EA016156B1

EA016156B1 - Захват микроорганизмов, подобных микобактериям

Info

Publication number: EA016156B1
Application number: EA200900701A
Authority: EA
Inventors: Стюарт Марк Вилсон; Кристофер Джон Стенли
Original assignee: Микросенс Медтек Лимитед
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2007-11-23
Publication date: 2012-02-28
Also published as: WO2008065047A1; EP2092336B1; AU2007327687A1; AP2746A; JP5196671B2; MX2009005656A; AU2007327687B2; AP2009004890A0; EA200900701A1; EP2092336A1; CA2670930A1; JP2010510788A; US20100143883A1; BRPI0719425A2; KR20100014250A

Abstract

В изобретении предложен способ получения из образца микроорганизмов, имеющих гидрофобную поверхность, таких как микобактерии, в том числе М. tuberculosis, который включает контактирование указанных микроорганизмов с собирающим реагентом, таким как pDADMAC, который имеет как гидрофобные свойства для связывания с микроорганизмами посредством гидрофобного взаимодействия, так и полярные свойства, для того, чтобы собрать указанные микроорганизмы на поверхности с кислыми свойствами.

Description

Изобретение относится к сбору на поверхности гидрофобных микроорганизмов, таких как микобактерии, и к последующей обработке, например к анализу их наличия или к их идентификации.

Патогенные микобактерии ответственны за некоторые тяжелые инфекционные заболевания у людей и животных. Микобактерии характеризуются гидрофобной восковидной оболочкой, содержащей миколовую кислоту или родственные соединения. Миколовые кислоты представляют собой сложные гидроксилированные жирные кислоты с разветвленной цепью, обычно имеющие углеродные цепи с длиной цепи в диапазоне С--_-8и. которые являются причиной серьезных проблем для обработки проб, вызывая агрегацию бактерий с образованием тяжей, и удерживая их на поверхности жидкостей и вызывая устойчивость к центрифугированию. Углеводородные цепи могут содержать или не содержать редкие оксигенированные группы, такие как гидроксил, метокси, кето или карбоксил. Патогенные микобактерии включают в себя МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к, которая является возбудителем ТВ, микобактерии МАС комплекса (прежде всего М. аущт и М. Ш1гасе11и1аге), которые являются оппортунистическими патогенами у пациентов, больных СПИД, М. рага1иЬегси1ок1к, которая вызывает воспаление кишечника, М. 1ергае, вызывающая лепру, комплекс М. капкаки, М. тапиит, М. Гопийит, и многие другие. Также существует много других непатогенных микобактерии, в том числе М. ктедтаБк. Также другие представители семейства Мусо1а1а имеют аналогичные компоненты гидрофобной оболочки. У некоторых длина цепи гидрофобных жирных кислот короче, чем у микобактерии, приблизительно на 50 атомов углерода, а у других приблизительно на 30.

Для диагностики микобактериальных инфекций, таких как туберкулез, наличие микроорганизмов должно быть показано с помощью микроскопии, культуральных или молекулярных способов, таких как ПЦР. Хотя микроскопия может осуществляться непосредственно из биологического образца, чаще сначала выделяют и концентрируют микобактерии из биологических образцов до анализа. Биологические образцы могут включать в себя мокроту, мочу, кровь, бронхиальный лаваж и т.д. Одним из наиболее распространенных типов образцов, получаемых для диагностики, является мокрота. Мокрота представляет особые проблемы для бактериологии. Мокрота является гетерогенной по своей природе и может быть кровянистой, гнойной и вязкой. Она также может быть контаминирована другими микроорганизмами, например, Ркеиботопак.

Обычно мокроту разжижают и в то же время очищают путем применения различных предварительных обработок. Такие обработки включают в себя применение 0,25-0,5 М гидроксида натрия с Ν-ацетил Ь-цистеином или без него, додецилсульфата натрия, щавелевой кислоты или трихзамещенного фосфата натрия. Время обработки может составлять 20-120 мин. Эти обработки предназначены для разжижения мокроты и уничтожения большинства контаминирующих организмов. Микобактерии имеют толстую восковидную оболочку и являются более резистентными к таким обработкам. Тем не менее, предполагается, что под действием такой обработки вплоть до 60% МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к погибает или оказываются нежизнеспособными. Кроме того, поскольку МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к и другие представители этого семейства растут так медленно, рост контаминирующих микроорганизмов, которые не погибли под действием этой обработки, все еще представляет проблему высокого процентного содержания культур, являющихся переросшими за счет быстрорастущих посторонних микроорганизмов.

После обработки с использованием агрессивных очищающих средств образец центрифугируют для концентрирования микобактерий, которые затем анализируют с помощью микроскопии, культивирования или молекулярной амплификации. Эта стадия центрифугирования привносит риск инфицирования персонала лаборатории, поскольку содержание любой пробирки, которая трескается или разбивается во время центрифугирования, может попадать в воздух с мельчайшими капельками воды и заражать окружающую среду. Центрифугирование также является узким местом в обработке образцов, поскольку только ограниченное количество образцов может быть центрифугировано единовременно. Кроме того, центрифугирование осаждает все вещества, которые оказались денатурированными и нерастворенными под действием процедуры агрессивного очищения, и может быть получен очень большой осадок, который создает проблемы для микроскопии или молекулярных методов.

Вследствие проблем, перечисленных выше, с существующими подходами очищения и концентрации было бы крайне полезным, если бы микобактерии могли быть собраны непосредственно из биологического образца. Было бы целесообразно, если бы эта процедура удаляла некоторые или все контаминирующие микроорганизмы так, чтобы химического очищения не потребовалось, или оно могло быть проведено в менее агрессивных условиях. Это также увеличило бы выживание очищенных микобактерии и повысило бы чувствительность последующих тестов.

В других применениях, отличных от обработки образцов, это также могло быть полезным для связывания микобактерии с твердой поверхностью, чтобы облегчить концентрирование или обработку микроорганизмов, например, сбор и промывание микобактерии из фагового раствора для удаления экзогенных неинфицирующих фагов или сбора и переноса микобактерии из одного раствора в другой.

Способы сбора микобактерии на твердых поверхностях ранее уже были предложены, включая применение связанного фага или связывающих пептидов, доставляемых фагами, иммобилизованных на бусах и действующих в качестве собирающих агентов (§1га!тапп е1 а1; 1 С1ш М1сгоЬю1. 2002 ШуетЬег; 40(11): 4244-4250) и включая выделение М. рага1иЬегси1ок1к из молока, путем использования бус, покры

- 1 016156 тых антителами (Стаи! I. К. е! а1; Αρρΐ Εηνίτοη ΜίετοΜοΙ. 1998 §ер; 64 (9):3153-8). Однако такой способ может быть слишком дорогостоящим для широкого применения, особенно в развивающихся странах, и может быть излишне специфичным в том, что не все желаемые бактерии будут собраны, и предусматривает использование молекул на основе белка, которые чувствительны к протеазам, денатурации и агрессивным химическим веществам.

Согласно НеИапб С. е! а1., 1ттипо1о§у 1994, 82, 445-449, можно нанести покрытие БЦЖ на латексные микробусины, путем инкубирования бусин с культивированными и отделенными бактериями. Однако маловероятно, что это будет эффективным для эффективного сбора таких бактерий из биологического образца, содержащего другие гидрофобные микроорганизмы или вещества.

Авторы изобретения обнаружили, что полидиаллилдиметиламмония хлорид (ρ-ΌΑΌΜΑΟ) связывает микобактерии с микробусинами карбоновой кислоты. Не связываясь следующей теорией, авторы изобретения считают, что основная цепь ρ-ΌΑΌΜΑΟ гидрофобно взаимодействует с восковидным покрытием микобактерии и положительный заряд в остове ρ-ΌΑΌΜΑΟ также может взаимодействовать с отрицательными зарядами на поверхности микобактерии, затем ρ-ΌΑΌΜΑΟ ионно взаимодействует через его боковые группы четвертичного аммония с карбоновыми кислотами микробус. Авторы изобретения также обнаружили, что поверхности, покрытые ρ-ΌΑΌΜΑΟ, такие как пластики или стекло, могут напрямую связываться с микобактериями.

Таким образом, микобактерии могут быть либо собраны непосредственно на поверхностях, покрытых ρ-ΌΑΌΜΑΟ, либо могут быть собраны на поверхности опосредовано.

Настоящее изобретение, следовательно, в настоящий момент в первом аспекте относится к способу получения из образца микроорганизмов, имеющих гидрофобную поверхность, этот способ включает в себя контактирование микроорганизмов с собирающим реагентом, этот собирающий реагент имеет как гидрофобные свойства, за счет чего этот собирающий реагент связывается с указанными микроорганизмами посредством гидрофобного взаимодействия с ними, так и полярные свойства, указанный собирающий реагент либо присутствует на поверхности и собирает микроорганизмы на нее, либо присутствует в растворе, указанный способ затем дополнительно включает в себя сбор указанных микроорганизмов на поверхности путем связывания указанного поглощающего реагента на указанной поверхности посредством полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным поглощающим реагентом.

Предпочтительно, указанный выше способ проводят, используя собирающий агент в растворе, поэтому этот способ включает в себя контактирование микроорганизмов с собирающим реагентом в растворе, этот собирающий реагент имеет как гидрофобные свойства, за счет чего этот собирающий реагент связывается с указанными микроорганизмами посредством гидрофобного взаимодействия с ними, так и полярные свойства, например, полиионные свойства, и сбор указанных микроорганизмов на поверхности, путем связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью посредством полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным собирающим реагентом.

Образец может представлять собой жидкий образец, такой как мокрота, моча, кровь, бронхиальный лаваж, и т. д. или может представлять собой твердый образец, такой как тканевой биоптат, например, образец кожи, который предпочтительно обрабатывают для экстракции или дисперсии микроорганизмов в жидкость для получения жидкого образца.

Необязательно, указанный собирающий реагент содержит длинную углеводородную цепь, несущую многочисленные полярные, например, ионные, участки. Указанные многочисленные полярные или ионные участки могут находиться вместе в одной части, например, концевой части, указанной цепи, или могут располагаться с определенными интервалами вдоль указанной цепи, как они находятся в ρΌΑΌΜΑΟ.

Собирающий реактив может быть анионным, но предпочтительно является катионным, как в случае ρ-ΌΑΌΜΑΟ и, предпочтительно, представляет собой сам поли-диаллилдиметиламмония хлорид (ΌΑΌΜΑ0). Поскольку большинство бактериальных клеток заряжены отрицательно, эффект связывания рΌΑΌΜΑΟ с восковидным покрытием микобактерий состоит в том, что клетки преобразуются в конечный положительный заряд. Это является преимуществом, поскольку это гарантирует, что другие контаминирующие микроорганизмы, которые не связываются с ρ-ΌΑΌΜΑΟ, остаются отрицательно заряженными и так и остаются несвязанными с микробусинами.

Кроме того, в вариантах осуществления с непосредственным получением, микроорганизмы, которые не являются гидрофобными в достаточной степени, не будут связываться с поверхностями, покрытыми ρ-ΌΑΌΜΑΟ в присутствии детергентов, таким образом, обеспечивая степень селективности в отношении типа собранных микроорганизмов.

Другие собирающие реагенты, которые могут быть рассмотрены, включают в себя полилизин или полиэтиленимин. Одним вариантом выбора был бы произвольный или блок сополимер гидрофобной аминокислоты, такой как триптофан, лейцин, валин, метионин, изолейцин, цистеин, или фенилаланин, и полярной аминокислоты, такой как лизин.

Собирающий реагент предпочтительно должен быть достаточно гидрофобным по характеру для гидрофобного связывания с пластиками, например, с полистирольными микропланшетами, обычно используемыми для связывания белков, или альтернативно, могут быть способными связываться со стек

- 2 016156 лом или поверхностями, подобными стеклу, или посредством полярного взаимодействия, либо достаточно гидрофобным по природе для гидрофобного связывания с поверхностью, которая соответственно может быть такой, которая может быть обнаружена у предметных стекол микроскопа или покровных стекол. Но она должна быть достаточно гидрофильной по природе, так, что она будет растворима в воде или в забуференной водной среде, по меньшей мере в присутствии подходящей системы детергентов или переносимого количества органического со-растворителя, такого как ΌΜ8Θ. Следовательно, она растворима в смеси с образцом и любыми другими используемыми материалами.

Независимо от изложенной выше теории настоящее изобретение во втором независимом аспекте относится к способу получения из жидкого образца микроорганизмов, имеющих гидрофобную поверхность, этот способ включает в себя контактирование микроорганизмов с растворимым собирающим: реагентом, который содержит поли-ОЛОМЛС, посредством чего собирающий реактив связывается с указанными микроорганизмами, и сбор указанных микроорганизмов на поверхности, путем связывания указанного собирающего реактива с указанной поверхностью.

В любом аспекте настоящего изобретения указанная поверхность соответственно обеспечивается бусинами. Они могут быть микро или нано величины. Соответственно они могут быть парамагнитными для легкого отделения от жидкой среды. Они могут иметь полимерную поверхность из карбоновых кислот или поверхность, характеризующуюся сульфатными или фосфатными группами.

Молекулярная масса поли-ЭЛОМЛС может находиться в интервале от менее 100000 (очень низкая), 100000-200000 (низкая), 200000-400000 или 500000 (средняя) или свыше 500000 (высокая).

Предпочтительно, образец контактирует с собирающим реагентом в присутствии системы детергентов из одного или нескольких детергентов, которые усиливают селективность связывания желаемых микроорганизмов. Желательно микроорганизмы связываются без связывания некоторых или всех контаминирующих гидрофобных веществ, присутствующих в образце, или без связывания некоторых или всех микроорганизмов в образце, сбор которых не является желательным.

Система детергентов может содержать аминокислотный амид жирной кислоты, который предпочтительно представляет собой Ν-лауроилсаркозин. Система детергентов альтернативно или дополнительно может содержать детергент Тритон X, предпочтительно Тритон Х-100.

Для большинства образцов собирающий реагент предпочтительно предоставляется в собирающем буфере, соответственно имеющем рН от 7-10, более предпочтительно 7-9, например от 8-9 или 8,2-8,6, например фосфатном буфере или Трис-буфере. Для образцов очень густой слизистой мокроты, содержащей большие количества мукополисахаридов, которые имеют много групп карбоновой кислоты, для сбора может быть благоприятным низкий рН. При достаточно низком рН карбоксильные группы нейтрализуются и не взаимодействуют с рЭАЭМАС или другой сульфатной или фосфатной группой, представляющей поверхность, связывающую микобактерии и последующий сбор ρΩΑΩΜΑί.'. или другую поверхность. Такие условия, хотя предназначены для образцов очень слизистой мокроты, могут быть использованы со всеми образцами. Соответственно рН собирающего реагента в этом случае составляет от 0 до 4, рН 4 является все еще достаточно низким для протонирования групп карбоновой кислоты. Следовательно, в зависимости от выбора твердой поверхности, рН собирающего реагента может по меньшей мере составлять от 0 до 10.

Обработка образца может, разумеется, включать в себя стадию очищения, на которой образец, или поверхность, несущая собранные микроорганизмы, обрабатывают для того, чтобы микроорганизмы, отличные от интересующих, становились нежизнеспособными. Это может осуществляться с помощью веществ, известных для этой цели, таких как гидроксид натрия с Ν-ацетилцистеином или без него, или только с Ν-ацетилцистеином. Разумеется, целью является сохранить собранные микроорганизмы, представляющие интерес, в жизнеспособном состоянии.

Собранные микроорганизмы в частности могут представлять собой микобактерии, которые могут быть любыми из тех, которые упоминаются выше.

Настоящее изобретение включает в себя способ выявления микроорганизмов, включающий в себя сбор указанных микроорганизмов на поверхности описанным способом, промывание указанных собранных микроорганизмов, и выявление указанных собранных микроорганизмов на указанной поверхности или после удаления с нее.

Используемый способ выявления может представлять собой любой способ соответствующий исследуемому микроорганизму. Для микобактерий вообще, и для М. 1иЬегси1о515 в частности, эти способы будут включать в себя культивирование и микроскопическое выявление, например, путем окрашивания, ПЦР - полимеразную цепную реакцию, ТМА - транскрипционно опосредованную амплификацию, 8ΌΑ амплификацию по типу замещения цепи, или другие методики амплификации и детекции, направленные на нуклеиновые кислоты самого организма, и способы на основе фагов, в том числе РА8ТР1адиеТВ, в котором добавляют фаг, инфицирующий микобактерий, и дают возможность войти в клетки, фаг, который остается снаружи клеток уничтожают и после дополнительного инкубирования для выхода фага из клеток, выявляют присутствие вышедшего фага, путем инфицирования дополнительных микроорганизмов.

Материалы, или избранные основные материалы, необходимые для практического осуществления

- 3 016156 способов выявления микроорганизмов, описанных выше, могут быть предоставлены в виде набора. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя набор для анализа микроорганизмов, содержащий растворимый собирающий реагент, имеющий как гидрофобные свойства, за счет чего этот собирающий реагент способен связываться с микроорганизмом, выявляемым посредством гидрофобного взаимодействия с ним, так и полиионные свойства, субстрат, имеющий поверхность для сбора указанных микроорганизмов на указанную поверхность, посредством связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью посредством полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным собирающим реагентом, и по меньшей мере одно из следующего:

фаг, способный инфицировать указанный микроорганизм;

праймеры для проведения амплификации геномной нуклеиновой кислоты указанного микроорганизма или указанного фага;

культуральную среду для культивирования указанного микроорганизма;

краситель для визуализации указанного микроорганизма для микроскопического исследования;

антитело (в виде целого ли антитела, или как его часть, имеющая аффинность селективного связывания) для связывания указанного микроорганизма; или детектирующий реагент для использования при выявлении метаболита, продуцируемого при культивировании указанного микроорганизма.

В соответствии с описанным выше изобретением, образец также может представлять собой газообразный образец, например, воздух, с содержащимися в нем микроорганизмами. Такой образец может быть барботирован в раствор собирающего реагента для связывания микроорганизмов с собирающим реагентом.

Альтернативно настоящее изобретение включает в себя набор для анализа микроорганизмов, содержащий собирающий реагент, нанесенный, и, таким образом, иммобилизованный на твердой поверхности, указанный собирающий реагент имеет как гидрофобные, так и полиионные свойства, за счет чего этот собирающий реагент способен связывать выявляемые микроорганизмы, и по меньшей мере одно из: фаг, способный инфицировать указанный микроорганизм;

Твердая поверхность может представлять собой предметное стекло.

Предпочтительно, собранные микобактерии, либо собранные напрямую, либо опосредованно, не повреждаются таким сбором и остаются жизнеспособными. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано для тестирования микроорганизмов на лекарственную чувствительность. В одном аспекте, на микобактерии воздействуют лекарственным средством, таким образом, чтобы лекарственное средство действовало на этот микроорганизм. После этого микобактерии могут быть собраны любым из описанных здесь способов, а затем могут быть исследованы на жизнеспособность, используя любое число ранее описанных способов, которые могут включать в себя микроскопию, с использованием красителей для определения жизнеспособности, способы на основе фагов, способы на основе культивирования или способы на основе ПЦР. В другом аспекте, микобактерии могут быть сначала собраны любым из описанных здесь способов, затем впоследствии их подвергают воздействию лекарственного средства таким образом, чтобы лекарственное средство могло подействовать на этот микроорганизм. После этого, микобактерии затем могут быть исследованы на жизнеспособность, с использованием любого количества описанных способов, которые могут включать в себя микроскопию, с использованием красителей для определения жизнеспособности, способы на основе фагов, способы на основе культивирования или способы на основе ПЦР. Используемые лекарственные средства могут включать в себя средства, обычно используемые для лечения туберкулеза, такие как рифампицин, стрептомицин, изониазид, этамбутол, пиразинамид и ципрофлоксацин.

Материалы, или избранные основные материалы, необходимые для практического осуществления способов определения чувствительности микроорганизмов к лекарственным средствам, описанных выше, могут быть предоставлены в виде набора. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя набор для исследования чувствительности микроорганизма к лекарственному средству, содержащий растворимый собирающий реагент, имеющий как гидрофобные свойства, за счет чего собирающий реагент способен связываться с выявляемым микроорганизмом, посредством гидрофобного взаимодействия с ним, так и полиионные свойства, субстрат, имеющий поверхность для сбора указанных микроорганизмов на указанную поверхность, путем связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью посредством полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным собирающим реагентом, и одно или и то, и другое из следующего:

- 4 016156 одно или несколько тестируемых лекарственных средств; и средства для определения, являются ли собранные микроорганизмы жизнеспособными, которые могут представлять собой одно или несколько из следующего:

краситель, указывающий на жизнеспособность, для визуализации указанных микроорганизмов для микроскопического исследования;

детектирующий реагент для использования при выявлении метаболита, продуцируемого при культивировании указанных микроорганизмов;

и, необязательно, одно или несколько из следующего, если еще не присутствует:

Альтернативно, настоящее изобретение включает в себя набор для исследования чувствительности микроорганизма к лекарственному средству, содержащий собирающий реагент, нанесенный, и, таким образом, иммобилизованный на твердой поверхности, указанный собирающий реагент имеет как гидрофобные, так и полиионные свойства, за счет чего собирающий реагент способен связываться с выявляемым микроорганизмом, и одно или и то, и другое из следующего:

одно или несколько тестируемых лекарственных средств; и средства для определения, являются ли собранные микроорганизмы жизнеспособными, которые могут представлять собой одно или несколько из следующего:

одно или несколько тестируемых лекарственных средств;

М. 1иЬегси1о818 переносятся на взвешенных в воздухе частицах, воздушно-капельной взвеси инфекционных частиц, которые образуются при кашле, чихании или громком разговоре инфицированных индивидуумов, у которых имеется легочный или ларингеальный туберкулез. Размер этих частиц составляет приблизительно 1-5 мкм, и они могут оставаться в воздухе в течение нескольких часов, обеспечивая возможность их распространения по всему помещению или зданию. Заражение происходит, когда восприимчивый человек вдыхает воздушно-капельную взвесь инфекционных частиц, содержащую М. 1иЬегси1о818, которые затем проходят рот или носовые ходы, верхние дыхательные пути и бронхи, чтобы достичь альвеол. Мультирезистентность (ΜΌΚ.) М. 1иЬегси1о818 также классифицируется по СЭС (схема классификации заболеваний) как категория С агент биологического терроризма и механизмом подачи предположительно создание взвешенного в воздухе аэрозоля.

Желательно защитить медико-санитарных работников, других людей в непосредственной близости от инфицированного человека, и военнослужащих от опасности заражения ингаляционным путем. Кроме того, сотрудники лаборатории, которые работают с образцами, зараженными ТВ, культурами ТВ и образцами, содержащими другие патогенные микобактерии (такие как М. рага1иЬегси1о818 в фекалиях) также имеют риск заражения. В настоящее время медико-санитарные работники и сотрудники лаборатории предпринимают попытки предотвратить заражение, используя защитные маски, или более современные респираторы с фильтрами для задержки частиц.

СОС рекомендует использовать респираторы с фильтрами для задержки частиц, сертифицированные Национальным институтом профессиональной безопасности и здоровья (ΝΙΘ8Η) (например, N95,

- 5 016156

N99, или N100), которые способны эффективно фильтровать мельчайшие частицы в диапазоне 1-5 мкм. Защитные маски в основном состоят из легких тканых или нетканых материалов; они могут иметь несколько слоев и могут иметь обозначения, которые указывают заданный размер пор. Однако большинство масок не являются ΝΙΟδΗ-сертифицированными в качестве респираторов, не защищают пользователя должным образом от воздействия ТВ и не удовлетворяют требованиям Ο8ΗΆ (комиссия по стандартам безопасности) для защиты органов дыхания. Исследование показало, что применение защиты органов дыхания определяется для снижения риска заражения у патронажных медицинских работников следующими соотношениями (по сравнению с отсутствием защиты): хирургическая защитная маска, 2,4 раза; одноразовая маска, задерживающая пыль, дым, влагу или одноразовая маска с высокоэффективной фильтрацией воздушных частиц (НЕРА), 17,5 раз; респиратор с эластомерным НЕРА картриджем, 45,5 раз; или электроприводной воздухоочистительный респиратор (РАРК), 238 раз. (1 Оссир Εηνίτοη Меб. 1997 8ер;39(9):849-54).

Хотя респиратор с фильтром для задержки частиц обеспечивает высокий уровень защиты, его недостатком является высокая стоимость и ограниченность в применении. Существует необходимость в усовершенствованной одноразовой защитной маске, которая обеспечивает усиленную защиту пользователя от взвешенной в воздухе микобактериальной инфекции в ситуациях, в которых респиратора нет в наличии или он не подходит для использования. Такая ситуация складывается в развивающихся странах, а также в обстановке лаборатории. Требуется защитная маска и/или фильтр, который предоставляет специфический и эффективный способ связывания аэрозолей, содержащих микобактерии, образованных инфицированными людьми, и случайно образованных в лаборатории, таким образом значительно повышая стандарт защиты пользователя.

Настоящее изобретение, соответственно, относится к фильтру для фильтрования потока газа для удаления микроорганизмов, заключенных в нем, указанный фильтр содержит полярный собирающий реагент на или выше полярной поверхности, этот собирающий реагент имеет как гидрофобные свойства, за счет чего он способен гидрофобно связываться с бактериями, покрытыми оболочкой, путем гидрофобного взаимодействия, так и полярные свойства, например, полиионные свойства, за счет чего он связывается, или приспособлен к связыванию с указанной полярной поверхностью.

Фильтр может принимать форму защитной маски для защиты того, кто ее носит, или может быть фильтровальным элементом, присоединенным к защитной маске или шлему. Это может быть фильтр, установленный или для установки в канале подачи воздуха.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, для обеспечения улучшенной защиты, защитная маска может быть снабжена, то есть пропитана, растворимым собирающим реагентом, имеющим как гидрофобные свойства, за. счет чего собирающий реагент связывается с микобактериями посредством гидрофобного взаимодействия, так и полярные свойства, например, полиионный характер, за счет чего собирающий реагент связывается с ионной поверхностью посредством полярного взаимодействия.

Растворимый собирающий агент может быть распылен на подходящий материал маски в твердой фазе, например, материал фильтра защитной маски, а затем высушен перед упаковкой продукта. При использовании защитная маска увлажняется в результате выдоха пользователя и собирающий агент затем становится солюбилизированным в слое влаги на поверхности материала маски. Воздействие аэрозолей, содержащих микобактерии, приведет к быстрому связыванию растворимого собирающего реагента с микобактериальными клетками. Применение твердофазного материала в маске, который является полиионным, приведет к иммобилизации микобактерий на твердой фазе. Это устранит любую возможность дальнейшего образования инфекционного аэрозоля с поверхности во время вдыхания и обеспечит высокий уровень защиты оператора.

В этом первом примере растворимый собирающий реагент станет связанным с полиионным твердофазным материалом маски при увлажнении и до воздействия аэрозоля. Это может оказывать эффект снижения эффективности захвата микобактерий, поскольку поверхность могла стать насыщенной собирающим реагентом и поэтому не будет связывать комплекс микобактериальные клетки/собирающий реагент в воздействующих аэрозолях.

Альтернативно, связанный собирающий реагент может иметь сниженную аффинность или авидность к микроорганизмам в силу препятствий со стороны твердой поверхности.

Этот недостаток можно преодолеть, используя двухслойную защитную маску, которая имеет первый наружный слой, пропитанный растворимым собирающим реагентом на нейтральном незаряженном материале. Воздействие аэрозолей приведет к образованию комплекса микобактерий/собирающий реагент, который затем становится прочно связанным полиионным материалом во втором внутреннем слое структуры защитной маски.

Соответственно, настоящее изобретение включает в себя фильтр, как описано вначале, где указанный собирающий реагент представлен на твердой поверхности, имеющей низкую аффинность связывания в отношении собирающего реагента, расположенного выше указанной полярной поверхности.

На сопровождающих чертежах на фиг. 1 представлена микроскопическая визуализация окрашивания по методу Циля-Нильсена МусоЬас1егшш Ьотк в примере 10 на стадии 5 (панель с левой стороны) и после стадии 6 (панель с пра

- 6 016156 вой стороны);

на фиг. 2 представлены микроорганизмы, выделенные из бусин на стадии 6 примера 10 при большем (верхняя панель) и меньшем (нижняя панель) увеличении;

на фиг. 3 представлены покрытые (слева) и непокрытые (справа) предметные стекла, обработанные в примере 11; и на фиг. 4 представлены микобактерии, собранные в примере 12, и окрашенные для демонстрации жизнеспособности.

Далее настоящее изобретение будет описано и проиллюстрировано следующими примерами. В этих примерах, поскольку М. зшедшайз имеют много общих свойств, подобных М. 1иЬегси1о§18, но не являются инфекционными, их использовали в качестве репрезентативной модели организма для рода микобактерий.

Примеры

Пример 1. Титрование ρΌΛΌΜΆϋ лиганда и собирающих бус Обоснование. Этот эксперимент проводили для определения оптимального количества лиганда и бус при использовании для сбора микобактерии. Количество собранных микобактерий анализировали с помощью ПЦР генома микобактерий.

Способ.

1. Репликации 1 мкл культуры МусоЬас1епиш зшедшайз проводили в 1 мл культуральной среды 7Н9 ОАЭС (среда 7Н9, дополненная 10% ОАЭС, ЭНсо).

2. Добавляли 250 мкл 5х собирающего буфера (250 мМ Трис рН 8,3, 5% (масс/объем) Νлауроилсаркозин, 5% (об/об) тритон Х-100, 5% (масс/объем) В8А) и перемешивали.

3. Различные количества рОАОМАС (81§ша АМпсИ, средняя молекулярная масса, от 400000 до 500000) разведенного в воде, добавляли, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин.

4. МуОпе парамагнитные бусы карбоновой кислоты добавляли в объемном соотношении 10:1 по сравнению с исходным объемом рЭЛЭМАС, перемешивали и инкубировали 15 мин.

5. Бусы собирали с помощью магнитной установки и промывали в 1 мл РВ8.

6. Добавляли 20 мкл 100 мМ ΝηΟΙΙ, 0,05% (об/об) Тритона Х-100 и бусы ресуспендировали и нагревали при 95°С в течение 5 мин.

7. Добавляли 10 мкл 200 мМ НС1 и 2 мкл элюата анализировали с помощью количественной ПЦР на МусоЬас1епиш зшедшайз.

ПЦР анализ.

Использовали прибор СИгошо 4 производства фирмы М.1 КезеагсИ 1пс. (Негси1е§, СаШогша). Использовали наборы 8уЬг Огееп (Еиго§еп1ес, 8егат§, Ве1§шш), которые позволяют выявлять ПЦР-продукт в результате флуоресценции интеркалятора двухцепочечной ДНК. Использовали следующие условия ПЦР: нагревание 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 65°Св течение 15 с и удлинение при 72°С в течение 15 с. Использовали ПЦР-праймеры 5' ТСА ООС ССТ СОА АЛО ССО АСТ ООО 3', 5' ССА ОСА СТС ООТ АСА АОА СТС ТОС 3', специфичные для генома М.зшедшайз.

Результаты.

Количество	Количество	Цикл, при	Цикл, при
использованного	использованных	котором ПЦР	котором ПЦР
ρυΑϋΜΑΟ	бус	была	была
		положительной	положительной
		Наличие М.	Отсутствие М.
		зтедта£1з	зтедтаЫз
			контроль
5 мкл 0,01%	50 мкл	25,2	34,1*
(об/об)
2 мкл 0,01%	20 мкл	27,2	Осталась
(об/об)			отрицательной
5 мкл 0,004%	10 мкл	26,5	37,1
(об/об)
’,5 мкл 0,004%	2,5 мкл	28,7	35,7

(об/об)

Заключение.

мкл 0,01% рОАОМАС работало лучше всего, давая сигнал на цикле 25 по сравнению с циклом 34 для небактериального контроля (фон - образование димеров ПЦР-праймеров). Разведения рОАОМАС и бус дали прегрессивно уменьшенное извлечение М. зшедшайз.

Пример 2. Исследование эффективности сбора.

Эффективность сбора М. зшедшайз добавленных в среду, исследовали в сравнении с тем же количеством М. 8ше§ша118 экстрагированным путем щелочного нагревания, и детектировали непосредственно с помощью ПЦР.

Способ.

1. Разведения культуры МусоЬас1епиш зшедшайз были сделаны в 1 мл культуральной среды 7Н9 ОАЭС (среда 7Н9, дополненная 10% ОАЭС, ЭНсо).

- 7 016156

2. Добавляли 250 мкл 5х собирающего буфера (250 мМ Трис рН 8,3, 5% (мас./об.) Νлауроилсаркозина, 5% (об./об.) Тритона Х-100, 5% (мас./об.) Β8Ά) и перемешивали.

3. 10 мкл 0,01%(об./об.) рЭАЭМАС (81§та А1бг1сй, средняя молекулярная масса, от 400000 до 500000) добавляли, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин.

4. 50 мкл МуОпе парамагнитных бус карбоновой кислоты добавляли, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин.

5. Бусы собирали с помощью магнитной установки и промывали в 1 мл ΡΒ8.

6. Добавляли 20 мкл 100 мМ ΝαΟΗ, 0,05% (об./об.) Тритона Х-100 и бусы ресуспендировали и нагревали при 95°С в течение 5 мин.

7. Добавляли 10 мкл 200 мМ НС1 и 2 мкл элюата анализировали количественной ПЦР на наличие МусоЪас1епит зтедтайз.

8. Кроме того, 1 мкл той же культуры М. зтедтайз обрабатывали непосредственно щелочью, как описано на стадиях 6-7 выше, и анализировали с помощью ПЦР таким же образом.

ПЦР анализ.

ПЦР описана в примере 1.

Результаты.

Разведение М.	Приблизительное	Цикл, при котором
зтедтаЁгз	количество	ПЦР была
	бактерий	положительной
10’³	100000	26,7
10~⁴	10000	32,0
10’⁵	1000	37,3
Отсутствуют М.	0	35,6
зтедта^хз - контроль
1 мкл М. зтедта^гз	100000	26,5

обработанных непосредственно

Заключение.

Эффективность сбора бактерий была очень высокой с аналогичным сигналом, генерированным от того же количества бактерий, добавленных и извлеченных, как и анализированных непосредственно. Всего лишь 10000 бактерий, добавленных в мл среды, могли быть извлечены и детектированы.

Пример 3. Изучение необходимости в собирающем буфере.

Обоснование. М. зтедтайз добавляли в среду и извлекали в присутствии или отсутствии собирающего буфера.

Способ.

Способ представлял собой способ, описанный в примере 1, за исключением того, что в один образец собирающий буфер не добавляли.

Результаты.

Наличие собирающего буфера Цикл, при котором ПЦР была положительной собирающий буфер отсутствует 25,5 собирающий буфер 23,0 используется

Заключение.

Собирающий буфер увеличивал извлечение бактерий на 2,5 цикла или примерно в 6 раз в единицах бактериальных геномов и бактерий. Это возможно вследствие воздействия детергентов на среду и снижения интерференции под действием ингибирующих элементов, которые ингибируют связывание М. 8те§тай8 с собирающим реагентом.

Пример 4. Демонстрация полезности захвата лиганда М. зтедтайз в исследовании на основе фагов.

Обоснование. Микобактерии могут быть протестированы на жизнеспособность через способность бактерий выступать в роли хозяина для инфицирования бактериофагами. Одной из проблем этого подхода является отделение инфицированных бактерий от экзогенных неинфицирующих бактериофагов. После отделения от экзогенного фага бактерии могут быть лизированы и исследованы на эндогенные инфицирующие бактериофаги.

Способ.

100 мкл М. зтедтайз добавляли к 10 мл среды 7Н9 ОА1)С и инкубировали в течение 3 часов при 37°С. Также готовили отрицательный контроль без бактерий.

100 мкл (около 10¹⁰ бляшкообразующих единиц) микобактериофага 1)29 добавляли к обеим пробиркам, и образцы помещали обратно в термостат.

мл аликвот удаляли в различные моменты времени после заражения и М. зтедтайз собирали из

- 8 016156 среды, как описано в примере 1, за исключением того, что три дополнительных промывания проводили в РБ8.

Собранные бактерии лизировали, как описано, и исследовали на наличие эндогенного инфицирующего фагового генома с помощью ПЦР. ПЦР проводили, как описано ранее, за исключением того, что использовали праймеры, специфичные в отношении фагового генома 5' ССТ СОО ОСТ ААА ААС САС СТС ТОА СС 3', 5' СТО ООА ОАА ТОТ ОАС АСО ССО АСС 3'.

Результаты.

Время после	Присутствие М.	Цикл, при котором ПЦР
инфицирования	зтедта(:1з	была положительной
15 мин	Присутствует	Осталась	отрицательной
15 мин	Отсутствует	39.8
3 0 мин	Присутствует	27
30 мин	Отсутствует	Осталась	отрицательной
60 мин	Присутствует	30
60 мин	Отсутствует	Осталась	отрицательной
90 мин	Присутствует	Осталась	отрицательной
90 мин	Отсутствует	Осталась	отрицательной
120 мин	Присутствует	31
120 мин	Отсутствует	Осталась	отрицательной
Заключение.

Способность собрать М. зшедшайз из среды позволила промыть бактерии и удалить экзогенный фаг. Только фаги, которые были впоследствии выявлены, представляли собой фаги, которые инфицировали бактерии. В этом примере этот способ использовали для мониторинга инфекционного процесса. Через 15 мин после добавления фага не было сигнала, детектируемого от бактерий. Фаг все же должен инфицировать и фаговый геном не реплицируется. Эндогенный фаговый геном появляется на 30 мин в бактериях, но идет на убыль в момент времени 60 мин, полностью исчезая в момент времени 90 мин, поскольку фаг реплицируется и лизирует бактерии. Сигнал снова появляется на 120 мин, поскольку высвобождаемое второе поколение реплицированных фагов проходит другой цикл инфицирования и репликации.

Пример 5. Демонстрация сбора микобактерий из мокроты.

Обоснование. Мокрота представляет собой сложный и вязкий матрикс. Эксперимент проводили для того, чтобы показать, что этот матрикс не помешал бы сбору микобактерий.

Способ.

Получали пул 5 образцов мокроты и разделяли аликвотами объемами 1 мл.

К половине аликвот добавляли 10 мкл культуры М. зшедшайз.

Добавляли 100 мкл 5М ΝαΟΗ, 2,5% Ν-ацетилцистеина и инкубировали в течение 15 мин для разжижения и деконтаминации мокроты. Добавляли 100 мкл 5М НС1, затем 250 мкл 5х собирающего буфера (как описано ранее).

Затем М. зшедшайз собирали из мокроты и количественно анализировали с помощью ПЦР, как описано в примере 2, стадии 3-8.

Результаты.

Образцы с М. зшедшайз были позитивными при цикле 20 ПЦР. Образец без бактерий (т.е. фон) был позитивным при цикле ПЦР 36,3.

Заключение.

Способ экстракции с использованием рБАОМАС и захвата бус не ингибировался матриксом образца (мокроты) и М. 8шедшаЙ8 с успехом извлекались из этого образца.

Пример 6. Демонстрация получения микобактерий из мокроты без необходимости разжижения и деконтаминации щелочью.

Обоснование. Мокрота представляет собой сложный и вязкий матрикс. Обработка щелочью разжижает и деконтаминирует мокроту, но также может повредить микобактерий. Этот эксперимент поводили для того, чтобы показать, что процедура экстракции может быть использована без предварительной обработки щелочью. М. зшедшайз снова использовали в качестве организма-модели рода микобактерий.

Способ.

К половине аликвот добавляли 10 мкл культуры М. зшедшайз. Добавляли 250 мкл 5х собирающего буфера (как описано ранее) и перемешивали.

Результаты.

Образец с М. зшедшайз был положительным при цикле ПЦР 24,7.

Образец без бактерий (т.е. фон) остался отрицательным.

- 9 016156

Заключение.

Способ экстракции с использованием рЭАЭМАС и собирающих бус не требовал предварительной обработки мокроты щелочью. Было отмечено, что добавления собирающего буфера было достаточно для того, чтобы вызвать разрушение и разжижение мокроты, что впоследствии позволяло извлечь М. 8тедтай8 из этого образца.

Пример 7. Демонстрация необходимости рЭАЭМАС лиганда в системе поглощения.

Обоснование. Этот эксперимент проводили для того, чтобы показать, что собирающий реагент, показанный здесь на примере рЭАЭМАС, является необходимым для сбора микобактерий, и что микобактерии не связываются с карбоксильными бусами в отсутствии собирающего реагента.

Способ.

0,5 мл аликвоты культуры М. 8тедтай8 в стационарной фазе центрифугировали для осаждения микроорганизмов, затем эти микроорганизмы ресуспендировали в собирающем буфере (50 мМ Трис рН 8,3, 1% (мас./об.) Ν-лауроилсаркозина, 1% (об./об.) Тритона Х-100, 1% (мас./об.) В8А).

К одной аликвоте добавляли 10 мкл 0,01% рЭАЭМАС, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин. В такую же аликвоту не добавляли рЭАЭМАС и оставляли на 15 мин.

мкл парамагнитных бус с карбоновой кислотой МуОпе (промытых х3 перед применением в 6Н₂О и ресуспендированных в исходном объеме 6Н₂О) затем добавляли к каждой аликвоте и инкубировали 15 мин.

Эти аликвоты затем помещали на магнит, и любое просветление мутной суспензии микроорганизмов оценивали визуально.

Супернатанты затем удаляли и сохраняли.

Бусы затем промывали в х1 собирающем буфере и х2 в среде 7Н9 ОАЭС и ресуспендировали в 1 мл этой среды.

Эквивалент 0,1 мкл супернатанта и суспензии бус осаждали на агаровых чашках 7Н9 ОАЭС и инкубировали в течение 2 дней при 37°С после чего подсчитывали количество колоний на каждой чашке.

Результаты.

После добавления магнитных бус и расположения аликвот на магните, происходило значительное просветление аликвоты, которую инкубировали с собирающим реагентом рЭАЭМАС. Это происходило вследствие сбора большинства микроорганизмов в суспензии на магнитных частицах. Аликвота, к которой не добавляли собирающий реагент, оставалась мутной, поскольку микроорганизмы оставались в суспензии. Количества собранных и несобранных бактерий в присутствии и отсутствии собирающего реагента подсчитывали из культур на агаровых пластинках и заносили в таблицу (смотри таблицу, приведенную ниже).

	Количество	Количество
	подсчитанных колоний	подсчитанных колоний
	Собирающий реагент	Собирающий реагент
	рБАБМАС отсутствует	рПАБМАС добавлен
Супернатант	Более 1000	490
Собрано на	359	Более 1000

бусах

Заключение.

Сбор микобактерий, как определено по визуальной мутности, посредством бус с карбоновой кислотой, зависел от присутствия р1)Л1)МЛС. Это визуальное наблюдение подтверждалось микробиологическим количественным определением. В присутствии собирающего реагента было собрано подавляющее большинство микобактерий, тогда как в отсутствие собирающего реагента происходила минимальная абсорбция на бусах.

Пример 8. Демонстрация селективности лигандного захвата в отношении микобактерий. Обоснование.

Этот эксперимент проводили для того, чтобы показать, что собирающий реагент р1)Л1)МЛС связывается специфически с микобактериями и не связывается с другими тестируемыми микроорганизмами, в том числе характерными грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами, которые также могут контаминировать соответствующие биологические образцы.

Способ.

Аликвоты по 0,5 мл культур М. 8терта118, ₽8еиботопа8 аегидто8а, 81арЪу1ососси8 аигеи8 и Е8сйепсЫа сой в стационарной фазе центрифугировали для осаждения микроорганизмов, затем эти микроорганизмы ресуспендировали в собирающем буфере (50 мМ Трис рН 8,3, 1% (масс/объем) Νлауроилсаркозин, 1% (об./об.) Тритон Х-100, 1% (мас./об.) В8А).

К каждой аликвоте каждого микроорганизма добавляли по 10 мкл 0,01% рЭАЭМАС, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин.

- 10 016156

Затем к каждой аликвоте добавляли по 50 мкл МуОпе парамагнитных бус с карбоновой кислотой (промытых х3 до использования в 6Н₂О и ресуспендированных в исходном объеме 6Н₂О) и инкубировали 15 мин.

Затем аликвоты размещали на магните, и любое просветление мутной суспензии микроорганизмов оценивали визуально.

Затем супернатанты удаляли и сохраняли.

Затем бусы промывали в х1 собирающем буфере. Аликвоты М. зтедтайз затем промывали х2 в среде 7Н9 ОАИС и ресуспендировали в 1 мл этой среды. Другие микроорганизмы промывали таким же образом в среде Мюллера Хинтона и ресуспендировали в 1 мл этой среды.

Эквивалент 0,1 мкл супернатанта и суспензии бус располагали либо на агаровых пластинках 7Н9 ОЛ[)С для М. Зтедтайз, либо на агаровых пластинках Мюллера Хинтона для других микроорганизмов и инкубировали при 37°С до появления бактериальных колоний, после этого подсчитывали количество колоний на каждой пластинке.

Результаты.

Как и раньше, суспензия М. зтедтайз просветлялась при размещении на магните, демонстрируя то, что микроорганизмы были собраны из суспензии. Суспензии всех других протестированных микроорганизмов оставались очень мутными, демонстрируя то, что микроорганизмы не собирались и оставались в суспензии. Количество собранных и несобранных бактерий подсчитывали из культур на агаровых пластинках и заносили в таблицу.

Микроорганизм	Количество колоний из	Количество колоний из
	супернатанта	бус
М. зтедта(:1з	221	Более 1000
Р.аегидипоза	Более 10000	12
3.аигеиз	Более 1000	8
Е. соИ	Более 10000	22

Заключение.

Собирающий реагент рИАИМАС давал возможность осуществить специфический сбор микобактерий М. зтедтайз. Другие тестируемые организмы не связывались с собирающим реагентом и не были собраны.

Пример 9. Изучение состава собирающего буфера, необходимого для специфического сбора бактерий.

Обоснование.

Этот эксперимент проводили для изучения компонентов собирающего буфера, которые являются важными для специфического связывания рИАИМАС с микобактериями.

Способ.

Аликвоты по 0,5 мл культур οί М. зтертаОз, Рзеиботопаз аегищпоза, 81арйу1ососсиз аигеиз и ЕзсйепсЫа сой в стационарной фазе центрифугировали для осаждения микроорганизмов, затем эти микроорганизмы ресуспендировали в различных компонентах собирающего буфера.

К каждой аликвоте каждого микроорганизма добавляли по 10 мкл 0,01% рИАИМАС, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин. К другой аликвоте каждого микроорганизма собирающий реагент не добавляли в качестве контроля для наблюдения за тем, как собирающий реагент опосредует сбор бактерий, 50 мкл МуОпе парамагнитных бус с карбоновой кислотой (промытых х3 перед использованием в 6Н₂О и ресуспендированных в исходном объеме 6Н₂О) затем добавляли к каждой аликвоте и инкубировали 15 мин.

Аликвоты затем размещали на магните, и любое просветление мутной суспензии микроорганизмов оценивали визуально.

Результаты.

Результаты были записаны и представлены в таблице, приведенной ниже. Микроорганизмы, не являющиеся микобактериями, не собирались на бусах в отсутствие или в присутствии собирающего реагента в любых буферных условиях. Сбор микобактерий зависел от присутствия собирающего реагента рИАИМАС и сбор бактерий наблюдали во всех изучаемых буферных условиях. Оказалось, что применение буфера, содержащего только Ν-лауроилсаркозин, частично ингибирует сбор бактерий. При использовании саркозина в комбинации с Тритоном-Х100, однако, эффективность сбора была восстановлена. В тех случаях, когда Ν-лауроилсаркозин не присутствовал в собирающем буфере, бусы были очень агрегированными после ресуспендировалия после сбора микобактерий. Включение Ν-лауроилсаркозина предотвращало это агрегирование после сбора бактерий и помогало обрабатывать бусы, что было бы важным для последующего промывания бус и обработке и анализа после сбора бактерий.

Заключение.

Как показано ранее, организмы, не являющиеся микобактериями, не собирались на бусах в присутствии или в отсутствие собирающего реагента в любых тестируемых условиях. Сбор микобактерий зависел от присутствия собирающего реагента и мог быть демонстрирован во всех тестируемых условиях.

- 11 016156

Включение Ν-лауроилсаркозина в собирающий буфер было важным для обработки после сбора бактерий и анализа собранного материала.

Пример 9. Таблица результатов

Используемый микроорганизм

Используемый	Р.аегидгпоза	Р.аегид!поза	3.аигеиз	3.аигеиз	Е. соИ	М.	М. зтедтаИ:
собирающий	С собирающим	Без	С	Без	С собирающим	Е.соИ	зтедтаЬаз	Без
буфер	реагентом	собирающего реагента	собирающим реагентом	собирающего реагента	реагентом	Без собирающего реагента	С собирающим реагентом	собирающего реагента
50 мМ Трис рН	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Прозрачный	Остался
8,4 1% Νлауроил саркозин 1% (об/об)Тритон Х-100	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным		мутным
50 мМ Трис рН	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Слегка	Остался
8,4 1% Ν- лауроил саркозин	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным	мутный	мутным
50 мМ Трис рН	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Прозрачный	Остался.
8,4 1% (об/об) Тритон Х-100	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным		мутным
50 мМ Трис рН	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Остался	Прозрачный	Остался
8,4	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным	мутным		мутным

Пример 10. Выявление микобактерий путем лигандного захвата и микроскопическое исследование кислотоустойчивых бактерий.

МусоЬас!епиш Βονΐδ собирали из раствора и окрашивали как кислотоустойчивым цветным красителем по методу Циля-Нильсена, так и флуоресцентным красителем аурамин-фенол непосредственно на бусах или после элюции.

Способ.

1. 250 мкл 5х собирающего буфера (250 мМ Трис рН 8,3, 5% (об/об) Тритон Х-100, 5% Цвиттергент [3-(п,№диметилмиристиламмоний)-пропансульфонат]) добавляли к 1 мл среды 7Н9, содержащей суспензию МусоЬас!егшш Ьον^8.

2. Добавляли 10 мкл 0,01%(об/об) рЭАЭМАС, перемешивали и инкубировали в течение 15 мин.

3. Добавляли 50 мкл МуОпе парамагнитных бус с карбоновой кислотой, перемешивали и инкубировали 15 мин.

4. Бусы собирали с помощью магнитной установки и промывали в 1 мл РБ8.

5. Половину объема бус наносили на предметное стекло, сушили и фиксировали нагреванием перед окрашиванием по методу Циля-Нильсена. На фиг. 1, панель, находящаяся слева, собранные микобактерии видны до элюции из лиганда/бус. Магнитные бусы указаны нижней стрелкой. Собранные на бусах, высокоагрегированные кислотоустойчивые микобактерии указаны верхней стрелкой, и их можно увидеть окруженными бусами.

6. Оставшиеся бусы ресуспендировали в 100 мкл дН20 и добавляли 10 мкл хлороформа. После встряхивания для премешивания хлороформа с водным слоем, бусы притягивались к боку пробирки магнитом и супернатант наносили на предметное стекло, сушили, фиксировали нагреванием и окрашивали как по методу Циля-Нильсена, так и аурамином-фенолом. Все окрашивания проводили, как описано в МеШса1 М1сгоЬ1о1оду, а РгасБса1 АрргоасБ, Εάδ., Ре!ег На^кеу апд БеИге ке\\т8, ΟχίοΜ Ип^егзйу Ргезз. На фиг. 1, панель с правой стороны, собранные микобактерии видны после элюции из лиганда/бус. Элюция содержит диспергированные кислотоустойчивые микобактерии (нижняя стрелка). Некоторые бусы все еще присутствуют (верхняя стрелка). На фиг. 2 показаны микроорганизмы, собранные с бус. При большом увеличении на верхней панели можно увидеть скопление флуоресцентных микобактерий, собранных на лиганде, а на нижней панели при меньшем увеличении можно увидеть характерную звездную ночь флуоресценции диспергированных микобактерий.

Результаты.

Микобактерии собираются лиганд/парамагнитными бусами, и без элюции, после окрашивания по методу Циля-Нильсена, их можно видеть в виде высоко агрегированного розового вещества, окруженного бусами. После элюции, микобактерии отделяются от бус и диспергируются (смотри фиг. 1 и 2).

Заключение.

Микобактерии могут быть собраны с помощью ТВ-лиганда и могут быть визуализированы с помощью кислотоустойчивого окрашивания и микроскопии. После элюции микобактерии выделяют из бус и диспергируют. Дальнейшие эксперименты показали, что лигандный захват и протокол окрашивания хорошо работают в случае клинических образцов ТВ в мокроте и что флуоресцентная микроскопия может быть использована для более чувствительного выявления.

Пример 11. Непосредственный сбор микобактерий на твердой поверхности, покрытой лигандом, с окрашиванием ίη зйи и выявлением собранных микроорганизмов с помощью микроскопии.

Обоснование.

Этот эксперимент проводили для того, чтобы продемонстрировать сбор микобактерий на предметных стеклах, покрытых р-1)А1)МАС, визуализированных с помощью окрашивания ίη и микроскопии.

- 12 016156

Способ.

Предметное стекло покрывали ρ-ΌΑΌΜΑΟ путем погружения предметного стекла в 2%(об./об.) ρΌΑΌΜΑΟ (разведенного из 20% матричного раствора в дистиллированной воде) и оставляли испаряться до сухости. Предметное стекло без покрытия использовали в качестве контроля. Затем предметные стекла промывали в больших количествах дистиллированной воды и сушили. Добавляли 100 мкл культуры М. зтедтайз к 800 мкл бН20 и 100 мкл собирающего буфера (10%(мас./об.) Цвиттергент [3-(η,Νдиметилмиристиламмоний)пропансульфонат], 10% (об./об.) Тритон Х-100, 500 мМ Трис рН 8,3) наносили на предметные стекла. После инкубирования в течение 10 мин предметные стекла промывали в дистиллированной воде и окрашивали по Грамму, как описано в Μеά^са1 ΜίοΓοόίοΙοβ}'. а Ргасйса1 ΛρρίΌαοΙι. Εάβ., Ре!ег На\\'кеу апб Оейге Ье^18, Θχίοτά Ипкегзйу Ргезз.

Результаты.

Грамположительные микобактерии можно было наблюдать с помощью микроскопа собранными в больших количествах на предметном стекле, покрытом ρ-ΌΑΌΜΑΟ (смотри фиг. 3), тогда как очень мало (если имеется) микобактерий собралось на предметном стекле без покрытия.

Заключение.

Этот пример демонстрирует, что микобактерии могут быть собраны на предметном стекле, покрытом ρ-ΌΑΌΜΑΟ, и что эти микобактерии могут быть окрашены ίη δίΐιι и рассмотрены под микроскопом. Аналогичные результаты также были получены из культур БЦЖ и окрашивания кислотоустойчивым красителем по методу Циля-Нильсена и флуоресцентным красителем аурамином-фенолом.

Пример 12. Сбор микобактерий непосредственно на твердой поверхности, покрытой лигандом, с окрашиванием ίη δίΐιι на жизнеспособность и выявлением с помощью микроскопии.

Обоснование. Этот эксперимент проводили для того, чтобы показать, что микобактерии, собранные на предметных стеклах, покрытых ρ-ΌΑΌΜΑΟ, остаются жизнеспособными и могут быть визуализированы с помощью витальных красителей ίη δίΐιι с последующим микроскопическим исследованием.

Способ.

На предметное стекло наносили покрытие ρ-ΌΑΌΜΑΟ путем погружения предметного стекла в 2% (об/об) ρ-ΌΑΌΜΑΟ (разведенный из 20% маточного раствора в дистиллированной воде) и оставляли его для испарения до сухости. Предметное стекло без покрытия использовали в качестве контроля. Затем предметные стекла промывали в большом количестве дистиллированной воды и сушили. Добавляли 100 мкл культуры Μ. зтедтайз к 800 мкл бН2О и 100 мкл собирающего буфера (10% (мас./об.) Цвиттергент [3-(η,N-диметилмиристиламмоний)-пропансульфонат], 10% (об./об.) Тритон Х-100, 500 мМ Трис рН 8,3)и наносили на предметные стекла. После инкубирования в течение 10 мин предметные стекла промывали в дистиллированной воде и добавляли 1 мг/мл Тиазолил голубого тетразолиума бромида (МТТ) в 7Н9, среда ΟΑΌΟ, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания в дистиллированной воде жизнеспособные микобактерии рассматривали под микроскопом.

Результаты.

Краситель МТТ откладывается в виде нерастворимого синего/черного пятна в жизнеспособных микроорганизмах, собранных на предметных стеклах, покрытых ρ-ΌΑΌΜΑΟ, позволяя выявлять жизнеспособные микроорганизмы с помощью микроскопии (см. фиг. 4).

Заключение.

Этот пример демонстрирует, что микобактерии могут быть собраны на предметных стеклах, покрытых ρ-ΌΑΌΜΑΟ, и что эти собранные микобактерии остаются жизнеспособными и могут быть окрашены витальными красителями, такими как МТТ.

Пример 13. Способ для использования со слизистой мокротой.

Обоснование. Некоторые образцы мокроты могут быть очень густыми и слизистыми с высокой концентрацией мукополисахаридов, которые в высокой степени поперечно связаны ковалентными сульфидными мостиками и наполнены карбоксильными группами. Рассматривалось применение восстановителей, таких как дитиотеитол и Ν-ацетилцистеин для разрушения дисульфидных связей, но мукополисахариды в высокой концентрации все же могут мешать сбору микобактерий посредством взаимодействия отрицательно заряженных карбоксильных групп с положительно заряженным ρΌΑΌΜΑΟ. Чтобы уменьшить это ингибирование, может быть целесообразным проводить сбор при низком рН - при рН, при котором карбоксильные группы нейтрализуются, но ρΌΑΌΜΑΟ остается заряженным. При таких низких рН было бы невозможным собирать ρΌΑΌΜΑΟ на карбоксильных бусах, поскольку они тоже потеряли бы свой заряд, следовательно, при низком рН карбоксильные бусы должны быть заменены на сульфатные бусы, которые остаются отрицательно заряженными в условиях, при которых карбоксильные бусы становятся нейтральными. Эти условия были протестированы для сбора ΜусοЬасΐеπит 1иЬег^ΐοβίδ из мокроты, поставляемой банком мокроты Всемирной организации здравоохранения.

Способ.

1. На аминные бусы ΒίοΜηβ (ВМ546, Ваидх ΓτώοηΙοι^δ 1пс., И8) сначала наносили покрытие в 5% (об/об) ρΌΑΌΜΑΟ (высокой молекулярной массы) в бН₂О в течение 1 ч, затем после промывания в бН₂О сверху покрывали 10 мг/мл декстран сульфатом (ММ 500000) в течение 1 ч в бН₂О. После промывания в бН₂О бусы ресуспендировали в исходном объеме бН₂О и затем они были готовы к использованию.

- 13 016156

2. 0,5 мл образцов гнойной мокроты (либо положительной, либо отрицательной в отношении микобактерий по данным микроскопии) тестировали в течение 20 мин с 2% (мас./об.) конечного дитиотреитола. В качестве положительного контроля в несколько образцов мокроты также было добавлено известное количество культивированных БЦЖ до обработки.

3. После этой обработки, добавляли 50 мкл 10% (об/об) Тритона Х-100, 10 мМ ЕБТА, 20 мкл 0,004% (об/об) рБАБМАС (ММ 500000) и 50 мкл 2, 5М НС1 и инкубировали в течение 10 мин. Ожидается, что рН на этой стадии составлял приблизительно 0,6.

4. Затем добавляли 20 мкл парамагнитных бус, покрытых декстран сульфатом, и инкубировали в течение 10 мин.

5. Бусы собирали магнитом, промывали в 1 мл 6Н₂О (эта стадия промывания обычно не требовалась бы, но проводилась для того, чтобы продемонстрировать активный захват микобактерий), ресуспендировали в 10 мкл 6Н₂О и наносили на предметное стекло. Предметные стекла обрабатывали для проведения флуоресцентной микроскопии микобактерий с аурамин-фенолом, как описано в примере 10.

Результаты.

Десять образцов мокроты, которые по сообщениям банка мокроты ВОЗ были отрицательными в отношении микобактерий туберкулеза, были отрицательными после проведения сбора и микроскопического анализа. Десять образцов мокроты, которые по сообщениям банка мокроты ВОЗ, были положительными, были явно положительными, как были контроли, в которые были добавлены БЦЖ. Более того, контрольные образцы указывали на высокую эффективность извлечения микобактерий из мокроты, по оценкам сравнительной микроскопии, что было извлечено 90-95% внесенных микобактерий.

Заключение

Для густых слизистых образцов сбор микобактерий хорошо проходил при рН, который был достаточно низким для нейтрализации групп карбоновой кислоты на мукополисахаридах.

В этом описании, если явным образом не указано иное, слово или используется в смысле оператора, который отражает истинное значение, когда встречается любое из двух или оба указанных состояния, в противоположность оператору исключительно или, для которого требуется, чтобы встречалось только одно из условий. Слово содержащий используется в смысле включающий, а не в смысле состоящий из. Все предшествующие сведения приняты во внимание выше, тем самым включены в качестве ссылки. Никакое подтверждение любого ранее опубликованного документа здесь не должно рассматриваться, как признание или представление того, что сведения этого документа являлись общедоступным известным уровнем техники в Австралии или в другом месте на эту дату.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения из образца микроорганизмов, имеющих гидрофобную поверхность, причём данными микроорганизмами являются микобактерии, который включает контактирование микроорганизмов с собирающим реагентом, который имеет как гидрофобные свойства, за счёт чего собирающий реагент связывается с указанными микобактериями, посредством гидрофобного взаимодействия с ними, так и полярные свойства, и который представляет собой полидиаллилдиметиламмония хлорид (полиБАБМАС), при этом указанный собирающий реагент либо находится на поверхности и собирает на неё указанные микобактерии, либо находится в растворе, и в этом случае указанный способ дополнительно включает сбор указанных микобактерий на поверхности путём связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью посредством полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным собирающим реагентом.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный собирающий реагент является катионным.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный полидиаллилдиметиламмония хлорид (БАБМАС) имеет молекулярную массу от около 200000 до 500000.
4. Способ получения из жидкого образца микроорганизмов, имеющих гидрофобную поверхность, причём данными микроорганизмами являются микобактерии, который включает контактирование микроорганизмов с растворимым собирающим реагентом, который содержит поли-БАБМАС, за счёт чего собирающий реагент связывается с указанными микобактериями, и сбор указанных микроорганизмов на поверхности путём связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец приводят в контакт с собирающим реагентом в присутствии детергента, который усиливает селективность связывания желаемых микроорганизмов.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный детергент содержит аминокислотный амид жирной кислоты.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный детергент содержит Ν-лауроилсаркозин.
8. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что указанный детергент содержит детергент Тритон X.
9. Способ выявления микроорганизма, включающий сбор указанного микроорганизма на поверхности способом по любому из предыдущих пунктов, промывание указанных собранных микроорганизмов и

- 14 016156 выявление указанного собранного микроорганизма на указанной поверхности или после удаления с неё.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что определяют жизнеспособность указанных собранных микроорганизмов.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанные собранные микроорганизмы обрабатывают лекарственным средством и определяют жизнеспособность этих микроорганизмов для установления влияния этого лекарственного средства на жизнеспособность указанного микроорганизма.
12. Набор для исследования микроорганизмов, содержащий либо (а) растворимый собирающий реагент, имеющий как гидрофобные свойства, за счёт чего собирающий реагент способен связываться с выявляемыми микобактериями посредством гидрофобного взаимодействия с ним, так и полярные свойства, при этом указанный собирающий агент представляет собой поли-ЭЛОМЛС, субстрат, имеющий поверхность для сбора указанных микобактерий на указанной поверхности, посредством связывания указанного собирающего реагента с указанной поверхностью путём полярного взаимодействия между указанной поверхностью и указанным собирающим реагентом, либо (Ь) собирающий реагент, иммобилизованный на твёрдой поверхности, при этом указанный собирающий реагент, имеющий как гидрофобные, так и полярные свойства, за счет чего он способен связываться с выявляемым микобактериями, представляет собой поли-ЭЛОМЛС и по меньшей мере одно из следующих компонентов:

фаг, способный инфицировать указанные микобактерии;

праймеры для проведения амплификации геномной нуклеиновой кислоты указанных микобактерий или указанного фага;

питательную среду для культивирования указанных микобактерий;

краситель для визуализации указанных микобактерий для микроскопического исследования; антитело для связывания указанных микобактерий; и возможно также содержит питательную среду для культивирования указанных микобактерий;

детектирующий реагент для использования при выявлении метаболита, продуцируемого при культивировании указанных микобактерий;

детектирующий агент, предназначенный для определения жизнеспособности указанных микобактерий; и/или один или несколько препаратов, которые потенциально могут повлиять на жизнеспособность указанных микобактерий.
13. Набор по п.12, отличающийся тем, что указанный собирающий реагент представляет собой поли-ПАОМЛС, имеющий молекулярную массу от около 200000 до 500000.
14. Набор по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанный фаг, указанные праймеры, указанное антитело или указанный детектирующий агент специфичны для идентификации комплекса М. 1иЬегси1о818, М. аушш, М. Ш1гасе11и1аге, М. рага1иЬегси1о818, М. 1ергае, М. каизавй, М. тагшит или М. Гойийит.
15. Набор по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что указанный набор содержит детектирующий агент, специфичный в отношении жизнеспособных микроорганизмов.
16. Набор по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что указанный набор содержит одно или несколько лекарственных средств, потенциально способных оказывать влияние на жизнеспособность указанных микроорганизмов.