DK168876B1 - Middel, der kan administreres oralt eller subcutant, til inhibering af angiogenese hos pattedyr samt fremgangsmåde til fremstilling af et sådant middel - Google Patents

Description

DK 168876 B1

Den foreliggende opfindelse angår et middel, der kan administreres oralt eller subcutant, til inhibering af an-giogenese hos pattedyr. Nærmere bestemt angår opfindelsen lægemidler, ved hjælp af hvilke man kan behandle pattedyr 5 med heparin eller heparin-fragmenter og med cortison, hy-drocortison eller 11-a-isomeren af hydrocortison med henblik på at inhibere angiogenese med efterfølgende regression af store tumormasser og forebyggelse af tumor-metastaser hos pattedyr, som bærer sådanne tumorer. Opfindel-10 sen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant middel.

Angiogenese, som er vækst af nye kapillarblodkar, er et vigtigt fænomen i normale processer, såsom fosterudvik-15 ling, dannelse af corpus luteum og heling af sår. Angiogenese er også en komponent i patologiske processer, såsom kronisk inflammation, visse former for immunrespons og neoplasi. Endvidere er angiogenesen en egenskab ved de fleste faste tumorer og nødvendig for disse tumorers 20 fortsatte vækst.

Det er tidligere blevet fremført, at heparin forøger intensiteten af angiogenese induceret af tumorer in vivo, selv om hverken heparin eller mastcellerne, som frigiver 25 heparin, har vist sig i stand til at inducere angiogenese i fravær af tumorceller eller tumorekstrakt; Taylor og Folkman, Nature Vol. 297, 307-312 (1982). Det er endvidere blevet rapporteret af Shubik et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 56, 769-774 (1976), at 6o-methyl-prednisolon 30 virker delvis undertrykkende på tumor-angiogenese i kindposerne hos hamstere under bestemte betingelser, men at tumorvæksten ikke lader sig standse, og mange andre publikationer har rapporteret vedvarende tumorvækst, selv under tilstedeværelse af store doser cortison. Endvidere 35 er det blevet rapporteret af Gross et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, Vol. 78, 1176-80 (1981), at medroxypro-gesteron, dexamethason og i mindre udstrækning cortison DK 168876 B1 2 virker inhiberende på tumor-angiogenese i hornhinderne hos kaniner, mens østradiol og testosteron er uden virkning.

5 Heparin, som er en o, Æ-glycosidisk bundet, højt sulf ateret copolymer af uronsyre og glucosamin, har i et halv århundrede været anvendt klinisk som et anti-koagula-tionsmiddel. På trods af forbindelsens store betydning og vidtstrakte anvendelse har man hverken opklaret den nøj-10 agtige struktur af heparin eller den bestemte måde, hvorpå forbindelsen virker som anti-koagulationsmiddel i blod. Mange af de vanskeligheder, der er forbundet med at bestemme strukturen af heparin, skyldes, at forbindelsen ikke er en homogen substans. Heparin er en polydispers 15 forbindelse med en molekylvægt i intervallet fra 5000 til 40.000. Inden for en given kæde finder man også strukturelle variationer, såsom forskellige grader af sulfatering, N-acetylering og C-5-epimerisering i uronsyre-resten.

20

Som følge heraf varierer den nøjagtige sammensætning af kommercielt heparin i afhængighed af forbindelsens oprindelse og den anvendte rensningsmetode. Heparin har været udsat for nedbrydning ved behandling med heparinase (et 25 enzym af bakteriel oprindelse beskrevet i US patentskrift nr. 4 341 869), hvorved molekylet spaltes ved de a-glyco-sidiske bindinger imellem N-sulfateret D-glucosamin-6-sulfat og L-iduronsyre-2-sulfat under dannelse af fragmenter, hertinder disaccharider, tetrasaccharider, hexa-30 saccharider og større oligosaccharider, som hver især simpelt hen er et kædeafkortet heparin-fragment med mindre modifikationer af de endestillede grupper (nedbrydningen resulterer i en Δ-4,5-umættethed i den terminale uronsyrerest), se Linhardt et al., J. Biol. Chem., Vol.

35 257, 7310-13 (1982).

DK 168876 B1 3

Visse midler til topisk applikation, som både indeholder heparin og hydrocortison eller hydrocortisonacetat, er beskrevet i litteraturen. F.eks. nævner Dicitionnaire VIDAL, side 793 og 1637 (1961) pomader og suppositorier 5 indeholdende disse komponenter sammen med andre ingredienser, såsom methyl- eller propyl-1,4-oxybenzoat. Fra R. Bueher: Drugs Made in Germany, Vol. 5, side 201 (december 1962) kendes en salve indeholdende hydrocortisonacetat, heparin og neomycinsulfat til behandling af ulcus cruris, 10 cicatrix, eksem og hæmorrhoider, og Rote Liste, side 947 (1961) omtaler et salvepræparat indeholdende heparin og hydrocortison til behandling af thrombophlebitis, varicer og ulcus cruris. Der er imidlertid ikke nogen af disse præparater, der er beregnet til - eller egner sig til -15 oral eller subeutan administrering.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes et middel, der kan administreres oralt eller subeutant, til inhibe-ring af angiogenese hos pattedyr. Midlet ifølge opfindel-20 sen er ejendommeligt ved, at de aktive bestanddele i det væsentlige består af 1) heparin eller et heparin-frag-ment, som er et hexasaccharid eller et større fragment, og 2) cortison, hydrocortison eller 11-a-isomeren af hydrocortison.

25

Det har således overraskende vist sig, at det er muligt at inhibere angiogenese hos pattedyr og at bringe tumormasser hos pattedyr til regression (og derved forhindre metastase) ved oralt eller subeutant at indgive heparin 30 eller heparin-fragmenter, som er hexasaccharider eller større fragmenter, sammen med cortison, hydrocortison eller 11-a-isomeren af hydrocortison. Det fuldstændige navn for isomeren er 11-a, 17,21-trihydroxypregn-4-en-3,20-di-on. Hverken modne ikke-voksende blodkar eller karvæv sy-35 nes at blive påvirket ved behandling med midlet ifølge opfindelsen. En inhibering af angiogenese i overensstemmelse med opfindelsen er, ud over virkningen med hensyn DK 168876 B1 4 til tumor-regression og metastase hos tumorbærende pattedyr, et effektivt kontraceptivt middel for hundyr, også selv om det angiogenese-inhiberende middel først indgives efter at inseminationen har fundet sted. Desuden er det 5 omhandlede middel effektivt til at reducere osteoporosis, ligesom det er effektivt til behandling af lidelser, der involverer neovaskularisering, såsom neovaskulære øjensygdomme .

10 Hverken cortison, hydrocortison eller 11-a-isomeren af hydrocortison bevirker alene en effektiv inhibering af angiogenese, og forbindelserne bevirker heller ikke tumorregression i fravær af heparin eller et heparin-frag-ment. Heparin alene inhiberer ikke angiogenese, men vir-15 ker tværtimod forstærkende herpå.

Administreringen af midlet ifølge opfindelsen kan foregå ad oral eller subcutan vej, idet "subcutan" omfatter intravenøs, intra-arteriel og subcutan injektion. Når der 20 er tale om heparin, som er kommercielt tilgængeligt i form af heparin-natrium, vil den orale indgivelse føre til en nedbrydning i mave-tarmkanalen, som resulterer i et tab af forbindelsens anti-koagulerende virkning, men eftersom det har vist sig, at nedbrydningsprodukterne om-25 fatter disaccharider og større fragmenter, er denne indgivelsesmetode særdeles effektiv i forbindelse med den foreliggende opfindelse, både med hensyn til heparin og med hensyn til heparin-f ragmenter. Såvel heparin som fragmenterne heraf kan anvendes i enhver fysiologisk ac-30 ceptabel, ikke-toxisk form, herunder i form af metalsalte, fortrinsvis natriumsalte, som alle omfattes af betegnelserne "heparin" og "fragment" i nærværende beskrivelse. Med henblik på at opnå de bedst mulige resultater foretrækker man heparin, som forhandles under handelsnavnet 35 "Panheprin"® (Abbott Laboratories), men man kan også anvende heparin fra andre leverandører, såsom Hepar, Inc., omend disse hepariner er mindre effektive. Cortison og de DK 168876 B1 5 fysiologisk acceptable, ikke-toxiske salte deraf, såsom acetatet, er kun i meget begrænset omfang opløselige i vand, og disse forbindelser indgives derfor fortrinsvis subcutant, og ikke oralt. Til oral indgivelse foretrækker 5 man hydrocortison eller dennes 11-a-isomer (idet disse forbindelser er relativt vandopløselige sammenlignet med cortison) eller et af deres vandopløselige, fysiologisk acceptable, ikke-toxiske salte, såsom phosphatet. Vand-uopløselige salte af hydrocortison eller 11-a-isomeren 10 heraf, som er ikke-toxiske og fysiologisk acceptable, indgives subcutant. Betegnelserne "cortison", "hydrocortison" og "11-a-isomeren af hydrocortison" benyttes i nærværende beskrivelse om såvel selve steroiderne som saltene deraf, således som defineret ovenfor.

15

De anvendte doser er kun begrænset af de velkendte grænser, der gælder for individuel administrering af forbindelserne cortison, hydrocortison og 11-a-isomeren heraf med henblik på opnåelse af de sædvanlige virkninger. He-20 parin kan indgives subcutant i så store mængder, som kan tolereres uden uheldige anti-koagulationsvirkninger. Eftersom heparin, der indgives oralt, ikke har nogen an-ti-koagulerende virkning, og da hexasaccharid-fragmentet ikke har nogen anti-koagulerende virkning, uanset om det 25 indgives oralt eller på anden måde, er det således muligt at indgive store doseringer uden risiko for blødninger. Orale doseringer af heparin af størrelsesordenen 27.000-45.000 enheder pr. kg legemsvægt pr. dag har vist sig at være effektive, men ved subcutan indgivelse viste det 30 sig, at doser på over ca. 600 enheder pr. kg legemsvægt to gange dagligt førte til uønskede anti-koagulations-virkninger. Med hensyn til hexasaccharid-fragmentet har det vist sig, at en dosis på 7 mg pr. kg legemsvægt to gange dagligt er effektiv ved subcutan indgivelse. Corti-35 sonacetat har vist sig effektivt i subcutane doseringer fra 250 mg/kg/dag ned til 37 mg/kg/dag, og hydrocortison har vist sig effektiv ved oral indgivelse i mængder på DK 168876 B1 6 0,45 mg/ml drikkevand (omkring 75 mg/kg/dag). Med hensyn til aktivitet er 11-e-isomeren af hydrocortison praktisk talt ligestillet med hydrocortison til opfindelsens formål.

5

Den dosisstørrelse, som kræves for at tilvejebringe regression af tumorer eller til at forhindre metastase, varierer i nogen grad i afhængighed af identiteten af tumoren, og det samme gælder for det tidsrum, som kræves for 10 at fremkalde en fuldstændig regression af tumoren. Tumorens størrelse ved begyndelsen af behandlingen påvirker også længden af den tidsperiode, som kræves til opnåelse af fuldstændig regression. På grund af forekomsten af an-giogenese ved psoriasis og arthritis kan det forventes, 15 at midlet ifølge opfindelsen vil være nyttigt til behandling af disse sygdomme. Eftersom indgivelsen af cortison, med eller uden heparin eller heparin-fragmenter, kan resultere i en lungeinfektion efter nogle dages forløb, er det ønskeligt samtidig at indgive et passende antibioti-20 kum som profylakse under behandlingen med midlet ifølge opfindelsen.

Det foretrækkes at opløse eller suspendere heparin (eller et fragment heraf) og cortison, hydrocortison eller 11-a-25 isomeren af hydrocortison i en passende bærer, som i sig selv skal være ikke-toxisk og fysiologisk acceptabel, såsom vand eller en normal saltopløsning. Man kan anvende midler, der indeholder blandinger af de aktive bestanddele, enten i tør form eller i en passende bærer.

30

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 35

Cortisonacetat (0,9 mg i 0,9 ml saltopløsning) blev udhældt over chorioallantoin-membranen af 8 dage gamle kyl- DK 168876 B1 7 lingefostre igennem en på forhånd frembragt åbning i æggeskallen. På den 9. dag blev 100 ug tumorekstrakt fra hepatoma-celler (som beskrevet af Zetter, Nature Vol.

285, 41-43, 1980) i 5 ul 1^0 anbragt i centret af en rund 5 plastic-dækplade med diameter 15 mm, og ekstrakten fik lov at tørre. I centrum af hver dækplade blev derefter anbragt en 5 ul prøve, der enten indeholdt heparin (6 ug svarende til 1 enhed) eller vand, og mindst 20 fostre blev udsat for hver prøve. Efter tørring blev dækpladen 10 anbragt på chorioallantoinmembranen. Et yderligere antal kontrolfostre modtog tumor-ekstrakt og/eller heparin, men blev ikke på forhånd behandlet med cortisonacetat. Membranerne blev undersøgt på dag nr. 11 ved hjælp af et stereoskop, der forstørrede 12 gange. Angiogenese var til 15 stede, hvis man kunne se nye kapillarer konvergere på pletten i dækpladens centrum. Alle de fostre, der var behandlet med vand eller heparin, men ikke med cortison, udviste angiogenese, hvilket også gjaldt for 80% af de fostre, der var behandlet med cortisonacetat alene. Mind-20 re end 2% af de fostre, der var behandlet med både heparin og cortisonacetat, udviste angiogenese.

EKSEMPEL 2 25 Slimhinde-heparin fra svin blev fuldstændigt nedbrudt under anvendelse af heparinase ved proceduren beskrevet af Langer et al., Science Vol. 217, 261-63 (1982), og produkterne blev fraktioneret under anvendelse af Sephadex®-kolonner ækvilibreret med 1M NH^OAc. Det nedbrudte hepa-30 rin havde ikke nogen anti-koagulerende virkning som bestemt ved aktiveret partiel thromboplastisk tid eller genforkalkningstiden for helt blod. Produktet eller produktblandingen (250 mg) blev opløst i 1 ml 1M NH^OAc, overført til en G-15 kolonne med dimensionerne 75 x 2,5 35 cm og elueret med en hastighed på 0,5 ml/min. Dette resulterede i flere ufuldstændigt resolverede toppe svarende til tetra-, hexa- og højere oligosaccharider samt en DK 168876 B1 8 separat top svarende til disaccharid-produktet. Denne di-saccharid-top blev frysetørret, opløst i 0,2 ml 1M NH^OAc og rechromatograferet på G-15, hvilket resulterede i den samme skarpe top, som derefter blev frysetørret. Blandin-5 gen af tetra-, hexa- og oligosaccharider blev frysetørret, genopløst i 1 ml 1M NH^OAc og elueret fra en G-50 kolonne med dimensionerne 50 x 1,25 cm ved en hastighed på 2 ml/min, hvilket resulterede i en ikke-resolveret dobbelt top svarende til tetra- og hexasaccharid-fragmen-10 terne samt en yderligere top svarende til oligosaccharider, som blev frysetørret. Tetra- og hexasaccharid-fragmenterne blev kombineret, frysetørret, genopløst i 1M NH^OAc og overført til en G-15 kolonne. Tetrasaccharidet blev elueret fra en G-15 kolonne i en enkelt top, hvis 15 center blev udskåret og frysetørret. Hexasaccharid-fraktionen blev frysetørret, genopløst i en 0,3 ml 1M NH^OAc og elueret fra en G-15 kolonne i en enkelt top, hvis center blev udskåret og frysetørret.

20 Fragmentstørrelsen blev bestemt ved at opløse en afvej et mængde af hver fraktion i 0,03 M saltsyre og måle absor-bansen af denne opløsning ved 232 nm. Molekylvægten af hvert fragment blev beregnet ved at anvende en molær absorptionskoefficient (for den o, 5-umættede carboxylat-25 endegruppe, der er til stede i hvert af disse produkter), på e = 5500. Di- og tetrasacchariderne blev yderligere karakteriseret ved sammenligning af deres gennemsnitlige . K-værdier på G-15 med mono-, di- og trisaccharid-standar-der. De målte molekylvægte var 530, 1210, 1600 og 1870 30 for henholdsvis di-, tetra-, hexa- og oligosaccharid-fraktionerne.

De forskellige heparin-fragmenter blev opløst i methyl-cellulose- skiver, enten alene eller sammen med cortison-35 acetat. Skiverne blev derefter overført til fire dage gamle blommesæk-membraner fra kyllingefostre dyrket i Petri- skåle som beskrevet af Taylor og Folkman, Nature, DK 168876 B1 9

Vol. 297, 307-312 (1982). Ved tilstedeværelse af corti-sonacetat (100 ag) udviste hexasaccharid-fragmentet den højeste anti-angiogenese-virkning, hvilket fremgår af den efterfølgende tabel.

5

TABEL I

% Fostre, der udviklede avaskulære zoner 48 timer efter implantation af methylcelluloseskiver i 4 dage gamle IQ blommesæk-membraner

Kone. Oligo- Hexa- Tetra- Di- (ug) saccharider saccharid saccharid saccharid 15 - 12 alle døde 100% 0% 0% 8 100% 100% 4 25% 100% 1 25% 50% 20 0,1 0 50%

Tetra- og disacchariderne var inaktive.

25 Oligosacchariderne var mindre aktive, og de var toxiske i højere koncentrationer. Derfor blev hexasaccharid-fragmentet benyttet i de efterfølgende eksperimenter. I den voksende 6 dage gamle choriollantoinmembran frembragte de skiver, der indeholdt hexasaccharid (12 ag) og cortison-30 acetat (100 ag), store avaskulære zoner op til 12,6 +0,1 mm i diameter i løbet af 48 timer. Som i tilfældet med heparin (med cortisonacetat) var der ingen kapillarer til stede i det mesodermale lag, mens de andre to lag af væv i membranen var intakte og levedygtige. Hexasaccharid 35 alene fremskynder ikke tumor-angiogenese, sådan som tilfældet er med heparin.

DK 168876 B1 10

Alle skiver indeholdt en kombination af cortisonacetat (100 ug) og et heparin-fragment. Der udvikledes ingen avaskulære zoner i nærværelse af et heparin-fragment alene og heller ikke med cortison eller methylcellulose ale-5 ne. Der anvendtes ti fostre i hver gruppe. Med hexasac-charid (plus cortison) var arealet af den avaskulære zone 17% af den vaskulære membran ved 12 ug og 15% ved 0,1 ug.

For oligosacchariderne var det maksimale avaskulære areal 10%.

10 EKSEMPEL 3

Befrugtede kyllingefostre blev udtaget fra deres skaller på dag nr. 3 (eller nr. 4) og inkuberet i en Petri-skål i 15 en atmosfære med høj fugtighed og indeholdende 5% CO2 som tidligere beskrevet af Auerbach et al., J. Devel. Biol., vol. 41, 391-94 (1974), idet der dog ikke anvendtes en ydre skål og antibiotika. På dag nr. 6 blev en methylcel-lulose-skive (10 ul), der indeholdt enten heparin (6 ug), 20 et hexasaccharid-heparin-fragment (12 ug), cortisonacetat (Sigma, pulver uden indhold af konserveringsmidler og suspenderingsmidler) eller en kombination af cortisonacetat og heparin eller cortisonacetat og hexasaccharid, im-planteret på chorioallantoinmembranen. Fostrene blev un-25 dersøgt 48 timer senere, og hvis der var fremkommet en klar avaskulær zone rundt om methylcellulose-skiven, blev denne zones diameter målt med en Nikon© Profile projektor ved en forstørrelse på 20 gange. Der anvendtes 30 fostre i hver gruppe. Der injiceredes tusch i hjertet på nogle 30 af fostrene umiddelbart inden formalin-fixering, således at det blev muligt at følge karrene til kanten af den avaskulære zone i histologiske sektioner.

Hexasaccharid og cortisonacetat producerede avaskulære 35 zoner med en diameter på 12,6 + 0,1 mm i alle fostre. Heparin og cortisonacetat producerede avaskulære zoner med en diameter på 8,9 + 0,7 mm. Der viste sig ikke nogen DK 168876 B1 11 avaskulære zoner i nærværelse af nogen af forbindelserne alene eller med methylcellulose alene.

Histologiske tværsnit af chorioallantoin-membranerne 5 viste, at kapillarerne udviklede sig normalt i nærværelse af enhver af forbindelserne alene. I modsætning hertil var der fuldstændigt fravær af kapillarer i det mesoder-male lag i nærværelse af enten hexasaccharid og cortison-acetat eller heparin og cortisonacetat, mens de ektoder-10 male og endodermale cellelag forblev upåvirkede. I den modne chorioallantoin-membran, hvor karrene ikke længere vokser, var kombinationerne af cortisonacetat og heparin eller cortisonacetat og hexasaccharid-fragment uden virkning .

15 EKSEMPEL 4

Polymerkorn (pellets) af ethylen-vinylacetat-copolymer (EVA) med en diameter på omkring 1 mm blev imprægneret 20 (idet man anvendte proceduren beskrevet af Langer et al.,

Nature, Vol. 263, 797-800 (1976)) med 180 ug heparin (Sigma), med 300 ug hexasaccharid-fragment, med 1,5 mg cortisonacetat (Sigma) eller med en kombination af corti-son og heparin. Kornene blev implanteret i hornhinden af 25 et kaninøje i en afstand af 1 mm fra limbus, og et stykke 3 V2 carcinoma, med et volumen på 1 mm blev implanteret distalt til polymeren i en afstand af 2 mm fra limbus. I det andet øje på hver kanin blev implanteret kontrolkorn, som var tomme, i sammenstilling med tumoren.

30

De gennemsnitlige frigivelseshastigheder var 15 ug/dag for heparin, 21 ug/dag for hexasaccharid-fragmentet og 5 ug/dag for cortison. Når forbindelserne blev blandet, blev de frigivet med samme hastighed. Det viste sig ved 35 spektrofotometri, at kornene frigav heparin i 14 dage, hexasaccharid i 11 dage og cortison i mere end 30 dage.

DK 168876 Bl 12

Efterhånden som kapillarblodkarrene voksede imod den implanterede tumor, blev den maksimale karlængde målt hver 3. dag med en stereoskopisk spaltelampe med en forstørrelse på 10 gange (+ 0,1 mm). På den 14. dag blev kani-5 nerne aflivet, og der injiceredes tusch i hver halspulsåre. Hornhinderne blev udtaget og undersøgt med et stereoskop .

Der kunne observeres nye kapillarblodkar, som voksede 10 imod tumoren og passerede over en tom pellet eller en pellet, der indeholdt heparin alene, med en gennemsnitshastighed på 0,44 mm/dag og over en pellet, der indeholdt cortison alene, med en hastighed på 0,22 mm/dag. Tumorerne bag disse pellets blev vaskulariseret i løbet af 6 til 15 8 dage. Når kornene indeholdt både cortison og heparin, var der ikke nogen kapillarvækst i 13 dage. Da heparin-cortison-kornene blev fjernet, eller når de var tømt for heparin, blev kapillarvæksten genoptaget. Histologiske snit viste, at tumorcellerne forblev levedygtige med mu-20 lighed for replikation, selv når de befandt sig umiddelbart op ad heparin-cortison-kornene.

I nærværelse af implanterede korn, hvori hexasaccharid-fragmentet fra eksempel 2 erstattede heparin, voksede nye 25 kapillarer imod tumorerne med en middelhastighed på 0,30 mm/dag i nærværelse af hexasaccharid-kornene, med en middelhastighed på 0,14 mm/dag, når kornene indeholdt cortison, og med en middelhastighed på 0,32 mm/dag, når kornene var tomme. I nærværelse af hexasaccharid-cortison-kom-30 binationen kunne der hos 4 kaniner ikke iagttages nogen kapillarvækst i løbet af den 13 dage lange observationsperiode, mens der hos en kanin voksede nogle få kapillarer med en hastighed på 0,07 mm/dag.

35 DK 168876 Bl 13 EKSEMPEL 5 (a) Ovarie-sarcoma 5 Ved hjælp af en trokar implanteredes tumorstykker af 3 størrelsen 1 mm subcutant 1 ryggen på 30 mus, der blev inddelt i grupper på 5. Behandlingen blev påbegyndt 10 dage senere, da det gennemsnitlige tumorvolumen var 1,5 x 2 3 · 10 mm . Den orale indgivelse af heparin var 200 enhe-10 der/ml i drikkevandet, og det gennemsnitlige daglige forbrug var 3-5 ml vand pr. 22 g mus. Cortisonacetat blev indgivet subcutant 1 gang dagligt i en dosis på 250 mg/kg i 6 dage, 125 mg/kg i 1 dag, 75 mg/kg i 1 dag og derefter en daglig vedligeholdelsesdosis på 37 mg/kg (en "spidsdo-15 sis"). Kontroldyrene modtog enten injektioner med saltvand, eller de modtog heparin alene eller cortisonacetat alene. Alle kontroldyrene var døde på dag nr. 34 med store primære tumorer og lungemetastaser. Alle mus, som var behandlet oralt med heparin og cortison i "spidsdo-20 ser", blev tumorfri på dag nr. 15 og forblev tumorfri, efter at behandlingen var blevet afbrudt.

En yderligere gruppe af mus blev behandlet på tilsvarende måde, idet de dog fik indgivet heparin to gange dagligt 25 ad subcutan vej i en dosis på 627 enheder, og der blev indgivet cortisonacetat subcutant en gang dagligt i en ensartet dosis på 75 mg/kg. Musenes respons var den samme som i det første forsøg med den undtagelse, at tumorerne vendte tilbage, efter at behandlingen var blevet afbrudt.

30 Disse mus blev permanent tumorfri, når de blev behandlet oralt med en "spidsdosis" af heparin og cortisonacetat som beskrevet ovenfor. En af disse mus døde på dag nr. 31 uden nogen stor primær tumor og uden nogen metastaser.

35 DK 168876 Bl 14 (b) Lewis lungecarcinoma

Behandlingen begyndte 7 dage efter implantation af et tu-morstykke på 1 cm i 42 mus, der inddeltes i grupper på 7 5 mus. Behandlingen foregik oralt med heparin og subcutant med cortisonacetat i "spidsdoser" som beskrevet ovenfor.

Alle kontroldyr var døde på dag nr. 33 med store tumorer og talrige lungemetastaser. I grupperne, som blev behandlet med heparin og cortisonacetat, blev behandlingen af-10 brudt hos hver enkelt mus, når tumoren havde været usynlig i omkring 7 dage. Ved oral behandling med heparin og cortisonacetat var alle mus ude af behandling på dag nr.

33, og de forblev tumorfri. I en anden gruppe, som blev behandlet subcutant med heparin og subcutant med corti-15 sonacetat (75 mg/kg), var 5 mus ude af behandling på dag nr. 37, og de forblev tumorfri. 2 mus døde af lungebetændelse på henholdsvis dag nr. 30 og dag nr. 33, og de 3 havde små primære tumorer (der var mindre end 75 mm ). I en mus blev fundet en enkelt metastase.

20

Med henblik på at fastslå, om andre steroider kunne erstatte cortison, blev heparin indgivet sammen med hydro-cortison, dexamethason eller medroxyprogesteron. Kun hy-drocortison viste sig at være lige så effektiv som corti-25 sonacetat med hensyn til at fremkalde tumor-regression, når forbindelsen blev indgivet sammen med heparin. Ved de højeste doser, som kunne tolereres, kunne hverken dexame-thasol (3,2 mg/kg) eller medroxyprogesteron (112 mg/kg) fremkalde en regression af Lewis lungetumorer, hverken 30 med eller uden heparin.

(c) B-16 Melanoma g 7,4 x 10 melanoma-celler blev injiceret subcutant i 40 35 mus, som blev inddelt i grupper på 5. En af disse grupper blev behandlet oralt med heparin, som beskrevet ovenfor, og oralt med hydrocortison (0,45 mg/ml i drikkevand). En DK 168876 B1 15 anden gruppe blev behandlet oralt med heparin og subcu-tant med cortisonacetat ("spidsdosis"), mens en 3. gruppe blev behandlet subcutant med heparin og cortisonacetat (75 mg/kg). Kontrolgrupperne modtog enten vand, heparin 5 alene eller hydrocortison eller cortisonacetat alene. Alle kontroldyrene var døde på dag nr. 31 efter udvikling af store tumorer og lungemetastaser. I grupperne, som blev behandlet med heparin og cortisonacetat, blev behandlingen afbrudt, efter at tumoren havde været usynlig 10 i omkring 7 dage. I gruppen, som blev behandlet oralt med heparin og cortisonacetat i "spidsdosis", døde den ene mus på dag nr. 24 med en delvis tilbagevendt tumor og to lungemetastaser, som var avaskulære og målte mindre end 0,1 mm. Alle andre mus i gruppen blev tumorfri og forblev 15 som sådanne, efter at deres behandling var blevet afbrudt på dag nr. 32. I gruppen, som blev behandlet subcutant med heparin og cortisonacetat, døde en mus på dag nr. 18 og en anden på dag nr. 21. Ingen af disse døde mus havde lungemetastaser. Behandlingen blev afbrudt for de øvrige 20 3 mus i gruppen på dag nr. 32. Tumorerne blev 3 uger se nere genbehandlet med godt resultat, idet der anvendtes oral indgivelse af heparin og cortisonacetat i "spidsdo-sis", og disse mus forblev tumorfri. I gruppen, som blev behandlet oralt med heparin og hydrocortison, forblev al-25 le mus tumorfri, efter at deres behandling var blevet afbrudt på dag nr. 47. Den orale behandling med heparin og hydrocortison syntes at være mere effektiv til behandling af melanoma end til behandling af ovariesarcoma eller Lewis lungecarcinoma.

30 (d) Blære carcinoma 3 70 mus, inddelt i grupper på 7, modtog subcutant en 1 mm tumorimplantation. Alle kontroldyr var døde på dag nr. 31 35 efter udvikling af store primære tumorer. Ingen af de mus, som var bærere af blærecarcinoma, udviklede lungemetastaser. En af grupperne blev behandlet oralt med hepa- DK 168876 B1 16 rin og subcutant med cortisonacetat ("spidsdosis"), idet behandlingen begyndte på dag nr. 9, hvor det gennemsnit- 3 lige tumorvolumen var 140 mm . Tumorerne holdt op med at vokse, men forsvandt kun delvis, hvorefter de indtog en 5 stationær tilstand, hvorunder tumorvolumenet forblev på 3 omkring 70 mm , så længe behandlingen blev fortsat (dvs. yderligere 61 dage). En enkelt mus døde af lungebetændelse på dag nr. 19. De "hvilende" tumorer var levedygtige, hvilket viste sig ved, at tumorerne påny begyndte at 10 vokse, hver gang behandlingen blev afbrudt, hvilket skete for en mus ad gangen begyndende på dag nr. 70. For en anden gruppe, der blev behandlet subcutant med heparin og cortisonacetat (75 mg/kg) som beskrevet ovenfor, var resultaterne tilsvarende, dvs. en langvarig "tumor-hvile".

15 En af musene døde på dag nr. 21.

På grund af den manglende evne hos standard-behandlingen, der består af oral indgivelse af heparin og cortisonacetat, til at frembringe en fuldstændig regression benytte-20 des højere orale koncentrationer af heparin med andre grupper. Med en oral "spidsdosis" af heparin (600 enhe-der/ml) og cortisonacetat opnåedes en mere signifikant tumorregression, og en stationær tilstand ("hvile") blev nået ved et mindre tumorvolumen på omkring 45 mm . En af 25 musene døde. Med 1000 enheder/ml heparin opnåedes imidlertid en fuldstændig regression. Her forblev musene tumorfri efter afbrydelse af behandlingen på dag nr. 39. Ingen mus døde i denne gruppe.

30 Sammenfattende kunne det fastslås, at alle tumorer enten standsede deres vækst eller undergik regression, når der blev indgivet en kombination af heparin og cortisonacetat. Hvis en af disse forbindelser derimod blev anvendt alene, fortsatte tumorvæksten med samme hastighed som hos 35 dyr, der kun modtog injektioner med saltvand. Alle sådanne kontroldyr døde efter svære tumor-angreb.

DK 168876 B1 17

Hos størstedelen af dyrene, der blev behandlet med heparin og cortisonacetat, var det muligt at opnå en "fuldstændig regression", hvilket vil sige, at tumorerne ikke begyndte at vokse igen, når behandlingen blev afbrudt.

5 Ved den mest effektive behandling, som bestod af en oral indgivelse af heparin (200 enheder/ml) og en subcutan "spidsdosis" af cortison, var det således muligt at opnå "fuldstændig regression" af ovarie-sarcoma (100% af til-fældene), Lewis lungecarcinoma (100% af tilfældene) og ΒΙΟ 16 melanoma (80% af tilfældene). Ved behandling af blære-carcinoma med det ovennævnte middel opnåede man imidlertid ikke nogen "fuldstændig regression", før doseringen af heparin blev forøget til 1000 enheder/ml, hvorefter 100% af tumorerne undergik regression uden siden hen at 15 begynde at vokse. Ved den mindre effektive behandlings form, som bestod af en subcutan indgivelse af heparin og cortison (75 mg/kg), opnåedes "fuldstændig regression" i 80% af ovarie-tilfældene, 71% af Lewis lunge-tilfældene, 60% af B-16 melanoma-tilfældene og 0% af blære-tilfælde-20 ne.

EKSEMPEL 6

Hexasaccharid-heparin-fragmentet fra eksempel 2 blev op-25 løst i en saltopløsning (1,5 mg/ml). 3 mus, som var bærere af implanterede ovarie-sarcoma, blev behandlet ved subcutan injektion af hexasaccharid-fragmentet to gange dagligt i en dosis på 7 mg/kg og subcutan injektion af cortisonacetat i "spidsdosis". Kontrolmusene fik enten 30 indgivet cortisonacetat alene, eller de fik indgivet saltopløsningen. Mens kontrol-tumorerne voksede progressivt, skete der en hastig regression af de tumorer, der blev behandlet med hexasaccharid og cortisonacetat, og disse tumorer var næsten ikke synlige fire dage senere.

35 Derefter blev behandlingen med hexasaccharid afbrudt, hvilket medførte, at tumorerne på ny kom til syne 3 til 5 dage senere.

DK 168876 B1 18 EKSEMPEL 7

For direkte at kunne observere avaskulære tumorer under den systemiske terapi implanterede man Lewis lungetumorer 5 i hornhinderne hos mus ved proceduren beskrevet af Muthukkaruppan et al., Science, vol. 205, 1416-18 (1979), og behandlingen blev påbegyndt 24 timer senere. En indgivelse af heparin (oral) og cortisonacetat ("spidsdosis") bevirkede en signifikant inhibering af kapillarvæksten 10 (0,02 mm/dag) i sammenligning med cortisonacetat alene (0,24 mm/dag), heparin alene (0,32 mm/dag) og en saltopløsning (0,23 mm/dag). I nærværelse af heparin og cortisonacetat forblev en tynd tumor-skive avaskulær. Der optrådte ikke nogen tredimensional tumorvækst. Ved kontrol-15 indgivelse af saltopløsning eller ved indgivelse af enten heparin eller cortisonacetat alene blev tumoren derimod vaskulariseret og voksede som en tredimensional masse, indtil den sluttelig perforerede hornhinden. Sådanne store tumorer kunne underkastes regression til den plane, 20 tynde intracorneale fase ved genoptagelse af kombinationen af heparin og cortisonacetat. De intracorneale tumorceller kunne imidlertid ikke udryddes, og en afbrydelse af indgivelsen af heparin og cortisonacetat førte til, at en vaskulariseret tumor igen viste sig.

25

Lungemetastaserne blev optalt i alle dyr, der døde. Der benyttedes et stereoskop, som forstørrede seks gange. I alle kontroldyrene var lungerne tæt besat med metastaser fra de tre typer af metastaserende tumorer. Når man der-30 imod anvendte enhver kombination af heparin og cortisonacetat, fandt man ikke nogen metastaser i mus, som var bærere af ovarie-sarcoma. Der blev kun fundet en enkelt metastase i en mus, som var bærer af Lewis lungecarcino-ma, og der blev fundet to avaskulære metastaser på mindre 35 end 0,1 mm hos en mus, som var bærer af B-16 melanoma.

Det næsten fuldstændige fravær af metastaser hos mus, der var behandlet med heparin og cortison, var så slående, at DK 168876 B1 19 det tydeligere fremgår af de følgende data:

Totalt antal lungemetastaser: 5 Kontrol-behandling = 4553 i 73 dyr Heparin + cortison = 3 i 39 dyr

Desuden viste der sig ingen lungemetastaser i nogen af de overlevende dyr, som var ude af behandling.

10

For at udelukke muligheden af, at tumor-regressionen kunne være fremkaldt af direkte cytotoxicitet, blev alle fire typer af tumorceller dyrket i nærværelse af 10% serum opnået fra mus, som modtog enten heparin, cortison-15 acetat, heparin og cortisonacetat eller intet medikament. Kombinationen af heparin og cortisonacetat virkede ikke inhiberende på cellevæksten, men tværtimod stimulerende. Endvidere viste de histologiske snit ikke nogen tegn på en cytotoxisk virkning på knoglemarven eller på tarmslim-20 hinderne hos dyr, der modtog en kombination af heparin og cortisonacetat.

For at udelukke muligheden af, at kombinationen af heparin og cortisonacetat kunne inducere tumor-regressionen 25 ved at fremskynde en immunreaktion, podede man mus med friske tumorceller i forskellige intervaller, efter at musene var taget ud af behandlingen. Disse tumorer voksede med samme hastighed som de oprindelige implantationer.

Hvis tumor-regressionen desuden var næsten fuldstændig, 30 og behandlingen med heparin og cortisonacetat tidligere var blevet afbrudt, genoptog den originale tumor sin vækst. Endelig kunne man, ved at standse og starte behandlingen eller ved at anvende suboptimale doser af heparin og cortison, opretholde flere tumorer på en næsten 3 35 konstant lille størrelse (nærmere bestemt 45-70 mm ) i perioder på mere end 8 uger.

DK 168876 B1 20

Inflammatorisk angiogenese, induceret ved implantation af siliciumoxid-partikler i hornhinden hos kaniner, og im-mun-angiogenese, induceret ved implantation af lymfeknuder fra en anden kanin, kunne også forebygges fuldstæn-5 digt med cortison-heparin-pellets. Cortison i sig selv bevirkede en midlertidig udsættelse af udbruddet af begge typer af angiogenese (sammenlignet med en tom pellet), og heparin i sig selv udsatte udbruddet af immun-angiogenese, men hver for sig kunne forbindelserne ikke forhindre 10 angiogenese i at bryde ud i længere tidsrum, sådan som det er tilfældet med cortison-heparin-kombinationen.

EKSEMPEL 8 15 En carcinoma fra et menneskes tyktarm blev indpodet sub-cutant i nøgne (athymiske) mus, hvor den fik lov at vokse 3 til et volumen på 0,5 cm . Kontroldyr og behandlede dyr modtog de samme forbindelser med den undtagelse, at koncentrationen af heparin i drikkevandet var 1000 enhe-20 der/ml. En anden behandlingsgruppe modtog endvidere en oral indgivelse af hydrocortison (0,45 mg/ml) og en oral indgivelse af heparin. Dyrene blev opbevaret i bure, som blev beskyttet af millipore-filtre. Tumorerne voksede progressivt i alle kontroldyrene, men udviste regression 25 i de dyr, der var behandlet med heparin og cortison eller med heparin og hydrocortison. De behandlede tumorer var næsten ikke synlige efter 6 ugers terapi.

EKSEMPEL 9 30 I det følgende eksperiment benyttedes "schweiziske" CD-I mus, fordi denne stamme let yngler, og fordi de befrugtede hunmus næsten altid leverer et fuldt kuld unger.

35 En hanmus blev efterladt alene i buret i 24 timer. Derefter blev burets strøelse skiftet, og der anbragtes 2 hunmus i buret kl. 5 om eftermiddagen. Næsten morgen kl.

21 DK 168876 B1 8 blev hunmusene undersøgt for tilstedeværelse af en klump i livmoderhalsen, hvilket indikerer insemination.

Der blev opstillet et antal bure med hanner og hunner, som var tilstrækkeligt til at opnå mindst 20 drægtige 5 hunner.

Behandlingen af de inseminerede hunner blev påbegyndt dagen efter inseminationen ved at tilbyde drikkevand til hver af fire grupper som følger: 10

Gruppe I: Heparin (Hepar) i 1000 enheder/ml i vand

Gruppe II: Hydrocortisonphosphat 0,45 mg/ml i vand 15 Gruppe III: (I) og (II) sammen i vand

Gruppe IV: Vand alene

Behandlingerne blev kun fortsat i fire dage, hvorefter 20 hunmusene blev anbragt i hver sit bur, hvor de blev overvåget nøje for tilstedeværelse af afkom. Burene blev kontrolleret dagligt for eventuelle tegn på abort (pels, fosterrester etc.).

25 Grupperne I, II og IV frembragte alle sunde kuld. I gruppe III fødtes der ikke nogen unger, og der var heller ikke tegn på abort. Dette understøtter den konklusion, at anti-angiogenese ved behandling med heparin og cortison inhiberer implantation, formodentlig ved at inhibere ka-30 pillarvæksten fra uterus.

35

Claims (7)

1. Middel, der kan administreres oralt eller subcutant, 5 til inhibering af angiogenese hos pattedyr, kendetegnet ved, at de aktive bestanddele i det væsentlige består af 1) heparin eller et heparin-fragment, som er et hexasaccharid eller et større fragment, og 2) cor-tison, hydrocortison eller 11-a-isomeren af hydrocorti- 10 son.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de aktive bestanddele i det væsentlige består af heparin og hydrocortison. 15

3. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de aktive bestanddele i det væsentlige består af cortison og et heparin-fragment, som er et hexasaccharid.

4. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de aktive bestanddele i det væsentlige består af hydrocortison og et heparin-fragment, som er et hexasaccharid.

5. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 25 de aktive bestanddele i det væsentlige består af hydrocortison og et heparin-fragment, som er et hexasaccharid, og at det endvidere omfatter et antibiotikum.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et middel ifølge et-30 hvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man blander de aktive bestanddele, enten i tør form eller i et passende bærestof, til en form, der er egnet til oral eller subcutan administrering.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man opløser eller suspenderer de aktive bestanddele i et ikke-toxisk, fysiologisk acceptabelt bærestof.