CN105671124A - 大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒。具体地，本发明公开了一种方法，所述方法包括(a)提供(1)至少一个疑似包含至少一个大肠菌菌株的样品、(2)至少一个包括至少一种水合的或可水合的培养基的培养装置、和(3)至少一种粒状浓集剂；(b)设置所述粒状浓集剂与所述样品相接触，使得所述大肠菌菌株的至少一部分结合至所述粒状浓集剂以形成结合大肠菌的粒状浓集剂；(c)设置所述结合大肠菌的粒状浓集剂与所述培养基相接触；(d)孵育包括与所述培养基相接触的所述结合大肠菌的粒状浓集剂的所述培养装置，所述培养基为水合的；以及(e)在不将所述大肠菌菌株与所述粒状浓集剂分离的情况下，光学检测所述大肠菌菌株的存在。

Description

大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2009/069629，国际申请日为2009年12月29日，进入中国国家阶段的申请号为200980157395.3，发明名称为“大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒”的中国发明专利申请的分案申请。
优先权声明
本专利申请要求下述美国临时专利申请的优先权：2009年12月9日提交的61/267,860；2008年12月31日提交的61/141,900；2008年12月31日提交的61/141,813；和2008年12月31日提交的61/141,685；上述美国临时专利申请的内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测试验样品中微生物的存在的方法。在另一方面，本发明还涉及用于实施这种方法的诊断试剂盒。
背景技术
在饮用水检测和食品安全检测中，大肠菌的存在与否被认为是重要的品质依据，并且在饮用水和某些食品(例如，乳制品)中允许的大肠菌的量在世界各地的多个国家中是有规定的。大肠菌包括粪便大肠菌，例如大肠杆菌。食品或水样品中存在的粪便大肠菌被用作食品或水的粪便污染以及可能存在的其他病原微生物的主要指示物。
用于检测、鉴定和/或计数水样品中的微生物的方法可见于(例如)美国公共卫生协会(AmericanPublicHealthAssociation)、美国自来水工程协会(AmericanWaterWorksAssociation)和水环境联合会(WaterEnvironmentFederation)联合出版的第21版纲要“StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater”(“SMEWW”)(水和废水检验标准方法)。SMEWW描述了下述膜过滤技术，其常常用于水检测中，以便获得以相对低浓度存在于相对大量的水中的微生物的直接计数。在实施这项技术中，使特定体积的水穿过膜过滤器，将该膜在培养基或装置中孵育特定时间段，随后将所得微生物菌落进行计数。膜过滤技术可用于监测样品的微生物品质，这些样品来自旨在生产饮用水的工艺，以及来自于各种天然的、未处理的水源。
用于检测、鉴定和/或计数食品样品中的微生物的方法通常根据食品的特性以及可能存在于样品中的微生物的类型而有所不同。用于检测食品样品的方法概要包括：由美国公共卫生协会(Washington,D.C.)公布的第27版“StandardMethodsfortheExaminationofDairyProducts”(乳品检验标准方法)，以及由美国食品药品管理局(theU.S.FoodandDrugAdministration,Washington,D.C.)公布的“BacteriologicalAnalyticalManual”(“BAM”)(细菌学分析手册)。通常将固体食品悬浮于水性介质中，并混合和/或研磨以得到可用于微生物定量分析方法中的食品材料的匀浆液。
然而，上述参考方法通常相对昂贵、涉及复杂的步骤、和/或需要相对复杂的仪器和/或相对较高受训程度的人员。例如，大多数膜过滤技术需要灭菌设备、真空歧管和结果的人工判读。另一个缺点为膜过滤器可被小颗粒(例如，泥沙、粉尘、锈或其他悬浮颗粒)堵塞。
诸如离心之类的技术需要用于采样大体积(例如，大于50毫升的体积)的专用电源设备，并且从这种体积中回收相对低数量的微生物需要相对长的时间段。用于样品的微生物分析的培养装置通常可仅容纳相对小的样品种菌体积(例如，大约1毫升)。这种局限性在水检测领域中尤其成问题，因为美国环境保护局(U.S.EnvironmentalProtectionAgency)水质检测条例(例如)规定检测大(100毫升)水样品体积。
发明内容
因此，我们认识到迫切需要用于快速检测、鉴定和/或计数病原微生物的方法。所述方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不涉及复杂的设备或程序)、和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质和/或病原微生物、不同微生物负荷、以及不同样品体积)有效。具体地讲，我们认识到需要用于检测、鉴定和/或定量试验样品(例如，用于饮用水和食品安全检测)中的大肠菌的简单、有效和/或高性价比的方法。
简而言之，在一个方面，本发明提供了用于检测样品中存在或不存在大肠菌的方法。所述方法包括：
(a)提供至少一个疑似包含至少一种大肠菌菌株的样品(优选地，为流体形式；更优选地，水样品)；
(b)提供至少一个培养装置，其包括至少一种水合的或可水合的培养基；
(c)提供至少一种粒状浓集剂，其在培养基为水合的情况下与培养装置中的培养基相接触时为基本上光学透明的；
(d)设置粒状浓集剂与样品相接触(优选地，通过混合进行)，使得大肠菌菌株的至少一部分结合至粒状浓集剂或被粒状浓集剂捕集，以形成结合大肠菌的粒状浓集剂；
(e)设置结合大肠菌的粒状浓集剂与培养装置的培养基相接触；
(f)孵育包括与培养基(所述培养基为水合的)相接触的结合大肠菌的粒状浓集剂的培养装置；以及
(g)在不将大肠菌菌株与粒状浓集剂分离的情况下，光学检测大肠菌菌株的存在(例如，大肠菌菌株的至少一个菌落的存在)。
优选地，大肠菌为产气大肠菌(更优选地，大肠杆菌(Escherichiacoli))，培养装置包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基(更优选地，培养装置为包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基的平膜培养装置)，粒状浓集剂包括微粒(更优选地，无机微粒)，和/或光学检测包括检测至少一种颜色变化(更优选地，至少一种颜色变化以及邻近大肠菌菌株的至少一个菌落的至少一个气泡的存在)。
所述方法还优选包括离析(优选地，通过重力沉降)结合大肠菌的粒状浓集剂、从样品中分离所得离析的结合大肠菌的粒状浓集剂、鉴定大肠菌菌株、和/或定量或计数大肠菌浓度。光学检测步骤可为人工的或自动的。
已经发现，某些相对低成本的粒状浓集剂可有效浓集大肠菌(包括(例如)相对大体积的样品(例如，100毫升水样品)中的相对低含量的大肠菌)，使得细菌不但保持活性以用于检测或分析，而且令人惊讶地可在存在(并且没有分离或去除)粒状浓集剂的情况下进行光学检测或分析(甚至通过自动光学检测***)。这种粒状浓集剂可用于浓集存在于样品(例如，食品或水样品)中的大肠菌菌株，以使得可更容易和快速地分析大肠菌菌株中的一个或多个。
令人惊讶地是，用于本发明方法中的粒状浓集剂通常不会显著干扰大肠菌代谢(包括酶和/或气体产生)和菌落生长，或干扰检测、鉴定和/或定量大肠菌通常所依据的大肠菌菌落指示物特性(例如，颜色变化和/或气泡)。因此，令人惊讶地是，孵育和检测期间所存在的粒状浓集剂通常不会显著降低大肠菌检测的精确度，包括专门鉴定大肠杆菌(这对于通过食品和/或饮用水品质检测来保持公共健康至关重要，如上所述)所需的更严格检测。
本发明的方法可在水检测中(其中水样品通常包含相对低数量的大肠菌)提供增加的采样效率(例如，相对于0.1mL常规未浓集的平板接种体积，能够使样品体积增加约两个数量级和/或使可检测微生物浓度降低约两个数量级)，并且可通过使用粒状浓集剂避免与使用用于浓集的膜过滤器相关的过滤器堵塞问题。通过能够有效的样品浓集，所述方法可与可仅容纳相对小样品种菌体积(例如，约1毫升)的培养装置相容。
本发明的方法相对简单并且成本低(不需要复杂设备、昂贵的菌株特异性材料或高受训程度的人员)并且可在现场相对快速地实施(优选实施例能够在约22至24小时内检测大肠菌)，而不需要较复杂现有技术的大肠菌检测方法(例如，膜过滤)通常所需的专门配备的实验室装置。另外，所述方法可对多种大肠菌和多种样品(不同样品基质，并且不同于至少一些现有技术的方法，甚至为具有低大肠菌含量和/或大体积的样品)有效。因此，本发明的方法的至少一些实施例可满足上述对于在多种条件下快速检测病原微生物(特别是大肠菌)的低成本、简单方法的迫切需要。
在另一方面，本发明还提供了用于实施本发明方法的诊断(或样品检测)试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)至少一种培养装置，其包括至少一种水合的或可水合的培养基；和
(b)至少一种粒状浓集剂，其在培养基为水合的情况下与培养装置中的培养基相接触时为基本上光学透明的。
具体实施方式
在以下详细说明中，描述了各组数值范围(例如，特定部分中的碳原子数的数值范围、特定组分的量的数值范围等等)，并且在每组数值范围内，范围的任何下限可与范围的任何上限配对。这种数值范围另外旨在包括包含在该范围内的所有数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等)。
如本文所用，术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
术语“优选的”和“优选地”是指本发明的实施例在某些情况下可提供一定的益处。然而，其他实施例在相同或其他情况下也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其它实施例是不可用的，且并非意图将其它实施例排除在本发明范围之外。
当术语“包含”及其变型出现在具体实施方式和权利要求中时不具有限制的意思。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如，疑似包含“一种”靶大肠菌的液体样品可被理解为是指该液体样品可包含“一种或多种”靶大肠菌。
上述“发明内容”部分并非旨在描述本发明的每个实施例或每种实施方式。以下具体实施方式更具体地描述了示例性实施例。在整个具体实施方式中，通过实例的列表提供指导，这些实例可以各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表性的组类，并且不应解释为排他性列表。
定义
本专利申请中使用的：
“大肠菌菌株”是指可通过检测方法区分的特定类型的大肠菌(例如，不同属的大肠菌、属内不同种的大肠菌、或种内不同隔离群的大肠菌)；
“浓集剂”是指结合包括大肠菌在内的微生物的材料或组合物(优选地，微生物捕集或结合效率为至少约60％；更优选地，至少约70％；甚至更优选地，至少约80％；最优选地，至少约90％)；
“培养装置”是指可用于在将允许至少一个细胞发生***的条件下繁殖微生物(包括大肠菌)的装置(优选地，培养装置包括用于降低或最小化偶发污染可能性的壳体和/或支持微生物生长的营养物质源)；
“检测”是指鉴定微生物(例如，靶大肠菌)的至少一种组分，由此确定微生物的存在；
“遗传检测”是指对来自靶大肠菌的遗传物质组分(如DNA或RNA)的鉴定；
“免疫检测”是指对来自靶大肠菌的抗原物质(如蛋白质或蛋白多糖)的鉴定；
“微生物”是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细菌、酵母、病毒和细菌内生孢子)；
“光学检测”是指对通过培养装置或培养基(包含至少一个微生物或微生物菌落)透射的、吸收的、发射的、反射的、折射的、散射的、或者说是转换的(优选地，至少部分透射的)且用作至少一个大肠菌菌株存在的指示物或探针的至少一种波长的光的鉴定(包括下述光学检测方法，例如，人视觉检查、显微成像、发光检测、荧光检测、其他模拟或数字光学成像方法(基于(例如)通过成像装置(例如，照相机、录像设备、或扫描仪)的反射、吸收、透射、和/或亮度(优选地，至少部分透射)测定)等等，以及它们的组合；优选的方法包括人视觉检查、数字光学成像(更优选地，使用扫描仪的数字光学成像)，以及它们的组合)；
“样品”是指所采集的(例如，待分析的)物质或材料；
“样品基质”是指除微生物以外的样品组分；
“基本上光学透明的”(关于粒状浓集剂)是指相对于不存在粒状浓集剂的对应光学检测而言，粒状浓集剂不会将约200nm到约1微米范围的至少一种波长(优选地，约400nm到约700nm范围的至少一种可见波长)的光(“检测波长”)的光学检测衰减或降低超过50％，并因此不妨碍将该波长用作至少一个大肠菌菌株存在的指示物或探针(例如，粒状浓集剂未显著改变或损害大肠菌生长标记(例如(如)菌落形态、颜色或颜色变化、和/或气泡)的观察或成像；优选地，相对于不存在粒状浓集剂的对应光学检测而言，粒状浓集剂将检测波长的光学检测衰减或降低小于或等于约35％(更优选地，小于或等于约25％；甚至更优选地，小于或等于约20％或约15％；还更优选地，小于或等于约10％；最优选地，小于或等于约5％))；并且
“靶大肠菌”是指需要进行检测的任何大肠菌菌株。
样品
本发明的方法可用于疑似包含大肠菌的基本上任何样品。大肠菌为细菌的肠杆菌科的成员，并且包括杆形的、革兰氏阴性的、不形成孢子的微生物。某些大肠菌为在孵育时(例如，在约35-37℃的温度下)能发酵乳糖(以产生酸和二氧化碳气体)的产气微生物。大肠菌可存在于人和动物的肠内(粪便大肠菌)但也可存在于水生环境中、污垢中以及植被上。
本发明的方法可用于检测样品中大肠菌(更优选地，产气大肠菌；最优选地，大肠杆菌，其中约95％为产气的)的存在。大肠菌菌属包括埃希杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏杆菌属(Shigella)和哈夫尼亚菌属(Hafnia)。大肠杆菌(E.coli)可通过其在某些类型的培养基上的生长和显色反应(例如，得自其产生β葡糖苷酸酶的颜色变化，β葡糖苷酸酶可由约97％的大肠杆菌产生)而与大多数其他大肠菌区分开。由于大肠杆菌为几乎唯一的粪便大肠菌，因此其存在可用作样品的粪便污染的间接证据。
可用于实施本发明的方法的合适样品包括(但不限于)医学样品、环境样品、食品样品、饲料样品、临床样品和实验室样品，以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如)来自生物源(例如，人或动物)的细胞、组织或流体。环境样品可为(例如)来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触和非接触区)、实验室或已潜在遭受生物恐怖的区域。食品和/或水加工、处理和制备领域的样品为优选的，因为这些样品在大肠菌和其他细菌性病原体的污染方面通常受到特别关注。
以液体形式或者以固体在液体中的分散体或悬浮液形式获得的样品可直接使用，或可进行浓集(例如，通过离心法)或稀释(例如，通过添加缓冲(控制pH的)溶液)。固体或半固体形式的样品可直接使用或可根据需要通过(例如)用流体介质(例如，消毒水或缓冲溶液)洗涤或冲洗或者悬浮或分散于流体介质中的方法来提取。优选地，固体或半固体样品可进行物理地(例如，匀化)和/或化学地(例如，通过与表面活性剂混合)处理，以有助于其微生物(包括大肠菌)悬浮于流体介质中。
可从表面(例如，通过擦拭或冲洗)获取样品。优选地，样品为流体(例如，液体、气体或者固体或液体在液体或气体中的分散体或悬浮液)。
可用于实施本发明的方法的样品实例包括食品(例如，新鲜产品或即食型午餐或“熟食”肉类)；饮料(例如，汁或碳酸饮料)；水(包括饮用水)；生物学液体、细胞或组织；等等。优选样品包括食品、饮料、水，以及它们的组合(饮料、水以及它们的组合是更优选的；水为甚至更优选的；并且饮用水为最优选的)。可适用于实施本发明的方法的流体样品的非限制性实例包括地表水、人或动物用水、生物药物制剂用水、悬浮于水性溶剂中的食品或乳品、饮料、果汁、工业用水、清洗水、灌溉用水、冷却水、循环水、锅炉水、锅炉补给水、地下水、再生水、经处理的水和废水。
样品体积可根据具体应用而不同。当所述方法用于食品病原体检测分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积可通常为毫升至升的范围(例如，100毫升至3升)。在工业应用中，例如生物工艺或制药配方中，所述体积可为成千上万升。
在本发明的方法中使用粒状浓集剂可从样品中以浓集状态分离出包括大肠菌的微生物，并且另外可允许将包括大肠菌的微生物与可阻碍所使用的检测程序的样品基质组分分离开。可任选地，可通过其他微生物浓集方法来补充粒状浓集剂的使用。例如，如果需要附加的浓集，可在将粒状浓集剂用于实施本发明的方法之前或之后利用或实施离心或基于排除尺寸的过滤(包括膜过滤)。
培养装置
适用于实施本发明的方法的培养装置包括下述那些装置，其包含至少一种可用于允许或促进包括大肠菌的微生物生长或代谢的培养基。培养装置的培养基可包含至少一种营养物质(优选地，至少一种可发酵营养物质)以支持至少一个大肠菌菌株的生长或代谢，以及可任选包含至少一种指示物以有利于菌株的检测。优选地，培养装置为平膜培养装置(例如，包括至少一个自支承基膜或基底和至少一个盖膜或片材)。
可支持多种微生物生长的营养物质的非限制性实例包括蛋白胨类、酵母提取物、葡萄糖等等，以及它们的组合。用于生长和/或鉴定包括大肠菌在内的某些微生物或微生物群所需要或期望的具体营养物质或营养物质组合为本领域中已知的(例如，紫红胆盐琼脂(VRBA)可用于大肠菌生长)。
如果需要，培养装置的培养基还可包含至少一种选择剂(例如，盐、表面活性剂或抗生素)，以便相对可存在于样品中的非靶微生物来提供有利于靶大肠菌生长和/或检测的环境。培养基还可包含胶凝剂。合适的胶凝剂包括可溶于冷水的天然和合成的胶凝剂。此类胶凝剂的非限制性实例包括瓜耳胶、黄原胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、褐藻胶等等，以及它们的组合。
可将培养基置于基本上任何合适的容器或壳体(例如，培养皿、烧杯或烧瓶)内以降低或最小化偶发污染的可能性。优选地，可在将结合大肠菌的粒状浓集剂设置为与培养基相接触之前对培养基和容器或壳体进行灭菌。
可用于实施本发明的方法的合适培养装置包括含有形式为预成形水凝胶基质(例如，琼脂、琼脂糖、或果胶酸钙)的培养基的那些培养装置；干燥、可再水合、平膜培养装置(例如，描述于美国专利号4,476,226(Hansen等人)；5,089,413(Nelson等人)；5,232,838(Nelson等人)；6,331,429(Ushiyama)；和6,638,755(Mizuochi等人)中的那些；上述专利的描述以引用方式并入本文中)；具有与水性混合物流体连通的多孔支承体的培养装置；等等，以及它们的组合。
可用的多孔支承体可具有多种物理形式(例如，织造织物、非织造物、凝胶、泡沫、网孔、稀松布、釉料、微复制型膜等等)中的任何一种。可用的多孔支承体可由亲水材料(例如，滤纸或玻璃纤维滤器)构造。或者，多孔支承体可由经处理以赋予材料亲水性的疏水材料或固有地能够通过(例如)毛细管作用运输水性溶剂或溶液的疏水材料构造。优选地，多孔支承体将不包含可通过水性溶剂运输并且妨碍检测靶大肠菌的材料。
用于实施本发明的方法的优选培养装置包括干燥、可再水合、平膜培养装置以及它们的组合。3MTMPetrifilmTM大肠菌计数平板和3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板(得自3M公司(St.Paul,MN))为优选的干燥、可再水合、平膜培养装置(后者为更优选的)。这些平板为可用于繁殖、检测和/或计数大肠菌的样品即用型培养装置。另外，后一种平板包含有利于在简单的一步检测、鉴定和计数方法中来鉴定大肠杆菌的指示物(通过检测至少一种颜色变化和邻近至少一个大肠菌菌落的至少一个气泡的存在)。本发明的方法通过其使用粒状浓集剂而尤其可用于将稀释的、相对大体积(例如，100毫升水)样品中的微生物浓集成最终的1毫升体积，从而可使用标准吸液技术直接转移至平板。
浓集剂
概述
适用于实施本发明的方法的浓集剂包括可结合包括大肠菌在内的微生物并且为基本上光学透明的(如上文定义)那些颗粒材料或组合物。如果需要，粒状浓集剂可通过其在下述特定光学检测方法中的光学透明性水平进行预筛检，所述特定光学检测方法为测定用于探测包含粒状浓集剂和水合培养基的样品的选定波长的光的光学检测程度(相对于同一波长在用于探测包含水合培养基而不含粒状浓集剂的相应对照样品时的光学检测程度)。
根据(例如)待使用粒状浓集剂的量和/或其平均粒度，优选的是选择不会显著吸收选定波长的光和/或折射率相对接近地匹配于水合培养基的折射率的浓集剂。例如，这二者的折射率差可选择为小于约0.2(优选地，小于约0.1；更优选地，小于约0.05；甚至更优选地，小于约0.02；最优选地，小于约0.01)。优选地(尤其是在用于涉及相对大样品体积和/或相对低大肠菌浓度的水品质检测中)，相对于不含浓集剂的相应对照样品，粒状浓集剂可捕集或结合存在于样品中的包括大肠菌在内的微生物的至少约60％(更优选地，至少约70％；甚至更优选地，至少约80％；最优选地，至少约90％)。
合适的粒状浓集剂包括粒状无机材料(例如，金属氧化物、金属硅酸盐、二氧化硅、金属碳酸盐、金属磷酸盐、硅藻土、表面改性的硅藻土等等，以及它们的组合)；具有官能团的粒子(例如，胺-官能化玻璃微珠)；具有生物分子、生物分子片段和/或生物分子衍生物的粒子(例如，具有表面结合抗体、蛋白质或维生素的微珠)；具有无机材料涂层的粒子；等等；以及它们的组合。如果需要，粒子可包括具有表面涂层或表面结合基团(例如，无机表面涂层或表面结合生物分子)的磁芯，前提条件是这种粒子可以足够小的量存在使得可保持基本光学透明性(如上文所述)。
粒状无机材料、具有官能团的粒子(优选地，官能化玻璃微珠；更优选地，胺-官能化玻璃微珠)以及它们的组合是优选的，其中粒状无机材料是更优选的。优选的粒状无机材料包括选自如下的那些：金属硅酸盐(例如，硅酸镁)；二氧化硅；金属碳酸盐(例如，碳酸钙)；金属磷酸盐(例如，羟基磷灰石)；金属氧化物、金或铂改性的硅藻土；以及它们的组合。金属碳酸盐(优选地，碳酸钙)；二氧化钛、金或铂改性的硅藻土(优选地，二氧化钛改性的硅藻土)；二氧化硅；金属磷酸盐(优选地，羟基磷灰石)；无定形金属硅酸盐(优选地，无定形的球化硅酸镁)；以及它们的组合是更优选的。无定形的球化硅酸镁为最优选的。
优选地是，粒状浓集剂包括微粒。微粒的优选粒度范围为约1微米(更优选地，约2微米；甚至更优选地，约3微米；最优选地，约4微米)至约100微米(更优选地，约50微米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约20微米)；其中任何下限可与范围中的任何上限配对。
使用上述浓集剂进行的浓集或捕集通常不特异性针对任何特定菌株、种或类型的微生物，并因此提供对样品中微生物全体群落的浓集。然后，可使用任何已知的光学检测方法用菌株特异性探针从捕集的微生物群落中检测特定的微生物菌株。
当分散或悬浮于水体系中时，无机材料显示具有表征材料和水体系pH的表面电荷。整个材料-水界面上的电位称为“ζ电位”，其可由电泳迁移率(即，由材料颗粒在设置于水体系中的带电电极之间的移动速率)进行计算。优选地，浓集剂在约7的pH下具有负ζ电位。
金属硅酸盐
适用于实施本发明方法的金属硅酸盐浓集剂包括金属的无定形硅酸盐，金属例如为镁、钙、锌、铝、铁、钛等等(优选地，镁、锌、铁、和钛；更优选地，镁)，以及它们的组合。优选为至少部分熔融颗粒形式的无定形金属硅酸盐(更优选地，无定形、球化金属硅酸盐；最优选地，无定形的球化硅酸镁)。金属硅酸盐为已知的并且可通过已知方法进行化学合成，或者通过开采和加工天然存在的原矿获得。
无定形、至少部分熔融颗粒形式的金属硅酸盐可通过下述已知方法中的任何一种来制备，所述已知方法为在可控条件下熔融或软化相对小的进料粒子(例如，平均粒度至多为约25微米)以制备大致椭圆形或球形粒子(即，具有通常为大致圆形且不含尖角或尖锐边缘的放大二维图像的粒子，包括真正或基本上圆形和椭圆形的形状以及任何其他的圆形或弯曲形状)。这种方法包括原子化、火抛光、直接熔融等等。优选方法为火焰熔融，其中通过直接熔融或火抛光固体进料粒子形成至少部分熔融的、基本上玻璃状的粒子(例如，如同描述于美国专利号6,045,913(Castle)的方法，其说明书以引用方式并入本文中)。最优选地，这种方法可通过将无规则形状进料粒子的相当大一部分(例如，约15至约99体积％；优选地，约50至约99体积％；更优选地，约75至约99体积％；最优选地，约90至约99体积％)转换成大致椭圆形或球形的粒子而用于制备无定形、球化金属硅酸盐。
一些无定形金属硅酸盐为市售的。例如，无定形的球化硅酸镁可商购获得以用于化妆品制剂(例如，以3MTMCosmeticMicrospheresCM-111得自3M公司(St.Paul,MN))。
无定形金属硅酸盐浓集剂还可包括其他材料(包括金属(例如，铁或钛)的氧化物、结晶金属硅酸盐、其他结晶材料等等)。然而，浓集剂优选基本上不含结晶二氧化硅。
适用于实施本发明的方法的尤其优选的浓集剂包括含有无定形金属硅酸盐并且具有下述表面组成的那些浓集剂，所述表面组成具有的金属原子与硅原子的比率小于或等于约0.5(优选地，小于或等于约0.4；更优选地，小于或等于约0.3；最优选地，小于或等于约0.2)，如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定。这种浓集剂包括描述于美国临时专利申请号60/977,180(3MInnovativeProperties公司)中的那些，其中浓集剂及其制备方法的描述以引用方式并入本文中。
优选地，尤其优选的浓集剂的表面组成还包括至少平均约10原子％的碳(更优选地，至少平均约12原子％的碳；最优选地，至少平均约14原子％的碳)，如通过X射线光电子能谱(XPS)所测定。XPS为可测定样品表面的最外侧约3至10纳米(nm)的元素组成并且对周期表中除氢和氦之外的所有元素均敏感的技术。XPS为对于大多数原子而言检测极限位于0.1原子％至1原子％浓度范围的定量技术。XPS的优选表面组成评价条件可包括相对于接受立体角为±10度的样品表面测得的90度的飞离角。
这种优选的金属硅酸盐浓集剂与(例如)普通金属硅酸盐(例如普通滑石)相比可具有带更高负电的ζ电位。另外令人惊讶地是，这种浓集剂比滑石可更有效地浓集诸如细菌之类的微生物(其表面通常往往带负电)。优选的是，这种浓集剂在约7的pH下具有负ζ电位(更优选地，在约7的pH下具有约-9毫伏至约-25毫伏范围的Smoluchowskiζ电位；甚至更优选地，在约7的pH下具有约-10毫伏至约-20毫伏范围的Smoluchowskiζ电位；最优选地，在约7的pH下具有约-11毫伏至约-15毫伏范围的Smoluchowskiζ电位)。
表面改性的硅藻土
适用于实施本发明方法的表面改性的硅藻土浓集剂包括下述浓集剂，所述浓集剂包括其表面至少一部分上具有表面处理物的硅藻土，所述表面处理物包含表面改性剂，所述表面改性剂包括金属氧化物(优选地，二氧化钛；然而可使用其他金属氧化物(单独或结合使用)，前提条件是这种金属氧化物可以足够小的量存在使得可保持基本光学透明性(如上文所述))、细纳米级金或铂，或者它们的组合。这种浓集剂包括描述于美国临时专利申请号60/977,200(3MInnovativeProperties公司)中的那些，其中所述浓集剂及其制备方法的描述以引用方式并入本文中。表面处理物还优选包括选自氧化铁、氧化锌、氧化铝等等，以及它们的组合(更优选地，氧化铁)的金属氧化物。尽管已知诸如金之类的贵金属具有抗微生物特性，但令人惊讶的是，用于本发明的方法中的含金浓集剂不仅可有效用于浓集微生物而且还可使得它们具有活性以便进行检测或分析。
可用的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级铂；细纳米级金与至少一种金属氧化物(优选地，二氧化钛、氧化铁，或它们的组合)的组合；二氧化钛；二氧化钛与至少一种其他(即，除二氧化钛之外)金属氧化物的组合；等等；以及它们的组合。优选的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级铂；细纳米级金与至少氧化铁或二氧化钛的组合；二氧化钛；二氧化钛与至少氧化铁的组合；以及它们的组合。
更优选的表面改性剂包括细纳米级金；细纳米级铂；细纳米级金与氧化铁或二氧化钛的组合；二氧化钛；二氧化钛与氧化铁的组合；以及它们的组合(甚至更优选地，细纳米级金；细纳米级金与氧化铁或二氧化钛的组合；二氧化钛与氧化铁的组合；二氧化钛；以及它们的组合)。细纳米级金、细纳米级金与氧化铁或二氧化钛的组合、二氧化钛，以及它们的组合是更优选的，其中二氧化钛为最优选的。
表面改性的硅藻土浓集剂中的至少一些与未经处理的硅藻土相比具有带至少稍高正电的ζ电位，并且浓集剂可令人惊讶地比未经处理的硅藻土能显著更有效地浓集诸如细菌之类的微生物(其表面通常往往带负电)。优选的是，这种浓集剂在约7的pH下具有负ζ电位(更优选地，在约7的pH下具有约-5毫伏至约-20毫伏范围的ζ电位；甚至更优选地，在约7的pH下具有约-8毫伏至约-19毫伏范围的ζ电位；最优选地，在约7的pH下具有约-10毫伏至约-18毫伏范围的ζ电位)。
包含细纳米级金或铂的表面改性的硅藻土浓集剂可通过这样制备：通过物理气相沉积(任选地，通过氧化气氛中的物理气相沉积)将金或铂沉积在硅藻土上。如本文所用，术语“细纳米级金或铂”是指所有维度上的尺寸均小于或等于5纳米(nm)的金或铂团粒(例如，粒子或原子簇)。优选地，所沉积的金或铂的至少一部分在所有维度(例如，粒径或原子簇直径)上的平均尺寸范围为至多(小于或等于)约10nm(更优选地，至多约5nm；甚至更优选地，至多约3nm)。
在最优选的实施例中，至少一部分金是超纳米级的(即，至少两个维度上的尺寸小于0.5nm，并且所有维度上的尺寸小于1.5nm)。可通过透射电子显微镜(TEM)分析法来测定单个金或铂纳米粒子的尺寸，这是本领域中熟知的。
硅藻土(或硅藻土粉)为由硅藻(一种海洋栖居微生物)残余物产生的天然硅土材料。因此，其可得自天然来源并且也为市售的(例如，得自AlfaAesar,AJohnsonMattheyCompany,WardHill,MA)。硅藻土粒子通常包括小的、开放的二氧化硅网络(形式为对称立方体、圆柱体、球体、板、矩形盒等等)。这些粒子的孔结构通常可为显著均一的。
硅藻土可以原始开采材料或以纯化和任选碾磨的粒子进行使用。优选地，硅藻土为具有直径尺寸范围为约1微米至约50微米(更优选地，约3微米至约10微米)的碾磨粒子形式。
可任选将硅藻土在使用之前进行热处理以去除有机残余物的任何残迹。如果使用热处理，则优选热处理为500℃或更低，因为较高温度可产生不利地高含量的结晶二氧化硅。
提供于硅藻土上的金或铂的量可在宽范围上变化。由于金和铂为昂贵的，因此期望使用不超过实现所需浓集活性程度而所需要的合理量。另外，因为纳米级金或铂在使用PVD沉积时可具有高度移动性，如果使用过多的金或铂，则活性可因金或铂中的至少一些聚集成较大团粒而损失。
由于这些原因，按硅藻土和金或铂的总重量计，硅藻土上的金或铂的负载重量范围优选为约0.005(更优选地，0.05)至约10重量％、更优选为约0.005(甚至更优选地，0.05)至约5重量％、并且甚至更优选为约0.005(最优选地，0.05)至约2.5重量％。
可以通过PVD技术(例如，通过溅射)沉积金和铂，从而在载体表面上形成浓集活性物质的细纳米级粒子或原子簇。据信，金属主要以元素形式沉积，但也可存在其它氧化态。
除了金和/或铂之外，还可在同一硅藻土载体和/或与含金和/或铂载体混合的其他载体上提供一种或多种其他金属。这种其它金属的例子包括银、钯、铑、钌、锇、铜、铱等等，以及它们的组合。如果使用这些其它金属，则可由与所使用的金或铂源靶相同或不同的靶源将它们共沉积到载体上。或者，可在沉积金和/或铂之前或之后将这些金属提供于载体上。可在沉积金和/或铂之前有利地将需热处理活化的金属施加到载体上并进行热处理。
物理气相沉积是指金属从含金属的源或靶向载体介质的物理转移。可以各种不同的方式实施物理气相沉积。代表性的方法包括溅射沉积(优选的)、蒸镀和阴极电弧沉积。可使用这些或其他PVD方法中的任何一种来制备用于实施本发明的方法的浓集剂，但PVD技术的特性可赋予所得活性。可通过利用目前使用的或者将来为此目的开发的任何类型的设备来实施PVD。
为了确保载体表面受到足够的处理，优选在充分混合(例如，翻滚、流化、碾磨等)待处理的载体介质的同时进行物理气相沉积。美国专利No.4,618,525(Chamberlain等人)中描述了用于PVD沉积的翻滚粒子的方法，其说明书以引用方式并入本文中。当在细粒子或细粒子聚集体(例如，平均直径小于约10微米)上实施PVD时，优选在至少一部分PVD过程期间对载体介质即进行混合又进行粉碎(例如，研磨或碾磨到一定程度)。
可以在宽范围内的基本上任意所需的温度条件下实施物理气相沉积。然而，如果在相对较低的温度下沉积金属(例如，温度低于约150℃、优选低于约50℃、更优选在环境温度(例如，约20℃至约27℃)或更低)，则沉积的金属可具有更大的活性(也许是因为缺陷更多和/或移动性及聚结程度更低)。基于有效性和经济性的考虑，环境条件下的操作通常可以是优选的，因为在沉积过程中不需要进行加热或冷冻。
可在惰性溅射气体气氛中(例如，在氩、氦、氙、氡或者它们中的两者或更多者的混合物(优选地，氩)中)实施物理气相沉积，并且可任选在氧化气氛中实施物理气相沉积。优选地，氧化气氛包含至少一种含氧气体(更优选地，含氧气体选自氧、水、过氧化氢、臭氧，以及它们的组合；甚至更优选地，含氧气体选自氧、水，以及它们的组合；最优选地，氧)。氧化气氛中还包含惰性溅射气体，如氩、氦、氙、氡或者它们中的两种或更多种的混合物(优选为氩)。在PVD过程期间，真空室中的(所有气体的)总气压可以为约1毫托至约25毫托(优选为约5毫托至约15毫托)。按真空室中的所有气体的总重量计，氧化气氛可包含约0.05重量％至约60重量％的含氧气体(优选地，约0.1重量％至约50重量％；更优选地，约0.5重量％至约25重量％)。
可任选将硅藻土载体介质在金属沉积之前进行煅烧，但这会增加其结晶二氧化硅含量。由于金和铂在通过PVD沉积时立即具有活性，因此通常不需要在金属沉积之后进行热处理，这与通过一些其他方法的沉积不同。然而如果需要，也可实施这种热处理或煅烧以提高活性。
一般来讲，热处理可涉及在约125℃至约1000℃范围的温度下对载体加热约1秒至约40小时、优选为约1分钟至约6小时的时间段，加热可以在任何合适的气氛中进行，例如空气、惰性气氛(例如氮、二氧化碳、氩)、还原性气氛(例如氢)等等。采用的具体热条件可取决于包括载体性质在内的各种因素。
一般来讲，热处理可以在低于使载体组分发生分解、降解、或者说是不当地受到热损害的温度下实施。根据诸如载体性质、金属量等等之类的因素，如果在过高的温度下对***进行热处理，则活性可能会在一定的程度上受到损害。
包含金属氧化物的表面改性的硅藻土浓集剂可通过这样制备：通过水解可水解金属氧化物前体化合物将金属氧化物沉积于硅藻土上。合适的金属氧化物前体化合物包括可被水解以形成金属氧化物的金属络合物和金属盐。可用的金属络合物包括下述络合物，其具有醇盐配体、过氧化氢配体、羧酸盐官能化配体等等，以及它们的组合。可用的金属盐包括金属硫酸盐、硝酸盐、卤化物、碳酸盐、草酸盐、氢氧化物等等，以及它们的组合。
使用金属盐或者过氧化氢或羧酸盐官能化配体的金属络合物时，可通过化学或热方法来诱导水解。在化学诱导水解中，可将金属盐以溶液形式引入硅藻土的分散体中，并且通过加入碱溶液来增加所得组合的pH直至金属盐作为金属的氢氧化物络合物沉淀于硅藻土上。合适的碱包括碱金属和碱土金属的氢氧化物和碳酸盐、铵和烷基铵的氢氧化物和碳酸盐等等，以及它们的组合。金属盐溶液和碱溶液的浓度通常可为约0.1至约2M。
优选地，在搅拌(优选地，快速搅拌)硅藻土分散体的情况下实施将金属盐加入至硅藻土中。可将金属盐溶液和碱溶液单独(以任一顺序)或同时引入到硅藻土分散体中，以便使所得金属氢氧化物络合物与硅藻土的表面进行优选基本上均一的反应。在反应期间可任选加热反应混合物以加快反应速度。一般来讲，所添加的碱量可等于金属的摩尔数乘以金属盐或金属络合物上的非氧或非羟基抗衡离子数。
或者，当使用钛或铁的盐时，可热诱导金属盐水解以形成金属的氢氧化物络合物并且与硅藻土的表面相互作用。在这种情况下，通常可将金属盐溶液加入到下述硅藻土分散体(优选地，搅拌分散体)中，所述硅藻土分散体已加热至足够高的温度(例如，大于50℃)以便促进金属盐的水解。优选的是，温度为约75℃至100℃，但如果在高压釜设备中进行反应，则可使用较高的温度。
当使用金属醇盐络合物时，可诱导金属络合物水解以通过金属醇盐在醇溶液中的部分水解来形成金属的氢氧化物络合物。金属醇盐溶液在存在硅藻土的情况下的水解可产生沉积于硅藻土表面上的金属氢氧化物物质。
或者，可通过在存在硅藻土的情况下使金属醇盐在气相中与水反应，从而将金属醇盐水解并沉积到硅藻土表面上。在这种情况下，可在(例如)流化床反应器或转筒式反应器中于沉积期间搅动硅藻土。
金属氧化物前体化合物在存在硅藻土的情况下进行上述水解之后，可通过沉淀或通过过滤或通过其他已知的技术来分离所得的经表面处理的硅藻土。可将分离产物通过用水洗涤来纯化并随后进行干燥(例如，在50℃至150℃)。
虽然通常使经表面处理的硅藻土在干燥之后进行官能化，但可任选在通常不损失官能性的情况下通过在空气中加热至约250℃至650℃进行煅烧来去除挥发性副产物。当将金属醇盐用作金属氧化物前体化合物时，优选进行该煅烧步骤。
一般来讲，利用铁的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括氧化铁纳米颗粒。当氧化铁与硅藻土的重量比为约0.08时，X射线衍射(XRD)不会显示明确的氧化铁材料的存在。相反，在3.80、3.68和下观察额外的X射线反射。该材料的TEM检查显示出硅藻土表面相对均匀地涂布有球形纳米颗粒状氧化铁材料。氧化铁材料的微晶尺寸小于约20nm，且大部分微晶的直径小于约10nm。这些球形微晶在硅藻土表面上的堆积在外观上为致密的，并且硅藻土表面由于这些微晶的存在而似乎为粗糙的。
一般来讲，利用钛的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括纳米颗粒二氧化钛。当将二氧化钛沉积至硅藻土上时，所得产物在煅烧至约350℃之后的XRD可显示出存在锐钛型二氧化钛的小微晶。利用相对较低的钛/硅藻土比率时或者在其中使用钛和铁氧化物前体的混合物的情况下，通过X射线分析通常观察不到锐钛的迹象。
由于二氧化钛为熟知的强效光氧化催化剂，因此本发明中的经二氧化钛改性的硅藻土浓集剂可用于浓集微生物以进行分析，并且随后还可任选用作光活化剂以杀灭残余微生物和去除使用之后的非所需有机杂质。因此，经二氧化钛改性的硅藻土可分离待分析的生物材料并随后进行光化学清洁以便再用。另外可将这些材料用于其中期望进行微生物去除以及抗微生物效果的过滤应用中。
接触
可通过多种已知的或将来开发的提供两种材料之间接触的方法中的任何一种来实施本发明的方法中的样品接触步骤。例如，可将粒状浓集剂添加至样品，或者可将样品添加至粒状浓集剂。可将具有粒状浓集剂的浸渍片浸于样品溶液中、可将样品溶液倾注到具有粒状浓集剂的膜上、可将样品溶液倾注到具有粒状浓集剂的导管或凹槽中、或者可使样品溶液穿过具有粒状浓集剂的过滤器(例如，织造或非织造材料过滤器或膜过滤器)。
然而，优选的是，在多种容器中的任何一种(任选地但也优选地，带盖的、闭合的或密封的容器；更优选地，带盖的试管、瓶子或广口瓶)中合并(使用任何添加顺序)粒状浓集剂和样品。用于实施本发明的方法的合适容器将由具体样品决定，并且可在尺寸和性质上大不相同。例如，容器可为小容器(例如，10毫升容器(例如，试管))或较大的容器(例如，100毫升至3升的容器(例如，锥形瓶或聚丙烯大口径瓶))。可将直接接触样品的容器、粒状浓集剂以及任何其他装置或添加剂在使用前进行灭菌(例如，通过受控热、环氧乙烷气体或辐射来进行)，以便减少或防止任何可导致检测误差的样品污染。足以捕集或浓集特定样品中的微生物(包括大肠菌)以便成功检测的粒状浓集剂的量将有所不同(取决于(例如)粒状浓集剂的特性、光学透明程度和捕集效率，以及样品体积)，并且可易于由本领域技术人员确定。例如，对于一些应用可使用约100毫克浓集剂/100毫升样品。粒状浓集剂的优选存在量足以提供至少约60％的捕集效率同时仍保持基本光学透明性。
如果需要，可通过将粒状浓集剂至少通过样品一次来实现接触(例如，通过依赖重力沉降(例如)约10分钟的一段时间)。可通过混合(例如，通过搅拌、摇动或使用振动台)使得浓集剂颗粒反复经过或沉降穿过样品的大部分，来增强接触。对于微升级的小体积(通常，小于0.5毫升)来说，诸如通过涡旋或“章动”，混合可以是快速的，例如，如美国专利号5,238,812(Coulter等人)所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。对于大于或等于0.5毫升(通常0.5毫升至3升)的较大体积来说，可通过以“翻跟头”的方式轻轻翻转粒状浓集剂和样品来实现混合，例如，如美国专利号5,576,185(Coulter等人)所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。可借助于例如被设置成固定试管或其他类型反应容器并以“翻跟头”方式缓慢旋转该试管或容器的装置来实现所述翻转。可在所需时间段内实施接触(例如，对于约100毫升或更少的样品体积，可用的接触时间为至多约60分钟；优选地，约15秒至约10分钟或更长；更优选地，约15秒至约5分钟)。
因此，在实施本发明的方法中，合并的样品和粒状浓集剂的混合(例如，搅动、摇动或搅拌)和/或预孵育(例如，在环境温度下)(例如，在将结合大肠菌的粒状浓集剂设置在培养装置中之前)为任选但也优选的，以便增加与粒状浓集剂的微生物接触。优选的接触方法包括将含微生物的样品(优选地，流体)与粒状浓集剂进行混合(例如，持续约15秒至约5分钟)和预孵育(例如，持续约3分钟至约60分钟)。如果需要，可在粒状浓集剂与样品的组合中包含一种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光分析试剂、核酸捕集试剂(例如，磁珠)、微生物生长培养基、缓冲液(例如，用于润湿固体样品；包括(例如)使用吸附缓冲液)、微生物着色试剂、洗涤缓冲液(例如，用于洗掉未结合的材料)、洗脱试剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，得自UnionCarbideChemicalsandPlastics(Houston,TX)的TritonTMX-100非离子型表面活性剂)、机械研磨/洗脱剂(例如，玻璃微珠)、光学检测分析组分(例如，指示剂或染料)等等)。
如果需要，可将粒状浓集剂(单独地或者与例如载体材料组合，形式为液体(例如，水或油)、固体(例如，织物、聚合物、纸张或无机固体)、凝胶、乳剂、泡沫或糊剂)施用或擦拭至非多孔或多孔的、固体的、经微生物污染的、或微生物可污染的材料或表面上(例如，作为样品采集的方法)。由此可在单个步骤中同时采集样品并且使其与粒状浓集剂接触。
离析和/或分离
可任选但优选地，本发明的方法还包括离析从样品接触步骤中产生的结合大肠菌的粒状浓集剂。优选可通过至少部分依赖于重力沉降(重力沉淀，例如，经约5分钟至约30分钟的时间段)实现这种离析。然而，在一些情况下，可取的是加快离析(例如，通过离心或过滤)，或者采用任何所述离析方法的组合。
本发明的方法还可任选但优选地包括将所得的结合大肠菌的粒状浓集剂与样品分离。对于流体样品，这可涉及去除或分离因离析产生的上清液。可通过本领域中熟知的多种方法来实施上清液的分离(例如，通过滗析或虹吸，以便将结合大肠菌的粒状浓集剂留在用于实施本方法的容器或管的底部)。
本发明的方法可人工实施(例如，以批次方式)或可为自动的(例如，以便能够进行连续或半连续处理)。
孵育
本发明的方法中的最初孵育步骤可通过将所得的结合大肠菌的粒状浓集剂设置为与培养装置的培养基相接触来启动，其中培养基在后续孵育期间为水合形式。这种接触可在存在或不存在样品的情况下(优选在不存在样品的情况下)进行，这取决于任选离析和/或分离步骤是否已经实施。然后可将培养装置(包含接触水合培养基的结合大肠菌的粒状浓集剂)在足以使至少一个细胞发生***的时间段和温度下孵育。
例如，可使用约12小时、15小时或18小时至约48小时(优选地，至少约18小时至约22小时)的孵育时间段和范围为约35℃至约37℃的孵育温度。可在培养基与结合大肠菌的粒状浓集剂开始接触之前或之后(例如，紧随其后或之后几分钟或几小时内)(或与此同时)进行培养基的水合(例如，通过添加水或水性稀释组合物，其可任选包含样品和/或结合大肠菌的粒状浓集剂)。培养基优选在孵育时间段期间保持基本上水合的(和/或优选基本上保持接触)。可任选地，可将结合大肠菌的粒状浓集剂与水合或可水合培养基进行混合(例如，以便形成结合大肠菌的粒状浓集剂与水合培养基的更均匀混合物)。
检测
已由粒状浓集剂捕集或结合(例如，通过吸附)的大肠菌可通过基本上任何目前已知或将来开发的所需光学检测方法来检测。这类方法包括(例如)人视觉检查、发光检测、荧光检测、显微镜法(例如，使用透射光显微镜或落射荧光显微镜，其可用于观察利用荧光染料标记的微生物)、其他模拟或数字光学成像方法(基于(例如)通过成像装置(例如，照相机、录像设备或扫描仪)的反射、吸收、透射和/或亮度测定)等等，以及它们的组合。优选的方法包括人视觉检查、数字光学成像(更优选地，使用扫描仪的数字光学成像)，以及它们的组合。
可在不将大肠菌菌株与粒状浓集剂分离的情况下实施所存在的大肠菌菌株的这类光学检测(利用一个或多个检测波长，在所述检测波长下粒状浓集剂显示具有足够的光学透明性(称为“基本上光学透明的”)，如上文所定义)。因此，可在培养装置进行孵育之后，在培养装置中进行分析(即，就地分析)。
如果需要，可给光学检测增添多种已知或将来开发的技术中(例如，免疫检测方法和遗传检测方法)的任意一种，或者将光学检测加入到多种已知或将来开发的技术中(例如，免疫检测方法和遗传检测方法)的任意一种中。大肠菌捕集之后的检测方法可任选包括去除样品基质组分的洗涤、染色等等。
光学检测可人工实施(例如，通过人视觉检查)或可为自动的。用于检测和/或计数(清点或定量)培养装置中的微生物菌落的自动光学检测***为本领域中已知的。此类自动***通常包括：成像***、确定菌落计数的图像分析算法以及显示和任选储存及操作菌落计数数据和图像的数据管理***。用于计数琼脂平板上的菌落的示例性***以商品名ProtocolTM购自Synbiosis(Cambridge,UK)并且描述于美国专利号6,002,789(Olsztyn等人)中，所述***的说明以引用方式并入本文中。用于计数3MTMPetrifilmTM计数平板(得自3M公司(St.Paul,MN))上的菌落的***描述于美国专利号5,403,722(Floeder等人)；7,298,885(Green等人)；和7,298,886(Plumb等人)中；所述***的说明以引用方式并入本文中。
通常，用于计数微生物菌落的自动光学检测***是通过菌落或来自菌落的代谢产物吸收、反射、发射、透射、折射或散射光的能力来检测靶微生物的存在。因此，可通过诸如(例如)色度测定法、荧光测定法或发光测定法(例如，化学发光或生物发光)之类的方法来光学检测菌落。
在用于大肠菌的至少一些测试中，大肠菌菌落可通过存在于包含乳糖的培养基中的pH指示剂的颜色变化进行检测并且试验性地鉴定为大肠菌。颜色变化可反映出培养基的pH变换，这可指示菌落由乳糖产生了酸性产物。因此，当观察到这种颜色变化时，可推测菌落为大肠菌菌落。
可在下述测试中确认所推测的大肠菌菌落为大肠菌，即当在菌落附近观察到一个或多个气泡时。一些大肠菌(包括95％的大肠杆菌)可由乳糖产生气体(即，二氧化碳)。可通过目测方法或自动***(如美国专利号7,298,886(Plumb等人)中所述的自动菌落计数***)光学地观察这种气泡。
3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板和3MTMPetrifilmTM大肠菌计数平板(得自3M公司(St.Paul,MN))为在水合和封闭时包含半固体、含乳糖的培养基的培养装置，所述培养基在其一侧连续接触自支承膜或基底并且在其另一侧连续接触覆盖膜或片材。这种平膜培养装置尤其适用于捕集由发酵乳糖的大肠菌微生物产生的气泡。
某些培养装置提供了用于确切鉴定存在于培养装置中的特定大肠菌菌株的手段，例如选择试剂和/或差异性试剂。例如，3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板包含葡糖苷酸酶活性指示剂，其能够鉴定为大肠杆菌的大肠菌菌落(例如，当观察到蓝色沉淀形成时)。然而，其他培养装置可仅提供临时鉴定。当进行这种临时鉴定时，有时希望通过进行额外的测试以对大肠菌的种类进行确认。因此，如果需要，本发明的方法可包括一种或多种额外的确认性测试。
当培养装置已进行孵育并且至少一种大肠菌菌株的存在已得到光学检测(例如，目测或通过自动检测***)之后，可将捕集的微生物从培养装置中取出以用于进一步的确认分析，或者在某些遗传或免疫测试情况下在培养装置中进行确认分析(即，就地确认分析)。进一步的确认分析可包括化学分析(例如，色谱法、光谱法或光谱测定法)、遗传分析(例如，杂交或核酸扩增)和/或免疫分析(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫色谱法、凝集反应或放射免疫测定法)。
可使用培养装置中的整个样品，通过(例如)从粒状浓集剂和培养基中移出或提取微生物或其组分来进行确认分析方法。或者，可分离和/或提取培养装置的较小区域或单独的菌落来进行确认分析方法。在一些方法中，可使用硝化纤维或尼龙膜来“提起”微生物或其组分，随后进行遗传、生物化学或免疫测试。具体的确认分析方法可见于“MolecularCloning,ALaboratoryManual”(分子克隆实验指南)，第3版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)，所述方法的说明以引用方式并入本文中。
诊断试剂盒
可将培养装置和粒状浓集剂与包装材料组合并以用于检测存在于样品中的大肠菌的诊断(或样品检测)试剂盒出售。用于实施本发明的方法的这种试剂盒包括：
(a)至少一个培养装置，其包括至少一种水合或可水合的培养基；和
(b)至少一种粒状浓集剂，其在与培养装置中的培养基(当培养基为水合的时)相接触时为基本上光学透明的。
优选地，试剂盒的培养装置包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基(更优选地，培养装置为包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基的平膜培养装置)，和/或粒状浓集剂包括微粒(更优选的是，无机微粒)。诊断试剂盒还优选包括一个或多个选自如下的组件：检测容器(更优选地，无菌检测容器)、裂解试剂、缓冲液、光学检测分析组分(例如，一种或多种指示剂染料)、使用实施本发明方法的粒状浓集剂和/或培养装置的说明书、自动检测***(例如，手持式检测装置或阅读器)，以及它们的组合。
粒状浓集剂可任选在含有防腐剂的小体积缓冲液中水合以提高储存和运输期间的稳定性，和/或可装在/等分分配在撕开式密封袋中以防止污染。浓集剂可为液体中的分散体或悬浮液形式，或者可为粉末形式。优选地，诊断试剂盒包括预量出的等份的(例如，基于样品体积)粒状浓集剂(更优选地，装在一个或多个撕开式密封袋内)。
试剂盒还可包括采样和/或检测配件，例如样品悬浮介质(例如，水、缓冲液或生长培养基)、试剂(例如，染料、指示剂、酶、酶底物、裂解试剂或促进洗脱的试剂)、采样装置(其可任选包括粒状浓集剂和/或缓冲液)、吸管、标签、镊子、样品载体和/或手套。如果需要，试剂盒中的各个组件可为灭菌的和/或可处于单独包裹的原始包装中。
实例
下面的实例进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。除非另外指明，否则下述实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。所有微生物培养物均购自美国模式培养物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)。除非另外指明，否则溶剂和其他试剂均来自Sigma-AldrichChemical公司(Milwaukee,WI)。
表面改性的硅藻土粒状浓集剂的制备
硅藻土粉(硅藻土)以白色粉末(325目；所有颗粒的尺寸小于44微米)购自AlfaAesar(AJohnsonMattheyCompany,WardHill,MA)。此材料通过X射线衍射(XRD)显示包含无定形二氧化硅以及结晶α-方石英和石英。
通过以下述方式表面处理硅藻土来制备包含两种不同表面改性剂(即，二氧化钛和氧化铁)的粒状浓集剂：
二氧化钛的沉积
通过在搅拌下将20.0克TiO(SO4)·2H2O(NoahTechnologiesCorporation,SanAntonio,TX)溶于80.0克去离子水中来制备20重量％的硫酸氧钛(IV)脱水溶液。将50.0克该溶液与175mL去离子水混合以形成二氧化钛前体化合物溶液。通过在快速搅拌下将50.0克硅藻土分散于较大烧杯中的500mL去离子水中来制备硅藻土的分散体。将硅藻土分散体加热至约80℃之后，经约1小时的时间段逐滴加入二氧化钛前体化合物溶液，同时快速搅拌。添加之后，将烧杯用表面皿盖住并将其内容物加热至沸腾20分钟。将氢氧化铵溶液添加至烧杯中直至内容物的pH为约9。通过沉降/滗析来洗涤所得产物直至洗涤水的pH为中性。通过过滤分离产物并将其在100℃下干燥过夜。
将干燥产物的一部分置于瓷坩埚内并通过下述方式进行煅烧，即以约3℃/分钟的加热速率从室温加热至350℃并随后在350℃下保持1小时。
氧化铁的沉积
基本上使用上述二氧化钛沉积方法来将氧化铁沉积到硅藻土上，不同的是用20.0克Fe(NO3)3·9H2O(J.T.Baker,Inc.,Phillipsburg,N.J.)溶于175mL去离子水中的溶液来替代硫酸氧钛溶液。将所得氧化铁改性的硅藻土的一部分按相似方法煅烧至350℃以用于进一步的检测。
材料
18兆欧的水：通过使用得自Millipore公司(Bedford,MA)的Milli-QTMGradient去离子***获得的18兆欧的无菌去离子水。
3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板(包括至少一种可发酵营养物质的平膜培养装置)得自3M公司(St.Paul,MN)。
尺寸范围为30-50微米的胺-官能化玻璃珠得自PolySciences公司(Warrington,PA)。
CaCO3：直径范围为2.5-10微米的碳酸钙粒子得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
CM-111：无定形的球化硅酸镁；成形为固体球的微球，且粒子密度为2.3g/cc；表面积为3.3m2/g；粒度：90％小于约11微米、50％小于约5微米、10％小于约2微米；以3MTMCosmeticMicrospheresCM-111得自3M公司(St.Paul,MN)。
Fe-DE：基本上如上文所述沉积到硅藻土的氧化铁。
羟基磷灰石：粒度为2-8微米的以目录号H0252得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)的1型羟基磷灰石粒子。
mHPA：平均粒度为约2微米的得自Chemicell,GmbH(Berlin,Germany)的经羟基磷灰石涂布的磁珠。
PCTE-1：平均孔尺寸为约0.4微米的得自Sterlitech(Kent,PA)的聚碳酸酯径迹蚀刻膜过滤器。
PCTE-2：平均孔尺寸为约0.2微米的聚碳酸酯径迹蚀刻膜过滤器(由Whatman制造；得自VWR(WestChester,PA))。
二氧化硅微球：平均直径为约2.5微米的二氧化硅微球；得自PolySciences公司(Warrington,PA)。
Ti-DE：基本上如上文所述沉积到硅藻土上的二氧化钛。
浓集剂的预筛检
将100mg各种粒状浓集剂(CM-111、CaCO3、Ti-DE、羟基磷灰石、Fe-DE和胺-官能化玻璃珠)进行称重、添加至5mL聚丙烯试管中，并悬浮于1mL18兆欧的无菌去离子水中。将50mg和10mg的Fe-DE样品以相同方式进行处理。将200微升体积的二氧化硅微球和100微升、50微升和10微升体积的经羟基磷灰石涂布的磁珠(mHPA)也按相同方式进行处理。通过在VWRAnalogVortexMixer(VWR,WestChester,PA)上以最高速度(设置为10:3200转/分(rpm))涡旋10秒来混合试管内容物。将悬浮的粒状浓集剂按照制造商的说明铺板到3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板上并进行密封。将47mm的PCTE过滤器通过洗瓶用无菌去离子水润湿约2分钟并添加至3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板，然后进行水合(通过围绕过滤器的边缘以及顶部添加约1mL的水进行)并根据制造商的说明进行密封。通过使用3MTMPetrifilmTMPlateReader(PPR，3M公司(St.Paul)；包括至少一个扫描仪的自动光学检测***)的数字光学成像来分析计数平板(包括含有无菌水样品而不含浓集剂的对照平板)以获得图像。针对PPR的蓝色、绿色和红色通道中的信号，通过使用MediaCybernetics公司(Bethesda,MD)的ImageProPlusTM6.3.0.512版软件来进一步分析图像。
PPR绿色通道中的信号(其具有525nm的波长)经计算为从计数平板的顶部反射的(绿)光和从计数平板的背部透射的(绿)光的总和。PPR绿色通道中的光/信号透射数据示于下表1中。
表1
粒状浓集剂 绿色通道中的信号透射百分比
对照(仅含水) 100
CM-111 114
CaCO3 98
Ti-DE 95
羟基磷灰石 76
二氧化硅微球 119
Fe-DE(100mg) 11
Fe-DE(50mg) 25
Fe-DE(10mg) 66
胺-官能化玻璃珠 110
MHPA(100μL) 43
MHPA(50μL) 58
MHPA(10μL) 80
PCTE-1过滤器 71
PCTE-2过滤器 90
实例1-7和比较例C-1–C-5
将一菌环量(标准的四毫米细菌环)的得自胰酶大豆琼脂平板(BectonDickinson,Sparks,MD)的大肠杆菌(ATCC51813)过夜划线培养物用于在3mL的Butterfield’s缓冲液(pH7.2,VWR,WestChester,PA)中制备0.5McFarland标准(VitekDENSICHEK,bioMerieux,Inc.,Durham,NC)。该标准对应于～108菌落形成单位/毫升(CFU/mL)。在过滤灭菌的18兆欧的去离子水中进行连续稀释。在100mL过滤灭菌的18兆欧的水中从102CFU/mL稀释液进行1:1000的进一步稀释，从而得到0.1CFU/mL(总计10个CFU)的最终浓度。添加1mL等分试样的100X强度吸附缓冲液(pH为7.2；1X强度为在每升水中含有5mM的KCl、1mM的CaCl2、0.1mM的MgCl2和1mM的K2HPO4)以获得1X的最终浓度。
将粒状浓集剂按上文所述(在“浓集剂的预筛检”中)的量进行称重并添加至250mL的无菌聚丙烯锥形底部管(VWR,WestChester,PA)中。盖住试管并将其内容物通过在室温(25℃)下手动摇动来混合约1分钟。
混合之后，将试管在ThermolyneVariMixTM摇动平台(BarnsteadInternational,Iowa,14周/分)上孵育45分钟。孵育之后，将试管内容物分到2×50mL的无菌锥形聚丙烯管(VWR,WestChester,PA)内并在2500rpm下离心5分钟，以离析所得的结合大肠杆菌的粒状浓集剂。滗出所得的上清液，将结合大肠杆菌的浓集剂粒子再悬浮于1mL的Butterfield缓冲液中并铺板至3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板上。
将所得的结合大肠杆菌的经羟基磷灰石涂布的磁珠(mHPA)用磁体(3-in-1MagneticParticleSeparator,CPG,Inc.,LincolnPark,NJ)离析且分离5分钟并按上文进行铺板。将各个计数平板根据制造商的说明进行密封并在37℃的培养箱(VWROrbitalShakingIncubator，型号#1575R，WestChester，PA)中进行孵育。
将得自初始102CFU/mL(不存在粒状浓集剂)的1:1000稀释液作为对照铺板至3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板上。
通过将各个过滤器设置在灭菌的玻璃过滤设备中来检测两个47mm的过滤器(PCTE-1和PCTE-2)。制备两个包含约10个CFU大肠杆菌的100mL水样品(基本上如上文所述)，并通过利用负压(真空)使样品穿过各个过滤器。将过滤器用表面灭菌的镊子对取出并设置到3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板上，然后基本上如上文所述进行水合并且根据制造商的说明进行密封。将包括过滤器的计数平板在37℃的培养箱中孵育过夜。
通过下述方式就地(即，不将大肠杆菌与浓集剂分离)获得菌落计数，所述方式为首先使用3MTMPetrifilmTM平板阅读器(自动光学检测)，随后使用人视觉检查(人工光学检测)作为自动阅读器计数的核对。使用下述公式(并且通过平均化自动和人工菌落计数)来计算结果：
捕集效率＝(浓集剂上的菌落数/对照中的菌落总数)×100
结果示于下表2中。
表2
*对于对照σ＝11
**对于对照σ＝15
***对于对照σ＝小于15
实例8以及比较例C-6和C-7
基本上如上文所述使用过夜生长的大肠杆菌来制备0.5McFarland标准。基本上如上文所述检测粒状浓集剂CM-111从50mL水样品中对于～10个CFU大肠杆菌的捕集。CM-111和样品之间的接触时间为30分钟，并且基本上如上文所述离析且分离所得的结合大肠杆菌的CM-111，以提供粒料。基本上如上文所述将粒料铺板至3MTMPetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌计数平板上并进行孵育。另外以类似方式处理包含～10个CFU和～100个CFU大肠杆菌(不存在CM-111)的对照计数平板(分别作为比较例C-6和C-7)。孵育24小时之后，将计数平板设置到3MTMPetrifilmTM平板阅读器(PPR，3M公司(St.Paul)；自动光学检测***)内，并根据制造商的说明通过自动检测***或阅读器来测定大肠杆菌菌落的数量(如上文所述，就地进行)。结果示于下表3中，其包括由分号隔开的重复值(对于每个样品进行两次单独的试验)。
典型的大肠杆菌菌落在计数平板中表现为蓝色菌落，具有邻近的气泡。表3中的最后一列示出了基于人视觉检查的核实(人工光学检测)由PPR的图像分析软件误数的菌落数。显著相对大的气泡有时引起自动检测***(根据气泡的尺寸)将单个菌落计数为2或3个菌落。
表3
将本文所引述的专利、专利文献、出版物中包含的参考说明内容以引用的方式全文并入本文，就如同将每个参考说明内容单独引入本文一样。对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的前提下，可对本发明作出各种无法预见的修改和更改。应该理解的是，无意使本发明不当地受限于本文所述的示例性实施例和实例，并且这些实例和实施例仅以举例的方式给出，本发明的范围仅旨在受限于如下文所述的权利要求书。

Claims (15)

1.一种方法，所述方法包括：
(a)提供至少一个疑似包含至少一个大肠菌菌株的样品；
(b)提供至少一个培养装置，所述培养装置包括至少一种水合的或可水合的培养基；
(c)提供至少一种粒状浓集剂，所述粒状浓集剂在所述培养基为水合的情况下与所述培养装置中的所述培养基相接触时为基本上光学透明的，其中所述粒状浓集剂包括微粒，所述至少一种粒状浓集剂可浓集多种大肠菌菌株；
(d)设置所述粒状浓集剂与所述样品相接触，使得所述大肠菌菌株的至少一部分结合至所述粒状浓集剂或被所述粒状浓集剂捕集，以形成结合大肠菌的粒状浓集剂，其中相对于不含所述粒状浓集剂的相应对照样品，所述粒状浓集剂捕集或结合存在于所述样品中的大肠菌菌株的至少约70％；
(e)设置所述结合大肠菌的粒状浓集剂与所述培养装置的所述培养基相接触；
(f)孵育包括与所述培养基相接触的所述结合大肠菌的粒状浓集剂的所述培养装置，所述培养基为水合的；和
(g)在不将所述大肠菌菌株与所述粒状浓集剂分离的情况下，光学检测所述大肠菌菌株的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为流体的形式。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为水样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述大肠菌菌株为产生气体的大肠菌菌株。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述大肠菌菌株为大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少一种可发酵营养物质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养装置为包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基的平膜培养装置。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述粒状浓集剂在7的pH下具有负ζ电位。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述设置与所述样品相接触是通过将所述粒状浓集剂与所述样品混合来实现的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括离析所述结合大肠菌的粒状浓集剂和/或从所述样品中分离所得的离析过的粒状浓集剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括鉴定和/或计数所述大肠菌菌株。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学检测包括检测至少一种颜色变化。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学检测通过自动光学检测***进行。
14.一种方法，所述方法包括：
(a)提供至少一个疑似包含大肠杆菌的水样品；
(b)提供至少一个平膜培养装置，所述平膜培养装置包括至少一种培养基，所述培养基为水合的或可水合的并且包含至少一种可发酵营养物质；
(c)提供至少一种粒状浓集剂，所述粒状浓集剂在所述培养基为水合的情况下与所述平膜培养装置中的所述培养基相接触时为基本上光学透明的，所述粒状浓集剂包括无定形的球化硅酸镁；其中所述至少一种粒状浓集剂可浓集多种大肠菌菌株；
(d)设置所述粒状浓集剂与所述水样品相接触，使得所述大肠杆菌的至少一部分结合至所述粒状浓集剂或被所述粒状浓集剂捕集，以形成结合大肠杆菌的粒状浓集剂，其中相对于不含所述粒状浓集剂的相应对照样品，所述粒状浓集剂捕集或结合存在于所述样品中的大肠杆菌的至少约70％；
(e)设置所述结合大肠杆菌的粒状浓集剂与所述平膜培养装置的所述培养基相接触；
(f)孵育包括与所述培养基相接触的所述结合大肠杆菌的粒状浓集剂的所述平膜培养装置，所述培养基为水合的；以及
(g)在不将所述大肠杆菌与所述粒状浓集剂分离的情况下光学检测所述大肠杆菌的存在，所述光学检测包括通过使用包含至少一个扫描仪的自动光学检测***的数字光学成像来检测至少一种颜色变化以及邻近至少一个大肠杆菌菌落的至少一个气泡的存在。
15.一种用于实施根据权利要求1所述的方法的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：
(a)至少一个培养装置，所述培养装置包括至少一种水合的或可水合的培养基；和
(b)至少一种粒状浓集剂，所述粒状浓集剂在所述培养基为水合的情况下与所述培养装置中的所述培养基相接触时为基本上光学透明的。
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