EA014878B1 - Предшественники половых стероидов, одни или в сочетании с селективным модулятором эстрогеновых рецепторов и/или с эстрогенами и/или ингибитором цгмф-фосфодиэстераз 5 типа, для профилактики и лечения вагинальной сухости и половой дисфункции у женщин в постменопаузе - Google Patents

Abstract

Новые способы лечения или снижения вероятности возникновения вагинальных дисфункций, в частности сухости влагалища и диспареунии, ведущих к половой дисфункции и снижению полового желания и активности, у восприимчивых теплокровных животных, включая человека, которые включают введение предшественника половых стероидов. В частности, раскрыто дополнительное введение эстрогена или селективного модулятора эстрогеновых рецепторов, в особенности выбранных из группы, состоящей из ралоксифена, арзоксифена, тамоксифена, дролоксифена, лодоксифена, GW-5638, TSE-424, ERA-923 и лазофоксифена, более предпочтительно соединений, имеющих общую структуру по формуле I, для медицинского лечения и/или торможения развития некоторых из вышеуказанных заболеваний. Также раскрыты фармацевтические композиции для введения активных ингредиентов и наборы, полезные для изобретения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа лечения или снижения вероятности возникновения проблем, затрагивающих слой 1атша ргорба или слой тикси1апк влагалища, с помощью предшественников половых стероидов, одних или в сочетании с новой комбинированной терапией, у восприимчивых теплокровных животных, включая человека. В частности, эти комбинации включают введение селективного модулятора эстрогеновых рецепторов (8ЕВМ) и повышение уровня предшественников половых стероидов у пациентов, причем предшественник выбирают из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона (ΌΗΕΑ), сульфата дегидроэпиандростерона (ΌΗΕΑ-З) и андрост-5-ен-3в,17в-диола (5-диола). Также могут вводиться эстрогены для противодействия потенциальным эффектам некоторых 8ЕКМ на приливы и другие симптомы менопаузы. Также может вводиться ингибитор цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа для улучшения половой активности. Изобретение также касается наборов и фармацевтических композиций для применения на практике вышеприведенной комбинации.

Уровень техники

В патенте ИЗ 5843932 сообщалось об эффекте на вагинальную атрофию одно-, трех- или шестимесячного курса лечения с помощью ΌΗΕΑ при нанесении в дозе 30 мг два раза в день в растворе 50% этанол-50% пропиленгликоль на участок кожи в 2 см² на спине у овариэктомированных крыс. Гистопатологическое исследование показало пролиферацию и ослизнение вагинального эпителия и устранение атрофии слизистой влагалища у крыс, получавших ΌΗΕΑ.

В исследовании, проводившемся на крысах с нанесением ΌΗΕΑ на кожу спины на протяжении 1, 3 и 6 месяцев, изучали только влияние на вагинальный эпителий (8оит1а е! а1., 1998, 1. З!его1б ВюсНет. Мо1. Вю1., 66(3): 137-149), но не на два других слоя - 1атта ргорба и тикси1апк. Затем было отмечено, что ΌΗΕΑ почти в 10 раз более эффективен при нанесении на вагинальный эпителий при местном применении, чем при нанесении на кожу на участке, удаленном от влагалища, так что для его действия требуется системное поглощение.

В более раннем исследовании эффекта ΌΗΕΑ при нанесении на кожу у женщин в постменопаузе на протяжении 12 месяцев в виде крема с 10% ΌΗΕΑ оценивали только эстрогенное действие ΌΗΕΑ (ЬаЬбе е! а1., 1997, 1. Сбп. Εпбοсбпο1. Ме!аЬ., 82: 3498-3505). Сообщается (см. с. 3500), что в качестве специфического параметра эстрогенного действия ΌΗΕΑ исследовали цитологию влагалища. Это обусловлено методом исследования - вагинальным мазком, который ограничивается поверхностными и легко удаляемыми клетками эпителия.

В настоящем изобретении описано влияние ΌΗΕΑ и других компонентов на три слоя влагалища тикси1апк, 1атта ргорба и эпителий - и новые преимущества на этих трех уровнях. Благотворное влияние ΌΗΕΑ на 1ат1па ргорба и тикси1апк, как полагают, имеет большое значение для положительного действия ингибиторов цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа, таких как виагра и других соединений или простагландин Е1.

Вагинальная сухость (сухость влагалища) поражает около 50% женщин в постменопаузе в возрасте от 50 до 60 лет и 72% после 70 лет (Вοкк^п-Αта^, 2000, Су песо 1 ОЬк!е! Бетб1, 28(3): 245-249). Из этих женщин около 80% испытывают мочеполовые нарушения, в особенности вагинит и диспареунию (Рапбй апб Оик1апбег, 1997, Αт. 1. Меб. ЗсЕ, 314(4): 228-31). Поскольку считается, что эти проблемы, по крайней мере, частично связаны с лишением половых стероидов, то в менопаузе следует подумать о соответствующей местной гормональной заместительной терапии. Недавно было признано, что женщины в постменопаузе не только лишаются всех овариальных эстрогенов, но они также постепенно лишаются и андрогенов, возникающих при периферическом интракринном превращении дегидроэпиандростерона (ΌΗΕΑ) в андрогены и эстрогены (ЬаЬбе е! а1., 1991, Мо1. Се11. бибоснноЕ. 78: С113-С118; ЬаЬбе е! а1., 1995, Αпп Ν.Υ. Αсаб. ЗсЕ, 774: 16-28; ЬаЬбе е! а1., 2003, бпб Веу, 24(2): 152-182). Действительно, уровень ΌΗΕΑ и ΌΗΕΑ-8 в сыворотке постепенно снижается, начиная с возраста 30-40 лет (ЬаЬбе е! а1., 2003, Ьпб Веу, 24(2): 152-182; Отепбекй е! а1., 1984, 1. С1ш. бибоснноЕ Ме!аЬ., 59: 551-555; ЬаЬбе е! а1., 1997, 1. Сбп. Ьпбосппо1. Ме!аЬ., 82: 2396-2402). В ряде исследований показано, что низкий уровень ΌΗΕΑ и ΌΗΕΑ-8 связан с рядом возрастных заболеваний и болезней (ЬаЬбе е! а1., 1997, 1. Сбп. Ьпбосппо1. Ме!аЬ., 82: 2396-2402; ПекНоиет е! а1., 1992, Сапсег Век, 52(1): 1-4; Зхабипап е! а1., 1994, Ок!еорогок 1п!., 4(2): 8488; ТНотап апб ^е1д1е, 1989, Α6υ 1ттипо1., 46: 221-261; Ватгей-Соипог е! а1., 1999, 1. Вергоб. Меб., 44(12): 1012-1020; Вагге!!-Соппог е! а1., 1999, 1. Лт. Себаб. Зос., 47(6): 685-691).

Эффективным подходом к ослаблению сухости влагалища и других симптомов менопаузы является использование гормональной заместительной терапии (ГЗТ) (Сгеепба1е апб 1ибб, 1993, 1. Αт. Себаб. Зос., 41(4): 426-436; 3!ибб е! а1., 1980, Ракейо, Ра1ео!б апб ΑтЬ^ик Ε6κ, МТ Ргекк, Ьапсак!ет, р. 127-139). Однако недавние клинические исследования показали, что сочетание эстрогенов и прогестинов повышает встречаемость рака молочной железы наряду с возможным отрицательным влиянием на сердечнососудистые явления (Со1ббх е! а1., 1995, Ν. Ε^Ε 1. Меб., 332: 1589-1593; Вокк е! а1., 2000, Ь. №б. Сапсег 1пк!., 92(4): 328-332; Воккоите е! а1., 2002, ^ΑМΑ, 288(3): 321-333). В то же время возрастает интерес к возможностям комбинированной заместительной терапии эстрогенами-андрогенами (ВокепЬетд е! а1., 1997, 1. Вергоб. Меб., 42(7): 394-404; Вигб е! а1., 2001, Сигг ХУотеп ^;·ι111ι Вер., 1(3): 202-205), хотя применение эстрогенного компонента ограничено из-за возможных осложнений, указанных выше. Исходя из

- 1 014878 современного прогресса в понимании физиологии половых стероидов у человека, особенно у женщин в постменопаузе (ЬаЬпе е! а1., 1991, Мо1. Се11. Епбост1по1., 78: С113-С118; ЬаЬпе е! а1., 2003, Епб Кеу, 24(2): 152-182), становится возможным применение ΌΗΕΆ для обеспечения женщинам в постменопаузе надлежащего уровня андрогенов и эстрогенов, синтезируемых в определенных тканях интракринными механизмами, без каких-либо системных эффектов (ЬаЬпе е! а1., 1997, 1. СИи. Епбосппо1. Ме!аЬ., 82: 23962402; ЬаЬпе е! а1., 2003, Епб Кеу, 24(2): 152-182; ЬаЬпе, 2001, КеГ Суп ОЬк!е!, 8: 317-322; Ьаксо е! а1., 2002, 145: 457-461). Восстановление чувствительных к андрогенам элементов вагинальной функции также должно способствовать действию ингибиторов цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа или простагландина Е1.

Селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (8ЕКМ) аколбифен (асо1Ь1Геие) (ЕМ-652) является производным бензопирана и был первоначально разработан для профилактики и лечения рака молочной железы (Саи!Ыет е! а1., 1997, 1. Меб. Сйет., 40: 2117-2122). Из всех известных соединений аколбифен обладает самым высоким сродством к ЕК (Саи!Ыет е! а1., 1997, 1. Меб. Сйет., 40: 2117-2122; ЬаЬпе е! а1., 1999, 1. 8!ето1б Вюсйет. Мо1. Βίο1., 69(1-6): 51-84; ТгетЬ1ау е! а1., 1997, Мо1. ЕпбосттоЕ, 11: 353-365) и обладает активностью как на ЕКа, так и на ΕΚβ (ТгетЬ1ау е! а1., 1998, Епбостшо1о§у, 139: 111-118). Это соединение проявляет чистую и очень сильную антиэстрогенную активность на молочную железу и эндометрий и в то же время снижает холестерин и триглицериды в сыворотке и предотвращает потерю костной массы, по крайней мере, у крыс (ЬаЬпе е! а1., 1999, 1. 8!ето1б. Вюсйет. Мо1. Βίο1., 69(1-6): 51-84). Кроме того, было показано, что применение ΌΗΕΆ не только не мешает, но и оказывает аддитивный ингибирующий эффект вместе с чистым антиэстрогеном аколбифеном на развитие опухоли молочной железы человека у голых мышей (Οηιινοίκ е! а1., 1991, Сапсег Кек, 51: 3131-3135; Ьио е! а1., 1997, Епбостшо1о§у, 138: 4435-4444). Комбинированное применение ΌΗΕΆ и аколбифена уже предлагалось в качестве благотворного химиопрофилактического и терапевтического подхода при раке молочной железы (ЬаЬпе, 2001, КеГ Суп ОЬк!е!, 8: 317-322). Действительно, ингибирующее действие ΌΗΕΆ на развитие ксенотрансплантатов рака молочной железы человека у голых мышей способствует его применению в качестве гормональной заместительной терапии (Οηιινοίκ е! а1., 1991, Сапсег Кек, 51: 3131-3135; СоиШатб е! а1., 1998, 1. Иа!1. Сапсег. 1пк!., 90: 772-778).

В \УО 99/63974 раскрыто медицинское применение селективного модулятора эстрогеновых рецепторов в сочетании с предшественниками половых стероидов.

Сущность изобретения

Соответственно целью настоящего изобретения является обеспечение эффективных способов лечения вагинальных проблем, в частности сухости влагалища, диспареунии и половой дисфункции, которые могут приводить к уменьшению полового влечения и активности, при минимализации нежелательных побочных эффектов.

Другой целью является обеспечение способов уменьшения риска возникновения вышеуказанных проблем.

В одном воплощении изобретение касается способа лечения или уменьшения риска возникновения сухости влагалища, включающего повышение уровня предшественников половых стероидов, выбранных из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона (ΟΗΕΆ), сульфата дегидроэпиандростерона (ΌΗΕΑ-8) и андрост-5-ен-3в,17в-диола (5-диола), у субъектов или пациентов, нуждающихся в таком лечении или таком предшественнике стероидов, а также включающего введение таким пациентам терапевтически эффективного количества селективного модулятора эстрогеновых рецепторов (8ЕКМ) в составе комбинированной терапии.

В другом воплощении изобретение включает дополнительное введение эстрогенов для противодействия эффектам 8ЕКМ на приливы и другие симптомы менопаузы.

В следующем воплощении изобретение включает дополнительное введение ингибитора цГМФфосфодиэстераз 5 типа или простагландина Е1 для улучшения половой активности.

В настоящем изобретении селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (8ЕКМ) представляет собой соединение, которое прямо или через его активный метаболит функционирует в качестве антагониста эстрогеновых рецепторов (антиэстрогена) в ткани молочной железы, но оказывает эстрогенное или эстрогеноподобное действие на костную ткань и на уровень холестерина в сыворотке (т. е. снижает холестерин в сыворотке крови). Нестероидные соединения, функционирующие в качестве антагонистов эстрогеновых рецепторов ш νίίτο либо в ткани молочной железы человека или крыс (в особенности если соединение действует как антиэстроген на раковые клетки молочной железы человека), вероятно, будут функционировать в качестве 8ЕКМ. Напротив, стероидные антиэстрогены вряд ли будут функционировать в качестве 8ЕКМ, так как они обычно не проявляют каких-либо благоприятных эффектов на холестерин в сыворотке крови. Нестероидные антиэстрогены, проверенные нами и функционирующие в качестве 8ЕКМ, включают ЕМ-800, ЕМ-01538, ралоксифен, тамоксифен, дролоксифен, торемифен, идоксифен, Т8Е-424, ЕКА-923, лазоксифен (СР 336156), арзоксифен (ЬУ 353381) и СХУ-5638. Мы проверили стероидный антиэстроген 1С1 182780 и нашли, что он не функционирует в качестве 8ЕКМ. В соответствии с изобретением 8ЕКМ можно вводить при той же дозировке, которая известна в этой области при применении этих соединений в качестве антиэстрогенов.

- 2 014878

Не намереваясь ограничиваться теорией, соединения 8ЕКМ, многие из которых предпочтительно имеют два ароматических кольца, соединенных одним или двумя атомами углерода, как полагают, должны взаимодействовать с эстрогеновым рецептором через вышеприведенную часть молекулы, которая лучше всего распознается рецептором. Предпочтительные соединения 8ЕКМ имеют такие боковые цепи, которые могут придавать им свойства селективных антагонистов в ткани молочной железы, не обладающих заметными свойствами антагонистов в других тканях. Таким образом, соединения 8ЕКМ могут легко функционировать как антиэстрогены в ткани молочной железы и в то же время неожиданно и легко функционировать как эстрогены в костной ткани или оказывать эстрогеноподобное действие на компоненты крови (где они благоприятно влияют на концентрации липидов и/или холестерина). Благоприятный эффект на холестерин и/или липиды может вылиться в благоприятный эффект против атеросклероза, на который, как известно, отрицательно влияют аномальные уровни холестерина и липидов.

В следующем воплощении изобретение включает способ, фармацевтическую композицию и набор, в которых селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу со следующими особенностями:

а) два ароматических кольца разделены 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца не замещены или замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

б) боковая цепь, обладающая ароматическим кольцом и функциональной группой третичного амина или его соли.

Предпочтительно боковая цепь выбрана из группы, состоящей из

Предпочтительно также, что эти два ароматических кольца оба представляют собой фенил, а боковая цепь обладает группировкой, выбранной из группы, состоящей из метина, -СО, -О- и -8, ароматического кольца и функциональной группы третичного амина или его соли.

В следующем воплощении селективный модулятор эстрогеновых рецепторов выбран из группы, состоящей из производных бензотиофена, производных трифенилэтилена, производных индола, производных бензопирана, 5,6,7,8-тетрагидронафталина и производных центхромана.

В одном воплощении предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой производное соединение бензотиофена следующей формулы:

где К₁ и К₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

В₃ и К₄ либо независимо выбраны из группы, состоящей из С₁-С₄-алкила, либо К₃, Кд и атом азота, с которым они связаны, вместе представляют собой любую структуру, выбранную из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино и морфолино;

А выбран из группы, состоящей из -СО-, -СНОН и -СН₂-;

В выбран из группы, состоящей из фенилена, пиридинилена и -цикло-С₄Н₂Н₂-.

Предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов выбран из группы, состоящей из ралоксифена, арзоксифена (ЬУ 353381) и ЬУ 335563.

В другом воплощении предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой производное соединение трифенилэтилена следующей формулы:

- 3 014878

где Ό означает -ОСН₂СН₂Х(В₃)В₄ или -СН=СН-СООН (В₃ и В₄ либо независимо выбраны из группы, состоящей из С1-С₄-алкила, либо Р₃. В₄ и атом азота, с которым они связаны, вместе представляют собой кольцевую структуру, выбранную из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино и морфолино);

Е и К независимо означают водород или гидроксил;

означает водород или галоген.

Предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой тамоксифен, ОН-тамоксифен, дролоксифен, торемифен, иодоксифен или 6^-5638.

В следующем воплощении предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой производное соединение индола следующей формулы:

где Ό выбран из группы, состоящей из -ОСН₂СН₂М(В₇)В₈, -СН=СН-СО-П(К.₇)В₈, -СС-(СН₂)_П-Ы(К₇)В₈ (В₇ и В₈ либо независимо выбраны из группы, состоящей из С₁-С₄-алкила, либо В₇, В₈ и атом азота, с которым они связаны, вместе представляют собой кольцевую структуру, выбранную из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино, кольца);

X выбран из группы, состоящей из водорода и С₁-С₆-алкила;

В₁, В₂, В₃, В₄, В₅ и К,₆ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила, С₁-С₆алкила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил.

Предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой Т8Е-424 или ЕВА-923.

В следующем воплощении предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов представляет собой соединение следующей формулы:

где № и В₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

В₅ и В₆ независимо означают водород или С₁-С₆-алкил;

Ό означает -ОСН₂СН₂Х(К.₃)В₄ (В₃ и либо независимо выбраны из группы, состоящей из С1-С4алкила, либо В₃, и атом азота, с которым они связаны, вместе представляют собой кольцевую структуру, выбранную из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино);

X выбран из группы, состоящей из -О- и СН^- ₂.

Предпочтительно соединение выбрано из группы, состоящей из О-(-)-тартратной соли (-)-цис(5В,68)-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола (лазофоксифена) и 3,4-транс-2,2-диметил-3-фенил-4-[4-(2-(2-(пирролидин-1 -илэтокси)))фенил]-7-метоксихромана.

В следующем воплощении предпочтительно селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет следующую формулу:

- 4 014878

где Κι и Κ₂ независимо означают водород, гидроксил или группировку, превращающуюся ίη νίνο в гидроксил;

Ζ означает двухвалентную замыкающую группировку, а предпочтительно Ζ выбран из группы, состоящей из -О-, -ΝΗ-, -8- и -СН^- ₂;

Κ₁₀₀ означает двухвалентную группировку, отделяющую Ь от кольца В на 4-10 промежуточных атомов;

Ь означает двухвалентную или трехвалентную полярную группировку, выбранную из группы, состоящей из -80-, -0ΘΝ-, -Ν< и -8ΟΝ<;

6₁ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей С₂ и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

6₂ либо отсутствует, либо выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей С| и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

С₃ выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

В частности, предпочтительны производные бензопирана следующей общей формулы:

где Ό означает -Ο0Ή₂0Ή₂Ν(Κ₃)Κ₄ (Κ₃ и Κ₄ либо независимо выбраны из группы, состоящей из С₁С₄-алкила, либо Κ₃, Κ₄ и атом азота, с которым они связаны, вместе представляют собой кольцевую структуру, выбранную из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино, кольца);

К_| и К₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил.

Кроме того, предпочтительно производные бензопирана являются оптически активными соединениями, имеющими абсолютную конфигурацию 8 по углероду 2, либо их фармацевтически приемлемыми солями, при этом данные соединения имеют такую молекулярную структуру

5'

5* где К_| и К₂ независимо выбраны из группы, состоящей из гидроксила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

Κ³ означает разновидность, выбранную из группы, состоящей из насыщенного, ненасыщенного или замещенного пирролидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидино, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного морфолино, азотсодержащей циклической группировки, азотсодержащей полициклической группировки и ΝΚ₃Κ^ (К_а и Κ.Η независимо означают водород, линейный или разветвленный С₁-С_б-алкил, линейный или разветвленный С₂-С_б-алкенил либо линейный или разветвленный С₂-С_б-алкинил).

В одном воплощении производное бензопирана представляет собой соль кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, адипиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, йодисто-водородной

- 5 014878 кислоты, бромисто-водородной кислоты, соляной кислоты, гидрохлоротиазидной кислоты, гидроксинафталиновой кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфоновой кислоты, метилсерной кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты, азотной кислоты, пальмитиновой кислоты, пивалиновой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, терефталевой кислоты, η-толуолсульфоновой кислоты и валериановой кислоты.

Предпочтительными селективными модуляторами эстрогеновых рецепторов являются аколбифен

ралоксифен, арзоксифен, тамоксифен, дролоксифен, торемифен, иодоксифен, С^-5638, Т8Е-424, ЕКА-923 и лазофоксифен.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено деление влагалища крыс вдоль продольной оси на 7 поперечных сегментов, от наружного отверстия (ойшт) (сегмент 1) до уровня шейки матки (сегмент 7) (ροτίίο уадша115 и1еп).

На фиг. 2 представлена гистоморфология вагинального эпителия 5-го сегмента в девяти группах крыс. Шкала в 1 - 40 мкм.

(A) Как пример эстрогенного эффекта, многослойный чешуйчатый эпителий крыс в период течки состоит из 4 основных слоев: одного слоя клеток ЧгаШт Ьа§а1е (Ь), 6-7 слоев клеток 81та1ит кртокит (§) и 81га1ит дгапи1а1ит из 5-6 слоев (д), покрытых сверху 81та1ит согпеит (с), состоящим из плотно упакованных уплощенных ороговелых клеток.

(B) Для иллюстрации ослизнения использовали крыс в период предтечки, находящихся под воздействием эстрогенов-прогестагенов. В большинстве сегментов 2-7 один базальный слой клеток (Ь) покрыт 5-6 слоями клеток ЧгаШт вршокит (§) и слоем ослизнения (т), состоящим из 3-4 слоев слизистых клеток.

(C) В контрольной группе ОУХ базальный слой клеток (Ь) покрыт слоем атрофических кубических клеток (а).

(Ό) Вагинальный эпителий крыс ОУХ, получавших ежедневно пероральную дозу аколбифена (2,5 мг/кг), проявляет атрофию, но при этом наружный слой низких столбчатых слизистых клеток (т) покрывает базальный слой клеток (Ь).

(Е) Вагинальный эпителий крыс ОУХ, получавших ежедневно пероральную дозу премарина (0,5 мг/кг). Вызванная ОУХ атрофия сменилась эстрогенным профилем, сравнимым с профилем в период течки.

(Е) У животных ОУХ, получавших премарин+аколбифен, преобладает атрофия с морфологией, похожей на морфологию получавших аколбифен крыс, хотя и наблюдаются более крупные слизистые клетки.

(С) После применения ОУХ у животных, которым раз в день на кожу спины наносили ΌΗΕΑ (80 мг/кг) на участок в 2x2 см, наблюдался гипертрофический эпителий, состоящий из 3-5 слоев слизистых клеток (т) поверх базального слоя (Ь). Стрелками отмечены некоторые инвагинации (впячивания), характерные для этого эпителия.

(H) На большей части вагинального эпителия у животных, получавших ΌΗΕΑ+аколбифен, на базальном слое (Ь) остался один слой слизистых клеток (т), тогда как в некоторых участках есть несколько слоев слизистых клеток поверх базального слоя (Ь).

(I) Применение ΌΗΕΑ+премарина привело к образованию смешанного эпителия, состоящего из 3-7 слоев клеток многослойного чешуйчатого эпителия (§), покрытых 3-5 слоями слизистых клеток (т) у 3 животных. У 2 животных участки многослойного чешуйчатого эпителия преобладали (вставка). Шкала на вставке - 30 мкм.

(1) При комбинированном применении ΌΗΕΑ, премарина и аколбифена эпителий имел такой же вид, как в группе ΌΗΕΑ+аколбифен.

На фиг. 3 представлена слизистая влагалища у животных ОУХ, при этом на (А) видны сильные воспалительные изменения, характеризующиеся очагами инфильтрации лейкоцитов с микроабсцессом (М) внутри эпителия, а на (В) видны очаги эрозии (Е), характеризующиеся уменьшением толщины эпителия и изъязвлением (И), которое проявляется как полное исчезновение эпителия.

На фиг. 4 представлено сравнение соответствующих групп для иллюстрации эстрогеноподобного эффекта аколбифена на вагинальный эпителий, окаймляющий сегмент 1 (наружное отверстие). У интактных крыс в период течки (А) и у животных, получавших премарин (Ό), эпителий состоит из 10-15 слоев и он является ороговевшим. У контролей ОУХ (В) толщина эпителия уменьшилась до 4-6 слоев и он, как правило, не ороговевший (см. отсутствие ЧгаШт дгапи1о8ит), тогда как у получавших

- 6 014878 аколбифен животных (С) толщина вернулась до 9-11 слоев и он подвергся ороговению.

На фиг. 5 представлена толщина (мкм) трех разных отделов влагалища на уровне 5 сегмента влагалища крыс: а) эпителий, Ь) 1ат1па ргорпа, с) тшсЫагЦ и б) общая толщина после 36-недельной обработки животных ΟVX с помощью ЭНЕЛ, премарина и аколбифена, поодиночке или в комбинации. Интактные животные в период течки и предтечки добавлены в качестве абсолютного контроля. Группы, имеющие одинаковые буквенные обозначения, не проявляют статистических отличий на уровне р<0,05.

На фиг. 6 для иллюстрации представлена плотность волокон коллагена 1ат1па ргорпа в 5 сегменте как низкая (А), средняя (В) или высокая (С).

На фиг. 7 представлены микрофотографии трех отделов влагалища: (Е) эпителий, (Ь) 1атша ргорпа и (М) ти5си1аг15 на уровне 5 сегмента влагалища крыс с упором на относительную толщину ти5си1аг15 в различных группах. Полосками показано деление стенки влагалища на 3 слоя для лучшей оценки распределения толщины между разными группами. А) интактные, В) ΟνΧ, а также ΟνΧ, получавшие С) аколбифен, Э) премарин, Е) премарин+аколбифен, Е) ЭНЕЛ. С) ОНЕЛ+аколбифен. Н) ОНЕЛ+премарин. I) ОНЕЛ+премарин+аколбифен.

На фиг. 8 представлен вес влагалища, измеренный через 36 недель после ОУХ и обработки животных ΟνΧ с помощью аколбифена, премарина и ЭНЕЛ поодиночке или в комбинации.

На фиг. 9 представлена иммуногистохимическая локализация АК, ЕКа и РК в (Е) эпителии, (Ь) 1ат1па ргорпа и (М) ти5си1аг15 на уровне 5 сегмента влагалища в различных группах. Полосками показано деление влагалища на 3 отдела.

На фиг. 10 и 11 представлено сравнение между различными соединениями 8ЕКМ: морфология вагинального эпителия у крыс.

На фиг. 12 представлен снимок препарата для микроскопии, показывающий положение 8 сегментов влагалища (весь верхний ряд и один срез в правом нижнем углу), за которыми следуют 4 сегмента матки (1 сегмент шейки матки и 3 сегмента двух рогов матки - 2 среза на один рог) в той последовательности, которая соответствует их первоначальному анатомическому положению. Сегмент 8 включает боковые складки влагалища по соседству с началом шейки матки.

На фиг. 13 представлен эффект интактных крыс. В период течки (слева) вагинальный эпителий состоит из 12-18 слоев клеток в 4 сегменте и 12-15 слоев в 6 сегменте.

В разгар течки (справа) вагинальный эпителий проявляет 6-10 слоев клеток в 4 сегменте и 5-7 слоев в 6 сегменте.

На фиг. 14 представлен эффект овариэктомии крыс без обработки. В 4 сегменте влагалище окаймлено многослойным чешуйчатым эпителием из 2-6 слоев клеток. В 6 сегменте наблюдается полная атрофия с 2-3 слоями плоских клеток. По всему влагалищу отмечаются редкие очаги небольших цилиндрических слизистых клеток.

На фиг. 15 представлен эффект плацебо в свечах. По сравнению с группой ΟνΧ без обработки многослойный чешуйчатый эпителий влагалища в группе плацебо был немного толще, при этом 4 сегмент проявлял 4-8 слоев клеток. В 6 сегменте наблюдалась такая же морфология, как и в группе ΟνΧ без обработки, с 2-3 слоями эпителиальных клеток. По всему влагалищу отмечались очаги небольших цилиндрических слизистых клеток, немного больше, чем у животных ΟνΧ без обработки.

На фиг. 16 представлен эффект 0,33 мг ЭНЕЛ на свечу. В 4 сегменте вагинальный эпителий многослойный чешуйчатый с 3-7 слоями клеток. Около 20-60% выстилки влагалища состоит из хорошо выровненных слизистых клеток, перемещающихся с 15-50% гипертрофических слизистых клеток, поверх одного или нескольких слоев многослойного чешуйчатого эпителия с неослизненными участками. В 6 сегменте толщина эпителия уменьшилась почти до той же толщины, что и у животных ΟνΧ без обработки: 2-5 слоев клеток, покрытых цилиндрическими слизистыми клетками. Наблюдалась большая вариабельность в содержании слизистых клеток: они занимали от 5 до 75% поверхности влагалища, чередуясь с неослизненными участками.

На фиг. 17 представлен эффект 0,66 мг ЭНЕЛ на свечу. В 4 сегменте многослойный чешуйчатый эпителий состоит из 3-6 слоев клеток. Около 5-20% выстилки влагалища состоит из хорошо пригнанных слизистых клеток, перемежающихся с 10-75%) гипертрофических слизистых клеток, поверх одного или нескольких слоев многослойного чешуйчатого эпителия. Также есть и неослизненные участки эпителия. В 6 сегменте толщина эпителия уменьшилась и он состоит из 2-4 слоев клеток многослойного чешуйчатого эпителия, покрытых слоем хорошо пригнанных слизистых клеток. Ослизненные участки варьировали от 20 до 80% поверхности влагалища, чередуясь с неослизненными участками.

На фиг. 18 представлен эффект 1 мг ЭНЕЛ на свечу. В 4 сегменте многослойный чешуйчатый эпителий проявляет 3-9 слоев клеток. Гипертрофические слизистые клетки, лежащие поверх 3-4 слоев чешуйчатых клеток, охватывают 50-70% поверхности влагалища, тогда как хорошо пригнанные слизистые клетки выстилают 5-30% поверхности влагалища. Неослизненные участки чередуются со слизистыми клетками. В 6 сегменте толщина эпителия тоже уменьшилась и он состоит из 2-4 слоев клеток. Гипертрофические слизистые клетки, лежащие поверх 1-3 слоев чешуйчатых клеток, занимают 30-100% поверхности влагалища, тогда как хорошо пригнанные слизистые клетки занимают 0-70%. Также наблюдаются отдельные разбросанные неослизненные участки.

- 7 014878

На фиг. 19 представлен график, отображающий влияние на вес тела 14-дневной обработки ΌΗΕΑ (свечи) при интравагинальном применении у крыс ОУХ. По сравнению с группой плацебо в группах, получавших ΌΗΕΑ в дозах 0,33 мг и 0,66 мг, вес тела слегка уменьшался, причем уменьшение было еще более выраженным в группе 1 мг.

На фиг. 20 представлен график, отображающий концентрацию ΌΗΕΆ в сыворотке после интравагинального применения 0,33 мг, 0,66 мг или 1 мг у крыс ОУХ. Значения площади под кривой (ЛИС) через 7 ч после применения ΌΗΕΆ составили 32±4, 50±7 и 131±23 нг-ч/мл при введении ΌΗΕΆ в дозах 0,33, 0,66 или 1 мг соответственно.

Осуществление изобретения

После прекращения секреции эстрогенов яичниками при менопаузе практически все андрогены и эстрогены синтезируются в периферических тканях-мишенях по интракринным механизмам из дегидроэпиандростерона (ΌΗΕΆ), происходящего из надпочечников. В самом деле, в отсутствие яичниковых эстрогенов постепенное снижение ΌΗΕΆ в сыворотке, вероятно, играет важную роль в сухости влагалища, воспалении, диспареунии и половой дисфункции, которые часто связаны с менопаузой. Для того чтобы оценить специфические эстрогенные и/или андрогенные эффекты возможной новой гормональной заместительной терапии, которая могла бы, среди прочих благотворных эффектов, ослабить сухость влагалища, мы исследовали морфологию влагалища крыс через 8 месяцев после овариэктомии (ОУХ) и обработки животных ОУХ с помощью ΌΗΕΆ, конъюгированных эстрогенов (премарина) и селективного модулятора эстрогеновых рецепторов аколбифена при их введении поодиночке или в сочетании. У интактных животных в период течки и у крыс ОУХ, получавших премарин, типичной характеристикой эстрогенного влагалища является ороговевший многослойный чешуйчатый эпителий. ОУХ приводила к общей атрофии, связанной с воспалительными изменениями, тогда как аколбифен снижал частоту воспаления и повышал количество и размер слизистых клеток в вагинальном эпителии. В используемых дозах премарин полностью устранял вызванную ОУХ атрофию эпителия, тогда как ΌΗΕΆ устранял атрофию частично. Действительно, вагинальный эпителий у животных ОУХ, получавших ΌΗΕΆ, подвергался гиперплазии с 3-5 слоями столбчатых слизистых и бокаловидных клеток, что типично для андрогенного действия. Добавление премарина к ΌΗΕΆ вело к образованию более плотного эпителия, чем у интактных животных. Более того, возрастала плотность волокон коллагена в 1атша ргорпа под действием ΌΗΕΆ. С другой стороны, при обработке одним аколбифеном проявлялась тенденция к повышению плотности 1ат1па ргорпа, которая достигала контрольных значений при комбинировании с ΌΗΕΆ.

После ОУХ мышечный слой влагалища уменьшался на 46%, и этот эффект обращался на 41% и 100% под действием ΌΗΕΆ и премарина соответственно. С другой стороны, уменьшение на 50% общей толщины стенки влагалища после ОУХ обращалось на 42 и 93% под действием ΌΗΕΆ и премарина соответственно, тогда как комбинация ΌΗΕΆ и аколбифена возвращала общую толщину стенки влагалища к такому значению, которое не отличалось статистически от интактных контрольных животных.

Иммуногистохимия выявила сильное мечение андрогеновых рецепторов (ЛК) во всех группах, получавших ΌΗΕΆ. С другой стороны, мечение эстрогеновых рецепторов альфа (ΕΚα) и прогестероновых рецепторов (РК) не обнаруживалось ни в одной из получавших аколбифен групп.

В итоге обработка с помощью ΌΗΕΆ или комбинации ΌΗΕΆ и аколбифена частично или полностью предотвращает вызванные ОУХ атрофические изменения, наблюдаемые в различных слоях стенки влагалища, через преобладающее андрогенное действие, о чем свидетельствует ослизнение эпителия и повышающая регуляция АК Представленные данные также демонстрируют особенно интересные эффекты ΌΗΕΑ на три слоя стенки влагалища, а именно сильное ослизнение эпителия, увеличение плотности волокон коллагена в 1атша ргорпа, а также повышение толщины слоя ти8си1аг18. Таким образом, ΌΗΕΑ оказывает и андрогенные, и эстрогенные эффекты на слизистую влагалища, тем самым обеспечивая более физиологичную заместительную терапию. Поскольку каждое из исследованных соединений обладает потенциально благотворными эффектами на функции влагалища, ΌΗΕΑ сам по себе или в сочетании мог бы весьма оптимально устранять вагинальную сухость и восстанавливать общую физиологию влагалища и способствовать коррекции половой дисфункции в связи с менопаузой. ΌΗΕΑ и другие компоненты могут применяться местным или системным образом.

Селективный модулятор эстрогеновых рецепторов по изобретению имеет молекулярную формулу со следующими особенностями: а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη νίνο в гидроксил; и б) боковой цепью, обладающей ароматическим кольцом и функциональной группой третичного амина или его соли.

Одним из предпочтительных 8ΕΚΜ по изобретению является ЕМ-800, приведенный в РСТ/СА96/00097 (АО 96/26201). Молекулярная структура ЕМ-800 такова

- 8 014878

Другим предпочтительным 8ЕВМ по изобретению является аколбифен (ЕМ-1538, также называе-

который представляет собой солянокислую соль сильного антиэстрогена ЕМ-652. По сравнению с ЕМ-800 соль ЕМ-1538 безопаснее, проще и легче синтезировать. При введении ЕМ-800 или ЕМ-1538, как полагают, возникает одно и то же соединение ίη νίνο.

Другим предпочтительным 8ЕВМ является лазоксифен (СР-336156; О-(-)-тартратная соль (-)-цис(5В,68)-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола) (доступен от РПхег 1пс., США).

К другим предпочтительным 8ЕВМ по изобретению относятся тамоксифен ((2)-2-[4-(1,2-дифенил1-бутенил)]-Н,Ы-диметилэтанамин) (доступен от 2епеса, ИК), торемифен (доступен от Огюп-Рагток Рйагтасеийса, Финляндия, или 8сйегтд-Р1оидй), дролоксифен и ралоксифен (Ей ЬШу апб Со., США), оспемифен (РС 1271) (доступен от Огюп-Рагток Рйагтасеийса, Финляндия), иодоксифен (8тййК1те Веесйат, США), левормелоксифен (3,4-транс-2,2-диметил-3-фенил-4-[4-(2-(2-(пирролидин-1ил)этокси))фенил]-7-метоксихроман) (Nονο Иогбщк А/8, Дания), который раскрыт в 81ιη1ιηί е! а1. АО 97/25034, АО 97/25035, АО 97/25037, АО 97/25038; и Когадаагб е! а1. АО 97/25036, СА-5638 (описан в АПюп е! а1., 1997, Епбосгшок, 138(9): 3901-3911), 8ЕВМ 3339, разрабатываемый фирмой АтепЕх (Франция), производные индола (раскрытые в М111ег е! а1. ЕР 0802183А1), а также Т8Е-424 и ЕВА-923, разработанные фирмой Ауе111 Ауега (США) и раскрытые в 1Р 10036347 (Атепсап йоте ргобисй согрога1юп), и нестероидные производные эстрогенов, описанные в АО 97/32837.

Можно использовать любые 8ЕВМ, как потребуется для эффективности, согласно рекомендациям производителя. Надлежащие дозировки известны в этой области. Можно использовать согласно изобретению любые другие нестероидные антиэстрогены, которые коммерчески доступны. Можно использовать любые соединения, обладающие близкой к 8ЕВМ активностью (пример ралоксифен).

В соответствии с изобретением соединения 8ЕВМ предпочтительно применяются в дозовом интервале от 0,01 до 10 мг/кг веса тела в день (предпочтительно от 0,05 до 1,0 мг/кг), предпочтительно 10 мг в день, особенно 20 мг в день, разделенных на две равные дозы, для субъекта со средним весом тела при пероральном введении, или в дозовом интервале от 0,003 до 3,0 мг/кг веса тела в день (предпочтительно от 0,015 до 0,3 мг/кг), предпочтительно 1,5 мг в день, особенно 3,0 мг в день, разделенных на две равные дозы, для субъекта со средним весом тела при парентеральном введении (т.е. внутримышечно, подкожно или через кожу). Предпочтительно соединения 8ЕВМ вводятся вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, как описано ниже.

Предпочтительным типом ингибитора цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа является силденафил, выпускаемый под коммерческим названием У1адга фирмой РПхег в США, тадалафил, выпускаемый под коммерческим названием СлаНА фирмой Е11 Ы11у в США, варденафил, выпускаемый под коммерческим названием Ьетйга фирмой Вауег (Германия). Также предпочтительны и те ингибиторы цГМФфосфодиэстераз 5 типа, которые находятся в процессе разработки: ΩΛ-8Ε59 фирмы Эопд-А Рйагт Тесй (Южная Корея), ЕМВ-62203 фирмы Мегск (Германия), ТА-1790 фирмы ТапаЬе 8е1уаки (Япония), 8СН446132 фирмы 8с11еп1щ-Р1оид11 (США) и ИК-371800 фирмы РПхег (США).

Одним из предпочтительных простагландинов является алпростадил, выпускаемый под коммерческим названием А1ргох-ТО фирмой ИехМеб (США).

В отношении всех дозировок, рекомендуемых в настоящем изобретении, лечащий врач должен отслеживать реакцию индивидуального пациента и соответственно корректировать дозировку.

Примеры

Пример 1.

Материалы и методы.

Животные и обработки.

Использовали самок крыс 8ргадие-ОаМеу (Сг1:СО®(8О)Вг УАР/Р1и8™) (Сйаг1е8 КАег ЬаЬогаЮгу, 81. Соп81ап1, Канада) 10-12-недельного возраста весом примерно 220-270 г в начале эксперимента. Жи

- 9 014878 вотных подвергали акклиматизации к условиям содержания (температура 22±3°С, влажность 50±20%, освещение 12 ч света/12 ч темноты, освещение включали в 7:15) в течение как минимум одной недели перед началом эксперимента. Животных содержали поодиночке и предоставляли им свободный доступ к воде и корму для грызунов (ЬаЬ ΩίοΙ 5002, Как1оп Ригша, 81. Ьош8, МО). Эксперимент проводили в соответствии с Директивой ССАС по содержанию и использованию экспериментальных животных, в виварии, одобренном Канадским советом по содержанию животных (ССАС) и Ассоциацией по оценке и аккредитованию содержания лабораторных животных (АААЬАС).

Всех 126 самок крыс разбивали случайным образом на 9 групп по 14 животных следующим образом: 1) интактный контроль; 2) овариэктомированный контроль (ОУХ); 3) ОУХ+аколбифен (2,5 мг/кг); 4) ОУХ+премарин (0,5 мг/кг); 5) ОУХ+премарин+аколбифен; 6) ОУХ+ЭНЕА (80 мг/кг);

7) ОУХ+ИНЕА+аколбифен; 8) ОУХ+ИНЕА+премарин; 9) ОУХ+ИНЕА+аколбифен+премарин. В первый день опытов животных во всех группах (кроме первой) подвергали двусторонней овариэктомии (ОУХ) под изофлурановым наркозом. Премарин и аколбифен вводили внутрь гаважем (0,5 мл на крысу) в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе, тогда как ЭНЕА в смеси 50% этанол-50% пропиленгликоль (0,5 мл на крысу) наносили локально на выбритый участок кожи спины 2x2 см. Выбранная дозировка для премарина соответствует минимальной дозе, достаточной для устранения вызванной ОУХ атрофии матки, тогда как аколбифен вводили в достаточной дозе, вызывающей атрофию матки наподобие ОУХ после его введения получавшим премарин животным ОУХ. Используемая доза ИНЕА создавала уровень ИНЕА в крови 70-100 нмоль/л. Обработки начинали на 2-й день опыта, а соединения вводили один раз в день на протяжении 36 недель. Животные в группах интактного контроля и контроля на ОУХ получали только носитель.

Через 24 ч после введения последней дозы голодавших всю ночь животных забивали под изофлурановым наркозом путем кровопускания из брюшной аорты (по 9 животных на группу) или с помощью перфузии сердца 10% формалином в нейтральном буфере (по 5 животных на группу). У животных, не подвергавшихся перфузии, выделяли влагалища и взвешивали, тогда как у подвергавшихся перфузии животных влагалища маркировали черной краской с брюшной стороны, а затем обрабатывали, как описано ниже.

Гистологические процедуры.

У каждого подвергавшегося перфузии животного целое влагалище фиксировали 10% формалином в нейтральном буфере. Затем каждое влагалище разделяли на семь равных поперечных сегментов, как показано на фиг. 1, подвергали стандартной обработке и все вместе заключали в один блок парафина. В пределах блока парафина семь цилиндрических сегментов влагалища располагали в той последовательности, которая соответствует их исходному анатомическому положению, и ориентировали перпендикулярно поверхности блока, что позволяло делать поперечные срезы сегментов. Для каждого животного делали срез в парафине толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином-эозином для морфологического исследования.

Гистоморфометрия.

Измерения различных слоев влагалища проводили на 5-м сегменте (фиг. 1), который находится примерно посередине между срединным участком и рогйо тадшаНх и1еп (сегмент 7). Этот 5-й сегмент, как оказалось, имеет репрезентативную поверхность эпителия и достаточную толщину гладких мышц. Снимки делали с помощью аппарата для цветной съемки ИС-330 3ССИ (Эаде-МТк М1сЫдап Сйу, ΙΝ, США) и подвергали оцифровке с помощью программы Ийаде-Рго Р1и§ 3.0 (МеШа СуЬегпеПск, 8Итег 8ргтд, МИ, США). Так, с помощью объектива х5 (Ьека Мкгокуйешк, \УП1о\\'ба1е. Оп1., Канада) делали 3-4 измерения толщины на один слой из репрезентативных участков эпителия и слоя ти8си1ап8, а также всех трех слоев влагалища вместе. Таким образом, измеряли общую толщину влагалища, толщину эпителия и толщину слоя тиксШапк. Толщину 1атта ргорпа получали, вычитая толщину эпителия и слоя ти8си1ап8 из общей толщины влагалища.

Иммуногистохимия.

Иммуноокрашивание проводили с помощью наборов ХутеД 8Р (8ап Егапсщсо, СА). Парафиновые срезы (4 мкм) очищали от парафина толуеном и регидрировали через этанол. Эндогенную пероксидазную активность оценивали при преинкубации с 3% Н₂О₂ в метаноле в течение 30 мин. Использовали методику микроволнового восстановления в цитратном буфере (Тасйа апб Сйеп, 1994). После охлаждения препаратов блокировали неспецифическое связывание с помощью 20% козьей сыворотки в течение 20 мин. Затем инкубировали срезы 1,5 ч при комнатной температуре с антителами к ЕКа (АВ-1, Са1Ьюсйет, СаИГогп1а), АК (N-20, 8ап1а Сгих Вю1есйпо1оду, СайГогта) или РК (АЬ-4, №оМагкега, СайГогша) при разведении 1:200, 1:250 и 1:250 соответственно. После отмывки буфером РВ8 срезы инкубировали с биотинилированным вторичным антителом против кролика в течение 10 мин, а затем со стрептавидинпероксидазой в течение еще 10 мин. В качестве хромогена использовали диаминобензидин для проявления комплекса биотин/стрептавидин-пероксидаза при наблюдении под микроскопом. Контрастирующее окрашивание выполняли с помощью гематоксилина США #2 в течение 30 с. В качестве контроля проводили иммуноабсорбцию избыточным количеством пептида, использовавшегося для получения антител,

- 10 014878 или заменяли их неиммунным 1дС кролика. Полуколичественную оценку количества и интенсивности иммуноокрашивания ядер осуществляли, как указано в табл. 2.

Таблица 1 Гистологическая оценка эпителия, 1атша ргорпа и ти8си1ат18 в семи сегментах влагалища крыс

Группа	Стенка влагал.	Сегмент 1	Сегмент 2	Сегмент 3	Сегмент 4	Сегмент 5	Сегмент 6	Сегмент 7
Интактные	течка	Е Ь м	К8 т-ь 3	К8 1-Ь 3	К8 1-Ь 1	КЗ 1-М М	К.8 М-М т	К8 М-М Т	К8 М-М Т
предтечка	Е Ь м	КЗ Т-М а	М8М- К8 1-М 3	М8М 1-М 1	МЭМ 1-М М	М8М- К8 1-М М	Μ8Μ- К8 М-М т	МЭМКЗ м-м т
ονχ	контроль	Е Ь м	А 1-Н 3	А ι-м 3	А 1-Н ί	А ί-Η 1	А ι-н 1	А М-М 1	А М-Н м
акол- бифен	Е Ь М	КЗ м-м 3	ΚΟΜ- Α 1-М 3	ЗСМА 1-Н 3	8СМ- А 1-Н 3	ΚΟΜ- Α ί-Η ί	ΚΟΜ- Α ί-Η ί	ΚΟΜ- Α М-Н ί
премарин	Е Е М	КЗ м-ь 5	КЗМЭМ 1-М 5	КЗМЭМ ί-Μ ί	К8- М8М М-М М	КЗМЭМ М-М т	К8 М-Н Т	К8 Т-Н Т
премарин + аколбифен	п Ь м	К8 М-М 5	А8СМ 1-М 3	ΚΟΜΑ 1-Н ΐ	ΚΟΜ- Α ί-Η ί	ΚΟΜ- Α М-М ί	ΚΟΜ- Α М-М 1	ΚΟΜΑ М-М м
ННЕА	Е Е М	К8ЬНМ м-н 5	ЬНМ 1-Н 3	ЬНМ 1-Н 5	ЬНМ ί-Η ι	ЬНМ ΐ-Η м	ьнм8СМ М-Н М	ЬНМ8СМ М-Н м
□НЕА + аколбифен	Е Ь М	К8ΙΉΜ8СМ М-М 3	8СМ- ЬНМ ί-Μ 3	8СМЬНМ 1-Н 3	8СМЬНМ ΐ-Η ι	8СМЬНМ М-Н 1	8СМЬНМ М-Н м	ьнм- 8СМ М-Н м
ПНЕ А + премарин	Е Ь М	К8 М-М 3	МЭМКЗ 1-Ъ 3	М8МК8 1-М 1	МЭМКЗ ί-Μ Μ	МЭМКЗ м-н т	К8 М-М т	К8 М-Н т
ОНГА + премарин + аколбифен	Е Ь М	К8 М-М 3	8СМЬНМ- К8 М-Н 3	8СМЬНМ 1-Н 3	8СМьнм м-н ι	8СМЬНМ 1-н м	8СМЬНМ М-Н м	ьнм- КСМ М-М м

Е - морфология эпителия: К8 - ороговевший многослойный чешуйчатый, ЬНМ - крупные гипертрофированные слизистые клетки, 8 СМ - мелкие пригнанные столбчатые или кубические слизистые клетки, М8М - смешанный многослойный чешуйчатый, покрытый слизистыми клетками, А - атрофия: мелкие кубические клетки.

Два различных обозначения для данного сегмента означают два разных профиля и то, что преобладает первый.

Ь - толщина 1ат1па ргорпа: Т - толстая, МТ - умеренно толстая, I - тонкая; плотность волокон коллагена: Н - высокая, М - средняя, Ь - низкая.

М - толщина слоя ти8си1ат18: Т - толстый, МТ - умеренно толстый, I - тонкий, 8 - редкий.

- 11 014878

Таблица 2 Полуколичественная оценка количества и интенсивности иммуноокрашивания ядер на АК, ΕΚα и РК в эпителии, 1атша ргорпа и ти8си1ап8 5-го сегмента влагалища крыс

Рецептор половых стероидов —►	АК	ΕΚα	РК
Стенка влагалища —»	Е	ь	м	Е	ь	м	Е	ь	м
	Группа
Ин-	эструс (течка):	2	2	1	1	1	3	2	3	3
тактные	мало ΕΚα, много РК	++	+++	+	+	+	+	+++	+++	+++
	диэструс: много ΕΚα, мало РК	3 +++	3 +++	3 Ч-++	3 +++	++	1 +	0	2 ++	2 -Н-
ονχ	контроль	+4-	+++	1 4-Н-	2 4-+	+++	1 +++	0	0	0
	аколбифен	2 ++	+++	1 +++	0	0	0	0	0	0
	премарин	2 ++	2 +++	+	2 ++	3 4~+	3 ++	2 4-+	2 4-++	3 +++
	премарин + аколбифен	2 -н-	1 +	1 +	0	0	0	0	0	0
	1)1 !ЕА	3 +-н-	3 4-Н-	3 +++	2 ++	2 +++	3 +++	0	0	1 ++
	()11ЕА + аколбифен	3 +4-4-	3 +++	3 +++	0	0	0	0	0	0
	ИНГА + пре-	2	3	3	2	2	3	2	2	3
	марин	+++	+++	+++	+	4-++	+++	++	4-Н-	+++
	ΏΗΕΑ + премарин + аколбифен	3 +++	3 +++	3 +++	0	0	0	0	0	0

Андрогеновый рецептор (АК), эстрогеновый рецептор альфа (ΕΚα), прогестероновый рецептор (РК), эпителий (Е), 1атта ргорпа (Ь), ти8си1аг18 (М).

Цифрами представлена полуколичественная оценка меченых ядер: 0 = нет, 1 = низкая, 2 = средняя, 3 = высокая.

Интенсивность метки указана как низкая: +, средняя: ++, высокая: +++.

Статистический анализ

Данные представлены в виде средних значений ± 8ЕМ из 8-9 животных на группу при определении веса влагалища или 5 животных на группу при определении толщины слоев влагалища. Статистическую значимость определяли с помощью многопредельного критерия Пиисаи-Кгатег (Кгатег, 1956, Вютейгсз, 12: 307-310).

Результаты

Морфология и толщина различных слоев влагалища крыс.

Для того чтобы изучить в точности и подробно три слоя стенки влагалища крыс, а именно эпителий, 1ат1иа ргорпа и ти8си1ап8, сначала исследовали семь сегментов, полученных по продольной оси (фиг. 1). Хотя между группами и наблюдались заметные морфологические отличия, но в общем эти отличия были одинаковы у всех животных одной и той же группы, и сегменты 2, 3, 4, 5, 6 и 7 проявляли похожую морфологию эпителия. Немногие исключения будут отмечены позже. Поэтому для иллюстрации эффекта различных обработок на вагинальный эпителий использовали сегмент 5.

В группе ОУХ отсутствие стимуляции яичников вело к атрофии вагинального эпителия, которой отличались все сегменты (табл. 1 и фиг. 2С), при наличии немногих небольших участков слизистых клеток. Важнее всего то, что часто обнаруживалось воспаление от средней до тяжелой степени, со многими очагами микроабсцессов внутри эпителия (небольших зон скопления лейкоцитов внутри эпителия). Эти изменения часто сопровождались очагами эрозии (зонами, в которых частично исчез слой эпителия) и изъязвления (полного исчезновения слоя эпителия) (фиг. 3).

У животных ОУХ, получавших аколбифен, в сегменте 1 проявлялся ороговевший многослойный чешуйчатый эпителий подобно тому, что в интактной группе, за исключением того, что он включал 9-11 слоев клеток в отличие от 10-15 слоев, отмеченных у животных в период течки или тогда, когда животные ОУХ получали премарин (фиг. 4). Таким образом, толщина эпителия у получавших аколбифен животных в сегменте 1 была выше, чем у крыс ОУХ, у которых он состоял лишь из 4-6 слоев клеток. В остальных сегментах (табл. 1) базальный слой был покрыт слоем низких столбчатых слизистых клеток (фиг. 2Ό), который был развит сильнее, чем у животных ОУХ. В группе ОУХ+аколбифен только три из пяти животных проявляли признаки минимального воспаления, тогда как у всех животных ОУХ обычно встречались воспалительные изменения от средней до тяжелой степени.

Во всех группах в сегменте 1 проявлялся сравнимый многослойный чешуйчатый эпителий, кроме животных группы ОУХ, у которых преобладала атрофия (фиг. 4). Более того, в группах ОУХ+ΌΗΕΑ и ОУХ+аколбифен преобладающий в сегменте 1 многослойный чешуйчатый эпителий сопровождался сли

- 12 014878 зистыми клетками (не показано).

Семь сегментов вагинального эпителия у животных ΟνΧ, получавших ΌΗΕΑ, состояли из крупных многослойных столбчатых слизистых клеток с набухшими цитоплазматическими вакуолями, что является типичным признаком андрогенного эффекта (табл. 1, фиг. 2С). После применения ΌΗΕΑ эпителий отличался несколькими большими инвагинациями (впячиваниями). Близкая морфология эпителия отмечалась во всех сегментах в группе ΟνΧ+ΌΗΕΑ+аколбифен за исключением того, что уменьшался размер слизистых клеток и количество их слоев (табл. 1, фиг. 2Н). У животных, получавших ΌΗΕΑ+премарин, со второго по пятый сегмент наблюдался толстый многослойный эпителий смешанного типа, состоящий из покрытого слоями слизистых клеток чешуйчатого эпителия в различных пропорциях (табл. 1, фиг. 21), что свидетельствует о сочетании эстрогенного и андрогенного эффектов. В этой группе у трех животных проявлялось ослизнение по вышеуказанным сегментам, тогда как у остальных двух животных наблюдался многослойный чешуйчатый эпителий во всех сегментах (табл. 1). При комбинировании премарина с ΌΗΕΑ и аколбифеном эпителий был похож на эпителий в группе ΌΗΕΑ+аколбифен, что указывает на блокирование аколбифеном пролиферации чешуйчатых клеток, вызванной эстрогеном (табл. 1 и фиг. 21).

Введение ΌΗΕΑ животным ΟνΧ повышало толщину вагинального эпителия до 38±4 мкм, тогда как добавление аколбифена к ΌΗΕΑ не изменяло толщину эпителия, которая оставалась на уровне 37±5 мкм. При совместном введении премарина и ΌΗΕΑ животным ΟνΧ наблюдалось повышение толщины до 84±6 мкм, что не отличалось статистически от значения в группе животных, получавших один премарин. Наконец, комбинация из премарина, ΌΗΕΑ и аколбифена дала толщину эпителия в 32±3 мкм, что близко к значению в группах, получавших один только ΌΗΕΑ или ΌΗΕΑ в сочетании с аколбифеном.

Батта ргорпа.

Степень плотности волокон коллагена во влагалище классифицировали как низкую, среднюю и высокую (фиг. 6), как отмечалось в зоне, прилежащей к эпителию. Низкая и средняя плотность была связана с наличием грубых волокон коллагена, слабо или менее слабо собранных вместе соответственно, тогда как термин высокая плотность использовался для описания плотно упакованных тонких волокон коллагена, проявляющих гладкий, текстурированный вид. У всех животных было сравнительно мало фиброцитов пропорционально количеству коллагена, причем они имели преимущественно уплощенный и сморщенный вид.

Тщательное обследование каждого животного (табл. 1) показывает, что в целом плотность волокон коллагена в сегменте 1 является средней (за исключением низкой в период течки и у получавших премарин животных ΟνΧ или высокой у крыс ΟνΧ и получавших ΌΗΕΑ крыс ΟνΧ), тогда как в сегментах 2 и 3 она возрастает и выходит на плато, которое в общем остается постоянным вплоть до сегмента 7. Так, у интактных крыс в период течки по продольной оси влагалища плотность волокон коллагена была низкой в сегментах 1-3 и средней в сегментах 4-7. Атрофия часто была связана с повышением плотности волокон коллагена в группах ΟνΧ и ΟνΧ+аколбифен (табл. 1). У получавших премарин животных ΟνΧ плотность была низкой в сегменте 1 и средней в сегментах 2 и 3, тогда как в остальных сегментах плотность волокон коллагена постепенно возрастала и становилась высокой в сегментах 6 и 7.

Визуальное исследование толщины 1атта ргорпа под световым микроскопом вдоль влагалища в общем показало, что она была умеренной в сегменте 1 и уменьшалась в сегментах 2-4. В сегментах 5-7 толщина постепенно возрастала до уровня, близкого сегменту 1. Соответствующие средние значения толщины 1атша ргорпа по измерениям в сегменте 5 (фиг. 5В) показывают, что ΟνΧ вызывала значительное снижение толщины 1ат1иа рторпа (76±2 мкм против 135±28 мкм в интактной группе) при незначительном снижении, вызванном аколбифеном (60±8 мкм). Повышение, наблюдавшееся после введения премарина или премарина+аколбифена у животных ΟνΧ, оставалось ниже, чем в интактной группе (100±9 и 90±3 мкм соответственно против 135±28 мкм). Применение ΌΗΕΑ также вело к статистически незначительному повышению толщины 1атта ргорпа (96±20 мкм), а добавление аколбифена вело к дальнейшему повышению толщины (136±17 мкм), достигавшей уровня интактных животных. Обработка животных ΟνΧ премарином+ΌΗΕΑ значительно повышала толщину (144±14 мкм) по сравнению с одним лишь ΌΗΕΑ. Наконец, животные, получавшие премарин+^ΗΕΑ+аколбифен, проявляли толщину (99±9 мкм), близкую толщине в группе, получавшей один ΌΗΕΑ, но меньшую, чем в группе премарин+ΌΗΕΑ, хотя отличие и не было статистически значимым.

ΌΗΕΑ вызывал умеренное повышение толщины слоя ти8си1аг18 (50±2 мкм), которая слегка уменьшалась при добавлении аколбифена (41±3 мкм). Наконец, комбинированная обработка премарином и ΌΗΕΑ приводила к заметному повышению толщины (62±3 мкм) по сравнению с животными, получавшими только ΌΗΕΑ. При добавлении аколбифена к премарину и ΌΗΕΑ толщина слоя ти8си1ап8 уменьшалась (46±5 мкм) до значения, сравнимого с ΌΗΕΑ и аколбифеном.

При измерении общей толщины стенки влагалища (фиг. 5Ό) не включали тонкий наружный слой соединительной ткани, составляющей слой адвентиция. ΟνΧ приводила к заметной (51%) атрофии стенки влагалища (128±3 мкм против 262±39 мкм у интактных), а добавление аколбифена на фоне ΟνΧ не оказывало влияния (108±8 мкм) (фиг. 7А, В и С). Обработка премарином удерживала общую толщину на

- 13 014878 уровне (253±10 мкм), близком к уровню интактных животных, тогда как добавление аколбифена к премарину обращало эффект премарина (150±4 мкм) (фиг. 7Ό и Е соответственно). Общая толщина влагалища при обработке ΌΗΕΑ (184±21 мкм) была примерно на 25% ниже, чем в группе, получавшей один премарин (фиг. 7Е). С другой стороны, добавление аколбифена к ΌΗΕΑ вело к незначительному повышению толщины (213±20 мкм), которое не отличалось значительно от интактной группы (фиг. 70). Наконец, совместное введение премарина и ΌΗΕΆ животным ОУХ заметно повышало толщину (290±13 мкм) до уровня, близкого к уровню интактных животных (фиг. 7Н). Добавление аколбифена к ΌΗΕΆ и премарину обращало эффект до значения (176±11 мкм), которое не отличалось значительно от одного лишь ΌΗΕΆ (фиг. 71).

Вес влагалища.

После 8-месячной обработки изменения веса влагалища, наблюдавшиеся между различными группами (фиг. 8), в общем отражают вышеописанные морфологические наблюдения. Действительно, вес влагалища после ОУХ уменьшался примерно на 50% (101±5 мг) по сравнению с интактной группой (205±11 мг), тогда как обработка одним лишь аколбифеном животных ОУХ не оказывала влияния на вес влагалища. С другой стороны, введение премарина вело к повышению веса влагалища, которое все-таки не достигало уровня интактных животных (170±9 мг), тогда как добавление аколбифена к премарину возвращало вызванный эстрогеном прирост веса на уровень, близкий животным ОУХ (96±4 мг). Наоборот, при введении ΌΗΕΆ животным ОУХ вес влагалища возрастал до уровня (171±12 мг), близкого к уровню группы, получавшей премарин, а комбинирование аколбифена и ΌΗΕΆ приводило к уменьшению веса (135±9 мг), который оставался выше уровня группы ОУХ. Наконец, совместное введение премарина и ΌΗΕΆ животным ОУХ приводило к увеличению веса влагалища (179±10 мг) до значения, близкого к уровню в группах ОУХ+ΌΗΕΑ и ОУХ+премарин. Добавление аколбифена к этой комбинации не оказывало значительного эффекта (194±12 мкм).

Обработка ΌΗΕΆ животных ОУХ вела к сильному мечению на АК многих ядер в трех слоях влагалища, причем наблюдалась одинаковая картина при использовании комбинаций ΌΗΕΑ+аколбифен и ΌΗΕΑ+премарин, за исключением меньшего числа меченых ядер в поверхностных слоях эпителия в последней группе. Комбинация ΌΗΕΑ, премарина и аколбифена также приводила к сильному окрашиванию большинства ядер в трех слоях стенки влагалища.

Обсуждение

Вагинальная сухость или атрофический вагинит, также называемый урогенитальной атрофией, вместе с половой дисфункцией, является распространенной проблемой у женщин в постменопаузе (ΝοΙο Ιονίΐζ, 2000, Мепораике, 7(3): 140-142). Самыми распространенными симптомами являются сухость, жжение, зуд, раздражение и диспареуния, что ведет к снижению либидо и ухудшению качества жизни (Вегтап е1 а1., 1999, Сигг. Орш. ЪгоЪ 9(6): 563-568). Поскольку, как известно, это связано с потерей эстрогенов, то лучшим способом лечения является эстрогеновая заместительная терапия (ΕΚΤ) и ΗΚΤ. Однако, поскольку новая информация по физиологии половых стероидов у женщин решительно предполагает важную роль андрогенов (ЪаЬпе е1 а1., 2003, Εηά Кет. 24(2): 152-182), то в настоящем исследовании сравнивали общие гормональные эффекты альтернативы к ΗΚΤ или ΕΒΤ, а именно ΌΗΕΑ, одного или в сочетании с чистым антиэстрогеном аколбифеном и еще с премарином, на морфологию влагалища крыс и экспрессию рецепторов половых стероидов. ΌΗΕΑ вводили через кожу, чтобы избежать пресистемного метаболизма в печени (ЪаЬпе е1 а1., 1996, Εηάοοηηοΐ., 150: 8107-8118).

В конечном счете, наши результаты показали, что вес влагалища значительно повышается при обработке премарином по сравнению с животными ОУХ, достигая значения, близкого к тому, что наблюдается в группе, получавшей ΌΗΕΑ. Уместно напомнить, что, хотя повышение веса влагалища и матки у грызунов обычно используют в качестве меры эстрогенного действия, однако эти органы также могут реагировать на прогестерон и тестостерон, среди прочих соединений (Έιηιικηδ апб Магйп, 1964, ΌοΓίΊηηη Εά, Αсаάет^с Ргекк ΝΥ: 1).

В предложенной тройной комбинации лошадиный эстроген премарин должен действовать на мозг, чтобы снять вазомоторные симптомы. В самом деле, преимущества совместного применения чистого селективного антиэстрогена аколбифена вместе с эстрогеном для того, чтобы нейтрализовать нежелательные периферические эффекты эстрогена, были хорошо описаны ЪаЬпе е1 а1. (ЪаЬпе е1 а1., 2003, Εηάοοήηοΐ., 144(11): 4700-4706). В настоящем исследовании, при введении аколбифена животным ОУХ, самым типичным морфологическим явлением, которое вызывал этот 8ΕΚΜ, было появление поверхностного слоя хорошо пригнанных мелких слизистых клеток, лежащих на базальном клеточном слое, причем такая картина была слегка еще более выражена в группе премарин+аколбифен и оставалась преобладающей во всех группах, получавших аколбифен, в том числе и тогда, когда этот 8ΕΡ.Μ добавляли к ΌΗΕΑ. Ослизнение вагинального эпителия при обработке антиэстрогеном отмечалось у неполовозрелых (Αηώ^Γδοη ηηά Канд, 1975, Αт. 1. Α^ΐ., 144(2): 197-207) и взрослых (Υοδίιίάη е1 а1., 1998, Сансег Ъей, 134(1): 43-51) крыс. Хотя такую морфологическую картину и сравнивали с ослизнением, вызванным прогестероном (Αηώ^ΐΈοη ηηά Каид, 1975, Αт. 1. Α^ΐ., 144(2): 197-207), но молекулярный механизм, по которому антиэстроген вызывает ослизнение эпителия, остается неизвестным.

- 14 014878

У женщин в постменопаузе были отмечены многие благотворные эффекты ΌΗΕΆ (ЬаЬпе с1 а1., 1997, I. С1ш. Εηάοοτίηοΐ. МекаЬ., 82: 3498-3505; ЬаЬпе ек а1., 1991, Мо1. Се11. Εηάοοήηοΐ., 78: С113-С118). Поскольку специфический рецептор ΌΗΕΆ не определен, то морфологические изменения влагалища крыс, наблюдавшиеся после обработки ΌΗΕΆ, отражают его интракринное превращение в активные половые стероиды, обладающие андрогенным и/или эстрогенным действием по интракринным механизмам (ЬаЬпе е1 а1., 1991, Μο1. Се11. Εηάοοπηο1.. 78: С113-С118). Эти изменения включают интенсивное ослизнение эпителия, сильное уплотнение тонких, плотно переплетенных волокон коллагена в 1ашта ргорпа и умеренное утолщение слоя ти5си1аг15 по сравнению с животными ОУХ. Первые два морфологические изменения типичны для андрогенного действия, тогда как третье проявляет эстрогеноподобное действие, что дополнительно подтверждается одновременным повышением экспрессии прогестероновых рецепторов в слое ти8си1ап8.

Поскольку ΌΗΕΆ подвергается превращению в андрогены или эстрогены либо в те и другие в периферических тканях, то появление толстого ослизненного многослойного эпителия в настоящем исследовании после обработки ΌΗΕΆ животных ОУХ свидетельствует о преобладающем андрогенном эффекте ослизнения во влагалище крыс, который может маскировать возможный одновременный небольшой эстрогенный эффект на уровне эпителия. В предшествующей работе уже отмечался такой эффект ослизнения на влагалище крыс ^ийа ек а1., 1998, I. 8кегоИ. Вюсйет. Μο1. Βίο1., бб(3): 137-149). В этом исследовании интравагинальное введение ΌΗΕΆ давало значительный эффект в дозе, меньшей в десять раз, чем та, которая оказалась активной при нанесении ΌΗΕΆ на кожу спины.

Представленные данные указывают на сосуществование основного андрогенного и второстепенного эстрогенного действия ΌΗΕΆ на влагалище крыс. Более того, эти результаты хорошо подтверждаются изучением вагинального эпителия животных ОУХ, получавших при таком же локальном нанесении ΌΗΕΆ, как и в нашем исследовании, еще и подкожную дозу антиандрогена флутамида (ЕЬИ) (неопубликованные результаты). В самом деле, андрогенный эффект ослизнения, вызываемый андрогенным компонентом ΌΗΕΆ, полностью обращался под действием ЕЬИ и приводил к появлению многослойного чешуйчатого эпителия, типичного для андрогенного действия (данные не приводятся). Если бы ΌΗΕΆ оказывал только андрогенное действие (ослизнение) на влагалище крыс, то этот эффект обращался бы под действием ЕЬи, и тогда бы наблюдался атрофический эпителий, подобный эпителию животных ОУХ. В предшествующих работах на гонадэктомированных самцах и самках крыс было четко установлено, что обработка ΌΗΕΆ вызывает стимулирующие андрогенные и/или эстрогенные эффекты на предстательную железу, семенной пузырек и матку в зависимости от того, какая ткань была намечена для изучения (ЬаЬпе ек а1., 1988, Εηάοα·ΐηο1., 123: 1412-1417).

Комбинация ΌΗΕΆ+аколбифен, с другой стороны, проявляет снижение степени ослизнения эпителия, при этом обнаруживается чередование слоя хорошо пригнанных слизистых клеток, т. е. эффект аколбифена, и инвагинация многослойных гипертрофированных слизистых клеток, что соответствует андрогенному эффекту ΌΗΕΆ. Соответственно аколбифен ингибирует частичный эстрогенный эффект ΌΗΕΆ, при этом сохраняется основной андрогенный компонент ΌΗΕΆ и прибавляется небольшой эстрогеноподобный эффект аколбифена, который лучше всего проявляется на уровне отверстия. Снижение веса влагалища, наблюдавшееся после добавления аколбифена к ΌΗΕΆ, является меньшим, чем то, которое получается после добавления аколбифена к премарину, тем самым иллюстрируя меньший эстрогенный компонент ΌΗΕΆ, который устраняется антиэстрогеном, тогда как основной андрогенный компонент не затронут. Кроме того, повышение толщины 1атта ргорпа и плотности волокон коллагена в группе ΌΗΕΆ+аколбифен в сравнении с животными ОУХ и интактными животными соответственно опять же свидетельствует о потенциальной роли андрогенов в повышении плотности волокон коллагена и толщины, поскольку эстрогенный компонент ΌΗΕΆ блокируется аколбифеном.

В других работах было показано, что действие ΌΗΕΆ на молочную железу крыс (8οϋΓ1α ек а1., 1998, Εηάοατηο1., 139: 753-7б4), сальные железы кожи ^ийа ек а1., 2000, I. Εηάο^ηο1., 1бб(2): 455-4б2) и минеральную плотность кости (Магке1 ек а1., 1998, I. Επάο^ι-ιοΙ, 157: 433-442) является почти исключительно андрогенным. Тем не менее, наличие эстрогенного действия ΌΗΕΆ на влагалище крыс было продемонстрировано ранее посредством индукции открытия влагалища и преждевременной овуляции у неполовозрелых крыс, обработанных этим соединением, тогда как ΌΗΤ - андроген, который не подвергается ароматизации до эстрогенов, не вызывал таких эффектов (Кпийхсп αηά МаЪезй, 1975, ΕμΒο^μΕ, 97(2): 458-4б8). Способность ткани влагалища крыс к ароматизации андрогенов, особенно тестостерона, вероятно, объясняет большую часть эстрогенного действия ΌΗΕΆ на этот орган (Ьерйагк ек а1., 1989, Βίο1. Вергой., 40(2): 259-2б7). Андрост-5-ен-3в,17в-диол (5-диол), метаболит ΌΗΕΆ, который связывается с эстрогеновым рецептором (81ию ек а1., 1950, I. Βίο1. С1ет., 250: 3095-3100; ΡοοΠιηαη ек а1., 1975, I. С1т. Εηάο^ηο1. МекаЬ., 40(3): 373-379; Уан Όοοτη ек а1., 1981, Επ^^ποΙ, 108: 1587-1594; Лйатз ек а1., 1981, Самсе!· Вее, 41: 4720-472б), также мог вносить вклад в эстрогенный эффект (Ροπ1ίπ αηά ЬаЬпе, 198б, Сапсег Вее, 4б: 4933-4937). Таким образом, предложенная комбинация антиэстрогена аколбифена с ΌΗΕΆ будет предотвращать нежелательные стимулирующие эффекты 5-диола. С другой стороны, аколбифен будет проявлять дополнительные преимущества, предотвращая потерю костной ткани (Магке1 ек а1., 2000,

I. 8кего1й Вюсйет. Μο1. Βίο1., 74(1-2): 45-5б).

- 15 014878

Насколько нам известно, ни в одной предшествующей работе не было показано стимулирующее действие ЭНЕА на плотность и морфологию волокон коллагена в 1ашша ргорпа и, в меньшей степени, на тизси1апз. Такое действие происходящих из ЭНЕА андрогенов и эстрогенов могло бы оказать благотворные эффекты на функцию влагалища у женщин в постменопаузе и должно обеспечить субстраты, необходимые для действия таких ингибиторов фосфодиэстераз 5 типа, как силденафил или тадалафил, возможно, через расслабление гладких мышц влагалища, опосредованное эндотелиальной синтазой оксида азота (еЫО8), индуцируемой андрогенами или эстрогенами (обсуждается в Мипагпх е! а1., 2003, 1. Иго1., 170(2 Р1 2): 840-844, И1зсизз1оп 844-845). В самом деле, как оказалось, аколбифен индуцирует еЫО8 в эндотелиальных клетках человека и крыс (81шопс1ш е! а1., 2002, ЕпйосгтоЕ, 143(6): 2052-2061).

Результаты, полученные во всех группах, затронутых обработкой ЭНЕА, показывают, что экспрессия АВ усиливается андрогенами, происходящими от интракринного превращения ЭНЕА во влагалище крыс, аналогичным образом во всех трех тканевых компартментах.

Благотворные морфологические изменения, наблюдавшиеся одновременно с сильной модуляцией АВ влагалища крыс андрогенами, свидетельствуют о том, что снижение уровня происходящих из ЭНЕА андрогенов в сыворотке женщин в постменопаузе может способствовать ухудшению здоровья влагалища и в конечном счете потере либидо и полового удовольствия, наблюдающегося в этой возрастной группе. Снижение уровня общего тестостерона, свободного тестостерона и ЭНЕЛ-8 в сыворотке действительно было обнаружено у женщин, консультировавшихся по поводу снижения полового влечения (Сиау апй 1асоЬзоп, 2002, 1. 8ех Мап1а1 ТЕег., 28 8ирр1. 1: 129-142).

В настоящем исследовании показано, что обработка самок крыс ОУХ с помощью ЭНЕА или комбинации ЭНЕА с аколбифеном и ЭНЕА с аколбифеном и премарином устраняет вызванные ОУХ атрофические изменения во влагалище преимущественно посредством андрогенного эффекта, через АВ, что отражается в сильном ослизнении эпителия и повышении плотности волокон коллагена в 1атша ргорпа. Обработка одним только ЭНЕА также умеренно повышала толщину тизси1аг1з. Такие данные подчеркивают важность половых стероидов, синтезируемых локально из ЭНЕА и ЭНЕА-8 в периферических тканях-мишенях. Наряду с этими благотворными эффектами, аколбифен снижал частоту воспаления, вероятно, через эстрогеноподобную индукцию защитного ороговевшего чешуйчатого эпителия на уровне отверстия и антиэстрогенный эффект ослизнения на внутреннем уровне.

Предлагались различные подходы для решения проблемы вагинальной сухости, зачастую связанной с диспареунией и потерей полового наслаждения. К примеру, часто назначаются дающие облегчение препараты эстрогенов для местного применения во влагалище, но при этом может происходить стимуляция эндометрия не встречающим противодействия эстрогеном (Ма11зоп е! а1., 1989, Ма1ш11аз, 11: 217222). При гистерэктомии у женщин в постменопаузе все еще применяется ЕВТ, но при этом, как хорошо известно, возрастает риск возникновения рака молочной железы. Кроме того, ЕВТ снижает уровень андрогенов в сыворотке, повышая уровень связывающего половые гормоны глобулина, что может вызвать относительный дефицит происходящих из яичников и надпочечников андрогенов, тем самым создавая дополнительное обоснование для параллельного возмещения физиологических андрогенов (Саззоп е! а1., 1997, ОЬз1е1. 6упесо1., 90(6): 995-998).

Пример 2.

Методы.

Животные и обработка.

Использовали самок крыс 8ргадие-Оате1еу (Сг1:СИ(8И)Вг) (СЕаг1ез ВВег ЬаЬога1огу, 81. Сопз1ап1, Канада) 10-12-недельного возраста весом 215-265 г на момент овариэктомии. Животных содержали поодиночке в помещении с контролируемыми условиями содержания (температура 22±3°С, влажность 50±20%, освещение 12 ч света/12 ч темноты, освещение включали в 7:15). Животным предоставляли свободный доступ к водопроводной воде и сертифицированному корму для грызунов (ЬаЬ И1е1 5002 (гранулы), Ва1з1оп Ригша, 81. Ьошз, МО). Эксперимент проводили в виварии, одобренном Канадским советом по содержанию животных (ССАС) и Ассоциацией по оценке и аккредитованию содержания лабораторных животных (ЛЛЛ^ЛС) в соответствии с Директивой ССАС по содержанию и использованию экспериментальных животных.

Проводили различные эксперименты: два 20-дневных и два 8-месячных опыта. В каждом из первых двух опытов животных разбивали случайным образом на 3 группы по 13-14 животных следующим образом: 1) интактный контроль; 2) овариэктомированный (ОУХ) контроль; 3) ОУХ+ралоксифен (0,5 мг/кг) либо 3) ОУХ+ЬУ 363381 (0,5 мг/кг). В одном 8-месячном опыте животных разбивали случайным образом на 5 групп по 7-8 животных следующим образом: 1) интактный контроль; 2) овариэктомированный (ОУХ) контроль; 3) ОУХ+аколбифен (0,5 мг/кг); 4) ОУХ+ЕВА-923 (0,5 мг/кг); 5) ОУХ+Т8Е-424 (0,5 мг/кг). В другом 8-месячном опыте животных разбивали случайным образом на 3 группы по 10-11 животных следующим образом: 1) интактный контроль; 2) овариэктомированный (ОУХ) контроль; 3) ОУХ+лазофоксифен (0,5 мг/кг). В первый день опытов животных в соответствующих группах подвергали двусторонней овариэктомии (ОУХ) под изофлурановым наркозом. Затем вводили исследуемые соединения внутрь гаважем один раз в день в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе (0,5 мл на крысу) с

- 16 014878

1-го по 20-й день опыта или с 1-го дня по 32-ю неделю опыта.

Через 24 ч после введения последней дозы животных забивали под изофлурановым наркозом путем кровопускания. Влагалища извлекали и погружали в 10% формалин в нейтральном буфере сразу же после резекции. Затем их либо разрезали на 7 поперечных сегментов (для аколбифена, ЕКА-923 и Т8Е-424), либо таким образом, чтобы выделить только средний сегмент (для ралоксифена, лазофоксифена и ЬУ 363381). После этого сегменты подвергали стандартной обработке и заключали в блоки парафина. Когда нужно, все сегменты в блоке парафина располагали в такой последовательности, которая соответствует их исходному анатомическому положению, и ориентировали перпендикулярно поверхности блока, что позволяло делать поперечные срезы сегментов. Для каждого животного делали срез в парафине толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином-эозином для морфологического исследования.

На фиг. 10 и 11 представлено сравнение между различными соединениями 8ЕКМ: морфология вагинального эпителия у крыс ОУХ при увеличении в 200 раз. На фиг. А-Ό представлена морфология эпителия первого сегмента влагалища (отверстия). В то время как эпителий животных ОУХ является тонким (4-6 слоев клеток), атрофическим и не проявляет заметного гранулярного слоя на А, тот же эпителий у 3 соединений 8ЕКМ является более толстым (8-11 слоев клеток) и проявляет многослойный гранулярный компартмент на В, С и Ό. На Е-К приведен сегмент, расположенный посередине влагалища. У животных ОУХ вагинальный эпителий является тонким и атрофическим (2-3 слоя клеток) на Е, однако его толщина возрастает во всех группах обработки (Е-К) благодаря наличию одного (аколбифен, ЕКА-923 и Т8Е-424) или нескольких (ралоксифен, лазофоксифен или ЬУ 363381) слоев слизистых клеток поверх базального слоя клеток.

Пример 3.

Материалы и методы.

Использовали самок крыс 8ртадие-ОаМеу (Сг1:СЭ®(8Э)Вг УАЕ/Р1ик™) (СЕаг1ек КАег ЬаЬога!огу, 8!. Сопк!ап!, Канада) 10-12-недельного возраста весом примерно 250-275 г в начале эксперимента. Животных подвергали акклиматизации к условиям содержания (температура 22±3°С, влажность 50±20%, освещение 12 ч света/12 ч темноты, освещение включали в 7:15) в течение как минимум одной недели перед началом эксперимента. Животных содержали поодиночке и предоставляли им свободный доступ к воде и корму для грызунов (ЬаЬ Э1е1 5002, Ка1к!оп Ригта, 8!. Ьошк, МО). Эксперимент проводили в соответствии с Директивой ССАС по содержанию и использованию экспериментальных животных, в виварии, одобренном Канадским советом по содержанию животных (ССАС) и Ассоциацией по оценке и аккредитованию содержания лабораторных животных (АААЬАС).

Всех 25 самок крыс разбивали случайным образом на 5 групп следующим образом: 1) три овариэктомированных интактных контроля (ОУХ); 2) четыре крысы ОУХ+свечи плацебо; 3) шесть ОУХ+свечи по 0,33 мг ϋΗΕΛ; 4) шесть ОУХ+свечи по 0,66 мг ΩΗΕΛ; 5) шесть ОУХ+свечи по 1,00 мг ΩΗΕΛ. В первый день опытов животных во всех группах подвергали двусторонней овариэктомии (ОУХ) под изофлурановым наркозом. На 5-й день опытов начинали вставлять по одной свече во влагалище и продолжали один раз в день вплоть до 18-го дня опытов, в целом на протяжении 14 дней обработки. Свечи осторожно вводили в отверстие влагалища, а затем осторожно проталкивали внутрь на 2-3 мм с помощью небольшой гладкой стеклянной палочки, которую дезинфицировали 70% спиртом и высушивали между каждым животным.

Через 24 ч после введения последней дозы животных забивали под изофлурановым наркозом путем кровопускания. Влагалище, включая мочеиспускательный канал, и матку извлекали, а затем обрабатывали, как описано ниже. Для дальнейшего анализа отбирали два кусочка паховой молочной железы, а также квадратный участок примерно 2x2 см выбритой кожи спины, которую клали на кусочек картона и осторожно разглаживали.

Приготовление свечей.

Содержащие ЭМЕА свечи готовили с помощью основы ^Ы!ерко1 Η-15 (Меб1кса, МоШгеаЬ Канада). Можно использовать и любую другую липофильную основу типа ЕаШЬаке, ^есоЬее, масла какао, масла бобов какао либо другие комбинации основ \У1Шерко1. Делали соответствующие навески □ИЕА, дающие конечные концентрации в 0,33, 0,66 или 1,00 мг на свечу в конечном объеме 50±3 мкл. Надлежащее количество гранул основы свечей для навески с тем, чтобы получить нужный конечный объем, рассчитывали, исходя из заранее измеренной плотности основы свечей, которая составила 47,5 мг на 50 мкл. Основу для свечей вносили в небольшой стакан, расплавляли в микроволновке при 50% мощности около 3 мин и 30 с, а затем переносили на электронагреватель, который настраивали на самую низкую мощность с тем, чтобы поддерживать основу свечей при температуре 50±3°С. Затем в основу добавляли тонкоизмельченный порошок ЭИЕА (полученный от 8с11е\\'е1/ег11а11 1пс. с чистотой в 100%), весь сразу, причем давали погрузиться целиком и оставляли для смачивания на 3 мин, после чего тщательно и медленно дробили и растворяли с помощью гладко заокругленной стеклянной палочки. Наконец, основу с растворенным ЭИЕА (плацебо представляло собой основу без ОИЕА) разливали, с помощью пипетки СПкоп на 1000 мкл с подогретым наконечником, по штативам с рядом формочек на 50 мкл. Эти формочки делали из микропробирок, которые заранее калибровали с помощью 50 мкл воды и отрезали на уровне линии

- 17 014878 поверхности воды. После охлаждения 30 мин при комнатной температуре свечи ставили на 4°С еще на 30 мин. Наконец, излишек основы удаляли лезвием бритвы, а свечи вынимали из формочек и хранили в закрытых стеклянных флаконах при 4°С до употребления. Их доводили до комнатной температуры перед применением на животных.

Гистологические процедуры.

Органы погружали в 10% формалин в нейтральном буфере сразу после резекции. Каждое влагалище и матку разделяли на 8 равных поперечных сегментов и 4 поперечных сегмента, включая два из шейки и два из каждых двух проксимальных и дистальных рогов матки соответственно. Затем сегменты подвергали стандартной обработке и все вместе заключали в один блок парафина. В пределах блока парафина все сегменты располагали в той последовательности, которая соответствует их исходному анатомическому положению, и ориентировали перпендикулярно поверхности блока, что позволяло делать поперечные срезы сегментов. Для каждого животного делали срез в парафине толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином-эозином для морфологического исследования.

Результаты.

Морфология эпителия.

После исследования всех сегментов влагалища оказалось, что сегменты 4 и 6 являются репрезентативными для сравнения различных обработок. Сегмент 4 был самым проксимальным относительно отверстия, но не проявлявшим признаков наружной кожи, и он не был или в меньшей степени был затронут теми легкими и средними воспалительными изменениями, которые обычно отмечались в наружной зоне слизистой влагалища у контрольных животных. Сегмент 6 представлял более глубокую слизистую оболочку влагалища и от шейки матки его отделял всего один сегмент.

В общем случае, на вентральной стороне влагалища проявляется более толстый и более ослизненный эпителий по сравнению с дорзальной стороной.

Интактные.

Как видно из фиг. 13, в период течки, т.е. под сильным эстрогенным влиянием, вагинальный эпителий является толстым и ороговевшим. В нем проявляется от 12 до 18 слоев клеток в сегменте 4 и от 12 до 15 слоев в сегменте 6. В отличие от толстого многослойного чешуйчатого эпителия на уровне отверстия, во внутреннем вагинальном эпителии не отмечены гранулярные слои. В период между течками, под минимальным гормональным влиянием, вагинальный эпителий является более тонким. В нем проявляется 6-10 слоев клеток в сегменте 4 и 5-7 слоев в сегменте 6.

Овариэктомия без обработки.

Как видно из фиг. 14, в сегменте 4 влагалище окаймлено чешуйчатым многослойным эпителием из 2-6 слоев клеток. Толщина этого сегмента весьма вариабельна между животными. В сегменте 6 наблюдается полная атрофия с 2-3 слоями плоских клеток. У этих животных по всему влагалищу встречались редкие очаги мелких цилиндрических слизистых клеток. Из трех животных в этой группе у двоих проявлялись слабые воспалительные изменения в трех внешних сегментах.

Плацебо.

Как видно из фиг. 15, по сравнению с группой ОУХ без обработки, вагинальный чешуйчатый многослойный эпителий в группе плацебо был немного толще, при этом в сегменте 4 проявлялось 4-8 слоев клеток. Однако в сегменте 6 наблюдалась такая же морфология, как и в группе ОУХ без обработки, с 2-3 слоями эпителиальных клеток. Как и у животных ОУХ без обработки, по всему влагалищу встречались очаги мелких цилиндрических слизистых клеток, причем их было слегка больше, чем у животных ОУХ без обработки. Из четырех животных в этой группе у трех проявлялись слабые воспалительные изменения в трех внешних сегментах.

ΌΗΕΑ по 0,33 мг на свечу.

Как видно из фиг. 16, в общем при низких дозах морфологический эффект ΌΗΕΑ характеризуется хорошо пригнанными цилиндрическими слизистыми клетками, тогда как при более высоких дозах слизистые клетки увеличиваются (гипертрофия), вакуолируют и накапливаются. В данной группе эффект ΌΗΕΑ еле заметен в сегменте 2 и постепенно нарастает в сегментах 3-4, где чередуются хорошо пригнанные и гипертрофированные слизистые клетки. Эффект ΌΗΕΑ медленно снижается в сегментах 5 и 6, где наблюдаются почти одни только хорошо пригнанные слизистые клетки. Эффект становится очень слабым в сегменте 7 и исчезает в боковых складках влагалища в сегменте 8 (который включает начало шейки матки). Так, в сегменте 4 вагинальный эпителий является многослойным чешуйчатым с 3-7 слоями клеток. От 20 до 60% выстилки влагалища состоит из хорошо пригнанных слизистых клеток, чередующихся с 15-50% гипертрофированных слизистых клеток, лежащих на одном или нескольких слоях чешуйчатого многослойного эпителия, и с неослизненными участками. В сегменте 6 толщина эпителия уменьшается почти до такой же толщины, как у животных ОУХ без обработки. Он состоит из чешуйчатого многослойного эпителия из 2-5 слоев клеток, покрытых слоем хорошо пригнанных слизистых клеток. Наблюдались большие колебания во встречаемости слизистых клеток - они занимали от 5 до 75% поверхности влагалища, чередуясь с неослизненными участками. Из шести обработанных животных у четырех проявлялось слабое воспаление, неравномерно распределенное по всему влагалищу.

- 18 014878

ΌΗΕΆ по 0,66 мг на свечу.

Как видно из фиг. 17, в этой группе эффект ΌΗΕΆ становится заметным в сегменте 2 и значительно возрастает в сегментах 3-4 и 5, где по большей части наблюдаются гипертрофированные слизистые клетки. Количество гипертрофированных слизистых клеток уменьшается в сегментах 6 и 7, где большинство клеток представляют собой хорошо пригнанные слизистые клетки. Так, в сегменте 4 многослойный чешуйчатый эпителий состоит из 3-6 слоев клеток. От 5 до 20% выстилки влагалища состоит из хорошо пригнанных слизистых клеток, чередующихся с 10-75% гипертрофированных слизистых клеток, лежащих на одном или нескольких слоях чешуйчатого многослойного эпителия. Есть и неослизненные участки эпителия. В сегменте 6 толщина эпителия уменьшается и он состоит из чешуйчатого многослойного эпителия из 2-4 слоев клеток, покрытых слоем хорошо пригнанных слизистых клеток. Количество ослизненных участков колебалось от 20 до 80% поверхности влагалища, чередуясь с неослизненными участками. Из шести обработанных животных у двух проявлялось слабое воспаление в трех внешних сегментах.

ΌΗΕΆ по 1,00 мг на свечу.

Как видно из фиг. 18, в этой группе эффект ΌΗΕΆ также становится заметным в сегменте 2, но он значительно возрастает в сегментах 3-4 и 5, где в подавляющем большинстве наблюдаются гипертрофированные слизистые клетки, и очень медленно уменьшается в сегментах 6, 7 и 8, где в подавляющем большинстве наблюдаются хорошо пригнанные слизистые клетки. Так, в сегменте 4 многослойный чешуйчатый эпителий состоит из 3-9 слоев клеток. Гипертрофированные слизистые клетки, лежащие на 34 слоях чешуйчатых клеток, занимают 50-70% поверхности влагалища, в то время как хорошо пригнанные - 5-30%. Неослизненные участки перемежаются с ослизненными клетками. В сегменте 6 толщина эпителия тоже уменьшается и он состоит из 2-4 слоев клеток. Гипертрофированные слизистые клетки, лежащие на 1-3 слоях чешуйчатых клеток, занимают 30-100% поверхности влагалища, тогда как хорошо пригнанные слизистые клетки занимают 0-70%. Также наблюдались отдельные разбросанные неослизненные участки. Из шести обработанных животных у четырех проявлялось слабое воспаление в четырех внешних сегментах.

Выводы.

1. Носитель, использовавшийся для интравагинальной обработки крыс, обладает требуемыми характеристиками:

а) его легко получить в калиброванной формочке;

б) отличная способность к полному растворению тонкоизмельченного порошка ΌΗΕΆ, что обеспечивает стандартизированную дозировку;

в) отсутствие заметной тканевой реакции и морфологических изменений слизистой влагалища: наблюдалось лишь небольшое повышение толщины эпителия в первых 3-4 сегментах, которое, вероятно, вызвано манипуляциями, сопровождающими вставление свечи.

2. ΌΗΕΆ оказывал эффект на морфологию вагинального эпителия в самой низкой исследованной дозе (0,33 мг на свечу). Эффект является максимальным от 3 до 5 сегмента, после чего он постепенно уменьшается и исчезает на уровне 7 сегмента.

3. В дозе 0,66 мг на свечу эффект ΌΗΕΆ также отмечается в 3 сегменте и остается весьма сильным в 6 сегменте.

4. В дозе 1,00 мг на свечу эффект ΌΗΕΆ является сильным от сегмента 2-3 до глубоких складок влагалища рядом с шейкой матки.

Примеры фармацевтических композиций

Ниже приведены для примера, но не для ограничения, некоторые фармацевтические композиции, в которых используется предпочтительный активный 8ΕΒΜ аколбифен, предпочтительный активный предшественник половых стероидов ΌΗΕΆ, предпочтительный эстроген 17в-эстрадиол или премарин, предпочтительный ингибитор цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа силденафил или тадалафил. Концентрация активного ингредиента может варьировать в широком интервале, как обсуждалось в настоящем описании. Количества и типы других ингредиентов, которые могут быть включены, хорошо известны в этой области.

Пример А.

Таблетки.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ϋΗΕΑ	15,0
Желатин	5,0
Лактоза	63,5
Крахмал	16,5

- 19 014878

Пример В.

Желатиновые капсулы.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ППЕА	15,0
Лактоза водосодержащая	70,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Пример С. Таблетки.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
ЦНЕА	15,0
Желатин	5,0
Лактоза	58,5
Крахмал	16,5

Пример Ό.

Желатиновые капсулы.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
Г)1!НА	15,0
Лактоза водосодержащая	65,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Пример Е. Таблетки.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
ЭНЕЛ	15,0
Премарин	0,5
Желатин	5,0
Лактоза	63,0
Крахмал	16,5

Пример Е.

Желатиновые капсулы.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
ОНЕА	15,0
Премарин	0,5
Лактоза водосодержащая	64,5
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Пример 6.

Таблетки.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Силденафил	15,0
ΌΗΕΑ	15,0
Желатин	5,0
Лактоза	48,5
Крахмал	16,5

Пример Н.

Желатиновые капсулы.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Силденафил	15,0
Аколбифен	5,0
ЦНЕА	15,0
Лактоза водосодержащая	50,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

- 20 014878

Пример I.

Таблетки.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
ΟΙ1ΕΑ	15,0
Силденафил	15,0
Желатин	5,0
Лактоза	43,5
Крахмал	16,5

Пример 1.

Желатиновые капсулы.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
ОНЕА	15,0
Силденафил	15,0
Лактоза водосодержащая	50,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Пример К.

Вагинальный крем.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ОНЕА	1,0
Аколбифен	0,2
Эмульгирующий воск, ΝΡ	18,0
Легкое минеральное масло, ΝΡ	12,0
Бензиловый спирт	1,0
Этанол 95%, иЗР	33,8
Вода очищенная, иЗР	34,0

Пример Ь.

Вагинальные свечи.

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ΏΗΕΑ	0,66-2,0
Основа УЩИерзо! Н-15	98 - 99,34

Содержащие ΌΗΕΑ свечи готовили с помощью основы \У1и1ер5о1 Η-15 (МеФкса, Моп!геа1., Канада). Можно использовать и любую другую липофильную основу типа ЕаФЬаке, ХУесоЬее. масла какао, масла бобов какао либо другие комбинации основ \У1Шер5о1.

Примеры наборов

Ниже приведены для примера, но не для ограничения, некоторые наборы, в которых используется предпочтительный активный 8ΕΚΜ аколбифен, предпочтительный активный предшественник половых стероидов ΌΗΕΑ, предпочтительный эстроген 17в-эстрадиол или конъюгированные эстрогены, предпочтительный ингибитор цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа силденафил или тадалафил. Концентрация активного ингредиента может варьировать в широком интервале, как обсуждалось в настоящем описании. Количества и типы других ингредиентов, которые могут быть включены, хорошо известны в этой области.

Пример А.

Соединение 8ΕΚΜ, эстрогены и ингибитор цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа вводятся перорально, а предшественник половых стероидов наносится местно или вводится через кожу.

Композиция 8ΕΚΜ для приема внутрь (капсулы).

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
Лактоза водосодержащая	80,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Композиция δΕΚΜ+эстроген для приема внутрь (капсулы).

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
Премарин	0,5
Лактоза водосодержащая	79,5
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

- 21 014878

Композиция §ЕКМ+эстроген+ингибитор цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа для приема внутрь (капсулы).

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
Премарин	0,5
Сиденафил	15,0
Лактоза водосодержащая	64,5
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Композиция предшественника половых стероидов для местного применения (гель).

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ГЛТГ.А	2,0
Триглицерид каприловый-кацриновый (ЪГеоЬее М-5)	5,0
Г екси ленглико ль	15,0
Транскутол (монометиловый эфир диэтиленгликоля)	5,0
Бензиловый спирт	2,0
Циклометикон (Όο« Согшпд 345)	5,0
Этанол (абсолютный)	64,0
Гидроксипропилцеллюлоза (1500 срз) (К1исе1)	2,0

Пример В.

Соединение 8ЕКМ и предшественник половых стероидов вводятся перорально. Композиция нестероидного антиэстрогена для приема внутрь (капсулы).__________________________________

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
Аколбифен	5,0
Лактоза водосодержащая	80,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Композиция предшественника половых стероидов для приема внутрь (желатиновые капсулы).

Ингредиент	Вес (% от общего веса композиции)
ПНЕ А	15,0
Лактоза водосодержащая	70,0
Крахмал	4,8
Целлюлоза микрокристаллическая	9,8
Стеарат магния	0,4

Аколбифен в вышеприведенных композициях может быть заменен другими соединениями 8ЕКМ (торемифеном, оспемифеном, ралоксифеном, арзоксифеном, лазофоксифеном, Т8Е-424, ЕКЛ-923, ЕМ800, 8ЕКМ 3339, СХУ-5638) так же, как и ЭНЕЛ может быть заменен другими ингибиторами половых стероидов, премарин может быть заменен другими эстрогенами и силденафил или тадалафил может быть заменен другим ингибитором цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа либо простагландином Е1. Можно включать более одного соединения 8ЕКМ или более одного предшественника или эстрогена или ингибитора цГМФ-фосфодиэстераз 5 типа, при этом суммарный вес в процентах должен предпочтительно равняться содержанию единственного предшественника или единственного соединения 8ЕКМ, приведенного в представленных выше примерах.

Claims (51)

1. Способ лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии, атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1ат1па ргорпа и/или слоя тикси1ап5 влагалища, включающий введение нуждающимся в таком лечении пациентам предшественника половых стероидов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона, андрост-5-ен-3в,17в-диола и 4-андростен-3,17-диона.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию введения пациентам терапевтически эффективного количества селективного модулятора эстрогеновых рецепторов для защиты матки и молочной железы от рака как составной части комбинированной терапии.

3. Способ по п.2, в котором селективным модулятором эстрогеновых рецепторов является аколбифен.

4. Способ лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии,

- 22 014878 атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением или недостаточной компактностью волокон коллагена в 1атта ргорба стенки влагалища путем увеличения плотности коллагеновых волокон в стенке влагалища, включающий введение нуждающимся в таком лечении пациентам предшественника половых стероидов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона, андрост-5-ен-3в,17в-диола и 4-андростен-3,17-диона.

5. Способ по п.4, дополнительно включающий стадию введения пациентам терапевтически эффективного количества селективного модулятора эстрогеновых рецепторов для защиты матки и молочной железы от рака как составной части комбинированной терапии.

6. Способ лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии, атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением или недостаточной толщиной слоя тикси1апк стенки влагалища у женщин в постменопаузе, путем увеличения толщины слоя тикси1абк стенки влагалища, включающий введение нуждающимся в таком лечении пациентам предшественника половых стероидов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона, андрост5-ен-3в,17в-диола и 4-андростен-3,17-диона.

7. Способ по п.6, дополнительно включающий стадию введения пациентам терапевтически эффективного количества селективного модулятора эстрогеновых рецепторов для защиты матки и молочной железы от рака как составной части комбинированной терапии.

8. Способ лечения или снижения вероятности возникновения половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1атта ргорба и/или слоя тикси1абк влагалища, включающий введение нуждающимся в таком лечении пациентам терапевтически эффективного количества предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона, андрост-5ен-3в,17в-диола и 4-андростен-3,17-диона и дополнительно введение селективного модулятора эстрогеновых рецепторов как составной части комбинированной терапии.

9. Способ по п.1, в котором предшественником половых стероидов является дегидроэпиандростерон.

10. Способ по п.1, в котором предшественником половых стероидов является сульфат дегидроэпиандростерона.

11. Способ по п.1, в котором предшественником половых стероидов является андрост-5-ен-3в,17вдиол.

12. Способ по любому из пп.1-8, в котором предшественник половых стероидов вводится интравагинально.

13. Способ по любому из пп.1-8, в котором предшественник половых стероидов вводится перорально или через кожу.

14. Способ по любому из пп.2, 3, 5, 7 и 8, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов вводится перорально, через кожу или интравагинально.

15. Способ лечения атрофического вагинита или вагинальной атрофии у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1ат1па ргорба и/или слоя тикси1апк влагалища, который включает введение нуждающимся в таком лечении пациентам предшественника половых стероидов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона, андрост-5-ен-3в,17в-диола и 4-андростен-3,17-диона, в сочетании с селективным модулятором эстрогеновых рецепторов.

16. Способ по любому из пп.2, 3, 5, 7, 8, 14 или 15, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу со следующими свойствами:

(а) два фенильных кольца разделены 1-2 промежуточными атомами углерода, причем оба кольца являются замещенными или незамещенными гидроксильной группой или группой, превращающейся ш У1уо в гидроксил;

(б) боковая цепь обладает группировкой, выбранной из группы, состоящей из метина, метилена, СО, -О-, -З-, ароматического кольца, функциональной группы третичного амина или их соли.

17. Способ по любому из пп.2, 3, 5, 7, 8, 14 или 15, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу со следующими свойствами:

(а) два фенильных кольца разделены 1-2 промежуточными атомами углерода, причем оба кольца являются замещенными или незамещенными гидроксильной группой или группой, превращающейся ш У1уо в гидроксил;

(б) боковая цепь обладает группировкой, выбранной из группы, состоящей из

- 23 014878

18. Способ по п.15, в котором предшественник половых стероидов и селективный модулятор эстрогеновых рецепторов вводятся интравагинально, перорально или через кожу.

19. Способ по любому из предыдущих пп.2, 3, 5, 7, 8, 14 или 15, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу с

а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη у1уо в гидроксил;

б) боковой цепью, обладающей ароматическим кольцом и функциональной группой третичного амина или его соли.

20. Способ по любому из пп.2, 3, 5, 7, 9, 14 или 15, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет следующую формулу:

где Κι и К₂ независимо означают водород, гидроксил или группировку, превращающуюся в гидроксил ίη у1уо;

Ζ означает двухвалентную замыкающую группировку;

Κ.ι₀₀ означает двухвалентную группировку, отделяющую Ь от кольца В на 4-10 промежуточных атомов;

Ь означает двухвалентную или трехвалентную полярную группировку, выбранную из группы, состоящей из -8Ο-, -ΟΟΝ-, -Ν< и -8ΟΝ<;

Οι выбран из группы, состоящей из водорода, С1-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей 6₂ и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

6₂ либо отсутствует, либо выбран из группы, состоящей из водорода, С1-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей 61 и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

6₃ выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

21. Способ по п.19, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов является оптически активным соединением, имеющим абсолютную конфигурацию 8 по углероду 2, либо его фармацевтически приемлемой солью, при этом данное соединение имеет такую молекулярную структуру где Κι и К₂ независимо выбраны из группы, состоящей из гидроксила и группировки, превращающейся ίη у1уо в гидроксил;

К³ означает заместитель, выбранный из группы, состоящей из насыщенного, ненасыщенного или замещенного пирролидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидино, насыщенно го, ненасыщенного или замещенного пиперидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного морфолино, азотсодержащей циклической группировки, азотсодержащей полициклической группировки и ΝΚΚ (К_а и К_ь независимо означают водород, линейный или разветвленный С1-С₆-алкил, линейный или разветвленный С2-С6-алкенил либо линейный или разветвленный С2-С6-алкинил).

22. Способ по п.21, в котором соединение или соль практически не содержит (2К)-энантиомера.

- 24 014878

23. Способ по п.21, в котором производное бензопирана представляет собой соль кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, адипиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, йодистоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, соляной кислоты, гидрохлоротиазидной кислоты, гидроксинафталиновой кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфоновой кислоты, метилсерной кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты, азотной кислоты, пальмитиновой кислоты, пивалиновой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, терефталевой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты и валериановой кислоты.

24. Способ по любому из предыдущих пп.5, 7, 8 или 14-19, в котором селективным модулятором эс-

25. Способ по п.19, в котором соединение выбрано из группы, состоящей из О-(-)-тартратной соли (-)-цис-(5К,68)-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола (лазофоксифена).

26. Способ по любому из предыдущих пп.2-8 или 12-19, в котором предшественником половых стероидов является дегидроэпиандростерон.

27. Применение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного предшественника половых стероидов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона и андрост-5-ен-3в,17в-диола в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем, пригодным для нанесения на слизистую влагалища, для изготовления фармацевтической композиции для лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии, атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1ат1па ргорпа и/или слоя тщсикнА влагалища.

28. Применение по п.27, при котором для изготовления указанной фармацевтической композиции дополнительно используют терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного селективного модулятора эстрогеновых рецепторов.

29. Применение по п.27, при котором наполнитель, разбавитель или носитель представляет собой гель.

30. Применение по п.27, при котором изготавливаемая фармацевтическая композиция представляет собой свечу или овоид.

31. Применение по п.28, при котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу с

а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

б) боковой цепью, обладающей ароматическим кольцом и функциональной группой третичного амина или его соли.

32. Применение по п.28, при котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу с

а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

б) боковой цепью, обладающей группировкой, выбранной из группы, состоящей из метина, метилена, -СО, -О-, -8-, ароматического кольца, функциональной группы третичного амина или их соли.

33. Применение по п.28, при котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу со следующими свойствами:

(а) два фенильных кольца разделены 1-2 промежуточными атомами углерода, причем оба кольца являются замещенными или незамещенными гидроксильной группой или группой, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

(б) боковая цепь обладает группировкой, выбранной из группы, состоящей из

- 25 014878

34. Применение по п.28, при котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет следующую формулу:

где В1 и В независимо означают водород, гидроксил или группировку, превращающуюся в гидроксил 1п тгуо;

Ζ означает двухвалентную замыкающую группировку;

В100 означает двухвалентную группировку, отделяющую Ь от кольца В на 4-10 промежуточных атомов;

Ь означает двухвалентную или трехвалентную полярную группировку, выбранную из группы, состоящей из -8О-, -СОЫ-, -Ν< и -8ОЫ<;

О1 выбран из группы, состоящей из водорода, С_гС5-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей О2 и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

О2 либо отсутствует, либо выбран из группы, состоящей из водорода, С_гС5-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей О1 и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

О3 выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

35. Применение по п.31, при котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов является оптически активным соединением, имеющим абсолютную конфигурацию 8 по углероду 2, либо его фармацевтически приемлемой солью, при этом данное соединение имеет такую молекулярную структуру где В1 и В2 независимо выбраны из группы, состоящей из гидроксила и группировки, превращающейся 1п т1то в гидроксил;

В3 означает заместитель, выбранный из группы, состоящей из насыщенного, ненасыщенного или замещенного пирролидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидино, насыщенно го, ненасыщенного или замещенного пиперидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного морфолино, азотсодержащей циклической группировки, азотсодержащей полициклической группировки и ΝΒΚ^ (Ва и Вь независимо означают водород, линейный или разветвленный Сг-Сб-алкил, линейный или разветвленный С2-С6-алкенил либо линейный или разветвленный С2-С6-алкинил).

36. Применение по п.35, при котором соединение или соль практически не содержит (2В)энантиомер.

37. Применение по п.35, при котором производное бензопирана представляет собой соль кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, адипиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, йодистоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, соляной кислоты, гидрохлоротиазидной кислоты, гидроксинафтойной кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфоновой кислоты, метилсерной кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты, азотной кислоты, пальмитиновой кислоты, пивалиновой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, терефталевой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты и валериановой кислоты.

38. Применение по п.28, при котором селективным модулятором эстрогеновых рецепторов является

- 26 014878

39. Применение по п.28, при котором соединение представляет собой О-(-)-тартратную соль (-)-цис(5К,68)-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола (лазофоксифен).

40. Применение по любому из предыдущих пп.27-39, при котором предшественником половых стероидов является дегидроэпиандростерон.

41. Набор лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии, атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1ат1па ргорпа и/или слоя тикси1апк влагалища, включающий первый контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, сульфата дегидроэпиандростерона и андрост-5-ен-3в,17в-диола, и дополнительно содержит второй контейнер, содержащий эффективное количество по меньшей мере одного селективного модулятора эстрогеновых рецепторов.

42. Набор по п.41 для лечения или снижения вероятности возникновения заболеваний или состояний влагалища, выбранных из группы, состоящей из сухости влагалища, вагинального зуда, вагинальной атрофии, атрофического вагинита, диспареунии и половой дисфункции у женщин в постменопаузе, вызываемых нежелательными состояниями или изменением одного или обоих слоев 1атта ргорпа и/или слоя тикси1аг1к влагалища, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу с

а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ш νίνο в гидроксил;

б) боковой цепью, обладающей ароматическим кольцом и функциональной группой третичного амина или его соли.

43. Набор по п.41, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу с

а) двумя ароматическими кольцами, разделенными 1 или 2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца либо не замещены, либо замещены гидроксильной группой или группой, превращающейся ш νίνο в гидроксил;

б) боковой цепью, обладающей группировкой, выбранной из группы, состоящей из метина, метилена, -СО, -О-, -8-, ароматического кольца, функциональной группы третичного амина или их соли.

44. Набор по п.41, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет молекулярную формулу со следующими свойствами:

(а) два фенильных кольца разделены 1-2 промежуточными атомами углерода, причем оба кольца являются замещенными или незамещенными гидроксильной группой или группой, превращающейся ш νίνο в гидроксил;

(б) боковая цепь обладает группировкой, выбранной из группы, состоящей из

45. Набор по п.41, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов имеет следующую формулу:

- 27 014878 где Κι и К₂ независимо означают водород, гидроксил или группировку, превращающуюся в гидроксил ίη νίνο;

Ζ означает двухвалентную замыкающую группировку;

Κ₄₀₀ означает двухвалентную группировку, отделяющую Ь от кольца В на 4-10 промежуточных атомов;

Ь означает двухвалентную или трехвалентную полярную группировку, выбранную из группы, состоящей из -80-, -ΟΘΝ-, -Ν< и -8ΘΝ<;

Οι выбран из группы, состоящей из водорода, С1-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей 6₂ и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

6₂ либо отсутствует, либо выбран из группы, состоящей из водорода, С1-С₅-углеводорода или двухвалентной группировки, соединяющей 61 и Ь с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, а также галоидных или ненасыщенных производных вышеприведенного;

6₃ выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

46. Набор по п.42, в котором селективный модулятор эстрогеновых рецепторов является оптически активным соединением, имеющим абсолютную конфигурацию 8 по углероду 2, либо его фармацевтически приемлемой солью, при этом данное соединение имеет такую молекулярную структуру

3'

5‘ где Κι и К₂ независимо выбраны из группы, состоящей из гидроксила и группировки, превращающейся ίη νίνο в гидроксил;

Κ3 означает разновидность, выбранную из группы, состоящей из насыщенного, ненасыщенного или замещенного пирролидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидино, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного морфолино, азотсодержащей циклической группировки, азотсодержащей полициклической группировки и ΝΚΚ (К_а и К_ь независимо означают водород, линейный или разветвленный С1-С₆-алкил, линейный или разветвленный С2-С6-алкенил либо линейный или разветвленный С2-С6-алкинил).

47. Набор по п.46, в котором соединение или соль практически не содержит (2К)-энантиомера.

48. Набор по п.46, в котором производное бензопирана представляет собой соль кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, адипиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, йодистоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, соляной кислоты, гидрохлоротиазидной кислоты, гидроксинафталиновой кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфоновой кислоты, метилсерной кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты, азотной кислоты, пальмитиновой кислоты, пивалиновой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, терефталевой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты и валериановой кислоты.

49. Набор по п.41, в котором селективным модулятором эстрогеновых рецепторов является

50. Набор по п.41, в котором соединение выбрано из группы, состоящей из О-(-)-тартратной соли (-)-цис-(5К,68)-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола (лазофоксифена).

51. Набор по любому из предыдущих пп.41-50, в котором предшественником половых стероидов является дегидроэпиандростерон.