EA004627B1 - Фармацевтические композиции фибринолитического агента - Google Patents

Фармацевтические композиции фибринолитического агента Download PDF

Info

Publication number
EA004627B1
EA004627B1 EA200200396A EA200200396A EA004627B1 EA 004627 B1 EA004627 B1 EA 004627B1 EA 200200396 A EA200200396 A EA 200200396A EA 200200396 A EA200200396 A EA 200200396A EA 004627 B1 EA004627 B1 EA 004627B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
pharmaceutical composition
zinc
metalloproteinase
fibrolase
lyophilized
Prior art date
Application number
EA200200396A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200200396A1 (ru
Inventor
Брент С. Кендрик
Брайан Петерсон
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA200200396A1 publication Critical patent/EA200200396A1/ru
Publication of EA004627B1 publication Critical patent/EA004627B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Описаны замороженная и лиофилизированная композиции металлопротеиназного фибринолитического агента (фибролазы или NAT), способ приготовления лиофилизированной композиции и набор и способ восстановления лиофилизированной композиции.

Description

Область, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к новым фармацевтическим композициям фибринолитического агента. Более конкретно, данное изобретение относится к замороженным жидким или лиофилизированным композициям фибролазы и, отдельно, тромболитика нового действия (ΝΑΤ), а также к способам их получения и применения.
Предпосылки создания изобретения
В большинстве случаев полипептиды не очень устойчивы в водной среде и претерпевают химическое и физическое расщепление, приводящее к потере биологической активности при обработке и хранении. Другой трудностью, которая, в частности, встречается при работе в водном растворе, является гидролиз, такой как деамидирование и расщепление пептидной связи. Эти эффекты представляют собой серьёзную проблему для терапевтически активных полипептидов, которые предполагается ввести человеку в определенном интервале доз, исходя из биологической активности.
Для уменьшения расщепления полипептидов водные фармацевтические композиции обычно хранят в охлаждённом или замороженном состоянии до момента применения. Или же для стабилизации полипептидов при длительном хранении используют лиофилизацию, особенно если полипептид сравнительно неустойчив в жидких композициях. Цикл лиофилизации обычно состоит из трёх стадий: замораживание, первичная сушка и вторичная сушка; АПНатк апб РоШ, 1оита1 οί Рагеп!ега1 8с1епсе апб Тесйпо1оду, Уо1ите 38, ИитЬег 2, радек 48-59 91984). На стадии замораживания раствор охлаждают до равномерного замерзания. На этой стадии основная масса воды образует лёд. Лёд сублимируется на стадии первичной сушки, которую проводят при давлении ниже давления паров льда, применяя вакуум. Наконец, сорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичной сушки при пониженном давлении и повышенной температуре. В этом процессе получают материал, известный как лиофилизированный осадок (брикет). После этого брикет можно снова восстановить перед употреблением.
Стандартная процедура восстановления лиофилизированного материала представляет собой добавление объёма чистой воды (обычно эквивалентного объёму, удаляемому лиофилизацией), хотя иногда при получении фармацевтических препаратов для парентерального применения используют разбавленные растворы антибактериальных агентов; Сйеп, Эгид Эеуе1ортеп! апб 1пбик1па1 Рйагтасу. Уо1ите 18, ИитЬег 11 апб 12, радек 1311-1354 (1992).
Считается, что лиофилизация является лучшим методом для удаления избытка воды из растворов полипептидов. Процесс лиофилизации может дать в результате продукты, которые устойчивы и способны храниться долго. Лиофилизированные продукты могут храниться при комнатной температуре и, следовательно, с ними легче работать и их можно распространять на более широком - географически - рынке, таком, где рефрижерация может быть недоступной.
Отмечено, что в некоторых случаях эксципиенты ведут себя как стабилизаторы лиофилизированных продуктов; Сагреп!ег е! а1., Эесе1ортеп!к т Вю1од1са1 8ΐаиба^ι^ζаί^οи, Уо1ите 74, радек 225-239 (1991). Например, известные эксципиенты включают полиолы (включая маннит, сорбит и глицерин); сахара (включая глюкозу и сахарозу); и аминокислоты (включая аланин, глицин и глутаминовую кислоту).
Кроме того, полиолы и сахара также часто используются для защиты от повреждения при замораживании и сушке и для повышения стабильности при хранении в высушенном состоянии. В большинстве случаев сахара, в частности дисахариды, эффективны как в процессе лиофилизации, так и при хранении. Сообщалось, что другие классы веществ, включая моно- и дисахариды и полимеры, такие как РУР (ПВП), являются стабилизаторами лиофилизированных продуктов.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к устойчивым фармацевтическим композициям фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), некоторые из них являются жидкими композициями, пригодными для хранения в замороженном состоянии, а другие пригодны для лиофилизации.
Благодаря фибринолитическим свойствам фибролазы и ΝΑΤ композиции по данному изобретению применимы для разрушения сгустков крови 1п угуо и могут применяться в терапии для этой цели.
Для целей данного изобретения термин ΝΑΤ относится к металлопротеиназе с фибринолитической активностью, которая характеризуется последовательностью 8ЕО Ш N0:1. ΝΑΤ-полипептид кодируется кДНК с последовательностью 8Е0 ГО N0:2, хотя любая ДНК с вариантом последовательности, кодирующей тот же полипептид, может применяться для экспрессии и получения в соответствии со способами, представленными ниже в данном описании.
Фибролаза представляет собой известную металлопротеазу, которая описана в научной и патентной литературе; см. Рапбо1р11 е! а1., Рго!ет 8с1епсе, СатЬпбде Цшуегкйу Ргекк (1992), радек 590-600 и Европейская патентная заявка N 0323722 (Уа1епхие1а е! а1.), опубликованная 12 июля 1989 г. Обычно фибролаза, применяемая в композициях по данному изобретению, имеет последовательность 8Е0 ГО N0:3, кодируемую кДНК с последовательностью 8Е0 ГО N0:4 (или её вариантом, кодирующим ту же самую аминокислотную последовательность).
Фибролазу и ΝΑΤ следует отличать от других терапевтических агентов для обработки сгустков крови ίη νίνο, таких как урокиназа, стрептокиназа и ίΡΑ, представляющих собой активаторы плазминогена. В отличие от этих (других) агентов фибролаза и ΝΑΤ действуют непосредственно на сгусток, разрушая как фибрин, так и фиброген.
Фармацевтические композиции по данному изобретению содержат, помимо терапевтически эффективного количества фибролазы или ΝΑΤ, цинковый стабилизатор и, при необходимости, наполнитель с другими эксципиентами или без них в фармацевтически приемлемом буфере, который, в комбинации, дает стабильный замороженный или лиофилизированный продукт, который может храниться длительное время.
В одном из аспектов данное изобретение включает замерзающую жидкую медицинскую композицию, содержащую фибролазу или ΝΑΤ, водорастворимую цинковую соль, лимоннокислый буфер, при необходимости дополнительный стабилизатор, выбранный из группы, состоящей из воды, растворимых солей кальция и при необходимости наполнитель (например, маннит). Для увеличения стабильности при замораживании-плавлении можно также добавлять поверхностно-активное вещество, такое как Т\тссп 80 (ΒΑ8Ε, битее, Ιΐΐίηοίδ). Для стабилизации значений рН равным или выше 7,4 можно добавлять Ττίδ-буфер (81дта, 8ΐ. Ьошк, Μίδδοιιπ) или другой буфер с буферной ёмкостью выше рН 7,0.
В другом аспекте данного изобретения фармацевтическая композиция может представлять собой лиофилизируемую или лиофилизированную фармацевтическую композицию, содержащую фибролазу или ΝΑΤ, цинковый стабилизатор (например, растворимую в воде соль цинка) и лимонно-кислый буфер, с другими эксципиентами (например, с наполнителем, таким как маннит, глицин и т.п.) или без них. Лиофилизированная композиция может также содержать дисахарид, такой как сахароза или трегалоза, в качестве лиопротетанта. Для защиты от металлопротеиназы (фибролазы или ΝΑΤ) от стрессов при лиофилизации можно добавлять поверхностно-активное вещество, такое как Тетееп 80. В идеальном случае значение рН сохраняется при 8,8±0,5 за счёт применения подходящего буфера с рКа в этом интервале (например, ТП5).
Изобретение также включает способ получения лиофилизированной композиции, содержащей стадии: (ί) смешение фибролазы или ΝΑΤ с буфером и водорастворимой солью цинка, а также с любыми требуемыми необязательными ингредиентами, и (и) лиофилизацию этой смеси.
Кроме того, изобретение включает набор для получения водной фармацевтической композиции, содержащий первый контейнер с вышеупомянутой лиофилизированной композицией и второй контейнер с физиологически приемлемым растворителем для этой композиции.
Ещё один аспект этого изобретения включает способ, содержащий стадии восстановления лиофилизированной композиции и введения восстановленной композиции больному, нуждающемуся в разрушении сгустков крови (тромбов).
Подробное описание изобретения
Для экспрессии последовательности, кодирующей полипептид фибролазы или ΝΑΤ, стандартными методами рекомбинантной экспрессии, хорошо известными специалистам в данной области техники, и получения посредством этого фибринолитически активного полипептида для композиций можно использовать ряд систем вектора-хозяина. Такие системы включают, но без ограничения, эукариотные клеточные системы, такие как млекопитающие, инфицированные вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом и т.д.); клеточные системы насекомых, инфицированные вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы; или прокариотные клеточные системы, такие как бактерии (например, Е. οοΐί), трансформированные при участии бактериофагальной ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Элементы экспрессии этих векторов варьируются по силе и специфичности. В зависимости от используемой системы вектора-хозяина можно использовать любой из ряда пригодных элементов транскрипции и трансляции.
Предпочтительно, для рекомбинантной экспрессии используют дрожжевую систему экспрессии (например, РкЫа ракФпк) из-за её более высокой эффективности. Подробное описание такой системы можно найти в патентах США № 4855231 (81готап е! а1.), 4812405 (Ъа1г е! а1.) 4818700 (Сгедд е! а1.) 4 855242 (Сгедд) и 4837148 (Сгедд). Экспрессия фибролазы в такой системе как правило включает ДНК с последовательностью 8ЕС ΙΌ N0:5, которая кодирует помимо зрелого полипептида (нуклеотиды 784-1392, препро последовательность (нуклеотиды 1-783). Экспрессия ΝΑΤ в такой системе обычно включает ДНК с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:6, которая кодирует препро последовательность (нуклеотиды 1-783) в дополнение к зрелому полипептиду (нуклеотиды 784-1386).
Когда полипептид (фибролаза или ΝΑΤ) получен, очищен и проанализирован на активность (известными специалистам в данной области техники методами), из него можно приготовить фармацевтические композиции по данному изобретению.
В данные композиции (либо замороженные, либо лиофилизированные) добавляют стабилизатор (который также можно называть стеклообразующая добавка) для предупреждения или уменьшения осаждения и химического расщепления фибролазы или ΝΑΤ при любых обстоятельствах. Мутный или густой при комнатной температуре раствор указывает на осаждение полипептида. Термин стабилизатор означает, что эксципиент способен предотвращать агрегацию или другой вид физической деградации, а также химическое разложение (например, аутолиз, деамидирование, окисление и т.д.) фибролазы или ΝΑΤ в водной среде.
Было найдено, что введение цинкового стабилизатора, и более конкретно, водорастворимой соли цинка, повышает стабильность металлопротеиназы (фибролазы или ΝΑΤ) в композиции каждого вида, по сравнению с препаратами, в которых для предупреждения агрегации и/или разложения полипептида используют неорганические или другие органические соединения. Конкретно, цинк при концентрации выше 0,01 миллимоля (мМ) стабилизирует металлопротеиназу при условии, что цинк при концентрации выше 1 мМ значительно ограничивает растворимость фибролазы или ΝΑΤ. Следовательно, рекомендуется интервал около 0,01-1 мМ. Примерами пригодных солей цинка являются ацетат цинка, сульфат цинка и хлорид цинка.
Замороженные жидкие композиции по данному изобретению, в частности, могут при необходимости (но необязательно) также включать водорастворимую соль кальция в качестве дополнительного стабилизатора. Примерами являются ацетат кальция, сульфат кальция или хлорид кальция, которые, предпочтительно, присутствуют в концентрации около 0,001-0,02 мМ и, более предпочтительно, в концентрации около 0,01-0,002 мМ.
Если требуется, помимо вышеуказанных можно использовать другие стабилизаторы, обычно применяемые в фармацевтических композициях, такие как сахароза, трегалоза или глицин. Обычно такие стабилизаторы добавляют в минорных количествах, в интервале, например, около 0,1-0,5 (вес/объём)%. Поверхностно-активные стабилизаторы, такие как Тетееп 20 или Тетееи 80 (ΒΑ8Ε) можно также добавлять в обычных количествах.
Если требуется, замороженные жидкие или лиофилизированные композиции могут также включать наполнитель/регулятор осмолярности. Предпочтительно, вводят маннит с концентрацией около 2-8% (вес/объём, в/о)%, и обычно с концентрацией около 5 (в/о)%.
Найдено, что выбор фармацевтически приемлемого буфера и рН также влияют на стабильность данных композиций. Фибролаза или ΝΑΤ наиболее устойчивы при значениях рН выше нейтрального (7,0). Заметное осаждение обеих металлопротеиназ происходит при рН ниже 7,0, когда замороженная композиция размораживается или лиофилизированная композиция восстанавливается. Буферная система композиций выбирается так, чтобы она была физиологически совместимой и сохраняла нужное значение рН в восстановленном растворе, а также в растворе перед лиофилизацией. Предпочтительно, рН буферная ёмкость буферных растворов составляет около рН 7,0-8,5.
Конкретно, буферы лимонной кислоты (например, лимонная кислота или соль лимонной кислоты), предпочтительно, вводятся в концентрации около 20-110 мМ, и наиболее предпочтительно, около 100 мМ в композиции замороженной и около 20 мМ в лиофилизированной композиции. Соли лимонной кислоты применяют как буферизаторы и стабилизаторы в композициях по данному изобретению. Используют ли кислоту как таковую, либо её соль - буфер выбирают для доведения рН композиции до значения в вышеуказанном заданном интервале (в случае лиофилизированной композиции - после восстановления). Можно добавлять в эффективных количествах дополнительные буферизаторы, такие как Тг® для сохранения адекватной буферной ёмкости выше рН 7,0.
Предпочтительная жидкая композиция, подлежащая замораживанию, содержит, помимо солюбилизированной фибролазы или ΝΑΤ, ацетат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, ацетат кальция с концентрацией около 0,0080,012 мМ и лимонную кислоту (или цитрат натрия) с концентрацией около 95-105 мМ при рН около 7,4. Другая предпочтительная жидкая композиция содержит фибролазу или ΝΑΤ, ацетат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, лимонную кислоту (или цитрат натрия) с концентрацией около 18-22 мМ, Тп5 с концентрацией около 0,02-0,06 мМ, маннит с концентрацией около 3-6 (в/о)% мМ и Т\тееп 80 с концентрацией около 0,008-0,012 (в/о)% мМ при рН около 8,0.
Предпочтительная лиофилизируемая композиция содержит, помимо фибролазы или ΝΑΤ сульфат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, лимонную (или цитрат натрия) с концентрацией около 18-22 мМ, Тп5 с концентрацией около 3-6 мМ, маннит с концентрацией около 3-6 (в/о)% мМ и Т\тееп 80 с концентрацией около 0,008-0,012 (в/о)% мМ при рН около 8,0.
Во всех композициях по данному изобретению фибролаза или NΑΤ присутствуют с концентрацией около 0,1-50 мг/мл - предпочтительно, с концентрацией около 5-40 мг/мл, более предпочтительно, и с концентрацией около 10-15 мг/мл - наиболее предпочтительно.
Относительные пропорции эксципиентов в этих композициях зависят от нескольких факторов. Например, количество металлопротеиназы и наполнителя (например, маннита) влияет на
Ί количество цинка (или кальция, если он присутствует), необходимого для стабилизации композиции. Количество стабилизатора, используемого в композициях, зависит от количества, необходимого для сохранения структурной целостности фибролазы или ΝΑΤ в ходе лиофилизации или другой обработки или при хранении.
Также в композицию могут быть включены другие эксципиенты при условии, что они физиологически совместимы и ни в коей мере не вредны для фибролазы или ΝΑΤ. Например, композиция может содержать минорные количества добавок, таких как консерванты, тонизирующие вещества, антиоксиданты или другие полимеры (например, корректоры вязкости или наполнители). Специалисты в данной области техники могут легко определить подходящие, фармацевтически приемлемые реагенты на основе знаний и опыта в отношении других фармацевтических композиций. См., например, Кет1пдйп'8 Рйагтасеийса1 8с1епсез (последнее издание), Маск РиЬйзЫпд Сотрапу, ЕазФп, РА.
Предполагается, что композиции устойчивы, по меньшей мере, в течение двух лет при -30°С для замороженной композиции, и в течение двух лет при 2-8°С для лиофилизированной композиции. Такая продолжительная устойчивость полезна для длительного хранения фармацевтического продукта и для перевозок на большие расстояния.
В другом аспекте данное изобретение также охватывает способ получения лиофилизированной композиции, включающий стадии:
(a) доведение рН смеси, содержащей ингредиенты без фибролазы или ΝΑΤ, до рН 7,68,2, (b) буферный перенос фибролазо- или ΝΑΤ-содержащего раствора в раствор композиции, полученный на стадии (а), а затем добавление эффективного количества поверхностноактивного вещества, и (c) лиофилизация смеси, полученной на стадии (Ь).
Фибролаза или ΝΑΤ и эффективные количества эксципиентов смешивают в условиях, эффективных для уменьшения агрегации высушенного полипептида фибролазы или ΝΑΤ в процессе восстановления средой для восстановления, например, растворителем, совместимым со способом введения и не препятствующим действию металлопротеиназы, таким как стерильная вода, физиологический раствор, раствор глюкозы или другие водные растворители (например, спирты, такие как этиловый, нпропиловый или изопропиловый, бутиловый или их смеси) и, при необходимости, другие компоненты, такие как антибактериальные агенты.
Эксципиенты могут смешиваться с металлопротеиназой в определённое время перед лиофилизацией. Время смешения эксципиентов и металлопротеиназы должно быть достаточ ным для приготовления соответствующей смеси; предпочтительно, смешение следует проводить в течение, примерно, одной-тридцати минут.
Затем приготовленный состав с металлопротеиназой можно лиофилизировать, хранить и восстанавливать с применением стандартных методов. Конкретные условия, при которых фибролаза или ΝΑΤ лиофилизируются и восстанавливаются, не особенно важны, при условии, что выбранные условия не разрушают металлопротеиназу и не вредны для стабилизатора. Предпочтительный лиофилизированный цикл включает замораживание композиции при -40°С, отжиг замороженного образца при -12°С и проведение первичной сушки при -30-35°С в течение двадцати-пятидесяти часов, а вторичной сушки при 20°С в течение двадцати-сорока часов. В большинстве случаев восстановленную композицию используют вскоре после восстановления (реконструкции).
Как ΝΑΤ, так и фибролазу лучше всего доставлять локально к месту тромба (сгустка) для наиболее эффективного лечения. Подобно фибролазе ΝΑΤ ковалентно связывается α2 макроглобулином в общем потоке. В комплексе с α2 макроглобулином ни фибролаза, ни ΝΑΤ не могут иметь доступ к целевому субстрату (т.е. фибрину или фибриногену) и в значительной степени не эффективны, если и до тех пор, пока не будет превышен максимальный природный уровень α2 макроглобулина. Следовательно, предпочтительно, чтобы композиции по данному изобретению вводились непосредственно в сгусток крови с помощью внутриартериальной или внутривенной катетеризации.
Описание примеров осуществления изобретения
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение.
Рекомбинантный ΝΑΤ (8ЕЦ ГО ΝΟ:1), используемый в примерах 1-3, получают экспрессией в Р. ра81оп8. Подробности, касающиеся подходящей системы экспрессии и способа, можно найти в патентах 8!готап е1 а1., Ьа1г е1 а1., Сгедд е1 а1. и Сгедд, ссылки на которые даны выше. Все химические реактивы имеют степень чистоты либо чда, либо И8Р.
Пример 1. Получение замороженной жидкой композиции.
Водный раствор, содержащий 100 мМ лимонной кислоты, 0,01 мМ ацетата кальция и 0,1 мМ сульфата цинка, готовят, смешивая ингредиенты при рН, доведенном до 7,4. ΝΑΤсодержащий раствор подвергают буферному переносу в раствор диализом (или же можно применять ультрафильтрацию). Образующийся ΝΑΤ-раствор концентрируют до 10 мг/мл и хранят в замороженном виде при температуре -30°С до употребления.
Пример 2. Приготовление лиофилизированной композиции.
Приготовление лиофилизируемой композиции. Водный раствор, содержащий 5 мМ Тп5. 20 мМ лимонной кислоты, 5 (в/о)% маннита, 0,5% (в/о) сахарозы и 0,1 мМ сульфата цинка готовят смешением ингредиентов при рН, доведенном до 8,0. ΝΑΤ-содержащий раствор подвергают буферному переносу в раствор композиции диализом (можно вместо него использовать ультрафильтрацию). Образующийся ΝΑΤраствор концентрируют до 10-12 мг/мл. Добавляют Ттеееи 80 до конечной концентрации 0,01 (в/о)%. Раствор хранят при температуре 2-8°С до момента лиофилизации.
Лиофилизированный цикл для получения лиофилизированного продукта. Приготовленную выше композицию сначала замораживают при температуре -40°С в лиофильной сушилке. Температура отжига устанавливается при -12°С; температура первичной сушки устанавливается -30°С; и температура вторичной сушки 20°С. Образующийся в результате лиофилизированный брикет (кек) имеет хорошую морфологию и содержит менее 3% воды, как показано титрованием по методу Карла Фишера; см. Р1кскег, Аидете. Скеш1е, Уо1ише 48, раде 394 (1935). По окончании процесса лиофилизации лиофилизированный брикет (осадок) помещают в пузырьки и под вакуумом плотно закрывают резиновыми пробками, прижимая верхние металлические полки в лиофильной сушке. Затем пузырьки обжимают с помощью 13-мм наружного алюминиевого уплотнения и помещают в термостаты, выдерживают при различных температурах.
Пример 3. Анализ восстановленных лиофилизированных образцов.
Анализ временных точек образца. Пузырьки с образцами вынимают из термостатов в определенные временные интервалы для анализа временных точек. Лиофилизированный образец восстанавливают 0,9 мл стерилизованной воды, т.е. воды для инъекций (МсОате 1пс., 1туше, СА). Визуально определяют прозрачность восстановленных растворов образцов. Отфильтрованные растворы анализируют с помощью ВЭЖХ, УФ-ущ-спектроскопии и определения ферментативной активности, чтобы количественно определить оставшийся растворимый ΝΑΤ в этих лиофилизированных образцах.
На основе вышеуказанных анализов можно сделать вывод, что более 90% ΝΑΤ регенерировано после восстановаления лиофилизированного продукта.
Оптическая плотность в УФ/видимой области (νίδ). 150-200 мкл раствора ΝΑΤ помещают в ультра-микрокювету из кварцевого стекла супрасил с длиной траектории 1 см. УФМкоптическую плотность определяют на спектрофотометре НР 8452Α с диодной матрицей (Нете1е11-Раскатб Со., ^11шшд1оп, ΌΕ). Концен трации ΝΑΤ определяют, используя А0,1% = 1,05 при 280 нм, с учетом расчетов на основе аминокислотного состава; ссылку см. ЕбеШоск, ΒίοскешЩту, Уо1ише 6, радек 1948-1954 (1967). После повторной гидратации лиофилизированного продукта не наблюдается заметного помутнения при определении оптической плотности при длине волны 350 нанометров (нм).
Высокоэффективная жидкостная хроматография. ВЭЖХ-анализ ΝΑΤ-образцов осуществляют на системе для жидкостной хроматографии НР 1050, снабжённой НР 3Ό Скешк1а1юп для сбора данных (Нете1еИ-Раскатб Со.). Образцы ΝΑΤ обнаруживают по оптической плотности при 280 нм и 214 нм, используя диодный детектор.
Для обращённо-фазовой ВЭЖХ (ОФВЭЖХ, ВР-НРЬС) образцы впрыскивают на колонку 2огЬах 3008В-СВ (4,6 х 250 мм) (Нете1е11-Раскатб Со.) в подвижной фазе, состоящей из 51,5% буфера А (2% изопропанола, 0,1% ΤΡΑ (ТФК)) и 48,5% буфера В (90% ацетонитрила, 2% изопропанола, 0,1% ТФК) при скорости потока 0,6 мл/мин. Буфер В выдерживают шесть минут, а затем постепенно доводят до 51% в течение двадцати минут. Эту концентрацию выдерживают одну минуту с последующим постепенным доведением в течение восьми минут до 90% и выдерживают при такой концентрации в течение пяти минут. Наконец, концентрацию буфера В опять постепенно доводят до 48,5% за три минуты. Регенерация ΝΑΤ после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 92%.
Для ионообменной ВЭЖХ (ИО-ВЭЖХ, ΙΕΧ-НРЬС) образцы впрыскивают на колонку ^кокаак 0ΕαΕ-5Γ^ (7,5 х 75 мм) ^ококаак, МоШдоше^Ше, Α1аЬата) в подвижной фазе, состоящей из 90% буфера А (20 мМ Ττίκ, рН 8,5) и 10% буфера В (20 мМ Ττίκ, 250 мМ №С1, рН 8,5) при скорости потока 0,5 мл/мин. Затем применяют градиент, повышая концентрацию буфера В от 10% до 75% за 20 мин, затем от 75% буфера В до 90% буфера В за одну минуту. Затем выдерживают эту концентрацию буфера В в течение пяти минут, а далее постепенно доводят до 10% буфера В за четыре минуты. Регенерация ΝΑΤ после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 90%.
Для гель-фильтрационной ВЭЖХ (ГФВЭЖХ, §ЕС-НРЬС) образцы наносят на колонку ^кокаак 6-20008^ХЬ (300 х 7,8 мм). Изократическое элюирование осуществляют при скорости потока 0,8 мл/мин, исплользуя буфер, содержащий 15 мМ фосфата натрия, рН 7,0 и 0,140 М хлористого натрия. Регенерация ΝΑΤ после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 95%.
Биоанализ. Образцы подвергали скринингу на активность против фибриновых сгустков. Малые аликвоты серийного разведения ΝΑΤ в интервале 0,01-1,0 мг/мл наносят на заранее образованные фибриновые сгустки в 96-луночных планшетах. Образцы инкубируют восемнадцать часов и лизис сгустков количественно определяют по оптической плотности при 500 нм. График зависимости оптической плотности от концентрации ΝΑΤ для различных рецептур сравнивают с графиком приготовленного эталона ΝΑΤ для сравнительной активности. Не обнаруживается ощутимой разницы между фибринолитической активностью ΝΑΤ после лиофилизации и активностью контрольного (нелиофилизированного) образца.
Сходные результаты анализа получены и для замороженной жидкой композиции после того, как последнюю разморозили (расплавили) при 4°С и анализировали, используя те же саАзп Рго С1п Суз Не Ьеи Азп Ьуз Рго
195 200 <210> 2 <211> 603 <212> ΟΝΑ <213>
Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности кодируетΝΑΤ (аналог фибролаэы) <400> 2 ссСССсссас ааадаСасдС асадсСддее ассдссдсед ассассдсас даасасеааа 60 еасаасддед асСседасаа ааессдесаа Сдддедсасс аааСсдесаа сассаееаас 120 дааассеаса даосассдаа саСссааССс асСССддССд дсссддааас сСддСссаас 180 саадаСССда СсассдССас ССседСаСсс сасдасасСс еддсабссСС сддСаасСдд 240 сдедааассд асседсСдсд есдссаасде саедасаасд сесаассдсс дассдсеаес 300 дасеесдасд дСдаСасСде СддСсСддсе СасдССддСд дсаСдСдеса ассдааасас 360 есСаседдед ССаСссадда ссасессдсС аССаассСдс ЕддССдсСсС дассаСддса 420 сасдааседд десаСаассС дддсаедаас сасдаСддса ассадСдСса ссдсддедса 480 аас£сседбд есасддссдс сасдссдссс даесаассаС ссааасЕдсс сессдасСдс 540 ссеаадааад асеассадас сеСсседасс деСаасаасс сдсадСдСае сседаасааа 600
ссд 603
<210> 3
<211> 203
<212> РНТ
<213> АдЫзСгобоп сопеогСгхх
<220>
<223> Природная фибролаза Аек1з1лх1опСопюлпх
мые протоколы.
Вышеприведённое изобретение описано с представлением некоторых подробностей для большей ясности и лучшего понимания. Также станет очевидно, что можно использовать различные другие комбинации формы и деталей в объёме данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Пример 4.
Операции, описанные в примерах 1 и 2, повторяют с рекомбинантной фибролазой вместо ΝΑΤ, получая аналогичные замороженные жидкие и лиофилизированные фармацевтические композиции.
ЗЕОЦЕЫСЕ Ы5Т1ЫС <110> Ашдеп Пдс.
<120> РНАРМАСЕЦПСАЬ СОМРОЗГПОИЗ ОГ ΓΙΒΚΙΝΟΕΥΤΙΟ ΑΟΕΝΤ <130> Α-57Θ <140> Ν/Α <141> 1999-10-01 <160> 6 <170> РаСепЫп Уег. 2.0
<400> 3 Рго С1п Агд Туг Уа1 С1п Ьеи Уа1 Не νβΐ А1а 15 Азр
С1п 1 <31п Агд РЬе
5 10
ΗΪ5 Агд МеС Азп ТЬг Ьуз Туг Азп <31у Азр Зег Азр Ьуз Не Агд С1п
20 25 30
Тгр Уа1 ΗΪ3 С1п 11е Уа1 Азп ТЬг Не Азп С1и Не Туг Агд Рго Ьеи
35 40 45
Азп Не О1п РЬе ТНг Ьеи Уа1 О1у Ьеи <31и Не Тгр Зег А5П О1п Азр
50 55 60
Ьеи Не Ткх Уа1 ТЬг Зег νηΐ Зег ΗΪ8 Азр ТЬг Ьеи А1а Зег РЬе (31у
65 70 75 80
Азп Тгр Агд 61и ТЬг Азр Ьеи Ьеи Агд Агд С1п Агд Нхз Азр Азп А1а
85 90 95
С1п Ьеи Ьеи ТЬг А1а Не Азр РЬе Азр С1у АЗр ТЫ ναΐ С1у Ьеи А1а
100 105 но
Туг Уа1 С1у С1у мее Суз 61п Ьеи Ьуз Нхз Зег ТЫ С1у νβΐ Не С1п
115 120 125
Азр ΗΪ3 Зег А1а Не Азп Ьеи Ьеи ν<ι А1а Ьеи ты МеС А1а Нхз С1и
130 135 140
Ьеи С1у Ηί5 . Азп Ьеи < 81у Мес Азп ΗΪ3 Аза С1у Азп С1п Суз Нхз Суз
145 150 155 160
С1у А1а Азп Зег Суз νβΐ Мес А1а А1а Мее Ьеи Зег Азр С1п Рго Зег
165 170 175
Ьуз Ьеи РЬе Зег Азр < Суз Зег Ьуз Ьуз Азр Туг С1п ТЫ РЬе Ьеи ТЬг '
180 185 190
Уа1 Азп Азп Рго 1 С1п ι Суз Не Ьеи Азп Ьуз Рго
195 200
<210> 4 <211> 609 <212> ϋΝΑ <213> Адк1зсго<3оп сопсогсгхх <210> 1 <211> 201 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: ΝΑΤ (аналог фнбролазы А£к1$ио4оп Сопюппх) <400> 1
Зег РЬе Рго С1п Агд Туг Уа1 б1п Ьеи Уа1 Не Уа1 А1а Азр Нхз Агд
1 5 10 15
Мее Азп ТЬг Ьуз 20 Туг Азп СХу Азр Зег 25 Азр Ьуз Не Агд С1п 30 Тгр Уа1
Η13 С1п 11е 35 Уа1 Азп ТЬг Не Азп 40 С1и Не Туг Агд Рго 45 Ьеи Азп Не
С1п РЬе 50 ТЬг Ьеи Уа1 С1у Ьеи 55 С1и Не тгр 5ег Азп 60 <31п’ Азр Ьеи 11е
ТЫ 65 Уа1 ТЬг Зег Уа1 Зег 70 Ηίβ Азр ТЬг Ьеи А1а 75 Зег РЬе С1у Азп Тгр 80
Агд С1и ТЬг Азр Ьеи 85 Ьеи Агд Агд С1п Агд 90 Нхз Азр Азп А1а С1п Ьеи 95~
Ьеи ТЬг А1а 11е 100 Азр РЬе Азр С1у Азр 105 ТЬг Уа1 С1у Ьеи А1а 110 Туг Уа1
С1у С1у МеС 115 Суз (31п Ьеи Ьуз ΗΪ3 120 Зег ТЬг С1у Уа1 11е 125 С1п Азр И18
Зег А1а 130 Х1е Азп Ьеи Ьеи УаХ 135 А1а Ьеи ТЬг МеС А1а 140 Нхз С1и Ьеи С1у
Нхз 145 Азп Ьеи (31у Мес Азп 150 Ηίβ Азр С1у Азп С1п 155 Суз Нхз Суз С1у А1а 160
Азп Зег Суз Уа1 Мее 165 АХа А1а Мее Ьеи Зег 170 Азр С1п Рго Зег Ьуз 175 Ьеи
РЬе Зег Азр Суз 180 Зег Ьуз Ьуз Азр Туг 185 С1п ТЬг РЬе Ьеи ТЬг 190 Уа1 Азп
<220>
<223> Кодирует природную фибролазу Α^ί$πο4οη Солюгатх <400> 4 саасааадае Ссссасааад асасдСасад сСддсеаесд ССдссдасса ссдеаедаас 60 ассаааеаса асддедасес сдасааааес сдСсааеддд сдсассааае сдесаасасс 120 аееаасдааа есбасадасс ассдаасаес сааСЕсасСС сддседдеее ддааасседд 180 сссаассаад аееедаесас сдесасССсС деассссасд асасСсСддс аСсссесдде 240 аассддсдсд ааассдассе дседсдесдс саасдесаед аСаасдсеса аседседасс 300 дсСаесдасе СсдасддСда СассдееддС ссддсееасд ССддСддсаС асаесаад^д 360 ааасаеесеа седдСдССае -ссаддаосас СссдсеаССа ассСдсСдде дсессдасс 420 аСддсасасд аасСдддеса СаассСдддС аедаассасд аеддсаасса дедесаседс 480 ддедсааасс сседСдССаС ддссдсСаед седСссдаес аассаессаа асхдССсесс 540 дассдсссеа адааадасеа ссадассесс сЬдассдееа асаасссдса дедСабссСд 600 аасааассд 609 <210> 5 <211> 1392 <212> ΟΝΑ <213> Адкхзеговоп сопСогСЫх <220>
<223> Природная профибролаза Α^ί$ιπχ3οη Сошолпх <400> 5 еаседссдсе адаСдааасд сессдасдес СасеасСаее сдаадсеесС аадаааддес аеасдааеес деесесСдаа сссаседдде сдссессаес сссдаеедаа сдСсдаааад сдаассааес аадаеасдса сессдасааа ассаседаас сассдССасс асдадасссс ссадссааса еасссадаес ааедддесае есесЕсдада даССасдаад аадеасдаад ССддаааааа ддСададааа даааасдаСд аадССдсаад дседссеаса асссаааасЬ адасаасааа аасасСааае ассаССаасд еддсссаасс ссссааессс сеасаасада Садаадддда сдеееаеааа ааадададде еедеееаесс аедссаСдеа асаааддсее есасеасееа сСдасСссас дсдаааедса адеасдаааа дддаабсаСа дасесссаса асаасддСда аааеабасад аадаееедас ееасссдсад сасссессдс аееадссдсе 60 дсасаааеес сддседаадс СдСсабсдде 120 дседеееедс саеееессаа садсасааае 180 дссадсаесд седсеааада адаадддд'еа 240 ессасеассс еддааеседд саасдесаас 300 асбссадеес сеаддддедс сдсесаасса 360 ааддесааса дСдаассаде едесеедсас 420 даееасесед ааасбсасеа сессссадас 480 даадаесасе дееасеасса еддеадааес 540 ессдсесдса асддессдаа дддесасеес 600 ссаССддааС едсссдасСс едаадсссас 660 даадаСдаад ссссааадае дедСддСдСС 720 аадааддссс ессааееааа сеедасеаад 780 садседдсеа есдссдседа ссассдсасд 840 аСссдСсаас дддедсасса ааесдесаас 900 аессаасеса сеееддседд еседдаааес 960 СсСдСаессс асдасасЬсС ддсаессССс 1020 ддЕаасЕддс дсдааассда ссЕдсЕдсдЕ сдссаасдЕс асдасаасдс ЕсаассдсЕд 1080 ассдссассд асЕЕсдасдд ЕдаЕасЕдЕЕ ддЕсЕддсЕЕ асдЕЕддЕдд саедЕдесаа 1140 сЕдааасаЕЕ сЕасЕддЕдЕ ЕаЕссаддас сасЕссдсЕа ЕЕаассЕдсЕ ддЕЕдсСсЕд 1200 ассаЕддсас асдаасЕддд ЕсаЕаассЕд ддЕаЕдаасс асдасддсаа ссадЕдЕсас 1260 ЕдсддЕдсаа асессЕдЕдЕ ЕаЕддсЕдсЕ аЕдсЕдЕссд аЕсаассаЕс сааассдеес 1320 ЕссдасЕдсЕ сЕаадааада сЕассадасс ЕЕссЕдассд ЕЕаасаассс дсадЕдЕаЕс 1380 ссдаасааас сд 1392 <210> б <211> 1386 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная последовательности <220>
<223> Описание искусственной последовательности: ρ«>ΝΑΤ (аналог профибролазы Α^ίηχίοη СопЮПпх) <400> б аЕдадаЕЕЕс сЕЕсааЕЕЕЕ ЕасЕдсЕдЕЕ ЕЕаЕЕсдсад саЕссЕссдс' аЕЕадсЕдсЕ 60 ссадЕсааса сЕасаасада адаЕдааасд дсасаааЕЕс сддсЕдаадс ЕдЕсаЕсддЕ 120 ЕасЕсадаЕЕ Еадаадддда ЕЕЕсдаЕдЕЕ дсЕдЕЕЕЕдс саЕЕЕЕссаа садсасааас 180 аасдддЕЕаЕ ЕдЕЕЕаЕааа ЕасЕасЕаЕЕ дссадсаЕЕд сЕдсЕааада адааддддса 240 ЕсЕсЕсдада ааадададдс ЕдаадсЕЕСЕ ЕсЕаЕЕаЕсЕ ЕддааЕсЕдд ЕаасдЕЕаас 300 даЕЕасдаад ЕЕдЕЕЕаЕсс аадаааддЕс асЕссадЕЕс сЕаддддЕдс ЕдЕЕсаасса 360 аадЕасдаад аЕдссаЕдса аЕасдааЕЕс ааддЕЕааса дЕдаассадЕ ЕдЕсЕЕдсас 420 *«сдаааааа асаааддЕЕЕ дЕЕсЕсЕдаа даЕЕасЕсЕд ааасЕсаЕЕа сЕссссадаЕ 480 ддсададааа ЕЕасЕасЕЕа сссаЕЕдддЕ даадаЕсасЕ дЕЕасЕасса ЕддЕадааЕс 540 даааасдаЕд сЕдасЕссас ЕдсЕЕсЕаЕс ЕсЕдсЕЕдЕа асддЕЕЕдаа дддЕсаЕЕЕс 600 аадЕЕдсаад дЕдаааЕдЕа сЕЕдаЕЕдаа ссаЕЕддааЕ ЕдЕссдасЕс ЕдаадсссаЕ 660 дсЕдЕсЕаса адЕасдаааа сдЕсдаааад даадаЕдаад ссссааада£ дЕдЕддЕдЕЕ 720 асссаааасЕ дддааЕсаЕа ЕдаассааЕс аадааддссЕ ЕссааЕЕааа сЕЕдасЕаад 780 адаЕсЕЕЕсс сасааадаЕа сдЕасадеЕд дЕЕаЕсдЕЕд сЕдассассд ЕаЕдаасасЕ 840 аааЕасаасд дЕдасЕсЕда сааааЕссдЕ сааЕдддЕдс ассаааЕсдЕ саасассаЕЕ 900 аасдаааЕсЕ асадассасЕ даасаЕссаа ЕЕсасЕЕЕдд ЕЕддЕЕЕдда ааЕсЕддЕсс 960 аассаадаЕЕ ЕдаЕсассдЕ ЕасЕЕсЕдЕа Есссасдаса сЕСЕддсаЕс сЕЕсддЕаас 1020 ЕддсдЕдааа ссдассЕдсЕ дсдЕсдссаа сдЕсаЕдаЕа асдсЕсаасЕ дсЕдассдсЕ 1080 аЕсдасЕЕсд асддЕдаЕас ЕдЕЕддЕсЕд дсЕЕасдЕЕд дЕддсаЕдЕд ЕсаасЕ'дааа 1140 саЕЕсЕасЕд дЕдЕЕаЕсса ддассасЕсс дсЕаЕЕаасс^ЕдсЕддЕЕдс ЕСЕдассаЕд 1200 дсасасдаас ЕдддЕсаЕаа ссЕдддЕаЕд аассасдаЕд~дсаассадЕд ЕсасЕдсддЕ 1260 дсааасЕссЕ дЕдЕЕаЕддс ЕдсЕаЕдсЕд ЕссдаЕсаас саЕссааасЕ дЕЕсЕссдас 1320, ЕдсЕсЕаада аадасЕасса дассЕЕссЕд ассдЕЕааса асссдсадЕд ЕаЕссВ^аас 1380 ааа«сд 1386

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическая композиция, содержащая металлопротеиназный фибринолитический агент, выбранный из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), цинковый стабилизатор и, при необходимости, наполнитель в фармацевтически приемлемом буфере.
  2. 2. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что цинковый стабилизатор представляет собой водорастворимую соль цинка, выбираемую из группы, состоящей из сульфата цинка, ацетата цинка и хлорида цинка.
  3. 3. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что буфер представляет собой лимонную кислоту или водорастворимую соль лимонной кислоты.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой маннит.
  5. 5. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что значение рН составляет около 6,5-8,5.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что она находится в виде замороженной жидкости.
  7. 7. Фармацевтическая композиция по и.6, отличающаяся тем, что она, при необходимости, содержит водорастворимую кальциевую соль.
  8. 8. Фармацевтическая композиция по и.7, в которой водорастворимую кальциевую соль выбирают из группы, состоящей из ацетата кальция, сульфата кальция и хлорида кальция.
  9. 9. Фармацевтическая композиция по π. 1, отличающаяся тем, что она представляет собой лиофилизированную композицию.
  10. 10. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что металлопротеиназа имеет аминокислотную последовательность §Εζ) Ю N0:1.
  11. 11. Водная фармацевтическая композиция, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, выбираемого из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), около 0,08-0,12 мМ сульфата цинка, около 0,008-0,012 мМ ацетата кальция и около 95-110 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, при этом рН указанной композиции примерно равен 7,4.
  12. 12. Фармацевтическая композиция по и. 11, отличающаяся тем, что она содержит 10 мг/мл металлопротеиназы в водном растворе, в состав которого входит 100 мМ лимонной кислоты, 0,01 мМ ацетата кальция и 0,1 мМ сульфата цинка.
  13. 13. Водная фармацевтическая композиция, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, выбираемого из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), около 0,08-0,12 мМ сульфата цинка, около 18-22 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, около 0,02-0,06 мМ Тп8, около 3-6% (в/о) маннита и около 0,008-0,012% (в/о) Т\\ссп 80, при этом рН указанной композиции примерно равен 8,0.
  14. 14. Водная фармацевтическая композиция, пригодная для лиофилизации, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, выбираемого из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), около 0,08-0,12 мМ сульфата цинка, около 18-22 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, около 3-6 мМ Тп5. около 3-6% (в/о) маннита и около 0,008-0,012% (в/о) Т\\ссп 80 и, при необходимости, около 0,1-0,5% (в/о) сахарозы, причём рН указанной композиции примерно равен 8,0.
  15. 15. Фармацевтическая композиция по и. 14, отличающаяся тем, что она содержит 12 мг/мл металлопротеиназы, 5 мМ Тп5. 20 мМ лимонной кислоты, 5% (в/о) маннита, 0,5% (в/о) сахарозы, 0,01% (в/о) Т\\ссп 80 и 0,1 мМ сульфата цинка, причем рН указанной композиции примерно равен 8,0.
  16. 16. Способ приготовления лиофилизированной композиции, включающий следующие стадии:
    (a) составление смеси металлопротеиназного фибринолитического агента, выбираемого из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), цинковой соли, наполнителя, стабилизирующего дисахарида и поверхностно-активного вещества в буфере, и (b) лиофилизация смеси, полученной на стадии (а).
  17. 17. Способ по и. 16, отличающийся тем, что рН указанной комбинации доводят перед лиофилизацией примерно до 7,8-8,2.
  18. 18. Способ по и. 16, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
    (a) доведение значения рН раствора, содержащего соль цинка, наполнитель и стабилизирующий дисахарид, до 7,6-8,2.
    (b) буферный перенос раствора, содержащего металлопротеиназу, в раствор, полученный на стадии (а), а затем добавление эффективного количества поверхностно-активного вещества, и (c) лиофилизация смеси, полученной на стадии (Ь).
  19. 19. Лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная способом по п.18.
  20. 20. Способ лизиса сгустков крови, включающий восстановление водной фармацевтиче ской композиции по п.1, которая была лиофилизирована, и введение восстановленной композиции пациенту, нуждающемуся в лизисе сгустков крови.
  21. 21. Набор для приготовления водной фармацевтической композиции, включающий первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию металлопротеиназного фибринолитического агента, выбираемого из группы, состоящей из фибролазы и тромболитика нового действия (ΝΑΤ), и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый растворитель для лиофилизированной композиции.
EA200200396A 1999-10-01 2000-09-29 Фармацевтические композиции фибринолитического агента EA004627B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/411,335 US6440414B1 (en) 1999-10-01 1999-10-01 Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
PCT/US2000/027022 WO2001024817A2 (en) 1999-10-01 2000-09-29 Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200200396A1 EA200200396A1 (ru) 2002-10-31
EA004627B1 true EA004627B1 (ru) 2004-06-24

Family

ID=23628514

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400182A EA006600B1 (ru) 1999-10-01 2000-09-29 Фармацевтические композиции фибринолитического агента
EA200200396A EA004627B1 (ru) 1999-10-01 2000-09-29 Фармацевтические композиции фибринолитического агента

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400182A EA006600B1 (ru) 1999-10-01 2000-09-29 Фармацевтические композиции фибринолитического агента

Country Status (28)

Country Link
US (4) US6440414B1 (ru)
EP (2) EP1438967A3 (ru)
JP (1) JP2003510369A (ru)
KR (1) KR100717435B1 (ru)
CN (2) CN101209347A (ru)
AT (1) ATE262923T1 (ru)
AU (1) AU769313B2 (ru)
BG (1) BG106578A (ru)
BR (1) BR0014420A (ru)
CA (1) CA2385966A1 (ru)
CZ (1) CZ20021033A3 (ru)
DE (2) DE04007657T1 (ru)
DK (1) DK1220685T3 (ru)
EA (2) EA006600B1 (ru)
ES (2) ES2218228T3 (ru)
HK (1) HK1049112B (ru)
HU (1) HUP0202654A3 (ru)
IL (1) IL148842A0 (ru)
MX (1) MXPA02003197A (ru)
NO (1) NO20021500L (ru)
NZ (4) NZ540967A (ru)
PL (1) PL355016A1 (ru)
PT (1) PT1220685E (ru)
SG (1) SG148823A1 (ru)
SK (1) SK4242002A3 (ru)
WO (1) WO2001024817A2 (ru)
YU (1) YU23302A (ru)
ZA (1) ZA200202400B (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60035260T2 (de) * 1999-02-22 2007-10-18 The University Of Connecticut, Farmington Neue albuminfreie faktor viii formulierungen
US6440414B1 (en) 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6261820B1 (en) 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US7033776B2 (en) 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
US6455269B1 (en) * 1999-12-17 2002-09-24 Amgen, Inc. Method for localized administration of fibrinolytic metalloproteinases
DE10149030A1 (de) * 2001-10-05 2003-04-10 Viscum Ag Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin
DE60305438T2 (de) * 2002-02-01 2006-12-21 Shimoda Biotech (Pty.) Ltd., Mill Park Lyophilisierte pharmazeutische zusammensetzung von propofol
AU2003219787A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Bayer Pharmaceuticals Corporation Formulation strategies in stabilizing peptides in organic solvents and in dried states
US6803046B2 (en) * 2002-08-16 2004-10-12 Bracco International B.V. Sincalide formulations
BRPI0519070A2 (pt) * 2004-12-15 2008-12-23 Amgen Inc composiÇço de fator de crescimento de queratinàcito liofilizada, mÉtodos para preparar um fator de crescimento de queratinàcito liofilizado, e para tratar uma doenÇa, e, kit para preparar uma composiÇço farmacÊutica aquosa
AU2006316005A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Eisai R & D Management Co., Ltd. Process for production of cinnamamide derivative
US8158152B2 (en) * 2005-11-18 2012-04-17 Scidose Llc Lyophilization process and products obtained thereby
WO2008056840A1 (en) * 2006-11-08 2008-05-15 Silla University Industry Academic Cooperation Foundation Fibrinolytic metalloprotease and composition comprising the same
EP1958618A1 (de) * 2007-02-15 2008-08-20 Octapharma AG Verfahren zur Gefriertrocknung mit optimierter Rekonstitution von Biopolymeren
NZ593190A (en) 2008-11-07 2013-01-25 Baxter Int Factor viii formulations
CA2767612A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Thrombogenics Nv Variants of plasminogen and plasmin
CN102000022A (zh) * 2010-11-23 2011-04-06 郑州大学 注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂及其制备方法
WO2012093132A1 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Thrombogenics Nv Plasminogen and plasmin variants
CN103764163A (zh) 2011-08-12 2014-04-30 斯路姆基因公司 纤溶酶原和纤溶酶变体
US20140212405A1 (en) 2013-01-28 2014-07-31 2294719 Ontario Limited Fibrinolytic/Proteolytic Treatment of Myofacial and Neuropathic Pain and Related Conditions
CN107250375A (zh) * 2014-11-06 2017-10-13 科罗拉多州立大学董事会 在血栓溶解剂存在下使用粘弹性分析鉴定新疾病状态
KR20210113271A (ko) * 2019-01-06 2021-09-15 엔도 글로벌 에스테틱스 리미티드 콜라게나제 제형 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2310133A2 (fr) 1975-05-05 1976-12-03 Fabre Sa Pierre Nouveau medicament comportant un activateur du plasminogene perfectionne
WO1982000196A1 (en) * 1980-06-27 1982-01-21 Mitchelson D Movement measuring apparatus and landmarks for use therewith
US4447236A (en) 1982-02-05 1984-05-08 Cordis Corporation Infusion catheter system
US4610879A (en) 1984-01-06 1986-09-09 University Of Southern California Fibrinolytic enzyme from snake vernom
CA1237482A (en) 1984-03-09 1988-05-31 Frank B. Stiles Catheter for effecting removal of obstructions from a biological duct
US4755167A (en) 1984-04-10 1988-07-05 Research Corporation In vivo method for distribution and stirring of therapeutic agents
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4855231A (en) 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4885242A (en) 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
US4818700A (en) 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4812405A (en) 1986-02-18 1989-03-14 Phillips Petroleum Company Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation
US5000185A (en) 1986-02-28 1991-03-19 Cardiovascular Imaging Systems, Inc. Method for intravascular two-dimensional ultrasonography and recanalization
US4848700A (en) * 1987-04-16 1989-07-18 Lockheed John A Canard control system for aircraft
ZA889415B (en) 1987-12-18 1989-09-27 Chiron Corp Compositions and method for recombinant production of crotalidus venum fibrolase
WO1990007352A1 (en) 1989-01-04 1990-07-12 Boston Scientific Corporation Angioplasty catheter
US5222941A (en) 1990-01-12 1993-06-29 Don Michael T Anthony Method of dissolving an obstruction in a vessel
EP0438200B1 (en) 1990-01-16 2002-07-17 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Method for the expression of heterologous genes in the yeast Pichia pastoris, expression vectors and transformed microorganisms
US5709676A (en) 1990-02-14 1998-01-20 Alt; Eckhard Synergistic treatment of stenosed blood vessels using shock waves and dissolving medication
US5250034A (en) 1990-09-17 1993-10-05 E-Z-Em, Inc. Pressure responsive valve catheter
US5167628A (en) 1991-05-02 1992-12-01 Boyles Paul W Aortic balloon catheter assembly for indirect infusion of the coronary arteries
US5380273A (en) 1992-05-19 1995-01-10 Dubrul; Will R. Vibrating catheter
EP0624642B1 (en) 1993-05-12 1999-01-20 Indian Council For Medical Research Novel thrombolytic agent, process for preparing same and its use for the preparation of a thrombi dissolving medicament
US5370653A (en) 1993-07-22 1994-12-06 Micro Therapeutics, Inc. Thrombectomy method and apparatus
US5834028A (en) 1993-12-17 1998-11-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Soluble thrombomodulin-containing composition
US5626564A (en) 1995-03-31 1997-05-06 Creighton University Adjustable sideholes catheter
US6020181A (en) 1995-05-17 2000-02-01 New York Blood, Inc. Inhibition of thrombus formation by medical related apparatus comprising treating with fibrinolytic matrix metalloproteinase
US5830468A (en) 1995-05-17 1998-11-03 The New York Blood Center, Inc. Fibrin(ogen) degradation by fibrinolytic matrix metalloproteinase
US5741779A (en) 1996-05-10 1998-04-21 Xoma Corporation Antithrombotic materials and methods
ATE302599T1 (de) 1996-05-24 2005-09-15 Angiotech Pharm Inc Zubereitungen und verfahren zur behandlung oder prävention von krankheiten der körperpassagewege
US5951981A (en) 1996-12-02 1999-09-14 Diatide, Inc. Thrombolytic agents with antithrombotic activity
US6413760B1 (en) 1997-04-15 2002-07-02 Genetics Institute, Inc. Highly purified mocarhagin cobra venom protease polynucleotides endcoding same and related proteases and therapeutic uses thereof
US6261820B1 (en) 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US6440414B1 (en) 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6455269B1 (en) 1999-12-17 2002-09-24 Amgen, Inc. Method for localized administration of fibrinolytic metalloproteinases
US20020081685A1 (en) 2000-08-03 2002-06-27 Fox Brian A. Disintegrin homologs, ZSNK10, ZSNK11, and ZSNK12

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020053065A (ko) 2002-07-04
EA200400182A1 (ru) 2004-08-26
HUP0202654A2 (hu) 2002-12-28
HK1049112B (zh) 2005-01-21
US20060246053A1 (en) 2006-11-02
KR100717435B1 (ko) 2007-05-14
JP2003510369A (ja) 2003-03-18
EA006600B1 (ru) 2006-02-24
EP1220685A2 (en) 2002-07-10
CN100353999C (zh) 2007-12-12
DE60009529T2 (de) 2005-04-14
US20060263347A1 (en) 2006-11-23
HUP0202654A3 (en) 2003-11-28
US7244426B2 (en) 2007-07-17
CZ20021033A3 (cs) 2003-06-18
BG106578A (bg) 2003-04-30
DE60009529D1 (de) 2004-05-06
NO20021500D0 (no) 2002-03-26
US20020192207A1 (en) 2002-12-19
EP1220685B1 (en) 2004-03-31
DK1220685T3 (da) 2004-08-02
PL355016A1 (en) 2004-03-22
SK4242002A3 (en) 2003-08-05
DE04007657T1 (de) 2005-01-13
NZ518007A (en) 2004-03-26
CA2385966A1 (en) 2001-04-12
HK1049112A1 (en) 2003-05-02
EA200200396A1 (ru) 2002-10-31
BR0014420A (pt) 2002-06-11
US6440414B1 (en) 2002-08-27
AU7743000A (en) 2001-05-10
ES2218228T3 (es) 2004-11-16
NZ550200A (en) 2008-04-30
PT1220685E (pt) 2004-08-31
ZA200202400B (en) 2003-05-28
NZ530959A (en) 2005-08-26
NZ540967A (en) 2007-02-23
IL148842A0 (en) 2002-09-12
SG148823A1 (en) 2009-01-29
ATE262923T1 (de) 2004-04-15
ES2224917T1 (es) 2005-03-16
CN101209347A (zh) 2008-07-02
WO2001024817A2 (en) 2001-04-12
NO20021500L (no) 2002-05-27
CN1402641A (zh) 2003-03-12
MXPA02003197A (es) 2002-09-30
EP1438967A3 (en) 2005-01-26
YU23302A (sh) 2005-06-10
US7138114B2 (en) 2006-11-21
US7311908B2 (en) 2007-12-25
WO2001024817A3 (en) 2001-10-18
AU769313B2 (en) 2004-01-22
EP1438967A2 (en) 2004-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004627B1 (ru) Фармацевтические композиции фибринолитического агента
EP0228862B1 (en) Stabilized human tissue plasminogen activator compositions
US6204036B1 (en) Stable transglutaminase preparations and processes for their production
JPS597693B2 (ja) 抗トロンビン製剤及びその製法
EP0875252A2 (en) Activated protein C formulations
HU195733B (en) Process for preparing a pharmaceutical composition containing tissue plasminogen activator
KR101897534B1 (ko) 건조한 트랜스글루타미나제 조성물
AU2004201694B2 (en) Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
JPH04198195A (ja) Ｃｐｂ―ｉの安定化方法及び製剤組成物
AU2006200638B2 (en) Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
WO1994024273A1 (en) Stable collagenase compositions and methods for their preparation
AU738891B2 (en) Stable transglutaminase preparations and process for producing them

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU