DK170948B1

DK170948B1 - Ikke naturligt forekommende pseudorabiesvirus, vaccine indeholdende dette virus samt fremgangsmåde til serologisk skelnen mellem inficerede og vaccinerede dyr

Info

Publication number: DK170948B1
Application number: DK157087A
Authority: DK
Inventors: Leonard E Post; Darrell R Thomsen
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1985-07-29
Filing date: 1987-03-27
Publication date: 1996-03-25
Also published as: AU5994886A; US4810634A; ATE60799T1; HK32696A; NO871313L; CA1275625C; ES2001752A6; EP0231209B1; DK157087D0; DE3677494D1; CN1018845B; JPH08333279A; FI871362A; AU591145B2; WO1987000862A1; JP2559384B2; PH25776A; JP2738524B2; KR950000887B1; IE861996L

Description

o i DK 170948 B1

Opfindelsens område.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt, serologisk identificerbar virusvaccine. Vaccinen ifølge opfindelsen tillader, at man skelner mellem dyr, som er 5 inficeret med et virulent vildtypevirus, og dyr, som er blevet vaccineret, ved anvendelse af et serologisk distinkt virus til vaccinen.

Opfindelsens baggrund.

10 Pseudorabiesvirus (PRV) er en sygdom, som infi cerer mange dyrearter i hele verden. PRV-infektioner kaldes afvekslende infektiøs Bulbar-paralyse, Aujeszky's sygdom og gal kløe. Der kendes infektioner i vigtige husdyr, såsom svin, kvæg, hunde, katte, får, rotter og mink. Rækken af 15 værtsdyr er meget lang og omfatter de fleste pattedyr og, i det mindste ved forsøg, mange fuglearter (en detaljeret liste over værtsdyr findes i D.P. Gustafson, "Pseudorabies", i Diseases of Swine, 5. udgave, A.D. Leman et al., udgivere (1981)). For de fleste inficerede dyr er sygdommen dødelig.

20 Voksne svin og muligvis rotter dræbes imidlertid ikke af sygdommen og er derfor sygdomsbærere.

Svinebestande er især modtagelige for PRV. Skønt de voksne svin sjældent viser symptomer eller dør af sygdommen, bliver smågrise akut syge, når de inficeres, og 25 døden indtræder sædvanligvis i løbet af 24-48 timer, ofte uden specifikke kliniske tegn (T.C. Jones og R.D. Hunt, Veterinary Pathology, 5. udgave, Lea & Febiger (1983)).

PRV-vacciner er blevet fremstillet ved en række teknikformer, og vaccination i endemiske områder i Europa er 30 blevet gennemført i mere end 15 år. Tabene er blevet nedsat ved vaccination, men vaccinationen har opretholdt viruset i miljøet. Der er ikke blevet fremstillet en vaccine, som vil forhindre infektion. Vaccinerede dyr, som udsættes for virulent virus, overlever infektionen og spreder derefter 35 mere virulent virus. Vaccinerede dyr kan derfor huse en latent infektion, som kan blusseop igen (D.P. Gustafson, supra).

0 2 DK 170948 B1

Svækkede og inaktiverede vacciner for PRV med levende virus er tilgængelige kommercielt i USA og blevet godkendt af USDA (C.E. Aronson, udgiver, Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals (1983)) .

5 Da voksne svin er bærere af PRV, er der i mange stater indført undersøgelsesprogrammer til påvisning af inficerede dyr. Et problem opstår, når der skal skelnes mellem de dyr, som bærer virulent PRV, og de dyr, som er blevet vaccineret. Antigenprofilen af de virulente 10 viruser og af de viruser, som anvendes i vacciner, er den samme og derfor kan det være umuligt at skelne mellem inficerede og vaccinerede dyr. Som resultat heraf vil reguleringer med hensyn til overflytning af seropositive svin gælde for både vaccinerede svin og for svin, som 15 tidligere har været inficeret med PRV (C.E. Aronson, supra).

PRV er et herpesvirus. Herpesvira er i almindelighed blandt de mest komplekse dyrevira. Deres genomer koder for mindst 50 virusspecifikke proteiner og indeholder op imod 150.000 nucleotider. Blandt de mest immunologisk reaktive 20 proteiner i herpesvira er glycoproteinerne, som blandt andet findes i virionmembraner og membranerne af inficerede celler. Litteraturen om PRV-glycoproteiner refererer til mindst fire virale glycoproteiner (T. Ben-Porat og A. S. Kaplan, Virology, 41, side 265-273 (1970), A.S. Kaplan 25 og T. Ben-Porat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 66, side 799-806 (1970)) .

Det er rapporteret, at adskillige herpesvira udskiller glycoproteiner i mediet i inficerede celler. Herpes simplex-virus (HSV) frigiver glycoprotein C og adskillige 30 afskårne former af glycoprotein D i mediet (B. Norrild og B. F. Vestergaard, Intervirology, 11, side 104-110 (1979) , R.E. Randall et al., J. Gen. Virol., 48, side 297-310 (1980)). Marek's sygdom-virus frigiver en væsentlig mængde af virionglycoprotein A i mediet (D. Van Zaane et al., 35 Virology, 121, side 116-132 (1982)), og herpes saimiri--virus frigiver også et virionglycoprotein i mediet 0 DK 170948 B1 3 (R.E. Randall og R.W. Honess, J. Gen. Virol., 51, side 445-449 (1980) ) . PRV frigiver et glycoprotein i mediet, om hvilket det er rapporteret, at det ikke er inkorporeret i de virale partikler (T. Ben-Porat og A.S. Kaplan, 5 Virology, 41, side 265-273 (1970), T.J. Rea,et al., J. Virol., 54, side 21-29 (1985)).

Det PRV-protein, som udskilles i mediet, er blevet betegnet 3a (T. Ben-Porat og A.S. Kaplan, supra), og det er også blevet betegnet glycoprotein X (gX) 10 (T. J. Rea et al., supra). gX har følgende karakteristika, når det er isoleret fra PRV-inficerede celler: (1) det er det dominerende protein i kulturmediet med dyrkede, PRV-inficerede dyreceller, (2) det er et glycoprotein, 15 (3) det har en molekylvægt på ca. 95 kd på SDS-poly- acrylamidgeler, (4) det er et sulfateret protein, (5) det er opløseligt i ca. 1%'s perchlorsyre, og (6) det er immunogent i standardlaboratoriemus.

20 Den foreliggende opfindelse overvinder de ovenfor omtalte problemer, f.eks. ved undersøgelse af svin for PRV-infektion, ved tilvejebringelse af en PRV-stamme, som er immunologisk distinkt fra vildtypeviruset, således at det tillades, at man skelner mellem vaccinerede og 25 inficerede dyr, uden at det er nødvendigt at dræbe de afprøvede dyr.

Disse antigene forskelle er et resultat af fjernelse af glycoprotein X fra vaccineviruset. Som resultat af disse genetiske ændringer er det muligt immunologisk at skelne 30 mellem inficerede og vaccinerede dyr på basis af deres serologiske profiler, uden at det er nødvendigt at dræbe de afprøvede dyr.

35 0 4 DK 170948 B1

Litteraturinformation.

N.W. Wathen og L.K. Wathen, J. Virol., 51, side 57-62 (1984), refererer til et PRV indeholdende en mutation i et viralt glycoprotein (gp50) og en frem-5 gangsmåde til udvælgelse af den mutant, som udnytter et neutraliserende, monoklont antistof rettet imod gp50. Wathen og Wathen beskriver ikke anvendelsen af dette virus som vaccine. Desuden ville dyr, som er immuni-ceret med dette virus, være umulige at skelne serologisk 10 fra inficerede dyr.

T.C. Holland et al., J. Virol., 45, side 672-782 (1983) , refererer til antigene varianter af HSV udvalgt med glycoproteinspecifikke, monoklone antistoffer. Blandt de udvalgte varianter er to, som ikke kan eksprimere 15 HSV-glycoprotein gC. Holland et al. beskriver eller antyder heller ikke anvendelsen af disses varianter til vacciner.

EP-offentliggørelsesskrift nr. 0.133.200 refererer til en diagnostisk antigen faktor, som skal anvendes sammen med visse lectinbundne PRV-glycoproteinunderenhedsvacciner 20 til at skelne mellem bærere og ikke-bærere for PRV.

EP-offentliggørelsesskrift nr. 0.074.808 refererer til specifikke DNA-sekvensindsættelser, -fjernelser og -substitutioner i eukaryotiske cellegenomer eller virale genomer, hvilket gennemføres stabilt ved anvendelse af 25 udvælgelige DNA-sekvenser omfattende et herpesvirusthymidin-kinasegen. Blandt de genomer, som er anført som følsomme for manipulering, er PRV. En anden beslægtet offentliggørelse beskriver ligeledes lignende metoder ( L.E. Post og B. Roizman, "A Generalized Technique for Deletion of Speci-30 fic Genes in Large Genomes: a Gene 22 of Herpes simplex Virus 1 Is Not Essential for Growth", Cell, 25, side 227-232 (1981)).

De metoder, som er beskrevet i disse litteraturstedey anvendes ved fremstilling af PRV ifølge opfindelsen.

EP-offentliggørelsesskrift nr. 0.141.458 refererer til 35 fjernelsesmutanter af PRV. Fjernelserne sker ikke i et gen, som koder for et udskilt glycoprotein. Desuden er der i dette 0 DK 170948 B1 5 EP—offentiiggøreisesskrift hverken antydet eller beskrevet anvendelsen af sådanne mutanter til serologisk at skelne mellem en vaccinevirus og en vildtypevirus.

A. L.J. Gielkens et al., "Genome Differences Among 5 Field Isolates and Vaccine Strains of Pseudorabies Virus", J. Gen. Virol., 66, side 69-82 (1985), refererer til en sammenligning af genomerne i forskellige markisolater'og modificerede (levende virus)-vaccinestammer af pseudorabi-esvirus (PRV) ved BamHI-restriktionskortlægning. Det er 10 rapporteret, at der er observeret to typer af variationer, (1) additioner og/eller fjernelser af nucleotidsekvenser i fragmenter afledt af TR - og IR -regionerne i PRV-genomet

5 S

og (2) formindsket eller forøget antal BamHI-spaltnings-steder i genomets U -region. Det er nævnt, at analyse af 15 viralt DNA med restriktionsendonucleaser eventuelt kan tilvejebringe en fremgangsmåde til at skelne PRV-mark-stammer.

Det er nu blevet fastslået, at én af de PRV-vacciner, som i øjeblikket er kommercielt tilgængelige, indeholder en 20 fjernelse for det gen, som koder for glycoprotein I, som det også er fastslået af Mettenleiter et al., J. Virol., 56, side 307-311 (1985)). Det er også blevet vist, at en anden kommerciel stamme (Bartha) mangler gp63i Disse vacciner kan være værdifulde ved visse af udførelsesformerne for 25 den foreliggende opfindelse som beskrevet i det følgende.

B. Lomniczi et al., "Deletions in the Genomes of Pseudorabies Virus Vaccine Strains and Existence of Four Isomers of the Genomes", J. Virol., 49, side 970-979 (1984), refererer til karakteriseringen af to kommercielle 30 vaccinestammer af PRV (fra Bartha og Norden), idet de har vist,at de har fjernelser i den særegne korte sekvens af PRV-genomet mellem 0,855 og 0,882 kortenheder. Dette område ligger inden for BamHI 7-fragmentet i PRV. Der er imidlertid intetsteds i noget af disse litteratursteder beskrevet 35 eller antydet et PRV, som mangler et udskilt glycoprotein, en vaccine omfattende en sådan mutant eller en fremgangsmåde DK 170948 B1 6 til at skelne mellem et vaccineret og et inficeret dyr ved anvendelse af en sådan PRV-mutant.

US-patentskrift nr. 4.514.497 beskriver PRV-tk -fjernelser. Der er ikke beskrevet et PRV med fjernelser, 5 som tillader, at man serologisk skelner mellem dyr, som er inficeret med en virulent vildtypevirus, og dyr, som er vaccineret.

Resume af opfindelsen.

10 Som anvendt i nærværende beskrivelse refererer udtrykkene "hensigtsmæssigt inaktiveret virus" og varianter af dette udtryk samt "avirulent" begge til såvel dræbte som svækkede vira.

Som anvendt i nærværende beskrivelse refererer 15 "udskilt glycoprotein" til et glycoprotein, som samler sig i et medium med inficerede celler ved dyrkning.

Den foreliggende opfindelse angår et ikke naturligt forekommende pseudorabiesvirus, som er ejendommeligt ved, at glycoprotein X-genet er inaktiveret, især et virus, som har 20 en fjernelse i glycoprotein X-genet.

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen er et pseudorabiesvirus, som ingen funktionel thymidinkinase producerer, især et virus, som har en fjernelse i thymidinkina-segenet.

25 En speciel udførelsesform for opfindelsen er et pseu dorabiesvirus, også har en fjernelse i gp50-genet på dets oprindelige sted, og hvor gp50-genet er indsat inden i eller i tæt binding med thymidinkinasegenet.

Den foreliggende opfindelse angår tillige en vaccine, 30 som er ejendommelig ved, at den indeholder et her omhandlet pseudorabiesvirus.

Den foreliggende opfindelse angår endelig en fremgangsmåde til serologisk skelnen mellem dyr, som er inficeret af et virulent pseudorabiesvirus, og dyr, som er vaccineret 35 mod dette virulente pseudorabiesvirus med den her omhandlede vaccine, og den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig DK 170948 B1 7 ved, at forskellen i produktionen af antistoffer med glycoprotein X bestemmes ved en rutineundersøgelse, såsom den velkendte ELISA-prøve af serumprøver fra de respektive dyr.

Den her omhandlede vaccine og den her omhandlede 5 fremgangsmåde har den fordel, at de gør det muligt, at man serologisk kan skelne mellem vaccinerede og inficerede dyr, uden at det er nødvendigt at dræbe de afprøvede dyr.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen..

Det her omhandlede PRV er blevet fremstillet ved anven-10 delse af rekombinant DNA-teknik. Idet der gås ud fra et let tilgængeligt plasmid (pPRXhl, også kendt som pUC1129), som indeholder det gX-gen, som det ønskes at fjerne, sammen med et andet offentligt tilgængeligt plasmid (pACYC184), er der konstrueret et plasmid (pPRXK4), som bærer gX-genet 15 underklonet til bekvem manipulering. Derefter fjernes gX-promotoren fra pPRXK4, og den klones ind i et andet offentligt tilgængeligt plasmid, pUC9, til konstruktion af plasmidet pPGXl. Dernæst fjernes HSV-thymidinkinasegenet (tk-genet) fra plasmidet pRBl03, og det indsættes på et 20 sådant sted i pPGXl, at det knyttes til gX-promotoren til frembringelse af plasmidet pGXTK2. Derefter fjernes det BamHI 7-fragment i PRV, som indeholder den C-terminale koderegion i gX-genet, fra pPRXhl, og det indsættes med strømmen fra tk-genet i pGXTK2 til dannelse af et plasmid 25 (pGXTK3), hvori HSV-tk-genet er flankeret af PRV-gX-promo-toren og den C-terminale koderegion for gX-genet. Derefter co-transficeres kaninhudceller med et tk""-gX+-PRV og pGXTK3 (tk+-gX ) til frembringelse af et tk+-gX -PRV ved fremgangsmåden ifølge L.E. Post og B. Roizman, infra. Til 30 sidst omdannes tk+-gX--PRV til et tk~-gX -PRV for at svække viruset til anvendelse som vaccine. Det er også blevet påvist, at et sådant tk”-gx”-PRV er effektivt som vaccine imod pseudorabiessygdommen.

I nedenstående skemaer A-K er illustreret konstruk-35 tionerne ifølge den foreliggende opfindelse. Visse konventioner er anvendt til illustration af plasmider og DNA-fragmen-ter som følger: DK 170948 B1 0 8 (1) Enkeltliniefigurerne repræsenterer såvel cirkulær som lineær, dobbeltstrenget DNA.

(2) Stjerner (m) viser, at det repræsenterede molekyle er cirkulært. Mangel på en stjerne viser, at 5 molekylet er lineært.

(3) Endonucleaserestriktionssteder er vist over linien.

(4) Gener er vist under linien.

(5) Afstandene mellem gener og restriktionssteder 10 er ikke vist i det rigtige målestoksforhold. Skemaerne viser kun deres stillinger i forhold til hverandre.

De metoder, som er anvendt ved plasmidkonstruktio-nerne, er rekombinant-DNA-standardmetoder, som er velkendte for fagfolk på området. Disse metoder er f.eks. beskrevet 15 i T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), og B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons (1984), hvortil der her skal henvises.

Mange af de her anvendte, specifikke metoder er 20 beskrevet i L.E. Post og B. Roizman, "A Generalized Technique for Deletion of Specific Genes in Large Genomes: a Gene 22 of Herpes simplex Virus 1 Is Not Essential for Growth", Cell, 25, side 227-232 (1981)r hvortil der her skal henvises. Specielt findes deri metoderne 25 til co-transfektions- og udvægelsesprocesser.

30 35 0 DK 170948 B1 9

Eksempel 1 1. Konstruktion af pPRXK4.

Under henvisning til skema A skal konstruktionen af et plasmid til underkloning af det komplette gX-gen 5 beskrives.

Skema A. Konstruktion af pPRXK4 (a) pPRXhl digereres med Xhol og Kpnl til opnåelse af fragment 1 (2,6 kb)

Xhol Kpnl Kpnl Xhol

10 * _J_]_I I

PgX---*· xxxxxxx *-----2j6kb----*· xhoI Kpnl 15 j_L · pgX—xxxxxx fragment 1 (b) Fragment 1 endeafstumpes med T4 DNA-polymerase og 20 EcoRI-bindeled adderes.

EcoRI EcoRI

J_L

pgX—♦ ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 25 (c) pACYC184 digereres med EcoRI og behandles med BAP til opnåelse af fragment 2.

EcoRI EcoRI

J---L

30 I I

Cmh Xetr (d) Fragmenter 1 og 2 ligateres til frembringelse af pPRXK4.

35

Msti EcoRI Msti EcoRI Msti * —1_1_I_I_1_ *

PgX----- xxxxx o 10 DK 170948 B1 X = glycoprotein X-gen

Cmr = chloramphenicol-resistens-gen

Tetr = tetracyclin-resistens-gen P v - gX-promotor

5 gX

Plasmid pPRXhl (også kendt som pUC1129 og tilgængeligt som deponeringsnummer B-15772 fra the Northern Regional Research Laboratory, US Department of Agriculture, Peoria, Illinois), som indeholder gX-genet og gX-promotoren 10 fra PRV, digeres med restriktionsendonucleaserne Xhol og

KpnI. Det tredjestørste af de fire fremkomne fragmenter (fragment 1, ca. 2,6 kb) isoleres ved polyacrylamidgel-elektroforese. Fragment 1 endeafstumpes med T4 DNA-polyme- rase, og EcoRI-bindeled adderes.

15

Vector pACYC184 (tilgængelig som deponering nr. 37033 fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) digereres med EcoRI og behandles med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) til opnåelse af fragment 2. EcoRI afskærer Cmr-aenet.

20

Derefter ligateres fragmenterne 1 og 2 til frembringelse af plasmidet pPRXK4. Dette plasmid indeholder det komplette σΧ-gen, herunder den sandsynlige gX-promotor (se Rea et al., supra).

25 30 35 DK 170948 B1 11 o 2. Konstruktion af pPGXl.

I skema B er vist underkloningen af gX-promotoren

Skema B. Konstruktion af pPGX 1 5 (a) pPRXK4 digereres med Mstt til opnåelse af fragment 3 (2,1 kb).

MstI EcoRI Msti

J_I_L

io |—-*· pgx (b) Fragment 3 opskæres med EcoRI til frembringelse af fragment 4 (400 bp).

15

EcoRI MstI

J_:__L

I—- pgx 20 (c) puc9 digereres med EcoRI og Smal til opnåelse af fragment 5 (2,6 kb).

EcoRI BamHI Smal

26 l-1-L

(d) Fragmenter 4 og 5 ligateres til opnåelse af pPGXl. 30 EcoRI BamHI

*_I_]_· I—-

pgX

35 DK 170948 B1 0 12

Den nucleotidsekvens, som erkendes af restrik-tionsendonucleasen MstI (TGCGCA), er placeret i den DNA-sekvens, som formodentlig koder for den 5'-ikke-trans-laterede region af gX-mRNA (Rea et al., supra). pPRXK4 5 digereres med MstI, og det næststørste fragment (fragment 3, ca. 2,1 kb) isoleres. Derefter opskæres fragment 3 med EcoRI, og det lille stykke (fragment 4, ca. 400 bp) isole res. Plasmidet pUC9 (tilgængeligt fra Pharmacia P/L, Inc., Piscataway, NJ. USA) digereres med EcoRI og Smal, og det 10 store fragment (fragment 5, ca. 2,6 kb) isoleres. Derefter ligateres fragmenterne 4 og 5 ved EcoRI-stederne og ved en Mstl/Smal-fusion til frembringelse af pPRGXl. Dette plasmid indeholder gX-promotoren med et BamHI-spaltningssted umiddelbart med strømmen fra promotoren.

15 20 25 30 35 0 DK 170948 B1 13 3. Konstruktion af pGXTK2.

Konstruktionen af et plasmid, hvori gX-promotoren er fusioneret med HSV-tk-genet, skal nu beskrives under henvisning til skema C.

5

Skema C. Konstruktion af pGXTK2 (a) pPGXl digereres med BamHl og behandles med BAP til opnåelse af fragment 6.

10 BamHl EcoRI BamHl

I_l_L

I—- pgx 15 (b) pRBl03 digereres med BamHl og Bglll til frembrin gelse af fragment 7 (2,9 kb).

Bglll BamHl BamHl * _I_I_I_* 2Q I---*· ttttttttt

PtJc «-------2.9 kb------

Bglll BamHl

I_L

25 ttttttttt

Fragment 7 (c) Fragmenter 6 og 7 ligateres til frembringelse af pGXTK2.

30

EcoRI BamHl * _J_I_* I------♦ tttttttt

pgX

35 p = thymidinkinasepromotor t = thymidinkinasegen.

DK 170948 Bl 14 0

Plasmidet pPGXl fra afsnit 2 digereres med BamHI og behandles med BAP til opnåelse af fragment 6. Plasmidet pRB103 indeholder BamHI-Q-fragmentet fra HSV-l-stamme F (L.E. Post et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

5 USA, 77, side 4201-4205 (1980)). Alternativt indeholder også plasmidet pHSV106, som er kommercielt tilgængeligt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA, BamHI-Q-fragmentet og kan anvendes ved denne konstruktion. pRB103 digereres med BamHI plus Bglll, og det næst-10 største fragment (fragment 7, ca. 2,9 kb) isoleres. Dette fragment indeholder HSV-tk-genet uden dets promotor. Ligatering af det digererede pPGXl (fragment 6) med det fragment (fragment 7), som indeholder tk-genet, ved BamHI--stederne og ved en Bglll/BamHI-fusion giver to plasmider, 15 som indeholder tk-fragmentet i modsatte orienteringer.

Plasmidet med tk-genet umiddelbart med strømmen fra gX-pro-motoren udvælges ved undersøgelse af BamHI- plus EcoRI--digereringsmønstrene og kaldes pGXTK2.

20 25 30 35 DK 170948 B1 0 15 4. Konstruktion af pGXTK3.

Under henvisning til skema D skal nu beskrives et plasmid omfattende HSV-tk-genet og PRV-sekvenser, som flankerer det.

5

Skema D. Konstruktion af pGXTK3 (a) pPRXhl digereres med BamHI til fremstilling af fragment 8 (6,9 kb).

10 BamHI Narl PvuII BamHI

]_J_I_L

XXXXXXXX 5050505050 6363636363 IIIIIIIIIII

gX-Ct 15 (b) pGXTK2 digereres med BamHI og behandles med BAP til opnåelse af fragment 9.

BamHI EcoRI BamHI

20 I-i-;-L

|-----*· ttttttt pgx (c) Fragmenter 8 og 9 ligateres til frembringelse af pGXTK3.

25

EcoRI BamHI BamHI

*_J_I_i

|----+ ttttttt |XXXXXX

PgX gX-ct 30 gX-Ct - C-terminal koderegion i gX-genet 50 = glycoprotein 50-gen 63 = glycoprotein 63-gen I = glycoprotein I-gen 35 0 16 DK 170948 B1 pPRXhl (se 1. ovenfor) digereres med BamHI, og fragment 8, ca. 6,9 kb) isoleres. Dette fragment er i litteraturen kendt som BamHI 7 (se Rea et al., supra). pGXTK2 digereres med BamHI og behandles med BAP til 5 frembringelse af fragment 9. Fragment 8 ligateres ind i BamHI-stedet i pGXTK2 (fragment 9). Det resulterende plasmid med fragment 8 i samme orientering som gX-promotoren kaldes pGXTK3. Dette plasmid har tk-genet umiddelbart med strømmen fra gX-promotoren og erstatter 10 det DNA, som koder for de N-terminale aminosyrer i gX.

5. Co-transfektion.

pGXTK3 opskæres med Clal, som det er vist i skema E.

15 Skema E. Co-transfektion PGXTK3 og et tk”-PRV.

(a) Co-transfektion af pGXTK3 og et tk”gX-PRV giver tk+-gX -produktet PRV^gXl (eller DT-A)

20 BamHI BamHI BamHI BamHI

_j_J_I_I_ |-----*-|ttttttt |xxxxx

Pgx gx-ct 25

Det således frembragte DNA-fragment, som indeholder den C-terminale region i gX (effektivt gX~) og hele HSV-^tk-genet fusioneret til gX-promotoren, anvendes til co-transfektion af kaninhudceller sammen med DNA fra en tk -gX -mu-30 tant af PRV (som her kaldes PRV HR), som udvælges ved vækst af PRV i nærværelse af ioddeoxyuridin efter metoden ifølge Tatarov, Zentralblatt Veterinarmedizin, 15, side 847-853 (1968).

tk+-gX~-rekombinantvira (som kan anvendes til vacci-35 ne efter hensigtsmæssig inaktivering) udvælges ved vækst i humane tk"-143-celler (J.P. Weir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, side 1210-1214 (1982) , Panicali og Paoletti, 0 DK 170948 B1 17

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, side 4927-4931 (1982), Campione-Piccardo et al., J. Virol., 31, side 281-287 (1982), K.L. Poffenberger et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 80, side 2690-2694 (1983), M.F. Stinski et al., 5 J. Virol., 55, side 431-441 (1985)) i HAT-medium (L. E. Post og B. Roizman, supra). Det således frembragte virus kaldes PRVAgXl eller DT-A. DT-A er tk+ og er fuldt ud i stand til at dræbe mus.

Vira udvalgt til vaskst i HAT, f.eks. DT-A, analyse- 10 res for syntese af gX ved mærkning af virale proteiner 35 14 med S-methionin eller C-glucosamin efterfulgt af immuno-udfældningmed anti-gX-serum. Der påvises intet gX.

Proteiner fra celler inficeret med tk+-gX~-viruset analyseres også ved "western blots" med anti-gX-serum, og 15 der påvises intet gX i celler inficeret med mutantviruset.

Det er også muligt at fjerne hele gX-genet. Ved f.eks. digerering af fragment 8 med Narl frembringes et fragment, hvori hele σΧ-genet er fjernet (se skema D).

Dette fragment kan derefter anvendes i stedet for frag-20 ment 8 til frembringelse af et gX -PRV, som fuldstændig mangler gX-genet.

Det har i nogen tid været kendt, at tk~-PRV er avirulent og giver gode vacciner. Derfor kunne man til hensigtsmæssig inaktivering af DT-A til fremstilling af et 25 tk”-virus, som er anvendeligt som vaccine, mutagenisere og udvælge for tk--PRV ved metoderne ifølge Tatarov (se f.eks. G. Tatarov, "Apathogenic Mutant of the Aujeszky Virus Induced by 5-iodo-2-Deoxyuridine (IUDR)", Zentral-blatt Veterinårmedizin, 15, side 847-853 (1968), G. Tata-30 rov et al., "Investigation of Harmlessness and Immunogenici-ty of the MK Strain of Aujeszky's Virus", Vet. Nauki, 6, side 49-54 (1969), G. Tatarov, "Results of Use of Live Vaccine MK-25 Against Aujeszky's Disease", Vet. Sbirka, 7, side 10-12 (1974), G. Tatrov, "Bulgarian MK-25 Vaccine 35 Against Aujeszky's Disease", Cah. Med. Vet., 43, side 347-352 (1974), G. Tatarov et al., "Development of an Avirulent Mutant of Aujeszky's Disease Virus Under the Influence of DK 170948 B1 0 18 5-Bromo-Desoxyuridine", Veterinary Science, 18, side 3-12 (1981), V. Khristova et al., "Thymidine Kinase Activity of Virulent and Vaccinal Strains of Aujezsky's Disease Virus", Veterinary Science, 22, side 15-22 (1985)) 5 eller ved lignende teknik (W.C. Topp, Virology, 113, side 408-411 (1981) S. Kit et al., Exp. Cell Res., 31, side 297-312 (1963) S. Kit et al., Virology, 130, side 381-389 (1983)).

PRVAgXl, som indeholder HSV-tk-genet, kan også 10 omdannes til et tk”-PRV ved en rekombination, som fjerner HSV-tk-genet ved co-transfektion af kaninhudceller med dette tk+-gX -PRV og et plasmid, som bærer en gX-fjernel-se, og udvælgelse for tk"*-rekombinanter med araT ved metoden ifølge L. E. Post og B. Roizman, supra, som følger og 15 illustreret i skema F.

Skema F. Konstruktion af pAGXB7 (a) pPGXl digereres med BamHI og behandles med BAP til opnåelse af fragment 6.

20

BamHI EcoRI BamHI

J_l_L

I—♦ pgx (b) pPRXhl digereres med BamHI til frembringelse 25 af fragment 8 (6,9 kb).

BamHI NarI PvuII BamHI

j_J_I__L

XXXXXXXX 5050505050 6363636363 IIIIIIIIIII

30 gX-Ct (c) Fragmenter 6 og 8 ligateres til frembringelse af plasmid pAGXB7.

EcoRI BamHI BamHI

»___I_I_L*

I----*· XXXXXXX 50505050 63636363 IIIIIIIIIII

Pgx gX-ct 35 DK 170948 B1 0 19

Som vist i skema F digereres plasmid pPGXl med BamHI og behandles med BAP som vist i skema C, trin (a), til frembringelse af fragment 6 omfattende gX-promotoren. Plasmid pPRXhl digereres med BamHI til 5 frembringelse af fragment 8 omfattende den C-terminale koderegion i gX som ovenfor nævnt og vist i skema D, trin (a). Dette fragment er også kendt som PRV-BamHI 7--fragmentet. Derefter ligateres fragmenterne 6 og 8 sammen, transformeres ind i E. coli, og klonerne afprøves for den 10 ønskede orientering af BamHI 7-fragmentet ved digere-ring med EcoRI plus PvuII. Den rigtige orientering er indiceret ved skabelsen af et 2,0 kb fragment ved dige-reringen. Det således frembragte plasmid kaldes p££XB7.

Plasmid p&GXB7 co-tr.ansficeres med viralt DNA 15 fra PRV^gXl under anvendelse af calciumphosphattrans- fektionsteknikken (Mocarski et al.. Cell, 22,243 (1980)) i kaninhudceller. De vira, som resulterer fra denne trans-fektion, overføres til vero-celler i nærværelse af 100 /ig/ml araT som beskrevet af Mocarski et al., supra. Individuelle 20 plader udplukkes og analyseres for det ønskede tk -rekombi-nantvirus ved restriktionsenzymdigerering af DNA som beskrevet af Mocarski et al., supra. Dette virus betegnes PRVAGXTK- eller DT-B (se skema G). Disse tk~-PRV er værdifulde, svækkede vira til vacciner som vist i nedenstående 25 eksempel 2.

30 35 0 20 DK 170948 B1

Skema G. Konstruktion af PRVAGXTK- ved rekombination (a) Co-transfektion af PRVÆGXl og p£GXB7 og rekombination giver PRV^GXTK .

5

BaraHI BaraHI/BgIII BamHI BamHI

*_I_I_I_I

|-----*· | ttttttt |xxxxx |

Pgx gx-ct | ίο | |

EcoRI | BamHI | BamHI

*_I_I_I_I I * |----- xxxxxxx

Pgx gx-ct 15 = region med overkrydsning (skala i højre overkrydsningsregion er ekstremt forvrænget) 20

For at differentiere mellem inficerede og vaccinerede dyr ved anvendelse af disse vira kan man f.eks. anvende en ELISA-prøve. Alment sættes gX-protein, frembragt f.eks. i E. coli ved rekombinant DNA-teknik (Rea et al., supra), 25 til hullerne i hensigtsmæssige plastplader og får tilstrækkelig tid til absorption til plasten (natten over, 20-25°C). Pladerne vaskes^ og et blokeringsmiddel (f.eks. BSA) tilsættes til neutralisation af eventuelle uomsatte steder på plastoverfladen. En vask følger, og derefter sættes svinese-30 rummet til hullerne. Efter ca. 1 times inkubering ved 20-25°C vaskes hullerne, og et protein A-peberrodperoxidasekonjugat sættes til hvert enkelt hul til inkubering i 1 time ved 20-25°C. Yderligere en vask følger, og enzymsubstratet (o-phenylendiamin) sættes til hullerne, og reaktionen af-35 sluttes med syre. Absorptionen måles ved 492 nm til kvantitativ bestemmelse af den mængde gX-antistof, som er til ste- DK 170948 B1 0 21 de i serummet. Mangel på gX-antistof viser, at et dyr ikke er inficeret. Ved afprøvning for andre antigener kan man fastslå, om et givet dyr er vaccineret eller ej.

5 Selv om PRVAGXTK” er en effektiv vaccine, kunne PRV-tk -mutationen udvalgt ved vækst i ioddeoxyuridin være en punktmutation. Hvis det var en punktmutation, kunne den vende tilbage til tk+ og muligvis blive virulent. Derfor er et tk--PRV med en fjernelse at foretrække.

10 US-patentskrift nr. 4.514.497 beskriver PRV-tk -fjernel ser. Den deri til fremstilling af tk”-PRV anvendte mærkestofredningsmetode anvendes først til opnåelse af tk -fjernelser i herpes simplex-virus (J.R. Smiley, Nature, 285,333-35 (1980), og L.E. Post et al., Cell, 24,555-565 15 (1981)).

Som vist i skema H er PRV-tk”-genet blevet kortlagt til BamHI 11 —fragmentet i PRV (T. Ben-Porat et al., Virology, 127,194-204 (1983)).

20 25 30 35 DK 170948 B1 0 22

Skema H. Konstruktion af tk-fjernelsesplasmider (a) BamHI 11 klones ind i pBR322 til frembringelse af plasmid pTKll.

ς BamHI Xhol BamHI

* _I I_I_* tktktktktktktktk (b) pTKll digereres med Xhol til frembringelse 10 af fragment 10.

Xhol BamHI BamHI Xhol

I_I_I_L

tktktktktktk tktktktktktktktktktktk 15 (c) Fragment 10 digereres med Bal31 og ringsluttes derefter igen til frembringelse af plasmidet , f.eks. pAtk-3 og pAtk-4, med fjernelse af varierende længder i tk-genet.

20 BamHI BamHI

* _L__I_* tktktktkddddddtktktktktk tk = thymidinkinasegen 25 d = fjernelse i thymidinkinasegenet 30 35 DK 170948 Bl 0 23

BamHI 11-fragmentet isoleres ved agarosegel-elektroforese af BamHI-digereret DNA fra PRV Rice-stamme og klones ind i pBR322 til frembringelse af plasmidet pTKll. pTKll har et enkelt Xhol-spaltningssted i 5 tk-genet. pTKll opskæres med Xhol og digereres i forskellige tidsrum med exonuclease Dal31, ringsluttes igen med ligase og transformeres ind i E. coli DH1 (Maniatis, supra, side 505). Dette frembringer en samling af plasmider med forskellige fjernelser i tk-genet.

10 To af disse plasmider udvælges, renses ved

CsCl-vægtfyldegradientcentrifugering og sekvenseres ved metoden i Maxam og Gilbert, Methods in Enzymology, 65 (del 1), side 497-559 (1980). Plasmid pAtk-3 har en fjernelse af 329 basepar fra tk-genet, og plasmid 15 pAtk-4 har en fjernelse på 275 basepar.

Før tk-fjerneiserne kan krydses ind i gX~-vira, er det først nødvendigt at gøre vira tk+ således, at tk -fjernelsesrekombinanterne kan udvælges. PRVAGXTK --DNA co-transficeres med plasmid pTKll i kaninhudceller.

20

De resulterende rekombinanfvira isoleres og dyrkes i 143-cel-ler i HAT-medium til udvælgelse af et tk+-virus, som er blevet kaldt PRVAgXtk PRV. DNA fra dette virus co-transficeres derefter med på.tk-4-DNA i kaninhudceller. De resulterende vira overføres til vero-celler i nærværelse af 25 — araT til udvælgelse for tk -rekombinanter. De resulterende vira afprøves for den rigtige rekombinant ved præpa'rering af DNA og restriktionsenzymanalyse. Disse rekombinanter har inkorporeret tk-fjernelsen. Et af disse vira, som er blevet kaldt PRVAgXAtk eller DT-C, indeholder den forven-30 tede tk-fjernelse og en gX-fjernelse. Det er blevet bestemt, at LD50 for DT-C er over 10^ pladedannende enheder i mus.

Til sammenligning er LD50 for PRVAgXPRVTK+ tre pladedannende enheder.

Selv om den i nærværende beskrivelse beskrevne 35 specifikke udførelsesform angår PRV og anvender rekombinant--DNA-teknik, vil det være klart for fagfolk, at lignende vacciner indeholdende fjernelser for udskilte glycoproteiner kan 0 24 DK 170948 B1 fremstilles med andre teknikformer og med anvendelse af andre vira, såsom Marek's sygdomsvirus og smitsomt okserhinotracheitisvirus.

Selv om nærværende beskrivelse primært angår 5 PRV, kan den anvendte teknik anvendes til fremstilling af serologisk forskellige herpesvira i enhver situation, hvor det er fordelagtigt at skelne mellem vaccinerede og inficerede dyr, således som det er tilfældet med PRV. Omfattet heraf er f.eks. Marek1 s sygdomsvirus og 10 smitsomt okserhinotracheitisvirus.

Selv om HSV-tk-genet er blevet placeret under kontrol af gX-promotoren, kan det tk-holdige DNA-fragment indsættes på en sådan måde, at det er under kontrol af en anden PRV-promotor eller en vilkårlig anden promotor, 15 som kan fungere til ekspression af tk-genet. F.eks. kan andre HSV-promotorer, f.eks. HSV-ICP4-promotoren, som kan eksprimeres i PRV-inficerede celler, også anvendes.

Man kan f.eks. indsætte PRV-tk-genet i gX-genet eller indsætte et vilkårligt andet tk-gen under kontrol af en promotor, som kan eksprimeres i PRV-inficerede celler.

Selv om tk-genet er blevet anvendt som det tilføjede mærkestofgen, kan et vilkårligt mærkestofgen indsættes i gX-genet til inaktivering af dette, når blot mærkestoffet tillader udvælgelse af vira, som bærer dette mærkestof, 25 til forskel fra dem, som mangler det. F.eks. kan antibiotikumresistensgener anvendes som mærkestofgenerne, såsom resistens mod G418 eller hygromycin.

Det er også muligt at indsætte andre gener end et udvælgeligt mærkestof i gX-genet. Til konstruktion af et sådant virus kan det fremmede gen placeres i et plasmid, såsom pGXTK3, idet det fremmede gen erstatter tk-sekvenserne. Dette plasmid kan derefter co-transficeres med DNA fra det tk -gX--virus, som er vist i skema E.

Udvælgelse med araT vil give rekombinantvira med det 35 fremmede gen indsat og eksprimeret. Et sådan gen kan f.eks. kode for et antigen i en anden virustype, f.eks. gastroenteri-tisvirus, som kan overføres, eller svineparvovirus, eller DK 170948 B1 0 25 fra en bakterie, såsom E. coli, som derefter vil udvikle en immunogen reaktion imod det andet virus.

Ved denne udførelsesform for opfindelsen er derfor frembragt en "multivalent" vaccine omfattende antigener

C

for to eller flere typer af vira eller andre pathogene organismer.

Som et eksempel på ovenstående er vævsplasminogen-aktivatorgenet (tPA-genet) blevet indsat i gX-genet som følger: 10 pPSA18 er et plasmid, som indeholder hele kode- regionen for tPA, med et enkelt BamHI-spaltningssted i den 5'-ikke-translaterede region i koderegionen. Det konstrueres som beskrevet i US-patentansøgning nr. 758.517 (indleveret 26. juli 1985). Som vist i skema I opskæres 15 pPSA18 med Ball, og BamHI-bindeled adderes til frembringelse af fragment-11.

20 25 30 35 0 26 DK 170948 B1

Skema I. Konstruktion af pGXTPA

(a) Plasmid pPSA18 opskæres med Ball, og BamHI--bindeled adderes til frembringelse af fragment 11.

5 pPSA18:

BamHI Ball *_I_I_* tptptptptptptptp Fragment 11:

10 BamHI

_!_:_

LLLL tptptptptptptptptptp LLLL

(b) Fragment 11 digereres med BamHI til frembrin-15 gelse af fragment 12 (1,95 kb).

BamHI BamHI

J_L

t pt pt pt pt pt pt pt pt pt pt pt p 20 (c) Plasmid pPGXl (skema B) opskæres med BamHI til frembringelse af fragment 6.

BamHI Hindlll EcoRI BamHI

25 J_I_]_L

I—♦

'P6X

(d) Fragmenterne 6 og 12 ligateres til frembringelse 30 af plasmid pGXTPA.

EcoRI BamHI BamHI Hindlll *_I_I_I_I_* I-----* tptptptptptptptp 35 ΡβΧ tp = vævsplasminogenak tivatorgen L = BamHI-bindeled 0 27 DK 170948 B1

Derefter digereres fragment 11 med BamHI til frembringelse af et fragment (fragment 12) på 1,95 kb indeholdende hele koderegionen i tPA. Dernæst opskæres plasmid pPGXl (skema B) med BamHI til frembringelse af 5 fragment 6. Derpå ligateres fragmenterne 12 og 6 til frembringelse af plasmid pGXTPA. Den rigtige orientering af tPA-cDNA i forhold til gX-promotoren bestemmes ved digerering med EcoRI, som frembringer et fragment på 1,1 kb, når orienteringen er rigtig.

10 Plasmid pGXTPA digereres med Hindlll til frembrin gelse af fragment 13 som vist i skema J.

Skema J. Konstruktion af plasmid pGXTPA-B7.

(a) Plasmid pGXTPA digereres med Hindlll til frem-15 bringelse af fragment 13.

Hindlll EcoRI BamHI BamHI Hindlll

1_I I_I I

I-----*· tptptptp 20 Pgx (b) Hindlll-bindeled adderes til fragment 8 (skema d) til frembringelse af fragment 14.

25 · BamHI BamHI

_I_I .

HLHLHL XXXXXXXXXXXXXXX HLHLHL

gX-Ct 30 (c) Fragmenter 13 og 14 ligateres sammen til frem bringelse af pGXTPA-B7.

EcoRI BamHI BamHI Hindlll Hindlll *_1_I_1______)_1_*

35 I----♦ tptptptp XXXXXXXXXXXXXXXXXX

pgx HL = Hindlll-bindeled.

o 28 DK 170948 B1

BamHI 7-fragmentet af PRV-DNA isoleres som ovenfor beskrevet (fragment 8) , og Hindlll-bindeled adderes til frembringelse af fragment 14. Fragmenterne 13 og 14 ligateres derpå sammen til frembringelse af 5 pGXTPA-B7. Den rigtige orientering af det i dette plasmid indsatte BamHI7-fragment bestemmes ved digerering med EcoRI og SphI. Derved frembringes et fragment på 5,8 kb, når orienteringen er rigtig.

Dernæst co-transficeres plasmidet pGXTPA-B7 med vi-10 ralt DNA fra PRVAGXl ind i kaninhudceller. De resulterende vira overføres til vero-celler i nærværelse af araT til udvælgelse af tk -rekombinanter. Et af de således udvalgte vira er blevet kaldt PRV-GXTPA. Når dette virus inficerer celler, producerer og udskiller cellerne tPA som påvist 15 ved immunoudfældning med anti-tPA antiserum. tPA-aktivitet på 20 ng/ml er blevet påvist ved en fibrinopløseliggørelses-prøve (Unkeless et al., J. Esp. Med., 137, side 85-111 (1973), Luskutoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3903-3907 (1977)).

20

Eksempel 2 I dette eksempel er beskrevet beskyttelsen af mus og svin mod FRV-fremkaldt dødelighed ved vaccination med en thymiainkinasemanglende glycoprotein X-fjernel-25 sesmutant (tk"*gX~) af PRV. 1 35

Dyr.

CF-l-hunmus, 5-6 uger gamle, fås fra Charles River Co.

Atten svin fremkommet ved krydsning, 5-6 uger gamle 30 og af blandet køn, fås fra J. Gilmore Enterprises. Svinene anbringes tilfældigt i tre rum, seks svin i hvert rum.

Svin og mus får foder og vand uden medicin ad libitum.

0 29 DK 170948 B1 2. Vira og celler.

PRV-fjernelsesmutanterne DT-A (HSVtk+gX ) og DT-B (tk'gX ) konstrueres ud ffastam-PRV som ovenfor beskrevet (HR-stamme, tk”gX ). DT-B syntetiserer ikke 5 thymidinkinase, og det syntetiserer ikke gX på grund af fjernelsen af gX-genet. Det virulente PRV (Rice-stamme) anvendes som det inficerende virus ved alle beskyttelsesstudier. Disse vira formeres i enten vero-celler eller svinenyre-15-celler (PK-15-celler).

10 3. Mikroneutralisationsprøve.

Mikroneutralisationsprøven gennemføres som beskrevet af T.C. Holland et al., J. Virol., 45, side 672-682 (1983). Musesera inkuberes med virus og 10% kanin-15 komplement i 3 timer ved 37°C, medens svinesera inkuberes med virus i fraværelse af komplement i 1 time ved 37°C. Neutralisationstiteren udtrykkes som den reciprokke værdi af den højeste fortynding af serum, som beskytter mere end 50% af cellerne mod cytopatiske virkninger.

20 4. Enzymbundet immunosorbentprøve (ELISA).

Antigenopløsningen fremstilles ved fortynding af gX-fusionsprotein (p60-ll, frembragt som beskrevet i US-patentansøgning nr. 853.087 (indleveret 17 april 1986)) 25 til 20/ig/ml i Voller's puffer (50 mM NaHCO^, 0,03% NaN^, indstillet på pH-værdi 9,6 med NaOH). Opløsningen filtreres gennem et 0,45 yum sterilisationsfilter ("Sartorius SM 165 55 K"). Om nødvendigt fortyndes den filtrerede opløsning yderligere med Voller's puffer før anvendelse.

30 100 /uliter p60-ll-protein i Voller's puffer (koncentration ca. 2 yug/ml) fyldes i hvert enkelt hul i en plade med 96 huller (''Coster 3590 EIA") . Adsorption foregår en enkelt nat over ved inkubering ved stuetemperatur. Hullerne vaskes tre gange med 300 /uliter Dulbecco's PBS 35 (8 g/liter NaCl, 0,2 g/liter KC1, 0,2 g/liter KH2P04 og 1,14 g/liter Na2HP04, resulterende pH-værdi er 7,3-7,4).

0 30 DK 170948 B1

Uomsatte steder på plastoverfladen neutraliseres ved inkubering i 2 timer ved 37°C med 3% BSA i Dulbecco's PBS (200 /aliter pr. hul). Sn enkelt vask af hvert enkelt hul med SOO^uliter Dulbecco's PBS følger efter. Derefter 5 omsættes det adsorberede antigen med antistoffer i 100/uliter fortyndet serum (opnået fra svin udsat for PRV) og inkuberes natten over 4°C. Uomsatte antistoffer fjernes ved vask tre gange med Dulbecco's PBS (300 ml/hul). Derefter sættes 100 ml protein A-peberrodperoxidasekonjugat (fortyndet 10 1/800 til musesera og 1/15.000 til svinesera, fortyndet i 50 mM Tris, 0,05% "Tween-20", 1% BSA, 0,02% NaN3, pH-vær-di 8,0) til hver enkelt hul til inkubering i 2 timer ved 37°C. Igen vaskes hullerne tre gange med Dulbecco's PBS (300 ml/hul). 100 /lliter substratopløsning sættes til hvert 15 enkelt hul. Denne opløsning fremstilles ved tilsætning af 10 mg o-phenylendiamin (i forvejen opløst i 0,5 ml CH3OH) og 25 ^iuliter 30%'s (vægt/volumen) #2*^2 ml puffer (17 mM citronsyre, 65 mM phosphat og 0,01% merthiolat, indstillet på pH-værdi 6,3 med NuOH). Enzymreaktionen fort-20 sætter i 10 minutter ved stuetemperatur, før 100 /lliter 4,5 M i^SO^ sættes til hvert enkelt hul. Absorption af chromoforen måles ved 492 nm under anvendelse af et Titertek Multiskan.

25 5. Viral isolering fra næsevatpinde.

Næsevatpinde indsamlet fra svin anbringes hver især i 1 ml Eagles Basal Medium (BME, M.A. Bioproducts) suppleret med 3% oksefosterserum (FBS) og antibiotika. Vatpindene opbevares ved -70°C, indtil de afprøves for 30 tilstedeværelsen af virus. Til virusisoleringsprøven optøes næsevatpindene i BME, og de enkelte vatpinde kasse res. Prøver (0,1 ml) podes ved dobbeltforsøg på svinenyre--15-cellemonolag (PK-15, ATCC CCL33) og inkuberes i 1 time ved 37°C for at tillade virusadsorption. Et overliggende 35 lag af medium-199 (Flow Laboratories) suppleret med 4% FBS, antibiotika og 1% agar anbringes på cellekulturerne. Efter 3 døgn farves cellemonolagene med neutralrødt, og pladerne tælles.

0 31 DK 170948 B1 6. Forsøgsmetode til musestudiet.

Virulensen af fire PRV-stammer vurderes på mus ved bestemmelse af den 50%’s dødelige dosis (LD50) for hver enkelt stamme. De fire PRV-stammer er: 1) vild-5 typen (Rice-stammen), 2) DT-A, 3) DT-B og 4) HR.

Hver enkelt virusstamme indgives til enten 5 eller 6 grupper af mus (10 mus/gruppe) i forskellige doser. Mus podes med 50 ^uliter af de respektive vira ad fodtrædepudevejen (dag 0). LD50-Bestemmelserne foretages 14 dage efter indgift (dag 14) 10 af vira, og sera udvindes fra de overlevende mus i grupper, som er givet den højeste dosis af de respektive vira. LD50 for hver enkelt virusstamme beregnes ved Sperman-Karber-metoden.

Overlevende mus fra LD50-virulensstudiet inficeres intraperitonealt på dag 14 med PRV-Rice-stamme med ca. 10 gan-15 ge LD50 (bestemt for den intraperitoneale vej) for PRV-Rice--stamme (10 LD50 = 5,4 x 10^ pladedannende enheder/mus). Studiet afsluttes 14 dage efter infektion (dag 28).

7. Forsøgsmetode for svinestudiet♦ 20 Svin injiceres intramuskulært på dag 0 med 2 ml n DT-B-stamme (ca. 1,5 x 10 pladedannende enheder/svin), 2 ml Norden-levende vaccine (PR-Vac) som anbefalet af fabrikanten eller saltopløsning. Alle svin inficeres på dag 20 med ca. 40 LD50 virulent PRV (Rice-stamme) (40 25 LD50 = 1,1 x 105 pladedannende enheder/svin). Studiet afsluttes på dag 34.

Serumprøver udtages, og hvert enkelt svin vejes, på dagene 1, 20 og 34. Næsevatpinde udtages dagligt på dagene 19-34.

30 8. Kriterier for effektivitetsbedømmelse.

Effektiviteten af PRV-DT-B-stamme (tk“gX~) som vaccine bedømmes på basis af beskyttelsen imod PRV-fremkaldt dødelighed og evnen til serologisk at skelne mellem PRV-35 -DT-B-behandlede svin og svin udsat for marktypeviruset.

DK 170948 B1 0 32

Tabel I viser den relative virulens af de fire PRV-stammer i mus udtrykt som de respektive LD50--bestemmelser. DT-B og HR har en stærkt nedsat virulens sammenlignet med vildtypestammen og DT-A, idet de er 5 mindst 1000 gange mindre virulente.

Tabel I Muse-LD50 10 Virusstamme Genetiske egenskaber LD50

Rice-stamme PRVtk+gX+ 40 pde/mus DT-A HSVtk+gx" 34 pde/mus DT-B tk gX 9,4x10^ pde/mus HR tk gX+ >2,3x10^ pde/mus 15

Mus, som overlever indgiften af de forskellige PRV-stammer, inficeres derefter på dag 14 ad intraperito- neal vej med virulent vildtype-PRV i en dosis på 10 gange o 20 LD50 (5,4 x 10 pladedannende enheder/mus). Som det er vist i tabel II, er mus, som får en dosis på 1 x 10^ pladedannende enheder eller derover af DT-B, og mus, som får en dosis på 2,3 x 10^ pladedannende enheder eller derover af HR, beskyttet mod infektionen med virulent vildtype-25 -PRV.

30 35 DK 170948 B1 0 33

Tabel II

Beskyttelse af mus vaccineret med svækkede PRV-stammer

Genetiske Dødelighed Neutralisa- ELISA

5 Virus- egenska- Dosis efter tionsti- Absorp- stamme ber__(pde/mus) infektion tera_ tionb DT-B tk-gX- 1.0 x 105 0/6 1024 0,05 1 .0 x 101» 0/10 10 1.0 x 103 0/10 1.0 X 102 4/10 1 .0 x 10V 7/10 1.0 x 10° 9/10 15 HR tk~gX+ 2.3 x 106 0/10 2048 0;60 2.3 x 105 0/10 2.3 x 101» 0/10 2.3 X 103 0/10 2.3 x 102 2/10 20

Kontrol --- 10/10 0;00 25 a Neutralisationstiter = den reciprokke værdi af den højeste fortynding af serum udtaget fra overlevende dyr (før infektion med PRV-Rice-stamme), som beskytter mere end 50% af cellerne mod cytopatiske virkninger.

30 k Absorptionsværdier repræsenterer ELISA-reaktioner opnået ved anvendelse af en 1/10-fortynding af serum. De anvendte sera de samme som til neutralisationsprøven.

35 DK 170948 B1 34 o

Desuden indeholder sera udtaget før infektionen fra mus, som har fået DT-B, en højere titer af neutraliserende antistoffer (neutralisationstiter 1024), medens reaktionen med gX-antigendeterminanter, baseret på ELISA-5 -data, er relativt insignifikant (ELISA-absorption = 0,05).

Sera udtaget før infektionen fra mus, som har fået HR, indeholder en høj titer af neutraliserende antistoffer (neutralisationstiter = 2048) , medens reaktionen med gX-antigendeterminanter er væsentlig (ELISA-absorption = 10 0,60).

Til vurdering af den beskyttende effektivitet og de diagnostiske betydninger af PRV-DT-B-stammen er svin blevet podet med DT-B, Norden-levende vaccine (PR-Vac) eller saltopløsning ad intramuskulær vej på dag 0 og infi-15 ceret intranasalt med vildtype-Rice-stammen på dag 14.

De resultater, som er vist i tabel III, viser at DT-B-stam-men kan sammenlignes med Norden-levende vaccine (PR-Vac) med hensyn til fremkaldelse af en signifikant, neutraliserende antistofreaktion og til opnåelse af beskyttelse mod 20 infektion med virulent Rice-stamme.

Tabel III

Beskyttelse af svin vaccineret med svækket PRV DT-B.

25 Geometrisk middel Aritmetrisk middel

Præparat Dødelighed titer*3 af ELISA-absorptiond DT-B 0/6 91 0,072 - 0,016e PR-Vac 0/6 36 0,130 - 0,061e

Saltopløsning 0/6 <4C 0,093 - 0,024 30 Ricea 0,942 - 0,228f a Fem svin i bedring, som har overlevet udsættelse for

Rice-stammen, er blevet åreladet i et forudgående studium. De er medtaget her til tilvejebringelse af 35 gX-reaktive sera som den ved ELISA anvendte kontrol.

DK 170948 B1 35 0 b

Den geometriske middeltiter er det geometriske middeltal af de neutralisationstitere, som er opnået for hver enkelt af de 6 svin i hver enkelt gruppe før infektion. Hver enkelt neutralisationstiter er den 5 reciprokke værdi af den højeste serumfortynding, som har beskyttet over 50% af cellerne mod cytopatiske effekter.

c Intet påviseligt antistof.

^ Det aritmetriske middeltal af ELISA-absorptionerne 10 er det aritmetriske middel af ELISA-absorptionsværdierne (1/40-fortynding af sera) opnået fra sera udtaget fra hver enkelt af de 6 svin/gruppe før infektion, bortset fra sidste tal (se ovenstående fodnote a) e Ikke signifikant forskellig (P > 0,05, tovejs, Student's 15 t-test) fra med saltopløsning behandlede svin.

^ Signifikant forskellig (P<0,05, tovejs, Student's t-test) fra med saltopløsning behandlede svin.

De data, som er opnået ud fra ELISA ved anvendelse 20 af gX-fusionsproteinet, antyder, at svin immuniseret med DT-B ikke har antistoffer imod gx, medens sera udtaget fra svin i bedring, som har overlevet udsættelse for viidtype-Rice-stammen, har. Ved dette studium reagerer sera udtaget fra svin, som har fået Norden-levende vaccine 25 (PR-Vac), ikke med gX-antigendeterminanter i en statistisk signifikant udstrækning (P> 0,05). Baseret på forudgående studier kan svin, som har fået Norden-levende vaccine (PR-Vac), imidlertid danne antistoffer imod gX, fordi Norden-stammen har det gen, som koder for gX. Derfor kan 30 sera udtaget fra svin, som er vaccineret med Norden-levende vaccine (PR-Vac), variere med hensyn til reaktivitet med gX-antigendeterminanter.

Svin behandlet med DT-B og Norden-levende vaccine udspreder sporadisk virus efter infektion, medens med 35 saltopløsning behandlede udskiller virus kontinuerligt indtil døden i de fleste tilfælde. Intet virus er blevet påvist i næsesekreterne fra et svin behandlet med DT-B og DK 170948 B1 0 36 et svin behandlet med Norden-levende vaccine (PR-Vac). Disse resultater antyder, at vaccinerede svin ikke udspreder virus så let som ikke-vaccinerede svin.

Den gennemsnitlige vægt på dag 20 (før infektion) 5 af svin behandlet med DT-B er ikke signifikant forskellig (P>0,05) fra den gennemsnitlige vægt af med saltopløsning behandlede kontrolsvin, hvilket viser, at vaccination med DT-B ikke på uheldig måde påvirker svinets vækst.

Disse resultater viser, at DT-B beskytter svin 10 mod infektion med virulent PRV og tillader serologisk at skelne mellem vaccinerede svin og svin i bedring, som tidligere har været udsæt for virulent PRV. DT-B formindsker ikke de behandlede svins vækst. Desuden viser virulensstudiet på mus, at DT-B er mindre virulent end 15 tk+-PRV-stammer i andre dyrearter end svin.

Eksempel 3

Efter praktisk taget samme metoder som beskrevet i eksempel 2 er der blevet foretaget tilsvarende forsøg 20 med DT-C-stammen af PRV. DT-C har en fjernelse for PRV- -tk-genet, og det er af denne grund den foretrukne udførelsesform for den foreliggende opfindelse. Resultaterne af disse forsøg er gengivet i tabel IV-VIII.

Tabel IV og VIII viser den formindskede virulens af 25 DT-C på svin, får og kalve. Tabel V og VI viser den beskyttende evne af DT-C. Tabel VII viser dosistitreringen for DT-C i svin.

30 35 0 DK 170948 B1 37

Tabel IV Muse-LD50 5 Virusstamme Genetiske egenskaber LD50

Rice-stamme PRVtk+gX+ 9 pde/mus DT-C tk”gX~ >l,0xl07 pde/mus HR tk“gX+ }1/5xl07 pde/mus

10 Tabel V

Beskyttelse af mus vaccineret med svækkede PRV-stammer

Geneti- Dødelighed Neutrali- ELISA

Virus ske egen- Dosis efter sations- Absorp- —tamme skaber__ (pde/mus) infektion titera tion^ 15 “ - DT-C tk“gX“ 1.0 x 10? 0/8 5120 0^051 1.0 x 106 0/8 1.0 x 105 0/8 1.0 x 104 0/8 20 1.0 x 103 0/3 1.0 X 102 2/7 1.0 x 101 7/8 HR tk“gX+ 1.5 x 107 0/6 2560 0)974 25 1.5 x 1θ6 0/7 1.5 x 105 0/8 1.5 x 101· 0/8 1.5 x 103 0/8 1.5 x 102 3/8 30 1.5 x 101 5/8

Kontrol — 7/8 <20 °/000 a Neutralisationstiter = den reciprokke værdi af den højeste 35 fortynding af serum, som er udtaget fra overlevende dyr (før infektion med PRV-Rice-stamme), og som beskytter mere end 50% af cellerne mod cytopatiske virkninger, k Absorptionsværdier repræsenterer ELISA fra reaktioner opnået ved anvendelse af en 1/10-fortynding af serum. De anvendte sera er de samme som anvendt til neutralisationsprøven.

DK 170948 B1 0 38

Tabel VI

Beskyttelse af svin vaccineret med svækket PRV-DT-C

Geometrisk middel-Aritmetrisk middel 5 Præparat Dødelighed titer af ELISA-absorptionc DT-C 0/6 26 0,072d 0,388e PR-Vac 0/6 16 0,105e 0,645e BME 3/6 <8 0,059d 0,250e a Svin, som får DT-C, PR-Vac og BME, har vægtforøgelser 10 for overlevende dyr fra dag 0 til dag 35 i forsøget på henholdsvis fra 8,1 til 27,1 kg, fra 6,5 til 23,0 kg og fra 6,0 til 11,4 kg.

tø

Geometrisk middeltal for de neutralisationstitere, som er opnået for hver enkelt af de 6 svin i hver 15 enkelt gruppe før infektion. Hver enkelt neutralisationstiter er den reciprokke værdi af den højeste serumfortynding, som beskytter over 50% af cellerne mod cytopatiske virkninger.

c Aritmetrisk middeltal af ELISA-absorptionsværdierne 20 (1/40-fortynding af sera) opnået for sera udtaget fra hver enkelt af de 6 svin/gruppe før infektion. Middeltal med forskellige tilføjelser er signifikant forskellige (P< 0,05) fra kontrolværdien fra dag 20, BME (Eagle's basalmedium). Det første tal er før infektion, det 25 andet tal er efter infektion.

30 35 0 39 DK 170948 B1

Tabel VII

Dosis titrering af DT-C i svin

Dosis Dødelighed3 Geometrisk middel- 5 (pde/svin) (Rice-infektion) titerb_ 1 x 107 0/6 23 1 x 1θ6 0/6 25 1 x 105 0/6 18 1 x 101* 0/6 18 10 1 x 103 0/6* 18 1 x 102 0/6 20

Kontrol 5/5 α 15 a Svin får indgivet 2 ml af hvert enkelt præparat i den viste dosis ved intramusmulær injektion på dag 0 og inficeres på dag 21 med ca. 80 LD50 (2,2 x 10^ pde/svin) af PRV-Rice-stamme.

•u se fodnote b til tabel VI.

20

Tabel VIII

Virulens af DT-C for får og kalve

Inokulum Døde/ Positive

Dyr (pde/dyr) Vej_ afprøvede næsevatpindek 25 Får 4 x 10? intranasal 1/3C 0/3 4 x 1θ7 intramuskulær 0/3 0/3

Kalve 4 x 107 intranasal 0/3 0/3 4 x 107 intramuskulær 0/3 0/3 30 a

Virussuspensionen indgives i et totalt volumen på 2 ml ad intranasal (1 ml pr. næsebor) eller intramuskulær vej. Dyrene iagttages for symptomer på Aujeskey's sygdom i 21 døgn efter indgift.

35 b Vatpinde af næseslimen udtages fra hvert enkelt dyr ved forsøgets afslutning, og de afprøves for PRV som ovenfor beskrevet.

DK 170948 B1 0 40 c Et får døde på dag 14 uden at vise symptomer på

Aujeskey's sygdom eller spredning af virus. Den sandsynlige dødsårsag for dette dyr var coccidiosis.

Denne sygdom blev diagnostiseret i andre får i begge 5 grupper.

Ved et andet aspekt for den foreliggende opfindelse behandles gX tk PRV yderligere for at sikre, at et virulent gx""tk+—PRV ikke bliver resultatet af en teoretisk 10 mulig rekombination mellem gX tk”-PRV ifølge opfindelsen og et vildtype-PRV i marken. Ved at følge de ovenfor beskrevne, almene metoder foretages en fjernelse i PRV gp50-genet på dets oprindelige sted, og en kopi af gp50-ge-net indsættes i tæt binding eller indsættes inden i tk-ge-15 net. Til fjernelse af det originale gp50-gen kan man anvende PvuII/BamHI-fragmentet i fragment 8 (se skema D) til gennemførelse af et mærkestofredningsforsøg som ovenfor beskrevet. Produktviruset vil være gX~tk~ og have en kopi af gp50-genet tæt bundet til eller inden i det, som bliver tilbage 20 af tk-gensekvensen. Da gp50 er essentielt for virusleve-dygtigheden, vil ethvert gX -virus, som er resultatet af en rekombination, også være gp50~ og ikke-levedygtigt.

Derfor vil det være umuligt at adskille gX - og tk -fjernelserne ved rekombination i marken til frembringelse af et 25 virulent gX -PRV.

Dette aspekt er illustreret mere detaljeret i skema K.

30 35 o DK 170948 B1 41

Skema K. Produktion af rekombinationssikre vira.

(a) ρΔΤΚ-4

BaraHI Sall Sphl Sall BamHI

5 *_1 1_II I * tktktktkddddddtktktktk (b) BaraHI 7

BaraHI Ndel PvuII Stul BamHI

10 J_J_I_]_L

XXXXXXXX 5050505050 6363636363 IIIIIIIIIII

gX-Ct

(c) PRVATKgpSO

15 BamHI Sall/Ndel Sall/Stul Sphl *—I-1_I_I * tktktktk 50505050505050505050 tktktktk

20 Ovennævnte piJTK-4 digereres med Sphl og BamHI

til frembringelse af et fragment indeholdende tk-fjernel-sen, hvorefter fragmentet isoleres. pUC19 (tilgængeligt fra Pharraacia/PL) digereres med BamHI og Sphl, og det største af de således frembragte fragmenter isoleres.

25 Derefter ligateres disse to fragmenter til frembringelse af plasmid pUCATK[-V, som indeholder et enkelt Sall-sted umiddelbart op til tk-fjernelsen. Derpå opskæres pUCATK4-V med Sall, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymersae til frembringelse af fragment A.

30 Ovennævnte fragment 8 (BamHI7) digereres med

Ndel, som opskærer mellem gX- og gp50-generne, og Stul, som opskærer i gp 63-genet, til frembringelse af et Ndel/-

Stul-fragment indeholdende gp50-genet (fragment B, ca. 1,8 kb).

Dette udfyldes med T4-DNA-polymerase, og derefter ligateres 35 fragmenterne A og B til frembringelse af plasmid pATK4gp50-8.

DK 170948 Bl 0 42

Plasmid pATK4gp50-8 opskæres med Hindlll og co-transficeres derefter med PRV-DNA ind i kaninhudceller.

Det resulterende virus dyrkes på et selektivt medium indeholdende araT til isolering af tk"-rekombinanter med den 5 struktur, som er vist i skema K (c). Dette virus er blevet betegnet PRVATKgpSO.

Derefter co-transficeres PRVATKgpSO med ovennævnte pGXTK3, og tk+-vira udvælges på 143-celler i HAT-medium.

Dette virus, kaldet PRVATKgpSOtk+(HSV), er gX~.

10 Dernæst underklones PvuII/BamHI-fragmentet indehol dende gp63-og gi-generne, fremstillet ved digerering af BamHI 7 med disse enzymer, ind i PvuII/BamHI-fragmentet fra pBR322 til frembringelse af plasmid pPR28-l (se US-patentansøgning nr. 844.113, indleveret 26. marts 1986).

15 Plasmid pPR28-l opskæres med PvuII, BamHI-bindeled adderes, og det således frembragte fragment digereres med BamHI til omdannelse af PvuII/BamHI-fragmentet på 5 kb til et BamHI-frag-ment. Dette BamHI-fragment klones derpå ind i BamHI-stedet i pPGXl (frembragt ovenfor). Det resulterende plasmid 20 co-transf iceres med PRVZ)TKgp50tk (HSV) . De resulterende vira udvælges for tk -phenotypen ved dyrkning på araT.

De udvalgte vira har gp50-genet indsat i den resterende del af tk-genet samt fjernet fra dets normale sted. De er også gX~. Derfor vil enhver rekombination med et markvirus, 25 som giver et tk+gX_-virus, frembringe et virus, som mangler et gp50-gen. Da gp50 er et essentielt gen, vil et sådant virus ikke være levedygtigt.

Skønt eksemplerne angår PRV, vil det være klart for fagfolk på området, at samme teknik kan anvendes til 30 frembringelse af tilsvarende rekombinationssikre vaccine- vira i andre herpesvira. Alment omfatter trinene 1) indsættelse af et essentielt gen umiddelbart op til en mutation, som giver avirulens, og 2) fjernelse af det essentielle gen fra det normale sted, som er bundet til det fjernede 35 gen for et udskilt protein. Endnu mere alment vil flytning af essentielle gener fra deres normale stillinger formind- 0 DK 170948 B1 43 ske sandsynligheden for rekombination med vildtypevira. Indsættelse af et udvælgeligt mærkestof er ikke absolut nødvendigt tål konstruktion af et PRV, som mangler gx.

F.eks. kan et plasmid indeholdende en fjernelse i gX-kode-5 regionen fremstilles ved fjernelse af baseparret BamHI-frag-ment fra gX-genet. Dette plasmid bliver derefter co-trans-ficeret med PRV-DNA efterfulgt af afprøvning af de vira, som stammer fra denne transfektion, for enten mangel på det fjernede stykke DNA ved nucleinsyrehybridisering eller 10 ved afprøvning for mangel af gX ved en antistofprøve (Holland et al., J. Virol., 46, side 649-652 (1983)).

De glycoprotein X-fjernelsesvira (gX"), som anvendes i vaccinerne ifølge opfindelsen, kan også frembringes ved andre teknikformer til fremkaldelse af mutationer 15 efterfulgt af afprøvning for vira, som mangler glycoprotein X, eller enhver anden teknikform, som anvendes til frembringelse af et virus, som har en fjernelse, som gør vaccineviruset serologisk forskelligt fra vildtypeviruset. Selv om man ikke kunne udvælge gX~-PRV (anti-gX-antistof-20 fer neutraliserer ikke PRV), kan man f.eks. anvende me toden ifølge T.C. Holland et al., supra, til udvælgelse for gi- eller glll-fjerneiser i PRV (Wathen, J. Virol., 58, 173-178 (1986)), som er anvendelige i vaccinerne ifølge opfindelsen.

25 Skønt svækkelse ved inaktivering eller fjernelse af tk-genet (Tatarov, supra, Post og Roizman, supra) er den foretruknemetode, kan gX--vira ifølge opfindelsen underkastes konventionelle, kemiske eller fysiske inaktiveringsprocesser, hvorved viruset gøres ikke-virulent, men stadigvæk beholder 30 sine antigene egenskaber. Disse inaktiverede vacciner kan formuleres med et hensigtsmæssigt hjælpestof, f.eks. alun.

Til en almen beskrivelse af forskellige teknikformer til vaccinefremstilling henvises til J.I. Duffy, Vaccine Preparation Techniques, Noyes Data Corporation (1980), 35 og G.W. Warr, "Preparation of Antigens and Principles of Immunization", i J.J. Marchalonis og G.W. Warr, udgivere, 44 DK 170948 B1 o

Antibody As A Tool - The Applications Of Immunochemistry, side 21-58, John Wiley og Sons (1982).

Det virulente PRV-virus kan formeres i dyrevævs-kulturer, indtil viruset er gjort ikke-patogent, dvs.

5 avirulent. PRV kan formeres i en bred mangfoldighed af vævskultursystemer, herunder f.eks. kyllingefostre, andefostre, svinenyrer, svinetestikler, oksefosternyrer, kattenyrer, hundenyrer og abenyrer, samt i etablerede cellelinier, f.eks. Madin Darby oksenyre (MDBK) og 10 Madin Darby hundenyre (MDCK).

Svækkelse af PRV kan opnås ved standardserie-passageteknikformer, herunder en afsluttende fortyndingspassage, idet der anvendes et antal passager i en følsom vævskultur, indtil viruset er ikke-patogent uden tab af immu-15 nogenicitet.

Tidsintervallerne mellem passagerne bør være tilstrækkelige til at tillade, at viruset replikerer mellem passagerne, og inkubationstemperaturerne er fortrinsvis fra ca. 30 til ca. 38°C. Den optimale passagetid afhænger af 20 det specielle virus, det kultursystem og den temperatur, som anvendes.

Det færdige vaccineprodukt bør indeholde en mængde avirulent PRV, som er tilstrækkelig til stimulering af en immunreaktion i sygdomsfølsomme dyr, og stadigvæk være ikke-25 -pathogen. Den anbefalede titer, som skal indgives til det 3 5 følsomme dyr, er fra ca. 10 til ca. 10 pladedannende en- 4 heder, fortrinsvis ca. 10 pladedannende enheder.

Viruspræparaterne ifølge opfindelsen kan fortyndes med vand til indstilling af deres styrke, og der kan dertil 30 være sat stabilisatorer, såsom dextrose og lactose, eller andre ikke-toksiske stoffer. Viruspræparaterne kan også tørres, f.eks. ved frysetørring, til opbevaringsformål eller til efterfølgende formulering til flydende vacciner.

Vaccinerne kan indgives dyrene ad forskellige veje, herunder intramuskulært, intravenøst, subcutant, intratra-chealt og intranasalt. Den foretrukne indgiftsvej er den in-tramuskulære.

35 45 0 DK 170948 B1

Til vaccination af søer kan anvendes en kur med to doser. Den første dosis kan indgives fra ca. flere måneder til ca. 5-7 uger, før soen får grise. Den anden dosis af vaccinen bør derefter indgives nogle uger efter den første 5 dosis, f.eks. fra ca. 2 til 4 uger senere, og vaccine kan indgives, indtil, men dog før, soen får grise. Alternativt kan vaccinen indgives som en enkelt 2 ml dosis, f.eks. ca. 5-7 uger, før soen får grise. En kur med 2 doser anses imidlertid for at være at foretrække til den mest effektive 10 immunisering af smågrisene. Halvårlig revaccination anbefales til ynglende dyr. Orner kan revaccineres til enhver tid.

Søer kan også revaccineres før yngling. Smågrise født af uvaccinerede søer kan vaccineres ca. 3 dage gamle.

Vaccinen kan også kombineres med andre vacciner for 15 andre sygdomme til fremstilling af en multivalent vaccine, som også kan indgives ad en vilkårlig af ovenstående veje.

Den kan også kombineres med andre medikamenter, f.eks. antibiotika.

En vaccine fremstillet ifølge den foreliggende 20 opfindelse vil stimulere en immunreaktion i et dyr, som er følsomt for sygdommen, uden at frembringe de kliniske symptomer, som forårsages af det virulente virus, i nogen signifikant udstrækning. En farmaceutisk effektiv mængde af vaccinen kan anvendes sammen med et farmaceutisk acceptabelt bære-25 stof eller fortyndingsmiddel til vaccination af sådanne dyr som svin, kvæg, får, geder og andre pattedyr.

30 35

Claims

1. Ikke naturligt forekommende pseudorabiesvirus, kendetegnet ved, at glycoprotein X-genet er inak- 5 tiveret.

2. Pseudorabiesvirus ifølge krav l, kendetegnet ved, at det har en fjernelse i glycoprotein X-genet.

3. Pseudorabiesvirus ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det ingen funktionel thymidinkinase 10 producerer.

4. Pseudorabiesvirus ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det har en fjernelse i thymidinkinasegenet.

5. Pseudorabiesvirus ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det også 15 har en fjernelse i gp50-genet på dets oprindelige sted, og at gp50-genet er indsat inden i eller i tæt binding med thymidinkinasegenet.

6. Vaccine, kendetegnet ved, at den indeholder et pseudorabiesvirus ifølge et hvilket som helst af 20 de foregående krav.

7. Fremgangsmåde til serologisk skelnen mellem dyr, som er inficeret af et virulent pseudorabiesvirus, og dyr, som er vaccineret mod dette virulente pseudorabiesvirus med en vaccine ifølge krav 6, kendetegnet ved, 25 at forskellen i produktionen af antistoffer mod glycoprotein X bestemmes ved en rutineundersøgelse, såsom ELISA af serumprøver fra de respektive dyr.