DK176653B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin med lav forestringsgrad, amideret pektin, som er opnåeligt ved fremgangsmåden, og anvendelse af dette - Google Patents

Description

DK 176653 B1

Titel. Fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin med iav forestrinqsqrad, amideret pektin, som er opnåeligt ved fremgangsmåden, og anvendelse af dette 5 Teknisk område

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin med lav forestringsgrad, som tilvejebringer geler med høj styrke. Yderligere angår opfindelsen amiderede pektiner, som er opnåelige ved denne 10 fremgangsmåde, samt anvendelser af sådanne pektiner

Kendt teknik

Pektin er et komplekst polysaccharid, som er forbundet med plantecellevægge.

15 Det består af en α-Ι-4-forbundet polygalacturonsyre-rygrad, som har mellemliggende rhamnose-rester, og som er modificeret med neutrale sukker-sidekæder og ikke-sukker-komponenter, såsom acetyl-, methyl- og ferulasyre-grupper.

De neutrale sukker-sidekæder, som indbefatter arabinan og arabingalactaner, 20 er forbundet til rhamnose-resterne i rygraden. Rhamnose-resterne har tendens til at klumpe sammen på rygraden. Således omtales denne region med sidekæderne som hår-regionen, og resten af rygraden navngives følgelig den glatte region.

25 Pektiner anvendes traditionelt som fødevareadditiver. Deres anvendelse har imidlertid ligeledes bredt sig til de farmaceutiske områder. Pektiner har længe været anvendt som et anti-diarrémiddel, og de kan forbedre tarmfunktionen. An-ti-diarré-virkningen menes delvist at skyldes pektins anti-mikrobielle aktivitet.

30 Pektiner er også virkningsfulde mod gastrointestinal ulcus og enterocolitis Pektiner har desuden indflydelse på celle-proliferationen i tarmene. De har også blod-cholesterol-formindskende virkning og udviser inhibering af atherosclerosis. Denne virkning er resultatet af vekselvirkninger mellem pektiner og galde- DK 176653 B1 2 salte. Pektiner har også vist sig at påvirke fibrin-nettet hos hypercholesterolæ-miske individer.

Evnen ti! vekselvirkning med mange divaiente metalioner gør pektiner til et 5 stærkt detoksificerende middet.

Modstandsdygtigheden hos pektin over for nedbrydning i den øvre mave-tarm-kanal og dets fuldstændige opløsning i tyktarmen gør pektiner meget egnede til colon-specifik levering. Coacervering med gelatine muliggør dannelsen af mi-10 krokugler, som er egnede til produkter med styret frigivelse. Yderligere anvendes pektin i tablet-formuleringer

Ifølge Kertesz, Z.l: The Pectic Substances, Interscience Publishers, Inc., New York, 1951, forekommer pektin-materialer i alt plantevæv. Af industriel vigtighed 15 er imidlertid især æbler, roer, hør, grapefrugt, citroner, lime, appelsiner, kartofler og solsikke. For nyligt har også pektin i Aloe vera udvist industriel anvendelighed.

Historisk set har pektin hovedsageligt været anvendt som geleringsmiddel til 20 marmelade eller lignende frugt-holdige eller frugt-aromatiserede, sukker-rige systemer. Eksempler er traditionel marmelade, marmelade med reduceret sukkerindhold, klare geleer, frugt-aromatiserede konfektioneringsgeler, ikke-frugt-aromatiserede konfektioneringsgeler, varmereversible glasurer til bagein-dustrien, varme-resistente marmelader til bageindustrien, ripples til anvendelse i 25 flødeis og frugtfremstillinger til yoghurt.

En væsentlig del af pektin anvendes i dag til stabilisering af mælkedrikke med lav ρΗ-værdi, herunder fermenterede drikke og blandinger af frugtjuice og mælk.

For nyligt har pektiner vist sig at være effektive til behandling af halsbrand forårsaget af esophagealsyre-reflux 30 DK 176653 B1 3

Galacturonsyre-resterne i pektin er delvist esterificerede, og de er til stede som methylesteren. Esterificeringsgraden defineres som procentdelen af carbo-xylgrupper, som er esterificerede. Pektin med en esterificeringsgrad ("DE") over 50% kaldes pektin med høj methylforestringsgrad ("HM") eller pektin med høj 5 forestringsgrad og pektin med en DE på mindre end 50% omtales som pektin med lav methylforestringsgrad ("LM”) eller pektin med lav forestringsgrad. De fleste pektiner, som forefindes i frugt- og grøntsager, er HM-pektiner. Aceta-tester-grupper kan yderligere forekomme ved carbon-2 eller -3 af galacturonsy-reresterne. Graden af acetatesterificering ("DAc") defineres som procentdelen 10 af gaiacturonsyrerester, som indeholder en acetatester-gruppe De fleste naturlige pektiner har en lav DAc, idet en undtagelse er sukkerroe-pektin.

Pektiner er opløselige i vand og uopløselige i de fleste organiske opløsningsmidler Pektiner med en meget lav grad af methyl-forestring og pektinsyrer er til 15 praktiske formål kun opløselige i form af et kalium- eller natriumsalt

Pektiner er mest stabile ved pH-værdi 3-4. Under pH-værdi 3 Ijernes methoxyl-og acetyl-grupper og neutrale sukker-sidekæder. Ved forhøjede temperaturer accelereres disse reaktioner, og spaltning af glycosid-bindinger i galacturonan-20 rygraden forekommer. Under neutrale og alkaliske betingelser forsæbes methy-lestergrupper og polygalacturonan-rygraden går i stykker via β-elimineringsspaltning af glycosid-bindinger ved de ikke-reducerende ender af methoxylerede galacturonsyre-rester. Disse reaktioner fremskrider også hurtigere med forøget temperatur. Pektinsyrer og LM-pektiner er resistente over for 25 neutrale og alkaliske betingelser, eftersom der ikke er nogen eller kun er et begrænset antal methylestergrupper.

Der er mange biokatalysatorer, som specifikt kan modificere og nedbryde pektin-molekyler. Disse biokatalysatorer indbefatter endo- og exo-30 polygalacturonase, pektat-lyase, pektin-methylesterase, pektin-acetylesterase og rhamnogalacturonase. Ifølge Rastall, R.: LFR Ingredients Handbook, Leatherhead Food RA, marts 1999, indbefatter pektinaser fra Aspergillus spp: DK 176653 B1 4

Biokatalysator EC nr. Substrat Virkning pH Temp.

_______opt, opt.

Pektinlyase 4.2.2.10 Pektin med høj Endoa-1,4 5-5,5 50 forestringsgrad b eliminer- ____ing___

Pektinmethyl- 3.1.1.11 Pektin med høj Tilfældig de- 4-4,5 55 esterase forestringsgrad esterificer- ______ing___

Endo- 3.2,1.15 Pektin med lav Endoa-1,4 4-4,5 45-50 polygalacturonase forestringsgrad depoiymeri- _____sering___

Exo- 3.2.1.67 Pektin med lav Exoa-1,4 5 55 polygalacturonase___forestringsgrad hydrolyse__

Arabinogalac- 3.2,1,90 Hår-regioner af Endob-1,3 4 50 tanase pectin 1,6hydro- ____lyse____

Mannanase 3.2.1.78 Hår-regioner af Endob-1,4 3-6 80 __pectin_hydrolyse __

Leverandører indbefatter Gist-Brocades, Novo Nordisk A/S, Rohm, Shin Nihon og Solvay.

5 Både HM og LM-pektiner kan danne geler, men ved fuldstændigt forskellige mekanismer. HM-pektin danner geler i nærværelse af høje koncentrationer af co-opløst stof, såsom sukker ved lav pH-værdi. LM-pektiner danner termorever-sible geler i nærværelse af calcium. Yderligere kan sukkerroe-pektin danne geler via tværbinding af de ferulerede grupper som beskrevet af Rombouts (US 10 4.672,034).

Pektiner har god lovgivningsmæssig status som et fødevareadditiv. De klassificeres som "Generally Recognized As Safe" ("GRAS") i USA og "Acceptable Daily Intake ("ADI") i europa.

15 I US 2,480. 710, Bryant, beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin. En langsomt gelé-dannende pektintype med 7,5% til 10% methoxy-indhold opsiæmmes i 65% IPA med 10% ammoniumhydroxid (28% ammoniak), og blandingen omrøres i to timer ved 25°C. Efter dræning af ammoniak-alkohol 20 tilsættes friskt 65% IPA. Koncentreret HCI tilsættes derefter til en surhed, som DK 176653 B1 5 resulterer i en pH-værdi af en 1% dispersion af det amiderede pektin på 3-4. pH-værdi højere end 5 og under 3 forårsager sandsynligvis yderligere uønsket modifikation under tørring. Opslæmningen filtreres og skylles først med 65% IPA og derefter med 90% IPA og tørres derefter Omdannelsen følger; 5

RCOOCHs + NH4OH = RCONHa + CH3OH + HzO

Den ønskede mængde ammoniak ligger i intervallet fra 2 til 16 gange mængden, som teoretisk påkræves til fuldstændig de-esterificering af det oprindelige 10 udgangsmateriale.

I stedet for anvendelse af et isoleret pektin, kan våd pektinudfældning benyttes.

I US 2.478.170 beskriver William et al., at pektin med lav forestringsgrad kan 15 fremstilles ved den delvise de-esterificering af enten pektin eller protopektin.

William et al anvender et pektin-udgangsmateriale, som er umodificeret, og som udviser en esterificeringsgrad på ca, 80%. Syre, alkali eller biokatalysatorer katalyserer denne de-esterificering I beskrivelsen anvendes alkali som de-esterificeringsmidlettil opnåelse af en esterificeringsgrad på 20 til 30%.

20 I US 2.448 818 beskriver McCready et al. anvendelsen af citrus-pektinesterase ti! in situ omdannelse af pektin til pektin med lav forestringsgrad og med et methoxyl-indhold på 6%, svarende til en esterificeringsgrad på ca. 37% Biokatalysatoren, som benyttes, er naturligt forekommende i citrusfrugt, og det er 25 kendt, at sådanne plante-esteraser resulterer i en blokvis de-esterificering.

I US 3.622.559 fremstiller Wiles et al. et pektin-udgangsmateriale via syreekstraktion ved ca. 70°C i 1-2 timer, Dette fører til et pektin med en molekylvægt (Mw) på 180.000 til 200.000 Dalton og et methoxyl-indhold på 10% (DE=61%) 30 til 10,5% (DE=64%). Dette pektin kan derefter yderligere de-esterificeres ved behandling af pektinet med syre eller en ammoniak-alkohol-blanding. Denne fremgangsmåde fører til pektin med lav forestringsgrad og med en molekylvægt (Mw) på 120.000 til 200 000 Dalton.

DK 176653 B1 6 I US 4.065.614 beskriver Nelson et amideret pektin med en amideringsgrad på mindst 27%. Udgangspektin-materialet skal have en esterificeringsgrad på over 60%, og amideringen gennemføres ved anvendelse af en blanding af flydende 5 ammoniak i et egnet organisk opløsningsmiddel, såsom isopropanol. Reaktionen gennemføres ved en temperatur inden for intervallet fra -15 - +15°C, indtil amideringsgraden har nået mindst 27%. Pektin-udgangsmaterialet beskrives som et hvilket som helst af de kommercielt tilgængelige pektiner med høj forestringsgrad.

10 I DK 157.616 B beskriver Buhi et al. et amideret pektin med en amideringsgrad på 5-25%, en forestringsgrad på mindst 50% og en gennemsnitlig molekylvægt på 15.000-75.000 Dalton Pektin-udgangsmaterialet fremstilles i overensstemmelse med en traditionel syreekstraktion, og amidering gennemføres i en blan-15 ding af flydende ammoniak og isopropanol ved 0°G..

I WO 98/58968 beskriver Larsen et al en fremgangsmåde til fremstilling af udvalgte fraktioner af pektin med høj forestringsgrad. Fremgangsmåden indbefatter to eller flere ekstraktionstrin, som er karakteristiske ved, at hvert foregående 20 trin indbefatter ekstraktion af pektinet fra det foregående trin ved lavere pH-værdi. Fraktioner af pektin med høj forestringsgrad er også nyttige som udgangsmaterialer til fremstilling af de-esterificeret pektin. Pektinudgangsmaterialet til de-esterificering har en DE på over 50%, og behandles med et de-esterificeringsmiddel til opnåelse af en pektin-fraktion med en 25 forestringsgrad, som reduceres med mindst 5% i forhold til graden for fraktionen af pektin med høj forestringsgrad og en amideringsgrad i intervallet 0-25%. De-esterificeringsmidler er syrer, alkalier eller kombinationer deraf.

I WO 00/08952 beskriver Madsen et al. en pektin-sammensætning, som ikke til-30 vejebringer nogen væsentlig gelering. Det beskrives, at forestringsgraden og/eller graden af blokstruktur kan modificeres ved anvendelse af biokatalysatorer, som opnås fra planter eller bakterier.

DK 176653 B1 7 I WO 00/15830 beskriver Christensen et al. en fremgangsmåde ti! behandling af pektin med en pektinmethylesterase. Pektin-methylesterasen hidrører ikke fra planter, men har mindst én plante-pektin-methylesterase-egenskab. Denne egenskab er den blok-vise de-esterificering af pektin, og det behandlede pektin 5 beskrives at indeholde mindst 70% estergrupper I US 6 069.000 beskriver Andersen et al. en biokatalysator med pektin-esterase-aktivitet. Opfinderne mener, at den forbedrede ydelse af pektin-esterasen ifølge opfindelsen skyldes virkningsmåden for biokatalysatoren ifølge 10 opfindelsen, idet der fortrinsvis tilvejebringes en blok-vis fordeling af syregrupperne i pektinet I US 5.707.847 har Cristgau et al. beskrevet en biokatalysator, som udviser pektin-methyl-esterase-aktivitet. Biokatalysatoren kan anvendes til demethyle-15 ring af pektin, f.eks. fra citrus, æbler, solsikker og/eller sukkerroe. Biokatalysatoren kan anvendes til fremstilling af lavt methyleret pektin ud fra højt methyleret pektin.

I denne reference er mikrobiel pektin-esterase sammenlignelig med hensyn til 20 virkning med syre og alkali, dvs. de-esterificering er tilfældig af beskaffenhed.

Ved de traditionelle fremgangsmåder til de-esterificering af pektin involverer kemiske fremgangsmåder anvendelsen af syre- eller alkalibehandiing af pektiner med høj forestringsgrad. Det er kendt, at disse fremgangsmåder resulterer i 25 depolymerisering af pektinet med høj forestringsgrad under de-esterificeringen, og som følge heraf skal kemisk de-esterificering typisk finde sted ved lave temperaturer. På den anden side gør dette de-esterificeringsprocessen langsom og yderligere gør investeringer i køleudstyr sådanne de-esterificerede pektiner mere omkostningsfyldte at fremstille. Yderligere, eftersom det er kendt, at de kemi-30 ske processer fjerner estergrupper på tilfældig vis, er de resulterende de-esterificerede pektiner med hensyn til carboxylsyregrupper mindre blok-agtige.

Det er kendt, at enzymatiske fremgangsmåder de-esterificerer pektin med høj DK 176653 B1 8 forestringsgrad på enten en tilfældig måde eller på en blok-vis måde. Yderligere er det kendt, at enzymatisk de-esterificering reducerer eller eliminerer depoly-merisation af pektinet med høj forestringsgrad under de-esterificeringen.

5 Imidlertid lider enzymatisk de-esterificering under det faktum, at esterificerings-graden ikke kan bringes under ca. 25%, som det beskrives af Smythe {US 2 599.531). Yderligere er der ikke beskrevet nogen enzymatisk proces, som resulterer i amiderede pektiner.

10 Der forbliver således det problem, at traditionelt fremstillede amiderede pektiner med lav forestringsgrad stadig lider under glycosid-nedbrydning og aggregering under amidering. Dette fører til amiderede pektiner med ændret konformation på grund af aggregering.

15 Tilstedeværelsen af pektin-aggregater i opløsning er rapporteret i litteraturen (Sorochan et al. 1971. Carbohydr. Res. bind 20, side 243-248; Jordan, R„ C. og Brant, D. A. 1978. Biopolymers, bind 17, side 2885-2895; Davis et al, 1980 Int J Biol, Macromol, bind 2, side 330-332). Pektin-aggregater dannes i opløsning under ikke-gelerende betingelser og kan anses for at være forstadier til gele- 20 ring; US patent nr. 6 143.337 i navnet Fishman, et al. Denne aggregering menes at forårsage, at det amiderede pektin bliver mindre opløseligt, hvilket fører til en lavere geleringsstyrke end den teoretisk mulige. Yderligere er ikke-amiderede pektiner med lav forestringsgrad med en esterificeringsgrad under 25% derfor fremstillet ved enten syre- eller alkali-de-esterificering, og for disse 25 pektiner med lav forestringsgrad forekommer det samme problem, nemlig at syre- eller alkali-hydrolyse reducerer molekylvægten af pektinet, og som følge heraf frembringes et pektin med lav forestringsgrad og med en lavere geleringsstyrke end det teoretisk mulige.

30 Følgelig er der et behov for en fremgangsmåde, som frembyder: ® En fremgangsmåde til reduktion af graden til esterificering til under 25% med mindre nedbrydning af glycosid-bindingerne i pektin-rygraden.

DK 176653 B1 9 ® Ikke-amiderede pektiner med lav forestringsgrad med en esterificeringsgrad under 25% med højere molekylvægt og en ikke-aggregeret eller mindre ag-gregeret konformation til tilvejebringelse afen stigning i geleringsstyrke.

• En fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin med højere molekyl-5 vægt og en mindre aggregeret konformation.

• Amiderede pektiner med lav forestringsgrad og højere molekylvægt og en ikke-aggregeret eller mindre aggregeret konformation til tilvejebringelse af en stigning i geleringsstyrke.

10 Kort beskrivelse af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde, med hvilken et pektinekstrakt først de-esterificeres ved anvendelse af en biokatalysator. Herefter de-esterificeres det de-esterificerede pektin med høj molekylvægt yderligere og det 15 amideres ved anvendelse af traditionelle fremgangsmåder. Eftersom biokatalysatoren kan de-esterificere til en DE på ca 25%, har traditionel de-esterificering og amidering lille indflydelse på molekylvægten af pektinet, da antallet af estergrupper væsentligt reduceres i den første del af fremgangsmåden 20 Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af amideret pektin med lav forestringsgrad omfattende trinnene: opnåelse af et pektin-udgangsmateriale, at bringe pektin-udgangsmaterialet i kontakt med en biokatalysator, som er i stand til at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet, at gøre det muligt for biokatalysatoren at de-estificere pek-25 tin-udgangsmaterialet ti! frembringelse af et de-esterificeret pektin, og yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin ved at bringe det de-esterificerede pektin i kontakt med en syre eller et alkali, som er i stand til at de-esterificere, og at gøre det muligt for syren eller alkaliet yderligere at de-esterificere det de-esterificerede pektin ti! frembringelse af et pektin med lav 30 forestringsgrad, hvor pektin-materialet under eller efter den yderligere de-esterificering amideres ved at bringe det de-esterificerede pektin i kontakt med ammoniak.

DK 176653 B1 10

Ved fremgangsmåden gøres det fortrinsvis muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en forestringsgrad under 60% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin, idet man især foretrækker en forestringsgrad på mellem 60% og 30%, mere foretrukket mellem 45% og 5 30% og mest foretrukket mellem 45% og 40%, specielt en forestringsgrad på 42%, før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin.

Den ved fremgangsmåden udvalgte biokatalysator udvælges fortrinsvis fra gruppen omfattende pektin-methylesterase (E C 3.1.111), som enten de-10 esterificerer på tilfældig måde eller på blokagtig måde.

Den foreliggende opfindelse angår også et amideret pektin, som er ejendommeligt ved at have et forhold R2, mellem den indre viskositet for det de-esterificerede udgangs-pektin og den indre viskositet for det amiderede pektin i 15 intervallet fra 1,01 til 1,25, Det foretrækkes, at forholdet R2 ligger i intervallet fra 1,03 til 1,18, især fra 1,04 til 1,15. Det amiderede pektin har en forestringsgrad på 30% eller mindre, fortrinsvis 10-20%, og en amideringsgrad på 18% eller mindre..

20 De amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse er nyttige i fødevarer, mere specielt i marmelader og geléer og mejeriprodukter De amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse er også nyttige i farmaceutiske produkter, produkter til personlig pleje og i husholdningsprodukter..

25 Andre eksempler på udførelsesformer og fordele ifølge den foreliggende opfindelse kan fastslås ved at gennemgå den foreliggende beskrivelse og de tilhørende tegninger.

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 2.3 afbilder data fra tabel 2.3 med gelstyrke langs y-aksen og calcium-koncentration langs x-aksen.

30 DK 176653 B1 11

Fig. 2 4 afbilder data fra tabe! 2,4, hvor y-aksen repræsenterer værdier af kritisk spænding, og x-aksen repræsenterer caiciumkoncentration

Fig. 2 5 er et plot med calcium-koncentration langs x-aksen og brudstyrke langs 5 y-aksen.

Fig. 2 6 afbilder data fra tabe! 2.6, med calcium-koncentration langs x-aksen og gelstyrke langs y-aksen.

10 Fig. 3.1 er et plot af data fra tabel 3,1 med DE langs x-aksen og Mark-Houwink-faktoren langs y-aksen,

Fig. 3.2 er et plot af data fra tabel 3.2 med DE langs x-aksen og brudstyrke langs y-aksen .

15

Fig 4.1 angiver data fra tabel 4.1, som vedrører test nr. 1 og viser gelstyrke af amideret pektin, som er fremstillet ud fra pektin-udgangsmateriale ved forskellige DE For hver udgangspektin-DE viser plottet også, hvorledes gelstyrken påvirkes af forskellige calciumion-koncentrationer 20

Fig. 4.2 er et plot af data fra tabel 4.1, som angår test nr. 2 og den viser gelstyrken af amideret pektin, som er fremstillet ud fra pektin-udgangsmateriale ved forskellige DE. For hver udgangspektin-DE viser plottet også, hvorledes gelstyrken påvirkes af forskellige calciumion-koncentrationer.

25

Bedste måde til udøvelse af opfindelsen

Uden at ønske at være bundet til nogen teori ændrer pektin-materialet molekylvægt og konformation under en amideringsproces. Pektinmolekyler påvirkes af 30 to fænomener. Et er β-eliminering, hvorved molekylet depolymeriseres til en lavere molekylvægt, og det andet er aggregering, hvorved molekylet ændrer konformation og molekylvægten forøges. Det har nu vist sig, at jo højere % DE forud for amidering, des mere aggregeret bliver det endelige produkt. Denne ag- DK 176653 B1 12 gregering antages sammen med en mere udtalt β-eliminerlng for pektin med høj %DE at være ansvarlig for faldet i gelstyrken, som observeres, når % DE af pektinet forud for amidering forøges Aggregering til det ekstreme vil føre til uopløselighed af polymeren og kan også forventes at være ansvarlig for mikro-5 geler eller præ-gelering, idet der resulteres i upassende gelstrukturer. Derfor skal pektinet, som anvendes til amidering, være de-esterificeret for at minimere tendensen til aggregering. Til opnåelse af et efterfølgende amideret pektin med høj geleringsstyrke, skal de-esterificeringstrinnet også gennemføres under betingelser, som minimerer depolymerisering, 10

Det er nu opdaget, ved først at anvende biokatalytisk (f.eks. enzymatisk) de-esterificering, at depolymerisationen og aggregeringen under en efterfølgende kemisk de-esterlficering og amidering reduceres betydeligt Resultatet er de-esterificerede og amiderede pektiner med hidtil ukendt lav tendens til aggrege-15 ring og samtidig ukendt høj molekylvægt.

I en foretrukken udførelsesform gennemføres de-esterificeringen med biokatalysatorer til en esterificeringsgrad på mellem 60 og 30% før amidering.

20 I en mere foretrukken udførelsesform gennemføres de-esterificeringen med biokatalysator til en esterificeringsgrad på mellem 45 og 30%.

I en endnu mere foretrukken udførelsesform gennemføres de-esterificeringen med biokatalysator til en esterificeringsgrad på mellem 45 og 40%.

25 I den mest foretrukne udførelsesform gennemføres de-esterificeringen med biokatalysator til en esterificeringsgrad på 42%,

Disse forskelle fra kendte pektiner resulterer i en række fordele: De-30 esterificerede pektiner, som er fremstillet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, frembringer vandige geler med større stivhed og brudstyrker end kendte de-esterificerede pektiner, og den foreliggende opfindelse gør det let præcist at styre esterificeringsgraden og fordelingen af estergrupper og/elier DK 176653 B1 13 amid-grupper.

Fremgangsmåden indbefatter de følgende trin: 5 For det første ekstraheres pektin med høj forestringsgrad fra et pektin-holdigt udgangsmateriale i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder, dvs, ekstraktion i enten surt eller alkalisk vand ved forhøjet temperatur. Eventuelt kan ekstraktet koncentreres ifølge kendt teknik. Alternativt opløses kommercielt, tørt pektin med høj forestringsgrad eller på forhånd ekstraheret, oprenset, isoleret 10 og tørret pektin med høj forestringsgrad igen, og det koncentreres eventuelt.

For det andet indstilles pektin-opløsningen, om nødvendigt, for at tilvejebringe de ønskede betingelser for aktiviteten af biokatalysatoren, Disse indstillinger kan indbefatte ændring eller overvågning af pektin-opløsningens temperatur, 15 pH-værdi eller ionisk koncentration.

Hvis pH-værdien af pektin-opløsningen skal indstilles til den optimale pH-værdi for den anvendte biokatalysator, og i tilfælde, hvor aktiviteten af biokatalysatoren skal forøges ved lavere pH-værdier, kan ionstyrken af udfældningen eller 20 opslæmningen forøges med salte, såsom natriumchlorid.

Under omrøring får biokatalysatoren mulighed for at virke på pektinet, og graden af esterificering overvåges let via den nødvendige tilsætning af alkali til opretholdelse af reaktionens pH-værdi. På denne måde er det let at opnå et de-25 esterificeret pektin med en særlig esterificeringsgrad. Fremgangsmåden kan også gennemføres kontinuert., I dette tilfælde kan in-line titreringsudstyr anvendes til overvågning af esterificeringsgraden og rørlængden, hvor de-esterificeringen finder sted og flowhastigheden af materialet, som skal de-esterificeres, bestemmer den endelige esterificeringsgrad. Andre fremgangs-30 måder til bestemmelse af esterificeringsgrad, såsom anvendelsen af nærinfrarød spektrometri (NIR), kan anvendes til overvågning af esterificeringsgraden DK 176653 B1 14

For det tredje kan den enzymatiske de-esterificering afsluttes med varme, syre eller alkali ved en hvilken som helst ønsket esterificeringsgrad.

Det er imidlertid opdaget, at særlig høj indre viskositet og høj Mark-Houwink-5 faktor, som uden at ønske at være bundet af teori kan henføres til lav aggregering, opnås, når de-esterificeringen af udgangsmaterialet bringes til afslutning, når esterificeringsgraden er reduceret til en værdi inden for intervallet på 30-60%. Dette fører til særlig høj gelstyrke af de resulterende amiderede pektiner Yderligere er det opdaget, at når de-esterificeringen bringes inden for samme 10 interval, dvs, 30-60% ved anvendelse af traditionelle midler, er aggregeringen af det resulterende amiderede pektin lignende aggregeringen af amideret pektin, som fremstilles ved først at de-esterificere med biokatalysator. Ved anvendelse af den traditionelle tilgang vil molekylvægten imidlertid være lavere end tilfældet er, når der anvendes biokatalysator. Yderligere opnås amiderede pektiner med 15 lavere gelstyrke, end amiderede pektiner, som fremstilles ved først at de-esterificere ved anvendelse af en biokatalysator.

For det fjerde udfældes det de-esterificerede pektin i alkohol, hvis de-esterificeringen fandt sted i opløsning Efter presning formindskes pH-værdien 20 af blandingen af udfældet de-esterificeret pektin og alkohol derefter med syre eller forøges med alkali i overensstemmelse med traditionel teknik. Ved at gøre dette kan esterificeringsgrader under 25% opnås uden et betydeligt tab af molekylvægt af det de-esterificerede pektin. Hvis det anvendte alkali er ammoniak, resulterer de-esterificerede og amiderede pektiner uden et betydeligt tab i mo-25 lekylvægt af det de-esterificerede og amiderede pektin.

Amideringen finder sted ved opslæmning af det udfældede de-esterificerede pektin i 60-70%, fortrinsvis 70% isopropanol, hvori der er opløst 20-30% (volu-men/volumen), fortrinsvis 25-26% (volumen/volumen) ammoniak. Denne op-30 slæmning holdes ved 0°C til stuetemperatur, fortrinsvis 0-10°C, og mest foretrukket ca. 5°C i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at forårsage den ønskede grad af amidering.. Efter fuldendelse af amideringen drænes det amiderede pektin, og det vaskes med 50-70%, fortrinsvis 60% isopropanol, hvorefter pH- DK 176653 B1 15 værdien indstilles til 4,2-4,4 med et alkali, såsom NaOH eller Na2C03 Endelig vaskes det amiderede pektin med 40-60% isopropanol, fortrinsvis 50% isopro-panol, hvorefter det presses og tørres ved en temperatur under 75°C.

5 Endelig tørres det resulterende slutprodukt, og det formales i overensstemmelse med traditionelle fremgangsmåder.

Denne fremgangsmåde fører til de-esterificerede og/eller eventuelt amiderede pektiner af hidtil ukendt funktionalitet, især med hensyn til gel-egenskaberne i 10 vandigt medium, herunder gelstyrke, brudstyrke, viskositet og til geler, som udviser en lavere grad af synerese og højere geleringstemperaturer og højere smeltetemperatur- Yderligere er de amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse fordelagtige på grund af deres forøgede opløselighed i vandige systemer.

15

Uden at ønske at være bundet til teori, menes det, at disse træk resulterer fra en væsentlig lavere depolymerisation af pektinet ifølge den foreliggende opfindelse sammen med en lavere tendens til aggregering.

20 Disse forbedrede egenskaber af det amiderede pektin ifølge den foreliggende opfindelse er nyttige til fremstillingen af fødevarer, farmaceutiske produkter, produkter til personlig pleje og til husholdningsprodukter.

De amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse er særligt nyttige til 25 fødevarer, såsom marmelader og geléer ved både høje og lave indhold af opløselige faststoffer med og uden frugt. Eksempler på sådanne slutanvendelser er traditionel marmelade, marmelade med reduceret sukkerindhold, klare geleer, frugt-aromatiserede konfektioneringsgeler, ikke-frugt-aTomatiserede konfektioneringsgeler, varmereversible glasurer til bageindustrien, varme-resistente syl-30 tetøjer til bageindustrien, ripples til anvendelse i flødeis og frugtfremstillinger til yoghurt.

De amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse er også nyttige til me- DK 176653 B1 16 jeriprodukter, såsom i yoghurt, cremesaucer, tærter, buddinger, pynt og fyld.

Eksempler på farmaceutiske produkter, hvor de amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse kan være nyttige, indbefatter tabletter, kapsler, forbin-5 dingspleje- og ostomi-produkter, som udnytter pektiner i deres formuleringer.

Eksempler på produkter til personlig pleje, hvor de amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes, indbefatter forskellige cremer, lotioner og tandpastaer, som benytter pektiner i deres formuleringer.

10

Eksempler på husholdningsprodukter, hvor de amiderede pektiner ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes, indbefatter forskellige luftforfriskende geler, renseprodukter og detergentformuleringer, som benytter pektiner i deres formuleringer.

15

Bestemmelse af rheoioaiske udtryk: ® Kritisk spænding som bestemt med RheoStress RS-100 er et mål for brudstyrken af gelen. De opnåede værdier med denne type udstyr karakteriseres 20 ved at være uafhængige af det særlige apparat, som benyttes ® Brudstyrke som målt ved TA.XT2 Analyser er en destruktiv fremgangsmåde til måling af kraften, som er nødvendig til at bryde en gel, og denne fremgangsmåde frembringer værdier, som ikke nødvendigvis er uafhængig af det anvendte apparat.

25 e Gelstyrke som målt med RheoStress RS-100 er en ikke-destruktiv måde til måling af hårdheden af en gel.

o Gelstyrke som målt med TA.XT2 Analyser er ligeledes et mål for hårdheden af gelen.

o Indre viskositet er viskositeten af en uendeligt fortyndet opløsning af polyme- 30 ren En lav indre viskositet indikerer en polymer, som er stærkt snoet eller forgrenet eller aggregeret og ligner en sfærisk konformatron. En høj indre viskositet indikerer en polymer, som er mere stang-formig og således mindre snoet, mindre forgrenet og mindre aggregeret. Disse indikationer er kun DK 176653 B1 17 sande, hvis polymererne, som det drejer sig om, har samme molekylvægt.

* Når konformationen af polymerer af forskellig molekylvægt skal sammenlignes, anvendes Mark-Houwink-faktoren, ”a". En lav værdi af "a" betyder en polymer, som er mere sfærisk eller aggregeret med hensyn til konformation, 5 hvorimod en høj værdi af "a" betegner en polymer, som er mindre aggregeret og således mere stang-formig, Mark-Houwink-faktoren er angivet med udtrykket "indre viskositet" = KM3, hvor "indre viskositet" repræsenterer den indre viskositet af polymeren, bestemt ved opløsningsviskositet-målefremgangsmåde, K er en konstant, og M er molekylvægten af polyme-10 ren, og "a" betegner Mark-Houwink-faktoren.

Bestemmelse af esterificerinasarad (DE) og qalacturonsvre (GAl i ikke-amid-pektin.

15 Princip:

Denne fremgangsmåde er en modifikation af FAO/WHO-fremgangsmåden til bestemmelse af % DE og % GA i pektin, som ikke indeholder amid og acetatester (Compendium of food additive specifications, Addendum 9, Joint 20 FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 57th session, Rom, Italien 5-14, juni 2001).

Fremgangsmåde - bestemmelse af % DE og % GA: 25 (syre-alkohol: 100 ml 60% IPA + 5 ml HCI, rygende 37%) 1. Afvej 2000 g pektin i et 250 ml glasbægerglas, 2. Tilsæt 100 ml syre-alkohol og omrør ved magnetisk omrøring i 10 minutter.

3. Filtrer gennem en tørret, afvejet glasfilterdigel.

30 4. Skyl bægerglasset fuldstændigt med 6 x 15 ml syre-alkohol 5. Vask med 60% IPA, indtil filtratet er chlorid-frit* (omtrent 500 ml).

6. Vask med 20 ml 100% IPA.

7. Tør prøven i 2½ time ved 105°C

DK 176653 B1 18 8. Afvej digelen efter tørring og afkøling i desikator 9. Afvej nøjagtigt 0,4000 g af prøven i et 250 ml glasbægerglas.

10 Afvej to prøver til dobbelt bestemmelse 11. Fugt pektinet med omtrent 2 ml 100% IPA og tilsæt omtrent 100 ml carbon-5 dioxid-frit, deioniseret vand under omrøring med magnetisk omrører *(Chloridtest: Overfør omtrent 10 ml filtrat til et reagensglas, tilsæt omtrent 3 ml 3N HN03 og tilsæt et par dråber AgN03 Filtratet er chloridfrit, hvis opløsningen er klar, ellers vil der være en udfældning af sølvchlorid).

10

Prøven er nu klar til titrering, enten ved hjælp af en indikator eller ved anvendelse af et pH-meter/autoburette.

Fremgangsmåde - bestemmelse af alene % DE: 15 (Syre-alkohol: 100 ml 60% IPA + 5 ml HCI, rygende 37%), 1. Afvej 2,00 g pektin i et 250 ml glasbægerglas.

2. Tilsæt 100 ml syre-alkohol og omrør med magnetisk omrøring i 10 minutter 20 3. Filtrer gennem en Buchner-tragt med filterpapir.

4. Skyl bægerglasset med 90 ml syre-alkohol.

5. Vask med 1000 ml 60% IPA.

6. Vask med omtrent 30 ml 100% IPA.

7. Tør prøven i omtrent 15 minutter på Buchner-tragt med vakuum-sug.

25 8., Afvej omtrent 0,40 g af prøven i et 250 ml glasbægerglas.

10. Afvej to prøver til dobbelt bestemmelse.

11. Fugt pektinet med omtrent 2 ml 100% IPA og tilsæt omtrent 100 ml deioniseret vand under omrøring på en magnetisk omrører 30 Prøven er nu klar til titrering, enten ved hjælp af en indikator eller ved anvendelse af et pH-meter/autoburette

Titrering ved anvendelse af indikator: DK 176653 B1 19 1. Tilsæt 5 dråber phenolphtalein-indikator og titrer med 0,1 N NaOH indtil ændring af farven (noter dette som Vi-titer).

2. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH under omrøring. Lad det stå i præcis 15 mi-5 nutter. Under henstand skal prøven være dækket med folie.

3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI under omrøring og omrør, indtil farven forsvinder 10 4. Tilsæt 3 dråber phenolphtalein og titrer med 0,1 N NaOH indtil ændring af farve (notér dette som Vj-titer).

Blindtesti 15 1 Tilsæt 5 dråber phenolphthalein til 100 mi carbondioxid-frit eller deionise- ret vand (samme type som der anvendtes til prøven) og titrer i et 250 ml glasbægerglas med 0,1 N NaOH indtil ændring affarve (1-2 dråber).

2. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH og lad prøven stå uberørt i præcist 15 minut-20 ter. Under henstand skal prøven være dækket med folie.

3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI og 3 dråber phenolphtalein og titrer indtil ændring affarve med 0,01 N NaOH (notér dette som Bi).

25 Titrering under anvendelse af pH-meter/autoburette:

Ved anvendelse af autoburette type ABU 80 kan de følgende indstillinger anvendes:

Prøve med % DE < 10 Blindtest

PiOportionalbånd 0.5 5

Forsinkelse sekunder 50 5

Hastighed-Vs 10 5

Hastighed - V2_15 5 DK 176653 B1 20 1. Titrer med 0,1 N NaOH til pH-værdi 8,5 (notér resultatet som Vi-titer).

5 2, Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH under omrøring og lad prøven stå uden omrøring i præcist 15 minutter. Under henstand skal prøven være dækket med folie.

3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI under omrøring og omrør, indtil pH er konstant.

10 4, Efterfølgende, titrer med 0,1 N NaOH til pH-værdi 8,5 (notér resultatet som V2-titer),

Blindtest 15 1. Titrer 100 ml carbondioxid-frit eller deioniseret (samme type som anvendt til prøven) vand til pH-værdi 8,5 med 0,1 N NaOH (1-2 dråber) .

2. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH under omrøring og lad blindtest-prøven hen-20 stå uden omrøring i præcist 15 minutter. Under henstand skal prøven være dækket med folie.

3. Tilsætning 20,00 ml 0,5 N HCI under omrøring og omrør, indtil pH-værdi er konstant.

25

4. Titrer til pH-værdi 8,5 med 0,1 N NaOH (notér dette som BO

Beregning:

Vt = V, + (V2-Bi)

% DE (grad af esterificering = ((V2 - Bi) x 100)ΛΛ % DFA (grad af fri syre) = 100 - % DE

30 DK 176653 B1 21 % GA* (grad af galacturonsyre) = (194,1 x Vt x N x 100) / 400 *På aske- og fugtfri basis 5 194,1: Molekylvægt af galacturonsyre N: Korrigeret normalitet for 0,1 N NaOH, som anvendes tii titrering (f.eks.

0,1002 N) 400: Vægt i mg af vasket og tørret prøve tii titrering % Rent pektin = (syre vasket og tørret mængde af pektin x 100) / (afvejet 10 mængde af pektin).

Bestemmelse af amiderinasarad (DA) oa forestrinasarad (DE) for pektin

Princip: 15

Denne fremgangsmåde er en modifikation af FAO/WHO-fremgangsmåden tii bestemmelse af % DE, % DA i pektin (Compendium of food additive specifications, Addendum 9, Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 57th session, Rom, Italien, 5-14 juni 2001, side 3-4), som ikke indeholder aceta-20 tester.

Procedure; (syre-alkohol: 100 ml 60% IPA + 5 ml HCI, rygende 37%) 25 1 Afvej 2.000 g pektin i et 250 ml glasbægerglas.

2. Tilsæt 100 ml syre-alkohol og omrør ved magnetisk omrøring i 10 minutter 3. Filtrer gennem en tørret BOchner-tragt og filterpapir af typen stærk, viskøs, super hurtig eller lignende.

30 4. Skyl bægerglasset fuldstændigt med 6 x 15 ml syre-alkohol.

5. Vask med 60% IPA, indtil filtratet er chlorid-frit* (omtrent 500 ml).

6. Vask med 20 ml 100% IPA.

7. Tør i ca 15 minutter på en Buchner-tragt under vakuumsug.

DK 176653 B1 22 8. Afvej digelen efter tørring og afkøling i exsikkator.

9. Afvej omtrent 0,4000 g af prøven i et 250 ml glasbægerglas.

10 Afvej to prøver til dobbelt bestemmelse.

11 Fugt pektinet med omtrent 2 ml 100% IPA og tilsæt omtrent 100 ml carbon-5 dioxid-frit vand under omrøring på en magnetisk omrører. Under disse be- tingelser går det amiderede pektin ikke i opløsning. Imidlertid er det amide-rede pektin opløseligt under de efterfølgende alkaliske betingelser.

*(Chlorid-test: Overfør omtrent 10 ml filtrat til et reagensglas, tilsæt omtrent 3 ml 10 3 N HN03 og tilsæt et par dråber AgN03. Filtratet er chloridfrit, hvis opløsningen er klar, ellers vil der være en udfældning af sølvchlorid).

Prøven er nu klar til titrering, enten ved hjælp af en indikator eller ved anvendelse af et pH-meter/autoburette 15

Indikator: 1. Tilsæt 5 dråber phenolphtalein-indikator og titrer med 0,1 N NaOH indtil farveændring {notér dette som Vi-titer).

20 2 Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH under omrøring. Lad det henstå i præcist 15 minutter. Under henstand skal prøven være dækket med folie, 3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI og omrør på en magnetomrører, indtil farven forsvinder 4. Tilsæt 3 dråber phenolphtalin og titrer med 0,1 N NaOH indtil farveændring 25 (notér dette som V2-titer).

Blindtest: 30 1. Tilsæt 5 dråber phenolphtaleintol til 100 ml carbondioxid-frit vand og titrer i et 250 ml glasbægerglas med 0,1 N NaOH indtil farveændring (1-2 dråber).

2. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH og lad prøven henstå uberørt i præcist 15 minutter., Under henstand skal prøven være dækket med folie.

DK 176653 B1 23 3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI og 3 dråber phenolphthalein og titrer indtil farveændring med 0,1 N NaOH (notér dette som Bi).

pH-meter/autoburette: 5 1. Titrer med 0,1 N NaOH til pH-værdi 8,5 (notér resultatet som V^titer).

2 Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH og lad prøven henstå uberørt i præcist 15 minutter Under henstand skal prøven være dækket med folie 3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI og omrør på en magnetomrører, indtil pH-værdien 10 er konstant.

4. Titrer efterfølgende med 0,1 N NaOH til pH-værdi 8,5 (notér resultatet som V2-titer)

Blindtest: 15 1. Titrer 100 ml carbondioxid-frit vand til pH-værdi 8,5 med 0,1 N NaOH (1-2 dråber).

2. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N NaOH og lad blindtest-prøven henstå uberørt i præcist 15 minutter. Under henstand skal prøven være dækket med folie.

20 3. Tilsæt 20,00 ml 0,5 N HCI og omrør på en magnetisk omrører, indtil pH- værdien er konstant 4. Titrer til pH-værdi 8,5 med 0,1 N NaOH (notér dette som Bi).

Destillation gennemføres på Kjeitex (destillationsapparat) 25

Kjeitex: Følg de angivne instruktioner med hensyn til start og afslutning.

30 1.. Overfør kvantitativt prøven til destruktionsrøret ved at skylle bægerglasset med en samlet mængde på 100 ml carbondioxid-frit vand i tre trin.

2. Anbring modtagelseskolben indeholdende 150 ml carbondioxid-frit vand og 10,00 ml 0,1 N HCI i apparatet.

DK 176653 B1 24 3. Tilsæt mindst 20 ml 10% NaOH til destruktionsrøret, som indeholder prøven.

4. Indstil destillationstiden til 5½ minut 5. Titrer destillatet med 0,1 N NaOH til pH-værdi 6,2 (notér dette som V3-titer) eller tilsæt 8 dråber methylrødt og titrer med 0,1 N NaOH indtil farveændring 5 (notér dette som V3-titer).

Blindtest-prøven destilleres og titreres som prøven (noter dette som B2-titer)

Beregning: 10 ® Vt = Vi + (V2- Bi) + (B2-V3) ® DE (forestringsgrad) = (V2 - Bi) x 100/Vt • DA (amideringsgrad) = (B2 - V3) x 100/Vt

Bestemmelse af molekylvægt (Mw) og indre viskositet (IV).

15

Til dette anvendes højtydende størrelsesudelukkelseschromatografi (HPSEC) med tripeldetektering.

Princip: 20

En pektin-prøve fraktioneres i overensstemmelse med hydrodynamisk volumen ved anvendelse af størreisesudelukkelseschromatografi. Efter separation analyseres prøven ved et tripel-detektorsystem bestående af brydningsindeks (Rl)-detektor, retvinkellaserlysspredning (RALLS)-detektor og et differential-25 viskometer. Information fra disse detektorer fører til bestemmelse af molekylvægt (Mw) og indre viskositet (IV). Mark-Houwink-faktoren beregnes ved anvendelse af molekylvægten og den indre viskositet, som opnås ved anvendelse af denne fremgangsmåde.

30 Materialer: • Pumpemodel 515, Waters, Hedehusene, Danmark.

• Afgasningsapparat, Gynkotek, Polygen Scandinavia, Århus, Danmark DK 176653 B1 25 ® Søjleovn, Waters, Hedehusene, Danmark.

o AS-3500 Autoprøveoptager med prøvepræpareringsmodul, Dionex Denmark, Rødovre, Danmark.

o 3 lineære mixed bed-søjier, TSK-GMPWXL, Supelco, Bellefonte, Pennsyl-5 vania, USA.

e Flydende fase: 0,3 M lithiumacetat-puffer, pH-værdi 4,8, Fluka Chemte AG,

Buchs, Schweiz.

• Dobbelt detektor, RI, Viscometry, Model 250, Viscotek, Houston, Texas, USA.

10 · RALLS Model 600, Viscotek, Houston, Texas, USA.

Fremgangsmåde:

Omtrent 2 mg af prøven afvejes i et 2000 ml prøveglas. Prøven opløses i auto-15 prøveoptageren efter følgende plan: 8 ml ethanol tilsættes, derefter 1300 ml acetatpuffer (0,3 M, pH-værdi 4,8), prøven opvarmes til 75°C og blandes i 9,9 minutter.. 300 ml af prøven opløses med 900 ml acetat-puffer, blandes derefter i 9,9 minutter. Prøven efterlades ved omgivelsernes temperatur i 20 minutter.

100 ml af prøven indsprøjtes med et 100 ml fuldstændigt loop, og flowhastighed 20 er 0,8 mi/min. To detektorer er til stede in-line, en retvinklet laserlysspred nings-(RALLS)-detektor (Viscotek) og en dobbeltdetektor bestående af brydningsindeks-detektor og et viskometer (Viscotek). Den specifikke stigning i brydningsindeks (dn/dc)-værdi for pektin indstilles til 0,144. Data fra detektorer forarbejdes med tri-SEC-software (Viscotek).

25 • Rheologiske målinger af syntetiske geler.

Materialer: 30 · 3,933 g kaliumcitrat, K3C6H5O7, H20, pro analyse, Merck KGaA, 64271

Darmstadt, Tyskland.

0 1,0 g natriumbenzoat, pro analyse, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Tyskland DK 176653 B1 26 * 3,12 g pektinprøve, til analyse » 124,08 g sukker β X ml 0,1 M CaCI2, pro analyse, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Tyskland, ® 18 + Y ml 50% vægt/volumen citronsyre, pro analyse, Merck KGaA, 64271 5 Darmstadt, Tyskland, ® Olie, flydende ved stuetemperatur.

® 260 g ionbyttet vand.

® 6 krystallisationsskåle, diameter: 61 mm, højde: 9 mm.

® Klart, tr/kfølsomt, klæbende tape.

10 ® TA.XT2 Texture Analyser, Stable Micro Systems, England ® RheoStress RS 100, Haake Fisons, Reciprotor Engineering A/S, DK-4930 Maribo, Danmark.

® Målesystem for RheoStress RS 100: kop/spindel Z20 DIN, Haake Fisons, Reciprotor Engineering A/S, DK-4930 Maribo, Danmark.

15 » Elektrisk varmeplade, Buch & Holm A/S, DK-2730 Herlev, Danmark.

® 1 liters kogekar.

® Elektrisk propelomrører, RW 20, Janke & Kunkel, IKA-Werk, Bie & Berntsen A/S, Rødovre, Danmark.

® Vægt, Mettler PJ 6000, Mettler Instruments, Greifensee-ZCirich, Schweiz.

20

Fremgangsmåde: 117 g IPPA-puffer (3,933 g kaliumcitrat/l, 18 ml citronsyre/!, 1,0 g natriumben-zoat/l) og 260 g ionbyttet vand blandes i et 1 liters kogekar Pektin-prøven, som 25 skal analyseres, tørblandes med 24 g sukker. Sukker- og pektin-blandingen tilsættes derefter til fremstillingen beskrevet ovenfor og opvarmes til kogning, medens der omrøres ved 500 omdrejninger pr. minut 100,08 g sukker tilsættes, og kogning fortsættes, indtil al sukker er opløst. Ion-byttet vand tilsættes, indtil en vægt på 520 g opnås. Bland Y ml CaCI2 og citronsyre, således at pH-30 værdien af den endelige fremstilling er 3,0 +/- 0,1 og tilsæt denne blanding til den kogende opløsning af pektin og sukker under omrøring ved 1000 omdrejninger pr. minut. Vægten af opløsningen indstilles til 520 g ved tilsætning af DK 176653 B1 27 ionbyttet vand og hældes i seks krystallisationsskåie (udstyret med klart, trykfølsomt klæbende tape) og en forvarmet rheometer-kop Z20 DIN ved 90°C,

Koppen dækkes med olie til forhindring af fordampning.

5 De 6 krystallisationsskåle efterlades natten over ved 25°C, derefter bestemmes gel- og brudstyrke sammen med afstand for brud ved anvendelse af TA.XT2-Texture Analyser.

Y-værdier:

Ca2* Ca2+ (4 mg/ml) (ppm) tilsat (ml) 0 0 2 15,4 4 30,8 8 61,5 — 92(3 _ 1231 10 ΤΑ XT2 Texture Analyser-analyser:

Et stempel på 0,5 tomme anvendes, og de følgende indstillinger benyttes: 15 ® Prætest-hastighed: 1,0 mm/s ® Test-hastighed: 0,5 mm/s ® Post-hastighed; 5,0 mm/s ® Brydningstest-hastighed: 1,00 mm/s ® Afstand: 7,00 mm 20 o Kraft: 10 g ® Tid; 5,00 sekunder ® Tælling. 5 DK 176653 B1 28 o Type: auto θ Udløsningskraft: 0,5/1,0 g

RheoStress RS-100-analyser: 5 Så snart prøven hældes i rheometer-koppen og dækkes med olie initieres en temperatursvingning (afkølingshastighed: rc/min, fra 90 til 25°C, frekvens 1 Hz, belastning 0,1-5 Pa) ti! bestemmelse af geleringstemperatur. Ved afslutningen af temperatursvingningen måles ved 25°C gelstyrke (G'} ved frekvensen 10 0,5 Hz, belastning 0,1-5 Pa (afhængigt af prøven). Endelig foretages en belast ningssvingning ved 25°C (frekvens 0,5 Hz, belastning 0,1-446 Pa). Den kritiske spænding angives som den sidste værdi af G', G" og den tilsvarende spænding før nedbrydning efter hærdning ved 25°C i 30 minutter, 15 Eksempler,

Ekstraktion af pektin fra skræl

En række pektin-holdige udgangsmaterialer blev ekstraheret til tilvejebringelse 20 af materiale til efterfølgende de-esterificering med traditionelle fremgangsmåder og de-esterificering med biokatalysatorer.

Tre forskellige pektin-udgangsmaterialer blev benyttet. Disse var tørrede skræller fra citron, appelsin og lime. Tørstoffet af udgangsmaterialerne var ca 90- 25 95%.

For hvert pektin-udgangsmateriale blev 30 kg tørret skræl tilsat til en 1000 liter rustfri ståltank indeholdende en blanding af 3,52 liter 65% salpetersyre og 931 liter ion-byttet vand,

Blandingen blev omrørt, medens den blev opvarmet til 70°C. Under fortsat omrøring fik blandingen lov at reagere ved 70°C i 6 timer.

Efter reaktion blev det varme ekstrakt siet på en vibrerende sigte (Vester Åby 30 DK 176653 B1 29 vibrator med maskestørrelse 0,25 mm, Danmark), Herefter blev det varme ekstrakt tilsat 50 ml ionbyttet harpiks pr. liter ekstrakt (Rbhm & Haas, Amberlite SR 1L, Tyskland), lonbytningen blev gennemført i 30 minutter under omrøring, og det resulterende ionbyttede ekstrakt blev filtreret på et roterende ru vakuum-5 tromlefilter ved 7Q°C. Før filtrering blev vakuumtromlen coatet med ca. 4 cm diatoméjord-filterhjælp (Celite 545).

Det filtrerede ekstrakt blev derefter inddampet under vakuum til ca. en tredjedel volumen 10

Dette koncentrerede ekstrakt blev anvendt i de følgende eksempler til de-esterificering.

Resultater: 15

Udgangsmateriale DE af ekstrakt Mw af ekstrakt Indre viskositet DA dl/g

Citronskræl 65,7 100300 4,267

Orangeskræ! 65J 113800 ' 3^941

Limeskræl 64,3 124950 5,00w

Tabel 1: Esterificeringsgrad, molekylvægt og indre viskositet af ekstrakter, som blev anvendt til yderligere de-esterificering. Wlw betegner molekylvægten.

20 Efter ekstraktion lå esterificeringsgraden mellem ca. 64 og ca. 66% afhængig af det anvendte udgangsmateriale. Molekylvægten viste et interval fra ca. 100 000 Dalton til ca. 125.000 Dalton for citrusfrugt-baserede udgangsmaterialer.

Sammenliqninqseksempel 1 25

De-esterificering ved anvendelse af syre:

Fra udgangspektin-materialerne blev 60 liter koncentreret ekstrakt afkølet til DK 176653 B1 30 50°C i en omrørt, kappe-om hyllet rustfri ståltank 456 g 65% salpetersyre blev tilsat under omrøring, og blandingen fik lov at reagere ved 50°C, indtil en ønsket esterificeringsgrad på ca. 40% blev opnået. Da dette var gennemført, blev 30 liter af reaktionsblandingen udfældet i 90 liter 80% isopropanol, vasket i ca. 5 5 minutter i 60% isopropanol, presset i en hydraulisk presse og ca. 100 g af det pressede materialet anvendt til måling af tørstof, forestringsgrad, molekylvægt etc. Det tilbageblevne pressede materiale blev delt i to afvejede portioner til senere amidering.

10 Det tilbageblevne 30 liter koncentreret ekstrakt blev yderligere omsat, indtil en forestringsgrad på ca. 30% og blev derefter behandlet i overensstemmelse med den tidligere prøve.

Resultater:

Udgangsmateriale Forestringsgrad Molekylvægt Delta Mw % Da (%)

Citron-pektin 39,3 62600 -37,6 65,7% DE 33,0 65800 -34,4

Appelsinskræl 36,6 60100 -47,2 65,1% DE 28,3 58000 -49,0

Limeskræl 40,0 73550 -41,1 64,3% DE 31,5 66500 -46,8 15

Tabel 2: Ændring i molekylvægt ved syre-de-esterlficerlng.

Når pektin-udgangsmaterialerne blev anvendt til syre-de-esterificering, blev molekylvægten af de de-esterificerede pektiner reduceret med ca. 34% og 49%, 20 Når man de-esterificerer pektin ved anvendelse af den traditionelle syre-de-esterificeringsproces, er reduktionen i molekylvægt således væsentlig .

Eksempel 1: 25 De-esterificerinq ved anvendelse af biokatalysator: DK 176653 B1 31

Pektin-udgangsmaterialerne, 60 liter koncentreret ekstrakt blev afkølet til 45°C i en kappeomhyllet rustfri ståltank under omrøring. pH-værdien af ekstraktet blev indstillet til 4,5 med en 10% natriumcarbonatopløsning. 540 enheder pr. liter koncentreret ekstrakt (fremgangsmåde) af Rheozym (Novozymes, Danmark) 5 blev tiisat. pH-værdien af ekstraktet blev holdt konstant på 4,5 ved tilsætning af en 10% natriumcarbonatopløsning. Den følgende beregning blev anvendt til at fastslå ændringen af forestringsgraden i pektinet, som resulterer fra den tilsatte mængde natriumcarbonat: Δ DE = (40,56541) (gram soda pr. gram pektin) + 3,383. Når den beregnede mængde natriumcarbonat blev tilsat for at nå en 10 forestringsgrad på 40%, blev 30 liter af reaktionsblandingen overført til en anden kappeomhyllet rustfri ståltank med omrøring. pH-værdien blev indstillet til 2,5 med fortyndet salpetersyre til standsning af biokatalysatorreaktionen, og blandingen blev opvarmet til 80°C og holdt ved denne temperatur i 10 minutter for at inaktivere biokatalysatoren.

15

Blandingen blev afkølet til under 50°C, og behandlet på samme måde som prøverne i sammenligningseksempel 1,

De tilbageblevne 30 liter koncentreret ekstrakt blev yderligere omsat, indtil en 20 beregnet forestringsgrad på ca. 30% og blev derefter behandlet i overensstemmelse med den tidligere prøve.

Resultater:

Udgangsmateriale Forestringsgrad Molekylvægt Delta Mw (%) Da %

Citronskræl 302 92200 43?! 65,7% DE 28,6 93350 -6,9

Appelsinskræl 39,9 101950 -10,4 65,1% DE 31,2 100550 -11,6

Limeskræl 39,1 114750 -8,2 64,3% DE 29,8 108500 -13,2 25 Tabel 11: Ændring i molekylvægt ved biokataiysator-de-esterificering DK 176653 B1 32 Når pektin-udgangsmaterialerne blev anvendt til biokatalysator-de-esterificering blev molekylvægten af de de-esterificerede pektiner reduceret med ca 7% og 13%. Anvendelsen af biokatalysatorer til de-esterificeringen af pektin resulterede således i meget mindre depolymerisering af pektin-udgangsmaterialerne.

5

Ud fra sammenligningseksempel 1 og eksempel 1 følger det, at forholdet R mellem molekylvægten af pektin-udgangsmateriale og molekylvægten af de-esterificeret pektinmateriale var som følger:

Prøve Citron Appelsin Lime _ _ _ ^ _ "Start 65/7 1~00 65J L00 64~3 L00 __ __ __ __ 33,0 1,52 28,3 1,96 31,5 1,88 Έϊό 36/2 L09 39^9 ΓΪ2 39J 0)9 28,6 1,07 31,2 1,13 29,8 1,15 10 --

Tabel 1.2: Opsummering af ændringer i molekylvægt

Ved anvendelse af en biokatalysator ti! de-esterificering forøges forholdet R betydeligt mindre, end når de-esterificeringen blev bragt i stand med traditionel sy-15 re Faktisk resulterede traditionel de-esterificering i en stigning af R fra 1 til så meget som 1,96, biokatalysator-de-esterificering resulterede i en stigning på kun 1,15.

Eksempel 2 20

Amidering:

De otte prøver fra sammenligningseksempel 1 og eksempel 1 blev amlderet 17 liter 70% isopropanol blev overført til en 30 liters kappeomhyllet rustfri ståitank 25 med omrøring, som var udstyret med et tæt låg. 6 liter 25% ammoniakopløsning blev tilsat, og temperaturen blev bragt ned til 5°C 1 kg presset materiale fra DK 176653 B1 33 sammenligningseksempel 1 og eksempel 1 blev tilsat i hvert af sammenligningseksempel 1 og eksempel 1 blev fire prøver amideret Af disse blev to prøver de-esterificeret til en højere esterificeringsgrad og to til 5 en lavere esterificeringsgrad.

For både den højere og lavere forestringsgrad var en højere og lavere amide-ringsgrad ønsket, og for at gennemføre dette blev amidering gennemført ved 5°C i 2½ time eller i 5 timer. Efter den specificerede reaktionstid blev det omsat-10 te pressede materiale drænet, vasket i 20 ml 60% isopropanol, drænet igen, tilsat 20 liter 60% isopropanol, og pH-værdien blev indstillet til 4,2 - 4,4 med fortyndet salpetersyre og drænet Endelig blev dette drænede materiale vasket i 20 liter 50% isopropanol, drænet, presset og tørret ved 70°C natten over .

15 Resultater;

Indre viskositet

Under amidering forekommer en konformationsændring i pektinet, som henfø-20 res til graden af aggregering af pektinet. Indre viskositet af et pektin påvirkes af både graden af aggregering og af molekylvægten af pektinet. Eftersom det har vist sig, at den indre viskositet af et pektin er direkte relateret til gelstyrken af geler, som er fremstillet med dette pektin, er den indre viskositet den foretrukne parameter at spore. Vi har derfor defineret R2 som forholdet mellem den indre 25 viskositet af pektin-udgangsmateriale i tabel 1 og den indre viskositet af det amiderede pektin, som resulterer fra en amidering af pektin-udgangsmaterialet.

DK 176653 B1 34

Amiderinq efter syre-de-esterificering;

Skræl DE start DE slut DA slut IVW R2 __%__%__% dl/g__

Citron 33,0 14,7 13,3 3,417 1,25 33.0 9,5 15,8 3,352 1,27 39.3 20,2 15,4 3,714 1,15 39.3 9,5 21,8 3,534 1,21

Appelsin 28,3 15^0 Ϊ3β 2,832 U9 28.3 9,6 13,7 2,794 1,41 36.6 17,7 14,4 3,253 1,21 36.6 10,4 22,1 3,098 1,27 lime 3l5 R3 Tlo ' 3,545 Ϊ7Ϊ 31,5 10,0 15,6 3,245 1,54 40.0 20,4 14,6 3,901 1,28 40.0 12,8 21,6 3,571 1,40 5 Tabe! 2.1: Indre viskositet af amiderede pektiner, som først er de-esterificeret Bemærkninger til søjler: * 1 "skræl" betegner pektin-udgangsmaterialet.

• 2 "DE start" betegner graden af forestring, som resulterer fra den første syre-de-esterificering * 3 "DE slut" betegner graden af esterlflcertng efter amidering 10 · 4 "DA slut" betegner graden af amidering efter amidering.

• 5 "IVw" betegner den indre viskositet efter amidering.

Dataene i tabel 2.1 viser de følgende ændringer i indre viskositet: 15 - Citron: syre-de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 15- 27%

Appelsin: syre-de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 21-41%

Lime: Syre-de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 28-54%.

Amiderinq efter biokatalvtisk de-esterificeringi 20 DK 176653 B1 35 _____ de start DE slut DA slut fiVw R2 __%__%__% dl/g__

Citron 28,6 12,9 9,5 3,644 1,17 28,6 10,2 12,7 3,874 1,10 36.2 17,7 14,2 4,148 1,03 36.2 11,0 17,0 3,711 1,15

Appelsin 31^2 TSjB 10,9 3,354 ΓΪ8 31.2 9,3 15,8 3,337 1,18 39.9 20,7 13,2 3,806 1,04 39.9 11,3 19,8 3,582 1,10 _____ __ ___ _____ _____ __ 29,8 7,9 16,1 4,266 1,17 39.1 18,1 16,1 4,569 1,09 39.1 10,9 21,7 4,422 1,13

Tabel 2.2: Indre viskositet af amiderede pektiner, som ferst er de-esterificeret med biokatalysator Bemærkninger til sejler; • 1 "skræl" betegner pektin-udgangsmaterialet.

5 o 2 "DE start” betegner graden af forestring, som resulterer fra biokatalysator-de-esterificering.

• 3 "DE slut" betegner graden af esterificering efter amidering.

• 4 "DA slut" betegner graden af amidering efter amidering, • 5 "IVw" betegner den indre viskositet efter amidering.

10 Dataene i tabe! 2 .2 viser de følgende ændringer i indre viskositet

Citron: biokatalytisk de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 3-17% 15 - Appelsin: biokatalytisk de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 4-18%

Lime: biokataiytisk de-esterificering resulterer i et fald i indre viskositet på 9-17%.

DK 176653 B1 36

Rheoloaiske målinger af syntetiske geler Gelstyrke på RheoStress RS-100

Skræl De-ester- DE DA Gelstyrke ved 25°C, Pa fremgangsmåde slut slut ___%_%__

Calcium-indhold, ppm - - — ggg,61i5| Q2 3 m i

Citron Syre 9,5 21,8 56,4 111 153 399 præ- præ- __________gel gel

Biokatalysator 11,0 17,0 202 459 545 668 792 1060

Appelsin Syre 17,7 14,4 οΧΤΪίΓ 16,9 217 326 364”

Biokatalysator 20,7 13,2 0$ 3,6 29,6 218 361 369“

Lime Syre 12,8 21,6 102 104 139 383 722 904” —— 0f18 048 5^5-209 492 596"

Biokatalysator 10,9 21,7 190 399 526 688 1250 1010 126 114 078 ig7 [g" “275 892 927~ 5

Tabel 2.3: Gelstyrke af amiderede pektin-geler ved forskellige caiciumkoncentrationer

Fig 2 3 viser data i tabel 2.3 med gel-styrken langs y-aksen og calcium-koncentrationen langs x-aksen.

10

Ved sammenligning af hver enkelt sæt amideret pektin baseret på udgangsmaterialet blev det bemærket, at for hvert udgangsmateriale, var gelstyrken af det amiderede pektin, som var de-esterificeret med biokatalysator, meget højere Dette var især bemærkelsesværdigt for udgangsmaterialerne citron og lime, 15 hvorimod effekten på gelstyrken for biokatalysator-de-esterificering var mindre udtalt for appelsin.

20 DK 176653 B1 37

Kritisk spænding på RheoStress RS-100

Skræl Deester- DE DA Kritisk spænding, Pa frem- slut slut gangs- % % __måde__________

Calcium-indhold, ppm _ 15)4 30,8 61,5 92,3 123,1

Citron Syre 9/5 2Ϊ/Ϊ 20,18 3ΪΤ 76,04 76,04 118,3 76,04

Biokataly- ThO 17/) 118,3 286,6 286,6 286,6 286,6 118,3 __sator____________

Appelsin Syre 17,7 14,4 NG 12,97 76,04 286,6 286,6 286,6

Biokataly- 20,7 13,2 NG 48,86 184,2 TS TS TS

__sator_________

Lime Syre 12,8 21,6 48,86 48,86 48,86 76,04 48,86 76,04 ___14,3 13,0 NG NG 31,4 184,2 286,6 286,6

Biokataly- 10,9 21,7 118,3 184,2 286,6 286,6 184,2 118,3 __sator_________

12,6 1 11,4 NG 3,44 76,04 TS TS TS

5 Tabel 2.4: Kritisk spænding for amiderede pektin-geler ved forskellige calcium-koncentrationer.

Fig. 2.4 viser data i tabel 2 .4 med kritisk spænding langs y-aksen og calciumkoncentration langs x-aksen.

10 Bemærk: • NG betegner, at ingen gel blev dannet, og således at prøven ikke kunne måles • TS betegner for stærk en gel og således uden for måieintervallet for appara-tet.

15

Som for gelstyrken blev den kritiske spænding stærkt forøget, når biokatalysator blev anvendt til de-esterificering sammenlignet med den traditionelle syre-de-esterificering.

DK 176653 B1 38

Brudstyrke på TA.XT2 Texture Analyser

Skræl Deester- DE DA Brudstyrke ved 25°C, gram frem- slut slut gangs- % % __måde____

Calcium-Indhold, ppm _ - 15|4 30 8 i 615 92]3 123i1

Citron Syre 21^8 ΗΪ0 5J0 5,50 7,80 10,20~ 8,70

Biokataly- 11,0 17,0 18,20 34,10 46,00 54,60 37,30 25,00 ___sator__________

Appelsin Syre 17,7 14,4 NG 11,70 13,50 31,30 42,00 36,40

Biokataly- 20,7 13,2 5,83 14,53 21,53 29,26 39,93 43,97 __sator___________

Lime Syre 12,8 21,6 14,10 5,10 5,50 7,80 10,20 8,70 _ 14,3 13,0 - - 20,20 46,30 57,90 43,40

Biokataly- 10,9 21,7 18,20 34,1 46,00 54,60 37,30 25,00 __sator__________ I 12,6 I 11,41 - I - I 32,6 76,20 101,20 94,40

Tabel 2.5: Brudstyrke af amiderede pektin-geler ved forskellige calcium-koncentrationer.

5

Fig. 2 5 viser data i tabel 2.5 med brudstyrke langs y-aksen og calciumkoncentration iangs x-aksen.

Bemærkninger: 10 · NG betegner, at ingen gel blev dannet, og således at prøven ikke kunne må les « - betegner, at ingen værdier blev genereret.

For udgangsmaterialerne citron og lime var forskellen i brudstyrke markant anis derledes ved sammenligning med traditionel de-esterificering ved anvendelse af syre i forhold til biokatalysator-de-esterificering. Ved de-esterificering med biokatalysator var brudstyrken af geler, som var fremstillet med de resulterende amiderede pektiner, meget højere end de tilsvarende brudstyrker af amiderede pektiner, som var fremstillet ud fra traditionelt syre-de-esterificerede udgangs-20 materialer. Virkningen var også tydelig for udgangsmaterialet appelsin.

DK 176653 B1 39

Gelstvrke på TA.XT2 Texture Analyser

Skræl Deester- DE DA Gelstyrke ved 25°C, gram fremgang slut slut __småde__%__%___________ ____Calcium-indhold, ppm

______ 0 15,4 30,8 | 61,5 I 92,3 123T

Citron Syre 9,5 21,8 - 2,30 5,10 5,40 6,70 4,60

Biokata- 11,0 17,0 4,60 7,60 15,10 15,80 13,10 8,50 iysator __

Appel- Syre 17,7 14,4 - 0,93 1,67 4,70 7,77 9,00 sin___________

Biokata- 20,7 13,2 0,70 1,07 1,73 3,57 5,50 7,40 __Iysator_________

Lime Syre 12,8 21,6 6,80 2,40 2,40 4,40 5,10 4,80_ ___14,3 13,0 5,20 9,60 16.20 18,90 15,70 12,60

Biokata- 10,9 21,7 - - 1,30 4,90 9,40 11,90

Iysator ___ _ 12,6 11,4 I - i - I 1,70 8,80 14,60 19,20 5 Tabel 2,6: Gelstyrke af amiderede pektin-geler ved forskellige calciumkoncentrationer,

Fig 2.6 viser data i tabel 2 6 med gelstyrke langs y-aksen og calcium kon centration langs x-aksen, 10 Bemærk: e betegner, at ingen værdier blev genereret..

Mønsteret var det samme. Citron- og lime-baserede amiderede pektiner viste en markant stigning i gelstyrke, når biokatalysator blev anvendt til de-15 esterificering af udgangsmaterialet, forud for amidering. Med hensyn til gelstyrke, forekom appelsin-udgangsmateriale at være upåvirket af de-esterificeringsfremgangsmåden før amidering.

Eksempel 3

Virkning af forestringsgrad af udgangsmateriale ti! amidering på Mark-Houwink- 20 DK 176653 B1 40 faktor og virkningen i hindbær-gel.

i dette eksempel blev udgangsmaterialet for amidering fremstillet i overensstemmelse med eksempel 2, Udgangsmaterialet blev imidlertid før amidering 5 de-esterificeret til en vis grad ved anvendelse af en biokatalysator.

Start DE, % "a" af det resulterende amiderede pektin 58 " 083 52 0,84 46 0,86 42 0,91 33 0,93 30 0,96

Tabel 31: Mark-Houwink-iaktor ved forskellige esterificeringsgrader 10 Fig. 3.1 viser data i tabel 3.1 med Mark-Houwink-faktor langs y-aksen og DE langs x-aksen.

Afbildningen viser en forøgelse af Mark-Houwink-faktoren, når DE for udgangsmaterialet formindskes. Den indikerer således, at når DE for udgangsma-15 terialet før amidering blev reduceret, opnåedes et mindre aggregeret, amideret pektin. Dette fører til et amideret pektin med bedre opløselighed, og følgelig et amideret pektin, som frembringer stærkere geler. Afbildningen indikerer også et lokalt maksimum ved ca. 42% DE, som indikerer, at et specielt stang-lignende amideret pektin blev fremstillet ud fra et sådant udgangsmateriale 20

For yderligere at klarlægge de særlige fordele ved anvendelse af et udgangsmateriale med en særlig DE, blev hindbær-geléer fremstillet med tre af de amiderede pektiner i overensstemmelse med eksempel 2.

DK 176653 B1 41

Materialer:

Emne Indhold Koncentration Forhandler

Opløsning Hindbærjuice 300 g/! Rynkeby, Ringe A Sukker 160 g/ί Danmark

De-ioniseret vand 185 g/l Danisco A/S,

Hanevand 185 g/l Danmark

Opløsning Pektin 0,56 g/l B De-ioniseret vand 160 g/l

Opløsning Natriumbenzoat 2 ml/kg Merck, Darm stadt, Tyskland C Kaliumsorbat 2 mi/kg Merck Darmstadt,

Tyskland

Opløsning Citronsyre (50% 5 ml/kg Merck, Darm- D (volumen/vægt)) stadt,

Tyskland • Vægt Mettler PJ 6000 (Mettler-Toledo, København, Danmark) • 2 liters kogekar 5 » Elektrisk varmeplade (Blomberg) • Waring-blandeapparat (Waring Products Division) • Bloom-glas, Pyrex • TA.TXT2 10 Fremgangsmåde

Hindbærjuice, sukker og vand (opløsning A) blev blandet Fremstillingen blev kogt, indtil al sukker blev opløst. Pektin blev opløst i varmt vand (90°C) (opløsning B) ved anvendelse af en Warring-blandemaskine med høj forskydning.

15 Pektinet (B) blev derefter tilsat til opløsning A, medens fremstillingen blev om-rørt kontinuert. Efter tilsætning af pektin-opløsningen, blev fremstillingen kogt i omtrent 2 min under omrøring Vand blev derefter tilsat, indtil en nettovægt på 1000 g.

42 DK 176653 B1

Konserveringsmidler (opløsning C) blev derefter tilsat. Endelig blev citronsyre (opløsning D) tilsat. Derefter blev igen nettovægten indstillet med vand til 1000 g. Fremstillingen blev fyldt i bloom-glas og blev efterladt natten over ved 25°C, 5 derefter blev gel- og brudstyrke bestemt sammen med afstand for brud ved anvendelse af TA.TXT2-analyseapparat.

TA.XT2-analvser: 10 Et stempel på V* tomme blev anvendt, og det følgende program blev benyttet; præ-test-hastighed 2,0 mm/s, test-hastighed 0,5 mm/s, post-hastighed 10,0 mm/s, brudtest-hastighed 1,00 mm, afstand 24,00 mm, kraft 40 g, tid 0,09 sek., tælling 5, type auto, udløsningskraft 2,5 g.

Start DE Brudstyrke, Ί Vurdering af geler % gram 58 337 Blødest gel, acceptabel, in gen prægelering 42 813 Stærkest gel. Ingen prægele ring 30 769 Stærk gel. Prægelering indi keret.

15

Tabel 3.2: Brudstyrke af amiderede pektin-geler.

Fig. 3.2 viser data i tabel 3.2 med brudstyrke langs y-aksen og DE langs x-aksen.

20 Særligt opløselige og således stærke gel-frembringende amiderede pektiner blev således fremstillet ud fra udgangsmaterialer, som var blevet de-esterificeret med biokatalysator til en forestringsgrad i intervallet fra ca. 30 til ca.

45%.

25 DK 176653 B1 43

Eksempel 4

Virkning af forestrinqsqrad og udgangsmaterialer til amiderinq på Mark-Houwink-faktor og virkningen i syntetiske geler.

5 1 dette eksempel blev udgangsmaterialet til amidering fremstillet ifølge eksempel 2. Før amidering blev udgangsmaterialet imidlertid de-esterificeret til et vist niveau ifølge tabel 3.1 ved anvendelse afen biokatalysator.

10 Yderligere blev pektinerne anvendt til fremstilling af syntetiske geler i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet tidligere {Rheologiske målinger af syntetiske geler).

To forskellige udgangs-pektiner blev anvendt. I test nr. 1 havde udgangspekti-15 net en højere molekylvægt end udgangspektinet i test nr. 2;

Test Start DE Molekylvægt nr. % Dalton Ί 46 152100 38 Ϊ49550 34 156500 2 61 Ti 0950 49 121050 36 113650

Tabel 4.1: Molekylvægt og indre viskositet af de de-esterificerede pektiner før amidering DK 176653 B1 44

Test Start DE a Slut DE Slut DA Gelstyrke ved 25°C, Pa nr. % % %

Calcium-indhold, ppm " ~~ 61,5 I 92,3 123/Γ Ί 46 0,794 2Ϊ3 187 356 475 577 38 0815 10,8 193 951 1540 Ϊ9Ϊ0 _ ο,83Ϊ 93 17\6 1460 2090 2530 ~2 61 0857 205 2Ϊ3 98 97 64 49 0,872 2X0 19^3 315 468 497 36 0,933 Τθ3 Ϊ67 927 1530 1680

Tabel 4,2: To amiderede pektiner fremstillet ud fra forskellige udgangsmaterialer og virkningen af start DE på Mark-Houwink-faktor og gelstyrke, 5

Resultaterne fra test nr, 1 og 2 er som følger; I test nr 1 var gelstyrkerne, skønt de enkelte prøver af amideret pektin var lignende med hensyn til molekylvægt og amideringsgrad, af disse amiderede pek-10 tiner ikke så sammenlignelige som det ses i tabel 4.2. Resultaterne viser at fo restringsgrad en af det de-esterificerede pektin før amidering ultimativt har en effekt på gelstyrken af det resulterende amiderede pektin Uden at være bundet af nogen teori resulterer konformationelie ændringer i amiderede pektiner, som indikeret ved stigningen i Mark Houwink-faktor, ”a", i amiderede pektiner, som 15 udviser forbedrede gelstyrker Således indikerer tabe! 4.2, at anvendelsen af en bio-katalysator til de-esterificering af et pektin-udgangsmateriale forud for amt-dering, i et amideret pektin med forbedret gelstyrke.

I test nr. 2 vises også samme fænomen som test nr. 1. Imidlertid viser test nr. 2 20 yderligere, at graden af esterificering af det bio-katalysator-de-esterificerede pektin fortrinsvis er under 60%, for at det resulterende amiderede pektin udviser betydeligt forøgede gelstyrker, sammenlignet med pektiner, som er de-esterificeret ved anvendelse af syre.

DK 176653 B1 45 Værdien af reduktionen af graden af esterificering af udgangsmaterialet til under 60% før amidering for at forøge gelstyrken er fremhævet i fig 4.. 1 og fig. 4..2..

5

Claims (24)

1, Fremgangsmåde tii fremstilling af amideret pektin med lav forestringsgrad omfattende trinnene: opnåelse af et pektin-udgangsmateriale, at bringe pektin- 5 udgangsmaterialet i kontakt med en biokatalysator, som er i stand til at de-este-rificere pektin-udgangsmaterialet, at gøre det muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til frembringelse af et de-esterificeret pektin, og yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin ved at bringe det de-esterificerede pektin i kontakt med en syre eller et alkali, som er i stand 10 til at de-esterificere, og at gøre det muligt for syren eller alkaliet yderligere at de-esterificere det de-esterificerede pektin til frembringelse af et pektin med lav forestringsgrad, hvor pektin-materialet under eller efter den yderligere de-esterificering amideres ved at bringe det de-esterificerede pektin i kontakt med ammoniak, 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det gøres muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en forestringsgrad under 60% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det gøres muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en forestringsgrad på mellem 60% og 30% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det gøres muligt for biokatalysatoren 25 at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en forestringsgrad på mellem 45% og 30% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det gøres muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en esterificeringsgrad på mellem 30 45% og 40% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin. DK 176653 B1 47

6, Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det gøres muligt for biokatalysatoren at de-esterificere pektin-udgangsmaterialet til en forestringsgrad på 42% før yderligere de-esterificering af det de-esterificerede pektin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at biokatalysatoren udvælges fra gruppen omfattende pektin-methylesterase (E.C. 3.1.1.11).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at pektin-methylestera-sen (E.C.3.1,1.11) de-esterificerer på en tilfældig måde. 10

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at pektin-methylestera-sen (E.C.3.1..1.11) de-esterificerer på en blokagtig måde.

10. Amtderet pektin, som er opnåeligt ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af 15 kravene 1-9, kendetegnet ved, at det har et forhold R2, mellem indre viskositet af det de-esterificerede udgangspektin og den indre viskositet af det amiderede pektin i intervallet fra 1,01 til 1,25.

11. Amideret pektin ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det har et forhold R2, 20 mellem indre viskositet af det de-esterificerede udgangspektin og den indre viskositet af det amiderede pektin i intervallet fra 1,03 til 1,18.

12. Amideret pektin ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det har et forhold R2, mellem indre viskositet af det de-esterificerede udgangspektin og den indre vi- 25 skositet af det amiderede pektin i intervallet fra 1,04 til 1,15.

13. Amideret pektin ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det har en forestringsgrad på 30% eller mindre og en amideringsgrad på 18% eller mindre.

14. Amideret pektin ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det har en forestrings grad på 10-20% og en amideringsgrad på 10-20% DK 176653 B1 48

15. Amideret pektin ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det har en forestrings-grad på 12-18% og en amideringsgrad på 5-30%,

16. Amideret pektin, som er opnåeligt ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af 5 kravene 1-9, kendetegnet ved, at det udviser en Mark-Houwink-faktor, "a" på over 0,8.

17. Amideret pektin, som er opnåeligt ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at det udviser en Mark-Houwink-faktor, "a", i in- 10 tervaliet fra 0,8 -1,0.

18. Amideret pektin, som er opnåeligt ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at det udviser en Mark-Houwink-faktor, "a", i intervallet 0,85-0,95. 15

19. Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i fødeva rer.

20 Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i marme-20 lader og geléer.

21 Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i mejeriprodukter.

22. Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i farma ceutiske produkter.

23. Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i produkter til personlig pleje. 30

24. Anvendelse af et amideret pektin ifølge ethvert af kravene 10-18 i husholdningsprodukter.