CN101775363B - 乙醇生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乙醇作为细菌发酵产物的生产，特别是涉及一种建立在同源重组基础上的基因失活和基因表达的新方法。

Description

乙醇生产
本申请为国际申请日2001年10月5日、国际申请号PCT/GB2001/004434于2003年5月27日进入中国国家阶段、申请号01819566.0、发明名称“乙醇生产”的分案申请。
本发明涉及乙醇作为细菌发酵产物的生产，特别是涉及一种建立在同源重组基础上的基因失活和基因表达的新方法。
许多细菌有天然的代谢能力，通过糖酵解途径将单糖转变为酸性和中性发酵产物的混合物。糖酵解是一系列酶促反应，六碳葡萄糖在此过程中降解，经多种中间产物变成两分子三碳化合物丙酮酸。许多细菌的糖酵解途径都产生丙酮酸作为普遍的中间产物，接着，丙酮酸代谢生成净产物NADH和ATP以及通常被认为是发酵产物的副产物。在有氧条件下，大约95％由糖酵解产生的丙酮酸在许多短的代谢途径中被消耗，同时NAD+经氧化反应再生。在此过程中，NADH被氧化，经一系列的步骤供给氢同剂量的氧以生成水，维持糖酵解的持续进行和ATP的产生。
在无氧条件下，大部分的ATP通过糖酵解形成，其余的ATP也可以在产生有机酸例如乙酸的过程中再生。NAD+是在有机物例如丙酮酸或乙酰CoA的还原过程中由NADH再生的。所以，糖酵解和丙酮酸代谢的发酵产物包括乳酸、甲酸、乙酸等有机酸以及中性产物例如乙醇。
大多数兼性厌氧菌无论在有氧还是无氧条件下都不能大量产生乙醇。它们在丙酮酸脱氢酶(PDH)的作用下经三羧酸循环(TCA)无氧代谢丙酮酸。在无氧条件下，丙酮酸主要的能量代谢途径是通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途径提供甲酸和乙酰CoA，然后乙酰CoA经磷酸转乙酰酶(PTA)和乙酸激酶(AK)作用转化成乙酸并同时产生ATP，或者，经乙醛脱氢酶(AcDH)和醇脱氢酶(ADH)催化还原为乙醇。为维持反应的计量平衡，糖酵解产生的过量NADH在丙酮酸还原成乳酸时被乳酸脱氢酶(LDH)重新氧化成NAD+。NADH也可以在乙酰CoA还原为乙醇时被AcDH和ADH重新氧化，但当细胞中有功能性LDH存在时，后者就是次要反应。为了促使ATP再生，大部分乙酰CoA转变成了乙酸，而且糖酵解产生的过量NADH也被LDH氧化，因此，乙醇的理论产量就很低。
产乙醇的微生物，例如Zymomonasmobilis和酵母，有第二种无氧发酵的方式，通常被称为乙醇发酵。在这种途径中丙酮酸被丙酮酸脱羧酶(PDC)代谢成乙醛和CO2。然后，乙醛被ADH还原为乙醇同时NAD+再生。乙醇发酵的结果是1分子葡萄糖转变为2分子乙醇和2分子的CO2。编码Z.mobilis菌体内这两种酶的DNA已经被分离、克隆，并且可以在通过以上的合成途径大量产生乙醇的宿主菌中表达。例如专利US5,000,000和Ingram等人(1997)BiotechnologyandBioengineering58，Nos.2和3已经报道了编码来源于Z.mobilis的PDC(pdc)和ADH(adh)基因可以掺入到“pet”操纵子，它可用来转化EscherichiaColi菌株形成共同表达Z.mobilispdc和adh两种基因的E.coli重组子。这样的结果是无论在有氧还是无氧条件下，在E.coli的生长过程中产生了从丙酮酸到乙醇为中心代谢的合成途径。专利US5554520也有类似报道，来源于Z.mobilis的pdc和adh均可以使用“pet”操纵子整合产生革兰氏阴性重组宿主菌，包括Erwina.Klebsiella和Xanthomonas品系。这些品系表达Z.mobilis外源基因，通过由丙酮酸到乙醇的合成途径大量产生乙醇。
专利US5482846报道了用编码PDC和ADH酶的异源基因同时转化中温(mesophilic)革兰氏阳性菌Bacillussp，这样，转化菌就可以产生乙醇作为它的初级发酵产物，并无报道提及采用pdc基因单独转化的细菌能产生乙醇。
EP-A-0761815介绍了一种同源重组的方法，通过这一方法，一个芽胞形成基因被***到Bcillusthurengiensis中。
EP-A-0603416介绍了一种同源重组的方法，通过这一方法，任意一种基因可被***到Lactobecillusdelbrueckii中。
EP-A-0415297介绍了一种方法，得到可表达一种突变蛋白水解酶的Bacillus菌株。
Biwas等人(JBacteriol.，175，3628-3635，1993)介绍了一种同源重组的方法，通过这一方法，LactococcusLactis的一个染色体基因被携带修饰拷贝的质粒所取代。这个方法使用了温敏性的质粒，所以不能用来转化嗜热菌。
生物催化剂催化生产乙醇时，采用耐热的微生物并在高温下操作取得了重大进步，糖类转化为乙醇的速率大大加快。例如：在嗜热Bacillus中的生产乙醇的能力比用传统的酵母30℃下发酵工艺的能力大10倍。所以，生产能力在一定体积时所需的工厂规模可以减少，工厂的构建费用也相应降低。在高温下，发酵罐中其它微生物对产物产生污染的可能性减小了，后续操作的时间相应减少，生产能力提高，对原料灭菌时所消耗的能量也降低了。而且，不再要求发酵冷却，进一步降低了操作费用。发酵产生的热量有助于乙醇的蒸发，降低了高度的乙醇对菌体的生长抑制，而这是存在于细菌发酵生产的普遍问题。发酵罐上部的乙醇蒸汽也有利于产物回收。
本发明人所用的菌株来自于一种野生型的分离菌，具有天然堆肥能力，比传统的中温微生物更适合将农业原料中的糖类转化为乙醇。这种基础菌株拥有全部转化遗传机器，可把己糖、戊糖以及纤维二糖转化为乙醇；本发明人只是简单地阻断了LDH途径来提高乙醇产量。这个过程被称为自我克隆并不涉及外源基因的表达，故符合遗传修饰有机体(GMO)的安全使用准则。
相反，传统的生物催化剂要么是不能利用戊糖的良好的乙醇生产催化剂，要么是可以利用戊糖的较差的乙醇生产催化剂。这些有机体已经用复杂的遗传学技术在遗传上进行了修饰，这样它们可以将已糖和戊糖都转化为乙醇。然而，这些重组有机体的稳定性以及安全性受到怀疑，因为这些有机体达不到GMO的安全准则。此外，重组中温菌对营养的要求较高，对高盐浓度和原种抑制物也较敏感。
由代谢反应引起的乳酸的形成(LDH途径)已经被体内化学诱变所阻断，因此得到的TN菌株是不产乳酸的，但能大量产生乙醇。然而，这种突变的菌株并不稳定，且会自发回复为产乳酸的野生型。在低pH和高糖环境下，回复突变体比突变体生长快，在连续培养时快速“取代”突变体。随着“取代”的进行，主要的发酵产物由乙醇变成了乳酸。
本发明人首创了一种分子生物学的方法来解决稳定性问题，并且了解了与乙醇生成有关的遗传体系。本发明人首选开发了遗传学技术对有机体进行特异性的操作，连续培养后得到了芽胞形成缺陷型突变体。接着，本发明人对几个关键的代谢基因：乳酸脱氢酶(ldh)，乳糖酶通透酶(lp)，醇脱氢酶(adh)和一个新的定位于ldh基因内的***序列进行测序。来源于化学突变菌株的ldh基因的DNA序列分析结果显示在编码区***一个自发的***序列元件(IE，也被称为IS元件)之后使基因失活。转座入/出ldh基因以及接下来的基因失活本身都是不稳定的，其结果就是产生回复。
本发明人确证ldh基因内的IE序列给同源重组提供了很大的区域，由此推测ldh突变的稳定性是可以提高的，只要将质粒DNA整合到TN菌株ldh基因的IE序列中。
通过质粒和ldh基因***序列两者间的特异性同源重组，ldh基因突变的稳定性得到了提高。得到的菌株为芽胞形成缺陷型、兼性厌氧和革兰氏阳性的Bacillus菌株，在连续培养过程中显示其生产乙醇能力的提高。以上结果表明新的突变型相当稳定，而且，较之于由体内化学诱变形成的第一代突变型有着更为优越的生长特性和乙醇生产能力。
通过基于同源重组的基因整合的新方法，菌株的质量得到了提高，整合的位点以及用于重组的质粒同样可以用来整合并过量表达天然的或异源的基因。
Southern杂交分析显示了有3个拷贝的转位***序列元件(IE)存在于BacillusLLD-R菌株的染色体上。该***序列长3.2Kb并包含三个可以被翻译成蛋白质的开放性的阅读框序列(ORF’s)。ORF1与国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的任何蛋白都无同源性，而istA和istB与一个已知的转座酶家族有高度的同源性。由LLD-R经体内化学诱变得到BacillusTN菌株(图9A和9B)，在结构基因ldh中发现一个拷贝的***序列，正是这个***序列使得ldh基因失活，从而得到乳酸阴性的表型，主要的发酵代谢产物也因此由乳酸变成了乙醇。在图1中列出了来源于BacillusTN菌株的ldh基因和IE序列(划线)的DNA序列，在图11中列出了L-LDH的氨基酸序列。然而，这种***并不稳定，TN突变株会自发回复突变成带有功能性ldh基因的TN-R菌株，主要的发酵代谢产物由乙醇变成了乳酸，如图2所示。这也表明BacillusTN突变株在遗传上的不稳定性。
经PCR扩增，IE序列从TN染色体DNA上获得，PCR引物选自位于***序列两侧的ldh基因序列。上游引物加入一个HindIII限制性酶切位点。下游引物加入一个XbaI限制性酶切位点，加入的限制性酶切位点便于下一步克隆到pUBUC质粒中，一个长3.2kb的含有***序列的PCR片段经HindIII和XbaI限制性内切酶切割后克隆到pUBUC质粒中，得到了pUBUC-IE质粒(图5)。
质粒DNA经转化后在携带pMETH质粒的E.coliTOP10细胞中扩增并纯化，转化Bacillussp之后对其进行体内甲基化以防止限制性酶切。甲基化的pUBUC-IE用于转化BacillusTN菌株。转化子首先在52℃下用TGP琼脂平板(卡那霉素)上分离，再用PCR扩增ldh基因进行筛选。用LDH引物未得到目的PCR产物(在设定的PCR条件下大于10kb)说明至少一个拷贝的质粒已经被整合到染色体中。
新菌株TN-T9在pH稳定且不含卡那霉素选择的条件下进行连续培养以检查此菌株的稳定性。采用发酵培养基中含有残余糖类的亚理想的发酵培养条件和偏向于回复突变的条件，证实了TN-T9菌株的稳定性。750小时的连续发酵除了培养基中残余的糖类、丙酮酸分泌物和许多与设定条件有所偏离的情况外，没有任何迹象表明有乳酸产生。在整个发酵过程中，乙醇大量地产生(图4)，表明在规定的实验条件下连续培养，TN-T9菌株的ldh基因突变是稳定的。
本发明人对BacillusTN-T9菌株的细胞生长和乙醇生产选择了最优化的发酵条件。
总而言之，本发明人发明了一个双重体系，在此体系中使用pdc/adh操纵子选择性地表达pdc和adh基因，提高了ldh突变株的稳定性。本发明人分离并测序了一个新的ldh基因和***序列元件，以及新的乳酸通透酶和乙醇脱氢酶基因。此外，本发明人开发了新的技术，用于质粒DNA与染色体的整合以及筛选重组的Bacillussp，同时，建立了一系列细菌发酵生产乙醇的最佳化条件。
因此，本发明首要的一个方面是涉及到一种重组的嗜热***，这种菌株通过同源重组的方法转化使基因突变更加稳定，也有利于可表达基因的***。
本发明同时详细介绍了一种重组的嗜热***，它经过质粒和细菌染色体DNA间的同源重组使ldh突变的稳定性得到了提高，形成了一种以产生乙醇作为细菌发酵产物的新菌株。
革兰氏阳性菌优先是B.thermoglucosidasius菌株。
更可取地，革兰氏阳性菌已经被携带如图1所示的IE序列或其功能性部分或变体的质粒转化，并且如图1所示的IE序列或其功能性部分或变体通过同源重组被稳定地整合到重组菌的染色体中。
更可取地，IE序列整合到重组菌的染色体中会造成天然ldh基因的失活。
更可取地，革兰氏阳性菌为BacillusTN-T9菌株(NCINB保藏编号NCIMB41075，按照布达佩斯条约的条款于2000年9月8日保藏)。
更可取地，革兰氏阳性菌也可选用BacillusTN-TK菌株(NCINB保藏编号NCIMB41115，按照布达佩斯条约的条款于2001年9月27日保藏)。
本发明也涉及到一种革兰氏阳性菌，通过对卡那霉素敏感的TN-T9菌株的突变体筛选获得。获得这种菌株的方法在所附的例子中有详细描述。
更可取地，革兰氏阳性菌为芽胞形成缺陷型。
本发明的第二个方面是提供一种革兰氏阳性菌，它的天然ldh基因因同源重组而失活，一个或更多的可表达基因被***到菌体染色体DNA中。此外，质粒可以单拷贝或多拷贝的方式从多个***位点整合到***序列中，由此基因的拷贝数增加，基因表达也得到提高。一个或多个可表达的基因可能被***到菌体染色体DNA中的一个或多个IE序列中，例如在TN-T9和TN-TK两种菌株的染色体上有三个IE序列。
表达的基因对Bacillus而言可能是天然存在的，例如乙醇脱氢酶，或者是外源的(即异源的)，例如来源于Z.mobilis的丙酮酸脱羧酶和来源于B.stearothemophilus的α-淀粉酶，这些基因在相同的转录控制下被重排到一个操纵子中，基因表达可以通过增加基因的拷贝数和使用不同的转录启动子序列调控。
一个或多个基因优先是pdc和/或adh。
adh的氨基酸序列如图12所示。
本发明的第三个方面是提供一种方法，通过同源重组使天然ldh基因失活，同时一个或多个可表达基因***到菌体的染色体中。
细菌优先是嗜热革兰氏阳性菌。
更可取地，失活基因为天然的ldh基因，一个或多个可表达基因为pdc基因和adh基因。
更可取地，pdc基因和adh基因形成PDC操纵子的一部分，PDC操纵子与图1所示的IE序列在同一个质粒上连接。
更可取地，pdc基因是与细胞异源。
更可取地，图1所示的IE序列和PDC操纵子或其一部分被稳定地整合到菌体的染色体上。
更有利地，基因失活和表达的方法包括使用一个穿梭载体，如图5所示，它能够在高达54℃的温度下在E.coli和Bacillussp菌株中复制。
本发明的第四个方面是提供一个穿梭载体，它能够在高达54℃的温度下在E.coli和Bacillussp菌株中复制，它有氨苄青霉素和卡那霉素抗性并携带来源于BacillusTN菌株的如图1所示的IE序列或其一部分。
穿梭载体优先是pUBUC-IE质粒，如图5所示。
更可取地，穿梭载体包含一个PDC操纵子，PDC操纵子包含一个pdc基因和一个adh基因，受ldh启动子的控制，与图1所示的IE序列连接。
本发明的第五个方面是提供一种在高温下筛选Bacillussp重组子的方法，包括质粒DNA经同源重组稳定地整合到重组子细菌的ldh基因中，以及用PCR筛选不含天然ldh基因和IE序列的重组子。
更可取地，来源于重组菌ldh基因的PCR扩增失败，显示了***序列成功地整合到ldh基因中。
本发明也提供一个或多个多肽，它们由如图1所示的从第652个核苷酸到第3800个核苷酸序列，或其功能性变体或其一部分编码，这些多肽都有转座酶的生物活性。
这些多肽无论是单独存在还是与其余多肽结合都有转座酶的生物活性。
更可取地，这些多肽的氨基酸序列可如图13，图14或图15所示，或者为其功能性的一部分或为其变体。
功能性的部分或变体至少保留如图13，图14或图15所示多肽的转座酶功能部分，且至少含20个氨基酸，更好至少含50个。此外，比较好地其变体与如图13，图14或图15所示的多肽至少有80％的同源性，90％的同源性更好，95％的同源性最好。同源性是优先用BLAST程序检测。
本发明的第六个方面提供如图6所示的一段DNA序列或其功能性变体，这段序列编码一个具有乳酸脱氢酶生物活性的多肽。
本发明的第七个方面提供如图7B所示的一段DNA序列或其功能性变体，这段序列编码一个具有乳酸通透酶生物活性的多肽。
本发明的第八个方面提供如图8所示的一段DNA序列或其功能性变体，这段序列编码一个具有乙醇脱氢酶生物活性的多肽。
在本说明书中，功能性变体含有序列增加、删除或替代得到的DNA序列，或含有遗传密码子简并性、杂交和/或编码一个有乳酸脱氢酶、乳酸通透酶或乙醇脱氢酶活性多肽的DNA序列。更可取地，这些变体与如图所示的序列至少有80％的同源性，90％的同源性更好，95％的同源性最好。同源性是优先用BLAST程序检测。
本发明的第九个方面是提供一种提高ldh突变体稳定性的方法，包括使用pdc/adh操纵子表达基因。
本发明的第十个方面涉及与本发明相关的重组Bacillussp的整合和筛选的技术。
本发明最后的第十一个方面，是提供用革兰氏阳性菌发酵生产乙醇的工艺方法，包括细胞生长和乙醇生产的pH值、温度、氧还值和特异稀释率等发酵条件的最佳化选择。发酵条件优先选用5.5-5.7的pH范围，40-75℃的温度范围，-360--400mV的氧还值以及0.3-0.8h-1的稀释率。
附图的简单说明
按照本发明重组菌的生产将仅以举例的方式描述，参考的附图如下：
图1含有一个***元件(IE)的DNA序列的核苷酸序列，其中IE序列用下划线标明；
图2遗传学不稳定的TN菌株的示意图；
图3BacillusTN突变菌内经单交换重组使LDH基因失活的方法示意图；
图4BacillucTN-T9突变株750小时连续培养稳定性的线图；
图5穿梭载体pUBUC-IE的示意图；
图6一种新的来源于BacillusLN菌株乳酸脱氢酶的DNA序列及氨基酸序列；
图7A一种新的来源于BacillusLN菌株乳酸通透酶的部分DNA序列及氨基酸序列；
图7B一种新的来源于BacillusLN菌株乳酸通透酶的完整DNA序列及氨基酸序列；
图8一种新的来源于BacillusLN菌株乙醇脱氢酶(划线)的DNA序列；
图9(A)BacillusTN-T9菌株的获得的示意图；
(B)BacillusTN-T9和TN-TK菌株的获得的示意图；
图10人工PDC操纵子结构示意图；
图11来源于TN菌株的L-乳酸脱氢酶(ldh)氨基酸序列；
图12来源于TN菌株的乙醇脱氢酶(adh)氨基酸序列；
图13IE序列编码的转座酶的氨基酸序列；
图14IE序列编码的转座酶的氨基酸序列；
图15IE序列编码的转座酶的氨基酸序列。
实施例
材料和方法
pUBUC质粒结构
用于E.coli和发明人的嗜热Bacillus菌株间DNA转移的穿梭载体由质粒pUC18和pUB110融合得到。质粒pUB110是一种从Staphyloccocusaureus分离得到的广泛使用的载体，它有卡那霉素的抗性，并且可以在高达54℃的温度下在B.stearothermophilus中复制(Narumietal.，1992BiotechnologyTechniques6.No.1)。质粒pUB110和pUC18在EcoRI和BamHI的作用下线性化并连接在一起形成pUBUC质粒(6.4kb)。质粒pUBUC有一个温敏型复制子，当温度超过54℃时，由于发生了较高温度下的同源重组，质粒不能复制，而在54℃时，却是一个用于基因整合的理想宿主。
质粒pMETH的结构
以Haemophilusaeygptius染色体DNA为模板经PCR扩增得到一段长1.1kb含有met基因的片段，并经过DNA测序的检验。met基因被BamHI和XbaI酶切，然后再被亚克隆到已用BamHI和XbaI线性化的表达质粒pCL1920中。所形成的质粒pMETH转化到E.coliTOP10细胞中，携带pMETH的E.coliTOP10细胞被增殖，收集培养物用于下一步转化，并在体内甲基化，所用方法见Tangetal(1994)Nuc.AcidRes.22(14)。感受态细胞在转化前于-70℃下分装保存。
PCR扩增
以TN染色体DNA为模板经PCR扩增获得IE序列，所用引物为LDH7和LDH8，采用ExpandTM高保真性PCR***(RocheDiagnostics)推荐的反应物浓度及PCR程序。冻干细胞的PCR扩增在Geniusthermocycler(Techne.Ltd.Cambridge)上进行，30个循环即可。上游引物LDH7为5’-AAGCTTGATGAAATCCGGATTTGATGG-3’，下游引物LDH8序列为5’-TCTAGAGCTAAATTTCCAAGTAGC-3’。这些引物选自位于***序列两侧的ldh基因序列。上游引物加入一个HindIII限制性位点，下游引物加入一个XbaI限制性位点，为下一步克隆建立适当的酶切位点(加入的位点有下划线表明)。
质粒pUBUC-IE的结构
E.coli质粒DNA的操作、转化和分离根据标准程序(Maniatis)进行。长3.2kb含有***序列的PCR片段用HindIII和XbaI酶切并克隆到质粒pUBUC中。得到了被称为pUBUC-IE(图5)的穿梭质粒，它可以在高达54℃的温度下在E.coli和Bacillus菌株中复制，有氨苄青霉素和卡那霉素抗性，并携带来源于BacillusTN菌株的IE序列。
PDC操纵子的结构
通过PFL或者PDH途径BacillusTN菌株将细胞内代谢物丙酮酸转变为乙酰CoA。乙酰CoA由AcDH或ADH催化，分别还原为乙醛和乙醇。外源PDC酶的导入给细胞提供了另一种生产乙醇的途径，就是使丙酮酸经PDC催化脱羧形成乙醛，再经天然ADH酶催化还原为乙醇。PDC和ADH都参与了丙酮酸到乙醇的转变。
我们的结果已经显示了来源于质粒pZP-1的Z.mobilispdc的表达促进了细胞的生长，提高了TN突变株的稳定性。然而，乙醇生成并无显著增加。所以我们决定增加pdc基因的表达并共表达来源于BacillusTN菌株的天然adh基因。
在质粒pZP-1中，pdc基因被置于来源于B.stearothermophilusNCA1503的ldh启动子序列的控制之下。我们决定用来源于BacillusLN的ldh启动子替换原启动子(结构1)。然后将来源于BacillusTN菌株的adh基因置于ldh启动子的控制下(结构2)。最后，pdc(来源于Z.mobilis)和adh(来源于BacillusLN)都被置于ldh启动子的控制下(结构3)。所有来源于Z.mobilis(pdc)和BacillusLN菌株(ldh启动子和pdc)的基因经PCR扩增，用适当的限制性酶切，连接在一起并克隆到E.coli质粒载体中。三个载体被克隆到复制型穿梭载体pUBUC，pFC1或整合型穿梭载体pUBUC-1E中用于染色体整合。
实施例1
TN的转化
质粒pUBUC-1E经转化，在携带质粒pMETH的E.coliTOP10细胞中增殖并纯化，之后在体内甲基化。然后，用甲基化的pUBUC-1E转化BacillusTN菌株。Bacillus菌株细胞于65℃时在50mlTGP培养基中生长直至600nm(A600)处光吸收值达到0.5-0.6，培养物置于冰上预冷15-30min。细胞经离心收集用10ml冷的TH缓冲液(272mM海藻糖和8mMHEPES，KOH调pH至7.5)洗一次，再用5ml冷的TH缓冲液冼二次。细胞沉淀用400μlTH缓冲液重悬，在电穿孔前于4℃保存。用甲基化的质粒DNA电转化TN菌株，详细步骤见Narumietal(1992)BiotechnologyTechniques6(1)。感受态细胞90μl等量分装，分别与2μl甲基化的质粒DNA(250ng/μl)混合。混合物转到冷的电转杯(0.2cm电极缺口)，冰上孵育5分钟，然后，细胞悬液置于由25μF电容提供的2.5kV电场中，脉冲通过EquiBioEasyJect电穿孔仪控制在201ohms(时间恒定，τ＝5ms)。细胞快速转入5ml预热的TGP中，于52℃孵育1小时，铺于TGP琼脂板(10μg/ml卡那霉素)上。平板于52℃孵育24-48小时。
重组子的筛选
下面的方法用于筛选温敏型质粒pUBUC-1E的染色体经同源重组整合得到的重组子
1、转化子于52℃在5mlTGP(卡那霉素)培养基中生长24小时。
2、50ml新鲜TGP(卡那霉素)培养基用1ml上述培养物接种，于52℃振荡水浴中温育直至OD600达到0.5左右。
3、15ml上述培养物于5℃，4100rpm离心5分钟，沉淀用150μlTGP(10μg/ml卡那霉素)培养基重悬，铺于TGP(卡那霉素)平板上。
4、平板在68℃温育16小时。
5、挑选单菌落，用PCR分析质粒整合到***序列的位点。
TN整合体的筛选
TN整合体在68℃时分离，对TN整合体用LDH引物经PCR扩增无法得到产物，说明至少有一个拷贝的质粒pUBUC-1E已经被整合到染色体中，整合的结果是，新的TN-T9菌株比亲本的TN菌株对ldh回复突变和“取代”更加稳定。
TN-T9菌株的稳定性
发酵在亚优化条件下进行，即培养基中含残余的糖类，有利于回复突变的条件。连续发酵750多小时，除了培养基中残余的糖类、丙酮酸分泌物和许多与设定条件有所偏离的情况外，没有任何迹象表明有乳酸产生。整个发酵过程中乙醇产量相当大，且未用卡那霉素来选择整合体。以上结果显示，TN-T9菌株在实验条件下(pH7.0，65℃，含2％糖类)连续培养，其ldh基因突变是稳定的。
乙醇产量和生产能力
以葡萄糖、木糖和葡萄糖/木糖为原料生产乙醇的发酵条件已经最优化选择：
培养类型：连续
温度：65℃
pH：6.8
加料糖浓度：2-10％
喷射气体：空气
氧还值：大于-350mV(通过空气流速控制)
稀释率：0.36-0.6h-1
在这样的条件下，乙醇产量为0.4-0.5g/g糖。采用0.5h-1的稀释率，2％和4％糖浓度加料分别可以得到大约4和8g乙醇/升/小时的乙醇生产能力。
实施例2
卡那霉素敏感的TN-TK菌株的筛选
BacillusTN-TK是一种卡那霉素敏感的TN-T9衍生菌株。它对ldh突变相当稳定，对以卡那霉素作为选择标记的质粒表达是一个理想的宿主。
TN-T9首先于68℃在5ml补加卡那霉素(10μg/ml)的TGP培养基中生长24小时，大约100ml培养物铺于两块TGP(km)琼脂板上，68℃孵育过夜。得到几百个菌落，将其中100个菌落用无菌牙签转移到新鲜的TGP(km)平板，68℃过夜生长之后，菌落(通过影印铺板)转移到新鲜的TGP平板和TGP(km)平板，68℃过夜培养。
在TGP平板而非相应的TGP(Km)平板上得到两个卡那霉素敏感的菌落。来自于这两个菌落的ldh区域经PCR扩增，其大小与来源于TN-T9(亲本菌株)的被打断的ldh基因相当。用PCR证明菌株已经失去了卡那霉素抗性的基因。筛选出来一个称为TN-TK的衍生菌株用于进一步生长实验。以上的实验证实了卡那霉素敏感性和ldh突变都是相当稳定的。
序列表
<110>埃尔斯沃思生物技术有限公司
***·贾维德
法伊奥纳·库斯丁
保罗·迈尔纳
爱德华·格林
<120>乙醇生产
<130>SPI093746-61
<140>PCT/GB01/04434
<141>2001-10-05
<150>US60/247,017
<151>2000-11-13
<150>UK0024554.8
<151>2000-10-06
<160>16
<170>FastSEQforWindowsVersion4.0
<210>1
<211>4913
<212>DNA
<213>BacillusTN菌株
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(4913)
<223>n＝A，T，CorG
<400>1
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LeuLeuLeuAlaAlaAsnThrSerGlyGlyValMetGlyLysLeuIle
485490495
SerProGlnSerIleAlaIleAlaThrAlaAlaValLysGluThrGly
500505510
LysGluSerHisLeuPheLysMetThrIleTyrTyrSerLeuIleLeu
515520525
LeuLeuPheValGlyValTrpThrTyrPheLeuSerThrAlaGlyMet
530535540
IleIleMetValCysTyrSerValArgHisArgValMetLysLysAsp
545550555560
ValPheCysGlyLeuPhe
565
<210>8
<211>1573
<212>DNA
<213>BacillusLN
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<213>BacillusTN菌株
<400>9
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202530
GluLeuValLeuIleAspValAsnLysAsnLysAlaGluGlyAspVal
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MetAspLeuAsnHisGlyLysValPheAlaProLysProMetAsnIle
505560
TrpPheGlyAspTyrGlnAspCysGlnAspAlaAspLeuValValIle
65707580
CysAlaGlyAlaAsnGlnLysProGlyGluThrArgLeuAspLeuVal
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AspLysAsnIleAsnIlePheLysThrIleValAspSerValMetLys
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SerGlyPheAspGlyValPheLeuValAlaThrAsnProValAspIle
115120125
LeuThrTyrAlaThrTrpLysPheSerGlyLeuProLysGluArgVal
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IleGlySerGlyThrIleLeuAspThrAlaArgPheArgPheLeuLeu
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195200205
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<212>PRT
<213>BacillusTN菌株
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GluValGluLysProSerIleSerTyrGlyGluValLeuValArgIle
202530
LysAlaCysGlyValCysHisThrAspLeuHisAlaAlaHisGlyAsp
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TrpProValLysProLysLeuProLeuIleProGlyHisGluGlyVal
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GlyIleValGluGluValGlyProGlyValThrHisLeuLysValGly
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AspArgValGlyIleProTrpLeuTyrSerAlaCysGlyHisCysGlu
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GlyTyrSerValAspGlyGlyTyrAlaGluTyrCysArgAlaAlaAla
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AspTyrValValLysIleProAspAsnLeuSerPheGluGluAlaAla
130135140
ProIlePheCysAlaGlyValThrThrTyrLysAlaLeuLysValThr
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GlyThrLysProGlyGluTrpValAlaIleTyrGlyIleGlyGlyLeu
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180185190
AlaValAspIleGlyAspGluLysLeuGluLeuAlaLysGluLeuGly
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151015
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202530
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354045
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505560
TyrArgIleTrpIleAlaArgTyrArgCysProGluCysArgArgThr
65707580
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100105110
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210215220
IleGly
225
<210>12
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<212>PRT
<213>Bacillus
<400>12
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<213>Bacillus
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<212>DNA
<213>BacillusTN菌株
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(3149)
<223>n＝A，T，CorG
<400>16
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aacccagtggatattttaacgtatgctac3149

Claims (27)

1.一种革兰氏阳性Bacillus菌，其特征在于使用一种基于在天然ldh基因内，质粒和***元件序列发生同源重组的质粒整合方法，使ldh突变更加稳定，由此，乙醇生产能力得到提高，其中天然ldh基因已经被失活，并且其中质粒包括一个或者多个可表达的基因。
2.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于所述菌是嗜热菌。
3.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于所述菌是从B.stearothermophilus、B.calvodelox、B.caldotenax、B.thermoglucosidasius、B.coagulans、B.licheniformis、B.thermodenitrificans和B.caldolyticus中筛选得到的Bacillussp。
4.按权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其特征在于Bacillussp为以NCIMB保藏编号NCIMB41075保藏的B.thermoglucosidasiusTN-T9菌株。
5.按权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其特征在于Bacillussp为以NCIMB保藏编号NCIMB41115保藏的B.thermoglucosidasiusTN-TK菌株。
6.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于所述菌用携带如SEQIDNO:1的第652-3800位核苷酸所示的***元件序列或其功能性部分或变体的穿梭载体转化。
7.按权利要求6所述的革兰氏阳性菌，其特征在于***元件序列，其功能性部分或变体经同源重组被稳定地整合到重组菌的染色体中。
8.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于所述菌为芽胞形成缺陷型。
9.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于所述菌表达一个异源的pdc基因。
10.按权利要求1所述的革兰氏阳性菌，其特征在于ldh基因不可逆失活。
11.一种天然ldh基因失活和一个或多个可表达基因***到ldh基因中的方法，包括天然ldh基因中的***元件序列与包含***元件序列和一个或多个可表达基因的质粒之间的同源重组。
12.按权利要求11所述的方法，其特征在于其中一个或多个可表达基因为pdc基因和adh基因。
13.按权利要求12所述的方法，其特征在于所述pdc基因和adh基因形成PDC操纵子的一部分，PDC操纵子经操作连接到如SEQIDNO:1的第652-3800位核苷酸所示的***元件序列上。
14.按权利要求12所述的方法，其特征在于所述pdc基因来源于Zymomonassp。
15.按权利要求12所述的方法，其特征在于所述pdc基因来源于Zymomonasmobilis。
16.按权利要求12所述的方法，其特征在于所述adh基因来源于BacillusLN菌株。
17.按权利要求11所述的方法，其特征在于***序列和PDC操纵子或它们的部分，都被稳定地整合到重组菌的染色体中。
18.按权利要求11所述的方法，包括使用一种穿梭载体，如图5所示，它能够在E.coli和Bacillus菌株中复制。
19.用按权利要求1-10中任一项所述的革兰氏阳性菌的发酵生产乙醇的工艺方法，包括应用最优化的发酵条件，其中发酵培养基的pH值在5.5-7.5的范围内。
20.按权利要求19所述的工艺方法，其特征在于所述发酵培养基的pH值为6.0-7.0。
21.按权利要求19所述的工艺方法，其特征在于所述发酵培养基的pH值为6.4-6.9。
22.用按权利要求1-10中任一项所述的革兰氏阳性菌的发酵生产乙醇的工艺方法，包括应用最优化的发酵条件，其中发酵培养基的温度是在40-75℃的范围内。
23.按权利要求22所述的工艺方法，其特征在于所述发酵培养基的温度为52-70℃。
24.按权利要求22所述的工艺方法，其特征在于所述发酵培养基的温度为60-68℃。
25.用权利要求1-10中任一项所述的革兰氏阳性菌的发酵连续生产乙醇的工艺方法，其特征在于加料稀释率在0.3-0.8h-1的范围内。
26.按权利要求25所述的工艺方法，其特征在于所述加料稀释率为0.4-0.6h-1。
27.按权利要求19-26中任一项的工艺方法，其特征在于使用的菌种为BacillusTN菌株。
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