DK172444B1 - Kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf, fremgangsmåde til deres fremstilling, rekombinant DNA og fremgangsmåde t - Google Patents

Description

i DK PR 172444 B1

Den foreliggende opfindelse angår kimære monoklonale antistoffer bestående af variable områder af museoprindelse og humane konstantområder og derivater deraf, fremgangsmåder til fremstilling af disse kimære monoklonale antistoffer og 5 deres derivater, rekombinant DNA, der koder for tunge og lette kæder af disse antistoffer, fremgangsmåde til fremstillingen af det rekombinante DNA, værtsceller transformeret med det rekombinante DNA, fremgangsmåde til fremstilling af værtscellerne, anvendelsen af de kimære monoklonale antistof-10 fer og deres derivater til diagnose og behandling af cancer, analysesæt, som indeholder de kimære monoklonale antistoffer, og farmaceutiske præparater, der indeholder antistofferne.

Immunglobuliner (antistoffer) spiller en vigtig rolle i 15 pattedyrs immunsystem. De dannes af plasmaceller og består af to identiske lette (L) polypeptidkæder og to identiske tunge (H) polypeptidkæder forbundet ved hjælp af disulfid-broer, eller polymerer af denne 4-kædede grundstruktur. De lette kæder er af typen κ eller λ, og de tunge kæder er af 20 typen μ, δ, γ, α eller t. Hver kæde består af et variabelt (V) område og et konstant (C) område. V-områderne, som viser betydelige sekvensforskelle i antistoffer med forskellig specificitet, omfatter yderst variable dele, såkaldte hypervariable områder eller komplementaritets-25 bestemmende områder (CDRs), flankeret af relativt konservative dele, såkaldte strukturområder (FRs).

Antistoffer er bifunktionelle molekyler. På den ene side forbinder de N-terminale variable dele af H- og L-kæde-30 polypeptiderne sig på yderst specifik og individuel måde under dannelse af en tredimensionel struktur med en entydig affinitet for specifikke kemiske strukturgener (epitoper) på overfladen af et antigen, dvs. et molekyle, som genkendes som fremmed af organismen og fremkalder et 35 immunrespons. Sådanne epitoper kan være molekyler med lav molekylvægt (haptener) eller dele af makromolekylære ke- 2 DK PR 172444 B1 miske strukturer, såsom proteiner, kulhydrater og glyco-proteiner, f.eks. celleoverfladeantigener.

Immunglobulinmolekylets (Ig) entydige antigenkombinerende 5 egenskaber skyldes genetisk rekombination af H- og L-kæde-kimliniegener på et tidligt stadium i B-celledifferentie-ringen, f.eks. under embryogenese: et ud af flere hundrede V-segmenter bindes til et af et lille antal forbindelsessegmenter (J-segmenter), og i tilfælde af H-kædelocus, 10 yderligere diversitetssegmenter (D-segmenter), hvorved der dannes et fuldstændigt entydigt sammenhængende V-(D)-J-om-lejret gensegment, der koder for et Ig-molekyle med specifikke antigenkombinerende egenskaber. Foruden antistof-forskelligartethed fremkaldt ved simpel genrekombination 15 kan det nøjagtige forbindelsessted, hvor V- og J-segment-gener kombinerer, varierer en smule. Da forbindelsesreaktionen kan optræde mellem forskellige basepar og yderligere nukleotider kan adderes under rekombinationsprocessen, kan forskellige aminosyrer, som ikke er kodet i 20 kimlinien, indsættes på stedet for hver potentiel V-J-eller D-J-kombination. Endvidere bidrager somatisk mutation af enkelte baser også til Ig-forskelligartethed.

Det andet væsentlige strukturtræk ved Ig-molekyler er deres evne til at aktivere forskellige biologiske reak-25 tionsveje i immunsysternet. Disse såkaldte effektorfunk-tioner (komplementbinding, stimulering af fagocytose, aktivering af frigørelse af mastceller fra granulationsvæv) findes hovedsagelig i de carboxyterminale segmenter i det konstante område af H-kædepolypeptiderne og er årsag 30 til dannelse af forskellige Ig-klasser (IgA, IgE, IgG, osv.), som fastlægger antistoffets rolle i et bestemt immunrespons.

Udviklingen af hybridomateknik har muliggjort dannelsen af kontinuerte cellelinier, for det meste murine hybrido-35 maer, der danner monoklonale antistoffer med ønsket 3 DK PR 172444 B1 specificitet, der kan anvendes til at identificere, isolere og karakterisere biologisk vigtige molekyler. En væsentlig begrænsning ved anvendelsen af murinafledte 5 monoklonale antistoffer som in vivo-diagnostika og terapeutika er imidlertid deres immungenisitet som fremmedproteiner, deres temmelig lange opholdstid i kredsløbet og dannelsen af skadelige immunkomplekser. På den anden side er behandlingen med humane monoklonale 10 antistoffer også begrænset, da human hybridomacellelinier kun er tilgængelige i et lille antal, sædvanligvis er ustabile og danner ikke monoklonale antistoffer med passende specificitet i tilstrækkelige mængder til rimelige priser.

15 Et lovende alternativ er modificeringen af immunglobulin-gener ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik. En mulighed for at nedsætte immungenisiteten og at undgå uønsket immunrespons er f.eks. fremstillingen af kimære antistoffer med fordelene og selektiviteten ved murine monoklonale 20 antistoffer og tillige de artsspecifikke egenskaber ved humane antistoffer.

Alle de teknikker, som kan anvendes til samling af kimære gener og fremstillingen af kimære antistoffer, indbefatter standardmetoder inden for rekombinant DNA-teknik (identi-25 ficering og isolering af Ig-gener, indsætning af de klonede gener i vektorer, transfektion til levedygtige cellelinier, ekspression af kimære proteiner). Afhængigt af kilden til generne, som skal kombineres, og naturen af de gener, som koder for det antigenspecifikke variable 30 område, opstår der imidlertid særlige problemer, og det er nødvendigt at udvikle nye metoder for at opnå brugbare løsninger.

Der er gjort adskillige forsøg på at fremstille kimære antistoffer. De afviger imidlertid med hensyn til den 35 grundlæggende idé, og de opnåede forskningsresultater varierer kendeligt med hensyn til rekombinantmolekylernes 4 DK PR 172444 B1 natur og egenskaber.

Der er fremstillet kimære antistoffer af adskillige immun-globuliner.

5 Neuberger et al. (Nature 314, 268, 1985) beskriver et kimært IgEXl-antistof, hvis tunge kæde er sammensat af et humant e konstant område fusioneret ved et variabelt museområde, som er specifikt for haptenet 4-hydroxy-3-nitro-phenacetyl (NP). Teknikken, som er anvendt til fremstil-10 lingen af det kimære antistof, er at konstruere et kimært gen, som koder for den tunge kæde, og at indføre dette kimære DNA-segment i J558L-musecellelinien, hvori den udtrykte kimære tunge kæde samles med den endogene lette musekæde til dannelse af komplette IgE-molekyler.

15 Boulianne et al. (Nature 312, 643, 1984) har bundet de variable områder af de tunge og lette kæder fra et anti-TNP-musemyeloma til henholdsvis humane μ- og κ-gener. De kimære gener er tranfekteret til myelomaceller. Imidlertid er det udskilte IgM ikke så effektivt som det oprinde-20 lige muse-IgM og viser andre bindingsegenskaber.

Dannelsen af kimært immunglobulin G ved at forbinde humane 7 konstante gener til murine variable gener er beskrevet forskellige steder.

I beskrivelsen til patentansøgning WO 87/02671 omtales et 25 kimært antistof, som binder til virale antigener, især hepatitis B-overfladeantigen, dannet ud fra et humant 7l-område og et variabelt område fra musemyeloma CRL 8017.

Der er også beskrevet dannelsen af et murint/humant kimært antistof på basis af det murine monoklonale antistof (MAb) 30 L6, hvilket også er beskrevet af Liu et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci. ΪΪ4, 3439, 1987). MAb L6 [IgG2a(x)] binder til et kulhydratantigen, som findes på overfladen af celler afledt af forskellige humane carcinomer. Der anføres nøj- 5 DK PR 172444 B1 agtige data for den humane coloncarcinomacellelinie C-3347. y2a og κ konstantområderne i MAb L6 er ombyttet med human 7I og κ konstantområderne ved rekombinering af 5 cDNA-molekyler, som koder for domæner med variable eller konstante områder.

Et andet kimært monoklonalt antistof rettet mod overfladeantigenerne på humane carcinomer er fremstillet af Sahagan et al. (J. Immunol. 137, 1066, 1986) ved 10 fusionering af variable områdeexons fra IgGl-antistoffet for den murine hybridomacellelinie B6.2 til humane γΐ/χ-gener. Bindingsegenskaberne for det kimære Ig er bestemt med A549.E1 humane lungecarcinomceller.

Sun et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 214, 1987) har kom-15 bineret DNA-fragmenter, som koder for de H-kæde/L-kæde-variable områder af anti-colorektal carcinoma (ACRC)-antistoffet, som produceres af musehybridoma 1083-17-A, med humane 73/Cκ-områder.

De kimære monoklonale antistoffer (MAbs) ifølge opfindel-20 sen er rettet mod carcinoembryonalt antigen (CEA). CEA er et komplekst immunreaktivt glycoprotein med en molekylvægt på 180.000, som findes i adenocarcinomer fra endodermalt afledt fordøjelsessystemepitel og føtal colon. Betydningen af CEA-immunanalyser til diagnostisering og fortsat 25 overvågning af cancerpatienter for sygdomstilbagefald eller respons på terapi er blevet bedømt og anerkendt i vid udstrækning. En af de væsentligste ulemper ved anvendelsen af anti-CEA-antistoffer til disse formål har været disse reagensers krydsreaktivitet med nogle tilsyneladende 30 normale voksne væv.

Tidligere undersøgelser har vist, at de fleste konventionelle hyperimmune antisera dannet mod CEA under anvendelse af forskellige immungener krydsreagerer med mange forskellige typer carcinomer samt CEA-beslægtede antigener, 6 DK PR 172444 B1 f.eks. uspecifikt krydsreagerende antigen NCA, tumoreks-traheret CEA-beslægtet antigen TEX, forskellige normale fækale antigener (NFA1, NFA2), galdeglycoprotein-I og 5 andre, som findes i colonmucosa, milt, lever, lunge, svedkirtler, polymorftkernede leukocyter og monocyter fra tilsyneladende normale individer (en oversigt er anført af Herberman & Mclntire i "Immunodiagnosis of Cancer", bind 9, del 1, N.Y., 1979. Dette betyder, at antiseraene gen-10 kender epi toper, som er specifikke for CEA alene, samt epitoper, som findes såvel på CEA som CEA-beslægtede antigener. Dette indicerer endvidere nærtbelægtede gener mellem CEA og CEA-beslægtede antigener såvel som precur-sor-produktrelationer mellem nogle af disse.

15 Det er anført, at polyklonale antistoffer (kanin, får) genkender 10-15 antigeniske steder i CEA (Sundblad et al.,

Protides Biol. Fluids 24, 435, 1976). Epitoperne er overvejende lokaliseret på peptiddelene af CEA og synes at være stærkt konformationsafhængige. Ved anvendelse af 20 monoklonale antistoffer er mindst 5 forskellige epitoper påvist i CEA (Hedin et al., Mol. Immunol. 23, 1053, 1986).

Det er kendt at anvende anti-CEA-monoklonale antistoffer til fremstilling af kimære antistoffer. I beskrivelsen til EP-patentansøgning nr. 0.125.023 anvendes et Ig7l-anti-25 stof, som stammer fra hybridomacellelinien CEA.66-E3. Det kimære antistof er ikke karakteriseret med hensyn til epitopspecificitet eller krydsreaktivitet, og der er heller ikke anført bindings- eller inhiberingsdata. I ovennævnte patentbeskrivelse beskrives anvendelsen af E.

30 coli til kloningen af DNA-fragmenter og ekspressionen af de kimære gener. Det er imidlertid velkendt, at prokaryote celler ikke tilvejebringer de nødvendige trin til biosyntese af funktionelle tetramere antistoffer, såsom korrekt nascent polypeptidkædefoldning, glycosylering og 35 samling. Opfinderne af opfindelsen beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 0.125.023 har i 7 DK PR 172444 B1

Proc. Natl. Acad. Sci. _81, 3273, 1984) beskrevet, at der ikke findes nogen påviselig antistofaktivitet i

Escherichia coli, som coproducerer IgG H- og L-kæder til det oprindelige museantistof, når fremstillingen gennem-5 føres som beskrevet i beskrivelsen til ovenstående patentansøgning. I beskrivelsen anføres et antal mulige værtsceller, herunder også pattedyrceller, men disse forslag er ikke underbygget af eksempler. Metoden til fremstilling af kimære antistoffer beskrevet i ovennævnte patentbeskrivel-10 se mangler derfor grundlaget for ekspressionen af de rekombinante genkonstruktioner og dermed udskillelsen af aktive monoklonale antistoffer.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at 15 konstruere hidtil ukendte kimære monoklonale antistoffer (MAbs), som har murine variable og humane konstante områdedeterminanter, binder specifikt til humant carcinoembryonalt antigen, 20 produceres i høj koncentration i levende ("immortalized") pattedyrcellelinier, og kan anvendes til diagnostiske og terapeutiske formål.

På baggrund af CEA-molekylets komplekse antigenstruktur 25 skal de ønskede kimære anti-CEA MAbs have følgende egenskaber: stor affinitet til CEA, høj procentvis binding til CEA-bærende carcinomaceller, såvel in vitro som in vivo, og 30 lav procentvis eller slet ingen binding til normale væv og celler.

Det kimære monoklonale antistof ifølge opfindelsen består af variable områder af museoprindelse og humane konstantom-35 råder, og antistoffet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det genkender epitoper på humant carcinoembryonalt 8 DK PR 172444 B1 antigen (CEA), som ikke findes på uspecifikt krydsreagerende antigen NCA55 og NCA95, på galdeglycoprotein eller på granu-locyter.

5 Der foretrækkes kimære monoklonale antistoffer og derivater med en affinitet på mindst 2,1 x 10^0 1/mol til humant CEA.

Til fremstillingen af et kimært monoklonalt antistof kon-10 strueres en kimær let kæde og en kimær tung kæde, som hver omfatter et variabelt og et konstant område, hver for sig, og der skelnes derfor mellem disse i den foreliggende beskrivelse, idet man specielt fremhæver det variable område i hver kimær konstruktion.

15

Det foretrukne kimære monoklonale antistof ifølge opfindelsen og dets derivater er karakteriseret ved, at de indeholder variable letkædeområder med formlen 20 FRi-Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Ser-Leu-His-FR2- I- CDR1L -1

Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser-FRj-Gln-Gln-Ser-His-Gly-Trp-Pro-Phe-Thr-FR«, I- CDR2L -1 I- CDR3L -1 (I), 25 hvori FRj er en polypeptidrest indeholdende 23-28 naturligt forekommende aminosyrer, FR2 er en polypeptidrest indeholdende 14-16 naturligt forekommende aminosyrer, FR3 er en 30 polypeptidrest indeholdende 30-34 naturligt forekommende aminosyrer, og FR4 er en polypeptidrest indeholdende 9-11 naturligt forekommende aminosyrer, og hvor aminosyren Cys kan foreligge i oxideret tilstand og danne S-S-broer. især foretrækkes et kimært monoklonalt antistof og derivater 35 deraf, som indeholder let kæde variable områder med formlen I, hvori polypeptidresterne i strukturområderne FRj_, 9 DK PR 172444 B1 FR2, FR3 og FR4 er de peptidrester, der fortrinsvis optræder i pattedyrantistoffer, især murine antistoffer.

De mest foretrukne kimære monoklonale antistoffer og deri-5 vater deraf ifølge opfindelsen omfatter let kæde variable områder med formlen I, hvori FRj. er en polypeptidrest med formlen A-Gly-Asp-Ile-Leu-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Leu-Ser-Val-Ser-Pro-Gly-Glu-Arg-Val-Thr-Phe-Ser-Cys (IA), hvori A betyder hydrogen, acyl eller resten Ala-Ser-Arg, 10 Ser-Arg eller Arg, især hydrogen, FR2 er polypeptidresten

Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Thr-Asn-Gly-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Met-

Lys (IB) 15 FR3 er polypeptidresten

Gly-Ile-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Phe-Thr-Leu-

Thr-Ile-Asn-Ser-Val-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys (IC), og FR4 er polypeptidresten

Phe-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys (ID) 20 og hvor aminosyren Cys kan foreligge i den oxiderede form 10 DK PR 172444 B1 og danne S-S-broer.

En form for et kimært monoklonalt antistof og derivater deraf indeholder variable letkædeområder med formlen I, 5 hvori FR-^, FR2, FR3 og FR4 er polypeptidrester med henholdsvis formlerne IA, IB, IC og ID, og hvor en eller flere, f.eks. 1, 2, 3 eller 4, enkelte aminosyrer er erstattet med andre aminosyrer uden for områderne CDR1L, CDR2L og CDR3L, og hvor aminosyren Cys kan foreligge i oxideret tilstand og 10 danne S-S-broer.

Det foretrukne kimære monoklonale antistof ifølge opfindelsen og dets derivater er karakteriseret ved, at de indeholder tung kæde variable områder med formlen FRs-Thr-Tyr-Ala-Met-Ala-Trp-Val-FRs-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Thr-Tyr-Tyr-Pro-I- CDR1H -1 I-----

Asp-Ser-Val-Lys-Gly-FR7-Gly-Phe-Tyr-Asp-Gly-Tyr-Leu-Tyr-Val-Val-FRe -- CDR2H -1 I- CDR3H -1 (II), 20 hvor FR5 er en polypeptidrest indeholdende 32-36 naturligt forekommende aminosyrer, FRg er en polypeptidrest indeholdende 14-16 naturligt forekommende aminosyrer, FR7 25 er en polypeptidrest indeholdende 32-34 naturligt forekommende aminosyrer, og FRg er en polypeptidrest indeholdende 12-14 naturligt forekommende aminosyrer, og hvor aminosyren Cys kan være på oxideret form og danne S-S-broer. Især foretrækkes et kimært monoklonalt antistof og derivater 30 deraf, som indeholder tung kæde variable områder med formlen II, hvori polypeptidresterne i strukturregionerne FRg, FR7, FRg og FR9 er sådanne, der fortrinsvis forekommer i pattedyrantistoffer, især murine antistoffer.

35 Ifølge opfindelsen foretrækkes især et kimært monoklonalt antistof og derivater deraf, som indeholder tung kæde variable områder med formlen II, hvori FR5 er en polypep- 11 DK PR 172444 B1 tidrest med formlen B-Gly-Val-Gln-Cys-Glu-Val-Lys-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Arg (HA), hvori B er hydrogen eller acyl, især hydrogen, 10 FRø er polypeptidresten

Arg-Gln-Thr-Pro-Glu-Lys-Arg-Leu-Glu-Trp-Val-Thr-Ser-Ile ( UB) 15 FR7 er polypeptidresten

Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Arg-Asn-Ile-Leu-Tyr-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Ile-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Arg (IIC), og FRø er polypeptidresten 2 5

Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Ser-Leu-Thr-Val-Ser-Ser (HD) og hvor aminosyren Cys kan foreligge i oxideret tilstand og danne S-S-broer.

30

En anden form for et kimært monoklonalt antistof indeholder variable tungkaedeområder med formlen II, hvori FR5, FRg, FR7 og FRø er polypeptidrester med henholdsvis IIA, IIB, IIC og IID, og hvor en eller flere, f.eks. 1, 2, 3 eller 4, 35 enkelte aminosyrer er ombyttet med andre aminosyrer uden for områderne CDR1H, CDR2H og CDR3H, og hvor aminosyren Cys 12 DK PR 172444 B1 kan være på oxideret form og danne S-S-broer.

Variable letkædeområder med formlen IA og variable tungkæde-områder med formlen IIA kan indeholde en acylrest, f.eks.

5 formyl eller alkanoyl, eksempelvis palmitoyl, myristoyl eller lavalkanoyl, såsom acetyl eller propionyl.

Den klasse, hvortil et Ig-molekyle hører, fastlægges af de konstante områder i H- og L-kæderne som anført ovenfor. Et 10 kimært monoklonalt antistof ifølge opfindelsen kan høre til en hvilken som helst immunglobulinklasse, f.eks. IgA, IgD,

IgE, IgG eller IgM. Et foretrukket kimært monoklonalt antistof ifølge opfindelsen er et immunglobulin i klasse G, som indeholder humane letkædekonstantområder < eller λ, især 15 humane konstantområder κ, og humane tungkædekonstantområder -ri, t2, y 3 og -r4, især humane konstantområder t4 .

Opfindelsen angår fortrinsvis et kimært monoklonalt antistof og derivater med variable letkædeområder med formlen I med 20 den foretrukne betydning, hvor aminosyren Cys kan være på oxideret form og danne S-S-broer, humane letkædekonstantområder κ., variable tungkædeområder med formlen II med den foretrukne betydning, hvor aminosyren Cys kan være på oxideret form og danne S-S-broer, og humane tungkædekonstantom-25 råder -r4 .

Derivater af kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er eksempelvis fragmenter, som bevarer deres specificitet over for de antigene determinanter på CEA-30 molekylet, såsom det monovalente fragment Fab og det divalente fragment F(ab')2' konjugater af de kimære monoklonale antistoffer med enzymer, fluorescensmarkører, me-talchelater, cytostatiske eller cytotoksiske stoffer, avidin, biotin og lignende, samt radioaktivt mærkede 35 antistoffer.

13 DK PR 172444 B1

Enzymer anvendt til antistofkonjugater ifølge opfindelse! er eksempelvis peberrodsperoxidase, alkalisk phosphatase Ø-D-galactosidase, glucoseoxidase, glucoamylase, kulsyre· 5 anhydrase, acetylcholinesterase, lysozym, malatdehydro· genase eller glucose-6-phophatdehydrogenase.

Fluorescensmarkører konjugeret med kimære antistoffer e: fluorescein, fluorochrom, rhodamin og lignende.

I sådanne konjugater er antistoffet bundet direkte ti 10 enzymerne eller fluorescensmarkørerne eller ved hjælp a en spacer- eller linkergruppe.

Som eksempler på metalchelatorer kan nævnes ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA), diethylentriaminpentaeddikesyr (DPTA), 1,4,8, ll-tetraazatetradecan, 1,4,8,11-tetraaza 15 tetradecan-1,4,8,11-tetraeddikesyre, l-oxa-4,7,12,15 tetraazaheptadecan-4,7,12,15-tetraeddikesyre elle lignende forbindelser. Cytostatika, som kan anvendes forbindelse med de kimære antistoffer, er bl.a. alkyle rende stoffer, såsom mechlorethamin, triethylenphosphor 20 amid, cyclophosphamid, ifosfamid, chlorambucil, busulfan melphalan eller triaziquon, endvidere nitrosourinstof forbindelser, såsom carmustin, lomustin eller semustin Endvidere antimetaboliter, såsom methotrexat, mercapto purin, cytarabin, fluorouracil, floxuridin eller ftorafur 25 Endnu en gruppe cytostatika indbefatter vinblastin o vineristin samt visse antibiotika, såsom actinomycin-D daunorubicin (daunomycin), doxorubicin, mithramycin streptonigrin, mitomycin og bleomycin. Andre egned cytostatika er bl.a. procarbacin, hydroxyurinstof 30 L-asparaginase, daearbazin, mitotan, estramustin elle podophyllotoxin. Endnu andre cytostatiske midler e hormoner og hormonantagonister, såsom corticosteroider, f.eks. prednison, progestiner, f.eks. hydroxyprogestero eller medroprogesteron, østrogener, f.eks. diethylstilbe 35 strol, antiøstrogener, f.eks. tamoxifen, androgener, 14 DK PR 172444 B1 f.eks. testosteron, og aromataseinhibitorer, f.eks.

aminogluthetimid.

Konjugater af kimære monoklonale antistoffer med cytotok-5 siske stoffer indeholder enten det intakte toksin eller A-kæden afledt deraf. Toksiner, som er egnede til antistofkobling, er bl.a. adskillige lectiner, såsom ricin eller abrin, eller diphtheritistoksin A, og lignende.

10 Radioaktivt mærkede kimaere monoklonale antistoffer indeholder f.eks. radioaktivt iod 125^ 131ΐ)^ yttrium (90γ), technetium (99mTc) eller lignende.

De kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge 15 opfindelsen fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, som er ejendommelige ved, at pattedyrceller, som producerer sådanne kimære monoklonale antistoffer, formeres in vitro eller in vivo, hvorpå de dannede monoklonale antistoffer eventuelt omdannes til derivater 20 deraf.

Formering in vitro gennemføres i egnede dyrkningsmedier, der er de gængse standarddyrkningsmedier, f.eks. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) eller RPMI 1640-25 medium, som eventuelt er tilsat et pattedyrserum, f.eks. føtalt kalveserum, eller sporelementer og vækstfremmende tilsætningsstoffer, f.eks. såkaldte "feeder"-celler, såsom normale musperitoneale exudatceller, miltceller, knoglemarvsmakrofager eller lignende.

30

Da de antistofproducerende celler bærer en selekteringsmarkør, som beskrives detaljeret i det følgende, kan dyrkningsmediet være tilsat selektive medier, f.eks. medier indeholdende G-418 eller xanthin, hypoxanthin/thymidin og 35 mycophenolsyre, for at forhindre normale celler i at overvokse de producerende celler.

DK PR 172444 B1 i 15

In vitro-produktion muliggør produktion i stor målestok til fremstilling af store mængder af de ønskede antistoffer. Teknikker til dyrkning af pattedyrceller under vævs-5 dyrkningsbetingelser er velkendt og indbefatter homogen suspensionskultur, f.eks. i en airlift-reaktor eller i en reaktor med kontinuert omrøring, eller immobiliseret eller indesluttet cellekultur, f.eks. i hule fibre, mikrokaps-ler, på agarosemikroperler eller på keramiske patroner.

10 Cellekultursupernatanterne screenes for de ønskede mono-klonale antistoffer, fortrinsvis ved hjælp af en enzym-immunanalyse, f.eks. en pletanalyse, eller ved radioimmun-analyse.

Til isolering af de kimære monoklonale antistoffer fore-15 tages først koncentrering af immunglobulinerne i kultur-supernatanterne, f.eks. ved fældning med ammoniumsulfat, : dialyse mod hygroskopisk materiale, såsom PEG, filtrering gennem selektive membraner eller lignende. De koncentrerede antistoffer kan om nødvendigt og/eller om ønsket 20 renses ved anvendelse af sædvanlige kromatografiske ί metoder, f.eks. gelfiltrering, ionbytterkromatografi, kromatografi over DEAE-cellulose eller (immun)-affinitets-kromatografi.

Der kan også opnås store mængder af de ønskede kimære 25 monoklonale antistoffer ved formering af cellerne in vivo.

Til dette formål injiceres cellekloner fra en histokompatibel og/eller tolereret Ig-producerende cellelinie i syngene pattedyr til fremkaldelse af vækst af antistofproducerende tumorer. Eventuelt forbehandles dyrene med et 30 carbonhydrid, især mineralolier, såsom pristan (tetrameth-ylpentadecan) inden injektionen. Efter 1-3 uger isoleres antistofferne fra kropsvæskerne fra disse dyr. Eksempel-vis injiceres hybridomaceller afledt af Balb/c-mus, som producerer de ønskede kimære og monoklonale antistoffer, 35 intraperitonealt i Balb/c-mus, som eventuelt er blevet 16 DK PR 172444 B1 forbehandlet med et carbonhydrid, såsom pristan, og efter 8-10 dages forløb udtages ascitesvæske fra disse dyr. De kimære monoklonale antistoffer Isoleres derfra på konven-5 tionel måde som anført ovenfor.

Fragmenter af kimære og monoklonale antistoffer, som bevarer deres specificitet over for humant CEA, f.eks.

Fab eller F(ab' )2-fragmenter, kan fås fra et kimært antistof fremstillet som beskrevet ovenfor på i og for sig 10 kendt måde, f.eks. ved gensplejsning af de egnede Ig-kodende exons, ved spaltning med enzymer, såsom papain eller pepsin, og/eller spaltning af disulfidbindinger ved kemisk reduktion.

Konjugater af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen 15 fremstilles ved anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved omsætning af et monoklonalt antistof fremstillet som beskrevet ovenfor med enzymet i nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, periodat, N,N’-o-phenylendimaleimid, N-(m-maleimiddobenzoyloxy)-succinimid, 20 N-(3-[ 2'-pyridyldithio ]-propionoxy)-succinimid, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid eller lignende forbindelser. Konjugater med avidin fremstilles på lignende måde. Konjugater med biotin fremstilles eksempelvis ved omsætning med monoklonale antistoffer med en aktiveret 25 biotinester, f.eks. biotin-N-hydroxysuccinimidesteren. Konjugater med fluorescensmarkører fremstilles i nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. de ovenfor anførte, eller ved omsætning med et isothiocyanat, fortrinsvis fluorescein-isothiocyanat. Konjugater af de kimære 30 antistoffer ifølge opfindelsen med cytostatiske/cytotok-siske stoffer og metalchelater fremstilles på analog måde.

Kimære monoklonale antistoffer, som er radioaktivt mærkede med iod (123jf 125χ^ 131i)^ fremstilles ud fra de monoklo-35 nåle antistoffer ifølge opfindelsen ved iodering på kendt 17 DK PR 172444 B1 måde, f.eks. med radioaktivt natrium- eller kaliumiodid og et kemisk oxidationsmiddel, såsom natriumhypochlorit, chloramin T eller lignende, eller et enzymatisk oxideringsmiddel, såsom lactoperoxidase, glucoseoxidase og 5 glucose. Kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kobles til yttrium (90Y) f.eks. ved hjælp af diethylen-triaminpentaeddikesyre (DTPA)-chelatering. Technetium-99m-mærkede kimære antistoffer fremstilles ved ligandombytningsprocesser, f.eks. ved reduktion af pertechnat (TCO4-) 10 med en stannoionopløsning, chelatering af det reducerede technetium på en "Sephadex"®-søjle og påsætning af antistofferne på søjlen, eller ved direkte mærkningsteknik, f.eks. ved at inkubere pertechnat, et reduktionsmiddel, såsom SnCl2, en pufferopløsning, såsom natrium-kalium-15 phthalat-opløsning, og antistofferne.

Det rekombinante DNA ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter et insert, der koder for et murint variabelt letkædeområde og/eller et murint variabelt tung-20 kædeområde af kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen. Pr. definition indeholder sådanne DNA'er kodende enkeltstrengede DNA'er, dobbeltstrengede DNA'er bestående af de kodende DNA1er og af DNA'er, som er komplementære dermed, eller disse komplementære (enkeltstrengede) DNA'er selv.

25

Et foretrukket rekombinant DNA ifølge opfindelsen omfatter et insert, som koder for et murint variabelt letkædeområde specifikt for humant CEA, der stammer fra genomisk DNA fra cellelinien CE 25 med deponeringsnummeret CNCM 1-719. Cel-30 lelinien CE 25 er dannet ved fusionering af B-lymfocyter fra milten fra Balb/c-mus og celler fra myelomaet P3-NS2/lAg4 og danner et murint anti-CEA-antistof med en κ let kæde og en -ri tung kæde.

3 5 Der foretrækkes et rekombinant DNA, som indeholder et insert, der koder for polypeptidet med formlen I, og som eventuelt indeholder introns, især et insert, der koder 18 DK PR 172444 B1 for polypeptidet med formlen I, hvori FR^, FR2, FR3 og FR4 er polypeptidrester med henholdsvis formel IA, IB, IC og ID, og som eventuelt indeholder introns.

5 Et eksempel på et foretrukket rekombinant DNA er et rekom-binant DNA, som indeholder et insert med formlen

TCTAGACTGCTGTGGTCTTTTAAGTAGCATGAAAAACATCTGCTAAAGAAGGAATTAGTT

1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 TGAACATGCTAGAAATACATCTGTGATACTCTCATCACTCTTGTTGGAAAGATATGCAAG 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 AAGCACTATTTGGCTATTATTTGGAAAGTGCTATAATGTATTTTGATATCTCAACCTCTG 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AAATTCTTCTGTATGTTGGCAGATTGTAAACCTTTACAAGGCTTTCATTCTCTTCTCTGG 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 AGAAAAATGTCTTTGTAGGCAATCCAGAATTTCTTATTTCTTGCTAATGAAATCTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200 GTGTGATATCACTTTAGTTTCATGTGTTGTTATGCTTCATGTAATGTTAAGAAAGTTAAA 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 GATGCTCCAATCCATATTGTAAGAAACATTCCAAGCCATGGAATAAGGCATGGATTTGAC 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 ATGCTCTTTATTTCAAACTACTGAATATATCTTAGAGATTTCTTTAGACTGTGTTAAATA 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 TGTAACCATTTAAGTAGGAGTCAAGTCTCCTTTAAATCTCAACAGCTCTTCAGGTAACCA 481 ----------f-----—~ ~ —v-----— +----——4·-------——+----------h 540 ACAAAAGGATAAATATTCTAATAAGICACTAGGAGCATGCTCTTCTGACCAGGTCTTTCT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TATAAGCAACATGAAGACAGTATGATTTGCATAAGTTTTTCTTTCTTCTAATGTCCCTGC 601 —---- -i----—-----(----------+---------h----------+---------+ 660 CTCTTAGAGTATTATAAGAAGATCTTTCTAGGGATGTGTCATGGTCCACACAAAAATAGG 661---------H----------+-—-------+----------h----------1----------+ 720 MVSTPQFLVFLLFWI P MetValSerThrProGlnPheLeuValPheLeuLeuPheTrpIlePro GAAAGTGTGAAGATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCA 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 19 DK PR 172444 B1 GGTAATGACTGTTTGGGTGTGGCAAAAAAGTGGAGATGTTATTTAAATACAAAATTTTCT 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 TGCTTTATTTGGAAGCCAATGTCACATGGGAATTGACTTTCAGTTTAAAGAAATTGATAC 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 AATAAAAGTCATTTATTTTTCTAAGTTGTTTAGAAGTGACTTTCATATTCAGTGTTATGA 901 ---------+---------+---------4----------+---------+---------+ 960 ASRGDILLTQS AlaSerArgGlyAsplleLeuLeuThrGlnSer TCGACTAATGTATCTTCCATTTTTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCT 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 PAILSVSPGERVTFSCRASQ ProAlalleLeuSerValSerProGlyGluArgValThrPheSerCysArgAlaSerGln CCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCACTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAG 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 SIGTSLHWYQQRTNGSPRLL SerlleGlyThrSerLeuHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySerProArgLeuLeu AGCATTGGCACAAGCTTACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTC 1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 MKYASESI SGIPSRFSG SGS MetLysTyrAlaSerGluSerlleSerGlylleProSerArgPheSerGlySerGlySer ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA 1141---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 GTDFTLTINSVESEDIADYY GlyThrAspPheThrLeuThrlleAsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyr GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAC 1201 —-------+----------1----------+—---—----η----------+---------+ 1260 CQQSHGWPFTFGSGTKLEIK CysGlnGlnSerHisGlyTrpProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluIleLys TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 CGTAAGTGGACTTTTGTTCATTTACTTGTGACGTTTTGGTTCTGTTTGGGTAGCTTGTGT 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 GAATTTGTGATATTT 1381 ---------+----- 1395 (III).

20 DK PR 172444 B1

Et rekombinant DNA indeholdende et insert med formlen III hvori et eller flere, f.eks. op til 10, enkelte nukleoti der er erstattet med andre nukleotider uden for nukleotic sekvenserne med formlen III fra henholdsvis position 5 1069-1102, 1147-1167 og 1263-1291, er også foretrukket.

Et andet foretrukket rekombinant DNA indeholder et insert der koder for et murint variabelt tungkædeområde specifik for humant CEA, som stammer fra genomisk DNA fra cellelinie 10 CE 25.

Der foretrækkes et rekombinant DNA, som indeholder e insert, der koder for polypeptidet med formlen II, og sc eventuelt indeholder introns, især et insert, der kode 15 for polypeptidet med formlen II, hvori FR5, FRg, FR7 c FRg er polypeptidrester med henholdsvis IIA, IIB, IIC c IID, og som eventuelt indeholder introns.

Et eksempel på et sådant foretrukket rekombinant DNA er e 20 rekombinant DNA, som indeholder et insert med formlen AAGCTTGTTCTGTTCACATGCAAGGAGGGAAACTAAACTGAGTATGGTGAATCCCTAACC 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AAAGGGAAAAAATGAAACTACAATATGTTTCAAATGCTGTAACTGAAATCTGGTTTTTTG 25 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 ATGCCTTATATCTGGTATCATCAGTGACTTCAGATTTAGTCCAACCCCAGAGCATGGTAT 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AGCAGGAAGACATGCAAATAAGTCTTCTCTCTGCCCATGAAAACACCTCGGCCCTGACCC 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGCAGCTCTGACAGAGGAGGCCAGTCCATGGATTTGAGTTCCTCACATTCAGTGATGAGC 241---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 35 21 DK PR 172444 B1 MNFGFSLIFLVLV MetAsnPheGlyPheSerLeuIlePheLeuValLeuVal ACTGAACACAGACACCTCACCATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTT 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 L K G LeuLysGly TTAAAAGGTAATTTATTGAGAAGAGATGACATCTATTTTACGCACATGAGACAGAAAAAA 361---------+---------+---------+------——----+---------+ 420 V Q ValGl TGTGGTTTGTTTTGTTAGTGACAGTTTTCCAACCAGTTATTCTCTGTTTGTAGGTGTCCA 421---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 CEVKLVESGGGLVKPGGSLK nCysGluValLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLy GTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 LSCAASGFTFRTYAMAWVRQ sLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheArgThrTyrAlaMetAlaTrpValArgGl ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACTTTCAGGACCTATGCCATGGCTTGGGTTCGCCA 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TPEKRLEWVTSISSGGTTYY nTlirProGluLysArgLeuGluTrpValThrSerlleSerSerGlyGlyThrThrTyrTy GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCCATTAGTAGTGGTGGTACCACCTACTA 601 ---------+---------+---------+—-------+---------+---------+ 660 PDSVKGRFTISRDNARNILY rProAspSerValLysGlyArgPheThrlleSerArgAspAsnAlaArgAsnlleLeuTy TCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTA 661 —--------+---------+——----——+~--------+---------+------———+ 720 LQVS SLRSEDTAIYYCARGF rLeuGlnValSerSerLeuArgSerGluAspThrAlalleTyrTyrCysAlaArgGlyPh CCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAGAGGTTT 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 YDGYLYVVDYWGQGTS LTVS eTyrAspGlyTyrLeuTyrValValAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerLeuThrValSe CTATGATGGTTACCTCTArGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCACCGTCTC 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

S

rSer CTCAGGTAAGAATGGCC 841 ---------+------- 857 (IV).

22 DK PR 172444 B1

Et rekombinant DNA, som indeholder et insert med formlen IV, hvori en eller flere, f.eks. op til 10, enkelte nukleotider er udskiftet med andre nukleotider uden for nukleotidsekvenserne med formlen IV fra henholdsvis posi-5 tion 575-595, 629-580 og 776-805, er også foretrukket.

Til samlingen af komplette tetramere immunglobulinmoleky-ler og ekspressionen af aktive antistoffer, fusioneres rekombinant DNA-inserterne, som koder for let og tung kæde 10 variable områder, med de tilsvarende DNA'er, som koder for let og tung kæde konstant områder, hvorpå der foretages inkorporering i hybridvektorer og overføring til passende værtsceller ved hjælp af disse hybridvektorer.

15 Opfindelsen angår derfor også rekombinant DNA'er, som indeholder et insert, der koder for et murint variabelt let-kædeområde specifikt for huamnt CEA fusioneret til et humant konstantområde κ eller λ. Der foretrækkes et rekombinant DNA, som koder for et foretrukket murint variabelt område 20 som beskrevet ovenfor fusioneret til et humant konstantområde κ .

Opfindelsen angår desuden rekombinant DNA'er, som indeholder et insert, der koder for murint variabel tung kæde specifik 25 for humant CEA fusioneret til et humant konstantområde nr, f.eks. -ri, -r2, ίγ3 eller -r4. Der foretrækkes et rekombinant DNA, som koder for et foretrukket murint variabelt område som beskrevet ovenfor fusioneret til et humant konstantområde t4 .

30

Opfindelsen angår tillige et rekombinant DNA, som er en hybridvektor indeholdende et insert, der koder for en kimær murin/human let kæde, som beskrevet ovenfor, og/eller et insert, som koder for en kimær murin/human 35 tung kæde, som beskrevet ovenfor, et fuldstændigt replikon og en eller flere dominante markørsekvenser, som er operativt bundet til ekspressionskontrolesekvenser.

23 DK PR 172444 B1

Markørerne gør det muligt at selektere værtsceller, som indeholder vektoren. Selektionsmarkører indbefatter gener, som giver resistens mod tungmetaller, f.eks. kobber, anti-5 biotika, f.eks. G-418 (geneticin, et neomycinderivat) eller hygromycin, eller gener, som kompletterer en genetisk læsion hos værtscellen, såsom mangel på thymidin-kinase, hypoxanthinphosphoryltransferase, dihydrofolat-reduktase eller lignende. Desuden indeholder hybridvekto-10 rer eventuelt signalsekvenser, et eller flere restriktionssteder, som er tilgængelige for indsætning af et strukturgen, forstærkere og/eller ekspressionskontrolsekvenser. Der kan anvendes mange forskellige transskrip-tionelle og translationelle regulatoriske sekvenser 15 afhængigt af værtens natur. Foretrukne vektorer er egnede til pattedyrværter og er baseret på virale formeringssystemer, såsom simianvirus 40 (SV40), Rous sarcomavirus (RSV), adenovirus 2, bovint papillomavirus (BPV), papovavirus BK-mutant (BKV) eller murin eller human 20 cytomegalovirus (CMV). Vektorerne kan eventuelt indeholde promotorer fra pattedyrekspressionsprodukter, såsom actin, collagen, myosin osv., eller de native promotor- og kontrolsekvenser, som normalt er forbundet med immunglobu1ingensekvenserne . Enhancere eller forstærkere er transskrip-25 tionsstimulerende DNA-sekvenser af viral oprindelse, f.eks. afledt af simianvirus, såsom SV40, polyomavirus, bovint papillomavirus eller Moloney sarcomavirus, eller er af genomisk, især murin oprindelse (muse Ig-enhancer). Et replikationsorigin tilvejebringes enten ved konstruktion 30 af vektoren, således at den indeholder exogent origin, f.eks. afledt af SV40 eller af anden viral kilde, eller ved hjælp af værtscellens kromosomale replikationsmeka-nisme. Eksempler på foretrukne vektorer er sådanne, der er afledt af pSV-vektorer, hvori den selekterbare markør er 35 anbragt under kontrol af SV40-early-promotoren, især pSV2gpt, som bærer xanthin-guanin-phosphoribosyltransfe-rasegenet, og pSV2neo, som bærer phosphotransferasegenet.

24 DK PR 172444 B1

De kimære genkonstruktioner for den lette kæde og for den tunge kæde overføres til værtscellerne efter hinanden eller samtidigt ved hjælp af to vektorer. Eventuelt kan såvel tunge som lette kæder klones i den samme hybrid-5 vektor og inkorporeres i en ettrinsproces som en enkelt konstruktion i værtscellerne.

Rekombinant DNA'erne, som koder for de kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved dyrkning 10 af en transformeret vært.

Især kan sådanne DNA'er fremstilles ved a) isolering af murine DNA'er fra en egnet hybridomacel-lelinie, selektering af de ønskede DNA'er, som koder for 15 de variable områder af monoklonale antistoffer rettet mod humant CEA under anvendelse af DNA-prober, b) isolering af humane DNA'er fra et genbibliotek, selektering af de ønskede DNA'er, som koder for de konstante områder af monoklonale antistoffer under anvendelse af 20 DNA-prober, c) konstruktion af kimære murin/human-gener ved inkorporering af DNA’et fra trin a) og b) i egnede hybridvektorer, d) overføring af de dannede hybridvektorer til en reci-25 pientvært og e) selektering og dyrkning af den transformerede vært.

DNA'et ifølge trin a) i den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan opnås ved isolering af genomisk DNA eller ved 30 fremstilling af cDNA ud fra isoleret mRNA. Da genomisk DNA-konstruktioner letter genekspression, foretrækkes fremstillingen og anvendelsen af genomisk DNA. Genomisk DNA fra hybridomaceller isoleres ved anvendelse af kendte fremgangsmåder, som indbefatter trin til oplukning af 35 cellerne, f.eks. ved lysering i nærværelse af detergenter, såsom "Triton", ekstraktion af DNA’et, f.eks. ved behandling med phenol og CHCl3/isoamylalkohol, og DNA-fældning.

25 DK PR 172444 B1 DNA'et spaltes, hensigtsmæssigt ved anvendelse af en eller flere restriktionsendonucleaser, f.eks. Xbal, Bglll,

EcoRI, Hindlll eller BamHI, de dannede fragmenter kopieres 5 på en egnet bærer, f.eks. nitrocellulosemembraner, og screenes med en DNA-probe som beskrevet mere detaljeret i det følgende for tilstedeværelsen af de DNA-sekvenser, som koder for den pågældende polypeptidsekvens, især for tilstedeværelsen af de omlejrede H- og L-kæde i Ig-gen-loci.

10 På denne måde finder man DNA-fragmenter, som indeholder inserter med henholdsvis tungkæde V-, D- og J-områder og letkæde V- og J-områder, eventuelt sammen med en leader-sekvens og introns.

Genomisk human DNA ifølge trin b) i den ovenfor beskrevne 15 fremgangsmåde isoleres fra egnet humant væv, fortrinsvis fra human placenta eller humane føtale leverceller, under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Et genomisk DNA-bib-liotek konstrueres deraf ved begrænsningsspaltning med egnede restriktionsendonucleaser, f.eks. Haelll og Alul, 20 og inkorporering i λ-charonfag, f.eks. λ-charon 4a, under anvendelse af velkendte fremgangsmåder. Det genomiske DNA-bibliotek kopieres, f.eks. på nitrocellulosemembraner, og screenes med en DNA-probe, som beskrevet nedenfor, for de pågældende DNA-sekvenser.

25 DNA-proben for de murine variable områder eller de humane konstante områder kan være et syntetisk DNA, et cDNA afledt af mRNA, og som koder for det ønskede immunglobulin eller et genomisk DNA eller DNA-fragment med kendt nukleotidsekvens. Der anvendes fortrinsvis en genomisk 30 DNA-probe eller en genomisk DNA-fragmentprobe. Som prober for påvisningen af det omlejrede Ig-gen-loci i de variable områder af L-/H-kæder, selekteres DNA-fragmenter med kendte nukleotidsekvenser i nabostillede konserverede variable eller konstante områder, som udgør Ig-loci'ene af 35 L-/H-kæden i pattedyret, hvorfra DNA'et er afledt, f.eks. Balb/c-mus. Udnyttelsen af murine DNA-prober til påvis- 26 DK PR 172444 B1 ning af humane DNA-sekvenser er baseret på sekvenshomolo-gier mellem de murine og humane DNA'er. DNA-proben isoleres fra egnet væv fra et passende pattedyr, f.eks. Balb/c-muselever, renses ved molekylær kloning i bakterio-5 fag X og subkloning af egnede DNA-fragmenter i egnede plasmidvektorer, såsom pUC12 eller pUC13, og udvinding/ rensning af klonede DNA-inserter under anvendelse af standardmetoder. Det rensede probe DNA mærkes, f.eks. radioaktivt ved hjælp af den velkendte nick-translationsteknik, 10 hvorpå der hybridiseres med det humane DNA-bibliotek i puffer- og saltopløsninger, som indeholder hjælpestoffer, f.eks. calciumchelatorer, viskositetsregulerende forbindelser, proteiner, uspecifikt DNA og lignende, ved temperaturer, som fremmer selektiv hybridisering.

15 Når man har identificeret et fragment, som indeholder den ønskede DNA-sekvens, kan dette fragment behandles yderligere til fjernelse af ikke-essentielt DNA, modificeres ved den ene eller begge ender og behandles til fjernelse af 20 alle eller en del mellemiiggnede sekvenser eller lignende.

Samlingen af de forskellige DNA-fragmenter til dannelse af kimære gener gennemføres under anvendelse af konventionel teknik, f.eks. ved kortendeligering eller forskudtendeli-25 gering, spaltning med restriktionsenzymer til dannelse af egnede kohæsive ender, eventuel udfyldning af kohæsive ender, behandling med alkalisk phosphatase til undgåelse af uønsket sammenføjning og ligering med passende ligaser.

30 Overførslen af de rekombinerede DNA'er, f.eks. overførslen af hybridvektorer, og selekteringen af transformerede celler beskrives i det følgende.

Værtscellerne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at 35 de er transformeret med rekombinant-DNA'er ifølge opfindelsen. Dvs. at værtscellerne er transformeret med et DNA, der koder for den lette kæde, og/eller et DNA, som koder for 27 DK PR 172444 B1 den tunge kæde, af det kimære monoklonale antistof ifølge opfindelsen.

Værtscellerne ifølge den foreliggende opfindelse må kunne 5 dyrkes in vitro og skal være af højere eukaryotisk oprindelse for at tilvejebringe et egnet miljø for fremstillingen af aktive antistoffer, da biosyntesen af funktionelle tetramere antistofmolekyler kræver korrekt foldning af den dannede polypeptidkæde, glycosylering og samling. Eksem-10 pier på egnede værtsceller ifølge opfindelsen er pattedyrceller, f.eks. C0S-7-celler, Bowes melanomaceller, Chinese hamster ovary (CHO)-celler, embryonale lungeceller L-132 og især pattedyrceller af lymfoid oprindelse, såsom myelomaceller eller lymfomaceller, f.eks. Sp2/0-celler.

15 Sp2/0 (ATCC CRL 1581) er en velkarakteriseret musecelle linie, som ikke udskiller Ig, og som er dannet ved fusionen af musemiltceller med myeloma X63-Ag8. Disse værtsceller tranficeres med den kimære H-kæde genkonstruktion alene med L-kæde genkonstruktionen alene eller med begge, 20 idet begge overføres ved hjælp af to separate vektorer eller under anvendelse af en dobbeltkonstruktionsvektor (L-kæde/H-kæde) som anført ovenfor. Der foretrækkes især værtsceller, som er transficeret med begge genkonstruktioner, der er overført ved hjælp af to separate vektorer, 25 og som udskiller kimære og monoklonale antistoffer med en affinitet til CEA som beskrevet ovenfor, f.eks. celler af cellelinien EFVIII/74Na 75-75/CKGa5-6 (betegnet CE75-5-6). Endvidere foretrækkes værtsceller, som er transficeret med begge genkonstruktioner, som er overført samtidigt ved 30 hjælp af en dobbeltkonstruktionsvektor, og som udskiller kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, f.eks. celler af cellelinien EFIX-pCEA-Ig-(γ4;C*) (betegnet som CE 4-8-13). Andre eksempler på værtsceller ifølge opfindelsen er celler transficeret med lignende rekombinant-35 plasmider, som indeholder andre orienteringer af H- og L-kædegenkonstruktionerne, under inkorporering af yderligere DNA-elementer for at fremme høje ekspressionsniveauer af de kimære monoklonale antistoffer.

DK PR 172444 B1 28 Værtscellerne ifølge opfindelsen er genetisk stabile, udskiller kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen med konstant specificitet og kan aktiveres fra dybfrosne kulturer ved optøning og rekloning.

5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af værtsceller, som udskiller kimære monoklonale antistoffer med specificitet til CEA som beskrevet ovenfor, er ejendommelig ved, at en egnet celle transformeres med en eller to vek-10 torer ved elektroporation, calciumbehandling, mikroinjektion eller protoplastfusion.

Vektorer indføres i pattedyrceller ved transfektion i nærværelse af hjælpeforbindelser, f.eks. diethylamino-15 ethyldextran, dimethylsulfoxid, glycerol, polyethylengly-col eller lignende, eller som co-precipitater af vektor DNA og calciumphosphat. Andre egnede metoder omfatter direkte mikroinjektion af vektor DNA i cellekernen, protoplastfusion og elektroporation, dvs. indføring af DNA 20 ved hjælp af en kort elektrisk strøm, som midlertidigt forøger cellemembranernes permeabilitet. Den efterfølgende selektion af transficerede celler kan gennemføres under anvendelse af en selektionsmarkør, som enten er kovalent integreret i ekspressionsvektoren eller tilsat som en 25 separat del. Selektionsmarkører omfatter gener, der giver resistens mod antibiotika, f.eks. G-418 (geneticin, et neomycinderivat) eller hygromycin, eller gener, som kompletterer en genlæsion i værtscellen, såsom manglen på thymidinkinase, hypoxanthinphosphoribosyltransferase, 30 dihydrofolatreduktase eller lignende.

Opfindelsen angår tillige monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge opfindelsen til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af mennesker og til diagnose.

De kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge opfindelsen anvendes til en række anvendelser, især til 35 29 DK PR 172444 B1 diagnose og terapi af cancer.

Et eksempel på diagnostisk anvendelse er den kvalitative og kvantitative bestemmelse af human carcinoembryonalt antigen, 5 især i biologiske væsker. De kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf kan anvendes i en hvilken som helst af de kendte immunanalyser, som anvender bindingsvekselvirkningerne meller antigen og monoklonalt antistof, såsom radioim-munanalyse (RIA), enzymbundet immunanalyse, immunofluore-10 scensanslyse, latexagglutination og haemagglutination .

Der kan anvendes en hvilken som helst af de kendte modifikationer af en RIA, f.eks. RIA i homogen fase, fastfase RIA eller heterogen RIA, enkel RIA eller dobbelt 15 (sandwich) RIA med direkte eller indirekte (kompetitiv) bestemmelse af CEA. Der foretrækkes en sandwich RIA, hvor en egnet bærer, f.eks. plastoverfladen af en mikrotiter-plade eller af et prøverør, f.eks. af polystyren, polypropylen eller polyvinylchlorid, glas- eller plastperler, 20 filtrerpapir eller dextran-, celluloseacetat- eller nitrocelluloseark eller lignende overtrækkes med et antistof mod CEA ved simpel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bæreren, f.eks. med glutaraldehyd eller bromcyanid, og inkuberes med testopløsningen og en opløsning 25 af et antistof, som er radioaktivt mærket med idet det opløste antistof, som genkender en anden epitop på CEA end det bærebundne antistof, og mængden af CEA bestemmes ved måling af radioaktiviteten bundet til bæreren. Det ene af de to antistoffer, som anvendes i 30 sandwich RIA'en, er et kimært monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, og det andet kan være et kendt monoklonalt eller polyklonalt anti-CEA-antistof eller også et kimært antistof ifølge opfindelsen.

De kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller i form af enzymkonjugerede derivater i en enzymimmunanalyse. Sådanne immunanalyser omfatter testmetoder, hvori der anvendes enzymmærkede kimære monoklonale antistofderivater ifølge opfindelsen 30 DK PR 172444 B1 eller kendte enzymmærkede antistoffer, som genkender og binder en epitop på antistofferne ifølge opfindelsen. Antigenmængden bestemmes i et kaskade-antigen-antistof-kompleks ved hjælp af en enzymtest.

5

Der foretrækkes en ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), hvor en bærer som beskrevet ovenfor i forbindelse med en RIA overtrækkes med et anti-CEA-antistof og inkuberes med en testopløsning indeholdende CEA. Efter 10 binding af CEA tilsættes et andet antistof rettet mod CEA, som binder til antistof-antigen-komplekset. De bundne antistoffer fremkaldes med et tredje enzymmærket antistof, som er specifikt for det konstante område i det andet antistof. Mængden af CEA bestemmes ved hjælp af en enzym-15 substratreaktion. Et af antistofferne, som anvendes i testen, er et kimært monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, og det andet kan være et kendt monoklonalt eller polyklonalt anti-CEA-antistof eller også et kimært antistof ifølge opfindelsen. Det mærkede antistof er f.eks. et 20 alkalisk phosphatase-mærket ged-anti-human IgG-antistof.

Der foretrækkes tillige en ELISA, hvor en bærer overtrukket med antistof inkuberes med en testopløsning indeholdende CEA og med en opløsning af et antistof, som er 25 konjugeret med et enzym, hvor det opløste antistof genkender en anden CEA-epitop end det bærebundne antistof. Et af antistofferne anvendt i denne test er et kimært monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, og det andet er et kendt monoklonalt eller polyklonalt anti-CEA-antistof.

30

Analysesættet ifølge opfindelsen til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af humant CEA er ejendommeligt ved, at det indeholder kimære monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen og/eller derivater deraf og eventuelt andre monoklo-35 nåle og polyklonale antistoffer og/eller hjælpestoffer.

Analysesæt ifølge opfindelsen til en radioimmunanalyse in- 31 DK PR 172444 B1 deholder f.eks. en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et eller flere monoklonale antistoffer, opløsninger af et radioaktivt mærket monoklonalt antistof eller radioaktivt mærket humant CEA, standardopløs -5 ninger af humant CEA, pufferopløsninger og eventuelt detergenter til undgåelse af uspecifik adsorption og aggregatdannelse, pipetter, reaktionsbeholdere, kalibreringskurver og lignende. Et eller flere af de monoklonale antistoffer i ; analysesættet er kimære monoklonale antistoffer ifølge opfin- 10 delsen.

Analysesæt ifølge opfindelsen til en enzymimmunanalyse indeholder f.eks. en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et eller flere monoklonale 15 antistoffer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et enzymmærket monoklonalt antistof, af enzymmærket humant CEA af et polyklonalt antihumant CEA-serum og/eller af enzymmærkede monoklonale eller polyklonale antistoffer, som genkender og binder antihumant CEA-antistoffet, 20 enzymsubstrater i fast eller opløst form, standardopløsninger af humant CEA, pufferopløsninger, detergenter, pipetter, I reaktionsbeholdere, kalibreringskurver, farveskalatabeller og lignende. Et eller flere af de monoklonale antistoffer i analysesættet er kimære monoklonale antistoffer ifølge opfin-25 delsen.

Som følge af deres nedsatte immunogenisitet er de kimære monoklonale antistoffer og deres derivater endvidere nyttige til behandling, til passiv immunisering uden 30 negative immunreaktioner, såsom serumsyge eller anafylaktisk chok, til lokalisering og in vivo-billed-dannelse af tumorer, til specifik behandling af syge celler, f.eks. steddirigeret afgivelse af cytotoxiner, immunomodulatorer eller andre farmaceutisk aktive mole- 35 kyler, hvor lokalkoncentration af det aktive stof er en vigtig faktor, eller lignende. Til in vivo-afbildning er det kimære antistof radioaktivt mærket eller konjugeret med et metalchelat komplekseret med et radionuclid, f.eks. iod, yttrium, technetium eller lignende, og radioscan 32 DK PR 172444 B1 ningsteknik kan anvendes til påvisning af primære og meta-statiske tumorer. Til dette formål injiceres det radioaktive antistof, f.eks. intravenøst, og patienten scannes med en 7-billeddanner med regelmæssige mellemrum. Tumorer, 5 som udtrykker CEA, vil optage flere radioaktive antistoffer end andet væv, og vil blive tydeligt genkendt ved hjælp af 7-billedkameraet. Fortrinsvis anvendes monoklo-nale antistoffer mærket med 131i til radioscanning i mængder på 3-8 μς, hvilket udgør 15-30 μΟί pr. kg legems-10 vægt. Til opnåelse af biocid virkning ved behandling af cancer anvendes de kimære antistoffer som derivater konjugeret til cytostatiske eller cytotoksiske stoffer som beskrevet ovenfor, f.eks. ricln A, som radioaktivt mærkede derivater eller indlejret i liposomer, som indeholder bio-15 cide reagenser. Den terapeutiske dosis til pattedyr ligger mellem ca. 1 mg og 5 mg pr. kg legemsvægt for de monoklo-nale antistoffer selv og mellem 0,1 mg og 5 mg pr. kg legemsvægt for konjugater med cytotoksiske midler, afhængigt af patientens tilstand og anvendelsesmåden. De 20 kimære antistoffer kan eventuelt anvendes i kombination med komponenter i værtens immunsystem, f.eks. komplement, som følge af tilstedeværelsen af det native konstante område. In vitro kan de omhandlede kimære antistoffer anvendes i forbindelse med komplement til fjernelse af 25 især CEA-holdige celler fra en blanding af celler.

Det farmaceutiske materiale ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder et kimært monoklonalt antistof eller derivater deraf ifølge opfindelsen. De farmaceutiske 30 materialer indeholder f.eks. kimære monoklonale antistoffer eller derivater deraf i en effektiv mængde sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flydende, farmaceutisk acceptable bærestoffer.

35 Der foretrækkes farmaceutiske præparater til parenteral indgift. Præparater til intramuskulær, subkutan eller 33 DK PR 172444 B1 intravenøs indgift er f.eks. isotoniske vandige opløsninger eller suspensioner, som eventuelt fremstilles kort før anvendelsen ud fra lyofiliserede eller koncentrerede 5 præparater. De farmaceutiske præparater kan være steriliserede og indeholde hjælpestoffer, f.eks. til konservering, stabilisering, befugtning, emulgering eller solubi-lisering af bestanddelene, salte til regulering af det osmotiske tryk, puffere og/eller viskositetsregulerende 10 forbindelser, f.eks. natriumcarboxycellulose, dextran, polyvinylpyrrolidon eller gelatine. Præparaterne fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved konventionel blanding, opløsning eller lyofili-sering, og de indeholder fra ca. 0,01 til ca. 50% af de 15 aktive bestanddele. Præparaterne til injektionsformål fremstilles og fyldes i ampuller eller hætteglas, som forsegles under aseptiske betingelser på kendt måde.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

20 Figurtekster

Symboler for restriktionssteder: A - Alul, B - BamHI, Bg -Bglll, E - EcoRI, H - Hindlll, Hh - Hhal, P - PstI, Sa -Sall, Sp - SphI, X - Xbal, Xm - XmnI.

V: variabel område Ig gensegment 25 J: forbindelsessegment D: diversitetssegment L: leadersekvens

Bokse angiver positionen for det omlej rede V-område og dets leaderpeptidkodende segment (sorte bokse) og positio-30 nen for J-segmenter (åbne bokse).

34 DK PR 172444 B1

Fig. 1: (A) G: kimliniekonfiguration for det murine L-kæde Ig-gen-locus, som viser positionen for J-segmenter og originet 5 for J-områdeproben.

L2 og L2.5: restriktionskort for de CE 25 hybridoma- specifikke omlejrede L-kæde Ig-gener udledt fra Southern blotanalyse (eksempel 3).

Plasmid pCEA-L2a: klonet segment af L2-genet.

10 (B) G: kimliniekonfiguration for det murine H-kæde Ig- gen-locus, som viser positionen af J-segmenter og originet for J-områdeproben.

H2 og H8: restriktionskort for de CE 25 hybridomaspeci-fikke omlejrede H-kæde Ig-gener afledt fra Southern blot-15 analyse (eksempel 3).

Plasmidet pH8al er ikke vist, men det konstrueres på samme måde som pCEA-L2a og indeholder Xbal/Xbal-segmentet af H8-genet.

[ E ]: EcoRI-steder i det klonede H8-gen, som ikke kan på- 20 vises ved Southern blot-analyse af CE 25 hybridoma DNA.

Fig. 2: Påvisning af L2- og H8-specifikke mRNA-transskripter i CE 25 hybridomaceller ved hjælp af Northern blot-analyse (eksempel 6): 25 RNA blots af 25 og 50 μg P3-NS2/lAg4-celle RNA (NS) og CE 25 hybridoma-celle RNA (CE 25) (a) under anvendelse af et L2 L-kædegensegment 35 DK PR 172444 B1 (b) under anvendelse af et H8 H-kædegensegment.

Flg. 3:

Skema for konstruktion af det kimære murin/human L-kædege 5 pCEA-CicGa (eksempel 8.1 og 8.2)

Symboler: se ovenfor.

F1g- 4:

Skema for konstruktion af det kimære murin/human H-kædegei pCEA~74Na (eksempel 8.3 og 8.4) 10 Symboler: se ovenfor.

Fig. 5:

Skema for konstruktion af pMlHuCx-la (eksempel 10.1 o 10.2)

Symboler: se ovenfor, restriktionssteder i parentese 15 eli- mineres under de forskellige kloningsprocesser.

Fig. 6:

Skema for konstruktionen af den kimære dobbeltkonstruktic pCEA(H+L)2neo bærende begge murin/human (γ4;κ) anti-CEi H- og L-kæde Ig-gener 20 Symboler: se ovenfor, restriktionssteder i parentese eli- mineres under de forskellige kloningsprocesser.

Fig. 7:

Binding af det kimære monoklonale antistof udskilt af CE 4-8-13 til CEA 25 OD: optisk tæthed.

36 DK PR 172444 B1

Forkortelser bp basepar CDR komplementaritetsbestemmende område 5 ddNTP dideoxyribonukleotid-triphosphat (N = adenin, cytosin, guanin eller thymin) dNTP deoxyrlbonukleotid-triphosphat (N “ adenin, cytosin, guanin eller thymin) DMEM Dulbecco's minimal essentialmedium 10 (Dulbecco & Vogt, J. Exp. Med. 99, 167, 1954) DTT dithiothreitol EDTA ethylendiamintetraeddeiksyre FCS føtal kalveserum HEPES N-2-hydroxyethyl-piperazin-N’ -21-ethan- 15 sulfonsyre HAT hypoxanthin/aminopterin/thymidin HT hypoxanthin/thymidin

Ig immunglobulin kb kilobase (par) 20 MOPS γ-morpholino-propansul fonsyre NZ-amin NZ-amin (10 g/1), NaCl (5 g/1), gærekstrakt (5 g/1, Difco), casaminosyrer (1 g/1, Difco)

MgS04*7H20 (2 g/1), pH 7,5 med NaOH PBS phosphatpufret saltopløsning (Dulbecco & Vogt, 25 J. Exp. Med. 99, 167, 1954) PBS-CM PBS uden MgCl2 og CaCl2 RIA radioimmunanalyse SDS natriumdodecylsulfat 20 x SET 3 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M Tris-HCl, pH 7,8 30 SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat TE-puffer 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan 37 DK PR 172444 B1

Eksempel 1

Fremstilling af hybrldomacellelinie CE 25 1.1 Rensning af carcinoembrynalt antigen (CEA) 5 Colon carcinomalevermetastaser udtaget ved obduktion (i løbet af 6 timer fra dødstidspunktet) ekstraheres med saltopløsning. 1 rumfang væv homogeniseres først i 3 rumfang 0,02 M phosphatpuffer pH 7,4 ved 4°C i 10 minutter i en Sorvall Omnimixer ved 8.000 o/m. Det rå homogenat 10 centrifugeres derpå ved 8000 G i 15 minutter ved 4°C. Den klare supernatant sættes til en immunadsorbens bestående af en blanding af de kendte anti-CEA-monoklonale antistoffer MAb 35 og MAb 115 (Haskell et al.. Cancer Res. 43, 3857, 1983, Buchegger et al., J. Exp. Med. 158, 413, 1983) 15 og MAb 73 (Buchegger et al., Immunol. Letters 5, 85, 1982) koblet til CNBr-aktiveret "Sepharose". CEA elu-eres med 2 M ammoniumthiocyanat.

1.2 Immunisering af Balb/c-mus 2 måneder gamle Balb/c-mus immuniseres med CEA ved intra-20 peritoneal injektion af 15 /tg saltopløsningsekstraheret renset CEA med komplet Freund's adjuvans. Efter 4 måneder gives intraperitonealt en række booster-injektioner indeholdende 15, 50 og 150 μg af det samme saltopløsning-CEA-praeparat uden Freund’s adjuvans henholdsvis 5, 4 og 3 dage 25 inden fusionen.

1.3 Cellefusion

Cellefusionen gennemføres under anvendelse af 1,5 x 10^ miltceller fra immuniserede mus og 1,5 x lO? celler fra musemyelomaet P3-NS2/lAg4 i overensstemmelse med alminde-30 ligt anerkendte fremgangsmåder (Koehler & Milstein, Nature 256, 495, 1975). Efter vaskning resuspenderes cellerne i 38 DK PR 172444 B1 48 ml standard Dulbecco’s minimum essential medium (Gibco nr. 0422501). Som fødeceller tilsættes 3 x 10^ peritoneal exudatceller fra normale mus pr. fusion. Cellerne fordeles 5 i 96 x 0,5 ml Costar huller og fødes 3 gange om ugen med standard HAT-selektionsmedium i 3-6 uger. Når væksten af hybridomacellerne bliver synlig, screenes supernatanterne som beskrevet i eksempel 1.4. Positive hybridomaer, f.eks. cellelinien CE 25 beskrevet i eksempel 1.5 genklones og 10 opbevares.

1.4 Påvisning af antistof i hybridomasupernatanter

Kulturvæsker fra voksende hybridomaer testes for tilstedeværelse af anti-CEA-antistof ved en modifikation af analysemetoden ifølge Farr (J. Infect. Dis. 103, 239, 15 1958) som tidligere beskrevet (Accolla et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. 77, 563, 1980). 1:10 (r/r) fortyndinger af cellekultursupernatanter Inkuberes in duplo med 125i_mærket CEA i 0,02 M Tris-HCl-puffer, pH 7,4. CEA bundet til antistoffer fældes ved 4°C ved tilsætning af 20 kold, mættet ammoniumsulfatopløsning i nærværelse af normal humanserum.

1.5 Opbevaring og behandling af hybridoma

Hybridoma CE 25, som udskiller anti-CEA-antistof MAb CE 25, kan dyrkes i kultur, fryses ved -80eC eller I flydende 25 nitrogen og gendyrkes. Cellerne klones ved anvendelse af grænsefortyndingsmetoden og formeres ved dannelse af ascites i Balb/c-mus, som er forbehandlet med pristan. Cellelinie CE 25 er deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, 30 15. december 1987, under nummeret 1-719.

39 DK PR 172444 B1

Eksempel 2

Isolering af DNA fra hybridomacellelinierne CE 25, P3-NS2/ !Ag4 og Balb/c-musenyreceller 5 CE 25 hybridomaceller (5 x 10?) dyrkes 1 suspensions-kultur ved 37eC i DMEM (Seromed) + 10% FCS (Seromed), 1 mM natriumpyruvat (Seromed), 2 mM glutamin (Seromed), 50 μΜ 2-mercaptoethanol og 100 μς/ιηΐ gentamycin (Seromed) og i en fugtig luftatmosfære og 7,5% CO2 i 175 cm3 vævskultur-10 kolber (Falcon 3028). Cellerne høstes ved centriguering, lynfryses 1 flydende nitrogen og opbevares i frossen tilstand som en pellet ved -80eC i et rent sterilt plastrør med hætte.

De frosne celler resuspenderes i 10 ml PBS, hvortil der er 15 sat 90 ml 0,3 M saccharose, 5 mM MgCl2, 0,1% (v/r) "Triton-X100", 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ved 4*C i et rent sterilt 100 ml plastbægerglas. Cellerne lyseres ved blanding, og kerner samles ved centrifugering (10 min., 10.000 o/m, 4eC, Sorvall RC-5-centrifuge, SS-34 rotor). Superna-20 tanten fjernes, og kernepelletten resuspenderes i 4,5 ml 75 mM NaCl, 24 mM EDTA, pH 8,0. Der tilsættes destilleret vand (100 μΐ), SDS (250 μΐ 10%'s (v/r) opløsning i destilleret vand) og 100 μΐ proteinase K-opløsning (Boehringer, 100 mg/ml opløsning i destilleret vand), og der blandes 25 forsigtigt. Blandingen Inkuberes ved 37eC natten over.

Opløsningen ekstraheres ved blanding med et tilsvarende rumfang redestilleret phenol mættet med 20 mM Tris-HCl, pH

8,0, ved 0eC. Den vandige fase isoleres efter centrifugering (10.000 o/m, stuetemperatur, Sorvall RC-5-centri-30 fuge, SS-34 rotor) og ekstraheres to gange med et tilsvarende rumfang CHClg/isoamylalkohol (24:1 r/r). DNA fældes ved tilsætning af 1/10 rumfang 3 M NaOAc, pH 5,0, efterfulgt af to rumfang absolut ethanol ved stuetemperatur.

Det fældede DNA udtages fra ethanolopløsningen, anbringes 40 DK PR 172444 B1 i 1 ral TE-puffer og opløses natten over ved 4'C. Udbyttet af DNA er ca. 0,5 mg.

DNA fra cellelinie P3-NS2/lAg4 udvindes på lignende måde.

5 Til præparationer af DNA fra Balb/c-musenyrevæv lynfryses frisk musenyre i flydende nitrogen, hvorpå vævet formales til et fint pulver i en ren steril pestil med en morter i nærværelse af flydende nitrogen, og DNA’et ekstraheres fra en vævsmængde svarende til 5 x 10*7 celler under anvendelse 10 af den nedenfor beskrevne metode.

Eksempel 3

Analyse af omlejrede Ig H- og L-kædegenloci i CE 25-celler

Hybridoma CE 25 indeholder H- og L-kæde Ig-genloci afledt af P3-NS2/lAg4-cellerne anvendt som fusionspartner til 15 dannelsen af hybridomaet. P3-NS2/lAg4-cellelinien er afledt af M0PC-21-myelomaet (Storb et al., Nucleic Acids Res. 8, 4681, 1980). Forskellene mellem "endogene" omlejrede loci og CE 25-specifikt omlejrede gener kan vises på følgende måde: 20 3.1 Kilde og præparation af probe DNA-fragmenter

Probe DNA-segmentet, som anvendes til påvisning af Balb/c-musekimlinie H-kæde J-område DNA-segmentet er ca. 1750 bp Bglll/Xbal-segment af Balb/c-muselever DNA, svarende til nukleotidpositionerne 1130-2881 i det publicerede kimlinie 25 H-kæde Ig-locus (Newell et al., Science 209, 1128, 1980; EMBL data base entry MUSIGCD07).

Probe DNA-segmentet, som anvendes til påvisning af Balb/c-musekimlinie Lkæde J-område-segmentet er et ca. 2240 bp Hindlll/Xbal-segment af Balb/c-muselever DNA, svarende til 30 nukleotidpositionerne 659-2900 i det publicerede kimlinie 41 DK PR 172444 B1 L-kæd© Ig-locus (Max et al., Proc. Natl. Acad. Scl. 76, 3450, 3454, 1979, EMBL database sekvens entry MUSIGKJC2).

DNA-prober renses ved molekylær kloning af Balb/c-muse-5 lever DNA i bakteriofag X, underkloning af passende DNA-fragmenter i pUC12- eller pUC13-plasmidvektorer og gen-vinding/rensning af klonet DNA-inserter under anvendelse af standardmetoder (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbour, N.Y., 1982).

10 DNA-prober fremstilles ud fra 300 ng rensede DNA-fragmen-ter ved nick-translation i nærværelse af of-32p..(jcTP>, p. coli DNA polymerase-X og DNasel, under anvendelse af den kendte standardmetode (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, 237, 1977). Mærket probe DNA isoleres fra ikke-inkorpo- 15 reret mærkereagens under anvendelse af "Sephadex G50”® (Pharmacia) kromatografi med en 10 x 0,5 cm separationssøjle og en elueringspuffer Indeholdende 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/r) SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.

3.2 Gelelektroforese af DNA

20 DNA-prøver (5 /ig) fra (a) P3-NS2/lAg4-myelomaet anvendes som moderfusionspartner ved dannelsen af CE 25-hybrido-maet, (b) CE 25-hybridomaet og (c) Balb/c-musenyreceller, fremstillet som beskrevet i eksempel 2, spaltes fuldstændigt under anvendelse af restriktionsenzymerne Xbal, 25 Bglll, EcoRI + Hindlll, BamHI, EcoRI eller Hindlll (Boehringer) under de af producenten anbefalede betingelser. DNA-fragmenter adskilles ved hjælp af flatlagsagaro-segelelektroforese under anvendelse af 10 x 20 x 0,5 cm 0,5% (v/r) agarose, (Biorad, standard lav Mr) geler og 30 elektroforesepuffer indeholdende 25 mM dinatrium-EDTA, 90 mM Tris-base, 90 mM borsyre, pH 8,3. Fragmenter af bakteriofag X spaltet enten med Hindlll eller med EcoRI pooles og mærkes radioaktivt under anvendelse af Klenow DNA-poly-merase I-fragment (Boehringer) i nærværelse af dNTPs og 42 DK PR 172444 B1 a_32p_dNTps under anvendelse af en kendt fremgangsmåde (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual". Cold Spring Harbour, N.Y., 1982). Disse anbrin- 5 ges i separate baner af agarosegelen til dannelse af en række mærkede DNA-markørfragmenter med kendt størrelse.

Efter adskillelse af DNA-fragmenter ved elektroforese overføres de ved blotting ved stuetemperatur til en nitrocellulosemembran under anvendelse af den kendte Southern-10 metode (Southern, J. Mol. Biol. 9j3, 503, 1975) med følgende mindre modifikationer. Efter elektroforesen afskæres overskud af agarose fra gelens kanter, hvorefter den udblødes ved stuetemperatur i 500 ml 0,25 M HC1-opløsning i 30 minutter efterfulgt af udblødning i 500 ml 1,5 M 15 NaCl, 0,5 M NaOH i 60 minutter til denaturering af DNA’et.

Gelen skylles kortvarigt med destilleret vand, hvorpå den udblødes i 60 minutter i neutraliseringsopløsning (3 M NaCl, 0,3 M Tris-HCl, pH 7,5). DNA-fragmenter overføres derefter natten over til en nitrocellulosemembran 20 (Schleicher & Schuell, porestørrelse 0,45 μια) under anvendelse af den ovenfor omtalte fremgangsmåde og under anvendelse af en opløsning indeholdende 3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat, pH 6,8. Nitrocellulosemembranen, som indeholder de blottede DNA-fragmenter lufttørres og opvarmes 25 ved 80eC i 2 timer under vakuum. Efter opvarmning fjernes overskud af tørre salte ved udblødning af membranen i 0,75 M NaCl, 0,075 M natriumcitrat, pH 6,8, inden hybridisering med radioaktivt mærkede DNA-prober.

3.3 DNA-hybridisering 30 Nitrocellulosefiltre fremstillet som beskrevet i eksempel 3.2 præhybridiseres i varmeforseglede plastposer i 4 timer ved 65®C i 20 ml præhybridiseringsopløsning indeholdende 0,2 ml 10% (v/r) SDS, 0,4 ml 5% (v/r) natriurnpyrophosphat, 0,4 ml sildesperma DNA (5 mg/ml i destilleret vand), som 35 har været udsat for forskydningskræfter ved passage gennem en 18 gauge injektionsnål, 5 ml Denhardt-opløsning 43 DK PR 172444 B1 (Denhardt, BBRC 23, 641, 1966, 0,2% (v/r) bovint serumalbumin, 0,02% (v/r) polyvinylpyrrolidon, 0,02% (v/r)

Ficoll-400 i 20 x SET puffer (3 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M 5 Tris-HCl, pH 7,8)) og 14 ml destilleret vand.

DNA-hybridiseringsblandingen indeholder 107 cpm radioaktivt mærket DNA-probe, 10 ml præhybridiseringsopløsning, fremstillet som beskrevet ovenfor, og 10% (v/r) dextran-sulfat (Sigma). Blandingen opvarmes til 100°C i 20 minut-10 ter til denaturering af DNA'et. Til hybridisering fjernes præhybridiseringsblandingen fra plastposerne og erstattes med hybridiseringsblånding. Efter fjernelse af luftbobler forsegles posen atter, og der inkuberes natten over ved 65eC. Til fjernelse af uspecifik bundet DNA fra membranen 15 udtages hybrid!seringsblandingen og membranen fra plastposen. Membranen anbringes i et bad indeholdende 500 ml 5 x SSC, 0,1% (v/r) natriumpyrophosphat og vaskes i 15 minutter ved 65°C. Derefter vaskes membranen ved 65°C i 30 minutter i 500 ml opløsning indeholdende henholdsvis 4 x 20 SSC, 3 x SSC, 2 x SSC og til sidst 1 x SSC samt 0,1% (v/r) natriumpyrophosphat i alle tilfældens. Membranen lufttørres, forsegles i en ren tynd polyethylenpose og autoradiograferes ved -70®C under anvendelse af Kodak røntgenfilm (X-omat TM AR) og billedforstærkende skærme i 25 op til tre dage.

De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel 1 og illustreret i fig. 1.

Tabel 1

Størrelse af CE 25-hybridomaspecifikke genomiske 30 DNA-frag- menter, som udviser homologi med murine H-kæde og li-kæde Ig J-område DNA-prober.

44 DK PR 172444 B1 DNA- Anvendt restriktionsenzym/fragmentstørrelse i kb probe Xbal Bglll EcoRI/ BamHI EcoRI Hindlll _Hindlll_ 5 H-kæde 8,0* 21,0 5,6 10,8 7,5 6,3 2,1 20,0 2,1 8,3 2,5 2,9 L-kæde 2,5 1,8 2,1 6,4 20,0 9,5 2,0* 1,2 1,9 4,5 18,0 1,9 10 * fragmenter, som koder for funktionelle H- og L-kæde V- område H8- og L2-segmenter af CE 25-antistoffet.

Ved sammenligning med moderfusionspartnercellelinien P3-NS2/lAg4, indeholder CE 25-hybridomaet to yderligere omle jrede H-kæde Ig-genloci og to yderligere omlejrede L-15 kæde Ig-genloci. Disse betegnes som henholdsvis H2 og H8 (fig. IB) og L og L2.5 (fig. 1A) ud fra størrelserne af musegenom DNA-fragmenterne påvist ved Xbal-restriktions-spaltninger ved hjælp af Southern-blotting under anvendelse af muse Ig-specifikke DNA-prober.

20 Eksempel 4

Molekylær kloning af funktionelt omlejrede H- og L-kæde Ig-gener af CE 25-hybridomaet 4.1 Fremstilling af størrelsesselekterede DNA-fraktioner Indeholdende CE 25-hybridomaspecifikke omlejrede H-25 og L-kæde Ig-loci CE 25-hybridoma DNA (50 μg) spaltes fuldstændigt med Xbal, ekstraheret med et tilsvarende rumfang CHClø/redestilleret phenol (1:1, r/r, mættet med 20 mM Tris-HCl, pH 8,0), 30 hvorpå der ekstraheres med et tilsvarende rumfang CHCI3 til fjernelse af spor af phenol. DNA fældes ved tilsætning af 0,1 rumfang 3 M NaOAc, pH 5,0 og 2,5 rumfang absolut I DK PR 172444 B1 I 45 ethanol ved -20‘C. DNA-pelletten udtages, opløses i 150 μΐ TE-puffer og sættes på en 12 ml 5-24% (v/r) NaCl-gradient i TE-puffer i et polyallomerrør til en Beckman SW41-rotor.

5 Gradienter centrifugeres i 4,5 timer ved 37.000 o/m ved 25°C og fraktioneres fra bunden. DNA-fraktioner (300 μΐ) svarende til (a) 1,5-2,5 kb lange DNA-fragmenter og (b) 6,0-9,0 kb lange DNA-fragmenter udtages hældes sammen og fældes under anvendelse af 2,5 rumfang absolut ethanol ved 10 -20*C. DNA fra sammenblandede fraktioner (a) og (b) iso leres ved centrifugering, tørres under vakuum og opløses i TE-puffer til koncentrationer på henholdsvis 50 ng/μΐ og 200 ng/μΐ.

4.2 DNA-ligeringer og pakning i bakteriofagpartikler 15 DNA-prøver (1 μΐ) fra fraktioner (a) og (b) som beskrevet ovenfor ligeres natten over ved 4°C med 0,8 μg X-OngC/ Xbal-spaltede bakteriofag-DNA-arme (Stratagene Inc., San Diego, USA) i 5 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM DTT, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, i nærvæ-20 relse af 5 enheder T4-DNA-ligase (Boehringer). Ligeringsblandingerne pakkes under anvendelse af Gigapack "PLUS" (Stratagene Inc., San Diego, USA) og udplades på E. coli K12/VCS257 (fremstillet ved vækst på NZ-amin/0,4% (v/r) maltose) under avendelse af NZ-aminvækstmedium i 25 overensstemmelse med producentens instruktioner ved en tæthed på ca. 250 pfu/cm2 under anvendelse af mikrobiologiske standardmeto- der. Pladerne inkuberes natten over ved 37eC.

L2 og L2.5 omlej rede L-kæde Ig-gen-loci påvises i biblio-30 tek (a) ved hjælp af Benton & Davis-hybridiseringsscreen-ing (Science 196, 180, 1977) under anvendelse af den nick-translaterede 32p_maerjcede muse L-kæde Ig DNA-probe beskrevet i eksempel 3.1. Positive hybridiseringsplaque plaque-renses, udtages under anvendelse af spidsen af en steril 35 pasteur-pipette, og fagen resuspenderes i 1 ml fagpuffer 100 mM NaCl, 8 mM MgS04.7H20, 0,01% (v/r) gelatine, 5 mM

46 DK PR 172444 B1

Tris-HCl, pH 7,5). Faglysater (10 ml) fremstilles ved adsorption af 20 μΐ fagsuspension til et cellerumfang på 100 μΐ udtaget fra en overnatskultur af E. coli K12/VCS257 5 dyrket i NZ-amin-medium tilsat 0,4% (v/r) maltose. Blandingen fortyndes til 10 ml med frisk NZ-amin-medium i sterile 50 ml Falcon-rør og dyrkes natten over ved 37eC under kraftig rystning. Der tilsættes 20 μΐ CHCI3, og rystningen fortsættes ved 37eC i 30 minutter. Rekombi-10 nantbakteriofag DNA fremstilles af lysaterne under anvendelse af en kendt fremgangsmåde (Blattner et al..

Science 202, 1279, 1978). DNA udvundet efter det sidste ethanolfældningstrin opløses i 100 μΐ TE-puffer. Udbyttet af fag DNA er ca. 100 μg.

15 DNA-prøver (1 /tg) fra hver positivt hybridiseret rekombi-nant bakteriofag spaltes fuldstændigt under anvendelse af restriktionsendonucleasen Xbal. Et L2-gensegment identificeres som et 2 kb Xbal-restriktionsfragment, når de spaltede rekombinant DNA-prøver analyseres ved hjælp af 1% 20 (v/r) agarosegelelektroforese. Det ca. 2,0 kb L2-genseg- ment udskæres af agarosegelen, renses ved ekstraktion med phenol/CHCl3 og genvindes ved ethanolfældning. Det rensede DNA-fragment underklones derpå i begge retninger i pUC12-plasmidkloningsvektoren, som er lineariseret ved Xbal-25 spaltning. Alle trinene er standardmetoder (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbour, N.Y., 1982). Restriktionsmapping af disse plas- midsubkloner under anvendelse af restriktionsendonuclea-serne Xbal, Bglll, PstI, Hindlll og BamHI bekræfter, at 30 strukturen af det klonede L2-gensegment svarer til strukturen af det oprindelige genomiske L2-gensegment udvundet ved Southern blotting af CE 25-hybridoma DNA som beskrevet i eksempel 3. Plasmider indeholdende det klonede L2-gen-segment i begge orienteringer betegnes pCEA-L2a og 35 pCEA-L2b. Et restriktionskort for pCEA-L2a er vist i fig.

1A.

47 DK PR 172444 B1

Bibliotek (b) anvendes som kilde for H8 omlejret H-kæde Ig-gensegmentet under anvendelse af samme fremgangsmåde. Screening af rekombinantfag for H-kædegen-loci opnås ved 5 hybridisering med den H-kædespecifikke radioaktivt mærkede DNA-probe beskrevet i eksempel 3.1. Positivt hybridise-ringsrekombinantfager plaquerenses, DNA isoleres og spaltes under anvendelse af Xbal som beskrevet ovenfor. En H8-gensekvens identificeres som et ca. 8 kb restriktions-10 fragment, når det adskilles fra kloningsvektor DNA ved spaltning med Xbal efterfulgt af elektroforese på 1% (v/r) agarosegel. H8-genet subklones i begge orienteringer i plasmidvektoren pUC12, lineariseret ved spaltning med Xbal. Restriktionsmapping af DNA subklonerne under anven-15 delse af enzymerne Xbal, PstI, Hindlll og BamHl bekræfter, at strukturen af det klonede H8-gensegment svarer til strukturen af det genomiske H8 omlejrede H-kæde Ig-locus, afledt ved Southern blotting af CE 25-hybridoma DNA under anvendelse af en H-kædespecifik radioaktivt mærket DNA-20 probe som beskrevet i eksempel 3. Disse H8-DNA subkloner betegnes pH8al og pH8bl. Et restriktionskort for pH8al Xbal-insert-DNA-fragmentet er vist i fig. IB.

4.3 Nukleotidsekvensanalyse af L2- og H8-gensegmenterne

Der gennemføres nukleotidsekvensering af L2- og H8-gen-25 lociene i pCEA-L2(a eller b) og pH8(al eller bl) under anvendelse af den kendte dideoxynukleotidkaedetermine-ringsmetode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463, 1977). Rekombinant plasmid DNA'er skæres under anvendelse af passende restriktionsendonucleaser, og DNA-30 fragmenter, som skal sekvenseres, udvindes ved 1% (v/r) gelelektroforese. Derefter klones og sekvenseres DNA-fragmenterne i M13-bakteriofagvektorer med Amersham Ml3-klo-ningssystemet under anvendelse af leverandørens anvisninger (Amersham International PLC, UK).

35 L-2-gensegmentet sekvenseres fra 5’-Xbal-restriktionsste- 48 DK PR 172444 B1 det til nukleotid 1395, lokaliseret 3’ i forhold til det omlejrede L-kæde V-J4-område. Nucleotidsekvensen er omfattet af formlen III.

5 Disse data bekræfter restriktionskortet for det klonede L2~gen i dette område (fig. 1A) og fastlægger sekvensen af det første exon, som koder for de N-terminale rester af L-kæde-leaderpeptidet (begyndende med methionin ved position 733 i sekvensen), en mellemliggende sekvens 10 (nukleotider 781-987), og kodningssekvensen for resten af leaderpeptidet og det omlejrede L2 V-område, som slutter med en prolinrest lokaliseret ved V-J4-område (nukleotider 988-1284). Nucleotider 1285-1395 svarer til den kendte muse κ-kæde Ig-kimliniesekvens (mellem 1725 og 1836 af 15 EMBL-databanksekvens entry MUSIGKJC2). Nucleotider 680-1284 svarer til et kendt musekimlinie L-kæde V-område (L7,

Pech et al., Nature 291, 668, 1981) bortset fra 7 ændringer i V-områdekodningssekvensen, som kan opstå ved somatisk mutation. Disse data fastlægger aminosyrekod-20 ningssekvensen for det omlejrede L2 L-kædegen omfattende leaderpeptidet, de tre strukturområder og komplementaritetsbestemmende områder CDRLs 1-3 (nukleotidrester 1069-1102, 1147-1167, 1263-1291) omfattende i-struktur V-J4-samlingen.

25 H8 H-kædegensegmentet sekvenseres fra det indre Hindlll-restriktionssted til nukleotid 857 anbragt 31 i forhold til det omlejrede H-kæde V-D-J-område. Nucleotidsekvensen er anført ved den efterfølgende formel IV.

Disse data bekræfter restriktionskortet for dette område 30 af H8-genet (fig. IB) og fastlægger sekvensen af det første exon, som koder for de N-terminale 16 aminosyre-rester af leaderpeptidet (begyndende med methionin ved position 322 i sekvensen), en mellemliggende sekvens (nukleotider 368-473) og kodningssekvensen af resten af 35 leaderpeptidet og H8 V-området op til en serinrest (nukleotider 474-844). Nucleotidrester 797-857 svarer til 49 DK PR 172444 B1 muse H-kæde Ig-kimliniesekvensen (mellem 2291 og 2352 af EMBL-databanksekvens entry MUSIGCD007) bortset fra 3 nukleotidændrInger, som påvirker den forudsagte kodnings-5 sekvens af J-området af H-kæde-polypeptidet. De første 796 nukleotidrester i sekvensen er homologe til, men ikke identiske med, kendt muse H-kæde V-område, som afledt af en undersøgelse af de tilgængelige sekvensdata i genbank NBRF- eller EMBL-bibliotekerne. Disse sekvenseringsdata 10 fastlægger aminosyrekodningssekvensen omfattende leaderpeptidet, de tre strukturområder og CDRHs 1-3 (nukleotider 575-595, 629-680 og 776-805), originet for H-kædediversitet (D)-segmentet (som stammer enten fra DSP2.3, DSP2.4 eller DSP2.6 af muse H-kæde Ig-kimlinie-15 locuset) og i-struktur V-D-J4-samlingen af det omlejrede H8 H-kædegen af hybridoma CE 25.

Eksempel 5

Sammenligning af nukleotidsekvenser af udtrykte H- og L-kæde Ig mRNAs og nukleotidsekvenser af omlejrede H- og L-20 kædegener fra musehybridomaet CE 25

5.1 Ekstraktion af total cellulær RNA

Total RNA ekstraheres under anvendelse af LiCl/urinstof-metoden beskrevet af Auffray & Rougeon (Eur. J. Biochem.

107, 303, 1980) og som modificeret af Le Meur et al. (Cell 25 23, 561, 1981). CE 25-hybridomaceller (5 x 107) dyrkes og præpareres som beskrevet i eksempel 2. Cellepellets optøes direkte i røret i nærværelse af 5 ml LiCl/urinstof (3M LiCl, 6 M urinstof, 200 /ig/ml heparin, 0,1% SDS, 10 mM NaOAc, pH 5,0). De efterfølgende trin er beskrevet i de 30 publicerede metoder. Metoden giver ca. 50 μg total cellulær RNA. Renset slutprodukt opbevares under 70% (r/r) ethanol ved -80eC ved en kendt koncentration.

50 DK PR 172444 B1 5.2 Nukleotidsekvensering af udtrykte H- og L-kaede Ig mRNAs

Nukleotidsekvensering af mRNA fra CE 25-hybridomaet gen-5 nemføres direkte i total cellulær RNA-fældninger under anvendelse af specifikke radioaktivt mærkede oligonukleo-tidprimere. Disse primeroligonukleotider er fremstillet kemisk på kendt måde (Rink et al., Nuc. Acids Res. 12, 6369, 1984).

10 (a) Sekvensering af muse C*-holdig mRNA opnås ved anven delse af en specifik oligonukleotidprimer med sammensætningen HO-5'-dGGGAAGATGGATACAGTTGG-3 T-OH. Denne sekvens er komplementær til kodons 3-12 i den publicerede muse Ck-kodningssekvens (Altenburger et al., Nuc. Acids Res. 9, 15 971, 1981).

(b) Sekvensering af muse IgGl-specifik mRNA opnås ved anvendelse af en specifik oligonukleotidprimer med sammensætningen HO-5'-dGGCCAGTGGATAGAC-31-OH. Denne sekvens er komplementær til kodons 7-11 i CHl-domænet (første 20 konstantområdeexon) af muse Ig7l H-kædekodningssekvensen (Honjo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. LB, 559, 1979).

Begge oligonukleotider mærkes radioaktivt ved 5'-enden i nærværelse af -y-32p_ATp (Amersham) under anvendelse af T4- polynukleotidkinase (Pharmacia) til en specifik 25 aktivitet på 2 x 10® dpm/pmol. Mærkning og adskillelse af radioak- tivt mærkede oligonukleotider fra ikke-inkorporeret 7-32p_ ATP under anvendelse af kromatografi på "Sephadex"®G50 (Pharmacia) gennemføres på kendt måde (Qu et al., Nuc. Acids. Res. 11, 5903, 1983).

30 Til sekvenseringen isoleres prøver (25 /*g) af RNA opbevaret under ethanol ved centrifugering ved 4eC i 30 minutter i en Eppendorf-centrifuge, og RNA’et resuspenderes i TE-puffer indeholdende 10® dpm 5'-endemærket primer. Denne 51 DK PR 172444 B1 blanding opdeles i alikvoter i 5 x 1 ml Eppendorf-rør indeholdende 1 /il annelleringspuffer, 5 enheder omvendt transskriptase (Genofit SA, Geneve), 1 μΐ dNTP-blanding og 5 1 /ti af ddATP (200 /tM), ddGTP (100 /zM), ddCTP (80 /tM) eller ddTTP (200 /tM) opløsning i destilleret vand i et slutrumfang på 5 /ti (alle fra Amersham International, UK).

Det femte reaktionsrør indeholder intet ddNTPs og anvendes til at måle integriteten af mRNA'et. Reaktionsblandingerne 10 inkuberes ved 37°C i 30 minutter i tilfælde af primer (a) og ved 42°C i 30 minutter i tilfælde af (b). Der anvendes følgende puffere og blandinger: annelleringspuffer til

primer (a): 60 mM MgCl2, 0,4 M KC1, 0,5 M Tris-HCl, pH

8,3, annelleringspuffer for primer (b): 60 mM MgCl2, 0,6 M 15 NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,3, dNTP-blanding: 2 mM af hver af de enkelte dNTPs i destilleret vand, bortset fra det, som svarer til det anvendte ddNTP i den pågældende sekvenseringsreaktion, som anvendes ved en koncentration på 0,5 mM.

20 Sekvenseringsreaktionerne afbrydes ved tilsætning af 20 /ti destilleret vand og 30 /ti 0,6 M NaOH til hvert rør. RNA hydrolyseres ved inkubering natten over ved 37eC. Reaktionsblandingerne neutraliseres ved tilsætning af 8,4 /ti 3 M eddikesyre, og DNA fældes ved tilsætning af 2,5 rum-25 fang absolut ethanol i nærværelse af 0,3 M NaOAc, pH 5,0.

De opnåede DNA-pellets lufttørres ved 60*C og resuspende-res i 2 μΐ sekvenseringsfarveblanding, hvorpå der elektroforeres på 6% polyacrylamid/urinstof DNA-sekvenseringsge-ler under anvendelse af standardmaterialer og standardme-30 toder (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463, 1977).

Sekvensen af L-kæde mRNA'et, som specifikt udtrykkes i musehybridoma CE 25, er 52 DK PR 172444 B1 1160 1180 1200

ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA mRNA: 3’-GACCCTAGGGAAGGTCCAAATCACCGTCACCTAGT

1220 1240 1260

GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAC mRNA: CCCTGTCTAAAATGAGAATGGTAGTTATcÅcACCTCAGACTTCTATAACGTCTAATAATG

1280 1300 1320

TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA mRNA: ACAGTTGTTTCAGTACCGACCGGTAAGTGCAAGCCGAGCCCCTGTTTCAACCTTTATTTT

CG

mRNA: GCccgactacgacgtggttgacataggtagaaggg-5' I- primer -1

Sekvensen løber 3'-5r og er komplementær til den del af det klonede og sekvenserede L2 L-kæde Ig-gen isoleret fra 5 CE 25-hybridoma DNA fra nukleotid 1166-1322 (jf. eksempel 4.3) .

Sekvensen af H-kæde mRNA'et, som specifikt udtrykkes i musehybridoma CE 25, er 614 634 654

TCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCCATTAGTAGTGGTGGTACCAC mRNA: 3'-ACCTCACCCAGTGTAG0TAATCATCACCACCATGGTG

674 694 714

CT AC TAT CCAG AC AGT GTGAAG GGCCGATTCACCATCTCCAGAGAT AAT GCCAG GAACAT mRNA: GATGATAGGTCTGTCACACTTCCCGGCTAÅgTGGTAGAGGTCTCTATTACGGTCCTTGTA

734 754 774

CCTGTACCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAG mRNA: GGACATGGACGTTCACTCGTCAGACTCCAGACTCCTGTGCCGGTAAATAÅtGACACGTTC

794 814 834

AGGTTTCTATGATGGTTACCTCTATGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCAC

mRNA: tccaaagatactaccaatg6agatacaacAcctgatgaccccagttccttggagtgagt0 854 CGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCC mRNA: GCAGA-5' 10 Sekvensen løber 3'-5' og er komplementær til den del af det klonede og sekvenserede H8 H-kæde Ig-gen isoleret fra CE 25-hybridoma DNA fra nukleotid 618-839 (jf. eksempel 4.3) . Den omfatter ikke sekvensen, som er komplementær til primerbindingsstedet.

53 DK PR 172444 B1

Eksempel 6

Specifik transskription af L2- og H8-specifikke mRNA transskripter i CE 25-hybridomaceller ved Northern blot-5 analyse

Total cellulær RNA fra enten CE 25-hybridomaceller eller fra P3-NS2/lAg4-celler fremstilles som beskrevet i eksempel 5. RNA-prøver (25 og 50 μg) isoleres ved centrifugering fra det ethanol, hvori det har været opbevaret, 10 hvorefter prøverne resuspenderes i 20 /il opløsning indeholdende 2,2 M formaldehyd, 50% (r/r) formamid, 1 mM EDTA, 40% (v/r) saccharose, 50 mM γ-morpholinopropansulfonsyre (MOPS) pH 7,0 og 0,5% (v/r) xylencyanol og 0,5% (v/r) bromcresolgrønt, der anvendes som markeringsfarvestoffer 15 til at følge elektroforeseprocessens forløb. Efter blanding sættes prøverne på 1% (v/r) agarosegeler under anvendelse af en elektroforesepuffer indeholdende 1 mM EDTA, 2,2 M formaldehyd, 50 mM MOPS, pH 7,0. Gelerne præel ektroforeres i 30 minutter inden anvendelse.

20 Efter elektroforesen afskæres overskud af agarose fra gelens sider, hvorpå gelen udblødes i 20 x SSC-puffer i 5 minutter. RNA overføres til nitrocellulosemembraner ved anvendelse af standard Northern blot-metoden (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring 25 Harbour, N.Y., 1982). Efter overføring natten over luft tørres membranen, hvorpå den opvarmes i 2 timer ved 80eC under vakuum. Inden hybridisering præhybridiseres membranen i 20 ml opløsning indeholdende 50% (r/r) formamid, 5 x SSC-puffer, 5 x Denhardt's opløsning (beskrevet i eksem-30 pel 3.3), 10 mM EDTA, 0,1% (v/r) SDS, 50 mM natriumphos-phat, pH 6,8 og 2 ml sildesperma-DNA underkastet behandling med forskydningskræfter (5 mg/ml i destilleret vand, eksempel 3.3). Inkubering foretages i en varmeforseglet plastpose ved 42°C i 8 timer. Til hybridisering fjernes 35 præhybridiserlngsblandingen fra plastposen, hvorpå der 54 DK PR 172444 B1 tilsættes hybridiseringsopløsning, som ligner præhybridi-seringsopløsningen, men som indeholder 2 x Denhardt's opløsning i stedet for 5 x Denhardt’s opløsning og 2 x 10? 5 cpm nick-translateret ^2p_mær}<e-t denatureret hybridise-ringsprobe-DNA. Den radioaktivt mærkede DNA-probe, som er specifik for det omlejrede L2 Ig L-kædegensegment, er plasmidet pCEA-L2a (fig. 1A og fig. 3). Det radioaktivt mærkede DNA, som er specifikt for det omlejrede H8 H-kæde-10 gensegment, er plasmidet pH8al (fig. IB). Fremstilling af nick-translateret probe DNA er beskrevet i eksempel 3.1.

Efter hybridisering i 16 timer ved 42eC fjernes membranen fra plastposen, hvorpå den vaskes to gange i 1 time ved 42°C i hybridiseringsblånding uden DNA-probe, derpå en 15 gang i 2 x SSC, 0,1% (v/r) SDS ligeledes ved 42eC, hvorpå der vaskes to gange i 0,1% x SSC, 0,1% (v/r) SDS, begge gange ved stuetemperatur. Derefter lufttørres membranen, hvorpå den anbringes i en tynd plasticpose og eksponeres på Kodak X-omat TM AR diagnostisk film ved -70eC under 20 anvendelse af en billedforstærkerskærm.

Resultaterne af Northern blot analysen er vist i fig. 2.

Eksempel 7

Molekylær kloning af konstantområdesegmenter af human Ig-genloci 25 7.1 Human-DNA-bibliotek

Der fremstilles et humant DNA-bibliotek i bakteriofagen X-vektor Charon 4a med begrænset spaltning af humant føtal lever-DNA med restriktionsendonucleaser Haelll og Alul under anvendelse af kendte metoder (Lawn et al., Cell 30 15, 1157, 1978). Ca. 1 x 10^ uafhængige rekombinantfager udplades på E. coli K12/803 og screenes ved hjælp af nucleinsyrehybridisering for tilstedeværelsen af human Cκ L-kædesekvenser og for human Ig74 H-kædesekvenser som be- 55 DK PR 172444 B1 skrevet nedenfor.

7.2 Isolering af humant Cx-holdig DNA-segment

En nick-translateret 32p_mærjcet muse ig L-kæde DNA-probe 5 fremstilles svarende til den, som er beskrevet i eksempel 3.1, og den anvendes til screening af rekombinantfag under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i eksempel 4.2. DNA isoleres fra plaquerensede positivt hybridiserende plaque under anvendelse af en standardfremgangsmåde (Blattner et 10 al., Science 202, 1279, 1978). Der isoleres et 2,5 kb

EcoRI DNA-fragment omfattende det humane C*-kodnings-segment (Hieter et al., J. Biol. Chem. 257, 1516, 1982) på denne måde, og det subklones i begge retninger i plasmid-vektoren pBR322, som er lineariseret med EcoRI. Disse 15 piasmider betegnes som henholdsvis pDA13b og pDA14a. Et restriktionskort for pDA14a konstrueres og er vist i fig.

3.

7.3 Isolering af humant y4 H-kædeholdigt DNA-segment

En nicktranslateret 32p_niær]cet muse IgG H-kæde DNA-probe 20 svarende til Xbal/Hhal-fragmentet af muse 72b-gen-locuset anvendes til at screene rekombinantfag som tidligere beskrevet (Takahashi et al., Cell 29, 671, 1982). En DNA-klon (nr. 188) indeholder det humane y4-gen-locus som bestemt ved restriktlonsmapping og ved nukleotidsekvens-25 analyse under anvendelse af Gilbert-Maxam-metoden (Proc.

Natl. Ac ad. Sci. 74, 560, 1977). Den del af klon nr. 188, som sekvenseres, svarer nøjagtigt til delen af det publicerede human -y4-gen mellem nukleotider 27-98 (EMBL data-basesekvensindgang HUMIGCD2). Et ca. 3 kb Hindlll/EcoRI 30 DNA-restriktionsfragment, indbefattende de 4 exons af γ4-genlocuset, subklones i plasmidvektoren pUC12 spaltet med HindiII/EcoRI. Plasmidet betegnes py4/l. Hindlll-stedet i P74/I findes i 74-genlocuset i Balb/c-muse-DNA (nukleotid-position 1 i EMBL databasesekvens entry HUMIGCD2, Ellison 56 DK PR 172444 B1 et al., DNA 11, 1981). EcoRI-stedet er afledt af EcoRI-kloningsstedet i Charon 4a-bakteriofag λ-kloningsvektoren ved enden af klon nr. 188. Et restriktionskort for ργ4/1 5 er vist i fig. 4.

Eksempel 8

Konstruktion af kimære muse/human (γ4;κ) antl-CEA H- og L-kaede Ig-qener og indsætning af disse gener i separate vektorer 10 Kimære konstruktioner indeholdende henholdsvis kimære muse/human anti-CEA H- og L-kædegener konstrueres og overføres sekvensvis til værtsceller ved hjælp af to ekspressionsvektorer som beskrevet i nedenstående eksempler 8 og 9.

15 Medmindre andet er anført anvendes de forsøgsmetoder, som er beskrevet i Maniatis et al. ("Molecular Cloning: A

laboratory manual”, Cold Spring Harbour, N.Y., 1982).

8.1 Molekylær kloning af et muse-DNA-seqment indeholdende L-kæde Iq-enhancerelementet 20 Et ca. 475 bp Alul DNA-restriktionsfragment indeholdende muse L-kæde Ig-enhanceren for RNA-transskription (Picard & Schaffner, Nature 307, 80, 1984, nukleotider 3691-4164 i

Balb/c-mus L-kæde Ig-locus, EMBL database sekvens entry MUSIGKJC2) klones ved kortendeligering i pUC12 plasmid- 25 vektoren, som er lineariseret ved anvendelse af restrik-tionsendonucleasen Smal. Ligeret DNA overføres til kompetent E. coli Kl2/803, og kloner udvælges efter dyrkning natten over på næringsagarplader (oxoid) indeholdende 50 μg/ml ampicillin. Af de to mulige orienteringer for insert 30 DNA udvælges en klon, som indeholder plasmidet pEL22, hvis restriktionskort er vist i fig. 3. pEL22 indeholder 475 bp muse Alul DNA-fragmentet i den samme orientering som i 57 DK PR 172444 B1 musegenomet med dets 3'-ende i nabostilling til EcoRI-stedet i pUC12-vektoren. Dets orientering bestemmes ved hjælp af nukleotidsekvensering i overensstemmelse med 5 Sanger-sekvenseringsmetoden beskrevet i eksempel 4.3 og under anvendelse af modifikationerne til direkte sekvensering af plasmid DNA-molekyler (Chen & Seeburg, DNA 4, 165, 1985). Den anvendte sekvenseringsprimer er Amersham reverse sekvenseringsprimeren (Cloning and Sequencing 10 Hanbook, Amersham International PLC, UK).

8.2 Det kimære L-kædegen (pCEA-CxGa)

Skemaet for konstruktionen af pCEA-CxGa er vist i fig. 3.

Plasmid pDAl4a (eksempel 7.2) og plasmid pEL22 (eksempel 8.1) spaltes fuldstændigt med restriktionsendonuclease 15 EcoRI. 2,5 kb EcoRI DNA-fragmentinsertet af pDAl4a adskilles fra vektorsekvenserne ved gelelektroforese på 1% (v/r) agarosegel og isoleres ved ethanolfældning efter ekstraktion med phenol/CHCl3 (eksempel 3.2). Ækvimolære mængder EcoRI-skåret pEL22 og pDA14a 2,5 kb DNA-insert 20 ligeres sammen natten over ved 4°C under anvendelse T4-DNA-ligase (Boehringer) og overføres til kompetent E. coli K12/803. Ampicillinresistente kolonier udvælges ved udpladning på dyrkningsagarplader Indeholdende 50 jig/ml ampicillin og inkubering natten over ved 37eC. Enkelte 25 kolonier selekteres, og der fremstilles plasmid DNA ud fra 5 ml minikulturer i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Ish-Horowicz & Burke (Nucleic Acids Res. 9, 2989, 1981). Spaltning af rekombinantplasmider under anvendelse af restriktionsendonucleasen Xbal anvendes til 30 bestemmelse af orienteringen af 2,5 kb EcoRI-fragmentet med hensyn til det transskriptionelle enhancer-holdige element af pEL22. En klon indeholdende disse fragmenter i den ønskede orientering udvælges, og plasmid-DNA isoleres.

Det tilsvarende rekombinantplasmid betegnes pKY14a. DNA 35 fra pKY14a spaltes partielt under anvendelse af restriktionsendonucleasen Xbal, ekstraheres med phenol/CHCI3 og 58 DK PR 172444 B1 udvindes ved ethanolfældning. Efter udvindingen behandles DNA'et med Klenow-DNA-polymerase-I-fragment (Boehringer) i nærværelse af dNTPs til gennemførelse af en udfyldnings-5 reaktion på de Xbal-spaltede DNA-ender. Flush-ende DNA-fragmenter kortendeligeres i nærværelse af T4-DNA-ligase (Boehringer), overføres til kompetent E. coli K12/803, og der fremstilles plasmid DNA minipræparationer fra individuelle ampicillinresistente kloner som beskrevet ovenfor.

10 Restriktionsmapping af rekombinantplasmider ved terminalspaltning under anvendelse af Hindi 11 + Xbal anvendes til identificering af en plasmidrekombinant (pXba5.5), som indeholder et slettet Xbal-restriktionssted i positionen, som er angivet i parenteser i fig. 3.

15 Det komplette DNA-insert (ca. 3 kb) af pXba5.5 isoleres ved partiel spaltning af plasmidet med EcoRI efterfulgt af fuldstændig spaltning med Sall, adskillelse fra vektor-DNA-sekvenser ved hjælp af 1% (v/r) agarosegelelektrofo-rese efterfulgt af phenol/CHClø-ekstraktion og ethanol-20 fældning som beskrevet ovenfor. Ca. 2 kb insert-DNA-frag-mentet af pCEA-L2a udvindes på tilsvarende måde efter terminalspaltning med EcoRI/Sall. Mængderne af de udvundne DNA-fragmenter bestemmes. Den eukaryotiske plasmidvektor pSV2gpt (Mulligen & Berg, Science 209, 1422, 1980) spaltes 25 fuldstændigt under anvendelse af EcoRI, og DNA ekstraheres på tilsvarende måde med phenol/CHClø, udvindes efter ethanolfældning, og mængden deraf bestemmes. Ækvimolære mængder af EcoRI-skåret pSV2gpt, 2 kb EcoRI/Sall-muse-DNA-fragment af pCEA-L2a og 3 kb Sall/EcoRI-muse-DNA-30 fragmentet af pXba5.5 ligeres sammen i en trevejsligeringsreaktion i nærværelse af T4 DNA-ligase (Boehringer). Rekombinantplasmider selekteres som beskrevet ovenfor, og de pi asmider, som har den korrekte orientering af DNA-fragmenter, karakteriseres ved restriktionsmapping. En 35 rekombinant med betegnelsen pCEA-CxGa indeholder DNA-frag-menterne i orienteringen vist i fig. 3. Det selekterbare markørgen (gpt) afledt af pSV2gpt og det dannede kimære 59 DK PR 172444 B1 muse/human L-kæde Ig-gen har samme transskriptionspolaritet.

8.3 Molekylær kloning af et muse-DNA-segment indehol- 5 dende H-kade Ig-enhancerelementet

Et 1,6 kb Hindlll/EcoRI DNA-segment fra Balb/c musegenomet (nukleotidpositioner 1963-3559, EMBL databank sekvens entry MUSIGCD07) behandles med Klenow DNA-polymerase-I-fragment (Boehringer) i nærværelse af dNTPs til dannelse 10 af et kortendet, dobbeltstrenget DNA-molekyle. DNA'et eks-traheres med phenol/CHCl3 og udvindes efter ethanolfæld-ning. Dobbeltstrengede Hindlll DNA-linkere adderes ved ligering i nærværelse af T4 DNA-ligase (Boehringer), og ekstraktions/fældningstrinene gentages. DNA-fragmentet 15 behandles derpå med restriktionsendonucleaser Hindlll +

Xbal, og det mindste af de to dannede Xbal/Hindlll-fragmenter (ca. 670 bp) isoleres efter adskillelse fra det andet ved hjælp af 1% (v/r) agarosegelelektroforese. Dette fragment klones i en Xbal/Hindlll-spaltet pUC13-plasmid-20 vektor under anvendelse af de i eksempel 8.2 beskrevne trin. Det dannede plasmid, der betegnes pDA4 (fig. 4), indeholder muse H-kæde Ig-enhanceren for transskription.

8.4 Det kimære H-kædegen (pCEA—y4Na)

Det muse Ig-enhancerholdige fragment af pDA4 isoleres 25 efter spaltning med EcoRI + Hindlll ved agarosegelelek-troforese/phenol-CHClø-ekstraktion/ethanolfældning. På tilsvarende måde isoleres 3 kb EcoRI/Hindlll DNA-insertet af ργ4/1. De to fragmenter ligeres sammen med pBR322-plas-midvektor-DNA lineariseret ved spaltning med EcoRI. Efter 30 transformation til E. coli K12/803 selekteres rekombinan-ter, og der fremstilles plasmid DNA-minipræparater. Restriktionsmapping under anvendelse af EcoRI, Hindlll og PstI fører til identificeringen af rekombinantkloner, som indeholder de ønskede DNA-fragmenter. En af disse kloner 60 DK PR 172444 B1 betegnes pDA16a (fig. 4). Ca. 3,7 kb insert-DNA-fragmentet af pDA16a isoleres efter terminalspaltning under anvendelse af restriktionsendonucleaser Xbal og EcoRI 5 efterfulgt af agarosegelelektroforese, phenol/CHCl3-eks-traktion og ethanolfældning. Ca. 1,7 kb EcoRI/Xbal-frag-mentet af pH8al indeholdende det omlejrede V-D-J4 H-kæde-segment af H8-genet renses på tilsvarende måde. Mængden af de to fragmenter bestemmes, og fragmenterne ligeres i 10 ækvimolære mængder ved en trevejsligationsreaktion med pSV2neo (Southern & Berg, J. Mol. App. Genet. 1, 327, 1982) lineariseret under anvendelse af EcoRI-restriktions-endonuclease i nærværelse af T4-DNA-ligase (Boehringer).

Efter transformation til E. coll K12/803 selekteres rekom-15 binanter som beskrevet ovenfor, hvorpå de karakteriseres ved restriktionsmapping under anvendelse af restriktions-endonucleaserne EcoRI, Hindlll, PstI og Xbal. En rekombinant med den ønskede orientering af DNA-fragmenter betegnes ρ0ΕΑ-γ4Νβ. I dette plasmid har det selekterbare 20 markørgen (neo) afledt af vektoren pSV2neo samme transskriptionspolaritet som det muse/human kimære H-kæde Ig-gen.

Eksempel 9

Transfektion og ekspression af kimære muse/human Ig-gener 25 pCEA-CxGa og pCEA--y4Na i muselymphoidceller

Sp2/0 (ATCC CRL 1581) er en velkarakteriseret musecellelinie af lymfoid oprindelse. Det er en Ig ikke-sekrete-rende variant af en cellelinie opnået fra fusionen af en musemiltcelle med myelomaet X63-Ag8, som er en sublinie af 30 myelomaet M0PC-21 (Koehler & Milstein, Eur. J. Immonol. 6, 511, 1976, Shulman et al., Nature 276, 270, 1978). Sp2/0-celler dyrket i DMEM tilsat andre stoffer som beskrevet i eksempel 2 høstes ved forsigtig centrifugering (130 G, 4eC) i 50 ml sterile rør (Falcon 2070) og vaskes/resus-35 penderes i PBS-CM (Seromed) ved en koncentration på ca.

61 DK PR 172444 B1 1 x 10^ celler/ml ved 4eC. Cellerne opbevares på is i op til 30 minutter.

9.1 Transfektion af Sp2/0 med det kimaere H-kæde Ig-gen 5 pCEA-*y4Na

Transfektion af den kimære H-kædegenkonstruktion (pCEA-74Na) opnås ved tilsætning af 20 μg supercoiled ρ0ΕΑ-γ4Νβ DNA i 50 μΐ TE-puffer til 1 x 10? Sp2/0-celler i 200 ^1 PBS-CM i et sterilt plastrør på is. Cellerne trækkes ind i 10 kammeret i et TA750-elektrotransfektionsapparat (Kruess GmbH, Hamburg, DE) og udsættes for en elektrisk puls på 3500 V/cm i 10 μδ under anvendelse af det cylindriske elektroporationskammer leveret af fabrikanterne, forafkølet ved tilførsel af steril, iskold PBS-CM til 15 kammeret i apparatet inden anvendelse. Cellerne udtages forsigtigt i et rent, sterilt cryorør (Nunc) og holdes på is i 10 minutter, hvorefter de inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 20 minutter efter fortynding (1:3, r/r) med vækstmedium (se ovenfor). Cellerne fordeles derefter i 20 96 huller i to 48-hullers vævskulturplader (Costar) ved en

celletæthed på ca. 1 x 10^ celler/hul i 1 ml DMEM vækstmedium indeholdende 15% FCS, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM Hepes, 1 mM glutamin, 100 /iM gentamycin (Gibco), 5 ng/ml insulin + 5 ng/ml transferrin + 5 pg/ml selen (CR-ITS

25 præmix., Collaborative Res. Inc.), 56 //g/ml folinsyre (Seromed), 36 jig/ml L-asparagin (Calbiochem), 116 μg/ml L-arginin-HCl (Calbiochem). Efter inkubering i 48 timer ved 37eC i en fugtig atmosfære indeholdende 7,5% CO 2 (Haraeus Cytoperm-inkubator) selekteres transficerede 30 celler ved tilsætning af 1 mg/ml G418-sulfat (Geneticin,

Gibco 066-1811). Medium og middel udskiftes hver anden dag. Cellerne screenes for ekspressionen af human IgG efter 14 dage under anvendelse af den såkaldte "prik"-analyse beskrevet i eksempel 9.2.

62 DK PR 172444 B1 9.2 Selektering af transfektanter, som indeholder intra-cellulær humant Ig H-kæde-polypeptid

Der forventes ikke påvisning af H-kæde Ig-protein i mediet 5 af Sp2/0-celler transficeret med den kimære H-kæde-gen-konstruktion alene, da H-kæder kun sekreteres, efter at de er blevet forbundet med L-kæder, men Sp2/0-celler Indeholder intet funktionelt L-kæde-polypeptid. Bekræftelse af ekspression af intracellulære H-kædepolypeptider i 10 celler transficeret med det kimære Ig H-kædegen pCEA~74Na gennemføres på følgende måde. Transficerede celler (1 x 105) samles fra dyrkningsmedium ved forsigtig centrifugering, vaskes med PBS og resuspenderes i 10 /il H2O. Cellerne oplukkes ved tre perioder med frysning i fast 15 carbondioxid og optøning ved 37eC. Cellerester fjernes ved centrifugering ved 5000 G (Eppendorf-mikrocentrifuge) ved stuetemperatur. Den intracellulære tung kædeekspression analyseres ved hjælp af en fremgangsmåde beskrevet af Towbin & Gordon (J. Immun. Meth. 72, 313, 1984) ved af-20 sætning af prøver (1 μΐ) af supernatanten i form af prikker på acetatcellulosemembraner (Millipore HAWAG, porestørrelse 0,45 /im). Efter blokering af uspecifik binding ved inkubering af membranerne i RIA-puffer (1% BSA (Fluka Fraction V, 05480), 0,2% NaN3 (Merck), 0,1% phenol-25 rødt (Seromed) i PBS) ved 37eC i 20 minutter vaskes de i PBS, hvorpå de inkuberes i 2 timer ved 37°C i fremkalderserum, som indeholder ged-anti-human IgG (mærket med alkalisk phosphatase, Tago), ved en fortynding på 1:1000 i RIA-puffer. Membranerne vaskes seks gange i PBS efterfulgt 30 af seks gange i H2O, hvorefter de inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter i substratpuffer indeholdende en l:l-blanding af følgende to opløsninger fremstillet umiddelbart inden anvendelse: (a) 1 mg/ml "Fast Blue B salt" (Fluka, 44660) i H2O, (b) 1 mg/ml 2-naphthylphosphat,

35 mononatriumsalt (Fluka, 71100) i 60 mM boratpuffer, pH

9,7. Reaktionen afbrydes ved inkubering af membranerne i methanol:eddikesyre:vand (5:1:5, r/r). Levedygtige celler 63 DK PR 172444 B1 svarende til de, som giver kraftigt farvesignal, angiver alkalisk phosphataseaktivitet (udtrykker således store mængder intracellulær human IgG tung kæde), klones. Blandt 5 adskillige sådanne klonede cellelinier udvælges en (EFVIII/74Na75-75) til yderligere transfektionsrunde med det kimære L-kæde genkonstruktionspiasmid pCEA-C*Ga.

9.3 Transfektion af EFVIIl/74Na75-75 med det kimære li-kæde Ig-gen pCEA-CxGa 10 Celler af EFVIII/74Na75-75 eller en hvilken som helst anden cellelinie fremstillet som beskrevet i eksempel 9.2 ekspanderes ved vækst i det i eksempel 2 beskrevne medium.

Ca. 1 x lO^-celler isoleres ved forsigtig centrifugering, og cellerne vaskes/resuspenderes i 200 μΐ PBS-CM på is.

15 Cellerne transficeres derpå under anvendelse af 10 μg supercolled pCEA-C<cGa DNA, og transfektanter udplades i vævskulturskåle under anvendelse af den i eksempel 9.2 beskrevne fremgangsmåde. Efter dyrkning i 60 timer selekteres transfekterede celler under anvendelse af et 20 vækstmedium, som indeholder 0,125 /*g/ml mycophenolsyre (Calbiochem, 475913, fra Behring Diagnostics), 250 /»g/ml xanthin og en 1:45 fortynding af hypoxanthin/thymidin (HT, 50x kone., Boehringer, 623091). Koncentrationen af mycophenolsyre forøges til 0,5 /tg/ml i løbet af den efterføl-25 gende 14 dages vækstperiode, idet mængderne af HT og xanthin holdes konstant. Efter denne periode analyseres cellekulturmedium fra huller i vævskulturskåle for udskilt human IgG som beskrevet i eksempel 9.4.

9.4 Antistofpåvisningsanalyse og bestemmelse af mængde 30 af sekreteret human IgG i transflcerede celler

Fladbundede mikro-ELISA-plader (Immulon, Dynatech, M129A) overtrækkes med enten 1 /xg/hul ged-anti-human κ-antistof (Tago, 060401) eller med 500 ng/hul renset human carcino-embryonalt antigen (Tu241, en gave fra Prof. J.-P. Mach, 64 DK PR 172444 B1

Department of Biochemistry, University of Lausanne), ved inkubering natten over ved 4eC. Efter vask med PBS, blokeres uspecifik binding ved inkubering med RIA-puffer 5 (eksempel 9.2) i 20 minutter ved 37eC i et fugtekammer, hvorefter der foretages yderligere vask med PBS. Der tilsættes cellesupernatanter (50 fil), og der inkuberes i 2 timer ved 37°C. Efter vaskning med PBS fremkaldes bundet kimært antistof under anvendelse af alkalisk phosphatase-10 mærket ged-anti-human IgG antistof (Tago, 902002) ved den anbefalede fortynding (1:1000) i RIA-puffer. Pladerne inkuberes i 2 timer ved 37eC. Pladerne vaskes flere gange med PBS, inden der tilsættes 150 fil substratpuffer, som indeholder 2 tabletter phosphatasesubstrat (p-nitrophenyl-15 phosphat, Sigma, 104R) i 10 ml substratpuffer (800 ml H2O, 97 ml diethanolamin, 130 ml 1 M HC1, 200 mg NaNg, 200 mg MgCl2*6H20, pH indstillet på 9,7). Efter inkubering i 15 minutter ved 37eC afbrydes farvereaktionen ved tilsætning af 50 μΐ 1 M NaOH. E405-495 måles under anvendelse af et 20 Titertek Multiscan MC-apparat. Levedygtige celler fra parallelhuller med store mængder udskilt human IgG klones.

En af flere sådanne kloner betegnes EFVIII/74Na75-75/

CkGA5-6 (kaldet CE 75-5-6), og denne er deponeret ved deponeringsinstituttet "Collection Nationale de Cultures 25 de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, 15. december, 1987, under nummeret 1-720.

Til bestemmelse af mængden af kimært antistof (y4;κ) udskilt af CE 75-5-6, anvendes flere standard human IgG4* myeloma-proteiner (fra Dr. F. Skvaril, Institute of Cancer 30 Research, Bern). Baseret på denne test udskiller transfec-tomaet CE 75-5-6 1 fig/ml kimært antistof til dyrkningsmediet efter 6 dages vækst.

65 DK PR 172444 B1

Eksempel 10

Konstruktion af kimære mus/human (γ4;χ) antl-CEA H- og L-kæde-gener og indsætning af disse gener i en dobbelt-5 konstruktionsvektor

Kimære konstruktioner indeholdende henholdsvis kimære mus/human-anti-CEA H- og L-kædegener konstrueres og overføres til værtsceller ved hjælp af en enkelt vektor indeholdende kimære H- såvel som L-kædegener som beskrevet i 10 nedenstående eksempel 10 og 11.

Medmindre andet er anført anvendes de forsøgsmetoder, som er beskrevet i Maniatis et al., ("Molecular Cloning: A

Laboratory manual", Cold Spring Harbour, N.Y., 1982).

10.1 Molekylær kloning af et muse DNA-segment lndehol-15 dende L-kæde Ig-enhancer-elementet (muse Ig L-kæde ACk precursor

Muse Cx-genet slettes fra kimiiniesekvenserne ved isolering af et 2 kb Pstl/Xmnl og et 1,1 kb XmnI/BamHI-fragment fra pLCEA/14A. (Walfield et al., Nucl. Acids Res. 8, 20 4689, 1980). Dette plasmid indeholder muse NS2 Cx L-kæde genet omlej ret ved J2-forbindelsessegmentet på et 7,0 kb BamHl/BamHl-restriktionsfragment. Dette fragment er ækvivalent med 7,0 kb BamHI/BamHI-fragmentet afledt af MOPC21/NS-ln som beskrevet af Walfield et al. (se 25 ovenfor). Den nøjagtige sekvens af 3,9 kb Pstl/BamHl-fragmentet er anført i EMBL databaseindgangen MUSIGKJC2, nukleotidpositioner 2368-6258.

Kloningen af disse to fragmenter i vektor pUC12, dobbelt-restriktionsspaltet med PstI og BamHI, giver et rekombi-30 nant plasmid med betegnelsen pMlACx. Det dannede klonede fragment indeholder kimliniesekvenser fra museimmunoglobu-lin let kæde-locuset startende ved Pstl-stedet, 268 bp 66 DK PR 172444 B1 downstream for J5-samlingssegmentet, gennem BamHI-stedet, 3884 bp downstream for Pstl-stedet. De nedenfor anførte nukleotidpositioner er angivet relativt i forhold til 5 første base i denne Pstl-genkendelsessekvens. Fragmentet inkluderer muse Ig Cx-enhancer-sekvenserne ved 1542-1666 i den oprindelige kimliniekonfiguration. Muse Cx-kodnings-området er blevet slettet mellem position 2021 og 2754 under anvendelse af eksisterende Xmnl-steder ved disse 10 positioner, gendannelse af et XmnI-sted ved samlingen af det slettede CK-gen. Det totale Pstl/BamHI-fragment måler 3152 bp og har nu et entydigt XmnI-sted på stedet for det slettede muse Cx-gen ved position 2017-2026 til kloningsformål. Et restriktionskort for pMlACx er vist i fig. 5.

15 10.2 Det kimære L-kædegen (pMceaC^-la)

De humane Cx-kodningssekvenser isoleres fra plasmid pDAl4a, en pBR322-rekombinant/ indeholdende et 2,5 kb EcoRI/EcoRI-fragment, hvori ca. 320 bp human Cx-kodnings-området er lokaliseret. Dette plasmid er beskrevet i 20 eksempel 7.2, og et restriktionskort er vist i fig. 3 og 5. Et 724 bp SphI/Hhal-fragment renses, og de udragende dele af 3'-enderne afskæres med bakteriofag T4 DNA-polyme-rase. Fragmentet starter 106 bp 5' og forlænger 296 bp 3’ af det humane Cx-kodningsområde. Det omfatter også poly-25 adenyleringsstedet, som ligger 177 bp 3' for Cx-kodnings-sekvensen.

ρΜΙΔΟχ indeholder 2 XmnI-steder, et ved samlingen af de slettede muse Cx-sekvenser og et i Ø-lactamasekodnings-sekvensen afledt af pUC12, som bibringer ampicillinre-30 sistens. pMlAC begrænses partielt til ampicillin. ρΜΙΔΟχ begrænses partielt med Xmnl, og den lineære form gelrenses. 50% af dette materiale begrænses ved XmnI-stedet i Ø-lactamasekodningssekvensen, og 50% er begrænset ved den nødvendige tidligere muse Cx-lokation.

67 DK PR 172444 B1

Indsætning af det humane Cx-fragment i det første XmnI-sted fører til et rekombinantplasmid uden et funktionelt /3-lactamasegen, da der kun findes rekombinanter, som 5 indeholder det humane Cx-fragment ved positionen for det tidligere muse Cx-område. Der er to mulige orienteringer. Rekombinantplasmidet indeholdende human Cx-fragmentet i den korrekte orientering, N-terminalen nærmest ved muse-enhancerområdet, identificeres ved restriktionsanalyse af 10 rekombinantplasmiderne med restriktionsendonuclease Avail.

Dette plasmid betegnes pMIHuCx-la.

Muse CEA let kædesekvenserne isoleres fra rekombinantplasmidet pCEA-L2a. Dette plasmid indeholder et 1,9 kb Xbal/Xbal-fragment, som koder for den funktionelle vari-15 able del af muse anti-CEA let kæden og er tidligere beskrevet (eksempel 4.2). Et restriktionskort er vist i fig. 1A, 3 og 6.

Ved partiel Xbal-restriktion efterfulgt af total EcoRI-restriktion isoleres muse anti-CEA let kæde variabel-20 segmentet på et 1,9 kb EcoRI/Xbal-fragment. Dette fragment har et ekstra 24 bp afledt af pUC12-polylinkeren omfattende restriktionssteder for BamHI, Smal og Sacl. Disse steder ligger 5' for mus variabelt anti-CEA-kodningsom-rådet. I den endelige genomiske konstruktion er de anbragt 25 ved samlingsstedet for rekombinantfragmentet og ekspressionsvektoren.

1,9 kb EcoRI/Xbal-fragmentet forbindes med 3,8 kb PstI/ BamHI-fragmentet fra pMIHuCx-la beskrevet ovenfor indeholdende muse Ig Cx-enhanceren og human Cx-kodningsområdet.

30 Med henblik på kloning isoleres det som et Xbal/EcoRI-fragment under anvendelse af Xbal-stedet 18 bp downstream for Pstl-stedet og EcoRI-stedet i pUC12-polylinkeren, som adderer 18 bp downstream for BamHI-stedet omfattende Smal-og Sacl-restriktionssteder. Disse polylinkersekvenser er 35 anbragt ved det andet forbindelsessted for rekombinant- 68 DK PR 172444 B1 fragment og ekspressionsvektor.

De to fragmenter samles og klones i ekspressionsvektoren pSV2gpt, begrænset med EcoRI, i en trevejsligeringsreak-5 tion. To orienteringer af fragmentet, med hensyn til gpt-genet, isoleres, enten både gpt og mus variabel anti-CEA-human Cκ i samme transskriptionsorientering (orientering a) eller i modsat transskriptionsorientering (orientering b). Begge orienteringer identificeres ved dobbelt-10 restriktionsspaltning med restriktionsendonucleaser Hindlll og Pstl. De betegnes pMceaC^-la og pMceaC^-lb.

Deres DNA-insert indeholder det fuldstændige kodningsområde for musevariable anti-CEA-human Ck konstant immun-globulin let kæden i den oprindelige musegenomiske kon-15 figuration. Fragmentet udvindes som et enkelt EcoRI/EcoRI-fragment på ca. 5,7 kb.

10.3 Det kimære H-kaedegen (pCEA~74Na)

Det kimære H-kædegen pCEA-74Na konstrueres som beskrevet i eksempel 8.3 og 8.4.

20 10.4 Den klmære dobbeltkonstruktion indeholdende både mus/human (·γ4;κ) anti-CEA H- og L-kaede Ig-gener (pCEA(H+L)2neo) Såvel den muse-CEA-human konstant kimære let kæde og tung kæde er indeholdt i et enkelt EcoRI/EcoRI-fragment, den 25 lette kæde på et 5,7 kb fragment i pMceaC^-la, den tunge kæde på et 5,3 kb EcoRl/EcoRl-fragraent i pCEA~74Na.

Ved samling af let- og tung-kæde EcoRI/EcoRI-fragmenterne og destruktion af EcoRI-stedet ved samlingen dannes en dobbeltgenkonstruktion, hvor alle kodningssekvenser og 30 regulatoriske sekvenser for mus/human (γ4;κ) anti-CEA H-og L-kæde Ig-generne er anbragt på et 11,0 kb EcoRI/EcoRI-fragment.

69 DK PR 172444 B1 pMceaC^-la og ρΟΕΑ-γ4Νβ spaltes partielt med EcoRI efterfulgt af udfyldning af den udragende 5'- ende med det store fragment af E. coli DNA-polymerase I (Klenow 5 fragment). Den lineære form af hvert plasmid gelrenses, hvorpå der foretages dobbeltrestriktionsspaltning med restriktionsendonucleaser EcoRI og Hpal. På denne måde frigøres det kimære fragment fra henholdsvis pSV2gpt-vektoren eller pSV2neo-vektoren, da de eneste restrik-10 tionssteder for Hpal er i de to vektorer. Kun en af EcoRI 5’-enderne i hvert fragment er en kort ende. Den anden ende er stadig en såkaldt klæbrig udragende 5*-EcoRI-ende.

De to fragmenter ligeres sammen i forholdet 1:1 med bak-teriofag T4 ligase til dannelse af sammenhængende mole-15 kyler. Et vist antal af let kæde-fragmenterne bindes til en kortende i et tungkædefragment. Total restriktion med EcoRI danner et vist antal 11,0 kb EcoRI/EcoRI-fragmen-ter, hvoraf 1/3 er en let kæde bundet til et tung kæde mus/human (γ4;κ) anti-CEA kimært fragment. De øvrige 2/3 20 består af tung-tung- og let-let-kædedimerer, som formentlig ikke kan klones.

Ved gelrensning af ca. 11,0 kb EcoRI/EcoRI-fragmenterne efterfulgt af kloning til pSV2neo- eller pSV2gpt-ekspressionsvektoren, begrænsning med EcoRI og transformation til 25 kompetente E. coli K12/803 fås et antal rekombinantplas-mider. Disse screenes ved kolonihybridisering til 1,9 kb Xbal/Xbal-fragmentet, som koder for mus-anti-CEA-variable let kædesekvenser, isoleres fra plasmid pCEA-L2a (eksempel 4.2). DNA fremstilles fra positive kolonier, og rekombi-30 nantplasmider med såvel tungt som let kæde mus/human (γ4;κ) anti-CEA kimære DNA-fragmenter identificeres ved restriktionsenzymanalyse med restriktionsendonucleaserne EcoRI, Xmnl og Pstl. Et rekombinantplasmid opnået på denne måde betegnes pCEA(H+L)2neo. Anti-CEA let og tung kæde 35 kimærfragmenterne er anbragt i modsat transskriptionsorientering. Anti-CEA tung kæde-fragmentet er i samme transskriptionsorientering som neo-genet i pSV2neo. EcoRI- 70 DK PR 172444 B1 stedet ved samlingspunktet for anti-CEA let- og tung-kæde kimærfragmenterne er destrueret, men det forventede Xmnl-sted, som er dannet ved samling af to kortende EcoRI-5 steder, er ikke til stede. Fra denne dobbelte kimære genkonstruktion isoleres mus/human (γ4;κ) anti-CEA let- og tung-kædekodnings- og -reguleringssekvenserne som et enkelt ca. 11,0 kb EcoRI/EcoRI-fragment. Et restriktionskort for pCEA(H+L)2ne0 er vist i fig. 6.

10 Eksempel 11

Transfektion og ekspression af den kimære mus/human (ύ4;κ) anti-CEA Ig H- og L-kæde dobbeltgenkonstruktion pCEA(H+L)2neo i muselymfoidceller

Transfektion af den kimære muse/human (γ4;κ) anti-CEA Ig-15 gen dobbeltkonstruktion pCEA(H+L)2neo opnås ved isolering af kodningsområderne for muse/human (γ4;κ) anti-CEA H- og L-kæderne på et enkelt ca. 11,0 kb EcoRI/EcoRI DNA-frag-ment fra pCEA(H+L)2neo. 15 /tg af dette fragment blandes med 1,5 μg pSV2neo, lineariseret med EcoRI, i 50 μΐ TE-20 puffer, hvorpå der foretages transfektion til Sp2/0 muselymfoidceller på nøjagtig samme måde som beskrevet i eksempel 9 for de kimære muse/human (yA;k) anti-CEA enkelt Ig-genkonstruktioner.

Selektion for neomycinresistens, antistofpåvisning og 25 bestemmelse af mængden af udskilt IgG i transficerede celler gennemføres på nøjagtig samme måde som beskrevet i henholdsvis eksempel 9.2 og 9.3. En kloncellelinie isoleret på denne måde og udvalgt på grund af høj ekspression af det kimære monoklonale antistof betegnes 30 EFIX-pCEA-Ig-(?4;CK) 4-8-13 (kaldet CE 4-8-13) og er deponeret ved "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, 22. november 1988, under nummeret 1-818.

71 DK PR 172444 B1

Transfektomaet CB 4-8-13 udskiller 10 μg/ml kimært antistof til dyrkningsmediet efter 6 dages vækst, bestemt ved de i eksempel 9.4 beskrevne metoder.

5 Eksempel 12

Karakterisering af det kimære monoklonale antistof

Bindingen af det kimære monoklonale antistof (γ4;κ) til CEA bestemmes ved hjælp ELISA-testen beskrevet i eksempel 9.4 for selektionen af kimære antistoffer. Med det kimære 10 anti-CEA MAb udskilt af cellelinien CE 4-8-13, kræves der mindre end 8 ng/ml af MAb*et til opnåelse af en optisk tæthed på 0,1 i testen (se fig. 7). Til competition-test anvendes renset CEA-antigen og en renset Ig-fraktion fra museascitesvæske dannet af CE 25-hybridomaet. De anvendte 15 metoder er baseret på kendte fremgangsmåder (Voller et al., "Manual of Clinical Immunology", 1976, 506). Bindingen af det kimære antistof til renset CEA i ELISA-testen hæmmes enten af opløselig CEA eller med renset murin CE 25 antistof. Over 99% af det udskilte kimære monoklonale 20 antistof kan absorberes på immobiliseret CEA-antigen. Selv om CE 25-stamhybridomaet danner et murint (γ1;κ) antistof ved fremkaldelse under anvendelse af ged-anti-mus IgGj (mærket med alkalisk phosphatase), er dette ikke tilfældet med CE 75-5-6 og CE 4-8-13.

25 De ovenfor beskrevne immunologiske tests viser, at antistoffet udskilt af cellelinierne CE 75-5-6 og CE 4-8-13: (a) binder til CEA-antigenet, (b) har humane konstantområde-(74;κ)-determinanter og mangler tilsvarende determinanter af museoprindelse, 30 (c) inhiberes af det tilsvarende murine antistof dannet af hybridoma CE 25, (d) binder specifikt til CEA-antigenet, da bindingen inhiberes af opløseligt CEA, 72 DK PR 172444 B1 (e) dannes i store mængder i transfektomaer indeholdende de kimære H- og L-kæde Ig-gener som beskrevet ovenfor (1 μg/ml af CE 75-5-6 og 10 μg/ml af CE 4-8-13).

5 Eksempel 13

Isolering og rensning af kimære monoklonale antistoffer til diagnostiske/terapeutiske formål 13.1 In vitro-syntese

En cellelinie som beskrevet ovenfor, der syntetiserer de 10 kimære monoklonale antistoffer, dyrkes på glasperler i en søjle med pakket lag.

Prækulturen til denne søjle fremstilles på følgende måde: Cellerne fra 4 sammenflydende 175 cm2 vævskulturkolber anvendes til at inokulere en Nunc-stabel. De adherente 15 celler løsnes fra kolben ved skylning af det sammenhængende cellelag med en trypsin/Versene-opløsning dannet af lige store rumfang trypsinopløsning (Gibco, 0,5 g/1) og Versene (Gibco, 1:5000). 4 x 10^-celler suspenderes i 400 ml modificeret konditioneret DMEM-medium (DMEMme(j * DMEM 20 yderligere tilsat 1 mM Na-pyruvat, 2 mM glutamin, 50 μΜ 2-mercaptoethanol, 10 mM Hepes og 10% FCS, medmindre andet er anført). Suspensionens rumfang indstilles på 500 ml ved tilsætning af frisk DMEMme(j. 500 ml cellesuspension overføres til en Nunc-stabel, og der inkuberes ved 37°C i en 25 luftatmosfære, som indeholder 10% C02· Henholdsvis 4, 7 og 10 dage efter inokuleringen tilsættes yderligere medium (3 x 500 ml). 14 dage efter inokuleringen høstes cellerne, og de anvendes til inokulering af reaktoren med pakket lag.

Det konditionerede medium fjernes først fra stablen. Der 30 tilsættes 500 ml trypsin/Versene-opløsning, og hele cellelaget udblødes i denne opløsning. Fri trypsin/Versene-opløsning hældes fra, og cellelaget henstilles i kontakt med resten af trypsin/Versene i 5 minutter. 500 ml kon- 73 DK PR 172444 B1 ditioneret medium sættes tilbage til cellerne. Cellerne løsnes ved omhyggelig rystning af stablen. Til stablen sættes yderligere 1,5 1 konditioneret medium, og hele 5 suspensionen overføres derpå til reaktoren med et pakket lag. Reaktoren består af en 10 1 cylindrisk glasbeholder fyldt med borsilikatglasperler med en diameter på 2 mm.

Mediet cirkuleres gennem reaktoren ved hjælp af en ydre pumpe i en mængde på 45 l/time. Koncentrationen af opløst 10 oxygen og pH-værdien i det cirkulerende medium måles og reguleres kontinuert. Der anvendes ren oxygen til at holde koncentrationen af minimal opløst oxygen over 10%' s mætning, og der anvendes CO2 og 1,0 NaOH til regulering af pH-værdien mellem 7,0 og 7,3. Væskerumfanget i reaktoren 15 og det ydre kredsløb er 5 1. Systemet holdes i et vandbad ved 37°C. Efter inokulering henstår cellerne til vækst i et DMEMmetj-medium indeholdende 10% serum, så snart glucosekoncentrationen i mediet falder til under 1 g/1 påbegyndes kontinuerlig udskiftning af mediet i en mængde 20 på 2 1/dag. Når koncentrationen af opløst oxygen falder til 20%, formindskes serumkoncentrationen i fødemediet til 1,25%. 2 dage senere forøges udvekslingsforholdet med 1 1/dag. De efterfølgende dage forøges udvekslingsforholdet yderligere op til en maksimumværdi på 5 1/dag. Efter dette 25 tidspunkt opsamles det udstrømmende medium med henblik på isolering og rensning af det kimære antistof.

13.2 Isolering og rensning af kimære monoklonale antistoffer

Dyrkningsmediet filtreres under anvendelse af et Minitan 30 ultrafiltreringssystem 0,1 μχα kassettefilter (type WLP0MP04, Millipore). Filtratet koncentreres 10 gange under anvendelse af Minitan ultrafiltreringssystemet forsynet med 30.000 MW cut-off filter-kassetter (type PTTK0MP04, Millipore). Det koncentrerede retentat 35 præpareres derefter til kromatografi på protein-A-Sepharose ved tilsætning af glycin og NaCl til en slut- 74 DK PR 172444 B1 koncentration på 1,5 M glycin og 3 M NaCl, og pH-værdien indstilles på 8,6 med 5 M NaOH. Derefter ledes dyrknings-mediumkoncentratet gennem en søjle indeholdende protein-A 5 Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, SE), hvorpå ikke-bun-det materiale udvaskes fra søjlen med bindingspuffer (1,5 M glycin, 3 M NaCl, pH 8,9 med NaOH), og søjlen elueres med en trinvis gradient med faldende pH-værdi bestående af 100 mM citronsyre indstillet på pH 3,0, 4,0, 5,0 og 6,0 10 med 5 M NaOH som beskrevet i anmeldelsesnoterne fra Pharmacia (Separation News, Vol. 13, No. 5). Den største koncentration af kimært antistof bestemmes ved hjælp af en ELISA-test til at eluere ved pH 4,0.

Eksempel 14 15 Påvisning af CEA ved hjælp af en enzymbundet immunsor-bentanalyse (ELISA) 14.1 Mærkning af kimære monoklonale antistoffer med alkalisk phosphatase 1,4 mg af et kimært monoklonalt antistof i 1,4 ml PBS 20 kobles i 2 timer med en opløsning Indeholdende 5 mg alkalisk phosphatase (Sigma P6774, type VII-T) i overensstemmelse med standardmetoden ifølge Voller et al.

(Bull. World Health Organ. 53, 55, 1976) og under anven delse af glutaraldehyd (0,2% r/r). Konjugatet overføres 25 til 5 ml Tris-puffer 0,05 M, pH 8,0, indeholdende 1 mM MgCl2, 1% BSA og 0,02% NaN3. Opløsningen opbevares i mørke ved 4®C.

14.2 Analysemetode

Polypropylenmikrotiterplader (Dynatech) dækkes i et tids-30 rum på 2 timer ved 37CC og natten over ved 4°C med 150 μΐ af en opløsning af det kimære monoklonale antistof udskilt af cellelinie CE 75-5-6 eller CE 4-8-13 (10 jig/ml) i en 75 DK PR 172444 B1 puffer med pH 8,6 (carbonatpufret 0,9% NaCl-opløsning indeholdende 0,02% natriumazid). Pladerne vaskes fem gange med PBS, og de proteinreaktive steder, som stadig forekom-5 mer, mættes ved inkubering i 1 time ved 37*C med 250 μΐ af en puffer, pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaNg i PBS).

Plader overtrukket på denne måde kan opbevares ved 4°C i denne puffer i nogle få dage.

50 μΐ af en fortyndingsrække af en testopløsning eller en 10 standardopløsning indeholdende renset humant CEA, 50 μΐ puffer pH 7,4 og 50 μΐ af en opløsning af det phosphatase-mærkede monoklonale anti-CEA-antistof MAb 35 (Haskell et al., Cancer Res. 43, 3857, 1983), som genkender en anden CEA-epitop end det kimære antistof (eksempel 14.1), 15 fortyndet 1:100 med puffer pH 7,4 blandes og inkuberes i hullerne i mikrotiterplader i 2 timer ved 37eC og 30 minutter ved 4eC. Pladerne vaskes fem gange med PBS, hvorpå der inkuberes i 30 minutter ved 37°C med 150 μΐ af en opløsning af p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i 10% di-20 ethanolaminpuffer, 0,5 mM MgCl£, pH 9,8). Ved at måle den optiske tæthed ved 405 nm bestemmes mængden af frigjort p-nitrophenol, som er proportional med mængden af det bundne enzyrophosphatase og dermed proportional med mængden af humant CEA i testopløsningen.

25 Testen kan også gennemføres ved anvendelse af det enzymmærkede kimære monoklonale antistof udskilt af cellelinie CE 75-5-6 eller CE 4-8-13 og overhældning af mikrotiterplader med det monoklonale anti-CEA-antistof MAb 35, som genkender en anden CEA-epitop end det kimære antistof.

30 14.3 Analysetest til ELISA

En analysetest til analysen beskrevet i eksempel 14.2 indeholder følgende: polypropylenmikrotiterplader, 76 DK PR 172444 B1 20 ml af det kimære monoklonale anti-CEA-antistof udskilt af cellelinie CE 75-5-6 eller CE 4-8-13 (10 μg/ml) i carbonatpufret natriumchloridopløsning (0,9% NaCl, 0,42% 5 NaHC03, 0,0072% Na2C03, 0,02% NaN3), 1 ml af det alkalisk phosphatasekoblede monoklonale anti-CEA-antistof MAb 35, som genkender en anden CEA-epitop end det kimære antistof (0,3 mg antistof pr. ml) i Tris-puf-fer (0,05 Μ, 1 mM MgCl2, 1% BSA, 0,02% NaN3, pH 8,0), 10 2 ml standardopløsning indeholdende 5 pg renset humant CEA, 300 ml PBS, 300 ml puffer pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaN3 i PBS)

50 ml p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml) i diethanolamin-15 puffer (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, indstillet på pH

8,9 med HC1), kalibreringskurve, farveintensitetsskala, brugsanvisning.

20 Eksempel 15

Farmaceutisk præparat til parenteral applikation 120 mg kimært monoklonalt antistof fremstillet ifølge eksempel 13 opløses i 5 ml fysiologisk natriumchloridopløsning. Opløsningen ledes gennem et bakteriologisk 25 filter, og filtratet fyldes i en ampul under aseptiske betingelser. Ampullen opbevares fortrinsvis i kulden, f.eks. ved -20°C.

Claims (55)

1. Kimært monoklonalt antistof bestående af va riable områder af museoprindelse og humane konstant-5 områder, kendetegnet ved, at det genkender epitoper på humant carcinoembryonalt antigen (CEA), som ikke findes på uspecifikt krydsreagerende antigen NCA55 og NCAgs, på galdeglycoprotein eller på granulocyter, og derivater deraf.

2. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har en affinitet på mindst 2,1 x 1010 1/mol for humant CEA.

3. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det omfat- 15 ter variable letkædeområder med formlen FRi-Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Ser-Leu-His-FR2-I- CDR1L -1 Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser-FRa-Gln-Gln-Ser-His-Gly-Trp-Pro-Phe-Thr-FR<i I- CDR2L -1 I- CDR3L -1 (I), hvori FRi er en polypeptidrest omfattende 23-28 naturligt forekommende aminosyrer, FR2 er en polypeptidrest omfattende 14-16 naturligt forekommende aminosyrer, FR3 er en 20 polypeptidrest omfattende 30-34 naturligt forekommende aminosyrer, og FR4 er en polypeptidrest omfattende 9-11 naturligt forekommende aminosyrer, og at aminosyren Cys kan foreligge i den oxiderede tilstand og danne S-S-broer.

4. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf 25 ifølge et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det omfatter variable letkædeområder med formlen I, hvor polypep-tidresterne i strukturområderne FR^, FR2, FR3 og FR4 er sådanne, der fortrinsvis forekommer i murine antistoffer. DK PR 172444 B1

5. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det omfatter variable letkædeområder med formlen I, hvori FR]_ er en 5 polypeptidrest med formlen A-Gly-Asp-Ile-Leu-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Leu-Ser-Val-Ser-Pro- Gly-Glu-Arg-Val-Thr-Phe-Ser-Cys (IA) , hvor A er hydrogen, acyl eller resten Ala-Ser-Arg, Ser-Arg eller Arg, FR2 er polypeptidresten

10 Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Thr-Asn-Gly-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Met-Lys (IB) FR3 er polypeptidresten Gly-Ile-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Phe-Thr-Leu- Thr-Ile-Asn-Ser-Val-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys (IC) , 15 og FR4 er polypeptidresten Phe-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys (ID) og at aminosyren Cys kan foreligge i den oxiderede tilstand og danne S-S-broer.

6. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det omfatter variable letkædeområder med formlen I, hvori FR^ FR2, FR3 og FR4 I DK PR 172444 B1 Lit er polypeptidrester med henholdsvis formel IA, IB, IC og ID, at en eller flere enkelte aminosyrer er ombyttet med andre aminosyrer uden for områderne CDR1L, CDR2L og CDR3L, 5 og at aminosyren Cys kan foreligge i den oxiderede form og Γ danne S-S-broer.

7. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det omfat-ter variable tungkædeområder med formlen FRs-Thr-Tyr-Ala-Met-Ala-Trp-Val-FRe-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Thr-Tyr-Tyr-Pro-1- CDRlH -1 I- Asp-Ser-Val-Lys-Gly-FR7-Gly-Phe-Tyr-Asp-Gly-Tyr-Leu-Tyr-Val-Val-FRe - CDR2H -1 I- CDR3H -1 (II). hvori FR5 er en polypeptidrest omfattende 32-36 naturligt ty forekommende aminosyrer, FRg er en polypeptidrest omfattende 14-16 naturligt forekommende aminosyrer, FR7 er en polypeptidrest omfattende 32-34 naturligt forekommende I 15 aminosyrer, og FRg er en polypeptidrest omfattende 12-14 naturligt forekommende aminosyrer, og at aminosyren Cys kan foreligge i oxideret tilstand og danne S-S-broer.

8. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-7, kendetegnet ved, at det omfatter 20 variable tungkædeområder med formlen II, hvor polypeptid-resterne i strukturområderne FR5, FRg, FR7 og FRg er de, der fortrinsvis forekommer i murine antistoffer. \ 9. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-8, kendetegnet ved, at det omfatter 25 variable tungkædeområder med formlen II, hvori FR5 er en , polypeptidrest med formlen DK PR 172444 B1 B-Gly~Val-Gln-Cys-Glu-Val-Lys-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Arg (HA), hvor B er hydrogen eller acyl, FR5 er polypeptidresten

5 Arg-Gln-Thr-Pro-Glu-Lys-Arg-Leu-Glu-Trp-Val-Thr-Ser-Ile (UB) FR7 er polypeptidresten Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Arg-Asn-Ile-Leu-Tyr-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Ile-Tyr—Tyr-Cys- Ala-Arg (IIC), og FRg er polypeptidresten

10 Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Ser-Leu-Thr-Val-Ser-Ser (HD) og at aminosyren Cys kan foreligge i oxideret form og danne S-S-broer.

10. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf 15 ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter variable tungkædeområder med formlen II, hvori FR5, FRg, FR7 og FRg er polypeptidrester med henholdsvis formlen IIA, IIB, IIC og IID, at en eller flere enkelte aminosyrer er ombyttet med andre aminosyrer uden for områderne CDR1H, CDR2H og 20 CDR3H, og at aminosyren kan foreligge på oxideret form og danne S-S-broer. DK PR 172444 B1

11. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-10, kendetegnet ved, at det omfatter humane konstante letkædeområder κ eller X.

12. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-11, kendetegnet ved, at det omfatter humane konstante tungkædeområder γΐ, y2, y3 eller y4.

13. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-12, kendetegnet ved, at det omfat- 10 ter humane konstante letkædeområder κ og humane konstante tungkædeområder yA.

14. Kimært monoklonalt antistof og derivater deraf ifølge et af kravene 1-13, kendetegnet ved, at det har variable letkædeområder med formlen I, hvori FR^, FR2,

15 FR3 og FR4 er polypept idrest er med formlen henholdsvis IA, IB, IC og ID, og hvor aminosyren Cys kan foreligge i oxideret form og danne S-S-broer, et humant konstant let-kædeområde κ, et variabelt tungkædeområde med formlen II, hvor FR5, FRg, FR7 og FR3 er polypeptidrester med formlen 20 henholdsvis IIA, IIB, IIC og IID, og hvori aminosyren Cys kan være på oxideret form og danne S-S-broer, og et humant konstant tungkædeområde 74.

15. Derivat af et kimært monoklonalt antistof ifølge et af kravene 1-14, kendetegnet ved, at det er et frag- 25 ment.

16. Derivat af et kimært monoklonalt antistof ifølge et af kravene 1-14, kendetegnet ved, at det er et konju-gat raed et enzym, en fluorescensmarkør, et metalchelat, et cytostatisk eller cytotoksisk stof, avidin eller biotin.

17. Derivat af et kimært monoklonalt antistof ifølge et af kravene 1-14, kendetegnet ved, at det er radioaktivt mærket. DK PR 172444 B1

18. Fremgangsmåde til fremstilling af kimære mono- klonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pattedyrceller, som producerer sådanne 5 kimære monoklonale antistoffer, formeres in vitro, hvorpå de dannede kimære monoklonale antistoffer eventuelt omdannes til derivater deraf.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af kimære mono klonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at pattedyrceller, som producerer sådanne kimære monoklonale antistoffer, formeres in vivo, hvorpå de dannede kimære monoklonale antistoffer eventuelt omdannes til derivater deraf.

20. Rekombinant DNA, kendetegnet ved, at det omfat-15 ter et insert, der koder for et murint variabelt letkæde- område og/eller for et murint variabelt tungkaedeområde af kimære monoklonale antistoffer ifølge krav 1.

21. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det omfatter et insert, som koder for et murint varia- 20 belt letkædeområde specifik for human CEA, der stammer fra genomisk DNA fra cellelinien CE 25 med deponeringsnummeret CNCM 1-719.

22. Rekombinant DNA ifølge krav 20 eller 21, kendetegnet ved, at det omfatter et insert, som koder for et 25 polypeptid med formlen I, eventuelt indeholdende introns.

23. Rekombinant DNA ifølge krav 20-22, kendetegnet ved, at det omfatter et insert, der koder for polypepti-det med formlen I, hvori FRj, FR2, FR3 og FR4 er polypep-tider med formlen henholdsvis IA, IB, IC og ID, og som 30 eventuelt indeholder introns. 1 Rekombinant DNA ifølge et af kravene 20-23, kendetegnet ved, at det indeholder et Insert med formlen DK PR 172444 B1 TCTAGACTGCTGTGGXCTTTTAAGTAGCATGAAAAACATCTGCTAAAGAAGGAATTAGTT 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ SO TGAACATGCTAGAAATACATCTGTGATACTCTCATCACTCTTGTTGGAAAGATATGCAAG 61 —+———------+----———— ----—+ 120 AAGCACTATTTGGCTATTATTTGGAAAGTGCTATAATGTATTTTGATATCTCAACCTCTG 121---------+— ————+—————————+—---180 AAATTCTTCTGTATGTTGGCAGATTGTAAACCTTTACAAGGCTTTCATTCTCTTCTCTGG 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 AGAAAAATGTCTTTGTAGGCAATCCAGAATTTCTTATTTCTTGCTAATGAAATCTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200 GTGTGATATCACTTTAGTTTCATGTGTTGTTATGCTTCATGTAATGTTAAGAAAGTTAAA 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 ' GATGCTCCAATCCATATTGTAAGAAACATTCCAAGCCATGGAATAAGGCATGGATTTGAG 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 ATGCTCTTTATTTCAAACTACTGAATATATCTTAGAGATTTCTTTAGACTGTGTTAAATA 421---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 TGTAACCATTTAAGTAGGAGTCAAGTCTCCTTTAAATCTCAACAGCTCTTCAGGTAACCA 481 ----- +---------+---------+---------+---------+---------+ 540 ACAAAAGGATAAATATTCTAATAAGTCACTAGGAGCATGCTCTTCTGACCAGGTCTTTCT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TATAAGCAACATGAAGACAGTATGATTTGCATAAGTTTTTCTTTCTTCTAATGTCCCTGC 601 —►—-----——+--------—f-------———+—"·”·“·+ 660 CTCTTAGAGTATTATAAGAAGATCTTTCTAGGGATGTGTCATGGTCCACACAAAAATAGG 661 —-----——+—-------+----———+ 720 MVS TPQFLVFLLFWIP MetValSerThrProGlnPheLeuValPheLeuLeuPheTrpIlePro GAAAGTGTGAAGATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCA 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 GGTAATGACTGTTTGGGTGTGGCAAAAAAGTGGAGATGTTATTTAAATACAAAATTTTCT 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 TGCTTTATTTGGAAGCCAATGTCACATGGGAATTGACTTTCAGTTTAAAGAAATTGATAC 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 AATAAAAGTCATTTATTTTTCTAAGTTGTTTAGAAGTGACTTTCATATTCAGTGTTATGA 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 ASRGDILLTQS AlaSerArgGlyAspIleLeuLeuThrGinSer TCGACTAATGTATCTTCCATTTTTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCT 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 PAILSVSPGERVTFSCRASQ ProAlalleLeuSerValSerProGlyGluArgValThrPheSerCysArgAlaSerGIn CCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCACTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAG 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 SI GTSLHWYQQRTNGSPRLL SerlleGlyThrSerLeuHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySerProArgLeuLeu AGCATTGGCACAAGCTTACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTC 1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 DK PR 172444 B1 MKYASESISGIPSRFSGSGS MetLysTyrAlaSerGluSerlleSerGlylleProSerArgPheSerGlySerGlySer ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA 11 Al---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 GTDFTLTINSVESEDIADYY GlyThrAspPheThrLeuThrlleAsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyr GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAC 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 CQQSHGWPFTFGSGTKLEIK CysGlnGlnSerHisGlyTrpProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluIleLys TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 CGTAAGTGGACTTTTGTTCATTTACTTGTGACGTTTTGGTTCTGTTTGGGTAGCTTGTGT 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 GAATTTGTGATATTT 1381 ---------+----- 1395 (III).

25. Rekombinant DNA ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det indeholder et insert med formlen III, hvori ét 5 eller flere enkelte nukleotider er ombyttet med andre nukleotider uden for nukleotidsekvenserne med formlen III fra position henholdsvis 1069-1102, 1147-1167 og 1263-1291.

26. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, 10 at det indeholder et insert, der koder for et murint variabelt tungkædeområde specifikt for humant CEA, som stammer fra genomisk DNA fra cellelinien CE 25 med deponeringsnummeret CNCM 1-719.

27. Rekombinant DNA ifølge krav 20 eller 26, kende-15 tegnet ved, at det indeholder et insert, der koder for polypeptidet med formlen II, eventuelt indeholdende introns. 1 Rekombinant DNA ifølge krav 20, 26 eller 27, kendetegnet ved, at det indeholder et insert, der koder 20 for polypeptidet med formlen II, hvori FR5, FRg, FR7 og FRø er polypeptidrester med formlen henholdsvis IIA, I IB, IIC og IID, og som eventuelt indeholder introns. DK PR 172444 B1

29. Rekombinant DNA ifølge et af kravene 20, 26, 27 og 28, kendetegnet ved, at det indeholder et insert med formlen AAGCTTGTTCTGTTCACATGCAAGGAGGGAAACTAAACTGAGTATGGTGAATCCCTAACC 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AAAGGGAAAAAATGAAACTACAATATGTTTCAAATGCTGTAACTGAAATCTGGTTTTTTG 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 ATGCCTTATATCTGGTATCATCAGTGACTTCAGATTTAGTCCAACCCCAGAGCATGGTAT 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AGCAGGAAGACATGCAAATAAGTCTTCTCTCTGCCCATGAAAACACCTCGGCCCTGACCC 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGCAGCTCTGACAGAGGAGGCCAGTCCATGGATTTGAGTTCCTCACATTCAGTGATGAGC 241---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 MNFGFSLIFLVLV MetAsnPheGlyPheSerLeuIlePheLeuValLeuVal ACTGAACACAGACACCTCACCATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTT 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 L K G LeuLysGly • TTAAAAGGTAATTTATTGAGAAGAGATGACATCTATTTTACGCACATGAGACAGAAAAAA 361---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 V Q ValGl TGTGGTTTGTTTTGTTAGTGACAGTTTTCCAACCAGTTATTCTCTGTTTGTAGGTGTCCA 421 ------+----———+——-----480 CEVKLVZSGGG.LVKPGG S L K nCysGluValLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLy GTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 340 LSCAASGFTFRTYAHAWVRQ sLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheArgThrTyrAlaMetAlaTrpValArgGl ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACTTTCAGGACCTATGCCATGGCTTGGGTTCGCCA 541---------+---------+---------♦---------+---------+---------+ 600 TPEKRLEWVTSISSGGTTYY nThrProGluLysArgLeuGluTrpValThrSerlleSerSerGlyGlyThrThrTyrTy GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCCATTAGTAGTGGTGGTACCACCTACTA 601 ——————f----—-—*·—+---------+-------+-------——+ 660 PDSVKGRFTISRDNARNILY rProAspSerValLysGlyArgPheThrlleSerArgAspAsnAlaArgAsnlleLeuTy TCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTA 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 LQVSSLRSEDTAIYYCARGF rLeuGlnValSerSerLeuArgSerGluAspThrAlalleTyrTyrCysAlaArgGlyPh CCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAGAGGTTT 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 DK PR 172444 B1 YDGYLYVVDYWGQG T SLTVS eTyrAspGlyTyrLeuTyrValValAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerLeuThrValSe CTATGATGGTTACCTCTATGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCACCGTCTC 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 S rSer CTCAGGTAAGAATGGCC 841 ---------+------- 857 (IV).

30. Rekombinant DNA ifølge krav 27, kendetegnet ved, at det indeholder et insert med formlen IV, hvori et eller flere enkelte nukleotider er ombyttet med andre 5 nukleotider uden for nukleotidsekvenserne med formlen IV fra position henholdsvis 575-595, 629-680 og 776-805.

31. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det indeholder et insert, som koder for et murint variabelt letkædeområde fusioneret til et humant konstant- 10 område κ eller x.

32. Rekombinant DNA ifølge krav 31, kendetegnet ved, at det Indeholder et Insert med formlen III fusioneret til et humant konstantområde κ.

33. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, 15 at det indeholder et insert, som koder for et murint variabelt tungkaedeområde fusioneret til et humant konstantområde γ1,γ2, y3 eller y4.

34. Rekombinant DNA ifølge krav 33, kendetegnet ved, at det indeholder et insert med formlen IV fusioneret til 20 et humant konstantområde γ4.

35. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det er en hybridvektor indeholdende et insert, som koder for en kimær murin/human letkæde ifølge krav 31 og/eller en kimær murin/human tungkæde ifølge krav 33, et DK PR 172444 B1 komplet replikon og en eller flere dominante markørsekvenser, bundet operativt til ekspressionskontrolsekvenser.

36. Rekombinant DNA ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det er en hybridvektor indeholdende et insert, som koder for en kimær murin/human letkæde ifølge krav 32 og/el-ler en kimær murin/human tungkæde ifølge krav 34, et komplet replikon og en eller flere dominante markørsekven-10 ser, bundet operativt til ekspressionskontrolsekvenser.

37. Rekombinant DNA, kendetegnet ved, at det er en hybridvektor ifølge krav 35 eller 36 egnet til pattedyrværter.

38. Rekombinant DNA, kendetegnet ved, at det er en 15 hybridvektor ifølge krav 35, 36 eller 37, hvor vektoren er afledt af plasmid pSV.

39. Rekombinant DNA, kendetegnet ved, at det er en hybridvektor ifølge krav 38, hvor vektoren er afledt af plasmid pSV2gpt eller af plasmid pSV2neo.

40. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant DNA1 er ifølge krav 20, kendetegnet ved, at man dyrker en transformeret vært.

41. Fremgangsmåde ifølge krav 40, kendetegnet ved, at man 25 a) isolerer murine DNA'er fra en egnet hybridomacellelinie, selekterer de ønskede DNA'er, som koder for de variable områder af monoklonale antistoffer rettet mod humant CEA under anvendelse af DNA-prober, b) isolerer humane DNA'er fra et genombibliotek, selek-30 terer de ønskede DNA*er, som koder for de konstante områder af monoklonale antistoffer under anvendelse af DNA-prober, DK PR 172444 B1 c) konstruerer kimære muse/human-gener ved inkorporering af DNA'erne fra trin a) og b) i egnede hybridvektorer, d) overfører de dannede hybridvektorer til en recipient-5 vært, og e) selekterer og dyrker den transformerede vært.

42. Værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret med rekombinante DNA'er ifølge et af kravene 31-39.

43. Værtscelle ifølge krav 42, kendetegnet ved, at 10 det er en pattedyrcelle af lymfoid oprindelse.

44. Værtscelle ifølge krav 42, kendetegnet ved, at det er en celle afledt af den Ig ikke-sekreterende muse-hybridomacellelinie Sp2/0 (ATCC CRL 1581).

45. Værtscelle ifølge krav 42 eller 44, kendetegnet 15 ved, at den er transformeret med en eller to vektorei ifølge et af kravene 36-39.

46. Værtscelle ifølge krav 45, kendetegnet ved, at det er en celle af cellelinien EFVIII/74Na75-75/CKGa5-l (CE 75-5-6 med deponeringsnummeret CNCM 1-720). 20 47. Værtscelle ifølge krav 45, kendetegnet ved, at det er en celle af cellelinien EFIX-pCEA-Ig-(γ4;Ck) (Cl 4-8-13 med deponeringsnummeret CNCM 1-818).

48. Værtscelle ifølge krav 42, kendetegnet ved, at den udskiller kimære monoklonale antistoffer ifølge kra^ 25 1.

49. Fremgangsmåde til fremstilling af en værtscelle ifølge krav 42 eller 48, kendetegnet ved, at en egnel celle transformeres med en eller to vektorer ved elektro-poration, calciumbehandling, mikroinjektion eller proto- 30 plastfusion. DK PR 172444 B1

50. Kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1 til anvendelse ved en fremgangsmåde til behandling af mennesker og til diagnose.

51. Anvendelse af kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1 til in vitro diagnosticering af cancer.

52. Anvendelse af kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1 til den kvalitative eller 10 kvantitative in vitro bestemmelse af humant CEA.

53. Anvendelse ifølge krav 51 af kimære monoklonale antistoffer og derivater deraf i en radioimmunanalyse eller en enzymimmunanalyse.

54. Analysesæt til den kvalitative eller kvantita-15 tive bestemmelse af humant CEA, kendetegnet ved, at de indeholder kimære monoklonale antistoffer ifølge krav 1 og/eller derivater deraf og eventuelt andre monoklonale og polyklonale antistoffer og/eller hjælpestoffer.

55. Farmaceutisk materiale, kendetegnet ved, at det 20 indeholder et kimært monoklonalt antistof eller derivater deraf ifølge krav 1.