EA000632B1

EA000632B1 - Средство противоинфекционного, противовоспалительного и противоопухолевого действия

Info

Publication number: EA000632B1
Application number: EA199800424A
Authority: EA
Inventors: Олег Викторович Травкин; Елена Владимировна Яковлева
Original assignee: Олег Викторович Травкин; Елена Владимировна Яковлева
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1996-04-11
Publication date: 1999-12-29
Also published as: RU2118532C1; WO1997002034A1; EA199800424A1; AU6536796A

Description

Область техники

Изобретение относится к области медицины, к биологически активным веществам, получаемым химическим путем, конкретно - к производным акридона и моносахаридов, и предназначено для применения в качестве противоинфекционного, противовоспалительного и противоопухолевого средства широкого спектра биологического действия.

Предшествующий уровень техники

Основу современной проитивоинфекционной химиотерапии составляют два типа лекарственных средств [Л 1]:

- средства для прямого избирательного подавления узловых стадий репродукции микроорганизмов, развития опухолей, в основном представляющие собой природные, полу- или полностью синтетические соединения (антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны, цитостатики и др.) [Л 2, 3, 4, 5];

- антимикробные средства широкого спектра действия, одновременно подавляющие воспроизведение многих видов микроорганизмов и новообразований, но косвенным путем, через воздействие на иммунную систему больного, в связи с чем их называют иммуномодуляторами. При этом детали строения генома, ферментов и мембран чужеродных агентов не имеют принципиального значения.

Это, например, первый из достоверно выявленных стимуляторов иммунитета 1-(-)2,3,5,6-тетрагидро -6-фенил-имидазо -(2,1 )-тиазола гидрохлорид, первоначально используемый в медицинской практике в качестве антигельминтного средства, под названием декарис (левамизол).

Как показали исследования, данное соединение обладает исключительно широким иммуномодулирующим действием и с успехом используется в настоящее время в качестве вспомагательного лекарственного средства при ряде иммунодефицитов [Л 6].

Известен также ряд высокомолекулярных иммуностимуляторов на основе полисахаридов и нуклеиновых кислот, например полигуаниловой и полиинозиловой кислот [Л 7].

Необходимо также указать 2,7-бис[2(диэтиламино)-этокси] -флюорен-9-он дигидрохлорид (тилорон), который проявляет иммуностимулирующее действие при лечении ряда экспериментальных инфекций (модель - белые мыши) [Л 8,9].

Дальнейшие исследования позволили выявить интерферониндуцирующую активность (один из видов стимуляции иммунитета), у целого ряда гетероциклических низкомолекулярных соединений, например, у 3-амино-7(диметиламино)-2-метил-5-хлор-фенотиазина [Л 10].

Представляют значительный интерес попытки ряда авторов получить иммуномодуляторы на основе моносахаридов с аминокислотными заместителями [Л 11], теоретическое обоснование - [Л 12].

Второй из представленных типов лекарственных средств (иммуномодуляторы), с нашей точки зрения, значительно более интересен, так как использование таких химических и биологических соединений, во-первых, не вызывает привыкания к ним микроорганизмов (что в значительной степени присуще средствам первого типа, обусловливая кратковременность эффективного их использования в медицинской практике 1,5-3 года), и во-вторых, основывается на мобилизации резервных иммунных сил организма больного.

Традиционно иммуномодуляторы разделяют на две основных группы: а) высокомолекулярные (полисахариды, полинуклеотиды и др.), их молекулярная масса превышает 1500. б) низкомолекулярные (некоторые аномальные моносахариды, нуклеозиды и другие гетероциклы). Их молекулярная масса, обычно не превышает 1 000.

Наиболее перспективными иммуномодудяторами считаются низкомолекулярные, поскольку они, как правило, не вызывают аллергических побочных реакций.

К настоящему времени исследовано большое число низкомолекулярных иммуномодуляторов в качестве потенциальных фармакологических средств для лечения ряда вирусных, бактериальных и грибковых инфекций, а также выявления их опосредованного цититоксического и противовоспалительного действия.

Основные недостатки исследованных препаратов сводятся к следующему:

- высокая токсичность и наличие кумулятивного эффекта при многократном использовании;

- высокая активность в отношении только одной из групп микроорганизмов, что делает их малоэффективными при смешанных инфекциях;

- широкий спектр фармакологической активности при невысокой эффективности делает их пригодными только в качестве вспомогательных лекарственных средств для усиления действия основных (например, антибиотиков).

- низкая стабильность при длительном хранении в растворах, что является причиной неоднозначности результатов фармакологических испытаний. Несмотря на перечисленные недостатки, в последние годы проведены многочисленные исследования, позволившие наметить ряд интересных подходов к решению проблемы по созданию эффективных низкомолекулярных иммуномодуляторов, способных найти применение в медицине в качестве лекарственных средств.

) В первую очередь, следует отметить производные акридона: Ы-метилен-карбокси-9акридон (акридонуксусная кислота, СМА).

В виде натриевой соли СМА известен под названиями камедон (неовир). Препарат показал высокую активность при лечении ряда заболеваний вызванных как ДНК-, так и РНК- содержащими вирусами, например вирусами герпеса HSV 1 и HSV 2, лихорадки долины Рифт, леса Семлики, венесуэльского энцефалита лошадей и др.

К сожалению, высокая активность препарата наблюдается только при лечении ряда вирусных заболеваний, в отношении большинства бактериальных, грибковых и смешанных инфекций препарат не эффективен [Л 13, 14, 15].

2) Представляют также значительный интерес некоторые монозамещенные эфиры моносахаридов: 3-О-(Ч№диметиламино-н-пропил)1,2:5,6-ди-О-изопропилиден-а,П -глюкофуранозы гидрохлорид (SM-1213), а также некоторые 6-О-алкиламинопроизводные D-галактипиранозы, описанные в патентах США, Великобритании, Германии, Японии [Л 16-21].

Эти соединения имеют относительно широкий спектр биологического действия (достоверно установлено: противовоспалительное, противоопухолевое и противовирусное действие), но недостаточную эффективность.

Это требует использования высоких доз таких препаратов для лечения заболеваний, что крайне нежелательно, из-за появления побочных эффектов, связанных с токсическим действием [Л 22].

3) Следует отметить, соединение: хлоргидрат Ν,Ν-диметиламиноэтилового эфира Nметилен-карбокси-9-акридона [Л 23], которое представляет интерес в качестве попытки объединить близкие по структуре фрагменты препаратов SM-1213 и СМА, представленных выше (HN-диметиламиноэтил- радикала и акридонового цикла). Это позволило получить препарат принципиально пригодный для перорального использования, хотя и с несколько сниженными иммуномодулирующими свойствами.

4) Интересная попытка модернизации СМА проведена авторами патента России [Л 24]. В результате проведенной работы, удалось получить соль СМА с природным аминосахаром (D-глюкамином). От натриевой соли СМА полученное соединение отличается более мягкими интерферониндуцирующими свойствами. Кроме того, по утверждению создателей, препарат обладает противовирусной, в том числе анти-ВИЧ, антипаразитарной, антипромоторной и радиопротекторной активностями.

К сожалению оказалось, что парентеральная лекарственная форма этого препарата отличается низкой стабильностью в растворах, что по видимому связано с инверсией D-глюкамина в водных растворах, переходящего в пять близких по строению аминомоносахаридов.

Приведенный краткий обзор современного состояния проблемы по созданию иммуномодулирующих средств показывает, что в целом она еще далеко не решена. Каждый из перечисленных выше препаратов имеет ограничения при его практическом использовании.

Раскрытие изобретения

Сущностью настоящего изобретения является создание лекарственного средства, совмещающего полезные качества акридонуксусной кислоты и монозамещенных эфиров моносахаридов (высокая эффективность первых, при широте спектра фармакологической активности, вторых).

Наиболее близки к заявляемому лекарственному средству - монозамещенные эфиры моносахаридов, имеющие общую формулу

S-O-Y, где S - моносахарид (пентозы, гексозы, гептозы),

Y - органический радикал общей формулы: -R₁-N-R₂

R3 где Ri - органический радикал с количеством углеродных атомов от 1 до 7;

R₂ и R₃ - атом водорода, галогена, тио-, гидроксигруппы, моновалентный органический радикал с количеством углеродных атомов от 1 до 7; описанные в патенте США № 4017608 [Л 16], опубликован 12.04.77.

Они выбраны нами в качестве прототипа по наибольшему структурному сходству и основному (базовому) элементу химического соединения.

Как уже было отмечено выше, при всех положительных свойствах прототипа, (широта спектра фармакологической активности), оно имеет недостаточно высокую эффективность и требует использования высоких доз препарата и длительного курса лечения, что исключает возможность применения этих соединений при тяжелой быстроразвивающейся патологии.

Задача изобретения - получение нового лекарственного средства, обеспечивающего уменьшение перечисленных выше недостатков, т. е. повышение активности против широкого круга заболеваний (противовирусное, противоопухолевое и противовоспалительное действие), другими словами, уменьшение необходимых доз препарата и курса лечения, а также - расширение области применения за счет появления выраженной противобактериальной и противовогрибковой активности, получение препарата, обладающего низкой токсичностью, высоким индексом терапевтического действия и стабильного при длительном хранении в растворах.

Поставленная задача решается получением новых химических соединений - солей акридонуксусных кислот и монозамещенных эфиров моносахаридов общей формулы:

где

X и Z - -ОН, -Н, -СН₂-ОН или группа Н₂с - о - с - сн₃

I / х

- НС - о ⁴ сн₃

W - -Н, алкил-, бензил -, (Z и W, Х и W) или Z и W; (Z и W, OW и W) или Z и W вместе образуют группу

- С - О х \

Н₃С СН₃

R(1), R(2) - -Н, галоген, алкил-, карбокси-, оксиалкил- или оксиарилгруппы, n=1-4;

R(3), R(4) - -Н, алкил-, или R(3) и R(4) вместе с атомом азота образуют морфолиновый, пиперидиновый или пиридиновый гетероцикл.

Лучшая реализация заявляемого средства, по мнению авторов:

А) - при использовании в качестве аниона N-акридонуксусной кислоты, а в качестве катиона 1,2:5,6-ди-О-изопропилиден 3-O(NNдиметиламино-н-пропил)а^-глюкофуранозы, с образованием соединения формулы

Это соединение представляет собой частный случай общей формулы (1).

Брутто формула - С₃₂И₄^₂О₉.

Молекулярная масса 598,94.

Химическое название: 1,2:5,6-ди-Oизопропилиден-3-О-^^-диметиламино-нпропил)-а^-глюкофуранозы 10'-метиленкарбоксилат-9'-акридон.

Б) при использовании в качестве аниона 3хлор-10-метиленкарбоксилат-9-акридон, а в качестве катиона 1,2:3,4-ди-О-изопропилиден 6О(^ N -диметиламиноэтил) α, D - галактопиранозу, с образованием соединения формулы:

Это соединение представляет собой частный случай общей формулы (2).

Брутто формула С₃₁Н₃^₂О₉С1 Молекулярная масса 61 9,11.

Химическое название: 1,2:3,4-ди-О-изопропилиден-6-О-^^-диметиламиноэтил)-а^галактопиранозы-3 '-хлор-10'-метиленкарбоксилат-9'-акридон.

Сущность изобретения поясняется ниже. Приведены 7 таблиц сравнительных испытаний заявляемого средства.

Таблица 1 - сравнительная характеристика видов активностей заявляемых соединений и исходных компонентов.

Таблица 2 - результаты изучения заявляемых препаратов на модели экспериментальной оспенной инфекции в сравнении с прототипом, камедоном и рибамидилом.

Таблица 3 - результаты изучения заявляемых препаратов на модели экспериментальной лихорадки долины Рифт в сравнении с прототипом, натрия 3-хлор^-карбоксиметил-9акридоном и рибамидилом.

Таблица 4 - влияние введения заявляемых препаратов на показатели, характеризующие противогрибковую активность макрофагов в отношении Candida albicans.

Таблица 5 - сравнительное изучение антибактериальной активности заявляемых соединений, прототипа и акридонового составляющего.

Таблица 6 - влияние заявляемых препаратов на рост солидной злокачественной опухоли Эрлиха в сравнении с прототипом и акридоновым компонентом.

Таблица 7 - влияние заявляемых препаратов на рост лейкоза Р-388 в сравнении с прототипом и акридоновым компонентом.

Заявители провели синтез всех вышеуказанных соединений. В общем виде он проводится следующим способом.

Эквимолекулярные количества обоих компонентов смешиваются в безводном ацетоне, смесь кипятят с обратным холодильником в течение 20-40 мин, предохраняя от попадания влаги. Полученный прозрачный раствор упаривают в вакууме, до объема, необходимого для выпадения осадка соли. Выпавший осадок отделяют фильтрацией, высушивают и затем перекристаллизовывают из безводного метанола. Перекристаллизованный осадок высушивают в вакууме при температуре не выше 35°С. Какойлибо существенной разницы в технологическом процессе получения различных солей общей формулы (1) и (2) не выявлено. Как правило, полученные соединения представляют собой крупные гигроскопичные кристаллы светложелтого цвета, хорошо растворимые в воде, диметилацетамиде, диметилсульфоксиде, глицерине, горячем этаноле, мало растворимы в эфире и хлороформе, практически нерастворимы в углеводородах.

Синтезированные соединения полностью охарактеризованы методами элементного анализа, тонкослойной хроматографии в ряде систем растворителей и измерениями УФ-; ИК-; и ЯМР- (Н¹ и С¹³)-спектрометрии.

Все полученные соли хорошо растворимы в воде и являются удобными для изготовления всех типов лекарственных форм.

Растворы полученных лекарственных форм имеют значения рН, близкие к физиологическим, стабильны при хранении в растворах в течение 1,5-2,0 лет (срок наблюдения), 20°С, без доступа света.

В результате изучения заявляемых химических соединений определены пороги токсических действий препаратов на организм, как по интегральному показателю - гибели животных, так и по воздействию на основные, жизненно важные системы: кровь, СС и ЦНС. Показано, что эти препараты не вызывают гемолиза эритроцитов. Внутримышечное и внутривенное применение их в дозах 10-100 мг/кг не оказывают отрицательного воздействия на гемодинамику, деятельность сердца и ЦНС. В дозах 300 мг/кг ни одно из заявляемых соединений не вызывало гибели животных и проявления токсического действия у мышей и крыс.

Эти препараты не обладают выраженными кумулятивными свойствами.

Внутривенное введение препаратов крысам в возрастающих дозах в хронических экспериментах не приводило к накоплению токсического эффекта (коэффициент кумуляции больше

5).

При внутримышечном введении соединения быстро всасываются в кровь, достигая максимальных концентраций через 20-50 мин.

Период полувыведения их (Т 50%) составляет, как правило 100-130 мин, элиминируются из организма главным образом за счет почечной экскреции. Через 24 ч после внутривенных инъекций в дозах 1 0-1 00 мг/кг они практически полностью выводятся и в крови либо совсем не определяются, либо присутствуют в следовых количествах.

Вещества А и В вводили ежедневно в течение 1 5 и 30 дней внутримышечно и внутривенно кроликам и собакам в дозах 10 и 50 мг/кг. Это не сказалось на состоянии животных, их массе тела, картине крови, функции печени, почек, поджелудочной железы, деятельности сердца и не сопровождалось выраженными патоморфологическими изменениями внутренних органов. Препараты А и В при всех способах введения не оказывали местно-раздражающего и пирогенного действий.

LD₅₀ синтезированных соединений были в 2-2,5 раза ниже, чем сумма LD₅₀ составляющих их компонентов, взятых в отдельности.

Как показали опыты, указанные вещества не обладают эмбриотоксическим и тератогенным действием при введении в течение всего периода беременности крысам в дозах, в 1 0 и 1 00 раз превышающих терапевтические.

Все полученные результаты подтверждают, что заявляемые химические соединения обладают низкой токсичностью, не вызывают выраженных побочных эффектов, хорошо переносятся больными, имеют высокий терапевтический индекс 50-100 и более, что позволяет использовать данные вещества в широком интервале доз.

Неожиданно оказалось, что полученные соединения в опытах на животных и культуре тканей проявили ярко выраженную противобактериальную и противогрибковую виды активностей, не обнаруживаемые, как у производных акридонуксусной кислоты, так и у монозамещенных эфиров моносахаридов, что позволяет использовать эти вещества в качестве потенциальных универсальных лекарственных средств при смешанных инфекциях.

Также было выявлено усиление противовирусных свойств:

индекс защиты (ИЗ) животных, инфицированных 10-100 LD₅₀ как РНК-, так и ДНКгеномными вирусами, составлял 70-85 % как при лечебно-профилактической, так и при лечебной схеме введения этих препаратов.

Исследование противовоспалительной активности синтезированных соединений, проведенное на модели заживления полнослойных кожных ран и серотонинового отека (эксудативная фаза воспаления), показало высокую эффективность этих препаратов.

Исследование противоопухолевой активности на модели перевиваемых опухолей (солидные опухоли: рак Эрлиха, меланома В-16 и асцитный лейкоз Р-388) позволяет констатировать наличие у данных соединений противоопухолевой активности. Отсутствие дозозависимого ответа на введение заявляемых препаратов, заставляет предполагать, что они не являются прямыми цитостатическими агентами, а эффективно воздействуют на замедление роста опухолей через иммунную систему организма.

Сравнительная характеристика видов активностей заявляемых соединений и исходных соединений приведена в таблице 1 .

Примеры конкретных способов получения заявляемых соединений приведены ниже.

Пример 1 .

г 3-О-(И,И,-диметиламино-н-пропил)1,2:5,6-ди-О-изопропилиден-аЦ-глюкофуранозы, представляющей собой прозрачную вязкую гидрофобную жидкость, смешивают с 14,5 г Nакридонуксусной кислоты в 150 мл безводного ацетона. Смесь нагревают до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. За это время осадок N-акридонуксусной кислоты полностью растворяется, смесь становится гомогенной. Раствор концентрируют в вакууме до общего объема 95 мл, охлаждают до +5°С, выдерживают при этой температуре в течение 7 ч. Выпавший осадок фильтруют и высушивают. Полученный светло-желтый крупнокристаллический осадок перекристаллизовывают из безводного метанола (1/3), отделяют от раствора фильтрацией и высушивают в вакууме (5 мм. рт. ст.), при температуре не более 32°С. Получают 29 г (выход- 84%) конечного продукта.

Химическое название: 3-О-(К^диметиламино-н-пропил)-1,2:5,6-ди-О-изопропилиден9 аЩ-глюкофуранозы Ы-метиленкарбоксилат-9'акридон.

Брутто формула С₃₂Н ^N^Oy.

Чистота (хроматографически) 98,5%.

Молекулярная масса 598,76.

Элементный анализ: вычислено: С 64,19; H 7,08; N 4,71; найдено: С 64,26; Н 7,15; N 4,63.

Данные ЯМР- (Н 1); DMSO (d δ):

1.1- 1,5м.д. - 4 группы -СН₃ в диоксолановых циклах дают 3 синглета: (1,25 м.д.; s(6^); (1,31 м.д.; s(3H)); (1,40 м.д.; б(3Н)).

1.5- 3,7 м.д. - область сигналов протонов N.N.-диметиламинопропил - заместителя: -N(CH3)2 (2,47 м.д.; s (6H)); -CH2-N (2,78 м.д.; К2Н)); -CH₂- (l,78 м.д.; q(2H)); -CH₂-O-(3,3-3,7 перекр. m).

3.5- 6,0 м.д. - область сигналов протонов глюкофуранозы: Н3-Н6 (3,5-4,5 м.д.; m); Н2 (4,62 м.д.; d (1Н)); H1 (5,83 м.д. d(1H));

4,98 м.д. - область сигналов протонов Nметиленкарбокси - заместителя: (s(2H));

7.2- 8,5 м.д.- область сигналов ароматических протонов акридона (7,35 м.д.; К2Н)); (7,7 м.д.; d(2H)); (7,83 м.д.; t(2H)); (8,4 м.д.; d(2H)).

Пример 2.

г 6-О-(НН-диметиламиноэтил)-1,2:3,4ди-О-изопропилиден-аЩ-галактопиранозы, представляющей собой прозрачную вязкую гидрофобную жидкость, смешивают с 21,6 г 3хлор-И-акридонуксусной кислоты в 170 мл безводного ацетона. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 40 мин. За это время осадок 3-хлор-И-акридонуксусной кислоты полностью растворяется, раствор становится прозрачным. Реакционную массу упаривают в вакууме до общего объема 80 мл, охлаждают до 0°С, выдерживают при этой температуре в течение 2 ч. Образовавшийся осадок фильтруют и высушивают. Полученный крупнокристаллический осадок желто-зеленого цвета перекристаллизовывают из безводного метанола (1/3), отделяют от раствора фильтрацией и высушивают в вакууме ( 5 мм. рт.ст.) при температуре не более 25°С. Получают 41,5 г (выход 89%) конечного продукта.

Химическое название:

6-О-^^-диметиламиноэтил)-1,2:3,4-ди-Оизопропилиден-аЦ-галактопиранозы 3'-хлор-Иметиленкарбоксилат-9'-акридон.

Брутто формула С^Н^^ОдСР

Чистота (хроматографически) 98%.

Молекулярная масса 619,11.

Элементный анализ: вычислено: С 60,14; Н 6,35; N 4,52; Cl 5,73; найдено: С 60,05; Н 6,41; N 4,63; Cl 5,70.

Данные ЯМР- (Н 1); DMSO (d δ):

1,15-1,5 м.д. - 4 группы -СН₃ в диоксолановых циклах дают 3 синглета: (1,23 м.д.^(6Н)); (1,37 м.д.;8(3Н)); (1,48 м.д.;8(3Н));

2.3- 3,7 м.д.- область сингалов протонов

НН-диметиламинэтил-заместителя: -N(CH₃)₂ (2,5 м.д.; s(6H)); -CH₂-N и -dI₂-O- (2,7-3,5 перекр. m);

3,5-6,0 м.д. - область сигналов протонов галактопиранозы: Н2-Н6 (3,5-4,8 м.д.; m); H1 (5,71 м.д. d(1H));

5,0 м.д. - область сигналов протонов Nметиленкарбокси-заместителя: (s (2H));

7.2- 8,6 м.д. - область сигналов ароматических протонов акридона.

Пример 3.

г 3-О-(1'-этил-2'-(N-морфолинил)-1,2-Oизопропилиден-аЩ-глюкофуранозы, представляющей собой прозрачную вязкую жидкость, смешивают с 19,5 г 3-хлор-6-метил-И-акридонуксусной кислоты в 250 мл безводного ацетона. Смесь нагревают до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 20 мин.

Полученный прозрачный раствор упаривают в вакууме до общего объема 1 00 мл, охлаждают до 0°С, выдерживают при этой температуре в течение 4 ч. Образовавшийся осадок фильтруют, высушивают и перекристаллизовывают из безводного метанола (1/3), отделяют от раствора фильтрацией и высушивают в вакууме (5 мм. рт.ст), при температуре не более 25°С. Получают 36,7 г (выход 88,4 %) конечного продукта.

Химическое название: 3-O-(1'-этил-2'-(Nморфолинил))-1,2-O-изопропилиден-α,D-глюкофуранозы 3 -хлор-6-метил-Ы-метиленкарбо ксилат-9 -акридон.

Брутто формула С^Н^^О^О.

Чистота (хроматографически) >98%.

Молекулярная масса 635,17.

Элементный анализ: вычислено: С 58,62; Н 6,20; N 4,41; Cl 5,58; найдено: С 58,73; Н 6,21; N 4,37; Cl 5,62.

Данные ЯМР- (Н 1); DMSO (d δ):

1.2- 1,5 м.д. - 2 группы -СН₃ в диоксолановом цикле дают 2 синглета, интенсивностью в 3 протона, каждый; 1,5-3,9 м.д.- область сигналов протонов N -этилморфолинил-заместителя: -CH2-N- и -CH2-N-CH2- морфолина (2,7 - 3,1 м.д.; m (6Н)); -СЩ-O- и - -CH₂-N-CH₂- морфолина (3,6-3,9 перекр. m).

3,5-6,0 м.д. - область сигналов протонов глюкофуранозы: Н3-Н6 (3,5-4,3 м.д.; m); Н2 (4,7 м.д.; а(1Н)); H1 (5,8 м.д. d(1H));

4,99 м.д. - область сигналов протонов Nметиленкарбокси-заместителя: (s (2H));

7,0-8,5 м.д. - область сигналов ароматических протонов акридона.

Пример 4.

г 3-O-(N,N,-диэтиламино-(2'-изобутил)1,2-O-изопропилиден-α,D-аллофуранозы, представляющей собой прозрачную желтоватого цвета вязкую жидкость, смешивают с 12,8 г 2'карбокси-N -метиленкарбоксилат-9 '-акридонуксусной кислоты в 1 00 мл безводного ацетона. Смесь нагревают до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 20 мин. Далее поступают аналогично способу приведенному в примере 2. Получают 21г (выход-75,5 %) конечного продукта.

Химическое название: 3-О-(Х,Х-диэтиламино-(2'-изобутил)-1,2-О-изопропилиден-а,Пглюкофуранозы 2-карбокси-Ы-метиленкарбоксилат-9-акридон.

Брутто формула 0₃₃Η₄₄Ν₂0₁₁.

Чистота (хроматографически) 98%.

Молекулярная масса 644,83.

Элементный анализ: вычислено: С-61,47; Н 6,88; N 4,36; найдено: С-61,35; Н 6,91; N 4,42.

Пример 5.

г 1-О-этил-5-О-(1'-бутил-4'-^-пиридинил)- α,Ό-рибофуранозид смешивают с 25,5 г 2оксиэтил-7-карбоксиэтил N -акридонуксусной кислоты в 150 мл безводного ацетона, с обратным холодильником в течение 40 мин. Далее поступают аналогично способу, приведенному в примере 2. Получают 43,5 г. (выход 78%) конечного продукта.

Химическое название: 1-О-этил-5-О-(1'бутил-4'-^-пиридинил)) α,Ό-рибофуранозида 2 -оксиэтил-7-карбоксиэтил N -метиленкарбоксилат-9-акридон.

Брутто формула С₃₆Н₄₅^Оц.

Чистота (хроматографически) 97%.

Молекулярная масса 681,83.

Элементный анализ: вычислено: С 63,41; Н 6,67; N 4,11; найдено: С-63,49; Н 6,58; N 4,12.

Пример 6.

г 5-O-бензил-3-O-(1'-этил-2'-(N-пиперидинил)-1,2-O-изопропилиден-α,D-ксилофуранозы смешивают с 74,2 г 2-(1'-этил-2'-бензилокси) N-акридонуксусной кислоты в 350 мл безводного ацетона. После кипячения в течение 20 мин, раствор упаривают в вакууме до объема 180 мл. Далее поступают аналогично способу, приведенному в примере 2.

Получают 122 г (выход 82 %) конечного продукта.

Химическое название: 5-О-бензил-3-О-(1'этил-2'-(N-пиперидинил)-1,2-O-изопропилиденα,Ό-ксилофуранозы 2-( 1 '-этил-2' -бензилокси) ^метиленкарбоксилат-9 -акридон.

Брутто формула С₄₆Н₅₄^О₉ .Чистота (хроматографически) 97%. Молекулярная масса 779,02. Элементный анализ: вычислено: С 70,92; Н 7,00; N 3,60; найдено: С 70,47; Н 7,05; N 3,66.

Промышленная применимость

Изучение противовирусной активности заявляемых препаратов проводилось на экспериментальной ортопокс-вирусной инфекции, вызванной у хлопковых крыс (массой 50-70 г) интраназальным введением вируса вакцины (штамм Л-ИВП) с инфекционной активностью 1,6 х 10(9) ООЕ/мл.

Для стандартизации условий опыта заражение во всех случаях проводили постоянной дозой вируса, равной 10 LD₅₀.

Препараты вводили в дозе 50 мг/кг крысам за 4 ч до и на вторые сутки после заражения лабораторных животных, применяя внутримышечный и внутрибрюшинный методы введения.

Эксперименты считались достоверными только при 100% гибели животных в контроле. В каждом опыте в качестве референс-препарата использовали рибамидил (виразол), который давали крысам перорально в дозе 1 00 мг/кг по стандартной лечебно-профилактической схеме.

Результаты изучения приведены в таблице

2. Из данных таблицы 2 следует сделать выводы, что заявляемые соединения проявляют высокую противовирусную активность, особенно выраженную при внутримышечном введении препарата (ИЗ=80 %), и являются перспективными противовирусными препаратами, значительно превосходящими прототип, камедон и рибамидил (референс-препарат).

Эффективность заявляемых препаратов при экспериментальной лихорадке долины Рифт исследовалась на белых беспородных мышах массой 1 0-1 2 г при подкожном заражении и на белых крысах массой 35-50 г, инфицированных внутрибрюшинно. Для воспроизводства инфекции использовали вирулентный штамм вируса лихорадки долины Рифт, пассированный в многослойных культурах клеток GMK. Оценку эффективности проводили на мышах, инфицированных дозами вируса 25-50 БОЕ, и крысах, зараженных дозой вируса 250 БОЕ, препараты вводили внутрибрюшинно по схеме экстренной профилактики (через 2 ч после заражения и затем 1 раз в сутки в течение 3 дней). Эксперименты считались достоверными только при 1 00% гибели животных в контроле. В опыте в качестве референс-препарата использовали рибамидил (виразол), который вводили животным в дозе 1 00 мг/кг по той же схеме.

Результаты изучения заявляемых препаратов на модели экспериментальной лихорадки долины Рифт приведены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 следует, что заявляемые соединения проявляют исключительно высокую противовирусную активность на модели экспериментальной лихорадки долины Рифт, значительно превосходящую активности исходных компонентов.

Противогрибковую активность заявляемых препаратов 3-О-(НН-диметиламино-н-пропил)1,2:5,6-ди-O-изопропилиден-α,D-глюкофуранозы ^метиленкарбоксилат-9-акридон (1 в таблице 4) и 3-O-(N,N,-диэтиламино-(2'-изобутил)1ДЮ-изопропилиден-аЩаллофуранозы 2 карбокси-N-метилен-карбоксилат-9 -акридон (2 в таблице 4) изучали на белых беспородных мышах. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозах: 25, 50 и 75 мг/кг массы тела животного. В качестве препаратов сравнения в опытах использовали 3-O-(N,N,-диэтиламино-(2'-изобутил)-1,2-O-изопропилиден-α,D-аллофуранозу (3 в таблице 4), являющуюся прототипом, и 2'карбокси-Ы-метиленкарбоксилат-9-акридон (4 в таблице 4), компонент, входящий в соединение (2), в дозах 25 и 75 мг/кг. Взвесь клеток С. albicans ( штамм N13, выращенных на среде Сабуро при 37°С в течение 2 суток), приготовленных по стандарту 50 млн., через 1 ч, вводили по 1 мл суспензии мышам, получавшим испытуемые препараты.

У животных через 7 ч после введения C.albicans осуществляли экстирпацию сальников и готовили пленочные препараты, которые окрашивали с помощью PAS- реакции. Затем подсчитывали число дрожжевых клеток с ростовыми трубочками в камере Г оряева.

Результаты исследований представлены в таблице 4. Как видно из данных таблицы 4, размножение возбудителя в пленках сальника животных, получавших препараты (1) и (2), резко снижалось по сравнению с контролем. Наиболее выраженное снижение вегетации Calbicans отмечено через 7 ч после внутибрюшинного введения в дозах 25 и 50 мг/кг, что свидетельствуют о противогрибковой эффективности заявляемых соединений, тогда как соединение (3), являющееся прототипом, не проявило достоверных противогрибковых свойств. Соединение (4) также оказалось неактивным.

Антибактериальное действие заявляемых препаратов изучено на модели хронического стафилококкового сепсиса, вызванного внутривенным введением золотистого стафилококка штамм 5а. Мышам вводили внутримышечно препараты в разовых дозах 25 и 50 мг/кг по лечебной (1 раз в сутки, в течение 5 дней), и по лечебно-профилактической схеме: за 2-суток до заражения, и продолжали в течение 5 суток после заражения.

По истечении срока терапии животных забивали, иссекали почки, гомогенизировали и производили высев на агар Чистовича для учета количества клеток St.aureus. Через 72 ч инкубации при 37°С определяли количество выросших колоний стафилококка.

Результаты сравнительного изучения антибактериальной активности заявляемых соединений приведены в таблице 5. Уровень обсемененности почечной ткани мышей, получавших заявляемые соединения, снизился более чем в 1 0 000 - 1 00 000 раз по сравнению с контролем, у прототипа также обнаружена слабо выраженнная противобактериальная активность, значительно меньшая, чем у заявляемых соединений, у акридонового составляющего активность не выявлена.

Влияние заявляемых синтезированных соединений:

1. 3 -O-(N,N-диметиламино-н-пропил)

1,2:5,6-ди-O-изопропилиден-α,D-глюкофуранозы-Ы-карбоксиметилакридон;

2. 1 -O-этил-5 -O-( 1 '-бутил-4 '-(N -пиридинил)- а.П-рибофуранозида 2 -оксиэтил-7карбоксиэтил ^метиленкарбоксилат-9-акридон в сравнении с

3. 1 -О-этил-5 -О-( 1 '-бутил-4 '-(N -пиридинил)- а.П-рибофуранозой (прототип);

4. 2-оксиэтил-7-карбоксиэтил N-метиленкарбоксилат-9-акридоном (акридоновым компонентом вещества (2) на рост перевиваемых опухолей изучали на моделях:

1. Солидная злокачественная опухоль Эрлиха (РЭ) - таблица 6;

2. Асцитный лейкоз Р-388 - таблица 7.

Солидную опухоль (РЭ) перевивали в подушечку задней лапы мышей-самцов, весом 1820 г линии SHR и С57В1, соответственно в количестве 10(6) клеток РЭ. Лейкоз Р-388 перевивали внутрибрюшинно мышам-самцам линии DBA в количестве 10⁶ клеток. Начиная с 3-го дня прививки РЭ (ко времени формирования опухоли и ее стромальных элементов) и со 2-го дня после прививки Р-388, мышам контрольных групп ежедневно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физраствора, а животным подопытных групп вводили препарат в дозах 20, 100 и 250 мг/кг. Как следует из представленных результатов (таблицы 6 и 7), заявляемые соединения обладают ярко выраженной способностью к торможению роста перевиваемых опухолей и по своей активности значительно превосходит прототип и акридоновый компонент. Результаты, приведенные в таблицах 2 - 7, убедительно подтверждают достижение поставленной фармакологической цели -усиление фармакологической активности и расширение спектра показаний нового препарата.

Из вышеизложенного следует, что получены новые химические соединения - соли монозамещенных эфиров моносахаридов и производных акридонуксусной кислоты, являющиеся эффективными терапевтическими препаратами, при этом с широким спектром биологической активности, в том числе активностью, неизвестной для соединений прототипа - антимикотической.

Приведенные способы синтеза данных соединений легко осуществимы в промышленных масштабах, не требуют дефицитного сырья и нестандартного оборудования. Учитывая все это, начата разработка на их основе лекарственных форм для парентерального, перорального и наружного использования.

Таблица 1. Сравнительная характеристика видов активностей заявляемых соединений и исходных компонентов

Виды фармакологической активности	Акридонуксусные кислоты	Монозамещенные эфиры моносахаридов	Заявляемые соединения
Противовирусная: ДНК-геномные вирусы	+	+	++
РНК-геномные вирусы	+	+	++
Противобактериальная, Е. coli, St. Aureus		+	+
Противогрибковая	-	-	+
Противовоспалительная	-	+	+
Противоопухолевая	+	+	++

- активность не выявлена + активность выражена ' +_ активность слабо выражена ++ активность ярко выражена

Таблица 2. Результаты изучения заявляемых препаратов на модели экспериментальной оспенной инфекции в сравнении с прототипом, камедоном и рибамидилом

Препарат	Схема введения	Доза,мг/кг	Метод введения	Индекс защиты
3-O-(N,N-Диметиламино-н-пропил1,2:5,6-ди-O-изопропилиден a,Dглюкофуранозы N-карбоксиметилакридон	двукратно: за 4 ч до и на вторые сутки после заражения	50	внутримышечно	46/60 (77%)
внутрибрюшинно	37/60 (62%)
3-О-( 1 -Этилморфолинил)-1,2-Оизопропилиден-аЩ-глюкофуранозы- 3 -хлор-6-метил-Л-карбоксиметил9-акридон	н	50	внутримышечно	24/30 (80%)
внутрибрюшинно	19/30 (63%)
3-О-(Л,Л-Диметиламино-н-пропил1,2:5,6-ди-О-изопропилиден a,Dглюкофураноза (прототип)	II	50	внутримышечно	29/60 (48%)
внутрибрюшинно	23/60 (38%)
Натрия Л-метиленкарбокси-9-акридон (камедон)	I,	50	внутримышечно	12/30 (40%)
внутрибрюшинно	8/30 (27%)
Рибамидил (виразол)	I,	100	перорально	2/30 (7%)

Числитель - число выживших животных; Знаменатель - число животных в опыте; в скобках - индекс защиты

Таблица 3. Результаты изучения заявляемых препаратов на модели экспериментальной лихорадки долины Рифт, в сравнении с прототипом, натрия 3-хлор-Ы-карбоксиметилакридоном и рибамидилом

Название препарата	Доза, мг/кг	Модельное животное	Инфицирующая доза, БОЕ	Уровень защиты, %
3-О-(Л,Л-Диметиламино-н-пропил-1,2:5,6-ди-Оизопропилиден а^-глюкофуранозы N-карбоксиметилакридон	25	мыши	25-50	87
50	крысы	250	100
Натрия 3-хлор N-карбоксиметилакридон	25	мыши	25-50	33
50	крысы	250	53
6-O-(N,N-Диметиламиноэтил)-1,2:3,4-ди-Оизопропилиден-аЮ-галактопиранозы 3-хлорN-метиленкарбо ксилат-9-акридо н	25	мыши	25-50	67
50	крысы	250	87
6-O-(N,N-Диметиламиноэтил)-1,2:3,4-ди-Оизопропилиден-аЮ-галактопираноза (прототип)	25	мыши	25-50	40
50	крысы	250	53
Рибамидил (виразол)	75	мыши	25-50	14
100	крысы	250	27

Таблица 4. Влияние введения заявляемых препаратов на показатели, характеризующие противогрибковую активность макрофагов в отношении Candida albicans

Название соединения	Доза, мг/кг	Показатель вегетации Candida albicans, %
через 7 ч после введе	через 24 ч ия препаратов
1) 3-О-(М,М-Диметиламино-н-пропил)-1,2:5,6-ди-	25	25,2	27,8
О-изопропилиден -аЩглюкофуранозы N-карбок-	50	26,4	28,5
симетил-9-акридон	75	31,0	35,2
2) 3-O-(N,N,-Диэтиламино-(2 '-изобутил) -1,2-O-	25	30,2	31,8
изопропилиден-аЩаллофуранозы 2-карбокси-	50	34,4	35,5
^метиленкарбоксилат-9-акридон	75	38,0	39,5
3) 3-O-(N,N,-диэтиламино -(2'-изобутил)-1,2-O-	25	46,0	46,2
изопропилиден-аЩаллофураноза	75	48,5	48,9
4) 2-карбокси-Л-метиленкарбоксилат-9-акридон	25	49,0	49,6
	75	49,4	49,7
Контроль		49,3	49,8

Таблица 5. Сравнительное изучение антибактериальной активности заявляемых соединений, прототипа и акридонового составляющего

Название соединения	Схема введения	Число животных в опыте	Доза, мг/кг	Обсемененность почечной ткани, КОЕ/г	% животных
в сутки	курс
3-O-(N,N-диметиламино-н-	Лечебно-	30	50	7 дней	менее 1 0	У 70%
пропил-1,2:5,6-ди-О-изопро-	профилакти-				10-100	У 30%
пилиден-аЩглюкофуранозы	ческая
N-карбо ксиметилакридон	Лечебная	15	50	5 дней	менее 1 0	у 50%
					10-100	у 45%
					100-1000	у 5%
	Лечебная	15	25	5 дней	менее 1 0	у 40%
					10-100	у 35%
					100-1000	у 25%
5Ю-бензил-3 -O-( 1 '-этил-2'-	Лечебная	20	50	5 дней	менее 1 0	у 30%
пиперидинил)-1,2Ю-изопро-					10-100	у 45%
пилиден-аЦ-ксилофуранозы 2-( 1'- этил-2' -бензилокси)^метиленкарбоксилат-9акридон					100-1000	у 25%
5^^^^-3 -O-( 1 '-этил-2'-	Лечебная	20	50	5 дней	10-100	у 10%
пиперидинил)-1,2Ю-изопро-					100-1000	у 35%
пилиден-аЦ-ксилофураноза					10⁵-10⁶	у 50%
					более 1 0⁷	у 5%
2-(1'-Этил-2'-бензилокси)-Л-	Лечебная	20	50	5 дней	100-1000	у 20%
метиленкарбоксилат-9-акри-					10⁵-10⁶	у 35%
дон					более 1 0⁷	у 45%
Контроль		30			100-1000	у 20%
					10⁵-10⁶	у 30%
					более 1 0⁷	у 50%

Таблица 6. Влияние заявляемых препаратов на рост солидного рака Эрлиха в сравнении с прототипом и акридоновым компонентом

Название соединения	Доза, мг/кг	Число животных в опыте	Масса oпухоли, мг
на 9/6 день	1 4/11 день	1 9/1 6 день
Контроль		20	68-4,2	111-5,1	171-13,4
3-O-(N,N - Диметиламино-н-	20	10	62-5,0	120-10,4	194-13,2
пропил-1,2:5,6-ди-O-изопро-	100	10	54-4,2	85-5,9	153-10,8
пилиден-а^-глюкофуранозы	250	10	43-3,9	65-5,0	106-12,8
N-карбоксиметилакридон
1-O-Этил-5-O-(бутил-4'-(N-
пиридинил)- а,Э-рибофура-	20	10	61-4,8	109-9,8	183-11,4
нозида 2-оксиэтил-7-карбо-	100	10	55-4,3	82-4,7	152-9,9
ксиэтил N-метиленкарбокси-	250	10	41-3,7	64-4,8	111-10,9
лат-9-акридон
1-O-Этил-5-O-(бутил-4'-(N-	20	10	70-4,6	121-8,9	189-12,4
пиридинил)- а,Э-рибофура-	100	10	61-4,0	98-4,8	169-12,7
нозид (прототип)	250	10	55-3,9	81-5,3	148-13,0
2-Оксиэтил-7-карбоксиэтил	20	10	68-4,4	120-8,7	182-11,9
^метиленкарбоксилат-9-	100	10	59-3,9	96-4,6	161-12,3
акридон	250	10	50-3,9	87-5,3	146-13,0

Таблица 7. Влияние заявляемых препаратов на рост лейкоза Р-388 в сравнении с прототипом и акридоновым компонентом

Название соединения	Доза, мг/кг	Число животных	Продолжительность жизни (в скобках, процент от уровня контроля)
3-O-(N,N-Диметиламино-н-пропил-1,2:5,6-ди-O-	20	10	10,7+0,29 (103)
изопропилиден а,Э-глюкофуранозы N-	100	10	14,3+0,68 (138)
карбоксиметилакридон	500	10	10,1+1,26 (97)
1-0-Этил- 5-0- (1'-бутил-4'-^-пиридинил)- a,D-	20	10	10,4+0,65 (100)
рибофуранозида 2-оксиэтил N-метиленкарбоксилат-	100	10	15,5+0,70 (146)
9- акридон	500	10	10,7+0,68 (103)
1 -O-Этил-5-O-( 1 '-бутил-4'-^-пиридинил)- a,D-	20	10	10,9+0,30 (105)
рибофуранозид (прототип)	100	10	12,7+0,63 (122)
	500	10	11,1+0,85 (107)
2 -Оксиэтил N -метиленкарбоксилат-9 -акридон	20	10	10,6+0,30 (102)
	100	10	12,5+1,05 (120)
	500	10	13,1+0,90 (126)
Контроль		20	10,4-0,19 (100)

ЛИТЕРАТУРА

1. Chemotherapy and Immunity. Ed. G. Pulverer, J. Jeljaszewicz, Gustav Fisher Verlag, 1985, 245 с.

2. Регистр лекарственных средств России (РЛС), под ред. Крылова Ю.Ф., Москва, Инфармхим, 1993, 1006 с.

3. Бердникова Т.Ф., Ломакина Н.Н., Новые антибиотики группы полициклических пептидов. Антибиотики и медицинская биотехнология, 1986, N 11, с. 814-820.

4. Коган Э. З., Синицин Н. И. и др., Линкомицин и его лекарственные формы. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1985, № 10, с. 783-788.

5. Яковлев В. П. Антибактериальная терапия в неинфекционной клинике: новые беталактамы, монобактамы и хинолоны. Фармакология:

химиотерапевтнческие средства, т. 20,

ВИНИТИ, 1992, 203 с.

6. Schneiden H, Levamisole- a general pharmacological perspective. Int. J. Immunopharmacological, 1981, v. 3, p. 9-13.

7. Gordon G., Minks M. A. The interferone renaissance molecular aspects of induction and action. Microbiol. Rev., 1981, v. 45, p. 244.

8. De Clercq E., Merigan KS.J. infect. Dis. 1971, Vol. 123, p. 190-199.

9. F. Smejkal, D. Zelena, J. Krepelka, I. Vankurova Derivatives of benzo (c)-fluorene, Acta virol. 1984, v. 29, N 11-18, p. 11.

10. Diederich J., Lodemann E. Arch. ges. Virusforsch. 1973. Bd 59., s. 172-173.

11. EP № 653434, МКИ С 07Н 15/12, опубл. 17.04.95.

12. Малайцев В.В. и др. Бюл. экспер. биол. 1985, № 8, с. 221-223.

13. Патент США № 3681360, опубл. 09.04.71.

14. Taylor J. L., Grossberg S. E. Тех. Rep. Biol. Med. 1981 82. Vol. 41 p. 158-163.

15. Szulc В., Piasecki E. Arch. Immun. Ther. Exp., 1988, 36, N 5, p. 537-545.

16. Патент США № 4017608 , МКИ А 61К 31/70, НКИ 424/180, 536/129, опубл. 12.04.1977прототип.

7. Патент Великобритании 1497409, C1 A 61К 31/33, опубл. 12. 01. 1978.

18. Патент Японии № 62-149694, МКИ С 07Н 15/12, А 61К 31/70.

19. Заявка Германии 2.455.026, МКИ А 61К, опубл. 03.07.1975.

20. Заявка Германии 2.612.717, МКИ С 07Н 15/04, опубл. 14.10.1976.

21. Патент США 4.735.934, С1, А 61К 31/70, опубл. 05.04.1988.

22. Nishikava Y., Yoshimoto К., Chem. Pharm. Bul., 1987, -35, № 7, р. 2894-2899.

23. Патент Польши 139805, МКИ C 07D 219/16, опубл. 31.07.1987.

24. Заявка России № 93017260/04 от 01.04.93.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Средство противоинфекционного, противовоспалительного и противоопухолевого действия, представляющее собой соль акридонуксусных кислот и монозамещенного эфира моносахарида общей формулы где

X и Z= -OH,-H, -СН₂-ОН или группа Н₂С — О—тС“СН₃- НС — О⁷ СН₃

W = - Н, алкил-, бензил -, (Z и W , Х и W ) или Z и W ; (Z и W, OW' и W) или Z и W вместе образуют группу

-_zc °_ н₃с сн₃

Ri,R₂ = -Н, галоген, алкил-, карбокси-, оксиалкил- или оксиарилгруппы, n= 1 -4;

R₃, R₄= -Н, алкил- или R₃ и R вместе с атомом азота образуют морфолиновый, пиперидиновый или пиридиновый гетероцикл;

2. Средство по п.1, представляющее собой соль N-акридонуксусной кислоты и 3-O-(N,Nдиметиламино-н-пропил)-1,2:5,6-ди-О-изопропилиден-а^-глюкофуранозы, общей формулы

3. Средство по п.1, представляющее собой соль 3 -хлор-10-метиленкарбоксилат-9-акридона и 1,2:3,4-О-диизопропилиден-6-О^^-диметиламиноэтил)-а^-галактопиранозы общей фор-