EA013617B1 - Мутации рецептора эпидермального фактора роста - Google Patents

Мутации рецептора эпидермального фактора роста Download PDF

Info

Publication number
EA013617B1
EA013617B1 EA200701804A EA200701804A EA013617B1 EA 013617 B1 EA013617 B1 EA 013617B1 EA 200701804 A EA200701804 A EA 200701804A EA 200701804 A EA200701804 A EA 200701804A EA 013617 B1 EA013617 B1 EA 013617B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
mutant
mutation
subject
disease
Prior art date
Application number
EA200701804A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701804A1 (ru
Inventor
Дэниель Фримэн
Тодд Хуан
Роберт Рейдински
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA200701804A1 publication Critical patent/EA200701804A1/ru
Publication of EA013617B1 publication Critical patent/EA013617B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Описаны мутации рецептора эпидермального фактора роста (EGFr), фосфатидилинозит 3'-киназы ("PI3K") и В-Raf. Описаны способы лечения опухолей, содержащих мутантный EGFr, человеческими моноклональными антителами, специфическими к EGFr. Также описываются способы и наборы для подтверждения присутствия одного или более мутантных EGFr, мутантных PI3K и/или мутантных В-Raf в образце и для лечения нарушений или состояний, связанных с присутствием мутантного EGFr, мутантного PI3K и/или мутантного В-Raf. Описываются также способы лечения опухолей, содержащих мутантный EGFr, мутантный PI3K и/или мутантный В-Raf.

Description

Настоящая заявка относится к мутациям рецептора эпидермального фактора роста (ЕОЕг), к полинуклеотидам, кодирующим мутантные ЕОЕт полипептиды, к векторам, содержащим эти полипептиды, клеткам, экспрессирующим эти полипептиды, и антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка относится также к мутациям фосфатидилинозит-3-киназы (ΡΙ3Κ), к полинуклеотидам, кодирующим мутантные ΡΙ3Κ полипептиды, к векторам, содержащим эти полинуклеотиды, и к антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка также относится к мутациям В-ВаЕ, к полинуклеотидам, кодирующим мутантные В-ВаЕ полипептиды, к векторам, содержащим эти полипептиды, клеткам, экспрессирующим эти полипептиды, и антителам, которые связываются с этими полипептидами. Настоящая заявка относится также к способам диагностики рака; способам лечения рака с применением соединений, реакционноспособных (реактивных) в отношении мутантных ЕОЕт полипептидов, мутантных ΡΙ3Κ полипептидов, мутантных В-ВаЕ полипептидов; и к способам и наборам для прогнозирования применимости анти-ЕОЕт специфических связывающих агентов, анти-Р13К специфических связывающих агентов, анти-В-ВаЕ специфических связывающих агентов при лечении опухолей.
Предпосылки создания изобретения
Некоторые применения моноклональных антител в терапии рака основаны на способности антитела специфически доставлять к раковым тканям цитотоксические эффекторные функции, такие как повышающие иммунитет изотипы, токсины или лекарства. Альтернативным методом является применение антител для того, чтобы непосредственно влиять на жизнеспособность опухолевых клеток, лишать их необходимых внеклеточных сигналов пролиферации, таких как сигналы, опосредуемые факторами роста через их клеточные рецепторы. Одной из привлекательных мишеней при таком подходе является рецептор эпидермального фактора роста (ЕОЕг), который связывает ЕОЕ и трансформирующий фактор роста α (ТОЕа) (см., например, ИПпсй е! а1., Се11 61: 203-212, 1990; Вазе1да е! а1., РНагтасоЕ ТНег. 64: 127-154, 1994; Мепбекоп е! а1., ίη Вю1ощс Тйегару оЕ Сапсег 607-623, Р1н1абе1р1на: ЕВ. ЫрршсоЦ Со., 1995; Еап е! а1., Сигг. Орш. Опсо1. 10: 67-73, 1998). Связывая ЕОЕ или ТОЕа с ЕОЕг, трансмембранный гликопротеин клеточной поверхности 170 кДа включает каскад клеточных биохимических событий, в том числе аутофосфорилирование и интернализацию ЕОЕг, которая достигает высшей точки при клеточной пролиферации (см., например, ИПпсй е! а1., Се11 61: 203-212, 1990).
Некоторые наблюдения позволяют связать ЕОЕг непосредственно с содействием развитию и прогрессированию человеческих солидных опухолей. Показано, что ЕОЕ-г сверхэкспрессируется на многих типах солидных опухолей (см., например, Мепбекойп Сапсег Се11з 7: 359 (1989), Мепбекойп Сапсег Вю1оду 1: 339-344 (1990), МобраНеб! апб Эеап 1п!'1 1. Опсо1оду 4: 277- 296 (1994)). Например, сверхэкспрессия ЕОЕ-г наблюдалась при некоторых злокачественных опухолях лёгкого, молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты (см., например, Мобфайеб1 апб Эеап 1п!'1 1. Опсо1о§у 4: 277-296 (1994)). Сообщалось, что повышение уровней рецептора ассоциируется с плохим клиническим прогнозом (см., например, Вазе1да е! а1. РНагтасоЕ Т1ег. 64: 127-154, 1994; Мепбекойп е! а1., Вю1ощс ТНегару оЕ Сапсег рр. 607-623, РЫ1абе1рЫа: ЕВ. Ь1рршсо!1 Со., 1995; Мобфайеб1 е! а1., 1п!1. 1. оЕ Опсо1оду 4: 277-296, 1994; ОиШск, Вг. Мебюа1 Ви11е!ш, 47: 87-98,1991; 8а1отоп е! а1., Сгй. Веу. Опсо1. Нета!о1. 19: 183-232, 1995). Показано, что как эпидермальный фактор роста (ЕОЕ), так и трансформирующий фактор роста-альфа (ТОЕ-α) связываются с ЕОЕ-г и управляют клеточной пролиферацией и ростом опухоли. Во многих случаях повышенная экспрессия поверхностного ЕОЕг сопровождается продуцированием опухолевыми клетками ТОЕа или ЕОЕ, что наводит на мысль о вовлечении аутокринной регуляции роста (см., например, Вазе1да е! а1. Р1агтасо1. ТНег. 64: 127- 154, 1994; Мепбе15о1т е! а1., Вю1ощс ТНегару оЕ Сапсег рр. 607-623, Р1н1абе1р1на: ЕВ. Ь1рршсо!1 Со., 1995; МобраНеб! е! а1., 1п!1. 1. оЕ Опсо1оду 4: 277-296, 1994; 8а1отоп е! а1., Стй. Веу. Опсо1. Нета!о1. 19: 183-232,1995).
Поэтому некоторые группы (исследователей) предположили, что антитела против ЕОЕ, ТОЕ-α и ЕОЕ-г могут применяться в терапии опухолей, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих ЕОЕ-г (см., например, Мепбекойп Сапсег Се1к 7: 359 (1989); Мепбекойп Сапсег Вю1о§у 1: 339- 344 (1990); МобраНеб1 апб Эеап 1п!'1 1. Опсо1оду 4: 277-296 (1994); Той е! а1. 1п!'1 1. Сапсег 62: 643-650 (1995)). Действительно, было показано, что, очевидно, антитела против ЕОЕ-г, блокирующие связывание ЕОЕ и ТОЕ-α с рецептором, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток. Однако в то же время антитела против ЕОЕ-г, по-видимому, не ингибируют независимый от ЕОЕ и ТОЕ-α рост клеток (МобраНеб! апб Эеап 1п!'1 1. Опсо1оду 4: 277-296 (1994)).
Моноклональные антитела, специфические к человеческому ЕОЕг, способные нейтрализовать связывание ЕОЕ и ТОЕα с опухолевыми клетками и ингибировать опосредованную лигандами пролиферацию клеток ш У11го. получают из мышей и крыс (см., например, Вазе1да е! а1., РНагтасоЕ ТНег. 64: 127154, 1994; Мепбекойп е! а1., в Вю1одс ТНегару оЕ Сапсег 607-623, РЫ1абе1рЫа: ЕВ. Ь1рршсо!1 Со., 1995; Еап е! а1., Сигг. Орш. Опсо1. 10: 67-73,1998; МобраНеб! е! а1., 1п!1. 1. Опсо1оду 4: 277-296, 1994). Некоторые из этих антител, такие как такие как мышиные 108, 225 (см., например, АЬоиб-Рпак е! а1., 1. Ыа!1. Сапсег 1пй. 80: 1605-1611, 1988) и 528 (см., например, Вазе1да е! а1., РНагтасоЕ ТНег. 64: 127-154, 1994; Мепбе18оНп е! а1., в Вю1ощс ТНегару оЕ Сапсег 607- 623, РЫ1абе1рЫа: ЕВ. Ь1рршсо!! Со., 1995) или крысиные
- 1 013617
1СК16, 1СК62 и 1СК64 (см., например, Моб)1а11еб1 е! а1., Ιηίί. 1. Оисо1оду 4: 277-296, 1994; Моб)1а11еб1 е! а1., Вг. 1. Сапсег 67: 247-253, 1993; Моб)1а11еб1 е! а1., Вг. 1. Сапсег 67: 254-261, 1993) моноклональные антитела, оценивали исключительно по их способности влиять на рост опухоли у мышиных моделей ксенотрансплантата. Большинство моноклональных антител против ЕСЕг эффективно предупреждали образование опухоли у бестимусных мышей при введении вместе с человеческими опухолевыми клетками (Ваке1да е! а1. Рйагтасо1. Тйег. 64: 127-154, 1994; Мобфайеб1 е! а1., Вг. 1. Сапсег 67: 254-261, 1993). После инъекции мышам, несущим установленные человеческие опухолевые ксенотрансплантаты, мышиные моноклональные антитела 225 и 528 вызывали частичный рецидив опухоли, и для ликвидации опухолей требовалось совместное введение химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин или цисплатин (Ваке1да е! а1. Рйагтасо1. Тйег. 64: 127-154, 1994; Меибекойи е! а1., в Вю1од1с Тйегару о! Сапсег 607623, Рй11абе1рй1а: 1.В. Ырршсо!! Со., 1995; Еаи е! а1., Саисег Век. 53: 4637-4642, 1993; Ваке1да е! а1., 1. №111. Саисег 1ик!. 85: 1327-1333, 1993). Химерный вариант моноклонального антитела 225 (С225), в котором вариабельные области мышиного антитела связаны с человеческими константными областями, проявляет повышенную ш νί\Ό противоопухолевую активность, но только в высоких дозах (см., например, Со1бк!еш е! а1., Сйшса1 Саисег Век. 1: 1311-1318, 1995; РгепеН е! а1., 1. 1ттиио1йег. Етрйак1к Титог 1ттиио1. 19: 419-427, 1996). Крысиные антитела 1СВ16, 1СВ62 и 1СВ64 вызывали регрессию установленных опухолей, а не их полное уничтожение (Мобфайеб) е! а1., Вг. 1. Саисег 67: 254-261, 1993). Эти результаты доказали, что ЕСЕг является перспективной мишенью терапии с применением антител против экспрессирующих ЕСЕг солидных опухолей, и привели к клиническим испытаниям на людях моноклонального антитела С225 для различных видах солидного рака (см., например, Ваке1да е! а1. Рйагтасо1. Тйег. 64: 127-154, 1994; Меибе1койи е! а1., Вю1одю Тйегару о! Саисег рр. 607-623, РЫ1абе1рЫа: ЕВ. Ырршсо!! Со., 1995; Моб)1а11еб1 е! а1., 1и!1. 1. о! Оисо1оду 4: 277-296, 1994).
Некоторые достижения в биологических областях сделали возможным получить полностью человеческое антитело против ЕСЕг. Используя мышей, трансгенных вследствие генов человеческого иммуноглобулина (Хеиотоике™ !есйио1оду, АЬдешх, 1ис.), создают человеческие антитела, специфические к человеческому ЕСЕг (см., например, Меибех, №а!иге Сеиейск, 15: 146-156, 1997; 1акоЬоуйк, Лбуаисеб Игид Иейуегу Веу1е^к, 31(1-2): 33- 42,1998; 1акоЬоуйк, Ехрей Оршюи ои 1иуекйдайоиа1 Игидк, 7(4): 607614,1998; Уаид е! а1., Сгй. Веу. Оисо1. Нета!о1. 38(1): 17-23, 2001; Международные патентные заявки \УО 98/24893; \УО 98/50433). Показано, что одно такое антитело, моноклональное человеческое 1дС2 антитело с аффинностью 5х10-11 М к человеческому ЕСЕг, блокирует связывание ЕСЕ с ЕСЕг, блокирует передачу сигнала от рецептора и ингибирует активацию и пролиферацию ш У1!го опухолевых клеток (см., например, Международная патентная заявка XVО 98/50433; патент США № 6235883). Исследования на бестимусных мышах показали, что панитумумаб также обладает ш νί\Ό активностью, не только предупреждая образование ксенотрансплантатов эпидермоидной карциномы человека линии А431 у бестимусных мышей, но также уничтожая уже установленные опухолевые ксенотрансплантаты линии А431 (см., например, Уаид е! а1., Сгй. Веу. Оисо1. Нета!о1. 38(1): 17-23, 2001; Уаид е! а1., Саисег Век. 59(6): 1236-43, 1999). Рассматривалось применение панитумумаба для лечения, наряду с другими, рака почки, колоректальной аденокарциномы, рака простаты и немелкоклеточного плоскоклеточного рака лёгкого (см., например, опубликованную патентную заявку США 2004/0033543), а в настоящее время проводятся клинические испытания этого антитела.
В некоторых типах клеток связывание факторов роста, таких как ЕСЕг, предупреждает апоптоз за счёт стимуляции фосфатидилинозит-3-киназы (Р13К) и В-Ва!. Активация Р13К включает молекулярный каскад, что приводит к даунрегуляции (отрицательной модуляции) центральных метаболических путей, контролирующих запрограммированную гибель клеток (Уао, В., 8с1еисе 267: 2003-2006, 1995). Члены семейства Ва! были также идентифицированы как регуляторы запрограммированной гибели клеток у млекопитающих (Нии!ег, Се11 80: 225-236, 1995). При нокаутировании по Ва! у мышей, у которых отсутствует В-Ва!, наблюдается нарушение жизнеспособности клеток, тогда как у мышей, у которых отсутствуют Ва!-1 или А-Ва!, не наблюдается таких нарушений (см., например, Ргйсйагб, Сшт. Вю1. 6: 614-617, 1996; \Vо^ηо\νкк^. №11. Сеие!. 16: 293-297, 1997), это показывает, что В-Ва! может обладать специфическими функциями в регуляции гибели клеток. Как Р13К, так и В-Ва! играют важную роль в нарушениях клеточной пролиферации, в частности в случае рака.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ №О: 2, 8ЕО ΙΌ №О: 3, 5ЕС ΙΌ №О: 5, 5ЕС ΙΌ №О: 6, 5ЕС ΙΌ №О: 7, 5ЕС ΙΌ №О: 8, 5ЕС ΙΌ №О: 9, 5ЕС ΙΌ №О: 10, 5ЕС ΙΌ №О: 12 и 8ЕО ΙΌ №О: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, состоящий, по меньшей мере, из одной аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ №О: 2, 5ЕС ΙΌ №О: 3, 5ЕС ΙΌ №О: 5, 5ЕС ΙΌ №О: 6, 5ЕС ΙΌ №О: 7, 5ЕС ΙΌ №О: 8, 5ЕС ΙΌ №О: 9, 5ЕС ΙΌ №О: 10, 5ЕС ΙΌ №О: 12 и 5ЕС ΙΌ №О: 13.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из
- 2 013617
8Ер ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕР ΙΌ N0: 10, БЕР ΙΌ N0: 12 и БЕР ΙΌ N0: 13. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из БЕР ΙΌ N0: 2, БЕР ΙΌ N0: 3, БЕР ΙΌ N0: 5, БЕР ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12 и БЕр ΙΌ N0: 13.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕР ΙΌ N0: 15, БЕР ΙΌ N0: 16 и БЕР ΙΌ N0: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из БЕР ΙΌ N0: 15, БЕР ΙΌ N0: 16 и БЕр ΙΌ N0: 17.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16 и БЕр ΙΌ N0: 17. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16 и БЕр ΙΌ N0: 17.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12, БЕр ΙΌ N0: 13, БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16, БЕр ΙΌ N0: 17, БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается клетка-хозяин, содержащая этот вектор. В некоторых вариантах изобретения предусматривается клетка, трансформированная по меньшей мере одним выделенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12, БЕр ΙΌ N0: 13, БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16, БЕр ΙΌ N0: 17, БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения полипептида. Способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который заключает в себе по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования полипептида. Способ включает культивирование клетки, содержащей по меньшей мере один выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает выделение полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается полипептид, полученный этим способом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок, содержащий выделенный полипептид, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12, БЕр ΙΌ N0: 13, БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16, БЕр ΙΌ N0: 17, БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20, слитую с гетерологичным полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается специфический связывающий агент, способный связываться с выделенным полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12, БЕр ΙΌ N0: 13, БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16, БЕр ΙΌ N0: 17, БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах изобретения специфический связывающий агент выбирают по меньшей мере из одной молекулы, выбранной из: антитела, антитела, в котором тяжёлая цепь и лёгкая цепь связаны линкером, одно- Εν антитела, иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина, ЕаЬ антитела, ЕаЬ' антитела, Г(аЬ')2 антитела, моноклонального антитела, поликлонального антитела, антиидиотипического антитела, полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антител, СОЯ-привитого антитела и антитела, которое ингибирует связывание ЕСЕ с выделенным полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из БЕр ΙΌ N0: 2, БЕр ΙΌ N0: 3, БЕр ΙΌ N0: 5, БЕр ΙΌ N0: 6, БЕр ΙΌ N0: 7, БЕр ΙΌ N0: 8, БЕр ΙΌ N0: 9, БЕр ΙΌ N0: 10, БЕр ΙΌ N0: 12, БЕр ΙΌ N0: 13, БЕр ΙΌ N0: 15, БЕр ΙΌ N0: 16, БЕр ΙΌ N0: 17, БЕр ΙΌ N0: 19 и БЕр ΙΌ N0: 20.
- 3 013617
В некоторых вариантах изобретения предусматривается получение антитела, способного связываться по меньшей мере с одним полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12 и ЗЕО ГО N0: 13. В некоторых вариантах изобретения способ включает введение животному по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12 и ЗЕО ГО N0: 13. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает получение антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12 и ЗЕО ГО N0: 13, из организма животного.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается трансгенное нечеловеческое животное, содержащее по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19 и ЗЕО 1О N0: 20.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19 и ЗЕО ГО N0: 20, связанную с твёрдой подложкой (носителем). В некоторых вариантах изобретения предусматривается полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО 1О N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19 и ЗЕО ГО N0: 20, связанную с твёрдой подложкой (носителем).
В некоторых вариантах изобретения предусматривается ряд полинуклеотидов, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19 и ЗЕО ГО N0: 20. В некоторых вариантах изобретения предусматривается ряд полипептидов, включающий по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0: 13, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 19 и ЗЕО ГО N0: 20.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается нуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСРг. В некоторых вариантах изобретения область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н. К745К, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, О849Р, Р910Ь и У948Л. В некоторых вариантах изобретения нуклеотидный зонд гибридизуется с комплементом полинуклеотида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций в субъекте. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики чувствительности к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций в субъекте. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия экспрессии или количественное определение экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 12 и ЗЕО ГО N0: 13 в образце от субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций на основании определения наличия экспрессии или количественного определения экспрессии полипептида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСРг полипептид в образце. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия мутантного ЕСРг полипептида в образце. В некоторых вариантах изобретения способ включает экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСРг полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ЕСРг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, К745К, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Р910Ь и У948Л. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает определение наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСРг полипептид в образце. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия мутантного ЕСРг полипептида в образце для анализа, взятом у субъекта.
- 4 013617
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики у субъекта рака, связанного с ЕСЕг. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701 Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: Ь688Р, 0701 Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948Л, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида позволяет диагностировать у субъекта рак, связанный с ЕСЕг. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полинуклеотида позволяет диагностировать у субъекта рак, связанный с ЕСЕг.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения вероятности развития рака, связанного с ЕСЕг, у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: Ь688Р, 0701Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из: Ь688Р, 0701Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие, по меньшей мере, мутантного ЕСЕг полипептида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с ЕСЕг. В некоторых вариантах изобретения присутствие по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полинуклеотида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с ЕСЕг.
В некоторых вариантах изобретения рак, связанный с ЕСЕг, является немелкоклеточным раком лёгкого.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ скрининга на модулятор активности, по меньшей мере, одного мутантного ЕСЕг полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из: Ь688Р, 0701Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А. В некоторых вариантах изобретения способ включает контактирование клетки с тестируемым соединением и определение, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения предусматривается соединение, идентифицируемое этим способом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией, выбранной из Ь688Р, 0701Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А. В некоторых вариантах изобретения способ содержит введение соединения субъекту, нуждающемуся в лечении от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ включает детектирование по меньшей мере одной ЕСЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, причём обнаружение по меньшей мере одной ЕСЕг мутации показывает, что пациент обладает повышенной чувствительностью к развитию заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ включает детектирование по меньшей мере одной ЕСЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, причём обнаружение по меньшей мере одной ЕСЕг мутации показывает, что у пациента наблюдается заболевание или состояние, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает введение субъекту антитела, которое специфически связывает мутантный ЕСЕг полипептид. В некоторых вариантах изобретения антитело является человеческим антителом. В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или его антиген-связывающая область.
В некоторых вариантах изобретения ЕСЕг мутацию выбирают из Ь688Р, 0701Η, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948А.
В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией является немелкоклеточным раком лёгкого.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией. В некоторых вариантах изобретения этот способ включает введение полинуклеотида, антисмыслового по отношению к полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 15, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20,
- 5 013617 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ установления профиля мутантной популяции ЕСЕг в специфической популяции индивидуумов. В некоторых вариантах изобретения этот способ включает определение наличия по меньшей мере одной ЕСЕг мутации в генетическом профиле индивидуумов в популяции. В некоторых вариантах изобретения способ дополнительно включает установление соотношения между мутантным ЕСЕг генетическим профилем и специфическими характеристиками индивидуума. В некоторых вариантах изобретения специфические характеристики индивидуума включают проявление заболевания или состояния, связанного с ЕСЕг мутацией.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ прогнозирования эффективности лечения гефитинибом заболевания или состояния у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение присутствия или отсутствия ЕСЕг мутации Т790М в мутантном ЕСЕг полипептиде субъекта. В некоторых вариантах изобретения присутствие ЕСЕг мутации Т790М в мутантных ЕСЕг полипептидах указывает на резистентность к лечению гефитинибом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения восприимчивости к лечению с помощью антитела против ЕСЕг у субъекта, страдающего раковым заболеванием. В некоторых вариантах изобретения способ включает определение присутствия или отсутствия ЕСЕг мутации Т790М у субъекта. В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или цетуксимаб.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается набор для обнаружения полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид у субъекта. В некоторых вариантах изобретения набор содержит зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСЕг полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, О701Н. Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948Л. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит два или более праймера для амплификации. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит детектирующий компонент. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит компонент для выборки нуклеотидов.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолей немелкоклеточного рака лёгких (Ν8ΟΕΟ) двадцати пациентов, на основании исследования, описанного в примере 1. ЕСЕг экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, ΡΙ3Κ экзоны 9 и 20 и В-ВаТ экзон 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа ЕСЕг, ΡΙ3Κ или В-ВаТ.
На фиг. 2 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолей колоректальной аденокарциномы (СВС) двадцати пациентов, на основании исследования, описанного в примере 1. ЕСЕг экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, ΡΙ3Κ экзоны 9 и 20 и В-ВаТ экзон 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа ЕСЕг, ΡΙ3Κ или В-ВаТ.
На фиг. 3 представлена таблица, на которой показан мутационный анализ образцов опухолей ΝΞΟΕΟ тридцати девяти пациентов, на основании исследования, описанного в примере 2. ЕСЕг экзоны 18, 19, 20, 21 и 23, и В-ВаТ экзоны 11 и 15 из геномной ДНК каждой опухоли амплифицировали, секвенировали и сравнивали с последовательностью дикого типа ЕСЕг или В-ВаТ.
На фиг. 4 показан результат анализа методом радиоактивного гель-электрофореза ингибирующей активности гефитиниба и панитумумаба в отношении аутофосфорилирования дикого типа и Т790М ЕСЕг на основании исследования, описанного в примере 3.
На фиг. 5 показано выравнивание некоторых мутантных ЕСЕг полинуклеотидных и полипептидных последовательностей и некоторых ΡΙ3Κ полинуклеотидных и полипептидных последовательностей с соответствующими последовательностями дикого типа.
На фиг. 6 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и ЕСЕг мутантных молекул.
На фиг. 7 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и ΡΙ3Κ мутантных молекул.
На фиг. 8 показаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности дикого типа и В-ВаТ мутантных молекул.
Подробное описание изобретения
Определения
Если не указано иначе, научные и технические термины, употребляемые применительно к настоящему изобретению, имеют значения, понятные всем специалистам в данной области техники. Кроме того, если не требуется по контексту, термины, относящиеся к единственному числу, включают множество, а термины, относящиеся к множественному числу, включают единственное число.
В основном номенклатура и методы, употребляемые применительно к клетке и клеточной культуре, молекулярной биологии и химии и гибридизации белков и олиго- или полинуклеотидов по данному опи
- 6 013617 санию являются обычной номенклатурой и обычными методами в данной области техники. Стандартные методы применяются для синтеза рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидов и культивирования и трансформации тканевой культуры (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют по описаниям производителя, или так, как это принято в уровне техники, или по данному описанию. Вышеуказанные операции и процедуры обычно осуществляют общепринятыми методами, хорошо известными в уровне техники и описанными в различных общих и более специальных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании. См., например, 8атЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (26 еб., Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1б 8рпп§ НагЬог, Ν.Υ. (1989)), учебник, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Номенклатура и лабораторные процедуры и методы, используемые применительно к аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии по данному описанию, являются общеизвестной и обычной номенклатурой и общеизвестными и обычными методами в данной области техники. Стандартные методы применяются для химических синтезов, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов.
В данной заявке, если не указано иначе, союз или означает и/или. Кроме того, термин включая, а также другие формы, такие как включает и включительно, не являются ограничивающими. Также, если не указано иначе, термины, такие как элемент или компонент, охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы.
Если не указано иначе, то следует понимать, что нижеприведённые термины, применяемые в соответствии с настоящим раскрытием, имеют следующие значения.
Термины выделенный полинуклеотид и выделенная нуклеиновая кислота применяются взаимозаменяемо и при использовании в данном описании означают полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения, или их некую комбинацию, который, вследствие своего происхождения (1) не ассоциируется с целым полинуклеотидом или с частью полинуклеотида, в котором выделенный полинуклеотид находится в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе как часть большей по размеру последовательности.
Термины выделенный белок и выделенный полипептид применяются на равных основаниях и в данном описании означают белок, соответствующий кДНК, рекомбинантной РНК или синтетического происхождения, или некую их комбинацию, который вследствие своего происхождения или источника, из которого он получен, (1) не ассоциируется с белками, обнаруженными в природе, (2) не содержит других белков из того же источника, например, не содержит мышиных белков, (3) экспрессируется в клетке отличного вида, или (4) не встречается в природе.
Термины полипептид и белок используются в данном описании взаимозаменяемо в качестве родового термина в отношении нативного белка, фрагментов, пептидов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, нативный белок, фрагменты и аналоги являются видами рода полипептидов.
Выражение Χ#Υ в контексте мутации в полипептидной последовательности является общепризнанным в уровне техники, где # указывает на локализацию мутации с точки зрения номера аминокислоты полипептида, X указывает на аминокислоту, находящуюся в этом положении в дикого типа аминокислотной последовательности, а Υ указывает на мутантную аминокислоту в этом положении. Например, изображение Ь688Р по отношению к ЕСЕг полипептиду показывает, что лейцин находится в положении аминокислоты 688 последовательности ЕСЕг дикого типа и что лейцин заменён на пролин в мутантной ЕСЕг последовательности.
Выражения мутантный ЕСЕг полипептид и мутантный ЕСЕг белок применяются равноправно и относятся к ЕСЕг полипептиду, содержащему по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82881ор, 0849В, Е910Ь и У948А. Некоторые типичные мутантные ЕСЕг полипептиды включают, но без ограничения, аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции, слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид включает дополнительные остатки на С- или Ν-конце, такие как, но без исключения, остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на аминоконце, остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка.
Выражения мутантный ΡΙ3Κ полипептид и мутантный ΡΙ3Κ белок применяются равноправно и относятся к ΡΙ3Κ полипептиду, содержащему по меньшей мере одну ΡΙ3Κ мутацию, выбранную из Е524К, Е545А и Н1047Ь. Некоторые типичные мутантные ΡΙ3Κ полипептиды включают, но без ограничения, аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции, слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантный ΡΙ3Κ полипептид включает дополнительные остатки на С- или Ν-конце, такие как, но без исключения, остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на
- 7 013617 аминоконце, остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка.
Выражения мутантный В-ВаГ полипептид и мутантный В-ВаГ белок применяются равноправно и относятся к В-ВаГ полипептиду, содержащему по меньшей мере одну В-ВаГ мутацию, выбранную из У600Е и К601Е. Некоторые типичные мутантные В-ВаГ полипептиды включают, но без ограничения, аллельные варианты, варианты, полученные при сплайсинге, варианты, являющиеся производными, варианты, полученные в результате замен, варианты, полученные в результате делеции и/или инсерции, слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ВаГ полипептид включает дополнительные остатки на С- или Ν-конце, такие как, но без исключения, остатки лидерной последовательности, нацеливающие остатки, метиониновые остатки на аминоконце, остатки лизина, метки и/или остатки слитого белка.
Выражение мутантный ЕСЕг слитый белок относится к слиянию одной или более аминокислот (таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного ЕСЕг полипептида.
Выражение мутантный Р13К слитый белок относится к слиянию одной или более аминокислот (таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного ΡΙ3Κ полипептида.
Выражение мутантный В-ВаГ слитый белок относится к слиянию одной или более аминокислот (таких как гетерологичный полипептид) на амино- или карбоксиконце мутантного В-ВаГ полипептида.
Термин природный (встречающийся в природе) по данному описанию в применении к объекту относится к тому факту, что объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не была умышленно модифицирована человеком в лаборатории, или иначе встречается в природе.
Выражение функционально связанный по данному описанию относится к позиционированию, расположению компонентов таким образом, что они связаны так, что это позволяет им функционировать заданным образом. Контрольная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, сходных с условиями для контрольных последовательностей.
Термин контрольная последовательность по данному описанию относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для того, чтобы влиять на экспрессию и процессирование кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательности терминации транскрипции; в эукариотах такие контрольные последовательности обычно включают промотор и последовательности терминации транскрипции. Предполагается, что термин контрольная последовательность включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессирования, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых предпочтительно, например, лидерные последовательности и последовательности партнёров по слиянию.
Термин полинуклеотид по данному описанию означает полимерную форму нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает одно- или двухцепочечные формы ДНК.
Термин олигонуклеотид по данному описанию включает природные или модифицированные нуклеотиды, связанные вместе природными или неприродными олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой субпопуляцию полинуклеотидов, обычно имеющих длину 200 оснований или менее. Предпочтительно, олигонуклеотиды имеют длину (протяжённость) 10-60 оснований, и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 оснований в длину. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными (однотяжевыми), например, для зондов, хотя олигонуклеотиды могут быть двухцепочечными, например, для применения в конструкции мутанта гена. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами.
Выражения мутантный ЕСЕг полинуклеотид, мутантный ЕСЕг олигонуклеотид и мутантная ЕСЕг нуклеиновая кислота применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду, кодирующему ЕСЕг полипептид, содержащий по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Е910Ь и У948Л.
Выражения мутантный ΡΙ3Κ полинуклеотид, мутантный ΡΙ3Κ олигонуклеотид и мутантная ΡΙ3Κ нуклеиновая кислота применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду, кодирующему ΡΙ3Κ полипептид, содержащий по меньшей мере одну ΡΙ3Κ мутацию, выбранную из Е524К, Е545А и Н1047Ь.
Выражения мутантный В-ВаГ полинуклеотид, мутантный В-ВаГ олигонуклеотид и мутантная В-ВаГ нуклеиновая кислота применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду, кодирующему В-ВаГ полипептид, содержащий по меньшей мере одну В-ВаГ мутацию, выбранную из У600Е и Κ60ΓΒ.
Термин природные нуклеотиды по данному описанию включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды по данному описанию включает нуклеотиды с
- 8 013617 модифицированными или замещёнными углеводными группами и т.п. Термин олигонуклеотидные связи по данному описанию включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, фосфороселеноатная, фосфородиселеноатная, фосфороанилотиоатная, фосфороамидатная связь и т.п. См., например, ТаИаисБе е! а1. №.ю1. Ас1бк Кек. 14: 9081 (1986); 8!ес е! а1. 1. Ат. СБет. 8ос. 106: 6077 (1984); 8!еш е! а1. Ыис1. Ас1бк Кек. 16: 3209 (1988); Ζοη е! а1. Αηΐί-Саисег Эгид Эеиди 6: 539 (1991); Ζοη е! а1. ОБдоиис1ео!1бек аиб Аиа1одиек: А Ргас!юа1 АрргоасБ, рр. 87-108 (Р. Ескк!ет, Еб., Охкогб ИшуеткИу Ргекк, Охкогб Еид1аиб (1991)); 8!ес е! а1. патент США Ыо. 5151510; ИБ1таии аиб Реутаи СБеписа1 Ке\зе\\'к 90: 543 (1990), раскрытие которых вводится в данное описание в качестве ссылки. При желании олигонуклеотид может включать метку для обнаружения.
Выражение селективно гибридизуется по данному описанию означает детектируемо и специфически связывается. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты селективно гибридизуются с нуклеотидными нитями в условиях гибридизации и отмывания, которые сводят к минимуму ощутимые количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Условия высокой жёсткости можно использовать для достижения условий селективной гибридизации, известных в технике и обсуждаемых в данном описании. Как правило, гомология нуклеотидных последовательностей между полинуклеотидами, олигонуклеотидами и фрагментами и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью составляет по меньшей мере 80%, и более характерно, с предпочтительно повышенными гомологиями по меньшей мере 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если между их последовательностями существует частичная или полная идентичность. Например, гомология 85% означает, что 85% аминокислот являются идентичными, когда две последовательности выравниваются с целью максимальной совместимости. Для достижения максимальной совместимости разрешены гэпы (щели) (в каждой из двух выравниваемых последовательностей); предпочтительно, длина гэпов составляет 5, более предпочтительно 2 или менее. Или же, и предпочтительно две белковые последовательности (или полипептидные последовательности, образованные из них, длиной по меньшей мере 30 аминокислот) являются гомологичными, по данному описанию, если их показатель выравнивания более 5 (в единицах стандартной девиации) при использовании программы АЫСЫ с матрицей данных для мутаций и значениями для гэпов, по умолчанию, б или более. См. ЭауБоГГ. М.О., в А!1ак ок Рто!еш 8ециенсе аиб 81гис!иге, рр. 101- 110 (Уо1ите 5, Ыа!юиа1 Вютебюа1 КекеагсБ РоиибаБои (1972)) и Дополнение (8ирр1етеи!) 2 к этому тому, 1-10. Две последовательности или их части являются более предпочтительно гомологичными, если их аминокислоты на 50% или более, чем на 50%, идентичны при оптимальном выравнивании с применением программы АЫСЫ. Выражение соответствует (чему-либо) по данному описанию означает, что полинуклеотидная последовательность гомологична (т.е. идентична, не строго эволюционно связана) цельной эталонной полинуклеотидной последовательности или её части, или что полипептидная последовательность идентична эталонной полинуклеотидной последовательности. В отличие от этого, выражение комплементарный (чему-либо) по данному описанию означает, что комплементарная последовательность гомологична всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности. В качестве иллюстрации, нуклеотидная последовательность ТАТАС соответствует эталонной последовательности ТАТАС и комплементарна эталонной последовательности СТАЛА.
Нижеприведенные термины применяются для описания взаимоотношений между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями: эталонная (стандартная) последовательность, интервал сравнения, идентичность последовательностей, процент (процентное содержание) идентичности последовательностей и практическая идентичность. Эталонная последовательность представляет собой определённую последовательность, используемую в качестве базы, основы для сравнения последовательностей; эталонная последовательность может быть из субпопуляции большей по размеру последовательности, например, в качестве сегмента полноразмерной последовательности кДНК или гена, данной в списке последовательностей, или может содержать полную последовательность кДНК или гена. Как правило, эталонная имеет 18 нуклеотидов или 6 аминокислот в длину, часто по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот в длину, и часто по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот в длину. Так как две полинуклеотидных или аминокислотных последовательности могут, каждая, (1) содержать последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), аналогичную для двух молекул, и (2) могут дополнительно содержать последовательность, расходящуюся между двумя полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями, сравнение последовательностей между двумя (или более) молекулами обычно проводят, сравнивая последовательности двух молекул посредством интервала (окна) сравнения для идентификации и сравнения локальных областей подобия (аналогии) последовательностей. Интервал сравнения по данному описанию относится к смысловому (концептуальному) сегменту по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидных положений или 6 аминокислот, где полинуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидов или 6 аминокислот и где часть полинуклеотидной последовательности в интервале (окне) сравнения) может содержать 20 процентов или менее добавлений, делеций, замен и т.п. (т. е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений
- 9 013617 или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей с целью выравнивания интервала (окна) сравнения можно проводить с применением алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана Λάν. Αρρΐ, Ма!й. 2: 482 (1981), алгоритма построения глобального выравнивания Нидельмана-Вунша 1. Мо1. ΒίοΙ. 48: 443 (1970), поиском подобия по методу Пирсона и Липмана Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. (И.8.А.) 85: 2444 (1988), с помощью компьютерной реализации этого алгоритма (ОАР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА в программе ^15соп51п Оепебсб 8оП\сагс Раскаде Ре1еа5е 7.0, (Оепебсб СотрЩет Отоир, 575 8аепсе Ότ., Маб15оп, ^15.), программное обеспечение Оепеетоткб или МасУесЮт) или с помощью инспекции, и выбирают наилучшее выравнивание (т.е. с наивысшим процентным содержанием гомологии в интервале (окне) сравнения), полученное различными методами.
Термин идентичность последовательностей означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными (т.е. при сравнении нуклеотида-за-нуклеотидом и аминокислоты-за-аминокислотой) при использовании интервала (окна) сравнения. Процент идентичности последовательностей рассчитывают путём сравнения двух оптимально выравненных последовательностей с помощью окна (интервала) сравнения, определяя число положений, в которых в обоих последовательностях находится идентичное нуклеотидное основание (например, А, Т, С, О, и или I) или остаток, получают число совпадающих положений, и число совпадающих положений делят на общее число положений в интервале (окне) сравнения (т.е. на размер окна) и полученный результат умножают на 100, получают процентное содержание (процент) идентичности последовательностей. Выражение значительная (заметная, практическая) идентичность по данному описанию означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, причём полинуклеотид или аминокислота содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 85% идентичную эталонной последовательности) предпочтительно по меньшей мере 90-95% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 90-95% идентичную эталонной последовательности), более обычно по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью (по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную эталонной последовательности) по сравнению с эталонной последовательностью с помощью окна сравнения (интервала сравнения) по меньшей мере из 18 нуклеотидных (6 аминокислотных) положений, часто с помощью окна сравнения (интервала сравнения), по меньшей мере из 24-48 нуклеотидных (8-16 аминокислотных) положений, где процент идентичности последовательностей рассчитывают, сравнивая эталонную последовательность с последовательностью, которая может включать делеции или добавления, составляющие в целом 20% или менее от эталонной последовательности в окне (интервале) сравнения. Эталонная последовательность может быть субпопуляцией большей последовательности.
В данном описании названия двадцати обычных аминокислот и их сокращения следуют общепринятым правилам. См. монографию 1ттипо1оду - А 8уп111е515 (2пб Ебйюп, Ε.8. Оо1иЬ апб Ό.Κ Огеп, Ебб., 8таиег Аб5ос1а!е5, 8ипбег1апб, Ма55. (1991)). Термин аминокислота или аминокислотный остаток по данному описанию относится к природным Ь аминокислотам или к Ό аминокислотам. В данном описании употребляются обычно используемые одно- или трёхбуквенные сокращения (Вгисе А1Ьег1б е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о! !йе Се11, Оат1апб РиЫЫипд. 1пс., №\ν Уотк (41Й еб. 2002)). Стереоизомеры (например, Όаминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродных аминокислот, таких как α,αдизамещённые аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты могут также быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры нетрадиционных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, εΝ,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). При изображении полипептидов в данном описании направление влево представляет собой направление к аминоконцу, а направление вправо представляет собой направление к С-концу, в соответствии со стандартным применением и обозначением.
Аналогично, если не указано иначе, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5' конец; левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называется 5' направление. Направление добавления 5'-3' образующихся РНК транскриптов называют направлением транскрипции. Области последовательности на нити ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и находятся 5' к 5' концу РНК транскрипта, называются апстрим (3'-5', в обратном направлении) последовательностями. Области последовательности на нити ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и находятся 3' к 3' концу РНК транскрипта, называются даунстрим (5'-3', в прямом направлении) последовательностями.
В применении к полипептидам термин значительная (практическая) идентичность означает, что две пептидные последовательности, будучи оптимально выравнены, например, с помощью программ ОАР или ΒΕ8ΤΕΙΤ с применением, по умолчанию, средневзвешенных гэпов (пробелов), по меньшей мере на 80% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичны, более предпочтительно по
- 10 013617 меньшей мере на 95, 96, 97 или 98% идентичны, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны. Предпочтительно положения остатков, которые не является идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Как обсуждается в данном описании, минорные вариации в аминокислотных последовательностях молекул антител или иммуноглобулина рассматриваются как охватываемые настоящим изобретением, при условии, что варианты в аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95% и наиболее предпочтительно 99%. Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие замены, которые имеют место в семействе аминокислот с родственными боковыми цепями. Генетически кодированные аминокислоты обычно делятся на семейства: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Более предпочтительными семействами являются серии и треонин представляют семейство алифатических гидроксикислот; аспарагин и глутамин представляют семейство амидсодержащих аминокислот; аланин, валин, лейцин и изолейцин входят в семейство алифатических аминокислот; фенилаланин, триптофан и тирозин входят в семейство ароматических аминокислот, а цистеин и метионин представляют семейство аминокислот с серосодержащей боковой цепью. Например, логично ожидать, что изолированная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серии или аналогичная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет основного влияния на связывание или свойства полученной молекулы, в особенности если замена не включает аминокислоту в каркасном сайте. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота, цистеин-метионин и аспарагин-глутамин.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются такие замены, которые (1) снижают восприимчивость к протеолизу, (2) снижают восприимчивость к окислению; (3) изменяют аффинность связывания для образования белковых комплексов; (4) изменяют аффинности связывания; (5) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины последовательности, отличающейся от последовательности природного пептида. Например, единичная или множественные аминокислотные замены (предпочтительно, консервативные аминокислотные замены) можно сделать в природной последовательности (предпочтительно, на участке полипептида вне домена (доменов), образующего (образующих) межмолекулярные контакты. Консервативная аминокислотная замена не должна заметно менять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна нарушать спирали, встречающейся в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, характерные для исходной последовательности). Примеры признанных в уровне техники вторичной и третичной структур описаны в Ρτοΐβίηδ, 81гис1игек апб Мо1еси1аг Ρτίηοίρίβδ (Сте1дЫоп, Еб., ^. Н. Егеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1984)); [гИгобисбоп ίο Ρ^οΐе^η 81гис1иге (С. Вгапбеп апб к Тоохе, ебк., Саг1апб ΡιιΝίκΙιтд, №\ν Уогк, Ν.Υ. (1991)); и Т1югп1оп е1 а!. №11иге 354: 105 (1991), которые ссылкой вводятся в данное описание.
Термин аналог по данному описанию относится к полипептидам, которые состоят по меньшей мере из 25 аминокислот, которые практически идентичны части аминокислотной последовательности природного полипептида и которые имеют по меньшей мере одну из активностей природного полипептида. Обычно полипептидные аналоги содержат консервативную аминокислотную замену (или добавление, или делецию) относительно природной последовательности. Обычно аналоги имеют длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот или больше, и могут часто иметь такую же длину, что и полноразмерный природный полипептид.
Пептидные аналоги обычно применяются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Эти типы непептидного соединения называются миметики пептида или пептидомиметики. Еаискете, ί. Абу. Эгид Век. 15: 29 (1986); УеЬет апб Ете1бтдет ΤΙΝ8 р.392 (1985); и Еуапк е! а1. 1. Меб. С1ет. 30: 1229 (1987), которые вводятся в данное описание в качестве ссылки. Такие соединения часто получают с помощью компьтерного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, аналогичные по структуре применимым в терапии пептидам, можно использовать для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики аналогичны по структуре эталонному полипептиду (т. е. полипептиду, который обладает биохимическим свойством и фармакологической активностью), такому как человеческое антитело, но одна или более пептидных связей замещены в них связью, выбранной из группы, состоящей из: -СЩБТН-, -СН28-, - СН2- СН-, -СН=СН-(цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и - СН28О-, методами, общеизвестными в уровне техники. Системная замена одной или более аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа Ό-аминокислотой того же типа (например, Όлизином вместо Ь-лизина) можно использовать для получения более устойчивых пептидов. Кроме того, (пространственно) затруднённые пептиды, содержащие консенсусную последовательность или вариант, практически идентичный консенсусной последовательности, можно получать методами, известными в уровне техники (Шхо апб С1етаксй Апп. Веу. Вюсйет. 61: 387 (1992), вводится в данное описание в каче
- 11 013617 стве ссылки); например, добавляя внутренние цистеиновые остатки, способные образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид.
Предпочтительные амино- и какрбоксиконцы фрагментов или аналогов наблюдаются близ границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать, сравнивая данные нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с общедоступными или запатентованными базами данных. Предпочтительно, компьютерные методы сравнения используют для идентификации мотивов последовательности или белковых доменов с предсказанной конформацией, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией. Известны методы идентификации белковых последовательностей, которые скручиваются в известную трёхмерную структуру (см. Во\\зе е! а1. 8с1епсе 253: 164 (1991)). Специалисты в данной области техники могут узнать мотивы последовательности и структурные конформации, которые можно использовать для определения структурных и функциональных доменов по изобретению.
Термин специфически связывающий агент относится к природной или неприродной молекуле, которая специфически связывается с целью (мишенью). Примеры специфически связывающих агентов включают, но без ограничения, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и низкомолекулярные соединения. В некоторых вариантах изобретения специфически связывающий агент представляет собой антитело. В некоторых вариантах изобретения специфически связывающий агент представляет собой антиген-связывающую область.
Выражение агент, специфически связывающийся с мутантным ЕСЕг полипептидом относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфический связывающийся с мутантным ЕСЕг полипептидом, представляет собой антитело к ЕСЕг полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным ЕСЕг полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область.
Выражение агент, специфически связывающийся с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом, представляет собой антитело к ΡΙ3Κ полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент специфически связывающийся с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область.
Выражение агент, специфически связывающийся с мутантным В-РаГ полипептидом относится к специфически связывающему агенту, который специфически связывает любой участок мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным ВРаГ полипептидом, представляет собой антитело к В-РаГ полипептиду. В некоторых вариантах изобретения агент, специфически связывающийся с мутантным В-РаГ полипептидом, представляет собой антиген-связывающую область.
Выражение специфически связывается относится к способности специфического связывающего агента связываться с мишенью с более высокой аффинностью, чем он связывается с не-мишенью. В некоторых вариантах изобретения специфическое связывание относится к связыванию с мишенью с аффинностью по меньшей мере в 10, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз более высокой, чем аффинность к немишени. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом анализа аффинности ЕЫ8Л. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом анализа ВИсоге. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют кинетическим методом. В некоторых вариантах изобретения аффинность определяют методом равновесия в растворе. В некоторых вариантах изобретения говорят, что антитело специфически связывает антиген, когда константа диссоциации антитела и одного или более его распознаваемых эпитопов равна <1 мкМ, предпочтительно <100 нМ и наиболее предпочтительно <10 нМ.
Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетероароматические гликопртеины около 150000 Да, состоящие из двух идентичных лёгких (Ь) цепей и двух идентичных тяжёлых (Н) цепей. Каждая лёгкая цепь связана с тяжёлой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как число дисульфидных связей между тяжёлыми цепями различных изотипов иммуноглобулина меняется. Каждая тяжёлая и лёгкая цепь также содержит регулярно расположенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая тяжёлая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (УН), за которым следует несколько константных доменов. Каждая лёгкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (УЬ) и константный домен на другом конце; константный домен лёгкой цепи выравнивается с первым константным доменом тяжёлой цепи, а вариабельный домен лёгкой цепи выравнивается с вариабельным доменом тяжёлой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу раздела (область контакта) между вариабельными доменами лёгкой и тяжёлой цепи (С1о11иа е! а1. 1. Мо1. Вю1. 186: 651 (1985); ΝονοΙην апб НаЬег, Ρτο^ ИаП. Лсаб. 8с1. ϋ.δ.Ά. 82: 4592 (1985); С1о1Ыа е! а1., Иа1иге 342: 877-883 (1989)).
Термин антитело относится как к интактному антителу, так и к его антиген-связывающему фраг
- 12 013617 менту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Его антигенсвязывающий фрагмент относится к участку или фрагменту молекулы интактного антитела, причём фрагмент сохраняет антиген-связывающую функцию. Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител, например, расщеплением папаином. Связывающие фрагменты включают ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Еу, одноцепочечные антитела (ксЕу), Еб' и Еб фрагменты. Способы получения различных фрагментов из моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Ρ1^&Ηϋη, 1992, Ιιηιηιιпо1. Веу. 130: 151-188). Понятно, что все сайты связывания антитела, отличного от биспецифического или бифункционального антитела, идентичны. Антитело практически (значительно) ингибирует адгезию рецептора к противорецептору, если избыток антитела снижает количество рецептора, связанного с противорецептором, по меньшей мере, примерно на 20, 40, 60 или 80% и более, обычно более чем, примерно на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% (по определению ш уйго методом конкурентного связывания).
Выделенное (изолированное) антитело представляет собой антитело, идентифицированное и выделенное и/или извлечённое из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой материалы, которые могут мешать применению антитела в диагностике или терапии, они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворённые вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) более чем до 95 вес.% антитела по определению методом Лоури, и секвенированием концевых и внутренних аминокислот на секвенаторе с вращающейся чашкой, или (2) до гомогенности с помощью ЗОЗ-ГАСЕ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, используя окрашивание Кумасси синим или предпочтительно серебром. Выделенное антитело включает антитело ш ЙШ в рекомбинантных клетках, не содержащее по меньшей мере один компонент природного окружения (среды) антитела. Обычно, однако, выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.
Термин вариабельный относится к тому факту, что последовательности некоторых участков вариабельных доменов антител очень различаются и используются для связывания каждого конкретного антитела с конкретным антигеном и для специфичности каждого конкретного антитела к конкретному антигену. Однако, вариабельность (изменчивость) не равномерно распределена среди вариабельных доменов антител. Она сосредотачивается в трёх сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (СОВ), или гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как лёгкой, так и тяжёлой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасом (скелетом) (ЕВ). Вариабельные домены нативных тяжёлой и лёгкой цепей, каждый, содержат четыре ЕВ области, имеющие, преимущественно, β-складчатую конфигурацию, связанные с помощью трёх СОВ, которые образуют петли, связывающие β-складчатую структуру, а в некоторых случаях образующие её часть. СОВ в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью ЕВ областей и, с СОВ другой цепи, участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антител (см. 1<аЬа1 е1 а1. (1991). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.
Еу представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. В двухцепочечных образцах Еу эта область состоит из димера вариабельного домена одной лёгкой и одной тяжёлой цепи в тесной нековалентной связи. В одноцепочечных Еу вариабельный домен одной тяжёлой и одной лёгкой цепи может быть ковалентно связан гибким пептидным линкером таким образом, что лёгкая и тяжёлая цепи могут связываться в димерную структуру, аналогичную структуре двухцепочечных Еу разновидностей. Именно в этой конфигурации три СИВ каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антиген-связывающего сайта на поверхности УН+УБ димера. Совместно шесть СИВ сообщают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако, даже единичный вариабельный домен (или половина Еу, содержащая три СИВ, специфических к антигену) способен распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем целый сайт связывания.
Термин гипервариабельная область по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, отвечающим за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из области, определяющей комплементарность, или СИВ (например, остатки 24-34 (Ь1), 50-62 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном домене лёгкой цепи и 31-55 (Н1), 50- 65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжёлой цепи; 1<аЬа1 е1 а1., Зециепсек о£ ЕгоЮиъ о£ Ешпипо^дЖб Щегей, 51,1 Еб. БиЕНс Неайй 8егу1се, №1бопа1 ЕчййШек, о£ Неайй, ВеШекба, ΜΌ. (1991)), и/или остатки из гипервариабельной петли (например, остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельном домене лёгкой цепи и 26-32 ((Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжёлой цепи; С1ю11иа апб Бекк I. Мо1. Вю1 196: 901-917 (1987)). Остатки каркасной области или ЕВ представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области по данному описанию.
Выражение гипервариабельные области или СИВ по данному описанию относится к участкам иммунологических рецепторов, которые осуществляют контакт со специфическим лигандом и опреде
- 13 013617 ляют его специфичность. Области СЭК иммунологических рецепторов являются наиболее вариабельной частью рецепторного белка, придающие рецепторам их разнообразие, которое возникает на шести петлях в дистальном конце вариабельных доменов рецептора, по три петли от каждого из двух вариабельных доменов рецептора.
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность и АЗКЦТ (АИСС) относятся к опосредованной клетками реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Ес рецепторы (ЕеК.8) (например, природные (нормальные) киллерные (ΝΚ) клетки (природные киллеры), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования АЗКЦТ (АИСС), ΝΚ клетки, экспрессируют только ЕсуКШ, тогда как моноциты экспрессируют ЕсуК1, ЕсуКИ и ЕсуКШ. Ес экспрессия на гемопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на стр. 464 обзора Кате1с11 апб ΚίηοΙ. Аппи. Кеу. 1ттипо1 9: 457-92 (1991). Для оценки АЗКЦТ (АИСС) активности молекулы, представляющей интерес, можно провести ш νίίτο АИСС анализ, такой, который описан в патентах США Νο. 5500362 или 5821337. Пригодные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные киллерные (ΝΚ) клетки. Или же, или кроме того, АИСС активность представляющей интерес молекулы можно оценивать ш νίνο, например, на животной модели, такой, которая раскрывается в С1упе§ е1 а1. РNА8 (И8А) 95: 652-656 (1988).
Термин эпитоп включает любую белковую (антигенную) детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином и/или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трёхмерные структурные характеристики, а также специфически заряд.
Термин агент по данному описанию обозначает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт из биологических материалов.
Термины метка или меченый по данному описанию относятся к введению детектируемого маркера, например, путём введения меченной радиоактивной меткой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильных групп, которые можно обнаруживать с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер, или ферментативную активность, которую можно детектировать оптическими или колориметрическими методами). В некоторых случаях метка или маркер могут также иметь терапевтические свойства. Можно использовать различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные в уровне техники. Примеры меток для полипептидов включают, но без ограничения, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15Ν, 358, 90Υ, 99Тс, ш1п, 1251, 1311), флуоресцентные метки (например, Е1ТС, родамин, лантаниды с фосфором), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы и заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортёром (например, пара последовательностей лещиновой застёжки-молнии, сайты связывания вторичных антител, металл-связывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах изобретения метки присоединяются с помощью плеч спейсера различной длины, уменьшая возможные пространственные затруднения.
Выражение фармацевтический агент или лекарство по данному описанию относится к химическому соединению или к композиции, способной, после введения пациенту соответствующим образом, вызывать заданный терапевтический эффект. Другие химические термины употребляются в соответствии с обычным применением в уровне техники, описанным в словаре Тке МсСга\\-НШ Июйопагу οί Сйетюа1 Тегтк (Рагкег, 8., Еб., МсСга^-ΗίΙΙ, 8ап Егапсщсо (1985)), который вводится в данное описание в качестве ссылки).
Термин противоопухолевый агент по данному описанию относится к агентам, которые обладают функциональным свойством ингибировать развитие или прогрессирование опухоли у человека, в особенности злокачественное (раковое) изменение, такое как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Ингибирование метастаз часто является свойством противоопухолевых агентов.
Выражение практически чисты по данному описанию означает, что целевой вид является преобладающим присутствующим видом, (т. е. в расчёте на моли его в композиции больше, чем любого другого отдельного вида), и, предпочтительно, практически очищенная фракция представляет собой композицию, в которой содержится по меньшей мере 50% (в расчёте на моли) целевого вида. Обычно практически чистая композиция содержит более 80% от всех имеющихся в композиции высокомолекулярных соединений (макромолекул), более предпочтительно примерно более 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Более предпочтительно целевой вид очищают до значительной (практической) гомогенности (загрязняющие примеси нельзя обнаружить в композиции обычными методами обнаружения), причём композиция состоит практически из единственного вида макромолекул.
Термин пациент включает человека и животных.
Термины млекопитающее и животное для лечения (обработки) относится к любому животному, относящемуся к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, и животных в зоопарке, спортивных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т. д. Пред
- 14 013617 почтительно, млекопитающим является человек.
Выражение болезненное состояние относится к физиологическому состоянию клетки или целого млекопитающего, при котором наблюдается прерывание, прекращение или нарушение клеточных функций или функций организма, систем или органов.
Термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным (превентивным) мерам, когда целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического состояния или нарушения, например, развития или распространения рака. Для целей данного изобретения благотворные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения, частичное снятие симптомов, уменьшение степени заболевания, стабильное (т. е. не ухудшающееся) состояние заболевания, приостановку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), детектируемую или недетектируемую. Лечение может также означать пролонгированную продолжительность жизни по сравнению с предполагаемой продолжительностью жизни в отсутствие лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже наблюдается состояние или нарушение, а также тех, кто склонен к этому состоянию или нарушению, или тех, у кого следует предупредить это состояние или нарушение.
Нарушение (расстройство) представляет собой состояние, на которое оказывает благотворное воздействие один или более видов лечения. Сюда входят хронические и острые нарушения (расстройства) или заболевания, включая такие патологические состояния, которые провоцируют у млекопитающего рассматриваемое нарушение. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить по данному описанию, включают доброкачественные и злокачественные опухоли, лейкозы и злокачественные заболевания лимфоидной ткани, в частности, рак молочной железы, рак прямой кишки, рак яичника, желудка, эндометриальный рак, рак слюнной железы, почки, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, простаты или мочевого пузыря. Предпочтительно по настоящему изобретению следует лечить злокачественную опухоль, такую как цервикальная карцинома, почечноклеточный рак (ВСС), опухоли пищевода и клеточные линии раковых клеток.
Заболевание или состояние, связанное с мутантным ЕСЕг полипептидом включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным ЕСЕг полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный ЕСЕг полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного ЕСЕг полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным ЕСЕг полипептидом, может существовать в отсутствие мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным ЕСЕг полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным ЕСЕг полипептидом, представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лёгкого, рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты.
Заболевание или состояние, связанное с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным ΡΙ3Κ полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный ΡΙ3Κ полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного ΡΙ3Κ полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом, может существовать в отсутствие мутации. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантньм ΡΙ3Κ полипептидом, представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лёгкого, рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты.
Заболевание или состояние, связанное с мутантным В-ВаГ полипептидом включает одно или более из следующих заболеваний или состояний: заболевание или состояние, вызванное мутантным В-ВаГ полипептидом; заболевание или состояние, которому способствует мутантный В-ВаГ полипептид; заболевание или состояние, которое является причиной мутантного В-ВаГ полипептида; и заболевание или состояние, ассоциированное с присутствием мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным В-ВаГ полипептидом, может существовать в отсутствие мутации. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным В-ВаГ полипептидом, может ухудшаться в присутствии мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние, связанное с мутантным В-ВаГ полипептидом, представляет собой рак. Типичные виды рака включают, но без ограничения, немелкоклеточный рак лёгкого, рак молочной железы, толстой кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы и шеи, яичника и простаты.
- 15 013617
При комбинированной терапии пациентов лечат специфическим агентом, связывающим целевой антиген, в комбинации с химиотерапевтическим или противоопухолевым агентом и/или с лучевой терапией. Рак лечат по протоколу добавления специфического связывающего агента к мутантному ЕСЕг полипептиду, специфического связывающего агента к мутантному РБК полипептиду и/или специфического связывающего агента к мутантному В-ВаГ полипептиду к стандартной терапии первой и второй линии. План протокола рассматривает эффективность как показатель, оцениваемый уменьшением массы опухоли, а также способностью снижать обычные дозы стандартной химиотерапии. Это снижение дозы позволяют проводить дополнительную и/или продолжительную терапию за счёт снижения связанной с дозой токсичности химиотерапевтического агента.
Монотерапия относится к лечению нарушения с помощью иммунотерапии пациентов, в отсутствие химиотерапевтического и противоопухолевого агента.
Полипептиды, фрагменты и слитые белки
В некоторых вариантах изобретения вариант с делецией является фрагментом полноразмерного мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным (например, вследствие ίη νί\Ό протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного ЕСЕг. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вариант с делецией, который является фрагментом полноразмерного мутантного РI3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного РI3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным (например, вследствие ίη νί\Ό протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного РВШ В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вариант с делецией, который является фрагментом полноразмерного мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент соответствует эпитопу мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент является природным (например, вследствие ίη νί\Ό протеазной активности). В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент синтезирован химическими методами. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент может быть связан с полипептидом, образуя слитый белок мутантного ВВаГ. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В некоторых вариантах изобретения такой фрагмент имеет протяжённость по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70 аминокислот.
В некоторых вариантах изобретения мутантный полипептид может быть связан по меньшей мере с одной небелковой группой. Такие группы включают, но без ограничения, Ν-связанные или О-связанные углеводные цепи, водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕС) и его производные (см., например, патент США 4179337). Другие химические модификации, подпадающие под этот термин, включают, но без ограничения, сополимеры этиленгликоля с пропиленгликолем, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт и родственные молекулы.
В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид может быть модифицирован в произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединённые химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного ЕСЕг полипептида.
В некоторых вариантах изобретения мутантный РI3Κ полипептид может быть модифицирован в произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединённые химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный РI3Κ полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного РI3Κ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ВаГ полипептид может быть модифицирован в
- 16 013617 произвольных положениях внутри молекулы, или в заданных положениях внутри молекулы, и может включать одну, две, три или более присоединённые химические группы. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-как полипептид может также быть модифицирован в заданных положениях в полипептиде, таких как аминоконец или выбранный лизиновый или аргининовый остаток внутри полипептида. Другие химические модификации включают, но без ограничения, детектируемую метку, такую как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, способствующие обнаружению и выделению мутантного В-ЯаГ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения эпитоп, способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лейциновой застёжки-молнии; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид или слитый белок мутантного ЕСЕг может быть связан с №концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. сой.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный ΡΙ3Κ полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения: эпитоп, способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лейциновой застёжки-молнии; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный ΡΙ3Κ полипептид или слитый белок мутантного ΡΙ3Κ может быть связан с №концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. со11.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается слитый белок мутантного В-ЯаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ЯаГ полипептид может быть слит с гомологичным полипептидом с образованием гомодимера или с гетерологичным полипептидом с образованием гетеродимера. Типичные гетерологичные полипептиды и пептиды включают, но без ограничения эпитоп, способствующий детектированию и/или выделению слитого белка; трансмембранный рецепторный белок или его участок, такой как внеклеточный домен, трансмембранный домен или внутриклеточный домен; лиганд или его участок, который связывается с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его каталитически активный участок; полипептид, промотирующий олигомеризацию, включая, но без ограничения, домен лещиновой застёжки-молнии; полипептид, который повышает стабильность слитого белка, включая, но без ограничения, константную область иммуноглобулина; и полипептид, обладающий каталитической активностью, отличной от терапевтической активности мутантного В-ЯаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ЯаГ полипептид или слитый белок мутантного В-ЯаГ может быть связан с №концевым метионином, который может содействовать экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. со11.
В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным ЕСЕг полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы, известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды.
В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изо
- 17 013617 бретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного Р13К полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным Р13К полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным Р13К полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы, известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды.
В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с аминоконцом мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения гетерологичный или гомологичный полипептид слит с карбоксиконцом мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения один или более гетерологичных или гомологичных полипептидов или пептидов слиты как с амино-, так и с карбоксиконцом мутантного В-ВаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит непосредственного с мутантным В-ВаГ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения полипептид слит с мутантным В-ВаГ полипептидом с помощью линкерной или адаптерной молекулы, известной в уровне техники. В некоторых из таких вариантов изобретения линкерная или адаптерная молекула создана таким образом, что она содержит сайт расщепления протеазами, позволяющий разделять слитые полипептиды.
Векторы, клетки-хозяева, трансгенные животные и получение и очистка белков
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный ЕСРг полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСРг полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 2, ЗЕО ΙΌ N0: 3, ЗЕО ΙΌ N0: 5, ЗЕО ΙΌ N0: 6, ЗЕО ΙΌ N0: 7, ЗЕО ΙΌ N0: 8, ЗЕО ΙΌ N0: 9, ЗЕО ΙΌ N0: 10, ЗЕО ΙΌ N0: 12 и ЗЕО ΙΌ N0: 13. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСРг полипептид содержит по меньшей мере одну ЕСРг мутацию, выбранную из: Ь688Р, 0701Н, К745К, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь82851ор, 0849В, Р910Ь и У948А. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии).
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный РЕ3К полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный РЕ3К полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 15, ЗЕО ΙΌ N0: 16 и ЗЕО ΙΌ N0: 17. В некоторых вариантах изобретения мутантный РЕ3К полипептид содержит по меньшей мере одну РЕ3К мутацию, выбранную из Е542К, Е545А и Н1047Ь. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии).
В некоторых вариантах изобретения предусматривается вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный В-ВаГ полипептид. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ВаГ полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 19 и ЗЕО ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-ВаГ полипептид содержит по меньшей мере одну В-ВаГ мутацию, выбранную из: У542Е и К545Е. В некоторых вариантах изобретения вектор представляет собой экспрессирующий вектор (вектор экспрессии).
В некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может содержать промотор, который распознаётся организмом-хозяином и функционально связывается с нуклеотидной молекулой, кодирующей мутантный ЕСРг. В некоторых вариантах изобретения нативный или гетерологичный промотор можно использовать в зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии и получения заданного белка.
Типичные промоторы для применения с прокариотическими хозяевами включают, но без ограничения, промоторные системы бета-лактамазы и лактозы; щелочной фосфатазы; промоторную систему триптофана (ΐτρ); и гибридные промоторы, такие как 1ае промотор. В некоторых вариантах изобретения можно использовать другие бактериальные промоторы. Последовательности известных бактериальных промоторов опубликованы, это позволяет специалисту в данной области техники лигировать их к заданной(ым) нуклеотидной(ым) последовательности(ям), используя линкеры или адаптеры, необходимые для введения любых заданных сайтов рестрикции.
Подходящие промоторы для применения с дрожжами-хозяевами также хорошо известны в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения энхансеры дрожжей, предпочтительно, применяются с промоторами дрожжей. Подходящие промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны. Типичные промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих включают, но без ограничения, промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, вирус обезьян (зелёной мартышки) 40 (ЗУ40). Типичные промоторы млекопитающих включают, но без ограничения, гетерологичные промоторы млекопитающих. Типичные гетерологичные промоторы млекопитающих включают, но без ограничения, промоторы теплового шока и промотор актина.
- 18 013617
Типичные промоторы, которые можно использовать для экспрессии мутантных ЕОЕг полинуклеотидов, включают, но без ограничения, область раннего промотора 8У40 (Вепок! апб СНатЬоп (1981), №!иге, 290: 304-310); промотор СМУ; промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Уатато!о е! а1. (1980), Се11, 22: 787-97); промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (Уадпег е! а1. (1981), Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И.8.А., 78: 1444-5); регуляторные последовательности гена металлотионина (Вгтк!ег е! а1. (1982), Ыа!иге, 296: 39-42); векторы экспрессии прокариот, такие как промотор бета-лактамазы (УШа-КатагоГГ е! а1. (1978), Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И.8.А., 75: 3727- 31); и !ас промотор (ОеВоег, е! а1. (1983), Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И.8.А., 80: 21-25).
В некоторых вариантах изобретения энхансерная последовательность может быть включена в вектор для повышения транскрипции в эукариотических клетках-хозяевах. Типичные энхансерные последовательности из генов млекопитающих включают, но без ограничения, глобин, эластазу, альбумин, альфафетопротеин и инсулин. В некоторых вариантах изобретения применяют энхансер вируса. Типичные энхансерные последовательности для активации эукариотических промоторов включают, но без ограничения, энхансер 8У40, ранний промотор/энхансер цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов. В некоторых вариантах изобретения энхансер может быть сплайсирован в вектор в положение 5' или 3' к кодирующей области полипептида. В некоторых вариантах изобретения энхансер расположен в сайте 5' от промотора. В некоторых вариантах изобретения энхансер расположен в сайте 3' от конца кодирующей области полипептида.
В некоторых вариантах изобретения векторами являются такие векторы, которые совместимы по меньшей мере с одной из клеток-хозяев: бактериальной, насекомого или млекопитающего. Примеры векторов включают, но без ограничения, рСВ11, рСВ3 и рсПЫА3.1 (1пуйгодеп Сотрапу, 8ап П1едо, СА), рВ8П (81га!адепе Сотрапу, Ьа 1о11а, СА), рЕТ15 (Ыоуадеп, Мабкоп, У1), рОЕХ (РНагтааа Вю!есй, Ркса!а^ау, N1), рЕОЕР-Ы2 (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА), рЕТЬ (В1иеВас11; 1пуйгодеп), рО8В-альфа (опубликованная патентная заявка РСТ №. УО90/14363) и рЕак1ВасЭиа1 (О1Ьсо/ВВЬ, Огапб 1к1апб, ΝΥ).
Примеры векторов включают, но без ограничения, космиды, плазмиды и модифицированные вирусы, совместимые с выбранной клеткой-хозяином. В некоторых вариантах изобретения векторы могут включать плазмиды, в том числе, но без ограничения, производные плазмиды В1иекспр1® (высококопийная фаг(е)мида на основе Со1Е1, 81га!адепе С1ошпд 8ук!етк 1пс., Ьа 1о11а СА), плазмиды для ПЦРклонирования, созданные для клонирования Тас.|-амплифицированных продуктов ПЦР (например, набор ТОРО™ ТА С1ошпд® Κι!, производные плазмиды РСВ2.1®, 1пуйгодеп, СагкЬаб, СА), и векторы млекопитающих, дрожжевые или вирусные векторы, такие как бакуловирусная система экспрессии (производные плазмиды рВасРАК, С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА). В некоторых вариантах изобретения рекомбинантные молекулы можно вводить в клетки-хозяева с помощью трансформации, трансфекции, инфицирования, электропорации или другими известными методами.
Термин трансфекция относится к приобретению клеткой-хозяином вектора экспрессии, вне зависимости от того, экспрессируются ли на самом деле какие-либо кодирующие последовательности. Рядовым специалистам в данной области техники известно множество способов трансфекции, включая, но без ограничения, осаждение с помощью СаРО4 и электропорацию. В некоторых вариантах изобретения трансфекцию считают успешной, когда в клетке-хозяине наблюдается любой показатель функционирования трансфецированного вектора.
В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут быть прокариотическими клеткамихозяевами (такими как Е. сой) или эукариотическими клетками-хозяевами (такими как клетка дрожжей, клетка насекомого или клетка позвоночного). В некоторых вариантах изобретения прокариотические клетки-хозяева, такие как Е. сой, продуцируют негликозилированный белок; например негликозилированный кйВСМА и негликозилированный кйТАС1, которые могут иметь преимущество перед гликозилированными эукариотическими молекулами. В некоторых вариантах изобретения клетка-хозяин, будучи культивирована в подходящих условиях, экспрессирует полипептид по изобретению, который можно затем собрать из культуральной среди (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретируется). В некоторых вариантах изобретения при выборе подходящей клетки-хозяина принимают во внимание различные факторы, такие как нужный уровень экспрессии, модификации полипептидов, желательные или необходимые для активности, такие как гликозилирование или фосфорилирование, и/или простота фолдинга (скручивания) в биологически активную молекулу.
Ряд подходящих клеток-хозяев известен в уровне техники и многие имеются в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Мапаккак, УА. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО) (АТСС №. ССЙ61), клетки СНО ОНЕВ (Иг1аиЬ е! а1. (1980), Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 97, 4216-20), человеческие эмбриональные почечные клетки (НЕК) 293 или 293Т (АТСС №. СВЙ1573) и клетки 3Т3 се11к (АТСС №. ССЙ92). Селекция подходящих клеток-хозяев млекопитающих и методы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и продуцирования и очистки продукта известны в уровне техники. Примеры клетокхозяев включают, но без ограничения линии клеток обезьян СО8-1 (АТСС №. СВЕ1650) и СО8-7 (АТСС
- 19 013617
Ыо. СКЬ1651), и линия клеток СУ-1 (АТСС Ыо. ССЬ70). Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, но без ограничения, клеточные линии приматов и клеточные линии грызунов, включая трансформированные линии клеток. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, нормальные диплоидные клетки, клеточные штаммы, полученные из ш νίΙΐΌ культуры первичной ткани, клеточные линии стволовых клеток и первичные эксплантаты. В некоторых вариантах изобретения клетки-кандидаты могут быть генотипически дефицитными по гену селекции, или могут содержать доминантный ген селекции. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, клетки мышиной нейробластомы Ы2А, клетки Неба, мышиные Ь-929 клетки, 3Т3 линии 8^1кк, Ва1Ь-с или ΝΙΗ мышей, клеточные линии хомяка ВНК или НаК, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, Маиаккак, УА). Каждая из этих клеточных линий известна и доступна специалистам в области экспрессии белков.
В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут быть бактериальными клетками. Примеры бактериальных клеток включают, но без ограничения, различные штаммы Е. соб (например, НВ 101, (АТСС Ыо. 33694) ОН5а, ΌΗ10 и МС1061 (АтСс Ыо. 53338)). Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, различные штаммы Ркеиботоиак крр., В. киЬббк, других ВасШик крр., и 8бер!отусек крр.
Многие штаммы клеток дрожжей, известные специалистам в данной области техники, также доступны в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения используются продажные системы экспрессии, например, система экспрессии РюБ1а Ехргеккюи 8ук!ет (1иу1Бодеи, 8аи П1едо, СА), в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах изобретения такая система основана на пре-про-альфа последовательности для управления экспрессией. В некоторых вариантах изобретения транскрипция инсерта (вставки) запускается промотором алкоголь оксидазы (АОХ1) при индукции метанолом. В некоторых вариантах изобретения клетка-хозяин может представлять собой 8ассБаготусек сепуБае.
В некоторых вариантах изобретения в качестве клеток-хозяев могут использоваться системы растительной клетки. В некоторых таких вариантах изобретения системы используются растительной клетки, трансфецированной при использовании экспрессирующих векторов вирусов (например, вирус мозаики цветной капусты, СаМУ или вирус табачной мозаики).
В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий мутантный ЕСРг полипептид, мутантный Р13К полипептид и/или мутантный В-КаГ полипептид, клонируют в экспрессирующий вектор бакуловируса, такой как рУЪ1393 (РБагМтдеи, 8аи П1едо, СА). В некоторых вариантах изобретения такой вектор можно использовать в соответствии с указаниями производителя (РБагМтдеи) для инфицирования клеток 8робор!ега Ггид1регба в кР9 в безбелковых средах и для продуцирования рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСРг полипептид, мутантный Р13К полипептид и/или мутантный В- КаГ полипептид очищают и концентрируют из таких сред на колонке с гепарин-сефарозой (РБагтааа).
В некоторых вариантах изобретения в качестве клеток-хозяев могут использоваться системы клеток насекомого. Некоторые такие системы описаны, например, в К1!!к е! а1. (1993), Вю!есБтдиек, 14: 810-7, Ьиск1оте(1993), Сигг. Орт. ВтксНиоЕ 4: 564-72, и Ьиск1оте е! а1. (1993), В У1го1, 67: 4566-79. Примеры клеток насекомых включают, но без ограничения, 8Г-9 и Н15 (1иубгодеи, Саг1кЬаб, СА).
В некоторых вариантах изобретения трансформацию или трансфекцию полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСРг полипептид, мутантный Р13К полипептид и/или мутантный В-КаГ полипептид в выбранную клетку-хозяина можно осуществлять общеизвестными методами, включая такие методы как применение хлористого кальция, электропорация, микроинъекция, липофекция или метод с ЭЕАЕдекстраном. В некоторых вариантах изобретения выбранный метод частично зависит от типа используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие подходящие методы хорошо известны специалистам и представлены, например, в 8атЬгоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 (2б еб., Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рпид НагЬог, Ы.У. (1989)).
Клетки-хозяева, содержащие (введённые трансформацией или трансфекцией) экспрессирующий вектор, кодирующий мутантный ЕСРг полипептид, мутантный Р13К полипептид и/или мутантный В-КаГ полипептид, можно культивировать, используя стандартные среды, хорошо известные опытным специалистам. В некоторых вариантах изобретения среды могут содержать все питательные вещества, необходимые для роста и жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах изобретения клетки Е. соб можно культивировать в бульоне Луриа (ЬВ) и/или в среде ТепгГю Вго!Б (ТВ). Примеры сред для культивирования эукариотических клеток включают, но без ограничения, среды КРМ11640, МЕМ, ОМЕМ, каждая из которых может быть дополнена сывороткой и/или факторами роста в соответствии с конкретной культивируемой клеточной линией. В некоторых вариантах изобретения клетки насекомого можно культивировать в среде Грейса, дополненной дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и/или фетальной телячьей сывороткой.
В некоторых вариантах изобретения в качестве дополнения к средам добавляют антибиотик или другое соединение, пригодное для селективного роста трансфецированных или трансформированных клеток. В некоторых вариантах изобретения соединение для применения выбирают с учётом селективного маркерного элемента, присутствующего на плазмиде, с помощью которой была трансформирована клетка-хозяин. В некоторых вариантах изобретения, в которых селективный маркерный элемент несёт
- 20 013617 устойчивость к канамицину, соединением, добавляемым к культуральной среде, является канамицин. Примеры соединений для селективного роста включают, но без ограничения, ампициллин, тетрациклин и неомицин.
В некоторых вариантах изобретения количество мутантного ЕСЕг полипептида, мутантного ΡΙ3Κ полипептида и/или мутантного В-ВаГ полипептида, продуцированного в клетке-хозяине, можно оценивать стандартными методами, известными в уровне техники. Примеры методов включают, но без ограничения, Вестерн-блот анализ, электрофорез в 8Ό8 в полиакриламидном геле, электрофорез в неденатурирующем геле, разделение методом ВЭЖХ, иммунопреципитацию и анализ активности.
В некоторых вариантах изобретения мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ полипептиды и/или мутантные В-ВаГ полипептиды, которые экспрессируются в прокариотических клетках-хозяевах, могут присутствовать в растворимом виде либо в периплазматическом пространстве, либо в цитоплазме, или в нерастворимом виде как часть внутриклеточных тел включения. В некоторых вариантах изобретения мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ полипептиды и/или мутантные В-ВаГ полипептиды могут экстрагироваться из клетки-хозяина любым стандартным методом, известным специалистам. В некоторых вариантах изобретения клетки-хозяева могут лизироваться с целью высвобождения содержимого периплазмы/цитоплазмы френч-прессом, гомогенизацией и/или ультразвуком с последующим центрифугированием.
В некоторых вариантах изобретения растворимые формы мутантных ЕСЕг полипептидов, мутантных ΡΙ3Κ полипептидов и/или мутантных В-ВаГ полипептидов, либо присутствующие в цитоплазме, либо высвобождающиеся из периплазматического пространства, можно дополнительно очищать методами, известными в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ полипептиды и/или мутантные В-ВаГ полипептиды высвобождаются из бактериального периплазматического пространства методами осмотического шока.
Если мутантный ЕСЕг полипептид, мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или мутантный В-ВаГ полипептид образует тела включения, они часто могут связываться с внутренней и/или наружной клеточными мембранами и, следовательно, после центрифугирования, в основном находятся в материале осадка (пеллет). В некоторых вариантах изобретения материал осадка можно затем обрабатывать при экстремальных значениях рН или хаотропным агентом, таким как детергент, гуанидин, производные гуанидина, мочевина или производные мочевины в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол, при щелочном рН, или трискарбоксиэтилфосфина при кислом рН, для высвобождения, разрушения и солюбилизации тел(ец) включения. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид, мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или мутантный ВВаГ полипептид можно затем анализировать, применяя гель-электрофорез, иммунопреципитацию и т. п.. В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид, мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или мутантный В-ВаГ полипептид можно выделять традиционными методами, такими как методы, представленные ниже и в Магйои е1 а1. (1990), Ме111. Ей/., 182: 264-75.
В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид, мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или мутантный В-ВаГ полипептид после выделения может быть биологически неактивным. В некоторых вариантах изобретения для восстановления биологической активности можно применять методы рефолдинга или превращения структуры полипептида в третичную и образования дисульфидных связей. В некоторых вариантах изобретения биологическую активность можно восстанавливать обработкой солюбилизированного полипептида, обычно, при значении рН выше 7, хаотропом с конкретной концентрацией. Хаотроп выбирают совершенно так же, как для солюбилизации тел(ец) включения, но, в некоторых вариантах изобретения, хаотроп применяют в более низкой концентрации, и необязательно применяют те же хаотропы, что и для солюбилизации. В некоторых вариантах изобретения раствор для рефолдинга/окисления также содержит партнёр-восстановитель или партнёр-восстановитель плюс его окисленная форма в специальном соотношении для того, чтобы создать конкретный редокс-потенциал, способствующий перегруппировке дисульфидных связей с образованием в белке дисульфидного(ых) мостика(ов). Примеры редокс-пар включают, но без ограничения, цистеин/цистамин, глутатион (С8Н)/дитиобис С8Н, хлорид меди, дитиотреитол(ЭТТ)/дитиан ΌΤΤ и 2-меркаптоэтанол(ЬМЕ)/дитиоЬ(МЕ). В некоторых вариантах изобретения для повышения эффективности рефолдинга можно использовать или может быть необходим сорастворитель, и примеры сорастворителей (сопартнёров), применяемые для этой цели, включают, но без ограничения, глицерин, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, аргинин и родственные молекулы.
В некоторых вариантах изобретения мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ полипептиды и/или мутантные В-ВаГ полипептиды можно получать синтетическими химическими методами. В некоторых вариантах изобретения метод химического синтеза может включать твердофазный пептидный синтез. В некоторых вариантах изобретения в методах химического синтеза могут использоваться методы, известные в уровне техники, такие, которые представлены в МегпПе1б е1 а1. (1963), Σ. Ат. СЬет. 8ос, 85: 2149; НоидШеи е1 а1. (1985), Ρι-ос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 82: 5132; и 81е\\'аг1 апб Уоиид (1984), 8о11б Ρ1ι;·ΐ!^ Ρерΐ^бе ЗупШеяк, Ρ^е^се СЬет1са1 Со., ВоскГогб, ГЬ. В некоторых вариантах изобретения полипептиды можно синтезировать с метионином или без метионина на аминоконце. В некоторых вариантах изобретения синтезированные химическими методами мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ
- 21 013617 полипептиды и/или мутантные В-Ва! полипептиды можно окислять методами, представленными в этих ссылочных материалах, с образованием дисульфидных мостиков. В некоторых вариантах изобретения полученные таким образом мутантные ЕСЕг полипептиды, мутантные ΡΙ3Κ полипептиды и/или мутантные В-Ва! полипептиды сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность, ассоциированную с нативным или полученным методами рекомбинантной ДНК мутантным ЕСЕг полипептидом, мутантным ΡΙ3Κ полипептидом и/или мутантным В-Ва! полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения для экспрессии мутантных ЕСЕг полипептидов, мутантных ΡΙ3Κ полипептидов и/или мутантных В-Ва! полипептидов можно использовать трансгенных животных. В некоторых вариантах изобретения можно использовать трансгенное млекопитающее животное (например, корову или козу) и получать гликозилированный мутантный ЕСЕг полипептид, гликозилированный мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или гликозилированный мутантный В-Ва! полипептид в молоке животного. В некоторых вариантах изобретения для получения гликозилированного мутантного ЕСЕг полипептида, гликозилированного мутантного ΡΙ3Κ полипептида и/или гликозилированного мутантного ВВа! полипептида можно использовать растения, известные в уровне техники.
В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид очищают до практически чистого состояния. В некоторых вариантах изобретения мутантный ΡΙ3Κ полипептид очищают до практически чистого состояния. В некоторых вариантах изобретения мутантный В-Ва! полипептид очищают до практически чистого состояния. Специалистам в данной области техники известны конкретные методы очистки белков. В некоторых вариантах изобретения очистка белка включает предварительное отделение полипептидных фракций от неполипептидных фракций. В некоторых вариантах изобретения полипептиды очищают методами хроматографии и/или электрофореза. Примеры методов очистки включают, но без ограничения, преципитацию (осаждение) сульфатом аммония; ПЭГ-преципитацию; иммунопреципитацию; тепловую (термическую) денатурацию с последующим центрифугированием; хроматографию, включая, но без ограничения, аффинную хроматографию (например, на протеин-А-сефарозе), ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию и обращённо-фазовую хроматографию; гельфильтрацию; хроматографию на гидроксилапатите; изоэлектрическое фокусирование; электрофорез в полиакриламидном геле; и комбинации этих и других методов. В некоторых вариантах изобретения полипептид очищают быстрой жидкостной хроматографией белков или жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВЭ). В некоторых вариантах изобретения стадии очистки можно изменять или некоторые стадии можно опускать и всё равно способ остаётся подходящим для получения практически чистого полипептида.
В некоторых вариантах изобретения мутантный ЕСЕг полипептид, мутантный ΡΙ3Κ полипептид и/или мутантный В-Ва! полипептид можно получать с одной или более аффинных меток, таких как гексагистидин или другой малый пептид, такой как ЕЬАС (ЕакДтап Собак Со., Науеп, СТ) или тус (Дпуйтодеп), по карбоксильному или по аминоконцу, и очищать в одну стадию на аффинной колонке. В некоторых вариантах изобретения полигистидин с высокой аффинностью и специфичностью связывается с никелем, поэтому для очистки меченных полигистидином партнёров по специфическому связыванию можно использовать колонку для никель-аффинной хроматографии (такую как О|адеп®). См., например, АикиЬе1 еД а1., ебк. (1993), СштепД Ρτοίο^ΐκ ш Мо1еси1аг ВюДоду, 8есДюп 10.11.8, 1ойп ^Д1еу & 8опк. Νονν Уогк. В некоторых вариантах изобретения можно использовать более одной стадии очистки.
В некоторых вариантах изобретения рассчитывают степень очистки полипептидного препарата. Специалистам в данной области техники известны конкретные методы расчёта степени очистки. Некоторые типичные способы включают, но без ограничения, определение специфической связывающей активности препарата и оценку количества полипептида в препарате методом 8Э8/ЕАСЕ. Некоторые типичные способы оценки степени очистки полипептидного препарата включают расчёт связывающей активности препарата и сравнение её со связывающей активностью начального экстракта. В некоторых вариантах изобретения результаты такого расчёта выражаются как кратность очистки. Единицы, применяемые для того, чтобы представить величину связывающей активности, зависят от конкретного анализа.
В некоторых вариантах изобретения полипептид очищают частично. В некоторых вариантах изобретения частичную очистку можно проводить, используя меньше стадий или применяя другие формы той же общей схемы очистки. Например, в некоторых вариантах изобретения катионообменная колоночная хроматография на ЖХВЭ хроматографе обычно даёт более высокую кратность очистки, чем тот же метод с применением системы хроматографии низкого давления. В некоторых вариантах изобретения способы, дающие более низкую степень очистки, могут способствовать более высокому общему выходу полипептида и сохранению связывающей активности полипептида.
В некоторых примерах электрофоретическая миграция полипептида может меняться, иногда заметно, в различных условиях 8Э8/ЕАСЕ. См., например, Сара1бД еД а1. Вюсйет. Вюрйук/Век Сотт, 16: 425 (1977). Понятно, что в различных условиях электрофореза средние (кажущиеся) молекулярные массы очищенного или частично очищенного полипептида могут быть различными.
Трансгенные животные
В некоторых вариантах изобретения предусматривается трансгенные животные, содержит один или более полинуклеотидов, кодирующие один или более мутантных ЕСЕг полипептидов, один или более
- 22 013617 мутантных РВК полипептидов и/или один или более мутантных В-Ва! полипептидов. В некоторых вариантах изобретения трансгенные животные включают, но без ограничения, грызунов, таких как мыши или крысы, кроликов, коз, овец и других сельскохозяйственных животных. Некоторых трансгенных животных можно получать общеизвестными методами, включая, но без ограничения, методы, описанные в патенте США № 5489743 и в Международной патентной заявке VО 94/28122.
В некоторых вариантах изобретения для создания трансгенных животных можно использовать области транскрипционного контроля животных, которые проявляют тканевую специфичность. Типичные области транскрипционного контроля для применения в случае тканеспецифической экспрессии в трансгенных животных включают, но без ограничения контрольную область гена эластазы Ι, активную в панкреатических ацинарных клетках (8\νίΠ е! а1. (1984), Се11, 38: 639-46; ОгпЦх е! а1. (1986), Со1б 8рпид НагЬог 8утр. ОнагИ. Вю1. 50: 399-409; МасОоиа1б (1987), Нера!о1оду, 7: 425-515); контрольную область гена инсулина, активную в панкреатических бета клетках (Намакам (1985), №а!иге, 315: 115-122); контрольную область гена иммуноглобулина, активную в лимфоидных клетках (Сгокксйеб1 е! а1. (1984), Се11, 38: 64758; Абатек е! а1. (1985), №а!иге, 318: 533-8; А1ехаибег е! а1. (1987), Мо1. Се11. В1о1, 7: 1436-44); контрольную область вируса опухоли молочной железы мышей, активную в клетках яичек, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Ьебег е! а1. (1986), Се11, 45: 485-95); контрольную область гена альбумина, активную в печени (РткеП е! а1. (1987), Сеиек аиб Оеуе1., 1: 268-76); контрольную область гена альфа-фетопротеина, активную в печени (Кгиш1аи! е! а1. (1987), Мо1. Се11. В1о1., 5: 1639-48; Наттег е! а1. (1987), 8с1еисе, 235: 53-58); контрольную область гена альфа-1-антитрипсина, активную в печени (Ке1кеу е! а1. (1987), Сеиек аиб Оеуе1., 1: 161-171); контрольную область гена бета-глобина, активную в миелоидных клетках (Модгат е! а1. (1985), №а!иге, 315: 338-340; КоШак е! а1. (1986), Се11, 46: 89-94); контрольную область гена основного белка миелина, активную в олигодендроцитах в мозге (Веабйеаб е! а1. (1987), Се11, 48: 703-712); контрольную область гена лёгкой цепи-2 миозина, активную в скелетных мышцах (8аи1 (1985), №а!иге, 314: 283-286); и контрольную область гена гонадотропин-высвобождающего гормона, активную в гипоталамусе (Макои е! а1. (1986), 8аеисе, 234: 1372-8).
В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. нокаутирован) полинуклеотид, кодирующий ЕСЕг полипептид дикого типа, и заменён одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный ЕСЕг полипептид, так что уровень экспрессии ЕСЕг полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный ЕСЕг полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и приёмы, которые описаны в патенте США 5557032, или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного ЕСЕг полипептида повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного ЕСЕг полипептида понижается.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. нокаутирован) полинуклеотид, кодирующий РкХК полипептид дикого типа, и заменён одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный РкХК полипептид, так что уровень экспрессии РкХК полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный РкХК полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и приёмы, которые описаны в патенте США 5557032, или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных РкХК полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных РкХК полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного РБК полипептида повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного РБК полипептида понижается.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого разорван (т.е. нокаутирован) полинуклеотид, кодирующий В-Ва! полипептид дикого типа, и заменён одним или более полинуклеотидов, кодирующих мутантный В-Ва! полипептид, так что уровень экспрессии В-Ва! полипептида дикого типа значительно снижается или полностью аннулируется в организме животного, и в его организме экспрессируется мутантный В-Ва! полипептид. В некоторых таких вариантах изобретения животных могут получать, используя такие методы и приёмы, которые описаны в патенте США 5557032, или другие методы, хорошо известные в уровне техники. В некоторых вариантах изобретения предусматривается животное, у которого модулируется активность промотора в отношении одного или более мутантных В-Ва! полипептидов (например, с помощью известных в уровне техники методов гомологичной рекомбинации) с целью изменения уровня экспрессии одного или более мутантных В-Ва! полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного В-Ва! полипептида
- 23 013617 повышается. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии мутантного В-РаГ полипептида понижается.
В некоторых вариантах изобретения трансгенное животное можно использовать для скрининга с целью определения подходящего лекарства. В некоторых вариантах изобретения определяют действие предполагаемого (подходящего, лекарства-кандидата) лекарства на трансгенное животное. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного ЕСЕг полипептида.
В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным ЕСЕг полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного ΡΙ3Κ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать экспрессию мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых; вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать экспрессию мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активность мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность возможного лекарства понижать или предупреждать активность мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать активацию мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать активацию мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантного В-РаГ полипептида. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать аутофосфорилирование мутантного В-РаГ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства понижать
- 24 013617 или предупреждать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным В-ВаТ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства повышать связывание одного или более специфических связывающих агентов (агентов для специфического связывания) с мутантным В-ВаТ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность заболевания или состояния, связанного с мутантным В-ВаТ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения определяют способность предполагаемого лекарства уменьшать интенсивность рака, связанного с мутантным В-ВаТ полипептидом.
Специфические связывающие агенты (агенты для специфического связывания) и антитела
В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным ΡΙ3Κ полипептидом. В некоторых вариантах изобретения предусматривается агент для специфического связывания с мутантным В-ВаТ полипептидом. В некоторых таких вариантах изобретения специфические связывающие агенты представляют собой антитела или их антиген-связывающие фрагменты.
В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела можно получать методом гибридом, впервые описанным 1<оН1ег е! а1., ШЕие, 256: 495 (1975). В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела можно получать методами рекомбинантной ДНК (патент США 4816567).
В некоторых вариантах изобретения, относящихся к методу гибридом, мышь или другое подходящее животное-хозяина, включая, но без ограничения, хомяка или макака, иммунизируют таким образом, чтобы извлечь лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, применяемым для иммунизации. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты могут быть иммунизированы ш νίΙΐΌ. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты, или лимфоциты, обогащенные В клетками, сливают с клетками миеломы в модуле для слияния клеток в электрическом поле или применяя подходящий фузогенный (сливающий) агент, такой как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Собтд, Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: ΡίΜαρ^ апб Ρ^асΐ^се, рр.59-103, [Асабетю Ρκκκ, 1996]).
В некоторых вариантах изобретения гибридомные клетки засевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. В некоторых вариантах изобретения, если в родительских миеломных клетках отсутствует фермент гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансфераза (НСΡВΤ или ДОВТ), культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), это вещества, которые предупреждают рост НСΡВΤ-дефицитных клеток.
В некоторых вариантах изобретения выбирают такие миеломные клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают устойчивое продуцирование высокого уровня антител в выбранных антителопродуцирующих клетках и восприимчивы к среде, такой как среда НАТ. Типичные линии миеломных клеток включают, но без ограничения, линии клеток мышиной миеломы, такие как клетки опухолей мышей МОР-21 и МС-11, имеющиеся в 8а1к Iηкΐ^ΐиΐе Се11 018(г1Ьи11оп Сеп1ег, 8ап О1едо, СайТогша И8А, и 8Ρ-2 или Х63-Ад8-653 клетки, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, ВоскуШе, Магу1апб И8А. В некоторых вариантах изобретения для продуцирования человеческих антител используют линии клеток человеческой миеломы и/или гетеромиеломы мышь-человечек (Хо/Ьог, 1 Тттипо! 133: 3001 (1984); Вгобеиг е! а1, Мопос1опа1 АпбЬобу Ρ^οбисίюη ТесНшсщек апб Аррбсабопк, рр. 51-63, Магсе1 Эеккег, Шс., №\ν Υο^к, [1987]).
В некоторых вариантах изобретения культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, специфических к антигену. В некоторых вариантах изобретения специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или ш νίΙΐΌ анализом связывания. Примеры анализов связывания включают, но без ограничения, радиоиммуноанализ (ВЬА), твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) и анализ Скетчарда по Мипкоп е! а1., Апа1. Вюсйет. 107: 220 (1980).
В некоторых вариантах изобретения после того, как идентифицированы гибридомные клетки, которые продуцируют антитела заданной специфичности, аффинности и/или активности, клетки можно субклонировать методом ограниченных разведений и выращивать стандартными методами (Собшд, Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Ρ^^ηс^ρ1ек апб ΡπκΙ^, рр.59-103, Асабетю Ριόκκ, 1996). Примеры культуральных сред для этой цели включают, но без ограничения, среду ЭМЕМ и ВΡМI-1640. В некоторых вариантах изобретения гибридомные клетки можно выращивать ш у1уо в виде асцитных опухолей у животного.
В некоторых вариантах изобретения моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки традиционными методами очистки иммуноглобулинов, например, такими как разделение на протеин Асефарозе, хроматографией на гидроксилапатите, гель-электрофорезом или аффинной хроматографией.
В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать традиционными методами (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжёлые и лёгкие цепи монокло
- 25 013617 нальных антител). В некоторых таких вариантах изобретения гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такого полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения выделенный полинуклеотид можно помещать в экспрессирующие векторы. В некоторых таких вариантах изобретения экспрессирующие векторы трансфецируют в клетки-хозяева с целью синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Примеры клеток-хозяев включают, но без ограничения, клетки Е. со11, клетки СО8 зелёной мартышки, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок. В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид может модифицироваться, например, ковалентным связыванием с последовательностью, кодирующей иммуноглобулин, целой или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид, при этом образуется химерное или гибридное антитело.
В некоторых вариантах изобретения неиммуноглобулиновые полипептиды заменяются на константные домены антитела. В некоторых вариантах изобретения неиммуноглобулиновые полипептиды заменяются на один антиген-связывающий сайт вариабельных доменов антитела с образованием химерного бивалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к целевому антигену, и другой антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к другому антигену.
В некоторых вариантах изобретения химерные или гибридные антитела можно получать ш νίΐΐΌ, используя методы, известные в химии синтетических белков, включая, но без ограничения, методы с применением сшивающих агентов. В некоторых таких вариантах изобретения можно создавать иммунотоксины по реакции дисульфидного обмена или с образованием тиоэфирной связи. Примеры реагентов для этой цели включают, но без ограничения, иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются человеческие антитела к целевому антигену. В некоторых вариантах изобретения гибридомную технологию применяют для создания человеческих антител с использованием в качестве партнёров по слиянию гетеромиелом (человек х мышь гибридных миелом) (см., например, КохЬог. Е 1ттипо1. 133: 3001 (1984); Вгобеиг, е! а1., Мопос1опа1 АпБЬобу РгобисБоп Τесйп^^иеб апб АррксаБопб, рр.51-63, Магсе1 Оеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1987). В некоторых вариантах изобретения клетки, секретирующие человеческие антитела, можно иммортализовать, инфицируя вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ, ЕВУ) (Ьатеб апб Ве11, Ь. 1ттипо1. Мебюбб 100: 5-40 [1987]). В некоторых вариантах изобретения иммортализация человеческих В клеток достигается введением определённой комбинации трансформирующих генов (Нагт е! а1., №11иге 400: 464-468 [1999]).
В некоторых вариантах изобретения для получения человеческих антител используют трансгенные животные (например, мыши), способные, после иммортализации, продуцировать спектр человеческих антител, не продуцируя эндогенный иммуноглобулин (см., например, ,1акоЬо\з1б е! а1., №11иге 362: 255258 [1993]; ЬопЬегд апб Ниб/аг, 1п!. Вес. 1ттипо1. 13: 65- 93 [1995]; ΕΐδΗνΐΜ е! а1., №11. Вю!ескпо1. 14: 845-851 [1996]; Мепбех е! а1., №!. Оепе!. 15: 146-156 [1997]; Огееп, к 1ттипо1 МеШобб 231: 11-23 [1999]; Τοт^ζика е! а1., Ргос. Асаб. 8ск И8А 97: 722-727 [2000]; обзор в ЫШе е! а1., 1ттипо1. ^бау 21: 364370 [2000]). Было описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжёлой цепи (ЬН) антитела у химерных и зародышевой линии мутантных мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенос енного антитела (^акοЬον^!б е! а1., Ргос. №111 Асаб. 8ск И8А 90: 2551-2555 [1993]). Перенос спектра генов зародышевого человеческого иммуноглобулина в таких зародышевой линии мутантных мышей приводит к продуцированию человеческих антител при антигенной стимуляции (ЬакоЬо\Пб е! а1., №Пиге 362: 255- 258 [1993]).
Мепбех е! а1. (№11иге ОепеБсб 15: 146-156 [1997]) получили линию трансгенных мышей, названных Хепотоибе® II, которые, при антигенной стимуляции, генерируют высокоаффинные полностью человеческие антитела. Это достигается интеграцией локусов с большим числом оснований человеческой тяжёлой цепи и лёгкой цепи зародышевой линии в мышей с делецией в эндогенном ЬН сегменте. Мышь ХепоМоибе® II включает локус человеческой тяжёлой цепи из 1020 т.н. о., содержащий около 66 УН генов, целые Он и ЬН области и три различных константных области (μ, δ и γ), а также включает 800 т.н.о. человеческого к локуса, содержащего 32 гена Ук, Ц сегмента и Ск гена. В некоторых вариантах изобретения антитела, продуцированные в этих мышах, во всех отношениях очень напоминают антитела человека, включая реаранжировку, сборку и спектр генов. В некоторых вариантах изобретения человеческие антитела экспрессируются преимущественно по сравнению с эндогенными антителами вследствие делеции в эндогенном ЬН сегмента, которая предупреждает реаранжировку гена в мышином локусе.
В некоторых вариантах изобретения трансгенное животное, содержащее гены человеческого иммуноглобулина (например, Хепотоибе® II (АЬдешх, Шс.)), могут быть иммунизированы антигеном, представляющим особый интерес, таким как мутантный ЕОЕг полипептид, мутантный РКК полипептид и/или мутантный В-ЕаГ полипептид. В некоторых вариантах изобретения сыворотки этих иммунизированных животных подвергают скринингу на реактивность антител против первичного антигена. В некоторых вариантах изобретения лимфоциты выделяют из лимфатических узлов или клеток селезёнки, и их далее можно обогащать В клетками селекцией СО138-негативных и СЭ19+ клеток. В некоторых вариантах изобретения такие В клеточные культуры (ВСС) сливают с клетками миеломы, получая гибридомы,
- 26 013617 подробно описанные выше. В некоторых вариантах изобретения такие культуры В клеток подвергают дополнительному скринингу на реактивность против первичного антигена. Такой скрининг включает, но без ограничения, ЕЫ§А, конкурентный анализ с известными антителами, которые связывают нужный антиген, и ίη νίίΐΌ связывание с транзиторно трансфецированными СНО клетками, экспрессирующими антиген. В некоторых вариантах изобретения единичные В клетки, секретирующие нужные антитела, идентифицируются с помощью специфического анализа на гемолитические бляшки. В некоторых вариантах изобретения клетки, нацеленные на лизис, представляют собой эритроциты овцы (8ВВС), покрытые антигенами. В некоторых таких вариантах изобретения образование бляшек указывает на специфический опосредованный антигеном лизис клеток-мишеней и, тем самым, на присутствие культуры В клеток, секретирующих нужный иммуноглобулин и комплемент. В некоторых таких вариантах изобретения единичную антиген-специфическую плазматическую клетку в центре бляшки можно выделить и использовать для выделения мРНК.
В некоторых вариантах изобретения полинуклеотид, кодирующий вариабельную область секретированного антитела, можно клонировать методом ПЦР обратной транскриптазой. В некоторых вариантах изобретения клонированный полинуклеотид далее встраивают в подходящий экспрессирующий вектор, такой как векторная кассета, такая как пкДНК φοΟΝΆ) или вектор пкДНК, содержащий константные домены тяжёлой и лёгкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах изобретения полученный вектор трансфецируют в клетки-хозяева (т.е. СНО клетки) и культивируют в традиционных питательных средах, подходящих для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих заданные последовательности.
В некоторых вариантах изобретения технологию фагового дисплея используют для получения человеческих антител и фрагментов антител ίη νίΙΐΌ с помощью спектра генов вариабельного (У) домена иммуноглобулина иммунизированных доноров (см., например, МсС'аГГеПу с1 а1., №11игс 348: 552-553 [1990]; обзор в 1<|рпуапо\' анб ЬбИе, Мо1 Вю1сс1то1. 12: 173-201 [1999]; НооденЬоот анб СЕатех, Iттипо1. Тобау 21: 371-378 [2000]). В некоторых вариантах изобретения гены У домена антитела клонируют в рамке считывания в ген либо основного, либо минорного оболочечного белка нитевидного бактериофага, такого как М13 или Гб, и визуализуют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. В некоторых вариантах изобретения нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, а селекции на основании функциональных свойств антитела также приводят к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах, включая, но без ограничения, форматы, определённые в следующих документах: 1о11пхоп ааб СЫхте11, С’иггеШ Οр^η^оη ίη 81гисШга1 Вю1о§у 3: 564- 571 [1993)]; \Ут1ег е1 а1., Ληηιι. Ве'. Iттино1. 12: 433-455 [1994]; ВаИАссща авб СаЛег, Сигг. Οр^η. §1гис1. Вю1. 8: 443-450 [1998]; и НоодеиЬоот авб СЕатех, ^тимк Тобау 21: 371-378 [2000]. Источники сегментов У-гена для фагового дисплея включают, но без ограничения, малую статистическую (случайную) комбинаторную библиотеку У генов из селезёнки иммунизированной мыши (СИс^он е1 а1., (№11иге 352: 624-628 [1991]) и набор У генов неиммунизированных человеческих доноров (Магкх е1 а1., ί. Мо1. Вю1. 222: 581-597 (1991), или СпГГНЕх е1 а1., ЕМВΟ I. 12: 725-734 (1993)).
В некоторых вариантах изобретения при естественном иммунном ответе гены антитела аккумулируют мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). В некоторых вариантах изобретения ряд введённых изменений придаёт повышенную аффинность. В некоторых вариантах изобретения высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно, реплицируется и дифференцируется в процессе последующей антигенной стимуляции. В некоторых вариантах изобретения этот естественный процесс можно имитировать, используя метод, называемый перетасовкой цепи (сйаш х1шГГ1тд) (Магкх е1 а1., Вю/Тес1то1. 10: 779-783 [1992]). В некоторых вариантах изобретения аффинность первичных человеческих антител, полученных фаговым дисплеем, можно повысить последовательной заменой генов У области тяжёлой и лёгкой цепей набором природных вариантов (спектром) генов У домена, полученных от неиммунизированных доноров, что способствует продуцированию антител и фрагментов антител с аффинностью в нМ интервале. В некоторых вариантах изобретения конструируют очень большой спектр фаговых антител (также называемый родоначальницей-всех-библиотек), описанный \Уа1егЕоихе е1 а1., Ииск Ас1бх Вех. 21: 2265-2266 (1993). В некоторых вариантах изобретения высокоаффинное человеческое антитело выделяют непосредственно из большой фаговой библиотеки (см., например, СпГГбЕх е1 а1., ЕМВΟ ί. 13Ж 3245-3260 (1994)). В некоторых вариантах изобретения для получения человеческих антител из антител грызунов, когда аффинности и специфичности человеческого антитела и исходного антитела грызуна аналогичны, можно использовать перетасовку генов. В некоторых таких вариантах изобретения ген У домена тяжёлой или лёгкой цепи антител грызунов, полученных методом фагового дисплея, заменяют спектром человеческих генов У домена, создавая химеры грызун-человек (также в данном описании называемые эпитопным импринтингом). В некоторых вариантах изобретения селекция вариабельных областей с помощью антигена приводит к выделению человеческих вариабельных областей, способных восстанавливать функциональный антиген-связывающий сайт, т. е. эпитоп определяет (делает отпечаток) выбор партнёра. В некоторых вариантах изобретения, когда процесс повторяется для того, чтобы заменить остальной У домен грызуна, получают человеческое антитело, которое не со
- 27 013617 держит каркасных или СОВ остатков, происходящих от грызуна (см. патентную заявку РСТ XVО 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.).
Биочипы (наборы)
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются (микро)биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных ЕСЕг полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных ЕСЕг полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных ΡΙ3Κ полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных ΡΙ3Κ полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных В-ВаТ полинуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более полинуклеотидов, комплементарных одному или более полинуклеотидов, кодирующих один или более мутантных В-ВаТ полинуклеотидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ЕСЕг полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных ЕСЕг полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных ЕСЕг полинуклеотидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ΡΙ3Κ полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных ΡΙ3Κ полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных ΡΙ3Κ полинуклеотидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ВВаТ полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых вариантах изобретения количество одного или более мутантных В-ВаТ полинуклеотидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на количество одного или более мутантных В-ВаТ полинуклеотидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является показателем присутствия или отсутствия мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является показателем присутствия или отсутствия мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения присутствие или отсутствие одного или более мутантных ВВаТ полипептидов в двух или более образцах клеток или ткани оценивают с применением биочиповой технологии. В некоторых таких вариантах изобретения сначала из образца клеток или ткани экстрагируют мРНК, а затем превращают в кДНК, которую гибридизуют с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения присутствие или отсутствие кДНК, которая специфически связывается с биочипом, является
- 28 013617 показателем присутствия или отсутствия мутантного В-ЯаГ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения уровень экспрессии одного или более мутантных В-ЯаГ полипептидов оценивают, вычисляя количество кДНК, которая специфически связывается с биочипом. В некоторых таких вариантах изобретения клетку или ткань обрабатывают перед определением и оценивают также способность обработки влиять на экспрессию одного или более мутантных В-ЯаГ полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных ЕСЕг полипептидов (см., например, МсВеаШ с1 а1., Баепсе, 289: 1760- 1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантных ЕСЕг полипептидов агенты подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными ЕСЕг полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного ЕСЕг полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными ЕСЕг полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных ЕСЕг полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных ЕСЕг полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов (см., например, МсВеаШ е1 а1., Баепсе, 289: 1760-1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов агенты ΡΙ3Κ подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными ΡΙ3Κ полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного ΡΙ3Κ полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными ΡΙ3Κ полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных ΡΙ3Κ полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных ΡΙ3Κ полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более мутантных В-КаГ полипептидов (см., например, МсВеа111 е1 а1., Баепсе, 289: 1760-1763, 2000). В некоторых вариантах изобретения предполагаемые специфически связывающиеся с одним или более мутантных ВЯаГ полипептидов агенты подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными В-ЯаГ полипептидами. В некоторых вариантах изобретения соединения, предполагаемые для модуляции активности мутантного В-ЯаГ полипептида, подвергаются скринингу с применением биочипа с мутантными В-ЯаГ полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединенийкандидатов понижать или предупреждать аутофосфорилирование мутантных В-ЯаГ полипептидов. В некоторых таких вариантах изобретения оценивается способность соединений-кандидатов повышать аутофосфорилирование мутантных В-ЯаГ полипептидов.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными ЕСЕг полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов в клетке или ткани.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными ΡΙ3Κ полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных ΡΙ3Κ полипептидов в клетке или ткани.
В некоторых вариантах изобретения предусматриваются биочипы, содержащие один или более агентов, специфически связывающихся с мутантными В-ЯаГ полипептидами. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают присутствие или отсутствие одного или более мутантных В-ЯаГ полипептидов в клетке или ткани. В некоторых таких вариантах изобретения оценивают количество одного или более мутантных В-ЯаГ полипептидов в клетке или ткани.
Некоторые методы
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ЕСЕг полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ΡΙ3Κ полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный В-ЯаГ полипептид. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ЕСЕг полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида животному и получение антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ЕСЕг полипептид животного. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ΡΙ3Κ полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного ΡI3К полипептида животному и получение антитела, способного
- 29 013617 связывать по меньшей мере один мутантный Р13К полипептид животного. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный В-КаГ полипептид, содержащий введение по меньшей мере одного мутантного В-КаГ полипептида животному и получение антитела, способного связывать по меньшей мере один мутантный ВКаГ полипептид животного. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 8Ер ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 17, 81Т) ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20, включающий введение животному по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 17, 81Т) ГО N0: 19 и 81Т) ГО N0: 20; и предусматривается получение из организма животного антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 17, 8Е0 ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 17, 81Т) ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20, включающий введение животному по меньшей мере одного фрагмента, по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 17, 8Е0 ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20, где по меньшей мере один фрагмент содержит по меньшей мере одну мутацию; и предусматривается получение из организма животного антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 13, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17, 8Е0 ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой человеческое антитело.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более Р13К мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-КаГ мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного ЕСЕг полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного ЕСЕг полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 9, 8Е0 ГО N0: 10, 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое
- 30 013617 связано с одной или более ЕСРг мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного РВК полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного РВК полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 15, ЗЕО ΙΌ N0: 16 и ЗЕО ΙΌ N0: 17, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более РВК мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 15, ЗЕО ΙΌ N0: 16 и ЗЕО ΙΌ N0: 17, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более РКК мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного В-ВаГ полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ВВаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного В-ВаГ полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 19 и ЗЕО ΙΌ N0: 20, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 19 и ЗЕО ΙΌ N0: 20, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более В-ВаГ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного ЕСРг полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики чувствительности к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного ЕСРг полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСРг мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансля
- 31 013617 ции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 6, 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8ЕО ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 12 и 8ЕО ГО N0: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ГО N0: 2, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 5, 8ЕО ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 9, 8Е0 ГО N0: 10, 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕСЕг мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного ΡΙ3Κ полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более РБК мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного ΡΙ3Κ полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 15, 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 17, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 15, 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 17, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ΡΙ3Κ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций у субъекта. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии мутантного В-РаГ полипептида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции мутантного ВРаГ полинуклеотида в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени экспрессии полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 19 и 8Е0 ГО N0: 20, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-РаГ мутаций, на основании наличия или степени экспрессии полипептида. В некоторых вариантах изобретения
- 32 013617 способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-ВаТ мутаций у субъекта, включает: (а) определение наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕО ΙΌ N0: 19 и ЗЕО ΙΌ N0: 20, в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более В-ВаТ мутаций, на основании наличия или степени транскрипции или трансляции полинуклеотида. В некоторых вариантах изобретения заболевание или состояние представляет собой рак.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСЕг полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ό688Ρ, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828йор, 0849В, Е910Б и У948А, и (б) определение наличия или отсутствия в образце полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия мутантного ЕСЕг полипептида, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСЕг полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ό688Ρ, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828йор, 0849В, Е910Б и У948А, и (б) определение наличия или отсутствия в образце мутантного ЕСЕг полипептида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ΡΙ3Κ полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ΡΙ3Κ полипептид, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ΡΙ3Κ полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ΡΙ3Κ мутацию, выбранную из Е542К, Е545А и Н1047Б, и (б) определение наличия или отсутствия в образце полинуклеотида, кодирующего мутантный ΡΙ3Κ полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия мутантного ΡΙ3Κ полипептида, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ΡΙ3Κ полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ΡΙ3Κ мутацию, выбранную из Е542К, Е545А и Н1047Б, и (б) определение наличия или отсутствия в образце мутантного ΡΙ3Κ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный В-ВаТ полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный В-ВаТ полипептид, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного В-ВаТ полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну В-ВаТ мутацию, выбранную из У600Е и Κ601Е, и (б) определение наличия или отсутствия в образце полинуклеотида, кодирующего мутантный В-ВаТ полипептид. В некоторых вариантах изобретения способ определения в образце наличия или отсутствия мутантного В-ВаТ полипептида, включает (а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного В-ВаТ полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну В-ВаТ мутацию, выбранную из У600Е и Κ60ΕΞ, и (б) определение наличия или отсутствия в образце мутантного В-ВаТ полипептида.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного ЕСЕг полипептида включает контактирование клетки, экспрессирующей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный ЕСЕг полипептид, с тестируемым соединением; и детектирование, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного ЕСЕг полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение повышает активность ЕСЕг полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение понижает активность ЕСЕг полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как понижающее активность ЕСЕг полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным ЕСЕг полипептидом. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как повышающее активность ЕСЕг полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным ЕСЕг полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного ΡΙ3Κ полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного ΡΙ3Κ полипептида включает контактирование клетки, экспрессирующей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутант
- 33 013617 ный ΡI3Κ полипептид, с тестируемым соединением; и детектирование, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного ΡI3Κ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение повышает активность ΡI3Κ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение понижает активность РБК полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как понижающее активность ΡI3Κ полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным ΡI3Κ полипептидом. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как повышающее активность ΡI3Κ полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным ΡI3Κ полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного В-ВаЕ полипептида. В некоторых вариантах изобретения способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного В-ВаЕ полипептида включает контактирование клетки, экспрессирующей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий мутантный В-ВаЕ полипептид, с тестируемым соединением; и детектирование, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного В-ВаЕ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение повышает активность В-ВаЕ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение понижает активность В-ВаЕ полипептида. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как понижающее активность ВВаЕ полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным В-ВаЕ полипептидом. В некоторых таких вариантах изобретения тестируемое соединение, идентифицированное как повышающее активность В-ВаЕ полипептида, можно использовать для лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одним мутантным В-ВаЕ полипептидом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией. В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, и этот способ включает:
(а) детектирование по меньшей мере одной ЕОЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, отличающееся тем, что обнаружение по меньшей мере одной ЕОЕг мутации показывает, что пациент имеет повышенную восприимчивость к развитию заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией; и (б) введение субъекту антитела, которое специфически связывает ЕОЕг полипептид.
В некоторых вариантах изобретения антитело является человеческим антителом. В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или антиген, связывающий его область.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, и этот способ включает:
(а) детектирование по меньшей мере одной ЕОЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, отличающееся тем, что обнаружение по меньшей мере одной ЕОЕг мутации показывает, что пациент имеет заболевание или состояние, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией; и (б) введение субъекту антитела, которое специфически связывает ЕОЕг полипептид.
В некоторых таких вариантах изобретения антитело является человеческим антителом. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой панитумумаб или антиген, связывающий его область.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, отличающийся тем, что по меньшей мере одну из ЕОЕг мутаций, выбирают из Б688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828к!ор, Р849В, Е910Б и У948А.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, отличающийся тем, что заболевание или состояние, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, представляет собой немелкоклеточный рак лёгкого.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ лечения субъекта от заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, причём этот способ заключается во введении полинуклеотида, антисмыслового по отношению к мутантному ЕОЕг полинуклеотиду, субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ установления профиля популяции мутантного ЕОЕг в специфической популяции индивидуумов, включающий: (а) определение присутствия по меньшей мере одной ЕОЕг мутации в генетическом профиле индивидуумов в популяции; и (б) установление связи между мутантными ЕОЕг генетическими профилями и индивидуумами. В некоторых таких вариантах изобретения специфические характеристики индивидуумов включают восприимчивость к развитию заболевания или состояния, связанного с ЕОЕг мутацией. В некоторых таких вариантах изо
- 34 013617 бретения специфические характеристики индивидуумов включают проявление заболевания или состояния, связанного с ЕСЕг мутацией.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ прогнозирования эффективности лечения заболевания или состояния гефитинобом, заключающийся в определении присутствия или отсутствия ЕСЕг мутации Т790М в мутантном ЕСЕг полипептиде субъекта, причём присутствие одного или более мутантных ЕСЕг полипептидов указывает на резистентность к лечению гефитинибом.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается способ определения восприимчивости к лечению субъекта, страдающего раком, антителом против ЕСЕг, причём способ заключается в определении присутствия или отсутствия у субъекта ЕСЕг мутации Т790М. В некоторых таких вариантах изобретения антитело представляет собой панитумамаб или цетуксимаб.
В некоторых вариантах изобретения предусматривается набор для обнаружения полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид в организме субъекта. В некоторых таких вариантах изобретения набор содержит зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСЕг полипептида, отличающуюся тем, что эта область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ε688Ρ, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828йор, 0849В, Е910Ь и У948А. В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит компонент для детекции (обнаружения). В некоторых вариантах изобретения набор дополнительно содержит компонент для выборки нуклеотидов.
Нижеприведённые примеры, включая проведённые эксперименты и полученные результаты, приводятся только с целью иллюстрации и не рассматриваются как ограничивающие настоящее изобретение.
Примеры
Пример 1. Идентификация ЕСЕг, ΡΙ3Κ И В-ВаГ мутаций в образцах опухолей немелкоклеточного рака легкого и аденокарциномы
Для идентификации мутаций в ЕСЕг, фосфорилированной 3'-киназе (ΡΙ3Κ) и В-ВаГ, ассоциированных с немелкоклеточным раком лёгкого (№СЬС), специфические экзоны ЕСЕг, ΡΙ3Κ и В-ВаГ выделяют и амплифицируют с применением образцов опухоли №СЬС. Для двойного слепого эксперимента по сравнению одного химиотерапевтического лечения (карбоплатин/паклитаксел) с лечением с помощью химиотерапии в комбинации с панитумумабом, человеческим антителом против ЕСЕг (Атдеи), образцы опухоли двадцати пациентов, зарегистрированных в испытании №СЬС первой линии, получают перед тем, как лечить пациента с помощью химиотерапии и/или панитумумаба. Для идентификации мутаций в ЕСЕг и ΡΙ3Κ, ассоциированных с клоректальной аденокарциномой (СВС), специфические экзоны ЕСЕг и ΡΙ3Κ выделяют из опухолей двадцати больных СВС и амплифицируют. Для двойного слепого эксперимента по сравнению одного химиотерапевтического лечения (карбоплатин/паклитаксел) с лечением с помощью химиотерапии в комбинации с панитумумабом, человеческим антителом против ЕСЕг (Атдеи), образцы опухоли двадцати пациентов, зарегистрированных в испытании СВС первой линии, получают перед тем, как лечить пациента с помощью химиотерапии и/или панитумумаба. Каждый выделенный экзон секвенируют для идентификации каких-либо изменений по сравнению с дикого типа последовательностями этих экзонов.
Отбирают образцы ЖС'ЕС опухоли двадцати пациентов (табл. 1) и образцы СВС опухоли двадцати пациентов (табл. 2). Часть образца каждой опухоли окрашивают для идентификации степени ЕСЕг экспрессии в опухоли и оценивают окрашивание по трёхбалльной шкале (где 3 является наивысшей степенью окрашивания). По меньшей мере у 10% каждого образца опухоли наблюдается уровень окрашивания три или выше. Опухолевую ткань отделяют от прилегающей нормальной ткани, некротического дебриса и стромы макрорассечением фиксированных в формалине, заключённых в парафин срезов тканей. Обработанные образцы фиксируют в виде микроскопических препаратов и хранят при комнатной температуре.
- 35 013617
Таблица 1. Образцы, взятые у больных ЖСйС
- 36 013617
Таблица 2. Образцы, взятые у больных СВС
Геномную ДНК получают из образцов в виде микроскопических препаратов, используя систему выделения ДНК Ρ^ηрο^ηД 811бе ΌΝΑ [8о1а11оп 8укДет Щуто Векеагсй, Огапе, СА) в соответствии с протоколом изготовителя. Конечный продукт выделенной геномной ДНК растворяют в 500 мкл воды. Последовательности, соответствующие экзонам 18, 19, 20, 21 и 23 человеческого ЕСЕг, экзоны 9 и 20 человеческого ΡΙ3Κ и экзон 15 человеческого В-Ва! амплифицируют методом ПЦР с применением праймеров, специфических для каждого экзона. Последовательности праймеров для каждого экзона обозначают, используя интронные последовательности 5' и 3' к каждому экзону в ДНК последовательности ЕСЕг дикого типа (Инвентарный №. в АС006977; 8ЕЦ ΙΌ N0: 55). Геномная нуклеотидная последовательность ЕСЕг дикого типа находится в СепЬапк Регистрационный №. АС073324. Полипептидная последовательность ЕСЕг дикого типа находится в СепЬапк Инвентарный №. АА883109 (8ЕЦ ΙΌ N0: 1). Прямой праймер для экзона 18 ЕСЕг представляет собой 5'-СССССАТСТСТСССАСТССТТТСС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 22), а обратным праймером для экзона 18 ЕСЕг является 5'-САААТАТАСАССТТССААССА СТС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 23). Прямой праймер для экзона 19 ЕСЕг представляет собой 5'-ААТАТСАСССТТАСС ТСССССТСС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 24), а обратным праймером для экзона 19 ЕСЕг является 5'-САСААААСС ТСССССТСАССТТС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 25). Прямой праймер для экзона 20 ЕСЕг представляет собой 5'СТСССТАААССТСССТСТССТАССТС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 26), а обратным праймером для экзона 20 ЕСЕг является 5'-ССАСССАСАСАСАТАТССССАТССС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 27). Прямой праймер для экзона 21 ЕСЕг представляет собой 5'-ССАТСААСАТСАСССТСААТТССС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 28), а обратным праймером для экзона 21 ЕСЕг является 5'-ССТССАТСТСТТАААСААТАСАСС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 29). Прямой праймер для экзона 23 ЕСЕг представляет собой 5'-ТСАТТСАТСАТСССАСТСССТТС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 30), а обратным праймером для экзона 20 ЕСЕг является 5- САССТСТТТСССТААСАССАССС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 31).
Полипептидная последовательность ΡΙ3Κ дикого типа находится в СепЬапк Инвентарный №. И79143 (8ЕЦ ΙΌ N0: 14). Последовательность кДНК Р13К дикого типа показана на фиг. 7 (8ЕЦ ΙΌ N0: 58). Прямой праймер для экзона 9 ΡΙ3Κ представляет собой 5'СТСТАААТСАТСТСТСААТССАСАСССС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 32), а обратным праймером для экзона 9 ΡΙ3Κ является 5'-СТАААТТСТССТТТАТТТАТТССААТАССТАТСС-3 (8ЕО ΙΌ N0: 33). Прямой праймер для экзона 20 ΡΙ3Κ представляет собой 5'-СТАССАААСССТСТСТААТТТТСТСАСАТТТСАСС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 34), а обратным праймером для экзона 20 ΡΙ3Κ является 5'СТТССТСТАААТТСТААТССТСТТСАТССАТТСТСС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 35). Полипептидная последова
- 37 013617 тельность В-КаГ дикого типа находится в СеиЬаик Инвентарный ТБе Ыо. ЫМ004333 (8ЕЦ ГО ЫО: 18). Последовательность кДНК В-КаГ дикого типа показана на фиг. 8 (8ЕЦ ГО ЫО: 60). Прямой праймер для экзона 11В-КаГ представляет собой 5'-ССССАТСТСТТССТСТАТСССТСТСАССС-3' (8ЕО ГО ЫО: 36), а обратным праймером для экзона 11 В-КаГ является 5'-СТТТАТТСАТСССААСАСТСААТАТТТСС-3' (8ЕЦ ГО ЫО: 37). Прямой праймер для экзона 15 В-КаГ представляет собой 5САТААТССТТССТСТСАТАСС-3' (8ЕЦ ГО ЫО: 38), а обратным праймером для экзона 15 Р13К является В-КаГ 5'-СТААСТСАССАССАТСТСАС-3' (8ЕО ГО ЫО: 39).
ПЦР осуществляют, используя Тад ДНК полимеразу (КосБе П1адиокйск Согр) и следующие условия: смешивают 5 мкл 10х Тад буфера, 0,5 мкл 24 мМ МдС12, 1 мкл геномной ДНК (около 0,5 нг), 7 мкл 2,5 мМ дНТФ (бЫТР, дезоксирибонуклеозидтрифосфата), 1 мкл Тад полимеразы (5 Ед.) и 29.5 мкл ббН2О. В каждую пробирку добавляют по шесть мкл объединённого исходного раствора праймеров (10 мкМ каждого). Протокол циклов следующий: 1 цикл 4 мин при 93°С, 10 с при 93°С, 30 с при 62°С, 30 с при 72°С, всего 35 циклов, и 1 цикл 4 мин при 72°С. В конце реакции поддерживают температуру 4°С.
Продукты ПЦР для каждого индивидуального экзона собирают и очищают на геле. Очищенные амплифицированные экзонные последовательности субклонируют в вектор рСК2.1, используя набор для клонирования ТОРО-ТА С1ошид Кй Циуйгодеи Согр) в соответствии с инструкциями производителя. Колонии Е. со11, содержащие нужный вектор и нужный встраиваемый экзон, собирают с помощью Сеие!1х Со1оиу Рюкег. Эти колонии выращивают в течение ночи в жидкой среде. Плазмидную ДНК каждой выращенной в течение ночи культуры выделяют с помощью биоавтомата О1АСЕЫ 9600, 3000 или 8000 Вю-гоЬо! (Р1адеи) в соответствии с инструкциями производителя.
Выделенную плазмидную ДНК, содержащую каждый экзон, секвенируют, используя набор В1дОуе 3.1 Тегш1иа!ог Кй (Аррйеб Вюкук!етк, 1ис.) согласно инструкциям производителя. Данные секвенирования получают на анализаторе 3700, 3100 или 3730 Сеиейс Аиа1ухег (Аррйеб Вюкук!етк, 1ис.) и анализируют с помощью программы БеОиегюНег (СеиеСобек Согр.). Последовательности экзонов из образцов, взятых у пациентов, сравнивают с экзонными последовательностями дикого типа. Схематически результаты показаны на фиг. 1 и 2.
Мутационным анализом образцов опухоли, взятых у больных Ы8СЬС, (фиг. 1) определяют несколько мутаций в ЕСРг: две различные мутации в экзоне 18 ЕСРг у двух различных пациентов (Ц701Н (8ЕЦ ГО ЫО: 40, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 3) и Ь688Р (8ЕЦ ГО ЫО: 41, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 2)); делецию из 15 п.о. (8ЕЦ ГО ЫО: 42, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 4) и мутацию (К745Ы (8ЕЦ ГО ЫО: 43, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 5)) в экзоне 19 ЕСРг у двух различных пациентов; три различные мутации в экзоне 20 ЕСРг у трёх различных пациентов (С781К (8ЕЦ ГО ЫО: 44, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 6), Т790М (8ЕЦ ГО ЫО: 45, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 8) и инсерцию гистидина между аминокислотами 771 и 772 (8ЕЦ ГО ЫО: 46, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 7)); одну мутацию (Ц849К (8ЕЦ ГО ЫО: 47, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 10)) в экзоне 21 ЕСРг у единственного пациента; и две различные мутации в экзоне 23 ЕСРг у двух различных пациентов (У948А (8ЕЦ ГО ЫО: 48, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 13) и Р910Ь (8ЕЦ ГО ЫО: 49, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 12)). Анализ Р13К экзонов в образцах, взятых у больных Ы8СЬС, выявляет единичную мутацию (Е545А (8ЕЦ ГО ЫО: 50, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 16)) в экзоне 9 Р13К, которая наблюдается у семи различных пациентов, и отсутствие мутации в экзоне 20 Р13К. Анализ В-КаГ экзона 15 также определяет единичную мутацию (У600Е (8ЕЦ ГО ЫО: 51, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 19)) у двух различных пациентов.
Мутационный анализ образцов опухоли, взятых у больных СКС, напротив, не выявляет каких- либо мутаций ЕСРг у двадцати СКС пациентов (фиг. 2). У тридцати из этих двадцати пациентов имеется та же самая мутация Е545А (8ЕЦ ГО ЫО: 50, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 16) в экзоне 9 Р13К, которую ранее идентифицировали в образцах, взятых у больных Ы8СЬС. Кроме того, у трёх других пациентов в этом экзоне идентифицируют мутацию Е542К (8ЕЦ ГО ЫО: 53, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 15). Одну мутацию (Н1047Ь (8ЕЦ ГО ЫО: 54, которая кодирует полипептид с 8ЕЦ ГО ЫО: 17)) идентифицируют в экзоне 20 Р13К у единственного пациента.
Таким образом двенадцать различных ЕСРг мутаций, одну Р13К мутацию и одну В-КаГ мутацию идентифицируют в образцах опухолей, взятых у больных Ы8СЬС, тогда как в образцах опухолей, взятых у больных СКС, идентифицируют три Р13К мутации и ни одной ЕСРг мутации.
Пример 2. Расширенный мутационный анализ немелкоклеточного рака легкого
Проводят расширенное исследование мутаций в образцах опухоли, взятых у других тридцати девяти больных Ы8СЬС. Для двойного слепого эксперимента по сравнению одного химиотерапевтического лечения (карбоплатин/паклитаксел) с лечением с помощью химиотерапии в комбинации с панитумумабом, человеческим антителом против ЕСРг (Атдеи), перед тем, как лечить пациента с помощью химиотерапии и/или панитумумаба, получают образцы опухоли тридцати девяти пациентов, зарегистрированных в испытании Ы8СЬС первой линии. Используя способы выделения ДНК, амплификации, субклонирования и анализа, идентичные способам, представленным в примере 1, ЕСРг экзоны 18, 19, 20, 21 и 23 и экзоны Ό-КаГ 11 и 15 анализируют на присутствие мутаций. Тридцать девять образцов подробно описа- 38 013617 ны в табл. 3, а результаты анализов этих образцов представлены на фиг. 3.
Таблица 3. Образцы, взятые у больных №8СЬС для расширенного исследования
Номер гистологии Номер пациента Клинические испытания Номер пациента
04Н-424 6АО 5-2 17096 4119
04Н-425 6Ζ-2 17099 4228
04Н-426 РАР-2 17102 4233
04Н-427 3Ρϋ-2 17105 4239
04Н-428 АМВ 5-2 17108 4167
04Н-429 Е1_Н 5-2 17111 4273
04Н-430 Ηϋϋ 5-2 17114 4144
04Н-431 СМУУ 5-2 17117 4213
04Н-432 Л. 5-2 17120 4165
04Н-433 НС 3-2 17123 4170
04Н-434 ΠΖ 8-2 17128 4219
04Н-435 ОК 5-2 17129 4265
04Н-436 КТ 5-2 17132 4248
04Н-437 ММЕ 8-2 17135 4240
04Н-438 6ОК 8-2 17138 ' 4179
04Н-439 ЬС 5-2 17141 4256 1
04Н-440 ОЬР 3-2 17144 4275
04Н-441 МНР 5-2 17147 4206
04Н-442 6ЕР 5-2 17150 4222
04Н-443 НВА 5-2 17153 4223
04Н-444 ΌΤ 5-2 17156 4231
04Н-447 Οϋ 5-2 17165 4207
04Н-449 ΌννΒ 5-2 17171 4164
04Н-450 ϋΙ-Η 5-2 17174 4211
04Н-454 ΝΡ6 5-2 17186 4136
04Н-456 ΝΕΝ 5-2 17192 4151
04Н-461 ΐννΡ 3-2 17207 4218
04Η-479 ΜΑΤ 3-2 17231 4229
04Η-482 ΟΡΗ 3-2 17240 4221
- 39 013617
04Н-484 6Р 5-2 17246 4156
04Н-493 65 8-2 17273 4208
04Н-497 6МР 5-2 17285 4189
04Н-503 ЗАЗ 3-2 17303 4254
04Н-504 6ϋΩ 3-2 17306 4152
04Н-507 НУУК 3-2 17315 4157
04Н-510 С8!_ 3-2 17324 4180
04Н-513 ΑΙ.Ε 3-2 17333 4205
04Н-515 У1Т 5-2 17339 4149
04Н-522 УАВ 3-2 17360 4257
Результаты анализа не идентифицируют ни одной мутации в экзонах 20 или 23 в ЕСРг. Единичную мутацию идентифицируют в экзоне 18 ЕСРг (Ь688Р (ЗЕО ΙΌ N0: 41, которая кодирует полипептид с ЗЕО ГО N0: 2)) в образцах, взятых у четырёх разных пациентов. Единичную делецию 15 и.о. (ЗЕО ГО N0: 42, которая кодирует полипептид с ЗЕО ΙΌ N0: 4) в экзоне 19 ЕСРг идентифицируют в образце единственного пациента. Две мутации идентифицируют в экзоне 21 ЕСРг (Ь858В (ЗЕО ГО: 61, которая кодирует полипептид с ЗЕО ΙΌ N0: 11) и Ь828§Гор (ЗЕО ΙΌ: 56, которая кодирует полипептид с ЗЕО ΙΌ N0: 9), каждая у двух различных пациентов. Никаких мутаций не идентифицируют в экзоне 11. Одну мутацию, К601Е (ЗЕО ΙΌ N0: 57, которая кодирует полипептид с ЗЕО ΙΌ N0: 20), в образце единственного больного идентифицируют в экзоне 15 В-ВаГ. Из идентифицированных мутаций две были определены ранее в примере 1 (Ь688Р в экзоне 18 ЕСРг и делеция 15 п.о. в экзоне 19 ЕСРг), а три идентифицируют впервые (Ь858В и Ь828§Гор 21 ЕСРг и К601Е в экзоне 15 В-ВаГ). В общей сложности девять подтверждённых мутаций в ЕСРг гене идентифицируют в девяти образцах №СЬС, взятых у пациентов, и одну подтверждённую мутацию в гене В-ВаГ идентифицируют в девяти образцах №СЬС.
Пример 3.
Обычно ЕСРг претерпевает событие фосфорилирования как предшествующее интернализации при связывании с лигандом, таким как ЕСР или ТСР-α. Соответственно, некоторые ЕСРг мутантные полипептиды, идентифицированные в примере 2, изучают с целью определения ингибирование ЕСРиндуцированного ЕСРг фосфорилирования ίη уйго.
Создают клеточные линии яичника китайского хомячка, сверхэкспрессирующие дикого типа (ЗЕО ГО N0: 1) или мутантный ЕСРг полипептид. Клетки каждой клеточной линии засевают в планшеты и перед стимуляцией ЕСР обрабатывают 0-2 мкМ либо пантимумаба, либо гефитиниба ([гсхха™, 4[хиназолинамин, №(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолин)пропокси], низкомолекулярный ингибитор киназ). Κ.’50 для ЕСР-индуцированного аутофосфорилирования рассчитывают для образцов, обработанных гефитинибом панитумумабом (табл. 4). Вате (необработанные) данные электрофореза для дикого типа ЕСРг и Т790М мутантных ЕСРг полипептидов показаны на фиг. 4.
Таблица 4. Κ.'50 для аутофосфорилирования ЕСРг после обработки гефитинибом или панитумумабом
ЕСРг мутация Премедикация гефитинибом 1С50 (нМ) Премедикация панитумумабом 1С50 (нМ)
отсутствует (дикого типа) 14.6 0.23
делеция 15 п.о. в экзоне 19 1.4 0.17
1858В. в экзоне 21 3.2 0.18
Т790М в экзоне 20 >2000 0.23
Как показано в табл. 4, как гефитиниб, так и панитумумаб эффективно предупреждают аутофосфорилирование ЕСРг при низкой концентрации дикого типа ЕСРг и делецию 15 п.о. и Ь858В ЕСРг мутантов. Однако аутофосфорилирование Т790М мутантного ЕСРг полипептида не ингибируется гефитинибом ДС50 > 2000 нМ), но эффективно ингибируется панитумумабом ДС50 0,23 нМ). Таким образом, премедикация панитумумабом более эффективна для больных НЗСЕС с мутацией Т790М в экзоне 20 ЕСРг, чем гефитинибом.
Пример 4. Корреляция мутационного анализа с эффективностью панитумумаба
После мутационного анализа в примере 2 результаты исследования выводят из слепого метода и сообщают пациентам, у которых наблюдаются мутации (табл. 5). Клинические данные оцениваются исследователем каждые шесть недель по Критериям оценки регрессии солидных опухолей (ВЕОЗТ),
- 40 013617 которые дают нормативы для идентификации улучшения, неизменного состояния при заболевании или прогрессирующего заболевания на основании размера опухоли (см. Ткетаййе е! а1., ЕеЬгиагу 2000, №\ν Сшйе1шей 1о Еνа1иаΐе (ке Яейропйе 1о ТгеаПпеп! ίη Бо11П Титоге, к №111. Сапсег Ιη5ΐ. 92(3): 205- 216).
Таблица 5. Образцы, взятые у больных №СЬС
Идентифицированная мутация Пол Анамнез курильщика Лечение % ЕСГг с уровнем окрашивания 3 или выше Реакция
Деления 15 п.о. экзон 19 муж. никогда химиотерапия 60 неизменное состояние болезни
Ь688Р экзон 18 жен. ранее химиотерапия 50 неизменное состояние болезни
Б688Р экзон 18 муж. ранее химиотерапия 80 частичный ответ
Ь688Р экзон 18 муж. ранее химиотерапия 10 неизменное состояние болезни
Т790М экзон 20 муж. ранее химиотерапия +панитумумаб 10 неизменное состояние болезни
Ь858К экзон 21 - муж. ранее химиотерапия +панитумумаб 90 неизменное состояние болезни
Ц701Н экзон 18 жен. никогда химиотерапия +п ан иту мумаб 20 прогрессиирующее заболевание
Делеция 15 п.о. экзон 19 жен. никогда химиотерапия Ьпаннту мумаб 40 частичный ответ
Результаты показывают, что панитумумаб в комбинации с химиотерапией дают неизменяемое состояние болезни в течение по меньшей мере 12 недель у пациентов с Т790М мутацией в ЕСЕг экзоне 20 и Ь858Я мутацией в ЕСЕг экзоне 21. При применении комбинированной терапии у больных с делецией 15 п.о. в ЕСЕг экзоне 19 наблюдают частичный ответ. Напротив, в случае лишь одной химиотерапии у больных с той же самой делецией 15 п.о. в ЕСЕг экзоне 19 наблюдают только неизменное состояние болезни.
В последних исследованиях идентифицированы несколько ЕСЕг мутаций в опухолях больных ^СЬС, которые проявляют чувствительность к ингибиторам ЕСЕг тирозинкиназы гефитинибу ([геййа'™. Ай1та2епеса) и эрлотинибу (Тагсета™ (Сепеп1еск), №(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4хиназолинамин). Ьупск е! а1. (2004, Асктакпд МШакопй ш 1Не Ер1йегта1 Сго\\111 Еас1от Яесер1от Ипйейутд ЯейропйАепейй оГ №п-Бта11-С.’е11 Ьцпд Сапсег (о СеЙтшЬ, №\ν Епд1апй I Мей. 350(21): 2129-30) нашли, что следующие ЕСЕг мутации ассоциированы с чувствительностью опухолей больных №СЬС на лечение гефитинибом: делеции в области аминокислот 746-753, Ь858Я, Ь861р и С719С. Ρаеζ е! а1. (2004, ЕСЕЯ Маакопй 1п Ьцпд Сапсег: Согге1акоп \νί(1ι С11шса1 Яейропйе (о СеГ1Пп1Ь Ткетару, Баепсе 304: 1497-1500) получили данные, аналогичные данным, полученным Ьупск е! а1., идентифицирующим ЕСЕг мутации Ь858Я, С719Б и различные делеционные мутации между аминокислотами 746 и 759, как восприимчивые к лечению гефитинибом. Ρаο е! а1., 2004 (ЕСЕ гесер!ог депе шШакопй аге соттоп ш 1ипд сапсегй Ггот пе\гег йтокеге апй аге аййоаа1ей νίίΠ йепййЯйу оГ (итоге (о деГ1Пп1Ь апй ейойшЬ, Ριτκ. №И1. Асай. Бск ИБЛ 101(36): 13306-13311) нашли, что аналогичные ЕСЕг мутации (делеция Е746-А750, деления Я747-Б752, Ь858Я и Я776С/Я858Я) ассоциируются с чувствительностью опухолей №СЬС к лечению гефитинибом или эрлотинибом.
Аналогично другим исследованиям в исследованиях, обсуждавшихся в примерах 1 и 2, также идентифицирован мутант с делецией 15 пар оснований в экзоне 19 и Ь858Я в экзоне 21 в качестве ЕСЕг мутаций, ассоциированных с ^СЬС опухолями. Из данных, ставших доступными пациентам после выведения из слепого метода, опухоли, содержащие любую из этих двух мутаций или Т790М, ингибируются панитумумабом в сочетании с химиотерапией. Однако мутацию Т790М ранее не идентифицировали в экспериментах с гефитинибом/эрлотинибом. Ш νίΙΐΌ исследования показывают, что в то время как аутофосфорилирование Т790М ЕСЕг мутантов эффективно ингибируется при низких концентрациях панитумумаба, гефитиниб не является эффективным ингибитором этого мутантного ЕСЕг. Таким образом, комбинированная терапия с применением панитумумаба, а не гефитиниба, может являться эффективным лечением в случае Т790М ЕСЕг мутантов.
Другие варианты изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения описания и практического применения изобретения по данному описанию. Предполагается,
- 41 013617 что описание и примеры рассматриваются только в качестве иллюстрации, при этом действительный объём и сущность изобретения указаны в формуле изобретения.
Приложение А. Страницы 1 и 2
Идентификация и доклиническая характеристика соматических мутаций в ЕСЕг гене на основании Фазы 2 Ν8ΟΕΟ клинического испытания панитумумаба: обнаружение новой мутации, чувствительной к панитумумабу и резистентной к гефитинибу Егеетап р1*, 1иап Т-*, 8агок1 Ι1, Сга\\Тогб I2, 8апб1ег А3, 8сйШег I4, Ρ^аде^ Ό5, 1ойпкоп Ό3, 1епай 81, Вабткку В1 (*Эти авторы внесли равный вклад в данное изобретение) 1Атдеп Шс:, Тйоикапб Оакк, СА; 2Иике итуегкйу Меб1са1 Сеп!ег, Иигйат, ΝΟ;3 УапбегЬПЫпдгат Сапсег Сеп!ег, №кйуй1е, Т№; итуегкйу оГ УЦсопЦп, Маб1коп, ^Ι; ИСЬА Меб1са1 Сеп!ег, Ьок Апде1ек, СА
Предпосылки.
Понимание различных механизмов взаимодействия между ингибиторами ЕСЕг и моноклональными антителами может привести к проникновению в путь метаболизма ЕСЕг, и способ лечения, вероятно, приведёт к клиническому улучшению. Панитумумаб, полностью человеческое моноклональное антитело, специфическое к внеклеточному домену ЕСЕг, в настоящее время изучается в испытании 1й линии ^СЬС, в котором сравнивается химиотерапия (карбоплатин/паклитаксел) с химиотерапией плюс панитумумаб (п=175; первичная концевая точка = время до прогрессирования). У 60 пациентов оценивают мутации ЕСЕг гена. Целью этого исследования является определение, действительно ли панитумумаб имеет отличную от гефитиниба активность против новых ЕСЕг мутаций.
Методы.
Геномную ДНК выделяют из рассечённых срезов ЕЕΡЕ опухоли (премедикация), ПЦР осуществляют на экзонах 18, 19, 20, 21 и 23 гена ЕСЕг, ПЦР продукты собирают, субклонируют и >30 колоний на экзон секвенируют и разрешают на генетическом анализаторе. Последующие ПЦР и секвенирование геномной ДНК подтверждает наличие мутаций. Эти данные сравнивают с данными клинических испытаний (определяемые исследователем с помощью ВЕС.48Т каждые 6 недель). Для определения ингибирования ЕСЕ-индуцированного аутофосфорилирования ЕСЕг ш уйго СНО клетки, сверхэкспрессирующие УТ и мутантный ЕСЕг, обрабатывают, добавляя 0-2 мкМ панитумумаба или гефитиниба перед стимуляцией ЕСЕ.
Результаты.
Из шестидесяти больных Ν8ΟΕΟ у 8 пациентов наблюдаются 5 различных соматических мутаций в гене ЕСЕг.
Приложение А. Страница 2
Паци -ент Пол Анамнез курильщика Лечение %ЕСРг (3+) Мутация Реакция
1 Муж Никогда Химиотерапия 60 Деления 15 п.о. Экзон 19 δϋ
2 Жен Ранее Химиотерапия 50 Толковая мутация. Экзон 18 8ϋ
3 Муж Ранее Химиотерапия 80 Толковая мутация. Экзон 18 РК
4 Муж Ранее Химиотерапия 10 Толковая мутация. Экзон 18 8Р
5 Муж Ранее Химиотерапия + панитумамаб 10 Толковая мутация. Экзон 20 8ϋ
6 Муж Ранее Химиотерапия + панитумамаб 90 Толковая мутация. Экзон 21 8ϋ
7 Жен Никогда Химиотерапия + панитумамаб 20 Толковая мутация. Экзон 18 Ρϋ
8 Жен Никогда Химиотерапия + панитумамаб 40 Делеция 15 п.о. Экзон 19 Рг
*ΡВ= частичный ответ (эффект), 8Ό= неизменное состояние болезни, ΡΌ= прогрессирующее заболевание
Величина Κ.'50 для ЕСЕ-индуцированного аутофосфорилирования ЕСЕг дикого типа, с делецией в экзоне 19, с точковой мутацией в экзоне 21 и с новой мутацией в экзоне 20, равна 14,6, 1,4, 3,2 и >2000 нМ для клеток после премедикации гефитинибом и 0,23, 0,17, 0,18 и 0,23 нМ для клеток после премедикации панитумумабом.
Заключение.
У восьми пациентов наблюдались соматические мутации в ЕСЕг гене. В СНО клетках, сверхэкспрессирующих ЕСЕг, панитумумаб ингибировал ЕСЕг-индуцированное аутофосфорилирование ЕСЕг вне зависимости от мутационного статуса. Новая мутация в экзоне 20 ЕСЕг ассоциируется с ш уйго чувствительностью к панитумумабу, резистентностью к гефитинибу и клиническим улучшением у больного, у которого наблюдается стабильное (неизменное) состояние болезни в течение 2 циклов (12 недель) в ответ на лечение панитумумабом + химиотерапия.
- 42 013617
Приложение В. Страница 1 и 2
Анализ мутаций в гене ЕСЕг у больных №СЬС, пролеченных панитумумабом плюс паклитаксел и карбоплатин или подвергавшихся только химиотерапии
Егеетаи Ό1*, Шаи Т1*, 8агок1 Ι1, С.’га\\Тогб Σ2, 8аиб1ег А3, 8сЫ11ег Σ4, Ρπι^γ Ό5, Ьокикои Ό3, Мокк 81, Вабшкку В1 (*Эти авторы внесли равный вклад в данное изобретение).
'Атдеи Шс., Ткоикаиб 0акк, СА; 2Иике ищуегкйу Меб1са1 СеШег, Откат, N0; 3 УаибегЬШ- Ш^гат Саисег сеи!ег, №кку111е, ΊΝ; 4ишуегкйу оГ ^ксоикш, Маб1кои, ^Ι; 5 ИСЬА Меб1са1 СеШег, Ьок Аиде1ек, СА.
Предпосылки: Панитумумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, специфическое к рецептору эпидермального фактора роста (ЕСЕг). Данные последних исследований подтверждают, что соматические мутации гена в домене ЕСЕг киназы ассоциированы с чувствительностью к низкомолекулярным ингибиторам тирозинкиназы (ΊΚΙκ) в субпопуляции пациентов (р1к) с немелкоклеточным раком лёгких ^8СЬС). Для определения связи (если таковая существует) между мутациями в гене ЕСЕг и реакцией больного (ρΐ) на лечение панитумумабом секвенируют ген ЕСЕг в опухолях 60 пациентов (ρΐκ) с №СЬС, включённых в фазу 2 рандомизированного исследования, в котором сравнивается эффективность и безопасность паклитаксела и карбоплатина (химиотерапия) с панитумумабом плюс химиотерапия. У соответствующих критериям отбора пациентов (ρΐκ) была стадия ШЬ/Ιν заболевания и, по данным иммуногистохимии, опухоли с экспрессией ЕСЕг 1+, 2+ или 3+ в >10% опухолевых клеток. Канцерогенный эффект оценивается исследователями каждые 6 недель по критериям ВЕС.Ч8Т. В этом исследовании участвует полный набор (и=175), и лечение продолжается.
Методы.
Опухолевую ткань (премедикация) отделяют от прилегающей нормальной ткани, некротического дебриса и стромы, разрезая фиксированные в формалине заключённые в парафин срезы ткани под световым микроскопом. Выделяют геномную ДНК и проводят ПЦР на экзонах 18, 19, 20, 21 и 23 гена ЕСЕг. Продукты ПЦР объединяют, субклонируют и анализируют минимум 30 колоний на экзон у пациента. Последующие ПЦР и секвенирование очищенной геномной ДНК подтверждает наличие мутации. Мутационный анализ ЕСЕг проводят химическим методом с флуоресцентным красителем-терминатором транскрипции и анализируют на генетическом анализаторе.
Результаты.
Секвенирование ДНК 60 №СЬС пациентов выявило соматические мутации в ЕСЕг гене всего у 8 пациентов, 4 пациента в группе, подвергавшейся химиотерапии, и 4 пациента в группе, получавшей химиотерапию плюс панитумумаб.
Пациент Лечение %ЕСгРг (3+) Мутация Реакция*
1 Химиотерапия 60 Делеция 15 п о. Экзон 19 5ϋ
2 Химиотерапия 50 Толковая мутация. Экзон 18 8ϋ
3 Химиотерапия 80 Толковая мутация. Экзон 18 РЕ.
4 Химиотерапия 10 Толковая мутация. Экзон 18 δϋ
5 Химиотерапия + панитумумаб 10 Толковая мутация. Экзон 20
6 Химиотерапия + панитумумаб 90 Толковая мутация. Экзон 21
7 Химиотерапия + панитумумаб 20 Толковая мутация. Экзон 18 Ρϋ
8 Химиотерапия + панитумумаб 40 Делеция 15 п.о. Экзон 19 ΡΚ
*ΡΕ= частичный ответ (эффект), 8Ό= неизменное состояние болезни, ΡΌ= прогрессирующее заболевание
Заключение.
У шестидесяти пациентов с №СЬС проверяют наличие соматических мутаций в ЕСЕг гене. У восьми пациентов обнаружены соматические мутации в ЕСЕг гене. У 3 пациентов наблюдался частичный ответ (частичный эффект) или неизменное состояние болезни при лечении панитумумабом плюс химиотерапия, у 1 пациента не наблюдается ответа на панитумумаб плюс химиотерапия. У четырёх пациентов наблюдался неполный ответ или неизменное состояние болезни при одной химиотерапии. Результат, полученный для 60 пациентов будет представлен.

Claims (46)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ΙΌ N0: 6, 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8Е0 ΙΌ N0: 8, 8Е0 ΙΌ N0: 9, ШТ) ΙΌ N0: 10, ШТ) ΙΌ N0: 12 и ШТ) ΙΌ N0: 13.
2. Выделенный полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последователь
3. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ ΝΘ: 2, 8Е0 ΙΌ ΝΘ: 3, 8Е0 Ю ΝΘ: 5, 8Е0 ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13.
4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из ЖО ΙΌ ΝΘ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13.
5. Вектор, содержащий по меньшей мере один выделенный полинуклеотид по любому из пп.3 или 4.
6. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.5.
7. Клетка, трансформированная выделенным полинуклеотидом по любому из пп.3 или 4.
8. Способ получения полипептида, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.6 в условиях, эффективных для продуцирования полипептида.
9. Способ по п.8, дополнительно содержащий выделение полипептида.
10. Способ получения полипептида, заключающийся в культивировании клетки по п.7 в условиях, эффективных для продуцирования полипептида.
11. Способ по п.10, дополнительно содержащий выделение полипептида.
12. Полипептид, полученный способом по п.8.
13. Полипептид, полученный способом по п.10.
14. Слитый белок, содержащий выделенный полипептид по любому из пп.1 или 2, слитый с гетерологичным полипептидом.
15. Специфический связывающий агент, который способен связываться с выделенным полипептидом по любому из пп.1 или 2.
16. Специфический связывающий агент по п.15, выбранный по меньшей мере из одной молекулы, выбранной из антитела, антитела, в котором тяжёлая цепь и лёгкая цепь связаны линкером, одно-Еу антитела, иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина, ЕаЬ антитела, ЕаЬ' антитела, Е(аЬ')2 антитела, моноклонального антитела, поликлонального антитела, антиидиотипического антитела, полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела, СОВ-привитого антитела и антитела, которое ингибирует связывание ЕОЕ с выделенным полипептидом, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 15, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 16, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 17, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 19 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 20.
17. Способ получения антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 11, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13, включающий введение животному по меньшей мере одного полипептида, содержащего по меньшей мере одну последовательность, выбранную из ЖО ΙΌ ΝΘ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 11, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13; и получение антитела, способного связывать по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 2, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 8, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 11, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13, от животного.
18. Трансгенное животное, содержащее полинуклеотид по любому из пп.3 или 4.
19. Полинуклеотид по любому из пп.3 или 4, связанный с твёрдой подложкой.
20. Полипептид по любому из пп.1 или 2, связанный с твёрдой подложкой.
21. Биочип, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид по любому из пп.3 или 4.
22. Биочип, содержащий по меньшей мере один полипептид по любому из пп.1 или 2.
23. Нуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕОЕг полипептида, отличающийся тем, что область содержит по меньшей мере одну ЕОЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828к!ор, 0849В, Е910Ь и У948А, или (нуклеотидный зонд) гибридизуется с комплементом этого полинуклеотида.
24. Способ диагностики заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕОЕг мутаций в субъекте, включающий:
(а) определение наличия или степени экспрессии полипептида по любому из пп.1 и 2 в образце, взятом у субъекта; и (б) диагностику заболевания или состояния, которое связано с одной или более ЕОЕг мутаций, на основании определения наличия или степени экспрессии полипептида.
25. Способ диагностики восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или более ЕОЕг мутаций в субъекте, включающий:
(а) определение наличия или степени экспрессии полипептида по любому из пп.1 и 2 в образце; и (б) диагностику восприимчивости к заболеванию или состоянию, которое связано с одной или бо
26. Способ определения присутствия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный полипептид в образце, включающий:
(а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕОЕг полипептида, отличающуюся тем, что эта область содержит по меньшей мере одну ЕОЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849К Е910Ь и У948А; и (б) определение присутствия или отсутствия полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕОЕг полипептид в образце.
27. Способ определения присутствия или отсутствия мутантного ЕОЕг полипептида в образце, включающий:
(а) экспозицию образца с зондом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕОЕг полипептида, отличающуюся тем, что эта область содержит по меньшей мере одну ЕОЕг мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849К Е910Ь и У948А; и (б) определение присутствия или отсутствия мутантного ЕОЕг полипептида в образце.
28. Способ диагностики рака, связанного с ЕОЕг, у субъекта, заключающийся в определении наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта, причём присутствие, по меньшей мере, мутантного ЕОЕг полипептида диагностирует ЕОЕг-связанный рак у субъекта.
29. Способ диагностики рака, связанного с ЕОЕг, у субъекта, заключающийся в определении наличия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта, причём присутствие по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полинуклеотида диагностирует у субъекта рак, связанный с ЕОЕг.
30. Способ определения вероятности развития рака, связанного с ЕОЕг, у субъекта, включающий определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, О701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта, отличающийся тем, что присутствие, по меньшей мере, мутантного ЕОЕг полипептида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с ЕОЕг.
31. Способ определения вероятности развития рака, связанного с ЕОЕг, у субъекта, включающий определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, в образце для анализа, взятом у субъекта, причём присутствие по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полинуклеотида является показателем вероятности развития у субъекта рака, связанного с ЕОЕг.
32. Способ по любому из пп.28-31, отличающийся тем, что рак, связанный с ЕОЕг, является немелкоклеточным раком лёгкого.
33. Способ скрининга на модулятор активности по меньшей мере одного мутантного ЕОЕг полипептида, содержащего по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, включающий:
(а) контактирование клетки по любому из пп.14 или 15 с тестируемым соединением; и (б) определение, действительно ли тестируемое соединение модулирует активность мутантного ЕОЕг полипептида.
34. Соединение, идентифицируемое способом по п.33.
35. Способ лечения заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, выбранной из Ь688Р, 0701Н, Κ745Ν, С781К, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Ь828б!ор, О849Е, Е910Ь и У948А, заключающийся во введении соединения по п.34 субъекту, нуждающемуся в лечении от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией.
36. Способ лечения субъекта от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией, включающий:
(а) детектирование по меньшей мере одной ЕОЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, причём обнаружение по меньшей мере одной ЕОЕг мутации показывает, что пациент обладает повышенной чувствительностью к развитию заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕОЕг мутацией; и
37. Способ лечения субъекта от заболевания или состояния, связанного по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией, включающий:
(а) детектирование по меньшей мере одной ЕСЕг мутации в полинуклеотиде субъекта, причём обнаружение по меньшей мере одной ЕСЕг мутации показывает, что у пациента имеется заболевание или состояние, связанное по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией; и (б) введение субъекту антитела, которое специфически связывает мутантный ЕСЕг полипептид.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что антитело является человеческим антителом.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что антитело представляет собой панитумумаб или его антигенсвязывающую область.
40. Способ по п.36, отличающийся тем, что по меньшей мере одну из ЕСЕг мутаций выбирают из Ε688Ρ, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Б828йор, 0849В, Е910Б и У948А.
41. Способ по п.36, отличающийся тем, что заболевание или состояние, связанное по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией, является немелкоклеточным раком лёгкого.
42. Способ лечения заболевания или состояния, которое связано по меньшей мере с одной ЕСЕг мутацией, заключающийся во введении полинуклеотида, антисмыслового по отношению к полинуклеотиду по любому из пп.3 или 4, субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
43. Способ установления профиля мутантной популяции ЕСЕг в специфической популяции индивидуумов, включающий:
(а) определение присутствия по меньшей мере одной ЕСЕг мутации в генетическом профиле индивидуумов в популяции; и (б) установление соотношения между генетическим профилем мутантного ЕСЕг и специфическими характеристиками индивидуумов.
- 43 013617 ности, выбранной из ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 2, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 3, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 5, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 6, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 7, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 8, ЖЕ) ΙΌ ΝΘ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 12 и 8ЕО ΙΌ ΝΘ: 13.
44. Способ по п.43, отличающийся тем, что специфические характеристики индивидуумов включают восприимчивость к развитию заболевания или состояния, связанного с ЕСЕг мутацией.
- 44 013617 лее ЕОЕг мутаций, на основании определения наличия или степени экспрессии полипептида.
45. Способ по п.43, отличающийся тем, что специфические характеристики индивидуумов включают проявление заболевания или состояния, связанного с ЕСЕг мутацией.
46. Способ прогнозирования эффективности действия гефитиниба на заболевание или состояние у субъекта, включающий определение присутствия или отсутствия ЕСЕг мутации Т790М в мутантном ЕСЕг полипептиде субъекта, отличающийся тем, что присутствие ЕСЕг мутации Т790М в одном или более мутантных ЕСЕг полипептидов указывает на резистентность к лечению гефитинибом.
47. Способ определения восприимчивости к лечению с помощью антитела против ЕСЕг у субъекта, страдающего раковым заболеванием, включающий определение присутствия или отсутствия ЕСЕг мутации Т790М у субъекта.
48. Способ по п.47, отличающийся тем, что антитело представляет собой панитумумаб или цетуксимаб.
49. Набор для обнаружения полинуклеотида, кодирующего мутантный ЕСЕг полипептид у субъекта, содержащий зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим область мутантного ЕСЕг полипептида, причём эта область содержит по меньшей мере одну ЕСЕг мутацию, выбранную из Ε688Ρ, 0701Н, Κ745Ν, С781В, инсерции гистидина между аминокислотами 771 и 772, Т790М, Б828йор, 0849В, Е910Б и У948А.
50. Набор по п.49, дополнительно содержащий два или более амплификационных праймера.
51. Набор по п.49, дополнительно содержащий компонент для детекции.
52. Набор по п.49, дополнительно содержащий компонент для выборки нуклеотидов.
- 45 013617 (б) введение субъекту антитела, которое специфически связывает мутантный ЕСЕг полипептид.
- 46 013617 больных Х8СЬС.
Результаты мутационного анализа образцов опухоли, взятых у
Р1КЗ Е09 Р1КЗ Е20 Ь-га1Е1 = тво ТВО ΤΒϋ тво ΤΒϋ тво ТОО ΤΒϋ тво тво ΤΒϋ тво ΤΒϋ ΤΒϋ тво ΤΒϋ тво тво
16914
17163
17261
17262
АТВ
17366
17369
17372
17891
17897
EA200701804A 2005-02-24 2006-02-23 Мутации рецептора эпидермального фактора роста EA013617B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US65626305P 2005-02-24 2005-02-24
PCT/US2006/006751 WO2006091899A2 (en) 2005-02-24 2006-02-23 Epidermal growth factor receptor mutations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701804A1 EA200701804A1 (ru) 2008-06-30
EA013617B1 true EA013617B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=36579263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701804A EA013617B1 (ru) 2005-02-24 2006-02-23 Мутации рецептора эпидермального фактора роста

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7981605B2 (ru)
EP (1) EP1851243A2 (ru)
JP (2) JP2008535477A (ru)
KR (1) KR20070106029A (ru)
CN (1) CN101208354A (ru)
AU (2) AU2006216477A1 (ru)
BR (1) BRPI0607235A2 (ru)
CA (1) CA2601936C (ru)
CR (1) CR9390A (ru)
EA (1) EA013617B1 (ru)
IL (1) IL185210A0 (ru)
MX (1) MX2007009963A (ru)
NO (1) NO20074826L (ru)
WO (1) WO2006091899A2 (ru)
ZA (1) ZA200707379B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2706116C1 (ru) * 2018-12-26 2019-11-14 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) Способ прогнозирования течения аденокарциномы легкого
RU2796334C2 (ru) * 2017-06-07 2023-05-22 Пресиджен, Инк. Экспрессия новых клеточных меток

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102886045A (zh) * 2005-02-03 2013-01-23 综合医院公司 治疗吉非替尼耐药性癌症的方法
US8067175B2 (en) 2005-02-11 2011-11-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for detecting a drug resistant EGFR mutant
EP2126127B1 (en) * 2007-01-25 2016-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
WO2008104183A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
US9340601B2 (en) 2007-03-01 2016-05-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Splice variants of the EGF receptor
WO2008112274A2 (en) * 2007-03-13 2008-09-18 Amgen Inc. K-ras and b-raf mutations and anti-egfr antibody therapy
GB2453173A (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Dxs Ltd Polynucleotide primers
US8022216B2 (en) 2007-10-17 2011-09-20 Wyeth Llc Maleate salts of (E)-N-{4-[3-chloro-4-(2-pyridinylmethoxy)anilino]-3-cyano-7-ethoxy-6-quinolinyl}-4-(dimethylamino)-2-butenamide and crystalline forms thereof
CL2009000843A1 (es) * 2008-04-11 2009-07-24 Galaxy Biotech Llc Metodo para tratar cancer en un paciente que comprende la administracion de un primer agente que es inhibidor de factor de crecimiento de hepatocito (hgf) en combinacion con un segundo agente que es inhibidor de una ruta de senalizacion celular diferente de la ruta hgf/cmet.
PL2310011T3 (pl) 2008-06-17 2013-12-31 Wyeth Llc Kombinacje przeciwnowotworowe zawierające HKI-272 i vinorelbine
US8784623B2 (en) * 2008-07-17 2014-07-22 Koninklijke Philips N.V. Nanopore device and a method for nucleic acid analysis
MX2011001927A (es) 2008-08-29 2011-04-21 Symphogen As Composiciones de anticuerpo recombinante anti-receptor de factor de crecimiento epidermico.
CN101445832B (zh) * 2008-12-23 2011-09-14 广州益善生物技术有限公司 Pik3ca基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
PT3301446T (pt) * 2009-02-11 2020-07-14 Caris Mpi Inc Perfilagem molecular de tumores
EP2475789A4 (en) * 2009-09-09 2013-12-18 Quintiles Transnat Corp METHODS FOR PREDICTING SENSITIVITY OF DISEASE OR DISORDER TO RECEPTOR TYROSINE KINASE INHIBITOR THROUGH MUTATION ANALYSIS IN PIK3CA GENE
JP5891172B2 (ja) * 2010-07-07 2016-03-22 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 正常乳腺上皮細胞からの腫瘍細胞の製造方法
US20120164641A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene
AU2012239997A1 (en) 2011-04-07 2013-10-17 Amgen Inc. Novel EGFR binding proteins
WO2012154908A2 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Brunangelo Falini Hairy cell leukemia biomarkers and methods of using same
EP2554551A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-06 Fundacio Institut mar d'Investigacions Médiques (IMIM) Mutations in the epidermal growth factor receptor gene
US20140005119A1 (en) * 2012-06-28 2014-01-02 Case Western Reserve University COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE ACTIVITY OF P110a MUTANT PROTEINS
JP6574136B2 (ja) * 2013-01-14 2019-09-18 ナショナル タイワン ユニバーシティ Ｅｇｆｒの発現をサイレンシングするためのｄｎａザイム
CN103739713B (zh) * 2013-12-10 2016-03-09 吴炯 一种新型诱导肺瘤细胞凋亡的融合蛋白及其应用
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
GB2521355A (en) * 2013-12-17 2015-06-24 Kymab Ltd Human targets I
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
WO2015092393A2 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Kymab Limited Human targets
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
CN105779480B (zh) * 2016-03-24 2020-03-20 成都康景生物科技有限公司 一种携带多位点突变型egfr新抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法和应用
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US9980967B1 (en) 2017-03-16 2018-05-29 National Chiao Tung University Method for overcoming drug resistance of EGFR mutation and cancerous stemness of human non-small cell lung carcinoma
CN108047308A (zh) * 2018-02-02 2018-05-18 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108047309A (zh) * 2018-02-07 2018-05-18 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108250268A (zh) * 2018-02-08 2018-07-06 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108409832A (zh) * 2018-03-07 2018-08-17 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108218959A (zh) * 2018-03-07 2018-06-29 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108218960A (zh) * 2018-03-07 2018-06-29 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108218961A (zh) * 2018-03-19 2018-06-29 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108440649A (zh) * 2018-05-31 2018-08-24 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108752424A (zh) * 2018-06-04 2018-11-06 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108440650A (zh) * 2018-06-04 2018-08-24 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108440651A (zh) * 2018-06-08 2018-08-24 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种***的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN109485721A (zh) * 2018-11-23 2019-03-19 杜学明 一种获得肿瘤特异性t细胞受体的方法
WO2020145715A1 (ko) * 2019-01-11 2020-07-16 주식회사 진캐스트 Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
KR102286025B1 (ko) * 2019-01-11 2021-08-05 주식회사 진캐스트 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소를 이용한 질량분석법
KR102370550B1 (ko) * 2019-01-11 2022-03-08 주식회사 진캐스트 Egfr 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
CN113840842A (zh) 2019-02-26 2021-12-24 詹森生物科技公司 利用双特异性抗EGFR/c-Met抗体的联合疗法和患者分层
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
CN113993544A (zh) * 2019-07-24 2022-01-28 神州细胞工程有限公司 用于治疗egfr高表达的癌症的多变剂量方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991003489A1 (en) * 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
WO2001068711A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-20 Thomas Jefferson University Sensitive detection of wild-type and mutant egfr by specific elisa assays in any biological sample

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
CA2497597A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-11 Sequenom, Inc. Methods for identifying subjects at risk of melanoma and treatments
ES2741546T3 (es) * 2004-03-31 2020-02-11 Massachusetts Gen Hospital Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico
ES2564127T5 (es) * 2004-06-04 2020-03-26 Genentech Inc Mutaciones en EGFR
MX2007000723A (es) * 2004-07-22 2007-03-12 Genentch Inc Composicion de anticuerpos her2.
US7442507B2 (en) * 2005-01-24 2008-10-28 New York University School Of Medicine Methods for detecting circulating mutant BRAF DNA
JP5154406B2 (ja) * 2005-04-13 2013-02-27 アステックス、セラピューティックス、リミテッド 医薬化合物
US20090202989A1 (en) 2005-06-28 2009-08-13 Hillan Kenneth J Egfr and kras mutations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991003489A1 (en) * 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
WO2001068711A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-20 Thomas Jefferson University Sensitive detection of wild-type and mutant egfr by specific elisa assays in any biological sample

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAZDAR A. F. ET AL.: "Mutations and addiction to EGFR: the Achilles 'heal' of lung cancers?", TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, ELSEVIER CURRENT TRENDS, vol. 10, no. 10, October 2004 (2004-10), pages 481-486, XP004586557, ISSN: 1471-4914, the whole document *
HUANG S-F ET AL.: "High frequency of epidermal growth factor receptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan", CLINICAL CANCER RESEARCH, THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 10, no. 24, 15 December 2004 (2004-12-15), pages 8195-8203, XP002369911, ISSN: 1078-0432, the whole document *
MARCHETTI A. ET AL.: "EGFR mutations in non-small-cell lung cancer: analysis of a large series of cases and development of a rapid and sensitive method for diagnostic screening with potential implications on pharmacologic treatment", JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, GRUNE AND STRATTON, NEW YORK, NY, US, vol. 23, no. 4, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 857-865, XP002369910, ISSN: 0732-183X, the whole document *
PAO W. ET AL.: "EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from never smokers and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 101, no. 36, 7 September 2004 (2004-09-07), pages 13306-13311, XP002334314, ISSN: 0027-8424, the whole document *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2796334C2 (ru) * 2017-06-07 2023-05-22 Пресиджен, Инк. Экспрессия новых клеточных меток
RU2796334C9 (ru) * 2017-06-07 2023-08-24 Пресиджен, Инк. Экспрессия новых клеточных меток
RU2706116C1 (ru) * 2018-12-26 2019-11-14 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) Способ прогнозирования течения аденокарциномы легкого

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006091899A2 (en) 2006-08-31
CA2601936C (en) 2014-06-17
BRPI0607235A2 (pt) 2009-08-25
CA2601936A1 (en) 2006-08-31
CR9390A (es) 2008-01-02
ZA200707379B (en) 2008-10-29
MX2007009963A (es) 2007-09-26
WO2006091899A3 (en) 2007-02-22
US7981605B2 (en) 2011-07-19
KR20070106029A (ko) 2007-10-31
CN101208354A (zh) 2008-06-25
US20070048754A1 (en) 2007-03-01
IL185210A0 (en) 2008-01-06
AU2010241462A1 (en) 2010-12-16
JP2012149070A (ja) 2012-08-09
JP2008535477A (ja) 2008-09-04
NO20074826L (no) 2007-11-23
US8546107B2 (en) 2013-10-01
EA200701804A1 (ru) 2008-06-30
AU2006216477A1 (en) 2006-08-31
US20120328620A1 (en) 2012-12-27
EP1851243A2 (en) 2007-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013617B1 (ru) Мутации рецептора эпидермального фактора роста
JP5905422B2 (ja) Ｋ‐ｒａｓ変異およびＢ‐ｒａｆ変異ならびに抗ＥＧＦｒ抗体療法
JP5937017B2 (ja) Ａｌｋ阻害剤に対する自然耐性または獲得耐性を有する癌の同定、評価および治療法
JP2010521153A (ja) Ｋ‐ｒａｓ変異および抗ＥＧＦｒ抗体療法
CN107109494A (zh) Il‑33介导型疾病的治疗方法和诊断方法
EP3149207A2 (en) Activating jak kinase biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response
PT1994410E (pt) Métodos e estojos para detecção precoce de cancro ou de predisposição a este
CN104805203A (zh) Vegf多态性和抗血管发生疗法
JP2017501137A (ja) Ｗｎｔ経路インヒビターに関連する予測バイオマーカーの同定
EP4103752A2 (en) Methods and compositions for identifying castration resistant neuroendocrine prostate cancer
KR20090111307A (ko) 전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도
CA2807104C (en) Bard1 isoforms in lung and colorectal cancer and use thereof
KR20150085459A (ko) 대장암 마커로서의 신규 ntrk1 융합유전자 및 이의 용도
JP2004533206A (ja) 化学療法のための標的としてのガン関連遺伝子
US6544742B1 (en) Detection of genes regulated by EGF in breast cancer
WO2001012664A2 (en) Notch receptor ligands and uses thereof
CN114058700A (zh) Rbm10基因的用途
JP2009535033A (ja) Ｃｒｉｐｔｏ−３の検出のための組成物および方法
KR102015527B1 (ko) 데스모글레인 3의 유전적 변이 및 이의 용도
US20040138161A1 (en) Methods of modulating proliferative conditions
AU2013201896A1 (en) Epidermal growth factor receptor mutations
AU2014206164A1 (en) K-ras mutations and anti-EGFr antibody therapy field

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU