DK171846B1 - Et kompleks, en fremgangsmåde til fremstilling af dette kompleks, en transformant vært, et rekombinant DNA-molekyle og et medikament for den specifikke stimulering af serum og sekretoriske antistoffer via mucøs tilstedeværelse af antigener - Google Patents

Description

i DK 171846 B1

Opfindelsen angår et kompleks, en fremgangsmåde til fremstilling af dette kompleks, en transformant vært, et rekombinant DNA-molekyle og et medikament for den 5 specifikke stimulering af serum og sekretoriske antistoffer via mucøs tilstedeværelse af antigener.

Et antal infektioner i pattedyr har tilstrækkeligt skadelig virkninger på pattedyr til at berettige 10 vaccination mod det særlige antigen, der er ansvarlig for infektionen. Derfor er der oprettet vaccinationsprogrammer, hvorved pattedyret udfordres antigenisk med et antigen, således at der fremkaldes en immunrespons til at bibringe pattedyret immunitet.

15

Indgift af antigenet i pattedyret kan ske på et antal måder omfattende intramuskulær injektion (i.m.), subcutant (s.c.) eller ved oral indgift (per os). I.m. eller s.c. injektion af antigen har de ulemper, at der 20 kræves relativt specialiseret personale, det er vanske ligt at foretage indgift i større målestok, det er kostbart, og der kan forekomme et antal bivirkninger, enten mod det immuniserende antigen eller mod det emulgeringsmiddel, som det forefindes i. Oral indgift af 25 vacciner er derimod relativt problemfri, undtagen for såvidt som oral indgift af en mængde materiale, som faktisk absorberes og er i stand til at stimulere en effektiv immunrespons, sædvanligvis er lav. Således overstiger den mængde antigen, der kræves til oral 30 immunisering, generelt langt den mængde, der kræves til systemisk induktion af immunitet. Der er også en stor ulempe ved oral indgift af de store mængder af antigen, der kræves til tilvejebringelse af en antistofrespons, og det er, at indgift af sådanne store mængder antigen ofte 35 fører til induktion af systemisk tolerance, se Tomasi, 1980; Mowat, 1985; Mowat og Parrot, 1983; Ngan & Kind, 1978; Hanson et al, 1979; Richman et al. 1978; Rothberg et al, 1973.

2 DK 171846 B1

Vidnesbyrd op til dato antyder, at den mekaniske til optagelse af antigen i tyndtarmen efter oral indgift primært sker via ikke-specifik prøveudtagning af ind holdet af tarmhulrummet af "M" celler, som ligger hen 5 over de Peyer'ske plaques og andre lymphoide klynger af GALT (velassocieret lymphoidt væv), se Bland og Britton, 1984. Den efterfølgende sensibilisering af lokale lymfo cytpopulationer fører til dannelsen af lokale IgA immunresponser plus sensibiliseringen af IgG 10 suppressorceller med ledsagende suppression af serum IgG responser, se Tomasi, 1980; Mowat, 1985, Mowat og Parrot, 1983; Ngan & Kind, 1978, Hanson et al, 1979; Richman et al, 1978; Rothberg et al, 1973.

15 Det er derfor åbenbart, at bindingsstedet for optagelse af antigen, hvadenten dette sker gennem de Peyer'ske plaques eller det lådne epithelium, og ret sandsynligt mængden af indgivet antigen, dikterer typen af immunrespons, der frembringes af oralt indgivet 20 antigen. Her opstår spørgsmålet om, hvorvidt der er andre antigener, bortset fra cholera toxin, som udviser evnen til specifikt at påvirke det mucøse immunsystem efter oral indgift og/eller at stimulere den humorale immunrespons på en dosisafhængig måde uden induktion af 25 systemisk tolerance og uden behovet for yderligere doser antigen.

På baggrund af dette synspunkt besluttedes det at undersøge det mulige potentiale af visse adhæsive 30 molekyler, som var impliceret i den første fæstnelse af et antal tarmpatogener til stimulering af immunresponsen ved oral indgift. Disse overfladeantigener, som udviser adhæsive egenskaber til et antal stammer af enterotoxigenisk E. coli (ETEC), er identificeret som 35 nonflagellare, filamentøse proteinøse vedhæng eller hårbærende, se Gaastra & de Graaf, 1982. Eksempler indbefatter CFA I og CFA II antigener af humane ETEC stammer og K88, K99, F41 og 897P hårbærende af animalske ETEC stammer, se Gibbons et al, 1985, Evans & Evans 1978, 3 DK 171846 B1

Levine et al, 1980; Morgan et al, 1978; de Graaf &

Roorda, 1982. Herudover er undersøgt evnen af et antal andre proteiner, som ikke spiller nogen åbenbar rolle i kolonisering til igangsættelse af immunsystemet efter 5 oral indgift. Disse antigener inkluderer et antal lectiner, et serotypt antigen af S. typhimurium, type "i" flagella, inaktiveret influenzavirus og S. typhirurium endotoxin (LPS). Oral indgift sammenlignedes med den respons, der frembragtes ved fuldt intramusculær indgift 10 (i.m.) EP-A-0,060,129 beskriver brugen af bakteriestammer til over-fremstilling af antigener fra patogene mikro organismer. Specifikt beskrives adhæsiver (pili) såsom 15 K88 typerne ab, ac, ad og ad(e) og K99, samt toxiner såsom LT, LTB og ST. Vaccinerne er fremstillet i nonpotogene E. coli og disse mikroorganismestammer kan derefter anvendes levende, eller kan være svækket eller slået ihjel ved kendte vaccinationsforberedelses-20 teknikker, i en vaccineforberedelse. Vaccinen anvendes forud for formering ved brug af en enkelt subkutan injektion hver gang. Vaccinen kan anvendes levende og indeholdende en passende adhæsinfaktor sammen med den non-toxine antigene determinant for en gastroenterisk 25 toxin, som permanent kan kolonialisere i den gastrointestinale trakt, sikrende en langtidsvirkende immunitet.

Opfindelsen adskiller sig klart fra Biotechpaten tet 30 (EP-0,060,129), som beskriver en kasse af molekyler (såsom pili og toxiner, mucøse immunogener) som kan bindes (kovalent) til et andet antigen (ikke et mucøst immugen) og kan anvendes oralt (ikke ved injektion) som et renset produkt (ikke som en helt dræbt eller levende 35 bakterie). I EP-0,060,129 er der ingen stedet nævnt noget om nogen af disse fusionsproteiner eller kemiske konjugationer.

4 DK 171846 B1 Således var formålet med disse studier at tilvejebringe en fremgangsmåde, hvorved optagelsen af et immunogen eller antigen gennem det gastrointestinale områdes slimhinde forebedres i et sådant omfang, at det 5 er muligt at frembringe serum og sekretoriske antistoffer ved oral indgift af lave doser af immunogenet uden induktion af oral tolerance.

Dette formål er opfyldt gennem et kompleks ifølge 10 krav 1, en fremgangsmåde ifølge krav 16 eller 17, en transformant vært ifølge krav 22, et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 24 og et medikament ifølge krav 26.

Følgelig beskriver opfindelsen en gruppe molekyler, 15 mucøse immunogener, som efter indgift fører til produktion af serumantistoffer til disse proteiner på niveauer, der kan sammenlignes med de, der opnås ved intramuskulær injektion af disse molekyker. Når større mængder af disse antigener endvidere tilføres, sker en 20 ledsagende stimulation af produktionen af mucøse antistoffer til de immuniserende molekyler.

I et yderligere aspekt ved opfindelsen beskrives en fremgangsmåde, hvorved den antistofrespons, der 25 frembringes til de oralt indgivne molekyler, kan forøges eller ændres ved samtidig indgift af et antal reguleringsmolekyler.

I et andet aspekt ved opfindelsen beskrives en 30 fremgangsmåde hvorved et hapten eller protein kan sammenkobles med et mucøst immunogen, hvor denne sammensætning efter indgift resulterer i produktionen af antistoffer til haptenet eller det påkoblede protein.

5 DK 171846 B1

FORKORTELSER

1. Ab - antistof 2. BSA - bovin se rumaIbumin

3. ConA - conconavlin A

4. DNP - dinitrophenyl 5 5. ELISA - enzymbundet immunosorbentana lyse 6. ETEC - enterotoxigenisk E. co L i 7. GALT - velassocieret lymfevav 8. HA - hydroxyapatit 9. im - intramuscular 10 10. LHRH - luteiniserende hormonfrigivende hormon 11. LPS - lipopolysaccharid 12. LT-B - varmelabilt toxin af entero toxigenisk E Co l i 15 13. 0/N - natten over 14. peroo - oralindgift 15. ps - polysaccharid 16. RT - stuetemperatur 17. sc - subcutant 20 18. SDS-PAGE - SDS-polyacrylamidgelelektro- phorese 19. TCA - trichloreddikesyre I en første udførelsesform tilvejebringer opfindelsen et kompleks omfattende: et immunogen bundet til et barer-25 molekyle, som er i stand til specifikt at samvirke med en hvirve Idyrsvarts mucøse epithelium, hvorved både den immunologiske aktivitet af immunogenet og barermolekylets evne til specifikt at samvirke med hvirveldyrsvartens mucøse epithelium i det vasenti i ge opretholdes, og navnte 30 kompleks er i stand til at fremkalde en systemisk, cellular og/eller mucøs immunrespons i hvirveldyrs varten .

Foretrukne immunogener ifølge opfindelsen omfatter: hele, en del af, analoger, homologer/ derivater og kombinationer deraf og et hormonterapeut i sk middel, antigen eller hapten.

35 Disse immunogener omfatter hormoner såsom LHRH (luteiniserende hormonfrigivende hormon),, FSH, H6H og inhibin, 6 DK 171846 B1 allergener såsom græspollen, f.eks. byg og ukrudtspollen, f.eks. kløver, skræppe, træpollen, f.eks. ask, cypres, plantepollen, f.eks. gyvel, epighelia, f.eks. kattehår, hundehår, grisebørster, og husstøv, hvedeavner 5 og kapok, immunogener til vacciner mod lidelser, såsom influenza, mæslinger, røde hunde, kopper, gul feber, difteritis, stivkrampe, kolera, pest, tyfus, BCG, haemophilus influenzae. Neisseria catarrhalis, Ke lbs i e 11 a pneumonia, pneumococ c i og s t reoptococ c i, især S. mutans; 10 og pili omfattende pili stammende fra E. co l i, N- gonorr-hoeae, N. Men i ng i t i s, N. catarrhalis, Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas spp, Mor axe 11 a bovi s, bacteroides nodosus, Staphylococc i spp, St reptococci spp og Bordetella spp.

15 Foretrukne bærermoleky l er omfatter bakterielle adhæsiner såsom 987P, K99, CFAI, CFAII, K88 eller F41; virale haemag-glutininer såsom fra influenza, mæslinger, røde hunde, kopper eller gul febei—vira, toxiner eller bindende underenheder deraf såsom LTB ricin, abrin, difteritoxin, modecin, 20 stivkrampetoxin og andre lignende strukturer, og leet i ner enten af plante- eller anden oprindelse. Lectiner omfatter f.eks. conconavalin A, Phytolacca mitogen eller lectiner fra Lens culinaris. Helix pomat i a. Glvcine max. Arachis hvpoaea eller Ulex europeus eller Abrin, aspargesært, hestebønne, 25 kamelfodstræ, ricinusfrø, valsk bønne, grøn havalge, håret vi kke, dolichos biflorus, horse shoe crab, jackbønne, japansk blåregn, j equirity, skotsk guldregn, limabønne, limulin, lotus, europæisk mistelten, mungbønne, maclura, pagodetræ, haveært, kartoffel, rød havebønne, rød havalge, sibirisk 30 ærtetræ, spiselig snegl, havesnegl, benvedtræ, sød ært, tomat, hvedespire eller vinget ært.

I en foretrukket udførelsesform for opfindelsen er der tilvejebragt et kompleks som omfatter luteini serende hormon-frigivende hormon og LTB.

7 DK 171846 B1 I en anden udførelsesform for opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til produktion af et kompleks som beskrevet ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter:

Ca) reaktion af immunogenet med barermolekylet til dannelse 5 af navnte kompleks, (b) kemisk modifikation af immunogenet til tilvejebringelse af mindst en funktionel gruppe, der er i stand til at danne en kemisk binding, og reaktion af immunogenet og barermolekylet til dannelse af navnte kompleks, eller 10 (c) kemisk modifikation af barermolekylet til tilvejebringel se af mindst en funktionel gruppe, der er i stand til at danne en kemisk binding, og reaktion af immunogenet og barermoleky let til dannelse af navnte kompleks,

Cd) kemisk modifikation af immunogenet og barermolekylet 15 til tilvejebringelse af funktionelle grupper, der er i stand til at danne en kemisk binding,og reaktion af immunogenet og barermolekylet til dannelse af komplekset, (e) reaktion af immunogenet med mindst et binderstof og reaktion af immunogenet og barermolekylet til dannelse 20 af komplekset, (f) reaktion af barermolekylet med mindst et bindingsstof og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komp lekset, (g) reaktion af immunogenet og bærermolekylet med mindst et 25 binderstof og reaktion af immunogenet og barermolekylet til dannelse af komplekset, eller (h) en kombination af ethvert af de foregående fremgangsmåde-trin.

I en anden form ti lvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde, ^0 som omfatter tilvejebringelse af et rekombinant DNA molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af immunogenet, en anden DNA-sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af barermolekylet, og vektor DNA, der transformerer en 35 vart med rekombinant DNA molekylet, således at værten er i stand til at ekspresere et hybridt proteinøst produkt, som 8 DK 171846 B1 omfatter dette kompleks, dyrkning af vårten til opnåelse af ekspressionen og indsamling af det hybride proteinøse produkt.

Alternativt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til 5 produktion af et kompleks, hvilken fremgangsmåde omfatter (a) kemisk syntese af immunogenet og/eller bærermoleky let og dannelse af komplekset ved kemisk reaktion, eller (b) syntetisering af et hybridpeptid omfattende aminosyre-sekvenser af immunogenet og bsrermoleky let. Fortrinsvis 10 fremstilles peptidet ved fast fase, enzymatisk eller manuel peptidsyntese.

I en foretrukket udførelsesf orm for opfindelsen er det syntetiserede immunogen eller bærermolekyle, selvom det er bundet til den faste fasepeptids synthesiser-harpiks, koblet til 15 henholdsvis bærermolekylet eller immunogenet.

I en anden form for opfindelsen er tilvejebragt en transformant vært, der er transformeret med et rekombinant DNA-molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvenserne af hele, en del af, en 20 analog, homolog, derivat eller kombination deraf af immunogenet, en anden DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af hele, en del af, en analog, homolog, derivat eller kombination deraf af barermolekylet, og vektor DNA.

25 I en foretrukken form for opfindelsen er den transformante vart en gramnegativ eller grampositiv bakterie, en gær, svamp eller en højere eukaryotisk celle. En en foretrukket form for opfindelsen er værten E. col i . En kultur af en transformant mikroorganisme, der falder indenfor den forelig-30 gende opfindelses rammer, er deponeret hos The American

Type Culture Collection og er tildelt nummeret: ATCC 67114 I en yderligere form omfatter opfindelsen et rekombinant 9 DK 171846 B1 DNA molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af immunogenet, en anden DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af bsrermolekylet, og vektor DNA. I en foretrukket 5 udførelsesform for opfindelsen er vektor DNA plasmid DNA, men alternative vektorer kan påregnes inden for opfindelsens rammer, og disse omfatter vira, bakteriofager og cosmider.

I en foretrukket form for opfindelsen er tilvejebragt plasmid pBTAK66, som, når en vartscelle er transformeret 10 med navnte plasmid, vil give et proteinøst produkt, som omfatter et polypeptid, der falder indenfor den foreliggende opfindelses rammer.

I en yderligere form for opfindelsen er tilvejebragt en po lynucleotidsekvens, som omfatter en første hybrid 15 polynucleotid sekvens, der fungerer som kodningssekvens for et fusionsprodukt omfattende en aminosyresekvens af et immunogen, der er sammensmeltet til en aminosyresekvens af et barermolekyle, en polynucleotidsekvens, der er tilstrak-keligt relateret til den første hybrid polynucleotidsekvens 20 til hybridisering til navnte første hybridpolynucleotid-sekvens, en po lynucleotidsekvens relateret ved mutation omfattende enkle eller multiple basesubstitutioner, deletioner, insertioner og inversioner, til den første hybridpoly-nucleotidsekvens eller hybridiseringssekvens eller en 25 po lynucleotidsekvens, som efter ekspression koder for en polypeptid, som udviser lignende biologisk eller immunologisk aktivitet til navnte sammensmeltningsprodukt.'

Fortrinsvis er polynucleotidsekvensen en sådan, hvori den første hybridpo lynuc l eotidsekvens fungerer som en kodnings-30 sekvens for aminosyresekvensen for hele, en del af, en analog, homolog, derivat eller kombination deraf af LHRH sammensmeltet til aminosyresekvensen af et barermolekyle, mere fortrinsvis LTB.

I en yderligere form for opfindelsen er tilvejebragt et medi- DK 171846 Bl 10 kament, som omfatter et kompleks ifølge opfindelsen sammen med en farmaceutisk acceptabel barer eller fortynder.

Eksempler på farmaceutisk acceptable barere og fortyndere omfatter typiske barere og fortyndere, såsom tabletter, 5 vandige opløsninger, natriumbicarbonatopløsninger og lignende fortyndere, som neutraliserer mavesyre eller har lignende bufferevne, glycoler, olier, olie-i-vand eller vand-i-olie-emulsioner, og omfatter medikamenter i form af emulsioner, geler, pastaer og viskøse colloidale dispers ioner.

10 Medikamentet kan prasenteres i form af kapsler, tabletter, langsom frigørelse eller eleksir eller som en gel eller pasta eller kan prasenteres som en nasespray ogskal i denne form vare i narvar af en aerosol. Endvidere kan medikamentet vare tilvejebragt som dyrefoder eller som føde, der er 15 egnet til mennesker.

Opfinderne har også fundet, at samtidig indgivelse af visse reguleringsmolekyler med et kompleks af den foreliggende opfindelse selektivt kan modificere størrelsen og/.eller typen af immunresponsen til kompleksets immunogen.

20 Følgelig tilvejebringer den foreliggende opfindelse endvidere et medikament, som omfatter et kompleks ifølge den foreliggende opfindelse sammen med et reguleringsmolekyle, hvilket selektivt kan modulere størrelsen og/eller typen af immunresponsen til kompleksets immunogen.

25 Reguleringsmolekylet ifølge opfindelsen omfatter basiske, neutrale og sure aminosyrer, såsom argin in, histidin, lysin, alanin, cystein, cystin, glycin, isoleucin, leucin, methio-nin, phenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrosin, valin, asparaginsyre, g lutaminsyre, vandopløselige 30 og uopløselige vitaminer såsom thiamin, riboflavin, pyri-doxal, cyanocoba lamin ascorbi nsyre, (V.C.), vita min etc., Ergosterol, vitamin E, vitamin A, vitamin K etc, sukkerarter omfattende monosaccharider, f.eks. galactose, mannose, mannitol, sorbitol, glucose, xylose, Allose, altrose, 11 DK 171846 B1 arabinose, digitoxose, erythrose, fructose, lyxose, nura-minsyre, mannose, pyruvinsyre, ribose, tagatose, talose og de amidaterede og N-acetylerede derivater deraf, oligosac-charider, f.eks. lactose, maltose, melibiose, sucrose, 5 cellubiose, N,N di acety l chitobi ose, gentobiose, isomaltose, laetobionsyre, trehalose, turanose og reguleringsmineraler og co-faktorer såsom manganese, magnesium, zink, calcium og jern.

Opfindelsen tiLvejebringer også en fremgangsmåde til pra-10 sentation af komplekset ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde omfatter mueøs indgift af et kompleks ifølge opfindelsen sammen med et reguleringsmolekyle, der er i stand til at modulere størrelsen og/eller typen af immunogenets immunrespons.

15 Opfindelsen tilvejebringer også oral indgift af medikamenterne ifølge opfindelsen for at fremkalde en respons til det aktive molekyle i vårten. En sådan respons kan, i det tilfalde, hvor det aktive molekyle er et antigen eller hapten, vare en systemisk og/eller mieøs immunrespons. I til-20 faldet hvor det aktive molekyle er LHRH eller et derivat, analog, homolog, del af eller kombination af LHRH, vil responsen vare hamning af kønskirtelfunktionen hos vårten. Hvor det orale medikament omfatter et reguleringsmolekyle ifølge opfindelsen, tilvejebringer opfindelsen en fremgangsm-25 måde til forøgelse af vårtens respons på det aktive molekyle, som omfatter indgift af et sådant oralt medikament i vårten.

Opfindelsen vil i det følgende blive narmere forklaret under henvisning til tegningen, hvor 30 fig. 1 viser den N-terminale aminosyresekvens af 987P pilin-underenheden sammenlignet med den N-terminale aminosyresekvens af andre pili nproteiner.

12 DK 171846 B1

Materialer.

Leet i ner opnåedes fra Sigma Chemical Co. Inaktiveret influenzavaccine opnåedes fra the Commonwealth Serum Labs. i Australien. Sukkerarter og vitaminer opnåedes fra følgende 5 kilder: Lactose (AR grad) - Ajax Chemicals, Sydney, Australien, fructose D(-), Mannose D(+), Sorbitol og Xylose D(+) (alle AR grad) - B.D.H. Chemicals Ltd. Poole,

England; Melibiose D( + ) - Si gma Chemical Co., St. Louis,

Miss.; Retinal (Vit A. aldehyd) - Fluka AG, Chemicals, 10 Fabrik Buchs, Schweiz; Thiamin - HCl (Vit B1), Riboflavin (Vit B2), Pyrodixal (Vit B6), Cyanocoba lamin (Vit B12), L-ascorbinsyre (Vit C), Ergosterol (Pro vit D) og dl-a-tocopherol (Vit E) - Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss.

Bakter i estammer og medier.

15 De E. c oli K99, 987P og LTB stammer, der anvendtes i disse eksperimenter, er opført i tabel 1 og var rundhåndede gaver fra Dr. Susan Clark, Molecular Biology Laboratory Biotechnology Australia. Kulturer dyrkedes ved 37C, med mindre andet er anført, under omrystning i luria vækstmedium (LB) 20 med eller uden 1 mM isopropyIthio-n-D-galactopyranosid (IPTG) som antydet (tabel 1). SaImone l latyphi murium dyrkedes ved 37C med omrystning i LB plus 0,2 procent glycerol.

TABEL 1

Stamme Genetisk mærke Stammeoprindelse Phenotype 25 BTA 595 p BTA 193 RB 791 LTB +

BT A 604 p BTA 201 MC 1061 987P

BTA 262 p BTA 106 ED 8654 K99

+ omfattende c 1 mM IPTG

RENSNING AF ANTIGENER 30 Pili fremst i11i ng

E. coli, der ekspresserede de klonede pili som detekteret under anvendelse af radiomærket antiserum, høstedes under logaritmisk fase af væksten. Kulturerne opvarmedes ved 60C

13 DK 171846 B1 i 30 minutter, hvorefter organismerne pelletteredes ved centrifugering ved 3000 x g i 30 minutter 4C. Supernatanten undersøgtes for pi Li indhold ved 12,5 procent SDS-PAGE under anvendelse af en modifikation af fremgangsmåden ifølge 5 Laemmli, 1970; Salit et al, 1980.

K99 rensning: Kultursupernatanten justeredes til pH 9,7 med C10N NaOH og omrørtes ved stuetemperatur (R.T.) i 10 minutter. Det resulterende praecipitat indeholdende pili genvandtes ved centrifugering ved 3000 x g i 30 minutter 4C.

10 og resuspenderedes i 100 ml destilleret HgO (dHgO), pH 7,2. Denne fremgangsmåde gentoges to gange.

987P rensning: Der anvendtes fremgangsmådr som beskrevet ovenfor, undtagen af pilipræci pitatet opnåedes ved justering af pH til 3,9 med iseddikesyre.

15 Hydroxyapatitchromatografi

Hydroxyapatit /HA) (DNA grad Bio-Gel HTP, Bio-Rad) ekspanderedes forsigtigt i et overskud af dH20 og efter en kort periode (< 2 min) dekanteredes slutprodukterne forsigtigt.

Frisk dH2<) tilsattes og anvendtes til forsigtigt at resuspen-20 dere gelen, hvorefter slutprodukterne dekanteredes igen.

Denne fremgangsmåde gentoges adskillige gange. En søjle på 30 x 5 cm fyldtes med en slurry på ca. 30 procent HA og bundfældedes ved tyngdekraft. Tæt pakning opnåedes derefter ved at passere dHgO gennem søjlen ved en strømningshastig-25 hed på 16 ml/time, indtil gelbundfaldsoverfladen var stationær. Prøver på 100 ml af enten K99 eller 987P tilførtes ved strømningshastigheder, der ikke oversteg 30 ml/time. Søjlen vaskedes derefter med dH2^, indtil intet protein kunne detek-teres i strømmen som detekteret ved 280 nm. Pili elueredes 30 ved en strømningshastighed på 30 ml/time under anvendelse af en lineær gradient på 15 til 250 mM natriumphosphat pH 7,5. Fraktioner indsamledes og undersøgtes ved hjælp af SDS-PAGE. Pi li-toppen genvandtes og samledes sammen.

14 DK 171846 B1

Ionbytterchromatografi

Indsamlede fraktioner af K99 og 987P fra HA chromatografi reprscipiter edes med NaOH, pH 9,7 eller iseddikesyre, pH 3,9 respektive. Efter cent i fuge ri ng ved 3000 x .g i 10 5 minutter resuspenderedes pelletterne, der indeholdt pili, i 50 mM citratbuffer pH 5,5 (K99) og 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 (987P) før ladning på ionbyttersøj lerne, der var akvilibreret med de samme buffere. K99 og 987P tilførtes CM og OEAE søjler henholdsvis ved en strømningshastighed 10 på 100 ml/time, vaskedes med 2 mangdedele ladningsbuffer og pili elueredes under anvendelse af en linear gradient fra 10 mM til 0,5 M NaCl i akvilibreringsbuffere. Fraktioner undersøgtes ved SDS-PAGE for proteinindhold og LPS-forurening ifølge Tsai og Frasch's (1982) metode.

15 LTB rensning

Tre liter LTB supernatant fortyndedes til 61 med dH20. pH justeredes til 6,5 med iseddikesyre og tilførtes til en 5 x 30 cm søjle af hurtigtflydende CM-Sepharose akvili-' breret med 10 mM phosphatbuffer pH 6,5 ved en strømn ings- 20 hastighed på 1,2 L/time. Søjlen vaskedes derpå med 400 ml 10 mM phosphatbuffer pH 6,5 og bundet protein elueredes med en linear gradient på 10-500 mM NaCl i 10 mM phosphat pH 6,5. Fraktioner indsamledes og analyseredes ved SDS-PAGE, og LTB-spidsen samledes.

25 Flagellae-isolation

Sen log-fasekulturer af bakterier pel lette redes ved centrifugering (3000 x g i 15 minutter ved 40. Cellerne resuspenderedes i salin og opvarmedes ved 60 C i 30 minutter efterfulgt af centrifugering ved 3000 x g i 10 minutter ved 4C.

30 Supernatanten praci piteredes ved tilsatning af en opløsning af 100 procent TCA (w/v) for at give en endelig koncentration på 10 procent (w/v) og omhvirvledes i 10 minutter ved 1500 x g ved 4X. Pelletten resuspenderedes i en lille mangde 1 M Tris-pH 8,8 og soniceredes indtil i opløsning.

35 Ethanol tilsattes til en endelig koncentration på 80 pro- 15 DK 171846 B1 cent (v/v) og flagellae omhvirvLedes ned ved 2000 x g i 10 min ved 4C. Pelletten resuspenderedes i acetone, soni-ceredes til suspension og repracipi te redes ved centrifugering ved 5000 x g. Endelig bragtes pelletten til opløsning 5 ved kogning i 10 procent SOS og 50 mM EDTA i 10 mM Tris-HCl pH 8,0 før Sephacryl S-200 chromatografi.

Flagellae-rensning

Efter kogning i 15 minutter klaredes flagellae ved centri fugering i 5 min i en Beckman Benchtop microfuge til fjer-10 nelse af ikke-opløst materiale. Supernatenten tilsattes til en 2,5 x 80 cm søjle af Sephacryl - S200 (Pharmacia, Fine Chemicals) akvilibreret med 20 mM Tris pH 8,8, 0,1 procent SOS og 10 mM EDTA og elueret under anvendelse af den samme buffer. Fraktioner indsamledes og analyseredes ved SDS-15 PAGE. Endelig samledes f lage l laetoppen og pracipiteredes med 10 procent (endelig koncentration) TCA efterfulgt af centrifugering, ethanol og acetone vaskedes som beskrevet ovenfor. Den endelige pellet resuspenderedes i dHgO.

Lipopolysaccharid (LPS) rensning 20 Kulturer af S. typhimurium, der havde st§et natten over, ekstraheredes i 30 min ved stuetemperatur med 0,5 M CaCL^ i 20 procent ethanol (v/v) indeholdende 100 mM citrat pH 3,0 og 5 procent Zuittergent 3,12 (w/v) (CaIb iochem.) . Bakterier pel letteredes ved centrifugering ved 3000 x g i 25 10 min ved 4C og pelletten resuspenderedes i 50 mM EDTA

pH 8,0. Suspensionen omrørtes kraftigt i 30 min ved stuetemperatur. Efter fjrenelsen af bakterierne ved centrifugering tilsattes ethanol til supernatant en til en endelig koncentration pi 75 procent. Proteinmaterialet pelletteredes 30 og supernatanten justeredes til 90 procent ethanol. Proteinmateriale pel letteredes og supernatanten justeredes til 90 procent ethanol. Pracipitatet , som dannedes, pelle11erede s og vaskedes med acetone, repracipiteredes og resuspenderedes endelig i dHgO. Præparatet analyseredes for sukker ind-35 hold under anvendelse af Anthrone reagent, se Herbert et 16 DK 171846 B1 al, 1985 og undersøgtes for tilstedevære l se af forurenende proteiner under anvendelse af SDS-PAGE. Commerciel E. c oli LPS (sigma Chemical Co.) anvendtes som standard i begge analyser. Geler farvedes for LPS under anvendelse 5 af sølvfarve ifølge Tsai og Frasch's (1982) metode.

Fremstilling af polysaccharid (PS)

Lipid A spaltedes fra S. typhimurium LPS præparatet ved inku-bering af LPS med 1 M iseddikesyre og opvarmning ved 100 C i 2-5 timer. Lipid A fjernedes derpå ved centrifugering 10 ved 3000 x g i 10 min ved 4C.

Beskrivelse af rensede antigener SDS-PAGE analyse af rensede K99 og 987P pili præparater afslørede tilstedeværelsen af et enkelt bånd, der migrerede ved 17500 og 20000 mol. wt. henholdsvis under reduktions-15 betingelser, se fig. 1. Dette stemmer overens med de publicerede data ifølge Isaacson og andre (Isaacson & Richter, 1981; Morris et al 1980; de Graaf et al, 1981, Fusco et al, 1978). Letheden ved praci pitering af disse proteiner ved pH 9,7 og 3,9 (for K99 og 987P respektive) antyder, at 20 pi af disse to proteiner er omtrent som de i dette område, se Isaacson 8 Richter, 1981; de Graaf et al, 1981. Sølvfarvning af disse præparater viste, at de indeholdt ringe (< 1 ^*g/100^Ag protein) eller ingen forurening med LPS.

Bestemmelse af 987P aminoterminalsekvens 25 Ami notermi na Imikrosekvensering udførtes for ansøgeren af

Biotechnology Research Enterprises S.A. Pty. Ltd., Adelaide, Sydaustralien. En prøve på 100 nmol af 987P renset som beskrevet ovenfor analyseredes. Am i notermina l sekvensen af 987P sammenlignes med den offentliggjorte sekvens af 30 K99 og afslører ingen homologi mellem disse to molekyler, se fig. 1, Gaastra og de Graaf, 1982.

Renset LTB og S. typhimurium flagellae fandtes også at være fri for forurenende LPS og at opføre sig som monomere af 17 DK 171846 B1 en tilsyneladende molekylvagt på 12.500 og 52.000 respektive/ når de undersøgtes ved SDS-PAGE under redukti on sforho l d .

Sølvfarvet SDS-PAGE geler af renset LPS afslørede ingen detekterbar proteinforurening. Komplekst sukkerindhold 5 som analyseret ved Anthronreaktion fandtes at vare 2 mg/ml.

Lipid A-fri polysaccharid fandtes også at indeholde 2 mg/ral polysaccharid og dens mangel på bevagelse på SDS-PAGE som afsløret i de sølvfarvede geler viste/ at den var fri for forurenende lipid.

10 Dinitrophenylering af antigener K99/ LTB og lectiner dinitrophenyleredes ifølge fremgangsmåden hos Little og Eisen, 1967. Kort fortalt reageredes barere i 0/1 M carb/bicarb buffer pY 9/5 med en 0/1 M opløsning af DNFB i acetone natten over ved stuetemperatur.

15 Porteinerne dialyseredes extensivt mod sammenkoblingsbufferen.

Tidligere studier hos ansøgeren har vist/ at 987P ikke har nogen frie aminogrupper udsat for kobling/ så en diamino-spacer bandtes først til de frie carboxylandele af proteinet som følger: 10 mg renset 987P præcipiteredes ved pH 20 3/9 ved tilsatning af iseddikesyre. Pili fjernedes vec centrifugering ved 3000 x g i 10 min ved 4C. Pelletten re-suspenderedes i dH^O og pH forøgedes til 6/5 med IN NaOH.

Piliopløsningen reageredes med 1-ethy1-3-C3-Di methylam ino-propyl) carbodiimid-HCL CEDAC, Bio Rad Laboratories/ Rich-25 mond/ Californien/ til en endelig koncentration på 0/5 mM

i nærvær af 20 mM 1/2-diaminoethan (BDH Chemicals Ltd./ Poo-Ιβ/ England) natten over ved stuetemperatur (20-230.

Det aminosubsti tuerede 987P dialyseredes i 24 timer mod to ændringer af 0/1 M carbonat/bicarbonatbuffer/ pH 9/5 før 30 anvendelse i de efterfølgende conjugat i onstrin. Lectin-bindingssteder beskyttedes under deres reaktion med DNFB ved tilsætning af de lectin-specifikke sukkerarter. Således tilsattes 50 mM opløsninger af D-glucose/ D-mannose, N-acetyl-D-galactosamin/ D-galactose/ N-acetyl-D-galactosa-35 min, D-ga l (1/3)-D-galN-Ac og L-fucose til følgende lectiner: 18 DK 171846 B1

Conconav l i η A, pokeweed mitogen, lens culinariS/ helix poma-t i a, phaseolus vulgaris, glycine max, arachis phpogea og ulex eruopeus, respektive.

Ant i genindgift 5 C57BL/6J hunmus (18-22 g) opnåedes fra Animal Resources

Centre, Perth, Vestaustralien. Alle mus blev sultet i 3-4 timer før oral eller intramuscular (i.m.) indgift af antigener. Mus tilførtes antigen i passende koncentrationer i 0,5 ml af 0,1 M carb/bicarbonatbuffer pH 9,5 under anvendelse 10 af en specielt prapareret nål. Parallelle doser af antigen injiceredes i.m. i 0,1 ml steril fysiologisk salin i venstre bagben. Grupper på 5 mus, der fik antigen, enten oralt eller i.m., fik to identiske doser antigen på dag 0 og dag 14. En blødprøve udtoges, ca 0,5 ml, fra den retro-orbi-15 tale plexus på dag 14 og dag 21. Mus slagtedes derpå ved cervical dislokation og vaskning af tyndtarmen udførtes på følgende måde: tyndtarmen fjernedes omhyggeligt og en lille mangde vaskningsbuffer på 1,0 ml, 30 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,9 procent N a C l, 50 mM EDTA plus 1,0 procent Tween 20 20 introduceredes i tarmhulrummet via en nål med stump ende.

Efter forsigtigt at have masseret tarmen trykkedes indholdet ud mellem tommel- og pegefinger. Tarmindholdet der således opnåedes, centrifugeredes straks til fjernelse af affald og lagredes ved -20C indtil analyse. Blodprøver 25 tillodes at klumpe ved 4eC før fjernelse af serum og lagring ved -20”.

Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) ELISA til bestemmelse af antistoftitreri nger udførtes som beskrevet ovenfor af Russe11-Jone s et al (1984).

30 EKSEMPEL 1

Identifikation af molekyler, der er aktive som mucøse immunogener Det mulige potentiale af et antal molekyler, der vides at besidde evnen til at binde til tarmslimhinden og at stimulere produktionen af en immunrespons efter oral indgift af 19 DK 171846 B1 disse molekyler undersøgtes. Den respons, der frembragtes af disse molekyler, sammenlignedes med responsen, der sås efter lignende tilførsel af andre molekyler uden mucøse bindingsfunktioner.

5 Som vist i tabel 1.1 detekteredes tre store klasser af proteiner i disse eksperimenter: de, der frembragte et serum og intestinal respons, K99, 987P, LTB, i nfluenzavaccine og de forskellige lectiner (klasse 1) (disse betegnes herefter som mucøse immunogener), de der kun frembragte 10 en serumrespons ULPS) (klasse II), og de, der hverken frembragte serumrespons eller intestinal respons ved de testede doser (Flagellae, BSA og P.S.) (klasse III). Indenfor klasse I antigener 987P var en tydeligt overlegen stimulering af IgA antistof (ab) (48,5 + 1,8) sammenlignet med 15 LTB (12,2 - 4,4) etter K99 (3,2 - 4,9). Herudover stimulerede 987P også gastrointestinalt IgG (10,8 - 1,76) i større omfang end enten K99 (3,0 - 5,3) eller LTB (1,0) og kun 987P var i stand til at stimulere serum IgA (10,8 - 8,8).

Alle fire klasse I antigener stimulerede serum IgG i li g — 20 nende omfang, se tabel 1.1. Klasse II antigen, LPS, stimulerede en lille serum IgG respons (12,1 - 1,0) uden nogen ledsagende IgA eller agastrointestinal reaktivitet. Endelig inducerede BSA, flagellae og p9lysacchari dandelen af LPS - klasse III antigener - hverken serum eller intestinal IgG 25 eller IgA. Repræsentative prøver fra aLle tre klasser K99, 987P, LTB, LPS og flagellae indgaves intramulculært og undersøgtes for både serum og intestinal respons, se tabel 1.2. Klasse I og II antigener gav lignende serum IgG responser, men producerede ikke serum IgA eller intestinal 30 IgG/IgA Ab responser. Kun anti-LPS serum IgG responsen syntes at være betydeligt forbedret ved i.rn. immunisering.

Hver af 987P, K99 og LTB undersøgtes endvidere i dosisrespons-studier efter både oral og i.m. indgift. Som det fremgår af tabel 1.3 og 1.4 gav 987P betydeligt højere titreringer 35 end både K99 og LTB uden hensyn til indgiftsmåden. Interessant nok udviste klasse I antigenet - LTB - en klokkeformet 20 DK 171846 B1 dosi srespons med et plateau maximum mellem 10 og 50yU,g.

Ingen af de andre klasse I antigener frembragte denne effekt, og det gjorde LTB efter i.m. indgift heller ikke. Oral indgift af alle klasse I antigener (Ag) frembragte højere 5 niveauer af intestinalt IgA Ab (S-IgA) over et stort område af de testede doser. Sammenligning mellem de to indgifts-måder antyder, at selvom i.m. injektion gav højere titreringer, resulterede oral indgift af mucøse immunogener i sådanne niveauer af ant i stofprodukti on, der 10 kunne sammenlignes med de, der opnåedes ved i.m. indgift mellem 10 og 100 g af antigen for klasse I og II antigener.

Tabel 1.1

Immunoreaktioner på oralt indgivne antigener.

Antigen anvendt Immunrespons, 1 dag 21 15 til immunisering Serum Intestinal

(20 g doser) IgG IgA IgG IgA

K99 968 - 120 <4 3,0 - 5,2 3,2 i 4,9 987P 776 t 64 10,8 ± 8,8 10,9 1 1,7 48,5 ± 1,88 LTB 1351 +211 <4 <4 12,2 + 4,4 20 Influenzavac. 179 i 34 <4 <4 <4

Flagellae <4 <4 <4 <4 LPS 12,1 1 1,0 <4 <4 <4 PS <4 <4 <4 <4 BSA <4 <4 <4 <4 25 Con A2 666 1 84 < 4 nd nd FW-mitogen2 541 1 119 <4 nd nd L.culi nar i s2 954 i 48 <4 nd nd H.pomatia2 591 t 127 <4 nd nd P.vulgaris 1378 + 110 4,8 2,3 nd nd 30 G.max2 1529 i 65 3,1 6,9 nd nd A.Hypogea1 1276 ± 242 >4 nd nd U.europeus2 1583 - 94 < 4 nd nd

Den reciprokke af anti serumopløsningen, som gav en ELISA- 2 udlæsning på 0,5 efter 45 minutter ved 37C. Hver vardi re-35 prasenterer middelvardien opnået fra 5 mus - 1 standard- 21 DK 171846 B1 afvigelse.

** Hver lectin substitueredes med 4 DNP molekyler/mo l lectin. ELISA titreringen reprssenterer enti DNP responsen som målt mod DNP-BSA.

5 Tabel 1.2

Immunreaktioner til antigener ved intramuscular indgift

Antigen anvendt Immunrespons, * dag 21 til immunisering Serum Intestinal

(20 g doser) IgG IgA IgG. IgA

10 <99 1024 ♦ 94 <i <4 <4 587P 1552 *112 <4 <4 <4 LTB 1782 ; ICC·.' <4 <4 <4

Flage 11 ae 1595*227 <4 <4 <4 LPS 338 ; 53 <4 <4 <4 15 * se tabel 1.1

Tabel 1.3

Dosisrespons på oralt præsenterede antigener

Antigen Immun recscns *. dag 21, per dosis (ug) 20 0.1 1.0 10 50 ICO 1.000

Serum IgG

<99 1.0 4.0 28 675 1351 4096 987P 4.0 14 84 538 1024 3104 LTB 9.0 194 1351 1331 391 891

25 Serum IgA

<99 <4 <4 <4 <4 <4 <4 987P <4 <4 <4 9.6 13.3 32 LT3 <4 <4 <4 <4 <4 <4

Intestinal IgG

30 <99 <4 <4 <4 <4 <4 <4 987P <4 <4 <4 4.0 4.0 8.0 LT3 <4 <4 <4 <4 <4 <4

Intestinal IgA

<99 <4 <4 <4 4.0 16.7 87 35 987P <4 <4 9.1 54 84 147 LTB <4 <4 <4 4.0 4.0 8.0 * j« 4.4 22 DK 171846 B1

Tabel 1.4

Dosisrespons på intramuskulært præsenterede antigener.

Antigen Immun resoons *, dag 2!, per dosis (ug) 0.) 1.0 10 50 ICO i.coo

5 Serum IgG

<90 255 445 776 1 351 1776 51C4 ag 7 p 256 891 1024 3104 4096 '8820 L7B 64 5S8 1175 1702 4096 3192

Serum ΙςΑ 10 TK99 <4 <4 <4 <4 <4 <4 53 7 P <4 <4 <4 <4 <4 <4 UB <4 <4 <4 <4 <4 <4

Ifuestinai IgG

<99 <4 <4 <4 <4 <4 <4 15 537? <4 <4 <4 <4 <4 <4 UB <4 <4 <4 <4 7.0 '5

Intestinal ΙςΑ «g g <4 <4 <4 <4 <4 4.5 937P <4 <4 <4 <4 4.0 6.0 20 UB <4 <4 <4 <-4 160 "-1 * se tabel 1.1 EKSEMPEL 2

Effekt af reguleringsmolekyler på immunresponsen på mucøse immunogener efter oral præsentati on.

25 Indledende studier i ansøgerens laboratorium med ved udavl formerede schweiziske hanmus antydede, at det var muligt at ændre immunresponsen på oralt præsenterede antigener ved samtidig indgift af visse reguleringsmolekyler. Følgelig tilførtes de mucøse immunogener K99, 987P og LTB til mus i 30 nærvær af et antal reguleringssukkerarter og vitaminer.

Det udledtes, at eftersom de forskellige antigener var kendt for at binde sig til forskellige molekyler på overfladen af tarmepithe l et, og da det er kendt, at der forekommer en ændring i fordelingen af glyc oproteiner og glyco-35 lipider gennem hele tarmhulrummets længde såvel som en ændring i fordelingen af absorptive celler, kan det være muligt at stimulere optagelsen af molekyler, der er bundet 23 DK 171846 B1 til disse celler ved at præsentere angibenerne i nærvær af det specifikke reguleringsmolekyle, der normalt optages af disse celler. En støtte for dette argument vil være, at de stimulerende molekylers profil vil ændres fra anti-5 gen ti l ant igen.

Oe i tabel 2.1, 2.2 og 2.3 viste resultater viser, at selvom de fleste af vitaminerne og sukkerarterne har haft nogen effekt ved modulering af immunresponsen på K99, 987P og LTB, synes nogle reguleringsmolekyler at være selek-10 tive i henseende til, hvilket mucøst immunogen de synes at indvirke på, men også i henseende til hvorvidt de primært inducerede en sekretorisk eller serumrespons. Således forøgedes serumantistof responsen til K99 betydeligt (P < 0,05) ved samtidig indgift af vit B12 af melibiose, uændret når 15 indgivet sammen med vit B2, vit D, vit E, fructose eller mannose Ig faldende i forskelligt omfang med vit A, vit B1, vit B6, vit C, lactose, sorbitol og xylose, se tabel 2.1. 1 modsætning hertil øgedes serum Ab responsen til oralt 20 987P, se tabel 2.2, når 987P indgaves sammen med vit B6, vit B12, vit C, vit E fructose eller mannose, men var uændret ved vit A, vit B1, vit B2, lactose, melibiose, sorbitol og xylose og faldt i nærvær af vit D. LTB udviste på den anden side en unik profil for virkningen af samtidig 25 indgift af reguleringsmolekyler på serum Ab niveauerne.

Resultaterne i tabel 2.3 viser klart en forøget serumtitrering til LTB i nærvær af vit A, vit B2, vit D, fructose, mannose og xylose. Lille eller ingen ændring med vit B1, vit B12, vit C eller melibiose og næsten fuldstændig hæmning 30 med vit B6, vit E, lactose, melibiose og sorbitol. Hæmningen af en immunrespons som set med vit B6, lactose, melibiose og sorbitol bør forventes på grund af lighederne i struktur mellem disse sammensætninger og galactose, som kræves at være den specifikke sukkerdeterminant på G M1 ganglieside, som 35 LTB vides at binde sig til. Disse resultater antyder i høj 24 DK 171846 B1 grad, at K99, 987P og LTB binder sig til og internaliseres af diskrete celler fra mi krovil løst epithel.

Dosisresponseksperimenter, se tabellerne 2.4, 2.5 og 2.6, viser, at det er muligt at stimulere immunsystemet s sekre-5 tionsgren uden ledsagende stimulering af serumantistoffer eller omvendt at forøge serumresponsen uden at påvirke niveauet for sekretorisk Abs ved enkel tilføring af reguleringsmolekyler til de oralt prasenterede mucøse immunogener. Således fører samtidig indgift af store doser af vit B12 10 eller melibiose med K99 til en to- til otte gange (respektive) forøgelse i serum Ab med lille ledsagende forøgelse af sekretorisk Abs. Omvendt fører samtidig indgift af vit D i øgede doser til et fald i serum Abs og en stigning i sekretorisk Ab. Visse reguleringsmolekyler resulterer på 15 den anden side også i stimulering af både sekretorisk og serum Ab titreringer som vist ved en otte gange stigning i serum Ab og en 1000 gange stigning i S-IgA efter samtidig indgift af vit C med 987P.

Eksperimenter, hvorved de mucøse immunogener injiceredes 20 i.m. sammen med vitaminer eller sukkerarter viste ringe effekt, om nogen, på immunresponsen og viste således, at andringen i respons på grund af samtidig indgift af disse molekyler sammen med de mucøse immunogener må forekomme på eller nar absorptionsbindingsstederne for disse mole-25 kyler snarere end direkte på immunsystemet, se tabel 2.7.

DK 171846 Bl TABEL 2.1

Effekter af reguleringsmolekyler pS immunresponsen på oralt indgivet K99 (20 ^tg)* 25

Antisiio-f Respons 5 Regulerings- Ces is Serum Intesti ra1

NoleRyle IcG IcA IqG IoA

none - 963+120 <4 3.0+Ξ.2 3.2-4.?

VI: A 20Mc 273^134 3.4-4.7 1.5-1.1 5.4-3.O

Vit Bl " 117-107 1.5-2.0 ’· 2.7+1.0 2.UO.? 10 Vir B2 " 604-215 <4 2.3+1.7 2.0-0.5

Vi: B6 " 14-50 <4 2.011.5 3.5-S.2

Vit 312·· " 3377+1255 4.0+3-0 <4 <4

Vit C·1 " 318+255 2.0+2.3 32 +1.1 98+7.0

Vit O2 " 1921+640 <4 <4 6.3^2.7 15 vit E " 512+123 <4 <4 4.4-2.1

Fructose 50mM 1782+966 8.4+3.7 2.9+1.5 34.7^4.2

Lactose " 84+204 <i <4 22.9-5.7

Mannose " 1176r411 2.6+3.4 10.2+3.4 21.1—0.3

Melibiose·1 " 1840+203 1.2+1.4 3.2+2.0 4.4-3.7 20 Sorbitol " 77+179 <4 1.3+0.4 20.5-3.4

Xylose " 328+217 <4 1.9+1.1 2.811.3 t

Den reciprokke af anti serumopløsningen, som gav en ELISA-udlæsning på 0,5 efter 45 min ved 3 7 0 C på dag 21 efter immunisering. Hver værdi er middelværdien af fem mus - 1 stand-25 ardafvigelse.

2

Hver værdi er middelværdien af 15 mus - 1 standardafvigelse. Disse molekyler testedes også i dosisresponseksperi-menter.

Tabel 2.2

Effekter af reguleringsmolekyler på immunresponsen på oralt 987P (20 jji.g)* 26 DK 171846 B1

Antistof Wessons 5 Regerings- 0os_j_s Serum Intestinal

Ho i e k yl 5 IgG IoA IcG IjA

nene - 775+64 !0.3-3.3 IC.9+ l. 7 48.5-1.3

Vi t A” 2CHg £43-40 29.0+20 3.4-3. i 20.5^24,= VI t 31 " 331 + 127 12.1+3.6 9.4+1.5 14.7-=.3 10 VIt 32 " 1082-271 31.1+11.9 17.3r7.5 21.1+11.3

Vi t 36. " 1732+509 23.51 23.7 22.3-9.3 39.9-7.1

Vlt 312 " 358311307 43.5 + 1 5.0 35.7 + 3.4 91.7-31 .S

VIt C1’ " 452111045 54.2+19.2 10.516.3 84.1+14.3

Vlt Q” ·· 396-69 13.8+11 .0 13.1+4.9 34.7+8.1 15 Vir E " 3468r776 9.13-2.5 H.l+4.2 19.9+3.9

Fructose 50mM 20431854 lO.S+3.6 J5.I+4.7 23.5+3.2

Lactose “ 1128+662 13.3+2.9 19.612.5 21.7+6.1

Mannose " 4970+2270 24.9-11.7 14.3+1.9 16.9-25.4

Meli biose-· " 1242+474 30.2+7.7 91.7+10.9 124.5+22.5 20 Sorbitoi” " 1 3891307 38.3-19.1 22.9+4-5 91.7+13.5

Xylose " 1024+94) 5.2+1.9 19.5+7.1 21.4+5.4 se tabel 2.1 2 se tabel 2.1

Tabel 2.3

Effekter af reguleringsmolekyler på immunresponsen på oralt LTB (20 ) * 27 DK 171846 B1

Antl-gfcof Respons 5 R g^L’ierings- Dosis Serum Intestinal

MoUk/le IqG IqA IqG IqA

none - 1351+211 <4 <4 12.2+4.4

Vlt A 20^g 4705+676 <4 <4 21.1+7.6 VIt Bl -O " 1782+3C9 <4 <4 16.0+2.1 10 Vlt 32 " 3565+508 <4 <4 16.013.7

Vlt B62 " 9.18+1.1 <4 <4 <4

Vlt B12 " 1024+116 <4 <4 24.2+11.9

Vlt C " 337+206 <4 <4 16.1+5.0

Vlt D " 4097+74 <4 <4 13.5+2.2 15 Vlt E " 194+64 <4 <4 13.4+3.6

Fructose 50mM 6208+1192 <4 <4 10.5+3.3

Lactose2 " 5.0+1.0 <4 <4 <4

Mannose " 4096+658 <4 <4 24.2+8.1

Mel i biose " 512+76 <4 <4 8.0+4.0 20 Sorbitol2 " 8.0+1.2 <4 <4 <4

Xylose " 5404+2211 <4 <4 21.1+9.2 se tabel 2.1 2 se tabel 2.1 28 DK 171846 B1

Tabel 2.4

Effekt af oralt indgivne reguleringsmolekyler på immunresponsen på oralt antigen (K99)*

Requiring«;- Daø 21 Immun respons per dosU (’^g". mM*) 5 Molekyle 0.) 1.0 10 50 100 500 1000

Serum IcG

VI t 312 256 675 1175 1552 2252 nd 2352

Vi t C 512 391 533 675 1024 nd 691

Vir 0- 553 533 775 8$1 1 782 nd 8S' 10 Mel iblose 123 255 675 4096 S4'0 25° nd

Serum IgA

Vit 512 <4 <4 4.0 5.2 nd <4

Vi t C <4 <4 4.0 16.0 18,0 n<j 15‘°

Vi - D <4 <4 <4 <4 <4 nd <4 75 Mel i b i ose <4 <4 <4 4.0 4-^ 4’^ nd

Intestinal IcG

Vit Bl2 <4 <4 *4 <4 <4 nd <4

Vit C <4 4.0 16.2 32.0 3a·1 nd 33'°

Vit 0 <4 <4 <4 <4 <4 nd <A

20 Me 1 i bios a <4 <4 <4 4.0 4-3

Intestinal IcA

Vit 312 <4 <4 <4 <4 5·2 nd 13,5

Vit C <4 <4 4.0 16.0 36-7 nd 73··5

Vit 0 <4 <4 4.0 8.0 13·9 nd 24,2 25 Me1 ibicss 5.2 4.0 4.0 4.0 9·2 4·0 n0 "i dosis ivitaminer; + , dosis i mM/ sukkerarter * se tabel 2.1 29 DK 171846 B1

Tabel 2.5

Effekt af oralt indgivne reguleringsmolekyler på immunresponsen på oralt antigen (987P)

Caq 21 Immun respons :er dosis (ug“,mM-o ν' 5 2aaulfcn*3S- molekyle 0.1 1.0 10 50 100 500 1000

Serum IgG

Vi t A 512 675 383 391 675 nd 583 VI: C 351 1351 4096 6192 3192 nd 9410 10 VI- D 2-352 2048 256 73 147 ηα Ϊ351

Mel i bi ose 512 431 463 1250 1006 1292

Sorbitol 373 1133 1024 )A00 2123 35 nd

Serum IgA

V!: A <4 <4 16.0 iO.O 36.0 nd 64.0 15 V‘: C 4.0 4.0 32.0 66.0 73.1 nd 85.7

Vs: D 64 16.0 16.0 16.0 23.0 nd 38.» .ye i i biose nd nd nd nd na nd nd

Sorbitol nd nd nd nd nd nd nd

Intestinal IgO

20 vit A <4 <4 4.6 17.2 16.1 nd 15.3

Vi t C <4 <4 16.0 6.0 5.2 nd »5.0

Vi: D <4 <4 <4 12.2 14.6 nd 14.0

Meiibiose 5.0 27 75 76 38.3 4.3 nd

Sorbitol 50 74 64 93 294 257 nd

25 Intestinal IgA

Vi: A <4 <4 4.0 25.9 32.1 nd 16.0

Vi t C <4 4.6 55 237 1024 nd 776 vit 0 <4 <4 16.0 147 25.2 nd 36.7

Mel i b i ose 7.5 39 65 159 58.0 16.0 nd 30 Sorbitol 52 51 67 111 178 180 nd ~ , dosis i ug, vitaminer; +, dosis i mM, sukkerarter * se tabe l 2.1 30 DK 171846 B1

Tabet 2.6

Effekt af oralt indgivne regulerings molekyter på immunresponsen på oralt antigen (LTB)*

Dag 21 Immun respons per dos!a (ug~,mM+) 5 Recjvi eri*g&- molekyle 0.1 1.0 10 50 100 500 10C0

Serum IgG

Vi t 36 2352 50*3 55.7 10.5 4.6 nd 4.0

Lactose 1782 1782 73.5 6.9 4.0 4.0 nd 10 Sorbitol 1024 256 18.3 13.9 4.0 4.0 nd

Serum IgA

Vit 36 <4 <4 <4 <4 <4 nd <4

Lactose <4 <4 <4 <4 <4 <4 nd

Sorbitol <i 1.4 <4 <4 <4 <4 nd

15 Intestinal IgG

Vit 56 <4 <4 <4 <4 <4 nd <4

Lactose <4 <4 <4 <4 <4 <4 nc

Sorbitol <4 <4 <4 <4 <4 <4 np

Intestinal IgA

20 Vit 66 5.6 <4 <4 <4 <& nd <4

Lactose 4.0 4.0 <4 <4 <4 <4 nd

Sorbitol 4.0 <4 <4 <4 <4 <4 nd dosis i ug, vitaminer; +, dosis i mM, sukkerarter * se tabel 2.1 31 DK 171846 B1

Tabel 2.7

Effekt af variation af dosis af samtidigt indgivne reguleringsmolekyler på immunresponsen på intramuskulart prisenteret antigen K99, 987P* 5 Dag 2l Immun respons

Antigen (U*wi 5i vet molekyle (u9} O.l l.O ’0 50 ICO 1C00

(s) IgG

10 '<35 Vi: 312 1121 U6S 1572 2323 A755 2109 •<3? VU D 1024 1272 1163 1372 1435 U15 S87·3 V1t C 1637 152? 1707 1700 1562 1651 (mM) 0.1 1.0 10 50 100 500

(s) IcG

15 <55 Mel i bl©S3 ' 024 1175 1057 1392 1252 =39 5S7P Me Ibiose 1553 1621 Ϊ 701 1515 1666 1621 537P Sorbitol ·670 1577 1543 1532 |7|| 1551 + intet serum IgA, intestinal IgG eller intestinal IgA ' detekteredes.

20 * se tabel 2.1 EKSEMPEL 3

De to foregående eksempler viste, at små doser af oralt indgivne mucøse immunogener har evnen til at inducere signifikante serum IgG titreringer med eller uden en paral-25 lel stigning i sekretorisk IgA antistofniveauer. Endvidere viste det sig, at immunresponsen kan tilpasses ved samtidig indgift af reguleringsmolekyler. Det resultat, at lectiner-ne, der anvendtes i det første studium, var i stand til at fungere som barere til påvirkning af en anti-DNP respons 3q antydede, at potentialet findes for i det mindste nogle af disse mucøse immunogener for at virke som "barere" for andre antigener og forbedrer derfor forholdsvis ringe op- 32 DK 171846 B1 tagelse af de fleste antigener tværs over det intestinale epithelium.

Det følgende studium var beregnet på at undersøge, hvorvidt dette bærerpotentiale eksisterer, og at etablere nogle af 5 de forskellige parametre for dets vellykkede brug som et middel til formulering af nye og mere effektive orale vacciner og/eller oralt indgivne medikamenter.

Materialer og metoder

Konjugerinq af antigener til mucøse immunogener 10 Dinitrophenylering af bærere DNFB reageredes med lectiner og bærer som beskrevet ovenfor (se generelle fremgangsmåder).

Lipopolysaccharid (LPS) og polysaccharid (PS konjugation) S. typhimurium LPS og PS rensedes som beskrevet ovenfor 15 (medfølgende eksempler). LPS og PS sammenkobledes med MI under anvendelse af periodat-fremgangsmåden, se Avtameus og Ternynck, 1971 .

Glutaraldehydsammenkobling

Leutiniseringshormonfrigi vende hormon (LHRH), bovin serum-20 albumin (BSA) fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss. og S. thphimurium flagella sammenkob ledes individuelt med MI under anvendelse af totrinsglut araIdehydfremgang s måden ifølge Ayrameus et al (1978). Kort fortalt reageredes det krævede protein med 0,2 procent g lutaraIdehyd i 2 timer 25 ved R.T. Proteiner dialyseredes natten over mod carb/bi-carb buffer pH 9,5 efterfulgt af tilsætning af MI ved molære forhold på 5, 10, 20 og 40:1, antigen:MI som krævet og reageret i 24 timer ved RT. Endelig tilsattes ethancla-min fra Sigma til en endelig koncentration på 0,1 M (1 time, 30 RT) efterfulgt af dialyse natten over ved 4C mod 0,1 M carb/bicarb buffer pH 9,5.

Peroxidase konjugerede lectiner commercielle præparater af peroxidase konjugerede til lec-ti nerne fra glycin max, arachis hypogea, tet ragonolobus 35 purpureas og conconavalin A fra Sigma.

Kemisk syntese af LHRH conjugater 33 DK 171846 B1 LHRH konjugeredes til LTB under anvendelse af g lut araIdehyd-proceduren skitseret ovenfor. 61ut ara ldehyd-akti ve ret LHRH tilsattes til LTB i et forhold på 20:1 LHRHrLTB og tillodes at sammenioble 0/N ved stuetemperatur. Det resulterende 5 konjugat dialyseredes extensivt mod 0,1 M carb/bicarb buffer pH 9,5 før indgift. Kontroller bestod af LHRH eller LTB som var behandlet med glutaraIdehyd alene.

Tabel 3.1

Anti stof respons på DNP-modøficerede mucøse immunogener 10 Immunogen Dosi'· Immun raspens * (ug) Anti-DNP Anti-bce^er

serum IgG Int IgA serum IgG Int IcA

<99 20 <4 <4 875—62 3.9*5.1 <39 100 <4 <4 1351-123 16.7*2.3 15 DNP5.K99 20 21*10.5 <4 64*7.2 <4 ONP18.K99 500 1024*77 42*9.6 123=27.4 76*12.5 0NP1.3.X99 500 1176*164 28*14.4 3565*192 38*21.0 987? 20 <4 <4 891*76 27.3*13.5 337P 100 <ά 1024=39 84*22.4 20 DNP6.937? 20 24*3-1 <4 147=12.2 <4 DNP25.937? 500 1024*144 14*3.1 111*34. 1 63*19.2 ONP2.5.987? 500 1351=156 7*1.4 2043*166 128*38-4 LT3 20 <4 <4 1361*211 12.2*4.4 DNP2.3.L75 20 24.3*5.6 <4 445=35 <4 25 iT3 100 <4 <4 891=56 4.0 DNP63SA 20 <4 *4 *4 <4 DNP6BSA 100 <4 <4 <4 <4

Con A** 20 666*34 <4 nd r.d PH-aii togen'· 20 641*119 <4 nd nd 30 L. cullnaris·* 20 954*43 <4 nd nd H. pomatia** 20 591*127 <4 nd nd DK 171846 Bl 34 P. vulgaris** 20 1373—110 4.3=2.3 nd nc G. max** 20 1529=53 3.1=5.9 nd na A. hypogea** 20 1276=242 <4 nd nc U. eurppeus** 20 1533=94 <4 nd na 5 1 2 Den reciprokke af anti serumopløsni ngen, som gav en ELISA-udlæsning p§ 0,5 efter 45 min ved 37C. Hver værdi repræsenterer middelværdien af 5 mus - standard afvigelse.

** hver lectin substitueredes med 4 DNP grupper.

Tabel 3.2 ^ q Bærerpotentiale af K99 for forskellige antigener

Immun Respons 1

Immunogen Moleer Dosis Antigen Ecener

Forh^icL (Wg) Serum IgG Int IgA Serum IgG In' IgA

K99 - 20 <4 <4 375-52 3-9+3·' 15 <99 - 100 <4 <4 135'-94 16-7+2.3 3SA-<39 1:4 20 <4 <4 <4 <d 3SA-<99 1:5 500 <4 <d 73.5+Π.2 <d SSA-<99 1:10 500 <4 <d 147±43.2 <d 3SA-<39 1:20 500 222-47 126-29.2 3803+226 04^16-3 20 3SA-K99 1:40 500 73+19.6 44,7.5 3176^39» 64+Π-5 r lag-<99 1:S 20 <4 <d <4 <4 LPS-09 1:1** 20 <4 <d <♦ <4 PS-<99 1:1** 20 <4 <d 229+101 5-2-2.3 3SA 20 <4 <4 25 F1 age 11 ae - 20 <4 <4 LP S - 20 12.1+2.7 <4 PS - 20 <4 4.2+0.4 se tabel 3.1 2 forhold baseret pS vægt 35 DK 171846 B1

Tabel 3.3 Bærerpotenti ale for 987P for forskellige antigener

Immun Respons *

Immunogen Molær Dosis Antigen Hctrer

5 Forhold. (Ug) Serum IgG Int IgA Serum IgG int IgA

987P - 20 <4 <4 391*75 27.3*13.5 987? - 100 <4 <4 1024*33 84*25.7 SSA-937? 1:4 20 <4 <4 84-2.6 *4 BSA-387? 1:5 SCO <4 <4 256-49 <4 10 BSA-9S7? I : 10 5C0 29.3*7.4 4.6=2.2 675*110 <4 8SA-9373 1:20 SCO 206*33 122*47.6 4263^408 \94+38.6 3SA-987? 1:40 ECO 124-47 110*23.4 4705*521 156+55

Flig-9373 1:5 20 1552*351 <4 LPS-937P 1:1·· 20 <4 <4 194*23.5 *4 15 PS-987? I:!’* 20 <4 <4 327-96 5-2r6.8 SSA 20 <4 <4

Flage!i ae - 20 <4 <4 _ IPS ‘ - 20 12.I+2.7 <4 PS - 20 <4 4.2+0.4 20 * se tabel 3.1 ** forhold baseret pS vægt

Tabel 3.4

Effekter af ændring af dosering af substitueret bærer p8 i mmunresponsen 25 Antigen Dosis Immun Respons (Serum IgG)' (Ug) Anti-SSA Anti-Bisrer BSA0.03.X99 70 13.9*4.4 776*143 BSA0.03.K99 140 36.7*14.5 1782*174 BSA0.03.K99 230 73.5-22.1 1989*215 30 BSA0.05.987P 70 36*2.6 891*109 BSA0.05.987P 140 168*23.7 1552*176 BSA0.05.987P 280 337*43.7 2042*180 * se tabel 2.1 36 DK 171846 B1

Tabel 3.5

Effekt af kemisk konjugeret LHRH-LTB på reproduktive organer i hunmus*

Konjggat Kobling Indgifts- Dosis Nr. Krop Ovarier kropsvægt måde i procent 5 l^g^mus vægt ♦uterus C+U/tot LHRH-LT3 glut os/os 20 5 21.19 0.03 0.I77.

LHRH-L73 glut os/os 50 5 21.16 0.04 0.23% LHRH glut os/os 50 6 20.12 Q.11 0.62% 10 LT3 glut os/cs 50 3 13.13 0.14 0.76% LHRH-LTs glut i .71/ i m 50 δ 20.15 0.16 0.97% LHRH, lr3 mix os/os 50 7 27.22 0.15 0.55% LHRH.LTS mix im/im 50 7 30.07 0.2S 0.73% LT3 - os/os 50 7 23.25 0.2* 0,877.

15 - - os/os - 5 13.15 0.16 0.82% * dyrene modtog antigen på dag 0 og dag 14. På dag 28 blev musene dræbt og deres reproduktive system vejet.

Tabel 3.6

Effekt af genetisk konstrueret LHRH konjugater på reproduk-20 tive organer af hunmus.

Xonjugat Indgifts- Dosis Krops- Ovarier pct. krops- måde (Mg) vægt uterus O-U/tCt* ν*9* 3—gal - < L.-iRh) 3.5 im/im 20 19.47 0.10 0.43 8-gal-(LHRH'3.5 Im/im 20 18.44 0.10 0.56 25 3-gal-iLHRH)3.5 im/im 50 19.39 0.10 0.54 LT3-<LHRH)2.5 os/os 20 19.35 0.08 0.59 LHRH os/os 20 19.34 0.10 0.44 LHRH Im/im 20 19.39 0.15 0.76 im/im - 17.74 0.08 0.46 30 * os/os - 18.63 0.11 0.60

For alle intramuskulære injektioner indgaves antigener i montanid. im/im kontroller modtog montanid/salin-blandinger .

* Dyr modtog antigen på dag 0 og dag 14. På dag 28 dræbtes musene og deres reproduktive system blev vejet.

37 DK 171846 B1

Gentisk fusion af LHRH til B-galactos i da se og LTB KONSTRUKTION AF EN PLASMIDVEKTOR, DER EKSPRESSERER ET SAMMENSMELTET LTB/LHRH HYBRID POLYPEPTID

1. DNA fragment indeholdende LTB kodningssekvenser 5 Et Hind III fragment opnåedes fra en pBR322 baseret plasmid indeholdende det klonede LTB gen ifølge Leong et al, 1985 fra plasmidet NP307 i E. coli stamme RC411, se Dallus et al, 1979, som var modificeret under anvendelse af et Spe I bindingssted nær stopcodon'et for LTB og derefter mungbøn~ 10 nenucleasedi gestion under anvendelse af standardbetingelser. Med mindre andet er angivet er de betingelser, der anvendes til standardrekombinant DNA teknikker og nucLeinsyremodi-ficeringsenzymer de samme som beskrevet i Molecular Cloning, A Laborabory Manual, Man i atis, Fritsch and Sambrook, 15 Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Dette eliminerede stop-codon, der normalt fandtes efter aminosyre 123 i LTB, fjernelse af 9 basepar af DNA og tilfældig dannelse af et Hind III bindingssted som vist nedenfor:

Η III

20 Η III Ile Ser Met Lys .

4· *

LTB kodninqssekvens ATC AGT ATG AAA. GCTT

o . ___ . 121 122

Størrelse = 573 bp

Dette fragment ligeredes til vektoren pUC13 ifølge Messing, 1983 efter Hind III digestion og phosphatasebehandling af 25 _ plasmidet ifølge standardbetingelser. Dette tjente til placering af den overskydende polybinderregi on af pUC13, indbefattende et PstI, Sall, Xbal, BamHl, Smal, SstI og EcoRI bindingssted nedenfor LTB sekvensen indeholdende DNA inserten.

30 2. Dannelse af syntetisk LHRH kodningsoligonucleotider

To oLigonucleoti der med 30 baser i længden med sekvenser som beskrevet i A og B nedenfor, var indrettet til at danne overlappende hybridduplexer som vist i C, hvilket resulterer i et duplex som vil indkode lineær ende-til-ende gentagel-35 ser af de 10 aminosyrer, der indkoder peptidhormonet LHRH, se Schally og Coy, 1983, Role of Peptides and Proteins in 38 DK 171846 B1

Control of Reproduction, McCann og Dhindsa eds, Elsevier Science Publishing Co, Inc., pp 89-110. I denne sekvens erstatter glutam i nsyre den normale N-terminale poryglutamin-sy re.

5 A. 5' 6AG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG 3' B. 5' GTA GGA CCA GTG CTC CCC GGG TCG AAG GCC 3' C * i A i i A i l..A .1 1 _ i I I .

B B etc .

Oligonucleotiderne fældedes sammen i 1 time ved 40°C i 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, endefyldtes med Klenow, og 10 derpå ligeredes blandingen i Smal skæring M13 mp18 under standprocedurer. M13 fag indeholdende inserter isoleredes, og DNA sekvenserne af inserterne bestemtes ved dideoxytek-' nikken. En rekombinant betegnet som P29 valgtes til den sammensmeltede konstruktion.. Dens DNA sekvens sammen med 15 de aminosyrer, den indkoder, i området af inserten ved Smal bindingsstedet er angivet nedenfor.

N-terminus af beta-galacto s i dase , alpha-fragment Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Leu Arg

ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC CTT CGA

20 EcorI

Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

CCC GGG GAG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG

<=-—-1---*

Clu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp 25 GAG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG GAG CAC TGG

ζ------> <->

Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr

TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC

— 3 ----—> Hindi 30 DNA sekvensen bekræftede insertionen af DNA fra de syntetiske o I igonucleoti der til anbringelse af en in-ramme fusion 39 DK 171846 B1 af ca. 3 og en halv gentagelser af LHRH indkodningssekvensen (34 aminosyrer). De komplette LHRH kodningsblokke er vist med pile.

Den replikat i ve fra DNA af P29 var digesteret med EcoRI og 5 Hindi (bindingssteder indikeret i DNA sekvensen ovenfor), og endefyldt under standardbetingelser. Det lille 140 baseparfragment isoleredes fra en polyacry lamidge l.

3. Konstruktion af LTB/LHRH fus i onsvektor . pUC13 plasmidet indeholdende LTB kodningssekvensen insat i 10 Hindlll bindingsstedet, se sektion 1 ovenfor, digesteredes med Sall, endefyldtes og phosphataseredes under standardbetingelser. Vektor DNA ligeredes til det endefyldte EcoRI/ Hindi fragment fra P29, se sektion 2 ovenfor. Fusionen bør have aminosyresekvensen nedenfor.

15 aal - 122 (lys)-ala-trp-ala-ala-gly-arg-asn-ser-ser-ser-val-pro-LTB kodningssekvens.

ley-arg-pro-gly- gly-his-t rp-se r-tyr-gly-leu-arg-pro-g lyj^-

LHRH

g ly-asp-pro-leu-glu-ser-arg-leu.

20 Oer er en stop codon 24 baser under LHRH sekvensen, som definerer produktionen af et 176 aminosyrepolypeptid med 122 aminosyrer fra LTB, 34 aminosyrer, der indkoder LHRH-gentagelsen, og yderligere 20 aminosyrer afledt af de tilstødende regioner.

25 Den korrekte konstruktion undersøgtes ved digestering af DNA fra minpreps med Eco RI og søgning efter plasmi der med et passende større Eco RI fragment. De formodede positiver undersøgtes endvidere for ekspression af dette polypeptid, drevet af lac promoteren af pUCl3. Bakterieekstrakter ana-30 lyseredes p9 polyacrylamidgeler efterfulgt af overførsel til nitrocellulosepapir og Western blotting med kaninanti-sera rettet mod et LTB og LHRH konjugat. Et peptid af den 40 DK 171846 B1 forventede størrelse detekteredes ved begge antisera.

4. Konstruktion af ekspressionsplasmid K66 og ekspressions-stamme BTA1185.

Et 573 bp Eco RI fragment af pUC13 LTB-LHRH fusionsplasmid 5 beskrevet i 3/ som indeholder LTB-LHRH fusionskodnings regionen i sin helhed, isoleredes fra en agarosegel og l i gere d e s til Eco RI skaring, phosphataseret ekspres s i on s vektor PKK223-3 fra Pharmacia. Det resulterende ekspressionsplas-mid PBTA K66 anbragte ekspressionen af fusionsproteinet un-10 der tac promoterens kontrol, hvor ekspression induceres med IPTG. Plasmidet transformeredes til E. coli varts-stamme JM101 (SupE, thi, (lac-pro AB) F 1 traD36, proAB laclq Z M 15)for at give vartsvektoren ekspressionssystem BTA1185.

15 5. Produktion og rensning af LTB/LHRH fusionsprotein til dyreforsøg.

LTBCLHRH)^ ^ producerende stammer dyrkedes som beskrevet ovenfor. Efter induktion med IPTG i 2 timer pelletteredes bakterierne ved centrifugering ved 3000 x g i 10 minutter 20 ved 4°C. Bakterierne resuspenderedes derpå i dHgO og lyse redes i en fransk presse. Efter fjernelse af bakterieaffald ved centrifugering ved 18000 x g i 10 minutter ved 4°C tilførtes supernatanten til en agthio-galactose-søjle fra Sigma. Fusionsproteinet elueredes med 0,5 M galac-25 tose og dialyseredes mod 0,1 M carb/bicarb buffer pH 9,5.

Antigenindgift og måling af immunrespons

Alle fremganngsmåder til oral presentation, antistofindsamlinger og ELISA bestemmelser var som beskrevet ovenfor.

RESULTATER

3q Demonstration af barerpotentialet i mucøse immunogener

Alle de mucøse immunogener, der testedes, udviste evnen til effektiv transport af det covalent bundne hapten 0ΝΡ tvårs over tarmslimhinden og at fremkalde en serum anti-DNP

41 DK 171846 B1

Ab respons efter tilførsel af di nitrophenyleret-MI.

DNP-modificeret BSA var imidlertid helt ineffektivt i fremkaldelse af en anti-DNP eller anti-BSA respons, når det tilførtes i de testede koncentrationer, se tabel 3.1.

5 Indledende eksperimenter, hvor K99 og 987P sammensattes til langt større molekyler end DNP, var ikke i stand til at frembringe immunrespons til hverken det mucøse immunogen eller til det molekyle, der var sammenkoblet dermed, se tabellerne 3.2 og 3.3, muligvis på grund af sterisk inter-10 ferens i bindingen af poli til det mucøse epithelium. Det besluttedes derfor at variere forholdet af antigen til MI.

Når forskellige forhold BSAtpili testedes, fandtes det, at når der tilførtes forhold på mere end 1:20 BSArpili, var det ikke muligt at frembringe hverken anti-BSA eller 15 anti-pili responser, heller ikke med en dosis på 500 ug, hvilket viste, at det ikke var muligt for komplekserne effektivt at associere med deres mucøse epithelium og derfor frembringe en immunrespons. Når forhold på 1:20 og 1:40 benyttedes, observeredes imidlertid gode responser 20 på bode BSA og pili, se tabellerne 3.2 og 3.3. Støreisen af immunresponsen varieredes ved andring af doserne af det tilførte kompleks, se tabel 3.4.

Oral indgift af LHRH sammensat til LTB førte til en signifikant reduktion i den samlede uterin- og ovarievægt hos 25 hunmus, der fik enten 20 eller 50 ug LHRH-LTB (P 0,05), se tabel 3.5, 3.6. Der observeredes intet sådant vægttab med hverken LHRH eller LTB alene eller sammen eller til intramuskalær injektion af LHRL-B-galactosidase LHRH—LTB eller frit LHRH. Effekten af vægttabet kunne 30 også observeres udviklingsmæssigt, idet der var fuldstæn digt fravær af modne follikler i ovarierne, og dyrene var således effektivt "kastrerede". Der var en mindre reduktion i vægten af de reproduktive områder, når musene tilførtes det genetisk konstruerede LTB-(LHRH)j ^ fusions-35 protein, se tabel 3.6, men i dette eksperiment var reduk- .42 DK 171846 B1 tionen ikke signifikant ved de anvendte doser.

Eksempel 4

Induktion af celleformidlet immunitet efter oral indgift af antigen.

5 Tilførsel af mucøse immunogener viste sig at være effektive til fremkaldelse af humorale responser som målt ved produktionen af serum og intestinale antistoffer. Det var ikke kendt, hvorvidt der var en ledsagende stimulering af en celleformidlet immun (CMI) respons på de mucøse 10 immunogener.

Det følgende studium er beregnet på at sammenlignet det CMI, der dannes ved oral præsentation af et mucøst immunogen med det, der dannes ved klassisk subcutan (s.c.) injektion af antigen i Complete Freund's Adjuvant (CFA).

15 F remgangsmåde r

Hanmus C57B1/6J immuniseredes ved tilførsel af 20 ^g antigen i 0,1 M carb/bicarb buffer pH 9,65 eller ved injice-ring af 20 jllg antigen i CFA s.c. Kontroller modtog kun buffer eller adjuvant. Syv dage efter immunisering i n j i — 20 ceredes mus i venstre bagbens trædepude med 10 g anti gen i 20 yu.1 salin og injiceredes med 20juk salin alene i højre forbens trædepude. Efter yderligere 24 timer måltes forskellen i tykkelse mellem venstre og højre bagbens trædepuder med et micrometer.

25 Resultater

De i tabel 4.1. viste resultater viser, at der dannes en god cellulær immunrespons efter oral tilførsel af enten 987P eller LTB mucøse immunogener. Faktisk var responsen overraskende høj, eftersom den kun var lidt mindre end den, 30 der dannedes ved s.c. injektion af disse antigener i CFA.

43 DK 171846 B1

Tabel 4.1

Dannelse af ce l leformidiet immunrespons efter oral prasen-tation af mucøse immunogener

Immuniseringsmåde 5 Antigen Kontrol Oral Subcutan 987P 11 ί 2 31 - 6,6 38 - 5 LTB 5 - 4^5 14 - 3,7 26 - 5/8 * Resultaterne reprasenterer forøgelsen af tradepudestør-relsen efter immunisering med antigen. Resultaterne er mid-Ί0 delvardien af 5 mus - standardafvigelse.

INDUSTRIEL ANVENDELSE

Industrielle anvendelser af opfindelsen omfatter fremstilling af orale medikamenter til indgift i hvirveIdyrsvarter.

Potentielle vaccinemodtagere af oral vaccine 15 Allergener: Forskellige graspollen: rug.

Ukrudtspollen: kløver/ skrappe Trapollen: ask/ cypres Plantepollen: gyvel

Epitheler: kattehår, hundehår, svinebørster 20 Forskelligt: husstøv, hvedeavner, kapok.

Hormoner: LHRH, FSH, HGH, inhibin Vacciner: Haemagglutuniner fra

Influenza, mæslinger, røde hunde, kopper, gul feber, difteri, stivkrampe, kolera, 25 pest, tyfus, BCG, haemophilus influenzae,

Neisseria catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Pneumococci, streptococci esp. S. mutans.. E. coli. N. Gonorrhoeaer N. Meningitis, N. catarrhalis, Tersinia sdd..

30 Pseudomonas aerim.iJiQ.&a, Pseudomonas sdd.,

Moraxel la bovis. Bacteroides nnrin <;ng x Staph SDD., Str.ep SPP·., Bordefpl I a <φρ-*> 44 DK 171846 B1

REFERENCE

AVREMEAS, S., Ternynck, T. & Geudson, J._L. 1978 Coupling of enzymes to antibodies andantigens. Scand. J. Immunol. 8.

5 suppl. 7, 7-23.

AVRAMEAS, S. & Ternynck, T. 1971 Peroxidase labelled antibody and Fab conjugate with enhanced intracellular penetration. Immunochem., 8, 1175-1179.

10 BEFUS, A.D., and J. Bienenstock. 1982. Factors involved in symbiosis and host resistance at the mucosa-parasite interface. Prog. Allergy. 31 : 76.

15 BIENENSTOCK, J., and A.D. Befus. 1980. Mucosal Immunolo gy. Immunology, 41 : 249.

BLAKE. M.S., and E.C. Gotschlich. 1984. Purification and partial characterization of the opacity-associated proteins 20 of Neisseria gonorrhoeae. 159 : 452.

BLAND, P.W. & Britton, D.C. (1984) Morphological study of antigen-sampling structures in the rat large intestine. Infect. Immun., 43, 693-699.

25 CLARK, S., A. Cahill, C. Stirzaker, P. Greenwood and R. Gregson. 1985. Prevention by vaccination-animal bacteria, p. 481-487. In S. Tzipori (ed.) Infectious diarrhoea in the y-oung. Elsevier Science Publishers B.V.

30

Contey, J.R., and L.R. Inman. 1981. Diarrhea due to Escherichia coli strain RDEC-l in the rabbit. The Peyer's patch as the initial site of attachment and colonization. J. Infect. Dis. 43 : 440.

35 DALLAS et.al. (1979) Cistrons encoding Escherichia coli heat labile toxin J. Bact. 139 850-858.

45 DK 171846 B1 ELSON, C.O. & EALDING, W. (1984a) Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulation with cholera toxin. J. Immunol., 132, 2736-2741.

5 ELSON, C.O. & EALDING, W. (1984b) cholera toxin did not induce oral tolerance in mice and abrogated oral tolerance to an unrelated antigen. J. Immunol. 133, 2892-2897.

EVANS, D.G. & Evans, D.J. (1978) New surface-associated 10 heat-labile colonization factor antigen (CFA/II) produced by enterotoxigenic Escherischia coli of serogroups 06 and 08.

Inf. Immun., 21, 638-647.

De GRAAF. F.K., P. Klemm, and W. Gaastra. 1981. Purifica-15 tion, characterization and partial covalent structure of the adhesive antigen K99 of Escherichia coli. Infect. Immun. 33 : 877.

De GRAAF, F.K. & Roorda, I. (1882) Production, purifica-20 tion, and characterization of the fimbrial adhesive antigen F41 isolated from calf enteropathogenic Escherichia coli strain B41M. Infect. Immun., 36, 751-758.

FUJITA, K. & Finkelstein, R.A. 1972 Antitoxic immunity 25 experimental Cholera. J. Infect. Dis., 125, 647-655.

FUSCO, P., A. To. S. To, and C. Brinton, Jr. 1978. The purification and characterisation of four types of E. Coli pili and the specificity of E. coli pili for immunity coloni-30 zation and adhesion, p. 60-70. In C. Miller (ed.), Xllith U.S. Japanm Conference on Cholera, Atlanta, Ga., 1977. National institution of Health, Bethesda, Md.

GAASTRA, W., and F.K. de Graaf. 1982. Host specific fim-35 brial adhesion of noninvasive enterotoxigenic Escherichia Coli strains. Microbiol. Rev. 46 : 129.

46 DK 171846 B1 GAASTRA, R.A. (1975) Anattempt to identify the intestinal receptor for the K88 ashesin by means of a haemagglutination inhibition test using glycoproteins and fractions and sow colostrum. J. Gen. Microbiol., 86, 228-240.

5 GIBBONS, R.A. (1975) Anattempt to identify the intestinal receptor for the K88 ashesin by means of a haemagglutination inhibition test using glycoproteins and fractions from sow colostrum. J. Gen. Microbiol., 86, 228-240.

10 HANSON, D.G., VAZ. N.M. MAIA, L.C.S. & LYNCH, J.M., (1979) Inhibition of specicic immune responses by feeding protein antigens. J. Immunol., 123, 2337-2343.

15 HERBERT, D., P.J. Phipps, and R.E. Strange. 1985. Carbo hydrate analyses, determination of total carbohydrate, p. 265-279. In J.R. Norris, and D.W. Ribben (ed.), Methods in Microbiology, v. 5B.

20 ISAACSON, R.E., J. Colmenero, and P. Richter. 1981.

Escherichia coli K99 pili are composed of one subunit speci es. FEMS Microbiol. Lett. 12 : 229.

ISAACSON, R.E., and P. Richter. 1981. Escherichia Coli 25 987P Pilus. Purification and partial characterization. J.

Bacteriol. 146 : 784.

KLIPSTEIN, F.A., ENGERT, R.F., & SHORT, H.B. (1980) Protective effect of immunization with heat - labile entertoxin 30 in gnotobiotic rats monocontamintaed with enterotoxigenic Escherichia coli. Inf. Immunol., 28, 163-170.

LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 35 (Lond.) 227 : 680.

LE0NG et. al. (1985) Nucleotide sequence comparison between heat labile toxin B-ssubunit cistrons from Escherichia 47 DK 171846 B1 coli of human and porcine origin Infection and Immunity 48 73-77.

LEVINE, M.M., Rennels, M.B., Daya, V. & Hughes, T.P.

5 (1980) Haemagglutination and colonization factora in entero toxigenic and enteropathogenic Escherichia coli that cause diarrhea. J. Inf. Dis., 141, 733-737.

LITTLE, J.R. & Eisen, H.N. (1967) Preparation of immuno-10 genic 2,4-dinitrophenyl and 2,,4,6- triitrophenyl proteins.

In "Methods in Immunology and Immunochemistry" (Ed. Williams, C.A. & Chase, M.W.). I, p.128. Academic Press, New York.

MESSIER, B., and C.P. Le Blond (1960). Cell proliferation 15 and migration as recealed by radioautography after injection of thymidine -H3 into male rats and mice. An. J. Anat. 106 : 247.

MESSING (1983) New M13 Vectors for cloning Methods in En-20 zymology 101 20-78.

MORGAN, R.L., Isaacson, R.E., Moon, H.W., Brinton, C.C. & To, C.-C. (1978) Immunization of suckling pigs against enterotoxigenic Escerichia coli-induced diarrheal desease by vac-25 cinating dams with purified 987 or K99 pili. Inf. Immun., 22, 771-777.

MORRIS, J.A., C.J. Thorns, and W.J. Sojka. 1980. Evidence for two adhesive antigens on the K99 reference strain Esche-30 richia coli B41. J. Gen. Microbiol. 118 : 107.

MOWAT, A. Mcl., (1985) The role of antigen recognition and suppressor cells in mice with oral tolerance to ovalbumin. Immun., 56, 253-260.

35 MOWAT, A.McI. & PARROT, D.M.V. (1983) Immunological responses to fed protein antigens in mice. Immun., 50, 547-554.

48 DK 171846 B1

NGAN, J. & KIND, L.S., (1978) Suppressor T cells for IgE

and IgG in peyer's patches of mice tolerant by the oral administration of ovalbumin, J. Immunol., 120, 861-865.

5 PIERCE, NF. & Koster, F.T. (1980) Påriming and suppressi on of the intestinal immune response to cholera toxoid/toxin by parenteral toxoid in rats. J. Immunol., 124, 307-311.

PIERCE, N.F., SACK, R.B., & SIRCAR, B.K., (1977) Immunity 10 to experimental cholera. J. Inf. Dis., 135, 888-896.

RICHMAN, L.K., CHILLER, J.M., BROWN, W.R., HANSON, D.G. & NELSON, N.M. (1978) Enterically induced immunological tolerance. J. Immunol., 121, 2429-2434.

15 RICHMAN, L.K., A.S. Graeff, and W. Strober. 1981 Antigen presentation by macrophage enriched cells from the mouse Peyer's patch. Cell Immunol. 62 : 1100.

20 ROTHBERG R.M., KRAFT, S.C., & MCHALEK, S.M., (1973) Sy stemic immunity after local antigenic stimulation of the lymphoid tissue of the gastrointestinal tract. J. Immunol., Ill, 1906-1913.

25 RUSSELL-JONES, G.J., E.C. Gotschlich, and M.S. Blake.

1984. A surface receptor specific for human IgA on group B streptococci possessing the Ibc protein antigen. J. Exp. Med. 160 : 1467.

30 RUSSELL-JONES, G.J., and E.C. Gotschlich. 1984. Identifi cation of proterin antigens of group B streptococci, with special reference to the Ibc antigen. J. Exp. Med. 160 .

1476.

35 SALIT, I.E., M. Blake, and E.C. Gotschlich. 1980. In trastrain heterogeneity of gonococcal pili is related to capacity colony variance. J. Exp. Med. 151 : 716.

49 DK 171846 B1 SCHALLY and COY (1983). Stimulatory and inhibitory analogues of LH-releasing hormone: Basic and clinical studies in Role of Peptides and Proteins in Control of Reproduction McCann and Dhindsa eds. Elsevie Science Publishing Co. Inc..

5 pp89-110. Maniatis, Fritsch and Sambrook (1982) Molecular

Cloning, Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory.

SEVENNERHOLM, A.M. & Holmgren, J. 1978 Inditification of E. coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside im- 10 munosorbent assay (GM-1 ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1, 19-23.

TOMASI, T.B., (1980) Oral tolerance. Transplantation, 29, 353.

15 TONER, P.G., K.E. Carr, and G.M. Wyburn (1971). Intestine. In The Digestive System - An Ultrastructural Atlas and Review, Butterworths, London.

20 TSAI, C.M., and Frasch, C.E. 1982. A sensitive silver stain for detecting lopopolysaccharide in polyacrylamide gels. Anlal. Biochem., 119, 115-119.

175

Claims (30)

1. Kompleks omfattende: et immunogen, som er egnet til vaccinationsformål, bundet til et bærermolekyle, som er i 5 stand til specifikt at samvirke med det mucøse epithelium i en hvirveldyrsvært; hvorved både immunogenets immunologiske aktivitet og bærermolekylets evne til specifikt at samvirke med det mucøse epithelium i en hvirveldyrsvært i det væsentlige opretholdes og bærer molekylet er et mucøse 10 epithelium bindermolekyle udvalgt fra hele, en del af, en analog, homolog, derivat eller kombination deraf af et bakterielt athæsin, viral haemogglutinin, et toxin, eller den bindende underenhed deraf, eller et lectin, men ikke inkluderende et immunogenbærerkompleks, hvor immunogenet 15 binder naturligt til bærermolekylet.

2. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at immunogenet er udvalgt fra hele, en del eller dele af, en analog, homolog, derivat eller en kombination deraf af et 20 hormon, et terapeutisk middel, antigen eller hapten.

3. Kompleks ifølge krav 2, kendetegnet ved, at immunogenet er hele, en del af, analog, homolog, derivat eller en kombination deraf af et hormon udvalgt blandt FSH,

4. Kompleks ifølge kravene l eller 2, kendetegnet ved, at immunogenet er et allergen.

5 Staphylococci spp, Streptococci spp og Bordetella spp.

5. Kompleks ifølge krav 4, kendetegnet ved, at allergenet er et græspollen, ukrudtspollen, træpollen, plantepollen, kattehår, hundehår, svinebørster eller andet epithel eller husstøv, hvedeavner eller kapok.

6. Kompleks ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at immunogenet er et overfladeprotein afledt af influenza, mæslinger, røde hunde, kopper, gul feber, difteri, stivkrampe, kolera, pest, tyfus eller BCG-forårsagende midler, Haemophilus influenzae. Neisseria catarrhalis. DK 171846 B1 Klebsiella pneumoniae, pneumococci og streptococci; eller en pilus afledt af E. coli. N. aonorrhoeae. N. meningitidis. N. catarrhalis. Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas spp, Moraxella bovis. Bacteroides modosus.

7. Kompleks ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at immunogenet er et overfladepolysaccharid afledt af difteri, stivkrampe, kolera, pest, tyfus eller BCG- 10 forårsagende midler, Haemophilus influenzae. Neisseria catarrhalis. Klebsiella pneumoniae, pneumococci og Streptococci.

8. Kompleks ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 15 ved, at immunogenet er et sekretorisk produkt afledt fra difteri, stivkrampe, kolera, pest, tyfus eller BCG-forårsagende midler, Haemophilus influenzae. Neisseria catarrhalis. Klebsiella pneumoniae, pneumococci og streptococci. 20

9. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bærermolekylet er det varmelabile toxin af enterotoxigenisk E. coli.

10. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den bakterielle philus er K99 eller 987P af E. coli.

11. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den bakterielle pilus er CPAI, CFAII, K88 eller F41. 30

12. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lectin er Conconavlin A, Pokeweed mitogen eller lectinet fra Lens culinaris. Helix ponatia. Glvcine max. Arachis hvpogea eller Ulex europeus. og hvor reguleringsmolekylet er 35 udvalgt fra vitamin A, vitamin Bl, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E, fructose, lactose, mannose, melibiose, sorbitol eller xylose. DK 171846 B1

13. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lectinet er Abrin, aspargesært, hestebønne, kamelfodstræ, castorbønne, favabønne, grøn havalge, håret vikke, horsegram Horseshoe crab, jackbønne, japansk blåregn, jequiritybønne, 5 skotsk guldregn, limabønne, limulin, lotus, europæisk mistelten, mungbønne, maclura, pagodetræ, haveært, kartoffel, rød havebønne, rød hav alge, sibirisk ærtetræ, spiselig snegl, havesnegl, ben vedtræ, sød ært, tomat, hvedespire eller vinget ært-lectin. 10

14. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det virale haemagglutinin er et haemagglutinin afledt af influenza, mæslinger, røde hunde, kopper eller gul febervirus. 15

15 DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af et bærermolekyle, som er egnet til at samvirke med det mucøse epithelium, hvilket bærermolekyle er et mucøst epithelium binder molekyle af hele, en del af, analog, homolog, derivat eller kombination deraf af et 20 bakterielt athæsin, viral haemagglutinin, et toxin, eller den bindende underenhed deraf eller et lectin, hvori immmunogenet og bærermole kylet danner et fusionspolypeptid, men ikke inkluderende et DNA molekyle, der kodes for et immunogenbærerkompleks, hvor iromunogenet bindes naturligt til 25 bærermolekylet.

15. Kompleks ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at immunogenet er hele, en del af, analog, homolog, derivat eller en kombination deraf af LHRH og bærermolekylet er hele, en del af, en analog, 20 homolog, derivat eller kombination deraf af LTB.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af et kompleks ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, hvilken fremgangsmåde omfatter: 25 (a) reaktion af immunogenet med et bærermolekyle til dannelse af nævnte kompleks, (b) kemisk modifikation af immunogenet til tilveje bringelse af mindst en funktionel gruppe, der er i stand til at danne en kemisk binding, og reaktion af immunogenet og 30 bærermolekylet til dannelse af komplekset, (c) kemisk modificering af bærermolekylet til tilvejebringelse af mindst en funktionel gruppe, der er i stand til at danne en kemisk binding, og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komplekset; 35 (d) kemisk modificering af immunogenet og bærer molekylet til tilvejebringelse af funktionelle grupper, der er i stand til at danne en kemisk binding, og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komplekset, DK 171846 B1 (e) reaktion af immunogenet ned mindst et bindingsmiddel og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komplekset, (f) reaktion af bærermolekylet med mindst et 5 bindingsmiddel og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komplekset, (g) reaktion af immunogenet og bærermolekylet med mindst et bindingsmiddel og reaktion af immunogenet og bærermolekylet til dannelse af komplekset, eller 10 (h) en kombination af ethvert af de foregående fremgangsmådetrin.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et kompleks ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvilken fremgangsmåde 15 omfatter: tilvejebringelse af et rekombinant DNA molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af immunogenet, en anden DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyresekvensen af bærermolekylet, og vektor DNA, transformering af en vært med 20 rekombinant DNA molekylet, således at værten er i stand til at ekspressere et hybrid, proteinøst produkt, som omfatter dette kompleks; dyrkning af værten til opnåelse af ekspressionen og indsamling af det hybride proteinøse produkt. 25

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et kompleks ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) kemisk syntese af immunogenet og/eller bærermolekylet 30 og dannelse af komplekset ved reaktioner ifølge fremgangsmåden i krav 16, eller (b) syntetisering af et hybridpeptid omfattende aminosyresekvenser af immunogenet og bærermolekylet.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at det syntetiserede immunogen eller bærermolekyle, medens det er bundet til den faste fase peptidsynthetisers harpiks, er koblet til bærermolekylet eller immunogenet, respektive. DK 171846 B1

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 og 19, kendetegnet ved, at det syntetiske peptid er hele, en del af, en analog, homolog, derivat eller 5 en kombination deraf af LHRH.

21. Ekspressionsprodukt af en transformant vært, kendetegnet ved, at den omfatter et kompleks ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3. 10

22. Transformant vært, der er transformeret med et rekombinant DNA molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for aminosyre sekvenserne af et immunogen, som er egnet til vaccinationsformål, og en anden

23. Transformant vært ifølge krav 22, kendetegnet ved, at værten er en gramnegativ bakterie, en grampositiv bakterie, en gær, svamp eller en højere eukaryotisk celle. 30

24. Rekombinant DNA molekyle omfattende en første DNA sekvens, som efter ekspression koder for en fusionspolypeptid omfattende aminosyre sekvensen af et immunogen, som er egnet til vaccinationsformål, og aminosyresekvensen af et 35 bærermolekyle, som er egnet til at samvirke med et mucøst epithelium bindermolekyle af hele, en del af, analog, homolog, derivat eller kombination deraf af bakterielt athæsin, viral haemagglutinin, et toxin, eller en bindende underenhed af et toxin, eller et lectin, men ikke DK 171846 B1 inkluderende et DNA molekyle, der kodes for et imrounogenbærerkompleks, hvor immunogenet bindes naturligt til bærermolekylet.

25. Rekombinant DNA molekyle ifølge krav 24, kendetegnet ved, at det også indeholder vektor DNA.

25 HGH, LHRH eller inhibin.

26. Medikament omfattende et immunogen, som er egnet til 10 vaccinationsformål, bundet til et bærermolekyle, som er i stand til specifikt at samvirke med det mucøse epithelium i en hvirveldyrsvært; hvorved både immunogenets immuhologiske aktivitet og bærermolekylets evne til specifikt at samvirke med det mucøse epithelium i en hvirveldyrsvært i det 15 væsentlige opretholdes, og bærermolekylet er et mucøse epithelium bindermolekyle udvalgt fra hele, en del af, en analog, homolog, derivat eller kombination deraf af et bakterielt athæsin, viral haemagglutinin, et toxin, eller den bindende underenhed deraf, eller et lectin, sammen med en 20 farmaceutisk acceptabel bærer eller dilnent, men ikke inkluderende immunogenbærerkomplekser, hvor immunogenet binder naturligt til bærermolekylet.

27. Medikament ifølge krav 26 til oral indgift. 25

28. Medikament ifølge krav 26 til nasal indgift.

29. Medikament ifølge et hvilket som helst af krav ene 26-28, kendetegnet ved, at medikamentet findes i 30 kapselform, tabletform, langsom frigivelsesform, eleksirform, gelform, pastaform eller næsesprayform.

30. Medikament ifølge et hvilket som helst af krav ene 26-29, som endvidere omfatter et reguleringsmolekyle, som 35 selektivt kan modulere størrelsen og/eller typen af immunresponsen til immunogenet af medikamentet. DK 171846 B1 I 5 10 Type 1 Ala-Ala-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Gly-Thr-Val-Hi $-Phe-Lys-Gly- K88 Trp-Met-Thr-Gly-Asp-Phe-Asn-Gly-Ser-VaUAsp-He-Gly-Gly- K99 Asn-Thr-Gly-The-Ile-Asn-Phe-Asn-Gly-lys-Ile-Thr-Ser-Ala- 987P AIa-Pro-Val-GIu-Asn-Asn-Thr-Cys-G1n-A1a-Asn-leu-Asp-Phe- Ne Isser I a Phe-Thr-leu-Ile-Glu-Leu-Met-Ile-VaMle-Ala-Ile-Val-Gly- 15 20 25 Type 1 Glu-Val-Val-Asn-Ala-Ala- K88 Ser-Ile-Thr-Ala-Asp-Asp-Tyr-Arg- K99 Thr-Cys-Thr-I1e-Glu-Pro-G1u-Ala- 987P Thr-Gly-lys-Val-Thr-Ala- x -Leu- Ne1sserla 11e-leu-Ala-Ala-Va1-A 1a-Leu-Pro- Fig.1 N-terminal amino add sequence of the 987? p1ljn Subun!t τ N-termlnal sequences of other pilin proteins are given for comparison.