EA010179B1

EA010179B1 - Биохимический синтез 1,4-бутандиамина

Info

Publication number: EA010179B1
Application number: EA200700329A
Authority: EA
Inventors: Катрин Эппельман; Петрус Мартинус Матеус Носсин; Леон Жан Реньер Мари Равен; Сусанна Мария Кремер; Марсель Герхардус Вубболтс
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2005-07-11
Publication date: 2008-06-30
Also published as: UA90479C2; MY152156A; US20090011478A1; CA2571528C; AU2005261861B2; WO2006005603A1; BRPI0513343A; AU2005261861A1; IN2007DE00479A; BRPI0513343B1; EA200700329A1; EP2949755A1; CN101010433A; CN101010433B; ES2581244T3; MX2007000566A; TW200605869A; ZA200700104B; CA2571528A1; DK1784496T3

Abstract

Изобретение относится к способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности ортининдекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазы, где у микроорганизма представлена также увеличенная активность образования N-ацетилглутамата по сравнению с исходным уровнем активности образования N-ацетилглутамата в микроорганизме, где производимый в микроорганизме 1,4-бутандиамин секретируется в среду ферментации и выделяется из среды ферментации. Изобретение также относится к векторам, плазмидам и хозяевам, несущим соответствующую увеличенную активность орнитиндекарбоксилазы и увеличенную активность образования N-ацетилглутамата.

Description

Настоящее изобретение относится к новому способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина (номер СЛ8 110-60-1; соединение обозначается также как тетраметилендиамин; в биохимической литературе чаще называется путресцином) в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной ативности по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности. Орнитиндекарбоксилазу ниже мы будем обозначать как «ОЭС». «Повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности» ниже будем обозначать как «повышенный уровень активности ОЭС». Известно, что, в основном, микроорганизмы, имеющие активность ОЭС. способны производить полиамины, такие как спермидин и спермин (общепринятые названия для продуктов Ы-(-3-аминопропил)-1,4-бутандиамин и

H, Н'-бис-(3-аминопропил)-1,4-бутандиамин, соответственно). Такие соединения, так же, как и сами различные короткие линейные диамины, такие, например, как 1,4-бутандиамин и 1,5-пентандиамин (называемый также кадаверином), в биохимических исследованиях часто называют полиаминами, хотя, исходя из точного химического определения полиаминов, следовало бы ожидать большего числа аминогрупп. Однако для целей настоящей патентной заявки будет применяться термин «полиамины» в его биохимическом значении, и таким образом, он включает 1,4-бутандиамин.

Уровень техники

Соединение 1,4-бутандиамин является важным исходным материалом для производства некоторых основных инженерных пластмасс: полиамида-4,6 эфира либо в форме гомополимера, или сополимеризованного, например, с 5% (по весу) полиамид-6 мономером (капролактам). Гомополимер полиамид-4,6 (нейлон-4,6) был описан еще в 1938 году (ϋδ-Α-2, 130948, СагоШегк). Он представляет собой продукт поликонденсации мономеров 1,4-бутандиамина и адипиновой кислоты. В настоящее время соединения полиамида-4,6 производятся и продаются, главным образом, в Нидерландах под торговым названием δΤΑΝΎΕ®.

Для синтеза 1,4-бутандиамина известен ряд химических путей. Все эти химические пути имеют недостаток, заключающийся в том, что стартовые материалы должны быть получены из источников, которые рассматриваются как невозобновляемые. Однако существует реальная потребность в обеспечении новыми и подходящими способами синтеза 1,4-бутандиамина из возобновляемых источников углерода и в применении биохимических способов (также называемых «биотрансформацией») в живых клетках. В основном, полиамины рассматриваются как токсические соединения для любой клетки или микроорганизма, которые применяются в биохимическом производстве. Таким образом, до настоящего времени считали, что такие новые пути биохимического синтеза являются непривлекательными.

Это, например, можно видеть из следующих ссылок: РикисЫ е! а1., Г ΒίοΙ. Сйет., т. 270 (1995), стр. 18831-18835; и 8и/ик1 е! а1., Ргос. Ναίΐ. δα. υδΑ, т. 91 (1994), стр. 8930-8934.

Фукуши и соавт. четко описали снижение жизнеспособности клеток (и синтеза почти всех видов белков), обусловленное аккумуляцией спермидина в дефицитных по спермидинацетилтрансферазе клетках Е. сой (то есть в клетках, где нет ацетилтрансферазы 8реО). Необходимо отметить, что Лимсувум и соавт. (Ышкиуиш е! а1., Г Вас1епо1. т. 182 (2000) стр. 5373-5380) показали, что при низких температурах таких проблем можно избежать за счет суперэкспрессии гена 5реС. Спермидин является продуктом, который в клетках производится из 1,4-бутандиамина, используемого в качестве интермедиата. Соответственно, биосинтез 1,4-бутандиамина неминуемо приводит к образованию спермидина.

Сузуки и соавт., с одной стороны, также продемонстрировали (на клетках мышей), что суперпродукция ОЭС приводит к аккумуляции полиаминов, особенно спермидина, и что при добавлении малых количеств спермидина уже наблюдается смерть клеток, даже в клетках, которые не дефицитны по 5реС. Сузуки и соавт. (цитировано выше) предположили, что эта пониженная жизнеспособность клеток обусловлена недостаточным ингибированием ОЭС антиферментами по механизму обратной связи и это можно преодолеть путем сверхпродукции подходящего антифермента. Такая суперпродукция антиферментов будет затем снижать продукцию полиаминов в клетках и, таким образом, не является реально возможным для продукции 1,4-бутандиамина.

Кроме того, как описали Кашиваги и соавт. (Ка^йтгащ е! а1., 1. Вас!егю1. т. 170 (1988) стр. 31313135), содержание полиаминов в Е. сой может быть изменено за счет суперэкспрессии гена, кодирующего ОЭС, в частности конститутивно экспрессируемого креС. Для этих экспериментов при клонировании была применена плазмида рОЭС, произведенная Бойлем и соавт. (Воу1е е! а1., Ме!йобк ίη Еп/утокду, т. 94 (1983), стр. 117-121). Ясно, что суперпродукция ОЭС не привела к сильному увеличению уровня 1,4бутандиамина в клетках. При 70-кратном увеличении уровня ОЭС наблюдалось не более чем 20% увеличение содержания 1,4-бутандиамина в клетках, независимо от количества орнитина, добавленного к клеткам. Однако, с другой стороны, было показано, что клетки, растущие в присутствии орнитина, демонстрируют повышенную секрецию 1,4-бутандиамина. При 70-кратном избытке в уровне ОЭС в итоге было обнаружено примерно в 8,5 раз более высокая продукция 1,4-бутандиамина (титр производимого

I, 4-бутандиаминабыл приблизительно 20-25 мг/л в сумме для внутри- и внеклеточных концентраций, то есть экстремально низкая концентрация). Авторы предположили, что такая крайне низкая эффективность продукции 1,4-бутандиамина может быть обусловлена уменьшением концентрации орнитина, и попытались решить эту проблему путем подкармливания клеток орнитином снаружи, но добились лишь мини

- 1 010179 мального улучшения. Соответственно, могло бы показаться, что невозможно обеспечить способы биохимического синтеза для производства 1,4-бутандиамина до значительно более высоких уровней, чем 30 мг/мл.

Более того, эти исследования, упомянутые выше, не были направлены на синтез полиаминов (включая 1,4-бутандиамин) как таковой, а пытались обеспечить большее понимание физиологических функций полиаминов на молекулярном уровне. При более высоком уровне орнитина в клетках вероятно также, что больше аргинина будет представлено в клетках. В соответствии с мнением Кашиваги такие более высокие количества аргинина должны оказывать значительный негативный эффект на образование

1.4- бутандиамина.

До сих пор ЕР-А-0726240 является одним из немногих патентов, относящихся к биохимическому синтезу полиаминов, включая 1,4-бутандиамин. Однако он описывает, между прочим, продукцию 1,4-бутандиамина путем ферментации природных продуктов, включающих белки в качестве основного компонента. В названном способе природные продукты сначала обрабатывали, подвергая их частичной или полной деградации, а затем любые нежелательные соединения (например, Нд, Сг, А§, Сй, 8е и РЬ), ингибиторы роста клеток, пестициды, антибиотики, детергенты, мыла, жиры, масла, цианиды и фенолы удаляли до стадии ферментации. Путресцин и другие диамины, произведенные таким путем, повторно применяются как удобрения, но включают такое большое количество других веществ, что они могут быть нежелательными в качестве исходного материала для продукции, например, полиамида-4,6.

Соответственно, сохраняется потребность в эффективном альтернативном биосинтетическом пути для синтеза 1,4-бутандиамина со значительно более высокими титрами, чем примерно 30 мг/л, предпочтительно даже без потребности во внешнем подкармливании (дорогим) ортинином. Эта потребность в улучшении доступности 1,4-бутандиамина основана, главным образом, на намерении применять его в качестве стартового материала, например для производства полиамида-4,6. В основном, пути получения

1.4- бутандиамина, известные на сегодняшний день, достаточно трудоемки и хлопотливы и могут приводить к получению количества названного продукта, которое без дополнительной очистки трудно будет применять в производстве нейлонов. Известные химические способы получения 1,4-бутандиамина требуют относительно дорогих исходных материалов и реактантов (включая реактанты, с которыми трудно обращаться) и относительно жестких условий реакции (температура и давление) с многостадийным и многореакторным дизайном, а также применения дорогих систем катализа. Соответственно, сохраняется потребность в альтернативных способах получения 1,4-бутандиамина, предпочтительно из менее дорогих исходных материалов, и устранения проблем обращения с реактантами, подобными цианисто-водородной кислоте. Хорошо известно, что природные выращиваемые и, таким образом, возобновляемые материалы из сельскохозяйственной продукции являются основой для источников углерода, таких как глюкоза (или других подходящих источников углерода и их смесей), которые могут быть применены в ферментации. Такие возобновляемые материалы являются относительно дешевыми и доступными в больших количествах. В основном, рассматривается как очень выгодное, если возобновляемые материалы могут быть применены в качестве исходного материала для получения всех видов химических материалов.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных возможностей для крупномасштабного промышленного производства 1,4-бутандиамина путем биотрансформации.

Раскрытие изобретения

Неожиданно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что эта цель достигается с применением нового способа биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень ОИС активности по сравнению с нативным уровнем ОИС активности, где в микроорганизме представлена также увеличенная активность образования Ν-ацетилглутамата по сравнению с исходным уровнем активности образования Ν-ацетилглутамата в микроорганизме, и что производимый

1.4- бутандиамин секретируется в среду ферментации и его извлекают из среды ферментации.

Как предназначено в настоящей патентной заявке, термин «биохимический синтез» (термин, который в контексте этой патентной заявки альтернативно рассматривается как «биотрансформация») включает не только способы, в которые вовлечены (кроме ряда чисто химических реакционных стадий) одна или более биокаталитическая реакция с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также чисто биохимические процессы, применяющие целые клетки подходящих для продукции штаммов. Такие чисто биохимические способы рассматриваются, соответственно, как относящиеся к ферментациям в случае, если биохимический синтез начинается с подходящего источника углерода, или рассматриваются как ферментации предшественника в случае, если биохимический синтез начинается от промежуточного продукта, уже имеющего углеродный скелет, из которого может быть получена молекула-мишень, которая должна быть синтезирована. Эти способы могут осуществляться либо в аэробных, либо в анаэробных условиях.

Биокаталитические реакции в биохимических синтезах настоящего изобретения могут быть проведены либо ίη νίνο, либо ίη νίΐτο. В основном, способы ίη νίνο являются способами, осуществляемыми в том случае, когда применяются живые клетки (термин «живые клетки» включает здесь также так называемые покоящиеся клетки); способы ίη νίΐτο, с другой стороны, обычно проводятся с применением лизатов клеток или (частично) очищенных ферментов. В соответствии с настоящим изобретением биохимический синтез проводится в микроорганизме. Это может быть сделано с применением целых клеток, под

- 2 010179 ходящих для продукции штаммов, но также может осуществляться с применением пермеабилизованных клеток; дифференциация между ίη νίνο и ίη νίίτο не имеет, однако, большого смысла для способов, проводимых с пермеабилизованными клетками или с иммобилизованными клетками-хозяевами. Однако будет очевидно, что индивидуальные биокаталитические стадии способа изобретения, когда они проводятся, например, с применением иммобилизованных ферментов, и т.п. рассматриваются как эквиваленты таких стадий в биохимическом синтезе, как предназначено в контексте настоящей заявки.

Орнитиндекарбоксилазы (то есть ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, или ОЭС) являются ферментами, относящимися к классу КФ 4.1.1.17. При суперпродукции уровень активности орнитиндекарбоксилазы можно легко сравнить с исходным (то есть не сверхпродуцированным) уровнем активности орнитиндекарбоксилазы в стандартных условиях (при 37°С в присутствии орнитина и РЬР) в бесклеточных экстрактах, с применением набора реактивов 81дша Όίαβηοδίίοδ для обнаружения двуокиси углерода, анализ описан у Остермана и соавт. (ОЛепшш А.Ь. с1 а1., 1994, ВюскешШту 33, стр. 13662-12667). Специалист, соответственно, может легко установить, имеет ли применяемая орнитиндекарбоксилаза увеличенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ОЭС) по сравнению с нативным уровнем активности орнитиндекарбоксилазы у применяемого микроорганизма, измеряя содержание белка или определяя уровень РНК. Различные стандартные способы определения содержания белка, например колориметрический, а также спектроскопический, описаны у Лоттцпейха и Зорбаса (Ьойкреюй апб 2огЬа§, ΒίοαηαΙνΙίΚ, 8рексйиш АкабешЦйег Уег1ад ОшЬН, Не1бе1Ьегд/Вегкп, Ι8ΒΝ 3-8274-0041-4 (1998), главы 3, 5, 21, 22 и 24). Способы определения концентрации белка, а также уровня РНК, например Нозерн-гибридизация, обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (ЯТ-РСЯ) и многие другие методы, описаны Самбруком и совт. (1. 8ашЬгоок, Е.Р. Ргйкск аиб Т. ΜπηιηΙΐδ, Мо1еси1аг с1опш§, А ЬаЬогаФгу Машаф 2^и6 Е6йюи, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8, Ι8ΒΝ 0-879-309-6, 1989). Однако специалисту в этой аналитической области известны многие другие стандартные способы, и нет потребности об их упоминании здесь.

Подходящей орнитиндекарбоксилазой, которая может быть применена в способе изобретения, являются все ферменты и мутанты этого, которые способны декарбоксилировать орнитин. Любой такой фермент может быть применен в способе изобретения при повышенном уровне активности, то есть в сверхпродуцированной форме. Такой повышенный уровень активности может быть достигнут любыми способами, известными специалисту, например посредством увеличения числа копий гена, или увеличением эндогенной активности или структуры фермента путем мутаций, или с применением дерегулированных ферментов. Однако наиболее предпочтительно это может быть достигнуто посредством суперэкспрессии гена орнитиндекарбоксилазы с повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Кроме того, необходимо отметить, что термин «повышенный уровень активности», как он применяется здесь для любой специфически названной ферментативной активности, предназначен для включения таких ситуаций, где такая ферментивная активность, например орнитиндекарбоксилаза, вообще не представлена в природном источнике микроорганизма, где реакция имеет место, но вводится туда предположительно путем генетической модификации.

В способе в соответствии с изобретением необходимо представить повышенный уровень активности образования Ν-ацетилглутамата (как дополнительно определяется здесь ниже, когда представлено обсуждение в отношении зависимых пунктов изобретения) по сравнению с исходным уровнем активности образования Ν-ацетилглутамата в микроорганизме. Сравнение увеличенного и исходного уровней образования Ν-ацетилглутамата может быть легко проведено, подобно такому определению активности орнитиндекарбоксилазы, с подходящими реакциями тестирования в стандартных условиях (анализ описан в ЛЬабреуа, А., 2001, 1. Вю1. Сйеш., 276, стр. 42869-42880) в бесклеточных экстрактах с применением радиоизотопного анализа 1-[¹⁴С]глутамата и ацетил-КоА в качестве субстратов.

В соответствии с настоящим изобретением 1,4-бутандиамин производится в микроорганизме с увеличенными активностями орнитиндекарбоксилазы и образования Ν-ацетилглутамата посредством биотрансформации и секретируется в среду ферментации, окружающую микроорганизм. 1,4-Бутандиамин секретируется в и выделяется из среды ферментации.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается улучшенный биохимический способ синтеза 1,4-бутандиамина и полученный 1,4-бутандиамин является прекрасным исходным материалом для производства, например, полиамида-4,6.

Образование 1,4-бутандиамина в больших количествах, как производится в соответствии с изобретением, является наиболее неожиданным из-за факта, что повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (вместе с увеличенной активностью образования Ν-ацетилглутамата) без каких-либо дополнительных мер, предпринятых для устранения негативных эффектов образования полиаминов на жизнеспособность клеток, могло бы привести к ожиданию смерти клеток.

Как упоминалось выше, в способе изобретения может быть применен любой фермент орнитиндекарбоксилазы с увеличенной активностью, например, в суперпродуцированной форме.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все орнитиндекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65%, идентичность с орнитиндекарбоксилазным фермен

- 3 010179 том сравнения из Е. сой и способны катализировать орнитиндекарбоксилазную реакцию. Известны многие орнитиндекарбоксилазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с орнитиндекарбоксилазным ферментом сравнения из Е. сой.

Определение процента идентичности с ферментом сравнения может быть выполнено способами, известными специалисту, например путем применения белковой последовательности фермента сравнения как «фермента запросов» для выполнения поиска в опубликованных базах данных, например идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с применением программ ВЙА8Т (версия 2.2.) и параметров по умолчанию соответствующей программы. См.: 1Шр:/\\л\л\'.псЫ.п1т.шй.доу.

Предпочтительно, если увеличенная активность орнитиндекарбоксилазы достигается за счет суперэкспрессии генов креБ и креС, кодирующих орнитиндекарбоксилазу (каждый фермент принадлежит к КФ 4.1.1.17), происходящих из одного из родов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа, 8й1де11а, 8а1тоие11а, УетщЫа и 8йе\\'апе11а. Орнитиндекарбоксилаза креБ является индуцибельной орнитиндекарбоксилазой, орнитиндекарбоксилаза креС является конститутивной орнитиндекарбоксилазой.

Более предпочтительно, чтобы ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, происходил из одного из видов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а Пехпеп. 8а1топе11а 1урЫтипит, Уегаша рекИк и 8йе\\'апе11а опеЫепкщ. До сих пор в литературе меньше информации об исследовании гена креС, чем креБ. Однако наиболее неожиданно и более предпочтительно, когда наилучшие результаты в соответствии с настоящим изобретением достигаются, если кодирующий орнитиндекарбоксилазу ген является геном креБ, более точно креБ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8а1топе11а (урЫтигшт и 8йе\\'апе11а опеЫепкщ. При сравнении с результатами, полученными с суперэкспрессией конститутивной орнитиндекарбоксилазой, кодируемой геном креС, безусловно, наилучшие результаты в соответствии с изобретением были достигнуты, когда применяли креБ.

В контексте настоящей заявки любой ген, будучи гомологичным любому из генов, кодирующих вышеназванные орнитиндекарбоксилазы, и кодирующий ферменты, имеющие активность орнитиндекарбоксилазы, достаточно сравнимую с показанной орнитиндекарбоксилазой, являются подходящими для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с помощью любой соответствующей стратегии клонирования, известной специалисту, например способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены орнитиндекарбоксилазы могут быть также получены путем целенаправленного конструирования.

Термин «активность образования Ν-ацетилглутамата» отражает, в контексте настоящей патентной заявки, любую ферментативную активность, обусловленную единственным ферментом или комбинацией ферментов, способную приводить к образованию Ν-ацетилглутамата в клетке.

В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены Ν-ацетилглутаматсинтазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45%, даже более предпочтительно по меньшей мере 65% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 75%, идентичность с Ν-ацетилглутаматсинтазой (ферментом сравнения) из Е. сой, которые способны катализировать реакцию образования Ν-ацетилглутамата. Известны многие Ν-ацетилглутаматсинтазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. сой.

Предпочтительно, увеличенная активность образования Ν-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии либо гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), и/или гена агд1, кодирующего ^-ацетил-Е-орнитин:Е-глутамат-Ы-ацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35). Очевидно, что любой ген, кодирующий фермент или мутант этого, имеющий такую же функциональность одного из ферментов, как упомянуто выше, будет рассматриваться как являющийся эквивалентом такого фермента в одном из классов КФ 2.3.1.1 или КФ 2.3.1.35.

В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения увеличенная активность образования Ν-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), происходящего из одного из родов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа, 8Ыде11а, 8а1топе11а, Уетыша, Рйо1отйаЬбик и Висйпега. Эти АгдА ферменты требуют присутствия (или источника) коэнзима А, чтобы быть активными в формировании Ν-ацетилглутамата.

В этом воплощении повышенная активность образования Ν-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу, происходящего из одного из видов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а Пехпегт 8а1топе11а еШепса, УетщЫа рекйк, Рйо1отйаЬбик Ытшексепк и Висйпега арЫбюо1а.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения повышенная активность образования Ν-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессиии гена атд1, кодирующего ^-ацетил-Ьорнитин:Е-глутамат-Ы-ацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35), происходящую из одного из родов, выбранных из группы, включающей ВасШик, Ь1к1епа, ОсеаиойасШик, 81арйу1ососсик, ЬаЫоЬасШик, СогупеЬаЫетшш, МусоЬаЫетшт, ТйеттоЬШба, 81тер1отусек и ВШбоЬас1етшт.

Подходящие ^-ацетил-Е-орнитин:Е-глутамат-Ы-ацетилтранферазы, которые могут быть примене

- 4 010179 ны в способе в соответствии с изобретением, являются М²-ацетил-Ь-орнитин:Ь-глутамат-М-ацетилтранферазами, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 40%, идентичность с Ы²-ацетил-Ь-орнитинЪ-глутамат-Ы-ацетилтранферазой из ВасШик (фермент сравнения) и способны катализировать Ν²ацетил-Ь-орнитин:Ь-глутамат-Ы-ацетилтранферазную реакцию. Известно, что многие Ы²-ацетил-Ь-орнитин:Ь-глутамат-Ы-ацетилтранферазы имеют такой уровень идентичности с соответствующим ферментом сравнения из ВасШик.

В противоположность ферментам АгдА, ферменты Атд1 вообще не требуют присутствия (или наличия источника) кофермента А, будучи активными при образовании N-ацетилглутамата. Соответственно, эти ферменты Атд1 являются явно более предпочтительными, нежели ферменты АгдА, для промышленного применения.

В этом другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения повышенная активность образования Ν-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена атд1, кодирующего Ы²-ацетилЬ-орнитин:Ь-глутамат-Ы-ацетилтранферазу, происходящего из одного из видов, выбранного из группы, включающей ВасШик сегеик, Ык1епа топосуЮдспск. ОсеаиоЬасШик Шеуепык, 81арйу1ососсик ерШеттЦ, Ьас1оЬасШик р1ап1атит, Ьас1оЬасШик 1асйк, СогупеЬас1епит д1и1аткит, МусоЬас1егшт 1ергае, ТйегтоЬШба [икса, 81тер1отусек соейсот и ВШбоЬас1егшт 1опдит.

В контексте настоящей заявки любой ген, будучи гомологичным любой вышеупомянутой активности образования Ν-ацетилглутамата и кодирующий ферменты, имеющие активность образования Ν-ацетилглутамата, достаточно сравнимую с показанной активностью образования Ν-ацетилглутамата, является подходящим для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с применением любой стратегии клонирования, известной специалисту, например способами, описанными здесь в экспериментально части. Альтернативно такие эквивалентные гены образования Νацетилглутамата могут быть получены путем целенаправленного конструирования.

В дополнительном предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина проводится в микроорганизме, где дополнительно посредством суперэкспрессии получена также увеличенная ферментативная активность для по меньшей мере двух других ферментов, либо:

(ί) аргининдекарбоксилазы, кодируемой геном креА (КФ 4.1.1.19), и агматиназы, кодируемой геном креВ (КФ 3.5.3.11; обозначается также как ген, кодирующий агматинуреагидролазу); или (й) аргининдекарбоксилазы, кодируемой геном креА (КФ 4.1.1.19), и агматиниминогидролазы, кодируемой геном адиА (КФ 3.5.3.12; обозначается также как ген, кодирующий агматиндеиминазу), и Νкарбамоилпутресцинамидогидролазы, кодируемой геном адиВ (КФ 3.5.1.53), и при необходимости также агматиназы, кодируемой геном креВ (КФ 3.5.3.11).

Преимуществом этого дополнительного предпочтительного воплощения является то, что 1,4-диаминобутан образуется даже в больших количествах.

Суперэкспрессия, как предназначено для использования здесь, может быть достигнута любым способом, известным специалисту; например путем увеличения транскрипционной и/или трансляционной эффективности соответствующего гена, но также любыми другими известными способами, такими как увеличение количества копий гена, или путем увеличения эндогенной активности или структуры ферментов за счет мутаций, или путем применения дерегулированных ферментов. Как предназначено в части (ί) дополнительного предпочтительного воплощения, упомянутая здесь выше комбинация 8реА и 8реВ предназначена для представления любой функциональной комбинации (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) 8реА и 8реВ. Фактически эта комбинация может быть также обозначена как 8реАВ. Часть (й) этого отражает, что в таких комбинациях 8реА и 8реВ сама 8реВ часть может быть заменена любой функциональной комбинацией (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) АдиА и АдиВ.

Яновиц и соавт. Папо\\йх е1 а1., ТЕВ8 Ьейетк 544 (2003), 258-261) описали, что агматиндеиминаза АдиА вовлечена в аргининдекарбоксилазный путь у высших растений. Кроме того, известно (№1кайа е1 а1., М1стоЬю1оду, 149 (2003), 707-714), что превращения, катализируемые 8реВ, могут также катализироваться ферментами, имеющимися у растений, а именно комбинированным действием агматиндеиминазы АдиА и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы АдиВ. Соответственно, вместо этого, или даже в комбинации со 8реВ, в контексте настоящего изобретения могут быть применены также АдиА и АдиВ. Источниками таких адиА и адиВ генов могут быть АтаЬШорщк Шайаиа и йусорегкюоп ексШепШт, но сравнимые гены могут быть обнаружены у мутантов Ркеийотопак аетодшока.

В контексте настоящей заявки любой ген, гомологичный любым вышеупомянутым аргининдекарбоксилазам, соответственно, агматиназам или агматиниминогидролазам или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазам, и кодирующий соответствующие ферменты, имеющие аргининдекарбоксилазную (соответственно, агматиназную, или агматиниминогидролазную, или Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазную) активность, достаточно сравнимую с соответствующими ферментами (в зависимости от обстоятельств), является подходящим в этом дополнительном предпочтительном воплощении способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть получены соответствующим способом посредством любой

- 5 010179 подходящей стратегии клонирования, известной специалисту, например способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены могут быть также получены путем целенаправленного конструирования.

Соответственно, в этом предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения применяются также дополнительные комбинации суперэкспрессированных генов, кодирующих: (ί) аргинидекарбоксилазу и агматиназу или (ίί) аргининдекарбоксилазу, и агматиниминогидролазу, и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, и при необходимости агматиназу.

В этом предпочтительном воплощении способа в соответствии с настоящим изобретением могут быть, в частности, применены все аргининдекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65%, идентичность с аргинидекарбоксилазой из Е. со11 (фермент сравнения) и способны катализировать аргинидекарбоксилазную реакцию. Известно, что многие аргниндекарбоксидазы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. сой.

Более того, в названном воплощении, в частности, могут быть применены все агматиназы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 60%, идентичность с агматиназой из Е. сой (фермент сравнения) и способны катализировать агматиназную реакцию. Известно, что многие агматиназы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. сой.

Дополнительно, в названном воплощении способа, в частности, могут быть применены все агматиниминогидролазы и/или Ν-карбамоилпутерсцинамидогидролазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 40%, идентичность с агматиниминогидролазой и/или с Ν-карбамоилпутерсцинамидогидролазой из Ркеиботопак (ферменты сравнения) и способны катализировать агматиниминогидролазную, соответственно, Ν-карбамоилпутерсцинамидогидролазную реакцию. Многие агматиниминогидролазы и Ν-карбамоилпутерсцинамидогидролазы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментами сравнения из Ркеиботопак.

Суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу в вышеуказанном предпочтительном воплощении изобретения, является предпочтительно геном аргининдекарбоксилазы креА, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа, 8й1де11а, 8а1шопе11а, Уегыша, Рак1еиге11а и №1ккепа. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является геном аргинидекарбоксилазы креА, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8й1де11а Пехпегг 8а1шопе11а еШепса. Уегышарекйк, Рак1еиге11а шийошба и №ккепа тешпдШШк.

Более того, в этом предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиназу, предпочтительно является геном агматиназы креВ, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа, 8а1шопе11а, Рго!еик, РйоШгйаЬбик, УШгю и №1ккепа. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназы креВ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а еЫепса, Рго!еик штйШк, РйоЫгйаЬбик ЫЫпексепк, У1йгю сйо1егае и №ккепа теЫпдШШк.

Кроме того, в этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий Νкарбамоилпутресцинамидогидролазу, является предпочтительно геном агматининиминогидролазы адиА и/или геном Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы адиВ, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, включающей Ркеиботопак, 8йер1ососсик, 8йер1отусек, А/о1оЬас1:ег, АгаЫборкй, №уокрЫпдоЬЫт и ВасШик. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную агматинимидогидролазу и/или суперэкспрессированную Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном агматинимидогидролазы адиА и/или геном Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы адиВ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей Ркеиботопак аегидшока, 81гер1ососсик ти1апк, 81гер1отусек ауегтйШк, Ахо1оЬас1ег уше1апби, АгаЫборкЫ Шайапа, ХоуокрЫпдоЬЫт аготайсгуогапк и ВасШик сегеик.

Способ изобретения может проводиться в любом подходящем организме-хозяине. Хозяева могут быть выбраны из группы продуцирующих организмов (или клеток), в основном, известных специалисту в биосинтезе. Такие организмы могут быть эукариотической природы, или, что более предпочтительно, прокариотического происхождения. Эукариотические клетки, например, могут быть клетками растений или грибов и из различных других групп, коллективно называемых «Протисты».

В частности, предпочтительно, чтобы способ в соответствии с изобретением проводился в организме-хозяине, выбранном из группы, включающей 8ассйаготусек кр., ВасШик кр., СогупеЬаЫегшт кр., ЕксйепсЫа кр. и Р1сй1а кр.

В способе изобретения особенно предпочтительно, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, был способен производить аминокислоты орнитин и/или аргинин. Для большей части природных микроорганизмов это требование удовлетворяется, поскольку обычно такая способность является ценной во всех штаммах дикого типа, так как аргинин является эссенциальной аминокислотой.

- 6 010179

Из этих видов ЕхсйспсЫа 8р. является предпочтительным, поскольку с ним легко обращаться при генетических манипуляциях, для того чтобы обеспечить штаммы с желаемыми суперэкспрессированными ферментативными активностями. Более того, Е8с11епс1йа 8р. уже в природе включает все вышеупомянутые ферментативные активности (то есть, кроме генов ади из растений), так что большая часть суперэкспрессированных генов может быть применена как гомологичные гены. Также СогупеЬас1ег1ит 8р. (хотя у него отсутствует природная орнитиндекарбоксилаза) является особенно предпочтительным, поскольку он является подходящим штаммом, производящим глутамат, с которым можно легко обращаться в ферментационных способах.

В способе настоящего изобретения глутамат является очень подходящим предшественником. Соответственно, способ предпочтительно осуществляется в штамме хозяина, способном образовывать глутамат (например, СогупеЬас1епит д1и1ат1сит).

Наилучшие результаты достигаются, когда способ в соответствии с изобретением осуществляется в организме-хозяине из группы, включающей 8ассйаготусе8 сегеуШае, СогуиеЬас1егшт 8р. и Е8с11епс1йа 8р., где в микроорганизме-хозяине кроме увеличенного уровня активности орнитиндекарбоксилазы и образования Ν-ацетилглутамата, по меньшей мере, увеличивается также уровень активности ферментов аргинидекарбоксилазы в сочетании с ферментами агматиназой и/или агматиниминогидролазой и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы. Как обозначено здесь, для каждого из упомянутых выше ферментов повышенный уровень активности сравнивается с исходным уровнем активности соответствующей названной ферментативной активности в микроорганизме-хозяине.

Будет ясно, что способ изобретения предпочтительно осуществляется в реакционных условиях, которые так же обычны, как условия ферментации. Способ может быть осуществлен как групповой, но также (если желательно) может быть осуществлен способ с подпитыванием культуры. Можно для удобства обеспечить, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, имел или обеспечивался подходящей системой для экспорта образованного 1,4-диаминобутана, предпочтительно, чтобы такой системой для экспорта была нативная система.

Настоящее изобретение, конечно, в заключение включает также все векторы, плазмиды и хозяеваносители, несущие повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности (повышенная активность ОЭС) по сравнению с исходным уровнем активности орнитиндекарбоксилазы, и повышенную активность образования Ν-ацетилгутамата по сравнению с исходным уровнем образования Ν-ацетилглутамата. В частности, для предпочтительных воплощений настоящее изобретение относится также ко всем векторам, плазмидам и хозяевам, дополнительно несущим высокий уровень одного или более других вышеупомянутых ферментативных активностей в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Осуществление изобретения

Изобретение будет теперь разъяснено посредством некоторых экспериментальных результатов, которые приводятся без намерения ограничить рамки изобретения.

Экспериментальная часть Основные процедуры

Были применены стандартные процедуры манипуляции с ДНК (8атЬгооск, 1. е1 а1. (1989), Мо1еси1аг с1оптд: а 1аЬога1огу тапиа1, 2'¹ Ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, Со1й 8рппд НагЬог, №\\-Уогк). ДНК была амплифицирована из хромосомной ДНК Е. сой Ы110 (2еррепГе1й. е1 а1. (2000), 1. Вас1егю1. 182, 4443-4452), Васй1и8 8иЬйЙ8 АТСС10783 или СогупеЬас1егй.1т дкНапйсит АТСС 13032, если не указано другое. ПЦР-амплификация была выполнена с применением ферментов с редактирующей активностью 8ΑΑ/ΑΌΥ Рго-ЭХА-Ро1утега8е (Рес.|1аЬ Вю1есйпо1од1е СтЬН, Ег1апдеп, Германия) или Р1а1йшт РГх ΌΝΑ Ро1утега8е (1пуйгодеп, Кагкгцйе, Германия) в соответствии с протоколами производителей, в то время как верификация сконструированных штаммов была проведена путем ПЦР колоний с применением Тас.| полимеразы ΒΕΑΌΥΜΙΧ (81дта, ТаиГкйсйеп, Германия). Рестрикционные сайты для последующего клонирования, а также дополнительные мутации были введены с олигонуклеотидами, купленными у фирмы МАС-Вю1ес11 (ЕЬег8Ьегд, Германия). Фрагменты ДНК были очищены с применением набора МшЕ1и1е Се1 Е.хйасОоп (О|адеп, Нййеп, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Приготовление плазмидной ДНК выполняли с применением набора ОIАргер 8рш Мййргер (О|адеп, Нййеп, Германия). Верификация сконструированных плазмид проводилась путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования (Адо^а, Вегйп, Германия).

Для высокого уровня экспрессии генов был применен вектор рГГ119ЕН (Ецг81е, ГР. е1 а1. (1986), Сепе 48, 119-131), подходящий для продукции белка, индуцированной действием изопропил бета-Этиогалактопиранозида (1РТС), основанной на индуцибельном под действием 1РТС 1ас промоторе и 1ас репрессорной системе (1ас1^р).

Конструирование плазмид (ί) Конструирование плазмиды рЭАВ2 (р!Г119ЕН-8реЕ).

Индуцибельный биодеградирующий ген 8реЕ Е. сой Ы110 (2еррепГе1й, е1 а1., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р!Г119ЕН (Ецг81е, ГР. е1 а1. (1986), Сепе 48, 119-131). Этот вектор позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, основанный на транскрипционном контроле клонированных генов 1РТС индуцибельным 1ас

- 7 010179 промотором и 1ас репрессорной системой (1ас1°). Для конструирования экспрессионной плазмиды ρΌΆΒ2 (р1Е11ЕН-креЕ) кодирующий ген креЕ был клонирован с оригинальными сайтом связывания рибосомы (РВ8), стартовым и стоп-кодоном.

Фрагмент ДНК, включающий креЕ из 2247 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. со11 ЬЛ10 (номер доступа АЕ000172, нуклеотиды 10242-12468) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'САС СТС СТС СТА ССТ ААА АТА ЛАС АСА ТСЛ АА3' [8ЕЦ ГО: Νο. 1] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Крп1 - курсивом) и

5'-ТСС АТС ТАС АСТ САС ТСА ТАА ТТТ ТТС ССС-3' [8ЕЦ ГО: Νο. 2] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт 8рЫ - курсивом)

В заключение фрагмент был модифицирован рестрикционными эндонуклеазами Крп1 и ХЬа1 и лигирования в экспрессионный вектор рбЕ 119ЕН, который был разрезан таким же образом. После трансформации в клетки Е. со11 ΌΗ5α (1пуйгодеп, Каг1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с БВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рБАВ3 (р1Е119ЕН креЕ, 7502 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.

(й) Конструирование плазмиды рЭАВ4 (р1Е119ЕН-креС).

Конститутивный биосинтетический ген креС Е. со11 БИ10 (2еррепГе1б. е! а1., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р1Е119ЕН (Еигк1е, 1.Р. е! а1. (1986), Сепе 48, 119-131), см. (1), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под 1РТС индуцибельным !ас промотором и 1ас репрессорной системой (1ас1°). Таким образом, кодирующий ген был клонирован с оригинальным стартовым и стоп-кодоном. Поскольку для гена креС, применяемого в исследованиях ίη кШсо, не было определено консервативного КВ8, на 7 п.о. выше стартового кодона креС с помощью точечного мутагенеза был введен оптимизированный КВ8.

Фрагмент ДНК из 2235 п.о., включающий креС, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой БЛЮ (номер доступа АЕ000379; нуклеотиды 2650-4867) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'-САС СТС ТАС АСС АСТ ТТС АСС ААТ АТС Т-3' [8ЕЦ ГО: №. 3] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и

5'-ТТТ ТСС АТС СТТ АСТ ТСА АСА САТ ААС ССТ АС-3' [8ЕЦ ГО: №. 4] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт 8рЫ - курсивом)

После заключительной модификации эндонуклеазами ХЬа1 и 8рЫ продукт ПЦР был лигирован в плазмиду р1Е119ЕН, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. сой ЛН5а (1пу11годеп, Каг1кгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с БВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рБАВ4 (р1Е119ЕН креС, 7491 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.

(ΐϊϊ) Конструирование плазмиды рБАВ1 (р1Е119ЕН-агдА).

Ген АгдА Е. сой БП10 (2еррепГе1б, е! а1., см основные процедуры), кодирующий Ν-ацетилглутаматсинтазу, был клонирован в экспрессионный вектор р1Е119ЕН (ЕигкГе, ГР. е! а1. (1986), Сепе 48, 119-131), см. (ΐ)). Ген был клонирован с оригинальными КВ8 и стоп-кодоном. Однако старт трансляции был изменен с СТС на АТС.

Фрагмент ДНК из 1365 п.о., кодирующий агдА, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой БП10 (номер доступа АЕ000365; нуклеотиды 3312-4643) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'-АТА АСА АТТ САА АСА ССТ СТС ССА ТСС ТАА АС-3' [8ЕЦ ГО: №. 5] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ЕсоШ - курсивом) и

5'-ТТТ ТСС ТАС СТТ АСС СТА ААТ ССС ССА Т-3' [8ЕЦ ГО: №. 6] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Крп1 - курсивом)

В заключение фрагмент был модифицирован рекстрикционными эндонуклеазами ЕсоИ1 и Крп1 и потом лигирован в экспрессионную плазмиду р1Е119ЕН, которая была разрезана тем же способом. После трансформации в клетки Е. сой ЛН5а (1пу11годеп, Кайкгийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с БВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды рОАВ1 (рГЕ119ЕН-агдА, 6627 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.

(ίν) Конструирование плазмиды рОАВ5 (р1Е119ЕН-агдА-креЕ).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8реЕ и Ν-ацетилглутаматсинтазы АгдА, кодирующий ген креЕ Е. сой БП10 (2еррепГе1б, е! а1., см. основные процедуры) был клонирован в агдА-экспрессионный вектор рБАВ1 (см. (ίίί)).

Фрагмент ДНК длиной 2225 п.о., включающий креЕ, был вырезан из сконструированной плазмиды

- 8 010179 ρΌΑΒ2 (см. А.1) путем обработки эндонуклеазами Κρηΐ и ХЬа1 и лигирован в плазмиду ρΌΑΒ1, включающую агдА (см. (ίίί)), разрезанную подобным образом. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α (I пх'Игодеп, Кагкгцйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды ρΌΑΒ5 (р!Е119ЕН-агдА-8реЕ, 8841 п.о.) для параллельной продукции 8]эеЕ и АгдА после приготовления проводили путем рестрикционного анализа.

(ν) Конструирование плазмиды ρΌΑΒ6 (ρΕΕΊ19ΕΗ-α^Α-^Ο).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8]эеС и Ν-ацетилглутаматсинтазы Αγ§Α. кодирующий ген 8|эеС Е. сой ЬП10 (Ζеρρеηίе1ά, е1 а1., см. основные процедуры) был клонирован в а^дΑ-экспрессионный вектор ρΌΑΒ1 (см. (ίίί)).

Путем расщепления сконструированной плазмиды ρΌΑΒ4 (см. (й)) эндонуклеазами ХЬа1 и 8ρ1ι1 был отделен фрагмент размером 2225 п.о., включающий ген ^еС с оптимизированным ΒΒ8. Затем фрагмент был лигирован в плазмиду ρΌΑΒ 1 (см. (ί)), включающую αι^Α, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α Дпуйгодеп, Кагкгцйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ΕΒ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. После приготовления верификация полученной плазмиды ρΌΑΒό (ρ!Γ119ΕΗ α^Α-^^ 8830 п.о.), позволяющая обеспечить параллельную экспрессию ^еС и αι^Α, была проведена рестрикционным анализом и последующим секвенированием.

(νί) Конструирование плазмиды ρΌΑΒ7 (ρΙΓ119ΕΗ-^ΑΒ).

Ген 8ρеΑ, кодирующий аргининдекарбоксилазу, а также ген ^Β, кодирующий агматиназу Е. сой ЬП10 (Ζеρρеηίе1ά, е1 а1., см. основные процедуры), были клонированы в экспрессионный вектор ρ!Γ119ΕΗ (Ецг^е, ГР. е1 а1. (1986), см. (ί)). Таким путем была сохранена оригинальная структура оперона генов, а также ΚΒ8, старт- и стоп-кодоны.

Фрагмент ДНК длиной 3079 п.о., включающий ^ΑΒ, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой Ы110 (номер доступа АЕ000377; нуклеотиды 1190-4247) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'-АСА СТТ ТСТ Α6Α ΑΤΑ ΑΤΤ Τ6Α ООТ ТСС СТА ТО-3' [8Еф ΙΌ: Νθ. 7] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и

5'-САТ ОСС ΑΤО СОО ТСС ΠΑ СТС О-3' [8Еф ΙΌ: Νο. 8] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт 8ρ1ι1 - курсивом)

После заключительной модификации рекстрикционными эндонуклеазами ХЬа1 и 8ρΜ ДНК-фрагмент был лигирован в экспрессионную плазмиду ρΙΕ 119ΠΗ, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. сой ΌΗ5;·ι Д^йгодеп, Кагкгцйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ΕΒ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды ρΌΑΒ7 (ρ^Е119ΕΗ-8ρеΑΒ, 8839 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.

(νίί) Конструирование плазмиды ρΌΑΒ8 (ρ^Е119ΕΗ-8ρеЕ-8ρеΑΒ).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8ρеΕ, аргининдекарбоксилазы 8ρеΑ и агматиназы ^Β, гены ^ΑΒ Е. сой Ы110 (ΖеρρеηΓе1ά. е1 а1., см. основные процедуры) был клонирован в ^еЕ-экспресс^нный вектор ρΌΑΒ2 (см. (ί)).

Путем расщепления плазмиды ρΌΑΒ7 (см. (νί)) рестрикционными эндонуклеазами ХЬа1 и 8ρ1ι1 был отделен фрагмент размером 3067 п.о., включающий оперон генов ^ΑΒ, и лигирован в плазмиду ρΌΑΒ26, включающую 8]эеЕ (см. (ί)), которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α Д^йгодеп, Кагкгцйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ΕΒ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды ρΌΑΒ8 (ρ^Е119ΕΗ-8ρеЕΑΒ, 10547 п.о.), позволяющей обеспечить параллельную продукцию 8ρеЕΑΒ, была проведена после приготовления рестрикционным анализом.

(νίίί) Конструирование плазмиды ρΌΑΒ10 (ρ^Е119ΕΗ-а^дΑ-8ρеЕ-8ρеΑΒ).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8ρеЕ, аргининдекарбоксилазы 8ρеΑ, агматиназы ^Β и Ν-ацетилглутаматсинтазы Αγ§Α, гены ^ΑΒ Е. сой Ы110 (Ζеρρеηίе1ά, е1 а1., см. основные процедуры) были клонированы в а^дΑ-8ρеЕ-экспрессионный вектор ρΌΑΒ5 (см. (ίν)).

Путем расщепления плазмиды ρΌΑΒ7 (см. (νί)) рестрикционными эндонуклеазами ХЬа1 и 8ρ1ι1 был отделен фрагмент размером 3067 п.о., включающий оперон генов ^ΑΒ, и лигирован в плазмиду ρΌΑΒ5, включающую а^дΑ-8ρеЕ (см. (ίν)), которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α Дпуйгодеп, Кагкгцйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ΕΒ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды ρΌΑΒ8 (ρ^Е119ΕΗ-Α^дΑ-8ρеЕΑΒ, 11886 п.о.), позволяющей обеспечить параллельную продукцию Αγ§Α и 8ρеЕΑΒ, была проведена после приготовления рестрикционным анализом.

Дх) Конструирование плазмиды ρΌΑΒ37 (ρ^Е119ΕΗ-а^д^Β8-8ρеЕ).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8ρеЕ и Д²-ацетил-ГорнитинА-глутамат-Н-ацетилтрансферазы Αγ§Ε кодируемой геном из Β;·κί11ιΐ5 щЫйк ΑΤСС 10783, ко

- 9 010179 дирующий ген атд1 В. киЬййк был клонирован в креЕ-экспрессионный вектор ρΌΆΒ5 (см. (ίν)) путем замещения представленного гена агдА. Ген был клонирован с оригинальным ΚΒ8 и стоп-кодоном.

ДНК-фрагмент, содержащий атд1 размером 1279 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК ВасШик киЬййк АТСС 10783 (номер доступа Ζ99109 (В. киЫШк киЬкр. киЫШк к1т.168, полный геном (раздел 6 из 21)); нуклеотиды 184321-185600) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'ТСА ССС САА ТТС АТС САТ АСА АСС ССА САС-3' |8ЕО ΙΌ: Νο. 9] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ЕсоШ - курсивом) и

5'-СТТ САТ ТТС ССТ АСС СТТ ТАТ ТАС СТС ССА ТАС СТС-3' |8ЕО ГО: Νο. 10] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Κρηΐ - курсивом)

Олигонуклеоиды были сконструированы в соответствии с последовательностью атд1, как представлено в геноме В. киЫШк киЬкр. киЫШк κΐτ.168.

Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмида рЭАВ5 были обработаны рестрикционными эндонуклеазами ЕсоШ и Κρηΐ. В случае рЭАВ5 были получены два фрагмента размером 1355 п.о. и 7486 п.о. Фрагмент размером 7486, включающий вектор рШ119ЕН и ген креЕ, был изолирован и лигирован с амплифицированньм фрагментом ДНК. После трансформации в клетки Е. сой ΌΗ5α (Ιηνίίτο^η, Кайктийе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды рЭЛВ8 (р!Е119ЕН-агд1Вк-креС, 8749 п.о.), была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием. Секвенирование выявило, что атд1 ген, клонированный из В. киЫШк АТСС 10783, отличается от описанного ранее атд1 гена из В. киЬййк киЬкр. киЬййк к1т.168. В сравнении с белком Атд1 из В. киЫШк киЬкр. киЫШк κίτ.168 (номер доступа САВ12961) белок Атд1, кодируемый атд1 геном, представленным в плазмиде рОАВ37, демонстрирует следующие изменения: Η72ϋ, Р74А, Т75А, Ь951, Е105Ь, С110О, Η134ϋ, Е142Р, А169Т, К181А, Т2161, А242С, О255Е, Ν353Η, 1363Ь, А380О, О383Е.

(х) Конструирование плазмиды рЭАВ38 (р!Е1 19ЕН-атд1Сд-креЕ).

Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы 8реЕ и ^-ацетил-Ьорнитин:Е-глутаматЧ-ацетилтрансферазы Атд1, кодируемой геном из СотупеЬаЫепит дЫЫткит, кодирующий ген агд1 С. д1Шаш1сит АТСС 13022 был клонирован в креЕ-экспрессионный вектор рЭАВ5 (см. (ίν)) путем замещения представленного гена агдА. Ген был клонирован с оригинальным КВ8 и стопкодоном.

Фрагмент ДНК, включающий атд1 размером 1219 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК С. д1и1ат1сит АТСС 13022 (номер доступа N006958 (С. д1Шат1сит АТСС 13022, полный геном); нуклеотиды 1466650-1467869) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'АСА САТ ССА АТТ САС ТАС САС ТТС САС АТС С-3' |8ЕО ГО: Νο. 11] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ЕсоШ - курсивом) и

5'-АСТ ССТ ССТ АСС ТТТ ТАА САС СТС ТАС СС-3' |8ЕО ГО: № 12] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Крп1 - курсивом)

Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмида рЭАВ5 были обработаны рестрикционными эндонуклеазами ЕсоШ и Крп1. В случае рЭАВ5 были получены два фрагмента размером 1355 п.о. и 7486 п.о. Фрагмент размером 7486 п.о., включающий вектор р1Н119ЕН и ген креЕ, был изолирован и лигирован с амплифицированным фрагментом ДНК. После трансформации в клетки Е. сой ЭН5а (1тйгодеп. Кат1кшйе, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды рЭАВ8 (р1Е119ЕН-атд1Сд-креЕ, 8679 п.о.) была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием.

(χί) Конструирование плазмиды рЭАВ3 (р!Е119ЕН-креС_пЕВЗ).

Конститутивный биосинтетический ген креС Е. сой ЬЛ10 ^еррегйеЫ, е1 а1., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор р!Е119ЕН (Еитк1е,

1.Р., е1 а1. (1986), Сепе 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под 1РТС индуцибельным 1ас промотором и 1ас репрессорной системой (1асГ). Таким образом, кодирующий ген креС был клонирован с оригинальным КВ8, старт- и стоп-кодонами.

ДНК-фрагмент, включающий креС_пЕВЗ, размером 2235 п.о. был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. сой Ы110 (номер доступа АЕ000379; нуклеотиды 2650-4867) с применением следующих олигонуклеотидов:

5'-САС СТС ТАС АСС АСТ ТТС АСС САТ АТС Т-3' |8ЕО ГО: № 13] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт ХЬа1 - курсивом) и

5'-ТТТ ТСС АТС СТТ АСТ ТСА АСА САТ ААС ССТ АС-3' |8ЕО ГО: № 14] (мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт 8рй1 - курсивом)

После заключительной модификации с помощью эндонуклеаз ХЬа1 и 8рй1 продукт ПЦР был лигирован в плазмиду р!Е119ЕН, которая была разрезана таким же образом.

- 10 010179

После трансформации в клетки Е. со11 ΌΗ5α (ΙηνίίΓΟβοη. Каг1кгцйе. Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с ЬВ агаром. включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды рЭАВ8 (р1Г119ЕН-агд1Сд-8реГ. 8679 п.о.) была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием.

Сравнительный эксперимент А.

Продукция 1.4-бутандиамина благодаря исключительно суперэкспрессии креС орнитиндекарбоксилазы с экспрессией гена. индуцированной ΙΡΤΟ (в колбе при покачивании).

Влияние суперэкспрессии кодирующего орнитиндекарбоксилазу гена креС на продукцию 1.4-бутандиамина было исследовано в штамме-хозяине Е. сой Ы110 (2еррепГе1б. е! а1.. см. основные процедуры). несущем плазмиду ρΌΑΒ3 (см. (ίχ)).

Этот штамм был тестирован в экспериментах с покачивающейся колбой с применением минимальной солевой среды. включающей Мд8О₄-7Н₂О (300 мг/л). СаС1₂-2Н₂О (15 мг/л). КН₂РО₄ (3 г/л). К₂НРО₄(12 г/л). ЫаС1 (100 мг/л). (ΝΗ₄)₂8Ο₄ (5 г/л). Να цитрат-3Н₂О (1 г/л). Ге8О₄-7Н₂О (75 мг/л). тиамин-НС1 (витамин Βι) (5 мг/л). а также микроэлементы А1₂(8О₄)₃-18Н₂О (3 мг/л). СоС1₂-6Н₂О (1.05 мг/л). Си8О₄-5Н₂О (3.75 мг/л). Н₃ВО₃ (0.75 мг/л). МпС1₂-4Н₂О (30 мг/л). №₂МоО₄-2Н₂О (4.5 мг/л). №8О₄-6Н₂О (3 мг/л). 2п8О₄-7Н₂О (22.5 мг/л). Основной раствор глюкозы (500 г/л) был автоклавирован отдельно и добавлен к стерилизованной среде до конечной концентрации 10 г/л.

В прекультуральную минимальную солевую среду. включающую 10 мг/л ампицилина. добавляли 15 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33°С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности 2 при 620 нм. 5 мл этой культуры впоследствии применяли для заражения основной культуры. включающей 50 мл той же среды. которую инкубировали в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1.5 при 620 нм (через «7 ч). была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ 1РТС.

Для того чтобы наблюдать продукцию 1.4-бутандиамина во времени. при культивации через различные интервалы времени были отобраны образцы. После отделения клеток центрифугированием разведенный супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения. Включенные амины обнаруживали как производные ортофтальдиальдегида при длине волны света 230 нм на приборе НеМей-Раскатб серии 1100 с применением С1₈-обратнофазовой колонки (ШЛеокП 120-5 С₁₈. Масйегеу&№де1. Эитеп. Германия). уравновешенной 50% буфером В (буфер А. 0.1М ацетат натрия. рН 7.2; буфер В метанол). Для разделения был применен следующий градиент: 1-7 мин линейный градиент буфера В от 50 до 75% со скоростью 0.5 мл/мин. 7-13 мин от 75 до 85% буфера В со скоростью 0.5 мл/мин. 13-14.5 мин от 85 до 50% буфера В со скоростью 1 мл/мин. 14.5-17 мин 50% буфера В со скоростью 15 мл/мин и 17-20 мин 50% буфер В со скоростью 0.5 мл/мин.

С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1.4-бутандиамина (см. табл. 1). которые были верифицированы ЯМР-спектроскопией.

Таблица 1 Образование 1.4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы в Е. сой

Примененный штамм	Экспрессированный ген	Концентрация 1,4бутандиамина (мг/л)
ЬЛЮрПАВЗ	нреС	50

Примеры. Улучшение продукции 1.4-бутандиамина путем увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы в комбинации с увеличенной активностью образования Ν-ацетилглутамата.

Пример 1. Продукция 1.4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы. а также суперпродукции АгдА (в колбе при покачивании).

Влияние параллельной работы Ν-ацетилглутаматсинтазы. катализирующей первую стадию биосинтеза орнитина. начиная с глутамата. и орнитиндекарбоксилазы 8реГ или 8реС на продукцию 1.4-бутандиамина было исследовано на штамме-хозяине Е. сой Ь1110 (2еррепГе1б. е! а1.. см. основные процедуры). несущем плазмиду рЭАВ5 (см. (ίν)) или рЭАВ6 (см. (ν)).

Эти штаммы были тестированы в экспериментах с покачивающейся колбой в минимальной солевой среде (см. сравнительный эксперимент А). Поэтому в прекультуральную минимальную солевую среду. включающую 100 мг/л ампицилина. добавляли 1-5 мкл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33°С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм. равной 2. Затем 5 мл этой культуры применяли для заражения основной культуры. включающей 50 мл той же среды. которая была инкубирована в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали величины оптической плотности 1.5 при длине волны 620 нм (после «7 ч). добавлением 10 мкМ 1РТС была индуирована экспрессия гена.

Для того чтобы наблюдать зависимую от времени продукцию 1.4-бутандиамина. через различные временные интервалы во время инкубации были взяты образцы. После отделения клеток путем центрифугирования супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разреше

- 11 010179 ния (см. сравнительный эксперимент А). С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 2).

Таблица 2

Образование 1,4-бутандиамина с применением параллельной суперпродукции АгдА и орнитиндекарбоксилазы в Е. сой

Примененный штамм	Экспрессированный ген	Концентрация 1,4бутандиамина (мг/л)
υΐ10ρϋΑΒ5	АгдА зреР	893
Х.Л ЮрПАВб	АгдА зреС	1064

Пример 2. Продукция 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы, а также суперпродукции Атд1 (колба с покачиванием).

Было исследовано влияние параллельной работы М²-ацетил-Е-орнитин:Е-глутамат-Ы-ацетилтрансферазы, кодируемой геном Атд1 либо из С. д1и1ат1сит, либо из В. киЬНПк, катализирующей образование Ν-ацетилглутамата и орнитина из Ь-глутамата и Ν-ацетилорнитина, и орнитиндекарбоксилазы крсР или крсС на продукцию 1,4-бутандиамина в штамме-хозяине Е. со11 ЬЛ10 (2сррспГс1б, с! а1., см. основные процедуры), несущем плазмиду рЭАВ37 (см. (ίχ)) или рЭАВ38 (см. (х)).

Эти штаммы были тестированы в экспериментах с покачивающейся колбой в минимальной солевой среде (см. сравнительный эксперимент А). Поэтому в предварительную культуру с минимальной солевой средой, включающую 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33°С, 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было применено для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после ~7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ ΙΡΤΟ.

Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина во времени в различные интервалы времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением ЯМР. Значение рН в образцах супернатанта культуры было доведено до 5,8, они были лиофилизированы и повторно растворены в Ό₂Ο. Н¹ ЯМР при 600 МГц и 323 К показал ожидаемые спектры резонанса, и пики, полученные при добавлении небольших количеств 1,4-бутандиамина, подтвердили его присутствие. При применении для калибровки стандартных веществ были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 3).

Таблица 3

Образование 1,4-бутандиамина с применением параллельной суперпродукции Атд1 и орнитиндекарбоксилазы в Е. со11

Примененный штамм	Экспрессируемые гены	Концентрация 1,4бутандиамина (мг/л)
ίΠ10ρϋΑΒ37	агд1Вз зреР	1050
ЕЛ 10 ρϋΑΒ38	агДС-й ЗреР	ИЗО

Пример 3. Улучшение продукции 1,4-бутандиамина в партии, начиная с орнитина, а также аргинина (колба с покачиванием).

Для демонстрации дополнительного улучшения образования 1,4-бутандиамина, начиная с орнитина, а также с аргинина, было исследовано влияние комбинированной суперпродукции орнитиндекарбоксилазы 8рсЕ, аргинидекарбоксилазы 8рсА и агматиназы 8рсВ. Кроме того, для обеспечения надлежащих запасов предшественника эти исследования сочетались с дополнительным экспериментом с суперпродукцией Ν-ацетилглутаматсинтазы АгдА, катализирующей первую стадию биосинтеза орнитина, начиная с глутамата.

Таким образом, была проведена культивация в покачивающейся колбе в минимальной солевой среде (см. А.3) путем применения штамма-хозяина Е. сой ЬЛ10 (2сррспГс1б, с! а1., см. основные процедуры), несущего плазмиды рЛАВ8 и рЛАВ10, соответственно (см. 2.2 и 2.3). Поэтому в предварительную культуру с минимальной солевой средой, включающую 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33°С, 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было применено для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33°С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после ~7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 10 мкМ ΙΡΤΟ.

Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина во времени в различные интервалы времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (см. сравнительный эксперимент А). С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4бутандиамина (см. табл. 4).

Claims

1. Способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность орнитиндекарбоксилазы) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазы, характеризующийся тем, что в микроорганизме представлена также повышенная активность образования Ν-ацетилглутамата по сравнению с нативной активностью образования Ν-ацетилглутамата в микроорганизме, и тем, что 1,4-бутандиамин, производимый в микроорганизме, секретируется в среду ферментации и извлекается из среды ферментации.

2. Способ по п.1, где увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы достигают путем суперэкспрессии генов креЕ или креС (каждый принадлежит КФ 4.1.1.17), кодирующих орнитиндекарбоксилазу и происходящих из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксНепсЫа, 8Ыде11а, 8а1топе11а, Уегйша и 8с11е\уапе11а.

3. Способ по п.2, где ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, происходит из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а Пехпегг 8а1шопе11а 1урЫтцгшт, Уегйша рекйк, 8с11е\уапе11а опейепйк.

4. Способ по любому из пп.1-3, где ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном креЕ, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8а1топе11а 1урЫтцгшт и 8с11е\\'апе11а опеИепйк.

5. Способ по любому из пп.1-4, где повышенной активности образования Ν-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии либо гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу (принадлежит к КФ 2.3.1.1), и/или гена агд1, кодирующего ^-ацетил-Е-орнитинЕ-глутамат-И-ацетилтрансферазу (принадлежит к КФ 2.3.1.35).

6. Способ по п.5, где повышенной активности образования Ν-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу и происходящего из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсШа, 8Ыде11а, 8а1топе11а, Уегйша, РНоЮгНаЬбик и Висйиега.

7. Способ по п.6, где повышенной активности образования Ν-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена агдА, кодирующего Ν-ацетилглутаматсинтазу и происходящего из одного из видов, выбранного из группы, состоящей из ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а Пехпегг 8а1топе11а еШепса, Уегйша рекйк, РНоЮгНаЬбик 1цттексепк и Висйпега арЫбко1а.

8. Способ по п.5, где повышенной активности образования Ν-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена агд1, кодирующего ^-ацетил-Ь-орнитинЪ-глутамат-Ν-ацетилтрансферазу (принадлежит к КФ 2.3.1.35), происходящего из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ВасШик, Ыйепа, ОсеапоЬасШик, 81арку1ососсик, ЬасФЬасШик, СогупеЬас1епит, МусоЬас1егшт, ТйегтоЬШба, 81гер1отусек и ВШбоЬас1егшт.

9. Способ по п.8, где повышенной активности образования Ν-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена, кодирующего ^-ацетил-Ь-орнитинЪ-глутамат-Ν-ацетилтрансферазу и происходящего из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ВасШик сегеик, Ык1ег1а топосуфдепек, ОсеапоЬасШик Шеуепкщ, 81арку1ососсик ерШегтЦ, Ьас1оЬасШик р1ал1агит, Ьас1оЬасШик 1ас11к, СогупеЬас1епит дЫаткит, МусоЬас1егшт 1ергае, ТйегтоЬШба (икса, 81гер1отусек соеНсог и ВШбоЬас1егшт 1опдит.

10. Способ по любому из пп.1-9, где дополнительно получают также увеличенную ферментативную активность по меньшей мере для двух других ферментов посредством суперэкспрессии либо (ί) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежит к КФ 4.1.1.19), и гена креВ, кодирующего агматиназу (принадлежит к КФ 3.5.3.11), называемого также геном, кодирующим агматинуреагидролазу; или (ίί) гена креА, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежит к КФ 4.1.1.19), и гена адиА, кодирующего агматиниминогидролазу (принадлежит к КФ 3.5.3.12) и называемого также геном, кодирующим агматиндеиминазу, и гена адиВ, кодирующего Ν-карбамоилпутресцинаминогидролазу (принадлежит к КФ 3.5.1.53), и при необходимости также гена креВ, кодирующего агматиназу (принадлежит к КФ 3.5.3.11).

11. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном креА аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйепсЫа, 8Ыде11а, 8а1топе11а, Уегйша, Рак1еиге11а и №ккепа.

12. Способ по п.11, где суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном креА аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, со

- 13 010179 стоящей из Е^сйспсЫа сой, 8й1дс11а Псхпсп. 8а1тоие11а степса. Усгщша ршШ, РайсигсПа тийоаба и №55спа тсшпдШбю.

13. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном крсВ агматиназы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйспсЫа, 8а1тоис11а, Рго1си8, Рйо1огйаЬби8, У1Ьгю и №155спа.

14. Способ по п.13, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном крсВ агматиназы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из ЕксйспсЫа сой, 8а1тоис11а сШспса, Рго1сш тйаЫШ, Рйо1огйаЬбш 1ишис8сси8, У1Ьгю сйо1сгас и №188спа тсшпдШбю.

15. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном адиА агматинимидогидролазы и/или геном адиВ Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Рксиботоиак, 81гср1ососсш, 81гср1отусс5, Ахо1оЬас1сг, АгаЫборщк, ^уокрйтдоЬшт и ВасШш.

16. Способ по п.15, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном адиА агматиниминогидролазы и/или геном адиВ Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Рксиботоиак асгидшока, 81гср1ососсш ти1аи8, 81гср1отусс5 аусгтйШк, Ахо1оЬас1сг ушс1аибй, АгаЫборык 1йайаиа, ^уокрйтдоЬшт аготайшуогага и ВасШш ссгеш.

17. Способ по любому из пп.1-16, где способ осуществляют в организме-хозяине, выбранном из группы, состоящей из 8ассйаготусс§ §р., ВасШш §р., СогуисЬас1сгшт §р., ЕксйсйсЫа §р. и Р1сй1а §р.

18. Способ по любому из пп.1-17, где способ осуществляют в организме-хозяине, выбранном из группы 8ассйаготусс§ ссгсуШас, СогуисЬас1сгшт §р., ЕксйсйсЫа §р., и в котором, помимо увеличенного уровня активности орнитиндекарбоксилазы и образования Ν-ацетилглутамата, увеличен, по меньшей мере, также уровень активности аргининдекарбоксидазы в сочетании с агматиназой и/или агматиниминогидролазой и Ν-карбамоилпутресцинамидогидролазой.

19. Векторы, плазмиды и хозяева, несущие повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ОЭС) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности по любому из пп.1-4 и повышенный уровень активности образования Ν-ацетиглутамата по любому из пп.1 и 5-9.

20. Векторы, плазмиды и хозяева по п.19, дополнительно несущие повышенный уровень активности одной или более дополнительных ферментативных активностей по любому из пп.10-18.