de transdução de sinal mediada por GM-CSF, conforme manifes-tado, por exemplo, em sinalização intracelular, proliferação celular ou liberação de substâncias solúveis, supra ou infra-regulação de ativação genética intracelular, por exemplo, que resulta na expressão de receptores de super-fície para ligantes que são diferentes de GM-CSF. Conforme será observado pelos versados na técnica, há uma multipli-cidade de modos de se determinar se um agente, um anticorpo em questão ou seu fragmento, por exemplo, deve ser classificado como um neutralizador. A título de exemplo, isto pode ser feito por um teste in vitro padrão, conduzido geralmente do seguinte modo: Em um primeiro experimento de proliferação, uma linhagem de células, o grau de prolife-ração da qual é conhecido como
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6/124 dependendo da atividade de GM-CSF, é incubada em uma série de amostras com concentrações variáveis de GM-CSF, sendo medido, depois da sua incubação, o grau de proliferação da linhagem de células. A partir desta medição é determinada a concentração de GM-CSF que permite uma proliferação metade da máxima das células. Um segundo experimento de proliferação é então conduzido, empregando-se em cada uma de uma série de amostras o mesmo número de células que foi usado no primeiro experimento de proliferação, a concentração de GM-CSF determinada acima e desta vez, concentrações variáveis de um anticorpo ou seu fragmento que se suspeita que seja um neutralizador de GM-CSF. A proliferação celular é novamente medida para se determinar a concentração do anticorpo ou seu fragmento que é suficiente para produzir uma inibição de crescimento que é a metade da máxima. Se o gráfico resultante de inibição de crescimento pela concentração de anticorpo (ou de seu fragmento) for de formato sigmóide, resultando em uma redução de proliferação celular com o aumento da concentração de anticorpo (ou de seu fragmento), então algum grau de inibição de crescimento dependente de anticorpo foi produzido, isto é a atividade de GM-CSF foi neutralizada até um certo ponto. Em tal caso, o anticorpo ou seu fragmento pode ser considerado um neutralizador no sentido da presente invenção. Um exemplo de uma linhagem celular, cujo grau de proliferação se sabe que depende da atividade de GM-CSF, é a linhagem de células TF-1, conforme descrito em Kitamura, T. et al. (1989) . J. Cell Physiol., 140, 323-34.
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7/124 [0011] Conforme será observado pelos versados na técnica, o grau de proliferação celular não é o único parâmetro pelo qual pode ser estabelecida a capacidade neutralizador. A medição do nível de moléculas de sinalização, por exemplo, (citocinas, por exemplo), cujo nível de secreção depende de GM-CSF, pode ser usada para a identificação de um neutrali-zador suspeito de GM-CSF.
[0012] Outros exemplos de linhagens celulares que podem ser usados para se determinar se um anticorpo em questão ou seu fragmento é um neutralizador da atividade de GM-CSF de primata incluem AML-193 (Lange, B. et al (1987). Blood 70, 192-9) ; GF-D8 (Rambaldi, A. et al (1993) . Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. et al (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11); M07E (Avanzi, G. C. et al. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103
(Valtieri, M. et al. (1987). Journal of Immunology 138,
4042-50); UT-7 (Komatsu, N. et al (1991). Cancer Research
51, 341-8) .
[0013] O anticorpo ou seu fragmento de acordo
com a invenção é monoclonal. Conforme empregado no presente, o termo monoclonal deve ser compreendido como tendo o significado tipicamente atribuído a ele na técnica, mais exatamente um anticorpo (ou seu fragmento correspondente) que se origina de um único clone de uma célula produtora de anticorpos tal como uma célula B, e que reconhece um único epítopo no antígeno ligado. É especialmente difícil se preparar anticorpos humanos que sejam monoclonais. Ao contrário de fusões de células B murinas com linhagens de
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8/124 células imortalizadas, as fusões de células B humanas com linhagens de células imortalizadas não são viáveis. Portanto, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção é o resultado de se superar obstáculos técnicos significativo geralmente reconhecidos como existindo no campo da tecnologia de anticorpos. A natureza monoclonal do anticorpo torna-o especialmente bem adequado para uso como um agente terapêutico, uma vez que tal anticorpo existirá em forma de uma única espécie molecular homogênea que pode ser bem caracterizada e produzida de modo reproduzível e purificada. Estes fatores resultam em um produto cuja atividade biológica pode ser prevista com um alto grau de precisão, o que é muito importante se tal molécula for ganhar uma aprovação reguladora para administração terapêutica em seres humanos.
[0014] É especialmente importante que o anticorpo mono-clonal (ou fragmento correspondente) de acordo com a invenção seja um anticorpo humano (ou fragmento correspondente). Ao se visar um agente de anticorpo destinado para a adminis-tração terapêutica a seres humanos, é extremamente vantajoso que este anticorpo seja de origem humana. Depois da administração a um paciente humano, um anticorpo humano ou seu fragmento com toda a probabilidade não produzirá uma resposta imunogênica intensa pelo sistema imune do paciente, isto é, não será reconhecido como sendo uma proteína estranha, isto é, uma proteína não humana. Isto significa que nenhuma hospedeira, isto é, nenhum anticorpo do paciente, será gerado contra o anticorpo
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9/124 terapêutico que caso contrário bloquearia a atividade do anticorpo tera-pêutico e/ou aceleraria a eliminação do anticorpo terapêu-tico do corpo do paciente, impedindo assim que ele exercesse o seu efeito terapêutico desejado.
[0015] O termo anticorpo humano, conforme empregado no presente, deve ser compreendido como significando que o anticorpo da invenção, ou seu fragmento, compreende (uma) sequência(s) de aminoácidos contida(s) no repertório de anticorpos de linhagem germinal humana. Para os fins de definição da presente invenção, um anticorpo, ou seu fragmento, pode, portanto, ser considerado humano se ele consistir em tal(tais) sequência (s) de aminoácidos de linhagem germinal humana, isto é, se a(s) sequência(s) de aminoácidos do anticorpo em questão, ou do seu fragmento, é(são) idêntica(s) a (uma) sequência(s) de aminoácidos de linhagem germinal humana expressa. Um anticorpo ou seu fragmento pode também ser considerado humano se ele consistir em (uma) sequência (s) que se desvia(m) da sua(s) sequência(s) de linhagem germinal humana mais próxima de não mais do que seria de se esperar devido à impressão de hipermutação somática. Além disso, os anticorpos de muitos mamíferos não humanos, de roedores tais como camundongos e ratos, por exemplo, compreendem sequências de aminoácidos de CDR3 de VH que se poderia esperar que também existissem no repertório de anticorpos humanos expressos. Qualquer (quaisquer) sequência(s) de origem humana ou não humana que se pode esperar que existisse(m) no repertório humano
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10/124 expresso seria(m) também considerada(as) humana(s)” para os fins da presente invenção.
[0016] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o GM-CSF de primata é GM-CSF humano (de Homo sapiens) ou GM-CSF de primata não humano. As variantes especialmente preferidas de GM-CSF de primata não humano incluem GM-CSF de macacos gibões (Nomascus concolor, também conhecido como gibão ocidental de crista negra) e GM-CSF de macacos da família Macaca, tais como GM-CSF de macaco résus (Macaca mulatta) e GM-CSF de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis). De acordo com esta modalidade da invenção, o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento apresenta reatividade cruzada entre a espécie humana e pelo menos uma das espécies de macacos mencionada acima. Isto é especialmente vantajoso para uma molécula de anticorpo que se destina à adminis-tração terapêutica em pacientes humanos, uma vez que um tal anticorpo normalmente terá que passar por uma multiplicidade de testes antes da sua aprovação reguladora, envolvendo determinados testes iniciais desta multiplicidade espécies de animais não humanos. Ao se conduzir tais testes, é geral-mente desejável se usar como espécie não humana uma espécie que apresente um alto grau de similaridade genética a seres humanos, uma vez que os resultados assim obtidos geralmente terão um alto grau de previsibilidade de resultados corres-pondentes que se poderia esperar quando se administrasse a mesma molécula a seres humanos. No entanto, tal capacidade de previsão baseada em testes animais depende pelo menos parcialmente da
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11/124 comparabilidade da molécula e é muito alta quando, devido a uma reatividade entre espécies, a mesma molécula terapêutica pode ser administrada a seres humanos e a modelos animais.Como ocorre nesta modalidade da invenção, em que uma molécula de anticorpo tem reação cruzada para o mesmo antígeno em seres humanos que em uma outra espécie próxima, e os testes podem ser conduzidos usando-se a mesma molécula de anticorpo em seres humanos que em espécies próximas, em uma das espécies de macaco mencionadas acima, por exemplo. Isto aumenta tanto a eficiência dos testes propriamente ditos como o poder de previsão permitido por tais testes no tocante ao comportamento de tais anticorpos em seres humanos, a espécie de destino final de interesse de um ponto de vista terapêutico.
[0017] De acordo com uma outra modalidade da invenção, um anticorpo monoclonal humano pode ser um anticorpo IgG. Conforme é bem conhecido na técnica, uma IgG compreende não somente as regiões variáveis de anticorpo responsáveis pelo reconhecimento e ligação a antígeno extremamente discrimi-nadores, mas também regiões constantes das cadeias polipeptídicas leves de anticorpo normalmente presentes em anticorpos produzidos por via endogênica e, em alguns casos, até mesmo decoração em um ou mais sítios com carboidratos. Tal glicosilação é geralmente uma característica do formato de IgG, e porções destas regiões constantes constituem a região denominada Fc de um anticorpo completo da qual se sabe que estimula diversas funções efetoras in vivo. Além disso, a região Fc medeia a ligação
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12/124 de IgG a receptor de Fc, prolongando assim a meia-vida in vivo assim como facilitando a acomodação da IgG em locais com presença aumentada de receptores de Fc - tecido inflamado, por exemplo. É vantajoso que o anticorpo IgG seja um anticorpo IgG1 ou um anticorpo IgG4, formatos que são preferidos, uma vez que seu mecanismo de ação in vivo é especialmente bem compreendido e caracterizado. Este é especialmente o caso para anticorpos IgG1.
[0018] De acordo com uma outra modalidade da invenção, o fragmento do anticorpo monoclonal humano pode ser um scFv , um anticorpo de domínio único, um Fv, um anticorpo VHH, um diacorpo, um diacorpo em série, um Fab, um Fab' ou um F(ab)2. Estes formatos podem, geralmente, ser divididos em duas subclasses, mais exatamente naquelas que consistem em uma única cadeia polipeptídica e nas que compreendem pelo menos duas cadeias polipeptídicas. Os membros da primeira subclasse incluem um scFv (compreendendo uma região VH e uma região VL ligadas em uma única cadeia polipeptídica por meio de um linker polipeptídico); um anticorpo de domínio único (compreendendo uma região variável única de anticorpo) tal como um anticorpo VHH (compreendendo uma única região VH). Os membros da segunda subclasse incluem um Fv (compreendendo uma região VH e uma região VL em forma de cadeias polipeptídicas que não estão associadas por covalência entre si); um diacorpo (compreendendo duas cadeias polipeptídicas não associadas por covalência, compreendendo cada uma delas duas regiões variáveis de anticorpo - normalmente uma VH e uma VL por
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13/124 cadeia polipeptídica - sendo as duas cadeias polipeptídicas dispostas em uma conformação de cabeça-cauda, de modo que resulte uma molécula de anticorpo bivalente); um diacorpo em série (anticorpos Fv de cadeia única bi-específicos compreendendo quatro regiões variáveis de duas especificidades diferentes - VH e VL - de imunoglobulina ligadas por covalência, formando um homodímero que é duas vezes maior do que o diacorpo descrito acima) ; um Fab (compreendendo como uma cadeia polipeptídica uma cadeia leve integral de anticorpo, ela mesma compreendendo uma região VL e a região integral constante de cadeia leve e, como uma outra cadeia polipeptídica, uma parte de uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma região VH completa e parte da região constante de cadeia pesada, sendo as duas cadeias polipeptídicas conectadas intermolecularmente por meio de uma ligação dissulfeto entre cadeias); um Fab' (como um Fab, acima, exceto pelo fato de ter ligações dissulfeto reduzidas adicionais compreendidas sobre a cadeia pesada de anticorpo); e F(ab)2 (compreendendo duas moléculas Fab', sendo cada molécula Fab' ligada à outra molécula Fab' respectiva por meio de ligações dissulfeto entre cadeias). em geral, os fragmentos de anticorpo do tipo descrito acima permitem uma grande flexibilidade em se adaptar, por exemplo, as propriedades farmacocinéticas de um anticorpo que se deseja para administração terapêutica, às exigências específicas disponíveis. Pode ser desejável, por exemplo, se reduzir o tamanho do anticorpo administrado a fim de se aumentar o grau de penetração no tecido quando se tratam tecidos
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14/124 conhecidos por uma vascularização precária (juntas, por exemplo). Em algumas circunstâncias, pode ser também desejável se aumentar a velocidade à qual o anticorpo terapêutico é eliminado do corpo, podendo tal velocidade ser
geralmente aumentada por redução do tamanho do anticorpo
administrado.
[0019] De acordo com uma outra modalidade da
invenção, o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento
pode estar presente em formas monovalentes monoespecíficas; multiva-lentes monoespecíficas, especialmente bivalentes monoespecí-ficas; ou multivalentes multiespecíficas, especialmente bivalentes biespecíficas. Em geral, um anticorpo multivalente monoespecífico, especialmente bivalente monoespecífico tal como a IgG humana integral conforme descrito acima pode trazer a vantagem terapêutica de que a neutralização efetuada por tal anticorpo é potencializada por efeitos de avidez, isto é, ligação pelo mesmo anticorpo a uma multiplicidade de moléculas do mesmo antígeno, neste caso de GM-CSF de primata. Diversas formas monovalentes monoespe-cíficas de fragmentos do anticorpo da presente invenção já foram descritas acima (um scFv, um Fv, um VHH ou um anticorpo de domínio único, por exemplo). Formas multi-valentes multiespecíficas, especialmente formas bivalentes biespecíficas do anticorpo monoclonal humano anti-GM-CSF de primata da invenção pode incluir uma IgG integral em que um braço de ligação se liga ao GM-CSF de primata ao passo que o outro braço de ligação se liga a um outro antígeno diferente do GM-CSF de primata. Uma outra
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15/124 forma multivalente multi-específica, especialmente bivalente biespecífica pode ser com vantagem um anticorpo biespecífico de cadeia única humano, isto é uma construção de anticorpo humano recombi-nante compreendendo duas entidades scFv conforme descrito acima, conectadas em uma cadeia polipeptídica contígua por um espaçador polipeptídico curto interposto conforme é conhecido na técnica (veja, por exemplo, WO 99/5440 para um anticorpo de cadeia única biespecífico anti-CD19 x anti-CD3). Neste caso, uma porção de scFv do anticorpo de cadeia única biespecífico compreendido no interior do anticorpo de cadeia única biespecífico especificamente se ligará a GM-CSF de primata conforme apresentado acima, ao passo que a outra porção de scFv respectiva deste anticorpo de cadeia única biespecífico
se ligará a um outro antígeno determinado como sendo de
benefício terapêutico.
[0020] De acordo com uma outra modalidade, o
anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento pode ser
derivado, por exemplo, com um polímero orgânico, com uma ou
mais moléculas de polietileno glicol (PEG), por exemplo, e/ou polivinil pirrolidona (PVP). Conforme é conhecido na técnica, tal derivação pode ser vantajosa na modulação das propriedades farmacodinâmicas de anticorpos ou de seus fragmentos. Especialmente preferidas são moléculas de PEG derivadas como PEG-maleimida, permitindo a conjugação com o anticorpo ou seu fragmento de um modo específico a sítio através do grupo sulfidrila de um aminoácido cisteína. Destes, especialmente preferidos são PEG-maleimida de 20 kD
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16/124 e/ou 40 kD, ou na forma ramificada ou de cadeia reta. Pode ser especialmente vantajoso se aumentar o peso molecular efetivo de fragmentos de anticorpos anti GM-CSF de primata humanos tais como fragmentos scFv por acoplamento destes últimos a uma ou mais moléculas de PEG, especialmente a PEGmaleimida.
[0021] De acordo com uma outra modalidade da invenção, o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento se liga especificamente a um epítopo, especialmente a um epítopo descontínuo, de GM-CSF de primata humano ou não humano compreendendo os aminoácidos 23-27 (RRLLN) e/ou aminoácidos 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL).
[0022] A variabilidade na posição 67 no interior do trecho 65-77 da sequência de aminoácidos ilustrada acima reflete a heterogeneidades nesta porção de gm-csf de primata entre, por um lado o GM-CSF humano e de gibão (em que a posição 67 é R) e, por outro lado, macacos da família Macaca, tais como macacos cinomolgos e résus (em que a posição 67 é Q).
[0023] Conforme empregado no presente, a numeração de GM-CSF humano e de primata não humano se refere à de GM-CSF maduro, isto é, GM-CSF sem sua sequência de sinal de 17 aminoácidos (o comprimento total de GM-CSF tanto na espécie humana como em espécies de primatas não humanos descritos acima é de 127 aminoácidos). A sequência de GM-CSF humano e a de GM-CSF de gibão é a seguinte:
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17/124
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE [0024] A sequência de GM-CSF em determinados membros da família Macaca de macacos, tal como, por exemplo, do macaco résus e macaco cinomolgo é a seguinte:
APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNKTV EWSEMFDLQ EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFQSFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE [0025] O epítopo mínimo, vantajosamente um epítopo des-contínuo, ligado pelo anticorpo monoclonal humano da invenção (ou seu fragmento) conforme descrito acima é indi-cado na sequência de GM-CSF acima em negrito. Conforme empregado no presente, o termo “epítopo descontínuo” deve ser compreendido como pelo menos dois trechos de sequências de aminoácidos não adjacentes dentro de uma cadeia polipeptídica dada, neste caso de um GM-CSF maduro humano e de primata não humano à qual se liga simultânea e especificamente (conforme definido acima) um anticorpo. De acordo com esta definição tal ligação específica simultânea pode ser de um polipeptídeo de GM-CSF na forma linear. Neste caso, pode-se imaginar o polipeptídeo de GM-CSF maduro formando uma alça estendida, alinhando-se em uma região dela duas sequências indicadas em negrito acima, aproximadamente em paralelo, por exemplo, e na proximidade uma da outra. Neste estado elas se ligam específica e simultaneamente ao fragmento de anticorpo da invenção. De acordo com esta definição a ligação simultânea
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18/124 específica de dois trechos de sequência de GM-CSF maduro indicado acima pode também assumir a forma de ligação de anticorpo a um epítopo conformacional. Neste caso, o GM-CSF maduro já terá formado sua conformação terciária como ela normalmente existe in vivo (Sun, H. W., J. Bernhagen et al. (1996) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5191-6) . Nesta conformação terciária, a cadeia polipeptídica de GM-CSF é dobrada de tal modo que ela faz com que os dois trechos de sequência indicados acima fiquem próximos no espaço, na superfície externa de uma região específica do GM-CSF dobrado maduro, por exemplo, onde eles são então reconhecidos devido à sua conformação tridimensional dentro do contexto das sequências polipeptí-dicas circundantes.
[0026] Em uma modalidade preferida, o epítopo acima (descontínuo) compreende ainda os aminoácidos 28-31 (LSRD), em caracteres itálicos nas sequências acima de GMCSF humano e de primata não humano. Em uma modalidade especialmente preferida, qualquer um dos epítopos acima (descontínuos) compreende ainda os aminoácidos 32,33 (TA) e/ou aminoácidos 21,22 (EA), sendo cada um dos dois trechos sublinhado nas sequências acima de GM-CSF humano e de primata não humano.
[0027] De acordo com uma outra modalidade da invenção, o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento compreende na sua região variável de cadeia pesada uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida do grupo que consiste naqueles apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 ou 56. É preferido um anticorpo monoclonal
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19/124 humano ou seu fragmento que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada, conforme apresentada na SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada na SEQ ID NO: 1; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 2; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 3; ou que compreende sequência de CDR1 de uma região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 4; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 5; ou que compreende uma sequência
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20/124 de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 6; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 7; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 8; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 9; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 10; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de
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21/124 cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 11; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 12; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 13; ou que compreende uma sequência de CDR1 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma sequência de CDR2 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme apresentada em SEQ ID NO: 56.
[0028] Ainda mais preferido é que qualquer uma das 14 combinações acima de sequências de CDR1, CDR2 e de CDR3 exista em um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que compreende ainda em sua região variável de cadeia leve uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID
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NO: 17, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18.
[0029] De acordo com uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal humano da invenção ou seu fragmento compreende na sua região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19. É preferido um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 20; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 21; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 22; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 23; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve
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23/124 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 24; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 25; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 26; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 27; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 28; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO:
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29; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 30; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 31; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 32; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 33; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 52; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 19 e uma
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25/124 região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 53 .
[0030] De acordo com uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal humano da invenção ou seu fragmento compreende na sua região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54. É preferido um anticorpo monoclonal humano, ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 20; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 21; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 22; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 23; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu
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26/124 fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 24; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 25; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 26; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 27; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 28; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de amino-ácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma
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27/124 sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 29; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 30; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 31; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 32; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 33; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 52; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, em que a região variável de cadeia leve compreende uma
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28/124 sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 53 .
[0031] De acordo com uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal humano da invenção ou seu fragmento compreende na sua região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55. É preferido um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 20; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 21; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 22; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 23; ou um
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29/124 anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 24; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 25; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 26; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 27; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 28; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região
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30/124 variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 29; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 30; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 31; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 32; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 33; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 52; ou um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, compreendendo
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31/124 a região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 55 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 53.
[0032] Uma modalidade preferida propõe um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que compreende na sua região variável de cadeia leve uma região CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 16, uma região CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 17 e uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 18 e que compreende na sua região variável de cadeia pesada uma região CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 14, uma região CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 15 e uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 56.
[0033] Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo monoclonal humano compreende na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 35; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 36; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
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NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 37; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 38; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 39; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 40; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 41; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 42; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 43; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 44; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 45; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID
NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos
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33/124 conforme apresentada em SEQ ID NO: 46; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 47; ou na sua cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 34 e na sua cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO: 48.
[0034] As modalidades preferidas acima propõem moléculas de anticorpo monoclonal humano e/ou fragmentos seus que são especialmente vantajosos como neutralizadores da atividade de GM-CSF de primata, especialmente humano. Os anticorpos monoclonais humanos ou fragmentos seus de acordo com estas modalidades preferidas especialmente são extremamente vanta-josos por diversas razões.
[0035] Em primeiro lugar, eles reconhecem o GMCSF de primata de modo extremamente específico, isto é, de uma mistura de GM-CSF de primata com outros fatores estimula-dores de colônia de primatas (com G-CSF e M-CSF de primatas, por exemplo), as moléculas que se ligam de acordo com estas modalidades especialmente preferidas são extremamente discriminadoras para GM-CSF de primata, ao passo que os outros fatores estimuladores de colônia no mesmo meio não são reconhecidos. Isto significa que é de se esperar que um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com estas modalidades, quando administrado a um ser humano, se ligará especificamente somente ao alvo desejado e neutra-lizará somente ele, ao passo que os demais alvos indesejá-veis não se ligarão nem serão neutralizados.
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Eventualmente, isso leva a um alto grau de previsibilidade no tocante ao modo terapêutico de ação in vivo.
[0036] Em segundo lugar, os ligantes de acordo com estas modalidades especialmente preferidas se ligam a GM-CSF de primata com uma afinidade extremamente alta. Foram obser-vados para moléculas desta classe valores de Kd de aproxima-damente 4 x 10-9 M até um valor baixo de aproximadamente 0,04 x 10-9 M, este último correspondendo a aproximadamente 10 pM. Como a taxa de associação cinética de tais moléculas em meio aquoso é extremamente controlada por difusão e não pode ser, portanto, melhorada além do permitido pelas condições de difusão locais em condições fisiológicas, um Kd se origina principalmente como resultado da taxa de dissociação cinética, koff, que é de aproximadamente 10-5 s-1 para o ligante de anticorpo com a afinidade máxima. Isto significa que, uma vez formado o complexo entre um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com qualquer uma destas modalidades da invenção por um lado, e o GM-CSF de primata por outro lado, ele não se separa facilmente, ou pelo menos não se separa rapidamente. Para as moléculas de ligação destinadas como neutralizadores de atividade biológica, estas características são extremamente vanta-josas, uma vez que o efeito neutralizador desejável normal-mente durará somente enquanto a molécula, cuja atividade biológica deve ser neutralizada (neste caso GM-CSF de primata) permanecer ligada pela molécula de ligação neutra-lizadora. Portanto uma molécula neutralizadora que permanece liga ao seu alvo
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35/124 destinado durante um tempo prolongado continuará a neutralizar durante um tempo prolongado corres-pondente.
[0037] A grande afinidade de ligação de anticorpos mono-clonais humanos ou fragmentos seus a GM-CSF de primata tem uma vantagem adicional. Normalmente, antígenos ou fragmentos seus serão eliminados da corrente sanguínea de um paciente de um modo dependente de tamanho, sendo as moléculas menores excretadas e eliminadas antes das maiores. Como o complexo dos dois polipeptídeos - anticorpo ou fragmento de anticorpo e GM-CSF ligado - é obviamente maior do que o anticorpo sozinho, o valor koff baixo mencionado acima tem o efeito de que o neutralizador terapêutico é excretado e eliminado do corpo do paciente mais lentamente do que seria o caso, em que ele não está ligado a GM-CSF. Portanto, é aumentada não somente a magnitude da atividade neutralizadora como também a sua duração in vivo.
[0038] Finalmente, a atividade neutralizadora determinada para os ligantes de acordo com estas modalidades especialmente preferidas é surpreendentemente alta. Conforme será descrito com mais detalhes abaixo, a atividade neutralizadora foi medida in vivo usando-se um ensaio de inibição de crescimento de TF-1 (Kitamura, T. et al. (1989), J.Cell Physiol. 140, 323-34). Como uma indicação de potencial de neutralização foram medidos os valores IC50, representando IC50 a concentração de anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com qualquer uma destas modalidades da invenção necessária para produzir uma inibição metade da
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36/124 máxima de proliferação de células TF-1. Para os anticorpos monoclonais humanos ou fragmentos seus de acordo com qualquer uma destas modalidades da invenção, foi determinado um valor IC50 de aproximadamente 3 x 10-10 M ou de aproximadamente 0,3 nM. As moléculas de ligação de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção são, portanto, neutralizadores extremamente potentes da atividade de GM-CSF de primata.
[0039] Resumindo, portanto, um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção acima apresenta um alto grau de discriminação para o antígeno desejado, se liga a este antígeno de modo extremamente firme e durante um tempo prolongado e apresenta uma atividade neutralizadora extremamente potente durante um tempo prolongado em que ele permanece ligado. Ao mesmo tempo, uma persistência prolongada do complexo ligante-antígeno reduz a velocidade da eliminação deste ligante do corpo, prolongando deste modo a duração do efeito terapêutico desejado in vivo.
[0040] Um outro aspecto da presente invenção propõe um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de homologia com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56. A homologia pode ser determinada por programas padrão de alinhamento de sequências tais como Vector NTI (InforMaxTM, Maryland, USA). Tais programas comparam sequências alinhadas numa base de aminoácido a aminoácido e podem ser ajustados a
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37/124 diversos níveis de drasticidade para a comparação (aminoácidos idênticos, substituição conservadora de aminoácido etc., por exemplo). Conforme o termo é usado no presente documento, dois aminoácidos em questão são considerados como consistindo em “substituições conservadoras” um do outro se cada um deles pertencer à mesma classe química, isto é, se for ácido, não polar, polar sem carga e básico. A título de exemplo não limitante, dois aminoácidos diferentes que pertencem à classe de aminoácidos não polares seriam considerados “substituições conservadoras” um do outro, mesmo se estes dois aminoácidos não fossem idênticos, ao passo que um aminoácido não polar, por um lado, e um aminoácido básico por outro lado não seriam consideradas “substituições conservadoras” um do outro. O painel 3.1 de “Molecular Biology of the Cell”, 4a. Edição (2002) por Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts e Walter agrupa os aminoácidos em quatro grupos principais: ácidos, não polares, polares sem carga e básicos. Tal agrupamento pode ser usado para o fim de se determinar, para os fins da presente invenção, se um aminoácido específico constitui ou não uma substituição conservadora de um outro aminoácido em questão.
[0041] Um outro aspecto da invenção propõe uma molécula de polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52 a 56 ou uma sequência de nucleotídeos que apresenta pelo menos 70% de homologia com ela, podendo a homologia ser
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38/124 determinada comparando-se uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56 com uma sequência de nucleotídeos em questão por alinhamento de sequências (conforme descrito acima para as sequências de aminoácidos), sendo um nucleotídeo na sequência em questão considerado homólogo se ele ou é idêntico ao nucleotídeo correspondente na sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos correspondente de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56, ou, se um ou mais desvio(s) de nucleotídeo(s) na sequência em questão de um ou mais nucleotídeo(s) correspon-dente(s) na sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56 resultar em um tripleto de nucleotídeos que, quando traduzido, resultará em um aminoácido que ou é idêntico ao aminoácido correspondente na sequência de amino-ácidos correspondente de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56. (devido a um tripleto degenerado) ou consiste em uma substituição conservadora dele. Neste caso, o termo substituição conservadora” deve ser subentendido conforme descrito acima.
[0042] Um outro aspecto da invenção propõe uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento ou uma molécula de polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-48 e/ou 52-56 ou que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma
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39/124 sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-8 e/ou 52-56, sendo homologia subentendida conforme explicado acima. De acordo com a presente invenção, o termo composição farmacêutica se refere a uma composição para administração a um paciente, de preferência, um paciente humano. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma composição para administração parenteral, transdérmica, intraluminal, intra-arterial, intratecal e/ou intranasal ou por injeção direta no tecido. Pretende-se especialmente que a composição farmacêutica seja administrada a um paciente por infusão ou injeção. A administração das composições adequadas pode ser efetuada por diferentes modos, por administração intravenosa, intra-peritoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradér-mica. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salina tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/ água, diversos tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, lipossomas etc. As composições que compreendem tais veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao paciente a uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo clínico responsável e por fatores clínicos. Conforme é do conhecido na técnica médica, as dosagens para qualquer paciente específico dependerão de muitos fatores
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40/124 que incluem o tamanho do paciente, área superficial do corpo, idade, do composto específico a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros medicamentos que estejam sendo administrados concomitantemente. Os preparados para a administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meio salino e tamponado. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado, ou óleos fixados. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluido e de nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles à base de dextrose de Ringer) e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais, como por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes e semelhantes. Além disso a composição farmacêutica da presente invenção poderia compreender veículos proteináceos, tais como, por exemplo, albumina sérica ou imunoglobulina, de preferência de origem humana. Pretende-se que a composição farmacêutica da presente invenção possa compreender, além do anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento (conforme descrito na presente invenção) outros agentes biologicamente ativos, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica.
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Tais agentes poderiam ser medicamentos que atuam no sistema gastrintestinal, medicamentos que atuam como citostáticos, medicamentos que previnem a hiperuricemia, medicamentos que inibem imuno-reações (corticosteróides, por exemplo), medicamentos que modulam a resposta inflamatória, medicamentos que atuam sobre o sistema circulatório e/ou agentes tais como citocinas conhecidas na técnica.
[0043] Um outro aspecto da invenção propõe um uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento conforme descrito acima ou de uma molécula de polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56 ou que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 7 0% de homologia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56, devendo homologia ser subentendida conforme descrito acima, na fabricação de um medicamento, opcionalmente compreendendo um ou mais agentes anti-inflamatórios, para o tratamento de doenças inflama-tórias. As doenças inflamatórias são escolhidas com vantagem do grupo que consiste em artrite reumatóide (RA) (incluindo RA que é resistente a tratamento com neutralizadores de THF-alfa), asma, esclerose múltipla (MS), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Síndrome de Angústia Respiratória Aguda (ARDS), Doença de Crohn, Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF), Doença Inflamatória Intestinal (IBD), uveíte, degeneração da mácula, colite, psoríase, Degeneração de Wallerian, síndrome
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42/124 antifosfolipídico (APS), síndrome coro-nária aguda, restenose, aterosclerose, policondrite de recaída (RP), hepatite aguda ou crônica, implantes ortopé-dicos fracassados, glomerulonefrite, lúpus ou distúrbios autoimunes.
[0044]
É de especial interesse o uso do anticorpo mono-clonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de RA (incluindo RA que é resistente a tratamento com neutraliza-dores de TNF-alfa), asma, MS e/ou doença de Crohn.
[0045]
No tocante a RA, asma e/ou MS há duas teorias populares no tocante à patogênese de artrite reumatóide (RA) . A primeira afirma que a célula T, através da interação com um antígeno - a ser ainda identificado- é a célula principal responsável por iniciar a doença assim como pela sustentação do processo inflamatório crônico. Esta teoria é baseada na associação conhecida de RA com antígenos de histocompatibilidade principal de classe II, no grande número de células T CD4+ e no uso de genes de receptores de células T torcidos no sinóvio de RA. Sabe-se que GM-CSF aumenta a função apresentadora de antígeno por aumentar a expressão de MHC de classe II na superfície e GM-CSF é produzida por células T, indicando um papel putativo para GM-CSF no progresso da doença de acordo com a hipótese à base de células T.
[0046] A segunda teoria afirma que, embora as células T possam ser importantes na iniciação da doença, a
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43/124 inflamação crônica se autoperpetua por macrófagos e fibroblastos de um modo independente das células T. Esta teoria é baseada na relativa ausência de fenótipos ativados de células T em RA crônica e na preponderância de fenótipos ativados de macrófagos e fibroblastos. GM-CSF é um estimulador potente de macrófagos e promove a proliferação de monócitos e macrófagos.
[0047] O GM-CSF conhecido como produzido principalmente por células efetoras (macrófagos) e células de tecido conectivo (fibroblastos) é expressa em abundância no sinóvio de RA e no seu fluido sinovial, conforme medido por ELISA ou estudos de RNAm. De acordo com a teoria de macrófagos-fibroblastos de RA, estes dois tipos de células parecem ser muito responsáveis pela criação de um estado autoperpetuador de inflamação crônica em que a participação de células T pode não ser mais crítica. Neste quadro, o macrófago ativo continuamente secreta IL-1 e THF que mantêm os fibroblastos sinoviais em um estado ativado. O fibroblasto, por sua vez, secreta quantidades grandes de: a) citocinas - IL-6, IL-8 e GM-CSF; b) prostaglandinas; e c) enzimas proteases. GM-CSF realimenta para promover a maturação de monócitos recém recrutados em macrófagos. IL-8 e IL-6 contribuem para o recrutamento e/ou ativação de outras populações de células, ao passo que as prostaglandinas e proteases atuam direta-mente para corroer e destruir os tecidos conectivos próximos tais como osso e cartilagem.
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44/124 [0048] No tocante à doença de Crohn, o fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos humano recombinante (rGM-CSF) proveniente de levedura mostrou eficácia no tratamento de doença de Crohn de moderada a grave (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002) . Lancet, 360, 1478-80) . Diversos artigos de resenhas desde então especularam sobre o efeito terapêutico desta citocina proinflamatória potente nesta doença, que se acredita que seja de natureza inflama-tória. As explicações possíveis para o modo de ação de rGM-CSF incluíam um componente de imunodeficiência na Doença de Crohn, a torção de Th 2, e a expansão de células dendríticas promovendo a diferenciação de células T reguladoras (WiIk NJ, Viney JL (2002) . Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C et al. (2003). Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6). Os inventores acreditam que possa ser proposto um modo mais simples de ação que seja simultaneamente mais consistente com o papel conhecido de GMCSF em outras doenças pro-inflamatórias.
[0049] GM-CSF é um dos adjuvantes mais potentes conhe-cidos que é o motivo pelo qual a citocina é coadministrada em numerosos testes de vacinação conduzidos atualmente. Simultaneamente, GM-CSF é extremamente imunogênico (Ragnhammar P et al. (1994) . Blood 84, 4078-87) . Um estudo muito recente (Rini B et al. (2005) Cytokine 29, 56-66) mostrou que o tratamento subcutâneo diário com rGM-CSF proveniente de levedura, conforme foi conduzido no teste da doença de Crohn (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80), levou dentro de três meses em 87% (1315) de
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45/124 pacientes com câncer de próstata a desenvolver anticorpos contra a citocina. Sessenta por cento de pacientes (9/15) desenvol-veram anticorpo neutralizadores de GM-CSF (policlonais). A possibilidade de uma resposta neutralizadora a GM-CSF não foi investigada no teste de doença de Crohn, nem foram determinados níveis séricos de GM-CSF durante terapia. Dentro do âmbito desta modalidade da invenção, tem-se como objetivo que os pacientes com a doença de Crohn tratados com rGM-CSF não responderam diretamente somente à atividade imuno-estimuladora da citocina, mas também, pelo menos em parte, responderam clinicamente a uma resposta a anticorpo que neutraliza tanto o GM-CSF administrado como o endógeno, que se sabe que é sobreproduzido na doença de Crohn (Agnholt J et al. (2004) Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 649-55) . A neutralização de anticorpos anti-GM-CSF, então, pode ter uma atividade terapêutica análoga na doença de Crohn que tem rGM-CSF e deve ser considerada como uma abordagem terapêutica alternativa, conforme é contemplado acima.
[0050] Um outro aspecto da invenção propõe um uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento conforme descrito acima ou de uma molécula de polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56 ou que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia de 7 0% com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-48 e/ou 52-56, devendo
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46/124 homologia ser subentendido como explicado acima, na fabricação de um medicamento, opcionalmente compreendendo um ou mais agentes anticancerígenos adicionais, para o tratamento de uma doença tumoral ou de uma outra condição com apoptose celular retardada, aumento de sobrevivência ou proliferação celular. Uma doença tumoral preferida é um câncer, sendo especial-mente preferidos leucemia, mieloma múltiplo, carcinoma gástrico ou carcinoma da pele.
[0051] Olver et al. ((2002) Cancer Chemother Pharmacol. 50, 171-8) aplicaram subcutaneamente o antagonista E21R de GM-CSF em pacientes com tumores sólidos que se sabia que expressavam receptores de GM-CSF, levando a uma redução temporária somente de níveis séricos de PSA. Além disso, a aplicação deste antagonista de GM-CSF em leucemia mielóide aguda (AML) não revelou nenhuma atividade clínica (Jakupovic et al. (2004) Blood 103, 3230-2.) . Além disso, a aplicação de anticorpos monoclonais anti-GM-CSF a pacientes com AML não revelou um efeito antileucêmico, apesar de níveis séricos suficientes e atividade biológica do anticorpo in vivo (Bouabdallah et al. (1998) Leuk Lymphoma 30, 539-49). Os autores, portanto, concluíram que o tratamento com anticorpos anti-GM-CSF não era efetivo em pacientes portadores de AML.
[0052] A invenção será agora descrita com mais detalhes nos exemplos não limitantes abaixo e nas figuras, ilustrando:
Figura 1 A intensidade de absorção (diretamente pro-porcional à intensidade de ligação) para
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47/124 uma variedade de moléculas de scFv anti-rhGM-CSF obtidas depois de quatro ciclos de panning em exibição nos fagos, conforme deter-minado por ELISA
Figura 2 A intensidade de fluorescência média (inver-samente proporcional à intensidade de neutralização) para uma variedade de scFv anti-rhGM-CSF e outras moléculas de teste, conforme determinado por um ensaio à base de citometria de fluxo
Figura 3 Os resultados de um ensaio de inibição de proliferação de TF-1 conduzido usando-se a molécula 5-306 de scFv anti-rhGM-CSF
Figura 4 A intensidade de absorção (diretamente pro-porcional à resistência de ligação) para uma variedade de moléculas de scFv humano anti-rhGM-CSF obtidas depois de quatro ou cinco ciclos de panning em exibição nos fagos conforme determinado por ELISA
Figura 5 Os resultados de um ensaio de inibição de proliferação de TF-1 conduzido usando-se diversos acertos representativos de scFv humano anti-rhGMCSF
Figura 6 Especificidade de ligação de anticorpos monoclonais humanos para GM-CSF humano e outros fatores humanos estimuladores de colônia.
Figura 7 Medições de ressonância de plasmônio de superfície caracterizando a ligação cinética de anticorpos monoclonais humanos anti-GM-CSF e seus fragmentos.
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Figura 8A Alinhamento de sequências de GM-CSF
de primata não humano e GM-CSF humano
Figura 8B Radiograma de pontos de peptídeo
mostrando a ligação de um fragmento de um anticorpo
monoclonal humano anti -GM-CSF a GM-CSF humano
Figura 9 Resultados qualitativos de um ensaio de inibição de proliferação de TF-1 conduzido usandose diversos fragmentos de anticorpo scFv humano representativos anti-rhGM-CSF
Figura 10 Resultados quantitativos do ensaio de inibi-ção de proliferação de TF-1 usando-se diversas IgGs repre-sentativas humanas anti-rhGM-CSF e fragmentos scFv corres-pondentes
Figura 11 Resultados quantitativos do ensaio de produ-ção de IL-8 conduzido usando-se diversos fragmentos de anticorpo scFv humano anti-rhGM-CSF
Figura 12 Resultados quantitativos do ensaio de inibi-ção de proliferação de TF-1 conduzido usando-se diversas IgGs representativas humanas anti-macGM-CSF e fragmentos de scFv correspondentes
Figura 13 Resultados de estudo de ligação comparativo mostrando a seletividade de ligação de IgG B anti-GM-CSF para GM-CSF humano recombinante e GM-CSF proveniente de diversas espécies não de primatas
Figura 14 Resultados de ensaio que investiga a depen-dência do potencial neutralizador de anticorpo IgG B anti-GM-CSF sobre a glicosilação de GM-CSF
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Figura 15 Resultados do estudo do efeito do
anticorpo IgG B anti-GM-CSF sobre a sobrevivência de
eosinófilos mediada por GM-CSF
Figura 16 Resultados do estudo do efeito do
anticorpo IgG B anti-GM-CSF sobre a ativação de eosinófilos
mediada por GM-CSF
Figura 17 Resultados de estudo de toxicologia
ex vivo usando-se anticorpo IgG B anti-GM-CSF medidos com base na fagocitose (A-C) e na ruptura oxidante (D-F) pelos granu-lócitos
Figura 18 Resultados de estudo de toxicologia ex vivo usando-se anticorpo IgG B anti-GM-CSF medidos com base na fagocitose (A-C) e na ruptura oxidante (D-F) pelos monócitos
EXEMPLOS
Exemplo 1: Obtenção do Antígeno recombinante humano rhGM-CSF (rh) usado para a geração de anticorpos humanos neutralizadores e fragmentos seus
Exemplo 1.1: Clonagem, expressão e purificação do Antígeno rhGM-CSF [0053] O gene que codifica o antígeno GM-CSF humano foi subclonado no vetor pET22b(+) (Novagene, USA) proveniente do vetor de expressão pORF-hGM-CSF (Novagen, USA) por meio de sítios de reconhecimento de enzima de restrição introduzidos por PCR NdeI e XhoI. O gene que codifica hGM-CSF em pET22b(+) foi fundido à sequência líder pelB e é adequada para a expressão em periplasma de E. coli.
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50/124 [0054] A produção e a purificação de proteína foram con-duzidas conforme descrito pelo fabricante. Resumindo, BL21DE3 de E. colí foram transformados com o plasmídeo de expressão e cultivados a 37°C em meio seletivo até uma densidade ótica de 0,5-0,8 a 600 nm. A produção de proteína foi induzida com a adição de IPTG até 1 mM e a redução da temperatura até 25°C. Uma preparação periplásmica foi conduzida por choque osmótico usando-se uma solução de sacarose a 20% para destruir seletivamente a parede celular mantendo uma membrana celular intacta. O hGM-CSF nativo contém duas pontes dissulfeto e a expressão no periplasma oxidante de E. colí permite a formação destas pontes dissulfeto funcio-nalmente importantes.
[0055] O GM-CSF recombinante humano (“rhGMCSF”) foi purificado em um processo de purificação de duas etapas por meio de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) e filtração por gel. Foram usados um Akta® FPLC System (Pharmacia) e o software Unicorn® para a cromatografia. Todas as substâncias químicas eram de categoria de pesquisa e foram adquiridas de Sigma (Deisenhofen) ou Merck (Darmstadt).
[0056] A IMAC foi conduzida usando-se uma coluna Qiagen Ni-NTA Superflow de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com tampão A2 (fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,2, NaCl a 0,4 M) e a preparação periplásmica (PPP) (100 mL) foi aplicada à coluna (2 mL) a uma taxa de fluxo de 2 mL/min. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão B2 a 5% (fosfato de
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51/124 sódio a 20 mM, pH 7,2, NaCl a 0,4 M imidazol a 0,5 M) para se remover a amostra que não se ligou. A proteína ligada foi eluída usando-se tampão B2 a 100% em 5 volumes de coluna. As frações de proteína eluída foram combinadas para uma posterior purificação.
[0057] A cromatografia por filtração por gel foi condu-zida em uma coluna Superdez 200 Prep Grade (Pharmacia) equilibrada com PBS (Gibco). As amostras de proteína eluída (taxa de fluxo 1 mL/minuto) foram submetidas a SDS-PAGE padrão e Western Blot para detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação de peso molecular (kit marcador de peso molecular, Sigma MW GF200). As concentrações de proteína foram determinadas medindo-se a DO a 280 nm e calculadas usando-se o coeficiente de extinção molecular específico a sequência.
Exemplo 1.2: Biotinilação do antígeno rhGM-CSF [0058] Para a seleção de biblioteca de fagos o antígeno rhGM-CSF produzido em E. coli (veja acima) foi biotinilado. A biotinilação foi efetuada em PBS contendo 5% de DMSO (Sigma) com um excesso molar de cinco vezes de EZLink Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) durante 1 hora à temperatura ambiente em um misturador de amostras (Dynal). Para a separação de Biotina livre e antígeno biotinilado de rhGM-CSF, foi conduzida cromatografia de troca de ânions (Resource Q, Amersham Biosciences) de acordo com protocolos padrão. A cromatografia resultou nas duas abordagens (designadas A e B, descritas abaixo) em dois picos de eluição. No caso A, o pico eluído primário foi fracionada
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52/124 novamente por meio de uma segunda etapa de cromatografia de troca de ânions (mesmas condições que acima) em dois picos de eluição.Em seguida as frações obtidas foram diluídas em série (diluições a 1:2; concentração inicial 6 pg/mL, determinada a partir do topo do pico) dispostas em placas ELISA de 96 poços e detectadas. A detecção foi conduzida usando-se A) um anticorpo anti-humano de GM-CSF M500-A (Sigma, 2,5 pg/mL em PBS/BSA a 1%) detectado com anticorpo policlonal caprino anti-murino específico a Fab 2 conjugado com peroxidase de rábano (Dianova, 1 pg/mL de PBS/BSA a 1%) e B) o anticorpo materno (1 pg/mL de PBS/BSA a 1%) detectado com anticorpo caprino policlonal anti-rato conjugado com peroxidase de rábano (Dianova, 1 pg/mL de PBS/BSA a 1%). A biotinilação bem sucedida foi demonstrada por um experimento ELISA análogo que foi conduzido usando-se estreptavidina conjugada com peróxido de rábano (Dako, 1 pg/mL de PBS/BSA a 1%). O sinal foi revelado por acréscimo de solução de substrato OPD (Sigma) e detectado a um comprimento de onda de 492 nm (comprimento de onda de referência 620 nm) . Para se estimar o grau de biotinilação, o ELISA mencionado acima foi conduzido usando-se frações de troca de ânions diretamente ou depois de uma etapa de incubação com 6,7 x 107 microesferas magnéticas (Dynabeads M280-Streptavidin, Dynal) com uma ligeira agitação durante 30 minutos. O sobrenadante resultante foi disposto nos poços de placas ELISA de 96 poços e detectado conforme descrito acima. Os resultados ELISA mostraram que o segundo pico eluído continha o rhGMCSF biotinilado e que aproximadamente 95% do rhGM-CSF eluído
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53/124 tinha se conjugado. As concentrações foram estimadas usandose o material original como um padrão e observou-se que eram de aproximadamente 20 pg/mL.
[0059] A bioatividade conservada do rhGM-CSF rotulado com biotina foi confirmada em ensaios de proliferação de TF-1 de acordo com os protocolos descritos abaixo na caracterização dos anticorpos de uma única cadeia (scFvs).
Exemplo 1.3: Rotulação do antígeno rhGM-CSF com fluoresceína [0060] Para os estudos de ligação nas células TF-1 o antígeno GM-CSF humano recombinante produzido em E. coli (veja Exemplo 1.2 acima) foi conjugado com éster Nsuccini-midílico do ácido fluoresceino-5(6)-carboxamidocapróico (Fluka, fluorescein-NHS). A etapa de conjugação foi condu-zida em tampão de borato (ácido bórico a 0,05 M, NaCl a 0,1 M, pH 8,5) contendo 17,5% de DMSO com um excesso molar de cinco vezes de fluoresceino-NHS durante 1 hora à temperatura ambiente em um misturador de amostras. Em seguida procedeu-se à filtração através de gel (Sephadex G25, Amersham Biosciences) para se dissociar o antígeno rhGM-CSF rotulado com fluoresceína de fluoresceino-NHS livre. A filtração através de gel resultou em dois picos medidos a um compri-mento de onda de 485 nm (comprimento de onda de referência 535 nm) , ao passo que o pico primário representa rhGM-CSF rotulado com FITC. O grau de rotulação foi determinado definindo-se a relação F/P do conjugado ([ mg/mL] = (A280 - 0,35 x A493) x 1,08; F/P = (A493/73.000) x
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54/124 (15.000/([mg/mL]) . A concentração determinada foi de 0,041 mg/mL com uma relação F/P de 1,2.
Exemplo 2: Geração e seleção de anticorpos neutralizadores humanos anti-GM-CSF e de seus fragmentos
Exemplo 2.1: Clonagem de VH materna a partir de hibridoma HB-9569 [0061] Conforme empregado em todos os exemplos acima, uma região V materna indica que a região V em questão e origina de uma molécula de imunoglobulina integral.
[0062] Conforme usado em todos os exemplos acima, um acerto indica uma mL que é conhecida como se ligando a um antígeno de interesse, mas cuja ligação não foi quantita-tivamente avaliada. Um acerto é uma molécula em um estágio precoce de caracterização para a qual já pode ter sido conduzida uma produção em pequena escala. Tal molécula se encontra no estágio de validação de caracterização.
[0063] Conforme usado em todos os exemplos acima, uma molécula guia indica uma molécula cujo potencial de ligação e neutralização já foi quantificado. A produção de uma molécula guia já ocorreu em grande escala.
[0064] Nos exemplos abaixo é descrito um modo possível de se geral um anticorpo monoclonal totalmente humano neutra-lizador de GM-CSF humano e a geração de seus fragmentos.
[0065] A finalidade deste experimento é o isolamento e a subclonagem do gene que codifica a VH no mAb materno produzido pela linhagem de células de hibridoma HB
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9569. O hibridoma HB-9569 foi obtido de ATCC (usa) . As células de hibridoma forma cultivadas em meio de cultura completo de ATCC: meio RPMI 164 0 com 2 mM de L-glutamina ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, 10 mM de HEPES, e 1,0 mM de piruvato de
sódio e suplementado com 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 10% de
soro fetal bovino a 37°C com 5% de CO2. Para a proteína de
RNA total, foram usadas 1 x 107 células e o RNA foi
preparado do modo descrito no manual de produto do kit
Qiagen Omni-Skript Kit (Qiagen, Alemanha). O DNAc foi sintetizado de acordo com métodos padrão (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Segunda Edição).
[0066] Para o isolamento do DNA de região V de cadeia pesada, conduziu-se RT-PCR empregando-se o conjunto de iniciadores MHALT1R.V: GCC GAA TTC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT e Race GSP rIgG2a/b: CAC ACC GCT GGA CAG
GGC TCC AGA GTT CC. O seguinte programa de PCR foi usado
para a amplificação: A desnaturação a 94 °C durante 15
segundos , o anelamento de iniciador a 52 °C durante 50
segundos e a extensão do iniciador a 72 °C durante 90
segundos foram conduzidos em 40 ciclos, estendendo -se
finalmente a 72°C durante 10 minutos. Os fragmentos V de DNA de cadeia pesada foram então isolados de acordo com protocolos padrão.
[0067] O fragmento V de DNA de cadeia pesada foi clonado em PCR script-CAM (Stratagene) conforme descrito pelo fabri-cante. As sequências foram identificadas por sequenciamento.
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Exemplo 2.2: Seleção de um VL humano [0068] A finalidade deste experimento consiste na seleção de um VL humano que possa se emparelhar com o VH materno clonado conforme descrito.
Exemplo 2.2.1.: Isolamento de RNA das células B positivas para IgD.
[0069] 100 mL de sangue foram tirados de doadores humanos sadios. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por um gradiente de ficoll de acordo com métodos padrão. Para se selecionar células positivas para IgD, 1 mL de microesferas de IgG anti-murina (CELLectionTM Pan Mouse IgG Kit: DYNAL) foi revestido com 20 pg de anticorpo IgD murino anti-humano (PharMingen). Aproximada-mente 2,5 x 107 PBMCs foram acrescentadas às microesferas e incubadas a 4°C durante 15 minutos. Depois de se lavar quatro vezes com 1 mL de meio RPMI (BioChrom) , as células positivas para IgD foram liberadas das microesferas, acrescentando-se 8 pL de tampão de liberação (DNase) e foram transferidas para um tubo fresco. Por este método puderam ser obtidas de 0,9 x 105 a 3,7 x 106 células positivas para IgD. O RNA total foi isolado de células positivas para IgD usando-se o kit RNeasy ® Midi Kit (QIAGEN) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNAc foi sintetizado de acordo com métodos padrão (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Segunda Edição).
Exemplo 2.2.2: Amplificação por PCR de regiões variáveis de cadeia leve (regiões VL)
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57/124 [0070] Para o isolamento de DNA de região V de cadeia leve, conduziu-se RT-PCR usando-se conjuntos de iniciadores V-kapa-(5'-huVK1-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3'), 5'-huVK2/4-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC-3'), 5'-huVK3SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3'), 5'-huVK5-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3'), 5'-huVK6-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3'), 3'-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI (5'GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3'), 3'hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI (5'GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3'), 3'hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3'). O RNA proveniente de células B positivas para IgD foi transcrito em DNAc (conforme descrito acima) e usado como DNA de gabarito em reações de PCR. Por cada reação PCR, um iniciador 5' foi combinado com um iniciador 3'. O número de reações PCR diferentes foi determinado pelo número de combinações possíveis de iniciadores 5' e 3'. Foi usado para a amplificação o programa de PCR abaixo: A desnaturação 94°C durante 15 segundos, o anelamento do iniciador a 52°C durante 50 segundos e a extensão do iniciador a 72°C durante 90 segundos foram conduzidos durante 40 ciclos, seguidos por uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Os fragmentos de DNA V de cadeia leve foram então isolados de acordo com protocolos padrão.
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Exemplo 2.2.3: Construção da biblioteca - clonagem do conjunto de VL humano [0071] Uma biblioteca de exibição em fagos foi em geral construída com base em procedimentos padrão, conforme descrito, por exemplo, em “Phage Display: A Laboratory Manual”; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
[0072] Os iniciadores selecionados para a amplificação por PCR deram origem a sítios de reconhecimento 5'-SacI e 3'-SpeI para os fragmentos V de cadeia leve. Duas reações de ligação foram montadas consistindo cada uma delas em 400 ng dos fragmentos kapa de cadeia leve (digeridos com SacI-SpeI) e 1400 ng do plasmídeo pBluescript KS+ (digeridos por SacI-SpeI; fragmento grande). Cada um dos dois conjuntos V resultantes de cadeia leve de anticorpo foi então transfor-mado em 300 pL de Escherichia coli XL1 Blue eletrocompetente por eletroporação (2,5 kV, cubeta de intervalo de 2 cm, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes Biorad) resultando em um tamanho de biblioteca de 5,8 x 108 clones independentes.
[0073] Os fragmentos kapa de DNA (cadeia leve) provenien-tes de diferentes amplificações de PCR receberam os pesos para cada ligação do seguinte modo: Cada iniciador 5' define um grupo específico. Dentro destes grupos, os iniciadores 3' definem os subgrupos. Os subgrupos receberam os pesos 1:2:1:1 correspondentes aos iniciadores 3'-hu-VkJ1-SpeI-BsiWI: 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI: 3'-hu-Vk-J3-SpeIBsiWI: 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI. Os grupos receberam os pesos
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59/124 de acordo com a sua distribuição na linhagem germinal 1:1:1:0,2:0,2 correspondendo aos iniciadores 5'-huVK1-Sac2001: 5'-huVK3-Sac-2001: 5'-huVK2/4-Sac-2001: 5'-huVK5-Sac2001: 5'-huVK6-Sac-2001.
[0074] Depois da eletroporação o ensaio foi incubado em caldo SOC (Fluka) para a expressão do fenótipo. As culturas foram então incubadas em 500 mL de meio de seleção SB contendo 50 pg/mL de carbenicilina e 2% peso/volume de glicose de um dia para o outro. No dia seguinte, as células foram coletadas por centrifugação e a preparação de plasmídeos foi conduzida usando-se um kit de preparação de plasmídeo disponível no comércio (Qiagen).
Exemplo 2.2.4: Construção da biblioteca de anticorpo - VL humano - VH materno [0075] Foi conduzida PCR para amplificar VH materno a partir do vetor que contém VH materno descrito acima no Exemplo 2.1. Para a amplificação foi seguido um protocolo de PCR de acordo com procedimentos padrão usandose o iniciador 5' MVH8 (5'-GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT-3') e o iniciador 3'-3'-MuVHBstEII (5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3').
[0076] Depois da purificação do produto de amplificação de aproximadamente 350 pb a partir de um gel de agarose analítico, o fragmento de DNA foi cortado com as enzimas de restrição BstEII e Xhol. O fagemídeo pComb3H5BHis (este vetor é descrito na dissertação de tese de Dr. Ralf Lutterbuse) foi digerido de acordo e o fragmento grande foi ligado com o fragmento mencionado acima. Depois da
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60/124 transformação em E. coli XL1 Blue, foi cultivado um único clone em 100 mL de meio SB (contendo 50 pg/mL de carbenicilina) e o plasmídeo foi preparado de acordo com protocolos padrão. A clonagem bem sucedida foi confirmada por sequenciamento do inserto (Sequiserve, Munique).
[0077] Este vetor pComb3H5BHis/VH materno foi restrito com as enzimas de restrição SacI e Spel. O fragmento de vetor grande foi isolado. O DNA de plasmídeo contendo a biblioteca VK do Exemplo 2.2.3 foi restringido com as enzimas de restrição SacI e Spel. Foi isolada a faixa de fragmento pequeno VK (aproximadamente 350 pb).
[0078] 1200 ng do fragmento de vetor foram ligados com 400 ng dos fragmentos VK e transformados em 300 pL do E. coli XL1 Blue eletrocompetente por eletroporação (2,5 kV, cubeta com um intervalo de 0,2 cm, 25 mF, 200 Ohm) resul-tando em uma biblioteca de scFv total com um tamanho de 2,8 x 108 clones independentes.
[0079] Depois da expressão do fenótipo e da lenta adapta-ção à carbenicilina, a biblioteca de anticorpos foi trans-ferida para o meio de seleção SB-Carbenicilina (50 pg/mL). A biblioteca de anticorpos foi então infectada com uma dose infecciosa de 1 x 1012 partículas de fagos auxiliares VCSM13 resultando na produção de secreção de fago M13 filamentoso, em que cada partícula de fago continha DNA de pComb3H5BHis de um único filamento codificando um fragmento scFv meio-humano e apresentava a proteína de scFv correspondente em forma de uma fusão traducional à proteína III de cápside do fago.
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Exemplo 2.2.5: Seleção de exibição em fago de um VL humano [0080] As partículas de fagos portando o repertório de scFv foram coletadas do sobrenadante de cultura por preci-pitação com PEG8000/NaCl e centrifugação. Em seguida de aproximadamente 1 x 1011 a 1 x 1012 partículas de fagos de scFv foram ressuspensas em 0,4 mL de PBS/0,1% de BSA e incubadas com rhGM-CSF recombinante biotinilado solúvel (produzido em E. coli, conforme descrito acima no exemplo 1) durante 2 horas com uma leve agitação em um volume total de 0,5 mL. (Concentrações de antígenos. Ciclos 1-3: 100 nM; ciclo 4 10 M; ciclo 5: 1 nM) . Em seguida acrescentaram-se 6,7 x 107 microesferas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) e incubaram-se com uma leve agitação durante 30 minutos.
[0081] Os fagos de scFv que não se ligaram especifica-mente ao antígeno alvo foram eliminados por etapas de lavagem com PBS/0,1% de BSA. Para tal fim, foram coletados complexos de microesferas de estreptavidinaantígeno bioti-nilado (com os ligantes potenciais a scFv) com um imã e foram ressuspensos em 1 mL de solução de lavagem (uma etapa de lavagem). Este procedimento de lavagem foi repetido até quatro vezes em outros ciclos.
[0082] Depois de se lavar, as entidades de ligação foram eluídas usando-se HCl-glicina, pH 2,2. Depois da neutra-lização com Tris a 2M, pH 12, o eluato foi usado para infec-ção da cultura fresca de E. coli XL1 Blue não infectado. Para se eluir as entidades de alto grau de ligação restantes esta etapa foi repetida usando-se HCl
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62/124 glicina, pH 1,0. Este segundo eluato foi novamente neutralizado e usado para a infecção de uma cultura fresca não infectada de E. coli XL1 Blue. As duas culturas infectadas de E. coli foram então misturadas e as células que foram transduzidas com sucesso com uma cópia de fagemídeo, codificando um fragmento scFv humano, foram então novamente selecionadas para resistência a carbenicilina e subsequentemente infectadas com o fago auxiliar VCSM13 para iniciar o segundo ciclo de exibição de anticorpo e seleção in vitro.
[0083] O DNA de plasmídeo que corresponde a 4 e 5 ciclos de panning foi isolado de culturas de E. coli. Para a produção de proteína solúvel de scFv, fragmentos de DNA de VL foram excisados dos plasmídeos (SacI-SpeI) e clonados por meio dos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His com o VH materno diferindo do pComb3H5BHis /VH materno pelo fato de que a construção de expressão (scFv, por exemplo) inclui um identificador Flag (TGDYKDDDDK) entre o scFv e o identificador de His6 e as proteínas de fago adicionais são deletadas.
[0084] Depois da ligação, cada combinação (diferentes ciclos de panning) do DNA de plasmídeo foi transformada em 100 pL de E. coli Xl1 Blue competente para choque térmico e disposto em placas de LB-agar de carbenicilina. Colônias individuais foram coletadas em 100 pL de LB-carb (50 pg/mL).
[0085] 10 pL desta suspensão de células foram tipicamente incubados em 5 mL de meio SB suplementado com
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63/124 carbenicilina até uma concentração de 50 pg/mL e MgCl2 até uma concen-tração final de 10 mM durante aproximadamente 6 horas a 37°C com agitação. Em seguida acrescentou-se IPTG até uma concen-tração final de 1 mM e a incubação foi continuada de um dia para o outro em um agitador a 30°C. As células foram centri-fugadas até formar um grânulo e este grânulo foi tipicamente ressuspenso em 0,5 mL de PBS. Com quatro ciclos de congela-mento a -70°C e descongelamento a 37°C, destruiu-se a membrana externa das bactérias por choque osmótico e as proteínas periplásmicas solúveis inclusive os scFvs foram liberadas no sobrenadante. Depois da eliminação de células intactas e detritos celulares por uma centrifugação posterior (5 minutos a 10.000 x g), o sobrenadante (isto é, PPP) contendo os scFvs foi coletado e ainda mais examinado.
[0086] O antígeno rhGM-CSF (Leukine Liquid, Immunex) foi imobilizado em placas ELISA de um dia para o outro a 4°C (50 pL de 1 pg de antígeno/mL de PBS por poço). Depois de se ter lavado os poços uma vez com PBS e bloqueando-se com PBS 3% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente, acrescentaram-se 100 pL de PPPs contendo scFvs foram acrescentados aos poços e incubados tipicamente durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de três lavagens com PBS/0,05% de Tween 20, a detecção de fragmentos scFv ligados ao antígeno imobili-zado foi conduzida usandose um M2 anti-flag (1 pg/mL de PBS/1% de BSA) e detectou-se com anticorpo policlonal espe-cífico a Fab2 caprino antimurino conjugado a peroxidase de rábano (Dianova, 1 pg/mL,
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PBS/1% de BSA) . O sinal foi reve-lado acrescentando-se uma solução de substrato de 2,2'-azino-di [ácido-3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico] (ABTS) e detectado a um comprimento de onda de 405 nm de acordo com protocolos padrão .
[0087] A partir de 20 clones testados (10 obtidos depois de 4 ciclos e 10 obtidos depois de 5 ciclos de panning), cinco lisados mostraram sinais ELISA intensos em contraste com PBS como um controle negativo no antígeno recombinante. Os resultados de ELISA são apresentados na Figura 1, em que as diversas moléculas de scFv testadas são dispostas ao longo do eixo dos x e o eixo de y apresenta a intensidade de absorção medida, indicando a absorção maior uma ligação mais forte. O controle negativo PBS é indicado no eixo dos x na extremidade esquerda. As moléculas de scFv que apresentam uma ligação considerável são indicadas acima da coluna de intensidade de absorção respectiva ou com um losango ou com um asterisco. O losango e o asterisco na Figura 1 repre-sentam duas sequências diferentes, isto é, o scFv cuja coluna de intensidade de absorção é indicado com um losango era de uma sequência, ao passo que todos os scFvs cujas colunas de intensidade de absorção são indicadas por asteriscos compar-tilham a mesma sequência comum.
[0088] Os cinco clones positivos para ELISA foram subme-tidos a sequenciamento de DNA. O sequenciamento foi condu-zido em Sequiserve (Munique). Um total de quatro clones compartilhavam a sequência de DNA que corresponde ao scFv 5-306 ao passo que a outra sequência (4-301) foi
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65/124 identificada somente uma vez. A sequência dominante correspondente a scFv 5-306 assim como a sequência 4-301 eram de origem humana e apresentava uma homologia muito próxima à sequência de linha germinal humana Vk1-O12.
Exemplo 2.2.6: Caracterização de construções de acerto de scFv derivadas da seleção de huVL [0089] A finalidade dos experimentos abaixo era a carac-terização dos acertos de scFv gerada pelos métodos descritos acima.
Exemplo 2.2.6.1: Expressão e purificação em pequena escala de acertos de scFv (derivados conforme descrito acima) em E. coli [0090] Para se obter as PPPs, as células foram cultivadas em meio SB suplementado com 20 mM de MgCl2 e carbenicilina a 50 pg/mL e foram redissolvidas em 1 mL de PBS depois de coletadas. A membrana externa das bactérias foi destruída por choque térmico (quatro ciclos de congelamento a -70°C e descongelamento a 37°C), e as proteínas periplásmicas solú-veis incluindo os scFvs foram liberadas para o sobrenadante. Depois de se ter eliminado as células intactas e os detritos de células por centrifugação, os sobrenadantes contendo os scFvs foram coletados e examinados ainda mais. Para a puri-ficação subsequente, 25 pL de NaH2PO4 a 20 mM, NaCl a 400 mM, imidazol a 250 mM, pH 7,0 foram acrescentados a uma PPP respectivo. A PPP foi purificada por meio de Colunas de rotação Ni-NTA Spin Columns (Qiagen) conforme recomendado no manual. Resumindo, uma solução de PPP respectiva foi acres-centada à coluna
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66/124 pré-equilibrada para se ligar à resina. As colunas de Spin foram lavadas duas vezes com NaH2PO4 a 20 mM, NaCl a 400 nM, imidazol a 20 mM, pH 7,0. A proteína que se ligou foi eluída duas vezes em 100 pL de NaH2PO4 a 20 mM, NaCl a 400 mM, imidazol a 250 mM, pH 7,0. As proteínas de scFv purificadas foram ainda analisadas no tocante à inten-sidade de ligação (taxa de dissociação cinética) e capaci-dades de neutralização (inibição de proliferação de TF-1 dependente de GM-CSF) conforme será descrito nos exemplos subsequentes. Embora não se separe e se distinga entre as conformações diferentes possíveis do scFv, esta purificação bruta de PPP resulta em proteína de scFv com 80% de pureza conforme avaliado por análise de Western blot (dados não apresentados).
Exemplo 2.2.6.2: Inibição de rhGM-CSF rotulado com FITC.
[0091] A finalidade deste experimento consiste em mostrar que os clones de scFv identificados são capazes de inibir a ligação de rhGM-CSF ao complexo de receptor de GM-CSF exibido na superfície de células TF-1. Seria de se esperar que as neutralizações de construções de scFv competiriam pelo epítopo de ligação a receptor na molécula de rhGM-CSF, tornando impossível ao rhGM-CSF se ligar ao complexo receptor de GM-CSF. Na medida em que a ligação por rhGM-CSF ao seu receptor é inibida do modo exposto acima, seria de se esperar uma redução na intensidade de tingimento de células TF-1 com fluorescência por rhGM-CSF rotulado por fluores-ceína (rhGM-CSF-FITC) em um ensaio à base de citometria de fluxo.
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67/124 [0092] Será descrito abaixo o desempenho de um tal ensaio à base de citometria de fluxo. Uma concentração final de 0,4 pg/mL de conjugado rhGM-CSF-FITC em PBS foi incubada com 10 pg/mL do anticorpo progenitor ou extrato periplásmico não diluído do scFv que foi purificado com Coluna de Spin de NiNTA. Deixou-se que as amostras de proteínas se equili-brassem a 25°C durante 1 hora antes da adição de uma suspensão de células TF-1. As células TF-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco; L-glutamina, isento de vermelho fenol), 10% de FCS inativadas por calor na ausência de rhGM-CSF de um dia para o outro. Uma concentração final de 2 x 106 célula/mL e 150 pL de suspensão de células foram usados por amostra. As células foram coletadas por centrifugação a 500 x g a 4°C durante 3 minutos e lavadas duas vezes com tampão FACS. As células lavadas foram ressuspensas em 100 pL de amostra de proteína pré-equilibrada contendo o rhGM-CSF-FITC e o anticorpo progenitor respectivo o scFv. As amostras foram incubadas a 4°C durante 60 minutos. Depois de duas outras lavagens, as células foram ressuspensas em 150 pL de tampão FACS gelado e subsequentemente analisadas por cito-metria de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 2. Mais especificamente, a Figura 2 mostra um gráfico em que diversas moléculas de teste são dispostas ao longo do eixo de x e em que a intensidade média de fluorescência (MFI) é indicada no eixo de y. Conforme se pode ver na Figura 2, uma nítida de perda de intensidade de fluorescência das células TF-1 foi observada com o anticorpo progenitor (segundo da esquerda ao
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68/124 longo do eixo de x). A ligação por competição a rhGM-CSF da molécula scFv designada 5-306 pode ser monito-rada por perda de tingimento de fluorescência de células TF-1 ao passo que a molécula 4-301 de scFv praticamente não apresentou nenhum efeito. Como estes resultados sugerem que a molécula de scFv designada 5-306 pode ser um neutralizador promissor de GMCSF, uma análise posterior da atividade neutralizadora foi restrita ao scFv 5-306.
Exemplo 2.2.6.3: Expressão em grande escala e purificação de guia de scFv [0093] A produção de proteínas e purificação em uma grande escala foi conduzida do seguinte modo. Resumindo, BL21DE3 DE E. colí foram transformadas com o plasmídeo de expressão e cultivadas a 37°C em 1 L de meio seletivo até uma densidade ótica a 600 nm de 0,5-0,8. A produção de proteína foi induzida com a adição de IPTG até 1 mM e as culturas foram incubadas durante outras 16 horas com agitação a uma temperatura de 25°C. As células foram coletadas por centrifugação a 5.000 x g durante 10 minutos e ressuspensas em 100 mL de 1 x PBS. As proteínas periplásmicas foram extraídas por congelamento em sequência ótimo em etanol/gelo seco e descongelamento em um banho-maria a 37°C durante quatro ciclos. Finalmente o extrato foi centrifugado a 10.000 x g durante 20 minutos.
[0094] O scFv 5-306 foi isolado em um processo de purificação de cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC) e filtração por gel. Todas as guias foram purificadas de acordo com este método. Para a cromatografia
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69/124 foram usados Akta® FPLC System (Pharmacia) e Software Unicorn®. Todos os produtos químicos eram de categoria para pesquisa e adquiridos de Sigma (Deisenhoven) ou Merck (Darmstadt).
[0095] IMAC foi conduzida usando-se uma coluna Qiagen Ni-NTA Superflow de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A coluna fio equilibrada com tampão A2 (10 mM de fosfato de sódio, pH 7,2, 0,4 M de NaCl) e a PPP (100 mL) foi aplicada à coluna (2 mL) a uma taxa de fluxo de 2 mL/minuto. A coluna foi lavada com 4 volumes de coluna de tampão B2 a 5% (fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,2, NaCl a 0,4 M, imidazol a 0,5 m), para se remover a amostra que não se ligou. A proteína que se ligou foi eluída usando-se 100% de tampão B2 em 5 volumes de coluna. Frações de proteína eluída foram combinadas para uma purificação subsequente.
[0096] A cromatografia por filtração por gel foi condu-zida em uma coluna HiLoadTM 16/60 Superdex 75 Prep Grade (Pharmacia) equilibrada com PBS (Gibco) . As amostras eluídas de proteína (taxa de fluxo 1 mL/minuto) foram submetidas a SDS-PAGE padrão e a Western Blot para detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). A separação dependente de tamanho na coluna Superdex 75 Prep Grade resultou em frações de picos nitidamente distinguíveis de monômero e de dímero associativo das guias de scFv. As concentrações de proteína foram determinadas medindo-se a densidade ótica a 280 nm e
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70/124 foram calculadas usando-se o coeficiente de extinção molecular específico a sequência da guia respectiva de scFv.
Exemplo 2.2.6.4: Inibição de proliferação de células TF-1 dependente de rhGM-CSF por uma guia de scFv [0097] A finalidades deste experimento consiste em se obter informações qualitativas sobre a atividade neutrali-zadora do scFv 5-306 meio-humano usando-se a linhagem de células TF-1 (DSMZ ACC 334) dependente de hGMCSF. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco; L-glutamina, isento de vermelho fenol), 10% de FCS inativadas por calor na presença de 2,5 ng/mL de rhGM-CSF conforme descrito pelo distribuidor (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemãnha). As células foram cultivadas até uma densidade celular de 0,5 x 106 células/mL. Para o teste de proliferação as células TF-1 foram coletadas por centrifugação a 300 x g durante 4 minutos e lavadas com 1 x PBS (Dulbeco' s, Gibco). As células foram ressuspensas a uma concentração final de 1 x 105 células/mL em RPMI 1640, 10% de FCS e foram usados 90 pL de suspensão de células por placa de microtitulação de cultura celular de fundo chato (0,9 x 104 células/poço). Foi usada uma concentração final de 0,3 ng/mL de rhGM-CSF para estimular a proliferação das células TF-1. Para a neutralização da proliferação dependente de hGM-CSF acrescentaram-se 10 pL de scFv purificado a 100 pL de uma solução de TF-1 e rhGM-CSF em uma série de diluições que variaram de aproximadamente 100 pg/mL a 100 pg/mL. As amostras foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 durante 72 horas. Depois de 72 horas, foi
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71/124 determinado o estado proliferativo das células TF-1, acrescentando-se WST-1 e monitorando-se a alteração colorimétrica com um leitor ELISA a 450 nm Os dados foram ajustados para uma meia inibição máxima de proliferação (IC50) usando-se o ajuste da curva de regressão não linear do software Prism.
[0098] Pôde ser observado um efeito inibidor de prolife-ração nitidamente dependente de dose de scFv 5-306 e foi comparável para as formas conformacionais monoméricas e diméricas. Ajustando-se para a meia inibição máxima de proliferação, foi determinado um valor IC50 de 7,3 nM para a forma monomérica e 3,5 nM para a forma dimérica. Os resultados são apresentados na Figura 3.
Exemplo 2.3: Construção das bibliotecas de anticorpos e seleção de exibição em fagos de VHs humanos [0099] A finalidade dos experimentos abaixo é a seleção de um conjunto de regiões VH humanas que se emparelhassem com a região VL humana de scFv 5-306 selecionada conforme descrito acima.
Exemplo 2.3.1: Isolamento de RNA das células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
[00100] 100 mL de sangue foram tirados de cinco doadores humanos sadios. As células mononucleares do sangue perifé-rico (PBMCs) foram isoladas por um gradiente de ficoll de acordo com métodos padrão. O RNA total foi isolado das PBMCs usando-se o kit RNeasy® Midi Kit (QIAGEN) seguindo-se as instruções do fabricante. O DNAc foi sintetizado de acordo com métodos padrão (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Segunda Edição).
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Exemplo 2.3.2: Amplificação por PCR de regiões variáveis de cadeia pesada (regiões VH).
[00101] A biblioteca VH foi construída e denominada Lib 134-VH. Esta biblioteca de VH consiste no repertório humano de FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3 provenientes das regiões VH ampli-ficadas por PCR da combinação de PBMC descrita acima, ligadas operativamente à CDR3 de VH do anticorpo progenitor seGuidas por uma sequência de linhagem germinal FR4 humana.
[00102] Para o isolamento de regiões VH de gabarito humano, conduziu-se RT-PCR usando-se um conjunto de iniciadores 5' específicos a VH (5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 (5'AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3'), 5'-huVH4-XhoI-2001 (5'CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'), 5'-huVH4B-XhoI- 2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3')) e um conjunto de iniciadores 3' específicos a VH (3'-hu-VH-BstEII-2001 (5'CTG AGG AGA CGG TGA CC-3'), 3'-hu-VH-J3-BstEII- 2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3')). Por reação de PCR, um iniciador 5' foi combinado com um iniciador 3' : o número de diferentes reações de PCR foi determinado pelo número de combinações possíveis de iniciadores 5' e 3'. O DNAc de PBMC (conforme descrito acima de quatro doadores somente foi usado como
fonte de genes de VH). O programa de PCR abaixo foi usado
para a amplificação: A desnaturação a 94 °C durante 15
segundos, o anelamento do iniciador a 52 °C durante 50
segundos e a extensão do iniciador a 72°C durante 60 segundos foram conduzidos durante 40 ciclos, seguido por uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Os produtos de amplificação
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com um tamanho de apro-ximadamente 350 pb foram isolados de
acordo com métodos padrão.
[00103] Para o isolamento de regiões VH de Lib
134, a RT-PCR foi conduzida em duas etapas. Primeiro, os
segmentos VH de cadeia pesada humanos (FR1-CDR1-FR2-CDR2FR3) foram amplificados por PCR a partir dos fragmentos VH do gabarito isolados, usando-se o mesmo conjunto de iniciadores 5' específicos a VH que foi descrito acima (5'huVH1,3,5-XhoI-2001, 5'-huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI2001) e um conjunto de iniciadores 3' específicos (3'-Lib 134-VH-1A-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC-3'), 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 (5'GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGY ACA GTA ATA CAC RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGC ACA GTA ATA CAA RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-4-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT SGC ACA GTA ATA CAC
RGC-3')) para as subfamílias de VH 1, 3 e 4 que se
emparelham na região muito terminal de FR3.
[00104] Foram usadas as seguintes combinações de
inicia-dores:
a) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3
b) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3
c) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3
d) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3
e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3 '-Lib 134- VH-4-MH3
f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'- Lib 134 -VH-4-MH3
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74/124 [00105] Por reação de PCR um iniciador 5' foi combinado com o iniciador 3'; o número de diferentes reações PCR foi determinado pelo número de combinações possíveis de
inicia-dor 5 ' e iniciador 3' . O programa de PCR abaixo foi
usado para a amplificação : A desnaturação a 94°C durante 15
segundos, o anelamento de iniciador a 52°C durante 50
segundos e a extensão do iniciador a 72°C durante 90
segundos foram conduzidos durante 40 ciclos, seguidos por uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Através desta etapa de PCR e da sequência do iniciador 3' respectivo, os segmentos VH humanos são prolongados para uma parte do CDR3 de VH de progenitor, que em seguida por sua vez se torna o sítio de iniciação para o iniciador 3' de PCR de segunda etapa.
[00106] Estes fragmentos de DNA de VH-(FR1-CDR1FR2-CDR2-FR3) DNA foram então usados como gabaritos em uma segunda reação de PCR usando-se novamente o iniciador 5' específico a VH respectivo e um iniciador 3' universal que corresponde ao terminal 3' universal dos fragmentos de DNA amplificados (3'-Lib 134-JH3-BstE2, 5'-AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC CCA GTA ATC AAA GTA GAC TGC-3').
[00107] Foi usado o seguinte programa de PCR para a amplificação:
[00108] A desnaturação a 94°C durante 15
segundos, o anelamento de iniciador a 52°C durante 50
segundos e a extensão do iniciador a 72°C durante 60
segundos foram conduzidos durante 40 ciclos, seguidos por
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75/124 uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Os fragmentos V de DNA foram isolados de acordo com protocolos padrão.
Exemplo 2.3.3: Construção de biblioteca - clonagem do conjunto de VH humano [00109] Em um segundo ciclo do método acima, foi escolhido o VL humano de scFv 5-306 identificados na primeira seleção anterior, e foi combinado subsequentemente com a biblioteca de fragmentos VH humanos descritos no Exemplo 2.3.4 com a finalidade de se gerar um scFv humano. Uma biblioteca de exibição em fagos foi construída em geral com base em procedimentos padrão, tais como, por exemplo, os descritos em “Phage Display: A Laboratory Manual”; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
[00110] Os fragmentos de DNA de cadeia pesada provenientes de amplificações de diferentes PCR receberam os seguintes pesos para cada ligação, a saber:
a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, tendo a-f os seguintes significados:
a) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
b) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
c) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
d) 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
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e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-
Lib 134-JH3-BstE2
f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x
3'-Lib 134-JH3-BstE2 [00111] Uma reação de ligação foi montada consistindo em 400 ng de conjunto de fragmentos Lib 134-VH humanos (digeridos por XhoI-BstEII) e 1200 ng do plasmídeo pComb3H5BHis/VL de 5-306 (o DNA que codifica a região VL do scFv 5-306 foi clonado por meio dos sítios de restrição SacI e SpeI no pComb3H5BHis de acordo com procedimentos padrão). O conjunto de VH humanos de anticorpos resultante foi então transformado em 300 pL de E. coli Xl1 Blue eletrocompetente por eletroporação (2,5 kV, cubeta de intervalo de 2 cm, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes Biorad) resultando em uma
biblioteca com um tamanho de um total de 1,6 x 108 clones
independentes.
[00112] Depois da eletroporação, o ensaio foi
incubado em caldo SOC (Fluka) para a expressão do fenótipo.
Cada uma das culturas foi então incubada em 500 mL de meio de seleção SB contendo 50 pg/mL de carbenicilina e 2% v/v de glicose de um dia para o outro. No dia seguinte, as células das culturas foram coletadas por centrifugação e a preparação do plasmí-deo foi conduzida usando-se um kit de preparação de plas-mídeo disponível no comércio (Qiagen) para preservar a biblioteca de DNA.
[00113] 1,5 pg da combinação de plasmídeos que codificava a combinação respectiva de scFv foi então submetida a eletroporação em E. coli XL1 blue (2,5 kV,
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77/124 cubeta de intervalo de 2 cm, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes Biorad) resultando em um tamanho de biblioteca de um total de 2,4 x 109 10 clones independentes. Depois da expressão do fenótipo e de uma lenta adaptação à carbenicilina, a biblioteca de anticorpos foi transferida para o meio de seleção SB-Carbe-nicilina (50 pg/mL). A biblioteca de anticorpos foi então infectada com uma dose infecciosa de 1 x 1012 partículas de fago auxiliar VCSM13 resultando na produção e secreção do fago filamentoso M13, contendo cada partícula de fago DNA de pComb3H5BHis de um só filamento que codifica um fragmento scFv humano e exibido na proteína de scFv correspondente como uma fusão traducional para a proteína III de cápside de fago.
Exemplo 2.3.4: Seleção de exibição em fago de um VH humano [00114] A biblioteca de fagos resultante portando o repertório clonado de scFv foi coletada do sobrenadante de cultura por precipitação com PEG 8000/NaCl e centrifugação. Aproximadamente 1 x 1011 a 1 x 1012 de partículas de fagos de scFv foram ressuspensas em 0,4 mL de PBS/0,1 de BSA e incubadas com rhGM-CSF solúvel biotinilado recombinante (material e E. coli, conforme descrito no exemplo 1) durante 1 hora com uma suave agitação em um volume total de 0,5 mL. Em seguida acrescentaram-se 6,7 x
107 microesferas magné-ticas de estreptavidina (Dynabeads M280-Streptavidin, Dynal) e incubadas em seguida com uma leve agitação durante 30 minutos.
[00115] Os fagos de scFv que não se ligassem especifica-mente ao antígeno alvo foram eliminados por
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78/124 etapas de lavagem com PBS/0,1% de BSA. Para tal fim, os complexos antígeno biotinilado-microesfera de estreptavidina (com os ligantes potenciais de scFv) foram coletados por um ímã e ressuspensos em 1 mL da solução de lavagem (uma etapa de lavagem) . Este procedimento de lavagem foi repetido até quatro vezes. Depois da lavagem, as entidades de ligação foram eluídas usando-se HCl-glicina pH 2,2 e depois de neutralização com Tris a 2M pH 12, o eluato foi usado para infecção de uma cultura fresca não infectada de E. coli XL1 Blue.
[00116] Para se eluir as entidades restante com alto grau de ligação, as microesferas foram ressuspensas diretamente em 200 pL de uma cultura fresca de E. coli XL1 Blue(DO 600> 0,5) e incubadas durante 10 minutos com uma leve agitação. As duas culturas foram então misturadas e as células trans-duzidas com sucesso com uma cópia de fagemídeo, codificando um fragmento scFv humano, foram novamente selecionadas para resistência a carbenicilina e infectadas subsequentemente com fagos auxiliares VCMS13 para iniciar o segundo ciclo de exibição de antibiótico e seleção in vitro.
[00117] Um total de 4 ciclos de seleções foram conduzidos para os dois anticorpos. As concentrações de antígenos foram reduzidas durante a seleção até as concentrações finais seguintes:
1° ciclo 100 nM
2° ciclo 10 nM
3° ciclo 10 nM
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4° ciclo 10 nM [00118] O DNA de plasmídeo de culturas de E. coli foi isolado correspondendo a 3 e 4 ciclos de panning.
[00119] Para a produção de proteína de scFv solúvel, os fragmentos de DNA de VH-VL foram excisados dos plasmídeos (Xhol e Spel) e clonados pelos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His (sem as proteínas de fago adi-cionais necessárias para a infecção por fagos). Depois da ligação, cada cm (diferentes ciclos de panning) de DNA de plasmídeos foi transformada em 100 pL de E. coli TG1 compe-tente para choque térmico e disposta sobre carbenicilina LB-agar. As colônias individuais foram coletadas e inoculadas em 120 pL de LB carb (50 pg/mL) 1% de glicose em placas de 96 poços (Greiner) . Os poços foram selados com uma membrana semipermeável (Greiner) e as placas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C em um incubador de agitação (placa mestra). em seguida 10 pL das culturas da placa mestra foram transferidas para uma segunda placa de 96 poços (placa operacional) contendo 90 pL de LB carb (50 pg/mL) 0,1% de glicose por poço. Depois de incubação durante 4 horas em um incubador de agitação a 37°C, a produção de scFv foi induzida acrescentando-se 20 pL de LB carb 5 mM de IPTG a cada poço. Depois de uma outra etapa de incubação de um dia para o outro a 30°C com agitação, as células foram submetidas a lise em uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente com 4 0 pL de tampão de lise (400 mM de ácido bórico, 320 mM de NaCl, 4 mM de EDTA, pH 8, 2,5 mg/mL de lisozima). As células residuais
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80/124 e os detritos de células foram separados por centrifugação durante 12 minutos a 1.900 x g (Hettich).
[00120] Os sobrenadantes contendo moléculas de scFv foram então testados para ligação em ensaios ELISA.
[00121] A detecção de fragmentos scFv ligados ao antígeno rhGM-CSF imobilizado (Leukine) foi conduzida usando-se um anti-flag M2 (1 pg/mL PBS/1% de BSA) detectado com anticorpo policlonal específico a Fab2 caprino antimurino conjugado a peroxidase de rábano (Dianova, 1 pg/mL PBS/1% de BSA). O sinal foi revelado acrescentando-se uma solução de substrato ABTS e detectado a um comprimento de onda de 405 nm.
[00122] Dos aproximadamente 100 clones testados depois do terceiro ciclo de seleção, 12 clones apresentaram uma ligação forte ao rhGM-CSF. Dos aproximadamente 160 clones testados depois do quarto ciclo mais de 80% dos lisados apresentaram fortes sinais ELISA em comparação com PBS como um controle negativo no antígeno recombinante. Os resultados dos clones representativos são ilustrados na Figura 4, em que estes clones representativos são dispostos ao longo do eixo de x e a intensidade de absorvência é indicada no eixo de y. Conforme se pode ver da Figura 4, o controle negativo PBS (segundo a partir da direita no eixo de x) não apresentou nenhuma ligação considerável, ao passo que os clones repre-sentativos de scFv scFv A, scFv 3035, scFv 3039, scFv 3080 e scFv 5-306 apresentaram graus diferentes de intensidade de ligação por ELISA.
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81/124 [00123] Todos os lisados foram testados sem rhGM-CSF em experimentos paralelos para a ligação inespecífica ao agente de bloqueio. Nenhum sinal detectável significativo pôde ser observado, indicando a especificidade da ligação ao rhGM-CSF.
[00124] As sequências de DNA de mais de 13 clones de scFv positivos para ELISA foram determinadas. Ao todo foram identificadas seis sequências diferentes. Todas as sequên-cias eram de origem humana e próximas à sequência de linha-gem germinal humana VH-1 1-O2.
Exemplo 2.3.5: Caracterização de construções de scFv humano contendo regiões VL e VH
Exemplo 2.3.5.1: Produção e purificação em grande escala de construções guias de scFv produzidas pelo método descrito no
Exemplo 3 [00125] As guias de scFv foram isoladas e purificadas conforme descrito no Exemplo 2.2.6.3.
Exemplo 2.3.5.2: Análise de cinética de ligação de guias de scFv por ressonância de plasmônio de superfície (SPR) [00126] A finalidade do experimento é a caracterização em profundidade das guias de scFv. A cinética de ligação (kd e ka) das guias de scFv foram medidas por injeção de 10 pL de proteína purificada em séries de diluição variando de 10 pg/mL a 1 pg/mL de scFv purificado e monitorando-se a dissociação a 25°C durante 100 segundos. A proteína foi tamponada com HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0, 005% de tensoativo P20) . Os dados foram ajustados usando-se o software BIAevaluationTM
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82/124 deter-minando a taxa constante para a cinética de dissociação e associação com uma equação de ligação de
Langmuir a 1:1 (Fórmulas 1 e 2) em que A é a concentração de análito injetado e B é a concentração do ligante dB/dt = -(ka *[A]*[B] -kd*[AB]) (1) dAB/dt = - (ka *[A]*[B]-kd*[AB]) (2) [00127] As curvas de ligação cinética foram determinadas usando-se até 8 concentrações de cada guia de scFv anali-sada. O ajuste independente dos dados brutos resultou em constantes de taxa de dissociação e associação que foram usadas para se calcular a constante de dissociação de equilíbrio (KD, os resultados são mostrados na Tabela 1).
Ka[1/Ms] Kd[1/s] KD [M] IC50[nM]
3035 1,6 x 105 ± 1,1 x 105 1,5 x 10-3 ± 0,4 x 10-3 0,9 x 10-8 3,2
3039 0,6 x 104 ± 0,4 x 104 0,9 x 10-4 ± 0,1 x 10-4 1,7 x 10-6 130,5
scFvA 1,7 x 106 ± 1,1 x 106 1,6 x 10-3 ± 0,2 x 10-3 1,2 x 10-9 2,6
3080 1,0 x 105 ± 0,5 x 105 3,5 x 10-3 ± 0,2 x 10-3 3,5 x 10-8 19, 1
2.3.5.3: Inibição de proliferação de células TF-1 dependente de rhGM-CSF por guias de scFv [00128] Depois da confirmação de que a intensidade de ligação específica foi preservada nas guias de scFv, a finalidade deste experimento consistiu em avaliar a especi-ficidade da interação da guia de scFv com o antígeno rhGM-CSF. A inibição da função biológica do
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83/124 antígeno rhGM-CSF por ligação do scFv foi caracterizada em um experimento de inibição de proliferação de TF-1.
[00129] Os experimentos de inibição de proliferação de TF-1 foram conduzidos conforme descrito acima. As células foram ressuspensas a uma concentração fina de 1 x 105 células/mL em RPMI 1640, 01% de FCS e foram usados 90 pL de suspensão de células por poço (0,9 x 104 células/poço). Uma concen-tração final de 0,3 ng/mL de rhGMCSF foi usada para estimular a proliferação das células TF1. Para a neutra-lização da proliferação dependente de rhGMCSF acrescentou-se scFv purificado em 1 x PBS em uma série de diluições com concentrações de proteína finais variando de 100 pg/mL a 10 pg/mL. 10 pL de solução de proteína filtrada com esterili-zação e submetida a diálise (filtro de 0,22 pm)foram acres-centados a 100 pL de solução de TF-1 e rhGM-CSF. As amostras foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 durante 72 horas. Depois de 72 horas, o estado proliferativo das células TF-1 foi determinado acrescentando-se WST-1 e monitorando-se a alte-ração colorimétrica com um leitor ELISA a 450 nm (Figura 5). Conforme se pode ver na figura 5, a atividade de neutrali-zação do GM-CSF humano é claramente demonstrada. scFv A apresentou a atividade neutralizadora mais forte.
Exemplo 2.4: Otimização das características de ligação dos scFvs selecionados [00130] Foi contemplado que a atividade biológica de um agente neutralizador para um ligante monomérico pode ser melhorada ou mesmo otimizada aumentando
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84/124 se a intensidade de ligação entre o neutralizador e o ligante, especialmente aumentando-se a taxa de dissociação do neutralizador.
[00131] Isto pode ser obtido, de preferência, produzindo-se a mutação da sequência da região respectiva VH e VL de um modo aleatório (inserindo-se uma ou mais mutações aleatória-mente em toda a sequência ou (ii) inserindo-se mutações individuais ou mutações múltiplas contíguas (trechos de cinco, seis, sete, oito, nove ou dez aminoácidos, por exem-plo) em regiões dos scFv que têm uma grande probabilidade de interagir com o antígeno. Os mutantes respectivos devem ser então caracterizados para qualquer aumento em atividade ou, antes da caracterização, devem ser enriquecidos para as qualidades preferenciais (ligação mais intensa, por exemplo) por meios de seleção adequada (isto é, exibição em fagos).
Exemplo 2.4.1: Aumento da afinidade por mutação de CDR3 de VH em uma ou mais posições [00132] Para se melhorar as características de ligação de um fragmento de anticorpo, de uma molécula de scFv, por exemplo, por mutações de pontos individuais ou por trechos curtos de aminoácidos, devem ser tomados com alvos resíduos de aminoácidos que têm uma probabilidade muito grande de interagir com o antígeno respectivo. Com esta abordagem, não é necessário se testar mais do que um número limitado somente de mutantes sem reduzir a probabilidade de sucesso. A CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo ou seu fragmento geralmente contribui muito para a ligação total de
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85/124 um antígeno por este anticorpo ou fragmento de anticorpo. Foi, portanto, contem-plado que um meio promissor de se aumentar a afinidade de ligação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode consistir em se submeter a mutação a sequência de nucleo-tídeos que codifica para CDR3 de VH.
[00133] Uma variedade de diferentes metodologias existe para a condução de tal mutagênese aleatória direcionada, sendo alguns deles descritos abaixo nos termos de como a afinidade de ligação de moléculas de scFv descrita acima podem ser aumentada:
[00134] A) Para se atingir a CDR3 de VH um sítio de restrição adequado deve ser introduzido na sequência de nucleotídeos no interior da CDR3 de VH, de preferência pela síntese genética da região VH tal como uma sequência de nucleotídeos de CDR3 modificada mantendo-se a sequência original de aminoácidos (Entelechon, Alemanha). Por meio da clivagem pela enzima de restrição respectiva e acrescen-tando-se S1 nuclease/DNA polimerase I de Klenow e dGTP seguida por um duplex oligomérico mutante, uma mutagênese aleatória direcionada em uma ou mais das posições de amino-ácidos pode ser conduzida, de acordo com Matteucci e Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983) . As VHs submetidas a mutagênese são subsequentemente combinadas com a VL respectiva (por meio de um linker adequado) em um vetor adequado de expressão de scFv e transformada em células de E. coli. As colônias individuais que expressam os scFvs variantes podem então ser coletadas e testadas para scFvs melhorados, conforme descrito para os teste e
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86/124 caracterização de acertos e guias de scFv nos exemplos anteriores.
[00135] B) Um método alternativo consiste na mutagênese mediada por oligonucleotídeo por um método de duplo inicia-dor, conforme descrito em detalhes em Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) “A laboratory manual”. Em essência a região VH é clonada em um vetor à base de M13 e é isolado o plasmídeo de um só filamento. Um iniciador capaz de se hibridizar ao gabarito de plasmídeo de um só filamento contendo uma sequência aleatorizada é anelado e estendido. Depois da propagação da combinação de plasmídeos respectivos em E. coll, as VHs mutadas podem ser coletadas da combinação de plasmídeos e combinadas com a VL original (por meio de um linker adequado) em um vetor de expressão scFv adequado e transformadas em células de E. coll. As colônias individuais que expressam os scFvs variantes são coletadas e testadas para scFvs melhoradas, conforme descrito para o teste e caracterização de acertos e guias de scFv nos exemplos anteriores.
[00136] C) Uma outra alternativa consiste em se produzir a mutação de até seis ou mesmo mais aminoácidos contíguos. Para tal fim, pode ser construída uma variante de deleção da sequência de nucleotídeos de VH tendo um a CDR3 e FR4 deletadas. Esta construção é usada como um gabarito para uma amplificação por PCR de uma ou de duas etapas em que um iniciador 5' adequado (hibridizando-se à extremidade 5' da sequência de VH e acrescentando um sítio de clonagem adequado) é combinado com um conjunto de iniciadores 3' que anelam
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87/124 na extremidade 3' da região FR3 como gabarito e acrescentam uma região CDR3 e FR4 (com um sítio de restrição adequado) ao fragmento de amplificação. Este conjunto de iniciadores 3' contém uma sequência de um ou mais tripletos para inserir códons aleatórios no interior da sequência de CDR3. Esta combinação de regiões VH contendo regiões CDR3 aleatorizadas pode então ser subsequentemente combinada com a VL respectiva (por meio de um linker adequado) em um vetor de expressão de scFv adequado e transformada em células de E. coli. As colônias individuais que expressam as scFvs variantes são então coletadas e testadas para scFvs melhoradas conforme descrito para o teste e caracterização de acertos e guias de scFv nos exemplos anteriores.
[00137] As combinações respectivas de scFvs mutados que têm uma diversidade maior (conforme pode ser facilmente testado) podem ser clonadas em um vetor de exibição em fago adequado e os scFvs melhorados podem então ser selecionados por exibição em fagos no antígeno de interesse, de prefe-rência em condições de concentrações de antígenos decres-centes para se selecionar afinidades maiores. As seleções de exibição em fagos são conduzidas de acordo com os protocolos padrão conforme descrito em outro ponto do presente docu-mento. Qualquer um dos métodos A a C acima pode ser combi-nado ou conduzido em ciclos repetidos para melhorar ainda mais e otimizar os scFvs já modificados.
Exemplo 2.4.2: Aumento da afinidade por mutação das regiões V aleatoriamente em toda a sequência integral.
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88/124 [00138] Em vez de se mutar sítios específicos do scFv que tem uma grande probabilidade de interagir com o antígeno respectivo, uma abordagem mais pragmática pode ser conduzida introduzindo-se mutações em pontos em toda a sequência integral de Vh e/ou VL e estando-se em seguida para scFvs otimizadas ou selecionando-se e testando-se para scFvs otimizados. A título de exemplo, a sequência de VH e/ou VL pode ser mutagenizada usando-se cepas mutadoras de E. colí (conforme descrito em Low et al. 260: 359 ff J. Mol. Bio. (1996)) ou incorporação falha de nucleotídeos por DNA polimerases conforme descrito em detalhe em Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) “A laboratory manual”. A clonagem, expressão e seleção de variantes otimizadas de moléculas de scFv podem ser conduzidas por exibição em fagos ou pela tecnologia frequentemente usada de exibição em ribossomo conforme descrito em EP 0 975 748 A1). As versões otimizadas são expressas em sistemas adequados de vetor/E. colí para se testar os candidatos de scFvs melhorados.
[00139] Uma metodologia adequada conforme descrita acima no Exemplo 2.4 foi aplicada para se otimizar uma guia de scFv representativa (scFv A), resultando em uma classe de fragmentos de anticorpos neutralizadores monoclonais humanos anti-GM-CSF representados pelas moléculas B-N de scFv. As características destas moléculas de scFv serão elucidadas e descritas com mais detalhes nos exemplo abaixo. A geração de moléculas de IgG monoclonal a partir das moléculas selecio-nadas de scFv é descrita no exemplo baixo.
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Exemplo 3: Clonagem e expressão eucariótica de anticorpos monoclonais a partir de scFvs selecionados [00140] Embora se saiba que as bactérias expressam frag-mentos Fab funcionais, elas geralmente não são capazes de produzir imunoglobulinas funcionais completas. Para a produ-ção de anticorpos funcionais completos, devem ser usadas células de mamíferos, e portanto a região VL de scFv 5-306 e diferentes de regiões VH de moléculas de scFv selecionadas nos exemplos anteriores foram subclonadas em vetores de expressão de mamíferos (especialmente as regiões VH de scFv A e de scFv B).
Exemplo 3.1: Clonagem da cadeia leve humana com base em scFv 5-306 [00141] Para se gerar sítios de restrição de terminal adequados, o fragmento de DNA que codifica a região VL de scFv 5-306 foi reamplificado por PCR, resultando em frag-mentos Vkappa com um sítio Bsu36I na extremidade 5' e um sítio Xho I na extremidade 3' . Este fragmento foi então subclonado no plasmídeo BSPOLL por Bsu36 I e Xho I usando-se o iniciador 5' (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAG TCTCCATCTTCCGTGTCTGC-3') e o iniciador 3' (5'-CATGCACTCGAGCT TGGTCCCTCCGCCGAAAG-3' ) , acrescentando assim uma sequência líder de mamífero e uma região constante humana Ckappa e foi verificado por sequenciamento. Utilizando-se EcoRI e SalI, o DNA de Vl-Ckappa de 5-306 foi excisado de BSPOLL e subclonado no vetor de expressão eucariótico pEF-ADA derivado do vetor de expressão pEF-DHRF (Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7021-5) por substituição do DNAc que
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90/124 codifica diidrofolato reductase (DHFR) murina por aquele que codifica a adenosina desaminase (ADA) murina.
Exemplo 3.2: Clonagem de domínios variáveis de cadeia pesada humana [00142] A partir de diferentes regiões VH humanas selecio-nadas nos exemplos anteriores (especialmente regiões VH de scFv A e de scFv B) , a região variável foi reamplificada por PCR, gerando sítios de restrição Bsu36I nas duas extremi-dades. para todas as construções foi usada a combinação de dois iniciadores: iniciador 5' VH-Bsu36I (5'-ACGTCACCTTAGGTG TCCACTCCCAGGTGCAGCTGGT CCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGC-3') e iniciador 3' (5'ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTC CCTTG-3'). Os fragmentos de DNA resultantes foram então subclonados usando-se estes sítios de restrição no vetor de expressão eucariótico pEFDHFR já contendo uma sequência líder euca-riótica e um fragmento de DNA que codifica a região cons-tante de cadeia pesada de IgG1 humana. As regiões variáveis de cadeia pesada foram assim inseridas entre a líder e a região constante de cadeia pesada. As sequências corretas das regiões variáveis foram confirmadas por sequenciamento.
Exemplo 3.3: Conversão de fragmentos scFv em IgGs humanas completas [00143] O plasmídeo que codifica a cadeia leve (VL 5-306/Ckappa) e o plasmídeo que codifica uma cadeia pesada (VH/região constante de IgG1 humana) foram cotransfectados em células HEK de acordo com protocolos padrão para expres-são temporária de proteínas e as células
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91/124 foram cultivadas para permitir a expressão e a produção das imunoglobulinas no meio de cultura, Deste modo, foram produzidas IgG A, derivando de scFv A e IgG B derivando de scFv B. Depois do período de produção respectivo, os sobrenadantes foram cole-tados e as imunoglobulinas humanas foram isoladas por cromatografia de Proteína A de acordo com protocolos padrão para a purificação de imunoglobulinas. As imunoglobulinas purificadas foram então usadas para experimentos de caracte-rização subsequentes
Exemplo 3.4: Reconversão de IgGs específicas em fragmentos scFv [00144] As regiões VH provenientes de construções de IgG (IgG A e IgG B, conforme descritas acima) foram reclonadas em um vetor de expressão de scFv adequado de acordo com protocolos padrão e foram acopladas operativamente através de um linker flexível à região VL oriunda da cadeia leve humana do Exemplo 3.1. Estas construções foram produzidas de modo solúvel no periplasma de E. coli, conforme descrito acima. A caracterização destes scFvs (scFv O, derivado de IgG A e scFv P derivado de IgG B) é descrita nos exemplos abaixo.
Exemplo 4: Avaliação da especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal humano anti-GM-CSF para GM-CSF de primata e humano.
[00145] A finalidade deste experimento consistia em mostrar que um anticorpo obtido conforme apresentado acima se liga especificamente a GM-CSF. Portanto, a ligação de tal anticorpo a fatores estimuladores de colônia
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92/124 recombinantes humanos (rh) diferentes (rhG-CSF e rhM-CSF, Strathmann) foi comparada à ligação do mesmo anticorpo a rhGM-CSF por ELISA.
[00146] 50 pL do antígeno específico (1 pg/mL em ps) foram dispostos sobre uma placa ELISA (Nunc, Maxisorp) durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de se ter lavado três vezes com PBS/0,05% de Tween 20, os poços foram bloqueados com 200 pL de PBS/3% de pó de leite desnatado seco por cavidade durante 1,5 hora à temperatura ambiente lavando-se em seguida 3 vezes com PBS/0,05% de Tween 20. 50 pL/poço de uma série de anticorpos humanos (IgG A e IgG B, por exemplo), cada um com cadeias leves idênticas de sequência de acordo com a SEQ ID NO: 34 mas com cadeias pesadas diferentes de acordo com as SEQ ID NOs: 35-48 foram acres-centados em uma série de diluições variando de 1 pg/mL a 0,5 ng/mL (em PBS/0,05% de Tween 20/3% de pó de leite desnatado seco) e incubados durante 1 hora. Depois de 3 lavagens com PBS/0,05% de Tween 20, o anticorpo que se ligou foi detectado usando-se 50 pL de um anticorpo IgG antihumano caprino conjugado a peroxidase de rábano (Dianova; diluído a 1:1000 em PBS/0,05% de Tween 20/3% de leite em pó desnatado seco). O sinal foi revelado acrescentando-se uma solução de ABTS (Roche) a 50 pL/poço e a absorção foi medida
a 405 nm usando-se um comprimento de onda de 450 nm como
referência.
[00147] Foram usados anticorpos de coelho
disponíveis no comercio (Strathmann Biotech AG) específicos
para rhM-CSF e rhG-CSF, respectivamente, como controles
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93/124 positivos para a ligação destes antígenos, sendo tal ligação detectada com anticorpos caprino anti-coelho conjugado a fosfatase alca-lina. O sinal foi revelado com uma solução de pNpp (Sigma) a 50 pL/poço e a absorção foi medida a 405 nm usando-se um comprimento de onda de 450 nm como referência.
[00148] Os resultados são mostrados nas Figuras 6a para dois anticorpos humanos representativos, IgG A e IgG B.
[00149] Conforme se pode ver na Figura 6A, o aumento da concentração do anticorpo titulado levou a um aumento em absorção, indicando uma boa ligação a rhGM-CSF para os dois anticorpos representativos IgG A e B. A Figura 6B mostra os resultados da ligação dos mesmos dois anticorpos represen-tativos a rh M-CSF. Conforme se pode ver nesta figura, o aumento das concentrações de um anticorpo de coelho anti-rhM-CSF levou a um aumento da absorção, isto é, ao aumento da ligação deste anticorpo de controle (pontos sólidos), ao passo que os dois anticorpos representativos descritos acima (quadrados sólidos e triângulos sólidos) são sobrepostos como uma absorvência de linha de base contínua que não aumenta com o aumento da concentração do anticorpo de teste. Um resultado completamente análogo é observado tanto para o anticorpo de controle como para as IgGs A e B de teste representativas na Figura 6C, mostrando os resultados de ligação a rhG-CSF.
[00150] Tomados em conjunto, os dados apresentados nas Figuras 6A, 6B e 6C indicam que os dois anticorpos de teste representativos IgGs A e B se ligam
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94/124 especificamente a rhGM-CSF, mas não a outros fatores estimuladores de colônia tais como M-CSF e G-CSF. Tal especificidade de ligação a antígeno é importante para um anticorpo agente terapêutico promissor.
Exemplo 5: Caracterização de dados de ligação para anticorpos monoclonais humanos anti-GM-CSF e seus fragmentos.
[00151] Era desejável se gerar uma classificação qualita-tiva de diversos membros identificados como ligantes posi-tivos de rhGM-CSF por ELISA, conforme descrito acima no Exemplo 2. A classificação foi destinada a refletir parâmetros cinéticos (taxa de dissociação) e equilíbrio (afinidade) de diversos ligantes de anticorpos representativos deste modo identificados. Para tal fim, foi conduzida ressonância de plasmônio de superfície (SPR) no aparelho BIAcoreTM 200, Biacore AB (Uppsala, Suécia) com uma taxa de fluxo de 5 pL/ minuto e HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensoativo P20) como tampão operacional a 25°C. O GM-CSF humano recombinante (Leukine Berlex, doravante alternativamente denominado “o antígeno” ou “rhGMCSF”) produzido em levedura foi imobilizado sobre células de fluxo 2-4 sobre um chip sensor CM5. A superfície do chip foi ativada injetando-se 80 pL de sódio hidróxi succinimida a 0,1 M, N-etil-N' (3-dimetil aminopropil)-carbodiimida a 0,4 M (NHS/EDC). O antígeno foi acoplado por injeção manual de 10 pg/mL de rhGM-CSF em acetato de sódio a 0,01 M, pH 4,7. Diferentes densidades do antígeno foram imobilizadas sobre células de fluxo 2-4 ajustando-se a quantidade de tempos de injeção manual. A célula de fluxo 1 foi deixada sem modifi
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95/124 cação ao passo que a célula de fluxo 2 foi revestida com a densidade mais alta possível de rhGM-CSF (800 RU). A célula de fluxo 3 foi revestida com 50% da quantidade de antígeno imobilizado na célula de fluxo 2 e a célula de fluxo 4 foi revestida com a mais baixa densidade de rhGM-CSF (típicamente 10%). A superfície ativada do chip sensor foi bloqueada injetando-se 85 pL de etanolamina a 1M e deixou-se o chip se equilibrar de um dia para o outro a uma taxa de fluxo constante de 5 pL/minuto de HBS-EP.
Exemplo 5.1: Determinação qualitativa de parâmetros de ligação cinéticos (taxa de dissociação) para fragmentos de scFv de anticorpos humanos monoclonais anti-GM-CSF.
[00152] Experimentos BIAcore foram conduzidos conforme apresentado no parágrafo precedente. Antes do experimento submeteram-se as soluções de proteína da preparação peri-plásmica (PPP) a diálise contra PBS a 25°C durante 2 horas e diluiu-se a 1:1 em HBS-EP. As características cinéticas de ligação dos membros da classe reivindicada foram medidas injetando-se 10 pL de solução de proteína periplásmica purificada a 25°C sobre o chip sensor. A adsorção de fundo não específica da proteína à superfície de chip sensor não modificada (FC1) foi subtraída do sinal de resposta nas células de fluxo imobilizadas de rhGM-CSF (FC2, FC3, FC4). O sinal de resposta relativo (FC2-1, FC3-1, FC4-1) foi deter-minado e a taxa de dissociação específica foi monitorada durante 100 segundos.
[00153] Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 7A durante uma série de fragmentos de
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96/124 scFv represen-tativos que tinham sido anteriormente identificados com ligantes positivos a rhGM-CSF em experimentos ELISA. Os fragmentos de anticorpo scFv representativos para os quais os dados Biacore são mostrados na Figura 7A são os seguintes: scFv A, scFv B, scFv C, scFv D, scFv E, scFv F, scFv G, scFv H, scFv I, scFv J, scFv K, scFv L, scFv M e scFv N.
[00154] Em geral, quando se interpretam os resultados Biacore, a amplitude do pico de ligação (RUmax) se correla-ciona diretamente à concentração de proteína na amostra injetada. A taxa de associação cinética (ka) é dependente de concentração e, devido às concentrações variáveis de proteí-na na PPP, não pode ser usada para a classificação qualita-tiva dos membros da classe reivindicada. A taxa de dissocia-ção cinética (kd) é independente da concentração de proteína e característica para a intensidade de ligação dos membros respectivos da classe reivindicada. Todos os membros identi-ficados da classe reivindicada apresentam uma ligação espe-cífica ao rhGM-CSF imobilizado. Foram identificados os mem-bros da classe reivindicada que tinham a melhor taxa de dissociação aparente e, depois de uma subsequente correlação dos dados de SPR com os dados de inibição, foram submetidos à determinação de afinidade por meio de experimentos de ligação de equilíbrio no BIAcore.
[00155] Ao se examinar a Figura 7A, portanto, observam-se picos distintos para cada um dos fragmentos de anticorpo scFv A-N representativos, cujas porções superiores
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97/124 mostram uma curvatura característica que pode ser extrapolada para se obter uma taxa de dissociação para o fragmento scFv em questão. Qualitativamente, portanto, podese concluir que cada um dos fragmentos de scFv representativos se liga bem ao GM-CSF humano.
Exemplo 5.2: Determinação quantitativa dos parâmetros de ligação de equilíbrio (afinidade) para determinados anticorpos humanos anti-GM-CSF e seus fragmentos de scFv [00156] Tendo-se estabelecido, qualitativamente no Exemplo 5.1 que um número de fragmentos de scFv de anticorpos anti-GM-CSF que tinham tesado positivos anteriormente para ligação a GM-CSF por ELISA demonstram taxas de dissociação cinética razoáveis quando ligados ao GM-CSF humano, era então dese-jável se obter uma representação quantitativa de tal ligação para anticorpos e seus fragmentos focalizando-se nas carac-terísticas de ligação de equilíbrio a GM-CSF humano recom-binante. Conforme apresentado acima no Exemplo 4, a ligação específica ao antígeno - neste caso rhGM-CSF - é um dos atributos característicos e específicos da classe de anticorpos anti-GM-CSF e seus fragmentos conforme reivindicado no presente documento.
[00157] A cinética de ligação (a taxa de dissociação, kd, e a taxa de associação, ka) de determinados membros repre-sentativos da classe de anticorpos humanos anti-GM-CSF e seus fragmentos foi medida injetando-se 10 pL de proteína purificada (isto é, anticorpo ou seu fragmento) em uma série de diluições que variam de 10 pg/mL a 1 pg/mL
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98/124 de proteína purificada e monitorando-se a dissociação a 25°C durante 100 segundos. A proteína purificada foi tamponada com HBS-EP. Os dados foram ajustados usando-se o software BIAevaluationTM, determinando-se a taxa constante para a cinética de disso-ciação e associação com uma equação de ligação de Langmuir a 1:1 (veja as Fórmulas 1 e 2 abaixo), em que A é a concen-tração do analito de proteína purificada injetado e B[0] é Rmax:
dB/dt = -(ka *[A]* [B]-kd*[AB]) (Fórmula 1) dAB/dt = - (ka *[A]*[B]-kd*[AB]) (Fórmula 2) [00158] Curvas de ligação cinética foram determinadas com até 8 concentrações de cada anticorpo humano anti-GM-CSF representativo ou seu fragmento analisado. O ajuste indepen-dente dos dados brutos resultou em constantes de taxas de dissociação e associação que foram usadas para se calcular a constante de dissociação de equilíbrio (KD) . Os resultados obtidos para cada anticorpo humano anti-GM-CSF represen-tativo ou seu fragmento são mostrados nas Figuras 7B-I. Especificamente, a Figura 7B mostra os dados de ligação obtidos para a IgG B representativa; a Figura 7C mostra os dados de ligação obtidos para IgG A representativa; a Figura 7D mostra os dados de ligação obtidos para scFv C repre-sentativo; a Figura 7E mostra os dados de ligação obtidos para scFv I representativo; a Figura 7F mostra os dados de ligação
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obtidos para scFv B representativo; a Figura 7G mostra os
dados de ligação obtidos para scFv A represen-tativo; a
Figura 7H mostra os dados de ligação obtidos para scFv E
representativo; a Figura 7I mostra os dados de ligação obtidos para scFv D representativo. Os dados estão resumidos abaixo na Tabela 2.
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Tabela 2: Dados de ligação de afinidade quantitativos para determinados anticorpos anti-GM-CSF humanos representativos e seus fragmentos
Anticorpo/ seu fragmento Na Figura Ka (s-1M-1) Kd(s-1) KD (M)
scFv A 7G 4,4exp5 ± 3,00exp5 1,84exp-3 ± 6,55exp-4 4,17exp-9
scFv B 7F 1,01exp6 ± 4,08exp5 8,07exp-4 ± 3,73exp-5 7,98exp-10
scFv E 7H 1,26exp5 ± 5,57exp4 2,55exp-4 ± 8,12exp-5 2,03exp-9
scFv C 7D 1,73exp5 ± 8,23exp4 4,77exp-4 ± 1,91exp-4 2,7 exp-9
scFv D 7I 7,60exp5 ± 6,70exp5 8,66exp-4 ± 2,13exp-4 1,14exp-9
scFv E 7E 2,32exp6 ± 2,13exp5 3,47exp-4 ± 8,78exp-5 1,50exp-9
IgG A 7C 2,09exp6 ± 1,32exp6 1,81exp-4 ± 8,77exp-5 8,7 0exp-11
IgG B 7B 3,63exp5 ± 2,40exp5 1,68exp-5 ± 5,74exp-6 4,64exp-11
Exemplo 6: Exigências mínimas de epítopo para um fragmento representativo determinado de um anticorpo humano anti-GM-CSF [00159] Era desejável se determinar o epítopo ligado por anticorpos humanos anti-GM-CSF e seus fragmentos conforme descrito e reivindicado no presente documento. Para tal fim, foi conduzido uma análise de detecção de peptídeo (pepspot) usando-se scFv A como um membro representativo desta classe de moléculas e GM-CSF humano como antígeno.
[00160] Geralmente um experimento pepspot é conduzido do seguinte modo. Peptídeos 13meros sobrepostos derivados da sequência de aminoácidos de hGM-CSF (para a sequência de GM-CSF de seres humanos e de determinados outros primatas, veja acima assim como a Figura 8A, assim como SEQ ID NOs: 49-51) foram ligados por covalência a uma
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101/124 membrana de celulose Whatman 50 pelo terminal C, permanecendo o terminal N aceti-lado livre. Os peptídeos 13meros individuais gerados (por JPT Peptide Technologies GmbH) são mostrados abaixo na Tabela 3. O comprimento de sequências sobrepostas de quaisquer dois peptídeos respectivos foi ajustada para 11 aminoácidos. De acordo com o protocolo do fabricante, a membrana foi enxaguada com EtOH absoluto durante 1 minuto, lavando-se em seguida com TBS e bloqueando-se com TBS/3% de BSA de um dia para o outro. Tal como ocorreu com todas as incubações e lavagens subsequentes, o bloqueio foi conduzido à tempera-tura ambiente. Depois de se ter lavado 3 vezes com TBS/0,05% de Tween 20 durante 10 minutos, a membrana foi incubada com 1 pg/mL de scFv A em tbs/3% de bsa durante 2,5 horas, lavandose em seguida, conforme antes. A detecção das scFv foi obtida usando-se um anticorpo anti-Penta-His (Qiagen, 0,2 pg/mL em TBS/3% de BSA) e em seguida um anticorpo IgG caprino anti-murino (específico a Fc-gama) conjugado a peroxidase de rábano (Dianova, a 1:10000 em TBS/3% DE BSA), sendo a incubação com estes anticorpos respectivos conduzida durante 1 hora. Depois de se ter lavado 3 vezes com TBS/ 0,05% de Tween 20 durante 10 minutos, o sinal foi revelado por quimioluminescência intensificada (SuperSignalWest Pico Luminol/Enhancer Solution e SuperSignalWest Pico StablePeroxide Solution; Pierce) e exposição a uma película BioMax (Kodak) .
[00161] Foram detectados sinais intensos de ligação de scFv A a trechos de GM-CSF humano em um trecho de
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102/124 pontos de peptídeos entre o ponto A e B assim como no ponto C (veja Tabela 3 abaixo e na Figura 8B) . Conforme se pode ver na Figura 8B, a ligação a outros pontos parece ser de uma intensidade menor. O trecho de pontos abrangendo os pontos A e B corresponde aos resíduos de aminoácidos 15-35. Todos os peptídeos 13meros que constituem esta região contêm um trecho mínimo de aminoácidos de aminoácidos 23-27 (RRLLN). O ponto C corresponde aos resíduos de aminoácidos 65-72 (GLRGSLTKLKKGPL) do GM-CSF humano. Estas descobertas indicam que scFv A tem uma probabilidade de reconhecer um epítopo descontínuo.
[00162] Na estrutura secundária de GM-CSF humano, os aminoácidos 15-35 estão situados na hélice A, ao passo que os resíduos que correspondem ao ponto C são parte de uma estrutura de alça localizada entre as hélices C e D. Um modelo tridimensional do dobramento da molécula revela uma proximidade estérica grande destes sítios entre si.
[00163] O motivo de sequência de aminoácidos mínimo nos peptídeos de pontos A-B corresponde aos resíduos 23-27 de GM-CSF humano (RRLLN). Uma intensidade de sinal aumentada do ponto A ao B pode ser explicada pela acessibilidade melhor do epítopo RRLLN no peptídeo que corresponde ao ponto B do que no peptídeo que corresponde ao ponto A. No Peptídeo A, o epítopo está localizado diretamente no terminal C que está ligado à membrana ao passo que no peptídeo B ele está localizado no terminal N mais acessível do peptídeo.
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Tabela 3: Sequências de peptídeos 13meros sobrepostos imobilizados na membrana de celulose
1. APARSPSPSTQPW 16. DTAAEMNETVEVI 31. LYKQGLRGSLTKL 46. TPETSSATQTITF
2 . ARSPSPSTQPWEH 17. AAEMNETVEVISE 32. KQGLRGSLTKLKG 47. ETSSATQTITFES
3. SPSPSTQPWEHVN 18. EMNETVEVISEMF 33. GLRGSLTKLKGPL (C) 48. SSATQTITFESFK
4 . SPSTQPWEHVNAI 19. NETVEVISEMFDL 34. RGSLTKLKGPLTM 49. ATQTITFESFKEN
5 . STQPWEHVNAIQE 20. TVEVISEMFDLQE 35. SLTKLKGPLTMMA 50. QTITFESFKENLK
6. QPWEHVNAIQEAR 21. EVISEMFDLQEPT 36. TKLKGPLTMMASH 51. ITFESFKENLKDF
7. WEHVNAIQEARRL 22. ISEMFDLQEPTSL 37. LKGPLTMMASHYK 52. FESFKENLKDFLL
8 . HVNAIQEARRLLN (A) 23. EMFDLQEPTSLQT 38. GPLTMMASHYKQH 53. SFKENLKDFLLVI
9. NAIQEARRLLNLS 24. FDLQEPTSLQTRL 39. LTMMASHYKQHSP 54. KENLKDFLLVIPF
10. IQEARRLLNLSRD 25. LQEPTSLQTRLEL 40. MMASHYKQHSPPT 55. NLKDFLLVIPFDS
11. EARRLLNLSRDTA 26. EPTSLQTRLELYK 41. ASHYKQHSPPTPE 56. KDFLLVIPFDSWE
12. RRLLNLSRDTAAE (B) 27. TSLQTRLELYKQG 42. HYKQHSPPTPETS 57. FLLVIPFDSWEPV
13. LLNLSRDTAAEMN 28. LQTRLELYKQGLR 43. KQHSPPTPETSSA 58. LVIPFDSWEPVQE
14. NLSRDTAAEMNET 29. TRLELYKQGLRGS 44. HSPPTPETSSATQ
15. SRDTAAEMNETVE 30. LELYKQGLRGSLT 45. PPTPETSSATQTI
Exemplo 7: Potência de neutralização de determinados anticorpos humanos anti-GM-CSF humano/fragmentos seus Exemplo 7.1: Avaliação qualitativa do potencial de neutralização de determinados anticorpos humanos anti-GM-CSF humano e de seus fragmentos [00164] A finalidade deste experimento é a obtenção de informações qualitativas sobre a atividade de neutralização de anticorpos neutralizadores humanos anti-GMCSF e seus fragmentos. Para tal fim foi usada a linhagem de células TF-1 (DSMZ, ACC 334) dependente de GM-CSF humano. A taxa de proliferação desta linhagem de células depende da presença de GM-CSF humano, de modo que, para se determinar
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104/124 se tal atividade de neutralização de fato existe ou não, pode ser usada a medição do crescimento das células depois de incu-bação das células com GM-CSF humano com ou sem um anticorpo que se suspeita que tenha uma atividade neutralizadora de GM-CSF.
[00165] Células TF-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco; L-glutamina, isento de vermelho fenol), 10% de FCS inativadas por calor na presença de 2.5 ng/mL rhGM-CSF, conforme descrito pelo distribuidor (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Ale-manha). As células foram cultivadas a uma densidade de células de 0,5 x 106 células/mL. Para o ensaio de prolife-ração as células TF-1 foram coletadas a centrifugação a 300 x g durante 4 minutos e lavadas com 1 x PBS (Dulbecco' s, Gibco) . As células foram ressuspensas a uma cnn final de 1 x 105 células/mL em RPMI 1640, 10% de FCS e foram usados 90 pL de suspensão de células por poço de placa de cultura de fundo chato de microtitulação (0,9 x 104 células/poço). Foi usada uma concentração final de 0,3 ng/mL de rhGM-CSF para se estimular a proliferação das células TF1. Para a neutralização da proliferação dependente de GMCSF, PPP purificada dos fragmentos representativos de um anticorpo anti-GM-CSF foi submetida a diálise contra 1 x PBS a 25°C durante 2 horas. 10pL da solução de proteína submetida a diálise e esterilizada por filtração (filtro de 0,22 pm) foram acrescentados a 100 pL de solução contendo TF-1 e rhGM-CSF.
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105/124 [00166] Depois de incubação durante 72 horas a 37°C a 5% de CO2, a situação proliferativa das células TF-1 foi determinado com ensaio colorimétrico baseado na clivagem de sais de tetrazólio (WST-1, Roche) por desidrogenase mitocon-drial em células viáveis. O corante formazan formado por células metabolicamente ativas foi quantificado medindose sua absorvência com um leitor ELISA A 450 nm.
[00167] A inibição da proliferação de células TF-1 depen-dente de GM-CSF humana pelos fragmentos representativos testados dos fragmentos de anticorpos humanos anti-GM-CSF humano tinham intensidades variáveis (Figura 9) . Embora dois tais fragmentos não tivessem um efeito neutralizante (scFv F e scFv L); cinco construções (scFv J, scFv K, scFv M, scFv N e scFv H) apresentavam uma inibição intermediária e sete construções (scFv B, scFv I, scFv E, scFv D, scFv G, scFv C, scFv A) apresentaram uma inibição intensa da proliferação de células TF-1 dependente de GM-CSF. A falta ou um grau menor de efeito neutralizador poderiam ser devidos a um nível mais baixo de expressão do scFv representativo específico ou a um complexo menos estável formado entre um scFv representativo específico e rhGM-CSF durante o período de incubação de 72 horas a 37°C.
Exemplo 7.2: A avaliação quantitativa de potencial de neutralização de determinados anticorpos humanos anti-GM-CSF humano e seus fragmentos, conforme medida por proliferação celular [00168] Moléculas de scFv representativo selecionadas mostradas acima como apresentando uma intensa inibição de proliferação de TF-1 foram então submetidas a
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106/124 uma análise quantitativa de eficácia de neutralização. Para tal fim, foi usada a mesma linhagem humana de células TF-1 dependentes de GM-CSF (DSMZ ACC 334). As células TF-1 foram cultivadas e preparadas para o ensaio de proliferação conforme descrito em detalhes no Exemplo 7.1 acima. Uma concentração final de 0,3 ng/mL de rhGM-CSF foi usada para estimular a prolife-ração das células TF-1. Para a neutralização da proliferação dependente de GM-CSF, 10 pL de amostras purificadas de anticorpos monoclonais humanos neutralizadores anti-GM-CSF humano ou fragmentos seus foram acrescentados a uma solução que continha 10 pL de TF-1 e rhGM-CSF em uma série de diluições. As concentrações de proteínas variavam de 10 pg/mL a 10 pg/mL.
[00169] As amostras foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 durante 72 horas. Depois de 72 horas, foi determinada a situação proliferativa das células TF-1 conforme foi descrito no Exemplo 7.1 acima. Os dados foram ajustados para uma meia inibição máxima de proliferação (IC50) usando-se o ajuste de curva de regressão não linear do software Prism.
[00170] O nítido efeito de neutralização de GMCSF obser-vado no experimento de inibição de proliferação qualitativo descrito no Exemplo 7.1. acima pôde ser confirmado e quanti-ficado. Todos os fragmentos scFv testados de anticorpos humanos monoclonais neutralizadores anti-GM-CSF humano apresentaram uma constante de meia inibição máxima (IC50) numa faixa nanomolar neste experimento de inibição de proli-feração. Uma classificação
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107/124 nítida em eficácia de neutrali-zação pôde ser estabelecida, conforme se pode ser na Figura 10A.
[00171] Os anticorpos IgG humanos neutralizadores monoclo-nais anti-GM-CSF humano testados apresentam uma eficácia de neutralização significativamente mais alta do que os seus correspondentes scFv. A constante de meia inibição máxima das moléculas de IgG gerada neste experimento se encontrava na faixa sub-nanomolar. Conforme se pode ver na Figura 10B, o IC50 avaliado para IgG A foi de
O, 9 nM e IgG B tinha um IC50 de 0,3 nM.
[00172] A fim de se verificar se os fragmentos de anticor-pos scFv gerados a partir de IgGs A e B (scFv O e
P, respectivamente), correspondiam quantitativamente no seu potencial de neutralização aos scFvs A e B, foram conduzidos ensaios análogos de neutralização de TF-1 conforme descrito acima exceto que se usaram scFvs o e P como moléculas de teste. Os resultados são mostrados nas Figuras 10C e 10D para scFvs P e O, respectivamente. Conforme se pode ver na Figura 10D, scFv O tem o mesmo potencial de neutralização que scFv A, mostrando que a reconversão de IgG de volta ao formato scFv é possível sem haver perda de atividade biológica.
Exemplo 7.3: Avaliação quantitativa de potencial de neutralização de determinados anticorpos humanos representativos anti-rhGM-CSF e seus fragmentos, conforme medidos por uma produção redução de IL-8.
[00173] Este experimento foi conduzido para se quantificar a atividade de neutralização de anticorpos
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108/124 representativos humanos anti-GM-CSF humano e fragmentos seus pela medição de produção dependente de GM-CSF de IL-8 pelas células U-937. O antígeno GM-CSF usado nos experimentos acima foi rhGM-CSF. As células monocíticas U-937 foram cultivadas em meio RPMI 1640 Gibco (L-glutamina, isento de vermelho fenol) suplemen-tado com 10% de FCS inativadas por calor conforme descrito pelo distribuidor (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Brauscehweig, Alemanha). As células foram cultivadas até uma densidade celular de 1 x 106 células/mL.
[00174] Ao se conduzir o ensaio de inibição baseado na medição de produção de IL-8, as células foram coletadas por centrifugação a 300 x g durante 4 minutos e ressuspensas até uma concentração final de 1 x 106 células/mL em RPMI 1640, 10% FCS. 1,8 x 105 células/poço (180 pL de suspensão celular) foram semeadas por poço de placa de microtitulação de cultura de células de fundo chato. Uma concentração final de 1 ng/mL de rhGM-CSF foi usada para estimular a produção de IL-8 pelas células U-937. 20 pL de scFv purificadas ou IgG foram acrescentadas a 180 pL de uma solução de células U-937 e rhGM-CSF em uma série de diluições que resultaram em concen-trações finais de proteína que variaram de 10 pg/mL a 10 pg/mL.
[00175] Depois de 18 horas de incubação a 37°C e 5% de CO2, as células foi giradas por centrifugação de placas de cultura durante 2 minutos a 600 x g. Os sobrenadantes foram coletados por pipetas e passados para uma nova placa e foram analisados para se determinar a
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109/124 concentração de IL-8 em seu interior usando-se o conjunto OptEIA Human IL-8 ELISA Set (Becton Dickenson and Company).
[00176] A detecção por ELISA foi conduzida de acordo com as instruções do fabricante. Resumindo, com 50 pL de anticorpo de captura diluídos em carbonato de sódio a 0,' M, pH 9,5, foi revestida uma placa de microtitulação, deixando-se de um dia para o outro a 4°C. Depois de se ter lavado 3 vezes com PBS/0,05% de Tween, os poços foram bloqueados com 200 pL de PBS/10% de FCS por poço durante 1 hora à tempe-ratura ambiente lavando-se em seguida 3 vezes com PBS/0,05% de Tween 20. Em seguida acrescentaram-se 50 pL das amostras de sobrenadante de cultura aos poços e incubaram-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Para uma posterior quantifi-cação da concentração de IL-8, foi conduzida uma diluição em série do padrão de IL-8 provido pelo fabricante, em todo o procedimento.
[00177] Depois de se ter lavado 5 vezes com PBS/0,05% de Tween 20, a detecção foi conduzida usando-se 50 pL do Working Detector (Detection Ab + Av-HRP) provido no OptEIA Human IL-8 ELISA Set. Depois de 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavaram-se os poços outras 7 vezes. O sinal foi revelado acrescentando-se uma solução de substrato OPD (Sigma e foi detectado a um comprimento de onda de 490 nm (usando-se um comprimento de onda de referência de 620 nm).
[00178] Uma curva padrão de IL-8 foi construída para calibração e a concentração de IL-8 nas amostras de sobre-nadante de cultura foi calculada de acordo com esta
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110/124 curva de calibração. Os dados foram ajustados para uma meia inibição máxima de produção de IL-8 (IC50) usando-se o ajuste de curva de regressão não linear do software Prism;.
[00179] Todos os fragmentos representativos de anticorpos humanos monoclonais neutralizadores anti-rhGM-CSF testados mostraram uma nítida inibição da produção de IL-8 por células U-937 dependente de GM-CSF, conforme se pode ser claramente pela redução na concentração de IL-8 com o aumento da concentração de scFv na Figura 11. A classificação em eficácia de neutralização observada neste experimento está de acordo com a classificação obtida testando-se as mesmas moléculas para o seu efeito neutralizador nos experimentos de inibição de proliferação de TF-1 descrito acima.
[00180] Deve ser observado que os valores IC50 determinados neste experimento são mais altos do que aqueles obtidos para as mesmas moléculas no experimento anterior de proliferação de TF-1. Isto se deve à concentração maior de GM-CSF neces-sária para a estimulação de produção de IL-8 por células U-937 do que a necessária para a estimulação de TF-1.
Exemplo 7.4: Avaliação quantitativa de potencial de neutralização de anticorpos humanos representativos anti-GMCSF humano e seus fragmentos sobre o GM-CSF de macaca recombinante, conforme medido pela proliferação celular.
[00181] A finalidade deste experimento foi mostrar a potência de neutralização de anticorpos representativos humanos anti-GM-CSF humano e de seus
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111/124 fragmentos para GM-CSF proveniente de primatas não humanos da família Macaca (macGM-CSF) [00182] Para se mostrar o efeito de neutralização de molé-culas selecionadas de scFv e IgG selecionadas sobre macGM-CSF, foi conduzido um experimento de inibição de prolife-ração de acordo com o protocolo descrito nos Exemplos 7.1 e 7.2 usando-se macGM-CSF em vez de hGM-CSF. Tanto hGM-CSF como macGM-CSF estimulam a proliferação de células TF-1 com a mesma meia eficácia máxima (EC50) . Foi usada uma concen-tração final de 3 ng/mL de macGM-CSF para estimular a proli-feração das células TF-1 no experimento que testou as molé-culas de scFv e 0,3 ng/mL de células de rhGM-CSF no experimento que testou IgG B como um anticorpo humano repre-sentativo anti-GM-CSF humano. A fim de se neutralizar a proliferação das células TF-1, 10 pL de anticorpo purificado humano anti-GM-CSF humano ou fragmentos seus foram acres-centados a 100 pL de solução de TF-1 e macGM-CSF em uma série de diluições. As concentrações finais de proteína variaram de 10 pg/mL a 10 pg/mL. As amostras foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 durante 72 horas. Depois de 72 horas, a situação proliferativa das células TF-1 foi determinada conforme descrito nos Exemplos 7.1 e 7.2. Os dados foram ajustados para a meia inibição
máxima de proliferação (IC50) usando-se o ajuste de curva de
regressão não linear do software Prism.
[00183] Conforme se pode ver na Figura 12A,
determinados fragmentos de anticorpos humanos monoclonais
representativos anti-GM-CSF humanos também apresentaram um
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112/124 nítido potencial de neutralização de macGM-CSF (scFv B, scFv E, scFv C, scFv I, scFv A). Além disso, conforme de pode ver na Figura 12B o aumento das concentrações do anticorpo IgG B monoclonal humano representativo anti-GM-CSF humano, levou nitidamente a uma redução em proliferação de TF-1, demonstrando o potencial neutralizador deste anticorpo. O interessante é que o valor IC50 gerado para IgG B neste experimento (0,3 nM) usando-se macGM-CSF para a indução da proliferação de células TF-1 é igual àquele gerado no experimento usando-se hGM-CSF, mostrando uma clara reatividade cruzada de IgG B para GM-CSF nestas espécies.
Exemplo 8: Reatividade cruzada de IgG B com GM-CSF proveniente de diversas espécies.
[00184] A reatividade cruzada de IgG B com GMCSF prove-nientes de diversas espécies não humanas foi investigada apara se identificar as espécies adequadas para estudos in vivo posteriores. Em um primeiro conjunto de experimentos, ligação de IgG B a GM-CSF recombinante comercialmente dispo-nível de seres humanos (Leukine®, Berlex), de porco, canino, de rato (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha) e murino (Strathmann Biotech, Hamburgo, Alemanha) foi testado em um experimento ELISA. Especificamente, uma placa ELISA foi revestida com 1 pg/mL de GM-CSF proveniente das diversas espécies mencionadas. Acrescentou-se IgG B em uma série de diluições e detectou-se, usando-se um anticorpo IgG1 anti-humano conjugado a peroxidase de rábano. A placa ELISA foi revelada por acréscimo de solução de substrato de
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OPD, o-fenileno-diamina (OPD, laranja amarelado quando reage com peroxidase) (Roche, Alemanha) e mediu-se a 490 nm.
[00185] Conforme se vê na Figura 13, IgG B demonstrou uma ligação robusta ao GM-CSF recombinante humano, ao passo que GM-CSF proveniente de outras espécies testadas não foi reconhecido. Porcos, cães, ratos ou camundongos podem, por-tanto, não ser adequados espécies para o teste in vivo. No entanto, conforme visto acima na Exemplo 7.4, IgG B mostra uma reatividade cruzada nítida com macGM-CSF (do macaco cinomolgo, Macaca fascicularis), significando que pelo menos uma espécie de macaco da família Macaca é adequado para estudos in vivo de IgG B.
Exemplo 9: Ligação de IgG B a variantes de GM-CSF diferentemente glicosiladas [00186] A finalidade deste experimento consiste em se determinar a extensão até a qual a ligação de IgG B a GM-CSF depende do padrão de glicosilação deste último. Para tal fim foi testada uma série de diluições de meio condicionado contendo hGM-CSF natural (glicosilação de humano), assim como hGM-CSF recombinante proveniente de E. coli (nenhuma glicosilação) e levedura (glicosilação de levedura), assim como GM-CSF de Macaca recombinante, para a sua potência de induzir a proliferação de TF-1.
[00187] O GM-CSF humano glicosilado foi obtido do sobre-nadante de cultura de células BEAS-2B tratadas com IL-1p (células pulmonares humanas obtidas de ATCC CRL-9609). As células BEAS-2B foram propagadas em meio BEBM substituído com o kit BEGM Bullet kit (Cambrex, Verviers, Bélgica) , mas
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114/124 cultivados em RPMI 1640, 10% de FCS na presença de 50 ng/mL de IL-1p (Strathmann Biotech, Hamburgo, Alemanha) para a indução de produção de GM-CSF. Depois de uma incubação de 48 horas a 37°C, 5% de CO2, o sobrenadante de cultura foi analisado para o seu teor de GM-CSF, usando-se o conjunto OptEIA Human GM-CSF ELISA Set (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
[00188] hGM-CSF recombinante proveniente de E. coli foi produzido internamente conforme descrito o Exemplo 1.1 de WO 2005/105844. hGM-CSF recombinante a partir de levedura foi obtido no comércio com o nome comercial Leukine (Berlex, USA) . GM-CSF de Macaca foi produzido recombinantemente em HEK 293 células.
[00189] Foi primeiro testada uma série de diluições de meio condicionado contendo hGM-CSF natural assim como hGM-CSF recombinante proveniente de E. coli e de levedura, e GM-CSF de Macaca para a sua potência de induzir a proliferação de TF-1. Todas as três variantes de glicosilação de GM-CSF humano e GM-CSF de Macaca apresentaram valores de EC50 muito semelhantes para a ativação de TF-1. Estes eram 10 pg/mL para hGM-CSF produzido por E. coli, 15 pg/mL para hGM-CSF produzido por levedura, 36 pg/mL para hGM-CSF produzido por células pulmonares humanas e 11 pg/mL para GM-CSF de Macaca, respectivamente (Figura 14A).
[00190] A atividade neutralizadora de IgG B foi então determinada na presença de 0,3 ng/mL de hGM-CSF recombinante ou de 0,2 ng/mL de hGM-CSF fisiológico. Depois
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de 72 horas, a situação proliferativa das células TF-1 na
presença de concentrações diferentes de IgG B foi
quantificada por uma reação colorimétrica (Figura 14B).
[00191] Tomados em conjunto, os dados
apresentados na Figura 14 mostram que IgG B inibiu a
proliferação de células TF-1 dependente de GM-CSF a
concentrações subnanomolares aparentemente independentemente
do padrão de glicosilação de GM-CSF humano. O padrão de
glicosilação de GM-CSF humano, portanto, não influencia
substancialmente a capacidade de IgG B de neutralizar a atividade de GM-CSF.
Exemplo 10: Efeito de IgG B sobre as atividades biológicas de GM-CSF sobre eosinófilos
Exemplo 10.1: Efeito de IgG B sobre a sobrevivência de eosinófilos mediada por GM-CSF.
[00192] Uma das diversas atividades biológicas de GM-CSF é o prolongamento de sobrevivência de granulócitos eosinófilos e neutrófilos. Como as doenças inflamatórias pulmonares estão associadas com um acúmulo local de eosinófilos, que repre-sentam um papel substancial na manutenção da inflamação, foi testada a eficácia de IgG B em inibir a sobrevivência de eosinófilos mediada por GM-CSF.
[00193] Os eosinófilos foram isolados do sangue periférico de doadores sadios por eliminação de neutrófilos CD16+ da população de granulócitos obtidos por centrifugação de gradiente de densidade e lise de eritrócitos. Eosinófilos do sangue periférico recém-isolados foram semeados a uma densi-dade de 5 x 104 células/poço em RPMI 1640/10% de FCS e
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Pen/Estrep em uma placa de microtitulação de fundo chato de 96 poços. Acrescentou-se GM-CSF em uma série de diluições que variaram de 33 ng/mL a 10 pg/mL para se monitorar a sobrevivência de eosinófilos dependente de concentração. Para se analisar o potencial de inibição de IgG B sobre a sobrevivência de eosinófilos dependente de GM-CSF, o anticorpo foi acrescentado em uma série de diluições que variaram de 10 pg/mL a 0,1 ng/mL. Uma concentração final de 0, ng/mL de GM-CSF foi usada para efetuar a sobrevivência de eosinófilos. Depois de uma incubação durante 72 horas a 37°C, 5% de CO2, foi acrescentado o reagente WST-1. A reação colorimétrica resultante correspondente à porção de células viáveis foi quantificada medindo-se a absorvência a 450 nm. Os dados foram analisados e ajustados para uma meia inibição máxima de sobrevivência (IC50) usando-se o ajuste de curva de regressão não linear do pacote de software Prism. Conforme se pode ver na Figura 15A, uma dose meia efetiva máxima (EC50) de 0,02 ng/mL de rhGM-CSF foi determinada. Conforme se vê na Figura 15B, foi observado um efeito potente de neutralização de IgG B com uma meia inibição máxima de sobrevivência de eosinófilos a uma concentração de anticorpos de 0,13 nM.
[00194] Estes dados indicam que IgG B é efetivo na inibição de sobrevivência de eosinófilos dependente de GM-CSF de um modo dependente de dose.
Exemplo 10.2: Efeito de IgG B sobre a ativação de eosinófilos induzida por GM-CSF.
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117/124 [00195] Foi também desejado se investigar o efeito de IgG B sobre a ativação de eosinófilos induzida por GM-CSF. Cons-tatou-se que a expressão de CD69 estava supraregulada nos eosinófilos periféricos (CD16-) isolados do sangue humano depois de uma estimulação durante 20 horas ou 3 dias com (a) 0,1 ng/mL de GM-CSF ou (b) 0,1 ng/mL de GMCSF, IL-3 e IL-5, mas não com (c) 0,1 ng/mL de IL-3 e IL-5 sozinhos (Figura 16A). Os eosinófilos cultivados na presença de meio somente não apresentaram nenhuma supra-regulação de CD69. CD69 pode, portanto, ser tomado como um marcador para a ativação de eosinófilos por GM-CSF e o nível de expressão de CD69 foi monitorado como uma medida de ativação de eosinófilos depen-dente de GM-CSF. Nos dois pontos no tempo (20 horas e 3 dias), IgG B (10 pg/mL) impediu de modo praticamente com-pleto a ativação dependente de GM-CSF de eosinófilos, conforme se pode ver pela ausência de expressão de CD69 em citometria de fluxo.
[00196] Os eosinófilos foram isolados conforme descrito acima no Exemplo 10.1 e cultivados a uma densidade de 5 x 105 células/poço em RPMI 1640/10 % de FCS e Pen/Estrep em uma placa de microtitulação de fundo chato de 48 poços. As células foram incubadas com meio somente ou na presença de 0,1 ng/mL de GM-CSF somente ou juntamente com 0,1 ng/mL de IL-3 ou IL-5. 10 pg/mL de IgG B foram usados para a neutralização de GM-CSF. Depois de uma incubação de 1 ou 3 dias, as células foram analisadas para a expressão de CD69 por citometria de fluxo.
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118/124 [00197] A detecção de CD69 por citometria de fluxo: A expressão de CD69 sobre eosinófilos foi determinada em um instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson). 105 células foram incubadas com 5 pL de um CD16 anti-humano conjugado a FITC (clone 3G8, BD Biosciences) e um anticorpo CD69 anti-humano conjugado com PE (clone FN50, BD Biosciences), cada um durante 1 hora a 4°C. Como um controle negativo foram usados anticorpos irrelevantes conjugados a FITC e a PE de isótipos correspondentes. Depois da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, 1% de FCS, 0,05% de NaN3 e foram ressuspensas em 250 pL de PBS, 1% de FCS, 0,05% de NaN3. Foi acrescentado iodeto de propídio às células mortas de rotulação até uma concentração final de 1 pg/mL imedia-tamente antes da análise de FACS. A interpretação dos dados foi efetuada usando-se o software CellQuestPro (BD Biosciences). As células positivas para iodeto de propídio (isto é, mortas) foram excluídas da análise de expressão de CD69.
[00198] IgG B também reduziu a porcentagem de eosinófilos vivos e ativados conforme monitorado pro tingimento com iodeto de propídio de células de CD16-/CD69+ na presença de 0,1 ng/mL de GM-CSF. IgG B reduziu a porcentagem de células ativadas de 35 % para 8 % depois de 1 dia e de 43 % para 3 % depois de 3 dias de cultura. Na presença de 0,1 ng/mL de GM-CSF, IL-3 e IL-5, a porcentagem de eosinófilos vivos e ativados foi reduzida de 32% para 8% e de 48% para 11% depois de 1 e 3 dias, respectivamente. Embora a supra-regulação de CD69 tenha sido completamente
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119/124 inibida por IgG B, números superiores de eosinófilos em repouso (CD16-/CD69+) sobrevi-veram durante 3 dias na presença de 0,1 ng/mL de GM-CSF, IL-3 e IL-5 em comparação com células incubadas com meio ou com GM-CSF somente (Figura
16A, última coluna) . O mesmo foi observado para células
incubadas na presença de 0,1 ng/mL de IL-3 mais IL-5.
[00199] Nos experimentos para se descobrir a
dose, IgG B foi acrescentada em série de diluições a
eosinófilos culti-vados na presença de 0, 1 ng/mL de GM- CSF
(Figura 16B) . Um efeito inibidor de IgG B sobre a
intensidade de fluores-cência média dependente de CD69 (MFI) foi observado a uma meia concentração máxima de 0,22 nM de IgG B.
[00200] Tomados em conjunto, estes dados indicam que IgG B é um neutralizador efetivo de atividade de GM-CSF dentro de um contexto biológico extremamente relevante para doenças inflamatórias das vias respiratórias, tais como asma, por exemplo.
Exemplo 11: Estudos preliminares de toxicologia ex vivo usando-se IgG B [00201] Conforme foi explicado acima, a neutralização da atividade de GM-CSF pode ser vantajosa terapeuticamente em uma série de quadros mórbidos. Simultaneamente, no entanto, GM-CSF representa um papel importante no funcionamento normal do sistema imune no combate de patógenos exógenos, como na fagocitose por neutrófilos granulócitos e monócitos, por exemplo. Esta função natural de neutrófilos e monócitos deve permaneces
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120/124 intacta na presença de quantidades terapêu-ticas de IgG B. Portanto, investigamos dois aspectos do processo fagocítico: 1) ingestão de bactérias (fagocitose); e 2) atividade de ruptura oxidante (indicadora de destruição intracelular). Estes estudos são dados em detalhes nos exemplos abaixo.
Exemplo 11.1: Ingestão de bactérias (fagocitose) [00202] A determinação da atividade fagocítica de granuló-citos e de monócitos em sangue integral heparinizado foi conduzida usando-se o kit Phagotest Kit por Orpegen (Heidelberg, Alemanha). Este teste é baseado na ingestão de E. coli opsonizado rotulado com fluoresceína por células fagocíticas. Estas células podem então ser detectadas por fluorescência verde em citometria de fluxo. 10 pL de E. coli opsonizado rotulado com fluoresceína foram acrescentados a 100 pL de sangue integral heparinizado e incubado a 37 °C. A incubação a 0°C foi conduzida como um controle negativo. Depois de 10 minutos, o processo fagocítico foi interrompido por resfriamento de amostras no gelo e por acréscimo de 100 pL de solução de extinção (Orpegen). Esta solução permite a discriminação de ligação e internalização de bactérias por extinguir a fluorescência de FITC de bactérias ligadas na superfície, ao passo que a fluorescência de partículas internalizadas permanece intacta. Depois de três etapas de lavagem com 3 mL de solução de lavagem (Orpegen), os eritró-citos foram
submetidos a lise. Os leucócitos restantes foram então
lavados com 3 mL de solução de lavagem (Orpegen). Depois da
adição de 200 pL de solução de tingimento de DNA, que
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121/124 permite a exclusão de bactérias ou células agregadas, as células foram analisadas por citometria de fluxo. A porcentagem de células que tenham efetuado a fagocitose foi determinada por meio de fluorescência FITC.
[00203] Para se determinar a influência de IgG B sobre a fagocitose, IgG B foi acrescentada a três amostras de sangue idênticas até uma concentração final de 10 pg/mL. Deixou-se então que estas três amostras fossem incubadas a 37°C com IgG B durante diversos períodos de tempo antes da adição de E. coli. E. coli foi acrescentada à primeira amostra imedia-tamente, ao passo que E. coli foi acrescentada à segunda e à terceira amostra depois de 24 horas e 48 horas, respecti-vamente.
[00204] Os resultados observados para os granulócitos: Imediatamente depois do sangue ter sido tirado, mais de 98% de granulócitos ingeriram as bactérias tanto na presença como na ausência de IgG B (Figura 17A) . Depois de uma incubação das amostras sanguíneas com IgG B durante 24 horas foi determinada uma redução para aproximadamente 92% sem IgG B e até 90% na presença de IgG B (Figura 17B). Depois de 48 horas, 81% de granulócitos testaram positivos para fagoci-tose na ausência e 89% na presença de IgG B (Figura 17C).
[00205] Os resultados observados para monócitos: Indepen-dentemente da presença ou não de IgG B, 98% dos monócitos estavam efetuando fagocitose imediatamente depois da retirada do sangue (Figura 18A). Depois de uma préincubação de 24 horas com IgG B, 90% dos monócitos eram
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122/124 positivos (Figura 18B) . Depois de uma pré-incubação de 24 horas sem IgG B 92% de monócitos eram positivos. Depois de 48 horas, constatamos que 81% dos monócitos sem IgG B e 89% com IgG B eram positivos para fagocitose (Figura 18C).
Exemplo 11.2: Ruptura oxidante [00206] A determinação da atividade de ruptura oxidante de granulócitos e dos monócitos em sangue integral heparinizado foi conduzida usando-se o kit Phagoburst Kit por Orpegen (Heidelberg, Alemanha). Este ensaio permite a determinação da porcentagem de células fagocíticas que produzem oxidantes reativos por oxidação do substrato diidro-rodamina (DHR) 123 no R 123 fluorescente. As células que apresentam uma ativi-dade de ruptura oxidante podem ser identificadas por cito-metria de fluxo. O sangue heparinizado foi incubado com diferentes estímulos para a indução de atividade de ruptura oxidante: 13-acetato de 12miristato de forbol (PMA) como um estímulo alto; E. coli opsonizada sem rotulação como estímulo intermediário e o peptídeo quimiotático N-formil-MetLeuPhe (fMLP) como estímulo baixo. 100 pL de sangue integral foram incubados com estes estímulos a 37°C. Como controle negativo foi conduzida uma incubação sem estimu-lação. Depois de 10 minutos de incubação, foi acrescentada uma solução do substrato DHR 123 e foi incubada durante outros 10 minutos. DHR 123 é convertido no R 123 fluores-cente pro células oxidantes. Depois de três etapas de lavagem com 3 mL de solução de lavagem (Orpegen), os eritrócitos foram submetidos a lise. Os leucócitos restantes foram lava-dos
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123/124 uma vez com 3 mL de solução de lavagem (Orpegen) . Depois da adição de 200 pL de solução de tingimento de DNA, que permite a exclusão de células ou bactérias agregadas, as células foram analisadas por citometria de fluxo.
[00207] Para se determinar a influência de IgG B sobre a ruptura oxidante, IgG B foi acrescentada a três amostras de sangue idênticas até uma concentração final de 10 pg/mL. Cada uma destas três amostras foi então dividida em três alíquotas e deixou-se incubando a 37°C durante períodos variáveis de tempo antes da adição, às alíquotas separadas, de E. coli, de fMLP ou de PMA. E. coli, fMLP ou PMA foram acrescentados às três alíquotas da primeira amostra imedia-tamente, ao passo que E. coli, FMLP ou PMA foram acres-centadas às três alíquotas da segunda amostra depois de 24 horas e 48 horas, respectivamente. Amostras de sangue paralelas com ausência de IgG B foram tratadas de modo idêntico como acima como controles. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 4, em que “+ na segunda coluna da esquerda indica que IgG B está presente na alíquota de amostra testada e “- na segunda coluna da esquerda indica o controle isento de IgG B.
Tabela 4: Efeito de IgG B sobre o comportamento de ruptura oxidante de granulócitos
Ponto no tempo IgG B Porcentagem de granulócitos oxidantes depois de estimulação com... Resultados mostrados na ...
E.coli fMLP PMA
0 h - 97 9 99 Fig. 17D
+ 94 10 99
24 h - 82 8 97 Fig. 17E
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+ 80 10 95
48 h - 68 6 64 Fig. 17F
+ 71 5 64
[00208] Resultados análogos foram obtidos usando-se monócitos em vez de granulócitos. O experimento foi condu-zido de modo análogo ao descrito acima, e os resultados são apresentados abaixo na tabela 5, em que “+ na segunda coluna da esquerda indica que IgG B está presente na alíquota da amostra testada, e “- na segunda coluna da esquerda indica o controle isento de IgG B.
Tabela 5: Efeito de IgG B sobre o comportamento de ruptura oxidante de monócitos
Ponto no tempo IgG B Porcentagem de granulócitos oxidantes depois de estimulação com... Resultados mostrados na ...
E. coli fMLP PMA
0 h - 62 0 79 Fig. 18D
+ 57 1 81
24 h - 30 4 35 Fig. 18E
+ 26 6 28
48 h - 29 4 17 Fig. 18F
+ 28 3 14
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que se liga especificamente a GM-CSF de primata e o neutraliza, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende na sua região variável de cadeia leve uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18, e compreende na sua região variável de cadeia pesada uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 56, em que o referido fragmento é um scFv, um diacorpo, um diacorpo em série, um Fab, um Fab' ou um F(ab)2.
  2. 2. Anticorpo monoclonal humano, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é uma IgG.
  3. 3. Anticorpo monoclonal humano, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida IgG é uma IgG1 ou IgG4.
  4. 4. Anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende na sua região variável de cadeia leve uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID
    Petição 870190100494, de 07/10/2019, pág. 143/153
    2/4
    NO: 17, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18, e compreende na sua região variável de cadeia pesada uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda na sua região variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos conforme apresen-tada na SEQ ID NO: 19, 54 ou 55.
  6. 6. Anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda na sua região variável de cadeia pesada uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID
    NOs: 21-23, 26, 28, 52 ou 53. 7. Anticorpo monoclonal humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de
    cadeia leve conforme apresentada na SEQ ID NO: 34 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada conforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35, 37, 40, 42 ou 48.
  7. 8. Anticorpo monoclonal humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de
    Petição 870190100494, de 07/10/2019, pág. 144/153
    3/4 cadeia leve conforme apresentada na SEQ ID NO: 34 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada conforme apresentada na SEQ ID NO: 35.
  8. 9. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  9. 10. Uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento compreendendo, opcionalmente, um ou mais agentes anti-inflamatórios adicionais para o tratamento de doenças inflamatórias.
  10. 11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que as doenças inflamatórias são selecionadas do grupo que consiste em artrite reumatóide (RA) (inclusive RA que é resistente a tratamento com neutralizadores de THF-alfa), asma, esclerose múltipla (MS), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), Síndrome de Angústia Respiratória Aguda (ARDS), Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF), Doença do Intestino Inflamatório (IBD), uveíte, degeneração macular, colite, psoríase, Degeneração de Wallerian, síndrome anti-fosfolipídico (AP), síndrome coronário agudo, restenose, aterosclerose, policondrite de recaída (RP), hepatite aguda ou crônica, implantes ortopédicos fracassados, glomerulonefrite, lúpus ou distúrbios autoimunes.
    Petição 870190100494, de 07/10/2019, pág. 145/153
    4/4
  11. 12. Uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento compreendendo, opcionalmente, um ou mais agentes adicionais anticancerígenos para o tratamento de uma doença tumoral ou outra condição com apoptose celular retardada, aumento de sobrevivência ou de proliferação celular.
    13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença tumoral é um câncer. 14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é leucemia, mieloma
    múltiplo, carcinoma gástrico ou carcinoma da pele.
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